RESUMO
As Junções Comunicantes (JC) desempenham um importante papel na
comunicação entre células nos diferentes sistemas do corpo humano. No
sistema imune, particularmente em Macrófagos, a presença e a funcionalidade
das JC, e a sua interação com Receptores P2X
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(R-P2X
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), estrutura
responsável pelo fenômeno de permeabilização, ainda é uma questão
controversa. Em função disto, resolvemos estudar estas questões. Para tanto,
foram utilizados Macrófagos Peritoneais de camundongos selvagens e
“knockout” para o receptor P2X
7
(Mφ e Mφ-P2X
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), e Células da linhagem
macrofágica J774-G8 (G8 e G8 ATP-resistentes [ATPr]) e J774-A1 (A1). A fim
de avaliar a funcionalidade das JC nestas células realizamos injeções de
corante com Lucifer yellow (457.2 Da). Os dados demonstraram que 70% dos
Mφ estavam acoplados, enquanto que apenas 5% das células A1 estavam
acopladas, diferentemente das células G8, que estavam acopladas a 84% das
células injetadas. No entanto, as células ATPr (que não sofrem
permeabilização) apresentavam apenas 9% das células acopladas, o que foi
confirmado ao utilizarmos os Mφ-P2X
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. Devido as diferenças funcionais, foram
feitos ensaios de RT-PCR, que demonstraram a mensagem para conexina43
(Cx43) em Mφ, células G8 e células ATPr. Ensaios de imunoeletrotransferência
foram feitos para verificar uma possível modificação na expressão da Cx43 e
do R-P2X
7
.
Os Mφ e as células G8 expressaram a Cx43 e o receptor P2X
7
,
enquanto que as células ATPr expressaram a Cx43, mas não o R-P2X
7
. Para
verificar a localização da Cx43 nas células G8 e ATPr, que apesar de não
estarem acopladas expressavam quantidades de Cx43 similares as das células
G8, foram realizados experimentos de imunofluorescência. A imunoreatividade
para Cx43 nas G8 se encontrava essencialmente na membrana plasmática.
Entretanto, nas ATPr a imunoreatividade estava presente majoritariamente no
citoplasma da célula, justificando os dados funcionais obtidos, e sugerindo uma
possível interação entre a Cx43 e o R-P2X
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, haja visto que esta célula não
expressa o R-P2X
7
, e não apresenta acoplamento. Para verifcar esta
suposição, foram feitos ensaios de microscopia confocal e co-
imunoprecipitação, que demonstraram, respectivamente, a presença da Cx43 e
do R-P2X
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no mesmo volume confocal em Mφ e em células G8, e interação
bioquímica das 2 proteínas nestas células, o que não foi observado nos Mφ-
P2X
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, através da microscopia confocal. No entanto, ao fazer os mesmos
experimentos para as células A1, observamos as duas proteínas presentes,
mas sem a interação ótica ou bioquímica. Com base neste resultado, as células
G8 e A1 foram utilizadas em Microarranjos de DNA, a fim de estudar as
interações moleculares demonstradas anteriormente. Os resultados
demonstraram que dos 1193 genes alterados nas células A1, 44% estavam
regulados negativamente, e deste total, 30% dos genes estão envolvidos com
proteínas que regulam a inserção ou funções das Cxs e dos R-P2. Portanto,
concluímos que as JC estão presentes e funcionais em Mφ e células G8, e
estão interagindo com R-P2X
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, o que pode estar sendo regulado por proteínas
que interagem com a Cx43 e R-P2X
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ao mesmo tempo, como observado nos
ensaios moleculares.