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GISELLE SEGNINI SENRA
ESTUDO COMPARATIVO DE REPARAÇÃO ÓSSEA EM
RATAS OVARIECTOMIZADAS TRATADAS COM
RISEDRONATO E Calcarea fluorica
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
MESTRE, pelo Programa de Pós Graduação
em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área
Biopatologia Bucal.
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1
GISELLE SEGNINI SENRA
ESTUDO COMPARATIVO DE REPARAÇÃO ÓSSEA EM
RATAS OVARIECTOMIZADAS TRATADAS COM
RISEDRONATO E Calcarea fluorica
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos, Universidade Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de
Pós Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Biopatologia
Bucal.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Aigotti Haberbeck Brandão
São José dos Campos
2006
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2
Ao LINCOLN,
meu marido, presente que Deus me proporcionou.
Homem que me traz equilíbrio, pela sua sabedoria;
segurança, pela sua força e dedicação e que
me envolve com inesgotável fonte de amor.
Te amo!
3
À minha princesa LÍVIA,
criança cheia de sensibilidade e amor,
amiga que me enche de afagos nas horas difíceis,
companheira em todos os momentos, inclusive os de estudo,
sorriso que traz luz e alegria para a minha vida.
Filha, você é a minha vida!
4
Aos meus pais, ALDO e LENIRA,
pelo amor, apoio e abnegação; por estarem sempre prontos
para virem me socorrer, apesar da distância;
pela confiança que sempre depositaram em mim e
por me alegrarem com esse jeito peculiar que vocês têm
e que eu amo profundamente.
Aos meus irmãos, NADJA, DINHO e CALI,
que além de irmãos são meus amigos, cada um do seu modo,
e peças importantes na estrutura da minha vida.
Obrigada por nos mantermos tão próximos, apesar da
correria de nossas vidas e da distância que nos separa.
5
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Profª. Drª. ADRIANA AIGOTTI HABERBECK BRANDÃO,
você é uma pessoa de grandeza incomensurável, professora de
conhecimento e capacidade extremos, orientadora de
dedicação e paciência sem fim, amiga presente, exemplo de
sabedoria e equilíbrio. Agradeço à Deus e à você por me
permitirem partilhar dessa convivência com pessoa tão
iluminada, que trouxe ensinamentos de toda natureza para a
minha vida.
Profª. Adjunta ROSILENE FERNANDES DA ROCHA,
pessoa importante da minha jornada profissional,
agradeço pelo acolhimento, pelo carinho e amizade que
sempre me reservou, por todos os ensinamentos recebidos e,
principalmente, pelo exemplo de força e de pessoa valorosa.
6
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, representada pelo Diretor da Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Prof. Dr. PAULO VILELA SANTOS JÚNIOR,
por possibilitar a realização desse mestrado.
À COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE
PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR (CAPES) pelo apoio financeiro.
À Prof. Adjunta YASMIN RODARTE CARVALHO,
pelas sugestões, auxílios e colaboração durante a realização deste
curso.
Ao Prof. Adjunto LUIZ EDUARDO BLUMER ROSA,
pelo apoio e sugestões em diversos momentos.
Ao Prof. Titular Dr. LUIZ CÉSAR DE MORAES pela
disposição e simpatia no auxílio da análise radiográfica.
Ao técnico de laboratório WALTER CRUZ, pelo
preparo do material histológico, mas principalmente pela paciência e
amizade.
A CAMILO DALELES RENNÓ pela competência na
realização da análise estatística deste estudo.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação,
ROSEMARY DA FÁTIMA SALGADO, ERENA MICHIE HASEGAWA
e MARIA APARECIDA CONSIGLIO DE SOUZA, pela atenção e
disponibilidade.
7
À secretária SÍLVIA SCARPEL, pela ajuda e
compreensão em todas as dúvidas, pelos conselhos e orientações
profissionais.
À bibliotecária ÂNGELA DE BRITO BELLINI, pela
disponibilidade e paciência na revisão deste estudo.
Aos funcionários do Biotério, LOURIVAL JACOB e
ANTÔNIO DOMINGOS SÁVIO BARBOSA MAIA VASCONCELOS
pela colaboração na fase experimental desta pesquisa.
Aos ANIMAIS EXPERIMENTAIS cujas vidas foram
sacrificadas em benefício do progresso da ciência, a eles o meu
profundo respeito.
A todos os COLEGAS DO PROGRAMA DE PÓS-
GRADUAÇÃO pelo agradável convívio e pela colaboração direta ou
indireta na realização deste estudo. Em especial, PIETRO
MAINENTI, FLÁVIA CELINA SGARBI, MÔNICA DAL PIAN
NOBRE, RODRIGO DIAS NASCIMENTO, CAROLINA JÚDICA
RAMOS, ANDRESA COSTA PEREIRA, SUSANA UNGARO
AMADEI, VANESSA ÁVILA SARMENTO SILVEIRA, ANA
CRISTINA POSCH, DANIELA MARTINS SOARES e ANGELA
BOLANHO.
À amiga CRISTINA WERKMAN, sempre prestativa,
pelo tempo dedicado à colaboração em todas as fases da realização
deste estudo, tornando-o possível de ser realizado.
Aos amigos PATRICIA PASQUALI DOTTO e
GUSTAVO NOGARA DOTTO, que me incentivaram em todos os
momentos, antes e durante a realização deste mestrado, e confiaram
na minha capacidade antes mesmo que eu o fizesse.
8
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...............................................10
RESUMO ............................................................................................. 13
1 INTRODUÇÃO..................................................................................14
2 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................16
2.1 Remodelação óssea .....................................................................16
2.2 Osteoporose ..................................................................................28
2.3 Modelos experimentais de osteoporose ........................................38
2.4 Reparação óssea...........................................................................42
2.5 Bifosfonatos ...................................................................................48
2.6 Homeopatia.................................................................................... 58
3 PROPOSIÇÃO..................................................................................65
4 MATERIAL E MÉTODO....................................................................66
4.1 Animais e grupos experimentais....................................................66
4.2 Método...........................................................................................67
4.2.1 Anestesia ....................................................................................67
4.2.2 Procedimentos cirúrgicos............................................................67
4.2.2.1 Ovariectomia e falsa ovariectomia (Sham) .............................. 67
4.2.2.2 Execução da lesão óssea ........................................................70
4.2.3 Tratamento..................................................................................72
4.2.4 Sacrifício e tempos experimentais .............................................. 73
4.2.5 Análise do reparo ósseo .............................................................73
4.2.5.1 Análise radiográfica .................................................................73
4.2.5.2 Análise histológica ...................................................................75
4.2.5.3.Análise histomorfométrica........................................................76
4.2.6 Análise estatística.......................................................................80
5 RESULTADO....................................................................................82
5.1 Densidade óptica ........................................................................... 82
9
5.1.1 Análise estatística dos grupos O e S ..........................................82
5.1.2 Análise estatística dos grupos R, Cf e O.....................................86
5.2 Análise histomorfométrica..............................................................89
5.2.1 Preenchimento com tecido ósseo nos grupos O e S ..................89
5.2.2 Preenchimento com tecido ósseo nos grupos R, Cf e O ............92
5.2.3 Área de osso trabecular nos grupo O e S...................................95
5.2.4 Área de osso trabecular nos grupos R, Cf e O ........................... 99
5.3 Análise histológica descritiva .........................................................103
5.3.1 Período de três dias....................................................................103
5.3.2 Período de seis dias. ..................................................................104
5.3.3 Período de 12 dias......................................................................105
5.3.4 Período de 18 dias......................................................................108
5.3.5 Período de 24 dias......................................................................111
6 DISCUSSÃO.....................................................................................114
CONCLUSÃO ......................................................................................130
8 REFERÊNCIAS ................................................................................131
ANEXO ...............................................................................................148
ABSTRACT..........................................................................................149
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µM = Micromolar
1,25(OH)
2
D
3
= Vitamina D
AP = Fosfatase Alcalina
BFs = Bifosfonatos
bmp = Bitmap
BMP = Proteína Óssea Morfogenética
BMU = Unidade Multicelular Básica
Ca
2+
= Íons Cálcio
CaF
2
= Fluoreto de Cálcio
CATK = Catepsina K
Cbfa1 = Core Binding Factor A1
CCD = Charged-Coupled Device
Cf = Ratas Ovariectomizadas e Tratadas com Calcarea fluorica
CFU-F = Unidades Formadoras de Colônias de Fibroblastos
CFU-OB = Unidades Formadoras de Colônias de Osteoblastos
CH = Escala Centesimal Hahnemanniana
cm = Centímetros
COBEA = Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
COLIA1 = Receptor do Colágeno tipo I alpha 1
D = Escala Decimal
DEXA = Absorciometria Dupla de Emissão de Raios X
DMO = Densidade Mineral Óssea
DO = Densidade Óptica
EGF = Fator de Crescimento Epidérmico
ER = Receptor de Estrógeno
11
FDA = Food and Drug Administration
FGF = Fator de Crescimento de Fibroblastos
GH = Hormônio de Crescimento
GM-CSF = Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos-Macrófagos
H+ = Íons de Hidrogênio
H
2
O
2
= Peróxido de Hidrogênio
IFN γ = Interferon γ
IGF = Fator de Crescimento Semelhante à Insulina
IL = Interleucina
Kg = Quilogramas
LCD = Dieta Pobre em Cálcio
LIF = Fator Inibidor de Leucemia
M-CSF = Fator Estimulante de Colônias de Macrófagos
mg = Miligramas
MgHPO
4
= Magnesia phosphorica
mm = Milímetros
MMP = Metaloproteinases
N = Normal
NaCl = Cloreto de Sódio
NaF = Fluoreto de Sódio
NCCAM = National Center for Complementary and Alternative Medicine
NOF = National Osteoporosis Foundation
O = Ratas Ovariectomizadas e Tratadas com Placebo
ODF = Fator de Diferenciação de Osteoclastos
OMS = Organização Mundial da Saúde
OP = Osteoprotegerina
OPGL = Ligante da Osteoprotegerina
OVX = Ovariectomia ou Ovariectomizado
PDGF = Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas
PGE
2
= Prostaglandina E
2
PTH = Paratormônio
12
PTHR1 = Receptor do PTH Humano
R = Ratas Ovariectomizadas e Tratadas com Risedronato
RANK = Receptor Activator for Nuclear Factor
κ
B
RANK-L = Ligante do RANK
RGD = Seqüência de Aminoácidos Arg-Gly-Asp
RNAm = Ácido Ribonucléico Mensageiro
S = Ratas Sham (falso ovariectomizadas) e Tratadas com Placebo
s = Segundos
SHR = Spontaneously Hipertensive Rats
SiO
2
= Silicea
T4 = Hormônio Tireoideano Tiroxina
TGF-β = Fator de Crescimento Transformante-β
TNF = Fator de Necrose Tumoral
TRAP = Fosfatase Ácida Tartarato-Resistente
vATPase = ATPase Vacuolar
VDR = Receptor de Vitamina D
13
SENRA, G.S. Estudo comparativo de reparação óssea em ratas
ovariectomizadas tratadas com risedronato e Calcarea fluorica. 2006.
149f. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal, Área Biopatologia
Bucal) - Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, São José dos Campos, 2006.
RESUMO
O aumento da expectativa de vida amplia as possibilidades de doenças degenerativas,
como osteopenia e osteoporose, que elevam a ocorrência de fraturas e demandam
tratamento prolongado. Os medicamentos usados no tratamento da osteoporose podem
interferir no reparo ósseo de fraturas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do
Risedronato (1,5mg/kg/dia) e do medicamento homeopático Calcarea fluorica 6CH (3
gotas/dia) no reparo ósseo em ratas com osteopenia induzida. Para isso, 105 ratas foram
submetidas à ovariectomia e 35 ratas à cirurgia sham. Após 35 dias, lesões
monocorticais de 2,5mm foram realizadas nas tíbias quando, então, iniciou-se a
medicação. Os animais ovariectomizados foram divididos em três grupos e um recebeu
Calcarea fluorica (Cf), outro risedronato (R) e, o terceiro (O), bem como o grupo sham
(S), receberam água destilada para efeito placebo. Após três, seis, 12, 18 e 24 dias de
tratamento, sete animais de cada grupo foram sacrificados, as tíbias removidas,
radiografadas para análise da densidade óptica, descalcificadas e processadas para
análise histológica e histomorfométrica. Os dados foram submetidos aos testes ANOVA
e Tukey (5%). Segundo a análise de densidade óptica (n=7), não houve diferença entre
os tratamentos aos três, seis e 12 dias e, aos 18 e 24 dias, o grupo R mostrou os valores
mais altos (p<0,05). Através da histomorfometria, foi avaliada a porcentagem de
preenchimento com osso neoformado na área total disponível compreendendo o defeito
e a cavidade medular e também a porcentagem de osso trabecular dentro da área
preenchida pelo calo ósseo aos seis, 12, 18 e 24 dias de tratamento (n=6). Em relação à
área de preenchimento total, o grupo R superou os valores dos demais (p<0,05)
enquanto que os grupos Cf e O se mostraram com valores iguais em todos os períodos
de tempo, diferindo somente aos seis dias, quando o grupo Cf foi superior ao O. A
porcentagem de área trabecular dentro da área preenchida pelo calo aos seis, 12 e 18
dias não foi diferente entre os grupos R, Cf e O. Aos 24 dias o grupo O apresentou os
maiores valores de área trabecular, sendo diferente do grupo R, com os menores
valores, e o grupo Cf mostrou valores intermediários. Concluiu-se que a ovariectomia
interferiu de forma prejudicial no reparo e que o medicamento risedronato foi o que
estimulou a maior formação óssea e a menor remodelação. A Calcarea fluorica 6CH
estimulou maior formação óssea nas fases iniciais da reparação quando comparada ao
grupo O, mas não interferiu negativamente na remodelação.
PALAVRAS-CHAVE: Alopatia; difosfonatos; homeopatia; Calcarea fluorica
6CH; regeneração óssea; osteoporose; ratos; radiografia dentária digital;
histomorfometria.
14
1 INTRODUÇÃO
A osteoporose é uma doença metabólica que leva à
deterioração da microarquitetura óssea e diminuição da massa óssea. A
manifestação clínica mais comum da osteoporose é representada pela
ocorrência de fraturas.
A osteoporose é um problema crescente de saúde pública
no mundo devido à ocorrência de longevidade aumentada. Também a
população brasileira acima dos 65 anos de idade já é a que mais cresce e
tende a elevar-se. Alta taxa de mortalidade, morbidade e os custos do
tratamento são importantes prejuízos trazidos pelas fraturas
osteoporóticas. Assim, a reparação óssea é um dos assuntos de estudo
mais urgentes numa sociedade que envelhece porque uma reparação de
fratura prejudicada pode aumentar dramaticamente a morbidade de
pacientes idosos.
Os aspectos de maior interesse ortopédico são: a
fragilidade óssea, a eficácia da fixação de implantes e a consolidação de
fraturas. A osteoporose muda o curso da reparação óssea através da
diminuição do volume e da velocidade de formação do calo ósseo.
Nos últimos anos, muita atenção tem sido dada aos
efeitos potenciais dos medicamentos usados para tratar a osteoporose na
reparação de fraturas advindas desta doença.
Existe uma variedade de tratamentos disponíveis para o
tratamento da osteoporose. Tratamentos anti-reabsortivos que incluem o
cálcio, vitamina D, bifosfonatos, calcitonina e a terapia de reposição
hormonal têm demonstrado alguma prevenção da perda óssea ou
redução de ocorrência de fraturas. Medicamentos anabólicos, que
15
estimulam a formação óssea como os fluoretos, o paratormônio e
análogos também têm sido considerados. Tem-se também testemunhado
crescente interesse por tratamentos alternativos como fitoterapia e
homeopatia.
Os bifosfonatos constituem um tipo de tratamento muito
utilizado para a osteoporose. Entre eles, o risedronato tem se mostrado
como medicamento que não só diminui a perda óssea, mas também
estimula a formação de novo osso. No entanto, é um tratamento
dispendioso e acompanhado de alguns efeitos adversos, principalmente
se considerarmos a necessidade do uso prolongado, justificando a
pesquisa de novos tipos de tratamento.
A homeopatia curativa oferece uma alternativa
interessante aos tratamentos clássicos, uma vez que é de baixo custo e
apresenta poucos efeitos adversos, porém, com escassos trabalhos
científicos explorando seus efeitos. A Calcarea fluorica encontra-se entre
os principais medicamentos homeopáticos de tropismo ósseo com
possibilidade de atuação positiva no reparo de fraturas ocorridas no
decorrer da osteoporose.
Assim, este trabalho se propõe a comparar a ação desse
medicamento homeopático ao risedronato, que representa uma das
classes de medicamentos alopáticos mais indicadas em casos de
osteoporose.
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Remodelação óssea
O osso é um tecido mineralizado que confere múltiplas
funções mecânicas e metabólicas ao esqueleto (DUCY et al.
28
, 2000),
entre elas a manutenção do nível sangüíneo de cálcio, provisão de
suporte mecânico para tecidos moles e de alavanca para a ação
muscular, abrigando a hematopoiese e dando alojamento e proteção para
o cérebro e a medula espinhal (HARADA & RODAN
39
, 2003).
É um tecido surpreendente, pois, embora sua aparência
dê a impressão errônea de inatividade, o osso está em constante
atividade, não só no esqueleto imaturo, no qual o crescimento e o
desenvolvimento são rapidamente aparentes, mas também no esqueleto
maduro, através de constantes e equilibrados processos de formação e
reabsorção (RESNICK et al.
83
, 1995), a remodelação óssea. Na
remodelação, que não está relacionada ao crescimento, o processo é
muito mais lento (JUNQUEIRA & CARNEIRO
45
, 2004; RESNICK et al.
83
,
1995) e diferentemente da modelação, onde o osso é removido de um
local e formado em um local diferente, ocorre neoformação óssea no
mesmo local da reabsorção (MANOLAGAS
63
, 2000).
A atividade metabólica normal do esqueleto adulto,
intimamente relacionada à homeostase do cálcio e do fósforo, envolve
predominantemente o processo cíclico e contínuo de destruição e
renovação ósseas, a remodelação (SZEJNFELD
102
, 2000; GUEDES
JÚNIOR et al.
36
, 2003; JUNQUEIRA & CARNEIRO
45
, 2004; RANG et al.
82
,
17
2004). A função óssea de promover a homeostase do cálcio se sobrepõe
às outras funções do esqueleto. A mobilização de cálcio do osso requer
reabsorção óssea e os principais mediadores deste processo são o
paratormônio (PTH) e a 1,25(OH)
2
vitamina D
3
(HARADA & RODAN
39
,
2003).
A remodelação é responsável pela completa renovação
do esqueleto adulto a cada dez anos (MANOLAGAS
63
, 2000).
Para Ham
38
(1975) a remodelação é necessária porque os
sistemas de Havers no osso compacto, ou as trabéculas no osso
esponjoso, não duram por toda a vida do adulto. Alguns sistemas, ou
parte deles são reabsorvidos, enquanto novos são construídos nos túneis
formados pela reabsorção. A formação de novo osso, ou mudança na
disposição das trabéculas do osso esponjoso ou mesmo do osso cortical
podem melhorar a capacidade da estrutura óssea em suportar peso ou
resistir a um novo tipo de força mecânica. Assim, a remodelação também
é estimulada pela alteração da função do osso.
O reparo de microfraturas é obtido através da
remodelação (RESNICK et al.
83
, 1995; BANDEIRA et al.
7
, 2000), assim
como a preservação da massa óssea e de sua arquitetura (GUEDES
JÚNIOR et al.
36
, 2003).
A duração da fase reabsortiva da remodelação óssea é
estimada em duas a três semanas enquanto que a fase neoformadora
dura cerca de três meses. Esses processos ocorrem de maneira
conjugada, de forma que a neoformação óssea seja sempre precedida
por reabsorção óssea (MUNDY
66
, 1999; SZEJNFELD
102
, 2000; HARADA
& RODAN
39
, 2003).
A remodelação acontece em várias áreas microscópicas e
focais dispersas pelo esqueleto, ocorrendo de forma cronológica e
geograficamente separadas umas das outras (MUNDY
66
, 1999). Em
adultos sadios, três a quatro milhões de sítios de remodelação são
iniciados por ano e cerca de um milhão estão ativos num dado momento
18
(MANOLAGAS
63
, 2000).
A reabsorção óssea é tarefa dos osteoclastos e a
formação de novo osso dos osteoblastos. No esqueleto adulto íntegro,
todos osteoclastos e osteoblastos pertencem a estruturas temporárias
conhecidas como unidade multicelular básica (basic multicellular unit -
BMU). Uma BMU mede, aproximadamente, 1-2mm de comprimento e 0,2-
0,4mm de largura e compreende um grupo de osteoclastos na frente, um
outro de osteoblastos na retaguarda, um capilar central, além de
suprimento nervoso e tecido conjuntivo associados. A sobrevida de uma
BMU é de seis a nove meses, maior do que a sobrevida de suas células
executoras, sendo necessário suprimento contínuo de novas células
(MANOLAGAS
63
, 2000).
A seqüência de eventos dentro da unidade de
remodelação óssea parece ocorrer em quatro fases distintas: ativação,
reabsorção, reversão e formação. Durante a fase de ativação, células
precursoras presentes na medula óssea, respondendo a sinais físicos e
hormonais, concentram-se sobre determinada região da superfície óssea,
fundem-se e transformam-se em osteoclastos multinucleados que
realizarão a reabsorção (SZEJNFELD
102
, 2000).
Os osteoclastos são células móveis, gigantes,
extensamente ramificadas, que contêm seis a cinqüenta ou mais núcleos.
Possuem citoplasma granuloso, algumas vezes com vacúolos, fracamente
basófilo nos osteoclastos jovens e acidófilo nos maduros com complexo
de Golgi, e por vezes, retículo endoplasmático rugoso bem desenvolvidos.
A superfície ativa dos osteoclastos, voltada para a matriz óssea,
apresenta prolongamentos vilosos irregulares formando pregas.
Circundando essa área com prolongamentos, existe uma zona
citoplasmática, a zona clara, pobre em organelas, porém contendo muitos
filamentos de actina, local de adesão do osteoclasto com a matriz óssea
(HAM
38
, 1975; JUNQUEIRA & CARNEIRO
45
, 2004).
A proliferação de precursores de osteoclastos é
19
estimulada fortemente pelo fator estimulante de colônias de macrófagos
(M-CSF), produzido pelos osteoblastos, e mais fracamente pelo fator
estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e pela
interleucina-3 (IL-3) (ATHANASOU
5
, 1996).
Athanasou
5
(1996) afirma que os osteoclastos são
membros do sistema fagocítico-mononuclear; derivados de células-tronco
hematopoiéticas pluripotentes, seguem a linhagem hematopoiética de
monócitos-macrófagos e têm também precursores circulantes, os
monócitos e macrófagos. No microambiente celular e hormonal do osso,
monócitos, macrófagos e seus precursores hematopoiéticos são todos
capazes de se diferenciar em osteoclastos que irão formar lacunas de
reabsorção e expressar receptores para calcitonina, ambas características
exclusivas destas células, além de expressar a fosfatase ácida tartarato-
resistente (TRAP), todas características que não estão presentes em seus
precursores. A diferenciação osteoclástica requer a presença de células
do estroma da medula óssea e osteoblastos, células que têm papel
central na ativação e controle hormonal da ação osteoclástica.
Quando são feitas coculturas de precursores de
osteoclastos e células osteoblásticas separadas por membrana,
osteoclastos não se diferenciam, mesmo na presença de agentes
reabsortivos. Células osteoblásticas modulam o desenvolvimento de
osteoclastos por mecanismos que requerem interação célula/célula
(UDAGAWA et al.
111
, 1995). Outros autores afirmam que em adição aos
sinais autócrinos, parácrinos e endócrinos, as interações célula/célula e
célula/matriz são necessárias para o desenvolvimento de osteoclastos e
osteoblastos. Estas interações são mediadas por proteínas expressas na
superfície dessas células e seriam responsáveis pelo contato entre o
precursor do osteoclasto e células do estroma ou osteoblastos. Moléculas
de adesão estariam envolvidas na migração destas células ao local de
reabsorção e na polarização, ativação e apoptose de osteoclastos
(ATHANASOU
5
, 1996; MANOLAGAS
63
, 2000).
20
Fato importante na compreensão da biologia do
osteoclasto foi a descoberta da RANK-L (RANK ligand) e da
osteoprotegerina (OPG). A RANK-L é uma molecula sinalizadora da
família do fator de necrose tumoral (TNF), secretada por osteoblastos.
Sua presença é necessária e suficiente para a diferenciação de
osteoclastos a partir de seus precursores que apresentam o receptor
RANK (receptor activator for nuclear factor
κ
B) (ZAIDI et al.
120
, 2003), um
receptor de diferenciação e ativação de osteoclasto. Boyle et al.
15
(2003)
também citam o M-CSF como imprescindível na osteoclastogênese e
outros autores (KONG & PENNINGER
51
, 2000) afirmam que nem o
RANK-L nem o M-CSF são capazes de induzir osteoclastos sozinhos,
somente atuando em sinergismo.
Fatores que estimulam o desenvolvimento de
osteoclastos incluem a prostaglandina E
2
(PGE
2
) (BANDEIRA et al.
7
,
2000; BOYLE et al.
15
, 2003) interleucinas IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, fator
inibidor de leucemia (LIF), oncostatina M, fator neurotrópico ciliar, TNF,
GM-CSF, M-CSF, ligante c-kit, fator de crescimento transformante-β
(TGF-β), PTH e 1,25(OH)
2
vitamina D
3
. Atuando em oposição estão a IL-
4, IL-10, IL-18, interferon γ (IFN γ) e a calcitonina (MANOLAGAS
63
, 2000).
Osteoblastos são as células-alvo para a ação dos fatores
locais e dos hormônios sistêmicos que estimulam ação osteoclástica,
liberando um fator solúvel ou um segundo mensageiro que estimula
diretamente a reabsorção óssea. Alternativamente osteoblastos elaboram
um fator para a matriz ou fator de membrana que estimula atividade
reabsortiva após contato com osteoclastos maduros. Em contraste, os
maiores inibidores da ação osteoclástica atuam diretamente nos
osteoclastos (ATHANASOU
5
, 1996).
O osteoblasto é estimulado pelo calcitriol, PTH e pela IL-6
a expressar o RANK-L (ou OPGL - ligante da osteoprotegerina, ou ODF -
fator de diferenciação de osteoclastos). O osteoblasto também sintetiza e
libera a OPG, idêntica ao RANK, que atua como receptor de atração e
21
que pode ligar-se ao RANK-L e inibir a ligação deste ao RANK (MARIE
64
,
2001; RANG et al.
82
, 2004), bloqueando a formação de osteoclastos e a
reabsorção óssea (BOYLE et al.
15
, 2003). A expressão de OPG é
diminuída pela PGE
2
e aumentada pela 1,25(OH)
2
vitamina D
3
, íons Ca
2+
e
TGF-β (KONG & PENNINGER
51
, 2000).
Osteoclastos maduros, apresentando TRAP, catepsina K
(CATK), receptor para calcitonina e integrina β
3
são ativados levando ao
início da reabsorção óssea. Em resposta à ativação do RANK pelo seu
ligante, o osteoclasto se torna polarizado e inicia mudanças estruturais
internas, como reorganização do citoesqueleto, (BOYLE et al.
15
, 2003)
formação de anéis de actina (SUDA et al.
100
, 1997) e de áreas de junção
entre a superfície óssea e a membrana basal formando um
compartimento selado.
A ligação à matriz óssea envolve a seqüência específica
de aminoácidos Arg-Gly-Asp (RGD) presente na matriz óssea e no
colágeno, fibronectina, osteopontina, trombospondina, sialoproteína óssea
e vitronectina (SUDA et al.
100
, 1997) com integrina β
3
(ou receptor
vitronectina integrina v-3) (MUNDY
66
, 1999). Essa ligação é essencial
para a polarização do osteoclasto, mas parece ser dependente da
presença de propriedades físicas da matriz como dureza, rigidez e
aspereza, não ocorrendo em superfície desmineralizada ou osteóide
(SUDA et al.
100
, 1997).
Este compartimento externo entre o osteoclasto e o osso
é acidificado através da exportação de íons de hidrogênio (H+), ação que
envolve a expressão de ATPase vacuolar (vATPase) (GEORGE et al.
34
,
2004) existente na borda vilosa do osteoclasto (SUDA et al.
100
, 1997). Há
também a secreção de enzimas líticas, como a TRAP e pro-CATK, para
esse compartimento (BOYLE et al.
15
, 2003).
Uma vez estimulado, o osteoclasto produz quantidades
substanciais de ácido lático e hialurônico, o que resulta em redução do pH
local e maior poder de dissolução das fibras colágenas. A ação em
22
conjunto de colagenases e do baixo pH no compartimento de reabsorção
leva à digestão extracelular das fases orgânica e mineral da matriz óssea
(GUEDES JÚNIOR et al.
36
, 2003).
Através deste processo o osteoclasto destrói o osso e os
produtos dessa degradação são processados e liberados na circulação
(BOYLE et al.
15
, 2003).
Alguns trabalhos têm sugerido que a superfície óssea é
preparada para a reabsorção pela ação de colagenases liberadas por
osteoblastos que revestem a superfície óssea uma vez que estes podem
produzir enzimas capazes de ativar colagenases latentes, como o ativador
de plasminogênio (MUNDY
66
, 1999) e a cascata da plasmina proteolítica.
O PTH e outros agentes reabsortivos teriam capacidade de estimular o
aumento da produção dessas proteases pelos osteoblastos, levando à
digestão da matriz orgânica desmineralizada (osteóide) que cobre toda
superfície óssea e expondo a matriz mineralizada, o que serviria de
estímulo para ativação de osteoclastos (ATHANASOU
5
, 1996). Além da
ação das proteases, os osteoblastos também seriam uma segunda fonte
de prótons contribuindo para a acidificação pericelular, que tem
importante papel na degradação de áreas ósseas desmineralizadas. A
estimulação dos osteoblastos por TNF induz acidificação 20% acima do
nível de equilíbrio, além de aumentar a expressão das metaloproteinases
MMP-1 e MMP-3 (GEORGE et al.
34
, 2004).
Osteoclastos são células terminalmente diferenciadas
com limitada sobrevida (SUDA et al.
100
, 1997), sendo que a sobrevivência
e participação em sucessivos ciclos de reabsorção são reguladas por
hormônios e citocinas. RANK-L e IL-1 aumentam a sobrevida de
osteoclastos maduros (SUDA et al.
100
,1997; BOYLE et al.
15
, 2003). A
apoptose dos osteoclastos parece envolver o TGF liberado através da
reabsorção óssea (MUNDY
66
, 1999) ou mediado através do estrógeno
(SUDA et al.
100
,1997).
Ainda não está claro o que encerra a fase reabsortiva,
23
mas um elevado nível de cálcio local ou substâncias liberadas pela matriz
parecem estar envolvidos (BANDEIRA et al.
7
, 2000), servindo como
agentes da conjugação entre a reabsorção e a formação óssea (GUEDES
JÚNIOR et al.
36
, 2003).
Na fase de reversão, células mononucleares da linhagem
de monócitos e macrófagos preparam a superfície para os osteoblastos
iniciarem a formação produzindo uma glicoproteína à qual os osteoblastos
podem se aderir (BANDEIRA et al.
7
, 2000). Szejnfeld
102
(2000) relata que,
durante 7 a 14 dias, uma espessa linha de “cimento” é depositada. Essa
região consiste de fibras colágenas organizadas ao acaso demarcando o
limite da lacuna de reabsorção e ligando o osso neoformado ao osso
velho.
A fase da formação óssea, intimamente ligada à
reabsorção, começa quando os pré-osteoblastos são atraídos para a
cavidade de reabsorção criada pelos osteoclastos (SZEJNFELD
102
, 2000).
Como os osteoclastos, também os osteoblastos são
derivados de precursores originados na medula óssea. Os precursores
dos osteoblastos são células-tronco mesenquimais pluripotentes, que
também dão origem às células estromais da medula óssea, condrócitos,
células musculares e adipócitos. Esses precursores eram chamados de
unidades formadoras de colônias de fibroblastos (CFU-F) e atualmente
são chamados de CFU-osteoblastos (CFU-OB). Osteoblastos também
podem se originar de pericitos, células mesenquimais aderentes ao
endotélio vascular (MANOLAGAS
63
, 2000).
Os osteoblastos são células grandes, arredondadas ou
poligonais, com núcleo excêntrico e citoplasma amplo, mostrando
características ultra-estruturais de células produtoras de proteínas, como
grande quantidade de retículo endoplasmático rugoso e aparelho de Golgi
(HAM
38
, 1975). Apresentam intensa basofilia, principalmente quando em
intensa atividade sintética, porém, quando em estado pouco ativo tornam-
se menores e a basofilia diminui (JUNQUEIRA & CARNEIRO
45
, 2004).
24
Estas células mostram-se achatadas e alongadas possuem poucas
organelas e recobrem a maior parte da superfície óssea no esqueleto
adulto. Parecem estar em estado de repouso ou relativamente inativas, e
são células com capacidade de transformação em osteoblastos ativos
(ATHANASOU
5
, 1996).
O mecanismo da conjugação formativo-reabsortiva parece
envolver substâncias produzidas localmente (KRANE & NEER
54
, 1990) e
a ocorrência da remodelação óssea simultaneamente em múltiplos locais
é vista como uma evidência de controle local, de forma autócrina e/ou
parácrina, mas também de mecanismos sistêmicos (MUNDY
66
, 1999;
BANDEIRA et al.
7
, 2000; DUCY et al.
28
, 2000).
Uma das teorias é que fatores estimuladores de
osteoblastos como fator de crescimento semelhante à insulina IGF-I, IGF-
II e TGF-β , que estavam mergulhados na matriz óssea (RANG et al.
82
,
2004), além de proteínas estruturais como o colágeno tipo 1 e a proteína
gla-óssea, são liberados da matriz óssea durante a reabsorção
osteoclástica levando à quimiotaxia de osteoblastos ou seus precursores
para os locais de reabsorção. A proliferação e diferenciação dos
precursores de osteoblastos também são mediadas por fatores locais
liberados durante a reabsorção como IGF, fator de crescimento de
fibroblastos (FGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)
(MUNDY
66
, 1999; MANOLAGAS
63
, 2000; GUEDES JÚNIOR et al.
36
,
2003).
No próximo evento seqüencial durante a fase de formação
ocorre a diferenciação do precursor de osteoblasto em célula madura
(MUNDY
66
, 1999).
Os fatores que promovem a osteoblastogênese, com
exceção das proteínas ósseas morfogenéticas (bone morphogenetic
proteins - BMPs), e em particular, a BMP-2 e -4 que são expressas na
vida pós-natal e servem para manter o contínuo suprimento de
osteoblastos, não podem induzir diferenciação de células mesenquimais
25
precursoras da medula óssea do adulto não comprometidas em
osteoblastos (MANOLAGAS
63
, 2000). O comprometimento precoce dos
precursores requer a expressão do fator de transcrição Cbfa1 (core
binding factor A1), que regula a transcrição de vários genes responsáveis
pelo fenótipo osteoblástico adulto produtor de colágeno tipo I,
sialoproteína óssea, osteopontina, TGF-β e osteocalcina. Outras famílias
de fatores de transcrição também são importantes, entre eles o Dlx5
(MARIE
64
, 2001), que também regula a osteocalcina, a fosfatase alcalina,
assim como a mineralização (MANOLAGAS
63
, 2000). BMP
S
podem
induzir a expressão de Cbfa1 (DUCY et al.
28
, 2000).
O TGF-β pode controlar o estado de repouso da
diferenciação osteoblástica in vivo e inibir a expressão de Cbfa1 em
culturas de osteoblastos (DUCY et al.
28
, 2000). Osteoblastos secretam e
depositam TGF-β na matriz óssea e podem responder a ele num modelo
autócrino de ação, sendo que esta ação depende do estágio de
diferenciação da célula. TGF-β estimularia proliferação e diferenciação
precoce de osteoblastos enquanto inibiria diferenciação terminal
reprimindo a transcrição de Cbfa1, que também está implicado na
regulação da deposição de matriz óssea por osteoblastos diferenciados
(ALLISTON et al.
2
, 2001), sendo a expressão em grande quantidade de
TGF-β
2
em camundongos transgênicos responsável pela mineralização
defeituosa, mesmo com o número grande de osteócitos (MAEDA et al.
61
,
2004).
Para Maeda et al.
61
(2004), o papel endógeno do TGF-β
na formação óssea ainda não foi totalmente elucidado, tendo sido
relatados efeitos positivos e negativos no osso. A inibição do TGF-β não
afetaria dramaticamente a diferenciação osteoblástica na fase precoce de
comprometimento, pois levaria a um aumento da expressão de BMPs. Na
fase de maturação, a expressão de TGF-β e de seus receptores é
induzida, sugerindo sua ativação durante este período.
26
Tem sido sugerida uma regulação neuroendócrina para
osteoblastos através da leptina, sintetizada nos adipócitos e com receptor
no hipotálamo. A leptina atua na regulação da massa óssea, obesidade e
reprodução. Não afeta a diferenciação osteoblastos, nem age diretamente
nos mesmos afetando sua função, sua ação é centralmente controlada no
hipotálamo, tendo um efeito inibitório na formação óssea (DUCY et al.
28
,
2000; HARADA & RODAN
39
, 2003).
Os osteoblastos sintetizam a parte orgânica da matriz
óssea (colágeno tipo I, proteoglicanas e glicoproteínas) e também são
capazes de concentrar fostato de cálcio, participando da mineralização da
matriz (JUNQUEIRA & CARNEIRO
45
, 2004), que ocorre durante em
média 15 dias após a deposição da matriz (KIMBLE
49
, 1997).
Durante o processo de mineralização, os osteoblastos
estabelecem um microambiente livre de inibidores de cristalização, tais
como proteínas séricas ligadoras de Ca
2+
e pirofosfatos.
Subseqüentemente, ocorre a precipitação dos cristais de hidroxiapatita
em asssociação com as fibras de colágeno. Admite-se que a enzima
fosfatase alcalina desempenhe um papel importante na mineralização. Os
osteoblastos contêm grandes quantidades de fosfatase alcalina cuja
atividade encontra-se aumentada durante esta fase e que atua na
clivagem dos grupamentos fosfato, levando tanto à diminuição da
efetividade dos inibidores locais de calcificação quanto no aumento da
concentração de fosfato nos locais de mineralização (GUEDES JÚNIOR
et al.
36
, 2003). A precipitação da porção mineral pode ocorrer apenas na
presença de concentrações ótimas de íons cálcio e fosfato, podendo ser
regulada pelos osteoblastos (KRANE & NEER
54
, 1990).
Na fase final do processo de formação cessa a atividade
osteoblástica. A lacuna de reabsorção é reparada completamente ou
quase que completamente (MUNDY
66
, 1999). A maioria dos osteoblastos
se torna células achatadas de revestimento ósseo, algumas osteócitos e
outras sofrem apoptose (MARIE
64
, 2001). As células de revestimento se
27
tornam menos ativas talvez pela ação do TGF (MUNDY
66
, 1999). Em
adição ao RANK-L, o TNF-α age em sinergismo como um sinal para a
apoptose de osteoblastos (ZAIDI et al.
120
, 2003).
Uma vez completada a formação óssea, há um
prolongado período de repouso com pouca atividade celular naquela
unidade óssea, até que um novo ciclo de remodelação se inicie
(BANDEIRA et al.
7
, 2000). Durante a secreção da matriz óssea alguns
osteoblastos ficaram retidos no osteóide, formando os osteócitos
terminais e os outros que ficaram revestindo interagem com precursores
de osteoclastos e os ativam, reiniciando assim o ciclo (RANG
et al.
82
,
2004).
Muitos outros hormônios e fatores de crescimento
sistêmicos podem acelerar o ciclo de remodelação, na modulação da
formação da matriz óssea: PTH, 1,25(OH)
2
D
3
, insulina, hormônio de
crescimento, esteróides sexuais, calcitonina, hormônios tireoideanos e
glicocorticóides (GUEDES JÚNIOR et al.
36
, 2003).
Todos os processos fisiológicos, patológicos e
terapêuticos exercem influência no esqueleto por meio de sua ação sobre
o ciclo de remodelação. Sob certas circunstâncias, cada ciclo de
remodelação pode resultar em pequena deficiência óssea que,
acumuladas acarretarão incremento da taxa de perda óssea
(SZEJNFELD
102
, 2000). As condições que levam à perda de massa óssea
não acontecem por processos completamente diferentes e sim através do
desarranjo do processo normal de remodelação óssea. Daí a importância
de conhecimento dos princípios dessa remodelação para poder entender
a patogênese da osteoporose (MANOLAGAS
63
, 2000).
28
2.2 Osteoporose
Uma definição internacionalmente aceita descreve a
osteoporose como uma doença sistêmica e progressiva caracterizada por
baixa massa óssea e deterioração da microarquitetura do tecido ósseo,
com conseqüente aumento da fragilidade e suscetibilidade à fraturas
(GENANT et al.
33
, 1999).
Atualmente, a densitometria óssea por DEXA
(absorciometria dupla de emissão de raios X) da coluna lombar e dos
fêmures proximais é considerada o padrão ouro para o diagnóstico da
osteoporose, para avaliação do risco de fraturas, para o
acompanhamento da evolução da doença e para monitorar o tratamento
(GENANT et al.
33
, 1999; BRANDÃO & HAUACHE
16
, 2005). Esse sistema
é calibrado para expressar os resultados em gramas por centímetros
quadrados (g/cm
2
; gramas de mineral ósseo/cm
2
de área analisada)
gerando o valor de densidade mineral óssea (DMO).
De acordo com a OMS (Organização Mundial da Saúde),
utiliza-se o T score (a média de DMO de adultos jovens normais menos a
DMO do paciente, dividido pelo desvio-padrão da média de adultos jovens
normais) para o diagnóstico da osteoporose: valores até -1,0 desvio-
padrão da média são considerados normais, valores entre -1,0 e -2,4
revelam osteopenia, enquanto que valores maiores ou iguais a -2,5
diagnosticam osteoporose. Cada desvio-padrão abaixo da média aumenta
de 1,5 a 3,0 vezes o risco de fratura, dependendo do sítio ósseo
analisado (LEDFORD et al.
57
, 1998; BRANDÃO & HAUACHE
16
, 2005). A
diminuição da densidade maior que 1 desvio-padrão significa 10 a 12 %
de perda de massa óssea (LANGER
56
, 2004). Pode-se ainda classificar a
osteoporose como grave ou estabelecida quando a DMO for maior que
2,5 desvios-padrão abaixo da média, na presença de uma ou mais
fraturas (SZEJNFELD
102
, 2000; GUEDES JÚNIOR et al.
36
, 2003).
29
A radiografia simples apresenta pouca sensibilidade para
o diagnóstico de osteoporose, revelando a perda óssea quando esta já é
maior do que 30-50%. No entanto, é o método de escolha para a
verificação de fraturas (RADOMINSKI et al.
81
, 2002; GUEDES JÚNIOR et
al.
36
, 2003; LANGER
56
, 2004; BRANDÃO & HAUACHE
16
, 2005).
Outras técnicas também podem ser usadas para acessar
o status esquelético e ajudar no monitoramento do risco de fraturas, como
o ultra-som quantitativo e a tomografia computadorizada (GENANT et
al.
33
, 1999).
A resistência óssea tem dois componentes: a densidade
óssea (mensurada em gramas por unidade de área ou volume) e a
qualidade óssea. A densidade óssea na osteoporose é determinada pela
quantidade de perda óssea ocorrida em relação ao maior valor de massa
óssea de um dado paciente, enquanto que para a qualidade óssea se
consideram conceitos de arquitetura, mineralização, lesões ocorridas
(como as microfraturas, por exemplo) e remodelamento. A DMO tem sido
usada como o melhor padrão de medida, pois é responsável por
aproximadamente 70% da resistência óssea (SUH & LYLES
101
, 2003).
Blake & Fogelman
9
(2002) ressaltam que deveria ser
notado que a definição de osteoporose não requer um indivíduo com
ocorrência de fratura anterior ao diagnóstico da osteoporose, mas introduz
o conceito de baixa massa óssea e a sua correlação com o risco
aumentado de fraturas. Definem a doença baseando-se essencialmente
num fator de risco, que é a baixa densidade óssea e afirmam que não há
nada mais lógico que isso, já que as fraturas tendem a ocorrer
posteriormente no desenvolvimento da doença, quando a integridade
esquelética já está severamente comprometida.
A osteoporose pode ser primária ou secundária. A
osteoporose primária ocorre em decorrência da privação estrogênica do
climatério ou do próprio processo de envelhecimento. A osteoporose
secundária, que conta com somente 5% dos casos de osteoporose, é
30
definida como resultante de condições clínicas ou uso de medicamentos
que contribuem ou estão associados à osteoporose (BRANDÃO &
HAUACHE
16
, 2005). As causas mais comuns da osteoporose secundária
são uso excessivo ou crônico de corticosteróides, hipertireoidismo, assim
como reposição inadequadamente alta de T4, alcoolismo, imobilização
prolongada, desordens gastrintestinais, hipercalciúria, alguns tipos de
neoplasias malignas e tabagismo (MANOLAGAS
63
, 2000).
O climatério é a transição gradual da fase reprodutiva da
mulher para a não-produtiva. No seu início (antes da menopausa), a
atividade dos ovários declina, resultando em diminuição da produção de
estrógeno e progesterona. A menopausa, última menstruação do ciclo
reprodutivo, decorre da falência de esteróides ovarianos, ocorrendo ao
redor dos cinqüenta anos (TEIXEIRA
103
, 2006).
Homens e mulheres iniciam a perda óssea por volta dos
quarenta anos, porém, devido à deficiência de estrógeno, as mulheres
experimentam uma fase de rápida perda óssea durante cinco a dez anos
após a menopausa, podendo haver sobreposição da osteoporose devido
à menopausa e devido ao envelhecimento em si. Nos homens há um
declínio de esteróides sexuais lento e progressivo levando a uma perda
óssea lenta e linear (MANOLAGAS
63
, 2000).
Hormônios circulantes podem agir nas células esqueletais
modulando a síntese de fatores locais e favorecendo ligações protéicas
com fatores de crescimento locais que por sua vez modulam a formação
óssea ou a sua reabsorção. Durante a menopausa, sinais que estimulam
a reabsorção óssea aumentam por causa de deficiência de estrógeno,
com uma conseqüente ativação dos osteoclastos. Evidências indicam que
tanto os osteoblastos como os osteoclastos sofrem apoptose ou morte
celular programada. A apoptose nos osteoblastos pode explicar a falha na
neoformação óssea, a chamada “osteopenia involutiva” que indivíduos
idosos experimentam. Em pacientes idosos, a presença e a função dos
osteoclastos diminui e os osteoblastos têm uma vida mais curta e menor
31
diferenciação. Estas alterações em células ósseas ocorridas na idade
avançada que, associadas aos fatores físicos e nutricionais, induzem a
osteoporose senil, que afeta ambos os sexos igualmente (HAGUENAUER
et al.
37
, 2001).
Riggs et al.
84
(2002) acrescentam fatores idade-
dependentes que atuariam secundariamente na osteoporose senil como o
hiperparatireoidismo, prejuízo no metabolismo da vitamina D, inadequada
ingesta de cálcio e deficiência nutricional de vitamina D, além da alteração
na função dos osteoblastos.
A massa de tecido ósseo presente em qualquer tempo da
vida adulta é o resultado da diferença entre a quantidade de osso
acumulada até a maturidade, isto é, o pico de massa óssea, e a perda
ocorrida (GENANT et al.
33
, 1999). Esse pico de massa óssea cortical é
atingido por volta dos 30-35 anos e 5-10 anos antes para o osso
trabecular, sendo perdido, pelas mulheres, cerca de 0,5 a 1% de massa
óssea ao ano, após os 35 anos (LEDFORD et al.
57
, 1998, SAMPSON
88
,
2002). Os fatores que interferem favorecendo a patogênese da
osteoporose são aqueles que prejudicam o acúmulo ósseo durante o
crescimento e aqueles que aceleram a sua perda posteriormente
(GENANT et al.
33
, 1999).
Diante dos fatores responsáveis pela osteoporose, vistos
sob uma perspectiva epidemiológica, o estrógeno é claramente um dos
principais, mas outros fatores contribuem, mesmo que de forma ainda não
bem quantificada, já que nem todas mulheres na menopausa
desenvolvem osteoporose (HARADA & RODAN
39
, 2003). Dessa forma,
seria desejável identificar fatores individuais de alto risco com a finalidade
de instituir um tratamento preventivo da ocorrência de fraturas (BLAKE &
FOGELMAN
9
, 2002).
Dos fatores que influenciam as chances de uma pessoa
desenvolver osteoporose a genética é muito importante (TURNER &
SIBONGA
110
, 2001) e explica 75% das variações de densidade óssea
32
idade-específicas (LEDFORD et al.
57
, 1998).
Há vários genes suspeitos de influenciar geneticamente
na osteoporose e entre deles incluem-se o gene para receptor de vitamina
D (VDR), o do receptor de estrógeno (ER), o do colágeno tipo I alpha 1
(COLIA1) e o do receptor do PTH humano (PTHR1). O PTHR1 está
relacionado com a análise de famílias osteoporóticas e o COLIA1 pode
predispor às fraturas afetando a qualidade e quantidade ósseas
(COMPSTON
20
, 2001; MARIE
64
, 2001).
Adicionalmente, o estilo de vida participa na manutenção
da saúde esquelética. A ingestão adequada de cálcio e a prática de
exercícios reduzem o risco de osteoporose, enquanto o fumo e a alta
ingestão de álcool aumentam esse risco (TURNER & SIBONGA
110
, 2001).
A preservação esquelética proporcionada pelo estrógeno
em mulheres pode estar evolucionalmente relacionada à necessidade de
reserva de cálcio para o desenvolvimento esquelético do embrião
(HARADA & RODAN
39
, 2003).
Os níveis de receptores de estrógeno (ER) em
osteoclastos são baixos e os efeitos anti-reabsortivos do estrógeno são
modulados mais indiretamente pela produção de fatores produzidos por
células do microambiente ósseo que por efeitos diretos nos osteoclastos
(COMPSTON
20
, 2001).
Deficiência de estrógeno aumenta a produção de IL-1, IL-
6, TNF-α, GM-CSF (KIMBLE
49
, 1997; COMPSTON
20
, 2001; SCHEIDT-
NAVE et al.
89
, 2001), M-CSF e PGE
2
. Essas substâncias aumentam a
reabsorção óssea principalmente através do aumento no número de pré-
osteoclastos na medula óssea, mas também do aumento da sobrevida e
atividade de osteoclastos (COMPSTON
20
, 2001; RIGGS et al.
84
, 2002).
A IL-6 tem atraído atenção especial pela evidência de que
teria um importante papel na patogênese de diversas doenças
caracterizadas por remodelação óssea acelerada e excessiva reabsorção
óssea focal ou sistêmica. Esta citocina estimula a osteoclastogênese, não
33
sendo necessária para esta finalidade in vivo em condições fisiológicas
normais, e sim em condições patológicas. Sua produção é estimulada em
células da linhagem estromal ou osteoblástica por várias citocinas e
fatores de crescimento (MANOLAGAS
63
, 2000). Um estudo de Scheidt-
Nave et al.
89
(2001) colocou a IL-6 sérica como o mais importante fator
preditivo para perda óssea femoral entre mulheres com até dez anos de
menopausa, sendo responsável por até 34% da variabilidade da DMO
nesse osso.
Atualmente a regulação da reabsorção feita pelo
estrógeno está sendo reavaliada por causa da descoberta da OPG, RANK
e RANK-L. O estrógeno aumenta a produção, pelos osteoblastos, de
OPG, um receptor solúvel que se liga ao RANK-L, e diminui a formação
de M-CSF e RANK. Parte destes efeitos estrogênicos ocorre
indiretamente, através dos intermediários estimulados pelo estrógeno.
Assim, IL-1 e TNF-α aumentam RANK-L, OPG e M-CSF, enquanto PGE
2
aumenta o RANK-L e diminui a OPG (RIGGS et al.
84
, 2002).
Recentemente, um estudo de Muthusami et al.
67
(2005)
demonstrou que a deficiência estrogênica leva à significante queda na
quantidade de enzimas antioxidantes no fêmur de ratas ovariectomizadas,
diminuindo a resistência das células ósseas ao stress oxidativo. Essa
queda das defesas antioxidantes leva ao aumento de H
2
O
2,
que irá
essencialmente promover o recrutamento de TNF-α para a indução de
perda óssea, aumentando a diferenciação e função de osteoclastos.
A ação do estrógeno nos osteoblastos é controversa,
evidências sugerem aumento na formação, diferenciação, proliferação e
função de osteoblastos (RIGGS et al.
84
, 2002). Inúmeros efeitos induzidos
pelo estrógeno tem sido descritos como a indução de IGF-I, TGF-β e
aumento da expressão de RNAm para BMP-6. Ele também aumenta a
expressão de receptores para 1,25(OH)
2
vitamina D, hormônio de
crescimento (GH) e progesterona (COMPSTON
20
, 2001).
Nas mulheres, a menopausa natural ou cirúrgica é
34
seguida por um período de acelerada remodelação óssea, com taxas de
formação e reabsorção aumentadas (KIMBLE
49
, 1997). Deficiência de
estrógeno afeta a remodelação de várias maneiras, primeiro aumenta a
freqüência de ativação das BMUs, levando a uma maior remodelação e
segundo, induz um desequilíbrio na remodelação prolongando a fase
reabsortiva, reduzindo a apoptose de osteoclastos e encurtando a fase
formativa aumentando a apoptose de osteoblastos. Como conseqüência
destas mudanças, o volume reabsorvido nas lacunas de reabsorção está
aumentado, em relação à capacidade de preenchimento destas lacunas
pelos osteoblastos. A reabsorção aumenta em 90% durante a
menopausa, enquanto a formação só aumenta 45% (RIGGS et al.
84
,
2002).
Com a remodelação acelerada, lacunas de reabsorção
podem ter sua profundidade aumentada levando a perfuração e perda de
elementos trabeculares. Como as trabéculas são parte de uma estrutura
integral, a perda de porções desta estrutura, levando a falta de
conectividade de elementos estruturais, pode comprometer a resistência
mecânica do osso. A continuação de ciclos de remodelação com
deficiência de formação óssea em relação à reabsorção irão finalmente
levar à redução da massa óssea (KIMBLE
49
, 1997).
Exames histomorfométricos de osso transilíaco biopsiado
identificaram defeitos microestrutrurais que, sob a luz do que se é
conhecido sobre propriedades mecânicas e estruturais dos materiais,
comprometerão futuramente a resistência óssea. Em mulheres durante a
menopausa e com osteoporose estabelecida, um déficit tanto na
espessura cortical, quanto no volume do osso trabecular tendem a ser
substancialmente reduzidos. Muito do déficit de osso trabecular pode ser
atribuído mais à perda de elementos trabeculares inteiros e
descontinuação da conectividade trabecular do que à diminuição da
espessura destes. A diminuída massa óssea da osteoporose pós-
menopáusica é predominantemente um déficit de osso cortical. A perda
35
de osso cortical envolve alargamento dos espaços medulares às custas
da estrutura cortical havendo trabeculação em superfícies
corticoendosteais (BARGER-LUX & RECKER
8
, 2002).
Logo após a menopausa a perda óssea é
predominantemente trabecular, seguindo-se, depois, a cortical
(BANDEIRA et al.
7
, 2000). A perda óssea que se segue no período de
cinco a dez anos que seguem a última menstruação pode ser de 2 a 4%
ao ano para osso trabecular e de 1% ao ano para osso cortical
(RADOMINSKI et al.
81
, 2002).
A relação entre volume ósseo e superfície
metabolicamente ativa é um dos fatores que definem a atividade
metabólica. Mesmo representando 20-25% do volume ósseo total, o osso
trabecular contribui com mais de 60% de toda área de superfície óssea
(RESNICK et al.
83
, 1995) e é mais ativo metabolicamente que o cortical,
fornecendo suprimento inicial nos estados de deficiência mineral e sendo
perdido mais rapidamente na osteoporose pós-menopáusica. Nos
indivíduos mais idosos outros fatores afetam de modo progressivo,
durante várias décadas e menos intensamente, ocasionando perdas
ósseas envolvendo tanto o osso trabecular como o cortical, sendo maior a
perda cortical (BANDEIRA et al.
7
, 2000) que irá ser responsável pelas
fraturas osteoporóticas de fêmur e rádio distal (GUEDES JÚNIOR et al.
36
,
2003).
Barger-Lux & Recker
8
(2002) concordam que a atividade
metabólica e a superfície óssea são maiores no osso trabecular, mas
afirmam que a perda óssea associada à ocorrência de fraturas não é uma
perda desproporcional de osso trabecular já que este conta somente com
20% da massa óssea total. Na osteoporose a DMO chega a ser 30%
menor que em mulheres saudáveis e mesmo que ocorra uma perda de
50% da massa óssea trabecular, essa perda levaria a somente 10% de
perda óssea total.
36
As mulheres perdem, durante toda a sua vida,
aproximadamente 50% do osso trabecular e 35% do osso cortical obtidos
no pico de massa óssea (TURNER & SIBONGA
110
, 2001).
Durante a vida adulta, o tamanho dos ossos varia
continuamente através da expansão das suas dimensões externas. Esta
expansão perióstica é menor que o aumento do espaço medular
resultante da reabsorção e gera diminuição da espessura cortical e
aumento da sua porosidade (RIZZOLI & BONJOUR
86
, 1999).
Para Barger-Lux & Recker
8
(2002), o acúmulo de
microlesões e/ou defeitos trabeculares poderiam enfraquecer o osso mais
do que poderia ser explicado pela deficiência de massa óssea. As
microfraturas ocultas indicam um aumento no risco de três a cinco vezes
de fraturas osteoporóticas (RADOMINSKI et al.
81
, 2002).
A osteoporose afeta 40% das mulheres brancas após os
quarenta anos de idade e 15% dos homens com mais de cinqüenta anos
de idade (LEDFORD et al.
57
, 1998).
Segundo a National Osteoporosis Foundation (NOF
73
,
2004), 80% das pessoas afetadas pela osteoporose são mulheres. Das
pessoas afetadas pela doença, uma em cada duas mulheres e um em
cada quatro homens terão fraturas relacionadas à osteoporose durante a
sua vida, levando a uma ocorrência de 1,5 milhões de fraturas
anualmente. Um histórico de fraturas atraumáticas também tem sido
incluído na definição de osteoporose tornando possível diagnosticá-la
clinicamente (SUH & LYLES
101
, 2003).
As fraturas osteoporóticas mais importantes são as de
vértebras, colo de fêmur e rádio distal (BANDEIRA et al.
7
, 2000). Existem
proporções diferentes de osso cortical e trabecular nesses sítios
freqüentes de fraturas. A coluna lombar, o rádio distal e o colo do fêmur
têm 66%, 25% e 25% de osso trabecular, respectivamente (GUEDES
JÚNIOR et al.
36
, 2003). As fraturas de vértebra ocorrem mais cedo, por
volta dos cinqüenta e sessenta anos de idade, pois refletem perda óssea
37
predominantemente trabecular. As microfraturas de vértebras são
geralmente assintomáticas, porém os pacientes que as apresentam têm
maior chance de evoluir para fraturas completas com dor significativa e
diminuição da mobilidade. As fraturas femorais ocorrem após os sessenta
anos, aumentando exponencialmente na oitava década e são as mais
graves, pois reduzem a expectativa de vida em 12%, e pode-se associar
com mortalidade, nos primeiros seis meses, de 20% (BANDEIRA et al.
7
,
2000; RADOMINSKI et al.
81
, 2002; GUEDES JÚNIOR et al.
36
, 2003). A
mortalidade subseqüente a fraturas femorais se deve em grande parte por
doenças crônicas, enquanto que as fraturas vertebrais aumentam o risco
de doenças pulmonares. A morbidade, a mortalidade e os custos são os
maiores resultados negativos provenientes das fraturas osteoporóticas
(SUH & LYLES
101
, 2003).
A osteoporose é uma doença que tem despertado grande
interesse em Saúde Pública, pois com o crescimento e envelhecimento da
população mundial, o número de pessoas idosas que se encontram na
faixa de risco para fraturas e mesmo a incidência idade-específica está
aumentando consideravelmente (KOWALSKI et al.
53
, 2001). A
longevidade aumentada associada ao aumento dos nascimentos
ocorridos após a Segunda Guerra Mundial irá aumentar o número de
americanos com risco de osteoporose nas próximas duas décadas
(TURNER & SIBONGA
110
, 2001). No Brasil, estima-se que a proporção de
idosos (maior de 65 anos) saltará de 5,1%, em 2000, para 14,2%, em
2050. Um levantamento constatou que a proporção de mulheres acima
dos 65 anos que vivem sozinhas vem aumentando. Alcançou 14,9% em
1989 e dessas, 60% possuíam renda inferior ou igual a um salário
mínimo. Dentre as pacientes maiores de setenta anos, 17,6% moravam
sozinhas. Caso sofressem algum tipo de fratura, as pacientes do estudo
atual enfrentariam basicamente dois problemas. Primeiro, a precariedade
de recursos financeiros para seu tratamento (somente 21% tinham
emprego remunerado e 43% tinham renda familiar mensal entre um e três
38
salários mínimos) e segundo, teriam dificuldades para desempenhar as
atividades da vida diária (KOWALSKI et al.
53
, 2001). Cooper
22
apud
Kowalski et al.
53
(2001) relatou que um ano após a fratura de quadril, 40%
das pacientes estudadas ainda não estariam aptas a caminhar sem
auxílio e 60% teriam dificuldades em realizar ao menos uma atividade da
vida diária como se vestir, banhar-se ou preparar sua alimentação.
2.3 Modelos experimentais de osteoporose
Animais de laboratório têm a maior participação nos
avanços sem precedentes ocorridos recentemente sobre o conhecimento
da osteoporose (TURNER et al.
109
, 2001).
Em 1995, a FDA (Food and Drug Administration) criou um
guideline para avaliação pré-clínica e clínica de agentes usados para o
tratamento e prevenção da osteoporose pós-menopáusica recomendando
a avaliação desses agentes em duas espécies animais, incluindo ratas
ovariectomizadas e em um segundo animal não-roedor, preferivelmente
um primata ovariectomizado, e reconheceu que nenhum modelo animal
mimetiza precisamente a condição humana da osteoporose (THOMPSON
et al.
105
, 1995).
Nenhum animal reproduz fielmente a condição humana
em parte porque o risco de fratura não pode ser reproduzido em animais
(WALSH et al.
116
, 1997; TURNER et al.
109
, 2001; EGGERMAN et al.
30
,
2005).
Uma das principais considerações na utilidade de um
modelo animal é a capacidade de predizer um resultado em humanos,
avaliando a similaridade dos eventos. Também são relevantes na
avaliação de um bom modelo animal a praticidade, o custo e a
disponibilidade desses animais, além de questões éticas (TURNER et
39
al.
109
, 2001, EGGERMANN et al.
30
, 2005).
Roedores, cachorros, macacos e gorilas são os principais
animais usados como modelo de osteoporose (TURNER et al.
109
, 2001).
Cachorros não mostram diferenças na DMO após ovariectomia e os
primatas têm uma perda de 1,4 desvios-padrão quando comparados a
animais saudáveis de controle. Assim, medidas adicionais como uso de
esteróides e dieta são necessários para induzir perda óssea significante
(EGGERMANN et al.
30
, 2005).
Os ratos são os animais usados com mais freqüência
como modelo experimental de osteoporose (JEE
44
, 1995; SZEJNFELD
102
,
2000; NAMKUNG-MATTHAI et al.
69
, 2001; TURNER
108
, 2001; TURNER et
al.
109
, 2001; EGGERMANN et al.
30
, 2005) porque têm preço e
manutenção baixos, crescem rapidamente, têm uma vida relativamente
curta, têm esqueleto bem caracterizado, são altamente disponíveis e
fornecem excelente modelo para muitos dos fatores de risco de
osteoporose. Suas desvantagens são o pequeno volume sangüíneo, seu
tamanho, a mínima remodelação cortical e a menor contribuição de osso
trabecular para a massa óssea total onde grandes perdas trabeculares
podem resultar em relativamente pequena perda óssea total (TURNER
et
al.
109
, 2001). Acrescenta-se ainda a ausência de prejuízo à função
osteoblástica em estágios tardios da deficiência estrogênica (TURNER
108
,
2001; EGGERMANN et al.
30
, 2005).
Segundo Jee
44
(1995), ratas ovariectomizadas como
modelo perda óssea por deficiência de estrógeno têm sido empregadas
por muitos e parecem ser o “padrão de ouro” para a perda óssea
trabecular por deficiência estrogênica, mesmo diante da deficiência deste
modelo pela ausente ou lenta perda óssea cortical.
Kalu
46
(1991) afirma que a ovariectomia em ratos induz
uma perda óssea com muitas características similares à perda óssea pós-
menopáusica. Essas características incluem: aumento na remodelação
óssea com a taxa de reabsorção maior que a de formação; uma rápida
40
fase inicial de perda óssea seguida de uma fase de perda mais lenta;
maior perda óssea trabecular que cortical; alguma proteção da perda
óssea pela obesidade; queda da absorção intestinal de cálcio e resposta
similar a tratamentos com estrógenos, bifosfonatos, tamoxifeno,
calcitonina, paratormônio e exercícios. Esta vasta similaridade é forte
evidência de que o modelo de perda óssea em ratos é possível de ser
utilizado para o estudo de problemas relevantes na perda óssea pós-
menopáusica.
A observação de que deficiência hormonal ovariana
aguda leva a elevada remodelação em osso trabecular eleva o interesse
no rato como modelo de perda óssea pós-menopáusica (TURNER et
al.
109
, 2001; EGGERMANN et al.
30
, 2005).
Alguns autores salientam que o rato deve ser descrito
como um modelo da perda óssea que ocorre inicialmente após a
menopausa e não como modelo de osteoporose, e que a perda óssea do
rato ovariectomizado deve ser considerada uma osteopenia, não uma
osteoporose (KALU
46
, 1991; TURNER
108
, 2001). Mamíferos não-primatas
não entram em menopausa espontânea, mas através da ovariectomia
(OVX) em ratos pode-se chegar a marcante osteopenia (WALSH et al.
116
,
1997; SZEJNFELD
102
, 2000).
Após a realização da OVX os ratos mostram uma perda
óssea bifásica, com uma rápida fase inicial de perda até os 100 dias
seguida de um período intermediário de relativa estabilização do osso
trabecular em um nível osteopênico. Após 270 dias, uma lenta fase de
perda óssea ocorre, com queda da quantidade de osso trabecular
(KALU
46
, 1991; EGGERMANN et al.
30
, 2005). Mesmo causando uma
menor redução da DMO em ratos quando comparado com humanos, a
OVX leva a uma queda das propriedades mecânicas do osso que se
mostra de magnitude similar (EGGERMANN et al.
30
, 2005).
Para Namkung-Matthai et al.
69
(2001), quando os ratos
são alimentados com uma dieta pobre em cálcio (low-calcium diet – LCD)
41
a queda da absorção de cálcio aumenta significantemente a perda óssea.
Estes autores afirmam que após a OVX aos dois meses de idade e com
LCD a osteoporose foi confirmada nas ratas aos cinco meses de idade
através da medida da densidade mineral óssea vertebral e femoral
usando DEXA e animais sham para cálculo do T-score.
Ratas têm perda óssea trabecular na tíbia proximal e em
vértebras lombares após OVX por um mecanismo de desequilíbrio da
remodelação óssea. Thompson et al.
105
(1995) encontraram, no 14
o
dia
após a OVX, um aumento da remodelação óssea, estreitamento e perda
de elementos trabeculares. Esses autores indicam que ratos em
crescimento respondem com uma perda óssea mais rápida e em maior
magnitude que ratos adultos após OVX. Após oito meses da OVX havia
perda óssea trabecular nas tíbias proximais de 10% para ratos adultos (19
meses de idade) enquanto que ratos jovens (cinco meses de idade)
perdiam 14% de osso trabecular após quatro meses de OVX, com um
aumento de 3,5 vezes na remodelação óssea. Após 12 meses de OVX
verificaram que a remodelação retornava a valores comparáveis aos
valores do grupo sham e sugeriram que estudos de agentes com
potencial terapêutico na OVX fossem restritos à duração de menos de 12
meses, período correspondente a quatro anos em humanos, e com a OVX
realizada em animais de três meses de idade e ainda, provavelmente,
estudos deveriam ser feitos com não mais que seis meses de duração
após a OVX.
O reconhecimento de um modelo animal apropriado
fornece informações sobre a qualidade e estrutura ósseas que não são
obtidas em pacientes participantes de estudos clínicos. Modelos animais
de osteoporose são imprescindíveis para a antecipação sobre a eficácia e
segurança de tratamentos em relação à qualidade óssea (THOMPSON et
al.
105
, 1995).
42
2.4 Reparação óssea
Os aspectos de maior interesse de aplicação ortopédica
são a fragilidade óssea, a eficácia da fixação de implantes e a reparação
óssea (EGGERMANN et al.
30
, 2005). A reparação óssea é um dos
assuntos de estudo mais urgentes numa sociedade que envelhece
(MAEDA et al.
61
, 2004) porque uma reparação de fratura prejudicada
pode aumentar dramaticamente a morbidade de pacientes idosos
(TURNER et al.
109
, 2001).
Ao lado de seu excelente comportamento mecânico, o
osso exibe um potencial inigualável para regeneração. O osso é capaz de
reparar fraturas ou defeitos locais com tecido regenerado com uma
organização estrutural altamente semelhante, sem deixar cicatriz
(SCHENK
90
, 1996).
Trowbridge & Emling
107
(1996) afirmam que a reparação
de fraturas ósseas segue os mesmos princípios da reparação no tecido
conjuntivo ou em outros tecidos mesenquimais, diferenciando-se apenas
pela formação de um tecido calcificado especializado.
A reparação tecidual inicia-se com a hemostasia,
formação do coágulo e de uma resposta inflamatória aguda com remoção
de tecido necrótico, restos celulares e formação de uma base provisória,
constituída, primeiramente, de uma malha de fibrina-fibronectina, para a
migração de células adjacentes à ferida, que invadem e iniciam a
repopulação da lesão. Em seguida, acontecem fenômenos de
angiogênese e formação de tecido de granulação (DANTAS
27
, 2000). Os
fibroblastos secretam colágeno e o tecido de granulação transforma-se
em tecido conjuntivo fibroso que se interpõe no local da fratura levando à
formação de um calo fibroso temporário que, em geral, está totalmente
formado em uma a duas semanas. O calo fibroso é substituído por tecido
osteóide, que se calcifica e forma o calo ósseo, formado por células
43
provenientes do periósteo e endósteo ou, freqüentemente, há formação
de cartilagem que precede a formação de tecido ósseo no calo. O calo
ósseo primitivo é formado por um tecido ósseo fibrilar grosseiro, sendo
substituído por um tecido ósseo lamelar maduro (calo secundário) num
processo lento que pode durar de meses até anos (TROWBRIDGE &
EMLING
107
, 1996). A remodelação do calo ósseo acontece por
reabsorção osteoclástica e subseqüente osteogênese converte esse osso
primário em osso cortical, restaura a forma e a integridade mecânica do
osso fraturado (SIMON et al.
96
, 2002).
O mecanismo desse padrão reparador é muitas vezes
considerado como uma recapitulação da osteogênese embriológica e do
crescimento (SCHENK
90
, 1996), com exceção da fase inflamatória inicial.
A hipóxia tecidual localizada, o coágulo e a inflamação ocorridos no local
de uma fratura, assim como a franca remodelação do calo em estágios
posteriores da reparação são respostas únicas, não havendo
correspondente durante o desenvolvimento esquelético (SIMON et al.
96
,
2002).
Histologicamente existem dois tipos de tecido ósseo: o
imaturo ou primário; e o maduro, secundário ou lamelar. O tecido primário
é o que aparece primeiro tanto no desenvolvimento embrionário como na
reparação de fraturas, sendo temporário e substituído por tecido
secundário. No tecido primário as fibras colágenas se dispõem
irregularmente, sem orientação definida, há menor quantidade de minerais
e maior proporção de osteócitos. Porém, no tecido ósseo secundário ou
lamelar essas fibras se organizam em lamelas paralelas ou concêntricas
separadas por uma substância cimentante que consiste em matriz
mineralizada, porém com muito pouco colágeno (LI et al.
59
, 2001;
JUNQUEIRA & CARNEIRO
45
, 2004). Essa fase de maturação e
remodelação do calo ósseo, a fase final da reparação, é a mais longa,
depende da taxa de remodelação e varia em diferentes espécies.
Geralmente, em humanos, ela leva de um a quatro anos e, 32 semanas
44
no cachorro para a completa substituição do calo por osso lamelar
funcionalmente competente. No rato este tempo ainda é incerto (LI et
al.
59
, 2001).
Li et al.
59
(2001) sugerem que a reparação total de uma
fratura seja considerada completa somente quando não houver mais
evidências radiográficas da linha de união dos fragmentos ósseos
fraturados, quando acontecer a restauração total da arquitetura óssea
histologicamente e quando o osso neoformado recuperar integralmente
sua resistência mecânica.
A formação óssea depende de dois pré-requisitos
indispensáveis: suprimento vascular amplo e suporte mecânico. Estes
princípios enfatizam o padrão de desenvolvimento ósseo inicial: na
ossificação direta ou intramembranosa, o tecido conjuntivo serve como
molde para a deposição óssea. O processo tem início pela diferenciação
de células mesenquimatosas que se transformam em grupos de
osteoblastos, sintetizam osteóide que logo se mineraliza, englobando
alguns osteoblastos que se transformam em osteócitos. Vários desses
grupos se formam havendo confluência das traves ósseas formadas,
dando ao osso um aspecto esponjoso, com cavidades entre as traves
penetradas por vasos sangüíneos e células mesenquimatosas
indiferenciadas, que irão dar origem à medula óssea. Durante a
ossificação indireta ou endocondral, a cartilagem serve como base sólida
que primeiramente será coberta e depois substituída por osso. Os
condrócitos sofrem hipertrofia e apoptose sendo suas cavidades
posteriormente invadidas por vasos sanguíneos e células osteogênicas
vindas do tecido conjuntivo adjacente. Estas células se diferenciam em
osteoblastos e depositarão matriz óssea sobre os tabiques de cartilagem
calcificada, que servem de apoio à ossificação. A ossificação endocondral
não ocorre em defeitos que não estão associados com uma fratura, nem
em fraturas que se reparam sob condições estáveis (SCHENK
90
, 1996;
JUNQUEIRA & CARNEIRO
45
, 2004).
45
Qualquer lesão óssea (fratura, defeito, fixação de
implantes, interrupção do suprimento sangüíneo) ativa a regeneração
óssea local pela liberação de fatores de crescimento e indutores. O osso
é, de fato, uma das fontes mais ricas em fatores de crescimento
(SCHENK
90
, 1996).
Certos fatores de crescimento que promovem a reparação
foram identificados. Estes regulam várias atividades celulares como a
proliferação, diferenciação e migração celular, além da síntese protéica e
da atividade secretora. Alguns deles são: fator de crescimento derivado
de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de
crescimento de fibroblastos (FGF), TGF-α e -β e a IL-1 (TROWBRIDGE &
EMLING
107
, 1996).
A osteoporose muda o curso da reparação óssea através
da diminuição da velocidade de formação do calo ósseo e da sua
quantidade (EGGERMANN et al.
30
, 2005).
Modelos animais com roedores são freqüentemente
utilizados para examinar a reparação de fraturas femurais, tibiofibulares
ou fibulares (WALSH et al.
116
, 1997).
Walsh et al.
116
(1997) fizeram um estudo mecânico e
histológico de fraturas femurais fechadas, além do conteúdo mineral
femural, em ratas ovariectomizadas aos três meses de idade. As fraturas
foram realizadas seis semanas após a OVX e analisadas após dez dias,
duas, quatro e seis semanas. Aos dez dias, os calos nos animais OVX
mostravam mais tecido mesenquimal indiferenciado e trabéculas ósseas
mais delgadas que os animais controle. Na segunda e quarta semanas,
permanecia o atraso da diferenciação no calo dos animais OVX em
relação aos controles, pois, na quarta semana, persistia a cartilagem
hialina enquanto que os controles mostravam osso maduro lamelar. Após
seis semanas, os calos dos animais controle e OVX eram similares, com
predominância de osso trabecular bem formado. Diferenças na resistência
à flexão foram verificadas na quarta semana refletindo a pobre qualidade
46
óssea e a menor quantidade de mineral ósseo, mas não foram detectadas
na sexta semana. Este estudo em ratos revela que a ovariectomia, após
curto período, pode prejudicar a reparação de fraturas femurais fechadas.
Namkung-Matthai et al.
69
(2001) usando ratas OVX e
recebendo LCD estudaram fraturas femorais abertas e verificaram
redução de 40% na área transversal e de 23% da DMO no osso do reparo
dessas fraturas observados após 21 dias comparados ao grupo sham.
Após a fratura, no sétimo dia o grupo sham apresentava formação óssea
enquanto o grupo OVX apresentava uma larga faixa de tecido fibroso. Ao
final de três semanas o grupo sham mostrava que a ossificação
endocondral havia progredido e mostrava extensas áreas de osso lamelar
sendo remodelado enquanto que o grupo OVX mostrava condrócitos
hipertróficos no início da ossificação. A histomorfometria revelou um
atraso na reparação do calo com pobre desenvolvimento de osso maduro
nas ratas OVX, indicando atraso na diferenciação celular.
O reparo de defeitos ósseos é um bom modelo para o
estudo da regeneração óssea. Ao contrário das fraturas, os defeitos são
menos propensos a fatores mecânicos e obstruções do suprimento
sanguíneo. Portanto, a reparação de defeitos ósseos em animais tem sido
amplamente utilizada em experimentos que visam pesquisar os efeitos de
técnicas cirúrgicas e fármacos na mesma (SCHENK
90
, 1996).
A quantidade e qualidade do osso reparado em condições
experimentais são influenciadas pela espécie animal, idade, localização
anatômica, envolvimento cortical (mono ou bicortical), presença de
periósteo ou dura-máter e estabilidade do defeito (ALKAN
1
et al., 2002).
Defeitos ósseos reparam por nova formação óssea e uma
incompleta reparação acontece na maioria dos casos devido a rápido
crescimento de tecido conjuntivo para dentro do defeito a partir das
margens da lesão e defeitos monocorticais podem evitar este problema
(ALKAN
1
et al., 2002).
Estudos examinaram a cicatrização de orifícios criados
47
em coelhos revelaram que orifícios com o diâmetro na ordem dos
osteônios (0,2mm) são concentricamente preenchidos por osso lamelar.
Em orifícios maiores, uma estrutura de osso embrionário é formada e
depois o osso lamelar é depositado nos espaços intertrabeculares
neoformados. O osso embrionário é formado mais rapidamente que o
osso lamelar, e o intervalo entre o depósito de matriz osteóide e a
mineralização é curto, de um a três dias. Comparada ao osso
embrionário, a formação do osso lamelar ocorre lentamente (SCHENK
90
,
1996).
Numerosos estudos têm avaliado o conceito de defeito de
tamanho crítico. Um defeito de tamanho crítico é aquele que não se
repara durante toda a vida do animal, mas como a maioria dos estudos
não se extende durante toda a vida do animal, o conceito experimental
refere-se àquele defeito que não se repara durante a duração do estudo
(GOSAIN et al.
35
, 2000).
Prado et al.
80
(2003) estudaram o tamanho crítico em
defeitos ósseos localizados em tíbias de ratas. Para tanto, utilizaram ratos
adultos nos quais foram confeccionados defeitos monocorticais de 2,3 ou
3,5mm de diâmetro. Os animais foram sacrificados aos 15, 30 e 45 dias
após a confecção do defeito. A porcentagem da área óssea no centro do
defeito foi avaliada através de planimetria por contagem de pontos e
posterior análise estatística. Os autores verificaram fechamento linear em
todos os grupos. Comparando os tamanhos de defeitos em cada período,
não foi encontrada diferença estatística com relação à porcentagem
óssea. Considerando o conceito de defeito de tamanho crítico, concluíram
que nenhum dos tamanhos testados é crítico, porém, como não houve o
preenchimento da área total, pode-se utilizar, com ressalvas, o modelo de
defeito ósseo em tíbia de ratos. Dadas as semelhanças com relação ao
reparo dos defeitos, os autores recomendaram o tamanho intermediário
por questões de ordem prática.
Gosain et al.
35
(2000) sugeriram que medidas lineares
48
comumente usadas para análise do fechamento de defeitos ósseos
podem não fornecer uma medida precisa da reparação destes como pode
ser obtido através de análise da ossificação baseada no volume de osso
depositado. Os autores encontraram resultados que mostram que defeitos
parietais de 5mm de diâmetro em porquinhos-da-índia, classificados como
de tamanho menor que o crítico pela análise da extensão linear, após 12
semanas, não ultrapassaram 40% de formação óssea quando analisados
pela área, tornando-os maiores que o tamanho crítico para o mesmo
período de estudo.
Estudos têm utilizado defeitos ósseos para avaliar a
reparação óssea em tíbia de ratas ovariectomizadas (AMADEI
3
, 2004;
SILVEIRA
95
, 2004), com ou sem a influência de medicamentos.
2.5 Bifosfonatos
Existe atualmente uma variedade de tratamentos
disponíveis para o controle da osteoporose. Agentes estimulantes de
formação óssea como os fluoretos, o paratormônio e seus análogos têm
sido considerados como uma opção de tratamento, por outro lado, os
inibidores da reabsorção óssea, que incluem o cálcio, a vitamina D, a
calcitonina, os esteróides gonadais e os bifosfonatos (BFs) têm mostrado
prevenir a perda óssea ou reduzir a ocorrência de fraturas
(NETELENBOS
74
, 1998).
Os esteróides da terapia de reposição hormonal foram por
muito tempo a primeira escolha terapêutica para o tratamento da
osteoporose, mas esse quadro vem se modificando e autores mais
recentes citam os bifosfonatos como o medicamento mais efetivo e usado
para essa finalidade (LEU et al.
58
, 2005; NANCOLLAS et al.
70
, 2006).
Os BFs são análogos sintéticos e estáveis do pirofosfato
49
(P-O-P), uma substância presente no organismo com função de inibir a
mineralização do osso. Nos BFs, o átomo de oxigênio central é
substituído pelo carbono (Figura 1) e essa ligação P-C-P torna esses
medicamentos quimicamente estáveis e resistentes à ação de ácidos e de
enzimas hidrolíticas. Não há nenhuma enzima conhecida que seja capaz
de clivar essa ligação (COMPSTON
19
, 1994; SZEJNFELD
102
, 2000; WOO
& ADACHI
118
, 2001; RODAN & RESZKA
87
, 2003).
Em relação à farmacocinética, os BFs comungam de
propriedades comuns. A absorção intestinal é pobre (<1 a 10%) e é
inibida por cálcio ou outros íons bivalentes que quelam o bifosfonato. São
rapidamente eliminados da circulação (meia-vida de 1 a 2 horas) e a
ligação ao mineral ósseo é de 20 a 60%, sendo que o restante é
eliminado pela urina (COMPSTON
19
, 1994; SZEJNFELD
102
, 2000;
RODAN & RESZKA
87
, 2003).
Os BFs são hidrofílicos e altamente solúveis em água e
portanto, raramente penetram membranas biológicas dos tecidos moles.
Essas mudanças físico-químicas também reduzem a susceptibilidade
intrínseca do metabolismo do medicamento, promovendo excreção
urinária ou biliar como substância inalterada (HIRABAYASHI &
FUJISAKI
41
, 2003). Todos esses fatores contribuem para a excepcional
ligação à superfície óssea, que combinada com a limitada capacidade de
penetração celular explicam a intensa afinidade da ação dos BFs ao
tecido ósseo e a vantajosa segurança desses medicamentos (RODAN &
RESZKA
87
, 2003).
O efeito colateral mais comum do BFs são as esofagites.
Cuidados devem ser tomados na administração para pacientes com
insuficiência renal. Os BFs reduzem a concentração sérica de cálcio
podendo causar hipocalcemia em pacientes com deficiência de vitamina D
(RISEDRONATE
85
, 2001; WOO & ADACHI
118
, 2001).
O átomo de carbono dos BFs permite a adição de cadeias
laterais, assim, substituições diferentes nas duas posições restantes do
50
átomo de carbono criaram diferentes BFs, cada um com propriedades
farmacológicas, atividade na reabsorção óssea e potência diferentes,
determinadas pela cadeia lateral (COMPSTON
19
, 1994; SZEJNFELD
102
,
2000; STEPAN et al.
98
, 2003).
Em ordem crescente de potência e atividade anti-
reabsortiva, os principais BFs são: etidronato, tiludronato, clodronato,
pamidronato, alendronato e risedronato (COMPSTON
19
, 1994).
O etidronato, primeiro bifosfonato, teve vários usos,
inclusive em produtos caseiros, como, por exemplo, no creme dental, na
inibição ou bloqueio de depósito de cálcio e tártaro. Foi utilizado em
calcificações heterotópicas após cirurgias de quadril, paraplegias e
doença de Paget (SZEJNFELD
102
, 2000; CASTRO et al.
18
, 2004), pois
quando em altas doses, inibe a mineralização do osso e cartilagem
(COMPSTON
19
, 1994; SZEJNFELD
102
, 2000).
Recentemente, novos BFs foram desenvolvidos com o
objetivo de dissociar os efeitos indesejáveis, na osteoporose, sobre a
mineralização óssea daqueles desejados sobre a reabsorção óssea. Os
derivados da amina parecem conferir alta potência, sem aumentar os
efeitos sobre a mineralização óssea ou alterar sua afinidade pela
hidroxiapatita. A atividade anti-reabsortiva pode ser aumentada
adicionando-se cadeias laterais ao grupo amino ou por meio de
substituições cíclicas, particularmente aquelas contendo nitrogênio no
anel heterocíclico, como no risedronato (Figura 1) (SZEJNFELD
102
, 2000;
CASTRO et al.
18
, 2004; NANCOLLAS et al.
70
, 2006).
51
FIGURA 1 -
Comparação entre as estruturas do pirofosfato, a básica dos
bifosfonatos e a nitrogenada do risedronato.
A estrutura P-C-P também é responsável pela forte
afinidade dos BFs ao osso e ligação à hidroxiapatita (SZEJNFELD
102
,
2000; WOO & ADACHI
118
, 2001). Outros autores (HIRABAYASHI &
FUJISAKI
43
, 2003; CASTRO et al.
18
, 2004; NANCOLLAS et al.
70
, 2006)
complementam que os dois grupos fosfonatos atuam em conjunto com o
grupo hidroxila ou amino da cadeia lateral (Figura 1) conferindo aumento
da afinidade com a hidroxiapatita, permitindo direcionamento eficiente e
rápido para a superfície óssea.
No estudo de Nancollas et al.
70
(2006), foi feita uma
comparação entre a afinidade de ligação à hidroxiapatita de vários
bifosfonatos e os autores demonstraram uma duração de ação mais
prolongada do alendronato e zoledronato comparado a efeitos mais
facilmente reversíveis do etidronato e risedronato. Estas diferenças de
afinidade foram atribuídas à cadeia lateral não-hidroxila.
Estudos auto-radiográficos mostram a localização
preferencial dos BFs marcados nas superfícies de reabsorção
(SZEJNFELD
102
, 2000; RODAN & RESZKA
87
, 2003) apoiando a idéia de
que sua presença nessa região é necessária para a ativação adequada
do osteoclasto (SZEJNFELD
102
, 2000). De fato, agentes osteotrópicos
tendem a se acumular em certas regiões do tecido ósseo, não se
distribuindo de forma homogênea e se concentrando em locais
caracterizados por alta taxa metabólica, isto é, lugares de maior
remodelação óssea. Na tíbia de ratos ele se concentra mais na epífise e
PIROFOSFATO
BIFOSFONATOS RISEDRONATO
52
metáfise do que na diáfise (HIRABAYASHI & FUJISAKI
41
, 2003;
STEPENSKY et al.
99
, 2003).
O tempo de permanência dos BFs no organismo e ossos
é longo, podendo durar dez anos ou mais, dependendo da velocidade de
remodelação do tecido ósseo (SZEJNFELD
102
, 2000; STEPENSKY et
al.
99
, 2003). A meia-vida esqueletal dos bifosfonatos em ratos parece não
estar bem estabelecida. Para Li et al.
59
(2001) o alendronato permanece
até duzentos dias enquanto Koivukangas et al.
50
(2003) relatam uma
meia-vida esqueletal de três a 12 meses para os bifosfonatos.
A primeira teoria sobre como os BFs atuariam retardando
a reabsorção óssea era de que haveria inibição da dissolução dos cristais
de hidroxiapatita via efeitos físico-químicos. Hoje se acredita que BFs
mais potentes e administrados em doses menores atuem por mecanismos
celulares, não físico-químicos (NANCOLLAS et al.
70
, 2006).
O BF incorporado à matriz óssea é farmacologicamente
inativo até ser liberado em um novo foco de reabsorção através da
acidificação, enquanto que o resto do medicamento ligado ao osso em
outros locais permanece praticamente quiescente (STEPENSKY et al.
99
,
2003). Não está bem estabelecido se a ação do medicamento poderia
ocorrer na margem apical dos osteoclastos, ou se o agente atua após sua
internalização na célula, ou se o bifosfonato é liberado no fluido ósseo
(SZEJNFELD
102
, 2000).
Após a liberação do medicamento do osso, esses agentes
atingem novamente a circulação e uma parte será excretada, enquanto
outra parte é readsorvida ao osso (STEPENSKY et al.
99
, 2003).
Grande parte dos autores relatam a ocorrência de
internalização dos BFs pelos osteoclastos (CONSEJO
21
, 2000; IM et al.
42
,
2004), o que provocaria a perda de estruturas intracelulares implicadas na
secreção de enzimas hidrolíticas e de H
3
O
+
, necessários para a ação
destrutiva dos osteoclastos sobre o tecido ósseo (CONSEJO
21
, 2000).
Existem teorias de que os dos BFs teriam efeitos sobre a
53
permeabilidade dos osteoclastos ao cálcio, acarretando as mudanças
estruturais que vêm sendo observadas na borda em escova ou no
citoesqueleto dessas células (SZEJNFELD
102
, 2000). Assim, inibiriam
diretamente a atividade osteoclástica através da alteração do
citoesqueleto modificando a morfologia celular, a borda em escova, a
sinalização de integrinas e o transporte de endossomos (STEPAN et al.
98
,
2003).
Os BFs podem ser agrupados em dois grupos, segundo o
seu mecanismo de ação. Os mais fracos e mais parecidos com o
pirofosfato, como o clodronato e o etidronato, podem ser metabolizados
em análogos citotóxicos do ATP não-hidrolizáveis que serão então
incorporados pelos osteoclastos levando-os à apoptose. Os mais potentes
não são metabolizados e atuam na via do mevalonato (WOO &
ADACHI
118
, 2001; LEU et al.
58
, 2006).
Os aminobifosfonatos reduzem a função dos osteoclastos
inibindo a farnesil difosfato sintetase, uma enzima da seqüência de
biossíntese do colesterol, pela via do mevalonato, requerida para a
produção de geranilgeranil difosfato. A geranilgeranil difosfato liga
proteínas à membrana celular por um processo chamado de isoprenilação
de proteínas. A depleção desta enzima limita a prenilação de pequenas
proteínas regulatórias que controlam a forma celular e a formação da
borda em escova dos osteoclastos, resultando em prejuízo para a função
dos osteoclastos (RODAN & RESZKA
87
, 2003; STEPAN et al.
98
, 2003).
Em nível celular, os aminobifosfonatos inibem a
diferenciação e recrutamento de osteoclastos (COMPSTON
19
, 1994;
SZEJNFELD
102
, 2000; STEPAN et al.
98
, 2003), assim como a sua adesão
à matriz mineralizada e reduzem seu tempo de vida pela ativação de
caspases pró-apoptóticas (STEPAN et al.
98
, 2003). A indução de
apoptose leva a uma reduzida profundidade das lacunas de reabsorção,
contribuindo para maior equilíbrio local de reabsorção e formação ósseas
(PARFITT et al.
77
, 1996).
54
Evidências recentes sugerem que os efeitos na
reabsorção óssea são também mediados, pelo menos em parte, pela
ação via osteoblastos (COMPSTON
19
, 1994). O bifosfonato estimulou a
liberação de um fator de inibição de osteoclastos em culturas de
osteoblastos de ratos (PARFITT et al.
77
, 1996). Atuando na retração de
osteoblastos de superfície e no recrutamento de osteoclastos e seus
precursores, os BFs modificam a remodelação óssea através da
diminuição da freqüência de ativação de BMU (SZEJNFELD
102
, 2000).
BFs também inibem a produção de IL-6 em células
humanas de osteossarcoma. Nos roedores, as células medulares são a
maior fonte de IL-6 e sua produção pelos osteoblastos da superfície
óssea poderia estar envolvida na origem de novas BMUs (PARFITT et
al.
77
, 1996).
O risedronato, terceira geração de BFs, é um piridil
bifosfonato com potência mil vezes maior que a do etidronato como
agente anti-reabsortivo (WOO & ADACHI
118
, 2001) indicado para o
tratamento e prevenção da osteoporose pós-menopausa e da
osteoporose induzida por corticosteróides em homens e mulheres, além
da Doença de Paget (RISEDRONATE
85
, 2000).
O risedronato é usado no tratamento da osteoporose pós-
menopausa na dosagem de 5 mg diários, durante dois a três anos, e
estudos de histologia óssea em mulheres com osteoporose tratadas com
risedronato 5mg diário indicam que o osso formado durante o tratamento
é de qualidade normal (RISEDRONATE
85
, 2001).
Os primeiros BFs atuavam primariamente em osso
trabecular e eram menos efetivos na prevenção de perda de osso
compacto e em fraturas de fêmur (LANE et al.
55
, 1996). Já o tratamento
da osteoporose pós-menopausa com risedronato resulta em aumento da
DMO (LANE et al.
55
, 1996; EASTELL
29
, 1998, HARRIS et al.
40
,1999;
FOGELMAN et al.
31
, 2000; WOO & ADACHI
118
, 2001) e em decréscimo
do número de fraturas tanto vertebrais como não-vertebrais (LANE et
55
al.
55
, 1996; EASTELL
29
, 1998, HARRIS et al.
40
,1999; WOO & ADACHI
118
,
2001). Tratamentos de três anos de duração levaram a um aumento
médio de 5,4% na DMO das vértebras lombares e de 3,3% e 1,6% no
trocânter e colo de fêmur, respectivamente. A respeito de redução de
fraturas vertebrais, os valores oscilam entre 40 e 50% e, no caso de
fraturas não-vertebrais há redução de 33 a 40% (CONSEJO
21
, 2000).
Recente estudo (ITO et al.
43
, 2005) com ratos
ovariectomizados verificou que muito da eficácia do risedronato explicada
somente pelo aumento da DMO e da massa óssea também está
relacionada com a sua capacidade, em doses superiores a 0,5mg/kg, de
aumentar a resistência óssea através da alteração da microarquitetura e
do aumento da conectividade de trabéculas, alterações que se mostraram
altamente correlacionadas com a melhora das propriedades biomecânicas
do osso, obtendo resultados superiores aos animais sham.
Para Borah et al.
13
(2005), um dos mecanismos dos BFs
que promovem a redução do risco de fratura é o aumento da
mineralização do osso. Quando há elevada remodelação óssea o tempo
de vida de uma BMU é curto, resultando em osso neoformado
parcialmente mineralizado, comprometendo as propriedades
biomecânicas do osso. Pela redução da remodelação ocasionada pelos
BFs é possível aumentar o tempo de vida da BMU e reduzir o seu
número, proporcionando uma mineralização secundária com o decorrer
do tempo. Estes autores confirmaram essa mineralização aumentada em
pacientes usando risedronato, por três anos, através de microtomografia
computadorizada com radiação synchrotron.
Boonen et al.
12
(2004) estudaram o risedronato usando
mulheres de oitenta anos ou mais, com osteoporose, e demonstraram
que, após um ano de uso do risedronato, houve redução de fraturas
vertebrais em 81% quando comparado a mulheres que receberam
placebo. Eles também verificaram que o risedronato é bem tolerado, não
mostrando, neste estudo, aumento de sintomas gastrintestinais.
56
Um estudo comparativo macroscópico e histológico dos
aminobifosfonatos (pamidronato, alendronato e risedronato) mostrou que
o risedronato exibiu efeitos gástricos mais favoráveis e seguros que os
aminobifosfonatos primários (BLANK et al.
10
, 1997). Outros estudos
atestaram a boa tolerabilidade do risedronato quando comparado a
placebos (HARRIS et al.
40
, 1999; FOGELMAN et al.
31
, 2000; McCLUNG
et al.
65
, 2001). Os achados de Kanatsu et al.
47
(2004) demonstraram que,
embora o risedronato possua efeitos irritativos e de prejuízo à cicatrização
de lesões estomacais pré-existentes, seus efeitos são muito menos
pronunciados que os do alendronato.
Cao et al.
17
(2002) sugeriram que a ação dos bifosfonatos
inibindo a reabsorção óssea e diminuindo substancialmente a
remodelação óssea leva a um efeito secundário e bastante proeminente
de supressão da atividade de formação óssea tanto em ratos como em
mulheres. No entanto, seus estudos com ratas OVX, assim como outros
em animais não castrados (LI et al.
60
, 1999; LI et al.
59
, 2001),
demonstraram que, na verdade, os BFs (incadronato, clodronato,
pamidronato e alendronato) não impedem a iniciação da reparação de
fraturas e a formação do calo ósseo, mas o uso contínuo desses
medicamentos, especialmente em altas doses, impede fortemente o
processo de remodelação do calo e a substituição do osso primário por
osso lamelar por causa da inibição da atividade de osteoclastos, célula
importante neste processo. Também verificaram uma maior mineralização
no calo ósseo dos animais tratados com os BFs (CAO et al.
17
, 2002).
Os efeitos dos BFs sobre a formação óssea e, mais
particularmente, sobre os osteoblastos e seus precursores vêm sendo
investigados por vários autores (D’AOUST et al.
25
, 2000; IM et al.
42
, 2004;
NAGASHIMA et al.
68
, 2005; VON KNOCH et al.
114
, 2005). Sugere-se que
os BFs devem ter um efeito estimulante sobre osteoblastos (IM et al.
42
,
2004).
D’Aoust et al.
25
(2000) encontraram sinais de maior
57
promoção da diferenciação de osteoblastos em defeitos criados na
calvária de ratos tratados com etidronato do que em animais controle.
Neste estudo o etidronato acelerou a formação de tecido osteóide e
também mineralizado, além de estimular maior porcentagem de área de
preenchimento do defeito.
Im et al.
42
(2004) observaram aumento da proliferação de
osteoblastos em culturas primárias de células ósseas humanas tratadas
com alendronato e risedronato em relação ao controle. Efeitos sobre a
maturação de osteoblastos foram observados através da expressão da
fosfatase alcalina, sinal precoce de diferenciação celular de osteoblastos
em culturas, que estava aumentada nas células tratadas. Também houve
aumento da expressão de BMP 2, colágeno tipo I e osteocalcina. Os
autores sugerem que o efeito anabólico dos BFs seja via aumento da
BMP 2 e outras proteínas ósseas morfogenéticas.
Estudo similar de Von Knoch et al.
114
(2005) com cultura
de células ósseas com origem na medula óssea tratadas com risedronato,
zoledronato e alendronato pesquisou e encontrou aumento da expressão
de fosfatase alcalina, colágeno tipo I e sialoproteína óssea tipo II em
células tratadas. O aumento de expressão dessas substâncias ocorreu de
forma dependente do tempo e tipo de tratamento, tendo o zoledronato e
efeito mais potente na promoção da proliferação e diferenciação de
osteoblastos.
Para Nagashima et al.
68
(2005) a ação do risedronato na
formação óssea de defeitos femorais em ratos foi bimodal, estimulatório
no desenvolvimento de células osteogênicas para a formação de osso
primário e inibitório na diferenciação terminal de osteoblastos na
remodelação e maturação final do osso, com conseqüente atraso na
formação de osso lamelar cortical. Dai et al.
26
(2004) relataram o
importante papel dos osteoclastos na regulação da formação óssea
osteoblástica, particularmente no desenvolvimento de matriz óssea
lamelar.
58
2.6 Homeopatia
A medicina alternativa é definida como qualquer dos
sistemas médicos de diagnóstico e tratamento que seja diferente do uso
de medicamentos alopáticos e de práticas cirúrgicas para tratar uma
doença ou lesão. Ela inclui grande quantidade de terapias como a
homeopatia, naturopatia, massagens, meditação, nutrição, suplementos
alimentares, acupuntura, entre outras (BODANE & BROWNSON
11
, 2002).
O médico saxão Samuel Hahnemann (1755-1843) foi o
fundador único de uma nova doutrina médica, a Homeopatia, na transição
dos séculos XVIII e XIX, período de revolução de idéias médicas em toda
a Europa. Deixou numerosos escritos que determinaram a teoria e a
prática homeopáticas, muitas das quais continuam atualmente em vigor
(CORNILLOT
23
, 2005).
Em 1966, durante o governo do presidente Castello
Branco, foi decretada obrigatória a inclusão da Farmacologia
Homeopática em todas as faculdades de farmácia do Brasil. Em 1977, foi
publicada a primeira edição oficial da Farmacopéia Homeopática
Brasileira. Em 1980, o Conselho Federal de Medicina reconheceu
oficialmente a homeopatia como especialidade médica, deixando, assim,
de ser uma “terapia alternativa” no Brasil (CORRÊA et al.
24
, 1997).
A palavra homeopatia, oriunda do grego homoios =
semelhante e páthos = doença ou sofrimento, designa a ciência
terapêutica que é baseada em quatro fundamentos assim sintetizados: a)
Lei da semelhança ou Similia similibus curentur; b) experimentação no
homem sadio; c) dose mínima; d) remédio único (KOSSAK-
ROMANACH
52
, 1984).
Dito de forma explicativa, a “Lei da Semelhança” é:
“Todo produto que administrado em dose forte a um
homem em boa saúde deflagra perturbações determinadas pode,
59
em dose fraca, fazer desaparecer essas mesmas perturbações no
homem doente” (TETAU
104
, 1987).
A prática da homeopatia supõe então uma
experimentação realizada pela administração de várias substâncias ao
homem sadio. Nesse sentido se pode dizer que a homeopatia era um
método experimental. O conjunto de indícios anotados nessa
experimentação feita em dose subtóxica traz o nome de patogenesia e
figura nas obras da “Matéria Médica”. Essa prática também faz o emprego
de doses fracas, infinitesimal, elevando-se, muitas vezes, bem além do
número de Avogadro (6,02x10
23
), a partir de 15CH (TETAU
104
, 1987).
Enquanto na terapêutica clássica são considerados os
efeitos primários, químicos ou cumulativos dos medicamentos, estando
bem estabelecida a dose útil de cada um deles, o mesmo não ocorre com
a homeopatia, onde o efeito do remédio se traduz pela reação vital,
variável de indivíduo a outro (KOSSAK-ROMANACH
52
, 1984).
Tem um outro aspecto em relação ao medicamento
homeopático que o distingue da alopatia que é a dinamização do
medicamento. A dinamização é a liberação da energia dinâmica por meio
da vibração molecular, as sucussões. Além do medicamento homeopático
ser extremamente diluído, ele passa por sucussões através de agitações.
Cada vez que o medicamento é diluído e passado para uma potência
mais alta ele é agitado cem vezes. Essa agitação, que à primeira vista
parece não ter importância, na verdade é necessária, porque muitos
medicamentos simplesmente diluídos são inertes, nada fazem e, depois
de agitados passam a ter um poder medicamentoso extraordinário. Isso
dinamiza o medicamento, desperta nele uma energia. O medicamento
homeopático age principalmente por energia, não por peso, não por
massa (NOÇÕES
75
, 1980).
Teorias sobre os medicamentos homeopáticos, chamados
de medicamentos energéticos, estão sendo atualmente exploradas.
60
Instrumentos agora são capazes de medir o campo eletromagnético do
corpo. Um remédio homeopático pode ter uma freqüência ressonante que
é capaz de interagir com uma freqüência produzida pelos tecidos do
corpo e assim causar um estado de equilíbrio que foi perturbado durante
a doença. Pode ser possível aumentar a intensidade do campo
eletromagnético de uma substância por meio de potencialização (BOYD
14
,
1993).
Os mecanismos de ação da homeopatia envolvem a
biofísica e tem-se utilizado estudos de absorção de ultravioleta, técnicas
de difração de raios X e ressonância magnética para se achar a
explicação para a inversão do efeito segundo a diluição (PATRÍCIO
78
,
2003). Um estudo usando ressonância magnética nuclear mostrou que 23
medicamentos e potências homeopáticas tinham nítidas leituras de
atividade subatômica, o que não acontece com um placebo (ULLMAN
112
,
1988).
Sharma
94
apud Ullman
112
(1988), professor de biofísica na
Índia, teoriza que as pequenas doses usadas em homeopatia são
capazes de atravessar a barreira sangüínea do cérebro e as membranas
celular e nuclear. Sua hipótese é a de que os medicamentos
homeopáticos mais potencializados podem atuar por mais tempo e com
mais profundidade que os medicamentos menos potencializados, porque
são capazes de penetrar nessas barreiras fisiológicas e,
conseqüentemente, liberar seus efeitos terapêuticos com maior
profundidade.
A atividade do medicamento é proporcional à sua
homeopaticidade (ou semelhança com os sintomas do doente) e ao seu
grau de dinamização ou potencialização que, quanto maior, maior é a
atividade medicamentosa. Portanto, a atividade do medicamento é
proporcional a estas duas observações e não à sua quantidade
(NASSIF
71
, 1995).
A simplicidade dos meios terapêuticos é outra grande
61
característica da doutrina homeopática. A concepção holística do ser
humano em seu estado fisiopatológico resulta em uma imagem dada
pelos sintomas característicos. A esta imagem única só pode
corresponder uma imagem medicamentosa também única
(CORNILLOT
23
, 2005).
O medicamento homeopático provém, basicamente, dos
três reinos da natureza – vegetal, animal e mineral – bem como da
indústria químico-farmacêutica (vacinas, toxinas, sintéticos) e de
laboratórios biopatológicos (NASSIF
71
, 1995).
Todo ser vivo é composto de substâncias orgânicas e
inorgânicas (sais minerais). A matéria inorgânica é fundamental para
manutenção da integridade estrutural e da atividade funcional dos órgãos
e tecidos. De acordo com a teoria de Schuessler, “o método bioquímico
substitui os esforços curativos da natureza pelas substâncias que fazem
falta nas partes afetadas, ou seja, pelos sais inorgânicos” (NOÇÕES
75
,
1980). Segundo ele, a substância química predominante no tecido
alterado pela doença tem ciclo biológico viciado, passível de ser
restabelecido pela administração de doses reduzidas da mesma
substância (KOSSAK-ROMANACH
52
, 1984).
Os medicamentos bioquímicos são empregados em baixa
potência (NOÇÕES
75
, 1980), como a 6CH – dinamizado até a sexta
potência, na escala centesimal, pelo método hahnemanniano (NASSIF
71
,
1995), ou em trituração e têm patogenesia sob o ponto de vista
homeopático, isto é, foram experimentados no homem são (NOÇÕES
75
,
1980). A administração em doses reduzidas, mas não infinitesimais, não
visa a alteração das células normais, porém, são suficientes para
compensar os menores desvios funcionais (KOSSAK-ROMANACH
52
,
1984).
Esses medicamentos teciduais, os sais de Schussler, são:
Calcium carbonicum, Calcium fluoricum, Calcium phosphoricum, Calcium
sulphuricum, Kallium muriaticum, Kalium phosphoricum, Kalium
62
sulphuricum, Ferrum phosphoricum, Natrium muriaticum, Natrium
sulphuricum e Silicea (NOÇÕES
75
, 1980).
Calcarea fluorica ou Calcium fluoricum, CaF
2
, ou fluoreto
de cálcio, sal de cor branca-acinzentada quando reduzido ao pó, pouco
solúvel na água, dispõe de minuciosa patogenesia e se destaca pela
coincidência da sua totalidade sintomática com alguns aspectos do
comprometimento da hipófise, semelhantes a hipo- ou disfunção
hipofisária. Hipófise e Calcarea fluorica influenciam a tonicidade dos
ligamentos e das articulações. O indivíduo relacionado ao quadro de
Calcarea fluorica apresenta sinais evidentes de hipertireoidismo
(KOSSAK-ROMANACH
52
, 1984).
É indicado fundamentalmente em doenças das fibras
elásticas e do tecido ósseo, principalmente periosteal, como medicamento
tecidual. Nas deformações ósseas e exostoses em diversas localizações
como: crânio, mandíbula, omoplata, dedos, patela, tíbia e membros em
geral, às vezes após a ocorrência de um traumatismo, ele é
provavelmente o melhor medicamento. Também tem sido útil em casos de
gota com deposição de cristais de monourato de sódio nas articulações
(KENT
48
, 1989; VIJNOVSKY
113
, 1992).
O tratamento homeopático curativo e, principalmente,
preventivo da osteoporose oferece uma alternativa interessante aos
tratamentos clássicos toda vez que estes forem contra-indicados ou,
mesmo, como primeira intenção. Segundo Cornillot
23
(2005) o tratamento
homeopático da osteoporose comporta todos os “calcários” da Matéria
Médica, ou seja, 34 medicamentos, mas três realmente são utilizados
nesta indicação que são os medicamentos constitucionais: Calcarea
carbonica, Calcarea phosphorica e Calcarea fluorica. Entre os principais
medicamentos de tropismo ósseo está a Calcarea fluorica, com
importante ação no metabolismo ósseo. Com efeito, a intoxicação crônica
fluorada pode acarretar distúrbios de osteocondensação e também
distúrbios de hipocondensação muito próximos da osteomalácia, a qual
63
também é próxima da osteoporose. Este autor recomenda prescrição
diária em 5CH ou, em caso de sujeito distrófico em 15CH, durante seis
meses até um ano, e posteriormente, em tratamento de dez dias por mês,
durante três anos.
Palermo et al.
76
(1999) estudaram os efeitos do
medicamento homeopático FMS Calciumfluor prescrito especificamente
para tratar osteoporose e que envolvia uma preparação de ressonância
simultânea de Calcarea fluorica (CaF
2
), Silicea (SiO
2
) e Magnesia
phosphorica (MgHPO
4
), nas potências D6/D12 em culturas de
osteoblastos derivados da tíbia de ratos. O objetivo foi de verificar
diferenças nas células osteogênicas em relação à proliferação e/ou
diferenciação através da modulação da expressão e produção de
marcadores osteogênicos como a fosfatase alcalina (AP), indicador da
maturação de osteoblastos, além da mineralização do osteóide, através
da incorporação de cálcio à matriz e formação de nódulos, eventos da
última fase de osteogênese. O tratamento não afetou a proliferação
celular ou a expressão de metaloproteinases 2 e 9, envolvidas na
remodelação da matriz extracelular. A atividade e os níveis de AP se
mostraram aumentados e a incorporação de Ca à matriz aumentou, com a
formação de nódulos de mineralização precocemente e em maior número
quando comparado com as culturas não-tratadas. Esses efeitos foram
obtidos com doses muito menores (0,043-0,086 µM) do que as
concentrações de fluoretos (NaF) necessárias (10 -100 µM) (MANDUCA
et al.
62
, 2005).
Os fluoretos são conhecidos agentes anabólicos para
osso, atuando na proliferação e diferenciação de pré-osteoblastos e
células mais maduras, mas possuem estreita janela terapêutica e efeitos
adversos em altas doses terapêuticas, impedindo sua aplicação no
tratamento de perdas ósseas como ocorre na osteoporose. Acrescenta-se
que a qualidade óssea obtida após longo tratamento com os fluoretos é
muito baixa devido ao excessivo acúmulo de flúor na matriz óssea
64
(MANDUCA et al.
62
, 2005).
Um estudo radiográfico da densidade óptica avaliando o
reparo de lesões confeccionadas em tíbias de ratos SHR castrados e
medicados com risedronato, Calcarea fluorica e Calcarea phosphorica,
avaliados sete e 21 dias após a confecção das lesões, mostrou valores
sempre maiores nos animais tratados com risedronato, seguido dos
tratados com Calcarea phosphorica, mas sem diferença estatisticamente
significante deste último para aqueles que receberam Calcarea fluorica
(SENRA et al.
93
, 2004).
Para o National Center for Complementary and Alternative
Medicine (NCCAM
72
, 2006), várias explicações têm sido propostas sobre
como a homeopatia funciona, porém nenhuma teoria foi cientificamente
comprovada. Estudos usando homeopatia têm sido contraditórios em
seus achados, mas mesmo os resultados positivos não são explicados
cientificamente. Esse centro ainda ressalta que as controvérsias e
debates que ocorrem sobre a homeopatia são causados principalmente
pelo grande número de conceitos-chave que são seguem as leis da
ciência, particularmente a química e a física. As falhas científicas na
comprovação de tratamentos não são exclusivas da homeopatia. Existem
opiniões de que a homeopatia funciona e é segura, mas que métodos
científicos modernos não explicaram ainda porque funciona.
65
3 PROPOSIÇÃO
Este trabalho tem como objetivo avaliar e comparar os
efeitos do risedronato e da Calcarea fluorica na reparação óssea em
defeitos realizados em tíbias de ratas ovariectomizadas.
66
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Animais e grupos experimentais
Para a realização deste trabalho foram utilizadas 140
ratas (Rattus novergicus, var. albinus, Wistar) com 105 dias de idade e
peso aproximado de 300g, mantidas em gaiolas em temperatura ambiente
e alimentadas com ração Guabi Nutrilabor e água ad libitum, fornecidos
pelo Biotério da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos –
UNESP.
Este estudo foi realizado de acordo com os Princípios
Éticos para a Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos –
UNESP sob protocolo nº 025/2003-PA/CEP (Anexo A).
Os animais foram divididos em quatro grupos
experimentais:
a) Grupo O - ratas ovariectomizadas e tratadas com
placebo (água filtrada), via oral, duas gotas/animal/dia;
b) Grupo S - ratas Sham (falso ovariectomizadas) e
tratadas com placebo (água filtrada), via oral, duas
gotas/animal/dia;
c) Grupo R - ratas ovariectomizadas e tratadas com
risedronato (Actonel - Hoeschst), via oral, 1,5mg/kg/dia
em suspensão aquosa calculada para que a dose por
animal correspondesse a três gotas;
67
d) Grupo Cf - ratas ovariectomizadas e tratadas com
Calcarea fluorica 6CH (Pharmaciantiga – São José dos
Campos, SP), via oral, três gotas/animal/dia em solução
hidroalcoólica de preparação homeopática.
4.2 Método
4.2.1 Anestesia
Para todos os procedimentos cirúrgicos os animais
receberam anestesia geral com solução aquosa a 2% de cloridrato de 2-
(2,6-xilidino)-5,6-dihidro-4H-1,3 tiazina (Rompun - Bayer, São Paulo, SP,
Brasil), substância sedativa e relaxante muscular, associada a ketamina
base (Dopalen - Agribrands do Brasil Ltda), anestésico geral, na
proporção de 1:0,5ml e administrados por via intramuscular na dose de
0,1ml/100g de peso dos animais.
4.2.2 Procedimentos cirúrgicos
4.2.2.1 Ovariectomia e falsa ovariectomia (Sham)
Nos animais dos grupos ovariectomizados, após a
anestesia geral, foi realizada depilação da região lateral do corpo, próxima
à altura dos rins e logo abaixo da última costela (Figura 2) seguida de
antissepsia com álcool iodado. Uma incisão longitudinal com extensão
68
média de 1cm na pele e na camada muscular foi confeccionada com o
uso de lâmina de bisturi n
o
15 montada em cabo de bisturi BardParker. O
ovário foi identificado e exposto, com o auxílio de uma pinça, para fora da
cavidade abdominal e, após amarria da vasculatura local, com linha de
algodão, para haver contenção da hemorragia, fez-se a excisão dos
ovários e de parte do útero e tecidos moles adjacentes (Figura 3). As
trompas foram reposicionadas na cavidade abdominal e, em seguida, a
camada muscular e a pele foram suturadas com fio de seda 3.0 (Ethicon -
Johnson & Johnson). Nova anti-sepsia foi realizada na região com álcool
iodado. Estes procedimentos foram realizados bilateralmente.
Nos animais do grupo falso ovariectomizado, ou grupo
Sham todos os procedimentos acima foram realizados, incluindo a
exposição dos ovários, exceto a amarria da vasculatura e a remoção dos
mesmos.
69
FIGURA 2 - Rata após a realização da depilação da região a ser operada
para a realização da OVX.
FIGURA 3 – Ovariectomia: a) corte da camada muscular; b) exposição dos
ovários e útero; c) amarria e excisão dos ovários; d) parte do
útero e tecido retirado.
a
b
c d
70
4.2.2.2 Execução da lesão óssea
Em todos os animais foi realizado um defeito ósseo
monocortical, arredondado, até o limite da medula óssea, na tíbia direita,
após 35 dias de castração. Após serem novamente anestesiados,
realizou-se depilação da região (Figura 4) e, após antissepsia local com
álcool iodado, foi realizada uma incisão de aproximadamente 1,5cm na
pele e músculo, na região do terço proximal tibiano, face medial, com o
uso de lâmina de bisturi n
o
15 montada em cabo de bisturi BardParker
(Figura 5). Após a exposição da tíbia do animal, o periósteo e os tecidos
moles foram afastados com espátula n
o
7 e até a exposição do tecido
ósseo. O defeito monocortical, realizado na face medial do osso, com a
utilização de uma broca esférica carbide de 2,5 mm de diâmetro (n
o
8)
utilizando-se motor elétrico (Asséptico – AEV 707 Implant Surgery
System), na velocidade de 1500 rpm, sob irrigação constante e abundante
com solução de NaCl 0,9% estéril durante toda a manipulação. Após
preenchimento do defeito ósseo com coágulo sanguíneo e estabilização
do mesmo a região foi suturada por planos com fio de seda 3.0 (Ethicon -
Johnson & Johnson). Nova anti-sepsia foi realizada na região com álcool
iodado.
71
FIGURA 4 - Rata após a realização da depilação da região a ser operada
para a realização do defeito ósseo.
FIGURA 5 - Execução do defeito ósseo: a) incisão; b) afastamento da
musculatura; c) perfuração com broca e irrigação; d) defeito
criado.
a
b
c
d
72
4.2.3 Tratamento
No dia seguinte à realização da lesão, os animais
iniciaram o tratamento, via oral, com auxílio de apreensão manual, através
de conta-gotas, ficando então os grupos divididos conforme a Figura 6.
FIGURA 6 - Divisão dos grupos experimentais para a realização do
tratamento.
140 ratas
35
OVX
35
OVX
35
SHAM
3 ½ meses de idade
300
g
35
OVX
35 dias
35 dias
35 dias
35 dias
lesão
óssea
lesão
óssea
lesão
óssea
lesão
óssea
Risedronato
Gru
p
o R
Calcarea
fluorica
Grupo Cf
Placebo
Gru
p
o O
Placebo
Grupo S
73
4.2.4 Sacrifício e tempos experimentais
Todas as ratas foram sacrificadas, em grupos de sete
animais, após três, seis, 12, 18 e 24 dias a partir do início do tratamento.
Para a realização do sacrifício foi utilizada anestesia geral em dose
excessiva. Em seguida as tíbias foram retiradas, parcialmente
descarnadas e fixadas com solução de formol a 10% (Formaldeído -
Regentes Analíticos Dinâmica), durante o período mínimo de 48 horas.
4.2.5 Análise do reparo ósseo
O reparo ósseo na região do defeito monocortical na tíbia
foi recebeu avaliações radiográfica, histológica e histomorfométrica.
4.2.5.1 Análise radiográfica
As tíbias foram radiografadas pelo Sistema de Radiografia
Digital Direta Intrabucal RVGui, versão 5.0 (Trophy Radiology, Marnela-
Vallée, France) dotado de dispositivo de carga acoplada, o sensor CCD
(charged-coupled device) para captura direta de imagem constituído de
um sistema ligado por cabo ao microcomputador, e utilizando aparelho
radiográfico com corrente contínua Gendex 765DC (Gendex Dental
Systems, Dentsply International, Chicago, IL, USA) de 65kVp e 7mA com
filtração de 2mm/Al, ponto focal efetivo de 0,4mm
2
e área focal de 6cm.
Para isso as tíbias foram posicionadas sobre o sensor, que estava fixado
em uma mesa, com a face na qual se encontrava a lesão óssea
74
centralizada na área ativa, que é de 30x20mm, e voltada para o sensor de
forma a não ser observada sobreposição das corticais na imagem
radiográfica da lesão. As tomadas radiográficas, com tempo de exposição
de 0,125s e com o cilindro posicionado com distância focal de 40cm foram
realizadas pela técnica do paralelismo (Figura 7).
O sensor do sistema de radiografia digital direta intrabucal
RVGui proporciona três tipos de imagens e dois modos de resolução
espacial. O modo de alta resolução, que foi utilizado nesta pesquisa,
produz imagens grandes de 1840x1360 pixels e este foi associado ao tipo
de imagem do modo “perio”, que é utilizado para observação do osso
alveolar. As imagens radiográficas foram obtidas com resolução de 600
dpi, salvas em formato bitmap (bmp) e analisadas pelo programa
UTHSCSA Image Tool, versão 3.00 (University of Texas Health Sciences
Center, San Antonio, Texas, USA) quanto à densidade óptica (DO). A
densidade óptica foi medida em uma região selecionada por uma elipse
que delimitava toda área do defeito criado e era demonstrada pelo
programa em uma escala de 256 níveis de cinza onde o preto
correspondia ao zero e o branco ao 255.
75
FIGURA 7 - Sistema de radiografias digitais RVGui (Trophy) e monitor do
computador mostrando a imagem radiográfica digital capturada.
Em detalhe, sensor CCD com a tíbia montada na posição utilizada
para radiografar.
4.2.5.2 Análise histológica
Após a realização da tomada radiográfica das peças, as
tíbias foram aparadas e submetidas à descalcificação com solução de
Plank-Rychlo. A solução estoque foi preparada da seguinte forma: cloreto
de alumínio 126,10gramas + ácido clorídrico 10N, 85ml + ácido fórmico
88%, 54ml dissolvidos em 1 litro de água destilada. Na hora da utilização
esta solução foi diluída em água destilada na proporção de 1:4. Após a
descalcificação completa, as tíbias foram seccionadas transversalmente
adjacente ao limite distal do defeito ósseo. O fragmento contendo a lesão
foi incluído, no sentido da superfície de corte, em bloco de parafina e
submetido a processamento histológico de rotina com obtenção de cortes
76
semi-seriados com aproximadamente 5 a 6µm de espessura e
aprofundamento de 100µm em cada nível, somando um total de doze
lâminas em cada bloco. Para cada nível foram confeccionadas duas
lâminas, uma foi corada com Hematoxilina e Eosina (HE – Merck & Co.,
Inc.) e a outra com Tricrômio de Masson (SIGMA Diagnostics – St. Louis,
MO, USA).
Após, os cortes mais centrais do defeito foram
selecionados e submetidos à análise, com o auxílio de microscopia de luz,
avaliando-se os aspectos morfológicos da reparação óssea, analisando o
desenvolvimento, substituição, maturação e remodelação das diversas
estruturas que se formam nas fases seqüenciais do reparo ósseo: coágulo
sangüíneo, tecido de granulação, aparecimento de células osteogênicas,
trabéculas ósseas neoformadas (matriz osteóide e matriz mineralizada),
trabéculas ósseas maduras e remodelação das mesmas.
4.2.5.3 Análise histomorfométrica
Para a documentação e análise histomorfométrica, as
lâminas foram fotografadas em diferentes aumentos com microscópio de
luz Zeiss Axiophot 2 (Carl Zeiss, Oberköchen, Alemanha), com câmera
digital acoplada Cyber-shot Sony, modelo DSC-S85. As imagens digitais
(formato JPEG) em aumento de 25x, de quatro lâminas, para cada animal,
da região mais central do defeito e coradas por Tricrômico de Masson
foram selecionadas para análise quantitativa do tecido ósseo neoformado
Utilizou-se o programa NIH Image J (U.S. National
Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA - http://rsb.info.nih.gov/ij/),
versão 1.31 para Windows. Foi calculada a área em pixels
2
de uma região
delimitada que abrangia todo o defeito criado e o canal medular
adjacente, chamada de área A, e também calculada uma segunda área
77
formada pela delimitação de toda a área preenchida por osso, chamada
de área B (Figura 9). Usando os valores obtidos calculou-se a proporção
de área preenchida por osso em relação à área A no corte analisado
seguindo a equação:
Preenchimento (%) = Área B x 100
Área A
FIGURA 8 - Fórmula para realização do cálculo do percentual de
preenchimento do defeito e canal medular.
A seguir, utilizou-se a ferramenta magic wand do
programa Adobe Photoshop, versão 7.0, para selecionar somente as
trabéculas ósseas presentes na área B, após delimitação prévia da área
de preenchimento com a ferramenta eraser. Essas trabéculas marcadas
foram copiadas e salvas como uma nova imagem (Figura 11) que foi
analisada pelo programa Image J para cálculo da área dessas trabéculas
através dos seguintes passos:
a) conversão da imagem para escala de cinza: Image →
Type → 8-bit;
b) conversão da imagem para preto e branco: Process
→ Binary → Threshold;
c) medição da área: Analyze → Analyze Particles
(coloque 500 para minimum particle size, escolha
Summarize e clique em 'OK');
78
FIGURA 9 - Delimitações das áreas A e B: a) área A (soma da área do
defeito e do canal medular); b) área B e demarcação dos limites
das trabéculas (pontilhado) em detalhe.
Área B
Área A
defeito
canal
medular
a
b
79
Com esses passos a área analisada (trabéculas) foi
delimitada e medida automaticamente em pixels
2
. A proporção de osso
formado (área trabecular) foi então calculada através da relação entre a
área ocupada somente pelas trabéculas ósseas neoformadas (área C)
(Figura 11) e a área preenchida por osso (área B) segundo a equação:
Área trabecular (%)= Área C x 100
Área B
FIGURA 10 - Fórmula para realização do cálculo do percentual de área
trabecular dentro da área de preenchimento.
Esse cálculo permite o conhecimento da proporção entre
trabéculas ósseas e espaço intertrabecular.
FIGURA 11 - Imagem: a) somente das trabéculas ósseas obtidas pelo Adobe
Photoshop; b) após o Threshold do Image J representando a
área C (em negro) que é considerada para o cálculo da área
trabecular.
As imagens possuíam código que não permitia a
identificação do grupo experimental ao qual pertenciam, possibilitando
uma análise cega dos dados, que foram tabulados e submetidos à análise
a
b
80
estatística. O valor da porcentagem de área preenchida por osso e a
porcentagem de volume trabecular nessa área, por animal,
corresponderam à média dos valores obtidos nas quatro lâminas
analisadas.
4.2.6 Análise estatística
A reparação foi medida operacionalmente de três formas:
a) densidade óptica da região do defeito criado (n=7);
b) proporção de área preenchida por osso (n=6);
c) proporção de área trabecular (n=6).
Os dados obtidos por meio da análise da densidade
óptica (0 a 255 da escala de cinza) e da análise histomorfométrica (%)
foram analisados de forma descritiva (média e desvio-padrão) e
inferencial. Para a análise estatística foram utilizados a Análise de
Variância (ANOVA, fator duplo) e o teste de Comparação Múltipla de
Tukey, com nível de significância de 5% através da utilização dos
programas STATISTICA for Windows, versão 7.0 (2000 - Analytical
Software Co.) e Excel 2003 for Windows.
A análise estatística foi realizada em duas partes. A
primeira seguiu um esquema fatorial tipo 2x5, para a densidade óptica, e
2x4 para as análises histomorfométricas, sendo que as variáveis
independentes consideradas foram a presença (Sham) ou ausência de
ovários (OVX) e os tempos de sacrifício dos animais (três, seis, 12, 18 e
24 dias, para a densidade óptica, e seis, 12, 18 e 24 dias, para a
histomorfometria). A segunda parte da análise estatística seguiu um
esquema fatorial tipo 4x5, para a densidade óptica, e 4x4 para as análises
histomorfométricas, sendo que as variáveis independentes consideradas
foram os tipos de tratamento - Sham e placebo (S), OVX e placebo (O),
81
OVX e Calcarea fluorica (Cf), além de OVX e risedronato (R) e os tempos
de sacrifício dos animais (três, seis, 12, 18 e 24 dias, para a densidade
óptica, e seis, 12, 18 e 24 dias, para a histomorfometria)
A variável resposta (ou dependente) foi a reparação
óssea das tíbias dos animais em cada uma das condições experimentais.
82
5 RESULTADO
Neste capítulo foram analisados os dados da reparação
óssea obtidos por meio de análise histológica morfométrica e descritiva e
da análise da densidade óptica.
Para as análises quantitativas, os dados obtidos foram
divididos e analisados em duas partes. Na primeira foram analisados os
grupos que receberam placebo, os grupos O e S, enquanto que na
segunda comparou-se os dados dos animais dos grupos
ovariectomizados entre si (R, Cf e O).
5.1 Densidade óptica
5.1.1 Análise estatística dos grupos O e S
Os dados referentes à análise descritiva das médias de
densidade óptica estão apresentados na Tabela 1 e representados na
Figura 12, mostrados a seguir.
83
Tabela 1– Média e desvio-padrão dos dados de densidade óptica segundo
as variáveis: ovariectomia (presença ou ausência de ovários) e
tempo de reparo (dias)
Ovariectomia (m±dp) Tempo de
Reparo
n
O S
3 7
95,36
±7,12
80,71
±5,88
6 7
98,00
±8,88
96,79
±9,78
12 7
104,57
±8,93
102,00
±4,41
18 7
97,00
±9,04
101,21
±7,42
24 7
92,21
±7,29
101,43
±9,34
n = tamanho da amostra
O = Ovariectomizado + placebo
S = Sham + placebo
m±dp = média ± desvio-padrão
Observou-se que os valores médios do grupo O foram
superiores aos do grupo S nos períodos de três, seis e 12 dias. Já nos
períodos de 18 e 24 dias o grupo S mostrou valores superiores ao grupo
O (Tabela 1).
Os valores de densidade óptica no grupo O se mostraram
crescentes com o aumento do tempo de reparo até os 12 dias, quando
sofreram uma queda. Já para o grupo S houve crescimento dos valores
até os 12 dias, mas após isso, mostraram tendência à estabilização.
A análise de variância (ANOVA) referente a esses dados
encontra-se na Tabela 2.
84
Tabela 2 – Resultado da ANOVA para aos dados de
densidade óptica
Fonte de
Variação
gl SQ QM F p
Tempo 4
1742,57 435,64 6,84
0,0001*
Ovariectomia 1
17,50 17,50 0,27
0,602
Interações 4
1120,57 280,14 4,40
0,0034*
Resíduos 60
3821,50 63,69
Total 69
6702,14
*p<0,05
Os resultados (Tabela 2) revelaram como efeito
significante o fator tempo e a sua interação com o fator ovariectomia.
Quando realizado o teste de Tukey (5%) (Tabela 3 e
Figura 12) verificou-se que não há diferença estatisticamente significante
entre os valores dos diferentes períodos do grupo O, enquanto que o
grupo S mostrou, no período de três dias, média significantemente
diferente das médias dos outros dias do grupo.
Após a comparação entre os grupos O e S nos diferentes
tempos de reparo, verificou-se que as médias de densidade óptica só
diferiram estatisticamente no período de três dias e mostraram valores
significantemente iguais em todos os outros períodos.
85
Densidade Óptica
70
80
90
100
110
120
3 6 12 18 24
Tempo de Reparo (dias)
O S
A
BBBBBBBB
A
B
FIGURA 12 – Gráfico das médias referentes aos valores de densidade
óptica considerando o efeito da ovariectomia e do tempo de
reparo, mostrando grupos homogêneos (Tukey).
Tabela 3 – Representação, em ordem crescente, das médias de densidade
óptica (DO) dos grupos, após o teste de comparação múltipla de
Tukey (5%)
Grupos
Tempo de
Reparo (dias)
Média DO Grupos Homogêneos
S 3 80,71 A
O 24 92,21 A B
O 3 95,36 B
S 6 96,79 B
O 18 97,00 B
O 6 98,00 B
S 18 101,21 B
S 24 101,43 B
S 12 102,14 B
O 12 104,57 B
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
86
5.1.2 Análise estatística dos grupos R, Cf e O
Para a análise dos resultados de densidade óptica dos
grupos ovariectomizados com diferentes tipos de tratamento, em relação
ao tempo de reparo, foi realizada a estatística descritiva, cujos valores
encontram-se na Tabela 4 e representados na Figura 13.
Tabela 4 – Média e desvio-padrão dos dados de densidade óptica segundo
as variáveis: tratamento e tempo de reparo (dias)
Tratamentos (m±dp) Tempo de
Reparo
n
R Cf O
3
7
90,93
±5,35
80,00
±7,00
95,36
±7,12
6
7
91,86
±4,92
92,86
±5,56
98,00
±8,88
12
7
111,93
±8,37
105,21
±6,79
104,57
±8,93
18
7
116,50
±6,72
98,86
±7,29
97,00
±9,04
24
7
113,50
±7,38
90,43
±5,34
92,21
±7,29
n = tamanho da amostra
R = Ovariectomizado + risedronato
Cf = Ovariectomizado + Calcarea fluorica
O = Ovariectomizado + placebo
m±dp = média ± desvio-padrão
Os grupos Cf e O mostraram médias de densidade óptica
com valores crescentes até o período de 12 dias e, a partir deste período,
as médias tiveram valores decrescentes. Já o grupo R mostrou valores
crescentes até os 18 dias, com decréscimo de valores após este período
de tempo.
87
Tabela 5 – Resultado da ANOVA referente aos dados de
densidade óptica
Fonte de
Variação
gl SQ QM F p
Tempo 4 4638,96 1159,74 22,43 0,0000*
Tratamento 2 2376,70 1188,35 22,98 0,0000*
Interações 8 2810,82 351,35 6,80 0,0000*
Resíduos 90 4653,14 51,70
Total 104 14479,63
*p<0,05
Os dados apresentados na Tabela 5 possibilitaram rejeitar
a hipótese de igualdade entre os efeitos do tratamento e tempo de reparo,
mostrando interação significante entre os fatores.
Após o teste de comparação múltipla de Tukey (5%)
(Tabela 6), pode-se afirmar que as condições com os maiores valores
foram aquelas formadas pelo grupo R aos 18 e 24 dias, sendo seguidas
pelo período de 12 dias para todos os grupos.
Densidade Óptica
70
80
90
100
110
120
3 6 12 18 24
Tempo de Reparo (dias)
R Cf O
A
B
C
A
B
A
B
C
B
C
A
B
C
C
D
E
C
D
E
D
E
B
C
D
B
C
E
A
B
A
B
C
E
88
FIGURA 13 – Gráfico das médias referentes aos valores de densidade
óptica considerando os tratamentos, os tempos de reparo e
mostrando os grupos homogêneos (Tukey).
Tabela 6 – Representação, em ordem crescente, das médias de densidade
óptica (DO) dos grupos, após o teste de comparação múltipla de
Tukey (5%)
Grupos
Tempo de
Reparo (dias)
Média DO Grupos Homogêneos
Cf 3 80,00 A
Cf 24 90,43 A B
R 3 90,93 A B
R 6 91,86 A B C
O 24 92,21 A B C
Cf 6 92,86 A B C
O 3 95,36
B C
O 18 97,00
B C
O 6 98,00
B C
Cf 18 98,86
B C D
O 12 104,57
C D E
Cf 12 105,21
C D E
R 12 111,93
D E
R 24 113,50
E
R 18 116,50
E
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
Quando comparou-se os grupos dentro dos tempos de
reparo foi observado que aos três dias o grupo Cf mostrou a média mais
baixa de densidade sem, no entanto, diferir de forma estatisticamente
significante do grupo R. Tanto para o período de seis dias, quanto para 12
dias, não houve diferença entre os tratamentos para os valores médios de
densidade óptica. Aos 18 e 24 dias o grupo R mostrou os valores mais
altos, com diferença estatisticamente significante dos outros grupos.
89
5.2 Análise histomorfométrica
5.2.1 Preenchimento com tecido ósseo nos grupos O e S
A estatística descritiva dos dados de preenchimento com
tecido ósseo (%) na área do defeito e canal medular encontra-se na
Tabela 7 e Figuras 14 e 15.
Os valores referentes ao período de três dias não se
encontram representados, pois a quantidade de osso presente em alguns
animais nesse período era muito pequena e imensurável pelo método
utilizado neste estudo e foi considerado como zero.
Tabela 7 – Média e desvio-padrão dos dados preenchimento com tecido
ósseo (% da área total) segundo as variáveis: ovariectomia
(presença ou ausência de ovários) e tempo de reparo (dias)
Ovariectomia (m±dp) Tempo de
Reparo
n
O S
6 6
24,56
±12,66
33,86
±14,04
12 6
65,93
±14,65
67,40
±8,26
18 6
23,77
±3,88
30,18
±8,96
24 6
21,25
±7,36
29,29
±6,30
n = tamanho da amostra
O = Ovariectomizado + placebo
S = Sham + placebo
m±dp = média ± desvio-padrão
Ambos os grupos, O e S, mostraram comportamento
semelhante em relação ao tempo de reparo. Seus valores médios de
preenchimento cresceram até os 12 dias e, a partir de então, sofreram
uma queda, sempre mostrando valores próximos entre os dois grupos.
90
Após a realização da análise de variância (ANOVA),
representada pela Tabela 8 verificou-se ausência de interação significante
e então os fatores ovariectomia e tempo foram analisados
separadamente, ambos fatores mostrando diferença estatisticamente
significante (p<0,05).
Tabela 8 – Resultado da ANOVA para os dados de
preenchimento com tecido ósseo nos grupo O e
S
Fonte de
Variação
gl SQ QM F p
Tempo 1 0,044848 0,044848 4,1860 0,0477*
Ovariectomia 3 1,379722 0,459907 42,9259 0,0000*
Interações 3 0,010426 0,003475 0,3244 0,8077#
Resíduos 38 0,407131 0,010714
Total
45 1,84
*p<0,05
#p>0,05, portanto não há interação: cada fator deve ser analisado separadamente
Preenchimento
0%
20%
40%
60%
80%
100%
OS
Ovariectomia
A
B
FIGURA 14 – Gráfico das médias referentes aos valores preenchimento com
osso (%), considerando a ovariectomia, mostrando grupos
91
homogêneos.
Pode-se observar na Tabela 9 o efeito da ovariectomia,
mostrando que o grupo O apresentou valores menores de preenchimento
com tecido ósseo com diferença estatisticamente significante do grupo S.
Após a realização do teste de Tukey (Tabela 10) para o
fator tempo de reparo verificou-se a existência de dois grupos
homogêneos, um representado pelo período de 12 dias e o outro, pelo
conjunto dos outros tempos de reparo (seis, 18 e 24 dias).
Preenchimento
0%
20%
40%
60%
80%
100%
6121824
Tempo de Reparo (dias)
A
B
AA
FIGURA 15 – Gráfico das médias referentes aos valores de preenchimento
com osso (%), considerando o tempo de reparo, mostrando
grupos homogêneos (Tukey).
Tabela 9 – Representação, em ordem crescente, das médias de
preenchimento com tecido ósseo (%) dos grupos O e S,
mostrando os grupos homogêneos considerando separadamente
a variável ovariectomia (presença ou ausência de ovários)
Grupos Média Grupos Homogêneos
O 33,88 A
92
S 41,17 B
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
Tabela 10 – Representação, em ordem crescente, das médias de
preenchimento com tecido ósseo (%) dos grupos O e S, após o
teste de comparação múltipla de Tukey (5%), realizado
separadamente para a variável tempo de reparo (dias)
Tempo de Reparo Média Grupos Homogêneos
24 24,47 A
18 26,97 A
6 29,21 A
12 66,67 B
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
5.2.2 Preenchimento com tecido ósseo nos grupos R, Cf e O
Os dados da estatística descritiva (média e desvio-
padrão) referentes aos tratamentos e aos diferentes períodos de
observação estão apresentados na Tabela 11 e representados na Figura
16.
Os valores referentes ao período de três dias não se
encontram representados, pois a quantidade de osso presente em alguns
animais nesse período era muito pequena e imensurável pelo método
utilizado neste estudo, sendo considerados como zero.
Observou-se (Tabela 11 e Figura 16) que todos os grupos
apresentam picos dos valores médios de preenchimento com osso aos 12
dias, havendo decréscimo desses valores até 24 dias, com exceção do
grupo R, que sofreu uma queda aos 18 dias e elevou novamente seus
valores aos 24 dias.
93
Tabela 11 – Média e desvio-padrão dos dados preenchimento com tecido
ósseo (% da área total) segundo as variáveis tratamento e
tempo de reparo (dias)
Tratamentos (m±dp) Tempo de
Reparo
n
R Cf O
6
6
80,86
±5,13
60,87
±8,39
24,56
±12,66
12
6
98,21
±8,21
65,38
±13,41
65,93
±14,65
18
6
75,61
±13,85
24,36
±10,29
23,77
±3,88
24
6
95,78
±5,87
23,41
±9,58
21,25
±7,36
n = tamanho da amostra
R = Ovariectomizado + risedronato
Cf = Ovariectomizado + Calcarea fluorica
O = Ovariectomizado + placebo
m±dp = média ± desvio-padrão
Quando aplicado o teste ANOVA para as variáveis tempo
de reparo e tratamento, verificou-se que o efeito conjunto dessas duas
variáveis foi estatisticamente significante, como observado na Tabela 12.
Tabela 12 – Resultado da ANOVA referente aos dados de
preenchimento com tecido ósseo nos grupo R, Cf
e O
Fonte de
Variação
gl SQ QM F p
Tempo 2 3,94082 1,97041 194,955 0,0000*
Tratamento 3 1,29409 0,43136 42,680 0,0000*
Interações 6 0,68300 0,11383 11,263 0,0000*
Resíduos 60 0,60642 0,01011
Total
71 6,52
94
*p<0,05
As médias das condições experimentais estabelecidas
pelas variáveis tempo e tratamento foram comparadas pelo teste de
Tukey (5%) (Tabela 13).
Tabela 13 – Representação, em ordem crescente, das médias de
preenchimento com tecido ósseo (%) dos grupos R, Cf e O,
após o teste de comparação múltipla de Tukey (5%)
Grupos
Tempo de
Reparo (dias)
Média Grupos Homogêneos
O 24 21,25
A
Cf 24 23,41
A
O 18 23,77
A
Cf 18 24,36
A
O 6 24,56
A
Cf 6 60,87
B
Cf 12 65,38
B C
O 12 65,93
B C
R 18 75,61
B C
R 6 80,86
C D
R 24 95,78
D
R 12 98,21
D
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
95
Preenchimento
0%
20%
40%
60%
80%
100%
6121824
Tempo de Reparo (dias)
R Cf O
C
D
B
A
D
B
C
B
C
B
C
AA
D
AA
FIGURA 16 – Gráfico das médias referentes aos valores preenchimento com
osso (%), considerando os tratamentos e os tempos de reparo,
mostrando os grupos homogêneos (Tukey).
Em todos os períodos de observação o grupo R mostrou
os maiores valores de preenchimento, diferindo estatisticamente dos
outros grupos.
Os grupos Cf e O se mostraram com valores
estatisticamente iguais em todos os períodos de tempo, diferindo somente
aos seis dias, quando o grupo Cf se mostrou superior ao O.
5.2.3 Área de osso trabecular nos grupos O e S
Os dados da estatística descritiva (média e desvio-
padrão) referentes à ovariectomia (presença ou ausência de ovários) e
aos diferentes períodos de observação estão apresentados na Tabela 14
e representados nas Figuras 17 e 18.
96
Pôde-se observar que as médias dos valores de
porcentagem de área trabecular nos grupos O e S mostraram
comportamento semelhante em relação aos dias de observação através
de valores em queda do sexto para o 12
o
dia e aumento desses valores
até o 24
o
dia. Os valores maiores foram encontrados no grupo O (Tabela
14).
Tabela 14 – Média e desvio-padrão dos dados área trabecular (% do
preechimento) segundo as variáveis ovariectomia (presença ou
ausência de ovários) e tempo de reparo (dias)
Ovariectomia (m±dp) Tempo de
Reparo
n
O S
6 6
50,75
±21,05
44,79
±5,19
12 6
43,60
±2,45
40,15
±8,25
18 6
61,60
±4,67
52,98
±8,76
24 6
75,22
±5,18
71,53
±8,39
n = tamanho da amostra
O = Ovariectomizado + placebo
S = Sham + placebo
m±dp = média ± desvio-padrão
Quando realizada a análise de variância ANOVA (Tabela
15) foi verificado que o fator ovariectomia (presença ou ausência de
ovários) não foi significante, assim como sua interação com o fator tempo.
Assim, o fator tempo, foi o único a apresentar significância, sendo
analisado separadamente pelo teste de Tukey (5%) (Tabela 16 e 17).
97
Tabela 15 – Resultado da ANOVA para os dados de área
trabecular (%) nos grupo O e S
Fonte de
Variação
gl SQ QM F p
Ovariectomia 1 0,03330 0,03330 3,552 0,0671
Tempo 3 0,59629 0,19876 21,201 0,0000*
Interações 3 0,00501 0,00167 0,178 0,9104#
Resíduos 38 0,35626 0,00938
Total
45 0,99
*p<0,05
#p>0,05, portanto não há interação: cada fator deve ser analisado separadamente
Tabela 16 – Representação, em ordem crescente, das médias de área
trabecular (%) dos grupos O e S, mostrando os grupos
homogêneos considerando separadamente a variável
ovariectomia (presença ou ausência de ovários)
Grupos Média Grupos Homogêneos
O
57,80
A
S
50,62
A
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
Tabela 17 – Representação, em ordem crescente, das médias de área
trabecular (%) dos grupos O e S, após o teste de comparação
múltipla de Tukey (5%), mostrando separadamente a variável
tempo de reparo (dias)
Tempo de
Reparo
Média
Grupos Homogêneos
12 41,87
A
6 47,77
A B
18 57,29
B
24 73,74
C
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
98
A Figura 17 mostra que as médias dos grupos O e S não
diferem de forma estatisticamente significante e fazem parte de um
mesmo grupo homogêneo.
Área Trabecular
0%
20%
40%
60%
80%
100%
OS
Ovariectomia
AA
FIGURA 17 – Gráfico das médias referentes aos valores de área trabecular
(%), considerando a ovariectomia, mostrando grupos
homogêneos (Tukey).
Considerando o fator tempo de reparo no teste de Tukey
observa-se a presença de três grupos homogêneos. O período de seis
dias mostrou valores intermediários aos dos períodos de 12 e 18 dias
(Figura 18).
A condição com maior área percentual ocupada por
trabéculas, nos grupos O e S, foi encontrada aos 24 dias.
99
Área Trabecular
0%
20%
40%
60%
80%
100%
6121824
Tempo de Reparo (dias)
A
B
A
B
C
FIGURA 18 – Gráfico das médias referentes aos valores de área trabecular
(%), considerando o tempo de reparo, mostrando grupos
homogêneos (Tukey).
5.2.4 Área de osso trabecular nos grupos R, Cf e O
Os dados da estatística descritiva (média e desvio-
padrão) referentes aos grupos ovariectomizados com os diferentes
tratamentos, e aos tempos de reparo estão apresentados na Tabela 18 e
representados na Figura 19.
Pôde-se observar que as médias dos valores de
porcentagem de área trabecular nos grupos R, Cf e O mostraram
comportamento semelhante em relação aos dias de observação através
de valores em queda do sexto para o 12
o
dia e aumento desses valores
até o 24
o
dia. Com exceção do sexto dia, quando o grupo R apresentou os
maiores valores de porcentagem de área trabecular, em todos os outros
dias de observação, foram encontrados no grupo O os maiores valores
médios (Tabela 18).
100
Tabela 18 – Média e desvio-padrão dos dados de área trabecular (% do
preechimento) segundo as variáveis tratamento e tempo de
reparo (dias)
Tratamentos (m±dp) Tempo de
Reparo
n
R Cf O
6
6
63,28
±8,01
58,23
±7,80
50,75
±21,05
12
6
41,83
±5,44
41,05
±7,77
43,60
±2,45
18
6
45,69
±5,50
57,65
±7,61
61,60
±4,67
24
6
48,87
±9,27
62,62
±12,73
75,22
±5,18
n = tamanho da amostra
R = Ovariectomizado + risedronato
Cf = Ovariectomizado + Calcarea fluorica
O = Ovariectomizado + placebo
m±dp = média ± desvio-padrão
A ANOVA da Tabela 19 mostrou que o fator tratamento e
tempo foram significativos, bem como sua interação.
Tabela 19 – Resultado da ANOVA referente aos dados área
trabecular (% do preechimento) nos grupos R, Cf
e O
Fonte de
Variação
gl SQ QM F p
Tempo 2 0,07605 0,03803 4,346 0,0172*
Tratamento 3 0,39690 0,13230 15,122 0,0000*
Interações 6 0,26439 0,04407 5,037 0,0003*
Resíduos 60 0,52493 0,00875
Total
71 1,26
*p<0,05
Quando realizado o teste de comparação múltipla de
101
Tukey (5%) (Tabela 20) verificou-se a formação de quatro grupos
homogêneos indicando pouca diferença entre os tratamentos dentro dos
períodos de observação, ou seja, os grupos apresentaram espaçamento
intertrabecular bastante semelhantes.
Tabela 20 – Representação, em ordem crescente, das médias da área
trabecular (%) dos grupos R, Cf e O após o teste de
comparação múltipla de Tukey (5%)
Grupos
Tempo de
Reparo (dias)
Média Grupos Homogêneos
Cf 12 41,05
A
R 12 41,83
A
O 12 43,60
A B
R 18 45,69
A B C
R 24 48,87
A B C
O 6 50,75
A B C
Cf 18 57,65 A
B C D
Cf 6 58,23 A
B C D
O 18 61,60
B C D
Cf 24 62,62
C D
R 6 63,28
C D
O 24 75,22
D
Letras iguais não diferem de forma estatisticamente significante
102
Área Trabecular
0%
20%
40%
60%
80%
100%
6 121824
Tempo de Reparo (dias)
R Cf O
C
D
A
B
C
D
A
B
C
AAA
B
A
B
C
A
B
C
D
B
C
D
A
B
CC
DD
FIGURA 19 – Gráfico das médias referentes aos valores de área trabecular
(%), considerando os tratamentos e os tempos de reparo,
mostrando os grupos homogêneos (Tukey).
Confirmaram-se esses resultados quando comparadas as
médias dos grupos dentro dos tempos de reparo (Figura 19). Aos seis, 12
e 18 dias, os grupos R, Cf e O não mostraram diferenças estatisticamente
significantes entre si. Aos 24 dias o grupo O apresentou os maiores
valores de área trabecular, sendo diferente do grupo R, com os menores
valores. O grupo Cf mostrou valores intermediários entre os outros dois,
mas sem diferenças estatisticamente significantes.
103
5.3 Análise histológica descritiva
Verificou-se, pela análise histológica, a presença de
diferenças entre os grupos experimentais, tanto em relação ao tratamento
quanto em relação aos períodos de observação. Em nenhum dos
períodos e tratamentos observados verificou-se junção perfeita do osso
novo com as bordas corticais do defeito.
5.3.1 Período de três dias
Os cortes histológicos já mostraram, neste período, nos
grupos tratados tanto com Calcarea fluorica (Cf) como com risedronato
(R), o início de formação óssea com a presença de tecido de granulação
diferenciando em osso na periferia e no fundo do canal medular, originado
a partir do endósteo, e preenchimento da região central do defeito e canal
medular (área A) com tecido de granulação e, por vezes, coágulo bem
formado, no entanto esses dois grupos diferiram em alguns aspectos. No
grupo R o preenchimento da área A foi completo. Seu osteóide mostrou-
se repleto de células osteogênicas e áreas com mineralização iniciada;
nas áreas onde persistia a presença de tecido de granulação este se
mostrou denso na periferia e mais frouxo no centro, com pequenos
coágulos. No grupo Cf não houve preenchimento do fundo do canal
medular e o tecido de granulação se apresentou mais fibroso.
Nos grupos S e O houve atraso na diferenciação, sem a
ocorrência de formação de trabéculas e osteóide. No grupo S, o tecido de
granulação era pobre em fibras colágenas e células, preenchia o fundo do
canal medular enquanto que sua parte superior, além do defeito estavam
preenchidos por coágulo estável, bastante fibrinoso. O grupo O (Figura
104
20a) mostrou-se ainda mais atrasado, com coágulo fresco ocupando toda
área, quase sem tecido de granulação, que só apareceu em alguns cortes
no fundo do canal medular.
5.3.2 Período de seis dias
Aos seis dias foi observado nos grupos R e Cf a presença
de trabéculas finas e entrelaçadas, de distribuição homogênea, com a
presença de muitos osteócitos e espaço intertrabecular preenchido por
tecido de granulação. Observou-se certo atraso do grupo Cf em relação
ao grupo R. O grupo R apresentava osso preenchendo todo o canal
medular, quase sempre, até a superfície do defeito, sem entretanto formar
ponte de osso cortical na união das bordas do mesmo e mostrando,
poucas vezes, pequena quantidade de tecido de granulação na região
mais central e superficial (Figura 20b). Alguns cortes apresentavam
esquírolas ósseas envolvidas por osso neoformado. Já o grupo Cf
mostrava uma área um pouco menor de preenchimento de osso, quase
sempre deixando o fundo do canal medular livre e sem a ocorrência da
nivelação óssea superficial, área que permaneceu com tecido de
granulação na maioria dos cortes.
Os grupos O e S mostraram-se em fase anterior do
processo de reparação quando comparados com os grupos R e Cf.
Houve, neste período, formação óssea de trabéculas jovens, finas e com
osteócitos volumosos que ocupavam somente o fundo e a periferia do
canal medular, ficando grande parte da região preenchida pelo tecido de
granulação e coágulo centrais. Esse tecido de granulação se mostrou
repleto de vasos sangüíneos de diversos calibres e com pouca
celularidade e fibras. No espaço intertrabecular do grupo S já havia a
presença de tecido medular.
105
5.3.3 Período de 12 dias
No grupo R havia osso jovem e bastante celularizado
preenchendo todo canal medular e formando ponte trabecular entre as
bordas do defeito na maioria dos cortes (Figura 20c). Esse osso se
mostrou com trabéculas grosseiras, de limites irregulares e aspecto
desorganizado, apresentando formações semelhantes a enovelados. O
espaço intertrabecular estava preenchido por tecido conjuntivo fibroso
com algumas áreas já apresentando tecido medular.
O grupo Cf diferenciou-se por mostrar sinais de
remodelação óssea. Na periferia foi observada a presença de trabéculas
maduras, sem osteóide e com osso menos celularizado enquanto no
centro do defeito havia osso jovem e com bastante celularidade. Mostrava
também liberação de parte do canal medular na maioria dos cortes. Os
espaços intertrabeculares eram maiores e sem tecido de granulação, mas
tecido medular.
Os grupos O e S apresentaram trabéculas jovens
bastante celularizadas fazendo alinhamento no terço mais superficial da
área A, mas com algumas áreas de tecido de granulação. Verificou-se a
presença de tecido medular nos espaços intertrabeculares e no fundo do
canal medular.
106
FIGURA 20 – Aspecto das fases iniciais do reparo ósseo; Tricrômio de
Masson. a) grupo O, três dias, área do defeito e canal medular
preenchidos por coágulo sangüíneo (■) e com início de
formação de tecido de granulação (►). Aumento original 100x;
b) grupo R, seis dias, área central do defeito preenchida por
tecido de granulação (►) e formação de osso trabecular (
♦), a
partir da periferia do defeito e canal medular. Aumento original
100x; c) grupo R, 12 dias, calo ósseo totalmente formado por
osso trabecular preenchendo área do defeito e canal medular.
Aumento original 25x.
107
108
5.3.4 Período de 18 dias
Aos 18 dias o grupo R mostrava pobre remodelação com
formação de ponte delgada unindo as extremidades do defeito, mas com
permanência de osso trabecular em grande parte do canal medular
(Figura 21a). As trabéculas ainda eram irregulares, com presença de
algumas estruturas enoveladas e fendas (Figura 22c) alternando com
áreas de osso com característica mais lamelar, com fibras orientadas,
mas menos celularizadas que aos 12 dias.
No grupo Cf (Figura 21b) a remodelação foi mais
acentuada, mostrando ponte óssea unindo as extremidades do defeito.
Esse osso aproximava-se do aspecto de osso cortical, com certa
continuidade, pequena espessura e pouca celularidade. Praticamente não
havia mais osso no canal medular, somente alguns restos de trabéculas
em alguns indivíduos.
Nos grupos O (Figura 21c) e S foi observada bastante
similaridade com o grupo Cf, com trabéculas alinhadas e orientadas no
sentido borda a borda no terço superficial do defeito e com o canal
medular liberado. Estes grupos apresentavam osso com mais celularidade
que o grupo Cf e de característica mais trabecular.
109
FIGURA 21 – Aspecto do reparo ósseo aos 18 dias; Tricrômio de Masson. a)
grupo R, calo ósseo volumoso constituído por osso trabecular
(
♦) preenchendo área do defeito e canal medular, com
ausência de remodelação. Aumento original 25x (+zoom digital
1,5x); b) grupo Cf, calo ósseo mostrando extensa remodelação
(■) formando ponte óssea (
●) alinhada com a superfície do
defeito e manutenção de remanescentes ósseos (□) na área
do canal medular. Aumento original 25x (+zoom digital 1,5x);
c) grupo O, ponte óssea delgada (
●) na superfície do defeito e
canal medular liberado (■).Aumento original 25x (+zoom digital
2,2x).
110
111
5.3.5 Período de 24 dias
Foi observado que o grupo R ainda apresentava
trabéculas ocupando cerca de 2/3 da área A (Figura 22a), mas com sua
organização e orientação superficial mostrando aspecto semelhante a
osso cortical. A presença das estruturas enoveladas (Figura 22c)
diminuiu, o osso tinha aspecto mais maduro, com pouca celularidade e
permanência de áreas com osso mais jovem.
Os grupos Cf, O e S apresentaram ponte óssea ora
formando lâmina cortical contínua (Figura 22d), ora mostrando perda de
continuidade (Figura 22h), ligando as bordas do defeito sem, entretanto,
apresentar união com o osso cortical velho (Figura 22e). Essa ponte era
formada por osso maduro (Figuras 22f e 22i) e com pouca celularidade de
espessura variável, mas bastante delgada, não atingindo e espessura do
osso cortical da borda do defeito.
112
FIGURA 22 – Aspecto do reparo ósseo aos 24 dias. a, b, c: grupo R; d, e, f:
grupo Cf; g, h, i: grupo O; Tricrômio de Masson. a) calo
volumoso de osso trabecular preenchendo área do defeito e
grande parte do canal medular. Aumento original 25x; b)
trabéculas com contorno (▲) e celularidade irregulares.
Aumento original 200x; c) trabéculas de textura irregular
mostrando fendas (◄) e enovelados (
●). Aumento original
200x; d) calo bastante remodelado com formação de ponte
delgada (■) de osso lamelar na superfície do defeito. Aumento
original 25x; e) ausência de união da ponte óssea com o osso
cortical (▼). Aumento original 100x; f) osso de aspecto
lamelar. Aumento original 200x; g) calo bastante remodelado
com formação de ponte óssea delgada (■) na superfície do
defeito. Aumento original 25x; h) lâmina óssea bastante
delgada e com áreas de descontinuidade (▼). Aumento
original 100x; i) osso predominantemente trabecular, com
bastante celularidade e com áreas de descontinuidade (▼).
Aumento original 200x.
113
114
6 DISCUSSÃO
Com o objetivo de comparar o efeito de dois
medicamentos na reparação óssea em animais com alterações
metabólicas que interferem na formação e remodelação óssea, um
medicamento alopático, o risedronato e outro homeopático, a Calcarea
fluorica 6CH, foi realizado este estudo experimental em ratas
ovariectomizadas.
Os ratos são os animais usados com mais freqüência
como modelo experimental de osteoporose (JEE
44
, 1995; SZEJNFELD
102
,
2000; NAMKUNG-MATTHAI et al.
69
, 2001; TURNER
108
, 2001; TURNER et
al.
109
, 2001; EGGERMANN et al.
30
, 2005). São também amplamente
utilizados em experimentos sobre doenças ósseas e testes
farmacológicos. A perda óssea induzida pela ovariectomia em ratas tem
muitas características similares à perda óssea pós-menopausa em
humanos, entre elas, algumas de importância para este estudo como:
aumento na taxa de remodelação óssea com a taxa de reabsorção
excedendo a taxa de formação óssea, uma fase inicial de perda óssea
rápida seguida de uma fase muito mais lenta e resposta terapêutica óssea
similar com o uso de bifosfonatos entre outros medicamentos (KALU
46
,
1991).
Ratos fêmeas são usados mais freqüentemente que os
machos (FUKUDA & IIDA
32
, 2004), pois 80% dos casos de osteoporose
ocorrem em mulheres após a menopausa.
Modelos animais com roedores são freqüentemente
utilizados para examinar a reparação de fraturas femorais, tibiofibulares
ou fibulares (WALSH et al.
116
, 1997), e essas pesquisas são de grande
115
importância, pois a taxa de mortalidade, a morbidade e os custos
representam grandes prejuízos trazidos pela osteoporose e suas fraturas.
Estudos histológicos de reparação óssea (WALSH et
al.
116
, 1997; NAMKUNG-MATTHAI et al.
69
, 2001; EGGERMANN et al.
30
,
2005) verificaram que a osteoporose muda o curso da reparação óssea
causando um atraso na formação do calo ósseo e na diferenciação de
células ósseas que participam do processo, apresentando persistência de
tecido fibroso imaturo em animais OVX em períodos de reparação nos
quais animais sham já apresentam formação óssea.
No presente estudo também foram observadas diferenças
na velocidade de diferenciação celular dentro do defeito, havendo no
grupo O permanência de coágulo e, posteriormente, de tecido de
granulação por mais tempo que no grupo S, que apresentou uma
formação mais precoce de tecido medular intertrabecular. Essas
diferenças só foram observadas nos períodos de três e seis dias. Nos
períodos posteriores houve tendência à aproximação da aparência
morfológica e celular entre os grupos O e S.
Também a média das porcentagens de quantidade de
osso formado foi menor no grupo O (33,88%) quando comparado ao
grupo S (41,17%), com diferença estatisticamente significante,
concordando com os estudos de Amadei
3
(2004), Silveira
95
(2004) e
Eggermann et al.
30
(2005) que relataram formação de calo ósseo menor
nos animais ovariectomizados.
Esta evidência física de reparação óssea alterada na
osteoporose tem grande importância na avaliação de tratamentos para
osteoporose e seus potenciais efeitos na reparação de fraturas ou
defeitos ósseos.
Segundo Stepan et al.
98
(2003) a histomorfometria óssea
é o método de escolha para o estudo das conseqüências do uso de
medicamentos com distintos mecanismos de ação tecidual, o que é o
caso deste estudo, que usa um medicamento alopático e um
116
homeopático. Optou-se aqui pela quantificação da porcentagem de área
preenchida por osso em relação à área total disponível no defeito criado e
canal medular, técnica que expressa a quantidade real de osso formado,
mediante a ação dos diferentes medicamentos, nos cortes analisados e
não a expressão de somente uma área selecionada no defeito ou de uma
projeção da quantidade de osso formado através da contagem de pontos
de intersecção de um retículo graduado sobreposto ao tecido ósseo.
Também a segunda análise histomorfométrica de porcentagem de área
de osso trabecular dentro da área preenchida por osso, excluindo a
participação de tecido mole intertrabecular, forneceu subsídios para
verificar se os tratamentos interferiam na disposição das trabéculas
ósseas e se havia espaçamento intertrabecular maior nos animais
tratados com um medicamento ou outro.
Neste estudo optou-se pela realização da ovariectomia
em ratas jovens (três meses de idade) e aguardou-se 35 dias para que os
seus efeitos na perda óssea fossem estabelecidos antes da realização
dos defeitos. Esta escolha foi suportada por informações obtidas na
literatura. Diversos estudos histomorfométricos, sobre reparação e
qualidade ósseas, têm utilizado ratas ovariectomizadas aos três meses de
idade (PENG et al.
79
, 1997; WALSH et al.
116
,
1997, CAO et al.
17
, 2002;
AMADEI
3
, 2004; SILVEIRA
95
, 2004; TIVESTEN et al.
106
, 2004). Kalu
46
(1991) enfatiza que ratos jovens, com aproximadamente três meses de
idade são facilmente disponíveis e baratos e, principalmente, manifestam
os efeitos da ovariectomia em um mês ou menos, com perda óssea com
características próximas da encontrada no rato senil.
Wronski et al.
119
(1989) relataram que em ratas
ovariectomizadas aos três meses foi observada dramática perda óssea
trabecular na região proximal da tíbia, que foi progressiva e evidente após
duas semanas, mas inequívoca após um mês. Resultado similar foi
encontrado por Thompson et al.
105
(1995) com aumento da remodelação
óssea, estreitamento e perda de elementos trabeculares no 14
o
dia após a
117
OVX. Esses autores indicam que ratos em crescimento respondem com
uma perda óssea mais rápida e em maior magnitude que ratos adultos
após OVX e recomendam que a OVX para indução de osteoporose seja
realizada em animais de três meses de idade e ainda sugerem que,
provavelmente, estudos de agentes com potencial terapêutico sejam
feitos com não mais que seis meses de duração após a OVX.
Os 35 dias utilizados neste estudo foram suficientes para
gerar diferenças na reparação ocorrida nos animais OVX quando
comparados aos animais sham, principalmente nos períodos de
observação de três e seis dias, mas não impediu a formação do calo
ósseo bastante volumoso aos 12 dias. Esses dados indicam que após 35
dias de ovariectomia podemos observar atraso na diferenciação celular
nas fases iniciais de reparação, mas sem haver muita interferência na
formação óssea posterior.
A metáfise da tíbia proximal mostra considerável perda
óssea após ovariectomia (SIMS et al.
97
, 1996). Namkung-Matthai et al.
69
(2001) mostraram secções de tíbia com evidência de elevada
remodelação óssea, demonstrada pela incorporação aumentada de
tetraciclina.
O conhecimento de que a tíbia é um osso bastante
envolvido na osteoporose associado à presença de poucos planos
teciduais sobrepostos que conferem facilidade de acesso cirúrgico levou à
escolha da tíbia para a realização dos defeitos ósseos desse estudo. Os
defeitos ósseos foram preferidos à realização de fraturas completas por
estarem menos sujeitos a fatores mecânicos e obstruções de suprimento
sangüíneo, conforme explicitado por Schenk
90
(1994), além de permitirem
uma padronização do tamanho da lesão óssea e controle da quantidade
de necrose no local, tanto de tecido ósseo como de tecido mole
adjacente. Além disso, defeitos monocorticais evitam o atraso da
reparação que ocorre quando há invasão de tecidos conjuntivo e
muscular adjacentes para o local do defeito (ALKAN et al.
1
, 2002)
118
eliminando a necessidade de uso de barreiras e tornando o procedimento
cirúrgico simplificado.
Neste trabalho, todos os animais tiveram os defeitos
criados fechados linearmente durante o período de observação indicando
que o tamanho de 2,5 mm de diâmetro utilizado não foi crítico. Para
Gosain et al.
35
(2000) que sugerem uma análise tridimensional do defeito
considerando o volume de osso formado ou, pelo menos uma análise
bidimensional da porcentagem de osso dentro da área do defeito, esse
defeito seria considerado de tamanho crítico, pois não houve, em três
grupos, após os 24 dias de observação, preenchimento completo da área
do defeito (Cf 23,41%; O 21,25% e S 29,29%), que deveria corresponder
a aproximadamente 30,21±5% da área total A. Os valores encontrados
demonstram que houve a formação de uma ponte de espessura bastante
menor que a espessura da cortical das margens do defeito, pois estes
valores se referem não só ao osso que formou a ponte óssea, mas
também às trabéculas remanescentes na área do canal medular. Sendo
ainda mais rigorosos no conceito de tamanho crítico, mesmo no grupo R o
tamanho poderia ser considerado crítico uma vez que mostrava a área do
defeito toda preenchida por osso aos 24 dias, mas esse osso era
trabecular, não ocupando 100% do espaço do defeito por causa da
presença dos espaços intertrabeculares.
Durante a reparação óssea, o calo é remodelado, sendo
continuamente reabsorvido e formado até a obtenção da arquitetura e da
integridade mecânica normais no osso restaurado (LI et al.
59
, 2001).
Neste estudo a remodelação não chegou ao seu final em todos os grupos
experimentais, no entanto, foi notado que os grupos Cf, O e S
remodelaram seu calos, mas formaram uma ponte delgada de osso
cortical de espessura bem menor que a da cortical original. Já o grupo R
mostrou atraso na remodelação óssea com permanência de calo
volumoso composto por osso trabecular aos 24 dias.
A reparação óssea depende, no seu período mais longo e
119
final, da taxa de remodelação óssea (LI et al.
59
, 2001). O atraso da
remodelação e da maturação óssea levando a formação de osso lamelar
no grupo R está em concordância com vários estudos que analisaram o
uso de bifosfonatos na reparação óssea em ratos (LI et al.
60
, 1999; LI et
al.
59
, 2001; CAO et al.
17
, 2002; NAGASHIMA et al.
68
, 2005) e também
observaram atraso na substituição do osso primário por osso lamelar com
o uso de diferentes bifosfonatos, inclusive do risedronato.
Li et al.
59
(2001) afirmaram que a reparação não é
completa enquanto não houver a união óssea nas bordas do defeito
radiograficamente, o que acontece antes da união histológica. Esse
atraso de união é clinicamente problemático, podendo trazer risco de
novas fraturas (AMANAT et al.
4
, 2005).
Neste estudo apresentado foi constatada uma falha, pois
não foi observada a união histológica do osso neoformado com as
margens corticais do defeito ósseo em nenhum dos grupos e tratamentos.
De fato, não se pode prever então quando haverá a regeneração óssea
completa desses defeitos em cada tratamento proposto, não sendo
possível responder ao questionamento de qual medicamento, risedronato
ou Calcarea fluorica, ou até mesmo, o placebo, irá promover essa
regeneração em menor tempo.
O atraso na reparação ou uma não união óssea pode ser
uma devastadora complicação de uma fratura mesmo após uma longa
recuperação (AMANAT et al.
4
, 2005). Assim, alguns autores chegaram a
sugerir (LI et al.
60
, 1999; CAO et al.
17
, 2002) que se deveria interromper o
uso de medicamentos para osteoporose em casos de fraturas não
vertebrais por conta do atraso da remodelação do calo, já que o objetivo é
a regeneração óssea, com formação de osso de estrutura histológica e
propriedades biomecânicas iguais às originais (Li et al.
60
, 1999). No
entanto, esses mesmos autores acabaram por concluir que os
bifosfonatos atrasam a remodelação do calo, mas não prejudicam a
recuperação da integridade biomecânica da fratura, pois levam à
120
formação de um calo maior que reflete uma adaptação segura da fratura
para a presença de osso de qualidade estrutural e mecânica inferior ao
lamelar. Amanat et al.
4
(2005) complementam que o atraso na
remodelação do calo primário na presença do medicamento pode ser
benéfico por favorecer o aumento do tamanho deste calo aumentando a
resistência do reparo inicial principalmente na presença de implantes
intra-ósseos.
De qualquer modo, como foi demonstrado por Nancollas
et al.
70
(2006), o risedronato tem menor afinidade pelo osso que o
alendronato, bifosfonato utilizado no estudo de Cao et al.
17
(2002).
Portanto, os efeitos de atraso na remodelação do calo podem acontecer
por um período de tempo menor que o promovido pelo alendronato não
sendo necessária a interrupção da administração desse medicamento em
pacientes com ocorrência de fraturas.
Assim, parece ser uma característica de todas as classes
de bifosfonatos a formação de calo ósseo maior, com forte inibição da
remodelação e maturação (CAO et al.
17
, 2002), em conseqüência da
inibição dos osteoclastos promovida por estes medicamentos, havendo
somente uma variação do período de inibição promovida pelos diferentes
bifosfonatos como demonstram os estudos de Li et al.
59
(2001) e Cao et
al.
17
(2002) onde não houve remodelação do calo após 49 semanas sob
tratamento com o incadronato e de 16 semanas sob tratamento com
alendronato, respectivamente.
Nesse estudo, o grupo O, aos 24 dias mostrava ponte
óssea delgada e remodelada de osso cortical, mesmo que com
descontinuidade em alguns pontos, o que deve ser uma conseqüência da
maior taxa de remodelação óssea promovida pela ovariectomia, através
da deficiência dos hormônios ovarianos.
Também no presente estudo, o tamanho do calo formado
nos animais tratados com risedronato foi maior que nos grupos que
receberam placebo e Calcarea fluorica. Atualmente vem sendo sugerido
121
nas publicações que os bifosfonatos têm efeitos anabólicos na massa
óssea (COMPSTON
19
, 1994) e acabam por promover aumento do
tamanho do calo ósseo (LI et al.
60
, 1999; LI et al.
59
, 2001; CAO et al.
17
,
2002; KOIVUKANGAS et al.
50
, 2003).
No estudo de D’Aoust et al.
25
(2000) comprovou-se efeito
do etidronato aumentando a marcação imunoistoquímica de osteopontina
e de sialoproteína óssea e aumentando a formação de tecido
osteóide/mineralizado em defeitos ósseos, mas não houve comprovação
de aumento da proliferação de células precursoras de osteoblastos.
Concluíram então, que o etidronato promove diferenciação de
osteoblastos.
Estudos mais recentes (IM et al.
42
, 2004; VON KNOCH et
al.
114
, 2005) parecem comprovar o efeito dos bifosfonatos alendronato e
risedronato na proliferação e diferenciação de células de culturas de
osteoblastos através da promoção do aumento do número de células em
relação aos controles e aumento da expressão de fosfatase alcalina,
BMP-2, colágeno tipo I, osteocalcina e sialoproteína II.
Através do presente estudo não se pode confirmar estes
dados, mas a observação histológica nos diferentes tempos de reparação
analisados permite que se afirme que o risedronato apresentou efeito
estimulatório da formação óssea, uma vez que, aos três dias havia início
de formação de trabéculas ósseas na área do defeito dos animais do
grupo R, sendo que tal fato não ocorreu nos grupo O e nem sequer nos
indivíduos normais do grupo S. Esse estímulo gerou os resultados
encontrados que foram formação mais precoce de osso nos grupo R e
formação de maior quantidade de osso primário nesse grupo, que se
manteve superior aos seis (80,86%) e 12 dias (98,21%). A formação de
osso secundário ou lamelar parece ter sido inibida numa fase
subseqüente da reparação, aos 18 e 24 dias, através da inibição da
reabsorção osteoclástica que antecede esta fase.
Mesmo com essa evidente ação do risedronato na
122
formação óssea e, portanto, nos osteoblastos, poder-se-ia afirmar que os
osteoclastos são células mais sensíveis ao tratamento com esse
medicamento que os osteoblastos, havendo maior interferência na
reabsorção do que na formação óssea.
O mesmo não pode ser dito sobre o medicamento
homeopático utilizado, a Calcarea fluorica. Assim como o grupo R, o
grupo Cf também mostrou evidências de estimulação da formação óssea
aos três dias, com aumento rápido da massa óssea até os seis dias
(60,87%), ultrapassando os valores do grupo O (24,56%) e S (33,86%) e
crescente até os 12 dias (65,38%), mas este medicamento parece não
interferir na remodelação óssea, uma vez que se observou depois uma
extensa remodelação e substituição do osso primário por lamelar, se
comportando esse grupo, a partir dos 12 dias, de forma semelhante ao
grupo O.
Experimentos em homeopatia veterinária mostram
resultados bastante promissores em ensaios controlados em animais,
onde o efeito placebo é menos provável (BOYD
14
, 2003).
O cálcio e o flúor têm várias ações sobre os tecidos
ósseos. A combinação química de cálcio e ácido fluorídrico gera a
Calcarea fluorica, um medicamento duplo com natureza e propriedades
novas. Esse medicamento pode manter algumas ações da cal e do ácido
fluorídrico, mas talvez apresente propriedades diferentes das observadas
nas duas substâncias isoladamente (NOÇÕES
75
, 1980).
Segundo a teoria de Schuessler um método bioquímico
substitui os esforços curativos da natureza pelas substâncias minerais
que fazem falta nas partes afetadas dos tecidos. Esses medicamentos
bioquímicos são representados por sais minerais que podem ser repostos
no organismo através de medicamento homeopáticos formulados em
baixa potência (6CH) ou em trituração e apresentam patogenesia sob o
ponto de vista homeopático, com ação descrita nas matérias médicas.
Alguns medicamentos homeopáticos constitucionais são indicados para
123
tratamento de osteoporose. A Calcarea fluorica é um deles e mostra
afinidade óssea (NOÇÕES
75
, 1980; KOSSAK-ROMANACH
52
, 1984).
O complexo FMS Calciumfluor foi usado no estudo de
Palermo et al.
76
(1999), que mostrou promover osteogênese in vitro, mas
não analisou seus efeitos in vivo. No estudo de Palermo et al.
76
(1999), foi
usada homeopatia complexa de ressonância, isto é com o uso de três
medicamentos preparados simultaneamente, Calcarea fluorica, Silicea e
Magnesia phosphorica, e foi observado um efeito dose dependente do
complexo CalciumFluor. Isso sugere que este medicamento não agiu
como medicamento homeopático, que teria a potência aumentada com o
maior número de diluições. Outro fato curioso é a realização do estudo in
vitro contrariando os preceitos da terapia homeopática que explica a
resposta ao medicamento como uma resposta do organismo como um
todo, não podendo assim ter seus resultados extrapolados para uma
condição in vivo (BOYD
8
, 1993; KOSSAK-ROMANACH
52
, 1984). A
atividade do medicamento homeopátido é proporcional à sua
homeopaticidade (ou semelhança com os sintomas do doente) e ao seu
grau de dinamização ou potencialização que, quanto maior, maior é a
atividade medicamentosa. Portanto, a atividade do medicamento é
proporcional a estas duas observações e não à sua quantidade
(NASSIF
71
, 1995).
No presente estudo, a Calcarea fluorica foi escolhida a
fim de verificar sua atuação na forma homeopática tradicional: in vivo e
como medicamento único, mesmo sem a possibilidade de individualização
do tratamento.
Assim, foi possível comprovar, in vivo que a Calcarea
fluorica agiu positivamente na formação óssea, mas por um período de
tempo muito curto e sem interferência na remodelação óssea e na
melhora da condição clínica do indivíduo. O medicamento não se mostrou
totalmente eficiente e vantajoso talvez porque não tenha sido feita a
individualização do tratamento. Achar o medicamento certo para um dado
124
indivíduo e situação é a chave do funcionamento da homeopatia
(KOSSAK-ROMANACH
52
, 1984). Isso é obtido pela individualização do
tratamento. Trabalhando com ratos não foi possível verificar essa variável.
No entanto, são usados tratamentos homeopáticos na veterinária com
vários relatos de sucesso, baseados na escolha dos medicamentos não
apenas pela individualização do caso, mas também pela possibilidade de
ação tecidual dos medicamentos, como é o caso dos medicamentos
constitucionais (NOÇÕES
75
, 1980; SCHOEN & WYNN
91
, 1998).
A análise da porcentagem de área trabecular dentro do
osso neoformado no calo nos permitiu concluir que, nas diferentes
condições experimentais, os tratamentos e a presença ou ausência de
ovariectomia não interferiram no tipo de osso formado no reparo, dada a
ausência de significância entre as condições experimentais. Assim,
animais ovariectomizados ou sham mostraram quantidade de osso
trabecular semelhante dentro da área de preenchimento. O tempo de
reparação por sua vez interferiu nesses resultados, mostrando valores
decrescentes até os 12 dias, e crescentes aos 18 (57,29%) e 24 dias
(73,74%), indicando a ocorrência de remodelação óssea e uma tendência
à substituição do osso trabecular por osso cortical na área do defeito.
Na análise que considerou os animais ovariectomizados
nas diferentes condições relativas aos diferentes medicamentos,
homeopático, alopático e placebo, a interação entre os fatores tempo e
tratamento nos leva a considerar os tratamentos dentro de cada dia de
reparação. Assim, aos seis, 12 e 18 dias, observa-se que não houve
diferenças entre os tratamentos no que diz respeito à porcentagem do
osso dentro da área de preenchimento e aos 24 dias vê-se diferenças
estatisticamente significantes somente entre o grupo R (48,87%) e O
(75,22%), o que se explica pela grande deficiência de remodelação do
osso primário e de formação de ponte de osso cortical no grupo R,
comportamento extremamente diferente do ocorrido no grupo O que,
como já explicado, sofreu intensa remodelação do osso neoformado, que
125
foi substituído por osso lamelar formando uma ponte cortical.
Enfim, essa semelhança dos valores da porcentagem de
osso trabecular observado nos diferentes tratamentos vem valorizar os
dados obtidos através da área de preenchimento (volume do calo),
reforçando que esses valores e suas diferenças entre os grupos
expressam diferenças reais de quantidade de osso, já que o osso
neoformado apresenta semelhanças de área trabecular dentro dos
períodos de observação para os diferentes tratamentos.
Dessa forma, a análise histomorfométrica realizada pela
associação dessas duas medidas de formação óssea se mostrou um
método bastante fiel de quantificação de formação óssea dentro de um
defeito cortical criado cirurgicamente.
É importante salientar que a análise histomorfométrica
realizada compreende uma região representada por quatro cortes da área
central do defeito. Na evolução do reparo esta é a última área a ter
formação de osso, a qual ocorre a partir das bordas do defeito e da
membrana endosteal, e é também a última área a sofrer remodelação,
representando assim a região em que o processo de reparação se
encontra mais atrasado em relação às demais áreas do defeito.
Para a realização da análise da densidade óptica foi
usada a radiografia digital direta pela técnica do paralelismo com distância
focal de 40 cm e colocando a face na qual se encontrava a lesão óssea
voltada para o sensor, diminuindo o espaço entre objeto e sensor, e
centralizada na área ativa do mesmo. Este posicionamento satisfaz as
condições de Schulze & D’Hoedt
92
(2002) para obtenção de imagem com
a melhor projeção no filme ou sensor, que são raios X paralelos devido à
distância fonte/objeto e incidindo perpendicularmente ao filme ou sensor e
ao objeto. O objetivo foi obter aumentada acurácia da radiografia e,
conseqüentemente, menor distorção da imagem.
O uso de radiografias digitais diretas possibilita a
realização de radiografias com obtenção de imagens imediatas,
126
rapidamente transferidas e arquivadas para um computador que podem
ser analisadas por programas de fácil acesso e de domínio público, como
é o caso do Image Tool. A análise das radiografias por computador pode
ser útil, uma vez que o diagnóstico do radiologista é baseado em
avaliação subjetiva, estando sujeito a variações intra e interpessoais, bem
como perda de informação devido à natureza sutil do achado radiológico,
fadiga visual ou distração (AZEVEDO-MARQUES
6
, 2001). A imagem
digital formada fornece uma informação de 256 níveis de cinza, porém o
olho humano reconhece aproximadamente 32 tons de cinza. Assim, o
programa Image Tool auxiliou na quantificação de características da
imagem que expressavam a densidade do tecido neoformado no defeito
criado cirurgicamente, a densidade óptica (DO) do defeito que,
dependendo do grau de contraste da imagem pode não ser compatível de
ser analisado pela visão humana.
Apesar das qualidades e vantagens da radiografia digital,
a análise radiográfica falhou em demonstrar a quantidade de tecido ósseo
neoformado na região do defeito. Quando comparados os grupos O e S, a
avaliação da densidade óptica não demonstrou diferença entre esses
grupos em nenhum período de observação que não fosse os três dias de
reparo, justamente o período em que se verificou, posteriormente, pela
análise histológica, não haver formação óssea nesses grupos. As
diferenças encontradas na DO desses dois grupos aos três dias deve ter
sido encontrada por diferenças na leitura radiográfica da cortical óssea
sobreposta ao defeito monocortical e de tecidos moles.
O grupo S mostrou valores de DO crescentes até o 12
o
dia, com manutenção dos valores alcançados até o 24
o
dia, mesmo tendo
sido verificado através da histomorfometria uma redução da área
preenchida por osso a partir do 12
o
dia. As alterações morfológicas que
ocorreram no osso durante o experimento foram bastante significativas
para não promoverem alterações na DO significativas e detectáveis. O
grupo O manteve valores de DO sem diferenças significantes durante
127
todos os períodos de observação, também não fazendo um paralelo com
o observado na análise histomorfométrica.
Nos grupos ovariectomizados e tratados, os grupos R e Cf
mostraram valores de DO sem diferenças estatisticamente significantes
nos tempos de reparo de três, seis e 12 dias. Aos 18 e 24 dias o grupo R
mostrou os valores mais altos, com diferença estatisticamente significante
dos outros grupos, demonstrando presença de maior massa óssea, o que
ocorreu devido à inibição de remodelação proporcionada pelo risedronato.
Outro estudo radiográfico da densidade óssea usando
radiografias digitais em lesões em tíbia de ratos SHR usando risedronato,
Calcarea fluorica e Calcarea phosphorica por sete e 21 dias mostrou
valores de DO sempre maiores para o risedronato, seguido da Calcarea
phosphorica, mas sem diferenças significativas deste último para a
Calcarea fluorica (SENRA et al.
93
, 2004).
Pode-se sugerir também que os valores mais altos de DO
no grupo tratado com risedronato se deva, em parte, a uma maior
mineralização do calo ósseo, como acontece com outro aminobifosfonato,
o alendronato (CAO et al.
17
, 2002).
Possivelmente, vários fatores influenciam a densidade do
tecido ósseo e do tecido neoformado no defeito, além da quantidade de
osso neofomado, como o grau de mineralização do tecido, a maturação
óssea, a transformação do osso trabecular em lamelar compacto e a
remodelação.
Segundo Werkman
117
(2005), os tratamentos estão
relacionados com diferentes alterações morfológicas como variação na
quantidade, espessura e qualidade das trabéculas, na celularidade
apresentada nos tecidos do calo ósseo e no grau de mineralização. A alta
variabilidade dos fatores observados, quando em conjunto, podem
possivelmente interferir de maneira direta na variação da densidade
óptica.
Associado a isso há também as deficiências no método
128
de avaliação radiográfico. Alguns autores afirmaram que o exame
radiográfico apresenta pouca sensibilidade, revelando alterações na
massa óssea quando esta já é maior do que 30-50% (RADOMINSKI et
al.
81
, 2002; GUEDES JÚNIOR et al.
36
, 2003; LANGER
56
, 2004; BRANDÃO
& HAUACHE
16
, 2005).
Outro fator que possivelmente interfere em análises de
estruturas tão pequenas é o processamento das informações
radiográficas. O processamento da imagem pelo computador é baseado
em estatísticas locais (média e desvio-padrão) dos valores de cinza dos
pixels contidos em uma região com a finalidade de realizar a binarização
da imagem, isto é, de transformá-la em uma imagem digital (AZEVEDO-
MARQUES
6
, 2001). Para Wagner et al.
115
(2005) este processamento da
imagem pode manipular o aspecto visual da densidade óptica levando a
uma representação irreal da densidade do objeto, diferentemente da
radiografia convencional, que têm contrastes mais definidos que a
radiografia digital. Essa alteração da imagem digital poderia ser uma das
causas que levaram à perda de informação radiográfica do objeto e
interferiu na análise de imagens com diferenças sutis de densidade, como
é o caso das tíbias de ratos.
Alguns estudos da literatura (LI et al.
60
, 1999; LI et al.
59
,
2001; CAO et al.
17
, 2002) têm utilizado radiografias realizadas com soft X-
ray, que possui menor corrente e potência (kVp) para a análise
radiográfica da reparação de fêmures fraturados de ratos.
O risedronato, neste estudo, estimulou formação de
grande calo ósseo, com inibição de remodelação, mas o aspecto irregular
do osso neoformado, com bordas de trabéculas indefinidas, aspecto de
fibras desorganizadas formando estruturas enoveladas trazem
preocupações a respeito da qualidade do osso neoformado. Estudos de
histologia óssea realizados em mulheres com osteoporose tratadas com
risedronato, 5mg diários, sem fraturas, indicam que o osso formado
durante o tratamento é de qualidade normal (RISEDRONATE
85
, 2001).
129
Mas fica o questionamento de qual é a qualidade do osso formado em
defeitos ósseos e fraturas sob tratamento contínuo com risedronato, uma
vez que a qualidade óssea depende de vários fatores.
O osso primário deve ser um osso provisório, pois tem
disposição de fibras e mineralização irregulares, osteócitos grandes,
numerosos e distribuídos aleatoriamente. A composição mineral e
colágena e as características estruturais da matriz óssea também
interferem na resistência óssea e a organização lamelar fornece a maior
densidade de colágeno por volume de tecido, sendo estruturalmente
importante para o osso cumprir suas funções mecânicas. O importante
papel dos osteoclastos na regulação da formação óssea osteoblástica,
particularmente no desenvolvimento de matriz óssea lamelar descrito por
DAI et al.
26
(2004) poderia ser suprimido com o uso de medicamentos
inibitórios da ação osteoclástica.
Há necessidade de estudos mais prolongados usando o
risedronato para se verificar após quanto tempo haverá a regeneração
completa do osso da lesão com o restabelecimento das características
histológicas e mecânicas normais do osso cortical e se ela ocorrerá sob
tratamento contínuo ou em longo prazo com este medicamento.
Esse estudo conseguiu demonstrar que a Calcarea
fluorica teve ação tecidual uma vez que estimulou o reparo em sua fase
inicial, apesar da observação ter sido puramente descritiva. Assim, se
fazem necessárias mais pesquisas com medicamentos homeopáticos,
que sejam realizadas com maior rigor científico, abordando não só
aspectos clínicos, mas também aspectos bioquímicos, histológicos,
fisiológicos e de biologia molecular entre outros, buscando a
compreensão dos mecanismos de ação dos mesmos.
130
7 CONCLUSÃO
A análise dos resultados, sob as condições experimentais
utilizadas, possibilitou concluir que:
e) a ovariectomia prejudicou a reparação óssea na
ausência de tratamento específico;
f) o risedronato foi o que estimulou maior formação
óssea;
g) o risedronato inibiu a remodelação e maturação
ósseas;
h) a Calcarea fluorica 6CH estimulou formação óssea
nas fases iniciais da reparação;
i) a Calcarea fluorica 6CH não inibiu a remodelação e
maturação ósseas.
131
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ABSTRACT
The increase in life expectancy is associated with a higher incidence of degenerative
diseases such as osteopenia and osteoporosis, which elevate the occurrence of bone
fractures, and demand long treatment. The medication used to treat osteoporosis can
interfere with bone fractures repair. The aim of this work was evaluating the effects of
Risedronate (1,5mg/Kg/day) and of the homeopathic medicine Calcarea fluorica 6CH (3
drops/day) on bone repair in rats with induced osteopenia. For that, 105 rats were
ovariectomized and 35 were sham operated. After 35 days, 2,5 mm monocortical bone
lesions were drilled on all animals tibiae. Then, treatment began. The ovariectomized
animals were divided in three groups, one received Risedronate (R), the other Calcarea
fluorica (Cf), and the third one (O) as well as the Sham group (S) received distilled water
as a placebo. The animals were sacrificed at three, six, 12, 18 and 24 days after the
beginning of treatment. Their tibiae were removed, radiographed, decalcified and
processed for morphological analysis. Data were submitted to ANOVA and Tukey (5%)
tests. According to optical density analysis, there were no differences between treatments
at three, six and 12 days, but at 18 and 24 days, group R showed the highest values
(p<0,05). Histomorphometric analysis evaluated the filling percentage by newly formed
bone within the total area available in the defect and medullar cavity together; and also
the percentage of trabecular bone within the callus. According to the first measure, the
group R showed the highest values in all periods, surpassing all the groups (p<0,05)
while the groups Cf and O showed similar results in all periods, except on day 6, when
group Cf was higher. The measure of the trabecular area in the callus showed no
difference between the groups R, Cf and O on the 6th, 12th and 18th days. On the 24th
day, group O showed the higher trabecular value and group R showed the lower value. It
was possible to conclude that ovariectomy has interfered negatively on the bone repair
process and that Risedronate stimulated a great amount of bone formation with low bone
turn over. Calcarea fluorica 6CH stimulated high bone formation at the initial stages of
bone repair when compared to the control group but didn’t inhibit bone remodelation.
KEYWORDS: Allopathy; homeopathy; Calcarea fluorica 6CH;
diphosphonates; bone regeneration; osteoporosis; rats; radiography,
dental, digital; histomorphometry.
150
Autorizo a reprodução xerográfica deste trabalho.
São José dos Campos, 17 de julho de 2006.
CD GISELLE SEGNINI SENRA
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