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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE CO-TRANSFORMAÇÃO
DE SOJA [GLYCINE MAX (L.) MERRILL] VIA
BOMBARDEAMENTO DE PARTÍCULAS UTILIZANDO UM
GENE DE SELEÇÃO E UM GENE DE INTERESSE EM
PLASMÍDEOS DIFERENTES
RAQUEL SACHET
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular da UFRGS como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Mestre
Orientadora: Dra. Maria Helena Bodanese Zanettini
Co-orientadora: Dra. Luciane Maria Pereira Passaglia
Porto Alegre
Maio de 2005
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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Biociências
Departamento de Genética
Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais
Este trabalho recebeu apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e do Centro do Agronegócio-Casa Rural.
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Agradecimentos
A todos vocês, que estiveram ao meu lado nas horas que chorei e nas horas que sorri, nas
horas que me lamentei e nas horas que de uma forma ou de outra demonstrei total alegria.
Muitas coisas aprendi, muitos valores guardei e muitas vitórias conquistei.
Mas tudo isso só foi possível, porque pude contar com a sincera ajuda de vocês.
Com vocês aprendi a respeitar e ser respeitada e principalmente aprendi que não podemos
ter medo de lutar para ser feliz, que devemos vencer nossos obstáculos, pois Deus sempre
está do nosso lado.
Agradeço pelo sorriso diário, sem mágoas nem rancores, agradeço de peito aberto, com a
alma explosiva por ter chegado ao fim de mais uma etapa.
Hoje quero parar e agradecer, porque vocês fizeram, fazem e sempre farão parte de minha
história!
Obrigada, pela amizade.
Obrigada, pela força que vocês me deram.
Obrigada, pelas inúmeras alegrias que senti em nossas conversas descontraídas.
Obrigada, pela compreensão que vocês tiveram por mim.
Enfim...!
São tantos OBRIGADOS, que aqui não caberia quase nada.
4
Sumário
Resumo ..................................................................................................................................5
Abstract ..................................................................................................................................6
Capítulo I - Introdução Geral................................................................................................. 7
I.1 INTRODUÇÃO...................................................................................................8
I.2 OBJETIVOS......................................................................................................18
Capítulo II - Soybean co-transformation by particle bombardment using a selectable
marker gene and a gene of interest on different plasmids ................................. 19
Capítulo III - Discussão Geral............................................................................................. 42
Capítulo IV - Referências Bibliográfica dos Capítulos I e III............................................. 46
5
Resumo
Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como
objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium
anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a
estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na
progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística,
tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares
MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA
e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo
pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram
transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material
estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram
transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina),
maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados
das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas
adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de co-
transformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e
de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa
de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46
Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de
trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo
para estudos de co-transformação.
6
Abstract
Aiming the increase of plant resistance to fungal disease, the present work was carried
out with the objective of introducing a gene (chit1) coding a chitinase from Metarhizium
anisopliae in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merril]. Co-transformation was the
strategy elected, in order to obtain marker-free transgenic plants in the progeny of
transformed plants. Co-transformation was performed via biolistic using somatic
globular embryo clusters of MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars as target tissues.
Plasmid pGusHyg, containg the reporter gusA gene and the selectable marker hpt gene,
was co-delivered with the pMOG463chit1 plasmid containg the chit1 gene. Bombarded
embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to
obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters were
sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and
regeneration media. A total of 387 and 380 histodifferentiated embryos were respectively
obtained from MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars. Transgenic adult fertile plants
were regenerated. To evaluate the co-transformation eficiency, DNA from
histodifferentiated embryos and from regenerated fertile plants was submitted to
molecular analysis. Data obtained allowed us to calculate co-transformation frequencies
of 44% and 50% for MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars, respectively. As far as we
are concerned there is no studies utilizing soybean somatic embryos for co-
transformation via biolistic.
7
Capítulo I
Introdução Geral
8
I.1 INTRODUÇÃO
A soja [Glycine max (L.) Merrill] cultivada é muito diferente das plantas ancestrais,
as quais eram rasteiras e se desenvolviam na costa leste da Ásia, principalmente ao longo
do Rio Yangtse, na China. Sua evolução começou com o aparecimento de plantas oriundas
de cruzamentos naturais entre duas espécies de soja selvagem que foram domesticadas e
melhoradas por cientistas da antiga China. Sua importância na dieta alimentar dessa antiga
civilização chinesa era tal que a soja, juntamente com trigo, arroz, centeio e milheto, era
considerada um grão sagrado, com direito a cerimoniais ritualísticos na época do plantio e
da colheita (EMBRAPA soja, 2005). A soja hoje cultivada é uma espécie anual, diplóide
(2n = 40), de autofecundação e pertencente à família Fabaceae (Hymowitz, 1979;
EMBRAPA Soja, 2005).
Apesar de conhecida e explorada no Oriente há mais de cinco mil anos, sendo uma
das mais antigas plantas cultivadas do Planeta, o Ocidente ignorou o cultivo da soja até a
segunda década do século vinte, quando os Estados Unidos iniciaram sua exploração
comercial, primeiro como forrageira e, posteriormente, como grão (EMBRAPA Soja,
2005). A revolução sócio-econômica e tecnológica protagonizada pela soja no Brasil
moderno pode ser comparada ao fenômeno ocorrido com a cana-de-açúcar no Brasil
colônia e com o café no Brasil imperial que, em épocas diferentes, comandaram o
comércio exterior do país. Em nosso país, a soja foi estabelecida como uma cultura
importante primeiramente na Região Sul (décadas de 1960 e 1970) e, em seguida, nos
cerrados do Brasil Central (a partir da década de 1980) (EMBRAPA Soja, 2005)
O Complexo Agroindustrial da soja movimenta mundialmente aproximadamente
U$ 215 bilhões/ano. Em 2004, o Brasil figurou como o segundo produtor mundial, com
uma produção de 50 milhões de toneladas ou 25% da safra mundial. Em primeiro lugar
encontram-se os Estados Unidos, com 65,8 milhões de toneladas. A receita cambial
auferida pela soja brasileira foi de aproximadamente 10 bilhões de dólares, e de cinco
vezes esse valor, se considerados os benefícios gerados ao longo da sua extensa cadeia
produtiva (EMBRAPA Soja, 2005).
Devido à sua posição de destaque em todo o mundo, a soja tem sido alvo de
constantes estudos para o melhoramento genético. No entanto, a caracterização das
9
cultivares brasileiras de soja, usando microssatélites como marcadores, demonstrou uma
estreita base genética em seu germoplasma (Priolli et al., 2002). Além disso, a fonte de
recursos genéticos, representada por espécies afins, também é inacessível para soja, devido
à incompatibilidade sexual dos cruzamentos interespecíficos e intergenéricos (Hu &
Bodanese-Zanettini, 1995).
Por esses motivos, a eficiência dos métodos tradicionais de cruzamento tem sido
bastante limitada, fazendo com que as pesquisas tenham sido direcionadas à utilização de
técnicas moleculares de transferência de genes. Sendo assim, a manipulação genética abriu
a perspectiva de que genes derivados de plantas, relacionadas ou não, e mesmo de
organismos de outros reinos, possam ser utilizados em programas de melhoramento da
soja. Diferentes técnicas para a transformação genética de plantas foram estabelecidas com
o desenvolvimento da cultura de tecidos e da engenharia genética (para revisão ver
Brasileiro & Lacorte, 1998; Bodanese-Zanettini & Pasquali, 2004).
Os cultivos de plantas transgênicas em geral registraram o segundo maior
crescimento em 2004, alcançando 81 milhões de hectares (200 milhões de acres). De
acordo com estudo divulgado pelo Serviço Internacional para a Aquisição de Aplicações
em Agrobiotecnologia (ISAAA), a área global cultivada com transgênicos cresceu 20% em
2004, representando um aumento de 13,3 milhões de hectares (James, 2004). No Brasil,
por exemplo, dados apontam crescimento de 66% da área com soja transgênica RR (Round
up Ready; Suzuki S & Yuyama, 2005).
Vários métodos de transferência de genes para tecidos-alvo já foram empregados
para a produção de soja transgênica. Os primeiros trabalhos de transformação por
bombardeamento de partículas utilizaram meristemas apicais (McCabe et al., 1988) e
culturas embriogênicas em suspensão (Finer & McMullen, 1991). Pelo sistema de
transferência mediada por Agrobacterium foram utilizados como alvo cotilédones imaturos
(Parrott et al., 1989; Yan et al., 2000), culturas embriogênicas em suspensão (Trick &
Finer, 1998) e tecido meristemático axilar localizado em nodos cotiledonares de plântulas
(Hinchee et al., 1988).
O sucesso dos métodos de transformação genética da soja, no entanto, não tem
correspondido às expectativas, o que pode ser atribuído à ineficiência das técnicas de
transferência de genes e, principalmente, da regeneração de plantas in vitro. Uma vez que o
gene tenha sido introduzido no tecido-alvo, é necessário que as células ou tecidos
10
transformados sejam regenerados em plantas, sendo esta uma limitação para a obtenção de
soja geneticamente modificada, já que esta espécie é de difícil regeneração in vitro (Trick
et al., 1997; Droste et al., 2001). Desta forma, pode-se dizer que existem três fatores
limitantes principais para a obtenção de soja transgênica, sendo eles: 1) o sistema de
cultura de tecido que precisa ser otimizado, 2) a eficiência do método de transformação
que ainda é baixa e de difícil reprodutibilidade, e 3) o limitado número de genótipos que
têm sido transformados com sucesso.
Um protocolo de transformação de soja ideal deve ser simples, rápido e de baixo
custo; proporcionar um método eficiente de seleção, sem a produção de plantas não-
transformadas ou quiméricas, e ter sucesso com várias cultivares (Olhoft et al., 2003).
Apesar de ainda ineficiente, trabalhos recentes têm demonstrado considerável avanço no
sistema de transformação de soja mediada por Agrobacterium. Yan et al. (2000) obtiveram
três plantas férteis e a análise de 48 progênies revelou um padrão de herança mendeliano.
Este foi o primeiro trabalho a demonstrar a exeqüibilidade do método de transformação
usando cotilédones zigóticos imaturos como explante. Segundo Ko et al. (2003), um fator
crítico para o sucesso da transformação de diferentes cultivares de soja é o uso de uma
linhagem adequada de Agrobacterium.
O método de transformação genética por bombardeamento de partículas, também
denominado de aceleração de partículas ou projéteis, biolística ou biobalística, é
caracterizado pela introdução de moléculas de DNA em células e tecidos intactos por meio
de microprojéteis acelerados em alta velocidade, capazes de atravessar a parede e as
membranas celular e nuclear, liberando no núcleo os fragmentos de DNA. Este método
tem sido reconhecido como um dos mais eficientes, pois utiliza como alvo o tecido intacto,
além de ser relativamente independente do genótipo (Bodanese-Zanettini & Pasquali,
2004).
Para a transferência de DNA para tecidos vegetais, Finer et al. (1992)
desenvolveram um aparelho denominado Particle Inflow Gun (PIG), o qual é simples e de
baixo custo se comparado aos demais aparelhos. O método desenvolvido por Finer &
McMullen (1991) utiliza partículas de tungstênio ou ouro cobertas com DNA, que são
impulsionadas diretamente por uma descarga de gás hélio sob baixa pressão (em torno de
60 psi), o que resulta em danos menores aos tecidos bombardeados. O tecido-alvo é
11
mantido em câmara com vácuo para que as partículas não sofram uma rápida
desaceleração após o disparo.
A principal vantagem do bombardeamento é a possibilidade de transferência de
genes, independentemente do genótipo, para qualquer tipo de tecido ou célula, sem a
necessidade da compatibilidade bactéria/hospedeiro exigida pelo sistema Agrobacterium.
Christou et al. (1989) demostraram que a introdução de DNA em soja via biolística pode
apresentar um padrão de herança mendeliano. Entretanto, a freqüência de integração
estável obtida via bombardeamento ainda é baixa e podem ocorrer rearranjos,
fragmentação do DNA inserido e/ou inserção de cópias múltiplas (Hadi et al., 1996). A
presença de cópias múltiplas pode resultar no silenciamento do transgene (Reddy et al.,
2003). Outros fatores limitantes deste método são os relacionados aos aspectos técnicos,
incluindo o tipo de aparelho e partícula e o fato de que alguns tecidos podem ser resistentes
à penetração das partículas devido a cutículas espessas e compactas, paredes celulares
lignificadas e superfícies pilosas (Hunold et al., 1994).
Vários tipos de explantes e células podem ser utilizados para a transformação por
biolística tais como folhas, caule e calos. De modo geral, a transformação de meristemas
apicais e células embriogênicas tem demonstrado maior eficiência para a obtenção de
plantas transgênicas (Lacorte et al., 1999, Bodanese-Zanettini & Pasquali, 2004).
O primeiro registro de transformação de soja via bombardeamento data de 1988
(McCabe et al., 1988), sendo que os autores utilizaram tecido meristemático como alvo.
No entanto, as plantas obtidas foram, em geral, quiméricas, devido à constituição
multicelular do meristema. Assim, para que a planta regenerada fosse totalmente
transgênica seria necessário que ocorresse a transferência do gene para as três camadas de
células que compõem o meristema apical. Porém, comprovou-se que as células
transformadas encontravam-se basicamente nas duas camadas mais externas dos ápices
meristemáticos dos brotos regenerados (Sato et al., 1993).
Posteriormente, vários trabalhos relataram a obtenção de embriões somáticos, por
via direta ou indireta, a partir de cotilédones de embriões zigóticos imaturos. Como a
origem dos embriões secundários é unicelular (Finer, 1988), o tecido embriogênico passou
a ser o principal tecido-alvo para a transformação genética, uma vez que uma única célula
epidérmica transformada de um embrião primário é capaz de originar, por embriogênese
secundária, um indivíduo totalmente transgênico. Além disto, a embriogênese somática
12
como sistema de regeneração de soja tem sido reconhecida por seu potencial em produzir
um grande número de plantas independentemente transformadas (Finer & McMullen,
1991).
Conceitualmente, a embriogênese somática é o processo pelo qual células
somáticas dão origem a estruturas semelhantes a embriões, sem que ocorra a fusão de
gametas, sendo esses capazes de se desenvolver em plantas. O padrão de desenvolvimento
de um embrião somático em dicotiledôneas apresenta características morfológicas
semelhantes àquelas do embrião zigótico (Guerra et al., 1999), passando pelos estádios
globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar. O embrião somático é uma estrutura bipolar,
com meristema apical e radicular e sem conexão física com o tecido de origem (Tisserat,
1991).
Embora a embriogênese somática seja amplamente utilizada para a regeneração de
plantas in vitro, ainda não se conhecem totalmente os processos que levam à formação dos
embriões. A resposta diferenciada das cultivares às condições da cultura ainda é o principal
obstáculo à regeneração da soja via embriogênese (Droste, 2001; Silva, 2005). Além disto,
uma cultivar que apresenta maior capacidade de indução de embriões não necessariamente
é a que tem a maior capacidade de conversão dos mesmos em plantas (Santos et al., 1997;
Droste, 1998; Silva, 2005).
Nos primeiros trabalhos desenvolvidos por nossa equipe foram utilizados apenas
genes marcadores e genes repórteres, com o objetivo de estabelecer as melhores condições
para a transformação genética da soja. Droste et al. (2002) utilizaram o plasmídeo
pGusHyg, o qual contém o gene repórter gusA, isolado da bactéria Escherichia coli, que
codifica a enzima β-glicuronidase (GUS) e o gene marcador higromicina-fosfotransferase
(hpt), derivado de um transposon de E. coli, sendo este capaz de conferir resistência à
higromicina e antibiótico derivados.
Quando se trata da introdução de genes de interesse, após a obtenção das plantas
transformadas, a manutenção da presença do gene marcador nestas é geralmente
desnecessária e indesejável. É recomendável que qualquer gene de seleção, especialmente
aqueles que conferem resistência a antibióticos ou a herbicidas, seja removido antes da
planta ser liberada no meio ambiente (Bettany et al., 2002). Isto evitaria um possível
escape do gene de resistência a herbicidas, por exemplo, por meio do pólen das linhagens
transformadas para espécies selvagens próximas (Scutt et al., 2002).
13
Em relação aos genes que conferem resistência a antibióticos, há também a
preocupação com a possibilidade de que tais genes possam ser transferidos
horizontalmente de plantas para bactérias do ambiente ou que os produtos vegetais
utilizados na alimentação possam transferir o(s) transgene(s) para microrganismos da flora
intestinal ou para as células humanas, o que tem dificultado a utilização comercial de
organismos geneticamente modificados (CSA, 2000). No entanto, estudos detalhados
demonstraram que a possibilidade de ocorrência de tais eventos é desprezível (Kuiper et
al., 2001; Bennett et al., 2004). Endo et al. (2002) acrescentaram que a presença de gene
de seleção impede o uso do mesmo marcador no momento da re-transformação, gerando
um empilhamento de genes na planta, o que poderia causar um efeito negativo desse
agente, diminuindo a capacidade de proliferação da célula transformada e a sua conversão
em planta adulta. Os genes repórteres/marcadores e o gene de interesse podem ser
introduzidos no mesmo cassete de transformação (co-integrado) ou serem introduzidos em
cassetes separados (co-transformação; Bettany et al., 2002).
Várias metodologias têm sido descritas para a remoção do gene de seleção das
plantas transgênicas (para revisão ver Ebinuma et al., 2001 e Miki & McHugh, 2004).
Dentre as várias técnicas descritas, duas têm apresentado maior potencial. A mais simples
é o sistema de co-transformação, o qual permite a segregação do gene de interesse e do
gene repórter/marcador na progênie de plantas transformadas, desde que tais genes tenham
sido inseridos em locus não ligados (Ebinuma et al., 2001). Uma outra estratégia, mais
complicada, é o uso de recombinases sítio-específicas sob o controle de promotores
induzíveis, para remover o gene marcador das plantas transgênicas após a seleção (Miki &
McHugh, 2004).
A co-transformação apresenta, também, a vantagem de permitir a inserção simultânea
de um grande número de genes em uma planta, com um número limitado de genes
marcadores (François et al., 2002). A maioria dos trabalhos de co-transformação foi
realizada com a utilização do sistema Agrobacterium. Na revisão publicada por Ebinuma et
al. (2001) está registrado o sucesso de co-transformação via Agrobacterium em diferentes
espécies e diferentes tecidos-alvo: protoplastos e discos de folhas de tabaco, segmentos de
hipocótilo de canola, discos de folhas de Arabidopsis e em arroz. Segundo os autores,
embora a eficiência de co-transformação tenha apresentado uma ampla variação (de 10 a
14
90%), na maioria dos trabalhos foi verificado que esta eficiência foi superior à prevista
para eventos independentes.
Utilizando técnicas de transferência direta, especialmente transformação de
protoplastos mediada por polietilenoglicol e bombardeamento com partículas, vários
grupos de pesquisa registraram eficiência de co-transformação variando de 18 a 88% em
diferentes espécies incluindo feijão, milho, aveia, soja, arroz e trigo (Campbell et al., 2000;
Bettany et al., 2002).
Em soja, uma eficiência de co-transformação de aproximadamente 25% foi
encontrada em experimentos envolvendo a aceleração de partículas ou a eletroporação de
protoplastos, bem como a aceleração de partículas utilizando meristemas como alvo
(Christou et al., 1990). Hadi et al. (1996) realizaram um experimento de co-transformação
via biolísitica tendo como tecido-alvo culturas embriogênicas em suspensão, usando até 12
plasmídeos diferentes. Das 26 plantas regeneradas testadas, todas continham pelo menos
oito plasmídeos diferentes, enquanto 73% dos clones continham os 12 plasmídeos. Em
outro trabalho, nódulos cotiledonares foram transformados por bombardeamento de
partículas ou via Agrobacterium. Quando os explantes foram co-cultivados com
Agrobacterium visando a co-integração de dois genes (mesmo plasmídeo) que
expressavam proteínas anti-fúngicas, das 11 plantas obtidas, quatro apresentavam ambos
os genes. Já quando cotilédones imaturos de soja foram co-bombardeados com dois
plasmídeos (contendo os mesmos genes do experimento anterior), 26 plantas foram
regeneradas e, destas, duas foram co-transformadas (Li et al., 2004). Não existem, até o
momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em
proliferação como alvo para estudos de co-transformação via biolística ou outro método de
transformação genética.
Um dos fatores limitantes para a obtenção de altos rendimentos na cultura da soja são
as doenças, que demandam conhecimento especializado para sua correta identificação,
avaliação de perdas e controle. Já foram identificadas, no Brasil, inúmeras doenças
causadas por fungos, bactérias, vírus e nematóides, algumas das quais de grande
importância, provocando perdas consideráveis no rendimento e, outras, de aparição
secundária, que não têm causado maiores prejuízos.
A aquisição de tolerância a herbicidas e de resistência a microrganismos e insetos é
um dos principais objetivos no melhoramento genético de plantas as doenças causadas por
15
microrganismos, principalmente aquelas de origem fúngica, são consideradas um dos mais
sérios problemas que afetam as plantações. Por este motivo, é de grande interesse
introduzir no genoma das plantas agrícolas genes que, potencialmente, possam conferir
resistência genética a tais moléstias.
De acordo com revisões apresentadas por Bonato (2000) e pela COODETEC
(2002), entre os diversos fungos que atacam a soja, destacam-se:
9 Rizoctônia (Rhizoctonia solani), que ataca a soja em duas fases. No início
do desenvolvimento, causando o denominado “tombamento por rizoctônia”, e em plantas
adultas, causando a morte em reboleiras a partir da floração;
9 Murcha por esclerócio (Sclerotium rolfsii);
9 Tombamento por pítium/fitófora (Pythium spp. e/ou Phytophora sojae).
De acordo com os autores acima citados, existem também fungos que causam
doenças de raízes, tais como:
9 Podridão por fitófora (Phytophora sojae);
9 Morte da extremidade da raiz principal (Pythium, Fusarium e Rhizoctonia);
9 Síndrome da morte súbita ou podridão vermelha da raiz (Fusarium solani f.
sp. glycines).
Uma das principais doenças que tem atingido as plantações de soja, desde sua
primeira constatação no Brasil na safra 2000/2001, é a Ferrugem Asiática, causada pelo
fungo Phakopsora pachyrhizi. Esta doença tem sido alvo de inúmeros estudos em face de
sua agressividade e poder de dano, causando a desfolha prematura e redução drástica no
rendimento de grãos (Suzuki & Yuyama, 2005).
Não existem cultivares de soja com resistência a esses fungos, sendo este um
grande desafio para os programas de melhoramento. Assim, a obtenção de plantas
geneticamente transformadas que apresentam aumento da resistência a moléstias fúngicas
surge como uma estratégia promissora e factível.
Segundo Punja (2001), as pesquisas visando o aumento da resistência a doenças
fúngicas em plantas transgênicas podem ser agrupadas em cinco categorias:
9 A expressão de genes que são diretamente tóxicos aos patógenos ou que
reduz seu crescimento. Estes incluem proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR),
tais como as enzimas hidrolíticas (quitinases, glicanases), proteínas antifúngicas (osmotina
16
e taumatina), peptídeos antimicrobianos (tioninas, defensinas, lectinas), proteínas
inativadoras de ribossomo (RIP), e fitoalexinas;
9 A expressão de genes que destroem ou neutralizam um componente do
arsenal patogênico, tais como poligalacturonase, ácido oxálico e lipase;
9 A expressão de genes que podem potencialmente aumentar a estrutura de
defesa da planta. Estes incluem níveis elevados de peroxidase e lignina;
9 A expressão de genes que liberam sinais que podem regular a defesa da
planta, incluindo a produção de elicitores específicos, peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
),
ácido salicílico (SA) e etileno (C
2
H
4
);
9 A expressão de genes de resistência (R) envolvidos na resposta
hipersensível (HR) e fatores de interação com avirulência (Avr).
As enzimas hidrolíticas quitinases e β-1,3-glicanases estão entre as proteínas
antifúngicas mais exploradas para a geração de plantas transgênicas resistentes, por serem
capazes de degradar os principais componentes da parede celular de fungos, as quitinas e
os glicanos, respectivamente (Fritig et al., 1998; Salmeron & Vernooij, 1998). Além disso,
as quitinases fazem parte do sistema de defesa das plantas, não sendo tóxicas para as
mesmas e para animais (Lorito et al., 1998).
O principal substrato das quitinases é o polissacarídeo quitina – um polímero não
ramificado de N-acetil-D-glicosaminas (NacGlcs) unidas por ligações do tipo β-(1,4). A
quitina é um dos polímeros mais abundantes da natureza, sendo constituinte do
exoesqueleto de artrópodes e de conchas de moluscos, e que também compõe a parede
celular de fungos e algumas algas. Investigações recentes indicaram que tanto em plantas
como em animais, as quitinas estão envolvidas não apenas no processo relacionado à
defesa ou à resposta ao estresse em geral, mas também nos processos de crescimento e
desenvolvimento (Kasprzewska, 2003).
Algumas espécies de culturas transgênicas expressando quitinases têm sido
avaliadas em casa de vegetação (Kern, 2003) e testes a campo (Melchers & Stuiver, 2000;
Punja, 2001) e demonstraram uma redução na incidência de doenças fúngicas.
Genes de plantas que codificam proteínas envolvidas na degradação da parede
celular, especialmente quitinases, foram usados visando alterar a resistência a fungos
patogênicos. No entanto, a inserção de apenas um gene não conferiu níveis de resistência
adequados e poucos trabalhos relatam a resistência a múltiplos patógenos. Os genes de
17
uma quitinase de pepino e de uma glicanase de Nicotiana plumbaginifolia foram
introduzidos em batata (Solanun tuberosusm L.). Os resultados mostraram que não houve
diferença significativa na habilidade dos extratos foliares das plantas transformadas em
inibir o crescimento de Rhizoctonia solani, quando comparadas com plantas controle
(Moravcíková et al., 2004).
Genes codificantes de quitinases isolados de fungos utilizados para o biocontrole de
outros fungos e de artrópodes como, por exemplo, Trichoderma harzianum, representam
notadamente um avanço na estratégia de emprego de transgenia, uma vez que apresentam
uma alta atividade antifúngica, agindo sobre um amplo espectro de fitopatógenos e por não
serem tóxicos às próprias plantas, mesmo quando em altas concentrações (Lorito et al.,
1998).
A introdução em soja do gene chit1, que codifica a quitinase CHIT42 do fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae (utilizado como biocontrole) e caracterizado
por Bogo et al. (1998), apresenta-se como uma perspectiva para introduzir a resistência a
fungos em plantas. Este gene foi transferido para plantas de tabaco por Kern (2003). Foram
obtidas plantas capazes de expressar o gene chit1 de forma estável. Plantas expressando
altos níveis da proteína CHIT42 mostraram-se consistentemente resistente ao fungo
Rhizoctonia solani, sugerindo uma relação direta entre a atividade enzimática e a redução
da área foliar afetada pelas lesões fúngicas.
18
I.2 OBJETIVOS
O presente trabalho tem por objetivo geral introduzir em cultivares de soja, via co-
transformação por biolística, o gene chit1 isolado do fungo Metarhizium anisopliae, com a
perspectiva de aumentar a resistência a moléstias fúngicas nestas plantas.
Os objetivos específicos desse trabalho são:
a) Avaliar a eficiência da estratégia de co-transformação, comparando a resposta de
duas cultivares de soja por meio de análises moleculares de embriões histodiferenciados e
de plantas regeneradas;
b) Obter plantas transformadas, as quais poderão conter apenas o gene marcador
(resistência ao antibiótico higromicina) ou, além deste, o gene de interesse (chit1).
19
Capítulo II
Soybean co-transformation by particle bombardment
using a selectable marker gene and a gene of interest
on different plasmids
Trabalho a ser submetido à revista PAB – Pesquisa Agropecuária Brasileira
20
Co-transformação de soja via bombardeamento de partículas utilizando um gene
marcador e um gene de interesse em plasmídeos diferentes
Raquel Sachet
(1)
; Luciane Maria Pereira Passaglia
(1)
; Milena Schenkel Homrich
(1)
;
Giancarlo Pasquali
(2)
and Maria Helena Bodanese-Zanettini
(1) *
(1)
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970, Porto Alegre, RS, Brazil
(2)
Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, Instituto de Biociências, Centro
de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Caixa Postal 15005, 91501-
970, Porto Alegre, RS, Brazil
*e-mail: maria.zanettin[email protected]
21
Resumo
No presente trabalho está descrita a co-transformação de soja [Glycine max (L.)
Merrill] via bombardeamento de partículas. Um plasmídeo contendo um gene (chit1) que
codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae foi bombardeado
concomitantemente com o plasmídeo pGusHyg, contendo os genes gusA e hpt de
Escherichia coli. Conjuntos de embriões somáticos de soja foram utilizados como tecidos-
alvo. Após a seleção, tecidos resistentes à higromicina foram individualmente proliferados
e deram origem a conjuntos de clones, que correspondem a eventos de transformação
independentes. Vinte e nove embriões e uma planta da cultivar MG/BR46 Conquista, e
nove plantas adultas e férteis da cultivar IAS-5 foram analisadas para verificar a presença
dos transgenes. Os dados obtidos permitiram calcular eficiências de co-transformação de
44% e 50% para as cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. As sementes
obtidas das plantas transgênicas co-transformadas consistem em um valioso material
genético para a avaliação da expressão e do padrão de herança dos genes exógenos.
Termos para indexação: bombardeamento de partículas, co-transformação, embriogênese
somática, soja, gene de seleção
22
Soybean co-transformation by particle bombardment using a selectable marker gene
and a gene of interest on different plasmids
Abstract
The present work describes the co-transformation of soybean [Glycine max (L.)
Merrill] via particle bombardment. A plasmid containing a chitinase gene (chit1) isolated
from Metarhizium anisopliae was co-delivered with the plasmid pGusHyg containing the
Escherichia coli gusA and hpt genes. Somatic embryogenic clusters were employed as
target tissues. After selection, hygromycin-resistant tissues were proliferated individually
to give rise to sets of clones corresponding to independent transformation events. Twenty-
nine histodifferentiated embryos and one regenerated plant of cultivar MG/BR46
Conquista, and nine adult fertile plants of cultivar IAS-5 were analyzed for the presence of
transgenes. Data obtained allowed us to calculate co-transformation efficiencies of 44%
and 50% for MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars, respectively. Seeds obtained from
transgenic co-transformed plants consistin a valuable genetic material to evaluate the
expression and the inheritance pattern of the foreign genes.
Index terms: co-transformation, particle bombardment, somatic embryogenesis, soybean,
selectable marker gene.
23
Introduction
During the last decades, the development of in vitro tissue culture techniques in
concert with advances in gene transfer technologies allowed the application of genetic
engineering to improve agronomic traits in crop plants, including soybean. Transgenic
soybean plants are produced using various DNA delivery methods and plant tissues,
including: 1) particle bombardment of shoot meristems (McCabe et al., 1988),
embryogenic suspension cultures (Finer & McMullen, 1991) and proliferative
embryogenic clusters (Droste et al., 2002); 2) Agrobacterium tumefaciens-mediated T-
DNA delivery into immature cotyledons (Parrott et al., 1989; Yan et al., 2000),
embryogenic suspension cultures (Trick & Finer, 1998), and axillary meristematic tissue
located in seedling cotyledonary-nodes (Hinchee et al., 1988; Olhoft et al., 2003).
Although the first production of fertile transgenic soybean plants has been reported about
15 years ago, current transformation protocols for soybean remain inefficient and limited
to a few cultivars. The ability to transform soybean using a straigthforward protocol with
high efficiency and high quality transgenic events is essential to impart a variety of genes
into the genome of this plant species to improve important agronomic traits.
Co-transformation is defined as the simultaneous introduction of multiple genes
followed by their integration into the cell genome. The genes are either present on the same
plasmid used in transformation (‘single-plasmid co-transformation’) or on separate
plasmids (‘multiple-plasmid co-transformation’). The main advantage of co-transformation
as a way to introduce multiple transgenes into a plant is that a single transformation event
can result in the integration of multiple transgenes as opposed to sequential transformation
which requires multiple, time-consuming transformation events (François et al., 2002). In
addition, co-transformation has been used as a system to generate marker-free transgenic
24
plants. This method is based on the principle that a proportion of transformed plants
carrying the selectable marker gene will also have integrated the transgene of interest at a
second, unlinked insertion site. Marker genes can subsequently be removed from such
plants by genetic segregation (Ebinuma et al., 2001; Scutt et al., 2002).
Every year fungal diseases cost millions of dollars due to crop damage despite the
extensive use of fungicides. Using transformation technology to strengthen host resistance
to these pathogens is not only a desirable but also an achievable objective. The most
widely used approach to enhance plant resistance against fungal pathogens has been to
overexpress hydrolytic enzymes (chitinases and glucanases), which belong to the group of
pathogenesis-related proteins (PR proteins; Punja, 2001). Here we report the efficient
soybean co-transformation via particle bombardment using two plasmids: one containing a
selectable marker gene and a second one harboring a chitinase (chit1) gene isolated from
Metarhizium anisopliae.
Material and methods
Plasmids used for soybean transformation
Plant transformation vectors used in this study were pGusHyg carrying the gusA
reporter gene and a hygromycin resistance gene (hpt) both driven by the Cauliflower
Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and nopaline synthase (nos) terminator, and
pMOG463chit1 harboring a fragment of 1.7 kb which contains the full cDNA for CHIT42
(chit1 gene) from Metarhizium anisopliae (Bogo et al., 1998). Both plasmids were used at
a final concentration of 1 μg μl
-1
.
25
Transformation procedure and selection of transformed tissues
Somatic embryogenic cultures of two soybean cultivars, MG/BR46 Conquista and
IAS-5, initiated and proliferated on solid 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)
containing medium (D20), as described in Droste et al. (2002), were used as target-tissues.
For the co-transformation of MG/BR46 Conquista embryogenic clusters (Experiment I), a
1:1 molar ratio of plasmids was used, while for IAS-5 embryogenic clusters (Experiment
II), the molar ratio was 4:1 (pMOG463chit1:pGusHyg). To precipitate DNA 5 μl of each
plasmid (Experiment I) and 4 μl of pMOG463chit1 and 1 μl of pGusHyg (Experiment II)
were added to 25 μl of 100 mg/ml
tungsten pellets (M10, Dupont, Wilmington, DE)
suspended in sterile distilled water. Next, 25 μl of 2.5 M CaCl
2
,
followed by 10 μl of 0.2 M
spermidine, were added to the suspension. After 5 min on ice, 50 μl of the supernatant
were removed. The pellet mixture was ressuspended using a bath sonicator (Model FS15,
Fisher Scientific Pittsburg, USA) immediately before using 2 μl for each bombardment.
Bombardments were performed using a Particle Inflow Gun – PIG (Finer et al.,
1992). Fifteen embryogenic clusters (about 50 mg tissue) were placed in each dish
containing D20 medium (Figure 1A). Twelve and 15 dishes were prepared for MG/BR46
Conquista and IAS-5 cultivars, respectively. Each dish was bombarded once. A sample of
randomly picked clusters from each dish was histochemically stained for GUS activity 48
hours after bombardment. The selection of transformed tissues was done on D20 medium
with 12.5 mg l
-1
hygromycin-B for 14 days, followed by three months culture on the same
medium containing 25 mg l
-1
hygromycin-B. After selection, pieces of green tissue were
subcultivated individually in dishes containing fresh D20 medium without antibiotic during
two additional months. Subcultures were performed every 14 days.
26
Embryo histodifferentiation and conversion into plants
To stimulate histodifferentiation, clusters of hygromycin-resistant embryogenic
tissues were transferred to modified MSM6 maturation medium (Finer & McMullen,
1991), containing MS salts, B5 vitamins, 6% sucrose, 0.3% Phytagel
TM
, pH 5.8. After 4
weeks, the embryos were individualized and transferred to fresh MSM6 medium for
further 4 weeks. Histodifferentiated embryos were subsequently placed on MSO
conversion medium, containing MS salts, B5 vitamins, 3% sucrose, 0.3% Phytagel
TM
, pH
5.8. Germinated embryos were individually transferred to glass pots containing the same
medium, aiming the regeneration of plants. Regenerated plantlets were transferred to
plastic cups covered with plastic films and containing vermiculite. Plantlets were gradually
exposed to ambient humidity and than transferred to 1 kg pots with organic soil and
maintained in a growth chamber.
Molecular analysis
Polymerase chain reactions (PCR) were performed using genomic DNA extracted
from samples of histodifferentiated embryos and leaf tissues of regenerated plants
according to the CTAB procedure of Doyle & Doyle (1987) with modifications. Each
reaction mixture (50 μl) consisted of 200 μM dNTPs, 2.5 U Taq DNA polymerase
(Biotools, 5 U μl
-1
), 1X Reaction Buffer with 2 mM MgCl
2
, 100 nM of each primer and
100 ng of each DNA sample. Reactions employed specific primers to the chit1 coding
region (MachitFor GGAGGGTGGACGTGGTCAC and MachitRev
GCTGCCCCCAATCCCTTG), to the hpt gene (HptFor
GCGATTGCTGATCCCCATGTGTAT and HptRev
GGTTTCCACTATCGGCGAGTACTT) and to the gusA gene (GusAFor
27
GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG and GusARev TGGATTCCGGCATAGTTAAAGG),
which amplified fragments of 750, 622 and 412 bp, respectively. Amplification reactions
were carried out in a termocycler (Thermo Hybaid) as follows: pre-cycling at 94°C for 5
min, followed by 30 cycles of 94°C for 45 s; 52°C for 45 s; and 72°C for 45 s, with a final
extension step of 2 min at 72°C. After electrophoresis in 1.5% agarose gel, PCR-generated
fragments were transferred overnight onto hybond N+ membranes (Amersham
Biosciences) using standard solutions and protocols (Sambrook & Russel, 2001). Probe
labeling, hybridization, stringency washes and detection were carried out as specified by
the ECL
TM
kit (Amersham Biosciences). DNA blottings were probed with 1.8 kb PCR
fragments corresponding to the E. coli hpt or gusA genes or with 750 bp PCR fragment of
pMOG463chit1 carrying the chit1 gene, purified from agarose gel by GFX kit (Amersham
Biosciences).
Results and Discussion
In order to evaluate the efficiency of co-transformation of soybean embryogenic
tissues via bombardment, two independent experiments were performed. In the first
experiment, embryogenic clusters of cultivar MG/BR46 Conquista were bombarded with
1:1 molar ration of the plasmids pGusHyg and pMOG463chit1. Since it has been
postulated that higher transformation frequencies can be obtained by increasing the amount
of the gene of interest in relation to the selectable marker gene (Bettany et al., 2002;
François et al., 2002), embryogenic tissues of IAS-5 cultivar were bombarded with a 1:4
(pGusHyg:pMOG463chit1) molar ratio in the second experiment. A high frequency of
GUS expression was observed in both experiments, which was demonstrated by blue
stained areas in almost all samples assayed (Figure 1B).
28
Selection of transgenic clones, maturation and conversion of transformed embryos
Three months after bombardment, hygromycin-resistant embryogenic soybean
tissues could be visually selected, counted and separately cultured for the establishment
and proliferation of individual clones, corresponding to independent transformation events,
in proliferation D20 medium without hygromycin.
Eight and seven proliferative sets of clones out of 52 and 59 independent pieces of
hygromycin-resistant tissues were established for MG/BR46 Conquista and IAS-5,
respectively (Table 1). Hygromycin-resistant embryo clusters were than transferred to
maturation medium. After 30 days on this medium, embryos from histodifferentiated
clusters (Figure 1C) were individualized. The individualized embryos were cultured for
further 30 days on the same medium. A total of 387 and 380 histodifferentiated somatic
embryos were obtained for MG/BR46 Conquista and IAS-5, respectively.
Histodifferentiated embryos exhibited diverse morphologies ranging from dicotyledoneous
embryos to highly abnormal types. The most common morphological classes were
embryos with fused or trumpet cotyledons (Figure 1D). These types are known to convert
to plants in low frequencies probably due to the absence of apical meristems (Suhasini et
al., 1996; Droste et al., 2002).
The histodifferentiated embryos were transferred to conversion medium. For
cultivar MG/BR46 Conquista, 12 plantlets were obtained, representing 3.1% of conversion,
calculated as the number of embryos converted into plantlets divided by the total number
of histodifferentiated embryos. For cultivar IAS-5, 42 plantlets were recovered,
corresponding to a conversion frequency of 11.0%. All plantlets were transferred to plastic
pots containing vermiculite and covered with plastic film (Figure 1E). They were gradually
exposed to ambient humidity. Two and 11 plants of MG/BR46 Conquista and IAS-5,
29
respectively, were transferred to larger pots with organic soil and maintained in the growth
chamber. One and nine plants of the above cultivars flowered and set seeds (Figure 1F).
The plants of cultivar IAS-5 were regenerated from four sets of clones, representing at
least four independent transformation events.
The plant conversion capacity of soybean tissues is highly dependent on the
genotype (Bailey et al., 1993; Santos et al., 1997; Droste et al., 2001). Cultivar IAS-5 is
already known to have a higher regeneration rate when compared to other soybean
cultivars (Santos et al., 1997; Droste et al., 2002). Although cultivar MG/BR46 Conquista
presented an excellent induction capacity, high proliferation potential and maturation of
embryos, it expressed a low rate of plant conversion. The results for MG/BR46 Conquista
confirm data recently obtained in other experiments performed in our laboratories (data not
shown).
Molecular analysis
Data obtained from molecular analysis are summarized in Table 2. We assumed
that embryos/plants derived from an independent piece of hygromycin-resistant
embryogenic tissue corresponded to an independent transformation event. However, the
molecular analysis showed that one piece of hygromycin-resistant tissue could contain at
least two independent transformation events. Therefore the events numbered as 2, 3 and 6
of MG/BR46 Conquista and 3 and 6 of IAS-5 were subdivided (2.1 and 2.2; 3.1 and 3.2
and so on). Nine and six independent transformation events were identified for cultivars
MG/BR46 Conquista and IAS-5, respectively. Twenty-nine histodifferentiated embryos
and one regenerated plant of cultivar MG/BR46 Conquista derived from nine independent
transformation events were screened for the presence of the fungal chit1 gene and for the
30
gusA gene by PCR. All samples and positive controls presented the expected 412 bp gusA
fragment (Table 2). This assay confirmed the stable transformation of embryos obtained in
the medium with hygromycin and that our selection system is very tight. The presence of
the expected 750 bp chit1 fragment was observed in DNA samples extracted from three
embryos.
PCR analyses of the nine adult fertile plants of IAS-5 derived from six independent
transformation events showed the presence of the expected 622 bp hpt fragment in all
plants (Figure 2A), and the presence of the 750 pb fragment corresponding to the chit1
gene in three of them (Figure 2B). Another fragment of smaller size, which is probably
related to an endogenous chitinase gene, was also amplified in all DNA samples.
In order to confirm the specificity of all fragments amplified by PCR, they were
transferred to a nylon membrane and hybridized with the specific probe for each gene.
Seven histodifferentiated embryos, derived from four independent transformation events of
MG/BR46 Conquista, and five adult fertile plants obtained from three transformation
events of IAS-5 (Table 2, Figure 2C) presented positive hybridization signals to the chit1
gene. Differences between PCR and hybridization results could be accounted to the higher
sensitivity of detection of the latter procedure.
The hybridization data allowed us to calculate the co-transformation efficiencies of
44% and 50% for cultivars MG/BR46 Conquista and IAS-5, respectively, calculated as the
number of co-transformation events divided by the total number of independent
transformation events. Co-transformation experiments utilizing genes carried by separate
plasmids indicated that those genes are often, but not always, inherited together and act as
linked genes (Campbell et al., 2000). The co-transformation via particle bombardment of
multiple transgenes present on separated plasmids has been employed successfully in a
31
number of plant species including French bean, maize, oat, soybean, rice and wheat, with
co-transformation efficiencies ranging from 18% to 88% (Campbell et al., 2000; Bettany et
al., 2002). The wide range of co-transformation efficiencies currently reported is likely due
to protocol differences in transformation, selection, or regeneration for individual
experiments.
The efficiencies recorded in the present work for cultivars MG/BR46 Conquista
(44%) and IAS-5 (50%) were higher than those reported for soybean by Christou et al.
(1990), who found co-transformation efficiencies around 25% for unlinked genes on
separate plasmids. These results were obtained for cell lines derived from protoplast
transformation experiments involving either electroporation or particle acceleration, as
well as to regenerated transgenic plants from experiments involving particle acceleration
into soybean meristems. As far as we know there are no studies utilizing soybean somatic
embryos for co-transformation via biolistic.
Despite the co-transformation success, the low rate of conversion of embryos into
plants for cultivar MG/BR46 Conquista represented a limiting factor to regenerate plants
expressing the chit1 gene. This result confirms that the response to transformation
procedure is genotype-specific (Trick et al., 1997).
Conclusion
This work clearly shows that transferring a gene of interest and a selectable marker
gene harbored into two separate plasmids can result in the successful co-integration of both
genes. In this study, nine plants of cultivar IAS-5 derived from six independent
transformation events were obtained. Plants representing three events of transformation
were shown to contain both hpt and chit1 genes. Although a similar co-transformation
32
efficiency was obtained for MG/BR46 Conquista, we were not able to regenerate adult co-
transformed plants of this cultivar. Additional analyses are required to further verify
transgene inheritance.
Acknowledgements
Research support was provided by Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Rio Grande do Sul (FAPERGS, Brazil) and Centro do Agronegócio-Casa Rural (RS,
Brazil).
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37
Table 1. Response of embryogenic clusters of two soybean cultivars following co-
transformation with plasmids pMOG463chit1 and pGusHyg and regeneration of transgenic
plants
Experiment MR BC HRT TE HE RP AP FAP
Conquista
1:1 180 52 8 387 12 2 1
IAS-5
4:1 225 59 7 380 42 11 9
Abbreviations: MR = Molar ratio; BC = Number of bombarded clusters; HRT = Number of hygromycin-
resistent tissues; TE = Number of transformation events; HE = Number of histodifferentiated embryos; RP =
Number of regenerated plantlets; AP = Number of recovered adult plants; FAP = Number of fertile adult
plants.
Table 2. Profile of transformed soybean plants derived from independent transformation
events, containing gusA/hpt and/or chit1 genes determined by hybridization analysis of
PCR products
Number of analyzed PCR analysis
Cultivar
Transformation
events
embryos plants gusA
+
/hpt
+
(1)
chit1
+
1 2 0 + -
2.1 4 0 + -
2.2 2 0 + +
3.1 2 0 + -
3.2 3 0 + +
4 1 0 + +
5 10 0 + -
6.1 4 1 + -
Conquista
6.2 1 0 + +
Total 9 29 1 9 4
3.1 na 2 + -
3.2 na 3 + +
4 na 1 + +
6.1 na 1 + +
6.2 na 1 + -
IAS-5
7 na 1 + -
Total 6 --- 9 6 3
(1)
DNA from embryos of cultivar MG/BR46 Conquista were probed with a 1.8 kb gusA fragment; DNA
from plants of cultivar IAS-5 were probed with 1.8 kb hpt fragment. Amplified DNAs were present (+) or
absent (-); na = not analyzed.
38
Figure 1. (A) Soybean somatic embryo clusters used as target tissues for bombardment
(bar = 2 mm); (B) Histochemical GUS expression two days post-bombardment (bar = 2
mm); (C) Histodifferentiated embryo cluster after one month on maturation medium (bar =
4 mm); (D) Individualized histodifferentiated embryos on conversion medium (bar = 5
mm), trumpet embryos are indicated by arrows; (E) Regenerated plantlet in a plastic pot
with vermiculite; (F) Transgenic adult plants.
40
Figure 2. (A and B) Agarose gel electrophoresis of PCR products obtained from the
amplification of DNA samples from transgenic and non-transgenic soybean plants and
embryos. Arrow is indicating fragments corresponding to the 622 bp hpt (A) and the 750
bp chit1 (B) gene fragments from IAS-5 transgenic plants (numbered according to the
transformation events). (+), positive controls: in (A) DNA from pGusHyg and in (B) DNA
from pMOG463chit1; E, external group: DNA from a transgenic soybean plant containg a
hpt gene; (-), negative control: reaction without DNA; the red arrow in (B) indicates the
amplification of the probably related endogenous chitinase gene; (C) Hybridization
analysis of PCR products of chit1 gene (as in B) probed with a 750 bp chit1 fragment.
DNAs with positive hybridization signal are indicated by arrow. W, DNA from a non-
transgenic IAS-5 plant.
42
Capítulo III
Discussão Geral
43
DISCUSSÃO GERAL
O objetivo do presente trabalho foi a introdução de um gene que codifica uma
quitinase de Metarhizium anisopliae, em soja, visando a obtenção de plantas com maior
resistência a moléstias fúngicas. A estratégia escolhida foi a co-transformação via
bombardemento utilizando os plasmídeos pMOG463chit1, contendo o gene de interesse e
pGusHyg, contendo o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, que confere resistência
ao antibiótico higromicina. Foram conduzidos dois experimentos envolvendo as cultivares
MG/BR46 Conquista (Experimento I) e IAS-5 (Experimento II). Em ambos os
experimentos foi seguido o protocolo estabelecido por Droste et al. (2002), variando
apenas as proporções dos plasmídeos utilizados. As proporções de
pGusHyg:pMOG463chit1 foram de 1:1 e 1:4 nos Experimentos I e II, respectivamente. A
alteração do protocolo no Experimento II foi baseada em estudos recentes que mostraram
um aumento na taxa de co-transformação com o aumento na proporção do plasmídeo
contendo o gene de interesse em relação ao plasmídeo contendo o gene marcador (Chen et
al., 1998; Bettany et al., 2002).
Foram obtidas freqüências de co-transformação semelhantes para MG/BR46
Conquista e IAS-5. Entretanto, não foi possível avaliar o efeito das diferentes proporções
de plasmídeos utilizadas uma vez que as cultivares foram testadas em experimentos
independentes e a resposta ao processo de transformação é genótipo-específica (Trick et
al., 1997; Droste et al., 2002; Wiebke, 2005; Silva, 2005). Futuros experimentos deverão
ser delineados para testar a eficiência da co-transformação de uma mesma cultivar, quando
são utilizadas diferentes proporções do plasmídeo que contém o gene de interesse em
relação àquela do plasmídeo com o gene marcador.
Os embriões histodiferenciados apresentaram diferentes morfologias, semelhantes
às descritas por Buchheim et al. (1989), Santos et al. (1997) e Droste et al. (2002). Embora
não tenha sido realizada a classificação morfológica dos embriões maduros, observou-se
que um grande número destes embriões apresentou a forma de trompete ou cotilédones
fusionados. Este fato explica, em parte, a baixa conversão dos embriões maduros em
plantas, o que também foi observado por Droste et al. (2002). Segundo Suhasini et al.
(1996), a ausência de meristema apical nestes tipos de embrião seria o motivo da baixa
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conversão. Este fato não é específico de embriões transformados, uma vez que o mesmo
foi observado em culturas de tecidos não transformados (Santos et al., 1997; Droste et al.,
2001).
Os resultados obtidos demonstraram que a cultivar MG/BR46 Conquista, apesar de
apresentar uma excelente capacidade de indução de embriões, alto potencial de
proliferação e maturação dos mesmos, demonstra uma baixa taxa de conversão em plantas.
Apesar do número de embriões histodiferenciados ter sido semelhante para as duas
cultivares (387 e 380 para MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente), apenas duas
plantas adultas da primeira cultivar foram regeneradas, enquanto 11 plantas adultas foram
obtidas para a segunda cultivar.
Em soja, tem sido demonstrado que a capacidade de conversão em plantas é
altamente dependente do genótipo (Bailey et al., 1993; Santos et al., 1997; Donaldson &
Simmonds, 2000; Droste et al., 2001; Meurer et al., 2001; Droste et al., 2002; Silva, 2005;
Wiebke, 2005). A baixa eficiência dos protocolos para regeneração de plantas in vitro é um
dos principais fatores limitantes para a obtenção de plantas transgênicas de soja. Embora as
taxas de conversão obtidas no presente trabalho (3 e 11 % para MG/BR46 Conquista e
IAS-5, respectivamente) pareçam, a primeira vista, muito baixas, valores semelhantes
foram obtidos em trabalhos prévios. Wiebke (2005), em estudo envolvendo a
transformação de embriões somáticos de soja utilizando o bombardeamento e
Agrobacterium de maneira integrada, registrou uma eficiência de conversão de 12%,
similar à obtida neste estudo para IAS-5.
O sucesso da co-transformação depende da eficiência na qual dois (ou mais)
transgenes independentes são transferidos para a célula da planta e intregrados em seu
genoma (= eficiência de co-transformação). Em termos de eficiência do processo, uma
ampla variação, de 10 a 90%, na eficiência de co-transformação tem sido registrada
quando é utilizado o sistema Agrobacterium (Ebinuma et al., 2001). Utilizando técnicas de
transferência direta, vários grupos registraram eficiências de co-transformação de 18 a 88%
(Campbell et al., 2000; Bettany et al., 2002). Em soja, uma eficiência de co-transformação
de aproximadamente 25% foi encontrada em experimentos envolvendo aceleração de
partículas ou eletroporação de protoplastos, bem como aceleração de partículas utilizando
meristemas como alvo (Christou et al., 1990). Os resultados obtidos no presente trabalho
permitem calcular uma taxa de co-transformação de 44% para a cultivar MG/BR46
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Conquista e de 50% para a IAS-5. Não é possível a comparação direta dos nossos
resultados com os registrados por Christou et al. (1990), uma vez que há diferenças nos
métodos de transformação e/ou no tecido-alvo utilizado. Não encontramos na literatura
trabalhos de soja utilizando embriões somáticos como alvo para estudos de co-
transformação, via biolística, tratando-se este, portanto, do primeiro trabalho a descrever
tal procedimento e resultados.
A escolha da estratégia de co-transformação foi baseada na possibilidade de
obtenção de plantas livres de genes de seleção na progênie resultante de cruzamento sexual
das plantas geneticamente transformadas. Em muitos trabalhos, tem sido verificada a
integração dos dois ou mais transgenes no mesmo lócus, mas há registros de integração em
lócus separados no genoma da planta (Campbell et al., 2000; François et al., 2002; Miki &
Mchugh, 2004). Em experimentos de co-transformação de feijão via bombardeamento,
Aragão et al. (1996) obtiveram 50% da integração dos transgenes em lócus separados.
As próximas etapas do presente estudo deverão incluir análises da segregação dos
transgenes na geração T1 das plantas co-transformadas, bem como da expressão do
transgene de interesse (chit1). O padrão de segregação permitirá verificar se os transgenes
foram integrados num mesmo lócus, ou em lócus independentes. Havendo a expressão do
gene de interesse, as plantas serão desafiadas com fitopatógenos importantes para a cultura
da soja visando avaliar sua resistência e/ou suscetibilidade à infecção. O primeiro patógeno
a ser testado será o fungo Rhizoctonia solani, uma vez que plantas de tabaco expressando
este mesmo gene chit1 apresentaram consistente resistência a este fungo (Kern, 2003).
46
Capítulo IV
Referências Bibliográfica dos Capítulos I e III
47
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