( PDF ) Estudo da distribuição e do efeito terapêutico da administração intramiocárdica ou intravenosa das células mononucleares de medula óssea no modelo experimental de infarto do miocárdio.

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VANESSA PINHO RIBEIR

ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO

TERAPÊUTICO DA ADMINISTRAÇÃO

INTRAMIOCÁRDICA OU INTRAVENOSA DAS

CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA

ÓSSEA NO MODELO EXPERIMENTAL DE

INFARTO DO MIOCÁRDIO.

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RI

DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2 0 0 7

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VANESSA PINHO RIBEIRO

ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO TERAPÊUTICO

DA ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA OU

INTRAVENOSA DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE

MEDULA ÓSSEA NO MODELO EXPERIMENTAL DE

INFARTO DO MIOCÁRDIO.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de

Bioengenharia e Biotecnologia Animal de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção

do título de Doutor em Ciências biológicas (Fisiologi

Orientadores:

Antônio Carlos Campos de Carvalho

Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Rio de Janeiro

2007

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iii

PINHO

RIBEIRO, VANESSA

Estudo da distribuição e do efeito terapêutico da administração intramiocárdica ou intravenosa

das células mononucleares

de medula óssea no modelo experimental de infarto do miocárdio

Vanessa Pinho Ribeiro.

Rio de Janeiro

, 2007.

xiii, 11

Tese de Doutorado em Ciências Biológicas (Fisiologia)

Universidade Federal do

Rio de

Janeiro

, Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho, 2007.

Orientadores:

Antônio Carlos Campos de Carvalho

Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Infarto Agudo do Miocárdio 2

Medula óssea

Terapia celular

Tecnécio.

Universidade do Rio de Janeiro.

Título

VANESSA PINHO RIBEIRO

ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO TERAPÊUTICO DA

ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA OU INTRAVENOSA DAS

CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA NO MODELO

EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCÁRDIO.

Rio de Janeiro, 1

de maio de 2007.

Antônio Carlos Campos de Carvalho

Pós

Doutor

Universidade

ederal do Rio de Janeiro

(UFRJ)

Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Pós

Doutora

Universidade

ederal do Rio de Janeiro

(UFRJ)

Léa Mirian Barbosa da Fonseca

Doutora

Universidade

deral do Rio de Janeiro

(UFRJ)

Paulo Roberto Slud Brofman

Doutor

Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC

PR)

Rosália Mendez

Otero

Pós

Doutora

Universidade

ederal do Rio de Janeiro

(UFRJ)

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular

(LCCM)

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de

Janeiro (UFRJ), sob orientação do Dr. Antônio Carlos Campos de Carvalho e co-

orientação

da Drª Regina C

oeli dos Santos Goldenberg com o apoio financeiro das seguintes instituições:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio d

e Janeiro (FAPERJ).

Programa Nacional de Excelência (PRONEX).

Esta tese é dedicada

Aos meus

pais,

Jofre e Luiza

pelo apoio emocional proporcionado todos estes anos,

seja diante da dificuldade para realização de um experimento, ou durante o nervosismo

excessivo proporcionado pelo exame de qualificação. Pelo exemplo de dedicação, amor,

carinho

, união e caráter que vocês me proporcionaram durante toda a minha vida. Por me

ensinarem que sempre devemos ir em busca de nossos sonhos de forma digna, honesta, sem

trapaças e falsidade. Por

me mostrarem que a

vida

é feita de

obstáculos

que devem ser vividos

e vencidos, para que possamos aprender com nossos erros,

amadure

cer

e nos tornarmos

pessoas melhores. Muito obrigada por tudo e principalmente

por me apoiarem, acreditarem no

meu potencial, e torcerem incondicionalmente pelo sucesso da BIOMÉDICA de vocês na

ciência.

A minha tia Eliane (LILI), que sempre esteve presente nos meus momentos de

angústia, nervosismo e

nas

conquistas

também

Por sempre zelar pelo meu bem-estar, e se

interessar pelo andamento da tese, e meus projetos futuros. Muito obrigada pelo amor e

carinho

sempre

vii

Não basta ensina

r ao homem uma especialidade, porque

se tornará assim uma máquina utilizável e não uma

personalidade. É necessário que adquira um sentimento,

um senso prático daquilo que vale a pena ser

empreendido, daquilo que é belo, do que é moralmente

correto". (Albert Einstein)

viii

Aos meus orientadores Prof. A

NTÔNIO

ARLOS

DE C

ARVALHO

Profª

EGINA

OELI

LDENBERG

, pelo aprendizado proporcionado durante estes quase sete anos de convivência

no laboratório, que contribuíram bastante para o meu cres

cimento pessoal e profissional.

Aos membros do LABORATÓRIO DE MARCAÇÃO DE CÉLULAS E M

OLÉCULAS

Departamento de Radiologia e do Serviço de Medicina Nuclear do Hospital Universitário

Clementino Fraga Filho, especialmente: S

ÉRGIO

, C

LÁUDIA

, F

LÁVIA

, DRª BIANCA E DRª L

ÉA

pela da marcação das células e realização das imagens cintilográficas.

Aos meus primeiros orientadores Dr. S

ÉRGIO

OUTINHO

e a Drª A

LDA

DA C

RUZ

que

me proporcionaram os primeiros ensinamentos da carreira científica. Minha eterna

admiração...

À Drª NAZARETH ROCHA pela realização das imagens ecocardiográficas e discussões sobre

os protocolos de i

squemia temporária.

Ao professor J

OÃO

EDRO

WERNECK DE C

ASTRO

por participar efetivamente deste

projeto, seja experimentalmente ou intelectualmente. Obrigada por tudo.

Ao professor E

MERSON

OPES

LIVARES

e o doutorando R

ICARDO

ENRIQUE

COSTA E

OUZA

por eventualmente me socorrerem na administração intramiocárdica das células.

À aluna de doutorado e minha amiga P

ATRÍCIA

FIDELIS DE O

LIVEIRA

pela sua contribuição

na realização das análises hemodinâmicas, paciência e auxílio nas minhas primeiras

can

ulações da veia jugular, e especialmente por me apoiar na fase de maior estresse durante a

tese: a qualificação. Obrigada, Pat. Não vou esquecer o que você fez por mim.

Aos alunos de iniciação científica: S

AMANTHA

OARES

, N

ATHÁLIA

LVES

, D

IOGO

EITE

AEL

PALETTA E D

ÉBORA

RANÇA

que durante estes quatro anos de realização da tese,

contribuíram, sofreram com as dificuldades e torceram pelo desenvolvimento deste trabalho.

Obrigada a todos. Saibam que eu também aprendi com vocês.

Técnica

DAISY AVANZI

IA D

AISY

) por me auxiliar na realização dos cortes

histológicos, pelo seu carinho, dedicação e claro, pelas suas caronas de volta para casa. Muito

obrigada, tia Daisy.

À Técnica

ULIANA

ASCIMENTO

por sempre estar pronta e disposta a ajudar. Obrigada,

Ju.

Às minhas três amigas patas do laboratório: J

IAS

, D

e C

AROL

que compartilharam

comigo nestes anos, momentos de alegria e confraternização nos Congressos e nights ; mas

também estavam presentes em momentos de muito estudo e trabalho. Ju, valeu por nossos

estudos juntas. Deb, obrigada por sempre estar disposta a ajudar, mesmo que você não tenha

nenhum comprometimento com o experimento. Carol, foi com esse projeto que tudo

começou, lembra? Desde então, nossa amizade só cresceu. Obrigada por tudo,

amigas. Adoro

vocês.

Às minhas amigas: R

ITA

que mesmo distante sempre me incentivou e apoiou nesta

carreira;

RIS

, pelo interesse, torcida e sua amizade todos esses anos; A

NNA

EATRIZ

FERNANDA E F

LÁVIA

que apesar da distância no momento, ainda se interessam e torcem pelo

meu sucesso. Ao meu amigo R

ICARDO

, que sempre presente, se interessava pelo andamento

da tese com muito carinho e paciência para escutar.

A todos os membros do

ABORATÓRIO DE

LETROFISIOLOGIA

ARDÍACA

NTÔNIO

AES DE

ARVALHO

e do LABORATÓRIO DE C

ARDIOLOGIA

CELULAR E M

OLECULAR

que de alguma

forma contribuíram para o desempenho deste trabalho.

Aos

MEUS PAIS, meu

IRMÃO

OFRE

, à minha

TIA

LIANE

, pelo apoio, compreensão,

incentivo, carinho e colaboração durante o desenvolvimento da tes

Aos meus tios Francisco e Valéria pelo apoio e pela colaboração na reta final da tese, e a

toda minha família.

Aos ratinhos, não agradeço, mas peço desculpas. Foi para o bem da ciência.

átrio esquerdo

âQRS

ângulo do vetor médio de desp

olarização ventricular

ASE

sociedade americana de ecocardiografia

ATP

adenosina trifosfato

AVE

acinesia do ventrículo esquerdo

AVED

área do ventrículo esquerdo em diástole

AVES

área do ventrículo esquerdo em sístole

BPM

batimentos por minut

BSS

solução salina balanceada

CEMO

células de estroma de medula óssea

kit

positivo para o c

Kit

CMMO

células mononucleares da medula óssea

CPM

contagem por minuto

CTH

células tronco hematopoiéticas

DDF

diâmetro da cavidade ventricula

r ao final da diástole

DDF

diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo

DMEM

dullbecco s modified eagle medium

dP/dT

primeira derivada temporal positiva

máxima

da pressão ventricular

dP/dT

- -

primeira derivada temporal negativa

máxima

da p

ressão ventricular

DSF

diâmetro da cavidade ventricular ao final da Sístole

DSF

diâmetro sistólico final do VE

ECG

eletrocardiograma

ECO

ecocardiograma

células

-tronco embrionárias ( embrionic stem cells )

freqüência cardíaca

ração de ejeção

FEA

fração de encurtamento de área

Fenc

fração de encurtamento

HSC

- células tronco hematopoiéticas ( hematopoietic stem cells )

i.m.

via intramiocárdica

i.v.

via intravenosa

IAM

infarto agudo do miocárdio

ICAM

- intercellular adhesion molecule

ICC

insuficiência cardíaca congestiva

infarto do miocárdio

iQRS

índice de amplitude do complexo QRS

MCI

massa celular interna

matriz extracelular

MMP

metaloproteinase 1

MMP

metaloproteinase 9

MMPs

metal

oproteinases

Nim

- Animais normais que receberam injeção intramiocárdica de células mononucleares de

medula óssea.

Niv

Animais normais que receberam injeção intravenosa de células mononucleares de

medula óssea.

isquemia por oclusão permanente.

OPim

- animais submetidos à isquemia por oclusão permanente tratados com células

mononucleares da medula óssea por via intramiocárdica.

OPiv

- animais submetidos à isquemia por oclusão permanente tratados com células

mononucleares da medula óssea por via intr

avenosa.

xii

isquemia por oclusão temporária.

OTiv

- animais submetidos à isquemia por oclusão temporária tratados com células

mononucleares da medula óssea por via intravenosa.

PAVE

perímetro de acinesia do VE.

PVE

pressão desenvolvida pelo vent

rículo esquerdo

PDFVE

pressão diastólica final do ventrículo esquerdo

PSVE

pressão sistólica do ventrículo esquerdo

PTVE

perímetro total do VE.

RNA

ácido ribonucléico

SDF

- stromal cell-

derived factor

-1

99m

Tecnécio

metaestável

TGF

- transforming growth factor-beta

TIMPs

- tissue inhibitor of MMPs (inibidor das MMPs)

TNF

fator de necrose tumoral

;

VCAM

- vascular cellular adhesion molecule

VDF

volume diastólico final

ventrículo esquerdo

VSF

volume sistólico

final

xiii

O infarto do miocárdio é a principal causa de mortalidade mundial. Atualmente, a

terapia com células da medula óssea é uma alternativa promissora para os pacientes com

doença cardiovascular isquêmica. Este estudo se propõe a identificar os sítios preferenciais de

migração das células de medula óssea (CMMO) durante a isquemia miocárdica aguda, e

correlacionar o impacto da presença destas células sobre a função cardíaca dos animais. Para

tanto, ratos Wistar foram submetidos à isquemia por oclusão temporária (OT) ou permanente

(OP) da artéria coronária esquerda. Quarenta e oito horas após o procedimento cirúrgico, as

CMMO foram marcadas com

99m

Tecnécio, e transplantadas pelas vias im (4-

6 x 10

) ou iv (1

5 x 10

) em ratos normais (N) e operados. A distribuição das células foi determinada por

imagens cintilográficas e contagem da radioatividade presente nos órgãos isolados, enquanto

que os parâmetros cardíacos foram analisados pelo eletro e ecocardiograma, assim como pela

hemodinâmica e teste de esforço. Após a terapia im, o percentual de células presente no

coração dos animais OP (2,516

0,394 %) foi significativamente maior comparado aos

normais (N) (1,190

0,255 %) (p < 0,001). No caso da terapia iv, os percentuais de células

presentes no coração dos animais normais (0,012

0,002 %), OP (0,047

0,022 %) e OT

(0,028

0,005 %) não foram estatisticamente diferentes. Três semanas após o tratamento

intravenoso ou intramiocárdico com CMMO, os animais apresentaram onda Q em DI, âQRS

> 90º, fração de encurtamento inferior a 50%, bem como perfil hemodinâmico e teste de

esforço típicos de animais infartados. Assim, a administração das CMMO por via iv ou im, 48

horas após o IAM não promoveu melhora na função cardíaca dos animais.

xiv

The myocardial infarction is the major cause of world´s mortality. Nowadays, therapy

with bone marrow cells is an exciting alternative for patients of ischemic cardiovascular

diseases. The aim of this study is evaluate the effect of mononuclear bone marrow cell

(BMMC) intravenous (i.v.) and intramyocardial (im) transplantation on an experimental

model of myocardial infarction (MI). For this, Wistar rats were submitted to temporary (TO)

and permanent (PO) occlusion of left coronary artery. Forty eight hours after surgery,

BMMCs were l

abeled with

99m

Technetium and infused by im (4

6 x 10

) or iv (1

5 x 10

) vias

in normal (N) and operated rats. The cell distribution was obtained by s

cintigraphy

and

radioactive counting of isolated organs. Electrocardiogram, echocardiogram, cardiopulmona

test and hemodynamic analyses evaluated cardiac parameters. After im injection, the

percentual of cells found in the heart of PO group (2,516

0,394 %) was significantly higher

than in N (1,190

0,255 %) (p < 0,001). At i.v. therapy, the percentual of the cells found in

the heart of normal (0,012

0,002 %), PO (0,047

0,022 %) and TO (0,028

0,005 %)

groups were not statistically different. Three weeks after both kinds of cellular therapy (i.m.

or i.v.), PO group still have Q wave in LI, âQRS > 90º, shortening fraction with less than

50%, hemodynamic and cardiopulmonary test profiles were typical of infarcted hearts. This

work demonstrate that the intramyocardial and intravenous injection, 48 hours after MI not

improved the cardiac function of the an

imals.

INTRODUÇÃO

1.1

O INFARTO DO MIOCÁR

DIO

1.2

ISQUEMIA E REPERFUS

ÃO

1.3

TERAPIAS CELULARES

1.3.1

CÉLULAS

TRONCO

1.3.2

A MEDULA ÓSSEA

1.4

MEDICINA NUCLEAR

OBJETIVOS

MATERIAIS E MÉTODO

3.1

ANI

MAIS

3.2

ETAPA

1 :

MODELOS DE INDUÇÃO

DO INFARTO AGUDO EXP

ERIMENTAL

3.2.1

GRUPO OP

MODELO DE OCLUSÃO P

ERMANENTE DA ARTÉRIA

CORONÁRIA

ESQUERDA

3.2.2

GRUPO OT

MODELO DE OCLUSÃO T

EMPORÁRIA DA

ARTÉRIA CORONÁRIA

ESQUERDA

3.2.2

PROTOCOLOS EXPERIME

NTAIS APLICADOS AOS

ANIMAIS SUBMETIDOS À

OCLUSÃO TEMPORÁRIA D

A ARTÉRIA CORONÁRIA

ESQUERDA

3.3

ISOLAMENTO DAS CÉLU

LAS DE MONONUCLEARES

DE MEDULA ÓSSEA

(

CMMO

)

3.4

ETAPA

ANÁLISE DA DISTRIBU

IÇÃO DAS CÉLULAS DA

MEDULA ÓSSEA

3.4.1

DETERMINAÇÃO DA TOP

OGRAFIA DE CORAÇÃO N

AS IMAGENS CINTILOGRÁFICAS

3.4.2

MARCAÇÃO DAS CÉLULA

S COM TECNÉCIO

3.4.3

INJEÇÃO DAS CÉLULAS

MARCADAS COM TECNÉCI

3.4.4

IMAGENS CINTILOGRÁF

ICAS

3.4.5

CONTAGEM DA RADIOA

TIVIDADE PRESENTE NO

S ÓRGÃOS ISOLADOS

3.5

ETAPA

ACOMPANHAMENTO DA F

UNÇÃO CARDÍACA APÓS

O TRATAMENTO COM

CMMO OU VEÍCULO

3.5.1

MARCAÇÃO DAS CÉLULA

S MONONUCLEARES

3.5.2

ANÁLISE FUNCIONAL

3.5.2.1

ANÁLISE ELETROCARDI

OGRÁFICA

3.5.2.2

ANÁLISE ECOCARDIOGR

ÁFICA

SUMÁRIO

xvi

3.5.2.3

ANÁLISE HEMODINÂMIC

3.5.2.3.1

CANULAÇÃO DA ARTÉRI

A CARÓTIDA COMUM

3.6

TESTE DE ESFORÇO

3.7

ANÁLISE ANATOMO

HISTO

PATOLÓLGICA

3.7.1

PREPARO DO MATERIAL

3.7.1.2

IDENTIFICAÇÃO DAS CÉ

LULAS MARCADAS

3.8

ANÁLISE ESTATÍSTICA

RESULTADOS

4.1

ETAPA

1 :

COMPARAÇÃO DOS DIFE

RENTES MODELO

S EXPERIMENTAIS DE

INDUÇÃO DO INFARTO D

O MIOCÁRDIO

4.1.1

ANÁLISE ELETROCARDI

OGRÁFICA

4.1.2

ANÁLISE ECOCARDIOGR

ÁFICA

4.2

PESQUISA DAS CÉLULAS MARCADAS COM HOECHST APÓS A ADMINISTRAÇÃO

INTRAVENOSA DE CMMO

NOS ANIMAIS DO GRUPO

4.3

ETAPA

ANÁLISE DA DISTRIBU

IÇÃO DAS CÉLULAS MON

ONUCLEARES DE

MEDULA ÓSSEA NO ORGA

NISMO

4.3.1

MARCAÇÃO DAS CÉLULA

4.3.2

IMAGENS CINTILOGRÁFICAS E CONTAGEM DA RADIOATIVIDADE PRESEN

NOS ÓRGÃOS ISOLADOS

4.3.2.1

CONTROLES EXPERIMEN

TAIS

4.3.2.2

GRUPOS EXPERIMENTAI

4.3.2.2.1

ANIMAIS NORMAIS

4.3.2.2.1.1

ADMINISTRAÇÃO INTRA

MIOCÁRDICA DE CMMO

4.3.2.2.1.2

ADMINISTRAÇÃO INTRA

VENOSA DE CMMO

4.3.2.2.1.3

COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO APÓS

ADMINISTRAÇÃO INTRAV

ENOSA E INTRAMIOCÁRD

ICA.

4.3.2.2.2

ANIMAIS SUBMETIDOS

À OCLUSÃO PERMANENTE

4.3.2.2.2.1

ADMINISTRAÇÃO INTRA

MIOCÁRDICA DE CMMO

4.3.2.2.2.2

ADMINISTRAÇÃO INTRA

VENOSA DE CMMO

4.3.2.2.2.3

COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO APÓS

ADMINISTRAÇÃO INTRAV

ENOSA E INTRAMIOCÁRD

ICA.

4.3.2.2.3

ANIMAIS SUBMETIDOS

À OCLUSÃO TEMPORÁRIA

xvii

4.3.2.2.4

COMPARAÇÃO DA DISTR

IBUIÇÃO NO ORGANISMO

DAS CMMO EM ANIMAIS

NORMAIS E SUBMETIDOS À ISQUEMIA APÓS ADM

INISTRAÇÃO

INTRAVENOSA E INTRAM

IOCÁRDICA

4.4

ETAPA

ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA DE ANIMAIS NORMAIS E

SUB

METIDOS À ISQUEMIA P

ERMANENTE TRATADOS C

OM CMMO OU VEÍCULO

4.4.1

ANÁLISE ELETROCARDI

OGRÁFICA

4.4.2

ANÁLISE ECOCARDIOGR

ÁFICA

4.4.3

ANÁLISE HEMODINÂMIC

4.4.4

TESTE DE ESFORÇO

4.4.5

PESQUISA DAS CÉLULA

S MARCADAS

- D

ISCUSSÃO

- C

ONCLUSÕES

101

7 -

IBLIOGRAFIA

102

1.1

O INFARTO DO MIOCÁR

DIO

O infarto do miocárdio (IM) é uma cardiopatia isquêmica, causada por obstrução de

vasos da circulação coronariana, que promove redução da perfusão local com conseqüente

morte de cardiomiócitos (Factor, 1990). Após a perda de cardiomiócitos necróticos, inicia-

rapidamente uma série de respostas celulares através da sinalização célula

célula; que regula o

reparo tecidual, contribuindo para a reconstrução do miocárdio infartado e a manutenção da

integridade do ventrículo. Este processo caracteriza

se, inicialmente, pela atração e invasão de

células inflamatórias no sítio da lesão, ativação e síntese de peptídeos, formação de novos

vasos sangüíneos (angiogênese), e surgimento bem como replicação de células do tipo

fibroblasto. Esta fase inflamatória inicial de cicatrização com resultante formação de tecido de

granulação, é seguida por uma fase fibrogênica que resulta no tecido cicatricial. Este que por

muito tempo foi considerado inerte é: dinâmico, vascularizado, metabolicamente ativo e

contrátil. A matriz é composta por miofibroblastos (fibroblastos fenotipicamente

transformados) que não são encontrados no tecido cardíaco normal (exceto nos folh

etos

valvares) (Sun & Weber 2000). Tal transformação fenotípica parece ser influenciada pelo

TGF

- 1 ( transforming growth factor-beta ). Desmouliere e colaboradores (1993)

demonstraram em estudos in vitro e in vivo que o TGF- 1 contribui para a diferenciação do

fibroblasto em miofibroblasto. Esta citocina é sintetizada por macrófagos ativados que no 1º e

2º dias após o IM aparecem no sítio da lesão. Em seguida surgem os miofibroblastos que

permanecem na cicatriz do infarto por longos períodos de tempo (muitos meses em ratos, e

anos em humanos) (Willems et al. 1994) e contribuem com o acúmulo de colágeno na região.

O balanço entre a síntese e a degradação de colágeno são os determinantes primários da

fibrose tecidual (Sun & Weber 2000). A degradação do colágeno envolve enzimas

proteolíticas conhecidas como metaloproteinases (MMPs). Sun e colaboradores (2000)

observaram durante a fase inicial de reparo do IM, em ratos, um aumento da atividade de

MMP

-1 (colagenase). Esta enzima tem atividade proteolítica e aumenta a degradação de

fibrilas de colágeno no sítio do IM. Em contrapartida, as TIMPs ( tissue inhibitor of MMPs )

que neutralizam esta atividade colagenolítica e inibem a forma ativada das MMPs, são

encontradas em grande quantidade no sítio do infarto a part

ir da primeira semana (Cleutjens

al.

1995). Isto gera um acúmulo progressivo de colágeno no sítio do infarto. Além disso, os

miofibroblastos residentes na cicatriz que são nutridos pelos novos vasos que se formaram,

continuam sintetizando colágeno tipo I, contribuindo assim para a formação do tecido fibroso

e o remodelamento estrutural das regiões não infartadas que estão distantes da área lesada,

conforme observamos nos grandes infartos transmurais (Sun & Weber 2000). Estas

transformações agudas e crônicas tanto na área infartada necrótica quanto na não-

necrótica,

bem como na região peri-infarto, geram uma cascata de alterações estruturais e geométricas

progressivas nos ventrículos que são geralmente referidas como remodelamento cardíaco

(Litwin

et al. 1994, Jain et al. 2001). Este processo promove mudanças nas dimensões da

parede ventricular e câmara cardíaca. Uma vez que a matriz extracelular (ME) está em contato

íntimo com todos os outros componentes do miocárdio, ela desempenha uma importante

função na manutenção da forma, tamanho e função ventriculares. O ventrículo submetido a

estresse, inicialmente exibe função adequada, forma normal, e relação massa-

volume

ventricular acima do normal. Entretanto, em um determinado ponto, a capacidade

compensatória

do coração é exaurida e o mesmo começa a falhar. Dependendo da magnitude

e da duração do estresse, os miócitos sobreviventes hipertrofiam, e a ME sofre alterações na

concentração bem como nos tipos de fibrilas de colágeno presentes. Neste estágio, a espess

ura

da parede ventricular está desproporcionalmente reduzida, o volume da câmara ventricular

bastante aumentado e o ventrículo tende a se tornar esférico (Janiki et al. 2006), ocorrendo

comprometimento da sua função e podendo evoluir para o quadro de insuficiência cardíaca

congestiva (ICC). Tal síndome ainda é considerada um importante problema de saúde pública

(Itescu

et al. 2003), e por isso torna-se fundamental o conhecimento de todas as alterações

fisiológicas e histopatológicas do coração, promovidas pelo infarto. Sendo assim, vários

grupos têm utilizado principalmente dois modelos experimentais para reproduzir de forma

fidedigna tais alterações: o modelo de oclusão permanente da artéria coronária esquerda e de

oclusão temporária deste mesmo vaso. Este último procedimento também é conhecido como

modelo de isquemia e reperfusão.

1.2

ISQUEMIA E REPERFUS

ÃO

A isquemia é caracterizada pela deficiência no aporte sangüíneo a determinado órgão

ou tecido. A sua principal conseqüência é hipóxia ou anóxia locais, ou seja, a deficiência

parcial ou total de oxigênio, respectivamente. Esta carência provoca alterações diretas nas

mitocôndrias, o que ocasiona a diminuição da fosforilação oxidativa e, conseqüentemente, dos

níveis de ATP (adenosina trifosfato). Isto por sua vez, compromete totalmente o sistema de

produção protéica celular e a bomba de sódio e potássio, aumentando os níveis de cálcio e

levando à tumefação celular (edema intracelular) (Case et al 1989). Até aqui, os danos são

reversíveis. Com a persistência da isquemia, ocorre uma vacuolização das mitocôndrias, que

podem ser visualizadas segundo Case e colaboradores (1989), 30 a 40 min após a isquemia.

Nesse estágio, instauram-se eventos de lesão celular irreversível, atuando principalmente nas

membra

nas. Há uma perda contínua de proteínas, enzimas e ácidos ribonucléicos (RNAs),

essenciais para a célula. Membranas lisossômicas são rompidas, levando ao extravasamento

das enzimas lisossomais para o citoplasma. Essas enzimas provocam digestão enzimática d

componentes celulares, ocasionando a morte celular por autólise. Portanto, a isquemia

provoca lesões reversíveis e irreversíveis, as quais são devidas principalmente à alteração dos

níveis de ATP e de cálcio.

Os distúrbios metabólicos durante isquemia ou hipóxia tissular são muito bem

estabelecidos, porém, evidências clínicas e experimentais demonstram que os principais

eventos que promovem disfunções celular e tecidual, relacionam-se com a subseqüente

reperfusão (Evora

et al.

1996).

A lesão de reperfusão é caracterizada por alterações funcionais e estruturais, que se

tornam aparentes durante o restabelecimento do fluxo após um período isquêmico. A

restauração do fluxo sangüíneo pode resultar em alguns efeitos deletérios, tais como: necrose

de células lesadas; acentuado edema celular; e restauração não uniforme do fluxo para todas

as porções do tecido (Evora et al. 1996). Conforme descrito anteriormente, quando o fluxo

sangüíneo tissular é interrompido, uma série de processos metabólicos e enzimáticos são

afetados, promovendo acúmulo de lactato, ativação de várias proteases intracelulares, e

aumento da permeabilidade vascular, que causa edema tissular. Por isso, a reversibilidade

deste processo está diretamente relacionada com a duração da isquemia (Stahl et al. 1989

apud Evora et al. 1996), e a reperfusão deve ser restabelecida o mais rápido possível. Embora

seja inquestionável o benefício da reperfusão precoce, a reintrodução do oxigênio em um

meio isquêmico desencadeia diversos eventos que provocam lesões tissulares adicionais e

acúmulo intracelular de cálcio (Ku 1982 apud Evora et al.1996, Braunwald &

Kloner

1985).

No tecido cardíaco, a aceleração do processo necrótico dos miócitos lesionados

irreversivelmente, o edema celular, o fenômeno de não-refluxo (restauração não uniforme do

fluxo sangüíneo após uma isquemia temporária, que promove disfunções no tecido cardíaco),

o paradoxo cálcio e oxigênio (lesões celulares ocasionadas pelo grande influxo de cálcio e de

oxigênio para o interior da célula após o restabelecimento da perfusão), a produção de radicais

livres do oxigênio (que podem prejudicar os miócitos isquêmicos), e a depressão da função

ventricular pós-isquêmica prolongada, são exemplos de eventos decorrentes da reentrada de

oxigênio no tecido isquêmico (Braunwald &

Kloner

1985). Tais efeitos contribuem para o

desenvolvimento de doenças cardíacas isquêmicas, como por exemplo, o infarto do

miocárdio, que dentre as doenças cardiovasculares destaca-se por possuir maior taxa de

mortalidade (Hristov et al. 2006). Os pacientes sobreviventes a grandes infartos apresentam

alto risco de desenvolverem ICC (Takemura & Fujiwara 2006). De acordo com Hosenpud e

colaboradores (2000), 44 % dos pacientes com ICC são candidatos a transplante cardíaco

(Hosenpud

et al. 2000), uma vez que as opções terapêuticas existentes atualmente

(farmacológicas e cirúrgicas) são limitadas e muitas vezes incapazes de interromper a

progressão deste quadro. Apesar de em alguns casos o transplante proporcionar um aumento

na sobrevida, as complicações causadas pela imunossupressão e a escassez de doadores

limitam a eficiência deste procedimento (Chiu et al. 1995). Portanto, a comunidade científica

busca alternativas terapêuticas para melhorar a sobrevida e a qualidade de vida destes

pacientes. Uma das mais promissoras possibilidades de conduta terapêutica que atualmente

está sob extensa investigação é a terapia cel

ular.

1.3

TERAPIAS CELULARES

De acordo com Fraser e colaboradores (2004), a terapia ideal para ser empregada no

tratamento do infarto do miocárdio deveria: minimizar a perda de cardiomiócitos pela redução

da morte celular, promover o retorno do miocárdio hibernante para sua função normal,

estimular a revascularização da região isquêmica através do aumento da angiogênese, e

regenerar cardiomiócitos viáveis para substituir aqueles perdidos na isquemia inicial,

preservando a função contrátil e reduzindo a formação de cicatriz. Uma das mais promissoras

possibilidades de conduta terapêutica que vem chamando bastante atenção é a terapia celular.

A proposta desta terapia em pacientes com doenças isquêmicas é melhorar a função contráctil

da câmara ventricular e impedir a progressão da insuficiência cardíaca pela administração de

um determinado tipo celular no paciente. Atualmente, as células-tronco têm sido empregadas

como um novo e promissor método para limitar a expansão do infarto e prevenir o

remodelamento c

ardíaco (Kraitchman

et al.

2005).

1.3.1

CÉLULAS

TRONCO

As células-tronco são caracterizadas como células indiferenciadas (sem especialização

funcional e marcadores de diferenciação tecido-específicos), com capacidade de proliferação,

auto

renovação,

e plasticidade (capacidade de se diferenciar em vários tecidos distintos)

(Loeffler & Potten,1997). A sua taxa de proliferação é baixa (Alison

et al.

2002), e as células

tronco podem seguir dois diferentes modelos de divisão celular: o chamado determinísti

co, no

qual sua divisão gera sempre uma célula-tronco idêntica e uma célula progenitora já

comprometida com alguma linhagem específica; ou o dito aleatório (ou estocástico), onde

algumas células-tronco geram somente novas células-tronco e outras geram apenas células

progenitoras já comprometidas (Loeffler & Potten 1997). As células-tronco mais primitivas

são o oócito fertilizado (zigoto) e as descendentes das duas primeiras divisões mitóticas. Estas

células são consideradas totipotentes, pois são capazes de gerar um embrião e o trofoblasto da

placenta (Dawn & Bolli 2005). Após quatro dias, estas células totipotentes começam a se

especializar formando uma massa de células esférica chamada de blastocisto, que por sua vez

contém a massa celular interna (MCI), d

a qual o embrião se desenvolve. A MCI do blastocisto

é formada por células-tronco embrionárias (do inglês, embrionic stem cells

ES), que se

diferenciam em células dos três folhetos embrionários (endoderma, mesoderma e ectoderma).

Porém, estas células não são capazes de originar a placenta e os tecidos que sustentam a

gestação. Desta forma, as células ES são células-tronco ditas pluripotentes. A maioria dos

tecidos possui células-tronco multipotentes, ou seja, capazes de produzir uma limitada

variedade de linhagens celulares diferenciadas de acordo com a sua localização (Alison et al.

2002, Lovell and Marthur 2004). As células-tronco do sistema nervoso central, por exemplo,

são multipotentes, uma vez que são capazes de originar três linhagens distintas: n

eurônios,

oligodendrócitos e astrócitos (Clarke et al. 2000, Momma et al. 2000). Por último, na

hierarquia das células-tronco temos as chamadas células unipotentes (ou progenitoras

comprometidas), capazes de originar um único tipo celular específico (ex: c

élulas

tronco

constituintes da camada basal da epiderme, que originam somente as células escamosas

queratinizadas da pele) (Lovell and Marthur 2004). Estas progenitoras comprometidas

originam células com capacidade de auto-renovação limitada e rápida taxa de proliferação. A

seguir, estas células se dividem originando células terminalmente diferenciadas, que perdem a

sua capacidade de proliferação e mais tarde evoluem para um processo de morte celular

programada (Alison

et al.

2002).

Baseando

-se na pluripotencialidade das células ES, estas seriam consideradas o tipo

celular mais apropriado para ser empregado na terapia celular. Contudo, o potencial

teratogênico, a necessidade de tratamento imunossupressor e questões éticas são fatores

limitantes para o seu uso terapêutico (Leri et al. 2005), o que torna as células-tronco adultas

as principais candidatas a serem usadas em tal tipo de terapia.

As células-tronco adultas estão presentes em muitos tecidos e órgãos, onde são

encontradas como células primitivas capa

zes de reparar danos causados por doenças ou lesões

durante a vida do indivíduo. Estas células tecido-específicas têm sido descritas em muitos

órgãos, tais como: medula óssea, trato gastrointestinal, pele, pulmões, fígado, músculo

esquelético, sistema nerv

oso central, e coração. Destas, a população mais bem estudada é a de

células tronco da medula óssea. (Dawn & Bolli 2005).

1.3.2

A MEDULA ÓSSEA

A medula óssea pode ser vista como um tecido organizado em dois compartimentos: o

compartimento hematopoiético, que fornece ao organismo células maduras de todas as

linhagens sangüíneas; e o compartimento estromal, que proporciona um microambiente

adequado para a auto-renovação, proliferação e diferenciação das células-tronco e

progenitoras hematopoiéticas (Hüttma

et al. 2003). Além disso, o compartimento estromal

abriga progenitores vasculares (Jackson et al. 2001) e células mesenquimais, capazes de se

diferenciarem em tipos celulares da maioria dos tecidos conjuntivos (Bianco

et al.

2001).

A população hematopoiética está distribuída na medula óssea em sítios específicos,

denominados microambientes. Nestes sítios encontramos células-tronco hematopoiéticas

(CTH), e progenitores das linhagens mielóide e linfóide em diferentes estágios de

diferenciação, ou seja, populações de células imaturas, em estágio intermediário de

desenvolvimento e maduras (Bianco 2000).

As CTH são caracterizadas como células multipotentes, com alta capacidade de

proliferação, auto-renovação e diferenciação em uma variedade de linhagens mielóide e

linfóide especializadas (Osawa et al. 1996, Goodell et al. 1996). São capazes de reconstituir e

manter todas as linhagens sangüíneas (Lovell & Mathur 2004), uma vez que possuem

habilidade para balancear os mecanismos de auto-renovação e diferenciação de acordo com a

necessidade do organismo. Além disso, sofrem morte celular programada e são mobilizadas

para fora da medula óssea em direção à circulação sangüínea (Weissman 2000, Bonnet et al.

2002) quando existe necessidade. São caracterizadas fenotipicamente por expressarem o

marcador hematopoiético CD45, bem como CD34, CD133 e CD117 (também chamado de c-

kit), porém, os marcadores de linhagem estão ausentes (lin-) (Dawn & Bolli 2005). Na fase

adulta, elas estão presentes no sangue ou na medula óssea, sendo o processo de hematopoiese

bastante hierarquizado.

Uma variedade de estímulos (citocinas solúveis, ligadas à membrana, ou associadas à

matriz extracelular, e moléculas de adesão celular) do estroma da medula óssea influenciam

as CTH e sua progênie (Whetton & Spooncer, 1998) na modulação da quiescência, na auto-

renovação, no comprometimento das CTH com determinada linhagem celular; bem como na

proliferação, maturação e apoptose das células maduras (Dennis & Charbord, 2002). Além

disso, o estroma da cavidade medular, constituído por células endoteliais, osteoblastos,

células adventícias, células reticulares e células

-tronco mesenquimais, fornece o suporte físico

necessário para a migração das células hematopoiéticas (CH) maduras até os sinusóides

(va

sos sangüíneos de parede fina) (Bianco 2000). Estes por sua vez, localizam-se próximos

aos sítios ativos de hematopoiese e transportam as células sangüíneas recém formadas para a

circulação periférica. Isto demonstra a importância do estroma na estimulação e regulação do

desenvolvimento das CH, bem como das próprias células do estroma da medula óssea

(CEMO), e da célula

tronco mesenquimal (Minguell

et al.

2000).

As células mesenquimais de medula óssea foram isoladas inicialmente por

Friedenstein e colaboradores (1974) e subseqüentemente por outros investigadores (Caplan

al.

1991, Clark et al. 1995, Pittinger et al. 1999), baseada na sua capacidade de aderência à

superfície da placa de cultivo do tecido e seu grande potencial de diferenciação. Estas célul

in vitro parecem capazes de se diferenciar em diversas linhagens celulares: osteoblastos,

condrócitos, adipócitos (Caplan et al. 1991, Prockop et al. 1997, Pittinger et al. 1999),

músculo esquelético (Ferrari

et al.

1998), músculo cardíaco (Makino

et al

1999, Tomita

et al.

1999, Wang

et al.

2000, Toma

et al.

2002, Hakuno

et al.

2002), células endoteliais (Jian

et al.

2002), hepatócitos (Petersen et al. 1999, Alison et al. 2000, Theise et al. 2000, Jian et al.

2002), neurônios, oligodendrócitos e astrócitos (Sanchez-

Ramos

et al. 2000, Woodbury et al.

2000, Jian

et al.

2002).

Baseando

-se nestes fatos, vários investigadores têm utilizado as células de medula

óssea como terapia alternativa no infarto do miocárdio experimental (Tomita et al. 1999,

Wang

et al. 2000, Orlic et al. 2001a, Orlic et al. 2001b, Jackson et al. 2001, Shake et al.

2002, Strauer et al. 2002, Hamano et al. 2002, Olivares et al. 2004; Olivares et al. 2007).

Destacando alguns destes trabalhos, Tomita e colaboradores (1999) implantaram

cél

ulas mesenquimais tratadas in vitro com 5-azacitidina (um agente demetilante de DNA) no

coração de ratos, 21 dias após a crioinjúria, e demonstraram que apesar delas não se

transdiferenciarem em cardiomiócitos, induziram angiogênese e impediram a expansão

cicatriz e dilatação da câmara ventricular. Na fase cicatricial do modelo de infarto do

miocárdio foi demonstrada angiogênese em cães submetidos ao tratamento intramiocárdico

com células de medula óssea 30 dias após a oclusão da artéria coronária descendente anterior

(DA). Entretanto, não houve melhora na função cardíaca de tais animais (Hamano et al.

2002). A melhora no desempenho cardíaco foi evidenciada por Shake e colaboradores (2002),

em porcos infartados, tratados com injeção intramiocárdica de células mesenquimais, 14 dias

após a oclusão da artéria coronária esquerda. Tal melhora foi observada através do aumento

na espessura da parede ventricular e redução na disfunção contráctil. Nossos resultados

prévios demonstraram que a administração intramiocárdica de células mesenquimais de

medula óssea, 28 dias após a oclusão da artéria coronária de ratos, diminuiu o grau de lesão

evidenciado, pelo eletro e ecocardiograma, duas semanas após o tratamento (Olivares et al.

2004). Além disso, os efeitos benéficos sobre a função cardíaca podem ser aprimorados pelo

tratamento prévio com captopril (Olivares

et al.

2007).

Alguns autores têm investigado a eficácia da administração intramiocárdica das

células mononucleares de medula óssea tanto no modelo animal (Oliva

res

et al. 2007) quanto

em humanos (Perin et al. 2003, Perin et al. 2004). No entanto, esta via é bastante invasiva

para aplicação em pacientes. Por este motivo, alguns pesquisadores têm investigado a

administração intravenosa (i.v.) de preparações contendo células-tronco, a fim de aumentar a

população endógena que migraria para o miocárdio após o infarto (Nagaya et al.

2004).

Entretanto, a localização destas células exógenas no tecido infartado tem contado

primariamente com análises histológicas pós-

morte.

Assim, a distribuição dinâmica destas

células

-tronco injetadas perifericamente e o seu tráfego só podem ser desvendados através de

estudos comparativos com a eutanásia seriada de uma grande quantidade de animais. Para que

isto seja evitado, e para atender as normas de bioética para a utilização de animais

experimentais são necessários métodos que avaliem a distribuição e o destino das células-

tronco, de forma não invasiva, sem a necessidade da histologia pós-morte (Kraitchman et al.

2005). Atualmente, dispomos de técnicas de medicina nuclear capazes de analisar a

distribuição de células (previamente marcadas com radiotraçadores) administradas por via

intravenosa, fornecendo de forma não invasiva, imagens cintilográficas que determinam o

potencial migratório

destas células para o sítio da lesão.

1.4

MEDICINA NUCLEAR

A Medicina Nuclear é a especialidade médica que utiliza elementos radioativos

(radionuclídeos)

in vivo para diagnosticar e/ou tratar doenças. Avalia a função e a estrutura

dos órgãos, o que possibilita uma identificação precoce de certas anormalidades, bem como

tem sua aplicação terapêutica em tratamentos de algumas doenças (ex: hipertireoidismo,

câncer de tireóide, dor óssea, etc.) Além disso, é bastante empregada no estudo da fisiologia e

siopatologia humanas, uma vez que estuda o curso temporal de um traçador radioativo e a

resposta fisiológica do corpo, através de imagens in vivo obtidas pela cintilografia (Bailey &

Adamson

2003).

Os traçadores radioativos são radioisótopos empregados no organismo em pequenas

quantidades, cujo percurso pode ser acompanhado por aparelhos detectores de radiação. A

radioatividade emitida é capaz de atravessar a matéria, e dependendo da sua energia,

percebida pelo aparelho detector onde estiver (Cardoso <htpp://www.cnen.gov.br>). Para

estudos diagnósticos sugere-se que a energia da radiação esteja em uma faixa adequada para

os sistemas de detecção, e que o isótopo apresente um rápido decaimento para forma não

radioativa (= meia vida, ou seja, tempo que leva para metade dos átomos passarem da forma

radioativa para forma estável). Baseado nestes critérios, o radioisótopo mais empregado

atualmente em medicina nuclear é o

Tecnécio.

tecnécio

metaestável (

99m

Tc) é um elemento radioativo fundamental para a

medicina nuclear, que permite realizar investigações de diversas funções vitais. Ele é gerado a

par

tir da eluição do

molibdênio (produto de fissão produzido em reatores nucleares) em

solução de NaCl 0,9%, apresentando

se sob a forma química de pertecnato de sódio (NaTcO

)

(Marques

et al. 2001). Este radioisótopo apresenta estados de oxidação que variam de +7 (o

mais estável, e a forma pelo qual é fornecida pelo gerador) até +1. As reações de

radiomarcação com

99m

Tc envolvem a redução do pertecnato (

99m

TcO

) a estados de oxidação

mais baixos que podem ser estabilizados por uma série de ligantes, como por exemplo,

doadores de N, O, S e P. Por causa da sua baixa energia emitida (radiação gama com energia

de 140 keV), da sua meia vida curta (seis horas) e da sua fácil aquisição, o

99m

Tc é o

radionuclídeo mais utilizado na cintilografia gama (Marques et al. 2001), podendo ser

administrado sob a forma química de pertecnetato de sódio ou ligado a outras moléculas. As

doses administradas são medidas em função do número de eventos radioativos por segundo,

sendo expresso em unidades Becquerel (1 Bq = 1 desintegra

ção por segundo) ou Curie (1 Ci =

3,7 x 10

Bq). Após a sua administração, geralmente por via endovenosa, o

99m

Tc e os demais

radioisótopos, ou os compostos aos quais estão acoplados (radiofármacos) têm um

comportamento biológico que é idêntico ao de similares não radioativos (Meira

htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm). A distribuição e o grau de concentração do

elemento radioativo nos diversos órgãos são avaliados por meio de imagens cintilográficas

A cintilografia é uma técnica não invasiva, segura, indolor, de baixo custo, e com

sensibilidade elevada para avaliar o funcionamento dos diversos órgãos (ex: coração, rin

cérebro, e outros) (Bailey & Adamson

2003). Tal método é baseado na administração

endovenosa do

radioisótopo (também chamado de traçador ), e na avaliação da energia gama

emitida pelos traçadores. Uma vez presente na circulação periférica, o radioisótopo é atraído

para órgãos específicos. O seu deslocamento e percurso podem ser acompanhados, pois a

energia emitida pelo traçador (geralmente radiação gama) é captada por um aparelho

chamando câmara de cintilação (ou gama câmara). A gama câmara é o sistema de detecção de

radioatividade utilizado para o estudo da distribuição in vivo dos diferentes compos

tos

radiomarcados. A interação da radiação gama no detector da câmara leva a emissão de luz

(cintilação), posteriormente convertida em sinal elétrico. A câmara de cintilação detecta a

radiação e determina a posição da fonte emissora (correspondente à área em que a luz foi

emitida) e sua energia (intensidade da luz emitida). Além da maior resolução, os

equipamentos mais modernos destacam-se pela capacidade de adquirir e processar estudos

tomográficos (SPECT = single photon emission computed tomography ), trazendo maior

sensibilidade e precisão na localização de lesões. Dentre as várias aplicações da cintilografia,

podemos destacar a sua capacidade de diagnosticar doença arterial coronariana, através da

chamada cintilografia de perfusão miocárdica (

Meira

htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm)

A cintilografia de perfusão do miocárdio avalia o fluxo de sangue para o músculo

card

íaco através das artérias coronárias. Isto possibilita definir possíveis obstruções

coronarianas, analisar a probabilidade da ocorrência de um infarto do miocárdio, e ainda pode

estimar a extensão de um infarto prévio. Este exame caracteriza-se pela captação da

radioatividade emitida por um radiofármaco (administrado por via endovenosa), o qual se

concentra nos miócitos, na dependência da sua irrigação e sua integridade celular, gerando

assim uma imagem do coração. Um radiofármaco bastante utilizado ligado

99m

Tc é o

tetrofosminn (Meira htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm). Este complexo interage

diretamente com o cardiomiócito, sendo captado por difusão passiva através de um gradiente

transmembrana. Além disso, fixa-se de forma estável com pouca redistribuição, em estruturas

citoplasmáticas, e possui afinidade pelo meio intramitocondrial. O grau de captação deste

radiofármaco é diretamente proporcional à perfusão miocárdica no momento de sua

administração, isto é, se uma área do coração não recebe sangue (isquemia), o traçador não

consegue chegar neste local, não há captação de radioatividade, e esta região não aparece na

imagem cintilográfica. Tal radiofármaco, após administração endovenosa e acúmulo no

miocárdio (que capta cerca de 1% da dosagem administrada), músculo esquelético, fígado,

baço, e rins, em proporção a perfusão regional, é rapidamente retirado da circulação (Meira

htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm).

Baseado

nos princípios citados anteriormente, o tetrofosmin-

99m

Tc vem sendo

amplamente utilizado na detecção de áreas de perfusão miocárdica de pacientes infartados

através da cintilografia de perfusão miocárdica. Além disso, células marcadas com um

traçador radioativo, como o

99m

Tc, infundidas na circulação periférica, podem ser localizadas

de forma não invasiva através de imagens cintilográficas. Portanto, a medicina nuclear é

bastante útil nos estudos que envolvem a aplicação da terapia celular, principalmente

aqueles

relacionados com as vias de administração.

Este estudo se propõe a identificar os sítios preferenciais de migração das células de

medula óssea (CMMO) durante a isquemia miocárdica aguda, e correlacionar o impacto da

presença destas células sobre a função cardíaca dos animais. Para tal, os objetivos deste

trabalho são:

- Identificar a distribuição das CMMO marcadas com

99m

Tc, administradas por via

intravenosa, em ratos submetidos à isquemia miocárdica aguda através da oclusão permanente

da artéria c

oronária esquerda.

- Verificar se existe diferença na distribuição das CMMO administradas por via

intravenosa, entre os modelos de oclusão temporária e permanente da artéria coronária

esquerda.

- Comparar a distribuição das CMMO marcadas com

99m

Tc, administradas por via

intravenosa e intramiocárdica, em ratos submetidos à isquemia aguda por oclusão permanente.

- Avaliar o efeito dos tratamentos intravenoso e intramiocárdico com CMMO na

função cardíaca dos animais submetidos à oclusão permanente da artéria c

oronária esquerda.

Comparar o efeito do tratamento intramiocárdico e intravenoso.

3.1

NIMAIS

Ratos Wistar machos e fêmeas singenêicos pesando entre 200-250g fornecidos pelo nosso

biotério foram utilizados para obtenção das células de medula óssea, bem como para indução

do infarto do miocárdio e os experimentos de distribuição das células. Todos os

procedimentos seguiram as normas do Comitê de Ética do Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro para utilização de animais de

Laboratório. Os animais foram separados em grupos de acordo com as seguintes etapas do

estudo:

- ETAPA 1

Grupo de animais destinados à avaliação da função cardíaca nos diferentes

modelos experimentais de infarto: modelo de oclusão temporária e de oclusão permanente da

artéria coronária esquerda.

- ETAPA 2

Grupo de animais destinados à análise da distribuição das

células

mononucleares da medula óssea (

CMMO) no organismo.

- ETAPA 3 - Grupo de animais destinados à avaliação da função

cardíaca

dos animais

tratados com CMMO ou veículo.

A análise dos parâmetros cardíacos nos diferentes modelos experimentais de infarto (Etapa

1) visa a validação do modelo de oclusão temporária da artéria coronária esquerda, para que

posteriormente a distribuição intravenosa das CMMO seja comparada em ambos os modelos

de isquemia propostos. Sendo assim, na etapa 1 foram avaliados os parâmetros cardíacos dos

seguintes grupos: animais normais, uma vez que estudos prévios não mostraram diferença no

eletro e ecocardiograma entre animais normais e falso-operados (Pinho-Ribeiro 2003),

animais submetidos à isquemia pela oclusão permanente ou oclusão temporária da artéria

coronária. Estes dois últimos grupos foram denominados OP e OT, respectivamente.

descrição d

etalhada de todos os grupos da etapa 1 está descrita no quadro 1.

Nos animais da etapa 2 analisamos a distribuição das CMMO marcadas com o traçador

99m

Tc a fim de estabelecermos os possíveis sítios de migração das células após a

administração intravenosa em animais normais, OP e OT. Além disso, a distribuição das

CMMO em animais normais e OP após administração intramiocárdica das células também foi

analisada. O quadro 2 fornece a descrição detalhada de cada grupo desta etapa.

Nos animais da etapa 3

alisamos a os parâmetros cardíacos de ratos submetidos à

isquemia por oclusão permanente, tratados com injeção intramiocárdica (grupo OP im) ou

intravenosa (grupo OP iv) de CMMO ou veículo (salina), 48 horas após o procedimento

cirúrgico. No caso dos anima

is que receberam veículo, não houve diferença significativa entre

aqueles que receberam tratamento intravenoso e os que receberam injeção intramiocárdica,

por isso todos foram agrupados em um único grupo chamado OP. Os parâmetros cardíacos

avaliados basear

-se no eletrocardiograma (ECG), ecocardiograma (ECO), análise

hemodinâmica e teste de esforço. O ECG e o ECO foram realizados antes do tratamento com

CMMO ou com veículo (48h após o procedimento cirúrgico) e três semanas após o

tratamento com células ou veículo. As análises hemodinâmicas e o teste de esforço foram

realizados somente três semanas após a terapia celular. A descrição detalhada de todos os

grupos da etapa 3 está descrita no quadro 3.

Quadro 1

Descrição dos grupos da etapa 1.

ETAPA 1

AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO CARDÍACA NOS DIFERENTES

MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFARTO.

NORMAIS

Análise

da função cardíaca de

animais

normais

(n = 10).

Análise

da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente

da artéria coronária esquerda (n = 10).

Análise

da função cardíaca de animais submetidos à

oclusão

temporária

(90 minutos) da artéria coronária esquerda (n = 10).

Quadro 2

Descrição dos grupos da etapa 2.

ETAPA 2

ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO.

Análise da distribuição das CMMO injetadas por via intravenosa em

animais

normais

(n = 10

Análise da distribuição das CMMO injetadas por via intramiocárdica

em animais

normais

(n = 10

Análise da distribuição das CMMO após administração intravenosa

em animais submetidos à oclusão permanente da artéria coronária

esquerda (n = 10)

Análise da distribuição das CMMO após

administração

intramiocárdica

em animais submetidos à oclusão permanente da

artéria coronária esquerda (n = 10)

Avaliação da distribuição das CMMO após administração intravenosa

em animais submetidos à oclusão temporária (90 minutos) da artéria

coronária esquerda (n = 7).

Quadro 3

Descrição dos grupos da etapa 3.

ETAPA

NIMAIS INFARTADOS TR

ATADOS COM

CMMO

Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente

da artéria coronária esquerda após administração de

veículo

(n = 10).

Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente

da artéria coronária esquerda após administração

intravenosa

de CMMO (n = 10)

Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente

da artéria coronária esquerda após

administração

intramiocárdica

de CMMO (n = 9)

3.2

ETAPA

1 :

MODELOS DE INDUÇÃO

DO INFARTO AGUDO EXP

ERIMENTAL

3.2.1

GRUPO OP: MODELO DE OCLUSÃO PERMANENTE DA ARTÉRIA

CORONÁRIA ESQUERDA

O modelo de infarto experimental em ratos induzido pela oclusão permanente da

artéria coronária esquerda descrito por Selye e colaboradores (1960) foi utilizado em nosso

laborató

rio (Olivares et al. 2004, Werneck-

Castro

et al. 2006, Olivares et al. 2007). Para

tal, os animais foram anestesiados com halotano (Cristália

), e em seguida realizada uma

incisão de aproximadamente 1 cm de comprimento na pele, em nível paraesternal esq

uerdo,

na junção dos terços inferior e médio da distância entre a clavícula e o rebordo costal. Os

músculos peitoral maior e menor foram dissecados para melhor visualização do gradil costal

esquerdo. Realizou-se uma sutura em bolsa, da pele e dos músculos da região, deixando o nó

aberto até o término da cirurgia. Neste momento, os animais foram submetidos à ventilação

mecânica através de um pequeno ambú de fabricação doméstica com o intuito de estimular os

movimentos respiratórios espontâneos. Com o auxílio de uma pinça hemostática reta, fez-se a

incisão entre o 4

ou 5

espaço intercostal esquerdo, através do qual o coração foi

exteriorizado por meio de uma suave compressão manual torácica direita. Após a localização

da artéria coronária esquerda (geralmente sob a aurícula esquerda), a mesma foi ocluída com

fio de seda 6-0 através de um nó duplo o mais próximo possível de sua origem na aorta. Em

seguida, o coração foi recolocado rapidamente em sua posição anatômica original e o nó da

sutura em bolsa finalmente apertado. A taxa de mortalidade induzida pelo procedimento

cirúrgico foi entre 30 e 40%. Após 48 horas, realizamos ECG e/ou ECO para verificar se o

infarto foi realmente induzido.

3.2.2

GRUPO OT: MODELO DE OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA

CORONÁRIA ESQ

UERDA

Os animais foram anestesiados com 50 mg/kg de cloridrato de quetamina (Vetaset ) e

5 mg/kg de cloridrato de xilazina (Rompum , Bayer), e após obtermos um plano anestésico

ideal, realizamos a entubação do animal. Para tal procedimento, o mesmo foi colocado em

decúbito dorsal e traqueotomizado. Desta forma, realizamos uma incisão em seu pescoço, os

músculos da região foram divulsionados, e a traquéia isolada. Em seguida, um jelco nº 30, foi

inserido entre os anéis da traquéia e conectado ao ventilador. Os animais foram mantidos sob

ventilação com pressão positiva com ar ambiente e suplementado com oxigênio (2L/min).

Para tanto, o ventilador foi calibrado de forma que a freqüência respiratória fosse em torno de

-80 ciclos/minuto e o volume corrente fixado em 1ml/g. Uma vez entubado, foi realizada

uma incisão na região entre o 4º e 5º espaços intercostais, os músculos peitoral maior e menor

divulsionados para obtermos o acesso ao gradil costal e visualizarmos o coração dentro da

caixa torácica. Em seguida, o fluxo sangüíneo da artéria coronária esquerda foi ocluído

durante 90 minutos, a fim de provocar uma lesão isquêmica no miocárdio. Ao final deste

período, o fluxo sangüíneo foi restabelecido (reperfusão local). Em seguida, foi realizada uma

sutura em b

olsa e o animal foi retirado do respirador.

3.2.2.1

PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS APLICADOS AOS ANIMAIS SUBMETIDOS

À OCLUSÃO TEMPORÁRIA

DA ARTÉRIA CORONÁRI

A ESQUERDA

Os animais submetidos à isquemia temporária foram avaliados 48h após o

procedimento cirúrgico, pelo ECG e/ou ECO, a fim de confirmarmos a presença de lesão

isquêmica. Uma vez confirmada a existência de disfunção cardíaca, os animais foram

submetidos dois diferentes protocolos experimentais especificados abaixo:

Marcação das células mononucleares de medula óssea com o corante nuclear

Hoechst, e injeção intravenosa destas células 48 horas após a cirurgia de oclusão

temporária, a fim de verificarmos se as células eram capazes de migrar para o

coração submetido à isquemia;

Marcação das CMMO com o ra

dioisótopo

99m

Tc para avaliação da distribuição

destas células após administração intravenosa nos animais com oclusão

temporária.

Em ambos os protocolos, os animais foram sacrificados 24 horas após a administração

das células.

3.3

SOLAMENTO DE CÉLULA

S MONONUCLEARES DE M

EDULA ÓSSEA

Ratos Wistar singenêicos pesando 200 a 300 g foram anestesiados com éter etílico PA

(Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e submetidos a deslocamento cervical. Com o auxílio de

uma pinça e uma tesoura estéreis retiramos a pel

e e os músculos adjacentes ao fêmur e à tíbia,

sempre evitando o rompimento de vasos sangüíneos presentes na região. As epífises ósseas

foram cortadas, e a cavidade medular lavada com meio de cultura Dulbecco s Modified Eagle

Medium (DMEM) (Life Tecnologies

, Grand Island, NY, EUA) utilizando uma seringa com

agulha de 18 gauge colocada sobre um tubo estéril de poliestireno cônico de 15 mL (Falcon

As células foram homogeneizadas com auxílio de pipeta Pasteur, e centrifugadas a 200 G

durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento de células foi ressuspenso em

DMEM sem soro, e em seguida adicionado cuidadosamente sobre o Ficoll (Histopaque 1083

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). A seguir, as células foram centrifugadas a

400 G durante 30 m

inutos à temperatura ambiente. Na interface Ficoll

meio, estão contidas as

células mononucleares (linfócitos e monócitos) e células-tronco de medula óssea, que foram

coletadas e colocadas em um tubo de poliestireno cônico de 15 ml (Falcon ). Em seguida,

ram ressuspensas em solução salina balanceada ( balanced salt solution - BSS), e

centrifugadas a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi

desprezado, e este processo repetido mais duas vezes para retirar o Ficoll que possa ter s

ido

coletado junto com as células. As células foram contadas na câmara de Neubauer (Hausser

Scientific

) e a sua viabilidade analisada com azul de Trypan. A população mononuclear

obtida foi utilizada logo em seguida para os experimentos de distribuição e/ou análise do

efeito da terapia celular.

3.4

ETAPA

ANÁLISE DA DISTRIBU

IÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA

3.4.1

DETERMINAÇÃO DA TOPOGRAFIA DO CORAÇÃO NAS IMAGENS

CINTILOGRÁFICAS

Para determinarmos a topografia do coração nas imagens cintilográficas em ratos

normais e infartados através da oclusão permanente da artéria coronária, injetamos por via

intravenosa (i.v.) tetrofosmin (Myoview

, Amershan Health AS, Oslo, Noruega) marcado

com

99m

Tc em ratos normais e OP (24 horas após a cirurgia). Isto nos permitiu diferenciar

áreas com perfusão miocárdica normal daquelas com fibrose (infarto) através de imagens

cintilográficas. As regiões com perfusão adequada emitem radioatividade e aparecem na

imagem. Entretanto, as áreas que possuem irrigação comprometida,

não aparecem na imagem,

pois o radiofármarco não chega nessa região.

3.4.2

MARCAÇÃO DAS CÉLULA

S COM

TECNÉCIO

Após o isolamento das CMMO conforme já descrito, as mesmas foram marcadas com

o radioisótopo

99m

Tecnécio e transplantadas pela via endovenos

a ou no miocárdio dos animais

dos diversos grupos experimentais descritos no quadro 2.

O processo de marcação das células com

99m

Tc consistiu na incorporação do

radionuclídeo às mesmas. Para tanto, as células foram incubadas, a temperatura ambiente,

com concentrações variando de 5 a 20 g/mL de SnCl

durante 5 minutos. Em seguida, este

complexo foi incubado com o radionuclídeo (7,4 x 10

Bq) durante mais 5 minutos, e

centrifugado três vezes com NaCl 0,9% a 450 G durante 20 minutos. Ao final da última

lavage

m, separamos o precipitado e o sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em NaCl

0,9%, e distribuído em seringas contendo 0,1 mL ou 0,3 mL cada. A quantidade de

radioatividade presente tanto no sobrenadante quanto no precipitado foi quantificada para

det

erminarmos a eficiência de marcação das células (quantidade de radioatividade

incorporada nas células).

3.4.3

NJEÇÃO DAS CÉLULAS M

ARCADAS COM

TECNÉCIO

Os animais foram anestesiados, colocados em decúbito dorsal, com suas patas traseiras

e dianteiras imobilizadas, para que as células fossem administradas por via intravenosa (i.v.)

ou intramiocárdica (i.m.), nos grupos submetidos à isquemia (48 horas após o procedimento

cirúrgico) e nos animais normais. Os protocolos experimentais utilizados estão de

scritos

detalhadamente nas Figura 1, 2 e 3.

Para administração das células por via i.v, fizemos uma incisão na pele do animal na

região lateral, abaixo do pescoço para visualização da veia jugular. Desta forma, com auxílio

de uma seringa de 1mL, injetamos as células marcadas com

99m

Tc direto pela veia jugular. O

conteúdo (0,3 mL) foi liberado lentamente dentro do vaso, e a seringa retirada do interior do

vaso, cuidadosamente, a fim de evitarmos extravasamento de sangue. Em seguida o animal foi

suturado, e em períodos pré-determinados (uma, três e 24 horas após a injeção das células)

realizamos as imagens cintilográficas.

Já para a administração por via i.m., o coração foi exteriorizado (conforme descrito

anteriormente no item 3.2.1) e as CMMO marcadas com

99m

Tc (0,1 mL) foram injetadas em

um único ponto do miocárdio com auxílio de uma seringa de insulina. No caso dos animais

infartados, a administração i.m. das células foi realizada no miocárdio viável adjacente à

cicatriz. Uma vez terminado tal processo, o coração foi colocado novamente em sua posição

anatômica original e o tórax suturado conforme descrito anteriormente no modelo de indução

do infarto experimental. As imagens cintilográficas foram realizadas nos mesmos períodos

pré

determinados descritos an

teriormente.

Nos animais normais e OP, as células foram administradas tanto por via i.v. quanto

i.m., sendo que neste último grupo, as mesmas foram injetadas 48 horas após o procedimento

cirúrgico, com concomitante confirmação da indução do infarto pela presença de onda Q na

derivação DI do registro eletrocardiográfico. Já nos animais do grupo OT, as células foram

administradas somente por via i.v., também após confirmação da indução do infarto pelo

ECG.

3.4.4

IMAGENS CINTILOGRÁF

ICAS

As imagens cintilográficas foram analisadas na gama câmara (Siemens) com

colimador pinhole de alta definição e janela selecionada para 140 KeV,

em diversos intervalos

de tempo: uma hora, três horas, e 24 horas após a infusão das células. Para realização de tal

procedimento,

o animal foi anestesiado com cloridrato de quetamina (Vetaset ) e cloridrato

de xilazina (Rompum , Bayer), conforme já descrito no item 3.2.2. Em seguida, o animal foi

colocado em decúbito dorsal, suas patas fixadas com fita adesiva em um suporte de madei

ra, e

este colocado sob o colimador de alta resolução e baixa energia da gama câmara. A aquisição

das imagens foi realizada em imagens planares, estáticas, de 5 minutos cada, com matriz 256

x 256, de corpo inteiro e nas incidências anterior, lateral e oblí

qua com 45º.

Figura 1

Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais normais.

A figura A esquematiza o protocolo realizado nos animais tratados com injeção

intramiocárdica (N im), enquanto que a figura B mostra o esquema dos animais tratados com

injeção intravenosa (N iv). T0 = tempo zero.

24h

Contagem dos

órgãos isolados

Imagem

cintilográfica

Marcação das

CMMO

com

99m

Injeção intramiocárdica

de 4 x 10

CMMO

marcadas com

99m

Imagem

cintilográfica

Imagem

cintilográfica

24h

Contagem dos

órgãos isolados

Imagem

cintilográfica

Marcação das

CMMO

com

99m

Injeção intra

venosa

1-3

x 10

CMMO

marcadas com

99m

Imagem

cintilográfica

Imagem

cintilográfica

Figura 2

Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais

submetidos à oclusão permanente da artéria coronária (OP). A figura A esquematiza o

protocolo aplicado aos animais tratados com injeção intramiocárdica (OP im), enquanto que a

figura B mostra o esquema dos animais tratados com injeção intravenosa (OP iv). T0 = tempo

zero.

Contagem dos

órgãos isolados

Imagem

cintilográfica

Oclusão permanente

da artéria coronária

esquerda

Injeção intra

venosa

1-2

x 10

CMMO

marcadas com

99m

Imagem

cintilog

ráfica

Imagem

cintilográfica

Marcação das CMMO

com

99m

Confirmação da

indução do infarto

pelo ECG

Contagem dos

órgãos isolados

Imagem

cintilográfica

Oclusão permanente

da artéria coronária

esquerda

Injeção intra

miocárdica

x 10

CMMO

marcadas com

99m

Imagem

cintilográfica

Imagem

cintilográfica

Marcação das CMMO

com

99m

Confirmação da

indução do infarto

pelo ECG

Figura 3

Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais

submetidos à oclusão temporária da artéria coronária (OT) tratados com injeção intravenosa

de CMMO. T0 = tempo zero.

Contagem dos

órgãos isolados

Imagem

cintilográfica

Oclusão durante 90

da artéria coronária

esquerda

Injeção intra

venosa

2-5

x 10

CMMO

marcadas com

99m

Imagem

cintilográfica

Imagem

cintilográfica

Marcação das CMMO

com

99m

Confirmação da

indução do infarto

pelo ECG

3.4.5

CONTAGEM DA RADIOAT

IVIDADE PRESENTE NOS

ÓRGÃOS ISOLADOS

Vinte e quatro horas após a infusão intravenosa das células, o animal foi eutanasiado

conforme descrito anteriormente, e a maioria dos seus órgãos retirados e pesados

isoladamente. Após a pesagem, os órgãos: coração, pulmões, fígado, baço, rins, estômago, e

tíbia;

foram distribuídos em tubos de ensaios, e os mesmos colocados em um contador de

radiação gama, que quantifica a radioatividade gama emitida por cada amostra de órgão

isolado. Em seguida, realizamos cálculos para converter estes valores representados em

ntagem por minuto (cpm) em termos percentuais, analisando os seguintes parâmetros:

% dose-

órgão

Representa a quantidade de radiação presente em determinado órgão.

Ou seja: (cpm do órgão/ nº de desintegrações radioativas por minuto corrigidas

pelo decaim

ento) x 100

% grama

tecido

É a dose

órgão dividida pelo peso do órgão, em gramas. Isto é:

[(cpm do órgão/ nº de desintegrações radioativas por minuto corrigidas pelo

decaimento)/peso do órgão] x 100

3.5

ETAPA

ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA APÓS O

TRATAMENTO COM CMMO

OU VEÍCULO

3.5.1

MARCAÇÃO DAS CÉLULA

S MONONUCLEARES

Os animais dos grupos OP im e OP iv, que tiveram suas funções cardíacas

acompanhadas, receberam por via i.m. ou i.v., respectivamente, células previamente marcadas

com um corante nuclear (Hoechst). Após a marcação, uma alíquota foi examinada em

microscópio de epifluorescência (AXIOVERT 100, Carl ZEISS), e excitada com iluminação

por lâmpada de mercúrio de alta pressão, HBO 50W, (

= 490 m) sendo a emissão

monitorada utilizando um filtro de 350 m a fim de verificar a marcação nuclear das células

com o corante. Uma vez confirmada a marcação, as células foram centrifugadas a 200 g

durante 5 minutos a temperatura ambiente, para obtenção do sedimento. O mesmo foi

ressuspenso em salina, e centrifugado a 200 g durante cinco minutos. Este processo foi

repetido de três a quatro vezes para a retirada do possível excesso do corante. Ao final da

última centrifugação, o volume foi ajustado de acordo com o número de células necessárias

para o

transplante celular, em alíquotas de 5-

6 x 10

células em 0,1 mL e 3-

4 x 10

células em

0,3 mL para injeções intramiocárdica e intravenosa, respectivamente.

3.5.2

- A

NÁLISE FUNCIONAL

3.5.2.1

NÁLISE ELETROCARDIOG

RÁFICA

O registro eletrocardiográfico foi realizado 48 horas após o procedimento cirúrgico, e

três semanas após a terapia com células ou salina, utilizando um eletrocardiógrafo

convencional (Cardimax FX-

2111

Fukuda Denshi) conforme descrito por Santos & Masuda

(1991). Para o registro eletrocardiográfico, os animais foram anestesiados com a combinação

de cloridrato de quetamina (Vetaset ) e cloridrato de xilazina (Rompum , Bayer) conforme

descrito anteriormente. Após o estabelecimento de um bom plano anestésico, verificado

através da ausência de reflexos posturais e motores, os animais foram colocados em decúbito

dorsal e suas patas dianteiras presas com fitas adesivas a fim de manter uma angulação de 90º

em relação ao examinador do corpo, evitando assim qualquer alteração na posição anatômica

coração. O posicionamento dos animais foi rigorosamente padronizado para diminuírmos a

variabilidade entre os registros, sobretudo para o cálculo dos vetores médios de

despolarização ventricular. Em seguida, agulhas hipodérmicas 30 x 1 conectadas aos quatr

eletrodos (derivações do plano frontal) foram colocadas nas patas dianteiras direita e esquerda

e na coxa esquerda, além da coxa direita que estava ligada ao fio terra (Figura 4A). As

derivações analisadas no plano frontal foram: DI, DII, DIII, aVR, aVL e aVF. O aparelho foi

calibrado para a velocidade de 50 mm/s e sensibilidade de 20 mm = 1 mV. Os parâmetros

analisados foram: presença de onda Q na derivação DI, orientação do vetor médio de

despolarização (âQRS) no plano frontal, e índice da amplitude do complexo QRS (soma do

complexo QRS nas derivações DI, DII e DIII).

3.5.2.2

NÁLISE ECOCARDIOGRÁF

ICA

Os exames foram realizados 48h após o procedimento cirúrgico (grupos 1, 2 e 3) para

confirmação da presença de infarto. Na etapa 3, além de ter sido analisada neste período, a

função cardíaca também foi avaliada três semanas após a terapia com células ou veículo. As

imagens ecocardiográficas foram obtidas em um equipamento comercialmente disponível

(Megas

Esaote) que permite a aquisição de imagens nos modos uni e bidimensional, com um

transdutor do tipo eletromecânico na faixa de 10 MHz.

Os animais foram anestesiados conforme já descrito no item 3.2.2, depilados na região

torácica, e em seguida, aplicado um gel no seu tórax, para diminuir o contato com o ar e

melhorar a qualidade das imagens obtidas (Figura 4B). Os animais foram colocados em

decúbito dorsal ou lateral esquerdo, para obtenção de imagens longitudinais e transversais por

um pesquisador que desconhecia o histórico do animal. Os parâmetros av

aliados

compreenderam: análise da geometria cardíaca e a função sistólica do ventrículo esquerdo

(VE), de acordo com o padrão da Sociedade Americana de Ecocardiografia (ASE) e conforme

descrito por Sahn e colaboradores (1978).

O exame foi realizado antes da cirurgia, 48h horas após o IAM, e três semanas após a

terapia celular ou após administração de veículo.

A geometria cardíaca foi analisada utilizando o modo unidimensional (Modo-M) para

avaliar os seguintes parâmetros: diâmetro da cavidade ventricular ao final da sístole (DSF) e

diâmetro da cavidade ventricular ao final da diástole (DDF), ambos em mm.

A função sistólica foi determinada pela da análise da fração de encurtamento (FEnc) e

da fração de ejeção (FE) do VE.

A fração de encurtamento foi ca

lculada pela diferença entre o diâmetro diastólico final

(DDF) e o diâmetro sistólico final (DSF), dividida pelo DDF e multiplicada por 100. Assim:

FEnc (%) = [(DDF

DSF) / DDF] x 100

Nos animais normais e falso-operados, a fração de ejeção, outro parâmetro de

avaliação da função sistólica, foi calculada elevando-se ao cubo os valores de DDF e DSF

(método cúbico), obtendo-se assim o volume diastólico final (VDF) e volume sistólico final

(VSF), conforme mostra a fórmula abaixo:

FE (%) = [(DDF)

(DSF)

/ (DDF)

] x 100

FE (%) = [VDF

VSF / VDF] x 100

Nos grupos de animais infartados, o coração encontrava-se muito dilatado, perdendo

sua forma cônica e invalidando o cálculo dos volumes pelo cubo dos diâmetros cavitários em

sístole e diástole. Para evitar tais erros, o ecocardiógrafo determinou automaticamente no

modo

M os volumes sistólico e diastólico já corrigidos pela fórmula de Teichholz:

V = [7,0 / 2,4 + D] x (D

)

Onde: V = volume ventricular final na diástole ou na sístole; e D = diâmetro diastólico ou

sistólico final ventricular (cm).

Nos animais submetidos à oclusão temporária da coronária, além de calcularmos as

frações de encurtamento e de ejeção pelo modo-M, a função sistólica foi calculada também

pelo método de Simpson. Este consiste na delimitação (com auxílio de um cursor) de toda a

cavidade ventricular em sístole e em diástole, o que proporciona a avaliação da função

sistólica global do coração (frações de ejeção e de encurtamento do VE). Desta forma,

minimizamos a possibilidade de realizarmos medidas equivocadas da função ventricular,

devido à super ou subestimação de segmentos específicos do VE.

Nos animais da etapa 3, a partir das imagens bidimensionais, também calculamos

outros dois parâmetros: a fração de encurtamento de área (FEA) e o percentual de acinesia do

ventrículo esquerdo (AVE), parâmetros estes também incluídos na avaliação global da câmara

ventricular esquerda.

O percentual da fração de encurtamento de área (FEA) foi calculado através das áreas

do ventrículo esquerdo

em sístole (AVES) e em diástole (AVED), conforme descrito a seguir:

% FEA = [(ADVE

ASVE) /ADVE] x 100

Já o percentual de acinesia do ventrículo esquerdo, que caracteriza a extensão do

infarto, foi calculado a partir dos perímetros de acinesia do VE (PAVE) e total do VE

(PTVE), medidos ao final da diástole, conforme descrito a seguir:

% AVE = [(PTVE

PAVE)/PTVE] x 100

Figura 4

Análise da função cardíaca dos ratos. A -

exame eletrocardiográfico . Note os eletrodos

fixados nas patas dianteiras e traseiras do animal (setas). B -

exame ecocardiográfico. Note o gel

condutor em contato com o transdutor e a pele do animal.

3.5.2.3

NÁLISE HEMODINÂMICA

3.5.2.3.1

CANULAÇÃO DA ARTÉRI

A CARÓTIDA COMUM

Os animais foram anestesiados conforme descrito anteriormente no item 3.2.2,

colocados em decúbito dorsal sob uma mesa cirúrgica, e suas patas traseiras e dianteiras

imobilizadas. Uma vez adquirido o plano anestésico ideal, fizemos uma incisão na pele do

animal na região inferior direita lateral a traquéia (Figura 5A). Com auxílio de duas pinças

curvas, divulsionamos os músculos próximos da artéria carótida, e isolamos a mesma (Figura

5B). O fluxo de sangue local foi obstruído, e com o auxílio de uma pinça oftálmica, fizemos

um pequeno corte no vaso, para a inserção da cânula de polietileno (PE 10

diâmetro interno

de 0,28 mm e externo

0,61 mm

Becton Dickson) dentro do vaso (Figura 5C). Para termos

certeza da eficácia da canulação do VE, a mesma era conectada ao transdutor de pressão

(MLT380/D, instrumentos/ADI) associado a um sistema de aquisição Power-

Lab400

(instrumentos/ADI), e o registro de pressão obtido deveria ser característico do VE. A outra

extremidade do cateter foi transpassada subcutaneamente entre as escápulas do animal,

permitindo que a mesma fosse exteriorizada no seu dorso (Figura 5D) para realização do

registro hemodinâmico. As análises da pressão intraventricular esquerda foram realizadas com

o animal anestesiado e acordado, considerando que o efeito do anestésico poderia interferir

nos registros hemodinâmicos do animal. Vinte quatro horas após a colocação da cânula

intraventricular, a extremidade exteriorizada foi acoplada ao transdutor de pressão

(MLT380/D, instrumentos/ADI) que se encontrava associado ao sistema de aquisição Power-

Lab400 (instrumentos/ADI). Após um período de adaptação de 30 minutos, iniciamos a

aquisição do registro da pressão intraventricular esquerda dos animais acordados. Os dados

hemodinâmicos foram calculados a partir da média de 10 batimentos cardíacos consec

utivos.

Os parâmetros avaliados foram: freqüência cardíaca (FC); pressão sistólica do ventrículo

esquerdo (PSVE); pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE); pressão

desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (PVE), representada pela diferença entre PSVE e

PDFVE; a primeira derivada temporal positiva

máxima

da pressão ventricular representada

pela primeira derivada temporal positiva máxima de pressão ventricular (dP/dT+); e a

primeira derivada temporal negativa

máxima

da pressão ventricular

represe

ntado pela dP/dT

3.6

TESTE DE ESFORÇO

Três semanas após o procedimento cirúrgico, os animais foram submetidos ao estresse

físico em uma esteira de ratos completamente vedada (esteira Accupacer, Accuscan

Instruments, Inc Columbs, Ohio, USA), com incli

nação fixada em 10

graus.

O protocolo de exercício máximo utilizado foi uma adaptação do trabalho de

Henderson e colaboradores (2002). Em síntese, cada animal passou por um processo de

adaptação ao exercício que correspondia a um período de três dias, no qual o rato corria

durante 5 minutos a uma velocidade constante de 17 cm/s. No quarto dia, testamos a

capacidade máxima em exercício de cada rato. O início do teste foi realizado com uma

velocidade inicial de 17 cm/s e inclinação constante de 10º. A cada

dois minutos, a velocidade

da esteira foi aumentada em 2 cm. Os animais que paravam de correr se aproximavam da área

de choque, e estes estímulos elétricos os mantinham em exercício, até sua exaustão. O critério

utilizado para determinarmos que o animal atingiu a exaustão foi a sua permanência na área

de choque por mais de um minuto.

Figura 5

Processo de canulação da artéria carótida. A

Incisão na região onde se localiza a

artéria

carótida.

B - Isolamento da artéria carótida após dissecação. C -

Introdução do cateter no

interior da artéria carótida.

Note

que o sangue foi aspirado, comprovando que o cateter encontrava

se no

interior do vaso. D - Exteriorização da cânula no dorso do animal (seta) para possibilitar a real

ização da

análise hemodimâmica do animal acordado.

3.7

ESTUDO ANATOMO

HISTO

PATOLÓGICO

A análise morfológica foi realizada nos corações dos animais da etapa 3 e em alguns

animais do grupo OT (etapa 2) para investigarmos a presença de células coradas no tecido

cardíaco. No caso do grupo OT, os animais foram eutanasiados 24 horas após a administração

das células, e o material em seguida fatiado e emblocado em OCT (Tissue Tek

conforme

descrito adiante. Enquanto que nos animais da etapa 3, os animais foram sacrificados três

semanas após a terapia.

3.7.1

PREPARO DO MATERIAL

Nos animais da etapa 3, três semanas após a terapia celular, realizamos todas as

análises funcionais, e em seguida os animais foram sacrificados para retirada do coração. Os

corações foram imersos em uma solução de KCl 0,05 M, objetivando a parada cardíaca em

diástole, e em seguida preservados em paraformaldeido 4 % com concentrações crescentes de

sacarose (10 %, 20 % e 30 %). Este m

aterial foi seccionado

em três partes idênticas (cada uma

com cerca de 2 mm), que correspondem do ápice para base, às regiões

histológicas

denominadas:

A, B e C. Em seguida, foram emblocados em OCT (Tissue Tek ), congelados

em nitrogênio líquido, e mantidos a -

C até o seu uso. Posteriormente foram obtidas fatias

de 7

destes materiais

, para pesquisa das células marcadas.

3.7.1.2

IDENTIFICAÇÃO DAS C

ÉLULAS MARCADAS

Conforme descrito anteriormente, as lâminas foram preparadas com fatia de 7 m das

fatias A, B e C do coração dos animais da etapa 3 e em alguns animais do grupo OT (n = 6).

Em seguida, os cortes foram lavados três vezes com PBS 1x por 10 minutos, e as lâminas

montadas. Este material foi analisado por microscopia de fluorescência para avaliar a

presença de células marcadas com Hoechst no tecido cardíaco destes animais.

3.8

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram expressos em média

erro padrão. A diferença entre os grupos foi

comparada através do teste de variância One-Way ANOVA com a correção de Bonferroni e

teste T pareado. O nível de confiança considerado foi de 95% (p < 0,05) e o programa

estatístico utilizado foi o GraphPad Prism 4.0

4.1

ETAPA

COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES MODELOS EXPERIMENTAIS DE

INDUÇÃO DO INFARTO D

O MIOCÁRDIO

Antes de realizarmos os experimentos de análise da distribuição das células,

procuramos validar a eficácia do procedimento cirúrgico de isquemia temporária. Para tal,

realizamos ECG e ECO 48 horas após a cirurgia, e comparamos com os exames de animais

nor

mais e submetidos à oclusão permanente (48 horas após o procedimento cirúrgico). Os

parâmetros avaliados no eletro e ecocardiograma foram listados respectivamente nas tabelas 1

e 2.

4.1.1

ANÁLISE ELETROCARDI

OGRÁFICA

Em relação ao ECG, podemos observar que a presença de onda Q em DI, uma

característica predominante nos animais infartados por oclusão permanente, não é regra nos

animais submetidos à isquemia por oclusão temporária. Nestes animais, observamos presença

de onda Q nesta derivação somente em 50% dos animais (cinco em dez). Por este motivo, os

dados eletro e ecocadiográficos do grupo OT apresentados respectivamente nas tabelas 1 e 2,

correspondem aos cinco animais que apresentaram onda Q em DI. Já nos animais normais, o

perfil eletrocardiográfico foi caracterizado pela ausência de onda Q na derivação DI. Desta

forma, a presença de onda Q em D1 foi parâmetro fundamental para considerar presença de

lesão isquêmica nos animais tanto do grupo OP quanto do OT. Com relação à orientação do

ângulo do vetor médio de despolarização ventricular (âQRS), observamos que nos animais

normais o âQRS encontrava-se entre 0 e 90º. Entretanto, nos animais submetidos às oclusões

permanente e temporária, o âQRS localizou-se entre 90º e 180º. Além disso, os valores do

âQRS de ambos os grupos foram significantemente maiores quando comparados aos dos

normais (p < 0,001) (Tabela 1). Não houve diferença significativa quanto ao índice de

amplitude do complexo QRS (iQRS) entre os três grupos analisados (normais, OP, OT),

suger

indo assim que 48 horas após a lesão isquêmica, não existe diferença significativa em

relação ao número de cargas despolarizantes.

4.1.2

ANÁLISE ECOCARDIOGR

ÁFICA

Em relação ao exame ecocardiográfico, podemos observar que o DSF nos animais

submetidos

à isquemia permanente foi significativamente maior em relação aos animais

normais (p < 0,001) (Tabela 2). Nos animais com isquemia temporária, o DSF foi semelhante

àquele observado nos normais. Já o DDF foi similar nos três grupos avaliados (Tabela 2). Em

relação às frações de ejeção e de encurtamento observamos que estes parâmetros foram

significantemente menores nos animais submetidos à isquemia por oclusão permanente

quando comparado com o grupo normal (p < 0,001) (Tabela 2). Entretanto, nos animais

sub

metidos à isquemia por oclusão temporária, tanto a FE quanto a FEnc foram similares

àquelas observadas no grupo normal, e significantemente superiores em relação ao grupo OP

(p < 0,001). A fração de ejeção calculada pelo modo-M foi similar àquela calculada pelo

método de Simpson (tabela 1), logo, obtivemos resultados compatíveis independente do

método de avaliação aplicado.

PARÂMETROS

NORMAIS

(n = 10)

ISQUEMIA PERMANENTE

(48h após indução cirúrgica)

(n = 10)

ISQUEMIA TEMPORÁRIA

(48h após i

ndução cirúrgica)

(n = 10)

ONDA Q EM D

0/10

10/10

05/10

ÍNDICE QRS

(

)

1,39

0,09

0,97

0,11

1,34

0,44

ÂQRS

60,37 ± 2,97

154,14

5,47*

126,16 13,33*

PARÂMETROS

NORMAIS

(n = 10)

(48h após indução cirúrgi

ca)

(n = 10)

(48h após indução cirúrgica)

(n = 5)

DDF

(

mm)

6,44

0,12

6,06 ± 0,37

5,80

0,33

DSF

(

mm)

3,24

0,22

4,61 ± 0,27*

3,18

0,51

ENC

(%)

49,40

3,01

24,00 ± 2,59

46,20

6,26

(%)

84,90

2,16

52,00 ± 4,68

80,20

6,22

FE SIMPS

(%)

87,25

0,90

77,25

5,60

(

BPM

)

220

237

ABELA

ARÂMETROS ELETROCARDIOGRÁFICOS DE ANIMAI

NORMAIS

SUBMETIDOS À

ISQUEMIA POR O

CLUSÃO PERMANENTE

(

)

OU POR OCLUSÃO TEMP

ORÁRIA

(

)

DA ARTÉRIA

CORONÁRIA ESQUERDA

média

erro

padrão

* p

0,0

em relação ao

normais;

ABELA

ARÂMETROS E

COCARDIOGRÁFICOS DE

ANIMAIS

NORMAIS

SUBMETIDOS À

ISQUEMIA POR OCLUSÃO

PERMANENTE

(

)

OU POR OCLUSÃO TEMP

ORÁRIA

(

)

DA ARTÉRIA

CORONÁRIA ESQUERDA

ISQUEMIA POR OCLUSÃO

PERMANENTE

(

)

DA ARTÉRIA CORONÁRI

A DESCENDENTE ANTERI

ESQUERDA E ISQUEMIA

POR OC

LUSÃO TEMPORÁRIA

(

)

MINUTOS

média

erro

padrão

DDF

diâmetro diastólico final

do VE

DSF

diâmetro sistólico final

do VE;

fração de encurtamento

do VE

fração de ejeção

do VE;

freqüência cardíaca; NR não realizado;

# p

< 0,001 em relação aos

animais normais;

< 0,001 em relação ao

grupo

p < 0,01 em relação

aos

animais normais

< 0,01 em relação ao

grupo

4.2

PESQUISA DAS CÉLULAS MARCADAS COM HOECHST APÓS ADMINISTRAÇÃ

INTRAVENOSA DE CMMO

NOS ANIMAIS DO GRUPO

Os animais submetidos à isquemia temporária de 90 minutos, receberam inje

ção

intravenosa de CMMO (marcadas com o corante nuclear Hoechst) 48 horas após o

procedimento cirúrgico. Vinte quatro horas após a administração das células, os animais

foram eutanasiados (n = 5), seus corações retirados, emblocados em OCT e congelados par

posteriormente verificarmos se as células seriam capazes de migrar para o tecido cardíaco

submetido à isquemia temporária. A análise deste material demonstrou presença de poucas

células marcadas com Hoechst, distribuídas isoladamente no tecido cardíaco destes animais

(Figura 6).

Figura 6

Fotos representativas das imagens de fluorescência (A) e campo claro (B) do tecido

cardíaco do VE de animais submetidos à isquemia temporária, sacrificados 24 horas após o

tratamento intravenoso com CMMO marcadas com o corante nuclear Hoechst. Note a

presença isolada de célula no tecido (seta). Imagem original aumentada 20x.

4.3

ETAPA

ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE

MEDULA ÓSSEA NO ORGA

NISMO

4.3.1

MARCAÇÃO D

AS CÉLULAS

Em todos os experimentos de distribuição, avaliamos a eficiência de marcação das

células com tecnécio, antes das mesmas serem administradas nos animais. Este parâmetro nos

forneceu o percentual de células marcadas com tecnécio que foram infundidas nos animais. A

eficiência média de marcação dos nossos experimentos foi de aproximadamente 85%,

demonstrando que grande parte das células incorporou o radioisótopo. Para confirmarmos que

o material radioativo não estava sendo excretado com o decorrer do tempo, analisamos a

quantidade de radioatividade presente tanto no precipitado quanto no sobrenadante das

células, nos seguintes períodos: uma, três, e 24 horas após a marcação (Figura 7). Verificamos

que a quantidade de radioatividade presente no sobren

adante não aumentou com o decorrer do

tempo, indicando que o material manteve-se incorporado na célula. Além disso, analisamos a

viabilidade das células, antes e após a marcação com tecnécio. Observamos que o

radioisótopo não influenciou a viabilidade das

células, que se manteve em torno de 95%.

Figura 7

Curva representativa da estabilidade da marcação com

99m

Tc em amostras de

células que foram mantidas na estufa durante uma, três e 24 horas após a marcação com o

radioisótopo. Após centrifugação, a análise do sobrenadante das células demonstrou que o

radioisótopo manteve-se incorporado na célula, uma vez que não houve aumento da sua

quantidade com o decorrer do tempo.

Curva de estabilidade da

marcação com Tc

99m

24h

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

pellet

sobrenadante

dose de Tc

99m

(micro Curie)

4.3.2

IMAGENS CINTILOGRÁFICAS E CONTAGEM DA R

ADIOATIVIDADE

PRESENTE NOS

ÓRGÃOS ISOLADOS

4.3.2.1

CONTROLES EXPERIMEN

TAIS

Antes de determinarmos a distribuição das células no organismo, investigamos a

topografia exata do coração de ratos normais e submetidos à oclusão permanente da artéria

coronária. Para tal análise, injetamos por via intravenosa tetrofosmin (Myoview

, Amershan

Health AS, Oslo, Noruega) marcado com

99m

Tc, e em seguida realizamos imagens

cintilográficas de corpo inteiro bem como nas incidências: anterior, lateral e oblíqua

(Figura

. As imagens cintilográficas de corpo inteiro tanto dos animais normais (Figura 8A) quanto

do grupo OP (Figura 8B), demonstraram captação no coração. A figura 8A, demonstra a

distribuição do tetrofosmin em um animal normal, 30 minutos após a administração do

radiofármaco. Além do co

ração, observamos captação do material nas regiões do fígado assim

como rins e bexiga, que são respectivamente órgãos de metabolização e excreção do

tetrofosmin. Na figura 8B, observamos captação nos órgãos de excreção do material

(intestino, rins e bexiga), além do coração. Este perfil, de ausência de marcação no fígado e

presença de marcação no intestino, ocorreu pelo fato da imagem cintilográfica ter sido

realizada mais de 30 minutos após a administração do material. Desta forma, o material já

havia sido totalmente metabolizado no fígado e já estava no intestino para ser excretado. Para

obtermos maiores detalhes sobre a perfusão cardíaca, realizamos imagens nas incidências

anterior (8C, 8F), oblíqua (8D, 8G) e lateral (8E, 8H). A Figura 8C representa a im

agem

anterior do coração de um animal normal, e demonstra uma perfeita perfusão cardíaca. Note

que o coração apresenta uma forma esférica, indicando que o tetrofosmin foi captado de

forma homogênea em ambos os átrios e ventrículos. O mesmo perfil foi obser

vado nas figuras

8D e 8E, que representam respectivamente as imagens oblíqua e lateral do coração do animal

normal. A Figura 8F, representa a imagem anterior do coração de um animal com infarto do

miocárdio (48h após a oclusão permanente da artéria coronária esquerda). Note que neste

caso, o coração não apresenta forma tão esférica, pois na região antero-lateral do VE (seta)

não houve captação do material, indicando que a perfusão nesta região encontrava-

prejudicada. Este perfil também foi observado nas imagens obliqua e lateral do coração,

representadas respectivamente nas figuras 8G e 8H.

Um outro controle experimental foi a realização de contagem dos órgãos isolados após

a injeção intravenosa de

99m

Tc livre em animais normais, ou seja, na ausência de células. A

análise dos órgãos isolados demonstrou que os órgãos com maior percentual dose-

órgão

foram: rins (0,434 ± 0,039%); estômago (0,296 ± 0,129), fígado (0,280 ± 0,061) e intestino

(0,132 ± 0,042) (Figura 9A). Estes órgãos estão envolvidos com a metabolização e excreção

99m

Tecnécio. A análise do percentual grama-tecido demonstrou predomínio no estômago

(

0,108

± 0,044) e nos rins (

0,307

0,064)

(Figura 9B), confirmando que o tecnécio livre é

bastante captado pelo estômago.

Figura 8

Imagem cintilográfica de um rato normal (A) e um infartado (B) após a

administração intravenosa de

tetrofosmin

. As imagens cintilográficas de corpo inteiro (A, B)

revelaram captação de radioatividade no coração, assim como nas regiões do fígado, rins,

intestino e bexiga. Nas imagens das incidências anterior (C, F), oblíqua (D, G) e lateral (E,

H), pudemos observar que o coração do rato normal (C, D, E)

apresenta uma forma esférica

, o

que caracteriza uma perfeita perfusão cardíaca; enquanto que o coração do animal infartado

(F, G, H), apresenta prejuízo na sua perfusão (seta).

CORAÇÃO

INTESTINO

BEXIGA

RINS

CORAÇÃO

FÍGADO E

RINS

BEXIGA

OBLÍQUA

LATERAL

N +

99m

Tc (n = 6)

COR

PUL

FÍG

BAÇO

RINS

EST

INT MO

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

% DOSE-ÓRGÃO

N +

99m

Tc (n = 6)

COR

PUL

FÍG

BAÇO

RINS

EST

INT MO

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

% GRAMA-TECIDO

Figura 9

Os gráficos representam o percentual dose-órgão (A) e grama-

tecido (B) nos

seguintes órgãos: coração (COR), pulmões (PUL), fígado (FI

G), baço, rins, estômago

(EST) e medula óssea (MO), 20 horas após a infusão intravenosa de

99m

Tc livre em ratos

normais (n = 6). Note que além do estômago temos grande quantidade de tecnécio livre

nos rins dos animais, sugerindo que este material está send

o excretado.

4.3.2.2

GRUPOS EXPERIMENTAI

A análise da distribuição das células propriamente dita, consistiu na comparação dos

resultados obtidos pela injeção de CMMO marcadas com

99m

Tc através das vias

intramiocárdica e intravenosa, tanto nos animais normais (N) quanto nos submetidos à

isquemia por oclusão permanente. No grupo oclusão temporária, analisamos a distribuição das

células somente após o tratamento intravenoso. As tabelas 3 e 4 mostram respectivamente os

percentuais dose-órgão e grama-tecido em todos os grupos experimentais tratados com

CMMO.

Em todos os grupos analisados, as cintilografias de 24 horas apresentaram padrões

similares àqueles observados nas imagens correspondentes de uma e três horas (dados não

mostrados). Como o radioisótopo tem meia vida curta, a qualidade da imagem de 24 horas

ficou prejudicada em relação às demais. Desta forma, optamos por não apresentar este

material.

Tabel

a 3

Percentual dose

órgão dos animais após administração de células mononucleares de medula óssea marcadas com

99m

Tc.

ÓRGÃOS

N im (n = 10)

OP im (n = 10)

N iv (n = 10)

OP iv (n = 10)

OT iv (n = 6)

CORAÇÃO

1,200 ± 0,270 %

2,020 ± 0,469%*

0,012

± 0,003 %

0,038 ± 0,016 %

0,026 ± 0,005 %

PULMÕES

0,098 ± 0,019 %

0,080 ± 0,017 %

0,099 ± 0,027 %

0,087 ± 0,028 %

0,174 ± 0,024 %

FÍGADO

3,033 ± 0,512 %

1,392 ± 0,334 %

4,495 ± 1,102 %

3,150 ± 0,689 %

7,738 ± 0,738%

BAÇO

0,195 ± 0,039 %

084 ± 0,020 %

0,489 ± 0,162 %

0,177 ± 0,030 %

0,318 ± 0,046 %

RINS

1,743 ± 0,339 %*

1,156 ± 0,314 %*

4,736 ± 0,964 %

2,279 ± 0,429 %

2,843 ± 0,529 %

ESTÔMAGO

0,025 ± 0,006 %

0,072 ± 0,019 %

0,050 ± 0,014%

0,074 ± 0,027%

0,159 ± 0,044 %

* #

MEDULA

ÓSSEA

0,015 ± 0,003 %

0,009 ± 0,002 %

0,022 ± 0,006%

0,013 ± 0,004 %

média

erro padrão; N

ratos normais; OP

ratos submetidos à isquemia por oclusão permanente; OT-

ratos submetidos à isquemia

por oclu

são temporária; i.m.

via intramiocárdica; i.v.

via intravenosa; NR

não realizado;

significativo em relação ao N iv;

significativo em relação ao N im; #

significativo em relação ao OP im;

significativo em relação ao

OP iv.

significativo em relação ao OT;

Tabela 4

Percentual grama

tecido dos animais após administração de células mononucleares de medula óssea marcadas com

99m

Tc.

ÓRGÃOS

N im (n = 10)

OP im (n = 10)

N iv (n

= 10)

OP iv (n = 10)

OT (n = 6)

CORAÇÃO

1,190 ± 0,255 %

2,516 ± 0,394 %

0,012 ± 0,002 %

0,047 ± 0,022 %

0,028± 0,005 %

PULMÕES

0,068 ± 0,013 %

0,088

0,022 %

0,070

0,019 %

0,065

0,020 %

0,100

0,017 %

FÍGADO

0,334

0,053 %

0,25

0,058 %

0,546

0,152 %

0,530

0,188 %

1,099

0,167 %

BAÇO

0,296

0,058 %*

0,208

0,043 %

1,193

0,397 %

0,423

0,110 %

0,583

0,060 %

RINS

0,882

0,216 % *

1,200

0,311 %*

2,660

0,372 %

1,873

0,417 %

1,825

0,383 %

ESTÔMAGO

0,014

0,003 %

0,045

0,009 %

0,033

0,011 %

0,071

0,034 %

0,069

0,015 %

MEDULA

ÓSSEA

0,033

0,006

0,023

0,005 %

0,065

0,021 %

média

erro padrão; N

ratos normais; OP

ratos submetidos à isquemia por oclusão permanente; OT-

ratos submetidos à isquemia

por oclusão temporária; i.m. via intramiocárdica; i.v.

via intravenosa; NR

não realizado;

significativo em relação ao N iv;

significativo em relação ao N im; #

signi

ficativo em relação ao OP im;

significativo em relação ao

OP iv.

significativo em relação ao OT;

4.3.2.2.1

ANIMAIS NORMAIS

4.3.2.2.1.1

ADMINISTRAÇÃO INTRA

MIOCÁRDICA DE CMMO

A Figura 10 representa imagens cintilográficas de ratos normais realizadas uma (A,

B) e três horas (G - J) após a injeção intramiocárdica (Nim) de 4 x 10

células. As figuras

10A e 10B representam respectivamente imagens cintilográficas de corpo inteiro e de

incidência anterior uma hora após a injeção intramiocárdica de CMMO. Observe que a

captação do radioisótopo manteve-se restrita à região do coração. No entanto, as imagens

cintilográficas do rato 2, três horas (Figuras 10 G - J) após a administração intramiocárdica

de CMMO, demonstraram além da captação cardíaca, presença de marcação no fígado e

nos rins. Este perfil foi mantido até 24 horas após a administração das células (Tabelas 3 e

4).

4.3.2.2.1.2

ADMINISTRAÇÃO INTRA

VENOSA DE CMMO

Em relação à injeção intravenosa de CMMO marcadas com

99m

Tc, as imagens

cintilográficas de animais normais (Niv), demonstraram que tal população celular

encontrava

-se distribuída preferencialmente no fígado e rins (Figura 11A e 11B). A análise

dos percentuais dose-órgão e grama-tecido corrobora o que observamos na imagem

cintilográfica, demonstrando maior captação hepática e renal (Figura 11C e 11D).

Figura 10

Imagens cintilográficas de ratos normais que receberam injeção

intramiocárdica de CMMO marcadas com Tecnécio. Note que na imagem de uma hora

após a injeção (rato 1), temos captação majoritariamente no coração (A,B). Já nas imagens

de 2 horas (C-F) e 3 horas (G-J) após a injeção (rato 2), além do coração, observamos

também captação no fígado e rins (setas).

COR

PUL

FIG

BAÇO

RINS

EST

INT

0.0

0.5

1.0

Niv (n = 10)

% DOSE-ÓRGÃO

Fígado

Rins

Bexiga

Figura 11

Imagem cintilográfica e contagem

dos órgãos isolados de animais normais tratados com

injeção intravenosa (N iv) de CMMO marcadas com

99m

(n =

10)

. As imagens cintilográficas de uma

hora (A) e três horas (B) após a injeção das células revelaram captação no fígado, rins, e bexiga. Estes

dados corroboram a análise dos percentuais dose-órgão (C) e grama-

tecido (D), 20 horas após a injeção

das células. O percentual de células presente no coração foi inferior a 0,5%.

G - J

COR

PUL

FIG

BAÇO

RINS

EST

0.0

0.5

1.0

Niv (n = 10)

% GRAMA-TECIDO

4.3.2.2.1.3

COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO

ORGANISMO

APÓS ADMINISTRAÇÃO I

NTRAVENOSA E INTRAMI

OCÁRDICA

A Figura 12 compara as duas vias de administração (intramiocárdica e intravenosa)

nos grupos normais (N im e Niv). Estes dados demonstraram que quando as células são

administradas diretamente no miocárdio, um percentual significativamente maior está

presente no coração em relação àqueles animais que receberam as células perifericamente

(p < 0,001).

N im

N iv

0.0

0.1

0.2

* p< 0,001 em relação ao N im

0.5

1.0

1.5

2.0

% dose-órgão

Figura 12

Comparação dos percentuais dose-órgão (A) e grama-tecido (B) dos corações de animais

normais tratados com injeção intramiocárdica ou intravenosa de CMMO. Note que o coração dos animais

que receberam as células por via intravenosa contém uma quantidade de células significantemente inferior

em relação aos tratados por via intramiocárdica (p < 0,001).

N im

N iv

0.0

0.1

0.2

0.5

1.0

1.5

2.0

* p < 0,001 em relação ao N im

% grama-tecido

4.3.2.2.2

ANIMAIS SUBMETIDOS

À OCLUSÃO PERMANENTE

4.3.2.2.2.1

ADMINISTRAÇÃO INTRA

MIOCÁRDICA DE CMMO

As imagens cintilográficas obtidas uma e três horas após a administração

intramiocárdica de CMMO (Figura 13A e 13B), demonstraram captação

predominantemente cardíaca. A contagem da radioatividade presente nos órgãos isolados

evidenciou a manutenção deste perfil até 24 horas após a administração das células

(Tabelas

3 e 4).

4.3.2.2.2.2

ADMINISTRAÇÃO INTRA

VENOSA DE CMMO

A imagem cintilográfica dos animais submetidos à oclusão permanente da artéria

coronária (OP iv) (Figuras 14A e 14B) assim como os percentuais dose-órgão (Figura 14C)

e grama tecido (Figura 14D) demonstraram que as CMMO injetadas na circulação

encontram

-se distribuídas preferencialmente no fígado e nos rins, enquanto que menos de

0,5% são encontradas no coração. Os percentuais dose-órgão e grama-tecido referentes ao

coração de animais normais e submetidos à isquemia permanente tratados com injeção

intravenosa de CMMO foram similares (Figura 15).

4.3.2.2.3

COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO A

PÓS

ADMINISTRAÇÃO INTRAV

ENOSA E INTRAMIOCÁRD

ICA

A Figura 16 compara as duas vias de administração (intramiocárdica e intravenosa)

nos grupos submetidos à oclusão permanente (OP im e OPiv). Quando as células são

admi

nistradas diretamente no miocárdio, um percentual significativamente maior está

presente no coração em relação àqueles animais que receberam as células perifericamente

(p < 0,001).

Figura 13

Imagem cintilográfica e contagem dos órgãos isolados de animais submetidos

à isquemia permanente. As figuras A e

B representam respectivamente, imagens de uma

(A) e três (B) horas após os tratamentos: intravenoso (esquerda) e intramiocárdico

(direita) com CMMO marcadas com

99m

Tc. Note que após a injeção intramiocárdica (im)

as células ficaram retidas no coração, enq

uanto que após o tratamento intravenoso (iv), as

mesmas se distribuem pelo fígado e rins, não se observando marcação na região cardíaca.

* Indica marcação no sítio de injeção.

FÍGADO

RINS

BEXIGA

CORAÇÃO

FÍGADO

BEXIGA

CORAÇÃO

Figura 14

Imagem cintilográfica e contagem dos órgãos isolados de animais

submetidos à oclusão permanente tratados com injeção intravenosa (

OP iv) de CMMO

marcadas com

99m

Tc. As imagens cintilográficas de uma hora (A) e três horas (B) após a

injeção das células revelaram captação no fígado, rins, e bexiga. Estes dados

corroboram com a análise dos percentuais dose-órgão (C) e grama-tecido (D),

24 horas

após a injeção das células. Podemos observar que tanto fígado como rins, retém cerca

de 4% da população de células injetadas, enquanto que o coração, não retém nem 0,5 %.

* Indica que houve uma pequena marcação no sítio de injeção.

COR

PUL

FÍG

BAÇO

RINS

EST

0.0

0.5

1.0

OP iv (n = 10)

% DOSE-ÓRGÃO

COR

PUL

FÍG

BAÇO

RINS

EST

0.0

0.5

1.0

OP iv (n = 10)

% GRAMA-TECIDO

rins

bex

iga

fígado

Figura 15

Comparação da quantidade de CMMO marcadas com Tc

99m

no coração

animais normais e submetidos à oclusão permanente tratados com injeção intravenosa.

A análise dos percentuais dose-órgão (C) e grama-

tecido (D), 20 horas após a injeção

das células, demonstrou que não houve diferença significativa em entre os grupos

alisados.

N iv

OP iv

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

(n = 10)

(n =10)

% dose-órgão

N iv

OP iv

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

(n = 10)

% grama-tecido

Figura 16 - Comparação da quantidade de CMMO marcadas com

99m

no coração de

animais submetidos à oclusão permanente tratados com injeção intramiocárdica ou

intravenosa de células. Os percentuais dose-órgão (A) e grama-tecido (B) demonstraram

uma quantidade de células significantemente superior no coração dos animais tratados por

via intramiocárdica em relação àqueles tratados por via intravenosa (p < 0,001).

OP im

OP iv

0.00

0.25

0.50

* p < 0,001 em relação ao OP im

% grama-tecido

OP im

OP iv

0.00

0.25

0.50

* p< 0,001 em relação ao OP im

% dose-órgão

4.3.2.2.3

ANIMAIS SUBMETIDOS

À OCLUSÃO TEMPORÁRIA

O padrão de distribuição das CMMO nos animais submetidos à oclusão temporá

ria

(OT) tratados por via intravenosa também demonstrou maior captação hepática e renal

(Figura 17). Este perfil, de baixa captação cardíaca e grandes captações no fígado e nos

rins, foi similar aquele observado nos animais submetidos à oclusão permanente (Tabelas 3

e 4). Isto sugere que o nosso modelo de oclusão permanente não interfere no padrão de

distribuição das CMMO.

4.3.2.2.4

COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO NO ORGANISMO DAS CMMO EM

ANIMAIS NORMAIS E SUBMETIDOS À ISQUEMIA APÓS ADMINISTRAÇÃO

INTRAVENOSA

E INTRAMIOCÁRDICA

Considerando a análise do percentual dose-órgão dos animais submetidos à

isquemia permanente tratados com injeção intramiocárdica (OP im), não observamos

diferença significativa em relação ao grupo normal (Figura 18A). Já o percentual g

rama

tecido, revelou no coração dos animais com isquemia permanente, uma quantidade de

células significantemente superior em relação aos animais normais (p <0,05) (Figura 18B).

Em relação à administração intravenosa, observamos que o percentual de células

presente no coração dos animais dos três grupos (normais, OP e OT) foi similar (Figura

19).

COR

PUL

FÍG

BAÇO

RINS

EST

OT (n=6)

% DOSE-ÓRGÃO

COR

PUL

FÍG

BAÇO

RINS

EST

INT

OT (n=6)

% grama-tecido

Figura 17

Contagem dos órgãos isolados de animais submetidos à oclusão temporária

(OT) tratados com injeção intravenosa de CMMO marcadas com

99m

Tc 48 horas após o

procedimento cirúrgico. A análise dos percentuais dose-órgão (A) e grama-tecido (B)

demonstrou que a maior parte das células se encontra distribuída no fígado e nos rins,

enquanto que o coração retém menos de 0,5 %.

N im

OP im

(n =10)

(n = 10)

% dose-órgão

N im

OP im

(n = 10)

* p < 0,05 em relação ao N im

% grama-tecido

Figura 18

Comparação da quantidade de CMMO marcadas com

99m

no coração de

animais normais e submetidos à oclusão permanente tratados com injeção

intramiocárdica. A análise do percentual dose-órgão (A) demonstrou que não houve

diferença significativa entre os grupos analisados. Entretanto, a análise do percentual

grama

-tecido (B), revelou nos animais com isquemia permanente uma quantidade de

células significantemente superior em relação aos animais normais (p < 0,001).

Figura 19

Comparação da quantidade de CMMO marcadas com

99m

no coração de

animais normais e submetidos às oclusões permanente (OP) e temporária (OT) da artéria

coronária tratados com injeção intravenosa (iv). A análise dos percentuais dose-órgão (A) e

grama

-tecido (B) demonstrou que não houve diferença significativa entre os grupos

analisados; e conseqüentemente a oclusão permanente da artéria coronária não prejudicou a

distribuição das células para o tecido cardíaco após administração intravenosa.

Fígado

Rins

Bexiga

N iv

OP iv

OT iv

0.0

0.1

0.2

0.3

n = 10

n = 6

n = 10

% grama-tecido

N iv

OP iv

OT iv

0.0

0.1

0.2

0.3

n = 10

n = 6n = 10

% dose-tecido

4.4

ETAPA

ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA DE AN

IMAIS

NORMAIS E SUBMETIDOS À ISQUEMIA PERMANENTE TRATADOS COM CMMO

OU VEÍCULO

Em relação aos animais submetidos à isquemia por oclusão permanente que

receberam injeções intramiocárdica ou intravenosa de veículo, não houve diferença

significativa em nenhuma das avaliações funcionais realizadas. Portanto, os dez animais

foram agrupados em um único grupo, descrito como OP.

Os animais submetidos à oclusão permanente foram tratados com injeção

intramiocárdica (OP im) (n = 9) e intravenosa (OP iv) (n = 10) de CMMO. Os animais

foram avaliados antes do tratamento (48 horas após o procedimento cirúrgico) e três

semanas após a terapia celular por meio de ECG e ECO. Já a análise hemodinâmica e o

teste de esforço foram realizados somente três semanas após o tratamento.

4.4.1

ANÁLISE ELETROCARDI

OGRÁFICA

A tabela 5 sumariza o perfil eletrocardiográfico dos animais normais e submetidos à

isquemia permanente, três semanas após a o tratamento com veículo, ou com CMMO por

via intravenosa ou intramiocárdica. O ECG dos animais normais é caracterizado

principalmente

pela ausência de onda Q na derivação DI e âQRS localizado entre 0º e 90º.

Não houve eventos de arritmia em nenhum dos animais avaliados.

O padrão eletrocardiográfico dos ratos submetidos à isquemia permanente, antes e

três semanas após o tratamento com veículo está sumarizado na tabela 6. Antes do

tratamento com veículo, ou seja, 48 horas após a isquemia permanente, todos os animais

apresentaram onda Q em DI e houve desvio do ângulo do vetor médio de despolarização

ventricular para direita (âQRS localizado

entre 90º e 180º). Este mesmo perfil foi observado

três semanas após a terapia com veículo, que por sua vez, foi bastante diferente do perfil

eletrocardiográfico normal. Três semanas após a isquemia por oclusão permanente, o âQRS

foi significativamente maior em relação ao grupo normal (p < 0,001) e o iQRS foi similar

entre estes grupos (Tabela 5). Em relação ao iQRS, não houve diferença significativa antes

e três semanas após a administração de veículo (Tabela 6).

O índice QRS dos animais tratados com injeção intramiocárdica, três semanas após

o tratamento com CMMO, foi significantemente menor em relação aos normais (p < 0,01).

O âQRS destes animais foi significantemente maior do que aquele observado no grupo

normal (p < 0,001) (Tabela 5), evidenciando um perfil eletrocardiográfico típico de animal

infartado. Além disso, o âQRS do grupo OPim foi similar ao grupo submetido à isquemia

permanente tratado com veículo (Tabela 5). Quando comparamos o ECG destes animais

antes e três semanas após o tratamento intramiocárdico com CMMO observamos que após

a terapia, o âQRS e o índice QRS foram significativamente menores do que antes da terapia

(p < 0,01 e p < 0,05, respectivamente) (Tabela 7). Este perfil foi significantemente diferente

daquele observado nos animais normais (Tabela 5). Estes dados indicam que a terapia

intramiocárdica com CMMO não impediu a progressão do quadro de infarto, uma vez que

houve a uma maior perda de cardiomiócitos (evidenciada pela diminuição do índice QRS).

Três semanas após o tratamento intravenoso com CMMO, o perfil

eletrocardiográfico dos animais submetidos à isquemia permanente foi típico de um animal

infartado. O âQRS manteve-se desviado para direita. A amplitude do índice QRS foi

significantemente menor do que do grupo normal (p < 0,01), e similar ao do grupo OP

(Tabela 5), indicando que houve perda de cardiomiócitos. O ECG destes animais antes e

três semanas após o tratamento intravenoso com CMMO demonstrou similaridade quanto

ao âQRS, e redução significativa no iQRS três semanas após o tratamento intravenoso com

CMMO (p < 0,05) (Tabela 8). Estes dados demonstram que a terapia intravenosa com

CMMO não foi capaz de melhorar o perfil elétrico do coração destes animais.

Tabela 5

Análise eletrocardiográfica dos animais normais e submetidos à isquemia

permanente, três semanas após o tratamento com veículo (OP) ou CMMO por via

intravenosa (OP iv) e intramiocárdica (OP im).

média ± erro padrão

# p < 0,0

01 em relação aos normais; * p < 0,01 em relação aos normais;

Tabela 6

Análise eletrocardiográfica dos animais submetidos à isquemia permanente,

antes e três semanas após administração de veículo (OP).

média ± erro padrão;

PARÂMETROS

NORMAIS

(n = 10)

(3 semanas)

(n = 10)

(3 semanas)

(n = 10)

(3 semanas)

(n = 9)

Onda Q em DI

0/10

10/10

9/9

Índice (mv)

1,39 ± 0,09

1,07

± 0,12

0,81

± 0,11*

0,72

± 0,06*

âQRS (graus)

60,37 ± 2,97

151,00

± 9,93

146,80 ± 8,66

129,89

± 8,97

PARÂMETROS

(48 horas)

(n = 10)

(3 sem

anas)

(n = 10)

Onda Q em DI

10/10

Índice (mv)

0,97 ± 0,11

1,07

± 0,12

âQRS (graus)

154,14

± 5,47

151,0

± 9,93

Tabela 7

Análise eletrocardiográfica dos animais submetidos à isquemia permanente,

antes (48 horas) e três semanas após o tratamento com CMMO administrada por via

intramiocárdica (OP im).

média

± erro

padrão;

# p < 0,05 ; * p < 0,01

;

Tabela 8

Análise eletrocardiográfica dos animais submetidos à isquemia permanente,

antes e três semanas após o tratamento com CMMO administrada por via intravenosa (OP

iv).

média

± erro padrão

# p < 0,05

PARÂMETROS

(antes do tratamento)

(n = 7)

(3 semanas após tratamento)

(n = 7)

Onda Q

em DI

7/7

Índice (mv)

1,05 ± 0,11

0,72

± 0,06

âQRS (graus)

157,70

± 2,36

129,89

± 8,97*

PARÂMETROS

(antes do tratamento)

(n = 10)

(3 semanas após tratamento)

(n = 10)

Onda Q em DI

10/1

10/10

Índice (mv)

1,03 ± 0,07

0,81

± 0,11

âQRS (graus)

149,90

± 3,71

146,80

± 8,66

4.4.2

ANÁLISE ECOCARDIOGR

ÁFICA

Os parâmetros ecocardiográficos médios dos animais normais e submetidos à

isquemia permanente, três semanas após a o tratamento com veículo, ou com CMMO por

via intravenosa ou intramiocárdica estão sumarizados na tabela 9. Nos grupos OP, OPim e

OPiv, a avaliação ecocardiográfica foi realizada 48 horas depois do procedimento de

isquemia permanente e depois de três semanas.

Nos animais normais, a função sistólica, representada pela Fenc (capacidade de

encurtamento do coração durante a sístole), foi em torno de 50 %, o que caracteriza

contração cardíaca normal. Da mesma forma, a geometria cardíaca representada pelos DSF

e DDF, não apresentou nenhuma anormalidade (Tabela 9).

Já nos animais submetidos à isquemia permanente, as frações de ejeção e de

encurtamento foram significantemente menores do que do grupo normal (p < 0,001)

(Tabela

9). Em relação à geometria ventricular, três semanas após a isquemia permanente, a

dilatação da cavidade ventricular tanto durante a sístole (DSF) quanto durante a diástole

(DDF) foi significantemente maior comparada com o grupo normal (p < 0,001 e p < 0,

01,

respectivamente) (Tabela 9). Três semanas após o procedimento cirúrgico, o átrio esquerdo

dos animais submetidos à isquemia por oclusão permanente encontrou-se significantemente

mais dilatado em relação aos normais (p < 0,001), demonstrando grande com

prometimento

da função cardíaca. De acordo com os dados do percentual de acinesia do ventrículo

esquerdo, praticamente 50 % da parede ventricular encontrava-se acinética. A fração de

encurtamento de área foi em torno de 27 %.

Quando comparamos os parâmetros ecocardiográficos 48 horas e três semanas após

o procedimento cirúrgico, nos animais submetidos à oclusão permanente que receberam

administração de veículo (Tabela 10), observamos que não houve diferença significativa

em relação a função segmentar do VE, ou seja: frações de encurtamento e de ejeção. As

áreas em sístole e em diástole, após três semanas foram significantemente maiores quando

comparadas com 48 horas (p < 0,001), o que refletiu uma fração de encurtamento de área

significantemente menor depoi

s de três semanas (p < 0,001), mostrando prejuízos na função

global do VE.

Os parâmetros ecocardiográficos analisados no grupo OP im foram: área em sístole,

área em diástole e fração de encurtamento de área (FEA). A área em diástole, três semanas

após

o tratamento intramiocárdico com CMMO foi significantemente maior em relação à

antes da terapia (p < 0,001) (Tabela 11). No entanto, em relação aos animais do grupo OP,

este parâmetro foi similar (Tabela 9). Além disso, ao final das três semanas, a área em

sístole dos animais OP im foi similar à do grupo OP (Tabela 9). Os parâmetros

ecocardiográficos ainda demonstraram que não houve diferença significativa em relação à

fração de encurtamento de área antes e três semanas após a terapia intramiocárdica com

MO (Tabela 11). Este percentual foi similar àquele encontrado no grupo OP três

semanas após administração de veículo (Tabela 9). No entanto, no grupo OP im parece ter

ocorrido uma estabilização da FEA três semanas após administração das CMMO, enquanto

que

no grupo OP, neste mesmo período a FEA foi significativamente reduzida em relação à

48 horas, demonstrando prejuízo na função global do coração destes animais.

Os dados da análise ecocardiográfica, antes e três semanas após a terapia celular

intravenosa, estão sumarizados na tabela 12. Os diâmetros diastólico e sistólico finais dos

animais, três semanas após a terapia i.v. com CMMO, foram significantemente maiores do

que aqueles observados no grupo normal (p < 0,001). Isto se refletiu em frações de

encurt

amento e de ejeção significantemente reduzidas em relação aos normais (p < 0,001),

caracterizando um perfil ecocardiográfico típico de animal infartado (Tabela 9). Em relação

ao percentual de área infartada, observamos que três semanas após o procedimento

cirúrgico, a área acinética dos animais tratados com injeção i.v. de CMMO foi similar

àqueles que receberam veículo. Isto indica que a extensão do infarto foi similar entre os

grupos. Também não houve diferença significativa em relação ao percentual da FEA entre

estes dois grupos, mostrando que a área durante a sístole e a diástole foi similar entre os

grupos OP e OP iv, após três semanas. Os diâmetros diastólico e sistólico finais dos

animais, três semanas após a terapia i.v. com CMMO foram significantemente maiores do

que aqueles observados antes do tratamento (p < 0,001) (Tabela 12). Isto se refletiu em

frações de ejeção e de encurtamento significantemente reduzidas em relação à antes do

tratamento (p < 0,05), indicando que o tratamento não promoveu melhora no desempenho

mecânico do coração destes animais.

Tabela 9 - Análise ecocardiográfica dos animais normais e submetidos à isquemia

permanente, três semanas após o tratamento com veículo (OP) ou CMMO por via

intravenosa (OP iv) e intramiocárdica (OP

im).

média ± erro padrão

DSF

diâmetro sistólico final;

DDF

diâmetro diastólico final;

fração de ejeção;

FENC

fração de encurtamento ÁREA; ÁREA

SÍST

área em sístole;

ÁREA DIÁST

área em diástole;

FEA

fração de encurtamento de área;

diâmetro do átrio esquerdo;

PAV

perímetro de acinesia do ventrículo esquerdo;

não realizado;

PTVE

perímetro total do ventrículo esquerdo;

AVE

acinesia do ventrículo esquerdo;

AORTA

diâmetro da Aorta

freqüência cardíaca;

# p < 0,001 em relação aos nor

mais;

p < 0,01 em relação ao OP;

PARÂMETROS

NORMAIS

(

sem cirurgia

)

(n = 10)

(3 semanas)

(n = 10)

(3 semanas)

(n = 10)

(3 semanas)

(n = 9)

DDF

(

mm)

6,44

0,12

8,02 ± 0,32

8,20 ± 0,97

DSF

(

mm)

3,24

0,22

6,55 ± 0,25

6,29 ± 0,25

ENC

(%)

49,40

3,08

18,20 ± 1,17

23,00 ± 1,72

(%)

84,90

2,16

43,20 ± 2,07

52,30 ± 3,05

ÁREA SIST

(

)

0,38 ± 0,03

0,33 ± 0,01

0,35 ± 0,02

ÁREA DIAST

(

)

0,52 ± 0,03

0,50 ± 0,02

0,52 ± 0,13

FEA

(%)

27,48 ± 2,73

34,07 ± 1,53

29,39 ± 4,25

(

)

2,57 ± 0,05

2,52 ± 0,05

PAVE

(mm

)

1,29 ± 0,08

1,20 ± 0,05

AVE

(%)

49,89 ± 2,25

51,44 ± 1,44

(

BPM

)

220

10,30

274 ± 22,94 270 ± 15,73

AORTA

(

)

3,12

0,13

2,80 ± 0,10

2,86 ± 0,10

(

)

3,17

0,15

5,10 ± 0,10

,02 ± 0,22

AORTA

1,02

0,02

1,82 ± 0,03

1,76 ± 0,06

Tabela 10

Análise ecocardiográfica dos animais submetidos à isquemia permanente, antes

e três semanas após ad

ministração de veículo (OP).

Média ± erro padrão;

# p < 0,001 em relação a 48 horas.

DSF

diâmetro sistólico final;

DDF

diâmetro diastólico final;

fração de ejeção do VE; FENC

fração de encurtamento do VE;

ÁREA SÍST

área em sístole; ÁREA DIÁST

área em diástole;

FEA

fração de encurtamento de área;

freqüência cardíaca;

PAVE

perímetro de acinesia do ventrículo esquerdo;

PTVE

perímetro total do ventrículo esquerdo;

AVE

acinesia do ventrículo esquerdo; NR

não realizado

AORTA

diâmetro da Aorta AE

diâmetro do átrio esquerdo;

PARÂMETROS

(48 horas)

(n = 10)

(3 semanas)

(n = 10)

DDF

(

mm)

6,06 ± 0,37

8,02 ± 0,32

DSF

(

mm)

4,61 ± 0,27

6,55 ± 0,25

ENC

(%)

24,00 ± 2,59

18,20 ± 1,17

(%)

52,00 ± 4,68

43,20 ± 2,08

ÁREA DIAST

0,29 ± 0,02

0,52 ± 0,02

ÁREA SIST

0,18 ± 0,03

0,36 ± 0,03

FEA

(%)

38,47 ± 4,35

27,48 ± 2,73

PTVE

(

)

1,90 ± 0,04

2,60 ± 0,05

PAVE

(mm

)

0,95 ± 0,03

1,30 ± 0,08

AVE

(%)

50,74 ± 1,17

49,89 ± 2,26

(

BPM

)

274 ± 22,94

AORTA

(

)

2,80 ± 0,10

(

)

5,10 ± 0,10

AORTA

1,82 ± 0,03

Tabela 11 - Análise ecodopplercardiográfica dos animais submetidos à isquemia

permanente, antes (48 horas após a cirurgia) e três semanas após o tratamento com CMMO

administrada por via intramiocárdica (OP im).

Média ± erro pad

rão * p < 0,01

em relação a antes do tratamento

DSF

diâmetro

sistólico final;

DDF

diâmetro diastólico final;

fração de ejeção; FENC

fração de encurtamento;

AVE

cinesia do VE; ÁREA DIÁST

área em diástole;

ÁREA SÍST

área em sístole;

FEA

fração de encurtamento de área;

não determinado

PARÂMETROS

(antes do tratamento)

(n = 9)

(3 semanas após tratamento)

= 9)

DDF

(

mm)

5,69 ± 0,48

DSF

(

mm)

4,36 ± 0,46

ENC

(%)

24,10 ± 2,57

(%)

55,11 ± 4,56

ÁREA DIAST

(

)

0,34 ± 0,06

0,52 ± 0,13*

ÁREA SIST

(

)

0,24 ± 0,06

0,36 ± 0,02

FEA

(%)

32,95 ± 5,60

29,39 ± 4,25

Tabela 12

Análise ecocardiográfica dos animais submetid

os à isquemia permanente, antes

e três semanas após o tratamento com CMMO administrada por via intravenosa (OP iv).

Média ± erro padrão;

DSF

diâmetro sistólico final;

DDF

diâmetro diastólico final;

fração de ejeção do VE;

FENC

fração de encurtamento do VE;

ÁREA

SÍST

área em sístole;

ÁREA

DIÁST

área em diástole;

FEA

fração de encurtament

o de área;

diâmetro do átrio esquerdo;

AVE

acinesia do ventrículo esquerdo;

freqüência cardíaca;

AORTA

diâmetro da Aorta

não realizado

PAVE

per

ímetro de acinesia do ventrículo esquerdo;

PTVE

perímetro total do ventrículo esquerdo;

# p < 0,001, * p < 0,05; **p < 0,01

PARÂMETROS

(antes do tratamento)

(n = 10)

(3 semanas após tratamento)

(n = 10)

DDF

(

mm)

6,33 ± 0,16

8,20 ± 0,31

DSF

(

)

4,56 ± 0,12

6,29 ± 0,24

ENC

(%)

26,80 ± 1,02

23,00 ± 1,72*

(%)

60,70 ± 1,80

52,30 ± 3,05**

ÁREA SIST

0,19 ± 0,01

0,33 ± 0,01

ÁREA DIAST

0,29 ± 0,02

0,50 ± 0,02

FEA

(%)

35,86 ± 2,94

34,07 ± 1,53

PTVE

(

)

2,00 ± 0,07

2,52 ± 0,05

AVE

(mm

)

1,00 ± 0,05

1,20 ± 0,05**

AVE

(%)

49,96 ± 1,37

51,44 ± 1,44

4.4.3

ANÁLISE H

EMODINÂMICA

A tabela 13 sumariza o perfil hemodinâmico dos animais. Os valores médios de

dP/dT + e dP/dT- do grupo normal foram respectivamente: 7556,15 ± 362,48 mmHg e -

5897,2 ± 245,11 mmHg e a pressão desenvolvida pelo VE foi em torno de 120 mmHg.

Todo

s estes parâmetros estão de acordo com o perfil de normalidade, mostrando que não

havia comprometimento na hemodinâmica cardíaca destes animais.

A dP/dT+ e a pressão sistólica do grupo OP foram significantemente menores

comparadas com o grupo normal ( p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente), indicando um

comprometimento da função sistólica (Tabela 13). Em relação à função diastólica, a dP/dT

três semanas após a isquemia foi significantemente menor do que do grupo normal (p <

0,001), e a pressão diastólica aumentou significantemente em relação aos normais (p <

0,001), refletindo assim em uma redução significativa da pressão desenvolvida (p < 0,01).

O padrão hemodinâmico do grupo OP im, três semanas após a terapia celular, foi

caracterizado por dP/dT+ e dP/dT

significantemente menores do que em relação ao grupo

normal (p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente). Além disso, a PVE foi significantemente

reduzida comparada com os animais normais (p < 0,001) (Tabela 13). Estes dados

demonstram que o tratamento intramiocárdico com CMMO, não foi capaz de promover

melhora na contratilidade e no relaxamento cardíacos, evidenciando assim um

comprometimento na pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo.

A análise hemodinâmica do grupo OP iv, três semanas após a terapia celular,

demonstrou que a dP/dT

e dP/dT

foram significantemente menores do que em relação

aos animais normais (p < 0,05 e p < 0,001, respectivamente) e similares quando

comparadas ao grupo OP. Além disso, a PVE foi significantemente reduzida comparada

com os animais normais (p < 0,001) e similar ao grupo OP (Tabela 13). Estes dados nos

permitiram concluir que mesmo após o tratamento intravenoso, tanto a capacidade contrátil

quanto a capacidade de relaxamento do ventrículo esquerdo (VE) destes animais

ncontravam

-se bastante comprometidas, refletindo respectivamente em uma redução e um

aumento das pressões sistólica e diastólica do VE; e conseqüente redução da pressão

desenvolvida pelo ventrículo esquerdo. Ou seja, o tratamento intravenoso com CMMO não

romoveu melhora na capacidade hemodinâmica destes animais.

Tabela 13

Análise hemodinâmica dos animais acordados dos grupos: normais e

submetidos à isquemia permanente, três semanas após o tratamento com veículo (OP) ou

CMMO por via intraven

osa (OP iv) ou intramiocárdica (OP im).

média ± erro padrão;

PVE

pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo;

PSFVE

pressão sistólica final do ventrículo esquerdo;

PDFVE

pre

ssão diastólica final do ventrículo esquerdo;

freqüência cardíaca;

* significativo em relação aos normais

PARÂMETROS

NORMAIS

(n = 9)

(3 semanas)

(n = 9)

(3 semanas)

(n = 6)

(3 semanas)

(n = 7)

dP/dT +

(mmHg/s)

7556,15 ± 362,48

5375,36 ± 354,20*

5552,90 ± 427,93*

5062,31 ± 427,90*

dP/dT

(mmHg/s)

5897,2 ± 245,11

4153,20

223,01*

4009,40

436,04*

4109,66

260,11*

PVE

(mm Hg)

129,20

± 4,26

85,68

5,45*

79,53

7,23*

78,55

± 6,74*

PSFVE

(mm Hg)

132,7

± 3,59

102,60

3,58*

101,50

4,00

93,03

± 6,66*

PDFVE

(mm Hg)

3,44

± 0,90

16,94

2,12*

21,98

4,54

14,47

2,95

FC (bpm)

352,40

± 16,44

350,80

11,91

335,7

16,32

375,40

11,47

4.4.4

TESTE DE ESFORÇO

A tabela 14 mostra o resultado do teste de esforço dos animais representados pelo

tempo de corrida em esteira. A função cardíaca durante o estresse físico foi analisada três

semanas após a isquemia permanente.

O grupo normal correu em média 24 minutos (1449 segundos), enquanto que o

tempo de exercício dos animais submetidos à isquemia por oclusão permanente foi em

média 13 minutos (794 segundos). O tempo que estes últimos permaneceram em exercício

foi significantemente menor comparado com os normais (p < 0,001)(Tabela 14), indicando

que a isquemia permanente prejudicou o desempenho cardíaco durante o exercício físico.

Os animais tratados com injeção intramiocárdica, apresentaram tempo de corrida

significantemente reduzido em relação aos normais (p < 0,05) (Tabela 14), e similar ao do

grupo OP, apesar de haver uma tendência dos animais OP im em permanecer mais tempo

em exercício. Isto demonstra que a capacidade cardiovascular destes animais manteve-

bastante comprometida mesmo após a terapia intramiocárdica com CMMO.

O tempo de corrida em esteira dos animais tratados com injeção intravenosa foi

significantemente reduzido em relação aos normais (p < 0,001) e similar ao dos animais

submetidos à oclusão permanente tratados com veículo (tabela 14). Desta forma, podemos

concluir que a função cardíaca continuou bastante comprometida, mesmo após o tratamento

intravenoso com CMMO. Ou seja, este tipo de terapia não foi capaz de prevenir a evolução

do quadro de infarto.

Após o tratamento com as células, seja por via intravenosa ou intramiocárdica, o

tempo que os animais permaneceram em exercício foi semelhante aquele observado nos

animais tratados com veículo.

Tabela 14

Teste de esforço de animais normais e submetidos à isquemia permanente, três

semanas após administração de veículo (OP) bem como tratamento intravenoso (OP iv) ou

intramiocárdico (OP im) com CMMO.

* p < 0,05 em relação aos animais normais

# p < 0,001 em relação aos animais normais

ANIMAIS

Tem

po em exercício

(segundos)

NORMAIS

(n = 10)

1449 ± 78,39

(n = 10)

794 ± 82,07

im (n = 9)

1049

± 85,70*

iv (n = 10)

700

± 117,8

4.4.5

PESQUISA DAS CÉLULA

S MARCADAS

Apesar do tratamento intramiocárdico não ter promovido melhora da função

cardíaca,

três semanas após a terapia, uma grande quantidade de células coradas com

Hoechst foi encontrada no tecido cardíaco destes animais, principalmente na região da

borda do infarto (Figura 20).

A análise microscópica do coração do grupo OP iv, três semanas após a terapia

celular, demonstrou presença de poucas células coradas com Hoechst no tecido cardíaco

(Figura 21). Estas células, quando presentes, encontravam-se bastante dispersas no tecido.

A pouca quantidade de células coradas no tecido, e possivelmente a grande extensão do

infarto podem justificar a ausência de melhora na função cardíaca destes animais.

Figura 20

Fotos representativas das imagens de fluorescência (A,C) e de campo claro

(B,D) da região C do tecido cardíaco de um animal submetido à isquemia permanente, três

semanas após o tratamento intramiocárdico de CMMO. Note a presença de grande

quantidade de células coradas com Hoechst no interior (A) e na borda do tecido (C).

Aumento de 20x da imagem original.

Figura 21

Fotos representativas de fluorescência (A,C) e campo claro (B,D) da análise

microscópica do ventrículo esquerdo de animais submetidos à isquemia permanente, três

semanas após o tratamento intravenoso com CMMO. Note a presença de células isoladas,

coradas com Hoechst no tecido cardíaco. As setas apontam as células presentes no tecido

cardíaco. Aumento de 20x da imagem original.

O modelo animal de infarto do miocárdio, através da oclusão permanente da artéria

coronária esquerda de ratos, previamente padronizado por Santos e Masuda (1991) é

bastante utilizado em nosso laboratório (Pinho-Ribeiro 2003, Olivares et al. 2004,

Werneck

Castro

et al. 2006, Olivares et al. 2007). No entanto, a utilização deste modelo

para avaliar a aplicação de terapias celulares intravenosas com células mononucleares

(CMMO) e de estroma de medula óssea (CEMO) no modelo de IAM foi criticada (Pinho-

Ribeiro 2003), uma vez que o principal vaso de irrigação cardíaca encontrava-

permanentemente ocluído. Isto poderia prejudicar a migração das células para o tecido

cardíaco e comprometer a melhora funcional após administração intravenosa. Considerando

tais críticas pertinentes, estabelecemos em nosso laboratório um modelo animal de oclusão

temporária (durante 90 minutos) da artéria coronária esquerda de ratos para compararmos a

distribuição das CMMO administradas por via intravenosa no organismo de ratos

submetidos à isquemia tanto por oclusão permanente (OP) quanto temporária (OT) da

artéria coronária esquerda.

ratos, o curso temporal da lesão isquêmica e da cicatrização ocorre

aproximadamente duas a três vezes mais rápido do que em humanos. O tempo de

reperfusão de 60 a 120 minutos após a oclusão é aproximadamente equivalente ao tempo

limite em que a terapia trombolítica é usualmente considerada em humanos (Hochman &

Choo 1987). Como Boyle e Weisman (1993) demonstraram que o tamanho do infarto e a

transmuralidade (capacidade de gerar isquemia transmural) são similares entre ratos

submetidos à isquemia por oclusão permanente e oclusão temporária de 60 a 120 minutos,

optamos por ocluir a artéria coronária esquerda durante 90 minutos, uma vez que este

período foi suficiente para promover as alterações eletrocardiográficas típicas de lesão

isquêmica em 50% dos animai

Em humanos, as variáveis eletrocardiográficas que surgem durante a isquemia são: a

onda Q patológica, a elevação do segmento ST e inversão da onda T. A presença de onda Q

caracteriza a existência de necrose miocárdica, e reflete a quantidade de miocár

dio

infartado. Já a elevação do segmento ST, representa a isquemia transmural (envolve toda ou

quase toda a espessura da parede ventricular irrigada pela coronária afetada) e tem sido

correlacionada tanto com a gravidade da isquemia quanto com o tamanho do risco de

miocárdio isquêmico (Atar & Birnbaum 2005). O perfil eletrocardiográfico dos animais

submetidos à oclusão temporária foi caracterizado pela presença de onda Q em DI. A

presença de onda Q em registros no início do curso do infarto, pode refletir tanto danos

irreversíveis como uma grande zona isquêmica (Bateman et al. 1983). Como a onda Q

esteve presente em 100% dos registros eletrocardiográficos dos animais do grupo OP, e a

fração de encurtamento deste grupo foi significativamente reduzida em relação ao grupo

OT (p < 0,01), podemos concluir que a isquemia por oclusão permanente promoveu um

quadro clínico mais grave nos animais. De acordo com Michael e colaboradores (1999), em

camundongos, tanto a isquemia temporária de 120 minutos quanto a permanent

e resultaram

em infartos de 30% do ventrículo esquerdo, e frações de ejeção semelhantes. No entanto,

nossos resultados demonstraram que tanto a fração de encurtamento quanto a de ejeção dos

animais submetidos à isquemia por oclusão permanente foram significativamente reduzidas

em relação ao grupo OT (p < 0,001), e o DSF foi significantemente mais elevado nos

primeiros (p < 0,001). Isto demonstra um maior comprometimento da função sistólica

cardíaca no grupo OP. Tal fato pode ter sido atribuído ao modelo de infarto. Conforme já

estabelecido em nosso laboratório, o modelo de isquemia permanente em ratos é

caracterizado pela oclusão da porção proximal da artéria coronária esquerda. Isto afeta a

região antero-lateral do VE e promove infartos extensos, que comprometem mais de 40 %

do ventrículo esquerdo (Olivares et al. 2007). Assim, em apenas 48 horas já observamos

significativa redução da fração de encurtamento e aumento significativo do DSF. No

entanto, a dilatação significativa da câmara ventricular durante a diástole só é observada

mais tardiamente, três semanas após o procedimento cirúrgico, quando o DSF é ainda

maior.

Michael e colaboradores (1999) demonstraram em camundongos que ventrículos

não reperfundidos tendem a desenvolver uma maior expansão do infarto e hipertrofia

compensatória.

A expansão do infarto é caracterizada pelo afinamento e pela dilatação da

região infartada, e se inicia nas primeiras 24 horas de IM. Embora a expansão do infarto

seja limitada à região infartada, a progressão do quadro é acompanhada de dilatação e

hipertrofia do miocárdio não infartado (Boyle & Weisman 1993). Por outro lado, os

corações de camundongos submetidos à oclusão temporária são mais capazes de compensar

a lesão cardíaca (Michael et al.1999). Portanto, nossos resultados em ratos corroboram

aqueles demonstrados em camundongos por Michael e colaboradores (1999).

Assim, os perfis eletro e ecocardiográficos dos corações 48 horas após o

procedimento cirúrgico, demonstraram que apesar do maior comprometimento da função

cardí

aca nos animais submetidos à isquemia por oclusão permanente, a oclusão temporária

durante 90 minutos foi capaz de caracterizar um perfil elétrico típico do quadro de IAM,

nos permitindo comparar a distribuição das CMMO entre ambos os modelos de isquemia

A análise da distribuição celular no organismo 48 horas após as isquemias

temporária e permanente demonstrou que mesmo com o fluxo coronariano liberado no

momento da administração intravenosa das CMMO, o percentual de células presentes no

coração foi inferior a 1%. Este perfil foi semelhante àquele encontrado nos animais

submetidos à oclusão permanente. Logo, podemos descartar a possibilidade de que a

oclusão permanente da artéria coronária esquerda estivesse comprometendo a migração das

células para o teci

do cardíaco. Sendo assim, os experimentos seguintes de análise da

função

cardíaca após a terapia com CMMO foram todos realizados utilizando o modelo de oclusão

permanente, estabelecido em nosso laboratório.

Dentre as doenças isquêmicas cardíacas, o infarto do miocárdio é uma importante

causa de insuficiência cardíaca (Tang

et al.

2006). Embora recentemente tenha sido relatada

a ocorrência de proliferação em cardiomiócitos humanos (Kajstura et al. 1998, Beltrami

al.

2001) bem como a presença de células-tronco (Beltrami et al. 2003) e células

progenitoras (Oh et al. 2003) no coração de animais adultos, a grande perda de

cardiomiócitos ainda limita a capacidade de restabelecimento da função contrátil após o

infarto (Blocklet et al. 2006). Atualmente, existe um grande interesse na utilização da

terapia com células da medula óssea no reparo e regeneração do tecido cardíaco de

pacientes após o infarto do miocárdio (Strauer

et al.

2002, Assmus

et al.

2002). No entanto,

ainda questiona-se bastante sobre: qual seria a subpopulação de células mais adequada para

este tipo de tratamento; o número de células necessário; e a via de administração mais

eficaz para aplicação da terapia celular em pacientes infartados.

Atualmente, os protocolos clínicos que utilizam a terapia com células-tronco em

pacientes com IM são bastante invasivos, uma vez que as células são transplantadas pelas

vias intramiocárdica (Perin et al. 2003, Perin et al. 2004,

Hendrikx

et al. 2006) ou

intracoronariana (Strauer et al. 2002, Assmus et al. 2002, Britten et al. 2003, Wollert et al.

2004, Lunde et al. 2006, Schachinger et al. 2006, Hristov et al. 2006). Desta forma, a

administração destas células por uma via menos invasiva, como a intravenosa, por

exemplo, é uma interessante estratégia para a doença miocárdica (Ma

et al.

2005).

Existem evidências de que a lesão isquêmica miocárdica mobiliza e potencializa a

migração das células-tronco da medula óssea para o tecido lesionado (Orlic et al. 2002,

Abbott

et al. 2004). Atualmente, essa capacidade de mobilização das células da medula

óssea e a aplicação da terapia intravenosa têm sido bastante investigadas (Orlic

et al.

2001a,

Orlic

et al. 2001b, Kocher et al. 2001, Pinho-Ribeiro 2003, Barbash et al. 2003, Abbott

al.

2004, Ma et al. 2005, Boomsma

al.

2006, Hu et al. 2007). Porém, existe muita

divergência quanto aos resultados encontrados.

Kocher e

colaboradores

(2001) mobilizaram células mononucleares CD34

CD117

bright

(subpopulação de células da medula óssea com fenótipo de progenitores

endotelia

is) humanas (através da administração de G-CSF), e as infundiram por via

intravenosa (2 x 10

células) em ratos atímicos, 48 horas após o IM. Eles verificaram

formação de novos vasos sanguíneos na região infartada (vasculogênese) e proliferação dos

vasos p

ré

-existentes (neoangiogênese), resultando em diminuição da apoptose dos miócitos

hipertrofiados na região peri

infarto, aumento da sobrevida do miocárdio viável, redução da

deposição de colágeno, e aumento da fração de ejeção pelo ecocardiograma. Ma e

col

aboradores (2005), por sua vez, avaliaram a migração de células mesenquimais da

medula óssea (5 x 10

células), administradas na veia da cauda, ½, um, dois, quatro e oito

dias após o IM. A avaliação da migração celular foi realizada 72 horas após a administ

ração

das células. A função cardíaca foi avaliada antes e 28 dias após a terapia celular. Os

autores demonstraram que as células migraram para o coração, principalmente 24 horas

após a administração, sendo que 48 horas, a quantidade encontrada ainda foi

significantemente maior do que ½ dia; e além disso houve melhora nas frações de ejeção e

de encurtamento, principalmente nestes dois tempos citados. Um estudo prévio de nosso

laboratório demonstrou que a infusão intravenosa de CMMO e de CEMO, cinco horas e

seis dias após o IM, respectivamente, não promoveu melhora na função cardíaca de ratos

infartados. Além disso, não foram encontradas células (previamente marcadas) no tecido

cardíaco bem como nas amostras de fígado, rins e pulmões analisadas (Pinho-

Ribeiro

2003).

Por outro lado, Barbash e colaboradores (2003) administraram na veia femoral,

células mesenquimais da medula óssea (4 x 10

células), 48 horas após isquemia

temporária (60 minutos), e avaliaram a capacidade de migração destas células. Eles

verificaram que menos de 1% das células migraram para o coração, enquanto que a maior

parte se manteve nos pulmões, sendo também encontradas no fígado e nos rins.

Estes

estudos citados divergiram bastante quanto ao tipo de população celular utilizada. Desta

form

a, nossa proposta foi avaliar a distribuição das células mononucleares de medula óssea,

48 horas após a administração intravenosa, e acompanhar a função cardíaca destes ratos

infartados, até três semanas pós-tratamento. Escolhemos tal população pelo fato de que

este tipo celular já demonstrou eficácia após a terapia intramiocárdica em pacientes com

infarto crônico do miocárdio (Perin

et al.

2003).

As imagens cintilográficas demonstraram que 48 horas após o IM, as CMMO

marcadas com

99m

Tc transplantadas na veia jugular, se distribuíram principalmente pelo

fígado e rins, enquanto que de acordo com o percentual grama-tecido, a quantidade de

células que migrou para o coração foi inferior a 1% da população inicialmente

administrada.

Estes resultados foram semelhantes àqueles obtidos por Barbash e

colaboradores (2003). Entretanto, não observamos permanência de células nos pulmões

conforme observado após a administração intravenosa das células mesenquimais, o que

pode ter sido decorrente do menor tamanho das CMMO. Este elevado percentual de células

presentes no fígado e nos rins, associado à pequena quantidade presente no coração, após

administração intravenosa de CMMO, também foi observado em estudos que utilizaram o

radioisótopo índio-oxina (In

111

), de meia vida de 67,3 horas, como traçador para

acompanhamento mais prolongado da distribuição das células progenitoras endoteliais e

derivadas da medula óssea no organismo após o IM (Aicher et al. 2003, Kraitchman et al.

2005). Logo, a presença de células nestes órgãos não está relacionada com a característica

do material radioativo empregado para a marcação celular, mas, provavelmente está

relacionada ao fato do fígado e do baço serem órgãos reticuloendoteliais, ou seja, capazes

de abrigar monócitos derivados da medula óssea, que uma vez presentes nestes órgãos, se

transformam em macrófagos altamente fagocíticos. O fato de estarmos lidando com células

mononucleares, que são ricas em monócitos, pode explicar o elevado percentual de células

presente nestes órgãos.

Já a análise funcional três semanas após a injeção intravenosa, demonstrou que a

terapia celular não foi capaz de conter a progressão do infarto, e melhorar função cardíaca;

uma vez que os parâmetros eletro e ecocardiográficos, bem como os hemodinâmicos e o

ste de esforço foram similares àqueles observados no grupo controle OP. A presença de

poucas células marcadas com corante nuclear no tecido cardíaco, três semanas após a

terapia intravenosa com CMMO deve ter contribuído para este quadro. Conforme já foi

scrito, a população de células-tronco da medula óssea representa cerca de 0,1% da

população total presente naquele órgão (Goodell et al. 1996). Como não estamos lidando

com uma população celular constituída somente por células-tronco, mas também por outros

tipos celulares, tais como linfócitos e monócitos, e a quantidade de células que migraram

para o coração foi pequena, sugerimos que a quantidade de células-tronco possivelmente

presente no tecido cardíaco após a lesão tenha sido ínfima, logo, incapaz de p

roporcionar

melhora funcional. Além disso, o procedimento cirúrgico de isquemia por oclusão

permanente provavelmente gerou infartos iniciais bastante extensos, uma vez que 48 horas

após a cirurgia, tanto os perfis elétrico e mecânico do coração destes animais já se

encontravam muito comprometidos.

Baseado na falta de sucesso da terapia intravenosa com CMMO, decidimos analisar

também a distribuição destas células quando transplantadas pela via intramiocárdica, 48

horas após o infarto do miocárdio; e analisar a função cardíaca dos animais três semanas

após a terapia celular.

A análise da distribuição das CMMO no organismo uma hora após a administração

intramiocárdica das células demonstrou que em alguns animais, tanto normais quanto

submetidos à isquemia permanente, as mesmas eram encontradas somente no coração,

enquanto que em outros animais, observávamos presença de células também no fígado e

rins. Isto pode ser explicado pelo fato de que durante o procedimento de injeção

intramiocárdica, algumas vezes ocorreu extravasamento de células durante a retirada da

seringa para aplicação em outro ponto distinto do tecido cardíaco, contribuindo assim para

a dispersão das células para outros órgãos, principalmente fígado e rins. Brenner e

colaboradores (2004) já relataram este perfil de distribuição celular, após a administração

intracavitária de células progenitoras hematopoiéticas (CD34

) marcadas com índio-

oxina.

Sendo assim, para aperfeiçoar a técnica de injeção, e minimizar a interpretação errônea dos

resultados,

em vez de realizarmos de duas a três injeções em pontos distintos do coração,

passamos a realizar a injeção intramiocárdica em um único ponto, evitando assim o

extravasamento das células.

As imagens cintilográficas e a contagem da radioatividade presente nos órgãos

isolados demonstraram que 24 horas após a administração intramiocárdica das CMMO,

grande quantidade de células ainda se manteve presente no coração. No entanto, a presença

destas células no tecido cardíaco, mesmo três semanas após a terapia celular, não foi

suficiente para promover melhora no desempenho cardíaco dos animais, uma vez que ainda

observamos: desvio do ângulo do vetor médio de despolarização ventricular,

comprometimento da função sistólica, e redução nas capacidades de contração (dP/dT+) e

relaxamento (dP/dT

), bem como da pressão desenvolvida pelo VE e do desempenho físico.

No entanto, a avaliação pela fração de encurtamento de área no ecocardiograma sugere uma

estabilização do quadro de infarto. Este perfil, também foi observado por Olivares e

colaboradores (2007) em ratos com infarto cicatrizado, tratados com injeção

intramiocárdica de CMMO, sugerindo que estas células podem estar contribuindo para

evitar a progressão do infarto. Além disso, esta incapacidade de promover melhora na

função cardíaca tanto dos animais OP im quanto do grupo OP iv, pode estar relacionada

com a extensão do infarto inicial e o processo inflamatório gerado a partir deste quadro.

A resposta inflamatória e a secreção de citocinas do tecido hospedeiro gerados

pela

lesão tecidual têm uma importante participação na evolução do quadro de infarto do

miocárdio. O grau da resposta inflamatória por sua vez é um importante determinante das

conseqüências geradas no paciente. Já as citocinas, liberadas pelo miocárdio hos

pedeiro,

são importantes na modulação do reparo tecidual e na adaptação após o dano tecidual (Nian

et al. 2004). Citocinas pró-inflamatórias como TNF-

(fator de necrose tumoral ) ou IL-

são secretadas logo após a isquemia miocárdica e podem regular agudamente a

sobrevivência ou apoptose de miócitos além de ativar resposta inflamatória celular

adicional (Nian et al. 2004). O estresse mecânico associado ao infarto do miocárdio

promove a imediata produção destas citocinas. No modelo de infarto do miocárdio

roedores, dentro das primeiras horas de infarto, existe na área infartada e não infartada, um

aumento de cerca de 50 e 15 vezes, respectivamente na regulação da expressão de RNAm

de citocinas intramiocárdicas, tais como:TNF- , IL-1

e IL-6 (Deten et al. 2002). Esse

aumento pode retornar para níveis basais se o infarto for pequeno. No entanto, se o infarto

for extenso, ou se a resposta inflamatória for exuberante, o aumento da regulação destas

citocinas pode ser mantido ou pode ocorrer uma segunda onda de super-regulação, que por

sua vez pode envolver a zona remota não infartada, promovendo um importante processo

de remodelamento em todo o miocárdio (Ono et al. 1998). O aumento da expressão das

citocinas precede o conseqüente aumento da atividade local da

MMP

-9 na área de infarto e

expressão de colágeno no miocárdio não infartado (Deten et al. 2002). Baseado nestas

evidências, e no fato de que 48 horas após o procedimento cirúrgico a fração de

encurtamento já se encontrava bastante reduzida (em cerca de 50%

), a câmara ventricular já

se apresentava dilatada e o âQRS significativamente desviado para a direita ( > 90º),

podemos inferir que o infarto inicial provavelmente foi bastante extenso. Isto pode

justificar a ausência de eficácia do tratamento, já que em alguns modelos animais de infarto

do miocárdio em que a terapia celular foi eficaz, a extensão do infarto era de apenas 30

40 % do VE (Michael et al. 1999). Talvez, em infartos menos extensos, possamos observar

eficácia na aplicação da terapia intramiocárdica com CMMO 48 horas após o IM,

impedindo assim a progressão do quadro clínico.

Quando comparamos a distribuição das CMMO, transplantadas por via

intramiocárdica, entre animais normais e submetidos à isquemia observamos que o

percentual grama

tecido (a

valiação mais fidedigna da quantidade de radioatividade presente

no órgão) demonstrou uma quantidade significativamente maior de células no coração dos

animais deste último grupo (p < 0,001). Tal fato pode ser explicado pela existência de

processo inflamatório, uma vez que após o IM, a quantidade de SDF-1 ( stromal cell-

derived factor-1 ) aumenta significativamente (Abbott et al. 2004). Esta quimiocina, por

sua vez forma um complexo com seu receptor CXCR4 (Boomsma

et al.

2006), presente em

diversos tipos celulares (células CD34

, de estroma de medula óssea, células maduras do

sangue, tais como: linfócitos, monócitos, megacariócitos e plaquetas) (Mohle et al. 1998).

Esta interação entre SDF-1 - CXCR4, proporciona assim a manutenção das células no local

que sofreu lesão. Além disso, após o IM, ocorre uma maior regulação de

ICAM

( intercellular adhesion molecule ) e VCAM-1 ( vascular cellular adhesion molecule ),

moléculas envolvidas com adesão e migração celular. Por outro lado, o SDF-1

expresso

constitutiva

mente em todos os tecidos (Shirozu et al. 1999), incluindo a medula óssea,

encontra

-se significantemente aumentado após o IM e influencia a migração de células da

medula óssea para o coração somente na presença de lesão cardíaca (Abbott

et al. 2004, Ma

al.

2005). Por este motivo, especula-se que o melhor momento para a aplicação da

terapia intravenosa seria durante o pico de expressão máxima do SDF-1, ou seja, 24 horas

após o IM (Ma et al. 2005), proporcionando assim uma maior migração das células

transp

lantadas na circulação periférica para o coração.

De acordo com Hu e colaboradores (2007), o curso da cicatrização do infarto e o

remodelamento cardíaco determinam o momento ideal, ótimo para a administração das

células. Segundo estes autores, entre 24 e 72 horas após o infarto, ocorre necrose

miocárdica massiva, e os leucócitos bem como os macrófagos se infiltram rapidamente no

miocárdio isquêmico. De acordo com os resultados obtidos por estes autores, uma semana

após o IM, seria o tempo ideal para a administração da terapia celular intramiocárdica, uma

vez que neste momento a maioria da região infartada é composta por tecido de granulação e

necrose e a reação inflamatória aguda estaria quase completa. No entanto, este momento

não seria ideal para a terapia intravenosa, uma vez que de acordo com Ma e colaboradores

(2005), o pico de secreção de SDF-1 e conseqüentemente o maior grau de migração das

células mesenquimais para o coração ocorre nas primeiras 24 horas após o IM. Embora 48

100

horas após o IM, esta quantidade de células mesenquimais seja reduzida em relação a 24

horas, ainda é significativamente maior do que ½ dia após o infarto (Ma et al. 2005).

Podemos especular então, que a secreção de SDF-1, 48 horas após o infarto, ainda estimula

a migração de célul

as para o tecido cardíaco isquêmico.

Estes fatos explicitados acima talvez possam elucidar a presença de maior

quantidade de células após a administração intramiocárdica, no coração dos animais OPim

em relação aos normais, assim como explicar a tendência dos animais OPiv apresentarem

um percentual de células mais elevado em relação aos normais, após a administração

intravenosa de CMMO.

Nossas evidências sugerem que a ausência de melhora no desempenho cardíaco

tanto após a administração intramiocárdica como intravenosa de CMMO não está

relacionada com o número de células administradas (4-6 x 10

e 1-4 x10

células,

respectivamente), já que este número foi compatível ou até mesmo superior em relação aos

estudos existentes na literatura (Kocher et al. 2001, Hamano et al. 2002, Barbash et al.

2003, Abbott et al. 2004, Ma et al. 2005). Apesar de termos administrado por via

intravenosa um grande número de CMMO nos diferentes grupos avaliados (normais e

submetidos às oclusões temporária ou permanente), observamos que menos de 1% desta

população se distribuiu no coração. De acordo com Strauer e colaboradores (2002), se

assumirmos que o fluxo coronariano humano normal é de 80 mL/minuto por 100 g de peso

do VE e considerando a massa do VE aproximadamente 200 g, a cada minuto o fluxo

sangüíneo na câmara ventricular seria de 160 mL/minuto. Isto corresponde a somente cerca

de 3 % do débito cardíaco (DC), se assumirmos DC de 5000 mL/minuto. Se extrapolarmos

estes dados para o modelo animal, o contato das células infundidas por via intravenosa com

o tecido miocárdico só seria possível depois de várias passagens do sangue periférico pelo

101

coração. Mesmo as células sendo administradas em um vaso sanguíneo próximo ao coração

como a veia jugular, observamos uma grande distribuição de células em órgãos como

fígado e rins. Desta forma, podemos especular que o sangue ao se movimentar pela

circulação sistêmica retém grande quantidade de CMMO em órgãos bastante

vascularizados tais como fígado e rins. Desta forma, a quantidade de CMMO extras na

circulação sistêmica conseqüentemente diminui, reduzindo assim a possibilidade de fixação

destas células no tecido cardíaco, a cada passagem de sangue pelo coração.

As evidências deste estudo demonstram que a via intramiocárdica parece ser a m

ais

indicada para administração de células em pacientes com infarto do miocárdio recente, uma

vez um maior percentual de células se mantém no tecido cardíaco. Além disso, sugerimos

que a ausência de melhora na função ventricular pode estar relacionada com a extensão do

infarto promovida por nosso modelo de oclusão permanente. Se, em modelos de infartos

menos extensos, a terapia celular melhora e estabiliza o desempenho cardíaco, estudos

futuros devem ser realizados para avaliação do potencial destas células

neste contexto.

102

Este estudo nos permitiu concluir que:

Após a administração intramiocárdica das CMMO, um percentual

significativamente maior é encontrado no coração de animais infartados em relação

aos normais.

O percentual de CMMO presente no coração dos animais infartados após

administração intravenosa é significantemente reduzido em relação à administração

intramiocárdica.

O modelo de isquemia por oclusão permanente não prejudicou a distribuição das

CMMO no organismo, uma vez que tanto neste modelo quanto no modelo de

oclusão temporária da coronária esquerda o percentual de células que migrou para o

coração após a injeção intravenosa foi inferior a 1%.

Todos os parâmetros funcionais avaliados demonstraram que as CMMO

administradas por via intravenosa ou intramiocárdica, não promoveram melhora na

função cardíaca dos animais, três semanas após a terapia.

Embora tenhamos encontrado grande quantidade de células marcadas no tecido

cardíaco dos animais infartados tratados com CMMO por via intramiocárdica (O

im), não observamos melhora na função cardíaca destes animais.

Apesar dos tratamentos intravenoso e intramiocárdico com CMMO 48 horas após o

infarto, não terem promovido melhora na função cardíaca dos animais, ambos

estabilizaram a função global do vent

rículo esquerdo pelo ecocardiograma.

103

ABBOTT J.D.; HUANG Y.; LIU D.; HICKEY R.; KRAUSE D.S.; GIORDANO F.J.

Stromal cell-derived factor-1alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the

heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence

of injury.

Circulation

110(21):3300

3305; 2004.

AICHER A

BRENNER W

ZUHAYRA M

BADORFF C

MASSOUDI S

ASSMUS

ECKEY T

HENZE E

ZEIHER A. M

DIMMELER S. Assessment of the tissue

stribution of transplanted human endothelial progenitor cells by radioactive labeling.

Circulation

107(16):2134

2139; 2003.

ALISON, M. R.; POULSOM, R.; FORBES, S.; WRIGHT, N. A. An introduction to stem

cells

. J. Pathol

. 197:419

-423, 2002.

ALISON, M. R.; POULSOM, R.; JEFFERY, R.; DHILLON, A. P.; QUAGLIA, A.;

JACOB, J.; NOVELLI, M.; PRENTICE, G.; WILLIAMSON, J.; WRIGHT, N.A.

Hepatocyte from non

hepatic adult stem cells.

Nature

406 (6793

): 257, 2000.

ASSMUS B.; SCHACHINGER V.; TEUPE C.; BRITTEN M.; LEHMANN R.; DOBERT

N.; GRUNWALD F.; AICHER A.; URBICH C.; MARTIN H.; HOELZER D.;

DIMMELER S.; ZEIHER A.M. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration

Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-

AMI).

Circulation

106(24):3009

3917; 2002.

ATAR S

BIRNBAUM Y. Ischemia-induced ST-segment elevation: classification,

prognosis, and therapy.

J. Electrocardiol

. 38(4 Suppl):1

7. 2005 Review.

BAILEY D.L. & ADAMSON K.L. Nuclear medicine: from photons to physiology.

Curr. Pharm. Des.

9(11):903

-916, 2003. Review.

BARBASH I.M.; CHOURAQUI P.; BARON J.; FEINBERG M.S.; ETZION S.;

TESSONE A.; MILLER L.; GUETTA E.; ZIPORI D.; KEDES L.H.; KLONER R.A.;

104

LEOR J. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the

infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution.

Circulation

108(7):863

882; 2003.

BATEMAN T.M

CZER L.S

GRAY R.J

MADDAHI J

RAYMOND M.J

.; GEFT

I.L

GANZ W., SHAH P.K

BERMAN D.S. Transient pathologic Q waves during

acute ischemic events: an electrocardiographic correlate of stunned but viable

myocardium. Am. Heart. J.

106(6):1421

1426; 1983.

BELTRAMI A.P

BARLUCCHI L

TORELLA D

BAKER M

LIMANA F

CHIMENTI S

KASAHARA H

;

ROTA M

MUSSO E

URBANEK K

LERI A

KAJSTURA J

NADAL

-GINARD B

ANVERSA P. Adult cardiac stem cells are

multipotent and support myocardial regeneration.

Cell

114(6):763

76; 2003.

BELTRAMI A.P

URBANEK K

KAJSTURA J

YAN S.M

FINATO N

BUSSANI R

NADAL

-GINARD B

SILVESTRI F

LERI A

BELTRAMI C.A

ANVERSA P

Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N. Engl. J.

Med.

344(23):1750

1757; 2001.

BIANCO P.; ROBEY, P. G. Stem Cells in tissue engineering.

Nature

414: 118

-121, 2001.

BIANCO, P.; ROBEY, P. G. Marrow stromal stem cells. J. Clin. Inv. 105: 1663-1668,

2000.

BLOCKET D.; TOUNGOUZ M.; BERKENBOOM G.; LAMBERMONT M.; UNGER P.;

PREUMONT N

STOUPEL E

EGRISE D.

;

DEGAUTE J.P

GOLDMAN M

GOLDMAN S. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells

after intracoronary injection.

Stem Cells

24(2):333

336; 2005.

BONNET, D. Hematopoietic stem cells.

J. Pathol

. 197: 430

-440, 2002.

105

BOOMSMA R.A.; SWAMINATHAN P.D.; GEENEN D.L. Intravenously injected

mesenchymal stem cells home to viable myocardium after coronary occlusion and

preserve systolic function without altering infarct size. Int. J. Cardiol. 2006 [Epub

ahe

ad of print].

BOYLE M.P

WEISMAN H.F. Limitation of infarct expansion and ventricular

remodeling by late reperfusion. Study of time course and mechanism in a rat model.

Circulation

88(6):2872

2883; 1993.

BRAUNWALD, E. & KLONER, R.A. Myocardial reperfusion: a double-edged sword?

Clin. Invest.

76(5):1713

-1719,1985.

BRENNER W.; AICHER A.; ECKEY T.; MASSOUDI S.; ZUHAYRA M.; KOEHL U.;

HEESCHEN C.; KAMPEN W.U.; ZEIHER A.M.; DIMMELER S.; HENZE E.

111

labeled CD34

hematopoietic progenitor cells in a rat myocardial infarc

tion model.

Nucl. Med.

45(3):512

518; 2004.

BRITTEN M.B.; ABOLMAALI N.D.; ASSMUS B.; LEHMANN R.; HONOLD J.;

SCHMITT J.; VOGL T.J.; MARTIN H.; SCHACHINGER V.; DIMMELER S.;

ZEIHER A.M. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in

patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from

serial contrast-

enha

nced magnetic resonance imaging.

Circulation

108(18):2212

2218;

2003.

CAPLAN, A.I. Mesenchymal stem cells.

J. Ortho. Res.

9: 641

-650, 1991.

CARDOSO, E.M.; ALVES, I.M.; BRAS, C.; PESTANA S. Apostila educativa. Aplicações

da Energia Nuclear. Disponível em: <

htpp://

www.cnen.gov.br

>. Acesso em 01 de maio

de 2007.

106

CASE RB. The ischemic myocardium: Matabolic, electrolityte, and structural

abnormalities. In: Carvalho VB, Macruz R. eds. Cardiopatia isquêmica: Aspectos de

portância clínica. São Paulo: Sarvier 63

-72.

CHIU, R.C.; ZIBAITIS, A.; KAO, R.L. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration

with satellites cell implantation.

Ann. Thorac. Surg

. 60: 12

-18, 1995.

CLARK, B.R.; KEATING, A. Biology of bone marrow stroma. Ann. N.Y. Acad. Sci. 770:

70-78, 1995.

CLARKE, D.L.; JOHANSSON, C.B.; WILBERTZ, J.; VERESS, B.; NILSSON, E;

KARLSTROM, H.; LENDAHL, U.; FRISEN, J. Generalized potential of adult neural

stem cells.

Science 2

88(5471):1660

-1663, 2000.

CLEUTJENS, J.P

KANDALA, J.C

GUARDA, E

GUNTAKA, R.V

WEBER, K.T

gulation of collagen degradation in the rat myocardium after infarction. J. Mol. Cell

Cardiol.

27(6):1281

-1892, 1995.

DAWN, B. & BOLLI, R. Adult bone marrow-derived cells: regenerative potential,

plasticity, and tissue commitment.

Basic Res. Cardiol

. 100(6):494

-503, 2005.

DENNIS, J. E.; CHARBORD, P. Origin and differentiation of human and murine stroma.

Stem Cells

20: 205

-214, 2002.

DESMOULIERE, A.; GEINOZ, A.; GABBIANI, F.; GABBIANI, G.

Transforming growth

factor

-beta 1 induces alpha-smooth muscle actin expression in granulation tissue

myofibroblasts and in quiescent and growing cultured fibroblasts. J. Cell Biol.

122(1):103

-111, 1993.

DETEN A.; VOLZ H.C.; BRIEST W.; ZIMMER H.G. Cardiac cytokine expression is

upregulated in the acute phase after myocardial infarction. Experimental studies in rats.

Cardi

ovasc Res.

55(2):329

340; 2002.

107

EVORA, P.R

PEARSON, P.J

SECCOMBE, J.F

SCHAFF, H.V. Ischemia-

reperfusion

lesion. Physiopathologic aspects and the importance of the endothelial function.

Arq.

Bras. Cardiol.

66(4):239

-245, 1996.

FACTOR, S. M.; Pathophysiology of myocardial ischemia. In: HURST, J. W.; SCHLANT,

R.C.; RACKLEY, C.E.; SONNEBLICK, E.H.; WENGER, N.K.; ed. The

Heart.

Arteries and veins

. 7ª ed. New York, Mc Graw

-Hill, Cap. 49, p. 940-959, 1990.

FERRARI, G.; CUSELLA DE ANGELIS, G.; COLETTA, M.; PAOLUCCI, E.;

STORNAIUOLO, A.; COSSU, G.; MAVILIO, F. Muscle regeneration by bone

marrow

derived myogenic progenitors.

Science

279(5356):1528

-1530,1998.

FRASER, J.K.; SCHREIBER, R.E.; ZUK, P.A.; HEDRICK, M.H. Adult stem cell therapy

for the heart

. Int. J. Biochem. Cell Bi

ol.

36(4):658

-666, 2004.

FRIEDENSTEIN, A.J.; DERIGLASOVA, U.F.; KULAGINA, N.N.; PANASUK, A.F.;

RUDAKOWA, S.F.; LURIA, E.A.; RUADKOW, I.A. Precursors for fibroblasts in

different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay

thod.

Exp. Hematol

. 2(2):83

92, 1974.

GOODELL, M. A.; Brose, K.; Paradis, G; Conner A. S.; Mulligan, R. C. Isolation and

functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.

Exp. Med.

183: 1797

-1806, 1996.

HAKUNO, D.; FUKUDA, K.; MAKINO, S.; KONISHI, F.; TOMITA, Y.; MANABE, T.;

SUZUKI, Y.; UMEZAWA, A., OGAWA, S. Bone marrow derived regenerated

cardiomyocytes (CMG cells) express functional adrenergic and muscarinic receptors.

Circulation

105: 380

-386, 2002.

108

HAMANO, K.; LI, T.S.; KOBAYASHI, T.; HIRATA, K.; YANO, M.; KOHNO, M.;

MATSUZAKI, M. Therapeutic angiogenesis induced by local autologous bone marrow

cell implantation.

Ann. Thorac. Surg

. 73(4):1210

-1215, 2002.

HENDERSON KK, WAGNER H

FAVRET F

BRITTON SL,

KOCH LG,

WAGNER PD

GONZALEZ NC. Determinants of maximal O

uptake in rats selectively bred for

endurance running capacity.

J. Appl. Physiol.

93(4):1265

-1274, 2002.

HENDRIKX M.; HENSEN K.; CLIJSTERS C.; JONGEN H.; KONINCKX R.; BIJNENS

E.; INGELS M.; JACOBS A.; GEUKENS R.; DENDALE P.; VIJGEN J.; DILLING

D.; STEELS P.; MEES U.; RUMMENS J.L. Recovery of regional but not global

contractile function by the direct intramyocardial autologous bone marrow

transplantation: results from a randomized controlled clinical trial.

Circulation

114(1

Suppl):I101

107; 2006.

HOCHMAN J.S. & CHOO H. Limitation of myocardial infarct expansion by reperfusion

independent of myocardial salvage.

Circulation.

75(1):299

306; 1987.

HOSENPUD, J.D

BENNETT, L.E

;

KECK, B.M

BOUCEK, M.M

;

NOVICK, R.J.

The

Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: seventeenth

official report

-2000.

J. Heart Lung Transplant.

19(10):909

931, 2000.

HRISTOV M.; HEUSSEN N.; SCHOBER A.; WEBER C. Intracoronary infusion of

autologous bone marrow cells and left ventricular function after acute myocardial

infarction: a meta

analysis

. J. Cell Mol. Med

. 10(3):727

733; 2006.

HU X.; WANG J.; CHEN J.; LUO R.; HE A.; XIE X.; LI J. Optimal temporal delivery of

bone marrow mesenchymal stem cells in rats with myocardial infarction. Eur. J.

Cardiothorac. Surg.

31(3):438

443; 2007.

109

HÜT

TMANN A

LI C.L

DUHRSEN U. Bone marrow-derived stem cells and

"plasticity".

Ann. Hematol

.. 82(10):599

604, 2003. Review.

ITESCU, S.; KOCHER, A.A.; SCHUSTER, M.D. Myocardial neovascularization by adult

bone marrow-derived angioblasts: strategies for improvement of cardiomyocyte

function.

Heart Fail. Rev.

8(3):253

258, 2003.

JACKSON, A. J.; MAJKA, S. M.; WANG, H.; POCIUS, J.; HARTLEY, C. J.; MAJESKY,

M. W., ENTMAN, M. L.; MICHAEL, L. H.; HIRSCHI, K. K.; GOODELL, M.A.

Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells.

J. Clin. Invest.

107:1395

-1402, 2001.

JAIN, M.; DERSIMONIAN, H.; BRENNER, D. A.; NGOY, S.; TELLER, P.; EDGE, A. S.

B.; ZAWADZKA, A.;WETZEL, K.; SAWYER, D.; COLUCCI, W. S.; APSTEIN, C.

S.; LIAO, R. Cell Therapy attenuates deleterious ventricular remodeling and improves

cardiac performance after myocardial infarction.

Circulation

103:1920

-1927, 2001.

JANICKI, J.S.; BROWER, G.L.; GARDNER, J.D.; FORMAN, M.F.; STEWART, J.A.

JR.; MURRAY, D.B.; CHANCEY, A.L. Cardiac mast cell regulation of matrix

metalloproteinase-related ventricular remodeling in chronic pressure or volume

overload.

Cardiovasc. Res.

69(3):657

-665, 2006.

JIAN, Y.; JAHAGIRDAR, B.N.; REINHARDT, R.L.; SCHWARTZ, R.E.; KEENE, C. D.;

ORTIZ

-GONZALEZ, X. R.; REYES, M.; LENVIK, T.; LUND, T.; BLACKSTAD, M.;

DU, J.; ALDRICH, S.; LISBERG, A.; LOW, W. C.; LARGAESPADA, D. A;

VERFAILLIE, C. M. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult

marrow.

Nature

20:1

-12, 2002.

110

KAJSTURA J

LERI A

FINATO N

DI LORETO C

BELTRAMI

C.A.;

ANVERSA P

Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans. Proc Natl Acad Sci USA.

95(15):8801

8805; 1998.

KOCHER A.A.; SCHUSTER M.D.; SZABOLCS M.J.; TAKUMA S.; BURKHOFF D.;

WANG J.; HOMMA S.; EDWARDS N.M.; ITESCU S.

Neovascularization of ischemic

myocardiu

m by human bone-

marrow

-derived angioblasts prevents cardiomyocyte

apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat. Med. (4):430-

436;

2001.

KRAITCHMAN, D.L.; TATSUMI, M.; GILSON, W.D.; ISHIMORI, T.; KEDZIOREK,

D.; WALCZAK, P.; SEGARS, W.P.; CHEN, H.H.; FRITZGES, D.; IZBUDAK, I.;

YOUNG, R.G., MARCELINO, M.; PITTENGER, M.F.; SOLAIYAPPAN, M.;

BOSTON, R.C.; TSUI, B.M.; WAHL, R.L.; BULTE, J.W. Dynamic imaging of

allogeneic mesenchymal stem cells trafficking to myocardial infarction.

Circulation

112(10):1451

-1461, 2005.

KU, D.D

Coronary vascular reactivity after acute myocardial ischemia.

Scie

nce

218(4572):576

-578, 1982.

LERI, A.; KAJSTURA, J.; ANVERSA, P. Cardiac stem cells and mechanisms of

myocardial regeneration.

Physiol. Rev.

85: 1373

-1416, 2005.

LITWIN, S.E.; KATZ, S.E.; MORGAN, J.P.; DOUGLAS, P.S. Serial ecocardiographic

assessment of the left ventricular geometry and function after large myocardial

infarction in the rat.

Circulation

89: 345

-354, 1994.

LOEFFLER, M.; POTTEN, C.S. Stem cells and cellular pedigrees

a conceptual

introduction. In: POTTEN, C.S.; ed. Stem Cells. Londres, Academic Press, cap. 1, p.

01-28, 1997.

111

LOVELL, M. J. & MATHUR, A. The role of stem cells for treatment of cardiovascular

disease.

Cell Prolif

. 37(1):67

-87, 2004.

LUNDE K.; SOLHEIM S.; AAKHUS S.; ARNESEN H.; ABDELNOOR M.; EGELAND

T.; ENDRESEN K.; ILEBEKK A.; MANGSCHAU A.; FJELD J.G.; SMITH H.J.;

TARALDSRUD E.; GROGAARD H.K.; BJORNERHEIM R.; BREKKE M.;

MULLER C.; HOPP E.; RAGNARSSON A.; BRINCHMANN J.E.; FORFANG K.

Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial

infarction

. N. Engl. J. Med

. 355(12):1199

1209; 2006.

MA J

GE J

ZHANG S

SUN A

SHEN J

CHEN L

WANG K

ZOU Y. Time course

of myocardial stromal cell-derived factor 1 expression and beneficial effects of

intravenously administered bone marrow stem cells in rats with experimental

myocardial infarction.

Basic Res. Cardiol.

100(3):217

223; 2005.

MAKINO, S; FUKUDA, K; MIYOSHI, S; KONISHI, F; KODAMA, H; PAN, J; SANO

M.; TAKAHASHI, T.; HORI, S., ABE, H., HATA, J-I; UMEZAWA, A.; OGAWA, S.

Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clin. Invest.

103: 697

-705, 1999.

MARQUES, F.L.N.; OKAMOTO, M.R.Y. AND BUCHPIGUEL, C. A. Alguns aspectos

sobre

geradores e radiofármacos de Tecnécio-99m e seus controles de qualidade.

Radiol. Bras.

34(4): 233

-239, 2001.

MEIRA L.R.S. Cintilografia - Aplicações diagnósticas. Disponível em:

htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm. Acesso em: 1 de maio de 2007.

MICHAEL L. H

BALLANTYNE C.M

ZACHARIAH J.P

GOULD K.E

POCIUS J.S

TAFFET G.E

HARTLEY C.J

PHAM T.T

DANIEL S.L

FUNK E

ENTMAN

112

ML. Myocardial infarction and remodeling in mice: effect of reperfusion. Am. J.

Physiol

. 277(2 Pt 2):H660

668; 1999.

MINGUELL, J. J.; CONGET, P; ERICES, A. Biology and clinical utilization of

mesenchymal progenitor cells

Braz. J. Med. Biol. Res.

33: 881

-887, 2000.

MOHLE R

HAAS R

HUNSTEIN W. Expression of adhesion molecules and c-kit on

CD34

hematopoietic progenitor cells: comparison of cytokine-mobilized blood stem

cells with normal bone marrow and peripheral blood. J. Hematother.

2(4):483

489;

1993.

MOMMA, S.; JOHANSSON, C.B.; FRISEN, J. Get to know your stem cells. Curr. Opin.

Neurobiol.

10(1): 45

49, 2000.

NAGAYA, N.; FUJII, T.; IWASE, T.; OHGUSHI, H.; ITOH, T.; UEMATSU, M.;

YAMAGISHI, M.; MORI, H.; KANGAWA, K.; KITAMURA, S. Intravenous

administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute

myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis. Am. J. Physiol. Heart

Circ. Physiol.

287(6):H2670

-676, 2004.

NIAN M.; LEE P.; KHAPER N.; LIU P. Inflammatory cytokines and postmyocardial

infarction remodeling

. Circ. Res.

94(12):1543

1553; 2004. Review.

OH H, BRADFUTE SB, GALLARDO TD, NAKAMURA T, GAUSSIN V, MISHINA Y,

POCIUS J.; MICHAEL L.H.; BEHRINGER R.R.; GARRY D.J.; ENTMAN M

.L.;

SCHNEIDER M.D. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing,

differentiation, and fusion after infarction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

.100(21):12313

12318; 2003.

OLIVARES, E.L.; COSTA-E-SOUSA R.H; WERNECK. DE CASTRO, J.P.S.; PINHO-

RIBEIRO, V.; SILVA M.G; RIBEIRO, K.C.; MATTOS; E.C.; GOLDENBERG,

113

R.C.S.; CAMPOS DE CARVALHO, A.C.; MASUDA, M.O. Cellular cardiomyoplasty

in large myocardial infarction: Can the beneficial effect be enhanced by ACE-

inhibitor

therapy?

Eur. J. Heart. Fail

. Mar 28, 2007.

OLIVARES, E.L.; PINHO-RIBEIRO, V.; WERNECK. DE CASTRO, J.P.S.; RIBEIRO,

K.C.; MATTOS; E.C.; GOLDENBERG, R.C.S.; MILL, J.G.; DOHMANN, H.F.; DOS

SANTOS, R.R; DE CARVALHO, A.C.C. ; MASUDA, M.O. Bone marrow stromal

cells improves cardiac performance in healed infarcted rat hearts. Am. J. Physiol. Heart

Circ. Physiol.

287 (2): H464

-470, 2004.

ONO K.; MATSUMORI A.; SHIOI T.; FURUKAWA Y.; SASAYAMA S. Cytokine gene

expression after myocardial infarction in rat hearts: possible implication in left

ventricular remodeling.

Circulation

98(2):149

156; 1998.

ORLIC D, HILL JM, ARAI AE. Stem cells for myocardial regeneration. Circ. Res.

91(12):1092

1102; 2002.

ORLIC, D.; KAJSTURA, J.; CHIMENTI, S.; JAKONIUK, I.; ANDERSON, S. M.; LI B.;

PICKEL J.; MCKAY, R.; NADAL-GINARD, B.; BODINE, D.M.; LERI, A.;

ANVERSA

, P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium

Nature

410:701-

705, 2001a.

ORLIC, D.; KAJSTURA, J.; CHIMENTI, S.; LIMANA, F.; JAKONIUK, I.; QUAINI, F.;

NADAL

-GINARD, B.; BODINE, D.M.; LERI, A.; ANVERSA, P. Mobilized bone

marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA

. 98 (18): 10344

-10349, 2001b.

OSAWA, M.; HANADA, KEN-ICHI; HAMADA, H.; NAKAUCHI, H. Long-

term

lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34low/negative hematopoietic stem

cell.

Science

273:242

-245, 1996.

114

PERIN E.C

DOHMANN H.F

BOROJEVIC R

SILVA S.A

SOUSA A.L

SILVA

G.V

MESQUITA C.T

BELEM L

VAUGHN W.K

RANGEL F.O

ASSAD J.A

CARVALHO A.C

BRANCO R.V

ROSSI M.I

DOHMANN H.J

WILLERSON J

.T.

Improved exercise capacity and ischemia 6 and 12 months after transendocardial

injection of autologous bone marrow mononuclear cells for ischemic cardiomyopathy.

Circulation

110(11 Suppl 1):II213

218; 2004.

PERIN, E.C.; DOHMANN, H.F.R.; BOROJEVIC, R.; SILVA, S.A; SOUSA, A.L.S.;

SOUZA, A.L.S.; MESQUITA, C.T.; ROSSI, I.; CARVALHO A.C; DOHMANN,

H.J.F.; SILVA, G.V.; BELÉM, L.; VIVAQUA, R.; RANGEL, F.O.D.; ESPORCATTE,

R.; GENG, Y.J.; VAUGHN, W.K.; ASSAD, J.A.; MESQUITA, E.T.; WILLERSON,

J.T. Transendocardial, autologous bone-marrow cell transplant in severe, chronic

isquemic heart failure.

Circulation

107 (18):2294

2302; 2003.

PETERSEN, B.E.; BOWEN, W.C.; PATRENE, K.D.; MARS, W.N.; SULLIVAN, A.K.;

MURASE, N.; BOGGS, S.S.; GREENBERGER, J.S.; GOFF, J.P. Bone marrow as a

potential source of hepatic oval cells.

Science

284: 1168

-1170, 1999.

PINHO-RIBEIRO V. Avaliação do potencial terapêutico das células de medula óssea no

infarto do miocárdio experimental (Dissertação de Mestrado), 2003.

PITTENGER, M.F.; MACKAY, A.M.; BECK, S.C.; JAISWAL, R.K.; DOUGLAS, R.;

MOSCA, J.D.; MOORMAN, M.A.; SIMONETTI, D.W.; CRAIG, S.; MARSHAK, D.R.

Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.

Science

284: 143-

147,

1999.

PROCKOP, D.J. Marrow stromal cells as stem cells

for nonhaematopoietic tissues.

Science,

276: 711

-774, 1997.

115

SAHN, D.J; DEMARIA, A; KISSLO, J; WEYMAN, A. Recommendations regarding

quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic

measurements.

Circulation

58(6):1072

-1083, 1978.

SANCHEZ

-RAMOS, J.; SONG, S; CARDOZO-PELAEZ, F.; HAZZI, C.; STEDEFORD,

T.; WILLING, A.; FREEMAN, T.B.; SAPORTA, S.; JANSSEN, W.; PATEL, N.;

COOPER, D.R.; SANBERG, P.R. Adult bone marrow stromal cells differentiate into

neural cells in vitro

. Exp. Neu

rol

. 164(2): 247

256, 2000.

SANTOS, P.E.B; MASUDA M.O. The eletrocardiogram of rats with an old extensive

myocardial infarction.

Braz. J. Med. Biol. Res.

24:1173

-1177, 1991.

SCHACHINGER V.; ERBS S.; ELSASSER A.; HABERBOSCH W.; HAMBRECHT R.;

HOLSCHERMANN H.; YU J.; CORTI R.; MATHEY D.G.; HAMM C.W.;

SUSELBECK T.; ASSMUS B.; TONN T.; DIMMELER S.; ZEIHER A.M.; REPAIR-

AMI INVESTIGATORS. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute

myocardial infarction

. N. Engl. J. Med

.. 355(12):1210

1221; 2006.

SELYE, H.; BAJUSZ, E.; GRASSO, S.; MENDELL, P. Simple techniques for the

cirurgical occlusion of coron

ary vessels in the rat.

Angiology

1:398

-407, 1960.

SHAKE, J. G.; GRUBER, P.T.; BAUMGARTNER, W. A.; SENECHAL, G.; MEYERS,

J.; REDMOND, J. M.; PITTENGER, M. F.; MARTIN, B. J. Mesenchymal stem cell

implantation in swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects

Ann. Thorac. Surg.

73:1919

-1926, 2002.

SHIROZU M, NAKANO T, INAZAWA J

TASHIRO K, TADA H, SHINOHARA T,

HONJO T. Structure and chromosomal localization of the human stromal cell-

derived

ctor 1 (SDF1) gene.

Genomics

28(3):495

-500,1995.

116

STAHL R.F

DEUTSCH E

FISHER C.A

WARSAW D.S

ADDONIZIO V.P. Cardiac

ischemia and endothelial function in the isolated rabbit heart. J. Surg. Res. 47(2):97-

104, 1989.

STRAUER, B.E.; BREHM, M; ZEUS, T.; KÖSTERING, M.; HERNANDEZ, A.; SORG,

R.V.; KÖGLER, G; WERNET, P. Repair of infarcted myocardium by autologous

intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation.

Circulation

106:1

2002.

SUN Y

ZHANG, J.Q

ZHANG, J

LAMPARTER, S

SUN, Y

ZHANG, J.Q

ZHANG, J

LAMPARTER, S. Cardiac remodeling by fibrous tissue after infarction in

rats.

J. Lab. Clin. Med.

135(4):316

323, 2000.

SUN, Y. & WEBER, K.T. Infarct scar: a dynamic tissue. Cardiovasc. Res.. 46(2):250-

256,

2000.

TAKEMURA, G

FUJIWARA, H

Morphological aspects of apoptosis in heart diseases.

J. Cell. Mol. Med.

10(1):56

-75, 2006.

TANG J.

;

XIE Q

PAN G

WANG J

WANG M. Mesenchymal stem cells participate in

angiogenesis and improve heart function in rat model of myocardial ischemia with

reperfusion.

Eur. J. Cardiothorac. Surg.

30(2):353

-61, 2006.

THEISE, N.D.; NIMMAKAYALU, M.; GARDNER, R.; ILLEI, P.B.; MORGAN, G.;

TEPERMAN, L.; HENEGARIU, O.; KRAUSE, D.S. Liver from bone marrow in

humans.

Hepatology

32(1):11

-16, 2000.

TOMA, C; PITTENGER, M.F; CAHILL, K.S.; BYRNE, B.J.; KESSLER, P. D. Human

mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in adult murine

heart.

Circulation

105: 93

-98, 2002.

117

TOMITA, S; LI, R.K; WEISEL, R.D.; MICKLE, D.A.G.; KIM E-J; SAKAI, T.; JIA, Z-

Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function.

Circulation

100 (Suppl): II

-247-25

6, 1999.

WANG, J.S.; SHUM-TIM, D.; GALIPEAU, J.; CHEDRAW,Y. E.; ELIOPOULOS, N.;

CHIU, R.C. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and potential

clinical advantages.

J. Thorac. Cardiovasc. Surg.

120(5):999

-1005, 2000.

WEISSMAN, I. L. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and

opportunities. Science

287:1442

-1446, 2000.

WERNECK

-CASTRO J.P

COSTA

-E-SOUSA R.H

DE OLIVEIRA P.F

PINHO-

RIBEIRO V

MELLO D.B

PECANHA R

MATTOS E

OLIVARES E. L

MAIA

A.C

MILL J.G

DOS SANTOS GOLDENBERG R.C

;

CAMPOS

CARVALHO

A.C.

G-CSF does not improve systolic function in a rat model of acute myocardial

infarction.

Basic Res. Cardiol. 10

1(6):494

-501, 2006.

WHETTON, A. D.; SPOONCER, E. Role of cytokines and extracellular matrix in the

regulation of haemotopoitec stem cells.

Curr. Opin. Cell. Biol

. 10:721

-726, 1998.

WILLEMS, I.E.; HAVENITH, M.G.; De MEY, J.G.; DAEMEN, M.J. The alpha-

smooth

muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. Am. J. Pathol. 145(4):

868-875, 1994.

WOLLERT K.C.; MEYER G.P.; LOTZ J.; RINGES-LICHTENBERG S.; LIPPOLT P.;

BREIDENBACH C.; FICHTNER S.; KORTE T.; HORNIG B.; MESSINGER D.;

ARSENIEV L.; HERTENSTEIN B.; GANSER A.; DREXLER H. Intracoronary

autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST

randomised controlled clinical trial

. Lancet

364(9429):141

148; 2004.

118

WOODBURY, D.; SCHWARZ, E.J.; PROCKOP, D.J.; BLACK, I.B. Adult rat and human

bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J. Neurosci. Res.

61(4):364

370,

2000.

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