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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ALDOSTERONA E HORMÔNIOS TIREÓIDEOS
REGULAM A EXPRESSÃO DO CANAL DE CLORETO
ClC-2 EM RIM DE RATOS
DÉBORA DOS SANTOS ORNELLAS
TESE DE DOUTORADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO
GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Centro de Ciências da Saúde
Universidade Federal do Rio de Janeiro
AGOSTO / 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Ornellas, Débora dos Santos
Aldosterona e Hormônios Tireóideos regulam a expressão do canal de
cloreto ClC-2 em rim de ratos
Rio de Janeiro: UFRJ; IBCCF; 2006
.
xviii ; 151 fls
Orientador: Marcelo Marcos Morales
Monografia de Doutorado – UFRJ / IBCCF/ Programa de Ciências Biológicas
(Fisiologia)
Referência Bibliográfica: f. 121 – 132
Área de concentração – Fisiologia Renal
1.Expressão gênica 2.Rim 3.Canal de cloreto ClC-2
4.Aldosterona 5.Hormônios tireóideos 6.Volume do fluido
extracelular
I. Morales, Marcelo Marcos II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Celular e Molecular do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro
na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico (CNPq), Financiador de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação Carlos
Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
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“Deus escolheu as cois
as
loucas do mundo para
confundir os sábios; e
Deus escolheu as coisas
fracas do mundo para
confundir as fortes (...)
para que, como está
escrito: Aquele que se
gloria, glorie-se no
Senhor.”
I Coríntios cap.1 vers 28 e 31. NT.
Bíblia Sagrada
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”Porque d’Ele e por Ele e para Ele são todas as coisas.”
A minha Mãe, uma mulher inconfundível e maravilhosa.
A minha família,
Aos meus amigos
Ao meu orientador,
Meu amor e gratidão.
vi
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AGRADECIMENTOS
Mãe, Pai tudo começou por vocês, meu sincero carinho.
Irmãos, amo vocês dois, Juliana e Felipe Mateus Ornellas.
Vó, não precisa chorar...
Tia Vera Lúcia , você é especial para mim.
A toda minha família, um enorme beijo.
Aos amigos que nunca entenderam o que eu faço, mas sempre me apoiaram. Obrigada!
Em especial a todos da Comunidade Paz e Vida.
Aos amigos Ilma Dayse, Cíntia e Fábio por fazerem parte da minha história.
Ao meu orientador que apostou em mim e tornou-se meu amigo durante esta caminhada.
Marcelo, a tese acabou, mas a amizade é para sempre.
Horacio, Ana Carolina e Aline, vocês têm meu carinho especial, porque sou fã de vocês.
Bruno Botelho, meu amigo dos olhos azuis. Consegui !!!
Danielle, minha amiga “chorona”. Conseguimos!!!
Roberta, Vera Tostes e Caroline, minhas queridas “estressadas” amigas. Beijos.
A todos que entendem e compartilham o mesmo sentimento de “tesesofrimento”: Felipe
Prota (cômico), Carolzinha (enfezada), Sabrina (Miss biofísica), Graziela (divertida),
Jackson (sabe Tudo), Juliana (juju festeira), André (faz tudo), Raquel &Tatiana (as
siamesas), Helber (semi-altista),
A todos que passaram pelo laboratório e conseqüentemente por mim, meu sincero obrigada.
A Edna e Luiza por todo apoio, ajuda, alegria, etc, etc. Sem palavras...
Aos professores que colaboraram com esta tese: Tânia Ortiga-Carvalho, Carmem Pazos-
Moura, Denise Pires Carvalho e Regina Goldenberg.
Dizer muito obrigada é “não significativo”. OBRIGADAAAAAA!!!!!!!!!!!!!!!!!
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ALDOSTERONA E HORMÔNIOS TIREÓIDEOS REGULAM A EXPRESSÃO DO
CANAL DE CLORETO ClC-2 EM RIM DE RATOS
Débora dos Santos Ornellas
Orientador: Marcelo Marcos Morales
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção
do título de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia).
A expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 foi estudada em rim de ratos
submetidos a dieta hipersódica, a adrenalectomia com e sem reposição de
aldosterona, e em ratos hiper e hipotireóideos. O RNAm do ClC-2 foi encontrado ao
longo do néfron, com exceção dos segmentos ducto coletor cortical e alça espessa
de Henle medular externa. O RNAm do ClC-2 diminuiu em 64% na alça espessa de
Henle cortical e 43% na alça espessa de Henle medular em dieta hipersódica; em
animais hipertireóideos, aumentou 47% e 56% nos túbulos proximal convoluto e reto,
respectivamente. A proteína do ClC-2 diminuiu 41% em rim de ratos com dieta
hipersódica, 62% em ratos hipotireóideos; e aumentou 63% em ratos hipertireóideos.
A tiroxina aumentou o RNAm do ClC-2, dose-dependente, em cultura primária de
células de túbulo proximal. O promotor do ClC-2 foi estimulado em células de túbulo
proximal em resposta aos hormônios tireóideos.
Camundongos com mutação ∆337T no receptor TRβ que apresentam
características da síndrome de resistência dos hormônios tireóideos apresentaram
menor expressão renal do RNAm do ClC-2 (41% em heterozigotos e 45% em
homozigotos) e da proteína ClC-2 (40% em heterozigotos e 43% em homozigotos)
em rim de camundongos. Esta redução não foi alterada pela indução do
hipotireoidismo.
Concluímos que a expressão gênica do ClC-2 é estimulada por aldosterona e por
hormônios tireóideos em rim de ratos. O estímulo por hormônios tireóideos ocorre
por aumento da transcrição do gene com possível participação do receptor TRβ.
Palavras-chave: Aldosterona, hormônios tireóideos, T
3
, T
4
, ClC-2, canal de cloreto,
rim, túbulo proximal, RNAm, RT-PCR, RPA.
Rio de Janeiro
Agosto / 2006
viii
viii
ABSTRACT
ClC-2 chloride channel is modulate by aldosterone and thyroid hormones in rat kidney
Débora dos Santos Ornellas
Orientador: Marcelo Marcos Morales
Gene expression of the chloride channel ClC-2 was studied in rat kidneys under
high sodium diet, adrenalectomy with and without aldosterone supply and in hyper
and hypothyroid rats. ClC-2 mRNA was found along the nephron with exception of
the cortical collecting duct and outer collecting duct. Under high sodium diet, ClC-2
mRNA decreased 64% in the cortical thick ascending limb of Henle loop and 43% in
the medullar thick ascending limb of Henle loop, respectively; in hyperthyroid rats it
increased 47% and 56% in the proximal convolute and straight tubules, respectively.
ClC-2 protein expression decreased 41% in rat kidneys under high sodium diets and
62% in hypothyroid rats; but increased 63% in hyperthyroid rats. Thyroxin increased
ClC-2 mRNA in primary cell culture of rat proximal tubules, dose-dependent manner.
ClC-2 promoter was stimulated in proximal tubule cells when exposed at the thyroid
hormones.
∆337T TRβ receptor mutate mice, that showed characteristics of the Thyroid
Hormones Resistance Syndrome, had ClC-2 mRNA expression decreased (41%,
heterozygous and 45%, homozygous). A similar decrease was observed in the
protein expression (45%, heterozygous and 44%, homozygous) in mutate mice
kidneys. Hypothyroidism induced in TRβ receptor mutate mice did not interfere in the
standard of ClC-2 expression that continued diminished in mice, without additional
effect.
We can conclude that ClC-2 gene expression is stimulated by aldosterone and
thyroid hormones in rat kidneys. Thyroid hormones increase the gene transcription
with probable participation of the TRβ receptor.
Key words: Aldosterone, thyroid hormones, T
3
, T
4
, ClC-2, chloride channel, kidney,
proximal tubule, mRNA, RT-PCR, RPA.
Rio de Janeiro
August / 2006
ix
ix
Ficha catalográfica........................................................................................................ii
Agradecimentos...........................................................................................................vi
Resumo.......................................................................................................................vii
Abstract......................................................................................................................viii
Sumário........................................................................................................................ix
Índice de figuras.........................................................................................................xiii
Lista de abreviaturas..................................................................................................xvi
I – INTRODUÇÃO
I.1) Regulação do volume do fluido extracelular.......................................................... 2
I.2) A família CLC de canais de cloreto...................................................................... 7
I.3) O canal de cloreto ClC-2..................................................................................... 10
I.4) Problemática 1: Seria o canal de cloreto ClC-2 modulado pela aldosterona em
rins de ratos?........................................................................................................ 18
I.5) Problemática 2: Seria a expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 modulada
pelos hormônios tireóideos em rins de ratos?....................................................... 21
I.6) Problemática 3: Estaria o receptor de hormônio tireóideo do tipo β envolvido na
expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 em rins de ratos?............................ 27
II – OBJETIVOS
II.1) Objetivo geral.......................................................................................................34
III – MATERIAIS E MÉTODOS
III.1) Grupos Experimentais........................................................................................36
III-1.1)Preparação dos ratos adrenalectomizados tratados ou não com
aldosterona.............................................................................................................36
III-1.2) Preparação dos ratos tratados com furosemida..............................................37
III-1.3) Preparação dos ratos hipotireóideos e hipertireóideos...................................38
x
x
III-1.4)Preparação dos camundongos hipotireóideos e hipertireóideos......................39
III-1.5) Camundongos com mutação TRβ...................................................................40
III-2) Métodos
III-2.1) Genotipagem dos animais...............................................................................40
III-3) Excisão Renal.....................................................................................................41
III-4) Microdissecção de túbulos renais......................................................................41
III-5) Extração de RNA-total........................................................................................44
III-6) Transcrição Reversa (RT)..................................................................................44
III-7) Reação de Polimerização em Cadeia (PCR).....................................................44
III-8) Ensaio de proteção contra a RNAse (RNase Protection Assay - RPA)............46
III-8.1) Síntese da Sonda de RNA Marcada...............................................................48
III-8.2) Hibridização da Sonda Marcada com o RNA..................................................49
III-9) “Southern Blotting”..............................................................................................50
III-10)
Immunoblotting”...............................................................................................51
III-11) Cultura primária de células de túbulo proximal de ratos..................................52
III-12) Estudo da região promotora do ClC-2..............................................................53
III-13) Análise dos parâmetros sanguíneos e urinários dos grupos experimentais da
fração de eletrólitos................................................................................................55
III-14) Radioimunoensaio............................................................................................55
III-15) Densitometria...................................................................................................56
III-16) Análise estatística.............................................................................................56
xi
xi
IV- RESULTADOS......................................................................................................58
VI-1) Expressão do RNAm do ClC-2 nas regiões corticais e medulares de rins de
ratos normais através da técnica de ensaio de proteção contra RNAse (RPA).....58
VI-2) Detecção da expressão do RNAm do gene do ClC-2 em diferentes segmentos
do néfron de rato................................................................................................. .60
VI -3) Análise da fração de excreção de eletrólitos em animais tratados com dieta rica
em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de aldosterona.................62
VI-4) Expressão do RNAm do ClC-2 em córtex e medula rim de ratos submetidos a
dieta hipersódica através da técnica de ensaio de proteção contra RNAse
(RPA)......................................................................................................................63
VI-5) Análise da expressão da proteína do ClC-2 em rim total de ratos através da
técnica de “immunoblotting”.................................................................,.................63
VI-6) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos submetidos a diferentes
tratamentos através da técnica de ensaio de proteção contra RNase (RPA)........66
VI-7) Experimentos preliminares à técnica de RT-PCR semiquantitativo...................66
VI-7.1) Determinação do comprimento do néfron necessário para a amplificação ideal
do gene do ClC-2 por RT-PCR..............................................................................66
VI-7.2) Determinação do número ideal de ciclos de PCR a ser utilizado para a
amplificação do RNAm do ClC-2 a partir de 3mm de PST de rato........................67
VI-8) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos em
dieta rica em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de aldosterona
por RT-PCR............................................................................................................70
VI-9) Modulação do RNAm de ClC-2 nos segmentos cTAL e mTAL de ratos tratados
com furosemida......................................................................................................74
xii
xii
VI-10) Determinação das concentrações séricas dos Hormônios Tireóideos em
ratos.......................................................................................................................77
VI-11) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim total de ratos hipotireóideos com ou
sem reposição e hipertireóideos avaliados por RPA..............................................78
VI-12) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos
hipotireóideos com ou sem reposição e hipertireóideos avaliados por RT-
PCR........................................................................................................................79
VI-13) Cultura primária de células de túbulo proximal de rato tratadas com Hormônio
Tireóideo...............................................................................................................84
VI-14) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de ratos controle,
hipotireóideos com ou sem reposição e hipertireóideos.......................................84
VI-15) Análise da região promotora do ClC-2 em cultura de células tratadas com
Hormônio Tireóideo...............................................................................................87
VI-16) Comparação dos parâmetros urinários dos camundongos com mutação no
receptor TRβ.........................................................................................................89
VI-17) Determinação das concentrações séricas dos Hormônios Tireóideos em
camundongos........................................................................................................90
VI-18) Modulação do RNAm do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos com
ou sem reposição hormonal e hipertireóideos por RT-PCR..................................90
VI-19) Modulação da proteína do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos com
ou sem reposição hormonal e hipertireóideos por “immunoblotting”.....................91
VI-20) Modulação do RNAm em camundongos com mutação no receptor TRβ........95
VI-21) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor TRβ......................................................................................95
xiii
xiii
VI-22) Modulação da expressão RNAm do ClC-2 em camundongos com mutação no
receptor TRβ tratados com metimazol..................................................................98
VI-23) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor TR-β tratados com metimazol.............................................98
V – DISCUSSÃO
V-1) Ação do hormônio aldosterona sobre a expressão gênica dos canais de cloreto
ClC-2 em rim de rato.................................................................................................102
V-2) Ação dos hormônios tireóideos sobre a expressão gênica do canal de cloreto
ClC-2 em rim de rato.................................................................................................106
VI – CONCLUSÃO...................................................................................................115
VIII – SOLUÇÕES UTILIZADAS..............................................................................117
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................121
VII –TRABALHOS PUBLICADOS...........................................................................134
xiv
xiv
FIGURAS E TABELAS
FIGURAS
Figura 1: Figura representativa do ClC-2.................................................................. 11
Figura 2. Conformação de abertura e fechamento do canal de cloreto ClC-2.......... 13
Figura 3: Ligação dos receptores de hormônios Tireóideos...................................... 29
Figura 4: Estrutura primaria representando os domínios funcionais dos receptores
nucleares ...............................................................................................................29
Figura 5: Estrutura primaria das diferentes isoformas codificadas pelos genes
receptores do hormônio tireóideo ..........................................................................31
Figura 6: Representação esquemática do mecanismo de ação do receptor do
hormônio tireóideo .................................................................................................32
Figura 7: Figura representativa do néfron...................................................................43
Figura 8: Clonagem e linearização do DNA............................................................... 47
Figura 9: Distribuição do RNAm do ClC-2 entre córtex, medula externa e medula
interna de rim de rato por Ensaio de Proteção contra Rnase
(RPA)......................................................................................................................59
Figura 10: Detecção do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de rato por RT-PCR....61
Figura 11: Expressão do RNAm do ClC-2 em grupos controle e 5d-Na
+
por RPA....64
Figura 12: Expressão da proteína do ClC-2 em ratos tratados 5d-Na
+
por
“immunoblotting”.....................................................................................................65
Figura 13: Expressão do RNAm do ClC-2 em grupos controle, ADX e ADX+ALDO
por RPA..................................................................................................................68
Figura 14: Determinação do comprimento do néfron para amplificação ideal do ClC-2
e β-actina na mesma reação de RT-PCR..............................................................69
xv
xv
Figura 15: Determinação do número de ciclos necessários néfron para amplificação
ideal do ClC-2 e β-actina na mesma reação de RT-PCR......................................69
Figura 16: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em túbulo proximal reto
(PST)......................................................................................................................71
Figura 17: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção espessa medular
da alça de Henle (mTAL).......................................................................................72
Figura 18: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção espessa cortical
da alça (cTAL)........................................................................................................73
Figura 19: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em cTAL tratados com
furosemida..............................................................................................................75
Figura 20: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em mTAL tratados com
furosemida..............................................................................................................76
Figura 21: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos por
RPA........................................................................................................................78
Figura 22: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em diferentes segmentos do
néfron por RT-PCR................................................................................................80
Figura 23: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em túbulo proximal
convoluto (PCT).......................................................................... ..........................81
Figura 24: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em PST............................82
Figura 25: Segmentos sem a expressão de ClC-2: ducto coletor cortical (CCD) e
medular externo (OMCD).......................................................................................83
Figura 26: Modulação da expressão do ClC-2 em cultura primária de PCT..............85
Figura 27: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de rato................86
Figura 28: Análise da região promotora do ClC-2......................................................90
xvi
xvi
Figura 29: Determinação da concentração necessária para amplificação por RT-PCR
em camundongos.......................................................................................................91
Figura 30: Determinação do número de ciclos necessário para amplificação por RT-
PCR em camundongos...............................................................................................91
Figura 31: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em rim de
camundongos.............................................................................................................92
Figura 32: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de
camundongos.............................................................................................................93
Figura 33: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor β................................................................................................94
Figura 34: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de camundongos
com mutação no receptor β........................................................................................96
Figura 35: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor β tratados com metimazol.........................................................98
Figura 36: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de camundongos
com mutação no receptor β tratados com metimazol.................................................99
TABELAS
Tabela 1: as seqüências e localizações dos oligonucleotídeos..................................49
Tabela 2: Fração de excreção de eletrólitos em animais tratados com dieta
hipersódica, adrenalectomizados com ou sem reposição..........................................62
Tabela 3: Concentrações séricas de Hormônios Tireóideos em ratos.......................77
Tabela 4: Fração de excreção de eletrólitos de camundongos com mutação no
receptor TRβ...............................................................................................................89
x
vii
xvii
Tabela 5: Concentrações plasmáticas de Hormônios Tireóideos em camundongos
com mutação no receptor TRβ...................................................................................92
xviii
xviii
LISTA DE ABREVIATURAS
Na
+
-5d – dieta rica em sódio por cinco dias
ADX – adrenalectomia
ADX+ALDO – adrenalectomia com reposição de aldosterona
AMPc – adenosina monofosfato cíclico
ATP – adenosina trifosfato
CaCo-2 – células intestinais tumorais humanas
CFTR – canal de cloreto transmembrana regulador da condutância e envolvido na
doença fibrose cística (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)
ClC-2 – canal de cloreto – 2 (chloride channel – 2)
cTAL – porção cortical espessa ascendente da alça de Henle
DCC – ducto coletor cortical
DEPC – Dietil pirocarbonato
ENaC – canal de Na
+
epitelial
FAN – Fator natriurético atrial
FEC – fluido extracelular
GMPc – guanosina monofosfato cíclico
HETE – heterozigoto
HOMO - homozigoto
HIPO – hipotireóideo
HIPO + T4 – hipotireóideo com reposição de T4
HIPER - hipertireoideo
HL – alça de Henle
IMCD – duto coletor medular interno
LBD – Domínio de Ligação ao Ligante
kDa - quilodalton
MBL –membrana basolateral
ML – membrana luminal
MMI - metimazol
NBD – domínio de ligação de nucleotídeo
NKCC – co-transportador Na
+
/K
+
/2Cl
-
xix
xix
OMCD – ducto coletor medular externo
PKA – proteína quinase dependente de AMPc
PKC – proteína quinase dependente de Ca
+2
PKG – proteína quinase dependente de GMPc
pS – pico Siemens. Unidade de dimensão da condutância elétrica que leva em
consideração: distância percorrida (em metros), pela massa de uma partícula (em
quilos), por tempo (em segundos) e a corrente elétrica (em ampére).
PCT – túbulo proximal convoluto
PST – Túbulo proximal reto
RNAm – RNA mensageiro
RPA – Ensaio de Proteção contra RNases
RT-PCR – transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase
T
3
– 3,3’,5 - triiodotironina
T
4
– 3,3’,5,5’ – tetraiodotironina ou tiroxina
TMD – domínio transmembrana
TRα – Receptor de hormônio tireóideo alfa
TRβ – Receptor de hormônio tireóideo beta
TSH – Hormônio Estimulante da Tireóide
TRH – Hormônio Liberador de Tireotrofina
RHT - Resistência ao Hormônio Tireóideo
INTRODUÇÃO
2
2
I-1) Regulação do volume do fluido extracelular
Em indivíduos normais, a composição do fluido corporal, seu volume e a sua
distribuição entre os diversos compartimentos devem permanecer dentro de faixas
estreitas de variações (Jacobson & Rector, 1990). Esse equilíbrio depende do
balanço de água e sais que são ingeridos e excretados diariamente pelo organismo.
Assim, os principais órgãos envolvidos com a regulação do volume do fluido
extracelular (VFEC) são o trato gastro-intestinal e os rins, por serem os principais
responsáveis, respectivamente, pela absorção e pela excreção de sais e água
(Cowley & Roman, 1996).
O volume do fluido extracelular compreende o volume de fluidos contidos nos
compartimentos intersticiais, linfáticos e vasculares. A regulação do volume contido
dentro dos vasos está relacionada com o controle de um dos mais importantes
parâmetros hemodinâmicos, a pressão arterial sistêmica que deve ser mantida
dentro dos limites normais para a devida irrigação dos vários tecidos e órgãos. Além
do controle do volume intravascular circulante, a pressão arterial também pode ser
alterada por variações do tônus vascular e da força de contração cardíaca.
Sabemos que o volume do fluido extracelular é mantido através da regulação da
massa de sódio contida nesse compartimento, pois o sódio (Na
+
) é o cátion
osmoticamente ativo mais abundante nesse meio. Cerca de 20% do peso corpóreo
corresponde ao fluido extracelular (FEC), sendo que mais de 90% de sua
osmolaridade é devida aos sais de sódio, posto que este é um íon tipicamente
extracelular que, geralmente está acompanhado por quantidades equimolares de
cloreto (Cl-). (Macknight & cols., 1977).
Alterações na ingestão de cloreto de sódio (NaCl), ou dos mecanismos de sua
excreção através do epitélio renal, podem estar relacionadas com a gênese de
3
3
distúrbios do volume do fluido extracelular tais como a hipertensão arterial sistêmica
ou a hipotensão, entre outras doenças (Chonko & cols., 1977).
Nos rins, a excreção do NaCl filtrado pelos glomérulos depende, em grande
parte, de fatores endócrinos e parácrinos que agem sobre transportadores iônicos
presentes ao longo do néfron (Yucha & Keen, 1996). Alterações dos níveis
circulantes e locais de substâncias natriuréticas (fator atrial natriurético, bradicinina,
adenosina) e anti-natriuréticas (angiotensina, vasopressina, aldosterona, hormônios
tireóideos) estão associadas a mudanças do volume extracelular e a modificações na
atividade e na expressão dos transportadores iônicos renais (Repke & cols., 1995;
Morales & cols. 1996).
Os mineralocorticóides, que são representados primordialmente pela aldosterona,
possuem ação importante na dinâmica de transporte de Na
+
no epitélio renal
diminuindo a excreção de Na
+
pela urina, mas também pela saliva, pelo suor e pelas
fezes (Guyton, 1989). Em condições normais, a massa de Na
+
eliminada pelo suor e
pelas fezes é desprezível, sendo os rins os principais efetores dessa excreção
(Dusing & cols., 1976). A liberação da aldosterona, produzida no córtex adrenal,
depende de um refinado controle que envolve a liberação da renina pelas células
justaglomerulares. A renina liberada age sobre o substrato angiotensinogênio,
produzido no fígado, dando origem a um decapeptídeo, a angiotensina-I que, sob a
ação da enzima conversora de angiotensina, localizada em endotélio, principalmente
pulmonar, é transformada no octapeptídeo angiotensina-II. A angiotensina II, além de
agir no rim promovendo a reabsorção de sódio no segmento do túbulo proximal,
promove no córtex adrenal a liberação da aldosterona. A aldosterona tem como
função principal estimular a reabsorção de sódio, principalmente, através dos
segmentos distais do néfron (Work & Jamison, 1987), onde promove o aumento da
4
4
permeabilidade luminal ao Na
+
através de canais de sódio conhecidos como Canais
de Sódio Epiteliais (ENaC) (Garthy & Palmer, 1997) concomitantemente, à secreção
de potássio (K
+
) e hidrogênio (H
+
). A reabsorção de Na
+
leva ao aumento da
osmolaridade plasmática com conseqüente estímulo à liberação e secreção do
hormônio antidiurético e a maior reabsorção de água nos túbulos distais convolutos e
ductos coletores, além de estimular a ingestão hídrica.
Por outro lado, o principal hormônio relacionado com a excreção de sódio pelos
rins é o fator natriurético atrial (FAN). Este peptídeo é produzido pelos miócitos
atriais e o estímulo para a sua liberação na corrente sanguínea é o aumento do
volume efetivo de sangue que chega aos átrios. A expansão dos átrios em situações,
como o aumento do volume do fluido extracelular, promove a liberação e a produção
do FAN pelos miócitos atriais. O fator atrial natriurético circulante tem como principal
ação inibir a reabsorção de Na+ na porção medular interna (IMCD) e medular
externa (OMCD) do ducto coletor e, desta forma, favorece a diurese (Aires, 1999).
Além disso, o FAN promove a vasodilatação sistêmica dos vasos (com exceção da
arteríola eferente), aumenta a filtração glomerular devido ao relaxamento das células
mesangiais que compõe o tufo glomerular e inibe a liberação de renina e
aldosterona.
No entanto, os hormônios tireóideos a tiroxina (3,5,3’,5’–tetraiodo-L-tironina ou T4)
e a triiodotironina (3,5,3’ - triiodo-L-tironina ou T3) (Griffin, 2000), também estão
relacionados com a regulação do volume do fluido extracelular.
Os hormônios tireóideos são conhecidos por participarem de maneira bastante
importante durante o crescimento e desenvolvimento e também por serem
hormônios envolvidos com o metabolismo (Griffin, 2000).
5
5
Por outro lado, os hormônios tireóideos também participam do controle do
equilíbrio hidroeletrolítico modulando a reabsorção de NaCl pelos rins, por aumento
ou diminuição de suas concentrações séricas (Azuma & cols., 1996). Alterações no
balanço hidroeletrolítico foram observadas em indivíduos hipertireóideos (aumento
da concentração plasmática circulante de T
3
e T
4
) e hipotireóideos (diminuição da
concentração plasmática circulante de T
3
e T
4
)
.
Os efeitos da disfunção da tireóide
sobre os rins incluem mudanças no fluxo sanguíneo renal (por aumento do débito
cardíaco), ritmo de filtração glomerular (por aumento do fluxo), capacidade de
absorção e de secreção tubular (por aumento da permeabilidade paracelular),
transporte de eletrólitos (por aumento da atividade dos transportadores de Na
+
) e
estrutura renal (Katz, 1975; Kinsella, 1985; Davis, 1983; Baum & Quigley, 2003;
Morales & cols., 1996; Alcade & cols. 1999; Klein & cols., 2001).
A presença no rim dos receptores nucleares específicos para hormônios
tireóideos (TRα
1
,TRβ
1
e TRβ
2
,) indica a existência de uma ação direta destes sobre
a função renal (Shahrara & cols., 1999). No rim, foi observado que os hormônios
tireóideos podem agir sobre a atividade e expressão da Na
+
/K
+
-ATPase, enzima
importante na reabsorção de grande massa de Na
+
pelos rins (Katz & cols.,1975).
Outros transportadores renais de Na
+
, tais como o trocador Na
+
/H
+
, e o transportador
Na
+
-Pi também possuem suas atividades e expressões aumentadas no
hipertireoidismo e diminuídas no hipotireoidismo (Morales & cols., 1996; Alcalde &
cols., 1999).
Watanabe e colaboradores, utilizando a técnica de ensaio de proteção contra
RNases e “patch-clamp”, observaram diminuição da expressão do RNAm e da
atividade do canal de Ca
+2
tipo L no coração de ratos hipertireóideos, o que pode
acarretar o aumento do tempo de duração do potencial da ação dos miócitos,
6
6
retardando a propagação do impulso elétrico no miocárdio, e pode originar uma
arritmia (desordem da condução do impulso elétrico no miocárdio) (Watanabe &
cols., 2003).
Como vimos até o momento, várias evidências experimentais mostram a ação de
hormônios sobre o transporte renal de Na
+
que é o principal cátion osmoticamente
ativo presente no meio extracelular. Porém, o Cl
-
é o principal ânion do fluido
extracelular e assim, os mesmos mecanismos que controlam o transporte de Na
+
devem estar relacionados com o transporte de Cl
-
(Hamlyn & Blaustein, 1986;
Gottschalk, 1988; Terry, 1994).
Neste trabalho será enfatizada a possível ação da aldosterona e dos hormônios
tireóideos sobre os transportadores de Cl
-
presentes nas células do epitélio renal. É
importante ressaltar que grande parte do Cl
-
filtrado pelo glomérulo é reabsorvida
juntamente com o Na
+
ao longo do néfron por mecanismos ativos e passivos.
A maior parte do NaCl é reabsorvida ao longo do túbulo proximal (50 –70%). No
segmento espesso da alça de Henle ocorre a reabsorção de 20 – 25% do NaCl, e no
segmento distal há reabsorção de cerca de 5%. Ao longo do ducto coletor ocorre a
reabsorção de aproximadamente 4% do NaCl e essa porcentagem pode variar
dependendo das necessidades do organismo através da ação, principalmente, de
hormônios. Assim, menos de 1% de Cl
-
, filtrado pelo glomérulo, é excretado através
da urina (Gögelein, 1988; Strange & cols., 1996; Franciolini & Petris, 1990; Fong &
Jentsch, 1995).
A reabsorção de Cl
-
ao longo do néfron dá-se por duas vias principais: a
paracelular e a transcelular. O transporte transcelular de Cl
-
através do epitélio renal
acontece a favor de gradiente eletroquímico, e é mediado por proteínas existentes
tanto nas membranas luminais como nas basolaterais. Esse transporte pode estar
7
7
acoplado ao de Na
+
, ao de K
+
ou ao de bicarbonato (HCO
3
-
), ocorrendo também
através de canais iônicos (Rocha & Kudo, 1990; Singh & cols., 1995). Dentre os
vários transportadores de Cl
-
destacamos os canais que, no rim, estão presentes em
diversos tipos celulares (Jentsch & cols., 1990; Linsdell & cols., 1997; Jentsch &
cols., 2002;). Estes canais têm sido caracterizados com a ajuda de técnicas
eletrofisiológicas, bioquímicas e de biologia molecular, o que tem permitido a
compreensão de suas funções e dos fatores que os modulam (Franciolini & Petris,
1990; Fong & Jentsch, 1995; Strange & cols., 1996 & Gögelein, 1998).
Neste trabalho, dentre os diversos canais de cloreto presentes no rim,
destacamos um canal bastante expresso ao longo do epitélio renal e que não possui
função fisiológica totalmente esclarecida neste órgão, o canal de cloreto ClC-2. O
ClC-2 foi primeiramente associado ao desenvolvimento pulmonar fetal (Murray &
cols., 1995) e, posteriormente, à participação na regulação do volume celular
(Thiermann & cols.,1992).
I-2) A família CLC de canais de cloreto
O ClC-2 é um canal de cloreto pertencente à família CLC de transportadores que
foram identificados pela equipe do Dr. Thomas Jentsch no início da década de 90
(Jentsch & cols., 1990). O primeiro canal desta família foi clonado a partir do órgão
elétrico do peixe Torpedo denominado de ClC-0; em mamíferos, apresenta a
expressão bastante abundante no músculo esquelético, onde participa da
estabilização da voltagem celular.
Os membros da família CLC foram encontrados em diferentes espécies, tais
como, bactérias, leveduras, plantas e animais invertebrados e vertebrados.
Atualmente, já foram encontrados nove subtipos de genes da família CLC em seres
8
8
humanos. Os canais pertencentes à família CLC podem estar expressos no mesmo
tecido, simultaneamente, tal como ocorre com o ClC-2, ClC–3, ClC-4, ClC-5, ClC-6 e
ClC-7, enquanto outros, tais como o ClC-1 e o ClC-Kb estão expressos de maneira
específica em alguns tecidos de mamíferos (Thiermann & cols., 1992; Wills e cols.,
2000; Maduke & cols., 2000). Os canais de Cl
-
dependentes de voltagem regulam a
passagem transcelular do Cl
-
, participando de várias funções incluindo-se a
regulação de volume celular (através de estrita regulação da concentração
intracelular de íons), a estabilização do potencial de membrana e a transdução de
sinal elétrico. As mutações nos genes da família CLC têm sido associadas a várias
doenças como as miotonias, síndrome de Bartter do tipo III, Doença de Dent,
nefrolitíase recessiva ligada ao cromossomo-X e diabetes insípidus.
O canal ClC-1, abundantemente expresso em músculo esquelético, está
associado à forma recessiva e dominante de miotomia (ou distrofia muscular) (Pusch
& Jentsch, 1994; Jentsch & Grünther, 1997). Acredita-se que a causa da miotonia
distrófica, pelo menos em parte, é devida a uma anormalidade ou redução na
expressão dos canais de cloreto ClC-1 das células musculares (Mandoki & cols.,
2002). A disfunção nos canais de cloreto aumenta o tempo de relaxamento muscular
após uma contração voluntária causando sucessivos disparos de potenciais de ação
levando as fibras musculares a um estado de hiper-excitabilidade.
O canal ClC-K, apresenta-se exclusivamente expresso no rim e trato urinário,
sendo as isoformas ClC-K1 e ClC-K2 encontrados em epitélio renal de rato e as
isoformas ClC-Ka e ClC-Kb encontrados em humanos, e podem estar envolvidos na
fisiologia e fisiopatologias renais. A equipe do Dr. Simon (Simon & cols., 1997),
através do uso de técnicas de biologia molecular, descobriu o envolvimento de
mutações do ClC-Kb com o surgimento da síndrome de Bartter do tipo III, que tem
9
9
como características principais à perda urinária de sal, alcalose hipocalêmica e a
hipotensão.
A função fisiológica do canal ClC-K1 foi estudada em modelos de camundongos
com mutação inativante neste gene. Os camundongos homozigotos são
aparentemente normais, porém produziram cinco vezes mais urina que os
camundongos heterozigotos e os normais. Estes camundongos homozigotos,
quando submetidos à privação de água por 24h sofreram severa desidratação, com
perda de 27% do peso corporal, e após receberem um agonista da vasopressina (ou
hormônio antidiurético) via intraperitoneal, apresentaram um mínimo aumento na
osmolaridade da urina, um quadro bastante parecido com o apresentado no diabete
insípidus nefrogênico (Matsumura & cols., 1999).
O ClC-5, a princípio, acreditava-se estar expresso exclusivamente no rim, porém
ele foi encontrado, também, em epitélio de vias aéreas, da retina, da aorta e em
células de músculo liso (Silva & cols., 2000; Wills & cols., 2000). A função do canal
ClC-5 tem sido estudada em camundongos nocautes para o gene do ClC-5, que
apresentam fenótipo similar a Doença de Dent (caracterizada por proteinúria de
baixo peso molecular, calciúria e formação de cálculos renais em humanos) ou
nefrolitíase hereditária. Porém, os mecanismos fisiológicos que resultam nesta
síndrome ainda não estão bem estabelecidos (Silva & cols., 2000; Waldegger &
Jentsch, 2000; Wills & cols., 2000).
O canal de cloreto ClC-7 está presente em tecidos diferentes, porém, em
contraste com os demais membros de sua família, encontra-se principalmente em
membranas de organelas intracelulares tais como os lisossomos e os endossomos
(Kornak & cols., 2001). Sua deficiência está associada ao aumento da deposição de
cálcio nos ossos, pois as células do tecido ósseo ficam incapazes de realizar a
10
10
reabsorção óssea (Pusch & Jentsch, 1994; Jentsch & Grünther, 1997). Kornak e
colaboradores (2001), construíram um camundongo que possui uma mutação
inativante no gene ClC-7 que apresentou todas as características de osteopetrose,
doença caracterizada pelo aumento generalizado da densidade óssea devido à
deficiência do processo fisiológico de sua reabsorção (Smith, 1982). Além disso, este
camundongo, devido a essa deficiência, não forma medula óssea capaz de produzir
células hematopoiéticas. Também foram realizados estudos em lisossomos de
osteoclastos (células do tecido ósseo responsáveis pela reabsorção óssea) destes
camundongos mutantes para ClC-7, e foi observado que esses osteoclastos foram
incapazes de acidificar o espaço extracelular. A prova cabal do envolvimento do ClC-
7 com a osteopetrose ocorreu com os estudos que demonstraram mutações no gene
ClC-7 em pacientes portadores de osteopetrose maligna infantil (Kornak & cols.,
2001).
No entanto, alguns destes canais como, o ClC-3, o ClC-4, o ClC-K2 e o ClC-2 não
possuem funções fisiológicas completamente elucidadas (Jentsch & cols., 1995).
I-3) O canal de cloreto ClC-2
Através das técnicas de “northen blotting” e imuno-histoquímica, foi possível
observar que o canal de cloreto ClC-2, alvo de nosso estudo, é abundante em
diversos tecidos, tais como: músculo esquelético, coração, cérebro, pulmão,
pâncreas, rim, estômago e intestino (Landry & cols., 1989). Além disso, a localização
deste canal de Cl
-
em células polarizadas pode ser tanto nas membranas apicais
quanto nas basolaterais (Thiemann & cols., 1992). Dr. Thiemann e colaboradores,
em 1992, através de métodos envolvendo biologia molecular e imuno-histoquímica,
mostraram que este canal possui uma expressão bastante abundante no rim, tanto
11
11
de seu RNAm quanto da sua proteína correspondente. A proteína correspondente ao
gene ClC-2 é um homodímero de 99 KDa que possui 907 aminoácidos (Jentsch &
Grünther, 1997). A estrutura molecular, atualmente aceita, descreve uma proteína
composta por onze domínios transmembranais, um domínio extracelular e um
domínio intracelular sendo que suas porções tanto amino quanto carboxi-terminais
encontram-se no citoplasma (Figura 1) (Jentsch & Grünther, 1997; Wills & Fong,
2001). No entanto, alguns autores divergem sobre a exata posição do quarto
domínio da proteína do ClC-2. Enquanto uns postulam que este domínio esteja
inserido na membrana plasmática (Jentsch & cols., 1990) outros sugerem que esteja
presente extracelularmente (Schmidt-Rose & Jentsch, 1997), porém a exata
localização deste domínio ainda não foi determinada.
O ClC-2 possui características moleculares e eletrofisiológicas distintas que o
identificam. Dentre as principais características eletrofisiológicas desse canal
podemos citar a maior permeabilidade ao cloreto em relação aos outros íons
halogênios, tais como o brometo e o iodeto (Cl>>Br >I) (Pusch & Jentsch, 1994).
Experimentos envolvendo técnicas eletrofisiológicas de “patch-clamp” mostraram que
o canal de cloreto ClC-2 tem uma condutância de 2 a 3 pS (pico Siemens) para o Cl
-
(Lorenz & cols., 1996) e essa condutância está vinculada à região N-terminal
(Gründer & cols., 1992b). Esses autores, ainda sugeriram, através desse
experimento, que o mecanismo de abertura e inativação do ClC-2 pode ser
dependente de um domínio N-terminal que se ligaria como uma “bola” na alça
citoplasmática entre as regiões transmembranais D7 e D8 (Para melhor
compreensão ver figura 2). Este modelo seria semelhante ao proposto para os
canais de potássio, onde o domínio citoplasmático funciona como uma bola aderida
a uma corrente que ao ser movimentada pode bloquear e desbloquear o canal
12
12
(modelo conhecido como “ball-and-chain”) (Hoffmann & Simonsen, 1989; Gründer &
cols., 1992a; Jentsch & cols., 1995).
ClC-2
Figura 1:
Figura representativa do modelo atual
mente aceito para a
proteína correspondente ao canal de cloreto ClC-
2 e sua disposição na
membrana plasmática (Wills & Fong, 2001).
Figura 2. Provável c
onformação de abertura e fechamento do canal de cloreto
ClC-2. Molecular Biology of the Cell ed 4
th
.
13
13
O ClC-2 também pode ter 50% de sua condutância bloqueada por alguns dos
conhecidos inibidores de canais de cloreto tais como o ácido carboxílico antracênico
(9-AC) e o difenilaminocarboxilato na concentração de 1mM. Porém, o DIDS (ácido
2, 2’ disulfônico – 4, 4’ diisotiociano), outro conhecido bloqueador de condutâncias
de Cl
-
, na concentração de 1mM, não provoca alteração da condutância do ClC-2
(Thiermann & cols., 1992). Outra característica da corrente elétrica gerada pela
permeabilidade ao Cl
-
através do ClC-2 é a linearidade da relação entre corrente e
voltagem quando células são submetidas a voltagens menores de –50 mV. Acima de
–50 mV não há aumentos consideráveis de corrente através do canal e, portanto,
não obedece ao padrão linear. Esse padrão é mantido quando células são
submetidas a meios hipotônicos (Gründer & cols., 1992a).
Outra característica do ClC-2 é o comportamento de sua condutância que pode
ser estimulada pelo aumento do volume celular, pela diminuição do pH no meio
extracelular, pela hipotonicidade, pela hiperpolarização ou pelo aumento das
concentrações intracelulares de cloreto (Jentsh & cols., 1999).
Foi observado, através de clampeamento de voltagem realizado em oócitos de
“Xenopus” injetados com RNAm do ClC-2 de rato, que a condutância do ClC-2 em
situação de hiperpolarização se mostra aumentada em voltagens bastante negativas
(entre -90 mV e -180 mV) (Thiermann & cols., 1992). No entanto, estes valores estão
fora dos padrões fisiológicos e o ClC-2 tenderia a estar sempre fechado. Dessa
forma, sugeriram-se outras formas de estímulo ao aumento da condutância por este
canal.
A condutância ao cloreto pelo ClC-2 encontrava-se aumentada em oócitos de
Xenopus injetados com RNAm do ClC-2 de ratos quando esses foram submetidos a
um banho com solução hipotônica (Gründer & cols., 1992a). A condutância ao
14
14
cloreto, através do ClC-2, também se mostrou aumentada quando oócitos que
expressavam o ClC-2 murino foram submetidos a pH ácidos (6,5 e 7,0). Porém,
quando os oócitos que expressavam o ClC-2 murino foram submetidos a pHs mais
alcalinos (8,0 e 8,5) a condutância através do ClC-2 mostrou-se inibida em relação
ao controle submetido ao pH de 7,5 (Jordt & Jentsch, 1997). Estes experimentos
foram realizados dentro da mesma faixa de voltagem fisiológica do experimento
realizado por Gründer e colaboradores.
Assim, a abertura do canal pode ser induzida em valores de voltagem
considerados dentro da faixa fisiológica. Logo, é plausível considerar o ClC-2 como
tendo papel relevante ao longo do epitélio renal o qual é constantemente submetido
a variações tanto de voltagem transepitelial quanto de pH.
A ativação do ClC-2, em presença pH ácido, dependente da fosforilação por
PKA foi observada em epitélio renal de humano e coelhos, mas não em epitélio de
ratos (Cuppoletti & cols., 2004).
Murray e colaboradores sugeriram um possível papel fisiológico para o ClC-2
quando observaram que a proteína localizava-se ao longo da superfície apical das
vias aéreas fetais de rato era abundante do meio até o final da gestação, no entanto,
diminuía bruscamente após o nascimento. Devido à sua localização apical e
abundância no epitélio pulmonar, o ClC-2 pode estar envolvido na secreção de fluido
durante a morfogênese normal do pulmão. Os estudos por eles realizados
demonstram a importância do ClC-2 no desenvolvimento embrionário dos pulmões
de ratos (Murray & cols., 1995).
Huber e colaboradores (1998) mostraram a importância do ClC-2 no
desenvolvimento do sistema urinário através de técnicas de biologia molecular em
cultura primária de células de ducto ureteral e ducto coletor cortical de diferentes
15
15
estágios embrionário e pós-natal de ratos. Eles observaram que o RNAm para o
ClC-2 aumentou entre o estágio embrionário do dia 15 até o dia 17, ocorrendo um
pico da expressão do RNAm do ClC-2 entre o dia 17 do estágio embrionário e o dia 3
após o nascimento, e ainda que o RNAm diminui entre os dias 3 e 6 após o
nascimento, sugerindo a participação do ClC-2 na morfogênese de estruturas do
sistema urinário.
Em experimentos de ensaio de “Whole-Cell Patch-Clamp” realizados em
culturas de células IB3-1 (células epiteliais imortalizadas oriundas das vias
respiratórias de pacientes com fibrose cística) transfectadas com o gene do ClC-2,
foi possível observar que as variações de pH e tonicidade estimularam o transporte
de Cl
-
pelo ClC-2 (Schwiebert & cols., 1998). Este trabalho sugeriu que o canal de
cloreto ClC-2 poderia ser uma possível via alternativa no tratamento da doença
pulmonar denominada fibrose cística que é causada pela mutação de um outro canal
de cloreto pertencente à família ABC de transportadores (ATP binding cassete
proteins). Em camundongos nocautes para ambos os genes, CFTR e ClC-2,
surpreendentemente, não há piora das alterações que normalmente são encontrados
nos tecidos severamente afetados pela doença fibrose cística. E, ao contrário do
esperado, estes animais sobreviveram por mais tempo que os animais com
disfunção somente para o gene do CFTR (Zdebik & cols., 2004).
Outros experimentos, agora utilizando, células da linhagem CaCo-2 (células de
carcinoma de cólon humano) demonstraram que o ClC-2 é capaz de contribuir para a
secreção de Cl
-
no epitélio intestinal humano. As células da linhagem CaCo-2 foram
transfectadas com RNAm antisense do ClC-2 (fitas antisense de RNAm tem a
capacidade de inibir a tradução do produto normal de RNAm da célula) e, após
análise por “patch clamp”, exibiram menor secreção de Cl
-
. Neste mesmo trabalho,
16
16
através de microscopia confocal, foi possível demonstrar que o ClC-2 está localizado
na membrana apical das células epiteliais do intestino (Mohammad-Panah & cols.,
2001).
Também foi evidenciado que o ClC-2 pode influenciar na concentração
citoplasmática de Cl
-
em neurônios, e influenciar nos potenciais de ação neuronais,
especulando-se que o funcionamento inadequado deste canal causaria epilepsia,
embora os animais nocautes para ClC-2 não apresentem convulsões. No entanto a
mutação do ClC-2 foi encontrada em três famílias que apresentavam o distúrbio. Em
astrócitos de camundongos nocautes para ClC-2, a corrente de Cl
-
foi abolida,
mostrando que esse canal pode ser importante na função no sistema nervoso
(Nobile & cols., 2000).
A evolução das técnicas de biologia molecular tem auxiliado na determinação do
real papel dos diversos genes. A construção de um camundongo nocaute para o
gene do ClC-2 pelo grupo de Bösl, em 2001, tem auxiliado na caracterização do
papel do ClC-2 no organismo. Os animais nocaute para o ClC-2 são viáveis,
possuem desenvolvimento normal, são férteis, apresentam concentrações hormonais
idênticas às dos animais selvagens e não mostram alterações físicas ou qualquer
alteração de comportamento (Bösl & cols., 2001). Também foram avaliadas, nesses
animais as concentrações séricas dos diferentes eletrólitos, com as concentrações
séricas de marcadores de função renal, pancreática e hepática. Todos esses
parâmetros mostraram-se normais, comparáveis aos encontrados nos animais
selvagens. Entretanto, há duas alterações que são mais pronunciadas em animais
nocautes do ClC-2: as degenerações dos túbulos seminíferos, assim como
diminuição do calibre desses túbulos, apesar de apresentarem espermatogênese
normal até a terceira semana de vida; e uma intensa e rápida degeneração das
17
17
células fotorreceptoras da retina, o que leva os animais à cegueira 30 dias após o
nascimento.
Isoformas do ClC-2 podem ser vias alternativas de transporte de Cl
-
em alguns
tecidos. A formação de “splicing” alternativos é uma opção de transportadores
provindos do mesmo gene com algumas funções alteradas. Um “splicing” alternativo
do ClC-2 menor em 20 pb (10 aminoácidos), comparado com o ClC-2 nativo, foi
identificado em intestino de porco. As diferenças funcionais entre ambos foram
detectadas por expressão heteróloga em células HEK-293 (linhagem de células
imortalizadas embrionárias de rim), sendo observado uma diferença na desativação
do canal. O canal truncado é mais rápido no transporte de Cl
-
porque possui uma
modificação no seu domínio NH
2
-terminal o que parece alterar seu funcionamento
(Cid & cols., 2000). Um outro “splicing” alternativo do ClC-2, identificado no coração
de rato (Britton & cols., 2005), tem menos 45pb (15 aminoácidos) e tem propriedades
cinéticas muito similares ao ClC-2 nativo.
I-4) Problemática 1: Seria o canal de cloreto ClC-2 modulado pela
aldosterona em rins de ratos?
A maior parte de NaCl filtrado nos glomérulos é reabsorvida ao longo dos vários
segmentos do néfron, sendo que nos túbulos proximais, distais e alça de Henle a
reabsorção de NaCl é proporcional à quantidade filtrada. Em contrapartida, ao longo
do sistema coletor, composto pelas porções cortical, medular externa e medular
interna, a reabsorção de NaCl é dependente de uma fina regulação hormonal e tem
papel muito importante na manutenção da volemia (Reineck & Stein, 1997). Essa
regulação se dá através de vários hormônios, dentre os quais destaca-se o papel da
aldosterona, que atua aumentando a reabsorção renal de Na
+
. A liberação deste
18
18
hormônio pelo córtex da adrenal depende, principalmente, do sistema renina-
angiotensina (Aires, 1999). O estímulo para a liberação de renina após a ativação do
sistema renina-angiotensina nas células renais ocorre em estado de hipovolemia (por
percepção de baixa pressão de perfusão renal) e também por estímulos do sistema
nervoso autônomo agindo de maneira direta sobre as células justaglomerulares
através de sinapses (Barajas & Muller, 1973, Barajas e Wang, 1979).
O aparelho justaglomerular é responsável pela liberação de renina e é formado
pelas células que compõem a parede da arteríola aferente e pelas células da parede
do túbulo distal. Estas células formam um sincício, devido à presença junções
comunicantes na membrana plasmática, permitindo a interligação entre seus
citoplasmas (Barajas, 1979). Duas teorias são utilizadas para explicar os
mecanismos de liberação de renina pelo aparelho justaglomerular: a teoria da
sobrecarga de sal no túbulo distal e a teoria do receptor de estiramento. Segundo a
primeira teoria, a diminuição na carga de NaCl que chega no túbulo distal, onde as
células são sensíveis a alterações da concentração de Na
+
, sensibiliza as células
justaglomerulares a liberarem renina. Já a teoria do receptor de estiramento defende
que as células da arteríola aferente (células justaglomerulares) são sensíveis a
variação da volemia, e, portanto, ao estiramento das paredes do vaso, liberando
renina após este estímulo (Fray, 1976).
A renina liberada na circulação age sobre um pré-pró-hormônio denominado
angiotesinogênio, produzido e secretado, principalmente, pelas células do fígado.
Este é clivado e transformado no pré-hormônio, angiotensina I que ainda não tem
atividade biológica potente quando comparada com seu subproduto, a angiotensina
II. A angiotensina II surge da clivagem da angiotensina I pela enzima conversora de
angiotensina (ECA), presente em grande abundância no epitélio pulmonar. A
19
19
angiotensina II, além de agir de maneira sistêmica nos receptores presentes na
musculatura lisa dos vasos levando à vasoconstricção, é responsável pela liberação
de aldosterona pelas células da glândula adrenal, na zona glomerulosa, através de
ação sobre receptores específicos de membrana, AT1.
O principal sítio de ação da aldosterona corresponde aos segmentos
ascendentes grosso da alça de Henle (TAL) (Work & Jamison, 1987), túbulo distal
(DT) e ducto coletor (CD) (Schwartz & Burg, 1978), onde leva ao aumento na
reabsorção do íon Na
+
(Malnic & cols., 1966). Isso se deve primeiramente pela
ação da aldosterona sobre a atividade dos ENaCs existentes na membrana luminal
dos segmentos distais do néfron (Canessa e cols., 1994). O aumento da
permeabilidade dos EnaCs e o conseqüente aumento das concentrações
intracelulares de Na
+
estimulam a atividade das Na
+
/K
+
-ATPases localizadas nas
membranas basolaterais e, portanto, a reabsorção de Na
+
(Palmer e cols., 1990).
Numa etapa posterior a aldosterona estimula a transcrição dos genes codificadores
tanto dos canais de sódio quanto da Na
+
/K
+
-ATPase (Horisberger & Rossier, 1992).
Nasemann e colaboradores, em 1987, através de técnicas de microperfusão em
ductos coletor cortical isolado de coelhos recém-nascidos, observaram que a
reabsorção de cloreto foi estimulada após tratamento com aldosterona, no entanto,
quando o néfron tornou-se maduro este efeito foi reduzido, porém continua presente
(Nasemann & cols., 1987). Em ratos adrenalectomizados foi observada uma redução
significativa no fluxo de NaCl em segmento medular espesso da alça de Henle
quando eles foram comparados com animais normais ou com aqueles que foram
adrenalectomizados e que receberam reposição de aldosterona via intra-peritoneal
nas doses de 5 µg/100 g P/C dia, consideradas fisiológicas (Martin & cols., 1983,
Work & Jamison, 1987). A ação da aldosterona sobre o transporte de Cl
-
em néfron
20
20
distal foi analisada em células imortalizadas de ducto coletor cortical. Estas células
expressam os genes para os canais de sódio sensíveis a amiloride e para os canais
de cloreto tais como o CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).
A adição de aldosterona ao meio de cultura destas células durante 24h, estimulou a
corrente de curto-circuito e o fluxo de Na
+
do lado apical da membrana para o lado
basal, que foi aproximadamente três vezes maior que em células não tratadas
(Duong & cols., 1998).
Porém, até o presente momento pouco é sabido sobre as bases moleculares do
transporte de Cl
-
modulado pela aldosterona no rim.
I-5) Problemática 2: Seria a expressão gênica do canal de cloreto ClC-2
modulada pelos hormônios tireóideos em rins de ratos?
É sabido que vários hormônios podem modular o transporte de sódio ao longo
do néfron, os quais estão envolvidos com o aumento (natriurese) e redução (anti-
natriurese) de excreção de NaCl e, conseqüentemente de água na urina. Em
situações de redução de volume são desencadeados, principalmente, efeitos anti-
natriuréricos que envolvem o sistema renina-angiotensina-aldosterona, destacando-
se a angiotensina II e a aldosterona. O efeito diurético ocorre em situação de
expansão de volume. O principal fator natriurético envolvido é o FAN. Esse peptídeo
é liberado na circulação quando os miócitos atriais são distendidos sendo que este
peptídeo promove a diminuição da pressão sistêmica pelo seu efeito vasodilatador
além de favorecer a excreção renal de sódio através do bloqueio de canais de Na
+
no ducto coletor renal (Reineck & Stein, 1997). No entanto, há evidências que outros
hormônios estão relacionados com a modulação do volume do fluido extracelular
(VFEC), além dos clássicos citados acima. Os hormônios tireóideos têm sido
21
21
relacionados com várias alterações da função renal, inclusive influenciando a
excreção de Na
+
na urina. Essas alterações foram observadas principalmente
quando os hormônios tireóideos apresentam-se acima ou abaixo das concentrações
plasmáticas consideradas normais (Katz & cols., 1975).
Experimentos realizados em ratos infundidos com doses fisiológicas (2,5 ng/
100g – PC.dia) de T
3
e T
4
marcado com iodo radioativo (I
125
) permitiram a
visualização da distribuição dos hormônios tireóideos em diversos órgãos através da
técnica de cromatografia líquida de alta e baixa pressão (HPLC E LPLC). O rim
recebeu cerca de 0,2% por 100g/PC da carga total de T
3
e T
4
circulantes no plasma
sanguíneo provavelmente, por apresentar uma alta taxa metabólica (Nguyen & cols,
1993). Essa demanda metabólica é necessária para que o rim realize suas funções,
por exemplo, a manutenção da volemia através da reabsorção da carga de NaCl ao
longo do néfron, a favor de um gradiente eletroquímico, dependente de energia,
gerados pela presença da Na
+
/K
+
-ATPase na membrana basolateral das células do
túbulo renal.
Está bem estabelecida a alteração no balanço hidroeletrolítico que ocorre em
indivíduos com hipertireoidismo (caracteriza-se pelo aumento da concentração
plasmática circulante de T
3
e T
4
) ou hipotireoidismo (caracteriza-se pelas baixas
concentrações plasmáticas de T
3
e T
4
circulantes ou pelo defeito na ligação dos
hormônios tireóideos aos seus respectivos receptores: síndrome da resistência ao
hormônio tireóideo).
A função renal de pacientes hipertireóideos apresenta alterações
hemodinâmicas ligadas a alterações do fluxo sanguíneo que geralmente apresenta-
se aumentado (Aas & Blegen, 1949). Por esse motivo observa-se, nesses pacientes,
um aumento do ritmo de filtração glomerular e do fluxo plasmático renal (Ford &
2
2
22
cols., 1961). A capacidade de transporte tubular também se apresenta maior tanto
para secreção, como acontece com o transporte de para-amino-hipurato de sódio,
quanto para reabsorção tendo como exemplo o transporte de glicose no túbulo
proximal (Eiler & cols., 1944; Ford & cols., 1961).
As alterações encontradas na função renal no hipotireoidismo são, geralmente,
opostas àquelas observadas no hipertireoidismo, com exceção da retenção de sódio
que ocorre em ambos os casos, porém por motivos diferentes. Enquanto o aumento
da massa corporal de Na
+
no hipotireoidismo é atribuído principalmente à diminuição
do ritmo de filtração glomerular, em conseqüência da diminuição da perfusão renal
(White & cols., 1947; Aikawa, 1956; Ford & cols., 1961), no hipertireoidismo ocorre o
aumento da reabsorção tubular de Na
+
, como discutido anteriormente.
Os parâmetros relacionados com a função renal de 77 pacientes hipertireóideos,
tratados e não tratados foram analisados. Os pacientes não tratados apresentaram
uréia sanguínea elevada e diminuição na creatinina sérica. O tratamento dos
pacientes que restaura ao estado de eutireoidismo acompanha a normalização dos
níveis séricos avaliados. O RFG apresentou um leve aumento mas não significativo
nos pacientes hipertireóideos. Também foi observado o aumento significativo da
atividade plasmática da renina nos hipertireóideos, provavelmente, em conseqüência
a transpiração excessiva e freqüente defecação que leva a depleção de volume
corporal (Shirota & cols., 1992).
Os achados em seres humanos são corroborados em experimentos realizados
com animais. Em 1985, Capasso e colaboradores utilizaram ratos induzidos ao
hipotireoidismo por tireoidectomia e ratos tireoidectomizados com reposição
hormonal de T
3
por três dias ou 10 dias (10µg/Kg PC.dia), e através da técnica de
microperfusão analisou a taxa de reabsorção do fluxo luminal em túbulo proximal,
23
23
(maior sítio de reabsorção de fluido tubular do néfron). A taxa de reabsorção no
túbulo proximal de ratos tratados com reposição de hormônios tireóideos teve um
aumento de aproximadamente 65% em relação aos ratos hipotireóideos. Os rins
destes mesmos animais após os estudos in vivo foram extraídos e transformados em
preparação de membranas isoladas de borda luminal (membrana borda em escova).
Estas membranas tiveram a permeabilidade ao Na
+
estudadas na presença de Na
+
marcado com isótopo radioativo no meio de incubação, onde foi observado um
pequeno aumento não significativo da permeabilidade luminal, o que pode indicar o
estímulo dos hormônios tireóideos sobre a atividade da Na
+
/K
+
ATPase presente na
membrana basolateral. Essa conclusão foi baseada no fato de que a Na
+
/K
+
ATPase
é responsável pela formação do gradiente eletroquímico que torna favorável a
entrada de Na
+
pela membrana luminal.
O RNAm e a proteína correspondente à Na
+
/K
+
ATPase em ratos hipotireóideos
com reposição de tri-iodotironina aumentaram significativamente em relação aos
ratos hipotireóideos (McDonough & cols., 1988). Também foram observados o
aumento das subunidades catalíticas α e β da Na
+
/K
+
ATPase em rins de ratos
submetidos à reposição hormonal de T
3
em relação aos hipotireóideos. Esses
experimentos sugeriram que a atividade da enzima, e não somente a sua expressão,
é estimulada pelo hormônio tireóideo.
DiBartola e colaboradores (1996) observaram, em gatos hipertireóideos, o
aumento do fluxo plasmático renal e do ritmo de filtração glomerular em relação a
gatos normais medindo os "clearances" de para-amino-hipurato de sódio e de
creatinina. Este efeito foi atribuído ao aumento do débito cardíaco mediado pelo
hormônio tireóideo e pela vasodilatação intra-renal. O tratamento destes gatos
hipertireóideos com metimazol (agente farmacológico que inibe a síntese e a
24
24
secreção de hormônios tireóideos) ou por tireoidectomia reverteu os efeitos
observados.
Azuma e colaboradores (1996) estudaram em túbulo proximal de ratos o
envolvimento dos hormônios tireóideos sobre a expressão de quatro isoformas
(NHE1, NHE2, NHE3 e NHE4) do trocador Na
+
/H
+
(abundantemente expressos na
membrana luminal das células do túbulo renal). Estudos envolvendo a técnica de
“northen blot” indicaram que o RNAm das isoformas NHE2 e NHE3 presente no
túbulo proximal do rim dos animais hipertireóideos apresentaram aumento
significativo em relação aos animais hipotireóideos. Por outro lado, as isoformas
NHE1 e NHE4 não apresentaram diferença significativa da expressão de seus
RNAms entre os grupos estudados.
A ação dos hormônios tireóideos sobre a permeabilidade dada pelo trocador
Na
+
/H
+
foi avaliada através de técnicas de microperfusão in vivo em túbulo proximal
e distal por Morales e colaboradores, em 1996. Os ratos foram induzidos ao
hipotireoidismo por tireoidectomia e comparados a ratos falsamente operados. O
parâmetro analisado foi à cinética de acidificação no túbulo proximal, onde foi
observado que a reabsorção de HCO
3
-
, bem como o pH intratubular apresentaram
tendência a diminuição, porém não significativa, em ratos tireoidectomizados.
Enquanto o tempo de acidificação tubular tanto proximal quanto distal aumentou
significativamente em ratos hipotireóideos. Esses dados sugeriram uma menor
expressão do trocador Na
+
/H
+
, principalmente em túbulos proximais de animais
hipotireóideos.
Outros autores mostraram a diferença da ação renal dos hormônios tireóideos
entre animais jovens e velhos através do estudo da expressão do RNAm e da
proteína correspondente ao co-transportador Na
+
/Fosfato. Ambos os grupos de ratos
25
25
foram tireoidectomizados e divididos em subgrupos que receberam reposição
hormonal com doses fisiológicas e supra-fisiológicas. Os ratos, jovens e velhos,
tireoidectomizados apresentaram redução significativa da expressão gênica do
trocador Na
+
/Fosfato. Quando foi administrada dose supra-fisiológica em ambos os
grupos (jovens e velhos) houve aumento significativo da expressão do co-
transportador em túbulos proximais. No entanto, os ratos velhos com reposição
hormonal, apesar de responderem ao estímulo, apresentaram menor resposta ao
estímulo por hormônio tireóideo do que ratos jovens.
Todos esses dados, apresentados anteriormente, estão de acordo com o fato de
que o rim apresenta as isoformas mais conhecidas de receptores nucleares
específicos para hormônios tireóideos (TRα
1
e TRβ
1
) (Shahrara & cols., 1999).
Possivelmente, há ação direta destes hormônios sobre as células do tecido renal.
Até aqui vimos que são bem estudadas as ações dos hormônios tireóideos
sobre transportadores de Na
+
. Porém, o íon Cl
-
é o principal co-íon do Na
+
(Hamlyn &
Blaustein, 1986; Terry, 1994). Assim, seria válido postular que os mesmos
mecanismos que modulam o transporte de Na
+
também estariam modulando o
transporte transcelular de Cl
-
(Gottschalk, 1988), já que grande parte do Cl
-
filtrado
pelo glomérulo é reabsorvida juntamente com o Na
+
ao longo do néfron por
mecanismos ativos e passivos.
Dentre os vários transportadores de Cl
-
existentes ao longo do néfron propomos
estudar a influência dos hormônios tireóideos, da aldosterona e das dietas ricas em
NaCl sobre a expressão do ClC-2 em rim de rato.
I-6) Problemática 3: Estaria o receptor de hormônio tireóideo do tipo β
envolvido na expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 em rins de ratos?
26
26
Os efeitos dos hormônios tireóideos são mediados através de receptores de
hormônios tireóideos (TRs). Os TRs foram identificados em 1986, como um produto
do proto-oncogene c-erbA, o precursor celular do oncogene viral erbA (Weinberger &
cols.,1986). Os TRs são membros da superfamília dos receptores nucleares, os
quais funcionam como fatores de transcrição dependentes de ligantes (Mangelsdorf
& cols., 1995). Estes TRs ligam-se a seqüências especificas no DNA chamadas de
elementos responsivos ao hormônio tireóideo (TRE). As seqüências TREs,
geralmente, estão localizadas na região promotora dos genes alvo e são especificas
para cada receptor. Os TREs possuem duas cópias de um hexanucleotídeo que
podem ser arranjadas em diferentes orientações (AGGTCA N AGGTCA; sendo N o
número de bases nucleotídicas que separa cada hexâmero) (Ribeiro & cols.,1998).
Os TRs ligam-se as seqüências TREs na forma de monômeros, homodímeros
(TR/TR) ou, preferencialmente, heterodímeros (TR/RXR) formados por associação a
outro membro da superfamília de receptores nucleares, o receptor de ácido retinóico
(RXR) (Glass, 1994). (Figura 3).
Os membros da superfamília de receptores nucleares exibem uma estrutura
com três principais domínios: amino-terminal, de ligação ao DNA (DBD) e de ligação
ao ligante (LBD), e uma pequena região que conecta o DBD ao LBD que forma uma
dobradiça chamada de “hinge” (Ribeiro & cols.,1998). (Figura 4).
Em mamíferos, dois genes distintos, o TRα e o TRβ, codificam diferentes
proteínas (TRα
1
, TRα
2
, ∆TRα
1
, ∆TRα
2
, TRβ
1
, TRβ
2
, TRβ
3
e ∆TRβ
3
) que são
resultado do processamento alternativo do RNAm (“splicing” alternativo) ou da
utilização de promotores alternativos no ato da transcrição do gene (Figura 5). Os
TRs ligam-se ao DNA mesmo na ausência do ligante. O complexo TR-DNA sem a
presença de T
3
associa-se a outras proteínas conhecidas como correpressores
27
27
porque atuam reprimindo a transcrição gênica. As proteínas correpressoras
interagem com as histonas desacetilases que impedem o “desenrolar” da fita de
DNA, portanto, compactam a cromatina na região promotora e inibem a maquinaria
de transcrição basal. Na presença do ligante, o complexo TR-DNA dissocia-se dos
correpressores e associa-se a proteínas co-ativadoras que interagem com as
histonas acetil-transferases que atuam hiperacetilando a fita de DNA, relaxando a
cromatina. Portanto, facilita o acesso dos fatores transcricionais, estimulando a
transcrição gênica (Figura 6).
Os TRs medeiam as ações de T
3
, assim como, mantêm as concentrações do
hormônio em níveis plasmáticos constantes através da alça de regulação do eixo
hipotálamo – pituitária – tireóide. Os hormônios tireóideos fazem uma alça negativa
de regulação na pituitária e no hipotálamo inibindo a síntese e secreção do hormônio
estimulante da tireóide (TSH) e do hormônio liberador de tireotrofina (TRH),
respectivamente (Lezoualc’h & cols., 1992).
A presença de mutações no TRβ o impede de ligar-se à molécula do T
3
. Estas
mutações geralmente ocorrem no domínio de ligação ao ligante (LBD), sendo que já
foram identificadas em seres humanos mais de 100 mutações diferentes em TRβ1.
O receptor mutado mantém a propriedade de se ligar à região TRE no DNA,
porém, o T
3
não se liga ao receptor. Além disso, o receptor mutado permanece ligado
a fatores correpressores exercendo um efeito dominante negativo, que é
característica da mutação ∆337T utilizada neste trabalho, interferindo com a ação do
receptor normal. Os animais com mutação no TRβ apresentam tanto sinais de
hipotireoidismo, como sinais de hipertireoidismo porque a quantidade de receptores
de hormônios tireóideos nos tecidos não é uniforme, ressaltando que há
28
28
predominância do TRα em coração e músculos esqueléticos e TRβ em rim, fígado e
cérebro (Flamant & Samurat, 2003; Willians, 2000; Lazar, 1993).
Figura 3: Ligação dos receptores de hormônios tireóideos, (TR)
a
seqüência esp
ecificas do DNA, formando homodímeros (A) ou
heterodímeros com o receptor de ácido retinóico (B).
Adaptado de Barra
& cols, 2004.
TR
A
B
Figura 4: Estrutura primá
ria representando os domínios funcionais dos
receptores nucleares: Domínio amino-terminal (NH2-
t), domínio de
ligação ao DNA (DBD), dobradiça (Hinge)
, domínio de ligação ao ligante
(LBD) e sua respectivas funções. Adaptado de Barra & cols, 2004.
29
29
Figura 5: Estrutura primá
ria das diferentes isoformas codificadas pelos genes
receptores do hormônio tireóideo
: as isoformas TRβ1, TRβ2, TRβ3 e TRβ∆3
são codificadas pelo gene THRB através da utilização de promotores
alternativos. O gene THRA, por “splicing”
alternativo e também pela utilização
de promotores alternativos, produz as proteínas TRα1, TRα2, TR∆α1 e TR∆α
2.
Adaptado de Barra & cols, 2004.
30
30
Figura 6: Representação esquemática do mecanismo de ação do receptor do
hormônio tireóideo: na ausência de T
3
, o TR se encontra ligado ao TRE como
homodímero (Representado) ou heterodímero associado a proteínas
cor
repressoras, que compactam a cromatina na região promotora e inibem a
maquinaria de transcrição basal (MTB). A ligação do T
3
(círculo) ao TR
promove uma mudança conformacional que induz
a liberação dos
correpressores e associação do TR com proteínas co-ativadoras. A
associação
do TR com proteínas co-
ativadoras relaxam a cromatina na região promotora e
recrutam a maquinaria de transcrição basal (MTB)
, ativando a transcrição de
genes alvo. Adaptado de Barra & cols, 2004.
31
31
Refetoff e colaboradores, em 1967, foram os primeiros a descrever os
sintomas causados por estas mutações denominada de Síndrome de Resistência ao
Hormônio Tireóideo (RHT). Esta síndrome é caracterizada por redução na resposta
dos tecidos-alvos ao hormônio tireóideo, apesar dos altos níveis séricos de T
3
e T
4
livres, apresentando um TSH elevado ou inadequadamente normal característico da
sensibilidade reduzida do tireotrofo (Beck-Peccoz & Chatterjee, 1994). Os indivíduos
apresentam bócio, deficiência auditiva, deficiência de aprendizado, retardo mental,
atraso no crescimento ósseo.
O modelo animal construído por Hashimoto e colaboradores (2001), no qual foi
retirado um aminoácido treonina na posição 337 no exon 6, apresenta fenótipo
similar a Síndrome de Resistência ao Hormônio Tireóideo. Camundongos
trangênicos mutados para o gene TRβ apresentam fenótipo similar a esta síndrome
porém relativamente moderado quando comparados a animais feitos hipotireóideos
por retirada da tireóide. Paradoxalmente, estes animais apresentam sinais
característicos de hipertireoidismo em alguns tecidos como, por exemplo, aumento
da freqüência cardíaca.
Estes modelos de camundongos com mutação no gene TRβ são úteis para
observar o mecanismo de ação dos hormônios tireóideos em tecidos-alvo. Nesta
tese, estes animais foram usados para identificar a possível participação do TRβ na
ação dos hormônios T
3
e T
4
sobre a modulação da expressão gênica do ClC-2 em
rim de ratos.
32
32
OBJETIVOS
33
33
II-Objetivo Geral:
O objetivo do presente trabalho é verificar se a expressão gênica do canal de cloreto
ClC-2 é modulada pelos hormônios tireóideos e pela aldosterona em rim de ratos.
II-1-Objetivos específicos:
1. Estudar a distribuição do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos.
2. Estudar se o RNAm do ClC-2 é modulado em rim total e em segmentos
dissecados do néfron de ratos submetidos a dietas hipersódicas e
adrenalectomizados, adrenalectomizados com reposição de aldosterona,
hipotireóideos e hipertireóideos.
3. Estudar a modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de ratos
submetidos dieta hipersódica, hipotireóideos e hipertireóideos.
4. Estudar a possível modulação do RNAm do ClC-2 pelos hormônios da tireóide
em cultura de células de túbulo proximal de ratos in vitro.
5. Estudar o possível mecanismo de ação dos hormônios tireóideos sobre a
expressão gênica do ClC-2 através do envolvimento da região promotora do
deste canal e via receptor TRβ, utilizando camundongos trangênicos para
esse receptor.
III-1) Grupos Experimentais
Todos os protocolos utilizados nesta tese e relacionados abaixo foram
aprovados pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa
(CAUAP) do IBCCF
o
da UFRJ.
34
34
III-1.1) Preparação dos ratos adrenalectomizados tratados ou não com
aldosterona
Para os experimentos de modulação de RNAm foram utilizados ratos da
linhagem Wistar, de 3 meses de idade (adultos jovens), pesando cerca de 150-
250g que foram mantidos em sala com controle de luminosidade (12h luz / 12h
escuro, iluminação a partir de 7:00, a luz é desligada ás 19:00h) e temperatura
entre 23 -26°C. Os animais foram distribuídos entre os seguintes grupos
experimentais:
Grupo controle: animais recebendo dieta normal e livre acesso à água de
beber.
Grupo hipersódico (5d-Na
+
): animais recebendo sódio em excesso (água
contendo NaCl (0,9% e ração normal – 0,8g NaCl por kilograma) por 5 dias.
Grupo adrenalectomizado (ADX): animais que sofreram remoção bilateral
da glândula adrenal, e preservados por 48 h recebendo 0,9% de NaCl na
água de beber e dieta normal. Estes animais, devido a ausência de
mineralocorticóides apresentam grande perda de sal pela urina. Assim,
necessitam de reposição salina para que sejam mantidos vivos (Stanton &
cols, 1985).
Grupo adrenalectomizado com reposição hormonal de aldosterona
(ADX+ALDO): os animais tiveram remoção bilateral da glândula adrenal com
reposição de aldosterona por via subcutânea a 5µg/100 g de peso corporal
durante 48 horas, via mini-bombas osmóticas inseridas no dorso do animal.
Para realização dos procedimentos cirúrgicos (adrenalectomia) foi utilizado
pentobarbital sódio (5mg/ 100g de peso corporal) a fim de anestesiar os ratos.
35
35
III-1.2) Preparação dos ratos tratados com furosemida
Para a análise do possível envolvimento do fluxo de íons através do epitélio na
expressão do canal ClC-2 na porção espessa cortical e medular da alça de
Henle, nós utilizamos ratos Wistar machos pesando de 150-250g submetidos a
diferentes doses de furosemida utilizando o mesmo protocolo já descrito na
literatura (Hirano & cols., 2000). Um grupo de animais recebeu uma dose de
furosemida em baixa concentração (que é suficiente para alterar o transporte de
eletrólitos na alça espessa de Henle), mas não altera a concentração plasmática
de aldosterona. Outro grupo recebeu uma alta dose de furosemida que além de
alterar o transporte também leva ao aumento dos níveis plasmáticos de
aldosterona (Hirano & cols., 2000).
Os animais foram anestesiados com diazepan na concentração de 0,5mg/ml,
dose única intraperitoneal. Possibilitando, desta forma, a introdução do tubo
gástrico até o estômago do animal e posterior entrada da solução com
furosemida por auxílio de uma seringa. Estes animais foram divididos em três
grupos:
Controles: animais receberam 300µl de solução salina utilizada como veículo
(solução de 0,9% de NaCl) por via oral através de um tubo gástrico.
Furosemida 10mg/kg: animais receberam 300µl de solução salina contendo
furosemida na concentração de 10mg/kg (F10) por via oral através de um
tubo gástrico.
Furosemida 100mg/kg: animais receberam 300µl de solução salina
contendo furosemida na concentração de 100mg/kg (F100) por via oral
através de um tubo gástrico.
36
36
III-1.3) Preparação dos ratos hipotireóideos e hipertireóideos
Para analisar a ação dos hormônios tireóideos sobre a expressão do canal de
cloreto ClC-2 no rim foram utilizados ratos também da linhagem Wistar, machos, de
3 meses de idade (adultos jovens), pesando cerca de 150-250g, foram mantidos em
sala com controle de luminosidade (12h luz / 12h escuro, iluminação a partir de 7:00,
a luz é desligada ás 19:00h) e temperatura entre 23 -26°C. O tratamento do grupo
experimental ocorreu por 21 dias e, foram distribuídos nos seguintes grupos
experimentais.
Grupo controle:
constituído por animais que receberam dieta normal, com
livre acesso à água de beber durante 21 dias. A partir do décimo-primeiro
dia (dez dias antes do sacrifício) receberam doses subcutâneas contendo
somente salina, para que fossem submetidos ao mesmo estresse dos
animais que receberam reposição hormonal.
Grupo hipotireóideo:
formado por animais recebendo metimazol 0,03% na
água de beber durante 21 dias. O metimazol (MMI; Sigma Chemical Co., St
Louis, MO, USA) é uma droga conhecida por sua ação inibidora da síntese
dos hormônios T
4
e T
3
.
Grupo hipotireóideo tratado com T
4
:
neste grupo os animais receberam
metimazol na água de beber durante os 21 dias. E receberam doses
subcutâneas diárias de T
4
na dosagem de 1µg por 100g de peso corpóreo
somente a partir do décimo-primeiro dia após o início do tratamento (10
dias anteriores ao sacrifício).
Grupo hipertireóideo: formado por animais normais que receberam T
4
na
dose de 10 µg por 100g de peso corpóreo, administrada por via
37
37
subcutânea, a partir do décimo-primeiro dia de tratamento (durante 10 dias
até o sacrifício).
III-1.4) Preparação dos camundongos hipotireóideos e hipertireóideos
Foram utilizados camundongos adultos machos da linhagem C57/BL6 da idade
de 3 meses pesando 20-25g foram mantidos em sala com controle de luminosidade
(12h luz / 12h escuro, iluminação a partir de 7:00, a luz é desligada ás 19:00h) e
temperatura entre 23 -26°C. Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos:
Grupo controle: este grupo teve livre acesso à comida e água até o dia do
experimento, recebendo doses subcutâneas diárias de salina, o veículo de
diluição do T
4
, por 15 dias.
Grupo hipotireóideo: Um segundo grupo de camundongos foi induzido ao
hipotireoidismo pela adição de 0,1% de metimazol na água de beber durante 45
dias.
Grupo hipotireóideo tratado com T
4
: neste grupo os camundongos receberam
metimazol na água de beber durante os 45 dias. E receberam doses subcutâneas
diárias de T
4
na dosagem de 1 µg por 100 g de peso corpóreo somente a partir do
trigésimo dia após o início do tratamento (15 dias anteriores ao sacrifício).
Grupo hipertireóideo: formado por animais normais que receberam T
4
na dose
de 10µg por 100g de peso corpóreo, administrada por via subcutânea durante 15
dias até o sacrifício.
III-1.5) Camundongos com mutação TRβ
Os camundongos com mutação no receptor TRβ de hormônios tireóideos foram
descritos por Hashimoto e colaboradores (2001) e foram gentilmente cedidos pela
38
38
Professora Tânia Ortiga Carvalho do Laboratório de Endocrinologia Molecular do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas filho da UFRJ . Estes animais apresentam uma
mutação pontual ∆337T no exon 6 do receptor que não permite a ligação de T
3
ao
complexo receptor-DNA. leva disfunção do mesmo. Camundongos heterozigotos
para a mutação foram acasalados e a prole foi caracterizada quanto ao seu
genótipo. Foram estudados os animais selvagens (controle), heterozigotos
(HETERO) e homozigotos (HOMO).
III-2) Métodos
III-2.1) Genotipagem dos animais
O DNA do animal foi extraído a partir de cerca 0,5 cm da porção distal da cauda
de cada animal que foi cortada utilizando bisturi cirúrgico após o desmame (15 dias
após o nascimento). A solução utilizada está no item soluções. Para a genotipagem,
foi empregada a técnica de PCR onde foram utilizados os oligonucleotídeos
específicos para a mutação ∆337T, para o gene selvagem ATG GGG AAA TGG
CAG TGA CAC, para o camundongo com mutação ATG GGG AAA TGG CAG TGA
GAG e um oligonucleotídeo comum a ambos animais AGC ACA CTC ACC TGA
AGA CAT ( Abel & cols., 1999). Foram utilizadas as condições seguintes:
desnaturação a 94°C por 5 minutos seguidos de 36 ciclos de temperatura que
compreendeu: um minuto a 94°C para desnaturação das fitas, seguido de
temperatura específica de ligação dos oligonucleotídeos, 62°C e, por fim, um minuto
a temperatura de 72°C para a ação da DNA polimerase. Após o último ciclo, todas as
reações de PCR foram seguidas por uma extensão a 72°C por dez minutos.
39
39
III-3) Excisão Renal
Os animais foram sacrificados por decapitação e submetidos a laparotomia para
excisão do rim esquerdo. Inicialmente o rim esquerdo foi perfundido com 20 ml de
solução salina (ver composição no item soluções) com auxílio de um cateter de
polietileno (PE-50) inserido na aorta abdominal. Depois de removido, o rim foi
decapsulado manualmente e colocado em uma placa de Pétri estéril, sobre gelo,
contendo solução salina. Foram realizados cortes transversais ao longo de todo eixo
córtico-papilar para que as diferentes porções pudessem ser macroscopicamente
identificadas, dissecadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido para
posteriormente serem armazenadas em freezer –70°C até o momento do
experimento.
III-4) Microdissecção de túbulos renais
Com o objetivo de mostrar a localização do ClC-2 ao longo do néfron, assim
como para avaliar a modulação da expressão gênica do ClC-2 em rins de animais
submetidos a diferentes situações experimentais foi realizada a técnica de
microdissecção de túbulos renais. Ratos Wistar após serem anestesiados por
inalação de éter etílico, tiveram seus rins esquerdos perfundidos, primeiramente,
com 10 ml de solução salina e em seguida, com 10 ml de solução salina acrescida
de colagenase e albumina via aorta abdominal. Os rins perfundidos foram
decapsulados e fatiados em secções transversais no sentido do eixo córtico-
papilar com espessura de aproximadamente 0,1 cm. Essas porções foram então
incubadas com solução salina contendo colagenase B (Sigma, St. Louis, USA)
(Solução salina acrescida de colagenase e albumina) por 40 minutos a 37°C (Kriz
40
40
& Bankir, 1988). Os túbulos renais foram identificados sob visão estereoscópica e
os segmentos identificados e isolados de acordo com o critério usual descrito por
Kriz & Bankir em 1988. Os seguintes segmentos do néfron foram dissecados:
glomérulo, túbulo proximal nas suas porções convoluta e reta (PCT e PST,
respectivamente), porção espessa medular (mTAL) e cortical (cTAL) da alça de
Henle, porção fina da alça de Henle (HL), ducto coletor cortical (CCD) e ducto
coletor medular interno (IMCD) e externo (OMCD) (Figura 7). O comprimento de
cada túbulo dissecado foi medido a partir de uma escala milimétrica localizada na
objetiva do microscópio esteroscópico (Moriyama & cols., 1990).
Para comparação da expressão gênica do ClC-2 entre os diversos grupos
experimentais foram realizadas as técnicas de RT-PCR semiquantitativo e Ensaio
de proteção contra RNase (RPA).
Para a quantificação da expressão do RNAm do canal de cloreto ClC-2 ao
longo do néfron de ratos utilizando a técnica de RT-PCR foram isolados 5
glomérulos ou 3 segmentos de néfron de 1 mm de comprimento cada. Pelo fato
de 3mm de segmentos tubulares dissecados conterem pequenas quantidades de
RNA, o reagente TRIzol
não pode ser utilizado. Neste caso os segmentos
dissecados foram permeados com o uso de detergente iônico Triton X-100 na
concentração de 2% do volume total e imediatamente submetidos à técnica de
RT-PCR semiquantitativo.
41
41
Figura
7
:
Figura representativa do néfron, onde são mostrados os seus
diferentes segmentos. Glomérulo (glm), túbulo proximal nas suas porções
convoluta e reta (PCT e PST, respectivamente), porção espessa medular
(mTAL) e cortical (cTAL) da alça de Henle, porção fi
na da alça de Henle
(HL), túbulo convoluto proximal (CNT) e distal (DCT), ducto coletor cortical
(CCD) e ducto coletor medular interno (IMCD) e externo (OMCD).
PCT
PST
HL
cTAL
DCT
CCD
OMCD
IMCD
CNT
CÓRTEX
MEDULA
EXTERNA
MEDULA
INTERNA
glm
42
42
III-5) Extração de RNA-total
Tecido renal (rim total, córtex, medula externa e interna) e células de cultura
primária de túbulo proximal de rato (cultura descrita no item 11) foram
homogeneizadas na presença do reagente TRIzol
®
(Gibco BRL - Life Technologies,
Rockville, MD, EUA). Após a extração, realizada de acordo com as instruções do
fabricante, o RNA precipitado foi solubilizado em 20 µL de água tratada com DEPC.
A concentração das amostras de RNA-total foi determinada por espectrofotometria
no comprimento de onda de 260 nm (Hitachi U-1100, Japão). A integridade das
amostras foi verificada através de eletroforese em gel de agarose 1% contendo (0,5
µg/ml) brometo de etídeo.
III-6) Transcrição Reversa (RT)
Para a síntese do cDNA, 0,5 µg/mL de oligonucleotídeo dT
12-18
(Gibco BRL - Life
Technologies, Rockville, MD, EUA) foi incubado à temperatura de 65°C, por 3
minutos, com concentrações distintas de RNA-total extraídas de diferentes amostras.
A transcrição reversa das amostras foi realizada em presença de 2,5U MMLV-RT (ou
SuperScript
TM
II RT) (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA) em
incubação por 80 minutos a 37°C. O cDNA obtido foi diluído em 10 µl de água
tratada com DEPC e foi estocado a -20°C até que fosse realizada a reação de PCR.
III-7) Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)
O cDNA, obtido na etapa anterior, foi utilizado como molde nas reações de
PCR. Para estes experimentos, foram sintetizados oligonucleotídeos específicos
43
43
para os genes correspondentes aos canais de cloreto ClC-2, assim como para o
gene correspondente a β-actina e GAPDH. (Tabela 1).
Molécula Seqüência do oligonucleotídeo Posição Tamanho
ClC-2 (rato)
Sense
Antisense
GeneBank n° X64139
5’ CTA TGC CAT CGC TGT CTG 3’
5’ GAA GTC GAG TCG GAA CCG 3’
345 – 362
943 – 960
615 pb
β-actina (rato)
Sense
Antisense
GeneBank n° V01217
5’ TAT GCC AAC ACA GTG CTG TCT GG 3’
5’ AAG AAA GCA AGA CAG TGA TTG TG 3’
2762 – 2784
2965 – 2987
226 pb
GAPDH (camundongo)
Sense
Antisense
GeneBank n°XM_906931
5’ CAA CCA ACT TGC TTA GCC C 3’
5’ GCT CTG GGA TGA CCT TGC 3’
458 – 477
647 – 664
206 pb
Tabela 1: São mostradas, as seqüências e localizações dos oligonucleotídeos utilizados, as espécies
de origem da qual a seqüência foi gerada, seu número de acesso no GeneBanK, e o tamanho dos
produtos de amplificação obtidos a partir da reação de RT-PCR.
As reações de PCR foram realizadas em um termociclador GeneAmp PCR
System 2400 (Perkin Elmer – Norwalk. EUA).
Após a transcrição reversa, todo o volume do cDNA foi utilizado nas reações de
PCR contendo diferentes pares de oligonucleotídeos. Para a amplificação, foram
utilizados 25 pmoles de cada oligonucleotídeo, 1,25 mM dNTP (Amershan
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA), 50mM KCl, 2 mM MgCl
2
, 10 mM Tris-Cl
44
44
pH 9.0, 0.1% Triton X-100 (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) e
2,5 U de Taq DNA Polimerase (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA),
em um volume total de 25 µL de reação.
As reações de PCR foram todas iniciadas por uma desnaturação a 94°C por 5
minutos seguidos de 35 ciclos (para amplificação em ratos) e 36 ciclos (para
amplificação em camundongos) de temperatura que compreendeu: um minuto a
94°C para desnaturação das fitas seguido de temperatura específica de ligação dos
oligonucleotídeos e, por fim, um minuto a temperatura de 72°C para a ação da DNA
polimerase. Após o último ciclo, todas as reações de PCR permaneceram 72°C por
dez minutos.
O produto da reação de PCR de cada amostra, correspondente aos vários
grupos experimentais, foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1,5 %. Os
produtos de amplificação foram identificados de acordo com o peso molecular
esperado.
O gene da β-actina ou do GAPDH foram amplificados conjuntamente com o gene
em estudo para todas as reações de PCR realizadas, e serviram como controle
interno de todos os experimentos de RT-PCR.
III-8) Ensaio de proteção contra a RNAse (RNase Protection Assay - RPA)
A comparação entre a expressão do RNAm dos genes em estudo em tecido
renal total dos diferentes grupos experimentais foi realizada através do ensaio de
proteção contra RNAse (RPA). Esta técnica, bastante sensível, permite a detecção
de pequenas variações da expressão de RNAm através da síntese de sondas de
RNA específicas para o gene em estudo. Tais sondas foram construídas por meio da
45
45
inserção de um fragmento de cDNA de rato, obtido por RT-PCR e purificado em gel,
em um vetor contendo promotores T3 e T7 flanqueando a região do “poli-linker”. A
partir disso, foi realizado o seqüenciamento dos clones positivos e verificação da
orientação do inserto para que pudesse ser realizada a sua linearização. Para a
transcrição in vitro, a alta especificidade das RNAs polimerases T7 pelo promotor
nos permite transcrever uma fita de DNA em RNA. (Figura 8).
5` 3`
vetor
cDNA
T
3
T
7
N
o
t
I
Not I
T
3
T
7
Not I
5`
5`
3`
3`
A
B
Figura 8: Clonagem e linearização do DNA para a produção da sonda
de RNA utilizada nos experimentos de RPA. (A) Orie
ntação do fragmento
do cDNA no vetor contendo os promotores T3 e T7
necessários à
transcrição in vitro. (B) Síntese do RNA marcado com [α
32
P] UTP. O clone
contendo o inserto de cDNA, referente ao gene do ClC-
2, foi digerido com
Not I e transcrito pela interação da enzima RNA polimerase T
7
com o
promotor localizado próximo ao sítio de clonagem. As setas indicam o
sentido da transcrição.
46
46
Todas as sondas estavam orientadas no sentido 5’→ 3’, ficou definido que a
linearização dos clones deveria ser feita utilizando a enzima de restrição Not I e
(Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA), para o gene do ClC-2. A
transcrição in vitro seria realizada na presença de RNA polimerase (T7 enzime Mix -
Maxi transcription – Ambion) no caso dos genes do ClC-2, GAPDH e/ou β-actina
(Figura 8).
III-8.1) Síntese da Sonda de RNA Marcada
A transcrição in vitro, a partir da fita de DNA linearizada, foi realizada de acordo
com o protocolo descrito no Kit MAXIscript
TM
(Ambion Inc., Austin, TX, EUA). Os
clones contendo o inserto de cDNA referente ao gene em estudo foram transcritos
pela interação da enzima RNA polimerase (T7 enzime Mix - Maxi transcription –
Ambion) ao promotor presente no vetor. O RNA formado foi marcado com 5 µl [α-
32
]
UTP (800 Ci/mol,10 mCi/ml, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA, EUA). Após
incubação a 37°C durante 1 hora, a remoção das fitas moldes de DNA foram
realizados por meio da adição de 1 µl de DNAse RNAse-free (2U/µl) e incubação a
37°C por 30 min. O volume da reação foi completado para 100 µl com H
2
O tratada
com DEPC a fim de se realizar uma extração com igual volume de mistura contendo
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico na proporção de 25:24:1, Vol/Vol. Após a
extração, a sonda foi separada dos nucleotídeos não incorporados em coluna
contendo “Sephadex G-50 Medium” (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA). O
material recuperado foi, então, precipitado, adicionando acetato de amônio na
concentração de 7,5M no volume correspondente a 30% do volume final e etanol
absoluto no volume correspondente a 250% do volume final da reação. Após
incubação a -80°C por 1 hora, a amostra foi centrifugada em 14.000 rpm (rotação por
47
47
minuto) a 4°C por 30 min. O precipitado foi lavado em etanol 70% e diluído em 30 µl
de tampão de hibridização fornecido pelo kit (Hybridization Buffer – Soln A, RPA
TM
kit, Ambion Inc., Austin, TX, EUA).
As sondas para a β-actina e GAPDH (Ambion Inc., Austin, TX, EUA), obtidas
comercialmente, foram utilizadas na normalização dos resultados da expressão do
RNAm do gene do ClC-2 analisado pela técnica de RPA. A síntese da sonda de RNA
anti-sense correspondente ao gene da β-actina e GAPDH foram sintetizadas,
também, na presença da enzima RNA polimerase (T7 enzime Mix - Maxi
transcription – Ambion).
Nestes experimentos, como marcador de peso molecular, utilizamos RNA
Century Marker Template Set (Ambion Inc., Austin, TX, EUA). Este é constituído de
cinco plasmídeos linearizados e que servem como molde na reação de transcrição in
vitro. A quantidade de 0,5 µg do marcador, após transcrição com RNA polimerase T
7
,
resultou na formação de cinco fragmentos de RNA que continham, respectivamente,
100, 200, 300, 400 e 500 pares de bases. Após diluído em tampão de amostra (Gel
Loading Buffer – Soln E, RPA
TM
kit, Ambion Inc., Austin, TX, EUA), o marcador foi
estocado a -20°C.
III-8.2) Hibridização da Sonda Marcada com o RNA
A sonda anti-sense, marcada radiotivamente com [α
32
P] UTP (800 Ci/mmol,
DuPont-New England Nuclear, Boston, MA, EUA), foi incubada com 40 µg de RNA-
total de rim de rato (1X10
5
cpm/amostra) extraído como descrito anteriormente. A
hibridização ocorreu durante 16 horas a 45°C. Todas as amostras foram co-
hibridizadas com uma sonda específica para β-actina (125 pb) ou para GAPDH (316
48
48
pb) (Ambion Inc., Austin, TX, EUA). Ainda, como controle adicional, todas as sondas
foram hibridizadas com 10 µg de RNA-total de levedura na presença e na ausência
de RNAse A e T
1
, de acordo com protocolo do Kit RNAse Protection Assay (RPA) II
(Ambion Inc., Austin, TX, EUA).
Os fragmentos protegidos foram então digeridos com RNAse Cocktail (1:100) e
separados por eletroforese em gel desnaturante (6% poliacrilamida/ 8M uréia), em
tampão TBE 1X, a 70 W. As bandas foram analisadas após exposição do gel seco
em filme auto-radiográfico (Kodak X-OMAT Films
TM
Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis,
Missouri, EUA), com intensificador, por aproximadamente 24 horas. A intensidade da
banda é diretamente proporcional à quantidade de híbridos formados durante a
reação de hibridização.
III-9) “Southern Blotting”
Com intuito de determinar a distribuição do RNAm do canal de cloreto ClC-2 ao
longo do néfron a técnica de “Southern blotting” foi utilizada.
Como descrito anteriormente, túbulos renais foram microdissecados, RNA
extraído e a técnica de RT-PCR realizada. O gel obtido na etapa anterior foi
denaturado e neutralizado. Os fragmentos de cDNA, contidos no gel, foram
transferidos para uma membrana de nylon Biodyne por força iônica através de uma
solução de 20X SSC, como foi descrito por Sambrook e cols (1989). Após a
transferência, o material foi fixado à membrana através de irradiação ultra-ultravioleta
(UV Cross linker Stratagene, La Jolla, CA, EUA). A membrana foi pré- hibridizada
com uma solução QuikHyb (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) por 10 min a 37°C. Para
hibridização foi utilizado como sonda um oligonucleotídeo (10 µM), interno de ClC-2
49
49
(5’ CAGGCTCAGCAATGGATG 3’) análogo à seqüência amplificada marcado
radiotivamente com [γ
32
P] dATP (3.000 Ci/mmol, Amersham, IL, EUA), utilizando a
enzima polinucleotídeo quinase T4.
A membrana foi lavada duas vezes por 15 minutos cada, em 2X SSC e 0.1%
SDS à temperatura ambiente e expostas em filmes de raio-X (Kodak X-OMAT Films
TM
Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, Missouri, EUA) a - 70°C por, no mínimo, 16 horas.
III-10) “Immunoblotting”
Com o intuito de determinar a expressão da proteína codificadora do canal de
cloreto ClC-2 em rim total de ratos controle e com dieta hipersódica durante 5 dias, a
técnica de “Immunoblotting” foi utilizada.
A expressão da proteína do ClC-2 de rim total de ratos, controle e com dieta
hipersódica foi comparada por “immunoblotting” utilizando imunoglobulina policlonal
de galinha (Ig)Y contra a região carboxi-terminal do ClC-2, que especificamente
reconhece a proteína do ClC-2 (Murray & cols.,1995). Os rins de ratos controle e
com dieta hipersódica foram homogeneizados. O homogenato foi centrifugado a
1000g por 10min. O precipitado foi diluído em 3 volumes da mesma solução, e a
centrifugação foi repetida. Ambos os sobrenadantes foram centrifugados a 10.000g
por 20 min. O sobrenadante formado foi centrifugado a 100.000g por 1 h, formando
um precipitado que foi diluído em solução de homogeneização. A concentração das
proteínas foi obtida utilizando-se o reagente de Bradford, e a albumina bovina usada
como padrão (Bradford, 1976). Os extratos foram solubilizados aquecendo a 95°C
por 2 min em solução. As proteínas (50µg) foram submetidas a eletroforese em gel
de poliacrilamida e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (PVDF-Bio-
Rad, Hercules, CA). A membrana foi incubada com o anticorpo (Ig) Y contra a região
50
50
carboxi-terminal do ClC-2 (1:50) em solução de ligação a 4°C por 12-24 h. Após isto,
a membrana foi incubada com o anti-galinha IgG (1:10.000) e streptavidina ligada a
peroxidase (1:1000) (Amersham,IL,USA,Arlington Heights,IL). O “immunoblotting” foi
revelado por quimioluminescência (Amersham) por 5 min. Os controle consistiram de
inibidor competitivo da proteína do ClC-2 com o antígeno ClC-2 purificado como
descrito previamente (Murray & cols , 1995; Thiemann, 1992).
Nos animais tratados com hormônios tireóideos, a proteína de rim total foi
observada e comparada utilizando um anticorpo primário contra ClC-2 de coelho
(Sigma), que corresponde ao peptídeo entre os aminoácidos 888 – 906 da proteína
original do ClC-2 de rato.
Os rins dos animais tratados com hormônios tireóideos foram homogeneizados
conforme descrito acima. Para o “immunoblotting”, 100µg de proteínas totais foram
submetidas à eletroforese em gel SDS-PAGE. Após eletroforese as proteínas foram
transferidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45µm (Immobilon-NC,
Sigma). O anticorpo utilizado foi diluído 1:300 em tampão Tris salina-Tween 3% de
leite desnatado. A membrana foi mantida nessa solução a temperatura ambiente por
1h. Em seqüência, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário anti-coelho
sintetizado em cabra IgG (H + L) conjugado a fosfatase alcalina (1:1000). A proteína
do ClC-2 foi detectada utilizando uma solução alcalina contendo “nitroblue
tetrazolium chloride” (NBT) e 50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolylpjhosphate p-
toluidine salt (BCIP) (Life Technologies, Rockville, IL, USA) por 5 min.
Em alguns experimentos, a detecção da proteína da β-actina, foi utilizado como
controle interno, que teve sua expressão observada pelo anticorpo primário contra β-
actina de rato sintetizado em camundongo. Nesse caso foi utilizado o anticorpo
51
51
secundário anti-camundongo sintetizado em cabra IgG conjugado a fosfatase
alcalina (1:3.000) (Sigma).
III-11) Cultura primária de células de túbulo proximal de ratos
Os ratos foram anestesiados com pentobarbitol de sódio (5mg/100g peso
corporal). A aorta abdominal foi acessada e o rim esquerdo perfundido. O rim, então,
foi dissecado em finos cortes transversais e incubado a 37°C por 30 minutos com
solução salina contendo 0,5mg/L colagenase B (Sigma Aldrich, USA). (Kriz & Bankir,
1988). Ao final da digestão, os túbulos proximais de ratos normais (peso entre 250 –
300g) foram dissecados por um método modificado descrito por Toutain e
colaboradores (1991). Estes túbulos são transferidos para o meio (DMEM/F-12, 1:1,
Sigma Aldrich, USA), complementado com 5% soro fetal bovino (BFS) e,
microdissecados sob visão estereoscópica. Após a dissecção, aproximadamente 80
segmentos de túbulos com cerca de 2mm de comprimento, foram fixados em placas
próprias de cultura de 20 mm (Corning Incorporated, Corning, New York, EUA)
previamente plaqueados em DMEM/F-12, 1:1 complementados com 5µg/mL insulina
e 5µg/mL tranferrina (ambos da Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10
-7
M
hidrocortisona, 5ng/mL selênio de sódio 25 IU/ml penicilina e 25µg/mL de
estreptomicina (todos da Sigma). Os túbulos foram cultivados por 21-25 dias até
chegarem a confluência em estufa a 37°C e 5% CO
2
.
III-12) Estudo da região promotora do ClC-2
A possível modulação da região promotora do ClC-2 foi analisada em cultura de
células imortalizada de túbulo proximal de rato (IRPTc), gentilmente cedidas pela Dra
Margarida de Melos Aires do Laboratório de Biofísica Renal do Instituto de Ciências
52
52
Biomédicas da Universidade de São Paulo. As células foram cultivadas em garrafas
próprias para o crescimento de células (25 cm
2
) (Corning Incorporated, Corning, New
York, EUA) até a confluência. O crescimento aconteceu em meio Dubelcco’s
Modified Eagle (DMEM), contendo baixa glicose, L-glutamina, 110 mg/L de piruvato
de sódio, hidrocloreto de piroxina e bicarbonato de sódio, além de 10% de soro fetal
bovino (SBF) (Gibco BRL, invitrogen, Calsbad, CA, USA), sempre em estufa a 37°C
com 5% CO
2
. Um dia antes da transfecção, as células em confluência da garrafa
foram expostas a tripsina 0,05% em solução livre de Ca
++
e Mg
++
para soltarem da
garrafa. Estas células foram plaqueadas em placa de seis poços (6-well com discos
de 35 mm de diâmetro) (Corning Incorporated, Corning, New York, EUA). Quando
estas células chegaram a 70% de confluência, elas foram co-transfectadas com 2µg
do DNA de plasmídeo contendo o promotor do ClC-2 (cedido gentilmente por Drª P.
Zeitlin, Dept° de Pediatria, John Hopinkins University, Baltimore, Maryland, USA)
(Chu & cols, 1999). O ensaio de transfecção transiente foi feito utilizando
LipofectAMINE 2000 (GIBCO), segundo o protocolo fornecido pelo fabricante.
Brevemente, 2µg da construção do promotor do ClC-2 e 0,5 µg de plasmídio pSV-β-
galactosidase
(gentilmente por Dr. Peter Kopp, Division of Endocrinology,
Northwestern University, Chicago, Illinois, USA) diluídos em 250 µl soro D-MEM sem
antibiótico, usando 6 µl de LipofectAMINE 2000 reagent
(Invitrogen, San Diego, CA,
USA) diluído em 250 µl D-MEM sem soro e antibiótico e adicionados as células em
volume final de 500 µl por poço. Após isso, as células foram incubadas a 37°C por 3
h com o meio mencionado acima. Após o período de incubação este meio foi
removido e 2 ml de meio D-MEM complementado foi adicionada a cada poço, onde
as células permaneceram incubadas por 24 h. Após este período as células foram
lavadas e tratadas com T
3
10
-9
M 10
-8
M 10
-7
M 10
-6
M 10
-5
M por 24 h à 37°C. As
53
53
células foram lavadas com tampão fosfato salino (PBS) e lisadas em 250 µl (por
poço) com tampão de por 20 mim a temperatura ambiente. A atividade da Luciferase
foi quantificada usando 200 µl de lisado de células, 100 µl de D-luciferin (Molecular
Probes Inc., Eugene, OR, USA) e 100 µl de tampão de ensaio da luciferase por
amostra. A emissão de luz foi detectada usando um TD-20/20 Luminometer (Turner
Designs, Ann Arbor, MI, USA) por 30 segundos a temperatura ambiente. A atividade
da β-Galactosidase utilizada para normalização dos resultados foi quantificada
usando 30 µl de lisado de células, 160 µl de reagente 2-Nitrophenyl-bD-
galactopyranoside (ONPG) e 810 µl de tampão β-gal a 420
nm.
III-13) Análise da fração de eletrólitos
Para análise dos parâmetros urinários e sanguíneos da fração de eletrólitos
foram retiradas amostras de sangue no momento do sacrifício e amostras de urina
de todos os ratos e/ou camundongos de cada grupo experimental. Foram medidos
as concentrações plasmáticas de K
+
, Na
+
, Cl
-
e creatinina e a fração de excreção
(FE) de cada um dos eletrólitos citados. A urina dos ratos foi coletada por um
período de 24 h anteriores ao sacrifício para determinar o fluxo urinário.
III-14) Radioimunoensaio
O hormônio tireóideo foi medido no plasma por radioimunoensaio altamente
sensível e específico usando anticorpo específico (Kit Coat A Count, Diagnostic
Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). O protocolo seguido neste
experimento foi fornecido pelo fabricante.
54
54
III-15) Densitometria
Foi feita a densitometria das bandas correspondentes a expressão dos RNAm e
da proteína do ClC-2, β-actina e/ou GAPDH nas diferentes situações descritas com
a utilização de programa de análise computacional (Scion Image corporation, gel
analysing software, USA). Os valores obtidos para o ClC-2 foram padronizados com
o controle interno, a β-Actina ou GAPDH.
III-16) Análise estatística
Os resultados estão apresentados em média ±EM. Para análise dos experimentos
com três grupos de animais ou mais foi realizado o teste de “One-way ANOVA”
seguido pelo teste de múltiplas comparações “Student-Newman Keuls”. Para a
comparação de dois grupos experimentais utilizamos o teste t-student. A diferença
foi aceita como significativa quando (*) p < 0,05 (estatisticamente diferente).
55
55
RESULTADOS
56
56
VI-1) Expressão do RNAm do ClC-2 nas regiões corticais e medulares de rins
de ratos normais através da técnica de ensaio de proteção contra Rnase (RPA)
O ensaio de proteção contra RNase (RPA) foi utilizado para quantificar o RNAm
do ClC-2 nas regiões corticais, medulares externas e internas de rim de rato normal.
A quantidade de RNAm referente ao gene do ClC-2 foi estimada através de
densitometria do sinal auto-radiográfico resultante da hibridização de 40 µg do RNA
total com sondas de RNA antisense marcado com UTP radioativo específicas tanto
para o ClC-2 quanto para a β-actina.
Quando as sondas foram hibridizadas com 10 µg de RNA total de levedura, na
presença de RNase, nenhum dos fragmentos protegidos pode ser observado, o que
demonstra a eficiência da enzima. Na ausência de RNase, as sondas não digeridas
apresentaram tamanho maior em relação ao fragmento protegido. Isto ocorre, porque
durante a síntese da sonda de RNA marcada, além do fragmento correspondente ao
gene de interesse pequenas seqüências do vetor linearizado também são transcritas.
A detecção dos fragmentos protegidos de tamanho correspondente a 615 pb
indica que o gene do ClC-2 está sendo expresso nos diferentes grupos
experimentais. Os fragmentos protegidos de 215 pb ou 316 pb correspondentes,
respectivamente, à expressão da β-actina ou do GAPDH, foram utilizados na
normalização dos resultados. Foi observado que o RNAm do ClC-2 (615 pb)
apresenta expressão diferenciada entre as regiões corticais e medulares, sendo a
medula externa a região de maior expressão desse RNAm. Em relação à medula
externa, a região cortical e medular interna apresentam, respectivamente, 75% e
24% da expressão do RNAm para o ClC-2 (Figura 9).
57
57
Valores densitométricos arbitrários
do ClC-2 /β-actina
ClC
-
2
β
-
actina
P M C O M E M I
615 p b
12 5 pb
A m ostras
s
Sondas
B
ClC-2
β-actina
0
1000
2000
3000
4000
5000
córtex ME MI
0
1000
2000
3000
4000
5000
córtex ME MI
ME
Córtex MI
ClC-2 (615 pb)
ME
Córtex MI
ClC-2 (615 pb)
ME
Córtex MI
ClC-2 (615 pb)
ME
Córtex MI
ClC-2 (615 pb)
ME
Córtex MI
ClC-2 (615 pb)
Córtex MI
ClC-2 (615 pb)
C
A
*
Figura 9: Distribuição do RNAm do ClC-2 entre córtex, medula
externa e medula interna de rim de rato. (A) Produto de PCR
submetido a “Southern blot” para o gene ClC-2 extraído das regiões de
córtex (CO), medula externa (ME) e medula interna (MI) de rim de rato.
(B) Figura representativa de um filme auto-radiográfico de RPA. (C)
Gráfico representativo da média dos valores densitométricos
arbitrários das bandas referentes ao gene ClC-2 normalizadas pela β-
actina. (n=4, (*) p< 0,05).
58
58
VI-2) Detecção da expressão do RNAm do gene do ClC-2 em diferentes
segmentos do néfron de rato
Nesses experimentos examinamos a expressão do RNAm do ClC-2 em
segmentos dissecados de néfron de rato. Cada reação foi realizada utilizando 3 mm
de comprimento de túbulos renais ou 5 glomérulos.
O produto de amplificação de 615 pb, referente ao RNAm do ClC-2 foi detectado
por RT-PCR no glomérulo, túbulo proximal na sua porção convoluta (PCT) e reta
(PST), porção espessa medular (mTAL) e cortical (cTAL) da alça de Henle, porção
fina da alça de Henle (TL) e ducto coletor medular interno (IMCD). O RNAm do ClC-2
não foi detectado no ducto coletor cortical (CCD) e no ducto coletor medular externo
(OMCD) (Figura 10).
A técnica de “Southern Blotting” foi utilizada para confirmar os resultados da
distribuição do RNAm do ClC-2 obtidos através de RT-PCR. A especificidade na
ligação da sonda (oligonucleotídeo interno marcado radiotivamente com [
32
P] γdATP)
ao fragmento de cDNA de 615 pb mostra tratar-se do RNAm do ClC-2. O produto de
amplificação da β-actina (226 pb) foi detectado em todos os segmentos do néfron
(Figura 10).
59
59
Figura 10: Detecção do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de rato.
Figura representativa da expressão do RNAm em cada segmento do
néfron. Glomérulo (GL), Túbulo proximal convoluto (PCT), túbulo
proximal reto (PST), porção espessa cortical da alça de Henle (cTAL),
ducto coletor cortical (CCD), porção espessa medular da alça de Henle
(mTAL), ducto coletor externo (OMCD), ducto coletor interno (IMCD) e
porção fina da alça de Henle (HL). São observadas bandas referentes ao
gene do ClC-2 em todos os segmentos com exceção dos segmentos
CCD e OMCD. O gene da β-actina foi utilizado como controle positivo
para a reação de RT-PCR e, a sua respectiva banda pode ser visualizada
em todos os segmentos do néfron.
HL
IMCD
OMCD
mTAL
cTAL
PST
PCT
Gl
CCD
HL
IMCD
OMCD
mTAL
cTAL
PST
PCT
Gl
RT-
RT-
CCD
PM
60
60
VI -3) Análise da fração de excreção de eletrólitos em animais tratados com
dieta rica em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de aldosterona
O sucesso do modelo experimental é sumarizado na tabela 2. Observamos,
nesta tabela, que a fração de excreção de potássio (K
+
FE) não variou
significativamente entre os diferentes grupos do modelo em relação aos ratos
controles. A fração de excreção de sódio (Na
+
FE) aumentou 79% nos ratos
adrenalectomizados (ADX) e 2 vezes no grupo submetido à dieta rica em sódio (alto-
Na
+
-5d) em comparação com os ratos controles. A fração de excreção de cloreto (Cl
-
FE) aumentou em 1,5 vezes no alto-Na
+
-5d e 58% em ADX quando comparados aos
animais controles. O fluxo urinário aumentou em 58% no grupo alto-Na
+
-5d e 76% no
grupo ADX. O ritmo de filtração glomerular (RFG) apresentou aumento de 57%
enquanto que o grupo ADX apresentou uma diminuição de 37%, ambos em relação
ao controle. Já os ratos ADX com reposição de aldosterona (ADX+ALDO), em doses
consideradas fisiológicas (Martin & cols., 1983), não apresentaram diferenças
significativas nas frações de excreção de Na
+
ou de Cl
-
, no fluxo urinário nem mesmo
no RFG em relação aos ratos controles. Quanto ao peso corporal, não houve
variação significativa entre os grupos experimentais.
Controle Na
+
-5dias ADX ADX+ALDO
K
+
FE (%) 48,47 ± 0,85
46,13 ± 3,12
45,76 ± 3,02
47,87 ± 0,63
Na
+
FE (%) 1,17 ± 0,35 3,60 ± 0,20* 2,1 ± 0,18* 1,02 ± 0,26
Cl
-
FE (%) 2,40 ± 0,36 6,20 ±2,34* 3,8 ± 0,22* 2,07 ± 0,56
Fluxo Urinário (ml/dia)
9,5 ± 0,5 15 ±1,00* 16,7 ± 0,6* 10,6 ± 0,7
RFG (ml/Kg/min) 5,84 ± 0,45 9,16 ± 1,29* 3,7 ± 0,56* 4,97 ± 0,35
Peso corporal (g) 205,4 ± 15 201,3 ± 5 198,7 ± 9 207,1 ± 9
Tabela 2: Valores do fluxo urinário, ritmo de filtração glomerular (RFG), peso corporal,
fração de excreção (FE) de K
+
, Na
+
e Cl
-
de ratos controle, submetidos a dieta hipersódica
durante 5 dias (Na
+
-5dias), adrenalectomizados (ADX) e adrenalectomizados com reposição
de aldosterona (ADX+ALDO) . (*) p<0,05.
61
61
VI-4) Expressão do RNAm do ClC-2 em córtex e medula rim de ratos
submetidos a dieta hipersódica através da técnica de ensaio de proteção
contra Rnase (RPA)
Foram comparadas as expressões do RNAm do ClC-2 extraídos de medula e córtex
renal de animais controle (C) e animais tratados com dieta rica em sódio por 5 dias
(Na
+
-5d). Nossos resultados mostram que, comparado com o controle, houve
diminuição de expressão do RNAm do ClC-2 em 44% no córtex e 28% na medula
quando animais são tratados com Na
+
-5d (n=4, p<0,05) (Figura 11).
VI-5) Análise da expressão da proteína do ClC-2 em rim total de ratos através
da técnica de “immunoblotting”
Após observarmos a modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em animais
controle e Na
+
-5d, a expressão da proteína do ClC-2 foi caracterizada somente em
rim total de ratos submetidos à Na
+
-5d e comparados à expressão em rim de ratos
controle. Foram colocados 50µg de proteínas de membrana extraídas de rim total de
ratos, controle e Na
+
-5d, em cada pista (ou linha) de gel desnaturante de
poliacrilamida para se comparar a expressão do ClC-2 entre esses dois grupos. Os
ratos submetidos à Na
+
-5d tiveram a expressão do ClC-2 diminuída em 41% dos
valores encontrados no grupo controle. A banda de menor peso molecular (80 kDa)
corresponde a uma variação funcional do ClC-2 descrita no rim (Cid & cols, 2000).
(Figura 12).
62
62
(615 pb)
ClC-2
(615 pb)
ClC-2
β
ββ
β
-actina (125pb)
β
ββ
β
-actina (125pb)
Córtex
Medula
Córtex
Medula
5
d
-
N
a
+
controle
Córtex
Medula
Córtex
Medula
5
d
-
N
a
+
controle
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
CC CM 5d C 5d M
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
CC CM 5d C 5d M
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
p<0,05
p<0,05
Figura 11: Expressão do RNAm do ClC-2 em grupos de animais
controle e tratados com dieta rica em sódio (5d-Na+) (A) Filme
auto-radiográfico com a presença das bandas para ClC-2 e β-actina,
respectivamente, para os grupos controle córtex (CC) e controle
medula (CM) e, o com dieta rica em sódio em córtex (5d C) e medula
(5d M). (B) Gráfico representativo dos experimentos de RPA (Ensaio
de proteção contra Rnase) comparando a expressão do RNAm do ClC-
2 em córtex e medula renal de ratos controle e submetidos à dieta rica
em sódio durante 5 dias. (n=4, (*) p<0,05).
63
63
5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+
controle
97 kDa
66 kDa
ClC-2
5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+
controle
5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+5d-Na+
controle
97 kDa97 kDa
66 kDa66 kDa
ClC-2ClC-2
0
0,5
1
1,5
Controle 5d-Na+
0
0,5
1
1,5
Controle 5d-Na+
*
Valores densitométricos arbitrários
do ClC-2
≅90kDa
ClC-2
(isoforma)
≈80kDa
Figura 12: Expressão da proteína do ClC-2 em rim total de ratos
controle e submetidos à dieta rica em sódio (5d-Na+) por
“immunobloting”. (A) Figura representativa de um experimento, controle e
dieta rica em sódio (5d-Na+) (B): Gráfico representativo da média dos
valores densitométricos relativos obtidos para as bandas do ClC-2 em
ambos os grupos de animais, controle e 5d-Na+. (n=3, (*) p<0,05).
64
64
VI-6) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos submetidos a diferentes
tratamentos através da técnica de ensaio de proteção contra RNase (RPA)
Para observar o possível papel da aldosterona na regulação da expressão do RNAm
do ClC-2 em rim total de rato, grupos de ratos controle, ADX e ADX+ALDO foram
avaliados através da técnica de RPA. Os fragmentos protegidos de 316 pb
correspondentes à expressão do GAPDH foram utilizados na normalização dos
resultados. Observou-se que adrenalectomia leva a diminuição da expressão do
RNAm do ClC-2 em rim total em 37% e na reposição da aldosterona em ratos
adrenalectomizados não há queda da expressão quando comparados ao controle
(n=4, p<0,05) (Figura 13).
VI-7) Experimentos preliminares à técnica de RT-PCR semiquantitativo
VI-7.1) Determinação do comprimento do néfron necessário para a
amplificação ideal do gene do ClC-2 por RT-PCR
O objetivo desse experimento foi determinar o comprimento ideal de néfron
dissecado no qual a amplificação do RNAm tanto do ClC-2 quanto da β-actina por
RT-PCR pudessem ser visualizados na mesma reação em gel de agarose 1,5%
corado com brometo de etídio. O segmento PST foi escolhido para realização deste
experimento por apresentar expressão abundante do gene do ClC-2.
Diversos comprimentos de PST de ratos controle foram dissecados e as
amostras obtidas lisadas em triton X-100 seguida de transcrição reversa e
amplificação por PCR. Os comprimentos de túbulos renais dissecados foram: 1.0,
1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 e 6 mm. Foi observado que o comprimento de 3 mm de túbulo
renal é o ideal para a realização dos experimentos, pois se apresenta na fase
exponencial de amplificação tanto do ClC-2 quanto da β-actina. A partir de 4.0 mm
65
65
de comprimento de PST foi observada a saturação da reação de RT-PCR para o
gene do ClC-2. Foi construído um gráfico referente aos valores das intensidades
densitométricas obtidas das bandas do gel do RT-PCR (Figura 14).
VI-7.2) Determinação do número ideal de ciclos de PCR a ser utilizado para a
amplificação do RNAm do ClC-2 a partir de 3mm de PST de rato
Uma vez determinada a comprimento ideal de túbulo renal a ser utilizada na reação
de RT-PCR para devida visualização dos genes ClC-2 e β-actina foi determinado o
número ideal de ciclos no qual a reação para amplificação dos dois genes juntos não
atinge a saturação. Foi utilizado neste experimento cDNA preparado a partir de 3mm
de PST extraído de rim de animais controle sendo que o número de ciclos utilizados
na reação de PCR foi: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 e 41 (Figura 15).
A análise das intensidades densitométricas das bandas revelou que a repetição
do ciclo por 35 vezes é a ideal para realização dos experimentos, pois não é atingida
a saturação da reação para nenhum dos genes amplificados.
66
66
controle
ADX
ADX+ALDO
615pb (ClC-2)
316pb (GAPDH
)
controle
ADX
ADX+ALDO
controle
ADX
ADX+ALDO
615pb (ClC-2) 615pb (ClC-2)
316pb (GAPDH
)
316pb (GAPDH
)
B
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Controle ADX ADX+ALDO
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Controle ADX ADX+ALDO
*
Valores densitométricos arbitrários
(ClC-2 / GAPDH)
Figura 13: Expressão do RNAm do ClC-2 avaliada por RPAem grupos
de animais controle, adrenalectomizados (ADX) e ADX com reposição
de aldosterona (ADX+ALDO). (A) Filme auto-radiográfico com a presença
das bandas para ClC-2 e GAPDH, respectivamente. (B) Gráfico
representativo dos experimentos de RPA comparando a expressão do
RNAm do ClC-2 em rim total de animais controle, ADX e ADX+ALDO. (n=4,
(*) p<0,05) vs controle.
67
67
Logaritmo dos valoresdensitométricos arbitrários
ClC-2 / β-actina
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
27 29 31 33 35 37 39 41
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
27 29 31 33 35 37 39 41
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
27 29 31 33 35 37 39 41
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
27 29 31 33 35 37 39 41
Número de ciclos
log CLC -2 log B-actinalog CLC -2 log B-actinalog CLC -2 log B-actinalog CLC -2 log B-actina
615 pb (ClC-2)
226 pb (β-actina)
615 pb (ClC-2)
226 pb (β-actina)
A
C
PM RT- 27 29 31 33 35 37 39 41
Logaritmo dos valoresdensitométricos arbitrários
ClC-2 / β-actina
3.30
3.60
3.90
4.20
4.50
0 1 2 3 4 5 6
Comprimento em mm
log ClC-2
logβ-actina
3.30
3.60
3.90
4.20
4.50
0 1 2 3 4 5 6
Comprimento em mm
log ClC-2
logβ-actina
B
D
PM RT(-) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Figura 14: Determinação do
comprimento do néfron
necessário a amplificação ideal
do RNAm do ClC-2 e
β
ββ
β
-actina
na mesma reação de RT-PCR.
(A) Gel de agarose 1,5%
representativo de um RT-PCR
realizado para os diferentes
comprimentos de túbulo proximal
reto (PST) dissecados. (B)
Gráfico representativo do
logaritmo dos valores arbitrários
obtidos através da densitometria
das bandas obtidas a partir do
RT-PCR para o gene do ClC- 2 e
do gene da
β
-actina em função
dos valores densitométricos dos
diferentes comprimentos, em
milímetros, de túbulo proximal
reto.
Figura 15: Determinação do
número de ciclos necessários
a amplificação ideal do RNAm
do ClC-2 e
β
ββ
β
-actina na mesma
reação de RT-PCR. (C) Gel de
agarose 1,5% representativo de
um RT-PCR realizado para os
diferentes ciclos de PCR
realizados. (D) Gráfico
representativo dos valores
arbitrários em logaritmo, obtidos
através da densitometria das
bandas obtidas a partir do RT-
PCR para o gene do ClC-2 e do
gene da
β
-actina em função dos
diferentes ciclos de RT-PCR
realizados.
68
68
VI-8) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos
em dieta rica em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de
aldosterona por RT-PCR
Para determinar o RNAm do ClC-2 é modulado pela aldosterona, foram realizados
experimentos nos segmentos onde sabidamente ocorre a ação da aldosterona e
onde o RNAm do ClC-2 está expresso (Scholer & cols, 1979). Assim, foram
microdissecadas as porções espessas medulares (mTAL) e corticais (cTAL) da alça
de Henle e o túbulo proximal reto (PST). Cada reação foi realizada utilizando 3mm
de túbulo renal de animais controle, ADX+ALDO e Na
+
-5d.
Na porção do túbulo proximal reto (PST), não foram observadas variações
significativas da expressão do RNAm do ClC-2 para os grupos controle, ADX, ADX +
ALDO e Na
+
-5d, respectivamente. (Figura 16).
Na porção espessa medular da alça de Henle (mTAL), foi observado diminuição
significativa na expressão do RNAm do ClC-2 de 43% no grupo ADX e 38% no
grupo Na
+
-5d quando comparados ao grupo controle. Não há variação da expressão
do RNAm do ClC-2 no grupo ADX+ALDO em relação ao controle. (Figura 17).
Na porção espessa cortical da alça de Henle (cTAL), a diminuição da expressão do
RNAm do ClC-2 no grupo ADX foi 64% e a diminuição no grupo Na
+
-5d foi 50%,
ambos comparados ao grupo controle. Já o grupo ADX+ALDO não apresentou
variação da expressão do RNAm do ClC-2 em relação ao controle. (Figura 18).
69
69
controle ADX
ADX +
ALDO
5d-Na+RT (-)PM
615 pb (ClC-2)
226 pb (β-actina)
0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
1
1 ,2
1 ,4
1 2 3 4
controle ADX
ADX+ALDO
5d-Na+
0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
1
1 ,2
1 ,4
1 2 3 4
controle ADX
ADX+ALDO
5d-Na+controle ADX
ADX+ALDO
5d-Na+
PST
V
alores densitométricos arbitrários
(ClC-2 / β-actina)
Figura 16: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em túbulo
proximal reto (PST) entre os diferentes grupos experimentais
avaliados por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1% representativo dos
experimentos realizados. As abreviações correspondem a controle
negativo (RT-) e grupos de animais controle (C), adrenalectomizados
(ADX), adrenalectomizados com reposição de aldosterona (ADX+ALDO) e
com dieta hipersódica por 5 dias (5d-Na+). (B) Gráfico representativo da
média da razão entre as intensidades do ClC-2 e da
β
-actina obtidas por
RT-PCR entre os diferentes grupos experimentais. (n=5).
70
70
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1 2 3 4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1 2 3 4
Na
+
controle ADX ADX+ALDO
5d-
*
*
Valores densitométricos
arbitrários
(ClC-2/β-actina)
615pb (ClC-2)
mTAL
5d -Na
+
controle
ADX
ADX+
ALDO
RT (-)PM
226pb (
β−
actina)
Figura 17: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção
espessa medular da alça de Henle (mTAL) entre os diferentes
grupos experimentais avaliados por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle
(C), adrenalectomizados (ADX), adrenalectomizados com reposição de
aldosterona (ADX+ALDO) e com dieta rica em sódio por 5 dias (5d-
Na+). (B) Gráfico representativo da média da razão entre as
intensidades das bandas do ClC-2 e da
β
-actina obtidas por RT-PCR
entre os diferentes grupos experimentais. (n=5) (*) p< 0,05 vs controle.
71
71
5d-Na
+
controle
ADX
ADX+
ALDO
RT (-)PM
615 pb (ClC-2)
226 pb (β-actina)
cTAL
controle
ADX
ADX+ALDO
5d-Na+
*
*
controle
ADX
ADX+ALDO
5d-Na+
controle
ADX
ADX+ALDO
5d-Na+
*
*
Valores densitométricos
arbitrários
(ClC-2/β-actina)
0
0,2
0,4
0,6
1
1,2
1,4
0,8
0
0,2
0,4
0,6
1
1,2
1,4
0,8
0,8
Figura 18: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção
espessa cortical da alça de Henle (cTAL) entre os diferentes
grupos experimentais avaliados por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle
(C), adrenalectomizados (ADX), adrenalectomizados com reposição de
aldosterona (ADX+ALDO) e com dieta rica em sódio por 5 dias (5d-
Na+). (B) Gráfico representativo da média da razão entre as
intensidades da banda do ClC-2 e da β-actina obtidas por RT-PCR entre
os diferentes grupos experimentais. (n=5) (*) p< 0,05 vs controle.
72
72
VI-9) Modulação do RNAm de ClC-2 nos segmentos cTAL e mTAL de ratos
tratados com furosemida
Para determinar o possível envolvimento da alteração de transporte gerada no
tratamento dos ratos ADX, ADX+ALDO e Na
+
-5d na modulação do RNAm do ClC-2,
ratos Wistar normais foram tratados com duas doses diferentes de furosemida.
Furosemida é um potente bloqueador do co-transportador tríplice Na
+
/K
+
/2Cl e altera
o transporte de íons nas células da porção espessa da alça de Henle.
Os valores obtidos correspondem a um aumento estaticamente significativo de
1,9 vezes o valor do controle em cTAL e 100% em mTAL para o grupo de alta dose
de furosemida (100 mg/Kg PC de furosemida). O grupo de ratos que recebeu a dose
mais baixa de furosemida (10 mg/Kg), não apresentou alteração da expressão do
RNAm do ClC-2 em ambos os segmentos analisados, cTAL e mTAL. (Figura 20).
73
73
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1 2 3
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1 2 3
controle
F10
F100controle
F10
F100
*
ClC-2 (615 pb)
β-actina (226 pb)
ClC-2 (615 pb)
β-actina (226 pb)
controle
F10
RT (-)
PM
F100
controle
F10
RT (-)
PM
F100
cTAL
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
Figura 19: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção
espessa cortical da alça de Henle (cTAL) entre os diferentes grupos
experimentais avaliados por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle
(C), animais que receberam 10mg/Kg (F10) e 100mg/Kg (F100) de
furosemida em solução oral (300µl) via cânula estomacal. (B) Gráfico
representativo da média da razão entre as intensidades do ClC-2 e da β-
actina obtidas por RT-PCR entre os diferentes grupos experimentais.
(n=3, (*) p< 0,05 vs controle).
74
74
controle
F10
RT (-)
PM
F100
controle
F10
RT (-)
PM
F100
mTAL
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3
*
-
-
controle
F10
F100
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3
*
-
-
controle
F10
F100
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3
*
-
-
controle
F10
F100
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3
*
-
-
controle
F10
F100
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
ClC-2 (615 pb)
β-actina (226 pb)
Figura 20: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção
espessa da alça de Henle porção medular (mTAL) entre os diferentes
grupos experimentais avaliados por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações correspondem
a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle (C), animais que
receberam 10mg/Kg (F10) e 100mg/Kg (F100) de furosemida em solução
oral (300µl) via cânula estomacal. (B) Gráfico representativo da média da
razão entre as intensidades do ClC-2 e da β-actina obtidas por RT-PCR
entre os diferentes grupos experimentais. (n=3, (*) p< 0,05 vs controle).
75
75
VI-10) Determinação das concentrações séricas dos hormônios tireóideos em
ratos
Nos animais hipotireóideos quase não se detectou T
4
pela técnica em uso, devido
a baixas concentrações de T
4
sérico, o grupo de animais hipotireóideos reposto com
T
4
apresentou valores de T
4
sérico similares ao grupo controle. Já o grupo de
animais hipertireóideos alcançaram um valor de 100% acima do controle. (Tabela 3).
Controle HIPO HIPO + T4 HIPER
T
4
sérico
(µ
µµ
µg/dl)
3,047±0,45
0,010±0,00
*
2,56±0,20
6,430±0,95
*
VI-11) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim total de ratos hipotireóideos com
ou sem reposição e hipertireóideos avaliados por RPA
Foi utilizada a técnica de RPA para observar o possível papel dos hormônios
tireóideos na regulação da expressão do RNAm do ClC-2 em rim total de ratos
distribuídos em grupos de ratos controle (C), hipotireóideos (HIPO), hipotireóideos
com reposição de tiroxina (HIPO+T
4
) e hipertireóideo (HIPER).
Os animais hipotireóideos apresentaram uma diminuição de 34% da expressão
do RNAm do ClC-2 em rim total, enquanto que nos animais hipertireóideos
apresentaram um aumento de 62% na expressão do RNAm do ClC-2; ambos foram
comparados aos ratos controles. Porém, os animais do grupo que recebeu reposição
de hormônio tireóideo tiroxina (HIPO+T
4
) não apresentaram variação significativa,
mas valores similares aos encontrados nos ratos controles. (Figura 21).
Tabela 3:
Quantificação sérica de hormônio tireóideo T
4
realizada por
radioimunoensaio específico. HIPO (Hipotireóideo), HIPO + T4 (
Hipotireóideo
com reposição hormonal), HIPER (Hipertireóideo), (*) p< 0,05.
76
76
ClC-2 (615 pb)
GAPDH (317pb)
0
0,5
1
1,5
2
Controle
HIPER
0
0,5
1
1,5
2
Controle
HIPER
CONTROLE
HiPO
HiPO + T4
HIPER
ClC-2 (SONDA)
GAPDH (SONDA)
ClC-2 (SONDA DIGERIDA)
GAPDH (SONDA DIGERIDA)
GAPDH (317pb)
HIPO
HIPO
+T4
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/GAPDH
*
*
Figura 21: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 entre os
diferentes grupos experimentais avaliadas por RPA (A) Filme auto-
radiográfico de RPA onde são observadas as bandas referentes aos
RNAm do ClC-2 e do GAPDH de rim de animais controle, hipotireóideos
(HIPO), hipotireóideos com reposição de T4 (HIPO+T4) e
hipertireóideos (HIPER). (B): Gráfico representativo dos valores obtidos
a partir da razão dos valores densitométricos do ClC-2 e do GAPDH,
entre os diferentes grupos experimentais estudados em relação ao
controle. (n=8, (*) p<0,05) vs controle.
77
77
VI-12) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos
hipotireóideos, com ou sem reposição, e hipertireóideos avaliados por RT-PCR
Foram realizados experimentos de RT-PCR para observar a expressão do RNAm
do ClC-2 em cada segmento do néfron dos grupos experimentais utilizados,controle
(C), hipotireóideos (HIPO) hipotireóideos com reposição de T
4
(HIPO+T4) e
hipertireóideos (HIPER). O resultado obtido mostrou que não há variação da
expressão do RNAm do ClC-2 em nenhum dos grupos (HIPO, HIPO+T4
e HIPER)
comparados ao controle nas seguintes porções do néfron: glomérulo, alça fina de
Henle (HL), porção espessa cortical (cTAL), porção espessa medular (mTAL) e
ducto coletor medular interno (IMCD). (Figura 22).
Na porção do túbulo proximal convoluto (PCT) foi observado que animais HIPER
aumentaram em 47% a expressão do RNAm do ClC-2, já os animais HIPO
observou-se uma diminuição da expressão em 52%, ambos quando comparados ao
grupo controle (n=6,
p<
0,05). (Figura 23).
No túbulo proximal reto (PST) a expressão do RNAm do ClC-2 aumentou no
grupo HIPER em 56% e diminuiu no grupo HIPO em 49,3%, em relação ao grupo
controle (n=6,
p<
0,05). (Figura 24). Em ambos os segmentos, os grupos HIPO+T4
apresentaram a expressão do RNAm do ClC-2 similar ao grupo de animais controle.
(Figuras 23 e 24).
78
78
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4
cTAL
Valores densitométricos
(ClC-2 / β-actina)
HIPO
HIPO
+
T4
C
HIPER
HIPO
HIPO
+ T4
C
HIPER
PM
RT (-)
C
l
C
-
2 (615pb)
β
-
actina (226pb)
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4
Glomérulo
Valores densitométricos
(ClC-2 / β-actina)
HIPO
HIPO
+ T4
C
HIPER
HIPO
HIPO
+ T4
C
HIPER
PM
RT (-)
C
l
C
-
2 (615pb)
β
-
actina (226pb)
Figura 22: Modulação da expressão do RNAm do ClC-
2 no glomérulo, Alça de Henle, Alça de Henle espessa
medular (mTAL), Alça de Henle esp
essa cortical
(cTAL), ducto coletor medular interno (IMCD) entre
os diferentes grupos experimentais avaliadas por RT-
PCR.
(A) Gel de agarose 1% representativo dos
experimentos realizados. As abreviações correspondem
a controle negativo (RT-) e grupos de
animais controle
(C), (HIPO) ratos hipotireóideos, (HIPO+T4) ratos
hipotireóideos infundidos com doses fisiológicas de
tiroxina (1µ
g/100g P.C./10 dias) e (HIPER) ratos normais
infundidos com doses altas de tiroxina (10 µ
g/100g
P.C./10dias). (B) Gráfico rep
resentativo da média da
razão entre as intensidades as bandas do ClC-2 e da β-
actina obtidas por RT-
PCR entre os diferentes grupos
experimentais. (n=5).
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4
mTAL
HIPO
HIPO
+ T4
C
HIPER
PM
RT (-)
C
l
C
-
2 (615pb)
β
-
actina (226pb)
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4
Alça de Henle
Valores densitométricos
(ClC-2 / β-actina)
HIPO
HIPO
+ T4
C
HIPER
HIPO
HIPO
+ T4
C
HIPER
PM RT (-)
C
l
C
-
2 (615pb)
β
-
actina (226pb)
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4
IMCD
HIPO
HIPO
+ T4
C
HIPER
PM
RT (-)
C
l
C
-
2 (615pb)
β
-
actina (226pb)
79
79
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4
HIPO HIPO
+ T4
HIPER
ClC-2 (615pb)
β-actina (226pb)
PM
(RT-)
C
HIPO
HIPO
+ T4
HIPER
C
*
*
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
PCT
Figura 23: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 no túbulo
proximal convoluto (PCT) entre os diferentes grupos
experimentais avaliados por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle
(C), (HIPO) ratos hipotireóideos, (HIPO + T4) ratos hipotireóideos
infundidos com doses fisiológicas de tiroxina (1
µ
g/100g P.C./10 dias) e
(HIPER) ratos normais infundidos com doses altas de tiroxina (10
µ
g/100g P.C./10dias). (B) Gráfico representativo da média da razão
entre as intensidades da banda do ClC-2 e da
β
-actina obtidas por RT-
PCR entre os diferentes grupos experimentais. (n=5) (*) p<0,05 vs
controle.
80
80
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4
ClC-2 (615pb)
β-actina (226pb)
*
*
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
C
PST
PM
HIPO
+ T4
HIPER
HIPO
C
HIPO HIPO
+ T4
HIPER
Figura 24: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 no túbulo
proximal reto (PST) entre os diferentes grupos experimentais
avaliados por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1% representativo dos
experimentos realizados. As abreviações correspondem a controle
negativo (RT-) e grupos de animais controle (C), (HIPO) ratos
hipotireóideos, (HIPO + T4) ratos hipotireóideos infundidos com doses
fisiológicas de tiroxina (1
µ
g/100g P.C./10 dias) e (HIPER) ratos normais
infundidos com doses altas de tiroxina (10
µ
g/100g P.C./10dias). (B)
Gráfico representativo da média da razão entre as intensidades do ClC-2
e da
β
-actina obtidas por RT-PCR entre os diferentes grupos
experimentais. (n=5) (*) p<0,05 vs controle.
81
81
Nos segmentos ducto coletor cortical (CCD) e ducto coletor medular externo
(OMCD) não houve detecção de bandas relativas ao RNAm do ClC-2 em nenhum
grupo de animais analisados. (Figura 25).
CCD
β-actina (226pb)
β-actina (226pb)
OMCD
A
B
PM RT(-) C
HIPO HIPO
+T4
HIPER
HIPER
PM
RT(-) C HIPO
HIPO
+T4
Figura 25: Representação dos segmentos do néfron onde não foram
observadas as expressões do RNAm do ClC-2 nos diferentes grupos
experimentais, por RT-PCR: ducto coletor medular interno (OMCD) e
ducto coletor cortical (CCD) (A) Gel de agarose 1% representativo dos
experimentos realizados CCD e em (B) OMCD. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle (C),
(HIPO) ratos hipotireóideos, (HIPO + T4) ratos hipotireóideos infundidos
com doses fisiológicas de tiroxina (1µg/100g P.C./10 dias) e (HIPER) ratos
normais infundidos com doses altas de tiroxina (10 µg/100g P.C./10dias)
(n=3).
82
82
VI-13) Cultura primária de células de túbulo proximal de rato tratadas com
Hormônio Tireóideo
A fim de observar a ação dos hormônios tireóideos sobre a expressão gênica
do RNAm do ClC-2 em cultura de células foi utilizada cultura primária de células de
túbulo proximal de ratos. As células de túbulo proximal tratadas com T
4
nas
concentrações de 10
-9
, 10
-8
e 10
-7
M por 24h. Sendo observado um aumento
significativo do RNAm do ClC-2 de 37% para 10
-9
M, 79% para 10
-8
M e 100% para
10
-7
M. Todos foram comparados à expressão do RNAm do ClC-2 do grupo de
células controle não tratadas (n=3,
p<
0,05). (Figura 26).
VI-14) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de ratos controle,
hipotireóideos, com ou sem reposição, e hipertireóideos
Sabendo que os níveis de RNAm não necessariamente estão correlacionados
com a quantidade de expressão de proteína, foram realizados experimentos de
“immunoblotting” a fim de observar a expressão da proteína do ClC-2 em rim de
ratos dos grupos experimentais tratados ou não com hormônios tireóideos. Todos os
grupos tratados foram comparados ao grupo controle. Animais HIPO apresentaram
um decréscimo na expressão protéica do ClC-2 em 62% e; animais HIPER
apresentaram um aumento de 63%, (n=4,
p<
0,05). Nos animais HIPO + T4 a
expressão da proteína foi restaurada ao valor do grupo controle. (Figura 27).
83
83
0
0,5
1
1,5
2
2,5
controle (-9) (-8) (-7)
concentração de T4
Figura 26: Modulação da expressão do ClC-2 em cultura primária de
túbulo proximal (PCT) (A) Figura representativa do gel de agarose 1,5% com
bandas referentes ao RNAm do ClC-2 e da β-actina extraído de células
submetidas a diferentes concentrações do hormônio tireóideo (T
4
), 10
-9
, 10
-8
e
10
-7
M, respectivamente, por 24h avaliadas por RT-PCR (B) O gráfico
representa a média dos valores densitométricos do ClC-2 e da
β
-actina em
relação a média do controle (n=3) (*) p<0.01vs controle.
PM
(RT-
)
10
-8
M
controle
10
-9
M
10
-9
M
ClC-2
PM
(RT-
)
10
-8
M
controle
10
-9
M
10
-9
M
ClC-2
10
-8
M
controle
10
-9
M
10
-9
M
controle
10
-9
M
10
-9
M
ClC-2
valores densitométricos arbitrários
ClC-2/ β-actina
β-actina
*
*
*
84
84
ClC-2 (90 kDa)
*
*
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
PM
HIPER
HIPO
+T4
HIPOC
Figura 27: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em em
rim total de ratos entre os diferentes grupos experimentais
avaliada por “immunoblotting” (A) Figura representativa de um
experimento, animais controle (C), (HIPO) ratos hipotireóideos, (HIPO
+ T4) ratos hipotireóideos infundidos com doses fisiológicas de tiroxina
(1
µ
g/100g P.C./10 dias) e (HIPER) ratos normais infundidos com
doses altas de tiroxina (10
µ
g/100g P.C./10dias). (B) Gráfico
representativo da média das intensidades do ClC-2 por
“immnublotting” entre os diferentes grupos experimentais. (n=5) (*)
p<0,05 vs controle.
85
85
VI-15) Análise da região promotora do ClC-2 em cultura de células tratadas com
Hormônio Tireóideo
Com o intuito de verificar se as alterações observadas na expressão do ClC-2
por hormônios tireóideos eram devidas a estímulo da região promotora do mesmo
gene, foi analisada a atividade da enzima luciferase associada a região promotora do
gene do ClC-2 transfectadas para células imortalizadas de túbulo proximal de ratos
IRPT. Os grupos de células que não sofreram transfecção com o plasmídeo
contendo a região promotora do gene ClC-2 associado ao gene da luciferase,
apresentam atividade desta enzima detectada no método luminométrico
praticamente nula. Já os grupo que sofreram a transfecção apresentam uma
atividade enzimática aumentada, o que indica que a transfecção celular foi bem
sucedida. As células transfectadas que receberam T
3
, no meio de cultura, nas
concentrações de 10
-9
M, 10
-8
,M 10
-7
M, 10
-6
M, 10
-5
M mostraram um aumento da
atividade da luciferase de 51.5%, 40.5%,
45.5%, 49% e 49%, respectivamente
(
p<
0.001,n=6), quando comparadas ao grupo que não recebeu o hormônio T
3
ao
meio de cultura (controle). (Figura 28).
8
6
86
*
Atividade da Luciferase
(ClC-2 / β-galactosidade)
*
*
* *
Concentração de T
3
(M)
Figura 28: Análise da atividade da enzima luciferase ligada ao
promotor do ClC-2 transfectadas em células imortalizadas de túbulo
proximal de rato (IRPT) em diferentes concentrações de
triiodotironine (T3). Células IRPT foram transfectadas com 2µg de
plasmídio contendo o promotor do ClC-2 ligado ao gene da luciferase e co-
transfectado com 2µg
β
-galactosidade) em forma dose-dependente por 24h.
Em cada experimento atividade da luciferase foi normalizada pela atividade
da
β
-galactosidade. Células transfectadas na ausência de T3 (controle).
Concentrações de T
3
: 10
-9
, 10
-8
, 10
-7
, 10
-6
e 10
-5
M. (*) p< 0,0001 vs
controle.
87
87
VI-16) Comparação dos parâmetros urinários dos camundongos com
mutação no receptor TRβ
Os parâmetros urinários dos camundongos com mutação no receptor
β
foram
analisados e comparados com camundongos normais da mesma linhagem. Todos
os parâmetros coletados estão representados na tabela 4. Não houve alterações
no ritmo de filtração glomerular (RFG), no fluxo urinário e na fração de excreção
de potássio entre os grupos mutados (heterozigotos e homozigotos) e normais. Os
camundongos heterozigotos não apresentaram alterações nos parâmetros
analisados mostrando função renal similar à de animais normais. Todavia, a
fração de excreção de Na
+
e Cl
-
aumentou em relação ao controle em 21% e 41%,
respectivamente, em camundongos homozigotos para a mutação do receptor
β
.
(Tabela 4).
controle HOMO HETE
RFG (µl/Kg/min) 755±107,82 710±85,83 820±68,8
FE Na
+
0,788±0,056
1,215±0,083 *
0,63±0,078
FE K
+
11,04±1,71 10,83±0,089 10,27±1,25
FE Cl
-
0,83±0,034
1,413±0,079 *
0,813±0,036
Fluxo urinário 88,12±1,19 85,87±2,57 86,25±2,4
Tabela 4: Valores do fluxo urinário, ritmo de filtração glomerular (RFG), peso corporal,
fração de excreção (FE) de K
+
, Na
+
e Cl
-
de ratos controle, C; HOMO, homozigoto; HETE,
heterozigoto para receptor β para hormônios tireóideos. (*)p< 0,05
88
88
VI-17) Determinação das concentrações séricas dos hormônios tireóideos em
camundongos
A determinação das concentrações séricas de tiroxina, T
4
, foram obtidas através
da utilização da técnica de Radioimunoensaio (RIE). Os resultados foram expressos
em
µ
g/ml na tabela 5.
Os animais heterozigotos para a mutação no TRβ foi de 4,90
±
0,83; o grupo de
animais em homozigoze para a mutação no TRβ apresentou valores de T
4
sérico
acima de 20
µ
g/dl, estourando o padrão de sensibilidade de detecção usado pelo
método.
Controle HETE HOMO
T
4
sérico
(µ
µµ
µg/dl)
4,29 ± 0,41
4,90 ± 0,83
> 20
VI-18) Modulação do RNAm do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos,
com ou sem reposição hormonal, e hipertireóideos por RT-PCR
Como a avaliação do RNAm do ClC-2 em rim havia sido realizada em ratos, os
mesmos experimentos foram repetidos em camundongos para comparar e
quantificar a possível influência dos Hormônios Tireóideos na expressão do RNAm
do ClC-2 em rim de camundongos utilizando RT-PCR.
Os experimentos preliminares mostraram que a melhor concentração de RNA
total para amplificação do RNAm do ClC-2 foi de 1µg RNA total de rim de
Tabela 5
:
Quantificação sérica de HormônioTireóideo (T
4
)
realizada por
radioimunoensaio específico. HETE (Heterozigotos), HOMO (Homozigotos)
(*) p<0,05).
89
89
camundongo (Figura 29). O número ideal de ciclos para a amplificação do RNAm do
ClC-2 e do RNAm do GAPDH (gene utilizado como controle interno da reação) na
mesma reação foi de 36 ciclos , ainda na fase exponencial de amplificação para os
dois genes (Figura 30). Assim, os valores, tanto de concentração quanto de número
de ciclos foram escolhidos na faixa exponencial de amplificação para os dois genes
(ClC-2 e GAPDH), antes de atingirem a saturação, o que permitiu a adequada a
análise da variação de expressão do RNAm entre os diferentes grupos
experimentais.
O grupo de camundongos hipotireóideos apresentou menor expressão do
RNAm ClC-2 em 33%, já os hipertireóideos aumentaram a expressão do RNAm do
ClC-2 em 75% (n=3,
p<
0,05) quando comparados com controle. Os animais
hipotireóideos, que receberam reposição com T
4
, apresentaram níveis de expressão
do RNAm do ClC-2 similar ao controle. (Figura 31).
VI-19) Modulação da proteína do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos
com ou sem reposição hormonal e hipertireóideos por “immunoblotting”
No grupo HIPO a expressão protéica do ClC-2 diminuiu em 70% enquanto que
o grupo HIPER aumentou a expressão da proteína em 20% (n=3,
p<
0,05), ambos
comparados ao grupo controle. A reposição dos animais hipotireóideos elevou a
expressão da proteína do ClC-2 ao valor do animal controle. Estes resultados foram
similares aos encontrados na expressão gênica do ClC-2 de ratos HIPO e HIPER.
Dessa forma, o mecanismo de ação dos Hormônios Tireóideos sobre a expressão do
ClC-2 pôde ser estudados em camundongos com mutação no receptor TRβ. (Figura
32).
90
90
615 pb (ClC-2)
206 pb (GAPDH)
3,00
3,50
4,00
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentração de cDNA (µg)
log
ClC-2
log
GAPDH
A
B
PM ( RT-) 0,062 0,12 0,25 0,5 1 2 (µg)
Logaritmo dos valores densitométricos
arbitrários ClC-2 / GAPDH
2,90
3,40
3,90
33 34 35 36 37 38 39 40 41
PM (RT-) 30 32 34 36 38 40
D
log
ClC-2
log -log
GAPDH
Nº CICLOS
Logaritmo dos valores densitométricos
arbitrários ClC-2 / GAPDH
C
Figura 29: Determinação da
concentração necessária para
a amplificação ideal do RNAm
do ClC-2 e GAPDH na mesma
reação de RT-PCR. (A) Gel de
agarose 1,5% representativo de
um RT-PCR realizado para os
diferentes ciclos de PCR
realizados (B) Gráfico
representativo dos valores
arbitrários em logaritmo, obtidos
através da densitometria das
bandas obtidas a partir do RT-
PCR para o gene do ClC-2 e do
gene do GAPDH em função de
diferentes concentrações no
cDNA de RT-PCR realizados.
Figura 30: Determinação do
número de ciclos
necessários a amplificação
ideal do RNAm do ClC-2 e
GAPDH na mesma reação de
RT-PCR. (C) Gel de agarose
1,5% representativo de um RT-
PCR realizado para os
diferentes ciclos de PCR
realizados. (D) Gráfico
representativo dos valores
arbitrários em logaritmo,
obtidos através da
densitometria das bandas
obtidas a partir do RT-PCR
para o gene do ClC-2 e do
gene da GAPDH em função
dos diferentes ciclos de RT-
PCR realizados.
91
91
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3 4
HIPO HIPO
+ T4
HIPER
ClC-2 (615pb)
β-actina (226pb)
PM (RT-)
C
HIPO
HIPO
+ T4
HIPER
C
*
*
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
Figura 31: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em
camundongos avaliadas por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle (C),
(HIPO) ratos hipotireóideos, (HIPO + T4) ratos hipotireóideos infundidos
com doses fisiológicas de tiroxina (1 g/100g P.C./10 dias) e (HIPER) ratos
normais infundidos com doses altas de tiroxina (10 g/100g P.C./10dias).
(B) Gráfico representativo da média da razão entre as intensidades das
bandas do ClC-2 e do GAPDH obtidas por RT-PCR entre os diferentes
grupos experimentais. (n=3) (*) p<0,05 vs controle.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3 4
HIPO HIPO
+ T4
HIPER
ClC-2 (615pb)
β-actina (226pb)
PM (RT-)
C
HIPO
HIPO
+ T4
HIPER
C
*
*
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
Figura 31: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em
camundongos avaliadas por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle (C),
(HIPO) ratos hipotireóideos, (HIPO + T4) ratos hipotireóideos infundidos
com doses fisiológicas de tiroxina (1 g/100g P.C./10 dias) e (HIPER) ratos
normais infundidos com doses altas de tiroxina (10 g/100g P.C./10dias).
(B) Gráfico representativo da média da razão entre as intensidades das
bandas do ClC-2 e do GAPDH obtidas por RT-PCR entre os diferentes
grupos experimentais. (n=3) (*) p<0,05 vs controle.
92
92
0,0
0,5
1,0
1,5
1 2 3 4
0,0
0,5
1,0
1,5
1 2 3 4
HIPO HIPO
+ T4
HIPER
C
HIPO
HIPER
C
*
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
HIPO
+ T4
ClC-2 (
≅
90 kDa)
β
-actina (
≅
42 kDa)
*
Figura 32: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em em rim
total de camundongo entre os diferentes grupos experimentais
detectadas por “immunoblotting” (A) Figura representativa de um
experimento, animais controle (C), (HIPO) camundongos hipotireóideos
(metimazol na água de beber por 45 dias), (HIPO + T4) camundongos
hipotireóideos infundidos com doses fisiológicas de tiroxina (1
µ
g/100g
P.C./15 dias) e (HIPER) camundongos normais infundidos com doses altas
de tiroxina (10
µ
g/100g P.C./15dias). (B) Gráfico representativo da média
das intensidades do ClC-2 por “immnublotting” entre os diferentes grupos
experimentais normalizadas pela β-actina. (n=5) (*) p<0,05 vs controle.
93
93
VI-20) Modulação do RNAm em camundongos com mutação no receptor TRβ
A análise densitométrica dos valores obtidos através da reação de RT-PCR
mostrou diminuição de 41,4% nos animais heterozigotos e 45,4% na expressão do
ClC-2 quando ambos foram comparados aos animais selvagens (controle) (
p
<0,001,
n=5) (Figura 33).
VI-21) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor TRβ
A análise da proteína do ClC-2 e da
β
-actina por “immunoblotting” em
camundongos mutados para o receptor TR-
β
foi feita nas mesmas condições
descritas para camundongos normais. Os valores foram normalizados através da
razão entre os valores densitométricos obtidos para ClC-2 e
β
-actina. Houve uma
menor expressão do ClC-2 em rins dos animais heterozigotos, 48,8% e homozigotos,
46,2% comparados com o grupo selvagem (
p<
0,001, n=5) Figura 34.
94
94
(RT-)
*
ClC-2 (615 pb)
GAPDH (206 pb)
ClC-2 (615 pb)
GAPDH (206 pb)
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2 / GAPDH
HETE
HOMO
PM C
*
Figura 33: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em
camundongos com mutação no receptor TRβ avaliados por RT-PCR.
(A) Gel de agarose 1% representativo dos experimentos realizados. As
abreviações correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais
controle (C), (HETE) camundongos heterozigotos para a mutação TRβ,
(HOMO) camundongos homozigotos para a mutação TRβ. (B) Gráfico
representativo da média da razão entre as intensidades das bandas do ClC-
2 e do GAPDH obtidas por RT-PCR entre os diferentes grupos
experimentais. (n=5) (*) p<0,05 vs controle.
95
95
HETE
HOMO
ClC-2 (90 kDa)
C
*
*
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2/β-actina
β-actina (42 kDa)
C
Figura 34: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim
total de camundongos com mutação no receptor TRβ detectadas
por ”immunoblotting” (A) membrana de nitrocelulose marcada após
marcação do anticorpo. As abreviações correspondem aos grupos de
animais controle (C), (HETE) camundongos heterozigotos para a
mutação TRβ, (HOMO) camundongos homozigotos para a mutação
TRβ. (B) Gráfico representativo da média da razão entre as
intensidades das bandas do ClC-2 e da β-actina. (n=5) (*) p<0,05 vs
controle.
96
96
VI-22)
Modulação da expressão RNAm do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor TRβ tratados com metimazol
Para investigar se a expressão gênica do ClC-2 em camundongos mutados
estava associada a outros fatores como alto nível plasmático de T
3
e T
4
livres, estes
animais foram tratados com metimazol (MMI) e induzidos ao estado geral de
hipotireoidismo com ou sem reposição hormonal com T
4
. A análise por RT-PCR da
expressão do RNAm renal do ClC-2 mostrou, em relação aos animais selvagens,
que: a) em animais heterozigotos + MMI - diminuição de 43%; b) em animais
homozigotos + MMI - diminuição foi 40,7% e; c) em animais selvagens + MMI -
redução de 47,7% (n=4,
p
<0,01). (Figura 35).
VI-23) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor TRβ tratados com metimazol
Quando a expressão renal da proteína foi comparada com animais selvagens
eutireóideos foi observado: a) nos animais heterozigotos + MMI – redução de 54,1%;
b) em animais homozigotos + MMI - diminuição de 54,4% e; c) em animais selvagens
+ MMI - redução de 41,3% (n=4,
p
<0,01). Figura 36.
97
97
*
*
ClC-2 (615 pb)
GAPDH (206 pb)
ClC-2 (615 pb)
GAPDH (206 pb)
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2 / GAPDH
C
*
*
HETERO
MMI
HOMO
MMI
PM
C
MMI
RT(-)
Figura 35: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em
camundongos com mutação no receptor TRβ tratados com
metimazol avaliada por RT-PCR. (A) Gel de agarose 1%
representativo dos experimentos realizados. As abreviações
correspondem a controle negativo (RT-) e grupos de animais controle
(C), animais controle tratados com metimazol (CMMI), (HETERO MMI)
camundongos homozigotos para a mutação TRβ tratados com
metimazol, (HOMO MMI) camundongos heterozigotos para a mutação
TRβ. (B) Gráfico representativo da média da razão entre as
intensidades das bandas do ClC-2 e do GAPDH obtidas por RT-PCR
entre os diferentes grupos experimentais. (n=5) (*) p<0,05 vs controle.
98
98
*
ClC-2 - 90 kDa
Valores densitométricos arbitrários
ClC-2 / GAPDH
C
*
*
HETERO
MMI
HOMO
MMI
C
MMI
β-actina - 42 kDa
C
C
HETERO
Figura 36: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em em rim
total de camundongos com mutação no receptor TRβ tratados com
metimazol detectadas por “immunoblotting” (A) membrana de
nitrocelulose marcada após marcação do anticorpo. As abreviações
correspondem aos grupos de animais controle (C), animais controle tratados
com metimazol (C MMI), heterozigotos para a mutação TRβ tratados com
metimazol (HETERO MMI) camundongos homozigotos para a mutação TRβ
tratados com metimazol (HOMO MMI) camundongos TRβ. (B) Gráfico
representativo da média da razão entre as intensidades das bandas do ClC-2
e da β-actina. (n=5) (*) p<0,05 vs controle.
99
99
DISCUSSÃO
100
100
V.1) Ação do hormônio aldosterona sobre a expressão gênica dos canais de
cloreto ClC-2 em rim de rato:
A regulação do transporte de NaCl é essencial para a manutenção do balanço de
sal no organismo e, conseqüentemente, do volume de fluido extracelular e da
pressão arterial (Jacobson & Rector, 1990; Cowley & Roman,1996)
Cerca de dois terços do ultrafiltrado formado no glomérulo é reabsorvido no
túbulo proximal de forma isotônica (Yucha & Keen, 1996). Na porção inicial do túbulo
proximal são reabsorvidos preferencialmente glicose, aminoácidos e HCO
3
-
através
do gradiente de Na
+
secundário ao transporte ativo criado pela Na
+
/K
+
ATPase. A
segunda porção do túbulo proximal reabsorve, aproximadamente, 60% do Cl
-
que
está em alta concentração em relação a outros íons. O processo de reabsorção de
Cl
-
corre tanto pela via celular quanto pela via paracelular (Yucha & Keen, 1996). O
transporte transcelular de cloreto ocorre, em parte, por canais de cloreto, por
exemplo a família de canais de cloreto ClC. Entre os vários canais da família ClC, o
canal de cloreto ClC-2 foi o escolhido para ser estudado neste trabalho por ter
abundante expressão renal, além de não ter seu papel fisiológico definido nesse
órgão. O ClC-2 possui características eletroquímicas que o tornam um candidato
fisiologicamente atrativo para ser estudado no rim. O ClC-2 é ativado por
hiperpolarização da membrana, por aumento do volume celular, por acidificação
extracelular, por aumento das concentrações intracelulares de Cl
-
(Thiemann & cols.,
1992; Jentsch & Grünther, 1997; Wills & Fong, 2001). Essas mudanças ocorrem
comumente no tecido renal e, portanto, influenciam as células do epitélio dos túbulos
renais (néfrons). O estudo do ClC-2 em rim de ratos teve início com sua localização
ao longo do néfron de ratos. E pudemos observar que o RNAm do ClC-2 está
expresso em todos os segmentos do néfron de rato, com exceção do ducto coletor
101
101
cortical (CCD) e ducto coletor medular externo (OMCD), o que sugere a sua
importância para o transporte do Cl
-
ao longo do néfron. A análise da expressão do
RNAm do ClC-2 nas diferentes regiões do néfron mostrou que a sua expressão é
maior em medula externa e córtex provavelmente devido a alta expressão do RNAm
do ClC-2 encontrada no segmento medular (mTAL) e cortical (cTAL) espesso da alça
de Henle.
A dieta rica em sal e a infusão da aldosterona em ratos foram modelos
experimentais propostos para estudar o envolvimento do ClC-2 no transporte de Cl
-
durante as variações do volume do fluido extracelular. Os diferentes modelos
experimentais utilizados foram analisados através de exames laboratoriais que
mostraram o sucesso dos grupos experimentais propostos (ver tabela 2): a) grupo de
ratos machos submetidos à dieta rica em sódio por cinco dias, b) grupo de ratos
adrenalectomizados (ADX) sem reposição hormonal, c) ratos ADX que receberam
reposição hormonal de aldosterona. Análise da expressão do RNAm do ClC-2 nestes
ratos demonstrou que a adrenalectomia e a dieta hipersódica levam à diminuição de
sua expressão somente nos segmentos espesso da alça de Henle medular e cortical,
os mesmos onde foi observado maior abundância na expressão do RNAm em
relação aos outros segmentos dissecados do néfron. Estes resultados sugerem que
estes dois segmentos do néfron, mTAL e cTAL, sejam locais onde haja modulação
da expressão gênica do canal de cloreto ClC-2, observada em rim total de ratos nos
modelos experimentais tratados com dieta rica em sódio e adrenalectomizados.
A redução da expressão não só do RNAm, mas também da proteína referente ao
ClC-2 em animais tratados com dieta rica em sódio, em relação ao grupo controle,
mostra que realmente existe a participação desse canal no transporte de Cl
-
durante
a regulação do volume do fluido extracelular, talvez pela diminuição da aldosterona.
102
102
Porém, essa redução da expressão poderia estar sendo modulada por influência de
outros hormônios relacionados com a regulação do volume do fluido extracelular, tais
como a angiotensina II e o fator atrial natriurético (Lumbers, 1999). Todavia,
observamos, em rim total de ratos ADX, que a expressão do RNAm do ClC-2 diminui
em relação aos ratos controle, e quando os ratos ADX recebem reposição de
aldosterona, esta expressão retorna aos valores controle. Estes resultados sugerem
fortemente que a aldosterona está diretamente envolvida na modulação da
expressão gênica do ClC-2.
Por outro lado, a adaptação das células do epitélio renal à variação do transporte
transcelular de íons bem como da hipertonicidade medular, provocada pelas
manobras experimentais utilizadas, também poderia alterar a expressão de inúmeros
genes codificadores de proteínas transportadoras (Aronson & Giebisch, 1997;
Moreno & cols., 1998). Desta forma, a redução da expressão do ClC-2 observada
seria devido à adaptação das células ao ambiente medular ou à nova dinâmica de
transporte transcelular e não pela mudança nos níveis de aldosterona.
A expressão do RNAm do ClC-2 em ratos controles não foi observada nos
segmentos CCD e OMCD, os dois maiores sítios de ligação de aldosterona no
néfron. Também não pudemos observar a expressão do RNAm do ClC-2 nos
segmentos CCD e OMCD em nenhum dos modelos experimentais utilizados neste
trabalho, tais como, ADX, ADX com reposição de aldosterona, ratos submetidos à
dieta rica em sódio ou ratos tratados com altas doses de furosemida. No entanto, a
presença dos receptores de aldosterona nos segmentos mTAL e cTAL (Farman &
Bonvalet, 1983; Vandervalle & cols., 1981) os fez bons candidatos para o sítio de
modulação pela aldosterona. Então, para examinarmos a regulação do ClC-2 pela
aldosterona, bem como, a expressão do RNAm do ClC-2 nos segmentos mTAL e
103
103
cTAL de ratos, nós utilizamos os modelos experimentais constituídos de ratos ADX,
ADX com reposição de aldosterona e submetidos à dieta rica em sódio. Nós
observarmos que a expressão do RNAm do ClC-2 diminuiu em ambos os
segmentos, cTAL e mTAL, tanto em ratos ADX quanto nos ratos que receberam
dieta rica em sódio. Por outro lado, a expressão do RNAm do ClC-2 nos ratos ADX
que receberam reposição de aldosterona foi similar à expressão do RNAm do ClC-2
observada nos ratos controle. Embora os resultados sugiram fortemente o
envolvimento da aldosterona na expressão do RNAm do ClC-2 nos segmentos da
alça espessa de Henle, esta modulação poderia estar ocorrendo através de um
efeito indireto da aldosterona em razão da sua ação sobre o transporte iônico neste
segmento. É sabido que o aumento do transporte de íons por células renais, por si
só, é capaz de modificar a expressão de genes. Assim, para elucidar essa questão,
nós utilizamos um modelo experimental constituído de ratos submetidos a tratamento
com doses altas (100 mg/Kg PC) ou baixas (10 mg/Kg PC) de furosemida via sonda
oro-estomacal. Hirano, em 2000, utilizou este protocolo, e observou que o volume
urinário dobrou nos ratos submetidos a baixas doses de furosemida e que o volume
urinário foi oito vezes maior nos ratos que receberam altas doses. A dose alta de
furosemida também dobrou a concentração plasmática de aldosterona enquanto
doses baixas não alteraram os níveis plasmáticos do mineralocorticóide (Hirano &
cols., 2000). Então, se a aldosterona modula a expressão do RNAm do ClC-2 na
porção espessa da alça de Henle, uma alta dose de furosemida também levaria a
modulação do RNAm do ClC-2. Porém, se a modulação observada em todos os
resultados ocorreu devido a adaptação das células à alteração no transporte
transcelular de NaCl, baixas doses de furosemida levariam a variação da expressão
do RNAm do ClC-2. Nossos resultados mostraram que a alta dose de furosemida
104
104
aumentou a expressão do RNAm do ClC-2 em ambos os segmentos, cTAL e mTAL.
Sendo assim, concluímos que a aldosterona é responsável pela modulação na
expressão gênica do ClC-2 na porção espessa da alça de Henle e, portanto, capaz
de induzir o transporte de cloreto neste segmento, onde os canais de cloreto
desempenham um papel importante no transporte transcelular de Cl
-
.
Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho sugerem fortemente a
modulação da expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 por aldosterona na
porção espessa da alça de Henle, nos segmentos mTAL e cTAL, sugerindo também
o envolvimento do ClC-2 no transporte transcelular de Cl
-
durante a regulação de
volume extracelular.
V.2) Ação dos hormônios tireóideos sobre a expressão gênica do canal de
cloreto ClC-2 em rim de rato:
Como descrito na introdução desta tese, existem estudos bastante convincentes
que mostram que o hormônio tireóideo promove o aumento da reabsorção renal do
fluido tubular (Capasso & cols., 1985 a, b). Além disso, há diversas evidências na
literatura sobre uma grande densidade de receptores de hormônio tireóideos no rim
(Amma & cols, 2006; Shahrara & cols., 1999), onde é observado uma grande
atividade metabólica, principalmente nas células tubulares renais onde ocorre um
intenso transporte iônico, principalmente em sua porção proximal . Vale lembrar que
no túbulo proximal ocorre a reabsorção isotônica de 60% a 70% de toda água e
solutos que foram filtrados pelo glomérulo (Weinstein, 1988). A energia primária de
todo o processo de reabsorção tubular provém da Na
+/
K
+
ATPase localizada nas
membranas basolaterais das células do epitélio do túbulo proximal, o que reduz as
105
105
concentrações intracelulares de Na
+
, criando o gradiente favorável para reabsorção
luminal deste mesmo íon através de vários transportadores (Doucet, 1988).
Neste segmento do néfron há reabsorção de HCO
3
-
e secreção de H
+
e por isso o
pH intratubular varia de 7,2 no início do túbulo proximal convoluto a 6,8 no final do
túbulo proximal reto (DuBose & cols, 1981). Alguns canais de cloreto, tais como o
ClC-2, têm a sua condutância modulada em diferentes faixas de pH. Em
experimentos de “voltage-clamp” realizados em oócitos que expressavam o ClC-2
humano foi mostrado que a diminuição do pH do meio extracelular de 7,5 para 7,0 e
6,5 levou ao aumento da condutância do ClC-2 ao Cl
-
(Gründer & cols, 1992b; Jordt
& Jentsch, 1997). Esses resultados sustentam o possível papel do ClC-2,
principalmente no túbulo proximal reto uma vez que é nesse segmento do néfron que
ocorre a diminuição do pH, devido à reabsorção de
HCO
3
-
, bem como o aumento da
permeabilidade ao cloreto (Jordt & Jentsch, 1997). Além do aumento da
permeabilidade ao Cl
-
no túbulo proximal reto, o gradiente tanto elétrico (luz
negativa) quanto químico (maior concentração luminal de cloreto) favorece sua
reabsorção nesse segmento.
Os canais de cloreto no túbulo proximal, tanto convoluto quanto reto, estão
localizados geralmente na membrana basolateral e utilizam o gradiente favorável
para o transporte passivo de cloreto, uma vez que o equilíbrio intracelular de cloreto
é instável (altas concentrações intracelulares de Cl
-
e célula negativa em relação ao
interstício) (Thakker, 1997). Vários hormônios agem no túbulo proximal modulando o
transporte de íons, inclusive o de cloreto. Devido a alta atividade metabólica desse
segmente do néfron não é surpresa a observação de que em estudos de
microperfusão em túbulo proximal de coelhos hipotireóideos seja mostrado que a
reabsorção de Cl
-
diminuiu em coelhos hipotireóideos (Baum & Quigley, 2003),
106
106
provavelmente devido a ação dos hormônios tireóideos sobre a atividade e/ou
expressão de canais de cloreto.
O modelo experimental de ratos hipotireóideos e hipertireóideos foi criado, em
nossos estudos, para estudar o possível papel do ClC-2 no rim. A tabela 3 mostra o
sucesso do nosso modelo experimental, onde observamos que as concentrações
séricas de T
4
dos animais induzidos ao hipotireoidismo pela adição de metimazol
(inibidor da síntese de hormônios tireóideos) em sua água de beber tornam-se quase
não detectáveis. As concentrações séricas deste hormônio nos ratos hipotireóideos
que receberam administração subcutânea diária de tiroxina retornam a valores
similares àqueles encontrados nos ratos controles. E, no grupo hipertireóideo
observamos um aumento significativo das concentrações séricas de tiroxina, quase
três vezes maior em relação aos animais controles.
A expressão do RNAm do canal de cloreto ClC-2 foi estimulada em rim de ratos
que tiveram as concentrações séricas de hormônios tireóideos aumentadas
(hipertireóideos), e diminuiu conforme as concentrações séricas de hormônios
tireóideos diminuíram (hipotireóideos). Quando analisamos a expressão do
RNAm em rim total destes ratos pela técnica de RPA observamos que o grupo
hipotireóideo apresentou uma diminuição na expressão do RNAm do ClC-2 quando
comparados a ratos controles. Enquanto que, o grupo de ratos hipertireóideos
apresentou um aumento na expressão do RNAm do ClC-2 em comparação aos ratos
controles. No grupo hipotireóideo reposto com tiroxina, cujas concentrações séricas
de hormônio tireóideo retornaram a valores similares àqueles encontrados nos ratos
controles (Tabela 3), não houve variação significativa da expressão do RNAm em
relação aos ratos controles. Assim, observamos que os hormônios tireóideos são
capazes de modular positivamente a expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos.
107
107
Azuma e colaboradores (1996) observaram que a reabsorção renal de NaCl diminuía
em animais hipotireóideos, mas a excreção destes íons tornava-se similar a valores
de animais eutireóideos quando era administrada a reposição hormonal. A Na
+
/K
+
ATPase, o co-transportador Na
+
/ Pi e o trocador Na
+
/ H
+
têm a expressão e a
atividade estimuladas no rim por Hormônios Tireóideos (Katz & cols, 1975; Morales &
cols, 1996; Alcade & cols, 1999). Além disso, a presença de receptores de
hormônios tireóideos no epitélio renal indica que estes hormônios podem ter ação
direta sobre a função renal (Shahara & cols, 1999).
Os segmentos do néfron onde ocorre maior transporte de cloreto de sódio são
os túbulos proximais convolutos e retos, justamente onde se observou o estímulo da
expressão do RNAm do ClC-2 em animais hipertireóideos. Estes resultados sugerem
que a variação da expressão do ClC-2, nestes dois segmentos, seja responsável
pelo aumento observado na expressão do RNAm de rim total. Sendo o Cl
-
o principal
co-íon do Na
+
, o estímulo causado pela ação dos hormônios tireóideos na expressão
RNAm do ClC-2 sugere que o ClC-2 seja importante para o transporte iônico ao
longo do néfron, principalmente no túbulo proximal. Os experimentos de
“immunoblotting“ mostraram que há estímulo da expressão da proteína do ClC-2 pela
ação dos hormônios tireóideos em rim de ratos, reforçando a importância desse
hormônio sobre a função renal.
No entanto nossos achados não excluíam, até esse ponto, uma ação indireta
dos hormônios tireóideos sobre a expressão do ClC-2. É sabido que ratos
hipotireóideos apresentam atividade da renina plasmática diminuída e
conseqüentemente apresentam menor concentrações plasmáticas de angiotensina I
e angiotensina II, bem como de aldosterona (Asmah & cols, 1998; Park & cols,
2001). Logo, o sistema renina-angiotensina poderia estar modulando a expressão do
108
108
ClC-2, sob a influencia dos hormônios tireóideos assim como ocorre com outros
genes (Stephen & Klip, 1995).
Os resultados obtidos com o tratamento de cultura primária de células de túbulos
proximais de rato com T
4
mostraram um aumento significativo dose-dependente da
expressão do RNAm do ClC-2. O estímulo observado indica a ação direta de T
4
sobre a expressão do RNAm do ClC-2 em células epiteliais dos segmentos PCT e
PST de rim de rato, corroborando os resultados observados nos experimentos
in vivo
.
Os hormônios tireóideos são secretados na circulação sanguínea na forma de
3,5,3’,5’ – tetraiodo-L-tironina (tiroxina ou T
4
) e uma menor quantidade na forma
3,5,3’- triiodotironina (T
3
), a forma ativa do hormônio. A concentração de T
4
plasmática é cerca de 45 vezes maior que a concentração de T
3
. Sendo que o T
4
é
convertido a T
3
por meio da desiodação de T
4
nos tecidos periféricos pela ação das
desiodades (Yen, 2001).
Os hormônios tireóideos circulam na corrente sanguínea ligados a proteínas
plasmáticas e menos que 0,3% destes hormônios estão livres no plasma. A ligação
dos hormônios tireóideos a estas proteínas carreadoras assegura uma distribuição
regular do hormônio nos tecidos alvos. A entrada ou saída dos hormônios tireóide
das células ocorre tanto por difusão passiva, como por transportadores específicos
que regulam a captação e o efluxo destes hormônios. (Hennemann & cols, 2001).
Uma vez no interior das células o T
3
liga-se a receptores específicos (receptores
de hormônio tireóideo -TRs) localizados no núcleo. Os receptores de hormônio
tireóideo (TR
α
e TR
β
) medeiam a ação do hormônio tireóideo ligando-se diretamente
na região promotora dos genes alvos, regulando a transcrição gênica. Os TRs ligam-
109
109
se a seqüências especificas nomeada de elementos responsivos ao hormônio
tireóideo (TRE). O complexo hormônio- receptor, uma vez ligado a região TRE pode
regular a transcrição gênica (Barra & cols, 2003).
A demonstração do mecanismo pelo qual o hormônio tireóideo age sobre a
expressão do RNAm do ClC-2 requereu novas estratégias experimentais tal como o
estudo da região promotora do gene do ClC-2 e análise da expressão do ClC-2 em
camundongos com mutação no receptor TRβ (mutação esta que impede a ligação do
hormônio ao receptor, e possui caráter dominante negativo devido a competição
entre os receptores normais e mutados). Nossos resultados mostraram que a
expressão do RNAm do ClC-2 aumentou de forma dose-dependente em cultura
primária de células de túbulos proximais de rato tratadas com T
4
, evidenciando uma
ação direta do hormônio sobre a expressão este canal. Experimentos envolvendo a
região promotora do ClC-2 foram realizados em células imortalizadas de túbulo
proximal de rato. Os resultados mostraram o estímulo da região promotora quando
as células, transfectada com o plasmídeo contendo a região promotora do ClC-2,
foram tratadas com T
3
. Então, se conclui que o estímulo por T
3
, observado sobre a
expressão gênica do ClC-2, neste trabalho, é devido, pelo menos em parte, ao
estímulo direto da região promotora deste gene.
O modelo experimental de camundongos hipotireóideos e hipertireóideos foi
criado para verificar, primeiramente, se nesses animais ocorre o mesmo perfil de
modulação renal do ClC-2 expresso em rim. A tabela 4 mostra o sucesso do nosso
modelo experimental, onde observamos que as concentrações séricas de T
4
dos
animais induzidos ao hipotireoidismo pela adição de metimazol (inibidor da síntese e
secreção de hormônios tireóideos) em sua água de beber tornam-se quase
indetectáveis. Enquanto no grupo hipertireóideo houve um aumento significativo das
110
110
concentrações séricas de tiroxina, quase três vezes maior em relação aos animais
controles.
Além disso, mostramos a expressão do RNAm e da proteína do ClC-2 reduzidas
em camundongos hipotireóideos e aumentadas significativamente nos camundongos
hipertireóideos.
Após mostrar que também em camundongos ocorre a modulação da expressão
renal do ClC-2 pelos Hormônios Tireóideos, passamos a estudar a expressão do
ClC-2 nos camundongos com mutação no receptor TRβ.
Os camundongos mutantes para TRβ apresentam sinais característicos à
Síndrome de Resistência ao Hormônio Tireóideo (RHT): altas concentrações
plasmáticas de T
3
e T
4
,e TSH elevado, ou inapropriadamente normal. O fenótipo
clínico mistura sinais de hipotireoidismo e hipertireoidismo, devido em parte ao fato
de que a distribuição dos receptores TRα e TRβ não ser semelhante em todos os
órgãos.
A expressão do RNAm e da proteína do ClC-2 nos camundongos TRβ estava
semelhantemente diminuída em cerca de 50% em camundongos heterozigotos
e homozigotos para a mutação, sugerindo a possível participação do TRβ no
estímulo observado anteriormente dos hormônios tireóideos
in vivo
tanto em ratos
quanto em camundongos. No entanto, esta modulação não foi abolida, sugerindo a
participação de outros mecanismos. Estes resultados são corroborados por estudos
recentes em rim de camundongos nocautes para o receptor TRβ, onde foi observado
que a desiodase do tipo 1 teve a expressão do RNAm diminuída em 50% nestes
animais (Amma & cols, 2006).
Para excluir a possibilidade de que a expressão gênica do ClC-2 estaria sofrendo
a interferência dos altas concentrações plasmáticas de T
3
e T
4
, os camundongos
111
111
com mutação no TRβ foram tratados com metimazol (inibidor da síntese e secreção
de hormônios tireóideos pela glândula tireóide) e assim, obtém-se concentrações de
hormônio tireóide plasmáticas reduzidas em todos os animais. Os animais com
mutação no TRβ tratados com metimazol apresentaram a expressão do RNAm e da
proteína do ClC-2 diminuídas em cerca de 50%, semelhantemente aos resultados
anteriores dos camundongos hetero e homozigotos para a mutação não tratados
com metimazol. Assim, estes resultados mostram que a redução da concentração
plasmática sérica de hormônio tireóideo não causou uma queda adicional na
expressão do canal de cloreto ClC-2 em animais TRβ mutados. Logo, o mecanismo
de ação dos hormônios tireóideos na expressão do ClC-2 no rim acontece, pelo
menos em parte, via receptor TRβ.
Nossos resultados nos permitem afirmar que a concentração basal de hormônios
tireóideos no plasma é importante para a transcrição gênica do canal de cloreto ClC-
2 em túbulo proximal em rim de rato, por estímulo direto da região promotora deste
canal via receptor TRβ. Embora não podemos descartar, efeitos regulatórios pós-
transcricionais, como estabilização da molécula de RNAm no citoplasma com
conseqüente aumento da sua meia-vida e provável aumento da tradução do RNAm
em proteínas; o aumento da inserção de canais de cloreto ClC-2 na membrana das
células epiteliais; ou o estímulo por uma via de sinalização rápida independente da
participação do mecanismo nuclear (Storey e col. 2006).
Apesar do canal de cloreto ClC-2 ainda ser descrito na literatura como uma
proteína constitutiva presente na membrana das células, os nossos dados
evidenciam a importância do canal de cloreto ClC-2 no epitélio renal, sendo este
estimulado por hormônios que alteram o transporte iônico no rim conforme suas
concentrações plasmáticas, portanto relacionados a regulação do volume do fluido
112
112
extracelular. Assim, podemos sugerir que o canal de cloreto ClC-2 possui um
importante papel no transporte iônico no epitélio renal.
113
113
CONCLUSÃO
114
114
Os resultados apresentados neste trabalho mostram a modulação positiva da
expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 por hormônios que participam da
regulação do volume do fluido extracelular como a aldosterona em porção espessa
cortical e porção espessa medular da alça de Henle de rim de ratos. Da mesma
forma, a expressão do ClC-2 é estimulada por hormônios tireóideos em túbulo
proximal convoluto e reto em rim de ratos, provavelmente por ação direta sobre a
região promotora via receptor TRβ.
Sugerimos, assim, a participação do canal de cloreto ClC-2 no transporte de
cloreto renal estimulado por hormônios envolvidos na regulação do volume do fluido
extracelular, evidenciando sua importância fisiológica.
115
115
SOLUÇÕES
116
116
1) Microdissecção
Solução Salina: 135mM NaCl, 5mM KCl, 1mM Na2HPO4.7H2O, 3mM
NaAcetato, 1,2 mM Na2SO4; 2,5 mM CaCl2; 1,2 mM MgSO4; 5,5 mM glicose; 5 mM
Hepes (pH 7,4).
Solução salina acrescida de colagenase e albumina: Solução 1 + 100 mg de
colagenase B e 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA).
Solução 1: 2% Triton X-100, 40U/
µ
L
RNase Inhibitor
(RNasin), 5 mM
Dithiotreitol (DTT).
Água Tratada com DEPC: Para 1 L de água deionizada adicionar 1 mL de
DEPC. Incubar a 37
°
C por 2 horas e autoclavar.
Todas as soluções foram feitas com H2O tratada com DEPC, e estocadas a 4
°
C.
2) Clonagem das Sondas
LB: 10 g Triptona/ 5 g Extrato de levedura/10 g de NaCl/ água deionizada para
1 L.
Tris-EDTA (TE) 1X: 10mM de Tris-HCL; 1mM de EDTA (pH 8.0).
3) Eletroforese
Tampão de amostra 6X: 0,25% de azul de bromofenol, 0,25% xileno cianol,
30% de glicerol em água.
TAE 50X: 242g de Tris base; 57,1 mL de ácido acético; 100mL de EDTA 0,5M
pH 8.0. Completar o volume com água deionizada para 1L.
TBE 5X: 54g de Tris base; 27,5g de ácido bórico; 20 mL de EDTA 0,5M pH
8.0. Completar o volume com água deionizada para 1L.
117
117
4) Western Blotting:
Solução de homogeização para proteína: 250 mmol/l sacarose; 1 mmol/l
EDTA, 20 mmol/l imidazol; pH 7,2; 1 mmol/l
Protease inhibitor
(4-(2-
aminoethyl)-
benzenesulfonyl fluoride
); 1 mmol/l benzamida; 10 mg/l leupeptina; 1 mg/l pepstatina
A; 1 mg/l aprotinine; e 1 mg/l quimostien).
Solução tampão de corrida de proteínas : 15 g/l SDS; 10 mmol/l Tris-Cl pH
6,8; 6 g/l DTT; 60 ml/l glicerol.
Tampão TBS-T: 136,8 mmol/L NaCl; 74,5 mmol/L KCl; 24,8 mmol/L Tris base,
pH=7,4; 0,5% (V/V) Tween 20.
Tampão TBS-T 5% milk: 136,8 mmol/L NaCl; 74,5 mmol/L KCl; 24,8 mmol/L
Tris base; pH=7,4; 0,5% (V/V) Tween 20; 50g/l leite em pó desnatado.
Tampão TBS-T 3% milk: 136,8 mmol/L NaCl; 74,5 mmol/L KCl; 24,8 mmol/L
Tris base; pH=7,4; 0,5% (V/V) Tween 20, 30g/l leite em pó desnatado.
Solução alcalina: 100mmol/L NaCl; 5mmol/L MgCl2; 100mmol/L tris base
pH=9,5.
5) Extração do DNA da cauda de rato
200µl de NaOH 0,2N por 25 min a temperatura de 75°C no banho-maria.
800 µl de Tris-HCl 0,2M com pH 8,0.
6) Ensaio da atividade da luciferase:
tampão de lise (25 mM gly-gly, 15 mM MgSO
4
, 4 mM EGTA, Triton X (25%) e
2 mM DTT).
118
118
tampão de ensaio da luciferase (25 mM gly-gly, 15 mM MgSO
4
, 4 mM EGTA,
15 mM KH
2
PO
4
, 6 mM ATP e 3 mM Dithiothreitol).
7) Ensaio da β
ββ
β-galactosidade
(ONPG) (60 mM Na
2
HPO
4
, 40 mM NaH
2
PO
4
and 2 mg/ml de ONPG) e 810
µ
l
de tampão
β
-gal (60 mM Na
2
HPO
4
, 40 mM NaH
2
PO
4
, 10 mM KCl, 1 mM
MgCl
2
e 50 mM
β
-Mercaptoethanol) a 420
nm.
119
119
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132
132
ARTIGOS PUBLICADOS
133
133
Débora S. Ornellas · Danielle S. Nascimento
Daniel H. Christoph · William B. Guggino
Marcelo M. Morales
Aldosterone and high-NaCl diet modulate ClC-2 chloride
channel gene
expression in rat kidney
Received: 5 November 2001 / Revised: 19 December 2001 / Accepted: 19 December 2001 / Published online: 20 February
2002
© Springer-Verlag 2002
Abstract It is well known that Na
+
reabsorption in the
kidney can be regulated by aldosterone. Although Cl
–
is
the most abundant anion present in the extra cellular fluids
the involvement of aldosterone in the regulation of
Cl
–
conductance through Cl
–
channels at the molecular
level is unknown. In this study, the effects of aldosterone
and high-Na
+
diet on the expression of ClC-2, a cell volume-,
pH- and voltage-sensitive Cl
–
channel, was examined
in the rat kidney. Total RNA isolated from Wistar
rats fed a high-Na
+
diet for 5 days, furosemide treatment,
adrenalectomy and adrenalectomy with replacement of
normal plasma levels of aldosterone were compared by
the use of ribonuclease protection assay (RPA), and/or a
semi-quantitative RT-PCR. The high-Na
+
diet reduced
renal mRNA and protein ClC-2 expression. The renal
expression of ClC-2 mRNA decreased in adrenalectomized
rats and was restored by plasma aldosterone replacement.
In addition, the semi-quantitative RT-PCR in different
segments of the nephron showed that these changes
were secondary to the modulation of ClC-2 mRNA
expression by aldosterone in the cortical and medullary
segments of thick ascending limbs of Henle’s loop.
These results suggest that ClC-2 may be involved with
aldosterone-induced Cl
–
transport in the kidney.
Keywords Aldosterone · ClC-2 · Chloride channel ·
Nephron · Rat · Kidney · mRNA · Ribonuclease
protection assay · RT-PCR
134
134
Thyroid hormone modulates ClC-2 chloride channel gene
expression in rat renal proximal tubules
D Santos Ornellas, R Grozovsky, R C Goldenberg, D P Carvalho,
P Fong
1
, W B Guggino
1
and
M Morales
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, Brazil, CEP 21949–900
1
Department of Physiology of the Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland, 21205, USA
(Requests for offprints should be addressed to M M Morales, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-UFRJ, CCS- Bloco G, 21949–900 Rio de
Janeiro, RJ,
Brasil; Email: mmorales@ biof.ufrj.br)
Abstract
Thyroid hormones has its main role in controlling metabolism,
but it can also modulate extracellular fluid volume
(ECFV) through its action on the expression and activity of
Na
+
transporters. Otherwise, chloride is the main anion in
the ECFV and the influence of thyroid hormones in the
regulation of chloride transporters is not yet understood. In
this work, we studied the e.ect of thyroid hormones in the
expression of ClC-2, a cell volume-, pH- and voltagesensitive
Cl
_
channel, in rat kidney. To analyze the
modulation of ClC-2 gene expression by thyroid hormones,
we used hypothyroid (Hypo) rats with or without
thyroxine (T
4
) replacement and hyperthyroid (Hyper) rats
as our experimental models. Total RNA was isolated and
the expression of ClC-2 mRNA was evaluated by a
ribonuclease protection assay, and/or semi-quantitative
RT-PCR. Renal ClC-2 expression decreased in Hypo
rats and increased in Hyper rats. In addition, semiquantitative
RT-PCR of di.erent nephron segments
showed that these changes were due exclusively to the
modulation of ClC-2 mRNA expression by thyroid hormone
in convoluted and straight proximal tubules. To
investigate whether thyroid hormones action was direct or
indirect, renal proximal tubule primary culture cells were
prepared and subjected to di.erent T
4
concentrations.
ClC-2 mRNA expression was increased by T
4
in a
dose-dependent fashion, as analyzed by RT-PCR. Western
blotting demonstrated that ClC-2 protein expression
followed the same profile of mRNA expression.
Journal of Endocrinology (2003) 178, 503–511
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