( PDF ) Extração de pesticidas em amostras de tomate pelas técnicas: extração sólido-líquido e purificação em baixa temperatura (ESL-PBT) e dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) para análise

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GEVANY PAULINO DE PINHO

EXTRAÇÃO DE PESTICIDAS EM AMOSTRAS DE TOMATE PELAS

TÉCNICAS: EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO E PURIFICAÇÃO EM BAIXA

TEMPERATURA (ESL-PBT) E DISPERSÃO DA MATRIZ EM FASE SÓLIDA

(DMFS) PARA ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa, como

parte das exigências do Programa de

Pós-Graduação em Agroquímica, para

obtenção do título de Magister Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL

2007

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GEVANY PAULINO DE PINHO

EXTRAÇÃO DE PESTICIDAS EM AMOSTRAS DE TOMATE PELAS

TÉCNICAS: EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO E PURIFICAÇÃO EM BAIXA

TEMPERATURA (ESL-PBT) E DISPERSÃO DA MATRIZ EM FASE SÓLIDA

(DMFS) PARA ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa, como

parte das exigências do Programa de

Pós-Graduação em Agroquímica, para

obtenção do título de Magister Scientiae.

APROVADA: 16 de fevereiro de 2007.

________________________

Prof. Fernando Barboza Egreja Filho

__________________________

Prof. Carlos Roberto Bellato

_________________________

Prof

. Maria Eliana L. R. de Queiroz

(Co-orientadora)

___________________________

Prof. César Reis

(Co-orientador)

________________________

Prof. Antônio Augusto Neves

(Orientador)

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, que em todos os momentos me fez sentir a sua

presença. E por tudo que Ele tem me proporcionado e em especial pelo que

não sou capaz de reconhecer.

À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Química, pela

oportunidade de desenvolvimento deste trabalho de pesquisa.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), pela concessão da bolsa de estudo.

Ao professor Antônio Augusto Neves, por sua orientação e atenção em

todos os momentos e pela confiança demonstrada ao longo deste trabalho.

À professora Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz pelo carinho e apoio

durante todo o desenvolvimento do trabalho de pesquisa.

Aos colegas de laboratório de Química Analítica (LAQUA) pela paciência

demonstrada, e que direta ou indiretamente, contribuíram de forma positiva

para a realização deste trabalho.

À minha família que apesar de distante sempre esteve presente em

todos os momentos.

iii

E ao Flaviano, que sempre procurou entender a minha necessidade de

dedicação ao mestrado, e contribuiu de forma significativa com a sua

experiência para a realização deste trabalho com paciência, carinho e atenção.

BIOGRAFIA

GEVANY PAULINO DE PINHO, filha de Joaquim Brant de Pinho e

Zenity Maria Paulino Brant, nasceu em Francisco Sá, Minas Gerais, em 19 de

outubro de 1980.

Em abril de 2001, iniciou o Curso de Graduação em Química pela

Universidade Federal de Viçosa, diplomando-se como licenciada em janeiro de

2005. Em fevereiro deste mesmo ano, iniciou o curso de pós-graduação em

Agroquímica, em nível de mestrado, na Universidade Federal de Viçosa,

submetendo-se à defesa de tese em fevereiro de 2007.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................. viii

RESUMO................................................................................................................ix

ABSTRACT............................................................................................................ xii

INTRODUÇÃO.........................................................................................................1

CAPÍTULO 1.........................................................................................................14

1.1. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................14

1.1.1. Preparo de soluções padrão de pesticidas .................................................14

1.1.2. Preparo de amostras de tomates hidropônicos fortificadas .........................15

1.1.3. Otimização da técnica de extração sólido-líquido e purificação em baixa

temperatura (ESL-PBT) .........................................................................................15

1.1.3.1. Planejamento de misturas.........................................................................15

1.1.3.2. Otimizações univariadas...........................................................................18

1.1.3.2.1. Efeito do sistema de agitação da ESL-PBT na porcentagem de

extração dos pesticidas em tomate........................................................................19

1.1.3.2.2. Efeito da força iônica na porcentagem de extração dos pesticidas em

tomate pela ESL-PBT ............................................................................................19

1.1.3.2.3. Avaliação do efeito de matriz na porcentagem de recuperação dos

pesticidas...............................................................................................................19

1.1.3.2.3.1. Superposição de matriz ......................................................................20

1.1.3.2.3.2. Variação da resposta do detector .......................................................20

1.1.3.2.4. Eficiência de adsorventes no clean up dos extratos obtidos na ESL-

PBT de amostras de tomate ..................................................................................20

1.1.4. Análise cromatográfica.................................................................................21

1.1.4.1. Curva analítica (método da padronização interna) ...................................22

1.1.4.2. Método otimizado da ESL-PBT e análise por cromatografia gasosa de

quatro pesticidas em tomate..................................................................................22

1.1.5. Validação do método analítico.....................................................................22

1.1.5.1. Seletividade ..............................................................................................23

1.1.5.2. Limite de detecção e quantificação...........................................................23

1.1.5.3. Linearidade de resposta do detector.........................................................23

1.1.5.4. Precisão....................................................................................................24

1.1.5.5. Exatidão....................................................................................................24

1.1..6. Determinação dos pesticidas em amostras reais de tomates.....................24

1.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................26

1.2.1. Análise cromatográfica.................................................................................26

1.2.2. Otimização da técnica de extração sólido-líquido e purificação em baixa

temperatura (ESL-PBT) .........................................................................................28

1.2.2.1. Planejamento de misturas.........................................................................28

1.2.2.2. Efeito do sistema de agitação da ESL-PBT na porcentagem de

extração dos pesticidas em tomate........................................................................35

1.2.2.3. Efeito da força iônica na porcentagem de extração dos pesticidas em

amostras de tomate...............................................................................................37

1.2.2.4. Avaliação do efeito de matriz na porcentagem de recuperação dos

pesticidas...............................................................................................................38

1.2.2.5. Eficiência de adsorventes no clean up dos extratos obtidos na ESL-

PBT de amostras de tomate ..................................................................................44

1.2.3. Metodologia otimizada.................................................................................48

1.2.4. Validação do método analítico.....................................................................49

1.2.4.1. Seletividade ..............................................................................................49

1.2.4.2. Limite de detecção e limite de quantificação.............................................50

1.2.4.3. Curvas analíticas e linearidade de resposta do detector ..........................52

1.2.4.4. Precisão....................................................................................................53

1.2.4.5. Exatidão....................................................................................................54

vii

1.2.5. Determinação dos pesticidas clorpirifós, λ-cialotrina, cipermetrina e

deltametrina em amostras comerciais de tomate...................................................56

CAPÍTULO 2..........................................................................................................57

2.1. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................57

2.1.1. Preparo de soluções padrão de pesticidas..................................................57

2.1.2. Preparo de amostras de tomates hidropônicos fortificados .........................58

2.1.3. Otimização da técnica de extração Dispersão da Matriz em Fase Sólida

(DMFS) ..................................................................................................................58

2.1.3.1. Extração dos pesticidas em tomate por DMFS – Técnica geral................58

2.1.3.2. Avaliação do adsorvente e eluente para a técnica de extração DMFS.....59

2.1.3.3. Planejamento Fatorial...............................................................................60

2.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................62

2.2.1. Avaliação de adsorventes e eluentes para a técnica de extração DMFS ....62

2.2.2. Planejamento Fatorial..................................................................................68

2.2.3. Metodologia otimizada.................................................................................72

2.3. Comparação das técnicas de ESL-PBT e DMFS............................................73

CONCLUSÕES......................................................................................................75

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................76

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

C-18 Octadecil

C-8 Octil

CG Cromatografia gasosa

CV Coeficiente de variação

DCE Detector por captura de elétrons

DIC Detector por ionização em chama

DMFS Dispersão da matriz em fase sólida

ESL-PBT Extração sólido-líquido e purificação em baixa temperatura

INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade

Industrial

LD Limite de detecção

LMR Limite máximo de resíduo

LQ Limite de quantificação

RESUMO

PINHO, Gevany Paulino, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de

2007. Extração de pesticidas em amostras de tomate pelas técnicas:

extração sólido-líquido e purificação em baixa temperatura (ESL-PBT) e

dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) para análise por

cromatografia gasosa. Orientador: Antônio Augusto Neves. Co-

orientadores: Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz e César Reis.

Procurou-se neste trabalho otimizar e validar a técnica de extração

sólido líquido e purificação a baixa temperatura (ESL-PBT) e otimizar a técnica

dispersão de matriz em fase sólida dos pesticidas: clorpirifós, λ-cialotrina,

cipermetrina e deltametrina em amostras de tomate. A composição da mistura

extratora utilizada na ESL-PBT foi otimizada realizando um planejamento

experimental de misturas de três componentes, com o objetivo de avaliar a taxa

de recuperação dos princípios ativos a partir das modificações da polaridade da

mistura extratora. Essas misturas de solventes, em fase única, foram

adicionadas às amostras de tomate previamente fortificadas, homogeneizadas

e deixadas no freezer por 12 horas. Depois de separadas as fases pelo

congelamento da fase aquosa, os líquidos sobrenadante foram separados e

submetidos à análise cromatográfica. Foi avaliado também o clean up dos

extratos utilizando os adsorventes florisil, sílica, C-18 e carvão ativado. A

quantificação dos pesticidas foi feita em cromatógrafo a gás com detector por

captura de elétrons, usando como padrão interno a bifentrina. A mistura

extratora, acetonitrila (80%), acetato de etila (15%) e água (5%), proporcionou

a melhor taxa de recuperação para todos os pesticidas (acima de 80%), e a

análise da superfície de resposta indicou que a extração dos pesticidas é

favorecida pela adição de acetato de etila, principalmente para os piretróides

cipermetrina e deltametrina. Estes pesticidas também são os que apresentaram

maior efeito de matriz na análise cromatográfica. Quando foram preparadas as

soluções padrões no extrato da matriz (branco), a taxa de recuperação de

todos os pesticidas diminuiu para cerca de 70%. As otimizações univariadas

mostraram: que a homogeneização da amostra de tomate com a mistura

extratora deve ser realizada em banho ultra-sônico por 1 minuto; que o

aumento da força iônica do meio não interfere na extração dos pesticidas e que

o clean up dos extratos remove significativamente os pigmentos quando 10 mg

de carvão ativo são adicionados à mistura extratora, obtendo uma taxa de

recuperação dos piretróides acima de 70%. Entretanto, esta etapa de clean up

é desfavorável para o clorpirifós. A técnica otimizada foi validada, determinando

as principais figuras de mérito, tais como: seletividade, limites de detecção e de

quantificação, linearidade, precisão e exatidão. Os resultados indicam que o

método de ESL-PBT é eficiente para a extração dos quatro pesticidas em

amostras de tomate, possibilitando a determinação destes compostos em

níveis menores que os limites máximos de resíduos estabelecidos pela

ANVISA. Na técnica dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) pequena

quantidade de amostra de tomate foi triturada com um adsorvente, sendo a

mistura transferida para uma coluna e eluída com um solvente apropriado.

Foram avaliados os adsorventes C-8, C-18, florisil e sílica como dispersantes

da amostra, e o acetato de etila e a mistura hexano: acetona (9:1) como os

eluentes. O florisil combinado com o acetato de etila proporcionou as melhores

porcentagens de extração e pureza satisfatória dos extratos. Assim, foi

executado um planejamento fatorial 2

para avaliar quantitativamente o efeito

de três fatores: proporção de adsorvente / amostra (1:1 e 2:1), co-coluna (sem

e com co-coluna) e banho ultra-sônico (sem e com banho ultra-sônico) na

porcentagem de extração dos pesticidas. Pelos resultados, a presença da co-

coluna apresentou um efeito negativo na extração do clorpirifós, embora

qualitativamente proporcionasse extratos mais limpos. A utilização do banho

ultra-sônico aumentou significativamente a extração dos pesticidas clorpirifós,

λ-cialotrina e cipermetrina. Observou-se efeito de interação apenas entre os

fatores proporção de adsorvente: amostra e auxílio do banho ultra-sônico, em

que a porcentagem de extração do clorpirifós e cipermetrina aumentou

significativamente em 6,62% e 8,08%, respectivamente. Comparando-se as

técnicas de extração ESL-PBT e DMFS, ambas apresentaram taxa de

recuperação semelhante para os pesticidas, exceto para o clorpirifós em que a

ESL-PBT apresentou resultado mais satisfatório. Além disso, os extratos

obtidos na ESL-PBT são menos susceptíveis à presença de interferentes e a

técnica apresenta menor custo.

xii

ABSTRACT

PINHO, Gevany Paulino, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, february

2007. Pesticide extraction in tomato samples by techniques: liquid–solid

extraction and low-temperature purification (LSE-LTP) and matrix solid-

phase dispersion (MSPD) and analysis by gas chromatography. Adviser:

Antônio Augusto Neves. Co-advisers: Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz

and César Reis.

The objective of this work was to optimize and validate the liquid–solid

extraction and low-temperature purification (LSE-LTP) methods and optimize

the matrix solid-phase dispersion (MSPD) method for the extraction of the

pesticides Chlorpyrifos, λ-cyhalothrin, cypermethrin and deltamethrin in tomato

samples. The composition of the extractive mixture used in LSE-LTP was

optimized by carrying out an experimental planning of three-component

mixtures to evaluate the recovery rate for the active principles starting from the

changes in the polarity of the extractive mixture. These one-phase solvent

mixtures were added to the tomato samples, homogenized and left in a freezer

by 12 hours. After separating the phases by freezing the aqueous phase, the

supernatant liquid was removed and chromatographically analyzed. The

cleanup of these extracts was also evaluated using the adsorbents Florisil,

silica, C-18 and activated charcoal. Pesticide quantification was carried out in a

gas chromatograph with electron capture detector, using bifentrin as internal

xiii

standard. The extractive mixture, acetonitrile (80%), ethyl acetate (15%) and

water (5%), provided the highest recovery rate for all the pesticides (above

80%), and the surface response analysis indicated that pesticide extraction is

improved by the addition of ethyl acetate, particularly for the pyrethroids

cypermethrin and deltamethrin. These pesticides have also shown larger matrix

effect on the chromatographic analysis. When the standard solutions were

prepared in blank matrix extract, the recovery rate of all the pesticides

decreased in approximately 70%. The univariate optimizations showed that the

homogenization of the tomato sample with the extractive mixture should be

performed in ultrasonic bath for 1 minute; that the increase of the medium ionic

force does not interfere in pesticide extraction; and that extract cleaning up

significantly removes pigments when 10 mg of active charcoal is added to the

extractive mixture, obtaining pyrethroid recovery rate above 70%. However, this

cleanup stage was unsuitable for Chlorpyrifos. The optimized technique was

validated by determining the main parameters such as selectivity, limits of

detection, quantification, linearity, precision and accuracy. The results indicate

that the LSE-LTP method is efficient for extracting the four pesticides in tomato

samples, allowing the determination of these compounds at levels lower than

the established as maximum residue limits by ANVISA. In the matrix solid

phase dispersion technique, a small amount of tomato sample was crushed with

an adsorbent, then the mixture was transferred to a column and eluted with

appropriate solvent. The adsorbents C-8, C-18, Florisil and silica were

evaluated as dispersants of the sample, and ethyl acetate and the mixture

hexane:acetone (9:1) as eluents. Florisil in combination with ethyl acetate gave

the best percentages of extraction and satisfactory extract purity. Thus, a 2

factorial arrangement was carried out to evaluate quantitatively the effect of

three factors: adsorbent proportion/sample (1:1 and 2:1), co-column (with and

without co-column) and ultrasonic bath (with and without ultrasonic bath) on the

percentage of pesticide extraction. The use of co-column caused a negative

effect on Chlorpyrifos extraction, although it provided qualitatively much cleaner

chromatograms. Ultrasonic bath increased significantly the extraction of the

pesticides Chlorpyrifos, λ-cyhalothrin, and cypermethrin, not interfering in the

extraction of deltamethrin. There was interaction effect only between the factors

adsorbent proportion: sample and ultrasonic bath, with the percentage of

extraction of Chlorpyrifos and cypermethrin increasing significantly by 6.62%

xiv

and 8.08% respectively. The comparison between the LSE-LTP and MSPD

techniques showed that both presented similar recovery rate for the pesticides,

except for the Chlorpyrifos that had better result with LSE-LTP. In addition, the

extracts obtained by LSE-LTP are less susceptible to the presence of

interferents and it is a less costly technique.

INTRODUÇÃO

Pesticidas e o meio ambiente

A utilização de produtos químicos para controlar pragas, doenças e

ervas daninhas possibilitaram ao ser humano aumentar a produção de

alimentos em quantidade e qualidade. Estes produtos denominados pesticidas,

praguicidas, agroquímicos, etc, foram por muito tempo utilizado de forma

indiscriminada, até surgirem algumas preocupações com os impactos

ambientais causados pelo seu uso inadequado (BARBOSA, 2004). Como por

exemplo, o acúmulo de agrotóxicos no solo levando à contaminação de lençóis

freáticos e de águas superficiais, tornando-as inadequadas para o consumo

humano (RIBEIRO et al, 2007).

Além disso, vale destacar que os pesticidas com características mais

lipofílicas podem se acumular nos tecidos adiposos de animais, contaminando

toda a cadeia alimentar, (D´AMATO et al, 2002), interferindo diretamente na

saúde humana, e na sobrevivência de alguns animais, através de

desequilíbrios ecológicos. Isto tem gerado uma preocupação e existe uma

tendência mundial de se empregar todos os recursos para se encontrar

compostos mais específicos, e que sejam menos tóxicos e persistentes no

ambiente (SANTOS, 2002).

Na busca de se eliminar estes problemas, os ambientalistas assumiram

a defesa de uma agricultura sem a utilização de pesticidas. Entretanto, sabe-se

que culturas livres de pesticidas geram colheitas com menor rendimento, o que

conduz a maiores áreas de cultivo para se obter a mesma quantidade de

alimentos, colocando em riscos novos ecossistemas (SANTOS, 2002). Por

isso, os agroquímicos sintéticos continuam sendo as alternativas mais eficazes

no controle de pragas.

Neste sentido, o monitoramento detalhado dos resíduos de agrotóxicos

no meio ambiente é de fundamental importância, principalmente para

assegurar a qualidade dos alimentos que chegam até o consumidor.

No Brasil, o controle de resíduos de agrotóxicos em alimentos começou

a se desenvolver isoladamente a partir da década de 1970, com o primeiro

laboratório de análise de resíduos, trabalhando na determinação de

organoclorados em leite, estendendo suas atividades também para análise de

pesticidas em carne bovina, devido às exigências nas exportações. Entretanto,

as dificuldades de manter um laboratório de análise de pesticidas, motivaram a

criação de Encontros Nacionais de Analistas de Resíduos de Pesticidas para

discutir o mau uso dos pesticidas e difundir a necessidade de se fazer a análise

destes.

Em 1980, foi criado o Grupo de Análise de Resíduos de Pesticidas

(GARP) que se fortaleceu transformando em uma Associação Grupo de

Análise de Pesticidas (AGARP) com competência para resolver problemas de

aquisições de padrão analítico puro, exigir maior qualidade dos solventes para

análise de pesticidas, padronização de metodologia analítica, etc. (LARA &

BATISTA, 1992).

No entanto, somente nos últimos anos, com os avanços científicos e

uma política responsável permitiu uma melhor avaliação da qualidade dos

alimentos consumidos em relação à presença de agrotóxicos (ANVISA, 2006).

Em 2001, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária do Ministério da

Saúde (ANVISA), implantou um Programa de Análise de Resíduos de

Agrotóxicos em Alimentos (PARA) com a participação de vários estados

brasileiros e laboratórios de análise de resíduos de agrotóxicos.

A criação deste programa tem como objetivo o monitoramento dos

principais pesticidas encontrados em frutas, verduras, hortaliças e outros

alimentos. Dentro do quadro de alimentos investigados, destaca-se o tomate

por ser um fruto muito consumido no Brasil, e por exigir em sua cultura uma

ampla variedade de pesticidas.

Cultura do tomate

Hortaliça de maior comercialização no país e muito apreciada pelo seu

elevado valor nutritivo, o tomate é rico em vitamina A e C, fosfato e potássio,

além de apresentar cerca de 95% de água em sua composição (SARAIVA,

2004).

O cultivo convencional de tomate exige grande quantidade e variedade

de adubos químicos e de defensivos agrícolas (inseticidas, acaricidas,

fungicidas, etc), sendo que este último representa aproximadamente 17% do

custo da produção (PENTEADO, 2004). Conseqüentemente, o uso dos

pesticidas no tomateiro pode provocar contaminações do solo, águas e dos

próprios frutos. Além disso, pode provocar desequilíbrios ecológicos, por

eliminar ou diminuir a eficiência dos inimigos naturais das pragas, podendo

resultar em surgimento de novas pragas, mais resistentes e persistentes para a

cultura (SARAIVA, 2004).

A contaminação dos frutos de tomates se dá predominantemente por

resíduos de agrotóxicos que podem persistir como camadas superficiais

depositadas no fruto. Alguns pesticidas podem penetrar na superfície do fruto,

dissolver-se e mover-se para o interior, incorporando à polpa. FREITAS (1992)

afirma que a lavagem convencional de um alimento (com água de torneira) não

provoca redução significativa nos níveis residuais dos frutos. Entretanto, lavar o

tomate com solução de NaCl a 10% reduz significativamente pesticidas do fruto

(cerca de 85%). Esta redução é também observada quando a pele do tomate é

removida (ABOU-ARAB, 1999).

A presença de pesticidas em tomates é mais freqüente por causa das

sucessivas aplicações semanais, o que aumenta a quantidade de resíduos nos

frutos. Outro fator agravante é a baixa degradação de alguns pesticidas, como

por exemplo, a presença de resíduos de piretróides em tomate descrito por

CABRAS et al (1985) e por FREITAS (1992) em relação ao organofosforado

metamidofós.

A persistência dos pesticidas no fruto do tomate é fortemente

influenciada pela umidade, temperatura, características físico-químicas do

pesticida, etc. Para minimizar impactos ambientais causados pela aplicação de

pesticidas, deve haver orientação técnica e agronômica durante a aplicação,

com relação à dosagem necessária, à época e às condições climáticas

favoráveis (chuvas, velocidade e direção do vento, etc.) para evitar a

contaminação do alimento.

Piretróides

Desde a introdução dos piretróides no mercado dos agrotóxicos, em

1973, estes análogos das piretrinas, têm sido amplamente usados como

inseticidas na agricultura, na horticultura, em tratamentos domissanitários, etc.

Conseqüentemente, os piretróides podem ser encontrados como resíduos em

solos, águas, alimentos, etc. (HIRATA, 1995; KASCHERES & CUNHA, 1989).

Os piretróides são muito utilizados, pois são bastante eficientes no

controle das pragas, estáveis e pouco tóxicos ao meio ambiente

quando

comparados às piretrinas, constituinte químico do piretro que possui atividade

inseticida (SODERLUND et al, 2002). Normalmente, a aplicação dos piretróides

é realizada na parte foliar das culturas, mas também podem ser utilizados em

produtos ensacados e armazenados (ANVISA, 2006). Dentre os piretróides

mais utilizados destaca-se a deltametrina, cipermetrina e a

-cialotrina, cujas

fórmulas estruturais estão representadas na Figura 1.

CNO

deltametrina

CNO

cipermetrina

CNO

-cialotina

Figura 1 – Principais piretróides utilizados em culturas de tomate.

As propriedades físicas destes pesticidas bem como o limite máximo de

resíduo (LMR) estabelecido pela ANVISA estão na Tabela 1.

Tabela 1 – Propriedades físicas dos piretróides deltametrina, cipermetrina e λ-

cialotrina e os LMR em tomate

Piretróides

massa molar / g

mol

-1

solubilidade em água/

mg L

-1

(20 °C)

LMR / mg kg

-1

de tomate

deltametrina 505 0,0002 0,03

cipermetrina 416 0,004 0,1

λ-cialotrina

449,5 0,004 0,05

Na produção de tomate, a cipermetrina é recomendada para controle de

insetos Tripes, já a deltametrina e a

-cialotina são freqüentemente utilizadas

como estressantes para desalojar as lagartas Tuta Absoluta do tomate. Os

piretróides de maneira geral são utilizados também no controle dos insetos de

Broca-pequena-do-fruto, Broca-grande-do-fruto, Lagartas, Grilos, etc.

(SARAIVA, 2004).

Os piretróides têm ação neurotóxica atuando na transmissão do impulso

nervoso. Segundo SODERLUND et al (2002) o modo de ação desta classe de

inseticidas é semelhante ao dos organoclorados ciclodienos. Isto é, atuam na

transmissão axônica, interferindo no fluxo normal dos íons sódios envolvidos na

transmissão do impulso nervoso.

Organofosforados

Na década de 1940, os organofosforados foram introduzidos no mercado

de pesticidas, sendo usado como inseticidas, acaricidas, nematicidas e

fungicidas. Devido a sua alta eficácia no controle de uma ampla variedade de

pragas estes compostos são os preferidos nas lavouras, possibilitando

encontrar resíduos e subprodutos em níveis nocivos ao consumo humano

(SILVA et al, 1999; SILVA et al, 2006).

Em relação aos agrotóxicos clorados os organofosforados são mais

tóxicos (em termos de toxidade aguda), porém proporcionam menos danos ao

meio ambiente por não serem bioacumuladores (WESSELING et al, 2005).

Eles podem ser absorvidos por diversas rotas, incluindo inalação, ingestão e

absorção dérmica. Atuam inibindo a ação da enzima acetilcolinesterase na

transmissão dos impulsos nervosos. Estes compostos são conhecidos por

induzirem ou agravarem certos problemas de saúde em seres humanos (EPA,

2006; SILVA et al, 2006). Como pode ser verificado no trabalho realizado por

RUSSO et al (2002), que encontrou organofosforados em tecidos humanos de

rins, fígado e tecido adiposo de pacientes saudáveis e afetados por câncer, os

quais foram quantificados em níveis de ng de pesticidas por grama de tecido.

Os organofosforados representam o grupo químico de agrotóxicos

formado por apenas ésteres de ácido fosfórico e outros ácidos à base de

fósforo. Dentre esta classe destaca-se o clorpirifós (Figura 2), com modo de

ação de contato, ingestão e fumigação.

ClCl

Cl OP(OCH

)

Figura 2 - Estrutura do clorpirifós.

A preocupação com a presença de clorpirifós em alimentos tem

motivado a realização de vários trabalhos, como por exemplo, o estudo de

clorpirifós em casca e polpa de pepino (FERST, 1991), em diversos vegetais

(VIANA et al, 1996), tomates (GOBO, 2001), em alface (PENA et al, 2003).

Destaca-se o estudo de CELLA (2002) que detectou clorpirifós em maçãs,

acima do limite máximo de resíduo permitido para amostras comerciais.

O clorpirifós é um sólido cristalino de massa molar 350,5 g mol

-1

, com

ponto de fusão de aproximadamente 43 ºC, que apresenta baixa solubilidade

em água (1,4 mg L

-1

a 25 ºC) (NRA, 2002). Em culturas de tomate, o clorpirifós

é utilizado principalmente no controle das lagartas Broca-pequena-do-fruto,

Broca-grande-do-fruto e lagarta-rosca (SARAIVA, 2004). O limite máximo

permitido para seus resíduos no tomate para fins industriais é 0,5 mg kg

-1

. Fato

interessante, é que a ANVISA não autoriza a aplicação deste inseticida em

culturas de tomate para consumo humano in natura.

Análises de pesticidas

Diversos métodos de análise são empregados na identificação e

quantificação de pesticidas em alimentos. Em geral, exigem uma técnica de

extração do analito, clean up dos extratos, ou pré-concentração dos compostos

antes da análise.

A técnica de extração mais freqüentemente usada é a Extração Líquido-

Líquido. Entretanto, é um método tedioso, de elevado custo, de difícil

automação e que consome grande quantidade de solventes orgânicos

(LANÇAS, 2004).

A Extração com Fluído Supercrítico (LEHOTAY, 1997) e a Extração em

Fase Sólida (LANÇAS, 2004; TORRES et al, 1997) são técnicas mais rápidas,

que utilizam menores quantidades de solventes orgânicos, e permitem analisar

matrizes com baixa concentração dos analitos, com maior sensibilidade de

detecção. Outra técnica muito divulgada em trabalhos científicos é a Extração

Sólido-Líquido, porém com elevado consumo de solventes orgânicos e

amostra, além da co-extração de um grande número de interferentes da matriz

(NAVARRO et al, 2002).

Técnicas como Microextração em Fase Sólida (FYTIANOS et al, 2006) e

Extração assistida por microonda (PAPADAKIS et al, 2006) estão sendo

aprimoradas para a extração de pesticidas em alimentos. Neste cenário, a

Dispersão da Matriz em Fase Sólida (DMFS) e Extração Sólido-Líquido e

Purificação em Baixa temperatura (ESL-PBT) tem revelado bons resultados na

extração de pesticidas em matrizes sólidas, devido à possibilidade de se

realizar em um único passo a extração de pesticidas e o clean up dos extratos.

A cromatografia gasosa (CG) é o método de análise mais empregado

devido à eficiência na separação e quantificação das espécies de interesse

presentes nos extratos, utilizando detector por captura de elétrons (DCE),

adequado para análise de compostos halogenados, ionização de chama (DIC)

ou espectrômetro de massas (EM) (COLLINS et al, 2006). Sendo este último

muito utilizado para a confirmação dos pesticidas, pois fornece informações

estruturais baseada na fragmentação dos compostos.

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector

ultravioleta é muito útil na quantificação de pesticidas não volatilizáveis.

Análises espectrofotométricas são mais úteis para quantificação de

ditiocarbamatos devido à geração de CS

após digestão ácida.

Dispersão da Matriz em Fase Sólida (DMFS)

Esta técnica foi desenvolvida por BARKER, em 1989, para extrair

compostos de amostras sólidas e semi-sólidas, como tecidos de animais, pois

a extração em fase sólida não se estendia para estas matrizes (BARKER,

2000a). O primeiro trabalho aplicando está técnica em análise de pesticidas em

alimentos foi reportada por LING & HUANG (1995), que detectaram piretróides

em vários vegetais.

A principal vantagem desta técnica é a simplicidade do método, baixo

consumo de amostra e reagentes, processos de extração e clean up da

amostra realizados simultaneamente (ALBERO et al, 2003). A DMFS consiste

em homogeneizar pequena quantidade do alimento com um adsorvente (sílica,

florisil, C-18

etc) em proporções de 1:1 a 1:4 (amostra: adsorvente). Em

seguida, a mistura (matriz e adsorvente) é transferida para uma coluna e eluída

com solvente apropriado. O extrato recolhido é concentrado e analisado por

cromatografia gasosa (LANÇAS, 2004; BARKER, 2000a e b).

Na Tabela 2 estão descritos alguns trabalhos mais recentes utilizando a

DMFS em análise de pesticidas e poluentes orgânicos em diversas matrizes.

Tabela 2 – Recentes trabalhos empregando a DMFS

Pesticidas Matriz Eluente Adsorvente Referência

Fungicidas Frutas e

vegetais

Acetato de etila C-18 NAVARRO et al, 2002.

Organofosforados

e organoclorados

Folha do

maracujá

Hexano:

acetato de etila

Florisil ZUIN et al, 2003.

HPA*

Peixe Acetonitrila C-18 PENSADO, 2005.

Herbicidas Óleo de oliva

Acetonitrila Aminopropil FERRER et al, 2005.

266 Pesticidas Maçã Hexano:

diclorometano

Terra de

diatomáceas

CHU et al, 2005.

*Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

Extração Sólido-Líquido e Purificação em Baixa Temperatura (ESL-PBT)

A partição por abaixamento da temperatura foi usada no passado para

isolar pesticidas em plantas e tecidos animais (ANGLIN & MCKINLEY, 1960).

Entretanto, a temperatura usada para tal separação era muito baixa (-78 °C),

impedindo a utilização da técnica. Em 1997, JUHLER ajustou a temperatura em

-10 °C para extrair organofosforados em matrizes gordurosas. Em 2001, esta

técnica foi empregada para determinar resíduos de pesticidas em óleo de oliva

(LENTZA-RIZOS et al, 2001).

Em 2004, GOULART desenvolveu uma metodologia simples e de baixo

custo, para análise de deltametrina e cipermetrina em leite. Este método

denominado extração líquido-líquido e purificação por precipitação a baixa

temperatura, permitiu determinar piretróides em leite por cromatografia gasosa,

sem a necessidade de etapas de clean up. Posteriormente, esta técnica foi

aplicada por VIEIRA et al. (2005, 2007) para extração de piretróides em

amostras de água e solo, passando a técnica a ser denominada para essas

matrizes de extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-

PBT) e extração sólido-líquido com partição em baixa temperatura (ESL-PBT).

Essa técnica consiste em colocar a amostra líquida ou sólida em contato

com um solvente menos denso que a água e com ponto de fusão abaixo de -20

°C. O sistema é agitado e levado ao freezer. Após um determinado período de

tempo a fase aquosa é congelada e o solvente orgânico ainda na fase líquida é

separado e analisado por cromatografia gasosa. O solvente que apresentou

melhores condições de extração e análise de piretróides em amostras de água

e solo foi a acetonitrila (VIEIRA, 2005; VIEIRA et al, 2007).

A acetonitrila é considerada um dos melhores solventes extratores para

a análise de pesticidas, pois geralmente apresenta compatibilidade com o

analito, com o preparo de amostra, na análise por cromatografia gasosa e pode

ser empregada para analisar pesticidas de diferentes polaridades. Além disso,

a acetonitrila extrai menos interferentes lipofílicos das matrizes quando

comparados com a acetona e o acetato de etila (MASTOVSKÁ & LEHOTAY,

2004).

A acetona também poderia ser empregada para a ESL-PBT, pois é

miscível em água, em todas as proporções, além de apresentar menor

temperatura de fusão e densidade que a água. Entretanto, a acetona é

incompatível com o sistema CG-DCE, sendo então, necessário após a extração

dos pesticidas a evaporação da acetona, e redissolução dos resíduos em outro

solvente. Alguns solventes que poderiam ser empregados na ESL-PBT são

apresentados na Tabela 3.

Tabela 3 – Propriedades físicas dos solventes passíveis de serem utilizados na

ESL-PBT

Solventes Ponto de fusão

/ °C

Ponto de ebulição

/ °C

Densidade

/ g cm

-3

Miscibilidade em

água

Acetonitrila -44 82 0,7793 miscível

Acetona -95 56 0,7856 miscível

Isopropanol -90 82 0,7827 miscível

Metanol -98 65 0,7872 miscível

Hexano -95 69 0,6563 imiscível

Acetato de

etila

-84 77 0,8942 imiscível

Fonte: LIDE, DAVID R.; CRC Handbook of Chemistry and physics, 1995.

O hexano, mesmo sendo insolúvel em água, pode ser utilizado na ESL-

PBT, desde que seja adicionado um co-soluto, como por exemplo, o

isopropanol, para a formação de uma única fase.

Efeito de matriz

Embora os métodos de análise de multirresíduos representem formas

efetivas de quantificar uma variedade de pesticidas em alimentos, as taxas de

recuperação para os compostos de interesse nem sempre são satisfatórias, por

apresentarem, muitas vezes, porcentagens de extração acima de 100 % e,

ainda, elevados desvios nas análises. Estes resultados estão relacionados com

os efeitos de matriz que ocorrem durante a análise cromatográfica

(MENKISSOGLU-SPIROUDI & FOTOPOULOU, 2004; HAJSLOVÁ, &

ZROSTLIKOVA, 2003). Este efeito de matriz foi descrito primeiramente por

ERNEY e colaboradores (1993) que observaram durante a análise de amostras

naturais, a co-extração de vários componentes da matriz, além dos compostos

de interesse, os quais provocavam modificações na resposta do pesticida.

A interferência dos componentes da matriz ocorre porque a curva

analítica utilizada para quantificar os pesticidas, geralmente, é preparada em

solvente puro. Já na análise dos extratos obtidos por um método de extração

adequado, além de apresentar os pesticidas, contém uma variedade de

compostos pertencentes à matriz que são co-extraídos. Estes compostos

interferem durante a análise cromatográfica, pois influenciam na quantidade de

pesticida que é transferido para a coluna. Esta interferência dos componentes

da matriz, na quantificação dos pesticidas na análise cromatográfica, é

denominada de efeito de matriz (GONZALEZ et al, 2002).

O efeito de matriz pode ocorrer em diversas partes do sistema

cromatográfico como: injetor, coluna ou detector. O liner do injetor (tubo de

vidro) é o principal responsável pelo efeito de matriz, pois sítios ativos deste

material podem adsorver ou induzir a degradação térmica de alguns analitos.

Quando as soluções padrão são preparadas no solvente puro e analisadas por

cromatografia, mais sítios ativos do liner estão disponíveis para interagir com

os pesticidas. Entretanto, quando se analisa os extratos, os pesticidas estão na

presença de componentes da matriz, ocorrendo assim uma competição pelos

sítios ativos. Dependendo das características do analito e da amostra, os

componentes da matriz podem ser adsorvidos no liner e mais pesticidas podem

ser introduzidos na coluna cromatográfica, originando uma resposta maior para

o pesticida quando comparado com a resposta deste em solvente puro

(HAJSLOVÁ & ZROSTLIKOVA, 2003). Proporcionando, assim, erroneamente

uma alta concentração do pesticida.

Um exemplo disso ocorreu na análise de captan em extratos de laranja.

Este pesticida quando preparado em tolueno não havia sido detectado pelo

detector por captura de elétrons, provavelmente devido a decomposição ou

interação com sítios ativos do liner. Depois de várias injeções de amostras de

extrato de laranja em que foi se acumulando componentes da matriz no

sistema cromatográfico o pico de captan foi quantificado, embora a

repetibilidade das amostras tenha sido baixa (HAJSLOVÁ et al,1998).

Normalmente, para corrigir estes erros nas taxas de recuperação, a

curva analítica pode ser preparada substituindo o solvente puro por extratos da

matriz isenta de pesticidas, durante a diluição das soluções padrão nas

diversas concentrações (RIBANI et al, 2004). Muitos pesticidas têm se

mostrado estáveis quando preparados em extratos da matriz. Tem-se

observado a degradação de organofosforados apenas quando se eleva a

temperatura de armazenamento dos padrões, caso contrário, quando os

padrões preparados no extrato da matriz são armazenados em baixa

temperatura, estes são tão estáveis quanto os padrões preparados em solvente

puro (KOCOUREK et al, 1998).

Além disso, numa tentativa de reduzir o efeito de matriz pode-se fazer o

uso de injeção on-column, para evitar a presença de sítios ativos do sistema de

injeção, ou freqüentes mudanças do liner do injetor. Pode-se também utilizar o

método de adição de padrão na própria matriz, ou ainda, etapas de clean up

dos extratos para reduzirem co-extrativos (POOLE, 2007; SCHENCK &

LEHOTAY, 2000).

Outra alternativa é a adição de substâncias químicas similares aos

componentes da matriz nos padrões preparados em solvente puro, para ocupar

os sítios ativos do liner, impedindo a adsorção ou degradação dos pesticidas.

Tais substâncias protetoras como o óleo de oliva (ou produtos de degradação

destes) têm maior capacidade de fazer ligações de hidrogênio que os

pesticidas com os grupos silanóis do liner (vidro). Desta forma, estes

compostos mascaram os sítios ativos e proporcionam maior transferência dos

pesticidas para a coluna (SANCHEZ-BRUNETE et al, 2005).

A intensidade do efeito de matriz pode variar de uma amostra para outra,

ou de acordo com a concentração do analito na matriz. HAJSLOVÁ et al (1998)

verificou que quanto menor a concentração do analito na amostra, maior será o

efeito de matriz. Um fato interessante foi observado por SCHENCK &

LEHOTAY (2000) em que o pesticida terbufós não apresentou nenhum efeito

de matriz quando analisado em concentrações mais altas. Entretanto, para

concentrações mais baixas apresentou significativo efeito de matriz.

O próprio sistema cromatográfico pode influenciar na intensidade do

efeito de matriz. Como exemplo, um cromatógrafo a gás utilizando como

detector um espectrômetro de massa (EM) apresentou maior efeito de matriz

em análise de organofosforados que um detector fotométrico de chama (DFC)

para os mesmos pesticidas. Acredita-se ser devido aos tipos diferentes de liner

e pequeno diâmetro da coluna usados para o CG-EM em relação ao CG-DFC.

Além disso, o próprio espectrômetro de massa contribui para o aumento da

resposta devido à superfície metálica do detector e o fato de não ocorrer

combustão neste (SCHENCK & LEHOTAY, 2000).

As propriedades físico-químicas dos pesticidas e dos interferentes, como

polaridade, volatilidade, estabilidade em altas temperaturas, etc. também são

fatores relevantes no estudo do efeito de matriz (MENKISSOGLU-SPIROUDI &

FOTOPOULOU, 2004). Pesticidas que contém os grupos amidas, sulfonas e/ou

ligações P=O, de uma forma geral compostos mais polar, são largamente

afetados pela matriz. Ou mesmo compostos de elevada massa molar como os

piretróides tendem a apresentar também um aumento da resposta (SANCHEZ-

BRUNETE et al, 2005).

Nesse trabalho foram otimizados os métodos de extração sólido-líquido

e purificação em baixa temperatura e dispersão da matriz em fase sólida, para

determinar os pesticidas clorpirifós, λ - cialotrina, cipermetrina e deltametrina

em amostras de tomate.

CAPÍTULO 1

EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO E PURIFICAÇÃO EM BAIXA

TEMPERATURA

1.1. MATERIAIS E MÉTODOS

1.1.1. Preparo de soluções padrão de pesticidas

As soluções empregadas neste trabalho foram preparadas pela

solubilização de padrões de clorpirifós (99,0% m/m - Chem Service),

cipermetrina (92,4% m/m - Chem Service),

-cialotrina (86,5% m/m - Syngenta)

e deltametrina (99,0% m/m - Chem Service), em acetonitrila (Mallickrodt /

HPLC). Soluções estoque de 500,0 mg L

-1

foram preparadas para cada padrão

e armazenadas em freezer. A partir da diluição das soluções estoque, foi

preparada uma solução de trabalho contendo os quatros pesticidas em

concentrações de 50,0 mg L

-1

Uma segunda solução de concentração igual a 50,0 mg L

-1

, utilizada

como padrão interno, foi preparada pela solubilização de padrão de bifentrina

(92,2 % m/m – FMC do Brasil) em acetonitrila.

1.1.2. Preparo de amostras de tomates hidropônicos fortificadas

Amostras de tomate (aproximadamente 4 a 5 unidades) foram trituradas

em processador caseiro e quantidades de polpa iguais a 4,0000 g foram

fortificadas com 100,0 μL de solução trabalho contendo os quatro pesticidas na

concentração de 50,0 mg L

-1

. As amostras contaminadas (1,25 mg kg

-1

) foram

deixadas por aproximadamente três horas em frasco aberto para evaporação

do solvente.

1.1.3. Otimização da técnica de extração sólido-líquido e purificação em

baixa temperatura (ESL-PBT)

Os ensaios da extração sólido-líquido e purificação em baixa

temperatura para análise dos pesticidas clorpirifós, cipermetrina,

-cialotrina e

deltametrina em amostras de tomate foram adaptados da técnica descrita para

a extração de deltametrina e cipermetrina em leite (GOULART, 2004) e para

extração de quatro piretróides em água e solo (VIEIRA, 2005; VIEIRA et al,

2007).

Em frasco de vidro transparente de 22,0 mL de capacidade, contendo

4,0000 g de polpa de tomate fortificada, foram adicionados 10,0 mL de uma

mistura extratora e homogeneizado. Posteriormente, a mistura foi resfriada em

freezer a -20 °C por 12 horas. Após a separação das fases pelo congelamento

da fase aquosa e da polpa de tomate, o líquido sobrenadante foi passado por

um papel de filtro contendo 1,5000 g de sulfato de sódio anidro (Nuclear). O

extrato foi recuperado em balão volumétrico de 10,0 mL em acetonitrila e

armazenado em frascos de vidro no freezer, até o momento da análise.

Após a extração, as concentrações dos analitos foram determinadas por

cromatografia gasosa, usando detector por captura de elétrons (DCE). Os

experimentos realizados na otimização são descritos nos itens 1.1.3.1 e

1.1.3.2.

1.1.3.1. Planejamento de misturas

A composição da mistura extratora utilizada na ESL-PBT foi otimizada

realizando um planejamento experimental de misturas de três componentes,

com o objetivo de avaliar a taxa de recuperação dos princípios ativos a partir

das modificações da polaridade da mistura extratora.

O modelo de planejamento de misturas com três diferentes solventes e

as características das três misturas extratoras avaliadas estão representadas

na Figura 1.1 e Tabela 1.1, respectivamente.

Solvente 1

Solvente 2

Solvente 3

Figura 1.1 - Modelo de planejamento de mistura.

Tabela 1.1 – Descrição dos planejamentos de misturas

Planejamentos de

misturas

Solvente 1

Solvente 2

Solvente 3

A Acetonitrila Água Acetato de etila

B Acetonitrila Água Metanol

C Isopropanol Água Hexano

A mistura extratora usada na ESL-PBT deve ser inicialmente

homogênea, para que somente após o abaixamento da temperatura ocorra a

separação das fases. Assim, quantidades mínimas e máximas de cada

solvente da mistura extratora foram estabelecidas para garantir a formação da

fase única.

Além disso, os solventes 1 e 2 na ESL-PBT, devem necessariamente

possuir limite inferior maior do que zero, pois o solvente 1 constituirá a fase

líquida após o congelamento enquanto que o solvente 2 formará a fase sólida.

Considerando, então, as restrições da mistura extratora na ESL-PBT,

os limites mínimos e máximos de cada solvente, foram estabelecidos, como

representado na Tabela 1.2.

Tabela 1.2 – Limites inferiores e superiores das quantidades de cada solvente,

expressos em % v/v

Solventes Limite inferior (%) – Limite superior (%)

1 65 – 80

2 5 – 20

3 0 – 15

A partir das quantidades mínimas e máximas de cada solvente, foi

delimitada, então, a região de estudo no planejamento, limitado pelos vértices

do triângulo 1, 2 e 3, Figura 1.2.

Solvente 1

Solvente 2

Solvente 3

Figura 1.2 – Região de estudo do planejamento de mistura, aplicados na

otimização do método ESL-PBT para extração de quatro pesticidas em tomate.

Os vértices do triângulo 1, 2 e 3 representam três tipos de misturas

extratoras de polaridades diferentes.

Em cada mistura extratora a proporção entre os solventes foi

determinada pelos pseudocomponentes, que é uma espécie de codificação.

Quando um solvente foi adicionado em sua quantidade máxima o

pseudocomponente foi 0,5 no planejamento de misturas. Quando a quantidade

mínima do solvente foi usada, o pseudocomponente correspondente foi zero. A

soma dos pseudocomponentes em uma fase extratora foi sempre igual a 1.

Estes cálculos dos pseudocomponentes foram obtidos pela equação 1.1:

pseudocomp.

= C(%) – Li (Equação 1.1)

100 - ∑ Li

Sendo que:

X = Pseudocomponentes dos solventes 1, 2 ou 3.

C(%) = Porcentagem do solvente na mistura analisada.

Li = Limite inferior do solvente (Tabela 1.2)

∑ Li = Somatório de todos os limites inferiores dos três solventes que compõe a

mistura. Neste planejamento, igual a 70%.

A Tabela 1.3 resume todas as informações necessárias para o

planejamento de misturas como os pseudocomponentes e a porcentagem de

cada solvente na mistura.

Tabela 1.3 – Composição das fases extratoras preparadas com misturas dos

solventes 1, 2 e 3, em valores reais dos componentes (%) e em

pseudocomponentes (X)

pseudocomponentes Mistura

Solvente 1 (%) Solvente 2 (%) Solvente 3 (%)

1 0,5 0,5 0 80 20 0

2 0 0,5 0,5 65 20 15

3 0,5 0 0,5 80 5 15

* O volume total após a mistura dos três solventes foi sempre 10,0 mL.

Para cada mistura de solventes foi avaliada a porcentagem de extração

de clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina presentes em amostra de

tomate.

Os resultados obtidos da porcentagem de recuperação dos pesticidas,

usando o modelo experimental e misturas, foram avaliados estatisticamente

utilizando o software Statistica

versão 6.0.

1.1.3.2. Otimizações univariadas

Para melhorar a eficiência da extração dos quatro pesticidas em

amostras de tomate e obter extratos mais apropriados para análise

cromatográfica foram realizadas otimizações univariadas, utilizando a mistura

extratora que melhores resultados apresentaram.

1.1.3.2.1. Efeito do sistema de agitação da ESL-PBT na porcentagem de

extração dos pesticidas em tomate

Avaliou-se a influência do mecanismo de homogeneização da amostra

com a mistura extratora na eficiência de extração dos pesticidas estudados. As

estratégias de agitação foram: agitação manual, agitação mecânica em mesa

agitadora (Tecnal TE - 420) por 10 minutos a 25 ºC e 175 oscilações por

minuto, ultra-som por 1 minuto e ultra-som por 10 minutos. Em cada estratégia,

a técnica de ESL-PBT foi utilizada como descrito no item 1.1.3., usando como

mistura extratora acetonitrila, água e acetato de etila (8,0: 0,5: 1,5).

1.1.3.2.2. Efeito da força iônica na porcentagem de extração dos

pesticidas em tomate pela ESL-PBT

O efeito da força iônica na porcentagem de extração dos quatro

pesticidas em amostras de tomate foi avaliado usando o método descrito no

item 1.1.3., usando como mistura extratora acetonitrila, água e acetato de etila

(8,0: 0,5: 1,5), sendo a mistura submetida ao ultra-som por 1 minuto.

Entretanto, a água adicionada à amostra para compor a mistura extratora foi

substituída por uma solução de NaCl na concentração de 0,20 mol L

-1

, para

aumentar a força iônica do meio.

1.1.3.2.3. Avaliação do efeito de matriz na porcentagem de recuperação

dos pesticidas.

Para observar o efeito de matriz na ESL-PBT em amostras de tomate na

análise de clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina por cromatografia

gasosa foram feitos dois estudos:

1.1.3.2.3.1. Superposição de matriz

Quando soluções padrão são preparadas em solvente puro e analisadas

por cromatografia gasosa, estas apresentam respostas diferentes das mesmas

soluções padrão preparadas no extrato da matriz, isenta de pesticidas. Para

avaliar essa influência dos componentes da matriz na resposta do detector

foram preparadas duas séries de soluções padrão contendo os quatro

pesticidas nas concentrações de 5; 10; 25; 75; 150; 300; 500; 625 e 750 μg L

-1

A primeira série foi preparada pela diluição da solução de trabalho (50,0 mg L

-1

)

contendo os quatro pesticidas em acetonitrila pura. A segunda série dos

padrões foi preparada pela diluição da mesma solução de trabalho no extrato

da matriz, obtido da ESL-PBT de tomates hidropônicos isentos de pesticidas.

O efeito de matriz também foi avaliado pela comparação das

porcentagens de recuperação obtidas quando as soluções padrões preparadas

em acetonitrila e no extrato da matriz foram empregadas para quantificar os

princípios ativos em amostras de tomate previamente fortificadas.

1.1.3.2.3.2. Variação da resposta do detector

A variação da resposta (área) dos pesticidas associada ao efeito de

matriz foi avaliada pela comparação dos resultados de injeções sucessivas

(três vezes) de uma solução padrão em acetonitrila, antes e após injeções

sucessivas (cinco vezes) de um extrato obtido da ESL-PBT de amostra de

tomates isentas de pesticidas.

1.1.3.2.4. Eficiência de adsorventes no clean up dos extratos obtidos na

ESL-PBT de amostras de tomate

Os extratos orgânicos obtidos da ESL-PBT de amostras de tomate foram

submetidos a uma etapa de clean up para melhorar a qualidade dos mesmos

com vistas à análise cromatográfica. Após o processo de resfriamento a – 20

°C da mistura, a fase orgânica líquida foi passada por um papel de filtro

contendo uma camada de sulfato de sódio anidro, (1,5000 g) e uma camada

inferior de adsorvente (0,5000 g). Os extratos foram recuperados para 10,0 mL

em acetonitrila e armazenados no freezer até o momento da análise

cromatográfica. Os adsorventes avaliados foram florisil (J. B. Barcker), sílica

gel (Mercker), octadecil C-18 (PR cola) e carvão ativado (Carlo Erba).

Também foi estudado o clean up dos extratos com adição do carvão

ativado diretamente na mistura da amostra com a fase extratora, antes do

processo de homogeneização. Analisou-se o clean up com 0, 5, 10 e 15 mg de

carvão ativo.

O uso do carvão ativado para o clean up dos extratos foi avaliado pelas

características dos cromatogramas (ruídos da linha de base e picos

interferentes), pela porcentagem de extração dos pesticidas e pela intensidade

da cor dos extratos, sendo este avaliado espectrofotometricamente na região

do UV-visível.

1.1.4. Análise cromatográfica

A identificação e quantificação dos extratos de pesticidas foram

realizadas em um cromatógrafo a gás (Shimadzu, GC – 17A), com um detector

por captura de elétrons (DCE). Para promover a separação entre os picos dos

compostos de interesse no menor tempo de análise, estabeleceram-se as

condições ideais de análise como temperatura da coluna, do injetor e do

detector, vazão dos gases e escolha do tipo de coluna cromatográfica.

As condições analíticas fixadas foram as seguintes:

Coluna capilar: Fase estacionária: 5% difenil e 95% dimetilsiloxano, 30 m x

0,25 mm de diâmetro interno e 0,1μm de espessura de filme.

Programação de temperatura da coluna: 200 ºC

290 ºC (2 min)

Tempo total de análise: 11 minutos

Temperatura do injetor: 280 ºC

Temperatura do detector: 300 ºC

Volume injetado: 1,0 μL

Gás de arraste: Nitrogênio

Vazão do gás de arraste: 1,2 mL min

-1

Divisão de fluxo: 1:5

10 ºC min

1.1.4.1. Curva analítica (método da padronização interna)

Foram preparadas soluções padrão de concentrações crescentes dos

analitos (5; 10; 25; 75; 150; 300; 500; 625 e 750 μg L

-1

) utilizando o principal

solvente da mistura extratora (acetonitrila). Nestas soluções adicionaram-se

100,0 μL de solução de bifentrina a 500,0 μg L

-1

, utilizada como padrão interno

(PI). Após análise dessas soluções, foi construído um gráfico relacionando a

razão de áreas (área do analito/ área do padrão interno) com as respectivas

concentrações dos analitos. Foram obtidos por regressão linear, as equações

das retas e os parâmetros que permitiram calcular as concentrações dos

analitos nas amostras.

Nos extratos das amostras de tomates também foram adicionadas a

mesma quantidade de padrão interno.

1.1.4.2. Método otimizado da ESL-PBT e análise por cromatografia gasosa

de quatro pesticidas em tomate.

Em amostras de tomate (4,0000 g) previamente processadas e

fortificadas com 1,25 mg kg

-1

de cada um dos pesticidas, foram adicionados

10,0 mL da mistura extratora (8,0 mL de acetonitrila, 0,50 mL de água destilada

e 1,5 mL de acetato de etila). A mistura foi sonicada por 1 minuto e deixada no

freezer a aproximadamente -20 °C por 12 horas. O solvente orgânico ainda

líquido foi passado por um papel de filtro contendo sulfato de sódio anidro. O

volume do extrato foi ajustado em balão volumétrico de 10,0 mL com

acetonitrila e armazenados no freezer até o momento da análise.

As análises cromatográficas dos extratos foram feitas usando as

condições cromatográficas descritas no item do 1.1.4.

1.1.5. Validação do método analítico

Para assegurar a credibilidade do método analítico desenvolvido, este foi

submetido a uma validação, conforme proposto por RIBANI et al (2004). Os

critérios considerados, neste trabalho, para a validação do método de extração

sólido-líquido e purificação em baixa temperatura e análise por CG-DCE, estão

dispostos na Tabela 1.4.

Tabela 1.4 – Parâmetros de desempenho analítico para validação do método

ESL-PBT e análise por CG

Parâmetros

Seletividade -

Limite de detecção e quantificação -

Linearidade de resposta do detector -

Precisão Repetitividade

Precisão intermediária

Exatidão Ensaio de recuperação

Comparação de métodos

1.1.5.1. Seletividade

A seletividade foi avaliada comparando-se os cromatogramas dos

extratos obtidos após extração dos componentes da matriz isenta dos

pesticidas em estudo, com os cromatogramas dos extratos da amostra de

tomate fortificada, preparada e analisada conforme o procedimento otimizado.

1.1.5.2. Limite de detecção e quantificação

Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) para cada um dos

pesticidas foram determinados usando os parâmetros da curva analítica. Para

este cálculo, construiu-se uma curva analítica utilizando soluções padrão

contendo clorpirifós, cipermetrina,

-cialotrina e deltametrina nas

concentrações 12, 8, 6, 4, 2 µg L

-1

. O LD e o LQ foram considerados como 3,3

e 10 vezes, respectivamente, a razão entre os coeficientes linear e angular da

curva analítica (RIBANI et al 2004).

1.1.5.3. Linearidade de resposta do detector

A linearidade de resposta do detector foi verificada pela curva analítica

preparada, conforme descrito no item 1.1.4.1, em que padrões de pesticidas

em acetonitrila foram preparados nas concentrações de 5, 10, 25, 75, 150, 300,

500, 625 e 750 μg L

-1

. Após a análise cromatográfica, foi construída uma curva

analítica, relacionando a razão de áreas (área do analito/ área do padrão

interno) com as concentrações dos analitos. A linearidade foi avaliada pelo

coeficiente de correlação determinado pela regressão linear.

1.1.5.4. Precisão

A precisão do método de extração sólido-líquido e purificação em baixa

temperatura e análise por cromatografia gasosa foram verificadas sob

condições de repetitividade e precisão intermediária.

A repetitividade do método de extração dos pesticidas clorpirifós,

cipermetrina,

-cialotrina e deltametrina em amostras de tomate foram

determinadas, conforme sugerido pelo INMETRO, realizando-se sete extrações

idênticas dos pesticidas, segundo procedimento descrito no item 1.1.4.2.

determinando o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação (CV).

A precisão intermediária foi analisada por meio da porcentagem de

recuperação dos pesticidas e respectivos coeficientes de variação, fazendo-se

o procedimento de extração descrito no item 1.1.4.2. em triplicatas e em três

dias distintos.

1.1.5.5. Exatidão

Entre as maneiras de avaliar a exatidão de um método pode-se recorrer

aos ensaios de recuperação.

Os ensaios de recuperação foram realizados em amostras de tomate

fortificadas em diferentes níveis: 0,025; 0,050; 0,100 e 0,250 mg kg

-1

de cada

um dos pesticidas, correspondendo, respectivamente, a 1, 2, 4 e 10 vezes o

limite de quantificação dos pesticidas. Estas amostras em triplicatas foram

submetidas ao método de ESL-PBT conforme descrito no item 1.1.4.2. e

analisadas por cromatografia gasosa nas condições descritas no item 1.1.4. A

exatidão foi avaliada pelo coeficiente de variação das medidas.

1.1.6. Determinação dos pesticidas em amostras de tomates

A técnica de ESL-PBT para determinação dos pesticidas clorpirifós,

cipermetrina,

-cialotrina e deltametrina otimizada e validada, foi aplicada em

amostras de tomates coletadas em três estabelecimentos comerciais de

Viçosa-MG.

Para a coleta das amostras foram utilizados sacos de polietileno para

armazenar 1 kg de tomate (cerca de 10 unidades) escolhidos ao acaso e

transportados ao laboratório para serem estocados a baixa temperatura até o

momento de preparo para a análise. Os tomates foram cortados e triturados em

processadores caseiros. Alíquotas de 4,0000 g da amostra de tomate foram

retiradas e submetidas ao processo de extração otimizado, conforme descrito

no item 1.1.4.2. e analisado por cromatografia gasosa.

1.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

1.2.1. Análise cromatográfica

O detector por captura de elétrons (DCE) apresenta alta sensibilidade

aos compostos halogenados, possibilitando a quantificação dos pesticidas

clorpirifós, cipermetrina,

-cialotrina e deltametrina na análise cromatográfica. A

identificação dos compostos estudados foi realizada por comparação entre os

tempos de retenção (t

) destes nos extratos com os da solução padrão. Na

Figura 1.3 A está representado o cromatograma da solução padrão dos

pesticidas em acetonitrila. O cromatograma dos extratos após a ESL-PBT

obtidos a partir de amostras de tomate fortificadas com os pesticidas é ilustrado

na Figura 1.3 B.

0123456789101

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

9.9

8.2

6.8

5.6

3.2

Resposta do detector

Tem

o de retenção

01234567891011

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

9.9

8.2

6.8

5.6

3.2

Resposta do detecto

Tempo de retenção

Figura 1.3 – A) Cromatograma da solução padrão de 500 μg L

-1

dos pesticidas ,

B) Cromatograma da amostra fortificada com 1,25 mg kg

-1

(500 μg L

-1

) dos

pesticidas e submetidas a ESL-PBT ( t

= 3,2 min: clorpirifós, t

= 5,6 min:

padrão interno, t

= 6,8 min: cialotrina, t

= 8,2 min: cipermetrina, t

= 9,9 min:

deltametrina).

Pelas características dos cromatogramas (Figura 1.3) observa-se que as

condições de análise (item 1.1.4.), como a programação de temperatura,

coluna utilizada e o fluxo do gás de arraste, possibilitou uma boa separação

dos compostos avaliados, inclusive dos isômeros. A

-cialotrina (t

= 6,8 min.)

e a deltametrina (t

= 9,9 min.) que apresentam dois isômeros cada uma, foram

quantificadas somando-se a área total dos pesticidas isoméricos. Caso

semelhante foi realizado com a cipermetrina que apresenta três isômeros (t

8,2 min.).

Comparando-se os cromatogramas da amostra fortificada (Figura 1.3 B)

com o da solução padrão dos pesticidas (Figura 1.3 A), observa-se na região

próxima ao pico atribuído ao solvente, nos três primeiros minutos de análise,

alargamento do pico. Isso indica que compostos polares da matriz são

extraídos e eluídos próximo ao solvente.

1.2.2. Otimização da técnica de extração sólido-líquido e purificação em

baixa temperatura (ESL-PBT)

1.2.2.1. Planejamento de misturas

Em 2004, GOULART descreveu o método de extração líquido-líquido e

partição em baixa temperatura, ELL-PBT, para extração e análise de

piretróides em leite por cromatografia gasosa. Posteriormente, a técnica foi

otimizada e validada por VIEIRA et al (2007) para extração de quatro

piretróides em água. Na descrição da metodologia recomenda-se usar 8 mL de

uma mistura extratora contendo acetonitrila (6,5 mL) e acetato de etila (1,5 mL).

Esta mistura, nessa proporção, permite formar uma fase única com a amostra

aquosa (4,0 mL). Com o abaixamento da temperatura a amostra aquosa é

solidificada, restando ainda no estado líquido a mistura extratora.

A acetonitrila, além de ser descrita como sendo um dos melhores

solventes na extração de pesticidas (MASTOVSKA & LEHOTAY, 2004), tem as

características necessárias para ser usada na técnica de ESL-PBT. A

acetonitrila forma com a água uma fase única em qualquer proporção e tem o

ponto de congelamento (T

= - 46 °C) bem mais baixo que a temperatura

utilizada no método (- 20 °C). Para que a sua eficiência como solvente extrator

seja ampliada é necessário modificar sua polaridade para que seja aplicado

para a extração de pesticidas de diferentes polaridades. Essas modificações

não podem alterar as características da mistura extratora com relação à

formação da fase única e das características de congelamento.

Além desses relatos na literatura, não se encontrou nenhum estudo

sistemático realizado para extração de pesticidas em amostras de hortaliças,

empregando esta técnica. Assim, na otimização do método para amostras de

tomate, foram estabelecidas previamente quantidades máximas e mínimas de

solventes, para que a mistura extratora mantivesse as características

necessárias.

Estudo recente realizado por Vieira (2005) demonstrou que a proporção

água: acetonitrila 1:2 resultou em melhores porcentagens de extração de

pesticidas na ESL-PBT. Assim, considerando que a amostra de tomate (4,0000

g) contém aproximadamente 95% de água, optou-se por acrescentar 0,5 mL de

água e 9,5 mL de fase orgânica para que a proporção água: solvente orgânico

aproximasse da relação 1:2. Para avaliar a influência da água na extração dos

pesticidas, analisou-se também misturas extratoras acrescentando um volume

máximo de água de 2,0 mL em 8,0 mL de fase orgânica, para obter uma

relação água : solvente orgânico cerca de 1:1.

A polaridade da acetonitrila pode ser reduzida pela adição de acetato de

etila. Assim a extração dos pesticidas menos polares é favorecida por esta

combinação. Entretanto, a miscibilidade do acetato de etila em acetonitrila e

água são limitadas. VIEIRA et al (2007) determinou que para a proporção 1:2

(fase aquosa: fase orgânica) a quantidade máxima de acetato de etila

adicionado em 8 mL de fase orgânica fosse 1,5 mL, para não romper o

equilíbrio da fase única. Por isso, adotou-se um volume de acetato de etila de

1,5 mL em 10,0 mL de fase extratora, para garantir a formação de uma fase

homogênea.

As porcentagens de extração, para os quatro pesticidas, usando as

misturas 1, 2 e 3 do planejamento de mistura A, nas proporções descritas na

Tabela 1.3 (pg. 18 ), estão na Tabela 1.5.

Tabela 1.5 – Porcentagem de recuperação dos pesticidas e respectivos

desvios-padrão na análise de amostras de tomate fortificadas, usando o

planejamento de mistura A (Tabela 1.1, pg. 16) e composição da misturas

extratora (Tabela 1.3, pg. 18)

Mistura Clorpirifós

R (%)

-Cialotrina

R (%)

Cipermetrina

R (%)

Deltametrina

R (%)

1 70,73 ± 1,83 69,44 ± 0,18 73,51 ± 2,12 73,08 ± 0,21

2 75,19 ± 0,83 76,16 ± 1,51 81,15 ± 2,56 80,94 ± 0,76

3 82,71 ± 2,75 86,02 ± 3,30 95,37 ± 4,71 95,58 ± 2,64

A mistura 1 constituída por acetonitrila, água e acetato de etila nas

proporções de 80%, 20%, 0%, respectivamente, é a mistura mais polar. Em

contra partida a mistura extratora 3 é a de menor polaridade (80% acetonitrila,

5% água e 15% acetato de etila). Já a mistura 2 (65% acetonitrila, 20% água e

15% acetato de etila) possui polaridade intermediária.

Os resultados da Tabela 1.5 indicam que à medida que diminui a

polaridade da mistura extratora, a porcentagem de recuperação dos pesticidas

aumenta. Sendo assim, a mistura 3, menos polar, proporciona melhor extração

dos pesticidas.

Considerando as quantidades máximas extraídas de cada um dos

pesticidas em função da polaridade da mistura extratora do planejamento de

misturas A, observa-se, na Figura 1.4, que a polaridade da mistura afeta mais a

deltametrina e a cipermetrina, enquanto que para o clorpirifós o efeito da

variação da polaridade da mistura extratora é menos significativo. Isso está

relacionado com a solubilidade dos pesticidas na fase aquosa, pois o clorpirifós

dissolve na água até 1,4 mg L

-1

, enquanto que os piretróides

-cialotrina,

cipermetrina e deltametrina solubilizam-se, respectivamente, 0,004; 0,004 e

0,0002 mg L

-1

. Assim, o clorpirifós é mais solúvel em água que os piretróides e

isso explicam a menor influência da polaridade da fase orgânica na extração

deste pesticida em relação aos piretróides.

Mais polar

Polaridade

intermediária

Menos polar

100

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

% Extração

Figura 1.4 - Influência da polaridade da mistura extratora na porcentagem de

extração para os pesticidas clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina.

O conjunto das porcentagens de extração, expressos na Tabela 1.5, foi

utilizado para ajustar o modelo linear, equação (1.2), usando o método dos

mínimos quadrados, para cada pesticida.

Y = b

+ b

Equação (1.2)

Este ajuste foi obtido com auxílio do software statistica

que fornece tais

modelos e determina o erro padrão de cada coeficiente (Tabela 1.6).

Tabela 1.6 – Coeficientes do modelo linear estimados para cada pesticida em

função das porcentagens de recuperação obtidos pela técnica ESL-PBT de

amostras de tomate, usando o planejamento de misturas A (acetonitrila, água e

acetato de etila)

Pesticidas Equações do modelo ajustado

(± erro padrão)

Clorpirifós Y = 78,25 X

+ 63,22 X

+ 87,17 X

(± 2,05) (± 2,05) (± 2,05)

0,9460

-Cialotrina

Y = 79,30 X

+ 59,58 X

+ 92,74 X

(± 2,58) (± 2,58) (± 2,58)

0,9545

Cipermetrina Y = 87,73 X

+ 59,29 X

+ 103,01 X

(± 4,08) (± 4,08) (± 4,08)

0,9368

Deltametrina Y = 87,71 X

+ 58,44 X

+ 103,44 X

(± 2,05) (± 2,05) (± 2,05)

0,9857

= pseudocomponente da acetonitrila

= pseudocomponente da água

= pseudocomponente do acetato de etila

A contribuição de cada pseudocomponente no processo de extração dos

pesticidas está representada na equação do modelo linear ajustado. Observa-

se que o pseudocomponente da água (X

) tem pesos bem próximos para os

pesticidas λ-cialotrina, cipermetrina e deltametrina, ou seja, a quantidade de

água afeta a extração destes pesticidas de forma similar. Já a equação do

modelo ajustado para o clorpirifós, devido a sua maior solubilidade em água,

possui um coeficiente maior para X

em relação aos piretróides. Como X

possui menor coeficiente entre os três pseudocomponentes analisados, isso

significa que a água apresenta menor contribuição para a extração dos

pesticidas, por isso deverá ser utilizada a quantidade mínima na mistura

extratora.

Analisando os coeficientes do pseudocomponente X

, acetonitrila, os

pesticidas podem ser separados em dois grupos, de acordo com a semelhança

dos coeficientes. A acetonitrila proporciona melhor extração da cipermetrina e

deltametrina, porque possuem massas molares maiores em relação ao

clorpirifós e

-cialotrina.

No entanto, resultados mais satisfatórios são obtidos com a adição do

acetato de etila, pois os pesos do pseudocomponente (X

) na mistura extratora,

para todos os pesticidas, são maiores, principalmente para a cipermetrina e

deltametrina. Por isso o acetato de etila deve ser adicionado na quantidade

máxima.

Para avaliar a qualidade dos ajustes do modelo linear foi feita uma

análise de variância para cada pesticida. Os resultados dispostos na Tabela 1.7

mostram, pelos valores do teste F, que existe pelo menos um coeficiente

significativo ao nível de 95% de confiabilidade no modelo linear para cada

pesticida. Entretanto, a análise da variância não especifica qual, ou quais,

coeficientes são mais importantes. Para isso, foi realizado o teste t de

“STUDENT” calculado pelo próprio programa do statistica

ao nível de 95% de

probabilidade, para os coeficientes da Tabela 1.6, sendo que todos estes

coeficientes apresentaram-se significativos, mostrando que eles, realmente,

descrevem o comportamento dos sistemas de misturas estudados.

Tabela 1.7 – Análise da variância para o ajuste do modelo linear aplicado às

respostas do planejamento de mistura para cada pesticida

Pesticidas Fonte de

Variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática

Teste F

Regressão 146,51 2 73,26

Desvio 8,37 3 2,79

26,26*

Erro puro 8,37 3 2,79

Clorpirifós

Total 154,88 5 30,98

Regressão 278,18 2 139,09

Desvio 13,27 3 4,43

31,44*

Erro puro 13,27 3 4,43

-Cialotrina

Total 291,46 5 58,29

Regressão 492,29 2 246,15

Desvio 33,23 3 11,08

22,22*

Erro puro 33,23 3 11,08

Cipermetrina

Total 525,52 5 105,10

Regressão 521,53 2 260,76

Desvio 7,58 3 2,53

103,18*

Erro puro 7,58 3 2,53

Deltametrina

Total 529,10 5 105,82

* Significativo a um nível α = 0,05

Os resultados comentados anteriormente são mais bem entendidos

observando a Figura 1.5 A, B, C, D, em que estão representadas as superfícies

de respostas no triângulo cujos vértices correspondem aos

pseudocomponentes (0,5; 0,5; 0,5) obtidas no planejamento de mistura A para

os pesticidas clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina, geradas pelo

software statistica

As curvas de nível mostram que a extração de todos os pesticidas é

favorecida com o aumento da quantidade de acetato de etila na mistura,

principalmente para a cipermetrina (Figura 1.5 C) e a deltametrina (Figura 1.5

D) em que se espera uma extração próxima a 100% com o aumento gradativo

do acetato de etila.

Para o clorpirifós (Figura 1.5 A) e

-cialotrina (Figura 1.5 B), espera-se

uma extração máxima de 86 e 90%, respectivamente. Considerando que estes

resultados pertencem a uma extração de multirresíduos de uma matriz

complexa como o tomate, os resultados são considerados bastante

satisfatórios.

Figura 1.5 - Curvas de nível das misturas de solventes acetonitrila, água e acetato de etila, em termos de pseudocomponentes. Modelo

linear para a extração: A) clorpirifós, B)

-cialotrina, C) cipermetrina, D) deltametrina.

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetato de etila

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetonitrila

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Água

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetato de etila

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetonitrila

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Água

100

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetato de etila

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetonitrila

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Água

100

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetato de etila

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Acetonitrila

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Água

O planejamento de mistura B, usando acetonitrila, água e metanol,

tornando a mistura mais polar, também foi avaliado. A presença do metanol

como um dos componentes da mistura dificulta o congelamento da fase

aquosa. Uma característica vantajosa é que o extrato ficou mais claro pela

menor extração de carotenóides da matriz, o que possibilita uma menor

interferência de componentes da amostra na análise cromatográfica.

O planejamento de mistura C, usando os solventes isopropanol, água e

hexano, mostrou-se inadequado para análise por CG, pela grande quantidade

de pigmentos nos extratos. Extratos menos puro, podem diminuir a vida útil da

coluna e de outras partes do equipamento.

Assim, com resultados pouco satisfatórios usando os planejamentos B e

C optou-se por abandonar essas duas possibilidades. O planejamento de

mistura A (acetonitrila, água e acetato de etila), com resultados mais aceitáveis

foi avaliado com relação a outras variáveis como estratégia de

homogeneização, força iônica e clean up dos extratos.

1.2.2.2. Efeito do sistema de agitação da ESL-PBT na porcentagem de

extração dos pesticidas em tomate

A agitação é uma etapa importante durante a extração, pois ocorre maior

interação dos solventes com os componentes da matriz semi-sólida,

principalmente os pesticidas. Desta forma, as amostras foram submetidas a

quatro tipos diferentes de agitação (agitação manual, agitador mecânico por 10

minutos, ultra-som por 1 e 10 minutos). Os resultados são ilustrados na Figura

1.6.

100

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

% Extração

agitação manual agitador mecânico ultra-som 1 minuto ultra-som 10 minutos

Figura 1.6 – Influência do mecanismo de agitação na porcentagem de extração

de quatro pesticidas em amostras de tomate por ESL-PBT.

Resultados semelhantes foram encontrados para as diferentes

estratégias de agitação. No entanto, a agitação mecânica, em mesa agitadora,

produziu um maior desvio padrão (Figura 1.7), o que pode ser explicado pela

aderência dos compostos nas paredes do recipiente de extração. A

homogeneização em ultra-som por um minuto conferiu uma melhor precisão

dos dados, por isso optou-se por esta forma de agitação da mistura.

0,55

3,59

0,30

1,40

6,51

3,02

1,71

0,09

0,48

0,78

0,81

0,29

0,68

0,08

1,15

0,58

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

Desvio-padrão

agitação manual agitador mecânico ultra-som 1 minuto ultra-som 10 minutos

Figura 1.7 - Desvio padrão das porcentagens de extração médias, usando

diferentes estratégias de homogeneização da amostra, na ESL-PBT em

amostras de tomates.

1.2.2.3. Efeito da força iônica na porcentagem de extração dos pesticidas

em amostras de tomate

O aumento da força iônica é sempre recomendado na extração de

pesticidas em amostras aquosas, pois a adição de um sal à mistura extratora

pode melhorar a taxa de recuperação, particularmente, no caso de analitos

polares. O aumento da força iônica provoca redução na solubilidade do analito

na matriz, facilitando a sua extração pela fase orgânica (LANÇAS, 2004). Além

de melhorar a porcentagem de extração, o aumento da força iônica diminui a

formação de emulsões.

Entretanto, o aumento considerável da força iônica pode romper o

equilíbrio da fase única na ESL-PBT, antes do congelamento da amostra,

fenômeno denominado de salting-out. Assim, para manter as características da

mistura extratora (80% de acetonitrila, 5% de água e 15% de acetato de etila),

e avaliar o efeito da força iônica, o volume de água foi substituído por uma

solução de NaCl 0,20 mol L

-1

. Os resultados obtidos após avaliação deste

parâmetro estão representados na Figura 1.8.

100

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

% Extração

Alteração da força iônica com NaCl Sem alteração da força iônica

Figura 1.8 – Porcentagem de extração de pesticidas e os respectivos desvio

padrão em amostra de tomate, obtidas sem e com alteração da força iônica

(solução de NaCl 0,20 mol L

-1

) da mistura extratora na ESL-PBT.

Os resultados obtidos para a extração dos pesticidas com o aumento da

força iônica do meio são estatisticamente iguais à porcentagem de extração

dos pesticidas sem alterar a força iônica, ao nível de 95% de probabilidade pelo

teste t. Observações semelhantes foram feitas por VIEIRA et al (2007), em que

a força iônica do meio não interferiu significativamente na extração de

piretróides em água por ESL-PBT.

1.2.2.4. Avaliação do efeito de matriz na porcentagem de recuperação dos

pesticidas.

A taxa de recuperação de pesticidas em alimentos, nem sempre é

satisfatória devido aos efeitos de matriz na análise cromatográfica. A

quantificação dos compostos pode ser afetada pela presença de compostos co-

extraídos da matriz. A presença dessas impurezas nas amostras analisadas

pode causar problemas no detector e mais ainda em sítios do injetor

(MENKISSOGLU-SPIROUDI & FOTOPOULOU, 2004).

Sítios ativos do liner (tubo de vidro) do injetor é a principal fonte do efeito

de matriz, pois adsorve e, ou, induz a degradação térmica de alguns analitos

(ERNEY et al, 1993). Quando as soluções padrão são preparadas no solvente

puro e analisadas por cromatografia gasosa, mais sítios ativos do liner estão

disponíveis para retenção dos analitos. Enquanto que ao preparar padrões no

extrato da matriz, ocorre uma competição por esses locais entre os

componentes da matriz e os analitos, possibilitando que uma maior quantidade

de pesticida esteja disponível para introduzir-se na coluna cromatográfica

(SCHENCK & LEHOTAY, 2000). Entretanto, preparar os padrões em extratos

brancos, além de aumentar o custo e o tempo da análise, a concentração dos

próprios interferentes da matriz pode diferir de uma amostra para outra (RIBANI

et al, 2004).

Para o desenvolvimento de um método analítico, os possíveis efeitos de

matriz na análise cromatográfica devem ser levados em consideração mesmo

para comprovar a ausência ou presença do fenômeno sobre uma longa faixa

de concentração do analito na matriz. Para isso, duas séries de soluções

padrão foram preparadas, sendo uma em solvente puro e a outra em extratos

de amostra de tomate (RIBANI et al, 2004). As curvas analíticas preparadas em

acetonitrila e em extrato da matriz foram comparadas para os pesticidas

clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina, nas Figuras 1.9 A, B, C, D,

respectivamente.

Na Figura 1.9 A, a inclinação da curva analítica preparada em

acetonitrila e no extrato da matriz são correspondentes, sugerindo assim que o

pesticida clorpirifós não apresentou efeito de matriz, ou seja, a presença dos

componentes da matriz não interferiu, significativamente, em sua análise

cromatográfica. O clorpirifós é um pesticida mais polar que os piretróides,

então, esperavam-se uma maior adsorção deste composto no liner do injetor,

entretanto isso não ocorreu porque o clorpirifós é mais volátil, permanecendo

pouco tempo no injetor para ser adsorvido, sendo analisado mais rapidamente.

No entanto, para os piretróides (Figuras 1.9 B, C, D) os padrões

preparados em acetonitrila apresentam uma resposta menor quando

comparado aos padrões preparados em extratos da matriz, principalmente para

a cipermetrina e deltametrina, pois o aumento do coeficiente angular foi mais

expressivo.

0,5

1,5

2,5

3,5

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Concentração mg L

-1

Razão

Soluções padrão no extrato da matriz

Soluções padrão em acetonitrila

0,5

1,5

2,5

3,5

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Concentração mg L

-1

Razão

Soluções padrão no extrato da matriz

Soluções padrão em acetonitrila

0,5

1,5

2,5

0 100 200 300 400 500 600 700 80

Concentração mg L

-1

Razão

Soluções padrão no extrato da matriz

Soluções padrão em acetonitrila

0,5

1,5

2,5

3,5

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Concentração mg L

-1

Razão

Soluções padrão no extrato da matriz

Soluções padrão em acetonitrila

Figura 1.9 – Curvas analíticas preparadas em acetonitrila e em extrato da matriz isenta de pesticidas: A) clorpirifós, B)

-cialotrina, C)

cipermetrina, D) deltametrina.

A B

Na Figura 1.10 estão apresentadas as taxas de recuperação dos

pesticidas, após a ESL-PBT de amostras de tomates fortificadas, quando

comparadas com soluções padrões feitas em acetonitrila e em extratos da

matriz. Observa-se que ao considerar a interferência dos componentes da

matriz, as porcentagens de extração dos pesticidas mostravam-se na realidade

próximos a 70%.

100

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

% Extração

Padrão em acetonitrila Padrão em extrato da matriz

Figura 1.10 – Comparação das porcentagens de extração dos pesticidas

(clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina) quando relacionadas com

solução padrão preparada em solvente puro (acetonitrila) e quando

relacionadas com solução padrão preparada no extrato da matriz e os

respectivos desvio-padrão.

Conforme já discutido, os piretróides são mais influenciados pelo efeito

de matriz, destacando-se a deltametrina cuja taxa de recuperação que

supostamente era cerca de 99% (padrão em acetonitrila), apresentou na

realidade uma extração de 72% quando a solução padrão foi preparada na

presença dos componentes da matriz .

Já para o clorpirifós era esperada a ausência de efeito de matriz,

entretanto as taxas de recuperação para este pesticida ao serem determinadas

relacionando com solução padrão preparada em acetonitrila e com solução

padrão preparada no branco, mostraram-se estatisticamente diferentes ao nível

de 95% de probabilidade. Embora essa diferença nas porcentagens de

extração do clorpirifós não excedeu a 6%, o efeito de matriz mostrou-se

significativo. Os dados das análises cromatográficas para o clorpirifós

apresentados nas Figuras 1.9 A (ausência de efeito de matriz) e 1.10 (presença

do efeito de matriz) foram obtidos em épocas distintas, sendo que as amostras

de tomates, o tempo de uso da coluna cromatográfica e do liner no injetor,

também eram diferentes nas duas situações. Fatores como estes é que

dificultam a quantificação exata do efeito de matriz para um dado pesticida.

Outra maneira de avaliar este efeito de matriz é verificar o aumento

gradativo da resposta (áreas) na análise cromatográfica. SCHENCK &

LEHOTAY (2000) ao estudar o efeito de matriz na análise de organofosforados

encontrou dificuldades, pois as respostas mudavam à medida que os

componentes da matriz se depositavam no sistema de injeção (liner), tornando-

se imprevisível.

Para avaliar esta variação das áreas dos pesticidas na análise

cromatográfica, solução padrão dos pesticidas, em acetonitrila, foi analisada

antes e após injeções sucessivas de extrato obtido da ESL-PBT de amostra de

tomates isentas de pesticidas.

Na Figura 1.11 comparou-se a razão (área do pesticida / área do padrão

interno) para cada pesticida antes e após a saturação do CG-DCE por

componentes da matriz.

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

Razão (Área pesticida / Área padrão interno

)

Resposta antes da saturação do CG-ECD Resposta depois da saturação do CG-ECD

Figura 1.11 – Comparação da razão das áreas (área do pesticida / área do

padrão interno) para os pesticidas clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e

deltametrina preparados em acetonitrila antes e após saturar o sistema

cromatográfico (CG-DCE) com componentes da matriz tomate (branco).

Observou-se na Figura 1.11, que as respostas de todos os pesticidas

aumentaram significativamente após injetar extratos de amostras de tomate. A

deltametrina foi o pesticida mais afetado pelos componentes da matriz, pois a

resposta deste composto aumentou em aproximadamente 35%. Para os

pesticidas cipermetrina,

-cialotrina e clorpirifós, houve um aumento de 19%,

12% e 4%, respectivamente. Observa-se que esta ordem decrescente de efeito

de matriz corresponde exatamente à ordem de retenção dos compostos no

sistema cromatográfico (Figura 1.3), ou seja, quanto maior o tempo de retenção

do pesticida na análise cromatográfica maior a interferência da matriz. Neste

sentido, os piretróides são largamente afetados pelo efeito de matriz devido a

sua elevada massa molar, o que dificulta a volatilização destes no injetor e

consequentemente maior tempo de análise (SANCHEZ-BRUNETE, 2005).

Embora o aumento da resposta para o clorpirifós tenha sido de apenas 4%, o

efeito de matriz mostrou-se significativo ao nível de 95% de probabilidade pelo

teste t.

O efeito de matriz nos resultados pode ser significativo e deve ser

determinado cuidadosamente. A exata avaliação do efeito de matriz pode evitar

estimativas errôneas dos teores dos analitos, além de se ter uma técnica mais

confiável. Para redução do efeito de matriz é recomendável o uso de curva de

calibração preparada em extratos da matriz isenta de pesticidas (RIBANI,

2004), ou a utilização de substâncias protetoras nos padrões preparados em

solvente puro (SANCHEZ-BRUNETE et al, 2005). Ou ainda submeter os

extratos a novos processos de clean up.

1.2.2.5. Eficiência de adsorventes no clean up dos extratos obtidos na

ESL-PBT de amostras de tomate

Vários estudos sugerem a etapa de clean up para reduzirem ou

eliminarem co-extrativos das amostras antes da análise cromatográfica

(HAJSLOVÁ et al, 1998). Em recentes estudos foi concluído que extensivo

clean up para várias matrizes vegetais com a combinação de cartuchos de

troca iônica e carvão ativado reduzem o efeito de matriz (HAJSLOVÁ et al,

2003). A etapa de clean up com carvão ativado é muito útil, principalmente, na

remoção de pigmentos da matriz. Entretanto, o extensivo clean up pode

resultar na perda parcial dos pesticidas e aumentar o tempo de análise e

custos (SCHENCK & LEHOTAY, 2000).

Mesmo com resultados satisfatórios no processo de ESL-PBT dos

quatro pesticidas em amostras de tomate, observou-se que os extratos

possuíam quantidades apreciáveis de pigmentos. No entanto, ao utilizar o

detector por captura de elétrons (DCE) ou mesmo o detector por ionização em

chama (DIC) não se observava a presença destes compostos nos

cromatogramas. Notava-se que nas análises havia um pronunciado efeito de

matriz que poderia estar associado à presença destes pigmentos. Com o

objetivo de tornar os extratos mais puros avaliou-se o clean up desses extratos

pelo uso de adsorventes como: florisil, octadecil (C-18), sílica e carvão ativado.

Tal processo deveria diminuir a pigmentação dos extratos sem interferir

significativamente na recuperação dos pesticidas.

As taxas de recuperação dos pesticidas na ESL-PBT, utilizando quatro

adsorventes no clean up dos extratos, comparados com padrões em

acetonitrila, são mostradas na Figura 1.12.

100

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

% Extração

sem clean up clean up com florisil clean up com C18 clean up com sílica clean up com carvão

Figura 1.12 – Influência dos adsorventes florisil, octadecil (C-18), sílica e

carvão ativado na porcentagem de extração dos pesticidas no clean up dos

extratos obtidos pela ESL-PBT.

Florisil, octadecil (C-18) e sílica não proporcionaram extratos mais

claros, e, além disso, diminuíram a taxa de recuperação dos quatro pesticidas

devido à adsorção. Já o carvão ativado possibilitou a obtenção de extratos

incolores, porém reduziu as porcentagens de extração de todos os pesticidas

para aproximadamente 50 %, devido ao seu alto poder adsortivo (SOJO et al,

1997). Este resultado é semelhante ao encontrado por TORRES et al (1997) ao

analisar 13 pesticidas em amostras de tomate, usando a extração sólido-líquido

seguida por clean up com 0,5 g de carvão ativado. Entre os compostos

analisados estavam clorpirifós, cipermetrina e deltametrina, encontrando as

respectivas porcentagens de extração 61%, 50% e 40%.

Entretanto, a adição de carvão ativado, em menor quantidade, durante o

processo de extração mostrou-se mais eficiente na remoção dos componentes

indesejáveis da matriz, e afetou, em menor extensão, a taxa de recuperação

dos pesticidas clorpirifós, cipermetrina,

-cialotrina e deltametrina nos extratos.

A Figura 1.13 mostra a influência da adição de 0, 5, 10 e 15 mg de carvão

ativado, durante a extração, na taxa de recuperação dos pesticidas.

005 5

51010

10 1015

15 15 15

100

clorpirifós cialotrina cipermetrina deltametrina

Pesticidas

% Extração

Figura 1.13 – Porcentagens de recuperação dos pesticidas clorpirifós,

cipermetrina,

-cialotrina e deltametrina com a adição de 0, 5, 10 e 15 mg de

carvão ativado durante o processo de extração na técnica ESL-PBT.

Observa-se, na Figura 1.13, que à medida que a quantidade de carvão

ativado é aumentada nos extratos as porcentagens de extração dos pesticidas

diminuem, principalmente para o clorpirifós. Quantidades superiores a 15 mg

do adsorvente, embora forneçam extratos livres de pigmentos, tornam a técnica

inviável devido à adsorção acentuada dos pesticidas, reduzindo a taxa de

recuperação dos piretróides para quantidades inferiores a 70% e do clorpirifós

para cerca de 50%.

Resultados mais satisfatórios foram encontrados utilizando-se 10 mg do

carvão ativado, pois a taxa de recuperação dos piretróides foi próxima a 74 % e

os extratos apresentaram-se claros. Estes resultados são semelhantes aos

apresentados na Figura 1.10 na análise do efeito de matriz, em que a extração

dos piretróides diminuiu para cerca de 70% quando a interferência dos

componentes da matriz foi levada em consideração. Entretanto, a adição de 10

mg de carvão ativado reduziu expressivamente a extração do clorpirifós para

quantidades inferiores a 60%.

Já a adição de 5 mg de adsorvente foi insuficiente para remover

compostos da matriz, embora tenha possibilitado extração dos piretróides em

taxas superiores a 80% e do clorpirifós para 68% .

A Figura 1.14 mostra o efeito da adição do carvão ativado (0, 5, 10, 15

mg) na remoção dos componentes da matriz, principalmente o licopeno,

responsável pela coloração vermelha do tomate, analisados por

espectrofotometria.

O licopeno e demais pigmentos presentes no extrato da matriz,

absorvem, na análise espectrofotométrica, na região de 380 a 500 nm

(CARVALHO, 2005), desta forma, observa-se pela Figura 1.14 que a adição do

adsorvente reduz significativamente o teor de carotenóides. Nos comprimentos

de onda entre 340 e 390 nm, há absorção de energia de compostos

polifenólicos aromáticos, os flavonóides, que são antioxidantes presentes no

tomate (SIMONETTI, 2005). Estes compostos são removidos, apenas, na

presença de quantidades mais expressivas do adsorvente (10 e 15 mg).

Assim, no desenvolvimento da metodologia da ESL-PBT para os

piretróides cipermetrina,

-cialotrina e deltametrina em amostras de tomate, o

clean up é convenientemente realizado com a adição de 10 mg de carvão

ativado durante o preparo da amostra, fornecendo extrações superiores a 70

%, além de apresentar remoção significativa dos componentes da matriz

avaliada pela análise espectrofotométrica.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

320 350 380 410 440 470 500 530 560 590

Comprimento de onda (nm)

Absorbância

0 mg de carvão

5 mg de carvão

10 mg de carvão

15 mg de carvão

Figura 1.14 – Espectros de absorção dos extratos obtidos a partir da ESL-PBT

de amostras de tomate isenta de pesticidas com a adição de 0, 5, 10, 15 mg de

carvão ativo.

Embora os pigmentos não sejam detectados pelo detector de captura de

elétrons, o estudo do clean up dos extratos ainda é relevante no sentido de

preservar o sistema cromatográfico e diminuir o efeito de matriz provocado

pelos constituintes da amostra e os seus produtos de degradação.

1.2.3. Metodologia otimizada

A metodologia de ESL-PBT aplicada na extração dos pesticidas

clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina nas amostras de tomate foi

otimizada por meio do planejamento de misturas associada às análises

univariadas do efeito da força iônica, influência do mecanismo de agitação e

etapa de clean up. Entretanto para a validação da ESL-PBT para análises de

pesticidas em amostras de tomate, optou-se por não utilizar a etapa de clean

up com 10 mg de carvão ativado, devido à redução significativa da

porcentagem de extração do clorpirifós. Além disso, a alteração da força iônica

da mistura extratora mostrou-se desnecessária. Apesar dos resultados

apresentarem efeito de matriz, este não foi levado em consideração durante a

etapa de validação, para não aumentar o custo e o tempo de análises. Desta

forma, a metodologia otimizada aplicada na validação ficou estabelecida da

seguinte forma:

Extração de 4,0000 g de tomate, previamente fortificado com 1,25 mg

-1

, com 8,0 mL de acetonitrila, 0,5 mL de água e 1,5 mL de acetato de etila

seguida de agitação por 1 minuto em ultra-som. Após a agitação as amostras

foram deixadas no freezer a – 20 °C por 12 horas. Após o congelamento as

amostras foram filtradas na presença de sulfato de sódio anidro. Os extratos

foram recuperados em balão volumétrico de 10,0 mL e armazenados no freezer

para posterior análise por cromatografia gasosa.

A metodologia otimizada foi aplicada tanto na análise dos pesticidas em

amostra da polpa do tomate assim como em amostra do tomate inteiro,

proporcionando valores semelhantes na taxa de recuperação. O tomate verde,

embora seu consumo in natura seja mais restrito, também apresentou taxas de

recuperação dos pesticidas na ESL-PBT similares ao tomate maduro,

diferenciando apenas na coloração do extrato.

1.2.4. Validação do método analítico

Para avaliar o desempenho do método analítico, vários parâmetros

foram considerados, segundo recomendações do INMETRO (2003):

seletividade, limite de detecção, limite de quantificação, linearidade, precisão e

exatidão.

1.2.4.1. Seletividade

Para avaliar a seletividade do método de extração e análise por

cromatografia compararam-se os cromatogramas do extrato obtido na ESL-

PBT de uma matriz de tomate isenta dos pesticidas (Figura 1.15 A) com os

extratos de duas amostras de tomate fortificadas com os compostos em estudo

(Figura 1.15 B).

A amostra de tomate, apesar de possuir uma composição complexa, não

apresentou interferentes nos mesmos tempos de retenção dos compostos

analisados o que torna a metodologia seletiva. Esta seletividade está também

relacionada com a seletividade do detector aos compostos halogenados.

01234567891011

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

Resposta do detector

Tem

o de reten

ão

01234567891011

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

9.9

8.2

6.8

5.6

3.2

Resposta do detector/mV

Tempo de retenção

Figura 1.15 – A) Cromatograma do extrato obtido da matriz isenta dos

pesticidas e B) Cromatograma da amostra fortificada com 500 μg L

-1

dos

pesticidas (t

= 3,2 min: clorpirifós, t

= 5,6 min: bifentrina, t

= 6,8 min:

cialotrina, t

= 8,2 min: cipermetrina, t

= 9,9 min: deltametrina).

1.2.4.2. Limite de detecção e limite de quantificação

O limite de detecção (LD) para métodos cromatográficos, representa a

menor quantidade da substância estudada que pode ser diferenciada do ruído

do sistema com segurança, entretanto a detecção não implica que o analito

seja quantificável. O limite de quantificação (LQ) é a menor quantidade do

analito que pode ser quantificada com exatidão (INMETRO, 2003).

O limite de detecção pode ser calculado por meio dos parâmetros da

curva analítica:

LD = 3,3 x s / S

Sendo que:

s = estimativa do coeficiente linear da curva analítica

S = inclinação ou coeficiente angular da curva analítica

Para o cálculo do limite de quantificação, foram adotados critérios

semelhantes ao limite de detecção, ou seja:

LD = 10 x s / S

Para o cálculo das estimativas dos LD e LQ, foram construídas curvas

analíticas utilizando soluções padrão contendo os pesticidas nas

concentrações de 12, 8, 6, 4 e 2 μg L

-1

. Os coeficientes linear e angular das

curvas analíticas, bem como os valores de LD e LQ obtidos para os compostos

estão na Tabela 1.8.

Tabela 1.8 – Estimativa dos coeficientes linear (s) e angular (S) das curvas

analíticas, limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)

Pesticidas s S

LD (μg L

-1

) LQ (μg L

-1

)

Clorpirifós 0,0006 0,0049 0,40 1,2 0,9906

-cialotrina

0,0032 0,0031 3,4 10,3 0,9965

Cipermetrina 0,003 0,003 3,3 10,0 0,9954

Deltametrina 0,0003 0,0021 0,47 1,4 0,9986

Verificou-se que os valores dos limites de detecção obtidos para análise

dos compostos clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina utilizando

CG – DCE estão entre 0,40 e 3,4 μg L

-1

. Já o limite de quantificação obtido está

entre 1,2 e 10,3 μg L

-1

. VIEIRA et al (2007), analisando os piretróides

cialotrina, cipermetrina e deltametrina em água e solo por CG-DCE obteve

valores para o LD entre 1,1 e 2,9 μg L

-1

e LQ entre 3,3 e 9,6 μg L

-1

1.2.4.3. Curvas analíticas e linearidade de resposta do detector

As curvas analíticas foram construídas utilizando o método da

padronização interna, relacionando a concentração do pesticida com a razão

das áreas (área do pesticida / área do padrão interno). Pequenas variações na

temperatura, no volume da amostra ou possíveis erros nas injeções manuais

não interferem acentuadamente nos resultados, quando utilizado a

padronização interna (RIBANI 2004).

O padrão interno escolhido é um piretróide, que não reage com os

componentes da matriz, não degrada e possui tempo de retenção diferente, na

análise cromatográfica, aos pesticidas analisados e compostos da matriz. Os

experimentos revelaram que a bifentrina é um eficiente padrão interno, pois

praticamente não apresentou efeito de matriz, mantendo constante sua área no

decorrer de todas as análises cromatográficas.

Na Tabela 1.9 estão as equações de regressão bem como os

respectivos coeficientes de correlação (r), obtidos a partir da regressão linear

dos dados. Os coeficientes angular e linear da curva da cipermetrina e

deltametrina foram muito semelhantes proporcionando superposição das

mesmas.

Tabela 1.9 – Equações das retas e os respectivos coeficientes de correlação

Pesticidas Equações r

clorpirifós Y = 0,0042x + 0,0929 0,998

-cialotrina

Y = 0,0040x - 0,0217 0,998

cipermetrina Y = 0,0023x - 0,0083 0,999

deltametrina Y = 0,0023x - 0,0144 0,999

Os valores dos coeficientes de correlação encontrados estão de acordo

com as normas da ANVISA que recomenda valores superiores a 0,99. Assim, o

detector por captura de elétrons apresenta linearidade de resposta na faixa de

concentração de 5 a 750 μg L

-1

para os pesticidas clorpirifós,

-cialotrina,

cipermetrina e deltametrina.

1.2.4.4. Precisão

A precisão foi avaliada em termos de repetitividade dos resultados e

precisão intermediária.

A repetitividade foi estudada pelo cálculo da estimativa do coeficiente de

variação (CV) de sete repetições do procedimento otimizado da extração

sólido-líquido e purificação em baixa temperatura para os pesticidas clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina.

Os resultados do coeficiente de variação obtidos para a amostra de

tomate variaram entre 2,13% e 6,08 % (Tabela 1.10), tendo o organofosforado

clorpirifós apresentado maior dispersão dos resultados. Entretanto esses

resultados demonstram excelente repetitividade, uma vez que os coeficientes

de variação se encontram bem abaixo do recomendado para amostras

complexas. Segundo RIBANI et al. (2004), são aceitáveis CV de até 20% para

amostras complexas, como por exemplo, o tomate.

Tabela 1.10 – Porcentagem de recuperação (% R), coeficiente de variação

(CV) e desvio padrão (DP) obtido após sete extrações dos pesticidas em

amostras de tomate

Pesticidas R (%) DP CV (%)

Clorpirifós 79,04 4,81 6,08

-cialotrina

79,37 3,71 4,68

Cipermetrina 88,44 1,91 2,13

Deltametrina 91,94 3,36 3,65

Já a precisão intermediária refere-se às variações ocorridas dentro de

um laboratório, quando alguns fatores são alterados, tais como: analista,

equipamentos, período (tempo), etc. Neste trabalho, a precisão intermediária

do método foi verificada pelas porcentagens de recuperação dos pesticidas e

respectivos coeficientes de variação (CV) analisados em três dias diferentes.

As análises foram realizadas aos 7 e 30 dias após o primeiro teste, pelo

mesmo analista, mesmo equipamento, etc. Os resultados obtidos estão

dispostos na Tabela 1.11.

Tabela 1.11 – Porcentagem de recuperação (% R) e coeficiente de variação

(CV) obtidos após a análise em dias diferentes, pelo mesmo analista

clorpirifós

-cialotrina

cipermetrina deltametrina

Dias

R(%) CV(%) R (%) CV(%) R(%) CV(%) R(%) CV(%)

1 Dia 83,00 3,91 86,59 3,67 89,53 1,87 97,93 3,55

7 Dias 81,63 2,34 82,66 3,28 90,05 2,63 92,41 2,57

30 Dias 82,43 1,53 84,53 1,20 92,09 1,80 91,82 0,56

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 1.11, pode-se

afirmar que a técnica de extração em estudo apresenta porcentagens de

recuperação estatisticamente iguais (ao nível de 95 % de probabilidade) em

diferentes dias, para cada pesticida extraído no tomate. Além disso, os valores

dos coeficientes de variação foram baixos variando de 0,56 a 3,91 para todos

os princípios ativos.

1.2.4.5. Exatidão

A exatidão da ESL-PBT foi avaliada realizando ensaios de recuperação,

em que a porcentagem de extração foi calculada adicionando os pesticidas em

concentrações próximas à 1, 2, 4 e 10 vezes o limite de quantificação (LQ).

Assim, os ensaios de recuperação foram realizados extraindo-se as

substâncias de interesse, presentes na matriz de tomate, conforme o

procedimento otimizado, obtendo-se no extrato final 10, 20, 40 e 100 μg L

-1

Estes valores correspondem a 0,025; 0,050; 0,10 e 0,25 mg kg

-1

de tomate,

respectivamente.

Os resultados obtidos para extração dos pesticidas clorpirifós,

cialotrina, cipermetrina e deltametrina no tomate, bem como os respectivos

coeficientes de variação estão apresentados na Tabela 1.12.

Tabela 1.12 – Porcentagem de recuperação (%R) e coeficiente de variação

(CV) obtidos após extração da amostra de tomate, fortificadas pelos pesticidas

em quatro concentrações diferentes

Concentração clorpirifós

-cialotrina

cipermetrina deltametrina

(μg L

-1

)

mg kg

-1

% R CV % R CV % R CV % R CV

10 0,025 81,78 1,77 79,32 2,22 - - 93,55 0,66

20 0,05 82,08 3,06 85,55 2,31 97,09 0,88 91,88 0,48

40 0,1 79,44 2,44 86,73 4,20 92,20 4,03 90,80 0,97

100 2,5 82,40 3,52 87,06 4,39 95,11 1,38 91,18 0,58

Os resultados apresentados na Tabela 1.12, para a extração dos

pesticidas em amostras de tomate são estatisticamente equivalentes entre si

(ao nível de 95 % de probabilidade), mostrando a exatidão do método.

Embora a extração dos três isômeros da cipermetrina tenha apresentado

boa taxa de recuperação, nas concentrações de 20, 40 e 100 μg L

-1

, observou-

se que em concentrações inferiores a 40 μg L

-1

, o terceiro isômero da

cipermetrina não pode ser quantificado, pois um interferente da matriz é

extraído e possui mesmo tempo de retenção do terceiro isômero. Este

interferente somente foi observado em concentrações muito baixas da

cipermetrina, pois nas concentrações de 500 μg L

-1

e 100 μg L

-1

ou no extrato

da matriz isento de pesticidas (branco), não foi perceptível a sua interferência.

A presença deste composto não faz perder a validade do método de extração

para a cipermetrina, pois a taxa de recuperação, mostrada na Tabela 1.12 para

as concentrações de 20 e 40 μg L

-1

, refere-se apenas aos dois primeiros

isômeros da cipermetrina.

A análise cromatográfica de analitos presentes em amostras complexas

e em níveis muito baixos pode sofrer interferências que afetam

significativamente os resultados. Por exemplo, na concentração de 10 μg L

-1

os sinais detectados da cipermetrina após a ESL-PBT não puderam ser

diferenciados dos ruídos, impossibilitando sua quantificação. Assim, até 20 μg

-1

foi possível quantificar a cipermetrina pela metodologia desenvolvida. Já o

clorpirifós,

-cialotrina e deltametrina foram quantificados em concentrações de

até 10 μg L

-1

com segurança.

Considerando o limite máximo de resíduo permitido (LMR), determinado

pela ANVISA para os pesticidas,

-cialotrina (0,05 mg kg

-1

), cipermetrina (0,10

mg kg

-1

) e deltametrina (0,03 mg kg

-1

), verifica-se que a metodologia otimizada

possibilita a extração e quantificação dos pesticidas em quantidades inferiores

às estabelecidas, considerando as respectivas taxas de recuperação. Por

exemplo, a cipermetrina não é quantificada em concentrações muito baixas

após ESL-PBT e análise por CG, entretanto, observa-se que o limite de

detecção do método (0,05 mg kg

-1

) é inferior ao LMR (0,10 mg kg

-1

1.2.5. Determinação dos pesticidas clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e

deltametrina em amostras comerciais de tomate

A técnica de ESL-PBT otimizada foi aplicada em três amostras de

tomates, obtidas em comércios da cidade de Viçosa-MG originários de

diferentes fornecedores.

Nas amostras analisadas, não foi constatada a presença de resíduos de

nenhum dos compostos: clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina.

CAPÍTULO 2

DISPERSÃO DA MATRIZ EM FASE SÓLIDA

2.1. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1.1. Preparo de soluções padrão de pesticidas

As soluções empregadas neste trabalho foram preparadas pela

solubilização de padrões de clorpirifós (99,0 % m/m - Chem Service),

cipermetrina (92,4% m/m – Chem Service),

-cialotrina (86,5% m/m -

Syngenta) e deltametrina (99,0 % m/m – Chem Service), em acetonitrila

(Mallickrodt / HPLC). Soluções estoque de 500,0 mg L

-1

foram preparadas

para cada padrão e armazenadas a baixa temperatura. A partir de diluição das

soluções estoque em acetonitrila, foi preparado uma solução de trabalho

contendo os quatros pesticidas em concentrações de 10,0 mg L

-1

Uma segunda solução de concentração igual a 10,0 mg L

-1

, utilizada

como padrão interno, foi preparado pela solubilização de padrão de bifentrina

(92,2 % m/m – FMC do Brasil) em acetonitrila.

2.1.2. Preparo de amostras de tomate hidropônico fortificadas

Amostras de tomate (aproximadamente 3 a 4 unidades) foram trituradas

em processador caseiro e quantidades de polpa iguais a 0,5000 g foram

fortificadas com 50,0 μL de solução de trabalho contendo os quatro pesticidas

na concentração de 10,0 mg L

-1

. As amostras contaminadas (1,00 mg kg

-1

)

foram deixadas por aproximadamente três horas em recipiente aberto para

evaporação do solvente.

2.1.3. Otimização da técnica de extração Dispersão da Matriz em Fase

Sólida (DMFS)

A técnica de extração dispersão da matriz em fase sólida foi otimizada

para a extração dos pesticidas clorpirifós, cipermetrina,

-cialotrina e

deltametrina em amostras de tomate. Após a extração, as concentrações dos

analitos foram determinadas por cromatografia gasosa com detector por

captura de elétrons. Os experimentos realizados na otimização são descritos

nos itens 2.1.3.1, 2.1.3.2, 2.1.3.3.

2.1.3.1. Extração dos pesticidas em tomate por DMFS – Técnica geral

Amostras de tomates, 0,5000 g, foram colocadas em cápsula de

porcelana e fortificadas. Foram acrescentados 0,5000 g de adsorvente e, em

seguida, macerou-se a mistura até a completa dispersão da amostra. A mistura

(amostra + adsorvente) na proporção de 1:1 foi transferida para uma coluna de

polietileno (cartucho) de 10 mL contendo 1,0000 g de Na

anidro retido por

lã de vidro.

O cartucho foi adaptado a um sistema a vácuo conforme a Figura 2.1.

Figura 2.1 – Representação da eluição dos extratos na dispersão da matriz em

fase sólida em cartuchos de polietileno.

Adicionaram-se 10,0 mL de solvente (fração 1) ao cartucho em dois

volumes iguais (5,0 mL + 5,0 mL). O fluxo foi ajustado a uma vazão de 0,4 mL

min

-1

, aproximadamente. Ao extrato coletado acrescentou-se 50,0 μL de

solução de padrão interno (bifentrina) a 10,0 mg L

-1

. Evaporou-se o solvente

sob corrente de ar e o extrato foi recuperado em 1,0 mL de acetonitrila para

análise por cromatografia gasosa.

Ao mesmo cartucho foi adicionado novamente 10,0 mL do mesmo

eluente (5,0 mL + 5,0 mL) e coletados em outro frasco de vidro (fração 2), para

avaliar o volume de solvente necessário para extrair os pesticidas do cartucho.

2.1.3.2. Avaliação do adsorvente e eluente para a técnica de extração

DMFS

O procedimento descrito no item 2.1.3.1 foi empregado para avaliar a

influência de quatros adsorventes e dois eluentes na porcentagem de

recuperação dos pesticidas e na remoção de componentes da matriz, como

mostrado na Tabela 2.1.

Tabela 2.1 – Adsorventes e eluentes avaliados para otimização da DMFS

Ensaios Adsorventes Eluentes

1 e 2 Sílica Acetato de etila

3 e 4 Sílica Hexano: Acetona (9:1)

5 e 6 Florisil Acetato de etila

7 e 8 Florisil Hexano: Acetona (9:1)

9 e 10 C-18 Acetato de etila

11 e 12 C-18 Hexano: Acetona (9:1)

13 e 14 C-8 Acetato de etila

15 e 16 C-8 Hexano: Acetona (9:1)

Os ensaios foram realizados em duplicatas. Para cada combinação de

adsorvente e eluente foi preparado um branco (extrato da matriz isenta de

pesticidas).

2.1.3.3. Planejamento Fatorial

Usando o adsorvente florisil que melhores resultados apresentaram e o

solvente mais adequado, acetato de etila, foi preparado um planejamento

fatorial com o objetivo de obter extratos mais puros e maiores taxas de

recuperação.

Para extração dos quatro pesticidas em tomate foi realizado um

planejamento fatorial completo 2

com o objetivo de avaliar o comportamento

de três fatores: (1) proporção adsorvente/amostra, (2) presença de co-coluna e

(3) auxílio do banho ultra-sônico na extração. Cada fator foi estudado em dois

níveis (Tabela 2.2). A co-coluna representa uma camada de adsorvente

(0,5000 g) colocada previamente dentro do cartucho para auxiliar no clean up

dos extratos, retendo componentes da matriz. Neste trabalho foi escolhida a

sílica como co-coluna.

Como o fatorial em questão envolve 3 fatores com dois níveis cada um,

o planejamento requer 8 experimentos. Em cada ensaio foram feitas duas

repetições totalizando 16 experimentos.

Os sinais empregados (-) e (+) indicam níveis dos fatores nos ensaios.

As respostas usadas para avaliar os efeitos dos fatores neste planejamento

fatorial foram as porcentagens de recuperação obtidas para cada um dos

pesticidas após extração nas amostras de tomates.

Tabela 2.2 – Planejamento fatorial 2

para amostras de tomate fortificadas

Fatores

codificados

Fatores originais

Ensaios

F(1) F(2) F(3) Adsorvente/ Amostra

(1)

Co-coluna

(2)

Banho ultra-sônico

(3)

1 e 2 - - - 1:1 sem sem

3 e 4 + - - 2:1 sem sem

5 e 6 - + - 1:1 com sem

7 e 8 + + - 2:1 com sem

9 e 10 - - + 1:1 sem com

11 e 12 + - + 2:1 sem com

13 e 14 - + + 1:1 com com

15 e 16 + + + 2:1 com com

Branco + + + 2:1 com com

Para otimizar a extração dos pesticidas clorpirifós,

-cialotrina,

cipermetrina e deltametrina por DMFS, os ensaios foram delineados da

seguinte maneira:

Em cápsula de porcelana foi adicionada 0,5000 g de amostra de tomate

hidropônico, previamente fortificada (item 2.1.3.1.). Adicionou-se 0,5000 ou

1,0000 g do adsorvente florisil correspondentes aos níveis (-) e (+),

respectivamente (Tabela 2.2). Triturou-se a mistura até completa dispersão da

matriz, sendo transferida, em seguida, para um cartucho contendo Na

anidro e uma co-coluna com 0,5000 g de sílica, caso o ensaio correspondesse

ao nível (+) do planejamento. Foram adicionados 5,0 mL de solvente extrator

ao cartucho e levado ao banho ultra-sônico por 10 minutos. Esta última etapa

foi realizada somente para os ensaios pertencentes ao nível (+) deste fator.

Posteriormente, foi realizada a eluição com mais 5,0 mL de solvente, e

coletadas em frascos de vidro . Adicionaram-se 50,0 μL de padrão interno

(bifentrina) a 10,0 mg L

-1

. O solvente foi evaporado sob corrente de ar, e o

extrato recuperado em 1,0 mL de acetonitrila. O mesmo procedimento nos

níveis superiores (+) dos três fatores foi realizado para uma amostra de tomate

isenta de pesticidas (branco), para verificar ausência de interferentes nos

tempos de retenção dos pesticidas.

2.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.2.1. Avaliação de adsorventes e eluentes para a técnica de extração

DMFS

A escolha do solvente adequado é a etapa determinante na eficiência da

extração dos pesticidas em amostras de tomate, e no procedimento de clean

up dos extratos na dispersão da matriz em fase sólida. Alguns trabalhos da

literatura têm relatado o uso do acetato de etila e da mistura de hexano:

acetona (9:1) como eluentes eficientes na extração de pesticidas (LING &

HUANG, 1995).

Entretanto, é importante destacar que o efeito do solvente depende das

características físicas do adsorvente utilizado na dispersão da amostra. Por

isso, foram avaliados quatro adsorventes de polaridades distintas na DMFS,

sendo o florisil (silicato de magnésio) e a sílica os mais polares, e o octadecil

(C-18) e octil (C-8) os de menor polaridade. Os resultados obtidos na extração

dos pesticidas variando os quatro adsorventes com os dois eluentes são

mostrados na Tabela 2.3.

Tabela 2.3 – Taxa de recuperação dos pesticidas (% R) e respectivos

coeficientes de variação (CV), na extração por DMFS

Pesticidas

Ensaios

Adsorvente /

Eluente

Clorpirifós

R(%) CV(%)

-cialotrina

R(%) CV(%)

Cipermetrina

R(%) CV(%)

Deltametrina

R(%) CV(%)

1 e 2 Sílica/Acetato 54,35 7,78 55,23 0,63 54,23 1,98 53,97 0,87

3 e 4 Sílica/Hex:Acet 63,81 11,58 50,12 6,73 50,62 3,36 48,17 1,76

5 e 6 Florisil/Acetato 59,69 6,45 81,79 3,84 87,85 3,86 85,95 4,17

7 e 8 Florisil/Hex:Acet 46,64 10,50 72,62 10,36 76,61 4,00 75,27 9,04

9 e 10 C18/Acetato 21,98 8,01 51,29 10,55 58,21 5,06 56,29 9,29

11 e 12 C18/Hex:Acet 29,43 12,01 44,61 2,26 41,25 8,12 42,66 3,32

13 e 14 C8/Acetato 67,22 10,27 74,58 2,81 69,84 3,72 67,18 1,90

15 e 16 C8/Hex:Acet 40,78 8,93 53,17 7,05 48,66 4,47 59,12 0,15

O uso do acetato de etila como eluente proporcionou as maiores taxas

de extração dos piretróides (

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina) em

relação à mistura hexano: acetona (9:1), para os quatro adsorventes. Destaca-

se como adsorvente o florisil, que proporcionou melhores porcentagens de

recuperação dos pesticidas. Os piretróides interagem fracamente com a

superfície do florisil devido ao seu acentuado caráter hidrofóbico, e por isso o

acetato de etila solubilizou estes pesticidas mais facilmente (LING e HUANG,

1995).

Verificou-se que as taxas de recuperação dos piretróides foram

superiores as encontradas para o clorpirifós. Este resultado foi diferente do

observado por (TORRES et al, 1997), que encontrou maiores valores de

extração para organofosforados em tomate, usando o adsorvente C-18 e

acetato de etila como eluente.

O C-18 forneceu os resultados mais baixos de extração para os

piretróides, quando eluídos com a mistura hexano: acetona (9:1). Isso pode ser

explicado pela forte interação dos pesticidas com este adsorvente, sendo

parcialmente removidos pelo solvente (TORRES et al, 1997).

Na Figura 2.2 está representado os cromatogramas dos extratos

recuperados em acetonitrila, após a extração dos quatro pesticidas em tomate

fortificados, pelo método da DMFS.

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

FLORISIL / ACETATO

1. Clorpirifós (59,69%)

2. Bifentrina

-cialotrina (81,79%)

4. Cipermetrina (87,85%)

5. Deltametrina (85,95%)

)

FLORISIL / HEX: ACETONA

1. Clorpirifós (46,64%)

2. Bifentrina

-cialotrina (72,62%)

4. Cipermetrina (76,61%)

5. Deltametrina (75,27%)

C8 / ACETATO

1. Clorpirifós (67,22%)

2. Bifentrina

-cialotrina (74,58%)

4. Cipermetrina (69,84%)

5. Deltametrina (67,18%)

)

C8 / HEX: ACETONA

1. Clorpirifós (40,78%)

2. Bifentrina

-cialotrina (53,17%)

4. Cipermetrina (48,66%)

5. Deltametrina (59,12%)

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta dodetector / mV

Tempo / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tem

o / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tem

o / min

Figura 2.2 – Cromatogramas obtidos por DMFS para os pares adsorventes/eluentes: A) Florisil / Acetato, B) Forisil / Hexano:Acetona,

C) C8 / Acetato e D) C8 / Hexano:Acetona, E) C18 / Acetato, F) C18 / Hexano:Acetona, G) Sílica / Acetato e H) Sílica / Hexano:Acetona.

C18 / HEX: ACETONA

1. Clorpirifós (29,43%)

2. Bifentrina

-cialotrina (44,61%)

4. Cipermetrina (41,25%)

5. Deltametrina

(

42,66%

)

C18 / ACETATO

1. Clorpirifós (21,98%)

2. Bifentrina

-cialotrina (53,29%)

4. Cipermetrina (58,21%)

5. Deltametrina

(

56,29%

)

SÍLICA / ACETATO

1. Clorpirifós (54,35%)

2. Bifentrina

-cialotrina (55,23%)

4. Cipermetrina (54,23%)

5. Deltametrina (53,97%)

SÍLICA / HEX: ACETONA

1. Clorpirifós (63,81%)

2. Bifentrina

-cialotrina (50,12%)

4. Cipermetrina (50,62%)

5. Deltametrina (48,17%)

G) H)

Avaliando-se a qualidade dos cromatogramas, percebe-se que aqueles

obtidos de extratos em que o hexano: acetona (9:1) foi usado como eluente,

são mais puros. Os cromatogramas B, D, F e H da Figura 2.2 mostraram,

aparentemente, serem extratos mais puros, especialmente na região após a

resposta do solvente.

Comparando-se os resultados obtidos usando o mesmo eluente,

observa-se o efeito do adsorvente na pureza dos extratos. Em todos eles, os

picos dos pesticidas 1, 2, 3, 4 e 5, estão bem separados. No entanto, no

cromatograma H, obtido do extrato usando hexano: acetona (9:1) como eluente

e sílica como adsorvente, observa-se a ausência de todos os picos

interferentes que estão presentes nos demais cromatogramas. Entretanto,

quantitativamente, no extrato, o adsorvente sílica proporcionou rendimentos de

extração insatisfatórios (Tabela 2.3).

Os cromatogramas dos extratos em que o florisil foi utilizado, mesmo

apresentando picos de outras espécies além dos pesticidas de interesse, são

de pureza satisfatória. Os extratos de um branco não mostraram a presença de

nenhum interferente com tempo de retenção igual aos dos pesticidas.

Comparativamente também com esse adsorvente foram obtidas as melhores

taxas de recuperação.

Para o florisil, usando maiores volumes de acetato de etila, não foi

possível melhorar a eficiência de extração. Uma segunda eluição feita no

cartucho mostrou que o processo não era eficiente para extrair os pesticidas

que ainda estavam adsorvidos (Figura 2.3). Quantitativamente a maior parte

(60 a 90%) dos pesticidas encontrava-se na primeira extração ao passo que na

segunda extração não excedia a 6%.

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

Figura 2.3 – Cromatograma de extrato obtido por DMFS para a extração dos

pesticidas em tomate para uma segunda eluição com acetato de etila no

mesmo cartucho.

Embora muitos trabalhos na literatura não reportem a importância do

condicionamento dos adsorventes na DMFS, estes quando são condicionados

antes da dispersão da amostra, podem diminuir a presença de interferentes e

possibilitar melhor porcentagem de recuperação dos pesticidas (BARKER et al,

2000a).

Os cromatogramas da Figura 2.4 (A e B) mostram a influência do

condicionamento do florisil utilizado como dispersante da amostra e da sílica

usada como co-coluna. O condicionamento foi realizado com acetato de etila,

em banho ultra-sônico por 10 minutos, antes da dispersão da amostra.

FLORISIL / ACETATO

1. Clorpirifós (2,49%)

2. Bifentrina

-cialotrina (5,66%)

4. Cipermetrina (5,78%)

5. Deltametrina

(3,46%)

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tem

o / min

Figura 2.4 - Cromatogramas obtidos de extratos obtidos da DMFS: A) Extração

dos pesticidas sem condicionamento do adsorvente, B) Extração dos pesticidas

com condicionamento do adsorvente.

As porcentagens de extração dos pesticidas foram similares nas duas

situações. Entretanto, o não condicionamento dos adsorventes resultou em

cromatogramas com muito ruído e sinais de impurezas, como pode ser

verificado na Figura 2.4A.

2.2.2. Planejamento Fatorial

O planejamento fatorial completo 2

foi escolhido por permitir avaliar a

influência dos fatores (proporção de adsorvente/amostra, presença de co-

coluna e auxílio do banho ultra-sônico na extração), sobre a porcentagem de

recuperação, e suas possíveis interações, com um número mínimo de

experimentos. As condições empregadas em cada ensaio e os valores

encontrados para as porcentagens de recuperação dos pesticidas são

descritos na Tabela 2.4.

Tabela 2.4 – Resultados de um planejamento fatorial 2

para estudar o efeito

de três fatores sobre a porcentagem de extração dos pesticidas em amostras

de tomate

Fatores originais % Recuperação (CV)

Ensaios

Adsorvente/

Amostra

(1)

Co-

coluna

(2)

Banho

ultra-sônico

(3)

Clorp. Cialot. Ciperm. Deltam.

1 e 2 1:1 sem sem 52,15

(3,39)

71,32

(3,22)

84,16

(3,08)

80,24

(1,60)

3 e 4 2:1 sem sem 39,11

(12,02)

61,21

(5,85)

84,42

(4,12)

73,70

(3,47)

5 e 6 1:1 com sem 36,06

(12,20)

79,12

(2,90)

85,71

(0,80)

81,42

(5,44)

7 e 8 2:1 com sem 39,60

(1,86)

73,85

(4,35)

78,91

(4,62)

69,17

(3,40)

9 e 10 1:1 sem com 60,69

(2,38)

84,78

(0,56)

84,73

(0,48)

86,41

(2,23)

11 e 12 2:1 sem com 64,73

(4,86)

88,28

(3,17)

99,21

(0,52)

89,18

(3,77)

13 e 14 1:1 com com 49,57

(4,49)

89,79

(7,32)

86,87

(0,27)

89,54

(5,42)

15 e 16 2:1 com com 62,52

(1,32)

90,15

(1,17)

94,70

(3,49)

86,70

(5,33)

As taxas de recuperação de cada um dos 16 ensaios foram tratados

estatisticamente com o objetivo de avaliar a influência de cada um dos fatores

isoladamente bem como das interações entre os fatores em suas taxa de

recuperação.

Na Tabela 2.5 estão resumidamente as taxas médias de recuperação de

cada um dos pesticidas, o efeito de cada fator, suas interações e as estimativas

do erro experimental. As estimativas dos efeitos correspondem a influências

significativas, ao nível de 95% de probabilidade.

Tabela 2.5 – Porcentagens de recuperação média, efeitos de cada fator e

interações entre os fatores (± estimativa do erro experimental) de extração de

cada um dos pesticidas, obtidos nos experimentos do planejamento fatorial

para amostras de tomate

Clorpirifós

-cialotrina

Cipermetrina Deltametrina

Recuperação média 50,55±1,40 79,81±1,64 87,34±1,17 82,04±1,71

(1) Adsorvente / Amostra 1,87±2,80 -2,88±3,28 3,94±2,34 -4,72±3,41

(2) Co-coluna

-7,23±2,80*

6,83±3,28 -1,58±2,34 -0,67±3,41

(3) Banho ultra-sônico

16,88±2,80* 8,08±3,28* 11,83±2,34*

0,00±3,41

(1) e (2) 6,37±2,80 0,42±3,28 -3,43±2,34 -2,83±3,41

(1) e (3)

6,62±2,80*

4,81±3,28

7,21±2,34*

4,68±3,41

(2) e (3) 0,57±2,80 -3,39±3,28 0,40±2,34 1,00±3,41

(1) e (2) e (3) -1,92±2,80 -2,00±3,28 0,10±2,34 0,03±3,41

* Efeito estatisticamente significativo ao nível de 95% de probabilidade pelo teste t.

Verificou-se que a proporção adsorvente: amostra não influenciou

significativamente ao nível de 95% de probabilidade pelo teste t na

porcentagem de extração dos pesticidas pela DMFS, considerando apenas as

proporções 1:1 e 2:1 de adsorvente: amostra. Todavia, proporções maiores

podem ser utilizadas para melhorar o rendimento de extração, conforme

sugerido por BARKER (2000b) a proporção 4:1, para análise de pesticidas em

frutas, vegetais e alimentos processados usando como dispersantes fases

ligadas (C-8 ou C-18). PENSADO et al (2005) avaliou a extração de

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em peixes com C-18 na proporção 3:1

(adsorvente: amostra).

Já a presença da co-coluna apresentou um efeito significativamente

negativo na extração do clorpirifós, diminuindo de 7,23% a porcentagem de

recuperação. O clorpirifós por ser um pesticida mais polar adsorve mais

fortemente na sílica que também é polar, dificultando a eluição.

Embora estatisticamente não se tenha observado nenhuma influência

significativa na extração dos piretróides, a presença da co-coluna afeta

qualitativamente os cromatogramas. Comparativamente os cromatogramas dos

extratos em que foi utilizada a co-coluna (Figuras 2.5 A e B) apresentaram

menos picos desconhecidos em relação aqueles em que a co-coluna não foi

utilizada.

Figura 2.5 – Cromatogramas de extratos obtidos da DMFS para o par

Florisil/Acetato de etila: A) Extração dos pesticidas com condicionamento

prévio do florisil e sem uso da co-coluna (sílica), B) Extração dos pesticidas

com florisil e com uso da co-coluna (sílica), ambos com condicionamento

prévio.

As setas indicadas na Figura 2.5A mostram os componentes da matriz

que foram eliminados na presença de sílica como co-coluna. Observou-se

também, uma redução dos ruídos na linha de base. Portanto, para análise de

piretróides em amostras de tomate a presença de sílica como co-coluna não

interfere na extração destes pesticidas e melhora a qualidade dos

cromatogramas eliminando componentes da matriz. Entretanto, na análise do

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tempo / min

012345678910111213

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Resposta do detector / mV

Tem

o / min

organofosforado (clorpirifós) não é recomendável, pois diminui a porcentagem

de extração.

O banho ultra-sônico foi o fator que apresentou maior influência na

recuperação dos pesticidas, como verificado na Tabela 2.5. O rendimento da

extração para o clorpirifós,

-cialotrina e cipermetrina aumentaram,

respectivamente, de 16,88%; 8,08% e 8,83%. Resultados semelhantes foram

observados por ALBERO et al (2003) na extração de endosulfan em polpas de

tomate. A deltametrina foi o único pesticida que não sofreu interferência do

ultra-som.

Observou-se que há um efeito de interação apenas entre os fatores (1) e

(3), ou seja, quando a extração é realizada com o adsorvente em maior

proporção (2:1) em banho ultra-sônico, a porcentagem de extração do

clorpirifós e cipermetrina aumentou significativamente em 6,62% e 8,08%,

respectivamente. Para os outros dois pesticidas a

-cialotrina e deltametrina o

aumento de 4,81% e 4,68%, respectivamente, não foi significativo.

Portanto, usar o florisil previamente condicionado na proporção

adsorvente: amostra 2:1, não utilizar co-coluna e deixar o cartucho exposto ao

banho ultra-sônico foram as melhores condições de extração dos pesticidas

clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina, em amostras de tomate por

DMFS.

2.2.3. Metodologia otimizada

A metodologia de extração DMFS aplicada para os pesticidas clorpirifós,

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina em amostras de tomate após a

otimização foi estabelecida da seguinte maneira:

Em cápsula de porcelana é adicionado 0,5000 g de amostra de tomate,

previamente fortificada com 1,00 mg kg

-1

. Macera-se a amostra com 0,5000 g

de florisil (condicionado com acetato de etila em banho ultra-sônico) até a

completa dispersão da matriz, sendo transferida a mistura, em seguida, para

um cartucho contendo 1,0000 g de Na

anidro. São adicionados 5,0 mL de

acetato de etila no cartucho e levado ao banho ultra-sônico por 10 minutos.

Posteriormente, é realizada a eluição com mais 5,0 mL de solvente, e

coletadas em frascos de vidro . Acrescenta-se 50,0 μL de padrão interno

(bifentrina) a 10,0 mg L

-1

. O solvente é evaporado sob corrente de ar, e o

extrato recuperado em 1,0 mL de acetonitrila e guardados no freezer até o

momento da análise cromatográfica.

2.3. Comparação das técnicas de ESL-PBT e DMFS

A DMFS não é considerada oficialmente um método de referência.

Entretanto, esta técnica tem sido empregada na extração de vários pesticidas

em alimentos como feijão (LOPES & DOREA, 2003), laranja (CARDOSO et al,

2004), chá (HU et al, 2005), etc. A vantagem desta técnica se deve ao fato de

que a extração dos analitos e o clean up dos extratos são realizados

simultaneamente (KRISTENSON et al, 2006). Desta forma, a DMFS pode ser

considerada como uma valiosa ferramenta na extração de contaminantes em

matrizes complexas como produtos comestíveis (BOGIALLI & CORCIA, 2006).

Assim, os resultados obtidos por ESL-PBT foram comparados com os

dados da DMFS para avaliar a exatidão do método. A Tabela 2.6 mostra as

porcentagens de extração, dos pesticidas pelas duas técnicas, calculadas para

amostras de tomate fortificadas com 1,25 mg kg

-1

para a ESL-PBT e 1,00 mg

-1

para a DMFS.

Tabela 2.6 – Taxas de recuperação dos pesticidas e seus respectivos desvios

padrão empregando a técnica de ESL-PBT e DMFS

Pesticidas

Métodos

Clorpirifós

-cialotrina

cipermetrina deltametrina

ESL-PBT 82,71 ±3,32 86,02 ±3,84 95,37 ±4,94 95,58 ±2,76

DMFS 64,73 ±3,15 88,28±2,80 99,21 ±0,52 89,18 ±3,77

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 2.6, pode-se

verificar que as técnicas de extração em estudo apresentaram porcentagens de

recuperação estatisticamente iguais, ao nível de 95% de probabilidade pelo

teste t, para a

-cialotrina, cipermetrina e deltametrina. A ESL-PBT mostrou-se

mais eficiente na recuperação do clorpirifós.

Vale destacar que a técnica DMFS é mais susceptível à presença de

interferentes nos extratos em relação a ESL-PBT, provenientes dos

adsorventes, componentes da matriz, solventes, etc. Embora na DMFS se

utilize uma quantidade de amostra oito vezes menor que a ESL-PBT (4,0000 g

: 0,5000 g) é necessário que o extrato final na DMFS seja concentrado dez

vezes (10 mL : 1 mL). Desta forma os interferentes estão mais concentrados na

DMFS. Além disso, a ESL-PBT é uma técnica que exige custos menos

elevados, pois se utiliza, basicamente solventes, enquanto que a DMFS exige

também adsorventes, não recuperáveis ao final do experimento.

Quando se compara qualitativamente os cromatogramas, as duas

técnicas, ESL e DMFS, mostraram-se equivalentes. Para isso, na dispersão da

matriz em fase sólida seria necessário utilizar co-coluna para auxiliar no clean

up e que os adsorventes sejam previamente condicionados, o que aumenta

consideravelmente o consumo de solventes. Caso contrário a ESL-PBT produz

cromatogramas mais limpos.

Portanto, a técnica de extração sólido-líquido e purificação em baixa

temperatura é uma alternativa de extração dos pesticidas clorpirifós,

cialotrina, cipermetrina e deltametrina em amostras de tomate, proporcionando

resultados qualitativos e quantitativos mais satisfatórios, quando comparado

com a dispersão da matriz em fase sólida.

CONCLUSÕES

Nesse trabalho foram otimizadas as técnicas de DMFS e ESL-PBT,

sendo esta última também validada. Essas técnicas foram utilizadas na

extração dos pesticidas clorpirifós, λ-cialotrina, cipermetrina e deltametrina em

amostras de tomate.

Durante a otimização da ESL-PBT foi realizado um planejamento de

misturas, para avaliar a influência da polaridade da mistura extratora na

porcentagem de extração dos pesticidas. A mistura composta por 80% de

acetonitrila, 15 % de acetato de etila e 5% de água proporcionou extrações

superiores a 80% dos pesticidas. Entretanto estas taxas de recuperação dos

pesticidas apresentaram efeito de matriz significativo, principalmente os

compostos de maiores tempo de retenção, como a deltametrina e cipermetrina.

Os extratos obtidos na ESL-PBT apresentaram coloração intensa que foram

significativamente removidos com 10 mg de carvão ativado, no entanto este

adsorvente diminuiu expressivamente a taxa de extração dos pesticidas,

principalmente o clorpirifós. Os resultados obtidos nos parâmetros de

validação, como seletividade, limite de detecção, limite de quantificação,

linearidade, precisão e exatidão indicam que os métodos ESL-PBT é eficiente

para a extração dos pesticidas em amostras de tomate, possibilitando as

análises cromatográficas das amostras e a determinação dos resíduos destes

piretróides em tomates com limites de quantificação próximos a 10 μg L

-1

Para a DMFS foi realizado um planejamento fatorial em que foram

estudados simultaneamente os efeitos da proporção entre a quantidade de

adsorvente e amostra (1:1 e 2:1), presença de co-coluna e auxílio do banho

ultra-sônico na extração dos pesticidas por esta técnica. A eficiência da

extração foi melhor quando a proporção de adsorvente/amostra 2:1 foi utilizada

com o auxílio do banho ultra-sônico para a extração. Já a presença da co-

coluna de sílica auxilia no clean up dos extratos, porém reduz a taxa de

recuperação do clorpirifós significativamente.

Portanto, quando se compara qualitativamente e quantitativamente as

duas técnicas de extração, a ESL-PBT proporcionou resultados mais

satisfatórios que a DMFS na extração dos pesticidas clorpirifós,

-cialotrina,

cipermetrina e deltametrina em amostras de tomate.

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