ads:
JACQUELINE PLEWKA
ESTUDO SOBRE VARIAÇÕES NO MÉTODO DE CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO
PARA O EXAME DE PAPANICOLAOU
Dissertação apresentada como requisito parcial
à obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas, Programa de Pós-graduação
em Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências
da Saúde, Universidade Federal do Paraná.
Orientadora: Profª. Tit. Maria Suely Soares
Leonart
Co-orientador: Prof. Dr. Aguinaldo José do
Nascimento
CURITIBA
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
A VIDA.....
“Os dias mais esplêndidos da vida
não são os chamados dias de êxito, mas
sim aqueles em que, saindo do desânimo
e do desespero, sentimos erguer-se
dentro de nós um desafio: a vida e a
promessa de futuras realizações”.
Gustavo Flaubert
ads:
Aos meus pais amados, Ervim e Ednir, pelo
amor, e por terem me dado como herança, o
estudo.
Aos meus irmãos Jony e Jackson, pelo amor, e
apoio em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
A DEUS, que me deu forças para continuar e vencer mais esse desafio.
A minha orientadora Profª. Tit. Maria Suely Soares Leonart, pela sua amizade,
seu amor maternal, sua dedicação, apoio e pelo seu amor à citologia cérvico-
vaginal, que me incentivaram em todos os momentos e, principalmente, por acreditar
em que seríamos capazes de realizar este trabalho.
Ao meu co-orientador Prof°. Dr. Aguinaldo José do Nascimento, pela
amizade, disponibilidade, paciência, sinceridade e bom humor. Seus conhecimentos
em estatística e informática foram inestimáveis na elaboração deste trabalho.
Aos meus pais, Ervim Plewka e Ednir Andriola Plewka, por me darem a vida e
por tudo que sempre foram. A meus irmãos Jony Ervin Andriola Plewka e Jackson
Plewka, meus sobrinhos André, Agnes, Luisa e Gabriel, minhas cunhadas Ana
Claudia e Kelly e toda minha linda família, pelo amor, carinho, apoio, e por
acreditarem em meu sucesso.
À minha grande amiga e companheira Michele Ana Flores Chaves, pela
grande amizade, motivação e alegria, e por tudo que passamos juntas, nas horas
boas e ruins.
À Irene Ermelindo Santos, amiga e funcionária do Laboratório de Hematologia
e Citologia Clínica do Curso de Farmácia da UFPR, pela amizade, carinho,
entusiasmo e cooperação no decorrer dos trabalhos.
Aos amigos do Laboratório de Hematologia e Citologia Clínica, em especial,
Fagner Salmazo Neiva, Christian Siebra, Melissa Pires de Lima, Fernanda Mattana,
Luciane Tuchoslki, pela amizade e companheirismo. E aos todos meus amigos que
sempre me deram muito carinho e apoio principalmente a Rosangela Cristina de
Lima, Jacqueline Nunes, Daniele Fialkoski Fogaça, Francielly Bragio e Álvaro
Barbosa.
Ao amigo e colega Maurício Turkiewicz pela força, disposição e cooperação
na realização dos experimentos, e aos militares TC Jorge Nunes Basso e TC
Narcizo Tonet por terem colaborado e disponibilizado equipamento de
fotomicrografia do LAPC/HGeC - Laboratório de Análises Patológicas e Clínicas do
Hospital Geral do Exército de Curitiba.
A Secretaria de Saúde do Município de Cascavel e ao Diretor Clínico do
Hospital Universitário de Cascavel, por manter as portas abertas nas Unidades
Básicas de Saúde e do Ambulatório do Hospital Universitário, permitindo a coleta
das amostras utilizadas neste trabalho, e a todos os funcionários que participaram
deste trabalho, principalmente às coordenadoras dos Postos de Saúde Parque São
Paulo, Palmeiras e IX de Novembro, apoiando e permitindo que este trabalho fosse
realizado.
Aos médicos ginecologistas, Aldo Luis Hota, Luiz Sérgio Fettback, Maria
Elena de Carvalho, Mônica Regina Moreira, Lisiane Cosmo Fávero, Silmara C. Rossi
Kissula Berto pela disposição e cooperação, e por acreditarem nos caminhos da
pesquisa científica, permitindo que este trabalho fosse realizado.
Ao Prof. Msc. Marco Antônio Randi, pela sua disponibilidade e orientação na
realização dos estudos morfométricos.
Aos colegas do Curso de Farmácia da Universidade Estadual do Oeste do
Paraná, por me apoiarem de forma irrestrita e possibilitarem o meu afastamento das
atividades didáticas para a realização do Curso de Mestrado, em especial ao Prof.
Marco Antônio Costa, pela compreensão e apoio.
Ao laboratório de Anatomia Patológica Prevenção e Diagnose, pelo apoio e
colaboração.
A todos os professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFPR que, de alguma forma contribuíram para a realização deste
trabalho.
A Regina Montrezol, secretária do Curso de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, pela atenção dispensada durante a realização do curso.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS..............................................................................................
LISTA DE TABELAS.............................................................................................
LISTA DE QUADROS...........................................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................
RESUMO................................................................................................................
ABSTRACT............................................................................................................
1
INTRODUÇÃO..................................................................................... 15
2
REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 18
2.1 HISTÓRICO......................................................................................... 18
2.2 ANATOMIA, HISTOLOGIA E CITOLOGIA DO APARELHO
REPRODUTOR FEMININO.................................................................
19
2.3 ASPECTOS EVOLUTIVOS DO CÂNCER DO COLO UTERINO E
SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÃO ......................................................
22
2.4 DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS (DST) E
CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL........................................................
25
2.5 PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV).................................................... 28
2.6 ALTERAÇÕES REATIVAS OU REPARATIVAS, INFLAMAÇÃO OU
PRESENÇA DE ORGANISMOS..........................................................
29
2.7 ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS INDICATIVAS DE
ANORMALIDADES EPITELIAIS CERVICAIS......................................
31
2.7.1 Células Escamosas Atípicas (ASC)..................................................... 31
2.7.2 Lesão Intraepitelial Escamosa de Baixo Grau (LSIL).......................... 31
2.7.3 Lesão Intraepitelial Escamosa de Alto Grau (HSIL)............................ 31
2.7.4 Carcinoma Escamoso Invasor............................................................ 32
2.7.5 Células Glandulares Atípicas (AGC)................................................... 32
2.7.6 Adenocarcinoma in situ (AIS).............................................................. 33
2.7.7 Adenocarcinoma Invasor..................................................................... 33
2.8 MÉTODOS DE COLETA E PREPARAÇÃO DO MATERIAL............... 33
2.9 CITOLOGIA CONVENCIONAL........................................................... 36
2.10 CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO......................................................... 37
2.11 ADEQUADAÇÃO E ESCRUTÍNEO DA AMOSTRA............................ 38
2.12 MEIOS PARA PRESERVAÇÃO E FIXAÇÃO CELULAR.................... 40
3
OBJETIVOS........................................................................................ 44
4
MATERIAL MÉTODOS....................................................................... 46
4.1 MATERIAL........................................................................................... 46
4.2 MÉTODOS........................................................................................... 46
4.2.1 Reagentes, Material de Consumo e Equipamentos............................. 46
4.2.1.1 Reagentes............................................................................................ 46
4.2.1.2 Material de consumo............................................................................ 47
4.2.1.3 Equipamentos...................................................................................... 47
4.2.2 Testes preliminares para escolha de método de citologia em meio
líquido...................................................................................................
47
4.2.2.1 Coleta de material................................................................................ 47
4.2.2.2 Procedimentos..................................................................................... 48
4.2.3 Experimentos....................................................................................... 50
4.2.3.1 Citologia Convencional (Controle)........................................................ 51
4.2.3.2 Citologia em Meio Líquido.................................................................... 52
4.2.3.2.1 Com emprego de Etanol 95%.............................................................. 53
4.2.3.2.2 Com emprego de formaldeído a 1% em tampão fosfato 150
mmoles/l pH 7,4...................................................................................
53
4.2.4 Análises citológicas........................................................................... 54
4.2.4.1 Avaliação citomorfológica por varredura.............................................. 54
4.2.4.2 Celularidade......................................................................................... 54
4.2.4.3 Homogeneidade na distribuição das células........................................ 56
4.2.4.4 Grau de sobreposição celular.............................................................. 56
4.2.4.5 Presença de células epiteliais escamosas e glandulares.................... 57
4.2.4.6 Presença de alterações celulares e artefatos...................................... 58
4.2.4.7 Presença de microorganismos e de seus efeitos citopáticos............... 58
4.2.4.8 Morfometria.......................................................................................... 59
4.2.5.9 Análise estatística................................................................................ 59
5
RESULTADOS.................................................................................... 62
6
DISCUSSÃO........................................................................................ 85
7
CONCLUSÕES.................................................................................... 100
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 103
ANEXO.................................................................................................................
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - FOTOMICROGRAFIAS DE MATERIAL CÉRVICO-VAGINAL
EM CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO COM FORMALDEÍDO 1%
57
FIGURA 2 - DISTRIBUIÇÃO DE FREQUÊNCIA DE CELULARIDADE EM
ESFREGAÇOS DE CITOLOGIA EM MEIOS LÍQUIDOS
ETANOL 95% E FORMALDEÍDO A 1%......................................
68
FIGURA 3 - FOTOMICROGRAFIAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS
INTERMEDIÁRIAS EM PREPARAÇÕES EM MEIOS
LÍQUIDOS APÓS PRESERVAÇÃO............................................
70
FIGURA 4 - FOTOMICROGRAFIAS DE CÉLULAS EPITELIAIS
CERVICAIS EM PREPARAÇÕES CONVENCIONAIS E EM
MEIO LÍQUIDO............................................................................
71
FIGURA 5 - FOTOMICROGRAFIAS DE MICRORGANISMOS EM
PREPARAÇÕES DE CITOLOGIA CERVICAL
CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO....................................
74
FIGURA 6 - FOTOMICROGRAFIAS DE ALTERAÇÕES CELULARES DE
MATERIAL CÉRVICO-VAGINAL EM PREPARAÇÕES
CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO....................................
77
FIGURA 7 - FOTOMICROGRAFIAS DE CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL
DE CASOS CLASSIFICADOS COMO ANORMALIDADES
EPITELIAIS SEGUNDO BETHESDA 2001.................................
80
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
IDENTIFICAÇÃO CELULAR ENTRE CITOLOGIA CÉRVICO-
VAGINAL CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO ETANOL
95%...............................................................................................
69
TABELA 2 - COMPARAÇÃO NA IDENTIFICAÇÃO CELULAR ENTRE
CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E EM
MEIO LÍQUIDO FORMALDEÍDO 1%............................................
72
TABELA 3 - COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA ENTRE CITOLOGIA CÉRVICO-
VAGINAL CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO ETANOL
95%................................................................................
73
TABELA 4 - COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA ENTRE CITOLOGIA CÉRVICO-
VAGINAL CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO
FORMALDEÍDO 1%......................................................................
75
TABELA 5 - COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES CELULARES ENTRE
CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E EM
ETANOL 95%................................................................................
78
TABELA 6 - COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES CELULARES ENTRE
CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E EM
MEIO LÍQUIDO FORMALDEÍDO 1%............................................
79
TABELA 7 - COMPARAÇÃO MORFOMÉTRICA ENTRE CÉLULAS
ESCAMOSAS INTERMEDIÁRIAS DE CITOLOGIA
CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO ETANOL 95%..............
81
TABELA 8 - COMPARAÇÃO MORFOMÉTRICA ENTRE CÉLULAS
ESCAMOSAS INTERMEDIÁRIAS DE CITOLOGIA
CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO FORMALDEÍDO 1%....
82
TABELA 9 - COMPARAÇÃO MORFOMÉTRICA DA RELAÇÃO
NÚCLEO/CITOPLASMA, ENTRE CÉLULAS ESCAMOSAS
INTERMEDIÁRIAS DE CITOLOGIA CONVENCIONAL E EM
MEIO LÍQUIDO ETANOL 95% E FORMALDEÍDO 1%................
83
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - COLORAÇÃO SEGUNDO PAPANICOLAOU MODIFICADA.
52
QUADRO 2 - AVALIAÇÃO DE PREPARAÇÕES DE CÉLULAS
ESCAMOSAS DA MUCOSA BUCAL E DA MUCOSA
VAGINAL, PRESERVADAS E/OU FIXADAS EM DIVERSOS
MEIOS LÍQUIDOS......................................................................
63
QUADRO 3 - AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE SEDIMENTAÇÃO PARA
PREPARAÇÕES DE CÉLULAS ESCAMOSAS DA MUCOSA
BUCAL E VAGINAL, PRESERVADAS EM ETANOL 95%........
64
QUADRO 4 - EFEITOS DA VELOCIDADE E TEMPO DE
CENTRIFUGAÇÃO COMUM NAS PREPARAÇÕES DE
CÉLULAS ESCAMOSAS DA MUCOSA BUCAL E VAGINAL,
PRESERVADAS EM ETANOL 95%..........................................
65
QUADRO 5 - AVALIAÇÃO DE CONFECÇÃO DE ESFREGAÇOS
CITOLÓGICOS CIRCULARES COM O AUXÍLIO DE
PONTEIRA DE MICROPIPETA, E POR ESTENSÃO, COM
AUXÍLIO DE LÂMINA EXTENSORA..........................................
66
QUADRO 6 - AVALIAÇÕ DA ADERÊNCIA DE PREPARAÇÕES DE
CÉLULAS ESCAMOSAS DA MUCOSA BUCAL E VAGINAL,
PRESERVADAS EM ETANOL 95%..........................................
66
QUADRO 7 - AVALIAÇÃO DA FIXAÇÃO DE CÉLULAS ESCAMOSAS DA
MUCOSA BUCAL E VAGINAL ..................................................
67
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ASC - Células escamosas atípicas
ASC-US - Células escamosas atípicas não exclui LSIL
ASC-H - Células escamosas atípicas não exclui HSIL
ASCUS -
Celulas escamosas atípicas de significado indeterminando
AGUS -
Celulas glandulares atípicas de significado indeterminando
AGC - Células glandulares atípicas
DIU - Dispositivo intrauterino
DST - Doença sexualmente transmissível
HPV - Papilomavírus humano
HSIL - Lesão intraepitelial de alto grau
JEC - Junção escamocolunar
LSIL - Lesão intraepitelial de baixo grau
NIC - Neoplasia intraepitelial cervical
N/C - Núcleo/citoplasma
OCE - Orifício cervical externo
SIL - Lesão intraepitelial escamosa
ZT - Zona de transformação
TBS - Sistema Bethesda
RESUMO
A redução da mortalidade e da incidência de câncer de colo de útero é possível
através da promoção da saúde e detecção precoce dos casos de lesões
precursoras com alto potencial de malignidade, através de programas estruturados
de rastreamento. A citologia oncótica tem sido reconhecida, cada vez mais, como
importante e fundamental instrumento para o rastreamento de tais lesões, bem
como para o diagnóstico de doenças sexualmente transmissíveis (DST), em
especial a infecção pelo papiloma vírus humano (HPV). A citologia em meio líquido
tem sido considerada, nos últimos anos, importante alternativa para o ganho de
sensibilidade do exame citológico cérvico-vaginal, com vantagens em relação à
convencional. No entanto, o seu emprego é limitado em sistemas de saúde pública
em países em desenvolvimento, especialmente devido ao seu alto custo. Desta
forma, este trabalho teve o objetivo de estudar novas alternativas de métodos em
meio líquido, mais acessíveis e adequados para citologia cérvico-vaginal. Coletou-
se material cérvico-vaginal de pacientes atendidas no Ambulatório do Hospital
Universitário do Oeste do Paraná (HUOP) e Unidades de Saúde Palmeiras,
Parque São Paulo e XIV de Novembro do Município de Cascavel-PR para exame
preventivo de câncer de colo de útero, após consentimento informado das
pacientes. Preparou-se amostras em meio líquido, em comparação ao método
convencional, por coleta com escova cônica, fixação e preservação em meio
líquido durante 1 a 24 horas, centrifugação a 289 x g, realização de esfregaço
circular do sedimento em lâmina, fixação por 30 min em etanol 95%, coloração de
Papanicolaou e montagem com Entellan (n=50). Alternativamente, amostras foram
fixadas em meio líquido formaldeído 1% (n=100) e que, após a centrifugação foram
incubadas em etanol 95% durante 1 h com sedimentação espontânea Em
amostras cujo meio líquido foi etanol 95%, obteve-se celularidade satisfatória,
adequabilidade na identificação morfológica de células escamosas superficiais,
intermediárias e parabasais, metaplásicas, endocervicais, polimorfonucleares,
histiócitos, hemácias e linfócitos, bem como na análise morfométrica de células
escamosas intermediárias; sensibilidade e especificidade satisfatórias para
microorganismos e alterações celulares como pseudoeosinofilia, metacromasia,
hiperqueratose, edema nuclear, halo perinuclear, grânulos querato-hialinos,
citólise, cariopicnose, paraqueratose, cariólise, coilocitose e binucleação. Em
amostras cujo meio líquido foi formaldeído 1% obteve-se celularidade satisfatória,
adequabilidade na identificação morfológica de células escamosas superficiais,
intermediárias e parabasais, metaplásicas, polimorfonucleares, hemácias e
linfócitos, bem como na análise morfométrica de células escamosas
intermediárias; sensibilidade e especificidade satisfatórias para microorganismos e
alterações celulares como pseudoeosinofilia, metacromasia, halo perinuclear,
grânulos querato-hialinos, hiperqueratose, edema nuclear, cariopicnose, citólise e
coilocitose. Em algumas amostras preparadas com etanol 95%, houve precipitação
de material proteináceo, que causou sobreposição de células. Nas amostras
preparadas com formaldeído 1%, houve alterações em células endocervicais e
histiócitos que dificultaram a sua identificação. Conclui-se que há necessidade de
estudos complementares, que possibilitem a proposição de alternativas viáveis
para citologia em meio líquido.
ABSTRACT
The reduction of the mortality and of the incidence of cervical cancer it is possible
through health programs and detection of the cases of precursory lesions with high
malignance potential, through structured screening programs. The oncotic cytology
has been increasingly recognized, as important and fundamental instrument for the
screening of such lesions, as well as for the diagnosis of sexually transmissible
diseases (STD), especially the infection for the human papiloma virus (HPV). The
liquid-based cytology has been considered, in recent years, important alternative for
improvements on sensibility of the cervical cytology, with advantages in relation to
the conventional Pap test. However, there is limitation for its use in systems of public
health in developing countries, especially due to its high cost. The aim of this work
was the study on new alternatives of methods in liquid-based, more accessible and
appropriate for cervical cytology. It was collected material for cervical cytology of
patients’ assisted in the Clinic of the Hospital Universitário do Oeste do Paraná
(HUOP) and Unidades de Saúde Palmeiras, Parque São Paulo and XIV de
Novembro of the Municipal district of Cascavel-PR for preventive exam of cervical
cancer, after the patients' informed consent. Samples for liquid based cytology, in
comparison with the conventional method, were collected with conical brush for
fixation and preservation in liquid medium during 1 to 24 hr, spinned at 289 x g,
confection of slides with circular smear of the sediment, fixation for 30 min in ethanol
95%, Papanicolaou staining and assembly with Entellan (n=50). Alternatively,
samples were fixed in formaldehyde 1% (n=100), and after the centrifugation they
were incubated in ethanol 95% during 1 hr with spontaneous sedimentation In
samples whose liquid medium was ethanol 95%, it was obtained satisfactory
cellularity, adequacy in the morphologic identification of superficial, intermeadiate
and parabasal scamous cells, metaplasic, endocervical, polymorfonuclear, histiocyte,
hematia and lymphocytes cells, as well as in the morphometrical analysis of
intermediate scamous cells; satisfactory sensibility and specificity for microorganisms
and cellular alterations as pseudo-oeosinophilia, metachromasia, hiperkeratosis,
nuclear edema, perinuclear halo, keratohialin granules, cellular lyse, kariopicnosis,
parakeratosis, kariolisis, koilocytosis and binucleation. In samples with formaldehyde
1% it was obtained satisfactory cellularity, adequacy in the morphologic identification
of superficial, intermediate, and parabasais scamous cells, metaplasic,
polimorfonuclear, hematia and lymphocytes cells, as well as in the morphometrical
analysis of intermediate scamous cells; sensibility and satisfactory specificity for
microorganisms and cellular alterations as pseudo-eosinofilia, metachromasia,
perinuclear halo, keratohialin granules, hiperkeratosis, nuclear edema, kariopicnosis,
cellular lyse and koilocytosis. In some ethanol 95% samples there were precipitation
of proteic material that caused superimposing of cells. In formaldehyde 1% samples
there were alterations in endocervical and histiocyte cells that hindered their
identifications. It is concluded that it is necessary more complementary studies, so
that viable alternatives for liquid-based cytology is make possible.
INTRODUÇÃO
15
INTRODUÇÃO
É consenso na literatura que, quanto mais precocemente forem detectadas
as lesões pré-neoplásicas ou neoplásicas, maiores são as probabilidades de
tratamento e de cura, reduzindo os níveis de incidência e de mortalidade por câncer
do colo do útero (KOSS, 1989; MONSONEGO, 1997). Programas de prevenção de
câncer cervical são adequados à redução significativa de sua incidência, como o
uso do exame de citologia cérvico-vaginal proposto por Papanicolaou. A experiência
em larga escala do programa de triagem realizado em British Columbia, durante
cerca de 40 anos, reduziu em 80% a incidência e a mortalidade por esta doença
(BRITISH COLUMBIA CANCER AGENCY, 2000).
É inegável, também, a contribuição que o exame de Papanicolaou tem
trazido ao diagnóstico de doenças sexualmente transmissíveis (DST), através da
sugestão da presença de microorganismos patogênicos, ou mesmo de seus efeitos
citopáticos específicos. De forma especial, destaca-se a infecção pelo Papiloma-
vírus humano (HPV), cujo efeito citopático, quando presente, leva à sugestão da
ocorrência de lesões pré-neoplásicas (WALBOOMERS et al, 1999).
No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) desenvolveu o Programa de
Prevenção do Câncer de Colo do Útero Viva Mulher, que oferece serviços de
prevenção e detecção precoce, através do exame convencional de Papanicolaou,
de ações educativas e do tratamento e reabilitação, em todo o território nacional. O
programa prioriza mulheres de 25 a 65 anos, considerando que a maior incidência
do câncer do colo de útero situa-se entre 40 e 60 anos. No entanto, muito ainda se
precisa avançar para se alcançar uma cobertura adequada das mulheres
suscetíveis ao desenvolvimento do câncer cervical, ou seja, todas as que já
iniciaram sua atividade sexual (NANDA et al., 2000).
Diversos estudos têm apontado para índices não ideais de sensibilidade do
preparado convencional de Papanicolaou (AHCPR, 1999). As causas citadas para
este fato são: insuficiente representatividade das células escamosas, endocervicais
e da junção escamo-colunar (JEC) (HUTCHINSON et al., 1992), secagem e ou má
fixação do material, distribuição não homogênea das células no esfregaço, presença
de leucócitos, hemáceas e restos celulares em excesso (KLINKHAMER et al.,
2003).
16
Mais recentemente, desenvolveu-se um sistema de preparo de amostras de
citologia em meio líquido, que tem sido considerado, nos últimos anos, importante
alternativa para melhorar a sensibilidade do exame citológico cérvico-vaginal. Em
especial, pela melhoria na qualidade da fixação do material e na homogeneidade da
distribuição celular no esfregaço, a citologia em meio líquido vem sendo
apresentada não como substituta, mas sim, como um aprimoramento do teste de
Papanicolaou. Possivelmente devido a estes fatores, tem-se obtido menores índices
de falso-negativos com esta metodologia em relação à convencional (RENSHAW et.
al, 2006).
Os sistemas disponíveis para citologia cérvico-vaginal em meio líquido
apresentam um custo muito mais elevado por exame em relação ao método
convencional, chegando a inviabilizar o seu uso como metodologia de escolha em
unidades de saúde e em programas de prevenção do câncer do colo do útero,
especialmente em países em desenvolvimento (MONTZ et al, 2001).
Desta forma, há necessidade de se estudar novas alternativas para se
desenvolver métodos mais sensíveis em relação ao convencional, porém acessíveis
para serem utilizados em programas de saúde pública.
17
2. REVISÃO DE LITERATURA
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 HISTÓRICO
Historicamente, podemos relatar o diagnóstico do câncer do colo uterino em
1907, quando se declarou que o mesmo poderia ser feito pelo aspecto celular, antes
da fase destrutiva da doença, isto é, antes da invasão do tecido conjuntivo. De 1908
a 1910, outros estudiosos concordaram com este achado, sendo que a descrição da
doença corresponderia ao que, mais tarde chamariam de carcinoma pré-invasor
(PAPANICOLAOU, 1928; AUGUSTO et al., 1982).
No ano de 1908, Schauenstein e no ano de 1910, Rubin, relataram as lesões
histológicas pré-cancerosas do colo uterino, estabelecendo as mesmas bases
anatomopatológicas que são empregadas até os dias de hoje (GOMPEL e KOSS,
1997).
O colposcópio, criado por Hinselmann em 1925, é um instrumento que
permite visualizar o colo uterino com aumento de 10 a 40 vezes, que auxilia com
exatidão a localização das lesões cancerosas (BIBBO, 1997).
Após cinco anos, em 1930, Meyer mostrou a importância da biópsia para o
diagnóstico conclusivo do câncer e, em conseqüência, inúmeros trabalhos
científicos, mostraram a evolução clínica imprevisível dessas lesões (GOMPEL e
KOSS 1997).
Em 1917, George Nikolas Papanicolaou propôs o uso sistemático do
esfregaço cérvico-vaginal; em 1923, ele estudou o ciclo sexual em mulheres
revelado pelo esfregaço vaginal. No ano de 1924, fez uma observação incidental de
que as células cancerosas derivadas da cérvice uterina poderiam ser observadas
em esfregaços vaginais. Em 1942, Papanicolaou demonstrou que o diagnóstico do
câncer em sua fase inicial poderia ser realizado através dos caracteres morfológicos
anormais das células esfoliadas do epitélio uterino (PAPANICOLAOU, 1948). No
final dos anos 40, as observações de Papanicolaou foram confirmadas por outros
cientistas e ginecologistas como Trault e Ayre, que sugeriram que fossem tomadas
amostras diretamente do cérvix com um tipo de espátula, ao invés de obtê-las da
vagina com uma pipeta, como descrito originalmente por Papanicolaou (CIBAS e
DUCATMAN, 1996).
19
Na década de 1950, a citologia influenciou o cenário médico, com o apoio de
patologistas validando o diagnóstico citológico para o câncer, consolidado por
Reagan, que buscou uma correlação entre a análise celular e processos patológicos
no trato genital feminino, estabelecendo critérios diagnósticos. Esse trabalho
fortaleceu a convergência de patologistas, com idéias de estudos em células
esfoliativas, com o objetivo de aperfeiçoar o diagnóstico de lesões do colo do útero e
do endométrio (SINGER e MONAGHAN, 2002).
Após quarenta anos de estudos sobre aspectos citológicos, houve a
publicação do “Atlas Citológico” por Papanicolaou, em 1957. Em 1967, Koss
publicou “Diagnostico Citológico e Bases Histológicas”, com estudos relacionando a
teoria e a prática da citologia com a histopatologia, e realçando a importância da
citopatologia (NAYLOR, 2000).
Ayre e Back publicaram em 1960 “A Função do Halo Celular na
Carcinogênese Cervical” e, entre outros autores, buscaram possíveis manifestações
pré-malignas ocasionadas por vírus.
Naib et al. (1961) publicaram importante observação morfológica na citologia,
qual seja, o efeito citopático do vírus herpes simples e a sua correlação com a
observação das lesões herpéticas, que confirmam em estudos subseqüentes,
alarmando a clínica com cervicites, vaginites e vulvovaginites herpéticas (DAS
DORES et al, 1999).
Diferentes estudos revelam que as lesões pré-cancerosas não tratadas
persistem ou regridem em porcentagens que variam de um autor para o outro, e
segundo a gravidade da lesão inicial. Estas variações são explicadas, em parte, pelo
caráter subjetivo da avaliação histológica das lesões pré-cancerosas e pela
diversidade das terminologias utilizadas (BIBBO, 1997).
2.2 ANATOMIA, HISTOLOGIA E CITOLOGIA DO APARELHO REPRODUTOR
FEMININO
O aparelho genital feminino é formado basicamente por vulva, vagina, útero,
trompas de Falópio ou trompas uterinas e ovários (RUBIN e FARBER, 1999).
O útero possui a forma de um cone ou pêra, com a porção mais volumosa
voltada para a porção superior do abdômen, recebendo o nome de corpo uterino e
20
o vértice voltado para a porção inferior do abdômen, em contato íntimo com o
canal vaginal, recebendo o nome de colo uterino (STEVENS e LOWE, 2001).
Ainda como definição de colo uterino ou cérvice, tem-se: segmento do útero
situado acima da inserção da vagina (porção supravaginal ou portio
supravaginalis) e em sua parte inferior, livre na cavidade vaginal, porção
intravaginal (portio vaginalis) (LONGATTO FILHO e SILVA FILHO, 2000).
Anatomicamente, o colo do útero se divide em duas porções denominadas
de ectocérvice e endocérvice: a primeira revestida por epitélio pavimentoso
estratificado do tipo não queratinizado (malpighiano), o qual reveste tanto a
ectocérvice quanto a parede da vagina; e a segunda, correspondente ao canal
endocervical, que é revestido por epitélio colunar simples ou cilíndrico,
predominantemente mucíparo, que forma saliências e reentrâncias, originando
formações glandulares, as quais armazenam em seu interior grande quantidade de
muco, produzido pelas células secretoras (LIRA NETO, 2000).
A JEC, porção anatômica que coincide com o orifício cervical externo (OCE)
em colos denominados padrão, é o encontro dos epitélios pavimentoso e glandular
(LONGATTO FILHO e SILVA FILHO, 2000). Esta região anatômica também é
conhecida como Zona de Transformação (ZT), terminologia originada na
colposcopia, quando predominam células escamosas metaplásicas (GOMPEL e
KOSS, 1997). Quando a JEC se projeta para fora do OCE, o processo é conhecido
como ectrópio ou ectopia, e quando a mesma é projetada para dentro do canal, o
processo é denominado de entrópio ou entopia (LIRA NETO, 2000).
Histologicamente, um corte da mucosa vaginal ou da ectocérvice mostra
três extratos de células escamosas, que, partindo da membrana basal ou tecido
conjuntivo de sustentação para a luz vaginal são denominados de camada
profunda, constituída por uma camada de células basais e várias de células
parabasais; extrato intermediário, constituído por várias camadas de células
intermediárias; e extrato superficial, constituído por várias camadas de células
superficiais (LIRA NETO, 2000). O processo de maturação e diferenciação desse
epitélio é diretamente dependente de ação hormonal cíclica de estrogênio e
progesterona, determinando o predomínio de células de determinado grau de
diferenciação celular, de acordo com a faixa etária e a fase do ciclo menstrual em
que a mulher se encontra (STEVENS e LOWE, 2001).
21
As células basais e parabasais são imaturas, aparecem em maior proporção
em esfregaços de mulheres acima de 35 anos de idade, ou na presença de
processos patológicos nos quais ocorra erosão superficial do epitélio, e
predominam em estados de baixa produção de estrógenos como, por exemplo:
antes da menarca, no pós-parto e na pós menopausa (GOMPEL e KOSS, 1997).
As células basais dificilmente são vistas em esfregaços citológicos, a não
ser em um processos patológicos extremamente erosivos, ou em carcinomas
anaplásicos, ou seja, com ausência de diferenciação. São células pequenas,
redondas ou ovais, com 10 a 12 μm, porém com relação núcleo/citoplasma (N/C)
elevada, e com cromatina em pequenos grânulos e, ocasionalmente, com
pequenos nucléolos (CIBAS e DUCATMAN, 1996).
As células parabasais medem 12 a 30 μm de diâmetro, com citoplasma
basófilo e apresentam forma redonda ou oval. O núcleo mede cerca de 8 μm, é
vesiculado e contém grânulos de cromatina ou cromocentros, nucléolos são vistos
raramente (BIBBO, 1997; MEISELS e MORIN, 1997).
As células intermediárias são achatadas, poligonais, com diâmetro de 30 a
40μm, o núcleo possui forma arredondada, cerca de 8 μm, com cromatina
finamente granulosa, cromocentros e, ocasionalmente, cromatina sexual visível. O
citoplasma é cianófilo, com diversos pequenos vacúolos, rico em glicogênio, que
se cora em amarelo na coloração de Papanicolaou. Na presença de bacilos de
Döderlein, estas células geralmente sofrem citólise, um processo peptolítico
normal (CIBAS e DUCATMAN, 1996).
As células superficiais
medem 35 a 45 μm de diâmetro, são maduras,
poligonais, com citoplasma eosinofílico, achatado, delicado e transparente, com
pequeno núcleo picnótico e muito denso, devido ao seu material nuclear se tornar
condensado e retraído. Estas células descamam, sobretudo como elementos
isolados. A forma revela uma considerável rigidez do citoplasma devido à presença
de filamentos de queratina ou tonofibrilas, que contribuem para o achatamento do
citoplasma durante a fase estrogênica (GOMPEL e KOSS, 1997). Um achado que
distingue a maturidade em certas células em rápida proliferação é a presença de
grânulos marrom-escuros intracelulares, chamados grânulos querato-hialinos os
quais, segundo alguns autores, possuem lipídios e são estrógeno dependentes
(BIBBO, 1997).
22
O epitélio que recobre a cavidade endocervical é formado por uma única
camada de células cilíndricas endocervicais, com função secretora e locomotora.
Estas células medem de 8 a 20 μm, são alongadas, com citoplasma claro,
finamente vacuolizado e palidamente cianofílico, ocasionalmente preenchido por
muco. O núcleo é excêntrico e vesicular, possui cromatina finamente granular e
regularmente distribuída, podendo ser observados um ou dois nucléolos pequenos
(KOSS, 1992). Em esfregaços citológicos, dependendo do ângulo sob o qual são
observadas, aparecem alongadas ou arredondadas. Os aglomerados vistos pelo
pólo apical oferecem um aspecto de “favo de mel”, com núcleos redondos
circundados por uma coroa citoplasmática arredondada. Vistas por suas faces
laterais, as células mostram uma disposição em “paliçada”, com núcleo
arredondado e situado na sua porção basal (GOMPEL e KOSS, 1997).
As células endometriais são observadas normalmente em citologia cérvico
vaginal até o 12º dia do ciclo. Após este período, seu aparecimento é associado a
processos patológicos como, por exemplo: endometrite, pólipos endometriais e
adenocarcinoma, ou devido ao uso de dispositivo intrauterino (DIU). São células
pequenas, medem de 4 a 16 μm, com citoplasma escasso, às vezes vacuolizado e
cianofílico. O núcleo é vesicular, redondo ou oval, de tamanho homogêneo, com
cromatina regularmente distribuída, pouco granular e geralmente sem nucléolos
visíveis. Arranjam-se em grupos coesos tridimensionais (MEISELS e MORIN,
1997).
2.3 ASPECTOS EVOLUTIVOS DO CÂNCER DO COLO UTERINO E SISTEMAS
DE CLASSIFICAÇÃO
Em 1943, Papanicolaou desenvolveu uma classificação com o intuito de
transmitir o grau de risco de a paciente desenvolver um câncer, porém não
estabeleceu nenhuma relação com a histologia (FOCCHI et al. 2000). Essa
classificação foi usada extensivamente no passado para reportar os achados em
citologia cervical, e era baseada no grau de certeza a respeito da presença de
células malignas no esfregaço. Sua classificação divide-se em: Classe I, ausência
de células anormais; Classe II, células atípicas, porém sem evidencia de
malignidade; Classe III suspeita de malignidade, mas não conclusiva de
23
malignidade; Classe IV, fortemente sugestiva de malignidade; e a Classe V
conclusiva de malignidade (WHO, 1988).
James Reagan (1953) propôs nova nomenclatura, a de Hiperplasia Atípica,
que posteriormente passa a se chamar Displasia, referindo-se a uma lesão
constituída por células atípicas situadas no epitélio e que conserva certo grau de
estratificação para a superfície. A displasia foi dividida em três graus de intensidade:
leve, moderada e severa. Reagan introduz também o conceito de dois novos tipos
de lesões cervicais: o carcinoma in situ, precursor do carcinoma invasivo e lesões
pré-cancerosas, considerando-as de evolução imprevisível. A partir destes
conhecimentos, Reagan tentou estabelecer um comparativo entre a citologia e a
histologia, porém encontrou dificuldades, devido a variações oriundas da falta de
subjetividade dos resultados (MARTINS e PEREIRA, 2000).
Richart (1967) discordou da terminologia “displasia” de Reagan, insistindo no
potencial invasivo das lesões epiteliais, independentemente do fenótipo das
anomalias, considerando que todas as lesões precursoras representam um espectro
contínuo de evolução (RUBIN e FARBER, 1999). Assim, Richart propôs o termo
Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC), em graus NIC I para displasia leve, NIC II
para displasia moderada e NIC III para displasia acentuada, considerando que a
diferenciação entre displasia acentuada e carcinoma in situ, não é reproduzível na
prática diária com nenhum grau de consistência. Sua argumentação se baseou na
dificuldade de prever a evolução clínica de uma lesão pelo exame microscópico
citológico ou histológico (KOSS, 1989).
Em 1988, a partir de uma reunião de citologistas de todo o mundo na cidade
de Bethesda, nos Estados Unidos da América, surgiu uma nova classificação em
citologia cervical, a qual recebeu o nome de Tratado Sistema Bethesda (TBS). Seu
principal objetivo era garantir uma terminologia uniforme e melhorar a comunicação
entre a tríade do câncer cérvico-vaginal: citologia, histologia e ginecologia (KOSS,
1992) O Sistema Bethesda teve quatro enfoques principais: estabelecer a qualidade
do esfregaço; simplificar a classificação para Lesão Intraepitelial Escamosa (SIL)
subdividida em Lesão Intraepitelial Escamosa de Baixo Grau (LSIL) e Lesão
Intraepitelial Escamosa de Alto Grau (HSIL); classificação obrigatória de no mínimo
LSIL, quando houver alteração citopática compatível com HPV; e criação de
nomenclaturas intermediárias denominadas Células Escamosas Atípicas de
24
Significado Indeterminado (ASCUS), e Células Glandulares Atípicas de Significado
Indeterminado (AGUS) (KURMAN e SOLOMON, 1997).
Em abril de 1991, houve um novo encontro para avaliação do impacto do
Sistema Bethesda 1988, no qual ocorreram alguns ajustes, entre eles: uma
apreciação sobre a qualidade da colheita do material cérvico-vaginal, avaliação geral
do diagnóstico, e descrição para os esfregaços anormais. Para avaliar a adequação
da amostra, foram definidas três categorias: Satisfatória para avaliação, Satisfatória
mas limitada e Insatisfatória para avaliação (KURMAN e SOLOMON, 1997).
O Sistema Bethesda foi atualizado em maio de 2001, e propôs que o laudo
citológico cérvico-vaginal deveria informar: metodologia de coleta, se citologia
convencional ou citologia em meio líquido; adequação da amostra, satisfatória ou
insatisfatória; categorização geral (opcional); e interpretação de resultados. Os
resultados da interpretação das amostras podem ser classificados como: negativo
para lesão intraepitelial ou malignidade, e anormalidades em células epiteliais
escamosas ou glandulares (BETHESDA, 2001). As amostras são categorizadas
segundo a anormalidade mais significante. ASCUS passa a ser dividido em ASC-
US quando não puder excluir LSIL, porém ainda não se pode caracterizá-la; e ASC-
H, quando não puder excluir HSIL bem caracterizada. A LSIL abrange displasia
leve/ NIC I e ou alterações citopáticas sugestivas de infecção por HPV; enquanto
HSIL abrange displasia moderada (NIC II), displasia grave (NIC III) e Carcinoma in
situ (NIC III). Contudo, quando houver HSIL associada com pleomorfismo celular
considerável, com sinais de diátese hemorrágica e/ou tumoral, necrose epitelial,
micro ou macronucléolos, achados suspeitos a favor de invasão, é classificado como
HSIL – não se pode excluir invasão (BETHESDA, 2001). AGUS mudou para células
glandulares atípicas (AGC), ou seja, considera-se que são células possivelmente
neoplásicas, devendo-se especificar a origem celular, se endocervical ou
endometrial, quando possível. Se houver critérios de malignidade, o
adenocarcinoma deve ser especificado se in situ ou invasor quando possível,
procurando identificar também a sua origem. O adenocarcinoma de endocérvice é
apresentado com descrições para as fases in situ e invasor e o adenocarcinoma de
endométrio, por outro lado, é descrito sem distinção de sua fase de evolução
(BETHESDA, 2001).
A Nomenclatura Brasileira para Laudo Citopatológico Cervical (NBLC) foi
implantada nacionalmente em laboratórios credenciados pelo Sistema Único de
25
Saúde (SUS), a partir do segundo semestre do ano de 2003 (BRASIL, 2003).
Baseia-se no Sistema Bethesda 2001, porém com a introdução de novos conceitos
estruturais e morfológicos na busca de um melhor desempenho laboratorial. As
principais alterações da NBLC, em relação ao BETHESDA 2001, são: avaliação
pré-analítica; na qual, a rejeição da amostra deve ser especificada, se é por
causas alheias e anteriores à chegada do material ao laboratório ou relacionada à
colheita, coloração ou microscopia. A adequabilidade da amostra, se satisfatória
ou insatisfatória, refere-se à representatividade, boa distribuição celular, fixação e
coloração, de tal modo que sua visualização permita uma conclusão. No
diagnóstico descritivo, a categoria alterações celulares benignas foi excluída, pois,
segundo a NBLC, não se aplica à realidade brasileira. Houve inclusão de uma
categoria separada para todas as atipias de significado indeterminado, e da
categoria de origem indefinida, destinada a situações onde não se consegue
estabelecer com clareza a possível origem das células atípicas. Estes casos
abrangem atipias de células escamosas possivelmente não neoplásicas e não se
pode afastar HSIL; atipias de células glandulares possivelmente não neoplásicas e
não se pode afastar HSIL; e, de origem indefinida possivelmente não neoplásicas
e não se pode afastar HSIL (BETHESDA, 2001).
2.4 DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS (DST) E CITOLOGIA
CÉRVICO-VAGINAL
O exame de Papanicolaou é um exame de baixo custo, que pode ser
empregado tanto para a pesquisa de lesões pré-malignas ou de malignidade,
como para o rasteio de agentes das DST. No Brasil, o uso de metodologias
específicas em programas de saúde para a pesquisa de agentes microbiológicos
causadores destas doenças ainda é incipiente. A sugestão de ocorrência das DST
pelo método de Papanicolaou dá-se, ou pela observação direta dos
microorganismos, ou por alterações citopáticas específicas provocadas por certos
microorganismos. De um modo geral, este exame tem graus de sensibilidade e
especificidade considerados aceitáveis (PANÚCO et al., 2000).
Recomenda-se um exame anual em mulheres sexualmente ativas, como
preventivo do carcinoma cervical. Porém, pacientes com história de DST devem
26
realizar o exame mais freqüentemente, devido ao risco aumentado de câncer
cervical, principalmente porque estas doenças, de modo geral, oportunizam
infecções pelo HPV, reconhecidamente carcinogênico (CDC, 2007).
A microbiota vaginal normal é colonizada por bacilos de Döderlein ou
lactobacilos, principalmente o Lactobacillus acidophilus, responsável pela
manutenção do pH vaginal ácido, normalmente entre 4 e 5, através da produção
de ácido láctico e peróxido de oxigênio, desfavorecendo assim o desenvolvimento
de patógenos (LONGATTO FILHO e SILVA FILHO, 2000).
Considera-se como vulvovaginite toda manifestação inflamatória e/ou
infecciosa do trato genital feminino inferior. Os microrganismos mais
freqüentemente envolvidos são: Candida spp, Trichomonas vaginalis, Gardnerella
vaginalis e Mobiluncus spp (VAN DICK e MEHEUS, 2000).
A candidíase é a infecção fúngica mais freqüente do trato genitourinário, não
apresentando limitação epidemiológica, pelo fato de ocorrer, na maioria das vezes,
em pacientes predispostas a um super crescimento de sua própria microbiota. As
espécies do gênero Candida são amplamente envolvidas em casos de
vulvovaginites, sendo que a C. albicans é responsável por aproximadamente 85%
dos casos, e outros são devidos principalmente a C. glabrata, C. tropicalis e C.
Krusei. No entanto, eventualmente, algumas outras espécies de leveduras também
podem colonizar o trato genital feminino. No método de Papanicolaou, pode-se
observar pseudo-hifas e células leveduriformes isoladas ou em pequenos grupos
(LONGATTO FILHO e SILVA FILHO, 2000).
A vaginose bacteriana está associada com a substituição dos lactobacilos
por microorganismos como Gardenerella vaginalis e espécies bacterióides como
Micoplasma spp e Mobiluncus spp (BETHESDA, 2001). A coloração de
Papanicolaou permite a detecção de Gardenerella vaginalis e Mobiluncus spp,
incluindo espécies: Mobiluncus curtisii e Mobiluncus mulieris em amostras
cervicais e a sua diferenciação em relação ao padrão lactobacilar. No material
citológico sugestivo de infecção por G. vaginalis, observa-se bactérias dispersas
como poeira entre as células epiteliais e formação de “clue cells”, células cobertas
por pequenas formações coco-bacilares aparentemente ligadas às células
cariopicnóticas por uma de suas extremidades, com limites pouco nítidos, os quais
têm valor diagnóstico confirmado em 90% dos casos com culturas positivas
(GOMPEL e KOSS, 1997). Já em casos de infecção por Mobiluncus spp incluindo
27
as espécies Mobiluncus curtisii e Mobiluncus mulieris, ao microscópio sob objetiva
de imersão (1000x), observam-se delicados bacilos sobre as células epiteliais,
conferindo às mesmas um aspecto de toalha felpuda, e a denominação de “comma
cells”, sem distinção entre as espécies (LONGATTO FILHO e SILVA FILHO,
2000).
O Trichomonas vaginalis é um protozoário unicelular flagelado, de formato
ovóide ou piriforme, que mede em geral 10 a 30 µm de comprimento por 7 µm ou
mais de largura, e que se movimenta por rotação e oscilação, através de 3 a
5 flagelos, juntamente com uma membrana ondulante que possui na parte anterior
do corpo. A via de transmissão é predominantemente sexual, e a infecção
desenvolve-se preferencialmente no epitélio escamoso, destruindo as células por
ação direta, sendo que a reação do hospedeiro se manifesta com intensa resposta
inflamatória, proliferação de capilares subepiteliais e micro-hemorragias. A
cervicocolpite decorrente está associada à diminuição da acidez de uma
microbiota mista normalmente cocoíde e às vezes associada a Leptothrix spp,
bactéria gram negativa com morfologia em estruturas finas, alongadas e
segmentadas, normalmente comensais da microbiota vaginal. A coloração de
Papanicolaou mostra-se extremamente vantajosa para a identificação de T.
vaginalis, sendo amplamente utilizada em programas de rasteio de câncer cervical
(LARA-TORRE e PINKERTON et al., 2003).
A Chlamydia trachomatis é uma bactéria gram negativa, intracelular
obrigatória, reconhecida principalmente nos países desenvolvidos, como o mais
comum dos patógenos sexualmente transmissíveis. Em mulheres, esta bactéria
está envolvida em casos de doenças inflamatória pélvica, gravidez ectópica e dor
pélvica crônica. Em aproximadamente 50% dos casos, as pacientes acometidas
podem ser completamente assintomáticas durante anos, podendo se tornar
inférteis (CHAN et al., 2000).
Os critérios para a sugestão de infecção por C. trachomatis através do
exame de Papanicolaou, envolvem a identificação de inclusões citoplasmáticas,
que representam os diferentes estágios do ciclo de vida da bactéria usualmente
presentes no interior de células metaplásicas e, ocasionalmente, de células
endocervicais (GRUPTA et al., 1979). A citologia evidencia pequenos elementos
no centro de um ou mais vacúolos citoplasmáticos com contornos nítidos.
Posteriormente, as células mostram múltiplos pequenos vacúolos bem delimitados
28
e contendo inclusões eosinofílicas constituídas pela condensação de partículas
desta bactéria, conferindo à célula um aspecto de “mordedura de traça” ou “moth
eaten” (BIBBO, 1997).
2.5 PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)
Os HPV compõem um grupo heterogêneo de vírus DNA, com mais de 100
diferentes tipos já identificados através de técnicas de biologia molecular. Cerca de
95% dos tumores malignos cervicais e de suas lesões precursoras contêm o
material genético de alguns genótipos de HPV (LONGATTO FILHO e SILVA
FILHO, 2000). Aproximadamente 40 tipos afetam o trato genital humano. Os HPV
de baixo risco (6, 11, 30, 42, 43 e 44) são mais encontrados em LSIL, os de risco
intermediário (31, 33, 35, 39, 51, 52, 58 e 61) são mais encontrados em HSIL e,
com menor frequência, em carcinoma, enquanto, os de alto risco (16, 18, 45 e 56)
aparecem em HSIL e em carcinomas, que se apresentam sempre como lesões
monoclonais (SOLOMON e NAYAR, 2001). Atualmente, a correlação entre a
infecção pelo HPV, lesões intra-epiteliais de colo, vagina e vulva e carcinomas
invasores é fato amplamente aceito (FOCCHI et al., 2000). Porém, o câncer
cervical não se desenvolve em todas as mulheres infectadas pelo HPV, sendo que
a presença de tipos mais agressivos e carcinogênicos de vírus como os HPV 16 e
18, pode não ser suficiente para contribuir para o desenvolvimento de lesões de
baixo grau, que possam, posteriormente, progredir a lesões de alto grau (DAS
DORES et al 1999). Diferentes co-fatores participam da gênese do câncer uterino
como: número de parceiros sexuais, início da atividade sexual em idade precoce,
fumo, uso de anticoncepcionais, causas genéticas e imunológicas. Além disso, a
transmissão pode ser facilitada pela presença de superfícies escarificadas ou
maceradas e oportunizar a infecção por outros agentes causadores de DST
(MEISELS e MORIN, 1997).
Quando o HPV infecta uma célula, pode ser eliminado, ficar latente ou
produzir infecção clínica ou sub-clínica ativa ou, ainda, integrar seu genoma ao da
célula hospedeira imatura, impedindo sua diferenciação e maturação (MARTINS e
PEREIRA, 2000).
29
A infecção pelo HPV pode ser sugerida principalmente pela observação de
células coilocíticas. Os coilócitos são células escamosas superficiais ou
intermediárias, em geral com volume aumentado, e com o núcleo excêntrico,
rodeado por zona clara irregular, que apresenta aspecto vazio e ocupa grande
parte do citoplasma. Na periferia da área clara perinuclear, o citoplasma é denso,
de coloração eosinofílica ou cianofílica. Os coilócitos podem conter um ou mais
núcleos grandes, hipercromáticos, discretamente irregulares, com a cromatina
densa, granulosa e grosseira. Além destas alterações celulares típicas de infecção
pelo HPV, ocorrem também células discarióticas, com aumento da relação
núcleo/citoplasma, cariomegalia, hipercromasia e/ou distribuição irregular da
cromatina (GOMPEL e KOSS, 1997). Segundo MEISELS (1997), outra alteração
citológica que pode ser atribuída ao vírus, é a disceratose, caracterizada por
aglomerados densos de pequenas células alongadas ou elípticas, núcleo denso,
cromatina mal definida, e com citoplasma orangeofílico.
2.6 ALTERAÇÕES REATIVAS OU REPARATIVAS, INFLAMAÇÃO OU
PRESENÇA DE ORGANISMOS
Compreendem alterações reativas ou reparativas, processos decorrentes de
respostas na presença de organismos responsáveis por infecção e a infiltrados
inflamatórios. Freqüentemente estão associados a trauma, estímulo hormonal ou
radiação, que podem ser tão exuberantes que mimetizam lesões escamosas ou
glandulares (KURMAN e SOLOMON, 1994; CIBAS e DUCATMAN, 1996).
A inflamação serve para destruir, diluir ou isolar o agente causador da injúria,
mas, por outro lado, põe em movimento uma série de eventos que, sempre que
possível, cicatrizam e reconstituem o tecido danificado. O reparo pode começar
durante as primeiras fases da inflamação quando o processo é extenso, mas se
completa geralmente após a neutralização da causa da injúria (KOSS, 1992;
KUMAR et al., 2005).
Na inflamação, as células escamosas maduras reativas mostram discreto
aumento nuclear, geralmente a área do núcleo não é mais do que duas vezes maior
que a de uma célula intermediária normal. Ocasionalmente são vistas células bi ou
multinucleadas. Pode haver discreta hipercromasia, mas a cromatina é finamente
30
granular e uniformemente distribuída (KURMAN e SOLOMON, 1994; CIBAS e
DUCATMAN, 1996).
Durante o reparo ativo, as amostras mostram lençóis de células imaturas
alongadas, com núcleo aumentado, cromatina pálida e macronucléolos
proeminentes, além de mitoses ocasionais, sendo que os dois últimos refletem a
síntese ativa de proteínas nas células de crescimento rápido, na tentativa de reparar
o tecido danificado. As células de reparo apresentam manutenção da polaridade, os
lençóis formados são coesos, com bordos citoplasmáticos indistintos e, geralmente,
há ausência de células isoladas anormais (CIBAS e DUCATMAN, 1996; BIBBO,
1997; MEISELS e MORIN, 1997). Como regra, a cromatina é finamente granular,
regularmente distribuída e não hipercromática (BIBBO, 1997).
Utiliza-se o termo metaplasia para descrever uma transformação reversível de
um tipo adulto de tecido em outro tipo geralmente também adulto, mantendo certas
características morfológicas de ambos, que ocorre com o objetivo de melhor
adaptação para a proteção a determinados agentes agressores (KOSS, 1992;
KUMAR et al., 2005). Pode representar também uma substituição adaptativa de
células mais sensíveis a estresse por outras capazes de resistir melhor ao ambiente
adverso (STEVENS e LOWE, 1996; KUMAR et al., 2005). Vários estudos de
microscopia eletrônica mostram que as células de reserva do epitélio endocervical
têm o potencial de se diferenciar tanto em células endocervicais produtoras de
muco, quanto em células escamosas. A metaplasia cervical escamosa é
representada por um espectro de alterações epiteliais, com células em vários graus
de maturidade. As células tendem a ser isoladas, com bordos distintos, redondas,
ovais ou poliédricas. No citoplasma há coloração mais densa na zona mais externa
ou ectoplasma, e uma zona mais clara perinuclear ou endoplasma. Os núcleos são
relativamente pequenos, redondos ou ovais, centralizados e uniformes, com
cromatina finamente granular, semelhantes aos de células endocervicais (BIBBO,
1997).
31
2.7 ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS INDICATIVAS DE ANORMALIDADES
EPITELIAIS CERVICAIS
2.7.1 Células Escamosas Atípicas (ASC)
As alterações celulares são sugestivas de uma lesão intraepitelial escamosa,
ou seja, são mais marcadas que aquelas dos processos reativos, mas são
quantitativamente ou qualitativamente insuficientes para uma interpretação definitiva
(BETHESDA, 2001). Nas células alteradas, os núcleos podem estar duas e meia a
três vezes maiores que os de células intermediárias normais, com discreta
hipercromasia, cromatina continua e regularmente distribuída, sem granulosidade. O
contorno nuclear geralmente é liso, fino e bem delimitado, mas pode ser levemente
irregular (MEISELS e MORIN, 1997).
2.7.2 Lesão Intraepitelial Escamosa de Baixo Grau (LSIL)
Engloba alterações celulares associadas a efeitos citopáticos do HPV, ou
seja, atipia coilocítica e displasia leve ou NIC I (BETHESDA, 2001). As células
ocorrem isoladas ou em lençóis e predominam as discarióticas do tipo intermediária
ou superficial com características de maturidade. Os núcleos são redondos ou ovais,
estão aumentados em cerca de três vezes o tamanho de uma célula intermediária
normal, porém há moderada variação no tamanho e na forma nuclear
ocasionalmente acompanhada de bi ou multinucleação. A membrana nuclear em
geral é lisa e claramente discernível, e a cromatina é finamente granular ou reticular
(CIBAS e DUCATMAN, 1996; MEISELS e MORIN, 1997).
2.7.3 Lesão Intraepitelial Escamosa de Alto Grau (HSIL)
Compreende displasia moderada ou NIC II, displasia acentuada ou NIC III e
carcinoma in situ. As células são predominantemente redondas ou ovais, com
citoplasma de aparência imatura, delicada ou densa, e podem ocorrer sozinhas, em
agregados sinciciais ou em fila indiana. Algumas das lesões podem possuir células
com citoplasma abundante e anormalmente queratinizado, com núcleos grandes e
32
hipercromáticos, cromatina borrada, pleomorfismo, anisocariose e hipercromasia.
Ocorre aumento na relação núcleo/citoplasma, a cromatina é granular ou mostra
bandas irregulares e cromocentros distribuídos regularmente. Os nucléolos são
pequenos ou não estão visíveis. A membrana nuclear é muitas vezes irregularmente
corada (MEISELS e MORIN, 1997).
2.7.4 Carcinoma Escamoso Invasor
Fenômenos inflamatórios e necróticos na superfície do tumor refletem no
aspecto dos esfregaços, e podem obscurecer as células cancerosas, com frequência
pobremente preservadas. As formas celulares redondas ou ovais são numerosas,
podendo ser predominantes às células cancerosas, que mostram em geral
acentuado pleomorfismo, com aberrações nucleares e citoplasmáticas. As células
estão geralmente arranjadas em agregados sinciciais, nos quais possuem bordos
indistintos, podendo demonstrar polaridade alterada. Outro achado comum é a
presença de grandes lençóis de células ou fragmentos de tumor. Esses grupos são
muito espessos e deve-se procurar por células cancerosas isoladas para confirmar o
diagnóstico. A configuração nuclear está em parte relacionada com a forma da
célula. O carcinoma invasor tem a maior proporção de formas nucleares não
isodiamétricas. A cromatina é densa e distribuída em blocos irregulares, sendo que
volumosos nucléolos estão freqüentemente presentes (MEISELS e MORIN, 1997).
2.7.5 Células Glandulares Atípicas (AGC)
Refere-se a células endocervicais ou endometriais que mostram atipias
nucleares mais evidentes em relação às de alterações reativas ou reparativas, mas
que não apresentam achados inequívocos de adenocarcinoma. As células ocorrem
em pequenos grupos, com bordos mal definidos e mínima alteração da polaridade,
com sobreposição nuclear e citoplasma escasso. Os núcleos estão pouco
aumentados, embora sejam, algumas vezes, três a cinco vezes maiores que em
células endocervicais normais. Podem ser vistos nucléolos pequenos e
hipercromasia discreta. A cromatina, em geral, é regularmente distribuída (CIBAS e
DUCATMAN, 1996; AUSTIN e RAMZY, 1998).
33
2.7.6 Adenocarcinoma in situ (AIS)
São vistos lençóis de células glandulares endocervicais malignas
compactadas ou amontoadas, e grupos circulares conhecidos como rosetas, com
sobreposição nuclear e perda de polaridade. Os núcleos geralmente são grandes e
hipercromáticos, com presença de macronucléolos. A cromatina tem padrão
grosseiramente granular e é regularmente distribuída, podendo estar presentes
corpos apoptóticos e figuras de mitose (BETHESDA, 2001).
2.7.7 Adenocarcinoma Invasor
Existem algumas caracterísitcas morfológicas que permitem a diferenciação
do adenocarcimoma invasor entre endocervical e endometrial, porém a origem
celular nem sempre é evidenciada. Em amostras citológicas, as células cancerosas
geralmente aparecem em grupos, que podem ser compactos, redondos, papilares
ou arranjados em rosetas. Os núcleos mostram tamanho aumentado, anisocariose e
hipercromasia. As células isoladas podem manter a forma colunar, mas
freqüentemente são redondas, ovais ou com formas irregulares. As principais
alterações ocorrem nos núcleos que são aumentados, hipercromáticos, com
cromatina grosseiramente granular e podem apresentar nucléolos grandes,
evidentes e, às vezes, múltiplos. A distinção entre AIS e adenocarcinoma invasor na
citologia ocorre pela presença de necrose e pela intensidade e características das
anomalias citológicas (KOSS, 1992).
2.8 MÉTODOS DE COLETA E PREPARAÇÃO DO MATERIAL
Para garantir uma boa qualidade da amostra, deve-se seguir algumas
recomendações, como, por exemplo, instruir a paciente para que não use duchas
vaginais ou qualquer tipo de lubrificante, e que não tenha relações sexuais 24
horas antes do exame. Não se deve fazer coleta de amostra durante a
menstruação devido à grande quantidade de sangue que inviabiliza a avaliação da
34
amostra e, se houver muito muco ou material purulento, esse deve ser removido
suavemente com um “swab” ou gaze antes de ser feita a coleta. (CAPURRO et al.,
2002).
Basicamente, duas são as formas de coleta usadas em citologia genital:
exfoliativa que consiste em recolher as células que descamam espontaneamente no
fundo do saco posterior da vagina; e abrasiva, na qual é feita uma raspagem da
mucosa de modo que as células se soltem do epitélio (OPAS, 1990).
Os instrumentos mais utilizados para a coleta da citologia cérvico-vaginal,
são: escova cilíndrica endocervical plástica ou de “nylon”, escova cônica e espátula
de Ayre que, pela suas formas, permitem a coleta da superfície da ectocérvix e da
endocérvix, na região da junção escamo-colunar (JEC).
Existem vários métodos de coleta para o preparo de esfregaços, cada qual
tem um valor específico para seu próprio objetivo na triagem de câncer ou avaliação
hormonal. Os métodos mais utilizados são: coleta convencional (coleta dupla ou
tríplice) e coleta em meio líquido.
Na coleta tríplice (VCE), colhe-se material de três áreas na mesma lâmina,
onde: V é o material coletado da parede lateral superior da vagina ou fundo de
saco vaginal; C da ectocérvice incluindo a JEC; E do canal endocervical, buscando
uma representatividade celular de todo o trato genital feminino.
Na coleta dupla, colhe-se material da endocérvice e ectocérvice, incluindo a
JEC. O Ministério da Saúde do Brasil, em 1996, elaborou um projeto-piloto para o
controle do câncer do colo uterino, utilizando a técnica de colheita dupla com
amostras da ectocérvice e JEC com espátula de Ayre, e do canal endocervical
com a escova cilíndrica, colocadas em uma única lâmina, deixando de colher
amostras do fundo de saco vaginal (INCA 2007).
A identificação deve ser realizada no momento da colheita: com grafite na
extremidade fosca da lâmina de microscopia ou com ponta de diamante em lâminas
lisas.
Depois de realizada a coleta, o material deve ser espalhado sobre a lâmina de
modo regular, com boa espessura e rapidamente para evitar a dessecação e,
consequentemente, preservar o estado morfológico das células. Toda a superfície
do instrumento de coleta deve estar em contato com a lâmina, para garantir a
transferência de porção representativa do material. O material deve ser espalhado
35
de modo regular, num único sentido, ocupando uma região determinada para cada
local de coleta.
A fixação dos esfregaços deve ser imediata para evitar dessecação, que
deforma as células e altera suas afinidades tintoriais. O etanol 95% é um fixador
de escolha, porque não é tóxico e apresenta um baixo custo. Atua desnaturando
as proteínas e os ácidos nucléicos, tornando-os insolúveis e estáveis. Os métodos
de fixação são divididos em três categorias: fixação úmida, onde a lâmina é
mergulhada em um tubete contendo etanol 95% e encaminhada ao laboratório, o
tempo mínimo de fixação é 15 min; fixação úmida com subsequente secagem ao
ar, para facilitar o transporte da lâmina; e fixação por nebulização ou cobertura do
esfregaço com solução de polietilienoglicol (Carbowax
®
) em etanol ou álcool
isopropílico. No caso, de nebulização, esta deve ser feita a cerca de 30 cm da
lâmina para evitar a formação de artefatos de imagem. O polietilenoglicol protege
as células, formando uma película sobre as mesmas. Antes da coloração, as
lâminas devem ficar mergulhadas em etanol 95% para completar a fixação e para
retirar a camada de polietilenoglicol (BIBBO, 1997).
A coloração de Papanicolaou, universalmente empregada na citologia
oncótica, é policrômica, o que permite a diferenciação das células em eosinófilas e
cianófilas devido ao processo de oxido-redução, que ocorre na superfície da célula
(PUNDEL e LICHTFUS, 1957). O corante nuclear é a hematoxilina que, por
oxidação pelo óxido de mercúrio, se transforma em hemateína, corando o núcleo em
azul após mordaçagem pelo alúmem de potássio. O Orange G, a eosina, o verde luz
e o marron de Bismark são corantes citoplasmáticos. O método da coloração
consiste nas seguintes fases: hidratação, coloração nuclear, desidratação e
coloração citoplasmática. Esta coloração tem como objetivos a definição de detalhes
estruturais do núcleo e a transparência celular, obtida através da passagem dos
esfregaços em etanol em concentrações decrescentes e crescentes, em fases de
hidratação e desidratação, respectivamente, e pelo uso de xilol (GOMPEL e KOSS,
1997). Muitas modificações da coloração original de Papanicolaou (1942) foram
propostas, e diferem basicamente quanto à intensidade da coloração nuclear e
citoplasmática. A coloração de Shorr, complementada pela Hematoxilina de Harris
proposta por Pundel (1957), também oferece bons resultados na citologia oncótica,
porém, foi preconizada para avaliação hormonal, através de uma boa diferenciação
entre células escamosas parabasais, intermediárias e superficiais.
36
Após a coloração, as lâminas devem ser montadas de forma permanente,
utilizando um líquido de montagem, entre lâmina e lamínula, que protegerá as
células contra danificação mecânica, artefatos de secagem ao ar, e perda da
coloração. Assim, as lâminas poderão ficar estocadas no escuro por longo período
de tempo. Para escolher o meio de montagem, deve-se analisar o índice de
refratividade da lâmina e lamínula e do líquido, para que este não cause distorções
morfológicas nas células. Vários meios de montagem vêm sendo usados em
citologia, como: Entellan
®
, bálsamo do Canadá, bálsamo sintético, verniz automotivo
e outros.
2.9 CITOLOGIA CONVENCIONAL
O uso combinado de espátula de Ayre e de escova endocervical tem
demonstrado bons resultados, e por isso, é a técnica de escolha para a citologia
cérvico-vaginal convencional (BOON et al. 1989). A qualidade do esfregaço neste
exame pode ser melhorada, coletando-se primeiro da região da JEC e depois da
endocérvice, evitando-se a presença de grande quantidade de hemácias e
leucócitos, que podem prejudicar a avaliação do material. A espátula de Ayre deve
ser levemente introduzida no canal endocervical, girando-se 360º para coletar
material de toda a região, incluindo JEC e ectocérvice. Na sequência, o material
deve ser transferido para uma lâmina de maneira delicada e uniforme, evitando-se
a formação de artefatos. Para coletar material do canal endocervical, introduz-se a
escova endocervical no canal, girando-se 360° para evitar uma abrasão
excessivamente vigorosa com sangramento (PARAISO et al. 1994). Ao se coletar
material pelo método convencional, obtém-se entre 600.000 a 1,2 milhão de
células epiteliais, mas apenas 20% destas células coletadas vão para a superfície
da lâmina de microscopia, e o restante, que fica aderido à espátula/escova, será
descartado (HUTCHINSON et al. 1994).
Distribui-se o material sobre a lâmina e procede-se à fixação rapidamente,
para que as células continuem bem preservadas. Alguns estudos mostram que a
distribuição do material em duas lâminas de microscopia detecta mais alterações
37
do que quando se emprega apenas uma, pois uma quantidade maior de células,
melhor preservadas e fixadas, é avaliada (NEIDT et al., 1996).
Para aumentar a coleta de células do canal endocervical e,
consequentemente, a detecção de lesões glandulares endocervicais, empregou-se
modificações no formato dos instrumentos de coleta como, por exemplo, a
espátulas de Aylesbury e de Szalay (RAMMOU-KINIA et al, 1991; MCGOOGAN et
al, 1998).
O uso de escovas modelo vassoura ou “broom like samplers” permite com
apenas um instrumento a coleta simultânea da ectocérvice, JEC e endocérvice,
sendo uma opção para a coleta convencional (MCGOOGAN et al.,1998),
A coleta da amostra cérvico-vaginal após a retirada do muco e restos
celulares da superfície cervical com um cotonete de celulose aumenta a
sensibilidade do exame convencional de Papanicolaou (OBWEGESER e BRACK,
2001).
2.10 CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO
A citologia em meio líquido surgiu para atender às demandas de escrutínio
computadorizado feito pelos aparelhos automatizados para citologia cérvico-
vaginal (TAKAHASHI e NAITO, 1997). Para viabilizar a leitura das lâminas por
computadores, era necessário um preparado que apresenta o menor número
possível de artefatos e sobreposições celulares (MCGOOGAN e REITH, 1996).
Esta metodologia é o resultado de mais de uma década de pesquisas, na busca de
um único meio, com condições de preparo citológico de excelência em fixação,
preservação celular e também adequado para estudo biomolecular (VELASCO,
2001).
Existem várias metodologias de preparo de citologia em meio líquido, como:
DNA-Citoliq® (Digene-Brasil), Thin Prep® (Cytyc Corp., USA), Autocyte® (Tripath,
USA). A United States Food and Drug Administration (FDA) aprovou a metodologia
de base líquida Thin Prep® (Cytyc Corp., USA) em 1996 e Autocyte® (Tripath,
USA) no ano de 1998 como uma alternativa ao exame de Papanicolaou
convencional, para a triagem do câncer cervical (FERENCZY e FRANCO, 2001).
38
São técnicas de preparação de amostras que diferem no uso dos reagentes
preservativos e protocolos de citopreparação. As técnicas de Thin Prep® e DNA-
citoliq ® apresentam a mesma forma de preparação, através de uso de filtros e
vácuo, sendo a lâmina preparada por impressão do material. Na técnica de
Autocyte® a amostra é preparada por citocentrifugação (GRUPTA et al, 2001).
O método de coleta da citologia em meio líquido consiste em usar uma
única escova de forma aproximadamente cônica, no caso da DNA-citoliq ®, a qual
possui extremidade destacável e desenho anatômico que se encaixa perfeitamente
ao OCE, permitindo a esfoliação de células do exocérvice, da JEC e do
endocérvice. A haste da mesma, após a coleta de material cérvico-vaginal, é
quebrada de forma a ser acomodada em um tubo de material plástico descartável
com capacidade para 10 ml, contendo líquido preservante e/ou fixador, que
permite a posterior preparação do material citológico em lâmina de microscopia.
Toda a celularidade do material recolhido fica, assim, disponibilizada de forma
homogênea e randômica, bem como, se tem a possibilidade da preparar várias
lâminas (CIBAS e DUCATMAN, 1996).
2.11 ADEQUADAÇÃO E ESCRUTÍNEO DA AMOSTRA
Segundo o Sistema Bethesda, a adequação da amostra é o componente
isolado mais importante da garantia de qualidade deste sistema. A presença dos
componentes escamoso e endocervical garante representatividade da ZT. As
mudanças pré-malignas e malignas ocorrem nesta área e, portanto, esta é a
principal região que deve estar representada para se detectar a grande maioria das
anormalidades (BIBBO, 1997).
No Sistema Bethesda 1991, a amostra é considerada “satisfatória para
avaliação” quando mais de 10% da lâmina estiver coberta com células escamosas
bem preservadas, e apresentar no mínimo dois grupamentos de células glandulares
ou metaplásicas compostos pelo menos de 5 células cada um. Porém, em casos de
epitélio atrófico, a ausência desses componentes pode não afetar a adequação da
amostra, sendo a mesma considerada satisfatória para avaliação. Quando a amostra
apresentar ausência de dados pertinentes à paciente como: idade, data da última
39
menstruação, informações adicionais apropriadas, como o uso de DIU,
anticoncepcionais, presença de sangue, inflamação acentuada, áreas densas,
fixação pobre, artefatos de fixação, contaminação e/ou outros fatores que obstruírem
a visualização e a interpretação de aproximadamente 50 a 75% das células
epiteliais, e ainda ausência de células endocervicais ou metaplásicas, tornam a
amostra “satisfatória, porém, limítrofe”. A amostra é considerada “insatisfatória para
avaliação” quando não apresentar estes critérios para a adequação (THE
BETHESDA COMMITEE, 1993).
O Sistema Bethesda 2001 elimina a categoria limítrofe, ficando apenas a
categoria satisfatória, a qual deve apresentar indicadores de qualidade. Os
elementos usados para determinar a adequação da amostra são: identificação da
paciente; informações clínicas relevantes; composição celular, amostra
representativa da JEC e interpretabilidade técnica. Essa categorização para
adequação da amostra aplica-se tanto para citologia convencional como em meio
líquido. A amostra é considerada satisfatória quando a lâmina não está danificada e
está corretamente identificada, vem acompanhada de informações clínicas
relevantes, apresenta fixação e coloração de boa qualidade, e possui número
adequado de células representativas dos dois epitélios: na citologia convencional
deve ter entre 8.000 e 12.000 células escamosas bem conservadas e bem
visualizadas, além de no mínimo 10 células da ZT (endocervicais ou metaplásicas)
isoladas ou em grupos; enquanto na citologia em meio líquido deve-se ter no mínimo
5.000 células escamosas bem preservadas e visualizadas, além de 10 células da
ZT. A amostra pode ser considerada satisfatória, porém com limitações por:
ausência de informações clínicas; razões impeditivas da interpretação de 50 a 75%
das células epiteliais ou por ausência de componentes da endocérvice e/ou ZT.
Deve haver descrição em nota no laudo, relatando o fato. A amostra é considerada
insatisfatória quando não há identificação da paciente, ou lâmina quebrada; com
obscurecimento de grande parte do esfregaço dificultando a interpretação de 75%
ou mais das células epiteliais, ou mesmo quando os componentes celulares
cobrirem menos de 10% da superfície da lâmina. A designação insatisfatória indica
que a amostra não é confiável para a detecção de anormalidades epiteliais cervicais
(BETHESDA, 2001).
40
2.12 MEIOS PARA PRESERVAÇÃO E FIXAÇÃO CELULAR
A finalidade do fixador é preservar as caracterísitcas morfológicas e
macromoleculares dos tecidos ou células, para posterior armazenamento ou
análise. Isto depende de mecanismos físicos-químicos, nos quais os componentes
macromoleculares dos tecidos e das células passam por um processo de
insolubilização, causando sua estabilização e inativação. Agem primeiramente
incapacitando biomoléculas intrínsecas, particularmente enzimas proteolíticas, e
em seguida atuam protegendo a amostra de danos extrínsecos (JUNQUEIRA e
CARNEIRO, 1991).
A fixação tem função de impedir a autólise ou degradação bacteriana do
material biológico a ser analisado, além de facilitar os processos de coloração, e
promover um enrijecimento de órgãos e tecidos.
A fixação pode ser realizada por agentes físicos, ou substâncias químicas,
chamadas fixadores. Os fixadores reagem quimicamente com macromoléculas
como proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídeos, promovendo a sua
estabilização molecular, coagulando-as ou tornando-as insolúveis e,
conseqüentemente, precipitando-as nos tecidos de origem.
Existem muitos compostos químicos que podem ser usados como
substâncias fixadoras, entre eles: álcool etílico e álcool metílico; aldeídos, como
formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído; tetróxido de ósmio , eficiente na
fixação de lipídeos; e ácido pícrico e ácido crômico, também excelentes fixadores
de proteínas (CARVALHO e RECCO-PIMENTEL, 2001)
Álcool etílico e álcool metílico, considerados agentes desnaturantes de
proteínas, atuam reduzindo a constante isoelétrica das proteínas, causando a sua
precipitação, e rompendo desta forma as suas ligações hidrofílicas, importantes na
manutenção da sua estrutura terciária (BENCROFT e STEVENS, 1990).
Aldeídos como formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído, são excelentes
fixadores de proteínas por promoverem ligações cruzadas entre cadeias
polipeptídicas. As reações do formaldeído com as proteínas são numerosas e
complexas, sendo a reação mais freqüente a formação do composto metilol, este
composto é reativo e pode condensar-se com um átomo de hidrogênio, para formar
uma ponte metilénica (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1991).
41
Com a finalidade de estabilizar eritrócitos em amostras para o controle de
qualidade em hematimetria, foi formulada uma solução preservadora baseada nas
condições de osmolaridade, pH e composição do plasma normal, no metabolismo
dos eritrócitos e em estudos já existentes sobre a sua preservação in vitro. Após
serem testadas formulações com diferentes concentrações de glicose, citrato de
sódio, fosfatos, cloreto de potássio, etilenodiaminotetracetato dissódico (EDTANa
2
)
albumina bovina, succinato de cloromicetina, sulfato de neomicina e cortisona, foi
demonstrado que uma delas, denominada meio CE, estabilizou os valores do
eritrograma em suspensões de eritrócitos durante 45 dias (LEONART et al, 1986).
Posteriormente, a adição de novos componentes, como a vitamina E, estabilizou-
se os valores do eritrograma para eritrócitos humanos por até 60 dias em meio de
CE de preservação, e melhorou a preservação de eritrócitos de ratos normais e
carentes em vitamina E (LEONART et al, 1989 b).
A partir do conhecimento de que a fixação parcial de eritrócitos em
glutaraldeído inibe a hemólise, foram padronizados a concentração e o tempo de
exposição ao mesmo, para eritrócitos suspensos em meio CE com vitamina E,
obtendo amostras estáveis para os valores de eritrograma durante 100 dias
(LEONART et al, 1989a).
Eritrócitos parcialmente fixados por glutaraldeído foram utilizados na
obtenção de amostras para controle de qualidade em hematologia (LEONART et
al, 1989a). A propriedade de aldeídos, de estabelecerem ligações crosslinking
entre grupos amino e sulfidril de proteínas, peptídeos e alguns lipídeos, é utilizada
na fixação de tecidos para microscopia eletrônica (SABATINI et al., 1963). O
glutaraldeído forma produtos estáveis, resistentes à hidrólise ácida, com efeitos
variáveis sobre as atividades biológicas, estabelecendo ligações específicas entre
grupos amino da lisina e –SH. Pode-se provocar com o glutaraldeído uma reação
de polimerização facilmente controlada, com manutenção de atividades
enzimáticas e de composição de antígenos e anticorpos (REICHLIN, 1980). A
fixação parcial da membrana eritrocitária diminui a hemólise, com redução da
deformabilidade e formação de oligômeros de alto peso molecular por interações
entre as proteínas da membrana (ARAKI, 1981). Portanto, a fixação parcial de
eritrócitos com glutaraldeído inibe a hemólise e mantém diversas propriedades
físicas e biológicas da célula.
42
FAVERO (1996) utilizou glutaraldeído como fixador para o estudo da
morfologia dos eritrócitos em doenças hemolíticas. Neste trabalho, pretende utilizá-
lo como fixador na citologia em meio líquido, ou em outras formulações, e avaliar a
qualidade de fixação das células escamosas cérvico-vaginais mantendo as
características morfotintoriais destas células, bem como a fixação do material
citológico na lâmina.
O álcool etílico 95% é utilizado mundialmente como fixador no exame de
Papanicolaou convencional, preservando as características morfotintoriais das
células e a fixação do material citológico na lâmina no preparo da mesma (FREITAS
e BOLSANELLO, 1978).
Assim, existem conhecimentos acumulados a respeito da ação de diversos
fixadores e preservadores de células epiteliais e de outros tecidos. Diversos
pesquisadores têm demonstrado a eficiência de métodos de citologia em meio
líquido. Porém, embora os mesmos estejam disponíveis comercialmente, seu uso
em geral não é acessível a sistemas de saúde pública de países em
desenvolvimento, como o Brasil. Desta forma, torna-se relevante a investigação de
métodos alternativos de citologia em meio líquido para material cérvico-vaginal.
43
3. OBJETIVOS
44
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver um estudo sobre metodologias alternativas para o preparo de
amostras cérvico-vaginais em meio líquido para o exame de Papanicolaou.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Testar preliminarmente o emprego de diferentes meios líquidos para
fixação e preservação de células epiteliais.
• Testar preliminarmente técnicas de sedimentação espontânea,
centrifugação e citocentrifugação na preparação de material citológico em
lâminas de microscopia.
• Testar preliminarmente técnicas de confecção do esfregaço
citológico.
• A partir do desenvolvimento dos itens acima, selecionar metodologia(s)
alternativa(s) e testá-las em material cérvico-vaginal coletado de mulheres
atendidas no Sistema Único de Saúde.
45
4. MATERIAL E MÉTODOS
46
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
Coletou-se material da mucosa bucal de 10 adultos saudáveis com idades
entre 20 e 56 anos, de ambos os sexos; e material vaginal de 10 mulheres adultas
saudáveis de 26 a 56 anos, entre docentes e alunos do Curso de Farmácia da
Universidade Federal do Paraná, voluntários, para a realização de testes
preliminares. Coletou-se, ainda, material cérvico-vaginal de 150 pacientes que já
haviam iniciado sua atividade sexual, numa faixa etária que variou entre 15 e 69
anos, sendo 100 pacientes atendidas nas Unidades de Saúde Palmeiras, Parque
São Paulo e XIV de Novembro do Município de Cascavel, PR e 50, atendidas no
Ambulatório do Hospital Universitário do Oeste do Paraná (HUOP), seguindo a
técnica de coleta recomendada pelo Sistema Bethesda (SB), após consentimento
informado (Anexo 1), segundo aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos do Setor de Ciências da Saúde da UFPR, em 28 de
setembro de 2006 (Anexo 2).
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Reagentes, Material de Consumo e Equipamentos
4.2.1.1 Reagentes: álcool etílico absoluto comercial, cloreto de potássio P.A.,
citrato de sódio P. A (Reagen
®
), EDTANa
2
(Reagen
®
), albumina bovina (Sigma
®
),
glicose (Merck
®
), fosfato monohidrógeno de sódio (Merck
®
), sulfato de neomicina
(Dicrisfarma
®
), succinato de cloromicetina (Merck
®
), cortisona (QSPFarma
®
),
glutaraldeído (Sigma
®
), fosfato dissódico (Merck
®
), álcool isopropílico (Reagen
®
)
formaldeído (Synth
®
) , kit para coloração de Papanicolaou Lote n° 6667
(Newprov
®
), xilol (Reagen
®
), Entellan (Merck
®
).
47
4.2.1.2 Material de consumo: espátulas de Ayre, escovas cilíndricas e cônicas para
coleta de material cérvico-vaginal (Adlin
®
), espéculos vaginais, tubos plásticos
cônicos de 15 ml com tampa hermética, lâminas para microscopia de 25 x 75 mm,
lamínulas de 24 x 60 mm.
4.2.1.3 Equipamentos: capela Casplast
®
, misturador tipo vortex Phoenix
®
, balança
analítica Bel Mark
®
210 A, centrífuga Celm
®
LS-3, citocentrífuga Cytopro
Wescor
®
, Medidor de pH Mettler Toledo MP
®
220, geladeira, microscópio de luz
binocular Nikon Eclipse
®
E 200 com objetivas de 10x, 40x e 100x e oculares de
10x, microscópio Nikon Eclipse
®
E 200 com câmera digital SANSUNG
®
FCC131.
4.2.2 Testes preliminares para escolha de método de citologia em meio líquido
Testou-se, preliminarmente, o emprego de diferentes meios líquidos para
fixação e preservação de células do epitélio cérvico-vaginal: técnicas de
sedimentação espontânea, centrifugação e citocentrifugação na preparação de
material citológico em lâminas de microscopia; e técnicas de confecção do
esfregaço citológico. As avaliações foram fundamentadas em consenso
morfológico entre dois observadores do grupo de pesquisadores do laboratório.
4.2.2.1 Coleta de material
Coletou-se células de epitélio bucal e vaginal. No primeiro caso, raspou-se
vigorosamente o epitélio bucal, na região da orofaringe, por esfoliação, com
escova citológica cilíndrica, de 10 voluntários adultos, com idades entre 20 e 56
anos, cinco do sexo masculino e cinco do sexo feminino, considerados saudáveis
por não apresentarem quaisquer sinais ou sintomas aparentes de doença. No
segundo caso, coletou-se material vaginal de 10 mulheres adultas, com idades
entre 26 e 56 anos, também consideradas saudáveis, por esfoliação, com escova
citológica cilíndrica. Todos os voluntários, docentes e alunos do Curso de
Farmácia da Universidade Federal do Paraná, assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido, de acordo com a aprovação do Comitê de Ética
em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos do Setor de Saúde da Universidade
Federal do Paraná.
48
4.2.2.2 Procedimentos
Suspendeu-se as células obtidas em 2 ml de meio líquido, contido em tubo
plástico cônico com capacidade de 15 ml, com tampa de rosca hermética. Em
seguida, homogeneizou-se a suspensão obtida em agitador tipo vortex, mantendo-
a em repouso por tempos variáveis, e submetendo-a a tratamentos variáveis,
como segue. Após a fixação do esfregaço, procedeu-se à coloração de
Papanicolaou modificada (Newprov
®
) (QUADRO 1) e montagem em Entellan
(Merck
®
); avaliou-se ao microscópio óptico, sob aumento de 400x, celularidade;
homogeneidade na distribuição das células; grau de sobreposição celular;
alterações celulares e artefatos.
Análise dos meios líquidos preservadores/fixadores: Testou-se:
• álcool etílico 95%;
• meio CE (cloreto de sódio 20 mmoles/l, cloreto de potássio 75 mmoles/l,
citrato de sódio 40 mmoles/l, EDTANa
2
1 mmol/l, albumina
bovina 0,09 mmol/l, glicose 20 mmoles/l, fosfato monohidrógeno de sódio
5 mmoles/l, sulfato de neomicina 2 mmoles/l, succinato de cloromicetina
7 nmoles/l e cortisona 0,027 mmol/l, pH 7,3 ± 0,1 e 318 ± 2 mOsm/KgH
2
0)
(LEONART et al, 1989 a);
• glutaraldeído 14 mmoles/l em tampão fosfato 150 mmoles/l pH 7,4
(LEONART et al,1989 a);
• formaldeído 1, 2 e 5% (p/v) em tampão fosfato 150 mmoles/l pH 7,4;
• albumina bovina 30, 60, 80, 100 e 120 mg/dl;
• albumina de Mayer pura (clara de ovo com glicerol 1:1) (TAKAHASHI,
1981), diluída 1:10 e 1:100 em água destilada.
• adição de álcool etílico 95% na proporção 1:1 com meio CE, glutaraldeído e
com formaldeído.
Após a incubação do material durante 1 a 2 h no meio líquido preservador
e/ou fixador, centrifugou-se a 289 x g durante 5 min (centrífuga CELM
®
LS-3).
Desprezou-se o sobrenadante por inversão do tubo cônico, confeccionando-se o
esfregaço pelo espalhamento de 50 µl de sedimento em forma circular com o
49
auxílio de ponteira de micropipeta descartável, com diâmetro de aproximadamente
30 mm, e secando-o por exposição ao ar.
Análise do método de sedimentação: Testou-se amostras preservadas em etanol
95% durante 1 a 2 h, por sedimentação espontânea durante 1 h; por centrifugação
comum (CELM
®
LS-3) a 289 x g por 5 min; e por citocentrifugação (Cytopro
Wescor
®
) a 128 x g por 5 min. Após a sedimentação espontânea, retirou-se o
sobrenadante com pipeta, deixando-se aproximadamente 50 µl de sedimento e no
caso da centrifugação comum, desprezou-se o sobrenadante por inversão do tubo
cônico. Em ambos, confeccionou-se o esfregaço pelo espalhamento de 50 µl de
sedimento em forma circular, com o auxílio de ponteira de micropipeta descartável,
com diâmetro de aproximadamente 30 mm, secando-o por exposição ao ar. O
diâmetro do preparado por citocentrifugação foi de 8 mm.
Análise da velocidade e do tempo de centrifugação: Testou-se amostras
preservadas em etanol 95% durante 1 a 2 h, por centrifugação a 128, 289 ou
514 x g durante 5 ou 10 min (centrífuga CELM
®
LS-3). Para avaliar a eficácia da
sedimentação celular, depositou-se 50 µl do sobrenadante entre lâmina e lamínula,
à fresco, observando-se ao microscópio óptico sob aumento de 400x, a presença
de células residuais não sedimentadas. Desprezou-se o sobrenadante por
inversão do tubo cônico, confeccionando-se o esfregaço com 50 µl de sedimento
por espalhamento circular com o auxílio de ponteira de micropipeta descartável,
com diâmetro de aproximadamente 30 mm, secando-o por exposição ao ar.
Análise da confecção do esfregaço: Testou-se amostras preservadas em etanol
95% durante 1 a 2 h, por centrifugação a 289 x g durante 5 min. Desprezou-se o
sobrenadante por inversão do tubo cônico, confeccionando-se o esfregaço com
50 µl de sedimento de duas formas: pelo espalhamento circular, com o auxílio de
ponteira de micropipeta descartável, com diâmetro de aproximadamente 30 mm;
ou por extensão do material, com o auxílio de uma lâmina extensora. Em ambos
os casos, os esfregaços foram secos por exposição ao ar.
50
Análise da aderência do material citológico em lâmina: Testaram-se amostras
preservadas em etanol 95% durante 1 a 2 h por centrifugação a 289 x g durante
5 min. Desprezou-se o sobrenadante por inversão do tubo cônico, confeccionando-
se o esfregaço com 50 µl de sedimento, por espalhamento circular, com o auxílio
de ponteira de micropipeta descartável, com diâmetro de aproximadamente
30 mm. Testou-se lâminas recobertas com 50 µl de albumina de Mayer, 50µl de
albumina de Mayer 1:50 em água destilada, ou 20 µl de poli-L-lisina 0,1%. Para as
lâminas recobertas com albumina de Mayer, os esfregaços foram secos por
exposição ao ar e para as recobertas com poli-L-lisina, incubados por 15 min em
câmara úmida.
Análise da fixação do esfregaço: Em amostras preservadas em etanol 95%
durante 1 a 2 h, centrifugou-se a 289 x g durante 5 min, retirou-se o sobrenadante
por inversão do tubo, confeccionou-se o esfregaço (diâmetro de cerca de 30 mm)
com 50 µl de sedimento, por espalhamento circular, com o auxílio de ponteira de
micropipeta descartável; tratou-se o esfregaço como segue: cobertura com solução
alcoólica de polietilenoglicol a 2% e exposição ao ar, ou simplesmente exposição
ao ar. No primeiro caso, empregou-se a fixação em álcool etílico a 95% durante
30 min e, no segundo caso, testou-se a fixação em álcool etílico a 95% durante 15
e 30 min.
4.2.3 Experimentos
A partir da análise dos resultados dos testes preliminares, definiu-se por
empregar, para os experimentos a serem realizados, como meios líquidos, etanol
95% e formaldeído a 1% em tampão fosfato 150 mmoles/l pH 7,4; sedimentação
espontânea e centrifugação comum, bem como confecção de esfregaços por
espalhamento circular e fixação dos esfregaços em etanol 95%. Como controle,
empregou-se o método convencional de Papanicolaou, realizado paralelamente
para todas as amostras analisadas. Para se estudar a citologia em meio líquido
com etanol 95%, coletou-se material cérvico-vaginal de 50 pacientes atendidas no
Ambulatório do Hospital Universitário do Oeste do Paraná (HUOP) para exame
preventivo de câncer de colo de útero; e para a citologia em meio líquido com
51
formaldeído a 1%, de 100 pacientes, atendidas nas Unidades de Saúde Palmeiras,
Parque São Paulo e XIV de Novembro do Município de Cascavel-PR, para a
mesma finalidade.
4.2.3.1 Citologia Convencional (Controle)
Após afastamento da parede vaginal com espéculo e visualização do colo
uterino, coletou-se material da região da JEC e da endocérvice, introduzindo-se a
escova endocervical no canal, e girando 360°. Em seguida, introduziu-se a
extremidade alongada da espátula de Ayre na região da JEC, girando-a 360º para
coletar material de toda a região da ZT e do ectocérvix (PARAISO et al, 1994).
Após a coleta, os materiais de região cérvico-vaginal obtidos foram
espalhados sobre duas lâminas de microscopia, de modo regular e em um único
sentido, procurando colocar em contato toda a superfície dos instrumentos de
coleta com as lâminas, otimizando a transferência do material, de forma a obter um
esfregaço de espessura adequada, representativo do material proveniente das
duas regiões em cada lâmina.
A primeira lâmina foi coberta com solução alcoólica de polietilenoglicol a 2%
e encaminhada para o laboratório para o exame preventivo de rotina da paciente, e
a segunda foi fixada em álcool etílico 95%, durante no mínimo 30 min e no máximo
2 dias, e corada pelo método de Papanicolaou modificado (Newprov
®
) (QUADRO
1). A análise dos esfregaços de citologia convencional foi realizada de acordo com
o item 4.2.4.
52
QUADRO 1 - COLORAÇÃO SEGUNDO PAPANICOLAOU MODIFICADA
Sequência de cubas
Procedimentos
Etanol a 80% 10 mergulhos
Etanol a 70% 10 mergulhos
Etanol a 50% 10 mergulhos
Água Destilada 10 mergulhos
Hematoxilina de Harris 1 min e 15 seg
Água corrente 6 min
Etanol a 50% 10 mergulhos
Etanol a 70 % 10 mergulhos
Etanol a 80% 10 mergulhos
Orange G 1min e 30 seg
Etanol a 95% 10 mergulhos
Etanol a 95% 10 mergulhos
Etanol a 95% 10 mergulhos
EA – 36 1min e 30 seg
Etanol a 95% 10 mergulhos
Etanol a 95% 10 mergulhos
Etanol a 95% 10 mergulhos
Xilol 10 mergulhos
Xilol 10 mergulhos
EA – eosina amarelada.
NOTA: kit para coloração de Papanicolaou NEWPROV
®
.
As lâminas foram montadas utilizando Entellan (Merck
®
), sob lamínulas de
24 x 60 mm.
4.2.3.2 Citologia em Meio Líquido
Após a coleta de citologia convencional (controle), introduziu-se uma escova
cônica (200 mm de comprimento, sendo 21 mm do eixo da ponta ativa e 0,7 mm
de diâmetro) no OCE, girando-a 360º para coleta de células do exocérvice, JEC e
endocérvice. Em seguida, a extremidade anatômica utilizada para a descamação
celular foi colocada em tubo cônico, com capacidade para 15 ml, contendo 2 ml de
meio líquido composto por etanol 95% ou formaldeído a 1% em tampão fosfato
150 mmoles/l pH 7,4.
53
4.2.3.2.1 Com emprego de Etanol 95%
Homogeneizou-se a suspensão de células em agitador tipo vortex por cerca
de 15 seg, retirou-se a escova cônica e centrifugou-se a 289 x g durante 5 min.
Desprezou-se o sobrenadante por inversão do tubo cônico. Confeccionou-se o
esfregaço pelo espalhamento de 50 µl de sedimento em forma circular, com o
auxílio de ponteira de micropipeta descartável, formando um esfregaço com cerca
de 30 mm, secando-o por exposição o ar. Fixou-se a lâmina em álcool etílico a
95% durante 30 min e procedeu-se à coloração de Papanicolaou e montagem da
lâmina, conforme descrito no Quadro 1.
4.2.3.2.2 Com emprego de formaldeído a 1% em tampão fosfato 150 mmoles/l,
pH 7,4.
Homogeneizou-se a suspensão obtida em agitador tipo vortex por cerca de
15 seg, retirou-se a escova cônica e centrifugou-se a 289 x g durante 5 min.
Desprezou-se o sobrenadante por inversão do tubo cônico. Sobre o sedimento,
adicionou-se 2 ml de álcool etílico 95% durante 60 min. Após sedimentação
espontânea, retirou-se o sobrenadante com micropipeta, confeccionando-se o
esfregaço pelo espalhamento de 50 µl de sedimento em forma circular, com o
auxílio de ponteira de micropipeta descartável, formando um esfregaço com cerca
de 30 mm, secando-o por exposição o ar. Fixou-se a lâmina em álcool etílico a
95% durante 30 min e procedeu-se à coloração de Papanicolaou e montagem da
lâmina, conforme descrito no Quadro 1.
54
4.2.4 Análises citológicas
4.2.4.1 Avaliação citomorfológica por escrutíneo
Após coloração e montagem, a leitura das lâminas foi procedida por
varredura horizontal sistemática e com auxílio de microscópio óptico com a
objetiva de 10x (aumento 100x) (KOSS e MELAMED, 2006). Os campos
sucessivos foram vistos e, a cada avanço, a porção final do último campo
microscópico foi parcialmente revista, para que nenhuma área do esfregaço
ficasse descoberta. Para as células ou microorganismos que necessitaram de
observação mais minuciosa, foi utilizada objetiva de 40x (aumento 400x), ou
mesmo de 100x (aumento 1000x). As citologias líquida e convencional de cada
paciente foram avaliadas separadamente, em dias alternados, com o intuito de não
haver indução do diagnóstico. A indicação dos tipos celulares, alterações
celulares, presença de organismos e classificação segundo Bethesda 2001 foi
realizada na forma de laudo descritivo (Anexo 3). As avaliações foram
fundamentadas em consenso morfológico entre dois observadores do grupo de
pesquisadores do laboratório.
4.2.4.2 Celularidade
Observou-se critérios mínimos de celularidade escamosa para citologia
convencional e em meio líquido (BETHESDA, 2001).
Uma estimativa da celularidade total em um esfregaço citológico em meio
líquido pode ser obtida com a realização da contagem de campos celulares
representativos. Foi avaliada a média de células em 10 campos em objetiva de 40x
(aumento 400x, diâmetro da ocular de 20 mm). O desenvolvimento dos cálculos
seguiu as fórmulas propostas por BETHESDA (2001):
55
a- Número médio mínimo de células por campo examinado, necessário para ter
5000 células no esfregaço:
Nº células requeridas por campo= 5000/ (área do círculo/ área do campo)
b- Cálculo do diâmetro do campo microscópico em milímetros (mm)
Diâmetro do campo microscópico (mm)= FN / valor da objetiva
FN= medida do diâmetro da ocular do microscópio utilizado (mm)
c- Cálculo da área de um círculo:
A= π x r² onde π=3,1416 e r= raio
d- Cálculo dos valores para o microscópico utilizado em nosso estudo (Nikon
Eclipse
®
E 200):
Cálculo do diâmetro do campo microscópico (mm)
Diâmetro do campo (D)= FN (20)/Objetiva de 40X
D= 20/40
D= 0,5mm
Cálculo da área do campo microscópico r= D/2
onde D=0,5mm r=0,5/2 r=0,25
A= 3,1416 x (0,25)² onde A= 0,1963 mm
Cálculo da área do círculo do esfregaço
Diâmetro do círculo= 30mm onde r= D/2, r=15 mm
Área do círculo= π x r² onde 3,1416x 15², A=706,86
Nº de células por campo= 5000/ (706,86/ 0,1963)
Nº de células por campo = 5000/3600,9
Nº de células por campo = 1,4 células por campo microscópico
56
Cálculo do número de células em todo o esfregaço (em 30 mm)
Nº de células = (Área do círculo x Nº médio células por campo)/ Área do campo
Nº de células = 706,86 x 1,4/ 0,1963
Nº de células = 5041
4.2.4.3 Homogeneidade na distribuição das células
Considerando-se esfregaços com celularidade satisfatória, convencionou-se
que a homogeneidade seria satisfatória se a maioria dos campos não
apresentasse mais de 30 células em aumento de 100x. Esta avaliação deve ser
evitada em esfregaços com celularidade muito alta, quando se encontra campos
com excessiva sobreposição.
4.2.4.4 Grau de sobreposição celular
Avaliou-se a sobreposição celular de forma semi-quantitativa, conferindo-se
cruzes para graus de sobreposição, relacionando-se (0) a nenhuma sobreposição,
(+) a pouca sobreposição; (++) a média sobreposição e (+++) a muita
sobreposição, de acordo com a Figura 1
57
FIGURA 1. FOTOMICROGRAFIAS DE MATERIAL CÉRVICO-VAGINAL
EM CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO COM FORMALDEÍDO 1%
1 - Nenhuma sobreposição; 2 - pouca sobreposição; 3 - média sobreposição; 4 - muita
sobreposição. Meio Líquido Formaldeído 1%; coloração Papanicolaou (100 x).
4.2.4.5 Presença de células epiteliais escamosas e glandulares
Avaliou-se a presença de células escamosas superficiais, intermediárias e
parabasais, de células metaplásicas e de células endocervicais, bem como de
leucócitos polimorfonucleares, histiócitos, linfócitos e hemácias, em cruzes. Assim,
indicou-se, de forma semi-quantitativa, em relação a quantidades de células escassa
(+), moderada (++), acentuada (+++) e abundante (++++).
Considerou-se aspectos morfológicos, como: tamanho e forma da célula e do
núcleo, intensidade e tonalidade da coloração do citoplasma e do núcleo,
distribuição e granulosidade da cromatina, relação núcleo/citoplasma, de acordo
com diversos autores (KURMAN e SOLOMON, 1994; CIBAS e DUCATMAN, 1996;
BIBBO, 1997; ATKINSON e SILVERMAN, 2000; BETHESDA, 2001; KOSS e
MELAMED, 2006).
58
4.2.4.6 Presença de alterações celulares e artefatos
Avaliou-se a presença de alterações reativas e degenerativas, como:
pseudoesinofilia, metacromasia, vacuolização citoplasmática, halo perinuclear,
grânulos querato-hialinos, apagamento de bordos citoplasmáticos, hiperqueratose,
paraqueratose, homogeneização da cromatina, espessamento de bordos
nucleares, cariorréxis, edema nuclear, binucleação, multinucleação, cariopicnose,
cariólise e citólise.
Observou-se também a ocorrência de alterações de lesões intraepiteliais ou
neoplásicas, como: hipercromasia, cariomegalia, aumento da relação núcleo/
citoplasmática, distribuição irregular da cromatina, contorno irregular do núcleo,
coilocitose e pleomorfismo celular.
Observou-se ainda a presença de artefatos, sendo que alguns deles foram
considerados como produtos da interferência da metodologia aplicada. Entre os
artefatos encontrados, relacionou-se: pleomorfismo celular, destruição celular,
alterações tintoriais, fundo sujo, entre outros.
4.2.4.7 Avaliação da microbiota e efeitos citopáticos de microorganismos
Observou-se a presença de microorganismos normais e patológicos na
microbiota cérvico-vaginal, seguindo critérios de Longatto Filho e Silva Filho,
(2000). Entre eles, registrou-se: bacilos de Döderlein, flora mista, flora cocoíde,
flora bacilar, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Actinomyces spp,
Candida spp, Mobilincus spp e Leptotrix spp.
Trichomonas vaginalis: protozoário flagelado com cerca de 15 a 20 µm,
forma ovalada, coloração cinza ou rosada, com núcleo excêntrico, ovalado e
hipercrômico, com grânulos eosinofílicos citoplasmáticos.
Actinomyces spp: bactérias de aspecto filamentoso, que aparecem como
grupos amorfos mais escuros centralmente e com projeções periféricas, lembrando
“ouriço do mar”.
Gardenerella vaginalis: reconhecidos pela identificação de clue-cells (células
pistas), células cariopicnóticas com citoplasma recoberto por diminutos
cocobacilos.
59
Mobiluncus spp: reconhecidos pela identificação de comma-cells, células
cariopicnóticas com citoplasma recoberto por bacilos.
Candida spp: reconhecimento de hifas e/ou esporos. As hifas ou micélios
têm comprimento variável, geralmente segmentado e de coloração rosada. As
células leveduriformes também aparecem rosadas e medem cerca de 3 a 6 µm.
Leptotrix spp: aparecem como estruturas curvilíneas, mais longas que os
bacilos de Doderlein e de coloração acizentada.
4.2.4.8 Morfometria
A análise morfométrica das células escamosas intermediárias foi feita pela
observação em microscópio Nikon ECLIPSE
®
E 200, capturando-se imagens com
câmera digital SANSUNG
®
FCC131. Considerou-se aspectos morfológicos como,
tamanho e forma da célula e do núcleo, áreas citoplasmática e nuclear e relação
núcleo/citoplasma.
As imagens captadas foram tratadas com o programa Adobe Photoshop 7.0,
e para padronização do contraste foi aplicado um filtro (mediana) em todas as
imagens para obtenção de melhor resolução. A morfometria celular foi monitorada
pelo programa, UTHSCSA
®
Image Tool.
4.2.5.9 Análise Estatística
Os dados obtidos na citologia em meio líquido convencional e nos ensaios
de citologia em meio formaldeído 1% e etanol 95% foram comparados utilizando-
se os seguintes testes estatísticos:
Foi utilizado o teste Z para duas proporções, com categorias mutuamente
excludentes, a fim de analisar os índices de concordância e discordância dos
métodos estudados, em relação aos números de observações das diferenciações
celulares. As variáveis estudadas foram: células escamosas intermediárias, células
escamosas superficiais, células escamosas parabasais, células endocervicais,
células metaplásicas, polimorfonucleares, histiócitos, linfócitos e hemácias.
60
Considerando o método de coleta convencional como controle em relação ao
do meio liquido, foram calculadas a sensibilidade e a especificidade relativas à
presença de células, de microorganismos e de alterações celulares, classificando-se
as observações como positivas ou negativas. Sensibilidade representa a habilidade
do método teste em detectar todas as observações positivas realizadas pelo método
de referência, e especificidade, em detectar as ausências. A prevalência de cada
variável estudada foi calculada pelas observações positivas do método controle. As
variáveis estudadas foram: 1) presença de células escamosas superficiais,
intermediárias e parabasais, de células metaplásicas e de células endocervicais,
bem como de leucócitos polimorfonucleares, histiócitos, linfócitos e hemácias; 2)
presença de microorganismos: bacilos de Döderlein, flora mista, flora cocoíde, flora
bacilar, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Actinomyces spp, Candida
spp, Mobilincus spp, e Leptotrix spp; 3) presença de alterações celulares:
pseudoesosinofilia, metacromasia, vacuolização, halo perinuclear, grânulos querato-
hialinos, apagamento de bordos citoplasmáticos, hiperqueratose, paraqueratose,
homogenização de cromatina, espessamento de bordos nucleares, cariorréxis,
edema nuclear, binucleação, cariopicnose, cariolise, citólise e hipercromasia.
Os dados da análise morfométrica das células foram comparados utilizando-
se a análise de variância (ANOVA, um critério) seguida do teste Tukey para
comparações de médias.
A significância estatística foi considerada para p < 0,05, e todos os cálculos
estatísticos foram efetuados utilizando-se a planilha eletrônica Excel (Microsoft
®
),
com programação apropriada e o pacote estatístico Statistica 6.0 (Statsoft
®
).
61
5. RESULTADOS
62
5. RESULTADOS
5.1 Resultados dos Testes Preliminares
Na análise dos meios líquidos preservadores/fixadores foram observadas as
qualidades morfotintoriais das células escamosas em etanol 95%; meio CE;
glutaraldeído 14 mmoles/l em tampão fosfato 150 mmoles/l pH 7,4; albumina bovina
30 a 120 mg/dl; albumina de Mayer; formaldeído em tampão fosfato 150 mmoles/l,
pH 7,4.
Foram consideradas satisfatórias as células escamosas preservadas/fixadas
em etanol 95%, e em formaldeído a 1% em tampão fosfato 150 mmoles/l, pH 7,4
(Quadro 2).
63
QUADRO 2 - AVALIAÇÃO DE PREPARAÇÕES DE CÉLULAS ESCAMOSAS DA
MUCOSA BUCAL E DA MUCOSA VAGINAL, PRESERVADAS E/OU
FIXADAS EM DIVERSOS MEIOS LÍQUIDOS
Celularidade
Homogeneidade
na distribuição
das células
Sobre-
posição
celular
Alterações
celulares Artefatos
E95 Satisfatória Satisfatória Satisfatória Ausentes Ausentes
CE Insatisfatória Satisfatória Satisfatória
Hipercromasia,
hiperqueratose,
edema nuclear
Pleomorfismo
CE + E95
1:1
Satisfatória Satisfatória Satisfatória
Hipercromasia,
hiperqueratose,
edema nuclear
Pleomorfismo
precipitados
sobre as
células
GLUTTF
1:1
Insatisfatória Satisfatória Satisfatória
Irregularidade de
membrana ,
pleomorfismo
moderado
Precipitados
sobre as
células
GLUT+E95
1:1
Satisfatória Satisfatória Satisfatória
Irregularidade de
membrana
células dobradas
halo perinuclear
Precipitados
sobre as
células
AB + E95
1:1
Satisfatória Satisfatória Satisfatória
Orangiofilia
moderada
Ausentes
AM conc+
E95 1:1
Insatisfatória Insatisfatória Insatisfatória
Pleomorfismo
acentuado
Material
proteináceo
abundante
AM 1:10 +
E95 1:1
Insatisfatória Insatisfatória Insatisfatória
Pleomorfismo
moderado
Material
proteináceo
moderado
AM 1:100 +
E95 1:1
Insatisfatória Insatisfatória Insatisfatória
Pleomorfimo
discreto
Material
proteináceo
discreto
FTF 1% Satisfatória Satisfatória Satisfatória Ausentes Ausentes
FTF 2% Satisfatória Satisfatória Insatisfatória
Pleomorfismo
discreto
Precipitado
sobre as
células
FTF 5% Satisfatória Insatisfatória Insatisfatória
Oriangiofilia,
irregularidade
membrana
Precipitado
sobre as
células
E95 - etanol 95%; CE - meio CE; GLUTTF - glutaraldeído 14 mmoles/l em tampão fosfato 150
mmoles/l pH 7,4; AB - albumina bovina 30 a 120 mg/dl; AM - albumina de Mayer; FTF -formaldeído em
tampão fosfato 150 mmoles/l pH 7,4.
N = 10 voluntários em duplicata (5 amostras mucosa bucal e 5 amostras mucosa vaginal)
Celularidade satisfatória ≥ 5000 células no esfregaço.
64
Na análise dos métodos de sedimentação os esfregaços obtidos por
centrifugação comum apresentaram melhores resultados em relação aos obtidos por
sedimentação espontânea e por citocentrífugação (Quadro 3).
QUADRO 3 – AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE SEDIMENTAÇÃO PARA
PREPARAÇÕES DE CÉLULAS ESCAMOSAS DA MUCOSA
BUCAL E VAGINAL, PRESERVADAS EM ETANOL 95%
Método de
sedimentação Celularidade
Homogeneidade
na distribuição
das células
Sobreposição
celular Artefatos
Centrifugação comum Satisfatória Satisfatória
Satisfatória
Ausentes
Citocentrifugação Satisfatória Insatisfatória
Insatisfatória
Ausentes
Sedimentação
espontânea
Satisfatória Satisfatória
Satisfatória
Ausentes
N = 10 voluntários em duplicata (5 amostras mucosa bucal e 5 amostras mucosa vaginal)
Celularidade satisfatória ≥ 5000 células no esfregaço.
As células foram centrifugadas a 289 x g por 5 min ou citocentrifugadas a 128 x g por 5 min,
e sedimentadas durante 1 h.
Na análise da velocidade e do tempo de centrifugação os esfregaços obtidos
por centrifugação a 289 x g por 5 min apresentaram melhores resultados em relação
às forças centrífugas relativas de 128 x g e 514 x g durante 10 min (Quadro 4). Não
foi observada a presença de células ao se analisar os sobrenadantes ao microscópio
óptico, demonstrando-se a eficiência da sedimentação.
65
QUADRO 4 - EFEITOS DA VELOCIDADE E TEMPO DE CENTRIFUGAÇÃO
COMUM NAS PREPARAÇÕES DE CÉLULAS ESCAMOSAS DA
MUCOSA BUCAL E VAGINAL, PRESERVADAS EM ETANOL 95%
Celularidade
Homogeneidade
na distribuição
das células
Sobreposição
celular
Alterações
celulares Artefatos
128 x g
5 min
Insatisfatória
Satisfatória Satisfatória Ausentes Ausentes
128 x g
10 min
Insatisfatória
Insatisfatória Insatisfatória Ausentes Ausentes
289 x g
5 min
Satisfatória Satisfatória Satisfatória Ausentes Ausentes
289 x g
10 min
Satisfatória Satisfatória Insatisfatória
Irregularidade da
membrana
Ausentes
514 x g
5 min
Satisfatória Satisfatória Insatisfatória
Irregularidade da
membrana
Ausentes
514 x g
10 min
Satisfatória Satisfatória Insatisfatória
Irregularidade da
membrana,
halo perinuclear
Ausentes
N = 10 voluntários em duplicata (5 amostras mucosa bucal e 5 amostras mucosa vaginal)
Celularidade satisfatória ≥ 5000 células no esfregaço;
Na análise da confecção dos esfregaços citológicos, os preparados por
espalhamento circular do sedimento com ponteira de micropipeta apresentaram
melhores resultados em relação aos estendidos com o auxílio de lâmina extensora
(Quadro 5).
66
QUADRO 5 - AVALIAÇÃO DE CONFECÇÃO DE ESFREGAÇOS CITOLÓGICOS
CIRCULARES COM O AUXÍLIO DE PONTEIRA DE MICROPIPETA,
E POR EXTENSÃO, COM O AUXÍLIO DE LÂMINA EXTENSORA.
Celularidade
Homogeneidade
na distribuição
das células
Sobreposição
celular
Alterações
celulares Artefatos
Esfregaço
circular
Satisfatória Satisfatória Satisfatória
Ausentes Ausentes
Esfregaço
estendido
Insatisfatória
Insatisfatória
Satisfatória
Irregularidade da
membrana celular,
pleomorfismo
Ausentes
N= 10 voluntários em duplicata (5 amostras mucosa bucal e 5 amostras mucosa vaginal)
Celularidade satisfatória ≥ 5000 células no esfregaço
Na análise da aderência do material citológico em lâmina, as lâminas
recobertas com 50 µl de albumina de Mayer, 50 µl de albumina de Mayer 1:50 em
água destilada, ou 20 µl de poli-L-lisina 0,1%, não apresentaram resultados
satisfatórios em relação à qualidade morfo-tintorial das células escamosas
analisadas (Quadro 6).
QUADRO 6 - AVALIAÇÃO DA ADERÊNCIA DE PREPARAÇÕES DE CÉLULAS
ESCAMOSAS DA MUCOSA BUCAL E VAGINAL, PRESERVADAS
EM ETANOL 95%
Celularidade
Homogeneidade
na distribuição
das células
Sobreposição
celular
Alterações
celulares Artefatos
Abumina de
Mayer
Insatisfatória Insatisfatória Insatisfatória
Irregularidade
da membrana
celular, halo
perinuclear,
pleomorfismo
Material
proteináceo
abundante
Albumina de
Mayer 1:50
Satisfatória Satisfatória Insatisfatória
Pseudoeosino-
filia
Material
proteináceo
Poli-L-lisina
0,1%
Satisfatória Satisfatória Satisfatória
Pseudoeosino-
filia
Resíduo
orangiofílico
N= 10 voluntários em duplicata (5 amostras mucosa bucal e 5 amostras mucosa vaginal)
Celularidade satisfatória ≥ 5000 células no esfregaço;
As lâminas foram recobertas com albumina de Mayer, albumina de Mayer 1:50 ou poli-l-lisina 0,1%.
67
Na análise da fixação do esfregaço, os esfregaços fixados em etanol 95%
durante 30 min apresentaram melhores resultados em relação aos fixados em etanol
95% durante 15 min e aos esfregaços recobertos com solução alcoólica de
polietilenoglicol a 2%, secos ao ar e posteriormente submetidos ao etanol 95% por
30 min (Quadro 7).
.
QUADRO 7 - AVALIAÇÃO DE FIXAÇÃO DE CÉLULAS ESCAMOSAS DA
MUCOSA BUCAL E VAGINAL
Celularidade
Homogeneidade
na distribuição
das células
Sobreposição
celular
Alterações
celulares Artefatos
Polietilenoglicol
2%+ etanol
95% 30 min
Satisfatória Satisfatória Satisfatória
Pseudo-
eosinofilia
Resíduo
orangiofílico
etanol 95% 15
min
Insatisfatória Satisfatória Satisfatória Ausentes Ausentes
etanol 95% 30
min
Satisfatória Satisfatória Satisfatória Ausentes Ausentes
Os resultados são baseados em 10 experimentos realizados em duplicata.
Celularidade satisfatória ≥ 5000 células no esfregaço
Esfregaços recobertos com solução alcoólica de polietilenoglicol a 2% e fixados em etanol 95%
30 min, e fixados em etanol 95% por 15 ou 30 min.
5.2 Resultados dos Experimentos
Na Figura 2, está representada a celularidade obtida em esfregaços de
citologia cérvico-vaginal em meio líquido, preparados a partir de amostras
coletadas em etanol a 95% e em formaldeído a 1% em tampão fosfato
150 mmoles/l pH 7,4. Em 50% dos esfregaços, o número de células epiteliais
encontradas foi da ordem de 10.000 e, no restante, foi acima de 10.000 células,
em ambos os meios líquidos, etanol 95% e formaldeído 1%.
68
FIGURA 2 – DISTRIBUIÇÃO DE FREQUÊNCIA DE CELULARIDADE
EM ESFREGAÇOS DE CITOLOGIA EM MEIOS
LÍQUIDOS ETANOL 95% E FORMALDEÍDO A 1%
A celularidade das amostras de citologia em meio líquido foi obtida pela contagem das
células em 10 campos em objetiva de 40x (aumento 400x, diâmetro da ocular de 20 mm)
e cálculo do número médio de células por campos. O desenvolvimento dos cálculos
seguiu as fórmulas propostas por BETHESDA (2001).
Etanol 95% - 50 amostras cérvico-vaginais; Formaldeído 1% - 100 amostras cérvico-
vaginais.
69
TABELA 1 – COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA IDENTIFI-CAÇÃO
CELULAR ENTRE CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL
E EM MEIO LÍQUIDO ETANOL 95%
ces
cei
cep
cend
meta
pmn
his
t
hem
linfo
Contagens identicas (1) 48 49 6 27 22 48 21 31 8
Contagens diferentes(2) 0 0 0 9 3 1 8 3 0
Tamanho da Amostra 48 49 6 38 26 49 29 39 8
Proporção do Grupo 1 1,000 1,000 1,000 0,711 0,846 0,980 0,724 0,795 1,000
Proporção do Grupo 2 0,000 0,000 0,000 0,237 0,115 0,020 0,276 0,077 0,000
Diferença entre as 2
Proporções 1 1 1 0,474 0,731 0,960 0,449 0,718 1
Diferença Hipotética 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
α 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
Z - - - 3,434 5,699 23,744 2,701 7,511 -
Teste Bicaudal
Valor Crítico Inferior -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960
Valor Crítico Superior 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960
P - - - 0,001 0,000 0,000 0,007 0,000 -
Decisão C C C C C C C C C
Ces – célula escamosa superficial; cei - célula escamosa intermediária, cep – célula escamosa
parabasal, cend - célula endocervical, meta - célula escamosa metaplásica, pmn –
poliformonucleares, hist – histiócitos, hem – hemáceas, linfo – linfócitos.
N = 50 amostras cérvico-vaginais
α nível de significância 5%; Z – teste de proporções para categorias mutuamente exclusivas;
C – Proporção estatisticamente idênticas de observações entre os dois métodos (p < 0,05); p –
probabilidade da distribuição Z.
Na contagem em cruzes, foi considerado idêntico quando havia a diferença de 1 grau (por exemplo:
+ = ++; + ≠ +++)
A presença de células escamosas superficiais, intermediárias e parabasais,
células endocervicais, células metaplásicas, polimorfonucleares, histiócitos,
linfócitos e hemácias, foi monitorada em citologia convencional e em meio líquido
etanol 95%, de forma semi-quantitativa codificada em cruzes. A Tabela 1 ilustra a
análise comparativa entre os dois métodos pelo teste de proporções (teste Z). A
análise estatística indica que as proporções de contagens idênticas são
estatisticamente maiores do que as contagens diferentes (p < 0,05). Portanto, o
índice de concordância foi superior ao de discordância.
A observação da identificação celular na citologia convencional e em meio
líquido formaldeído 1% está ilustrada na Tabela 2. No que diz respeito a células
endocervicais e histiócitos, a proporção de contagens diferentes entre os dois
70
métodos foi relativamente alta. Estes resultados indicam que, nas amostras em
formaldeído, a identificação celular não foi a mesma que na citologia convencional,
para estes dois tipos celulares. Por outro lado, resultados idênticos foram
observados para os demais tipos celulares.
A figura 3 mostra fotomicrografias de células escamosas de material
cérvico-vaginal de uma paciente, em esfregaços preparados após preservação nos
meios líquidos etanol 95% e formaldeído 1%, durante 24, 48 e 72 h.
FIGURA 3 – FOTOMICROGRAFIAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS
INTERMEDIÁRIAS EM PREPARAÇÕES EM MEIOS
LÍQUIDOS APÓS PRESERVAÇÃO
Tempos de preservação: citologia em meio líquido com formaldeído 1% - 24h (1),
48h (3) e 72h (5); citologia em meio líquido com etanol 95% - 24h (2), 48h (4) e 72h
(6); Coloração Papanicolaou (400 x).
71
A Figura 4 apresenta fotomicrografias das células epiteliais de material
cérvico-vaginal, em preparações obtidas de acordo com as metodologias
analisadas.
FIGURA 4 – FOTOMICROGRAFIAS DE CÉLULAS EPITELIAIS
CERVICAIS EM PREPARAÇÕES CONVENCIONAIS
E EM MEIO LÍQUIDO
Citologia convencional (A); citologia em meio líquido com etanol 95% (B); citologia em
meio líquido com formaldeído 1% (C); células endocervicais (1), células escamosas
intermediárias (2), células escamosas superficiais (3), células escamosas parabasais
(4), células metaplásicas (5). N: citologia convencional (150 amostras cérvico-
vaginais); citologia em meio líquido com etanol 95% (50 amostras cérvico-vaginais),
citologia em meio líquido com formaldeído 1% (100 amostras cérvico-vaginais).
Coloração de Papanicolaou (400 x).
72
TABELA 2 – COMPARAÇÃO NA IDENTIFICAÇÃO CELULAR ENTRE
CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E EM
MEIO LÍQUIDO FORMALDEÍDO 1%
ces
cei
cep
cend
meta
poli
his
t
hem
linfo
Contagens idênticas (1) 86 97 12 35 45 87 32 45 19
Contagens diferentes(2) 3 3 1 47 7 11 18 12 1
Tamanho da Amostra 89 100 14 82 59 98 50 75 20
Proporção do Grupo 1 0,966 0,970 0,857 0,427 0,865 0,888 0,640 0,789 0,950
Proporção do Grupo 2 0,034 0,030 0,143 0,573 0,135 0,112 0,360 0,211 0,050
Diferença entre as 2
Proporções 0,933 0,940 0,714 -0,146 0,731 0,776 0,280 0,579 0,900
Diferença Hipotética 0 0 0 0 0 0 0 0 0
α
0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
Z 4,475 4,772 1,443 -1,014 2,832 4,074 1,237 2,460 2,065
Teste Bicaudal
Valor Crítico Inferior -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960 -1,960
Valor Crítico Superior 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960 1,960
P 0,000 0,000 0,025 0,310 0,005 0,000 0,216 0,014 0,039
Decisão C C C D C C D C C
Ces – célula escamosa superficial; cei - célula escamosa intermediária, cep – célula escamosa
parabasal, cend - célula endocervical, meta - célula escamosa metaplásica, pmn –
poliformonucleares, hist – histiócitos, hem – hemáceas, linfo – linfócitos.
N: 100 amostras cérvico-vaginaisl
Teste Z para duas proporções em categorias mutuamente exclusiva; D – Proporção
estatisticamente diferente de observações entre os dois métodos (p < 0,05); C – proporções
idênticas (p>0,05). p – probabilidade da distribuição Z.
Na contagem em cruzes, foi considerado idêntico quando havia a diferença de 1 grau (por
exemplo: + = ++; + ≠ +++).
A presença de microorganismos no método de citologia em meio líquido em
etanol 95%, em comparação à citologia convencional, usada como controle, foi
analisada pelos cálculos de sensibilidade e especificidade (Tabela 3). Todos os
microorganismos observados na citologia convencional também foram observados
na citologia em meio líquido em etanol 95%. Nesta coleta, foi observada maior
freqüência para bacilos de Doderlein, flora cocoíde, flora mista e Gardenerella
vaginalis. Não foi observado nenhum resultado falso positivo ou falso negativo.
73
TABELA 3 – COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA ENTRE CITOLOGIA
CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E EM MEIO
LÍQUIDO ETANOL 95%
Diagnóstico
Verdadeiro positivo
Verdadeiro negativo
Falso positivo
Falso negativo
Total
Sensibilidade (%)
Especificidade (%)
Freqüência (%)
Bacilos Doderlein
21 26 0 0 47 100 100 44,7
Flora Cocoíde 13 34 0 0 47 100 100 27,7
Flora Mista 12 35 0 0 47 100 100 25,5
Gardenerella vaginalis
12 35 0 0 47 100 100 25,5
Flora bacilar 3 44 0 0 47 100 100 6,4
Candida spp
1 46 0 0 47 100 100 2,1
Mobiluncus spp
1 46 0 0 47 100 100 2,1
Leptotrix spp
0 47 0 0 47 - 100 0,0
Trichomonas vaginalis
0 47 0 0 47 - 100 0,0
Actinomyces spp
0 47 0 0 47 - 100 0,0
Controle: citologia convencional
N- 50 amostras cérvico-vaginais
A freqüência representa os verdadeiros positivos do método controle
Na Figura 5 observa-se fotomicrografias de microorganismos de material
cérvico-vaginal, em preparações com os meios líquidos em estudo em
comparação à citologia convencional. A presença de microorganismos em
amostras preparadas pelo método de citologia em meio líquido em formaldeído
1%, em comparação à citologia convencional, usada como controle, está ilustrada
na Tabela 4. Igualmente, todos os microorganismos observados na citologia
convencional também foram observados na citologia em meio líquido formaldeído.
Nesta coleta foi observada maior freqüência para Bacilos de Doderlein, flora mista,
flora cocoíde e Gardenerella vaginalis. Resultados falso negativos para amostras
em formaldeído foram observados para Candida spp e Actimomyces spp.
74
FIGURA 5 – FOTOMICROGRAFIAS DE MICRORGANISMOS EM
PREPARAÇÕES DE CITOLOGIA CERVICAL
CONVENCIONAl E EM MEIO LÍQUIDO
Citologia convencional (A); citologia em meio líquido com etanol 95% (B); citologia
em meio líquido com formaldeído 1% (C); (1) Trichomonas vaginallis, (2)
Gardenerella vaginalis, (3) Candida spp; (4) Bacilos Doderlein (citólise); (5)
Actinomyces spp. Coloração de Papanicolaou (400x e 100x para Actinomyces spp)
75
TABELA 4 – COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA ENTRE CITOLOGIA
CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E EM MEIO
LÍQUIDO FORMALDEÍDO 1%
Diagnóstico
Verdadeiro positivo
Verdadeiro
negativo
Falso positivo
Falso negativo
Total
Sensibilidade (%)
Especificidade (%)
Freqüência (%)
Bacilos Doderlein
55 55 0 0 110 100 100 50
Flora Mista 18 92 0 0 110 100 100 16,4
Gardenerella vaginalis
16 94 0 0 110 100 100 14,5
Flora Cocoíde 9 101 0 0 110 100 100 8,2
Flora Bacilar 5 105 0 0 110 100 100 4,5
Actinomyces spp 1 108 0 1 110 50 100 1,8
Candida spp 1 108 0 1 110 50 100 1,8
leptotrix spp
1 109 0 0 110 100 100 0,9
Mobiluncus spp
1 109 0 0 110 100 100 0,9
Trichomonas vaginalis
1 109 0 0 110 100 100 0,9
Controle: citologia convencional;
N- 100 amostras cérvico-vaginais
A freqüência representa os verdadeiros positivos do método controle
A análise de alterações celulares observadas em amostras em meio líquido
etanol 95%, em comparação à citologia convencional usada como controle, foi feita
por cálculos de sensibilidade e especificidade (Tabela 5). Maiores freqüências
foram observadas para as alterações: pseudoeosinofilia, metacromasia,
hiperqueratose, edema nuclear, halo perinuclear, grânulos querato-hialinos e
vacuolização. Os valores de sensibilidade variaram de 100 a 0%, indicando certo
grau de dificuldade de avaliação de alterações celulares no método de meio líquido
com etanol 95%, quando comparado ao convencional.
A análise de alterações celulares observadas em amostras em meio líquido
com formaldeído 1%, em comparação à citologia convencional como controle, está
ilustrada na Tabela 6. Maiores prevalências foram observadas para:
pseudoesosinofilia, metacromasia, halo perinuclear, grânulos querato-hialinos,
vacuolização, hiperqueratose e edema nuclear. Da mesma forma, os valores de
sensibilidade variaram de 100 a 0%, indicando certo grau de dificuldade de
76
avaliação de alterações celulares pelo método em meio líquido com formaldeído
1%, quando comparado ao convencional.
Observou-se sensibilidade superior a 70%, em citologia em meio líquido
com etanol 95%, para pseudeosinofilia, metacromasia, hiperqueratose, edema
nuclear, halo perinuclear, grânulos querato-hialinos, citólise, cariopicnose,
paraqueratose, cariólise, coilocitose e binucleação, e; para citologia em meio
líquido com formaldeído 1%, para pseudoeosinofilia, metacromasia, halo
perinuclear, grânulos querato-hialinos, hiperqueratose, edema nuclear,
cariopicnose, citólise e coilocitose.
Na Figura 6 são apresentadas fotomicrografias de alterações celulares de
material cérvico-vaginal, em preparações obtidas pelas metodologias estudadas
em comparação à citologia convencional.
77
FIGURA 6 – FOTOMICROGRAFIAS DE ALTERAÇÕES CELULARES DE
MATERIAL CÉRVICO-VAGINAL EM PREPARAÇÕES
CONVENCIONAIS E EM MEIO LÍQUIDO
Citologia convencional (A); citologia em meio líquido com etanol 95% (B); citologia em
meio líquido com formaldeído 1% (C);(1) vacuolização citoplasmática; (2) edema
nuclear; (3) grânulos querato-hialinos, (4) metacromasia, (5) orangeofilia, (6)
pseudoeosinofilia, (7) cariorrexis, (8) halo perinuclear. Coloração de Papanicolaou (400x)
78
TABELA 5 – COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES CELULARES ENTRE
CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E
EM MEIO LÍQUIDO ETANOL 95%
Diagnóstico
Verdadeiro positivo
Verdadeiro negativo
Falso positivo
Falso negativo
Total
Sensibilidade (%)
Especificidade (%)
Freqüência (%)
Pseudoeosinofilia 49 0 0 0 49 100 - 100
Metacromasia 36 9 1 3 49 92,3 90,0 79,6
Hiperqueratose 29 17 1 2 49 93,5 94,4 63,3
Edema nuclear 18 25 2 4 49 81,8 92,6 44,9
Halo perinuclear 16 26 3 4 49 80,0 89,7 40,8
Grânulos querato-hialinos 15 30 0 4 49 78,9 100 38,8
Vacuolização 3 31 0 15 49 16,7 100 36,7
Citólise 12 37 0 0 49 100 100 24,5
Cariopicnose 7 38 1 3 49 70,0 97,4 20,4
Apagamento de bordos
citoplasmáticos 2 44 0 3 49 40,0 100 10,2
Cariorréxis 1 44 0 4 49 20,0 100 10,2
Paraqueratose 3 46 0 0 49 100 100 6,1
Cariólise 3 45 1 0 49 100 97,8 6,1
Hipercromasia 1 45 1 2 49 33,3 97,8 6,1
Multinucleação 1 47 0 1 49 50,0 100 4,1
Coilocitose 1 48 0 0 49 100 100 2,0
Espessamento de bordos
nucleares 0 48 0 1 49 0 100 2,0
Binucleação 1 48 0 0 49 100 100 2,0
Homogenização de cromatina 0 49 0 0 49 - 100 0,0
Controle: citologia convencional.
N= 50 amostras cervicais
A freqüência representa os verdadeiros positivos do método controle.
79
TABELA 6 – COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA
AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES CELULARES ENTRE
CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL CONVENCIONAL E
EM MEIO LÍQUIDO FORMALDEÍDO 1%
Diagnóstico
Verdadeiro positivo
Verdadeiro negativo
Falso positivo
Falso negativo
Total
Sensibilidade (%)
Especificidade (%)
Freqüência (%)
Pseudoeosinofilia 147 10 0 0 157 100,0 100,0 93,6
Metacromasia 124 25 2 6 157 95,4 92,6 82,8
Halo perinuclear 77 63 10 7 157 91,7 86,3 53,5
Grânulos querato-hialino 64 80 0 13 157 83,1 100,0 49,0
Vacuolização 30 82 1 44 157 40,5 98,8 47,1
Hiperqueratose 56 83 5 13 157 81,2 94,3 43,9
Edema nuclear 45 96 4 12 157 78,9 96,0 36,3
Cariopicnose 41 110 2 4 157 91,1 98,2 28,7
Citlólise 33 123 0 1 157 97,1 100,0 21,7
Cariorréxis 10 135 1 11 157 47,6 99,3 13,4
Apagamento de bordos
citoplasmáticos 7 137 1 12 157 36,8 99,3 12,1
Hipercromasia 7 135 4 11 157 38,9 97,1 11,5
Cariólise 9 140 2 6 157 60,0 98,6 9,6
Paraqueratose 6 145 1 5 157 54,5 99,3 7,0
Espessamento de bordos
nucleares 1 148 0 8 157 11,1 100,0 5,7
Binucleação 5 148 0 4 157 55,6 100,0 5,7
Homogenização de
cromatina 2 151 0 4 157 33,3 100,0 3,8
Multinucleação 3 151 0 3 157 50,0 100,0 3,8
Coilocitose 2 155 0 0 157 100,0 100,0 1,3
Multinucleação com
amoldamento 0 156 0 1 157 0,0 100,0 0,6
Controle: citologia convencional.
A freqüência representa os verdadeiros positivos do método controle.
Na Figura 7 são apresentadas fotomicrografias de citologia cérvico-vaginal
de casos classificados como anormalidades epiteliais segundo o Sistema
Bethesda 2001 em preparações em meio líquido, com etanol 95% e com
formaldeído 1%, em comparação a esfregaços convencionais.
80
FIGURA 7 – FOTOMICROGRAFIAS DE CITOLOGIA CÉRVICO-VAGINAL DE
CASOS CLASSIFICADOS COMO ANORMALIDADES
EPITELIAIS SEGUNDO SISTEMA BETHESDA 2001
Citologia convencional (A); citologia em meio líquido com etanol 95% (B); citologia em
meio líquido com formaldeído 1% (C);(1) lesão intraepitelial de baixo grau (sugestiva de
infecção por HPV); (2) lesão intraepitelial de alto grau; (3) carcinoma cervical
escamoso. Coloração de Papanicolaou (400x).
81
Os resultados obtidos para a área e o perímetro celulares, monitorados pelo
programa Image Tool for Windows, estão ilustrados nas Tabelas 7 a 9. Ao se
comparar a morfometria entre células escamosas intermediárias observadas pelo
método em meio líquido com etanol 95% e pela citologia convencional (Tabela 7),
não foi observada nenhuma diferença para as dimensões de área e perímetro
(p>0,05).
Ao se comparar a morfometria entre células escamosas intermediárias
observadas pelo método em meio líquido com formaldeído 1% e pela citologia
convencional (Tabela 8), não se observou nenhuma diferença para as dimensões
de área e perímetro na monitoração do núcleo (p>0,05) mas, para o citoplasma,
observou-se diferenças nas dimensões de área e perímetro entre os dois métodos
(p<0,05)
TABELA 7 – COMPARAÇÃO MORFOMÉTRICA ENTRE CÉLULAS ESCAMOSAS
INTERMEDIÁRIAS DE CITOLOGIA CONVENCIONAL E EM MEIO
LÍQUIDO ETANOL 95%
dev. Lim. Confiança dif.
N Area pad. EPM -95% +95% média p
núcleo controle 98 494,46 121,79 12,30 470,04 518,88
11,50 0,999
álcool 95% 98 505,96 133,05 13,44 479,28 532,63
Cito- controle 98 12973,96 5576,00 566,16 11850,15 14097,77
-450,18 0,550
plasma álcool 95% 98 12523,78 4929,53 497,96 11535,47 13512,08
Perí- dev.
Lim. Confiança
dif.
N metro
pad.
EPM -95% +95%
média
p
núcleo controle 98 88,19 10,49 1,07 86,06 90,31
0,61 1,000
álcool 95% 98 88,80 10,95 1,10 86,62 90,97
Cito-
controle 98 450,62 91,89 9,43 431,90 469,34
-5,19 0,939
plasma
álcool 95% 98 445,43 84,25 8,43 428,71 462,15
Desv.pad. – desvio padrão; dif. média – diferenças entre médias; EPM - erro padrão da
média, N - tamanho amostral; p – propabilidade da distribuição Tukey.As medidas celulares
foram capturadas em pixel utilizando o programa Image Tool for Windows V. 3.0
82
TABELA 8 – COMPARAÇÃO MORFOMÉTRICA ENTRE CÉLULAS ESCAMOSAS
INTERMEDIÁRIAS DE CITOLOGIA CONVENCIONAL E EM MEIO
LÍQUIDO FORMALDEÍDO 1%
dev.
Lim. Confiança dif.
N Area
pad.
EPM ´-95% ´+95% média p
núcleo controle 196 554,93 135,42 9,67 535,85 574,01
-6,97 0,999
formaldeído 1% 196 547,95 126,41 9,01 530,19 565,72
Cito- controle 196 17824,15 5877,98 419,86 16996,11 18652,19
-1561,6 0,005
plasma
formaldeído 1% 196 16262,52 5031,67 359,40 15553,70 16971,34
Perí- dev.
Lim. Confiança dif.
N metro
pad.
EPM ´-95% ´+95% média p
núcleo controle 196 93,18 11,81 0,84 91,52 94,84
-0,33 0,999
formaldeído 1% 196 92,85 11,31 0,81 91,26 94,44
Cito- controle 196 550,51 188,21 13,44 523,99 577,02
-42,16 0,000
plasma
formaldeído 1% 196 508,35 81,77 5,80 496,92 519,78
Desv.pad. – desvio padrão; dif. média – diferenças entre médias; EPM - erro padrão da média, N -
tamanho amostral; p – propabilidade da distribuição Tukey.As medidas celulares foram
capturadas em pixel utilizando o programa Image Tool for Windows V. 3.0
Ao se comparar a relação núcleo citoplasma entre células escamosas
intermediárias obtidas pelos métodos em meio líquido com etanol 95% e com
formaldeído 1% em relação à citologia convencional, não se observou diferenças
para esta relação (Tabela 9, p>0,05). No entanto, ao se comparar os resultados
obtidos para a relação núcleo citoplasmática nos dois grupos de pacientes
estudados, ou seja, aqueles em que se comparou o método em meio líquido com
etanol 95% com a citologia convencional, e o método em meio líquido formaldeído
1% com a citologia convencional, observou-se menor relação núcleo citoplasma no
segundo caso, independentemente da metodologia empregada.
83
TABELA 9 COMPARAÇÃO MORFOMÉTRICA DA RELAÇÃO
NÚCLEO/CITOPLASMA, ENTRE CÉLULAS
ESCAMOSAS INTERMEDIÁRIAS DE CITOLOGIA
CONVENCIONAL E EM MEIO LÍQUIDO ETANOL 95%
E FORMALDEÍDO 1%
Razão desv. Lim. Confiança dif.
N N/C pad. EPM -95% +95% Média p
controle 98 0,0430 (1:23) 0,0164 0,0017 0,0397 0,0463
0,0031 0,277
álcool 95% 98 0,0461 (1:21) 0,0225 0,0023 0,0416 0,0506
controle 196 0,0349 (1:29) 0,0188 0,0013 0,0322 0,0375
0,0026 0,183
formaldeido 1% 196 0,0375 (1:27) 0,0199 0,0014 0,0347 0,0403
Desv.pad. – desvio padrão; N - tamanho amostral; t – t observado; GL – graus de
liberdade; p – propabilidade da distribuição t.
As medidas celulares foram capturadas em pixel (bit), utilizando o programa Image Tool
for Windows V. 3.0
84
6. DISCUSSÃO
85
6. DISCUSSÃO
A coleta do material é relevante para se testar qualquer metodologia de
avaliação citológica. Para que amostras sejam consideradas satisfatórias, há
necessidade de uma celularidade mínima dos esfregaços. Em levantamentos
populacionais realizados pelo exame de Papanicolaou, demonstrou-se que a coleta
de material pode ser responsável por até 90% entre os 15 a 50% de resultados
falsos negativos encontrados com citologia convencional (BOLICK e HELLMAN,
1998). Alguns autores têm demonstrado que a citologia em meio líquido pode ser
mais sensível em relação à convencional na detecção de anormalidades, justamente
devido ao fato de que as células recolhidas pelo instrumento de coleta se transferem
para um meio líquido, podendo ser concentradas para comporem uma preparação
(BOON et al. 1989).
Neste trabalho, para os testes preliminares, coletou-se raspado de mucosa
bucal e de parede vaginal com o auxílio de espátula de madeira e escova cilíndrica,
tendo-se obtido boa celularidade apenas com o uso de escova. Para os
experimentos com pacientes atendidas no SUS, coletou-se material cérvico-vaginal
com o auxílio de escova cônica, após a coleta do exame de Papanicolaou de rotina.
Após a fixação e preservação em meio líquido e o processamento das amostras,
obteve-se esfregaços com celularidade satisfatória (Figura 2).
Em estudos com citologia em meio líquido, um dos problemas enfrentados
pelos pesquisadores é o de garantir o atendimento adequado à paciente e, ao
mesmo tempo, coletar amostras representativas a serem testadas pelo método, o
que levou ao desenvolvimento de ao menos três modelos de estudo. Em alguns
trabalhos sobre citologia cérvico-vaginal em meio líquido, empregou-se apenas
amostras coletadas diretamente para o frasco contendo meio líquido (PAPILLO et
al., 1998; BELINSON et al., 2001; OBWEGESER e BRACK, 2001; CHEUNG et al.,
2003; NEGRI et al., 2003; PEREIRA et al., 2003). Em outros trabalhos, como os de
Wilbur et al. (1993), Mcgoogan e Reith (1996), Bishop et al. (1998), Hutchinson et al.
(1994), Ferency et al. (2001), Ring et al. (2002), utilizou-se amostras divididas, ou
seja, empregando-se o mesmo instrumento de coleta, espalhou-se o material
cérvico-vaginal sobre lâmina de microscopia, confeccionando-se assim, o esfregaço
para citologia convencional e, a seguir, mergulhou-se o mesmo instrumento de
coleta, contendo material residual, no meio líquido em estudo.
86
Longatto Filho et al. (2005), entretanto, empregaram o mesmo instrumento de
coleta para obter amostras para citologia convencional e citologia em meio líquido,
porém coletando duas vezes da mesma paciente. Assim, a amostra para citologia
convencional foi coletada com espátula de Ayre e escova endocervical e, após a
confecção do esfregaço convencional com ambas, a mesma escova, contendo
material endocervical residual, foi usada para coletar nova amostra da ectocérvice e,
em seguida, colocada em um frasco contendo meio líquido. Bolick e Hellman (1998)
utilizaram coleta de amostra não dividida, com escova endocervical e espátula
plástica para a citologia convencional, seguida de escova tipo vassoura para a
citologia líquida, Vassilakos et al. (2000), também utilizaram duas coletas da mesma
paciente.
McGoogan e Reith (1996), observaram diferenças na celularidade de
citologia em meio líquido (ThinPrep
®
e Cytorich
®
) devido aos instrumentos de coleta,
com boa celularidade ao empregar material residual em escova Cervex, e escassa
celularidade, em espátula de Ayre de madeira.
Um cuidado tomado neste estudo foi o de priorizar a coleta para a citologia
convencional, ou seja, garantir a realização do exame de rotina da paciente. Desta
forma, assegurou-se as condições rotineiras para a investigação citológica. O
mesmo cuidado foi também descrito no trabalho de (WILBUR et al., 1993). Ao se
coletar primeiramente a citologia de rotina da paciente e, com o material residual da
espátula de Ayre e da escova endocervical, se confecciona em seguida outra lâmina
convencional. A metodologia de coleta para citologia em meio líquido colocando-se a
amostra direto no frasco com meio líquido levou a melhores resultados quando-se
comparou com a citologia convencional, conforme trabalhos apresentados por
Vassilakos et al. (2000) e Longatto Filho et al. (2005), aumentando a sensibilidade
da citologia em meio líquido detectando lesões cervicais.
O uso isolado de espátula de Ayre de madeira diminui a sensibilidade da
citologia em meio líquido quando comparada à citologia convencional, por absorver
as células. A associação de escova Cervex ou cytobrush com espátula de Ayre de
madeira ou plástico aumentou a sensibilidade da citologia em meio líquido quando
comparada à convencional, em estudos com divisão de amostra (LAVERTY et al.,
1995).
Estudos como os de Neidt et al. (1996) e Tabbara et al. (1994) demonstram
que a confecção de duas lâminas em citologia convencional aumenta a sensibilidade
87
deste método, principalmente em detectar HSIL (HINDMAN et al., 1981). A espátula
de Ayre e a escova citológica têm sido validadas como efetivas para a coleta de
material cérvico-vaginal em metodologia convencional, em vários estudos. A
associação de ambas melhora a detecção de lesões glandulares e lesões cervicais
(MARTIN-HIRSCH et al., 1999).
Na citologia em meio líquido, o emprego de novos modelos de escovas, como
as de forma cônica ou de vassoura, embora mais dispendioso em relação à
associação de espátula de Ayre e escova citológica, tem demonstrado maior
sensibilidade. Hutchinson et al. (1991), demonstraram que a citologia em meio
líquido coletada com escova cônica apresenta aproximadamente o dobro de células
epitelias, em relação ao emprego de espátula e escova combinados, e cerca de
cinco vezes mais células epitelias que a citologia coletada apenas com a espátula
(HOWELL et al. 1998). Portanto, uso da escova cônica é o instrumento mais
indicado em estudos com coleta de citologia em meio líquido com divisão de
amostras, conforme demonstrado em trabalho de Austin e Ramzy (1998).
A satisfatoriedade celular da citologia convencional pode ser melhorada,
consequentemente aumentando sua sensibilidade e especificidade (CIBAS et al.
2001), através da remoção do muco e dos restos celulares da superfície cervical
com um swab de algodão antes da coleta convencional. Obwegeser e Brack (2001)
conseguiram comparar a sensibilidade da citologia convencional, com a citologia em
meio líquido. O uso de instrumentos adequados na citologia convencional como a
espátula de Szalay, a qual coleta células do canal endocervical ao mesmo tempo em
que coleta da superfície cervical, melhora a celularidade. A espátula de Szalay e a
Aylesburg, pela modificação em seu tamanho e forma, conseguem coletar células da
zona de transformação (ZT) e tem sido descritas como um importante instrumento
para o aumento da sensibilidade do exame convencional (RAMMOU-KINIA et al.,
1991). O aumento da sensibilidade no exame convencional de Papanicolaou é
importante, pois esta metodologia apresenta um custo menor quando comparada à
citologia em meio líquido, podendo melhorar os índices dos programas de triagem
em países em desenvolvimento.
Para o desenvolvimento do trabalho, realizou-se testes preliminares com o
intuito de avaliar a metodologia mais adequada a ser testada em material cérvico-
vaginal de um grupo de mulheres atendidas na rede pública de saúde. Para tanto,
empregou-se material citológico obtido de raspado bucal e vaginal.
88
Testou-se vários meios para preservação e fixação de células epiteliais em
lâmina, com o intuito de se desenvolver uma metodologia alternativa viável e de baixo
custo para citologia em meio líquido. O desenvolvimento de técnicas de citologia em
meio líquido em substituição ao método convencional de Papanicolaou para citologia
cérvico-vaginal surgiu a partir das demandas de escrutínio computadorizado,
considerando-se que a presença de artefatos e de sobreposições celulares dificulta
sobremaneira a identificação celular por automação. Adicionalmente, as conhecidas
limitações do método de Papanicolaou em relação à sua sensibilidade, especialmente
no que se refere à representatividade da amostra, fez com que muitos citologistas
buscassem o aperfeiçoamento do mesmo. Desta forma, a evolução das técnicas de
citologia em meio líquido permitiu estudos através dos quais se obteve preparações
mais finas e homogêneas, com menos superposições e artefatos e mais
representativas do material obtido por esfoliação. Alguns autores têm demonstrado a
detecção de maior número de casos de anormalidades epiteliais com o emprego de
citologia em meio líquido, em relação ao método de Papanicolaou, sugerindo que,
além de maior representatividade, com este método se poderia conseguir melhor
preservação e fixação celulares (ALVES et al, 2004).
Para a escolha de meio(s) líquido(s) para preservação e fixação de células
epiteliais para este trabalho, procurou-se testar substâncias e composições já
conhecidas, algumas empregadas rotineiramente em laboratórios de citologia e outras
já reconhecidas cientificamente devido às suas propriedades em relação a células de
diversos tecidos.
O etanol é amplamente empregado como fixador celular, sendo utilizado com
sucesso, na concentração de 95% em meio aquoso, para a fixação de células em
lâmina no exame de Papanicolaou (TAKAHASHI, 1981). Considerou-se que o seu uso
em meio líquido, caso fosse eficiente, seria extremamente prático, simples e barato,
como método alternativo para citologia cérvico-vaginal. Nos testes preliminares
realizados com etanol 95%, observou-se boa preservação das células escamosas
vaginais e bucais, com boa celularidade e homogeneidade e ausência de artefatos.
Assim, optou-se por testá-lo em maior número de amostras cérvico-vaginais.
O meio de conservação de eritrócitos (meio CE) foi desenvolvido por
pesquisadores desse laboratório, com o objetivo de preservar eritrócitos e plaquetas
em amostras de controle de qualidade para os valores hematimétricos (LEONART et
al., 1986). O emprego de componentes diversos, entre eles nutrientes, como a
89
glicose e fontes de íons; a albumina bovina, como estabilizadora da membrana
celular, antibióticos e cortisona para evitar a contaminação bacteriana,
etilenodiamino tetracetato de sódio como quelante do íon cálcio, permite a
conservação destas células durante cerca de 60 dias. A incubação de eritrócitos e
plaquetas com glutaraldeído permite uma fixação parcial da membrana celular pelo
crosslinking entre moléculas protéicas. No entanto, as preparações de células
escamosas obtidas por suspensão em meio CE, com ou sem adição de etanol 95%
apresentaram alterações celulares de coloração, como hipercromasia e
hiperqueratose, de forma e tamanho, como irregularidades de membrana,
pleomorfismo e edema nuclear, além da formação de artefatos, como precipitados
sobre as células. Em relação à celularidade, as preparações obtidas só foram
satisfatórias na presença de etanol 95% na proporção de 1:1.
O glutaraldeído é bastante empregado como fixador de células e de tecidos,
especialmente em técnicas de microscopia eletrônica (SABATINI, 1963). O emprego
de glutaraldeído em meio alcoólico ou em tampão fosfato em células escamosas
causou alterações celulares como irregularidade de membrana, células dobradas e
halo perinuclear, bem como formou precipitados sobre as células. A celularidade foi
somente satisfatória em meio alcoólico.
A albumina bovina é utilizada em preparados citológicos com o objetivo de
aderência do material celular à lâmina de microscopia. As células escamosas em
meio contendo albumina adicionada de etanol 95% nas concentrações finais de 15 a
60 mg/dl, apresentaram alterações tintoriais, em especial moderada orangiofilia.
A albumina de Mayer, utilizada rotineiramente em preparações citológicas de
líquidos, como a urina, com o intuito de aderência celular a lâmina (TAKAHASHI,
1981, KOSS e MELAMED, 2006) foi usada nas preparações em células escamosas,
concentrada em diluições 1:10 e 1:100, em meio alcoólico, com etanol 95% na
proporção 1:1. As preparações apresentaram celularidade e homogeneidade
insatisfatória em todas as preparações, e presença de pleomorfismo celular, com
material proteináceo na lâmina, formando um fundo sujo que obscurecia a
visibilidade das células.
O formaldeído é usado rotineiramente em laboratório como fixador de células
e tecidos, principalmente de peças para estudos anatomopatológicos, bem como na
composição de outros meios fixadores (TAKAHASHI, 1981). Ao se testar o
formaldeído em concentrações de 1 a 5% em tampão fosfato pH 7,4, para a fixação
90
e preservação de células escamosas, obteve-se satisfatoridade apenas na
concentração de 1%. Nas concentrações maiores de formaldeído, observou-se
alterações morfotintoriais das células, bem como presença de artefatos.
Na escolha da metodologia de concentração celular, optou-se por metodologias
viáveis, empregadas em rotina de laboratório clínico. A centrifugação comum e a
sedimentação espontânea apresentaram resultados satisfatórios em comparação à
citocentrífugação. Deve-se considerar, entretanto, que o diâmetro das aberturas dos
suportes empregados para a citocentrifugação foi de apenas 8 mm. Assim, o diâmetro
reduzido das preparações citológicas obtidas ocasionou excessiva sobreposição
celular, causando insatisfatoriedade. Outros autores relatam melhores resultados com
preparações citocentrifugadas cujo diâmetro varia de 13 ou 20 mm (GRUPTA et al.,
2001).
Na avaliação da velocidade e tempo de centrifugação, utilizou-se variações
baseadas em preparações citológicas utilizadas em rotina de laboratório,
considerando-se a fragilidade das células em relação à força da centrifugação
(HOFFKEN et al., 1978). Assim, empregou-se velocidades de 128, 289 e 514 x g
durante 5 e 10 min, sendo que, com a velocidade de 289 x g durante 5 min obteve-se
preparações com celularidade e homogeneidade satisfatórias. Demonstrou-se a
eficiência da centrifugação, pela constatação da ausência de células escamosas ao
microscópio óptico no sobrenadante, após a sedimentação.
Para a confecção do esfregaço, testou-se métodos empregados rotineiramente
em laboratório, como a extensão dos sedimentos obtidos em lâmina, conforme são
feitas as extensões sangüíneas em hematologia, e espalhamento do sedimento, como
realizado para exames de bacterioscopia. Preparados feitos por espalhamento
circular do sedimento apresentaram celularidade e homogeneidade satisfatória, com
ausência de alterações celulares. Em preparações feitas por extensão, observou-se
alterações celulares, tais como irregularidade da membrana e pleomorfismo celular,
além de celularidade e homogeneidade insatisfatórias.
A aderência do material citológico foi analisada com uso de Albumina de Mayer
concentrada e diluída e poli-L-lisina, utilizadas com esta finalidade em laboratórios de
citologia e indicadas em literatura especializada (TAKAHASHI, 1981; KOSS e
MELAMED, 2006). Apesar da eficiência destes componentes em relação à adesão
das células na lâmina de microscopia, as preparações obtidas foram insatisfatórias
91
devido à ocorrência de alterações tintoriais, tais como orangiofilia, e excessiva
sobreposição celular.
Conforme descrito em literatura especializada, o tempo de fixação de
esfregaços cérvico-vaginais deve ser de 15 a 30 min (KOSS e MELAMED, 2006). No
entanto, nos testes preliminares realizados para o tempo de fixação em etanol 95%
das preparações em lâmina neste trabalho, obteve-se melhores resultados com
30 min de fixação em comparação a 15 min. No caso de esfregaços recobertos com
solução alcoólica de polietilenoglicol a 2% e secos ao ar, com posterior fixação em
etanol 95% por 30 min, observou-se alterações tintoriais.
Assim, a partir dos testes preliminares realizados, definiu-se a metodologia a
ser avaliada com o material cérvico-vaginal. Em relação aos meios líquidos para
preservação e fixação, optou-se pelo emprego de etanol 95% e de formaldeído 1%
em tampão fosfato 150 mmoles/l pH 7,4. Para sedimentação das células obtidas,
empregou-se a centrifugação comum na velocidade de 289 x g durante 5 min. No
caso das amostras mantidas em formaldeído 1% em tampão, após a centrifugação,
ressuspendeu-se as células em etanol 95% e deixou-se que as mesmas
sedimentassem espontaneamente durante 1 h, preparando-se os esfregaços a partir
do sedimento. Este procedimento foi realizado porque observou-se que a confecção
dos esfregaços não foi eficiente quando se empregava suspensão de células em
meios aquosos, ou seja, a celularidade era insatisfatória devido à demora na
evaporação da fase líquida.
A celularidade mínima obtida com as metodologias em meio líquido
desenvolvidas foi de cerca de 10.000 células, o que ocorreu em 50% das
preparações, com médias na faixa de 15.000 células, independentemente do
método empregado (Figura 2). A contagem da média de células foi estimada segundo
fórmulas propostas pelo Sistema Bethesda (SOLOMON e NAYAR., 2001), que
recomenda o cálculo a partir do número de células por campo em alguns campos e
estabelece que a celularidade deve ser ao menos de 5000 células em preparações
de citologia cérvico-vaginal em meio líquido. Desta forma, a celularidade obtida
neste trabalho foi satisfatória, não havendo diferenças estatisticamente significativas
entre as contagens nos dois métodos (anova, p = 0,734).
As regras estabelecidas pelo Sistema Bethesda para o cálculo de celularidade
são perfeitamente aplicáveis devido à homogeneidade das amostras de citologia em
meio líquido e à forma circular das preparações (KIMBERLEY et al, 2003).
92
A comparação nas observações de presença de células escamosas
superficiais, intermediárias e parabasais, células endocervicais, células
metaplásicas, polimorfonucleares, histiócitos, linfócitos e hemácias em citologia
convencional (controle) e em meio líquido com etanol 95% e com formaldeído 1% foi
monitorada em forma semi-quantitativa codificada em cruzes. As tabelas 1 e 2
ilustram a análise comparativa pelo teste z para proporções em categorias
mutuamente exclusivas, entre as freqüências de ocorrências de identificação de
células em preparações de citologia convencional e de citologia em meio líquido. O
teste estatístico de comparação para duas proporções mutuamente excludentes
indica que as proporções de concordância com o controle foram superiores às de
discordância (p < 0,05). Utilizando-se formaldeído não foi verificada a mesma
identificação celular que a citologia convencional apenas para dois tipos celulares,
células endocervicais e histiócitos. A proporção de contagens diferentes entre os
dois métodos foi relativamente alta. As semelhanças morfológicas encontradas para
as células escamosas, metaplásicas, polimorfonucleares, linfócitos e hemácias, bem
como as diferenças para as células endocervicais e histiócitos, estão representadas
na Figura 4. Pode-se observar no caso das células endocervicais, que a estrutura da
cromatina foi alterada pelo emprego de formaldeído na citologia em meio líquido,
tornando-se compactada e hipercromática. Em relação aos histiócitos, observou-se
alterações na estrutura citoplasmática, não se conseguindo perceber a presença de
vacuolização, ou seja o seu aspecto esponjoso, característica morfológica relevante
para a identificação destas células.
Uma limitação observada em preparações obtidas em citologia em meio
líquido com etanol 95% foi relativa ao achado, nas amostras ricas em muco,
polimorfonucleares e ou hemácias, de material proteináceo acompanhado de
formação de grumos de células, com sobreposição de células epiteliais,
polimorfonucleares e hemácias. Tal fenômeno provocou obscurecimento importante
em algumas amostras, dificultando a identificação de células, organismos e
alterações. O etanol tem a propriedade de desnaturar proteínas, alterando sua
estrutura terciária, podendo ser o causador de tais artefatos em amostras ricas em
proteínas. Os métodos comerciais de citologia em meio líquido em geral preconizam
a retirada de hemácias, leucócitos e muco por gradiente de densidade ou filtração,
no sentido de se obter amostras limpas (GRUPTA et al., 2001).
93
Para a avaliação do efeito do tempo de preservação das células escamosas
nos meios líquidos empregados, testou-se em uma amostra de material vaginal, a
incubação em etanol 95% e em formaldeído 1% durante 24, 48 e 72 horas. Como se
pode observar na Figura 3, não houve influência dos tempos de preservação
empregados nas qualidades morfotintoriais das células escamosas ou mesmo dos
microorganismos presentes.
Algumas discrepâncias menos acentuadas observadas para as outras
variáveis poderiam ser explicadas por diferenças de avaliação na codificação em
cruzes. Notou-se, também, que as diferenças observadas para as células
endocervicais se deveram, de modo geral, a sua presença nas preparações de
citologia convencional e ausência nas preparações de citologia em meio líquido, o
que pode ter sido conseqüência da segunda coleta abrasiva do canal endocervical,
considerando-se que este epitélio é constituído por uma única camada de células
endocervicais, as quais poderiam ter sido reduzidas na primeira coleta.
A maior porcentagem de células endocervicais e de células metaplásicas na
citologia convencional também foi observada em outros trabalhos, e tem sido
atribuída à coleta, especialmente ao modelo de divisão de amostra. Em coletas com
uma única amostra, tem-se relatado quantidades adequadas de células
endocervicais e metaplásicas (LAVERTY et al., 1995; LEE et al., 1997; BISHOP,
1997; BISHOP et al., 1998 )
A presença de microorganismos em preparações pelos métodos de citologia
em meio líquido com etanol 95% e com formaldeído 1%, em comparação com as de
citologia convencional, foi analisada pelos cálculos de sensibilidade e especificidade
(Tabelas 3 e 4). Todos os microorganismos observados na citologia convencional
também foram observados na citologia em meio líquido, com excelentes índices de
sensibilidade e de especificidade. Foi observada maior freqüência para Bacilos de
Döderlein, flora cocoíde, flora mista e Gardenerella vaginalis. Como se pode
observar na Figura 5, não houve diferenças na identificação morfológica dos
diversos microorganismos ao se comparar as metodologias estudadas com a
citologia convencional.
Não foi observado nenhum resultado falso positivo ou falso negativo nas
preparações de citologia em meio líquido com etanol 95%. Na observação da
citologia em meio líquido com formaldeído, foram observados resultados falso
negativos para Candida spp e Actimomyces spp. Entretanto, só havia 2 casos
94
positivos (1,8% de prevalência), o que não serve de base para uma inferência
estatística, por não oferecer segurança para uma conclusão.
Os resultados obtidos para a presença de microorganismos na citologia em
meio líquido corroboram os achados de outros autores, que apontam para
sensibilidade e especificidade ótimas para o método. Hutchinson et al. (1991)
referem-se ao fato de que os microorganismos são facilmente identificados em
citologia em meio líquido, em comparação à citologia convencional. No trabalho de
Bishop et al. (1998), não se observou diferenças significativas na identificação de
agentes infecciosos e de alterações benignas, comparando-se a citologia
convencional com a citologia em meio líquido (AutoCytePREP
®
).
No trabalho de Papillo, et al., (1998), foi observado um aumento de 25,51%
na detecção da identificação de agentes infecciosos. Relata-se ainda que, a
distribuição homogênea das células epiteliais sobre a lâmina, aliada à ausência ou
diminuição de leucócitos e ou hemáceas, conferindo um aspecto mais limpo à
preparação, facilita a visualização de agentes infecciosos, bem como de suas
alterações citopáticas.
Entretanto, relata-se em alguns trabalhos que, dependendo da metodologia
de preparo na citologia em meio líquido, ocorre uma diminuição na quantidade dos
microorganismos observados, o que não impede a sua identificação (KOSS e
MELAMED, 2006).
A análise de alterações celulares em preparações obtidas por citologia em
meio líquido com etanol 95% e com formaldeído 1%, em comparação com a
citologia convencional, empregada como controle, através de cálculos de
sensibilidade e especificidade, está ilustrada nas Tabelas 5 e 6. Maiores
prevalências entre as alterações observadas foram encontradas para
pseudoeosinofilia, metacromasia, hiperqueratose, edema nuclear, halo perinuclear,
grânulos querato-hialinos e vacuolização. Os índices de sensibilidade e de
especificidade foram excelentes para os dois métodos de citologia líquida, apenas
para as ocorrências pseudoeosinofilia e metacromasia. Como se pode observar na
Figura 6 as alterações celulares observadas em preparações de citologia em meio
líquido e de citologia convencional não apresentaram diferenças morfológicas
relevantes, a não ser a vacuolização, que não pode ser percebida claramente em
preparações de citologia e meio líquido com formaldeído.
95
Observou-se sensibilidade superior a 70%, em citologia em meio líquido
com etanol 95%, para pseudeosinofilia, metacromasia, hiperqueratose, edema
nuclear, halo perinuclear, grânulos querato-hialinos, citólise, cariopicnose,
paraqueratose, cariólise, coilocitose e binucleação, e; para citologia em meio
líquido com formaldeído 1%, para pseudoeosinofilia, metacromasia, halo
perinuclear, grânulos querato-hialinos, hiperqueratose, edema nuclear,
cariopicnose, citólise e coilocitose.
A freqüência das observações nas alterações celulares observadas pareceu
ser um fator fundamental na comparação entre citologia em meio líquido e
convencional. Observou-se uma tendência de menor sensibilidade para a citologia
em meio líquido, quando comparada com a convencional para prevalências mais
baixas (Tabelas 5 e 6). Possivelmente, algumas alterações celulares ficam mais
evidentes na convencional e menos marcantes na líquida, o que poderia levar o
citologista a temer resultados falsos negativos.
Em algumas preparações foram encontradas alterações celulares
suficientes para classificá-las como lesões intraepiteliais cervicais, e em um caso,
carcinoma escamoso invasor. Estes casos não foram incluídos nas análises
estatísticas realizadas devido à escassez dos resultados obtidos. No entanto,
como se pode observar na Figura 7, houve evidência na observação de critérios
morfológicos relevantes como hipercromasia, cariomegalia, aumento da relação
núcleo-citoplasma, irregularidades na distribuição da cromatina, irregularidade do
contorno nuclear, pleomorfismo celular e disqueratose.
A maioria dos estudos atribui maior sensibilidade para a metodologia em
meio líquido, tanto na detecção de LSIL, quanto HSIL, como pode ser
demonstrado nos trabalhos de Wilbur et al., (1993), Bishop et al., (1998), Ring et
al., (2002), Negri et al., (2003). Hodgson et al., (2005) e Longatto Filho et al.,
(2005). Este aumento na detecção em termos percentuais variou para LSIL desde
3,2% (RING et al., 2002), até 115,5% (HODGSON et al., 2005) e para HSIL variou
desde 6% (BISHOP et al., 1998) até 37,5% (HODGSON et al, 2005). O aumento
no diagnóstico de carcinoma foi observado em 25% por Bishop et al., (1998). No
trabalho de Papillo et al., (1998) agruparam os resultados de HSIL e carcinoma,
encontrando um aumento de 55,14% destes casos.
As áreas e os perímetros de células escamosas intermediárias, monitorados
pelo programa Image Tool for Windows, em unidades pixel (bit), estão ilustrados
96
nas Tabelas 7 a 9. Não foi observada nenhuma diferença para as dimensões de
área e perímetro em relação às preparações de citologia convencional, nas
análises feitas para citologia em meio líquido com etanol 95% (p>0,05). Porém,
nas análises feitas para citologia em meio líquido com formaldeído 1% (Tabela 8),
a área média e o perímetro citoplasmático das células escamosas intermediárias,
foram menores que os do método convencional (p<0,05). Não se encontrou
diferenças estatisticamente significativas para a relação núcleo-citoplasma (1:23
no método convencional e 1:21 no meio líquido com formaldeido 1%; 1:29 no
método convencional e 1:27 no meio líquido com etanol 95%), como ilustrado na
tabela 9, ao se comparar a citologia em meio líquido e a metodologia convencional.
No entanto, houve diferença significativa entre os grupos estudados, com uma
tendência de se observar menor relação núcleo-citoplasma no grupo em que se
comparou a citologia no meio líquido com formaldeído com a citologia
convencional.
Esses resultados sugerem que o citoplasma, com maior ambiente aquoso,
sofre maior contração com o formaldeído 1% que com o álcool 95%.
O aumento da preservação celular na citologia em meio líquido, pode induzir
a avaliação errada, super valorizando as alterações celulares interpretadas como
alterações atípicas ou displásicas, principalmente pela melhora de detalhes
nucleares (HUTCHINSON et al., 1991, DAVEY et al, 2006). No trabalho de Lemay e
Meisels (1999), para diminuir a tendência inicial de super avaliação, os citologistas
fizeram um treinamento antes de analisar as preparações em meio líquido, isto
ocorre principalmente pela melhor fixação e preservação de detalhes nucleares, com
melhor visualização da cromatina, em especial pelo desvio temporário da
normalidade com diminuição de componentes inflamatórios que obscurecem as
células epiteliais.
Diversos pesquisadores (PAPILLO et al., 1998; BISHOP et al., 1998;
BELINSON et al., 2001; OBWEGESER e BRACK, 2002; RING et al., 2002;
CHEUNG et al., 2003; NEGRI et al., 2003; PEREIRA et al., 2003; HODGSON et
al., 2005) encontraram algumas diferenças para o reconhecimento de objetos em
material cérvico-vaginal na citologia em meio líquido, em comparação à citologia
convencional. Existem vários fatores, entre os quais, a distribuição homogênea de
células na lâmina, a redução de restos celulares, material proteináceo, leucócitos e
ou hemácias, algumas vezes a redução na quantidade de microorganismos, os
97
menores índices de superposição de células, a qualidade da preservação e fixação
das células, que podem influenciar nas qualidades morfotintoriais dos objetos a
serem analisados. Relata-se, por exemplo, que na citologia em meio líquido as
células se tornam mais arredondadas, pode haver um leve aumento da relação
núcleo-citoplasma, e os índices de hipercromasia podem ser diminuídos em
relação à citologia convencional (PARKIN et al. 2005).
Os resultados obtidos a partir dos experimentos realizados neste trabalho
sugerem que meios líquidos conhecidos como fixadores celulares, como por
exemplo, soluções de etanol e de formaldeído, podem ser empregados na fixação
e preservação de células epiteliais cérvico-vaginais. A metodologia empregada
para a coleta de material e a preparação de esfregaços de material cérvico-vaginal
foram eficientes para se obter boa celularidade e satisfatoriedade das amostras
obtidas. No entanto, observou-se algumas limitações nas metodologias
desenvolvidas, especialmente no que se refere à identificação de células
endocervicais e histiócitos quando se empregou formaldeído 1%, bem como
presença de artefatos por superposição de células em algumas amostras
preparadas com etanol 95%. Desta forma, os resultados obtidos apontam para
novos experimentos a serem realizados com os dois meios líquidos empregados e
com líquidos apresentando novos componentes.
A citologia em meio líquido apresenta vantagens como a coleta e a forma de
preparação das amostras, que garantem uma maior representatividade em relação à
citologia convencional, mesmo com celularidade inferior (NEIDT, et al., 1996), o
tempo de análise de citologia em meio líquido, é praticamente a metade do tempo
da citologia convencional. A média do tempo de avaliação da citologia convencional
em um estudo de Mcgoogan e Reith, (1996) é cerca de 6 min e 64 seg, enquanto
que nas citologias em meio ThinPrep é 3 min 37 seg e CytoRich 3 min 11 seg,
porém pela menor celularidade que a convencional, a análise requer mais
concentração e pela qualidade de fixação e alteração morfológica causada pela
metodologia de preparo, um maior treinamento.
A citologia em meio líquido nos EUA custa cerca de duas vezes mais, do
que a citologia convencional, U.S. $28,76 versus U.S. $14,31, conforme
demonstrado em trabalho de Hodgson et al., 2005.
O desenvolvimento de uma metodologia alternativa para citologia cérvico-
vaginal em meio líquido, que seja simples e acessível economicamente para que
98
possa ser empregada em rastreamentos populacionais, será relevante para o
desenvolvimento de países como o Brasil e para a prevenção e controle do câncer
cervical.
99
7. CONCLUSÕES
100
7. CONCLUSÕES
Estudos sobre metodologias alternativas para citologia cérvico-vaginal em meio
líquido, em comparação ao método convencional, em preparações feitas por coleta
com escova cônica após a coleta convencional, fixação e preservação em meio
líquido durante 1 a 24 h, centrifugação a 289 x g, realização de esfregaço circular do
sedimento em lâmina, fixação por 30 min em etanol 95%, coloração de
Papanicolaou e montagem com Entellan, permitem concluir que:
A - Em amostras cujo meio líquido foi etanol 95%, obteve-se celularidade
satisfatória, adequabilidade na identificação morfológica de células escamosas
superficiais, intermediárias e parabasais, metaplásicas, endocervicais,
polimorfonucleares, histiócitos, hemácias e linfócitos, bem como na análise
morfométrica de células escamosas intermediárias; sensibilidade e
especificidade satisfatórias para microorganismos e alterações celulares como
pseudoeosinofilia, metacromasia, hiperqueratose, edema nuclear, halo
perinuclear, grânulos querato-hialinos, citólise, cariopicnose, paraqueratose,
cariólise, coilocitose e binucleação.
B - Em amostras cujo meio líquido foi formaldeído 1% e que, após a centrifugação
foram incubadas em etanol 95% durante 1 h com sedimentação espontânea,
obteve-se celularidade satisfatória, adequabilidade na identificação morfológica
de células de células escamosas superficiais, intermediárias e parabasais,
metaplásicas, polimorfonucleares, hemácias e linfócitos, bem como na análise
morfométrica de células escamosas intermediárias; sensibilidade e
especificidade satisfatórias para microorganismos e alterações celulares como
pseudoeosinofilia, metacromasia, halo perinuclear, grânulos querato-hialinos,
hiperqueratose, edema nuclear, cariopicnose, citólise e coilocitose.
Considerando-se que, nas amostras preparadas com etanol 95% houve
precipitação de material protéico que causou sobreposição de células,
polimorfonucleares e hemácias, especialmente em materiais ricos em muco,
polimorfonucleares ou hemácias. Considerando-se ainda, que nas amostras
preparadas com formaldeído 1%, houve alterações em células endocervicais e
101
histiócitos que dificultaram a sua identificação; conclui-se que há necessidade de
estudos complementares com estes e outros métodos, que possibilitem a proposição
de métodos de citologia em meio líquido alternativas.
102
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
103
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Agency for Health Care Policy and Research. Evidence report/technology
asssessment n° 5: evalution of cervical citology. Rockville, 1999. US Departament
of Health and Human Services AHCPR publication n° 99-E010.
ALVES V.A.F. et al. Comparasion of manual and automated methods of liquid-based
cytology. A morphologic study. Acta Cytologica. v 48, p. 187-193, 2004.
ARAKI, K.; RIFKIND, J.M. The rate od osmotic hemolysis. A relationship with
membrane bilayer fluidity. Biochima Biophysica Acta. v. 645, p. 81-90,1981.
AUGUSTO, A. et al. Sobre a história natural do câncer do corpo uterino. Um estudo
retro e prospectivo. Jornal Brasileiro de Ginecologia. v. 92, n.6, p.317-324. 1982.
AUSTIN, R.M.; RAMZY, I. Increased detection of epithelial abnormalities by liquid-
based gynecologic cytology preparation: a review of acumulated data. Acta
Cytologica. v. 42, p. 178-184, 1998.
ATKINSON, B. F; SILVERMAN, J. F. Atlas de dificultades diagnosticas en
citopatologia. Harcourt, 2000.
BELINSON, J. et al., Shanxi province cervical câncer screening study: a cross-
sectional comparative trial of multiple thecniques to detect cervical neoplasia.
Gynecologic Oncology, p. 439-444, 2001.
BENCROFT, J.D.; STEVENS, E. Theory and practice of histological techniques,
Churchill Livingstone, 1990.
BETHESDA 2001. Disponível em http: /www.bethesda2001.cancer.gov.br. Acesso
16 de fevereiro 2007.
BIBBO, M. Comprehensive Cytopathology, 2 ed. WB Saunders Company, 1997
BISHOP, J.W. Comparasion of the CytoRich system with conventional cervical
cytology. Preliminary data on 2.032 cases from a clinical trial site. Acta Cytologica.
v. 41, p. 15-23, 1997.
BISHOP, J.W.; BIGNER, H.S.; COLGAN, J.T.;HUSAIN, M.D.; HOWELL, P.L.;
MCINTOSH, M.K.;TAYLOR, Q.D.; SADEGHI, H.M. Multicenter masked evaluation of
AutocytePrep thin layers with matched convencional smears. Incluind initial biopsy
results. Acta Cytologica. v.42, p. 189-197, 1998.
BOLICK, R.D.; HELLMAN, M.S. Laboratory and efficacy assessment of the thinprep
cervical cancer screening system. Acta Cytologica. v 42, p. 209-213,1998.
BOON, M.E.; GRAAFF, J.C.; RIETVELD, W.J. Analysis of five sampling methods of
the preparation of cervical smears. Acta Cytologica. v.33, p.843, 1989.
104
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretária de Assistência à Saúde. Instituto Nacional
de Câncer – INCA. Estimativas da incidência e mortalidade por câncer. Rio de
Janeiro: INCA. p.92, 2003.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria n. 92, de 2001. Disponível em: <http:
/www.saude.gov.br> Acesso em 23 de abril de 2007.
British Columbia Agency Cervical Cancer Screening Program. 1999 annual report.
Vancouver, The Agency, 2000.
CAPURRO, I.V.; ROJO, J. A E. et al. Programa de deteccion y control de cancer de
cuello uterino en servicio de salud araucania sur. Revista Chilenã de Obstetricia y
Ginecología, v. 67, n.2, 2002.
CARVALHO, F.H.; RECCO-PIMENTEL, S.M. A célula, 2001. Manole, São Paulo,
2001.
CDC- CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. National Center
for HIV, STD and TB Prevention. Division of Sexually Transmitted Diseases.
Disponível em: <http: /www.cdc.gov/nchstp/dstd/dstdp.html> Acesso em: 23 de
fevereiro 2007.
CIBAS, E.S.; DUCATMAN, B.S. Cytology: Diagnostic principles and clinical
correlates. W.B. Saunders Company, 1996.
CIBAS, E. S.; DEAN, B.; MAFFEO, N. et al. Quality assurance in gynecologic
cytologic: the value of cytotechnologist – cytopathologist discrepancy logs. American
Journal of Clinical Pathology, v. 115, p.512-516, 2001.
CHAN, E. L.; BRANDT, K.; et al. Comparasion of the effectiveness of polimerase
chain reaction and enzyme immole/lunoassay in detecting Chlamydia trachomatis in
different female genitourinary specimens. Archives of pathology e Laboratory
Medicine. v. 124, 2000.
CHEUNG, A.N.Y. et al. Liquid -based cytology and conventional cervical smears.
American Cancer Society. p.331-335, 2003.
DAS DORES, G.; TATOMARU, E.; et al. Aspectos atuais do rastreamento das
lesões HPV induzidas e do câncer do colo uterino com métodos morfológicos e
biomoleculares. News Lab. v.35, p. 196-204, 1999.
DAVEY, E. et al. Effect of study design and quality on unsatisfactory rates, cytology
classifications, and accuracy in liquid-based versus conventional cervical cytology: a
systematic review. Lancet, v. 367, p. 122-132. 2006.
FAVERO, P.R. Estudo das proteínas de membrana e morfologia dos eritrócitos
em doenças hemolíticas. Curitiba, 1996. 119p. Dissertação (Mestrado em
Bioquímica) Universidade Federal do Paraná.
105
FERENCZY, A.; FRANCO, E. Cervical-cancer screening beyond the year 2000. The
Lancet Oncology. v. 2, p. 27-32. 2001.
FOCCHI, J; RIBALTA, J.C.L.; SILVA, L.D.C.G. Câncer de colo uterino:
importância, epidemiologia e fatores de risco. Tratado de Ginecologia. 3º ed.
São Paulo: Roca, 2000.
FREITAS, O.T.; BOLSANELLO, A. Fundamentos de Citologia, Livros técnicos e
científicos Editora S.A. Rio de Janeiro, 1978.
GOMPEL, C. KOSS, L. G. Citologia ginecológica e suas bases anatômicas. 1 ed.
São Paulo: Manole, 1997.
GRUPTA, P. K.; LEE, E. F.; et al. Cytologic investigations in Chlamydia infection.
Acta Cytologica, v. 23, n.4, p.315-320, 1979.
GRUPTA, K. P.; BALOCH, W. Z.; BIBBO, M. Processing liquid-based gynecologic
specimens. Comparison of the avaible techniques. Acta Cytologica, v.45, n.6, 995-
998, 2001.
HINDMAN, D. R.; PAPLANUS, S.H.; WIENS, J..; SUCILI,T. N. The value of duplicate
smears in cervical cytology. Acta Cytological, p. 41- 53, 1981.
HODGSON, W., KAPLAN, J.K., RODRIGUEZ, M., MCHALE, M.T., ROSE, S.G.,
ELKAS, C.J. The impact of converting to liquid-based cervical in a military population.
Gynecologic Oncology. p. 1-5, 2005.
HOWEL, P.L. et al. The Autocyte prepraration system for gynecologic cytology. Acta
Cytologica. v.42, p.171-177, 1998.
HOFFKE, H. OTTO, K. SOOST, J.H. Cytomorphologic results of preparation
experiments for monolayer deposition of cervical material. The Journal of
Histochemistry and Cytochemistry. v. 27, p. 19-24, 1979.
HUTCHINSON, M.L, CASSIN, C.M. BALL, H.G. The efficacy of an automated
preparation device for cervical cytology. American Journal of Clinical Pathology.
v.96, p. 300-305,1991.
HUTCHINSON, M.L; AGARWAl, P.; BERGER, B.; CIBAS ES. A new look at cervical
cytology: ThinPrep multicenter trial results. Acta Cytologica, v. 36, p. 499-504, 1992.
HUTCHINSON, M.L; ISENSTEIN, L.M.; GOODMAN, A; et al. Homogeneous
sampling accounts for the increased diagnostic accuracy using the Thin Prep
processor. American Journal of Clinical Pathology. v.101, p.215, 1994.
INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (INCA) Disponível em: < ‘www.inca.gov.br>
Acesso em: 20 de maio de 2007.
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. Guanabara
Koogan, Rio de Janeiro, 1991.
106
KIMBERLEY, D.; IOFFE, B.O.; PUSZKIEWICZ, C.T.; SAUVEGEOT, J. Effect of
cellularity on the sensitivity of detecting squamous lesions in liquid-based cervical
cytology. Acta cytologica, v. 47, p. 605-610, 2003.
KLINKHAMER, J.J.M.P; MEERDING, J.W.; ROSIER, M.W.F.P.; HANSELAAR, M.J.A
Liquid-based cervical cytology. A review of the literature with methodos of evidence-
based medicine. Cancer Cytopathology. p. 263-271. 2003.
KOSS, L. G. The Papanicolaou test for cervical cancer detection. A triumph and a
tragedy. The Journal American of Medical Association. v. 22, n 5, p. 737-743,
1989.
KOSS, L. G. Diagnostic cytology. 4th ed. Philadelphia: J. B. Lippincott Company,
1992.
KOSS, L.G.; MELAMED, M.R. Koos Diagnostic cytology and its histopathology
bases. 5
th
ed. Philadelphia: J. B. Lippincott Company, 2006.
KURMAN, R.J.; SOLOMON, D. The Bethesda System for reporting cervical
vaginal cytologic diagnoses: definitions, criteria and explanatory notes for the
terminology and specimen adequacy. New York. Sring-Verlag, 1994.
KURMAN, R.J.; SOLOMON, D. O Sistema Bethesda para o relato de diagnóstico
citológico cervicovaginal. Revinter, 1997.
KUMAR, V.; ABBAS. K.A; FAUSTO, N. Robbins e Cotran: Patologia: Bases
Patológicas das Doenças. Elsevier, 7° ed. 2005.
LARA-TORRE, T.; PINKERTON, J.S. Accuracy of detection of Trichomonas vaginalis
organisms on a liquid-based Papanicolaou smear. America Journal Obstetrics
Gynecology. p.354-356. 2003.
LAVERTY, C.R.A.; THURLOE, J.K.; REDMAN, N.L.; FARNSWORTH, A. An
Australian trial of ThinPrep. A new cytopreraratory technique. Cytopathology v. 6, p.
140-148, 1995.
LEE, R.L.; ASHFAQ, B.; BIRDSONG, G.G.; CORKILL, M.E., MCINTOSH, K.M.;
INHORN, S.L. Comparison of conventional Papanicolaou smears and fluid-based
thin layer system for cervical cancer screening. Obstetrics Gynecology. v.90,
p.278-284, 1997.
LEMAY, C.; MEISELS, A. 100% rapid escreening for quality assurance. Acta
Cytologica, Chicago, v. 43, p.86-88, 1999.
LEONART, M. S. S.; GRANATO, E. S; NASCIMENTO A J., HASHIMOTO, Y;
LEONART, R. Solução preservadora de eritrócito para controle de qualidade do
eritrograma. Revista Brasileira de Análises Clínicas. v. 18, p. 7-12, 1986.
107
LEONART, M. S. S.; SILVA, E. L.; STINGHEN, et al. Amostra para controle de
qualidade do eritrograma estável durante 100 dias. Revista Brasileira Análises
Clínicas, Rio de Janeiro: v.21, p.111-113, 1989 a.
LEONART, M. S. S.; NASCIMENTO A J., et al. Effect of vitamin E on red blood cell
preservation. Brazilian Journal of Medical Biological Research, v.22, p85-86,
1989 b.
LIRA NETO, J. B. Atlas de citopatologia e histologia do colo uterino. Medsi. Rio
de Janeiro. 2000.
LONGATTO FILHO, A; SILVA FILHO, A.M. Colo uterino e vagina: processos
inflamatórios, aspectos histológicos, citológicos e colposcópicos. 1° ed. Rio de
Janeiro: Revinter, 2000.
LONGATTO FILHO, et al., DCS liquid-based system is more effective than
conventional smears to diagnosis of cervical lesions: study in high-risk population
whit biopsy-based confirmation. Gynecologic Oncology, v. 97, p. 497-500, 2005.
MARTINS, N.V; PEREIRA, E.G. Conhecendo o HPV: patologia do trato genital
inferior, colposcopia e cirurgia de alta frequência. 1º ed. São Paulo: Frôntis:
2000.
MARTIN-HIRSCH, P.; LILFORD, R.; JARVIS, G. KITCHENER, H.C. Efficacy of
cervical-smear collection devices. LANCET, n. 354, p. 1763. 1999.
MELAMED, M. R.; Rescreening for quality control in cytology. Acta Cytologica, v 40,
p.12-13, 1996.
MEISELS, A; MORIN, C. Cytopathology of uterus. Chicago: ASCP Press, 1997.
MCGOOGAN, E.; COLGAN, J.T.; RAMZY, I. et al. Cell preparation and criteria for
sample adequacy. Acta Cytologica. v 42, p. 25-32, 1998.
MCGOOGAN, E.; REITH, A. Would monolayers provide more representative
samples and improved preparations for cervical screening? Overview and evaluation
of systems available. Acta Cytologica. v. 40, p. 107-118, 1996.
MONSONEGO, F.E., New developments in cervical cancer screening and
prevention. 1ed. London: Blackell science, 1997.
MONTZ, F.J.; FREDERIC, L. B.; RISTOW E. R.; CORNELISON, T. Impact of
increasing Papanicolaou test sensitivy and compliance: a modeled cost and
outcomes analysis. Obstetrics e Gynecology v. 97, n° 5, p. 781-788, 2001.
NANDA, K.; MCCRORY, D. C.; MYRES, E. R. et al. Accuracy of the Papanicolaou
test in screening for and follow-up of cervical cytologic abnormalities: a systematic
review. Annals of Internal Medicine v. 132, p.810-819, 2000.
108
NAYLOR, B. The century for cytopathology. Acta Cytologica v. 44, p. 709-725,
2000.
NEGRI, G. et al., ThinPrep versus conventional Papanicolaou smears in the cytologic
follow-up of women with equivocal smears. American Cancer Society, p. 342-345,
2003.
NEIDT, G.W., CONNOR, A., GALLO, L., LUFF, R. Improved detection of
premalignant/malignant disease of the cervix: Two slides really are better than one:
One laboratory`s experience with over 4,5 million Pap smears. Acta Cytologica. v
40, pg. 1024, 1996.
OBWEGESER, J.H.; BRACK, S. Does liquid-based technology really improve
detection of cervical neoplasia? A prospective, randomized trial comparing the Thin
Prep pap test with the conventional pap test, incluind follow-up of HSIL cases. Acta
Cytologica. v.45, p. 709-714, 2001.
ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD. Manual de normas y
procedimientos para el control del cáncer de cuello uterino. Washington: OPAS;
1990.
PANÚCO, C. A B.; RODRÍGUEZ, I.D; et al. Detection of Clamydia trachomatis in
pregnant women by the Papanicolaou technique, enzyme immole/lunoassay and
polymerase chain reaction. Acta Cytologica, v.44, n.2,114-123, 2000.
PAPANICOLAOU, G. N. New cancer diagnosis. Proccedings of the Third Race
Betterment Conference, New York, 1928.
PAPANICOLAOU, G.N.; TRAUT, H. F. Diagnosis of uterine cancer by the vaginal
smear. New York: Commole/lonwealth fund, 1948.
PAPILLO, L. J.; ZARKA, A M.; JOHN, S. L. T. Evaluation of the Thinprep Pap test in
clinical practice. A seven-month, 16.314 case experience in Northern Vermont. Acta
Cytologica. v.42, 203-208, 1998.
PARAISO, M.F.R.; BREADY, K.; HELMCHEN, R. et al. Evaluation of the
endocervical cytobrush and cervex-brush in pregnant women. Obstetric
Gynecology v.84, p 539, 1994.
PEREIRA, S. M. M. et al. Cellularity evaluation in liquid-based cytology preparations.
Revista Instituto Adolfo Lutz, v. 62, p. 35-39, 2003.
PARKIN, D.M.; BRAY, J.; FERLAY P. Global cancer statistics. Cancer Journal of
Clinical v.55, p. 74-108, 2005.
PUNDEL, J. P.; LICHTFUS, C. Modifications de la coloration cytologique des frottis
vaginaux à l’hématoxyline-Shorr. Gynaecologia v.144, p. 58-60, 1957.
109
RAMMOU-KINIA, R.; ANAGNOSTOPOULOU, I.; GOMOUSA, M.; Comparasion of
spatula and nonsaptula methods for cervical sampling. Acta Cytologica. v. 35, p.
69-74, 1991.
REICHLIN, M. Use of glutaraldehyde as a coupling agent for proteins and peptides.
Method Enzymologist. New York: v. 70, p. 159-165, 1980.
RENSHAW, A A; MODY, R.D.; MOLLY, W.; BENTZ, S.J.; COLGAN J.T. The
significance of certification in liquid-based cytology and performance in the College of
American pathologistis interleboratory comparison program in cervicovaginal
cytopathology. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. v. 130, p. 1269-
1272, 2006.
RING, M. et al., Evalution of liquid-based cytology in cervical screening of high-risk
populations: a split study of colposcopy and genito-urinary medicine populations.
Cytopathology. p, 152-159, 2002.
RUBIN. E.; FARBER, J.L. Patologia. 3 ed Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999.
SABATINI, D.D.; BENSCH, K.; et al. R.J. Citochemistry and electron microscopy.
The preservation of celular ultrastructure and enzymatic activity by aldeyde fixation.
Journal of Cell Biology, New York : v.17, p.19-58, 1963.
SINGER, A; MONAGHAN, J. M. Colposcopia – Patologia e Tratamento do Trato
Genital Inferior. 2 ed. Revinter. Rio de Janeiro, 2002.
SOLOMON, D.; NAYAR, R. Sistema bethesda para citopatologia cervicovaginal.
2.ed.Rio de Janeiro: Revinter, 2001.
STEVENS, A J.; LOWE, J. Patologia, São Paulo, 2001.
TABBARA, S.O., HORBACH, N., SIDAWY, M.K., The adequacy of the one-slide
cervical smear in the detection of squamoous intraepithelial lesions. American
Journal Clinical Pathology v.101, p. 647-650, 1994.
TAKAHASHI, M. Atlas Colorido de Citologia do Câncer. 2.ed. São Paulo: Editora
Manole, 1981.
TAKAHASHI, M.; NAITO, M. Applications of the cytorich monolayer preparations
system for cervical cytology: a prelude to automated primary screening. Acta
Cytologica. v. 41, p.1785-1789. 1997.
THE BETHESDA COMMITEE. The Bethesda System for reporting cervical/vaginal
cytologic diagnosis. Acta Cytologica, v.37, p.115-124, 1993.
VAN DYCK, E., MEHEUS, A. Z.; Diagnóstico de laboratório de las enfermedade
de transmissión sexual. Genebra: Organización mundial de la Salud, 2000.
110
VASSILAKOS, P. GRIFFIN, S.; MEGEVAND, E, e CAMPANA, A. Cytorich liquid-
based cervical cytologyc test: screening results in a routine cytopathologyc service.
Acta cytologica, v.42, p.51-55, 2000.
VELASCO, J. Citologia líquida. VPH Hoje. v. 1, p.8-9. 2001
WALBOOMERS, J.M.; JACOB M.V.; MANOS M.M. Human Papilomavirus is a
necessary cause of invasive cervival wordlwide. Journal Pathology v.189, p.12-19,
1999.
WILBUR, D.C. et al. Clinical trials demonstrate an increased detection rate of
abnormal cervical cytologic specimens. American Journal of Clinical Pathology. p.
209-214. 1993.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Cytological screening in the control of cervical
cancer: technical guidelines. Geneva: WHO; 1988.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
