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PIETRO MAINENTI
CARCINOGÊNESE QUIMICAMENTE INDUZIDA POR
DMBA EM GLÂNDULAS SALIVARES SUBMANDIBULARES
DE RATOS (Rattus norvegicus)
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
MESTRE, pelo Programa de Pós-
Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL,
Área Biopatologia Bucal.
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PIETRO MAINENTI
CARCINOGÊNESE QUIMICAMENTE INDUZIDA POR
DMBA EM GLÂNDULAS SALIVARES SUBMANDIBULARES
DE RATOS (Rattus norvegicus)
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos, Universidade Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de
Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Biopatologia
Bucal.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Eduardo Blumer Rosa
São José dos Campos
2006
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Não posso dizer que cheguei ao meu destino.
Também não digo, simplesmente, que este é o começo.
O que sei é que o caminho é o mesmo de sempre.
Mas a partir de hoje, de agora,
enxergo com mais clareza o que existe à minha frente.
Acredito mais na direção e menos no tempo,
contemplando o que de bom meu caminho me oferece.
Pietro Mainenti
17-05-06
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, ANTONIO e GLADYS, pelo apoio irrestrito e
constante em todos os meus projetos de vida. Sua presença
abnegada e conforto emocional sempre estiveram ao meu alcance
nos primeiros sinais de necessidade e fraqueza.Obrigado.
Às minhas irmãs, SANDRA e LUISELLA, que sempre me
incentivaram a continuar minha formação acadêmica. Agradeço
pelos conselhos e, também, pelo amor e carinho sempre
presentes.
Ao meu tio IVERSON, pela sua presença cada vez mais
constante.
À minha namorada PATRÍCIA, pelo apoio à minha jornada
acadêmica. Agradeço a você por estar ao meu lado nesta
caminhada.
Aos meus padrinhos ADÉLIA e FERNANDO, por toda torcida
pelas minhas conquistas.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Prof. Adjunto LUIZ EDUARDO BLUMER ROSA,
academicamente meu orientador, meu mestre.
Sempre presente, zeloso e disponível para o trabalho a ser realizado.
Na vida real, meu amigo.
Pessoa sensível e leal.
Simplesmente agradeço.
Profª. Adjunta ROSILENE FERNANDES DA ROCHA,
por ter me acolhido quando da minha chegada à UNESP.
Por festejar meu sucesso mas também por apontar meus erros.
Muito obrigado.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, representada pelo Diretor da Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos, Prof. Dr. PAULO
VILELA SANTOS JÚNIOR, por possibilitar a realização desse
mestrado.
À Prof. Adjunta YASMIN RODARTE
CARVALHO, pelas sugestões, auxílios e colaboração durante a
realização deste curso.
Á Profa. Dra. ADRIANA AIGOTTI
HABERBECK BRANDÃO, pela orientação sempre acolhedora.
.
Às técnicas de laboratório MARIA SALETE
FARIA e ANA LOURDES DA SILVA MACHADO, pelo esmero
no preparo do material histológico.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação,
ROSEMARY DE FÁTIMA SALGADO, ERENA MICHIE
HASEGAWA e MARIA APARECIDA CONSIGLIO DE
SOUZA, pela atenção e disponibilidade.
À bibliotecária ÂNGELA DE BRITO BELLINI,
pela disponibilidade e paciência na revisão deste estudo.
Aos funcionários do Biotério, LOURIVAL
JACOB e ANTÔNIO DOMINGOS SÁVIO BARBOSA MAIA
VASCONCELOS pela colaboração na fase experimental desta
pesquisa.
Aos ANIMAIS EXPERIMENTAIS cujas vidas
foram sacrificadas em benefício do progresso da ciência, a eles o
meu profundo respeito.
A todos os COLEGAS DO PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO pelo agradável convívio e pela colaboração
direta ou indireta na realização deste estudo. Em especial,
FERNANDO AUGUSTO CERVANTES GARCIA DE SOUSA,
FLÁVIA CELINA SGARBI, MÔNICA DAL PIAN NOBRE,
RODRIGO DIAS NASCIMENTO, ELAINE DIAS DO
CARMO, ANDRESA DA COSTA PEREIRA, VANESSA
ÁVILA SARMENTO SILVEIRA.
À amiga ANGELA BOLANHO, que me inspirou
no tema deste trabalho. Sou muito grato por sua paciência e
dedicação em me auxiliar nas várias fases desta pesquisa.
Às amigas GISELLE SEGNINI SENRA e
CRISTINA WERKMAN que, cada uma à sua maneira,
contribuíram para a realização deste trabalho experimental.
Aos amigos e colegas cirurgiões
bucomaxilofaciais GUSTAVO SAGGIORO OLIVEIRA,
HERBERT MENDES MORAES e GLADSON DE SOUZA
GURGEL, pelo suporte dado aos meus pacientes e aos meus
plantões hospitalares em Juiz de Fora (MG).
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...................................................... 10
RESUMO ......................................................................................................... 12
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 13
2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................... 15
2.1 Carcinogênese ........................................................................................... 15
2.2 Carcinogênese química .............................................................................. 20
2.3 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos................................................... 21
2.4 Modelos animais para carcinogênese química em glândulas salivares...... 23
2.5 Carcinogênese experimental em glândulas salivares animais.................... 28
2.6 Respostas do hospedeiro às neoplasias induzidas quimicamente .............. 36
2.7 Neoplasias de glândulas salivares em humanos......................................... 37
2.7.1 Carcinoma de células escamosas ............................................................ 37
2.7.2 Sarcomas ................................................................................................. 38
2.7.3 Carcinossarcomas.................................................................................... 39
3 PROPOSIÇÃO.............................................................................................. 41
4 MATERIAL E MÉTODO ............................................................................ 42
4.1 Preparação dos animais.............................................................................. 43
4.2 Análise histológica..................................................................................... 45
4.3.Documentação fotográfica ......................................................................... 46
5 RESULTADOS............................................................................................. 47
5.1 Aspectos clínicos........................................................................................ 47
5.1.1 Quinta semana......................................................................................... 48
5.1.2 Décima semana ....................................................................................... 48
5.1.3 Décima quinta semana. ........................................................................... 49
5.1.4 Décima oitava semana ............................................................................ 50
5.1.5 Décima nona semana............................................................................... 51
5.1.6 Vigésima semana .................................................................................... 51
5.2 Macroscopia das peças cirúrgicas.............................................................. 52
5.3 Aspectos histopatológicos.......................................................................... 54
5.3.1 Quinta semana......................................................................................... 54
5.3.2 Décima semana ....................................................................................... 57
5.3.3 Décima quinta semana ............................................................................ 62
5.3.4 Décima oitava semana ............................................................................ 66
5.3.5 Décima nona semana............................................................................... 67
5.3.6 Vigésima semana .................................................................................... 67
6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 71
7 CONCLUSÃO .............................................................................................. 82
8 REFERÊNCIAS............................................................................................ 84
ANEXOS ........................................................................................................ 92
ABSTRACT....................................................................................................... 94
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
cm Centímetro
CYP1A1 Gene que codifica enzima de detoxificação da família
do citocromo CYP
CYP1B1 Gene que codifica enzima de detoxificação da família
do citocromo CYP
DMBA 7,12-dimetilbenzantraceno ou 9,10-dimetil 1,2-
benzantraceno
DNA do inglês “Desoxyribonucleic acid”, traduzido como
ácido desoxirribonucléico
EGF do inglês “Epidermal Growth Factor”, traduzido como
fator de crescimento epidérmico
FGF do inglês “Fibroblast Growth Factor”, traduzido como
fator de crescimento fibroblástico
FOSJC Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
p16 gene p16
p53 gene p53
Rb gene do retinoblastoma
g Grama
H/E Hematoxilina e Eosina
IM intra-muscular
µl Microlitros
µm Micrômetro
ml Mililitros
mg Miligramas
mm
3
milímetro cúbico
OMS Organização Mundial de Saúde
PAH do inglês “Polycyclic Aromatic Hydrocarbons”,
traduzido como Hidrocarboneto Policíclico Aromático
pH medida da acidez de uma solução – p: potencial e h:
hidrogênio
ppm partes por milhão
PVPI polivinil pirrolidona iodo 1%
ras
do inglês “ra
t sarcoma”, traduzido como sarcoma do
rato. Constitui uma família de genes identificada em
vírus que causam sarcomas em ratos (H-ras, K-ras e
N-ras)
RNA do inglês “Ribonucleic Acid”, traduzido como ácido
ribonucléico
UNESP Universidade Estadual Paulista
% porcentagem
Ø diâmetro em milímetros (entre 0,35 e 0,40mm)
referente a fio cirúrgico
MAINENTI, P. Carcinogênese quimicamente induzida por DMBA
em glândulas salivares submandibulares de ratos (rattus
norvegicus).2006.94f. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal,
área Biopatologia Bucal)- Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista, São José dos Campos, 2006.
RESUMO
A carcinogênese consiste em um processo de alterações genéticas após contato
celular com agentes físicos, químicos ou biológicos. Esta interação pode culminar
em manifestações de fenótipos malignos celulares. No estudo experimental da
carcinogênese em glândulas salivares animais, os autores são unânimes em
apontar os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) como potentes agentes
carcinogênicos. O 7,12 – dimetilbenzantraceno (DMBA), pertencente ao grupo
dos HPA, é considerado o carcinógeno químico de eleição para a tumorigênese de
glândulas salivares animais. Este trabalho visou o estudo de DMBA injetado em
glândulas salivares submandibulares de ratos. Foram utilizados 28 ratos (Rattus
norvegicus), com três meses de idade e peso aproximado de 300g. Os animais
foram divididos em quatro grupos de sete indivíduos. Após anestesia, tricotomia e
anti-sepsia as glândulas submandibulares esquerdas de todos os animais foram
expostas por incisão cervical anterior. Utilizando-se seringa de 1,0 ml injetou-se
0,1 ml de solução de DMBA/acetona à 2% naquelas glândulas. O plano epitelial
foi suturado com seda preta 3-Ø. Ao final da 5ª, 10ª, 15ª, e 20ª semanas os animais
foram sacrificados utilizando-se doses letais da solução anestésica/relaxante. Os
resultados revelaram, na 5ª semana, sete casos de sialadenite crônica. Na 10ª
semana, um caso com atipia celular ductal, dois casos de carcinoma epidermóide e
quatro de sialadenite crônica. Entre a 15ª e 20ª semanas, foram observados três
casos de hiperemia, três casos de carcinoma epidermóide, um caso de sarcoma e
sete casos de carcinossarcoma. A análise dos dados, em porcentagem, revelou:
3,6% de atipia celular, 3,6% de sarcoma, 10,7% de hiperemia, 17,9% de
carcinoma epidermóide, 25% de carcinossarcoma e 39,4% de sialadenite crônica.
Conclusão: Os dados obtidos permitiram o estudo da história natural da
carcinogênese glandular por DMBA desde os processos inflamatórios iniciais até
à formação de neoplasias mesenquimais, epiteliais e mistas.
PALAVRAS-CHAVE: Carcinogênese; glândulas salivares; DMBA, neoplasias.
1 INTRODUÇÃO
Os efeitos de produtos industriais e do meio ambiente
nos seres vivos parecem ter sido notados primeiramente no homem.
No século XVI descobriu-se que mineradores das regiões européias de
Schneeberg e Joachimstal encontravam-se doentes. Somente após
trezentos anos tornou-se claro o quadro clínico destes mineradores.
Tratava-se de câncer pulmonar, provavelmente causado por urânio e
seu subproduto radônio, presentes em minas de prata e cobalto
(WEISBURGER
35
, 1994).
No século XVIII, Percival Pott teceu observações
associando o câncer de pele do escroto à atividade laborativa dos
limpadores de chaminé. Hill, outro estudioso, vinculou o uso de rapé
aos carcinomas nasais. Mas somente no século XX que a
carcinogênese química experimental com animais de laboratório foi
desenvolvida (RODRIGUES & CAMARGO
24
, 1999).
As descobertas advindas das observações de ocorrência
de neoplasias humanas associadas às substâncias químicas e riscos
ocupacionais, culminaram na descoberta dos hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPA). Estas substâncias, produtos da
combustão incompleta de combustíveis fósseis, principalmente, foram
reconhecidas como compostos de considerável potencial
carcinogênico (WOOLF
38
, 1998).
Os primeiros experimentos controlados com animais e
carcinógenos químicos foram conduzidos por pesquisadores japoneses
em 1918 (SHKLAR
27
, 1970; EL-MOFTY
8
, 1977). O uso de órgãos-
alvo, como as glândulas salivares, somente ocorreu em 1942, com
Steiner (STANDISH
28
, 1957; CATALDO et al.
3
, 1964; SHKLAR
27
,
1970; EL-MOFTY
8
, 1977).
O estudo da carcinogênese quimicamente induzida em
glândulas salivares tem como agente mais utilizado o DMBA (9,10-
dimetil 1,2-benzantraceno ou 7,12-dimetilbenzantraceno). Este
composto faz parte do elenco dos HPA. Pode ser utilizado na forma de
pellet ou na forma de solução em diferentes veículos como vaselina e
acetona. Os animais pesquisados são, em sua maioria, ratos e hamsters
(CHAUDHRY et al.
5
, 1966; TURBINER et al.
34
, 1969; HINDY et
al
17
, 1995). Sumitomo et al.
30
(1996) realizaram experimentos, por
meio de implantação, em glândulas submandibulares de ratos, de
esponja embebida em DMBA a 1%.
Existe uma marcada discordância na metodologia de
carcinogênese quimicamente induzida em glândulas salivares animais.
Também há incongruência no que se refere aos resultados encontrados
pelos autores que estudam esta linha de pesquisa. O presente trabalho
tem por objetivo estudar o modelo de carcinogênese química em
glândulas submandibulares de ratos. Os achados clínicos dos animais
e os aspectos macroscópicos e microscópicos das peças cirúrgicas
foram valorizados. Por meio de padronização da metodologia de
injeção de DMBA, pretendeu-se avaliar e discutir os padrões
histológicos encontrados, na intenção de fornecer dados concretos
para estudos vindouros.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Carcinogênese
Um agente carcinogênico é qualquer fator que aumente
o risco individual para o desenvolvimento de uma neoplasia
(WOOLF
38
, 1998). Segundo Rodrigues & Camargo
24
(1999), os
termos carcinogênese ou oncogênese se referem à história natural de
uma neoplasia, desde os eventos incipientes de alteração genotípica de
uma célula normal até as apresentações fenotípicas tumorais. A
carcinogênese pode ocorrer após contato celular com carcinógenos
químicos (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, metais), físicos
(raios ultravioleta, radiação ionizante) e biológicos (vírus).
Em 1947, Berenblun & Shubik
*
, formularam seus
conceitos de iniciação e promoção de tumores ao estudarem,
experimentalmente, tumores em pele de camundongos. Naquela época
sugeriu-se a idéia de interação de um agente carcinogênico como
iniciador e uma substância promotora não carcinogênica. Os exemplos
utilizados se referiam ao DMBA e óleo de cróton, respectivamente.
Atualmente, aqueles conceitos ainda são válidos.
Algumas novas descobertas se somaram aos dados iniciais. Assim, à
luz do conhecimento moderno, a carcinogênese completa requer
etapas seqüenciais e dinâmicas para o desenvolvimento de tumores.
*
BERENBLUM, I; SHUBIK, P. A new qualitative approach to the study of the stages of
chemical carcinogenesis in the mouse’s skin. Br J Cancer, p.383-91, 1947.
Os conceitos de iniciação, promoção, progressão e manifestação
constituem os eventos que marcam as transformações celulares
(RODRIGUES & CAMARGO
24
, 1999).
O contato das células com um agente carcinogênico
não leva à imediata subversão celular e tecidual. A primeira etapa,
conhecida pelo termo iniciação, se traduz pela alteração definitiva do
material genético celular (DNA). O carcinógeno pode modificar ou até
destruir genes, mas a população celular se mantém inalterada. Um
agente promotor carcinogênico ou não, induz a divisão celular no
tecido iniciado. O fenômeno de progressão amplia o contingente
celular por perda de controle multiplicativo, estabelecendo a
manifestação do fenótipo maligno (FRANKS
12
, 1990).
A ativação dos HPA ocorre pelo sistema enzimático do
citocromo P-450, do compartimento microssômico hepático, por meio
do receptor aril hidrocarboneto. Este receptor é responsável por
mediar os efeitos tóxicos, teratogênicos e oncogênicos dos HPA,
sendo a primeira etapa do metabolismo destas substâncias
(RODRIGUES & CAMARGO
24
, 1999; IDE et al.
19
, 2004).
A ação do sistema P-450 sobre o DMBA,
sucintamente, é marcada pela oxidação deste carcinógeno em 3,4-
epóxido. Uma hidrólise se segue, formando a substância 3,4-diol. O
sistema P-450 novamente é acionado e por oxidação forma o 3,4-diol-
1,2-epóxido. As enzimas que participam destes eventos são a
CYP1A1 e a CYP1B1, sendo esta última, de intensa expressão em
carcinogênese de pele e de glândulas salivares de camundongos. O
3,4-diol-1,2-epóxido tem a capacidade de interagir com o DNA
causando mutações (IDE et al.
19
, 2004).
Faz-se mister estabelecer o conceito de mutação. Por
meio do fenômeno de tautomerismo, as unidades elementares do
DNA, denominadas bases nitrogenadas, podem sofrer permuta interna
de radicais ou troca de ligações químicas modificando suas
propriedades e forma original. Todavia, este acontecimento não é
responsável por alterações na fita de DNA uma vez que, em perfeito
funcionamento, a duplicação do material genético se utiliza
preferencialmente das bases originais. Se, por acaso, as formas
tautoméricas forem utilizadas, a alteração pode ser aceita e até trazer
vantagens seletivas entre indivíduos de mesma espécie. Entretanto,
alterações de pH ou agentes químicos podem resultar em pareamento
incorreto de bases, refletindo em erros na transcrição do DNA ou
RNA. Outro dano mutagênico importante é a ação de agentes
exógenos, como substâncias químicas orgânicas ou inorgânicas e
irradiação por raios-X. Nas interações entre estes agentes e o DNA há
uma reação hidrolítica entre a água e o DNA ou clivagem do esqueleto
de DNA, culminando em agressões permanentes às informações
genéticas (GRIFFIN
16
, 1990).
Os genes responsáveis pela manifestação de neoplasias
são denominados oncogenes. A família de genes ras é reconhecida em
muitas neoplasias (H-ras, K-ras e N-ras). Conforme Rodrigues &
Camargo
24
(1999), o nome ras vem de rat sarcoma. Os oncogenes,
antes de se tornarem ativados são conhecidos como proto-oncogenes.
Em carcinogênese química participam tanto os oncogenes como os
genes supressores de tumor p53 e Rb (retinoblastoma) (STANLEY
29
,
1995).
Os mecanismos genéticos em carcinogênese
experimental de glândulas salivares não foram completamente
elucidados (STANLEY
29
, 1995; BALMAIN & HARRIS
2
, 2000; IDE
et al.
18
, 2002). Em se tratando de neoplasias induzidas em pele, mama,
pulmão, fígado, bexiga e cólon de camundongos, a família de
oncogenes ras encontra-se sempre envolvida
(STANLEY
29
, 1995;
BALMAIN & HARRIS
2
, 2000). As alterações em pele de
camundongos após exposição ao DMBA causam mutação no códon
61 alterando o gene H-ras (STANLEY
29
, 1995; BALMAIN &
HARRIS
2
, 2000; IDE et al.
18
, 2003).
Em neoplasias de camundongos, conforme apontam
Balmain & Harris
2
(2000), pode-se esperar recombinações mitóticas e
perda de heterozigose e mutação no gene p53, Rb e deleção de p16
homozigoto. O mesmo mecanismo é comparável ao da espécie
humana.
O gene p53 desempenha papel crucial no controle do
câncer. Mutações neste gene apontam para um prognóstico ruim em
pacientes com tumores glandulares (IDE et al.
18
, 2002). Segundo
Stanley
29
(1995), o gene p53 tem a capacidade de parar a divisão
celular e promover uma verificação do DNA. Em algumas doenças
como a síndrome de Li-Fraumeni, há a mutação de um alelo do gene
p53. Os pacientes com esta enfermidade podem apresentar tumores
mamários, carcinomas adrenocorticais, sarcomas e osteossarcomas,
tumores de sistema nervoso e leucemia.
Ide et al.
18
(2002), desenvolveram uma pesquisa com
camundongos apresentando certas características particulares. Os
animais foram geneticamente alterados para apresentar deficiência em
genes p53. Um grupo era constituído de dois alelos sem expressão de
gene p53. Outro grupo apresentava somente um gene ativo. Um
terceiro grupo, formado de cepas selvagens, apresentava expressão
genética de p53 de maneira dominante. Os animais dos três grupos
receberam uma injeção intra-glandular de 1mg de DMBA. Os achados
desta pesquisa revelaram a presença de neoplasias em 100% dos
camundongos que apresentavam total falta de expressão do gene p53.
Sob expressão parcial deste gene, 70% dos animais revelaram tumores
glandulares. Os animais com genética dominante foram acometidos de
neoplasmas somente em 10% dos casos.
Para Balmain & Harris
2
(2000), apesar das diferenças
óbvias entre humanos e roedores, com raras exceções, as neoplasias e
seu desenvolvimento em diversas regiões mostram interessante
similaridade histológica. Estes autores conferem aos camundongos um
bom exemplo animal para estudo. A rapidez na formação de tumores
nesses animais parece estar associada à ocorrência maior de falhas no
reparo do DNA após uso de carcinógenos. Além do mais, células
tumorais de camundongos parecem se imortalizar mais facilmente. As
células humanas, após alguns ciclos mitóticos, chegam a senescência e
morrem. Este evento se processa principalmente por inabilidade da
enzima telomerase em manter a integridade cromossômica durante
várias divisões.
2.2 Carcinogênese química
A carcinogênese química, segundo apreciações
retrospectivas de dados epidemiológicos históricos, parece remontar o
século XVI. As evidências de envolvimento do meio ambiente e de
produtos industriais em carcinogênese foram primeiramente
observadas em seres humanos. Dos primeiros indícios destas
associações citam-se as descrições de Paracelsus e Agricola que
pesquisaram a doença pulmonar em mineiros da região de Schneeberg
e Joachimstal, na Europa. Somente trezentos anos após estas
observações é que o diagnóstico de neoplasia pulmonar foi sugerido
acreditando-se na presença de urânio e seu subproduto, o radônio, nas
minas de cobalto e prata daqueles lugares (WEISBURGER
35
, 1994).
Em 1775, Percival Pott, observando o alto índice de
câncer de pele de escroto de limpadores de chaminé apontou para a
inter-relação entre o contato crônico com o alcatrão e a ocorrência de
neoplasias (WIGLEY
36
, 1990)
Rodrigues & Camargo
24
(1999) asseveram que entre
70% a 80% dos tumores humanos se relacionam com fatores
ambientais, reforçando os apontamentos de Wigley
36
(1990) e
Weisburger
35
(1994).
Uma vez que a espécie humana, no mundo moderno,
entra em contato inevitável com uma infinidade de substâncias
químicas, testes com produtos químicos se fazem necessários. A
indução de tumores pelo uso de substâncias oncogênicas é
considerada uma ferramenta experimental essencial para o estudo da
carcinogênese e, também, para testes de drogas e processos industriais
direcionados à alimentação (FRANKS
12
, 1990; FASSONI et al.
11
,
1993).
Os estudos controlados com cobaias, utilizando
carcinógenos, têm como grupo de maior uso os hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos. O DMBA, entre outros, pertence a este grupo.
Segundo os apontamentos de Odukoya & Shklar
22
(1984), o uso de
carcinogênese química deve, necessariamente, utilizar duas
substâncias. Uma delas deve ser carcinogênica e, portanto, iniciadora
e a outra, promotora. Estes autores não consideram o uso do
carcinógeno DMBA como substância capaz de responder pelas etapas
de iniciação e promoção. Entretanto, Fassoni et al.
11
(1993) asseveram
ser o DMBA um carcinógeno completo, respondendo pelas etapas de
iniciação, promoção e progressão, em oncogênese de mucosa bucal de
hamsters.
2.3 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
A revolução industrial proporcionou significativas
mudanças no modo de vida das pessoas daquela época. Todavia,
muitas atividades profissionais trouxeram riscos ocupacionais por
contato com substâncias químicas de potencial oncogênico. O uso do
alcatrão e de óleos lubrificantes levou ao reconhecimento de
carcinógenos denominados hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(WOOLF
38
, 1998).
Conforme Woolf
38
(1998), somente em 1915 se
relacionou o alcatrão ao tumor de pele em pesquisa experimental.
Todavia Skhlar
27
(1970) afirmou ter ocorrido em 1918, por meio das
experiências de Yamagiwa e Ichikawa, a indução de tumores de pele
com uso de alcatrão.
Woolf
38
(1998) comenta que após estas pesquisas
descobriu-se o 1,2 – benzantraceno por meio da destilação incompleta
do alcatrão. Esta substância provou ser um carcinógeno fraco.
Somente após 1930, Sir Ernest Kennaway e colaboradores isolaram o
3,4 – benzopireno, potente carcinógeno. Este composto está presente
no cigarro e na fumaça exaurida de motores a gasolina. Pertencem ao
grupo dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos o 7,12 –
dimetilbenzantraceno, o 3,4–benzopireno, o 1,2,5,6 – dibenzantraceno
e o 3 – metilcolantreno. Fassoni et al.
11
(1993) somam a este grupo o
4-quinolina 1-óxido (4NQO).
Conforme cita El-Mofty
8
(1977), Shafer, em 1962,
utilizou vários carcinógenos policíclicos aromáticos, sob forma de
implantes, em glândulas salivares de ratos. Suas conclusões o levaram
a considerar o DMBA como o mais potente carcinógeno utilizado.
Sumitomo et al.
30
(1996) consideraram o DMBA como
o mais potente carcinógeno, atuando tanto como iniciador quanto
como promotor.
Para Ogawa et al.
23
(2000), tratando-se de
tumorigênese induzida de glândulas salivares, o DMBA é o melhor
agente carcinógeno. Isto ocorre, pois ele é um potente indutor de
lesões em curto espaço de tempo.
O DMBA é considerado por IDE et al.
19
(2004) o
carcinógeno mais bem estudado e utilizado em carcinogênese
experimental.
2.4 Modelos animais para carcinogênese química em glândulas
salivares
O modelo experimental de tumor em pele de
camundongos é tido como paradigma de carcinogênese, servindo ao
estudo de promoção e progressão neoplásica. Outros animais, ou suas
cepas, são necessários quando a intenção é o estudo de oncogênese em
órgãos específicos. O camundongo cepa A se apresenta como
principal modelo para neoplasias pulmonares por meio do uso dos
HPA. Os ratos figuram como outro exemplo para a realização de
carcinogênese em rins, bexiga, pâncreas, estômago, intestino
(ENZMANN et al.
10
, 1998).
Experimentalmente, o desenvolvimento de câncer
bucal e maxilofacial se presta ao estudo dos mecanismos que
envolvem o desenvolvimento de tumores em humanos. Existem
metodologias direcionadas aos tumores de lábio, língua, cavidade
bucal e nasal. Os animais mais utilizados são os hamsters Sírios
dourados. As lesões tumorais em glândulas salivares requerem o uso
de ratos (ENZMANN et al.
10
, 1998).
Os ratos foram objeto de estudo de Cataldo et al.
3
(1964), na intenção de padronização de uma metodologia de implante
de DMBA na forma de pellets.
Chaudhry et al.
5
(1966) escrutaram as diferenças entre
carcinogênese química em glândulas salivares de hamsters e de ratos.
Seu experimento contou com uso de DMBA associado a
propilenoglicol na forma de pellets de 1mm
3
. A concentração de
DMBA utilizada para todos os animais foi de 0,2; 0,4 e 0,8mg, ou
seja, 5%, 10% e 20%. Os autores concluíram que hamsters somente
desenvolvem sarcomas. Os ratos apresentaram mais carcinomas em
relação a ocasionais sarcomas, perfazendo a proporção de 2,5:1.
Quanto maior a concentração de carcinógeno, maior a incidência de
neoplasias, sendo carcinomas em ratos e sarcomas em hamsters. Outra
conclusão importante estava relacionada a falta de dados no que
concerne ao mesmo experimento por meio de injeção direta de DMBA
nas glândulas.
Em 1969, Schmutz & Chaudhry
25
desenvolveram
estudo no qual injetaram DMBA em solução vaselinada, em glândulas
submandibulares de ratos. Sob concentrações de 1% e volume
variando de 0,025ml a 0,05ml, 38% a 45% dos animais pesquisados,
em vários grupos, desenvolveram carcinomas. Um animal recebeu
1,5% em 0,05 ml, desenvolvendo fibrossarcoma bem diferenciado.
Todavia, o uso de 0,05ml de solução de DMBA a 2% produziu
tumores em 100% dos animais. Dois ratos apresentaram carcinomas
concomitantes a fibrossarcomas. Metástases não foram observadas.
Pesquisas realizadas por Turbiner & Shklar
34
(1969)
utilizando pellets puros de DMBA, em três espécies distintas de ratos,
não revelaram alterações significativas entre elas. Os autores
utilizaram ratos Sprague-Dawley, Long-Evans e Wistar e ao final de
13 semanas de estudos todos os ratos apresentaram somente
carcinomas.
Segundo Wigley & Carbonell
37
(1976), pode-se utilizar
DMBA sob forma de emulsão. Ao DMBA deve ser adicionada
acetona. A emulsão é preparada com KY gel, solúvel em água. Os
animais utilizados para esta metodologia são camundongos. Estes
podem receber 0,05 ml (2mg) de emulsão, por via per cutânea, até as
glândulas salivares.
Conforme verificou El-Mofty
9
(1978), o estudo de
carcinogênese experimental em glândulas submandibulares tornou-se
uma metodologia sedimentada para a pesquisa de tumores
glandulares. A fim de estudar a tumorigênese em outros parênquimas
glandulares, este autor preconizou a implantação de pellets de DMBA
em glândula parótida de ratos Fisher. Os passos cirúrgicos seguiram
os apontamentos de Cataldo et al.
3
(1964), a não ser pela incisão
cervical que foi desenhada de forma semilunar, ao invés de retilínea
mediana. Os ratos receberam implantes de DMBA a 5%. Durante
vinte semanas, este pesquisador obteve cada vez menos tumores a
partir da décima semana, conforme se processavam os sacrifícios.
Suas conclusões sugeriram uma regressão espontânea tumoral
possivelmente associada à glândula parótida. Todos os tumores
obtidos foram carcinomas de células escamosas.
Takai et al.
31
(1984) conduziram pesquisa com injeção
de 0,02mg de DMBA em óleo de oliva, nas glândulas
submandibulares de camundongos submetidos a crioterapia e
laqueadura de artéria e ducto glandular. Os autores diagnosticaram
carcinomas e sarcomas em combinação ou isoladamente. Também
encontraram fibrossarcomas e um caso, até então não relatado na
literatura, de adenoma pleomórfico com transformação maligna.
Hindy et al.
17
(1995), desenvolveram um levantamento
histórico das metodologias de utilização de DMBA. Conforme suas
verificações, os animais passíveis de pesquisas experimentais foram
os coelhos, os ratos, os hamsters e os camundongos. A glândula
submandibular foi tida como objeto de estudo devido às suas
proporções e fácil localização. O DMBA foi associado a algumas
substâncias (acetona, vaselina, uma mistura de acetona a 10% em
água destilada e geléia KY). As variadas concentrações foram
injetadas, com ou sem exposição cirúrgica. Para estes autores as
soluções utilizadas podem conter desde 0,05ml/0,1% (0,05mg) até
0,05ml/4,0% (2mg) de DMBA. Contudo, as suas pesquisas foram
desenvolvidas com pellets de 1g de DMBA implantados em
submandibulares de camundongos DDY, após acesso cirúrgico. Seus
resultados apontaram para a ocorrência de carcinomas epidermóides e
somente dois casos de neoplasias semelhantes ao adenoma
pleomórfico.
Sumitomo et al.
30
(1996) afirmaram que as pesquisas
com carcinogênese em glândulas salivares animais são capazes de
induzir neoplasias em 55 a 80% dos casos. Os tumores mais comuns
são carcinomas e fibrossarcomas. Os métodos de indução podem ser
realizados por injeção de DMBA em solução oleosa ou por
implantação de pellets ou esponja contendo DMBA. Segundo estes
autores, a desvantagem da injeção de carcinógeno se dá pela
dificuldade em localizar o exato local de colocação da droga no estudo
histopatológico. Contudo, a vantagem é a fácil utilização da
metodologia. Em relação às células responsivas ao carcinógeno, foi
evidenciado a marcação de PCNA em estruturas ductais e císticas
neoformadas. Fato que, conforme estes pesquisadores, raramente
ocorre em parênquimas glandulares normais.
As pesquisas de Zaman et al.
40
(1996) revelaram um
fato interessante. Utilizando ratos e ratas Wistar, foi aplicado, por
exposição direta das glândulas submandibulares, 0,05 ml de DMBA a
1% em acetona, duas vezes por semana. Todos os animais
desenvolveram neoplasias. Estes autores descreveram a indução de
adenocarcinomas em 100% das ratas que receberam injeções de
DMBA, estando estas lesões associadas a fibrossarcomas, em 50%
dos casos. Os ratos, todavia, desenvolveram fibrossarcomas. Somente
um caso de carcinoma foi verificado. Estes autores concluíram que a
diferença de gêneros contribui para a ocorrência de respostas
diferentes entre animais.
O uso de DMBA dissolvido em acetona, conforme os
apontamentos de Tsujimoto et al.
33
(1999), em uma única injeção de
50µl (1mg) de solução de DMBA a 1%, em camundongos ICR, foi
suficiente para que os animais apresentassem carcinomas. Suas
pesquisas imunoistoquímicas, para descobrir o papel do fator de
crescimento epidérmico (EGF), na tumorigênese de carcinomas,
contudo, não lograram resultado.
Os apontamentos de Ogawa et al.
23
(2000),
determinaram que uma única aplicação de 1% DMBA, dissolvido em
acetona, em ratos, só é capaz de produzir carcinomas e sarcomas.
Contudo, uma segunda injeção, após dois meses da primeira, é
suficiente para ocorrerem adenocarcinomas.
Na tentativa de descobrir fatores endógenos que
promovam a indução de tumores experimentais, Yura et al.
39
(2001)
pesquisaram a carcinogênese por injeção de DMBA em camundongos
ICR e marcação imunoistoquímica para fator de crescimento
fibroblástico (FGF) e para EGF. Eles concluíram que o EGF não
desempenha qualquer papel na carcinogênese em comparação ao FGF
que demonstrou marcação nas primeiras fases da história natural dos
carcinomas.
2.5 Carcinogênese experimental em glândulas salivares animais
Os estudos primordiais de tumorigênese em glândulas
salivares ocorreram em 1910, com Löwenstein. Entretanto, somente
após a utilização de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos as
pesquisas se tornaram efetivas (STANDISH
28
, 1957; CATALDO et
al.
3
, 1964; SHKLAR
27
, 1970).
Conforme verificou El-Mofty
8
(1977), Benecks e
Schroder produziram neoplasias malignas em ratos, em 1939, com uso
de benzopireno. Em 1942, Steiner obteve sucesso em induzir
carcinomas epidermóides e adenocarcinomas. Ele fez uso de implantes
de carcinógeno químico denominados pellets, em glândulas
submandibulares de ratos, camundongos, hamsters e coelhos.
(STANDISH
28
, 1957; CATALDO et al.
3
, 1964; SHKLAR
27
, 1970).
Estudos realizados por outros autores, após os
apontamentos de Steiner, revelaram resultados por vezes muito
diferentes. Concluiu-se que variados carcinógenos, aplicados sob
metodologias diferentes em animais também diferentes resultavam em
achados neoplásicos distintos, devido às inerências dos animais
(STANDISH
28
, 1957; CHAUDHRY et al.
5
, 1966; TURBINER &
SHKLAR
34
, 1969; SHKLAR
27
, 1970; TAKEUCHI et al.
32
, 1975; EL-
MOFTY
8
, 1977).
Segundo Standish
28
(1957), Steiner acreditou que a
origem das neoplasias glandulares, induzidas quimicamente por ele,
ocorrera por metaplasia acinar e ductal. Em 1950, Bauer e Byrne
apontaram para uma histogênese ligada às células ductais intercalares
e mioepiteliais. Gross, em 1953, afirmou acreditar em uma origem
neoplásica a partir de células mioepiteliais sem, contudo, apresentar
detalhes histopatológicos de seus experimentos.
Uma vez que Standish
28
(1957) não se mostrava
satisfeito com as pesquisas conduzidas até sua época, por falta de
referências histogenéticas nos artigos sobre carcinogênese em
glândulas, este autor iniciou um estudo focado nas transformações
histológicas dos tecidos até o aparecimento de tumores. Assim sendo,
ele descreveu detalhadamente as fases de formação de neoplasias após
a implantação de pellets de metilcolantreno e DMBA associados à
parafina. Conforme descreveu este autor, as superfícies ventrais
cervicais de ratos foram incisadas para a colocação dos implantes nas
glândulas submandibulares unilateralmente. As alterações histológicas
iniciais apontaram para uma resposta de células gigantes
multinucleadas ao redor do pellet. O DMBA pareceu suscitar uma
reação conjuntiva mais marcante, com intensa atividade fibroblástica e
abscessos. Alguns animais chegaram a apresentar fibrossarcomas. As
alterações parenquimatosas iniciais foram exíguas. Contudo, este
autor revelou aspectos de proliferação ductal, seguidos de metaplasia
escamosa, formação de cistos epidermóides ceratinizados e carcinoma
epidermóide. As conclusões deste trabalho indicaram que as
neoplasias se originaram dos ductos estriados e, ainda, que o
metilcolantreno é um carcinógeno lento, ao passo que o DMBA se
mostrou de ação rápida.
O modelo de carcinogênese química fazendo-se uso de
pellets de DMBA também foi utilizado por Cataldo et al.
3
(1964).
Estes autores apresentaram dados que complementam as pesquisas de
Standish
28
(1957). Para eles a incisão cervical anterior deve ser
realizada obtendo-se aproximadamente 3,0 cm. A glândula
submandibular após exposição deve receber um implante de 5mg de
DMBA em pó.
Conforme verificaram Cataldo et al.
3
(1964), após uma
semana, as incisões e leitos cirúrgicos dos ratos que receberam
implantes de DMBA em seus estudos apresentaram-se fechados.
Pequenas massas foram verificadas interessando as glândulas
operadas. Somente após três meses as massas foram identificáveis,
aumentando volumetricamente as regiões glandulares. As peças
excisionadas revelaram, após hemissecção, glândulas com lesões
sólidas e lesões císticas.
A história natural dos tumores induzidos por DMBA
em pellets, conforme Cataldo et al.
3
(1964) pode ser verificada por
meio de etapas bem demarcadas histologicamente. Estes autores
dividiram os eventos da carcinogênese nomeando suas fases.
Inicialmente, se apresentou uma fase degenerativa na qual ocorreu
necrose por coagulação das células ao redor do pellet e intensa reação
inflamatória. Também ocorreu apagamento dos elementos acinares e
persistência dos ductos. O implante do carcinógeno foi circundado por
necrose tecidual reparada a posteriori por tecido conjuntivo. Estas
manifestações histopatológicas foram esperadas nas primeiras quatro
semanas de pesquisa.
A fase seguinte, denominada fase proliferativa por
Cataldo et al.
3
(1964), consistiu em proliferação de epitélio ductal,
formação de cavidades císticas e achados histológicos de displasias
epiteliais, principalmente de ductos estriados. A presença de grande
estroma hialinizado conteve elementos carcinomatosos, delineando a
imagem negativa do pellet. O reconhecimento de metaplasia escamosa
das paredes císticas, aposição de camadas de células epiteliais e
profusão na produção de ceratina evidenciou a terceira fase,
denominada fase metaplásica.
A etapa final, denominada fase neoplásica maligna,
revelou a presença de carcinomas epidermóides caracterizados por
células grandes e bizarras, hipercromáticas e com perda de polaridade
e coesão. Os tumores epiteliais encontrados foram carcinomas
epidermóides e adenocarcinomas. Em seus achados somente um caso
de sarcoma foi diagnosticado, apresentando-se muito pleomórfico e
invasivo. Contudo, sua história natural não foi elucidada (CATALDO
et al.
3
, 1964).
Os estudos de Turbiner & Shklar
34
(1969) e Shklar
27
(1970) confirmaram a ocorrência de certos eventos na carcinogênese
induzida por implantes de DMBA. Para estes autores, a tumorigênese
por DMBA em glândulas salivares se apresentou como um modelo
experimental bem documentado, verificando-se as fases histológicas
reportadas por Cataldo et al.
3
(1964).
Em 1975, Takeuchi et al.
32
desenvolveram um estudo
com vários carcinógenos injetados em ductos de glândulas salivares
submandibulares de ratos machos da espécie Donryu. Eles foram
capazes de estudar, com o uso de DMBA, as metaplasias escamosas
em glândulas salivares submandibulares de ratos até a ocorrência de
carcinomas após três a quatro meses de pesquisa. Após sete a oito
meses, os sarcomas se mostraram bem evidentes. Outros carcinógenos
como o metilcolantreno e o 4NQO, formaram lesões linfoepiteliais
após três meses. Lesões compatíveis com adenoma pleomórfico
ocorreram entre o quarto e o quinto mês. Em estágios mais avançados
foram observados carcinomas e fibrossarcomas. Exíguas alterações
histopatológicas foram verificadas com o uso de substâncias não
pertencentes ao grupo dos HPA.
Foi idealizada por Wigley & Carbonell
37
(1976),
pesquisa com indução de neoplasias por DMBA, por meio de injeção
per cutânea, em glândulas salivares submandibulares de
camundongos. Estes autores observaram a ocorrência de carcinomas e
fibrossarcomas. Contudo, estes achados foram interpretados como
tumores independentes. Para estes autores as células responsivas ao
carcinógeno foram as células ductais.
O achado de autores clássicos, no que tange a
carcinogênese de glândulas salivares animais, se revelou muito bem
documentado em relação aos eventos histológicos da história natural
das neoplasias em ratos, conforme El-Mofty
8
(1977). Entretanto, para
ele, o conhecimento das alterações celulares e histoquímicas desde os
primórdios das lesões até às manifestações de carcinomas ainda
necessitava de pesquisas. Assim sendo, este estudioso iniciou um
experimento utilizando DMBA a 5%, na forma de pellet, em glândulas
submandibulares de ratos Fisher. Os animais foram sacrificados a cada
quatro semanas, perfazendo 20 semanas. Seus resultados apontaram
para a presença de glicoproteínas neutras e mucopolissacarídeos nas
primeiras quatro semanas de pesquisa, sugerindo material de origem
intracelular acinar e ductal, liberado após destruição destes. A partir
da décima semana, todos os seus animais foram diagnosticados como
portadores de carcinomas de células escamosas bem diferenciados.
Pelo acompanhamento histoquímico das lesões, as conclusões deste
trabalho apontaram para uma metaplasia de células acinares e ductais
convergindo para a formação de carcinomas.
Takai et al.
31
(1984), em estudo com camundongos,
referendaram que as figuras de sarcomas e carcinomas associadas
devem receber a designação de “tumores de colisão”. Também,
segundo estes autores, a histogênese de tumores glandulares de
roedores deve ser considerada como tendo origem ductal. Seus
argumentos são baseados no fato de que células ductais, formando
túbulos contorcidos granulares compreendem mais de cinqüenta por
cento das glândulas submandibulares.
No ano de 1995, Hindy et al.
17
, intencionados em
estudar o modelo de carcinogênese por DMBA em glândulas
submandibulares de camundongos, não obtiveram sucesso em
produzir sarcomas e adenocarcinomas, conforme sua revisão de
literatura. Entretanto, além dos casos de carcinoma, diagnosticaram
dois casos de lesões semelhantes a adenoma pleomórfico. Para estes
autores, o DMBA parece ser um carcinógeno muito potente, causando
grande e drástica alteração nas células, sendo necessária a descoberta
de uma substância de efeitos mais brandos.
Sumitomo et al.
30
(1996) aludiram o fato de que as
glândulas salivares de ratos e camundongos apresentam uma
histomorfologia singular, também apontada por Takai et al.
31
(1984).
As estruturas ductais são compostas por unidades secretoras e
condutoras denominadas túbulos contorcidos granulares. Estas
estruturas não são encontradas nos humanos e parecem ser as células
parenquimatosas que respondem aos carcinógenos. Por meio de
avaliações histoquímicas e imunoistoquímicas, a história natural de
tumores induzidos por DMBA em ratos foi estudada. Assim, a
histopatologia dos casos revelou uma fase de necrose e degeneração,
seguida por metaplasia epitelial e formação de cistos e pseudo-ductos
e, finalmente, a ocorrência de carcinoma de células escamosas. Após
imunoistoquímica, estes autores apontaram a porção ductal das
glândulas como responsáveis por todas as etapas estudadas
histoquimicamente.
Segundo Enzmann et al.
10
(1998), em carcinogênese
química por DMBA em glândulas salivares, as displasias ocorrem
após oito semanas da introdução do pellet. Após dez semanas os
primeiros tumores se mostram evidentes. Estes autores sugerem que
este modelo experimental não preenche os requisitos da definição de
iniciação uma vez que o carcinógeno, segundo eles, é utilizado em
doses subcarcinogênicas.
Os experimentos de Tsujimoto et al.
33
(1999), com
indução de tumores em glândulas salivares de camundongos
apontaram para os seguintes eventos histopatológicos: a) inicialmente
ocorreu atrofia do ácinos e dos túbulos contorcidos granulares;
infiltração linfocítica e fibrose; b) formação de pseudo-ductos e
estruturas císticas com metaplasia e c) associação de carcinomas às
estruturas epiteliais.
Em 2002, Ide et al.
18
foram capazes de produzir quatro
tipos de lesões em glândulas salivares de camundongos:
fibrossarcomas, rabdomiossarcomas, carcinomas de células escamosas
e carcinossarcomas. O carcinógeno DMBA, na quantidade de 1g, foi
injetado em glândulas submandibulares daqueles animais. Esta
pesquisa foi realizada com animais alterados geneticamente para
expressar pobremente ou não expressar gene p53.
2.6 Respostas do hospedeiro às neoplasias induzidas
quimicamente
O efeito de mudanças sistêmicas pode alterar o decurso
da indução de lesões por DMBA. Shklar
27
(1970), afirmou que o uso
de cortisona intravenosa em animais sob carcinogênese de glândulas
salivares diminuiu o tempo de crescimento das lesões, tornando-as
mais exuberantes e invasivas. Ainda segundo este autor, o estresse
também pode diminuir o tempo de progressão de neoplasias. Ogawa et
al.
23
(2000), atestam congruentemente no que tange ao menor decurso
de neoplasias com uso de cortisona.
O crescimento de tumores, após uso de DMBA em
glândulas salivares de ratos, para Ciapparelli et al.
6
(1972), parece
estar intimamente relacionado à presença do oligoelemento zinco na
alimentação. Estes autores verificaram que ratos sendo privados de
zinco apresentaram carcinomas mais rapidamente e maiores do que os
animais que ingeriram até 250ppm na água. Estes últimos, em alguns
casos, não revelaram presença de neoplasias. Outros foram
acometidos de carcinomas acompanhados de grande resposta
inflamatória e aumento volumétrico de nódulos linfáticos.
Conforme aludem Tsujimoto et al.
33
(1999), os tumores
experimentais têm sua evolução retardada pelo uso de isoproterenol.
Entretanto, testosterona acelera o processo de indução de tumores. Os
mecanismos de retardo e aceleração não foram inteiramente
discutidos.
2.7 Neoplasias de glândulas salivares em humanos
O quadro nosológico tumoral humano é formado por
muitas neoplasias. Na intenção de situar o assunto discorrido a seguir,
somente as lesões malignas, de interesse para a pesquisa em questão,
serão referidas. Pretendeu-se esboçar generalidades destes tumores em
humanos uma vez que sua ocorrência em carcinogênese experimental
é muito esperada.
Conforme atestam Ogawa et al.
23
(2000), alguns
tumores comuns em carcinogênese animal, como carcinomas de
células escamosas e sarcomas, são raros em humanos.
2.7.1 Carcinoma de células escamosas
Em patologia humana, o carcinoma primário de células
escamosas é encontrado em menos de 1% dos tumores de glândulas
salivares (DARDICK
7
, 1996; LEWIS & OLSEN
21
, 2005; SHAPIRO
& BHATTACHARYYA
26
, 2006). A histopatologia dos carcinomas
epidermóides não difere daquela de outras regiões topográficas em
cabeça e pescoço. São reconhecidas figuras de ceratinização e pontes
intercelulares nas massas epidermóides. Ocasionalmente metaplasia e
displasia escamosa podem ser reconhecidas em ductos salivares. A
invasão do tumor em direção ao parênquima glandular é acompanhada
de resposta fibrosa ou desmoplásica do estroma (DARDICK
7
, 1996;
LEWIS & OLSEN
21
, 2005).
Segundo Dardick
7
(1996), o diagnóstico de carcinoma
primário de células escamosas pode ser confundido pela presença de
carcinoma mucoepidermóide indiferenciado, devendo ser pesquisada
evidências de mucina intra-citoplasmática. Deve-se descartar,
também, a ocorrência de metástase e invasão de lesões maxilofaciais
não glandulares.
2.7.2 Sarcomas
A ocorrência de tumores benignos mesenquimais, em
glândulas salivares humanas, é mais comum que achados de sarcomas.
O acometimento de humanos por sarcomas de glândulas salivares é
raro. Somente 0,3% das neoplasias malignas é sarcomatosa. Os
pacientes acometidos são pacientes idosos. Qualquer tipo de sarcoma
pode ocorrer nos sítios glandulares. Os casos publicados remetem aos
padrões de hemangiopericitoma, schwannoma maligno, fibrossarcoma
e histiocitoma fibroso maligno. Todos extremamente invasivos,
agressivos, recorrentes e metastatizantes (GNEPP
14
, 2005).
Os lipossarcomas são os sarcomas mais comuns em
adultos. Todavia, são raros em região de cabeça e pescoço. A
ocorrência de lipossarcomas pleomórficos é ainda mais rara quando os
sítios estudados são as glândulas salivares. Nestas regiões, os
rabdomiossarcomas e os histiocitomas fibrosos malignos respondem
por 40% dos sarcomas (CHANDAN et al.
4
, 2004).
Em estudo de pacientes pediátricos, Shapiro &
Bhattachayya
26
(2006) reconheceram 7,8% de rabdomiossarcomas em
seus levantamentos. Para estes autores, estas neoplasias têm pior
prognóstico em relação a tumores epiteliais glandulares.
Segundo Kariya et al.
20
(2003), muitos casos outrora
diagnosticados como rabdomiossarcomas, miossarcomas,
lipossarcomas, fibrossarcomas e sarcomas indiferenciados em
glândula salivares devem ser classificados como histiocitomas
fibrosos malignos. Ainda, para estes autores, podemos subclassificar
os histiocitomas fibrosos malignos em: a) tipo pleomórfico-enovelado;
b) tipo mixóide; c) tipo de células gigantes; d) tipo angiomatóide e e)
tipo inflamatório.
2.7.3 Carcinossarcomas
As primeiras observações de existência de tumores
mistos malignos parecem remontar ao ano de 1967, no qual King
chamou atenção para a neoplasia carcinossarcoma (ALVAREZ-
CAÑAS & RODILLA
1
, 1996).
O carcinossarcoma é uma neoplasia maligna
extremamente rara em patologia maxilofacial humana. Para Alvarez-
Cañas & Rodilla
1
(1996), os carcinossarcomas perfazem somente
0,16% dos tumores malignos de glândulas salivares.
Gnepp et al.
15
(1991), ao fazerem um levantamento dos
casos do Instituto de Patologia das Forças Armadas Americanas
(AFIP), encontraram somente oito casos. Gnepp
13
(2005) afirmou
existir na literatura somente 50 a 60 casos descritos até 2005.
A história natural deste tumor encontra associação com
recorrência de um adenoma pleomórfico ou malignização de adenoma
configurando um carcinossarcoma em adenoma pleomórfico
(GNEPP
13
, 2005). Entretanto, Alvarez-Cañas & Rodilla
1
(1996)
referem ser o carcinossarcoma uma verdadeira neoplasia mista,
devendo ser diferenciado do carcinoma em adenoma pleomórfico.
Em sua maioria os carcinossarcomas são bifásicos
sendo compostos por variações de elementos carcinomatosos e
sarcomatosos (GNEPP et al.
15
, 1991; DARDICK
7
, 1996). O
componente sarcomatoso mais comum é o condrossarcoma. Outras
diferenciações mesenquimais também reconhecidas são o
osteossarcoma, fibrossarcoma, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma e
o angiossarcoma (DARDICK
7
, 1996). Os carcinomas podem
apresentar diferenciação ductal fraca ou ainda, podem ser
indiferenciados. De uma maneira geral os carcinossarcomas são muito
invasivos e destrutivos (GNEPP et al.
15
, 1991; GNEPP
13
, 2005).
Segundo Dardick
7
(1996), alguns carcinossarcomas
podem ter sua origem associada a tumores de células gigantes.
Ocasionalmente, alguns carcinossarcomas podem revelar campos
histológicos focais de carcinoma epitelial-mioepitelial.
As figuras de anisocitose e anisocariose são comuns e
acompanham os campos histológicos dos carcinossarcomas
(DARDICK
7
, 1996).
3 PROPOSIÇÃO
Os objetivos deste trabalho foram:
a) implantar uma metodologia experimental de
carcinogênese química em glândulas salivares
submandibulares de ratos.
b) induzir a formação de neoplasias primárias de
estruturas glandulares.
c) avaliar, do ponto de vista histológico, os achados
de nosso estudo e contrastá-los com as
descrições encontradas na literatura.
4 MATERIAL E MÉTODO
Foram utilizados 28 ratos (Rattus norvegicus, var.
albinus, Wistar), com três meses de idade e peso aproximado de 300g
cada. Os animais foram divididos em quatro grupos com sete
indivíduos. Todos os animais foram mantidos em gaiolas, sob
condições ambientais apropriadas e alimentados com ração comercial
e água ad libitum (Biotério da Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos – UNESP).
Os ratos foram tratados de acordo com os princípios
éticos para pesquisas com animais, segundo o Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA). A pesquisa foi aprovada pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São
José dos Campos – UNESP, segundo protocolo nº 038/2004-PA/CEP
de 08 de dezembro de 2004 (Anexo A).
O carcinógeno escolhido foi o 9,10-dimetil-1,2-
benzantraceno, DMBA (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, USA). Uma
solução foi manipulada contendo 2% de DMBA e acetona como
veículo. A solução anestésica utilizada para os animais constou de
dois agentes: Rompum® (Bayer S.A, Brasil) associado a Dopalen
injetável (Agribrands do Brasil LTDA), na proporção de 1:0,5 ml, por
via intra-muscular (IM), na dose de 0,1ml/100g.
Todos os animais, operados no mesmo dia, receberam
injeção de solução de DMBA nas glândulas submandibulares
esquerdas. Ao final da quinta, décima, décima quinta e vigésima
semanas, sete animais de cada grupo foram sacrificados.
Em todas as etapas cirúrgicas utilizou-se de material de
proteção individual devido à alta periculosidade da substância
carcinogênica DMBA. Fez-se uso de óculos, gorro, máscara, avental
cirúrgico descartável e dois pares de luvas para cada operador,
tomando-se o cuidado de colá-las à vestimenta por meio de fita
adesiva crepe. Técnicos do biotério, que manipularam os animais
durante o experimento, também receberam cuidados de proteção.
4.1 Preparação dos animais
Os animais, previamente divididos em quatro grupos,
foram anestesiados por meio de uma solução anestésica contendo um
relaxante muscular - cloridrato de 2 - (2,6 – xilidino) - 5,6 - dihidro-
4h – 1,3 – tiazina (Rompum®, Bayer S.A, Brasil) associado a um
anestésico geral dissociativo – cloridrato de cetamina (Dopalen
injetável, Agribrands do Brasil LTDA) na proporção de 1:0,5 ml, por
via intra-muscular, na dose de 0,1ml/100g de peso.
Na intenção de preservar o efeito anestésico e o
conforto aos animais optou-se por anestesiar e operar individualmente
cada grupo, porém no mesmo dia.
Após anestesia, os ratos foram submetidos à tricotomia
da região cervical anterior. A anti-sepsia pré-operatória dos ratos foi
conduzida com PVPI (Polivinil Pirrolidona Iodo 1% - Ind. Química
Rioquímica LTDA). Os animais de todos os grupos receberam uma
incisão cervical, iniciando-se pela região central a 0,5 cm da
mandíbula. O término da diérese atingiu, de forma oblíqua, à distância
de 0,5 cm da cintura escapular esquerda. Assim sendo, o corte final
somou, em média, 3,0 cm em todos os animais. Expuseram-se, então,
as estruturas cervicais superficiais esquerdas. O material utilizado para
tal procedimento constou de uma lâmina de bisturi 24, montada em
cabo Bard-Parker n° 4 (Figura 1).
FIGURA 1 - Preparação do animal para a aplicação do DMBA: a)
tricotomia; b) incisão cervical,
Após divulsão, as glândulas submandibulares
esquerdas foram identificadas. Por meio de uma seringa de 1ml para
aplicação de insulina, injetou-se 0,1ml de solução de DMBA a 2%
naquelas glândulas. O plano epitelial foi suturado com fio de seda
preta 3-Ø em pontos isolados (Figura 2).
FIGURA 2 - Aplicação de solução de DMBA: a) injeção de 0,1ml de
DMBA; b) sutura com fio de seda preta 3-Ø, em pontos
isolados.
Ao final da quinta, décima, décima quinta e vigésima
semanas os animais foram sacrificados utilizando-se doses letais da
solução anestésica/relaxante. Novas incisões cervicais foram
realizadas na intenção de remover as glândulas salivares maiores do
pescoço. As glândulas submandibulares esquerdas foram identificadas
por meio de um ponto simples de sutura com fio de seda preta 3-Ø. As
peças cirúrgicas foram acondicionadas em frascos de vidro, de boca
larga, contendo quantidade suficiente de solução de formaldeído
tamponado a 10%.
4.2 Análise histológica
Após a fixação das peças cirúrgicas em solução de
formol a 10%, o material foi examinado macroscopicamente e,
posteriormente, incluído em parafina. Os cortes histológicos foram
padronizados para apresentar 5µm de espessura. O processo
histoquímico utilizado foi coloração pelo método da Hematoxilina e
Eosina (H/E).
A leitura das amostras foi realizada em microscopia de
luz convencional (Axiophot - Carl Zeiss, Oberköchen, Germany).
Todo o material obtido foi analisado de maneira
qualitativa, procurando-se observar seus aspectos histomorfológicos
mais significantes.
4.3 Documentação fotográfica
Todas as etapas da pesquisa, incluindo os períodos pré-
sacrifício dos animais, as peças anatômicas e os cortes histológicos,
foram documentados e fotografados com câmera digital CCD Sony
DSC-S85 Cybershot, com 4.1 megapixels (Sony Inc., Japan).
A partir desse material, foram selecionadas as
fotografias e as fotomicrografias mais representativas para confecção
do material ilustrativo.
5 RESULTADOS
5.1 Aspectos clínicos
Os animais apresentaram boa recuperação do
procedimento cirúrgico no qual se injetou solução de DMBA a 2%,
mantendo alimentação e hidratação sem alterações. Exceção se fez em
relação aos animais 22 e 23 que necessitaram de antecipação de
sacrifício devido à dificuldade de alimentação, respiração e
deambulação.
De uma maneira geral, as manifestações clínicas de
lesões glandulares se tornaram evidentes após dez semanas de
pesquisa. Uma elevação cervical anterior esquerda foi verificada em
alguns animais (Figura 3).
FIGURA 3 - Abaulamento em região cervical de animal após dez
semanas de aplicação do carcinógeno (*).
5.1.1 Quinta semana
Sete animais foram sacrificados constituindo-se o
primeiro grupo do estudo. Não foram observadas alterações físicas
aparentes nos animais.
Animais 2 e 3: notou-se a presença de supuração
proveniente das glândulas submandibulares esquerdas durante o
procedimento de excisão das glândulas salivares e estruturas cervicais.
Os outros animais não apresentaram alterações clínicas
relevantes.
5.1.2 Décima semana
Animais 9 e 13: estes animais apresentaram discreto
aumento da região topográfica referente às glândulas salivares
submandibulares esquerdas.
Animal 14: notou-se presença de supuração e de
aderências entre a glândula e os planos epiteliais cervicais durante a
exérese da glândula submandibular esquerda.
Os outros animais não apresentaram alterações clínicas
relevantes.
5.1.3 Décima quinta semana
Animal 15: aumento clinicamente notável na região
cervical anterior. Após incisão do pêlo observou-se presença de
secreção purulenta. Uma ulceração, em região central da glândula
submandibular esquerda, revelou presença de massa amorfa e
esbranquiçada sugestiva de material necrótico. A glândula se
apresentou aderida às estruturas adjacentes.
Animal 16: a glândula submandibular esquerda se
mostrou aderida à musculatura cervical.
Animal 17: a glândula submandibular se mostrou
clinicamente volumosa, apresentando aderências musculares e em
profundidade, acometendo região anterior às vias aéreas.
Animal 18: notou-se diminuição volumétrica da
glândula submandibular esquerda estando esta aderida às estruturas
vizinhas.
Animal 19: observou-se aderência da glândula
submandibular esquerda à musculatura mastigatória ipsilateral. Notou-
se, na superfície inferior da glândula submandibular, um nódulo
acastanhado.
Animal 20: os achados clínicos evidenciaram uma
aderência acometendo a glândula submandibular esquerda, cintura
escapular e pele ipsilateral.
Animal 21: notaram-se aderências em músculos
mastigatórios, cintura escapular e vias aero-digestivas à esquerda.
5.1.4 Décima oitava semana
Animal 22: o animal mostrou-se com exagerado
aumento cervical anterior em surto de crescimento (Figura 4). Notou-
se dificuldade de deambulação e alimentação da cobaia. Este animal,
pertencente ao quarto e último grupo da pesquisa, foi sacrificado duas
semanas antes do tempo previsto. A peça cirúrgica foi excisada por
meio de plano de clivagem entre as estruturas peri-lesionais. Não se
evidenciou separação entre as glândulas salivares. O espécime
cirúrgico foi seccionado e revelou consistência flácida e superfícies
brancacentas.
FIGURA 4 - Crescimento exagerado de neoplasia. Nota-se a integridade
do pêlo.
5.1.5 Décima nona semana
Animal 23: notou-se dificuldade de deambulação e
respiração deste animal, antecipando-se o sacrifício em uma semana.
Após incisão notou-se atrofia glandular à esquerda e aumento
volumétrico à direita. As glândulas submandibulares encontravam-se
aderidas às cinturas escapulares bilateralmente e comprimindo a
traquéia posteriormente.
5.1.6 Vigésima semana
Animal 24: lesão de grande volume, abaulando a região
cervical anterior esquerda. Após incisão notou-se lesão telangiectásica
insinuando-se, com aderências, à região toráxica.
Animal 25: a glândula submandibular esquerda
mostrou evidente atrofia após abordagem cirúrgica.
Animal 26: notou-se atrofia de glândula submandibular
esquerda com aderências às estruturas peri-glandulares.
Animal 27: evidente aumento volumétrico cervical
esquerdo. Após incisão, notou-se lesão multilobulada, em região de
glândula submandibular esquerda. A região cervical direita não
revelou alterações. A excisão glandular requereu remoção do músculo
masseter esquerdo.
Animal 28: sem evidências de alterações clínicas. Após
incisão foram notados sinais sugestivos de atrofia da glândula
submandibular esquerda. Este órgão se apresentou com aspecto
macroscópico semelhante a gordura. Aderências ao músculo masseter
ipsilateral foram observadas.
5.2 Macroscopia das peças cirúrgicas
Todas as glândulas salivares e estruturas removidas
apensas a elas foram acondicionadas em vidros de boca larga e com
quantidade suficiente de solução tamponada de formol a 10%.
Após fixação das peças cirúrgicas procedeu-se a
macroscopia do material obtido. Notou-se no primeiro e segundo
grupos, respectivamente, facilidade e moderada facilidade de
identificar estruturas anatômicas. Também se mostrou evidente uma
manutenção das dimensões volumétricas glandulares, assemelhando, o
material, às glândulas normais. Após hemissecção pôde-se apontar,
mesmo em presença de lesões, os limites estruturais das glândulas
submandibulares esquerdas e direitas (Figura 5).
FIGURA 5 - Peças cirúrgicas de animal pertencente ao primeiro grupo.
Pode-se identificar as glândulas submandibulares direita (*)
e esquerda (+).
Todavia as peças cirúrgicas do terceiro e quarto grupos
revelaram outras características. Observou-se dificuldade em
reconhecer os parênquimas glandulares e seus limites após
hemissecção. Tornou-se patente o apagamento de estruturas e sua
substituição por tecido sólido ou por estruturas císticas ou por
combinação de ambos (Figura 6).
FIGURA 6 - Peças cirúrgicas evidenciando alterações macroscópicas: a)
a glândula submandibular esquerda apresenta
p
redominância de tecido sólido envolvendo estrutura
cística; b) evidências de aumento volumétrico glandular
com a presença de grande estrutura cística que verteu
líquido marrom-acastanhado no momento de sua clivagem.
5.3 Aspectos histopatológicos
Todas os diagnósticos histopatológicos foram
realizados baseando-se na coloração por Hematoxilina e Eosina. Os
resultados histopatológicos da pesquisa se encontram agrupados na
seção anexos. A seguir, as descrições histológicas dos casos.
5.3.1 Quinta semana
Animal 1: notou-se extensa destruição parenquimatosa
glandular e apagamento da identidade secretora. Um ducto excretor
dilatado, roto, com hiperplasia epitelial e células com discreto
pleomorfismo foi evidenciado. Uma estrutura prolongando-se em
forma de gota apontou uma incipiente invasão mural (Figura 7). A
cápsula de tecido conjuntivo fibroso e algumas áreas do estroma
apresentaram fibroblastos com aspecto menos fusiforme e mais
arredondado. Outras áreas revelaram grande quantidade de inflamação
purulenta e neutrófilos.
Animal 2: os cortes histológicos revelaram parênquima
de glândula submandibular normal e regiões com perda das unidades
acinares, dilatação das estruturas ductais e vasos sanguíneos dilatados
e ectásicos (Figura 8). Algumas células ductais mostraram-se com
aspecto de degeneração hidrópica. Na luz dos vasos, coleções de
polimorfonucleares foram observadas. O estroma conjuntivo revelou
células fibroblásticas com polimorfismo leve e neutrófilos em
profusão. Nódulos linfáticos hipertróficos completaram o quadro
histológico.
Animal 3: observou-se normalidade do parênquima
glandular submandibular. Entretanto, uma região de interface entre a
glândula submandibular e a glândula parótida revelou dilatação ductal
associada a êmbolos de neutrófilos. Também se notou imagens
artefatuais de perda de coesão parenquimatosa da glândula
submandibular. O estroma conjuntivo apresentou celularidade
discretamente polimórfica. Completando o quadro visualizou-se
nódulo linfático hipertrófico.
Animal 4: evidenciou-se interface entre glândula
submandibular e glândula parótida com apagamento do parênquima
submandibular (Figura 9). Nesta região houve proliferação de epitélio
ductal em continuidade a esta glândula. Células inflamatórias
polimorfonucleares e epiteliais foram encontradas nas luzes ductais.
Algumas projeções ductais murais se insinuaram no conjuntivo
(Figura 10). Os vasos sangüíneos se mostraram ectásicos e dilatados.
Alguns focos hemorrágicos intra-glandulares submandibulares foram
visualizados. Nódulos linfáticos contínuos à glândula submandibular
foram verificados.
Animal 5: notou-se preservação da histomorfologia
glandular. Todavia, algumas regiões revelaram perda arquitetural dos
ácinos mucosos. Na intimidade do parênquima glandular
submandibular pôde-se reconhecer uma região extensa de necrose
tecidual. Em outra região verificou-se a presença de proliferação de
estruturas nervosas sem, todavia, apresentar atipias. Na intimidade da
cápsula foram encontrados vasos dilatados e ectásicos. Alguns poucos
fibroblastos apresentaram-se mais achatados, sem seu aspecto
fusiforme. Completando o quadro observou-se a ocorrência de
nódulos linfáticos hipertróficos.
Animal 6: observou-se manutenção dos parênquimas
glandulares. Na interface entre glândulas submandibular e parótida
evidenciou-se extensa hemorragia. A glândula submandibular
apresentou regiões marcadas por proliferação de massas epiteliais
diferenciando-se em estruturas ductais. O interior dos ductos mostrou-
se preenchido por êmbolos de neutrófilos e células epiteliais. Algumas
células ductais se revelaram com núcleos aumentados e
hipercromáticos. Outros campos revelaram proliferação de estruturas
nervosas adjacentes aos ductos dilatados. Em associação às glândulas
foram verificados nódulos linfáticos hipertróficos.
Animal 7: os parênquimas glandulares mantiveram
morfologia arquitetural normal. As glândulas submandibulares
apresentaram regiões de dilatação ductal sem a ocorrência de
hiperplasia de parede. Observou-se a continuidade de fibras
musculares em relação ao órgão submandibular. A cápsula fibrosa
desta glândula revelou a presença de fibroblastos discretamente
polimórficos. Extensas áreas de necrose apagaram a arquitetura peri-
glandular. Alguns campos revelaram perda de tecido acometendo
fibras musculares estriadas. Os linfonodos se apresentaram
hipertróficos.
5.3.2 Décima semana
Animal 8: o material examinado constou de lesões
císticas ductais apresentando pleomorfismo celular e luzes
preenchidas por neutrófilos e figuras de ceratina. O parênquima da
glândula submandibular evidenciou uma região de perda de
arquitetura glandular com ácinos mucosos aumentados em tamanho.
Houve a ocorrência de padrões de necrose tecidual acometendo
glândula submandibular, glândula parótida e linfonodo, com
apagamento dos limites desta última estrutura. Outras regiões
revelaram focos de hemorragia na intimidade da glândula
submandibular. Contudo, o restante das estruturas não apontou
anormalidades.
Animal 9: observou-se apagamento de parte do
parênquima da glândula submandibular, sendo substituído por áreas
de necrose tecidual, encerrando ductos ora pequenos ora dilatados, em
forma de cistos. As células ductais se revelaram pleomórficas. Notou-
se, também, presença de massas epiteliais com ceratinização
individual e polimorfonucleares, em estroma aparentando desmoplasia
(Figura 11). A cápsula fibrosa, por vezes, revelou a presença de ductos
associados a proliferação de nervos. Os nódulos linfáticos se
mostraram hipertróficos. Em alguns campos, notou-se a permeação de
células fibroblásticas aumentadas de tamanho, em estroma linfático.
Animal 10: as unidades acinares submandibulares se
apresentaram com marcada alteração histomorfológica, revelando
contornos pouco nítidos, principalmente envolvendo as células
mucosas. Uma região próxima da interface entre as glândulas
submandibulares e parótida apresentou proliferação e dilatação ductal
e ectasia vascular. Os ductos foram mal formados e encerraram, em
seu interior, um material amorfo. Em outras regiões notou-se união da
cápsula ao parênquima glandular. Na intimidade deste tecido
conjuntivo observaram-se células inflamatórias polimorfonucleares e
massas epiteliais se diferenciando em ductos (Figura 12). Ao redor
destas estruturas se apresentaram fibroblastos com pleomorfismo
celular. Ainda nestes campos pôde-se verificar a ocorrência de vasos
sanguíneos de variados calibres, com ou sem parede muscular,
ectásicos e dilatados e imagens de necrose tecidual. Também se
verificaram nervos em proliferação na intimidade dos vasos
sanguíneos. Os nódulos linfáticos se apresentaram hipertróficos. Os
planos profundos musculares por vezes encontraram-se associados ao
tecido conjuntivo da cápsula sem, contudo, haver invasão.
Animal 11: os cortes histológicos revelaram
parênquima de glândula submandibular, ora com arquitetura normal,
ora com apagamento das estruturas secretoras e ductais por invasão
conjuntiva. Áreas de necrose tecidual foram permeadas por massas
celulares coesas e ductiformes e muitas células polimorfonucleares.
Estas células inflamatórias também foram verificadas no interior
luminal das estruturas ductais e pseudo-ductais. O forramento destas
estruturas se apresentou variando de simples a estratificado com
presença de células polimórficas. Notou-se, também, proliferação de
tecido conjuntivo fibroso orientando-se em direção aos planos
musculares profundos, porém, sem invasão. O parênquima glandular
parotídico também se apresentou subvertido e circundado pelo tecido
conjuntivo sendo, ocasionalmente, permeado por este. Os nódulos
linfáticos encontram-se hipertróficos.
Animal 12: notaram-se remanescentes de glândula
salivares submandibulares separados por tecido conjuntivo, com
variados graus de celularidade, figuras de necrose tecidual e pseudo-
abscessos. Alguns fibroblastos revelaram discreto pleomorfismo.
Verificou-se no estroma, ainda, a proliferação de estruturas ductais e
pseudo-ductais alojando, em sua luz, células inflamatórias
polimorfonucleares. As células de revestimento dos ductos e pseudo-
ductos revelaram-se com contornos pouco nítidos. Os planos
musculares profundos fizeram interface com o tecido conjuntivo
lesional. Nódulos linfáticos hipertróficos e outros parênquimas
glandulares sem anormalidades completaram o quadro histológico.
Animal 13: evidenciaram-se várias figuras de ductos
salivares hiperplásicos, revelando atipias celulares ocasionais (Figura
13). Alguns ductos apresentaram proliferação celular moderadamente
polimórfica em projeção. Outros ninhos celulares epidermóides se
insinuaram no estroma conjuntivo, por vezes, sugerindo pseudo-
ductos. As luzes das estruturas ductais e pseudo-ductais encerraram,
em seu interior, células polimorfonucleares e algumas células
epiteliais ductais. Ao redor destas estruturas percebeu-se extensa
necrose e remanescentes de parênquima glandular submandibular.
Associou-se a este quadro um linfonodo intimamente justaposto ao
estroma conjuntivo e às figuras de necrose e grande fragmento de
glândula submandibular com integridade morfológica.
Animal 14: notou-se, na intimidade dos tecidos
musculares, a presença de extensa área de necrose (Figura 14). Figuras
de pseudo-abscesso se mostram evidentes e próximas de nódulos
linfáticos hipertróficos. Outras áreas revelam parênquimas glandulares
sem evidências de alterações celulares ou arquiteturais.
FIGURA 7 - Nota-se estrutura ductal em detalhe. À direita pode-se reconhecer
a luz do ducto (LD) e a parede do ducto (PD). Observar uma
projeção em forma de gota (*) em direção ao conjuntivo (C). H/E
400x.
FIGURA 8 - Nota-se moderada proliferação de células ductais. A cabeça de
seta aponta uma projeção intra-luminal. H/E 400x.
FIGURA 9 - Extensa área de apagamento de parênquima glandular e necrose
tecidual (N) acha-se presente e próxima a remanescente de lóbulo
de glândula submandibular (SM). H/E 100x.
FIGURA 10 - O quadro histológico revela proliferação ductal (cabeça de seta) e
massa de células epiteliais ductais se insinuando para o conjuntivo
(seta). Nas luzes dos ductos são vistos polimorfonucleares
neutrófilos (*). H/E 100x.
FIGURA 11 - Nota-se a presença de ducto com hiperplasia de parede (cabeça de
seta) e massas epiteliais em proliferação (setas). A área focal de
hialinização (H) completa o quadro histopatológico. H/E 100x.
FIGURA 12 - Ilhota de neoplasia revelando formação de estruturas pseudo-
ductais e metaplasia escamosa nas células centrais (setas). H/E
400x.
FIGURA 13 - As setas revelam a hiperplasia da parede de um ducto neoformado.
Na luz deste encontramos restos epiteliais e células inflamatórias.
Nota-se uma região focal de hialinização (*). H/E 100x.
FIGURA 14 - Pode-se verificar a extensa área de necrose (N) de permeio a fibras
musculares estriadas esqueléticas (M). H/E 25x.
5.3.3 Décima quinta semana
Animal 15: os cortes histológicos apresentaram lesão
cística epitelial com estratificação variável (Figura 15). Figuras de
invasão mural foram evidenciadas. As células epiteliais mantinham-se
com pleomorfismo moderado. Ceratinização intra-luminal se mostrou
patente. Alguns campos do estroma apresentaram aspectos sugestivos
de áreas ósteo-condróides. Notou-se, nestas regiões, a presença de
células polimórficas e fusiformes com aspecto fibroblástico. O
parênquima glandular submandibular se apresentou atrófico. Um
nódulo linfático, associado à lesão, foi evidenciado. Diagnosticou-se
o caso como carcinossarcoma.
Animal 16: observou-se a presença de dois padrões
distintos de parênquima de glândula submandibular. Um deles
apresentou aspecto de normalidade. O outro revelou organização
celular acinar coesa e com hipercromatismo. Contudo, não se
verificou a ocorrência de atipias. Puderam-se observar, também, áreas
extensas de tecido conjuntivo frouxamente arranjado e muitos vasos
sangüíneos pequenos e ectásicos. Por vezes o tecido conjuntivo
envolveu fibras musculares. Compuseram também o quadro nódulos
linfáticos hipertróficos. Não se diagnosticou neoplasia neste caso.
Animal 17: uma lesão cística epitelial pôde ser
evidenciada. (Figura 16 e 17). Seu revestimento era composto por
epitélio pavimentoso estratificado descontínuo, por vezes atrófico e,
por vezes, hiperplásico. O estroma conjuntivo encerrou pérolas
córneas e apresentou figuras mesenquimais alongadas, sugerindo
parênquima muscular neoplásico. Outros campos revelaram a
ocorrência de células gigantes e células fusiformes polimórficas
(Figura 18). Um padrão mixóide foi verificado englobando
remanescentes de ácinos submandibulares. O diagnóstico foi
carcinossarcoma
Animal 18: evidenciou-se a presença de interseção de
figuras de carcinoma anaplásico e áreas de desmoplasia. A neoplasia
se mostrou circundada por estroma de tecido conjuntivo frouxo
ricamente vascularizado. Vasos dilatados e ectásicos, bem como
figuras de hemorragia, estiveram presentes. Outros achados, como
presença de nódulo linfático e parênquimas glandulares
histomorfologicamente preservados, compuseram o quadro
histológico.
Animal 19: os campos histológicos revelaram lesão
cística revestida por epitélio estratificado e hiperplásico, formando
ceratina profusamente. Notaram-se figuras de células carcinomatosas
invadindo estroma conjuntivo. O tecido conjuntivo se revelou
intensamente vascularizado. Pôde-se notar, formando a cápsula
tumoral, um conjunto de células polimórficas mesenquimais
adjacentes à porção carcinomatosa e aos planos musculares. O caso foi
diagnosticado como carcinossarcoma.
Animal 20: os cortes histológicos revelaram uma lesão
cística única separada do parênquima glandular submandibular
normal. O interior da luz da lesão evidenciou profusão de figuras de
ceratinização. O revestimento da lesão mostrou-se marcado por
hiperplasia epitelial papilomatosa. A celularidade polimórfica revelou
hipercromasia nuclear e figuras ocasionais de pérolas córneas e
ceratinização intra-epitelial. O estroma se mostrou marcado por
infiltrado inflamatório predominantemente crônico mononuclear com
presença de vasos sangüíneos pequenos e congestos. Figuras de
hialinização ocasionais foram encontradas. Diagnosticou-se a
neoplasia como carcinoma intra-luminal/intra-mural.
Animal 21: os campos histológicos mostraram a
ocorrência de células fibroblásticas anaplásicas em associação a
campos de aspecto condróide. Outras áreas revelaram feixes e
estruturas luminais delimitadas, parcialmente, por células fusiformes.
Imagens de invasão muscular foram visualizadas em alguns campos.
Uma figura luminal, revestida por epitélio atrófico e epitélio
hiperplásico ductal, se mostrou evidente. Os parênquimas glandulares
não mostraram alterações histomorfológicas. Contudo, imagens de
neoplasia sarcomatosa foram evidenciadas em continuidade à glândula
submandibular. Foram observadas, em objetivas de grande aumento,
conjuntos de células epiteliais invadindo o estroma conjuntivo de
forma intra-mural. Completando o caso notaram-se imagens
sugestivas de adipócitos, entretanto, sem distinção de seus núcleos.
Diagnosticou-se a lesão como carcinossarcoma.
FIGURA 15 - Estrutura cística com parede ductal revestida por epitélio (setas),
apresentando formação de carcinoma epidemóide luminal (CL).
Notar presença exuberante de ceratina (*). H/E 25x.
FIGURA 16 - Formação de carcinoma epidermóide com proliferação mural
(cabeça de seta). Presença de grande quantidade de ceratina na
porção luminal (*). H/E 100x.
FIGURA 17 - Detalhe da figura anterior. Presença de células neoplásicas
(cabeças de seta) revelando pleomorfismo celular e nuclear
evidentes. H/E 630x.
FIGURA 18 - Detalhe da presença de célula gigante multinucleada (setas) e
células polimórficas em área de invasão de musculatura estriada
esquelética. H/E 630x.
5.3.4 Décima oitava semana
Animal 22: notou-se a presença de lesão cística,
revelando células carcinomatosas intra-luminais formando um padrão
papilar/papilífero. O epitélio neoplásico se mostrou ora atrófico ora
hiperplásico. Áreas focais evidenciaram a presença de massas
epiteliais e células individuais e pérolas córneas. Um padrão mixóide,
por vezes em interface com padrão fasciculado, foi evidenciado
(Figura 19). Ambos os padrões mostraram orientações variadas de
seus fascículos sendo mais evidente a atipia celular no padrão sólido
fasciculado. O estroma revelou vasos congestos e figuras de
angiogênese. Também foram evidentes áreas de interface entre
músculos e sarcoma. A glândula parótida se mostrou englobada pela
neoplasia mesenquimal. Alguns campos histológicos evidenciaram
atrofia da glândula submandibular com presença de infiltrado
inflamatório mononuclear e ductos. Outras áreas revelaram
remanescentes de glândula submandibular envoltos pela neoplasia
mesenquimal. Observou-se nódulo linfático hiperplásico.
Diagnosticou-se um carcinossarcoma.
5.3.5 Décima nona semana
Animal 23: os cortes histológicos revelaram neoplasia
mesenquimal. Notou-se padrão sólido celularizado com áreas de
células fibroblásticas, polimorfas, em arranjos isolados ou dissociando
e invadindo músculos ou associadas a células gigantes. Células
atípicas e anaplásicas foram evidenciadas em outros campos
histológicos. O diagnóstico definiu um sarcoma.
5.3.6 Vigésima semana
Animal 24: os cortes histológicos apresentaram
neoplasia predominantemente sólida, mesenquimal, associada a
poucas imagens de grupos de células epiteliais. Foram evidenciadas
áreas de fasciculação fibroblástica em justaposição a áreas de
aparência mixóide. Figuras de dilatação e congestão vascular foram
notadas bem como áreas de hemorragia extensa. Outros campos, em
objetivas de grande aumento, revelaram células mesenquimais
anaplásicas e mitoses atípicas. Ninhos de células epiteliais,
moderadamente diferenciadas e com núcleos hipercromáticos, foram
observados em associação ao padrão mixóide. As ilhas epiteliais se
mostraram ora individualmente ceratinizadas, ora formando pérolas de
ceratina. Não foram evidenciados parênquimas glandulares. O
diagnóstico definiu um carcinossarcoma (Figura 20).
Animal 25: o caso 25 não apresentou qualquer
alteração histopatológica glandular. Notou-se presença de hiperplasia
de nódulos linfáticos.
Animal 26: notou-se lesão cística revestida por epitélio
escamoso revelando proliferação intra-luminal e presença de
acentuada ceratinização. Houve ocorrência de células com perda da
relação núcleo/citoplasma e pleomorfismo celular e nuclear.
Observou-se, também, a presença de pérolas córneas na intimidade da
lesão intra-luminal. O tecido conjuntivo evidenciou células
fibroblásticas com grande pleomorfismo, envolvendo massas epiteliais
e, por vezes, imagens de hialinização (Figura 21). O infiltrado
inflamatório presente se mostrou mononuclear. Os parênquimas
glandulares foram evidenciados sem ocorrência de alterações
arquiteturais. A lesão tumoral mostrou-se acolada à glândula
submandibular e contínua à glândula parótida. Outros campos
histológicos mostraram células epiteliais e nervosas atípicas
associadas à glândula parótida. Diagnosticou-se o caso como
carcinossarcoma.
Animal 27: observou-se estrutura cística revestida por
epitélio escamoso estratificado projetando-se para a luz e, por vezes,
revelando projeções papilíferas. Uma profusa produção de ceratina foi
verificada. A espessura epitelial foi variável, desde poucas camadas a
imagens de hiperplasia. Outros campos histológicos mostraram
invasão mural de células epidermóides isoladas ou agrupadas. As
massas epiteliais, ocasionalmente, apresentaram pérolas córneas,
mitoses atípicas, anisocitose, anisocariose e subversão da relação
núcleo/citoplasma (Figura 22). Ilhas de células neoplásicas foram
evidenciadas, ocasionalmente, se insinuando ao redor de estruturas
vasculares. A cápsula fibrosa revelou infiltrado inflamatório
polimorfonuclear e vasos congestos e dilatados. Traços de parênquima
glandular submandibular, externamente à cápsula, foram observados.
O diagnóstico foi de carcinoma intra-mural/intra-luminal.
Animal 28: os parênquimas glandulares se mostraram
com arquitetura preservada. Todavia, observaram-se campos com uma
perda volumétrica de parênquima submandibular associado a
hiperplasia de nódulo linfático. Na intimidade da glândula parótida,
verificou-se presença de áreas com ductos apresentando células
levemente pleomórficas, circundadas por tecido conjuntivo denso. Os
tecidos musculares encontraram-se contínuos às áreas de fibrose e
espessamento vascular sem, contudo, evidenciar neoplasia ou
infiltração.
FIGURA 19 - Padrão neoplásico fasciculado e mixóide, exibindo células
fusiformes alongadas, representando área sarcomatosa de um
carcinossarcoma. H/E 200x.
FIGURA 20 - Intenso pleomorfismo celular e nuclear, com presença de figuras
de mitoses atípicas (cabeça de seta). H/E 400x.
FIGURA 21 - Carcinossarcoma. O círculo aponta para uma ilhota de células
epiteliais malignas, de permeio a porção sarcomatosa. H/E 200x.
FIGURA 22 - Massa neoplásica epitelial próxima a espaço vascular ectásico e
congesto. Notar figura de mitose atípica (cabeça de seta). H/E
630x.
6 DISCUSSÃO
O reconhecimento de que os seres humanos são
susceptíveis a agentes carcinogênicos remonta ao século XVI
(WEISBURGER
35
, 1994). Segundo Rodrigues & Camargo
24
(1999),
no século XVIII, Percival Pott sugeriu a participação do alcatrão em
tumores de pele. A confirmação destas suspeitas veio com os
experimentos de Yamagiwa e Ichikawa em 1915, conforme Woolf
38
(1998) ou em 1918, segundo Skhlar
27
(1970). A descoberta dos
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos se deu nesta aludida época
pela destilação do 3,4-benzopireno (WOOLF
38
, 1998).
O conhecimento e entendimento acerca da história
natural de carcinomas foram obtidos após experimentos em pele de
camundongos. Formulou-se, em 1947, a idéia de agente carcinógeno e
agente promotor, segundo Odukoya e Skhlar
22
(1984). Modernamente,
conforme Rodrigues & Camargo
24
(1999), a carcinogênese é
representada pelas seguintes fases: iniciação, promoção e progressão,
com conseqüente manifestação tumoral.
Odukoya & Shklar
22
(1984) não acreditaram que o
DMBA respondesse sozinho pelas etapas da carcinogênese.
Entretanto, conforme os apontamentos de Shafer (1962)
*
, e os achados
de Sumitomo et al.
30
(1996), Ogawa et al.
23
(2000) e Ide et al.
19
(2004), a substância DMBA é o carcinógeno policíclico aromático de
*
SHAFER, W.G. Experimental salivary gland tumorigenesis. J Dent Res, v.41, p.117,
1962.
escolha para a pesquisa com roedores, sendo potente indutor e
promotor de neoplasias. Fassoni et al.
11
(1993) classificaram o DMBA
como carcinógeno completo. Em nosso experimento, tornou-se
evidente que, uma única injeção intra-glandular de DMBA a 2%, foi
totalmente responsável pela indução de neoplasias. Ficou claro que o
DMBA se apresenta como um carcinógeno completo. Discute-se,
então, qual o real significado da idéia de Enzmann et al.
10
(1998) que
afirmam ser o DMBA subcarcinogênico nos experimentos de
tumorigênese de glândulas salivares. Uma vez que o contato celular
com o agente oncogênico desencadeia uma série de eventos oxidativos
e de detoxificação, culminando em agressão ao DNA e expressão de
fenótipo maligno, não se pode negar o papel carcinogênico do DMBA.
Geneticamente, os tumores animais e humanos
parecem guardar semelhanças, compartilhando um desenvolvimento
coincidente (BALMAIN & HARRIS
2
). O conhecimento acerca do
papel de genes, como os da família ras e o p53, parece bem conhecido
em carcinogênese experimental e humana. Contudo, os eventos
genéticos em carcinogênese experimental de glândulas salivares não
estão completamente esclarecidos, segundo referiram Stanley
29
(1995), Balmain & Harris
2
(2000) e Ide et al.
18
(2002). Em nosso
levantamento bibliográfico a participação dos genes ras, p53, p16 e
Rb é aludida somente para experimentos com camundongos
(STANLEY
29
, 1995; BALMAIN & HARRIS
2
, 2000; IDE et al.
18
,
2002). Segundo Balmain & Harris
2
(2000), os camundongos
apresentam-se como boas cobaias para carcinogênese. Nestes animais,
a indução de cânceres ocorre por falhas na reparação do DNA. Nota-
se, então, carência evidente de estudo genético no que se refere aos
ratos e às suas neoplasias glandulares salivares induzidas. Todavia,
pela rápida formação de lesões em nosso estudo, podemos especular
que a reparação genética deficiente em ratos expostos a carcinógenos
pode ser semelhante a dos camundongos.
Os modelos animais de carcinogênese química foram e
tem sido extensamente estudados. Os objetivos relacionados à indução
de tumores em animais se prestam ao estudo da carcinogênese per se e
de drogas e substâncias às quais o homem pode ter contato voluntário
ou não. Estes conceitos foram apresentados por Franks
12
(1990) e
Fassoni et al.
11
(1993) e são válidos para a pesquisa em questão pois
esta, além de outros objetivos, intenciona o entendimento dos eventos
da carcinogênese experimental de glândulas salivares. Os animais que
se prestaram ao nosso estudo de carcinogênese experimental foram
tratados de forma adequada, levando-se em consideração os princípios
éticos do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).
Foram mantidos em grupos de sete animais, recebendo alimentação e
hidratação ad libitum. Não se pretendeu estudar qualquer resposta
sistêmica do hospedeiro às neoplasias experimentais fora do escopo da
revisão da literatura.
Os autores que estudam oncogênese quimicamente
induzida em glândulas salivares animais descrevem achados muitas
vezes conflitantes. Eles divergem quanto aos modelos animais e, às
vezes, quanto às lesões causadas em um mesmo modelo utilizando-se
a mesma metodologia. Estas discrepâncias sugerem ser, a
carcinogênese em glândulas salivares, de difícil reprodução.
Entretanto, os autores concordam que as várias metodologias
estudadas podem revelar achados muito diferentes. Uma das hipóteses
recai sobre inerências de cada espécie animal utilizada (STANDISH
28
,
1957; CHAUDHRY et al.
5
, 1966; TURBINER & SHKLAR
34
, 1969;
SHKLAR
27
, 1970; TAKEUCHI et al.
32
, 1975; EL-MOFTY
8
, 1977).
A carcinogênese quimicamente induzida em glândulas
salivares pode ser conduzida levando-se em consideração várias
metodologias. Os modelos animais diferem entre autores. Assim
posto, podem ser utilizados cobaias como rato (CATALDO et al.
3
,
1964; CHAUDHRY et al.
5
, 1966; SCHMUTZ & CHAUDHRY
25
,
1969; TURBINER & SHKLAR
34
, 1969; EL-MOFTY
8
, 1977;
ZAMAN et al.
40
, 1996; ENZMANN et al.
10
, 1998), hamster
(CHAUDHRY et al.
5
, 1966) e camundongo (WIGLEY &
CARBONELL
37
, 1976; TAKAI et al.
31
, 1984; HINDY et al.
17
, 1995;
TSUJIMOTO et al.
33
, 1999; YURA et al.
39
, 2001). Os coelhos são
citados por Standish
28
(1957), Cataldo et al.
3
(1964) e Shklar
27
(1970)
como animais utilizados por Steiner, em 1942, juntamente com ratos,
hamsters e camundongos. Os experimentos de nossa pesquisa foram
conduzidos em ratos. Estes animais se apresentaram como bons
modelos animais. Seu manuseio não foi complicado e não existiu
necessidade de muitos cuidados em relação à sua alimentação e
hidratação. O controle clínico dos animais também pôde ser levado a
curso sem complicações. Sua anatomia e histologia glandular foram
de fácil reconhecimento, proporcionando o estudo macroscópico e
microscópico das lesões.
Em carcinogênese glandular, os diferentes
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, dentre eles o DMBA, podem
ser implantados (CATALDO et al.
3
, 1964; CHAUDHRY et al.
5
, 1966;
TURBINER & SHKLAR
34
, 1969; EL-MOFTY
8
, 1977; HINDY et
al.
17
, 1995) ou injetados (SCHMUTZ & CHAUDHRY
25
, 1969;
WIGLEY & CARBONELL
37
, 1976; TAKAI et al.
31
, 1984; ZAMAN
et al.
40
, 1996; TSUJIMOTO et al.
33
, 1999; OGAWA et al.
23
, 2000;
YURA et al.
39
, 2001) por meio de procedimento cirúrgico de
exposição do órgão glandular ou não. Na presente pesquisa optou-se
pela cirurgia do animal por meio de uma incisão modificada. Ao invés
de um corte cervical central utilizamos uma abordagem cirúrgica por
incisão paramediana esquerda. Assim, conseguimos evidenciar a
glândula submandibular esquerda sem a necessidade de extensa
divulsão.
Existem marcadas incongruências no que concerne
ao uso de pellets de DMBA. Não são fornecidos dados consistentes
em relação às dimensões, à forma e a maneira de se confeccionar estes
implantes. Alguns autores somente citam uma ou duas características
quaisquer do pellet, como Chaudhry e al.
5
(1969) que apresentam a
dimensão de 1mm
3
e o veículo sendo propilenoglicol. Uma vez que as
descrições sobre implantação de pellets de DMBA são parcamente
ilustradas, decidiu-se pela utilização da injeção de DMBA em acetona,
por ser este procedimento mais fácil de ser reproduzido e conduzido.
Em relação à indução de tumores por meio de injeção
de DMBA, nota-se, claramente, a não uniformidade dos estudos. As
concentrações de DMBA variaram de 0,1% a 4% conforme aludiu
Hindy et al.
17
(1995), sempre em volume constante de 0,05ml. Outros
autores apontaram para concentrações de 1% (TSUJIMOTO et al.
33
,
1999; IDE et al.
19
, 2004) e 2% (SCHMUTZ & CHAUDHRY
25
, 1969).
Os veículos utilizados também diferem entre pesquisadores. Schmutz
& Chaudhry
25
(1969) utilizaram uma solução vaselinada de DMBA.
Uma emulsão com KY gel e DMBA pode ser preparada, segundo
Wigley & Carbonell
37
(1976). Para Takai et al.
31
(1984), o óleo de
oliva foi a substância veicular de eleição. Zaman et al.
40
(1996) e
Ogawa et al.
23
(2000), associaram o DMBA à acetona. Em nossos
experimentos, a acetona foi utilizada para a dissolução do DMBA.
Obtivemos uma boa solução para veicular 0,1ml de DMBA a 2% nas
glândulas submandibulares dos ratos.
Não há dissonância na história natural dos carcinomas
induzidos através de implantação de DMBA na forma de pellets. As
fases degenerativa, proliferativa, metaplásica e neoplásica maligna
foram primeiramente apontadas por Cataldo et al.
3
(1964) e
confirmadas pelos autores que os sucederam. Contudo, a gênese das
lesões causadas por injeção de carcinógeno não foi, ainda, referida na
literatura. A ocorrência de outras neoplasias também não foi
acompanhada das descrições de sua história natural. Sob forma de
crítica, Ogawa et al.
23
(2000) reportam que Zaman et al.
40
(1996) não
se interessaram em descrever as características dos adenocarcinomas
induzidos por DMBA, tão pouco seus constituintes celulares.
A história natural das neoplasias induzidas em nossos
experimentos, em contraste com os achados de Cataldo et al.
3
(1964),
pôde evidenciar semelhanças e diferenças, conforme se segue. A fase
degenerativa foi percebida no primeiro grupo de nosso experimento,
através do reconhecimento de necrose e reação inflamatória
polimorfonuclear com apagamento das estruturas acinares e
persistência dos ductos. Todavia, preferiu-se a denominação de
sialadenite crônica uma vez que este quadro histológico pareceu-nos
traduzir melhor as manifestações histomorfológicas presentes. A
ocorrência de células gigantes percebida por Standish
28
(1957) na
primeira fase da implantação de DMBA não foi verificada. Estes
achados se mostraram ocasionais no terceiro grupo de sacrifício de
nossos ratos.
A segunda fase, denominada proliferativa por Cataldo
et al.
3
(1964), foi marcada por proliferação de epitélio ductal,
formação de cistos acompanhados de displasias epiteliais e elementos
carcinomatosos ao redor dos pellets de DMBA, em estroma
hialinizado. O segundo grupo de sacrifício de nosso experimento
evidenciou um caso de atipia celular ductal, dois casos de carcinoma
epidermóide e quatro casos de sialadenite crônica. Pareceu-nos que
nossos achados não se distanciaram muito daqueles do referencial
teórico. Todavia, achamos muito importante adicionar dados
referentes ao estroma conjuntivo. A histopatologia das lesões
avaliadas por nós evidenciou ocasional desmoplasia, pleomorfismo
celular fibroblástico e proliferação eventual de estruturas nervosas.
Critica-se a pouca consideração do estroma nas descrições dos autores
como Cataldo et al.
3
(1964), Turbiner & Shklar
34
(1969) e Shklar
27
(1970).
A terceira fase, denominada metaplásica, foi
caracterizada pela presença de metaplasia escamosa nas paredes dos
cistos, ocorrência de hiperplasia epitelial e profusão na produção de
ceratina (CATALDO et al.
3
, 1964). Nossas avaliações, entretanto,
apontaram para lesões com características mais definidas. Ao invés de
uma fase com figuras de metaplasia, encontramos imagens celulares e
teciduais de neoplasias. Assim sendo, diagnosticamos dois casos de
carcinoma e quatro casos de carcinossarcoma. Vale lembrar que a não
observação do estroma não nos permitiria o diagnóstico das neoplasias
malignas mistas, ou seja, os carcinossarcomas. Um caso de hiperemia
foi diagnosticado, sem ser acompanhado de atipias.
A última etapa, conhecida por fase neoplásica maligna
foi identificada pela ocorrência de carcinomas epidermóides
(CATALDO et al.
3
,1964). Para o nosso estudo, fica claro que na
ocasião do terceiro sacrifício, nossa pesquisa já se apresentava
próxima da fase neoplásica maligna. O quarto grupo estudado por nós
apresentou um caso de carcinoma, um caso de sarcoma e três casos de
carcinossarcoma. Novamente, faz-se mister recordar a importância na
observação do estroma conjuntivo. Fica evidente, também, que as
neoplasias induzidas experimentalmente podem ser bifásicas,
associando carcinoma e sarcoma. Dois animais apresentaram-se com
sinais histológicos de hiperemia e ausência de atipias celulares.
Cataldo et al.
3
(1964), apesar de não considerarem a
formação de neoplasias mesenquimais em seu estudo, fazem alusão a
uma hialinização peri-implante de pellet de DMBA. Suas descrições
contemplam a presença sempre constante de fibroblastos atípicos,
principalmente nos últimos grupos de animais sacrificados. Um caso
de alterações teciduais sarcomatosas também é citado por estes
autores. Se mostra patente a não valorização das atipias celulares
fibroblásticas. Talvez por que, segundo Alvarez-Cañas & Rodilla
1
(1996), o reconhecimento de tumores mistos malignos
(carcinossarcomas) só se deu em 1967, com King.
Segundo Wigley & Carbonell
37
(1976), a carcinogênese
de glândulas salivares em camundongos pode produzir carcinomas e
fibrossarcomas síncronos. Estes autores concluíram que as lesões não
têm relação entre si. Faz-se mister lembrar que em 1984, Takai et al.
31
apontaram ocorrências de carcinomas associados a sarcomas. Estes
autores denominaram o encontro destas figuras histopatológicas como
“tumores de colisão”. A mais recente classificação de tumores de
cabeça e pescoço da Organização Mundial da Saúde (OMS),
reconhece uma neoplasia glandular com aspectos carcinomatosos e
sarcomatosos denominada carcinossarcoma (GNEPP
13
, 2005). A
pesquisa por nós conduzida revelou a associação de sarcomas a
carcinomas em 25% dos casos relativos à carcinogênese por DMBA
em 28 ratos. Estes animais foram diagnosticados como portadores de
carcinossarcomas, em total acordo com a classificação da OMS.
O estudo experimental de neoplasias salivares animais
é pertinente uma vez que os tumores primitivos de glândulas salivares
em humanos são relativamente raros. Todavia, a carcinogênese
química, apesar de servir ao propósito de permitir o estudo de
neoplasias induzidas, não deve ter seus resultados sempre
extrapolados para os seres humanos. Um exemplo deste fato pode ser
verificado no que concerne à carcinogênese de pulmão em
camundongos cepa A. As neoplasias podem ser induzidas com
substâncias diferentes, como o 4NQO, dieta de gorduras ou ferro e
inalação de cloreto de sódio e exposição oral ao glicerol (ENZMANN
et al.
10
, 1998).
É importante lembrar que as neoplasias diagnosticadas
nos animais pesquisados por nós constituem lesões primitivas
extremamente raras em parênquimas glandulares humanos. O
carcinoma de células escamosas é diagnosticado em menos de 1% dos
casos (DARDICK
7
, 1996; LEWIS & OLSEN
21
, 2005; SHAPIRO &
BHATTACHARYYA
26
, 2006). Os sarcomas respondem por 0,3% das
neoplasias malignas (GNEPP
14
, 2005) e os carcinossarcomas por
0,16% dos casos (ALVAREZ-CAÑAS & RODILLA
1
, 1996). Uma
vez que as manifestações destas neoplasias não são esperadas em
nosologia tumoral humana, fica patente a importância da
carcinogênese experimental para ofertar material de estudo.
A histopatologia dos carcinomas em humanos, descrita
por Dardick
7
(1996), parece-nos guardar semelhanças importantes em
relação aos tumores induzidos quimicamente em animais. O
reconhecimento de metaplasia e displasia escamosa ductal, além das
figuras carcinomatosas nos remete aos quadros histológicos dos ratos
estudados. A presente pesquisa foi capaz de evidenciar casos de
carcinossarcomas não valorizados pelos autores consultados. No caso
do sarcoma e nos casos de carcinossarcomas, entendemos que há a
necessidade de se escrutar as peculiaridades de cada lesão, com o
intuito de se conhecer os reais componentes mesenquimais das
neoplasias em questão.
7 CONCLUSÃO
Contrastando-se os dados clínicos e histológicos
obtidos com o referencial teórico, pôde-se concluir que:
a) a carcinogênese experimental em glândulas
submandibulares de ratos, por meio de injeção de
DMBA, se apresentou como uma metodologia
viável na indução de neoplasias glandulares;
b) a metodologia de injeção de DMBA em glândulas
salivares de ratos é segura, uma vez que a indução
se faz em um único tempo cirúrgico;
c) a maioria dos autores consultados não fez
referências ou não interpretou de maneira acurada
os próprios resultados histológicos no que se refere
a participação do estroma conjuntivo em suas
neoplasias induzidas;
d) a ocorrência de carcinossarcomas deve ser
considerada no diagnóstico das neoplasias salivares
induzidas por DMBA intra-glandular, em modelo
experimental;
e) os padrões histológicos neoplásicos evidenciados
em nosso experimento foram: sarcoma, carcinoma
epidermóide e carcinossarcoma.
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Anexo A – Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo B – Resultados dos diagnósticos histopatológicos
MAINENTI, P. Chemical carcinogenesis in rat (rattus norvegicus)
submandibular gland using DMBA. 2006. 94f. Dissertação
(Mestrado em Biopatologia Bucal, área Biopatologia Bucal)-
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade
Estadual Paulista, São José dos Campos, 2006.
ABSTRACT
The carcinogenesis consists in a process in which the direct contact between cells
and some physical, chemical or biological agents results in cell malignization. In
the scope of experimental salivary gland carcinogenesis there is a consensus in the
use of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) as carcinogens. The 7,12 –
dimethylbenzanthracene (DMBA) is the most used PAH. This paper aims the
investigations of the DMBA injected in rats submandibular glands. For this
purpose, 28 rats (Rattus norvegicus), three months old (300 gr. weight,
approximately) were used. The animals were divided into four groups of seven
each. All animals were anesthetized and shaved in the neck. After antisepsis, one
ventral neck incision, followed by dissection was performed in each animal. The
left submandibular gland was injected with 0.1 ml of 2% DMBA in acetone. The
skin was closed with 3-Ø silk suture. By the end of the 5
th
, 10
th
, 15
th
and 20
th
weeks the animals were sacrificed by lethal doses of anesthetics. The results in the
5
th
week presented seven cases of chronic sialadenitis. After 10 weeks one case of
ductal cell atypia was evident, two cases of squamous cell carcinoma and four
cases of chronic sialadenitis were also seen. Between the 15
th
and 20
th
weeks the
cases were diagnosed as follows: three cases of hyperemia, three cases of
squamous cell carcinoma, one case of sarcoma and seven cases of
carcinosarcoma. The data analysis showed 3.6% of cellular atypia, 3.6% of
sarcoma, 10.7% of hyperemia, 17.9% of squamous cell carcinoma, 25% of
carcinosarcoma and 39.4% of chronic sialadenitis. Conclusion: the results allowed
the investigation of the glandular carcinogenesis natural history after DMBA
injection, from the beginning of inflammatory changes to the neoplastic
manifestation of mesenquimal, epithelial and mixed tumours.
KEYWORDS: Carcinogenesis, salivary gland, DMBA, neoplasia.
Autorizo a reprodução xerográfica deste trabalho.
São José dos Campos, 19 de setembro de 2006.
PIETRO MAINENTI
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