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ELISABETE FANTUZZI
AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DO EXTRATO AQUOSO
DE Agaricus blazei E SUA RELAÇÃO COM A TRANSLOCAÇÃO
BACTERIANA EM MODELO ANIMAL
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia Agrícola,
para obtenção do título de Doctor
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
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ELISABETE FANTUZZI
AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DO EXTRATO AQUOSO
DE Agaricus blazei E SUA RELAÇÃO COM A TRANSLOCAÇÃO
BACTERIANA EM MODELO ANIMAL
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia Agrícola,
para obtenção do título de Doctor
Scientiae.
APROVADA: 27 de abril de 2007.
Prof. Jacques Robert Nicoli Prof. José Mário da Silveira Mezencio
(Co-orientador)
(Co-orientador)
Prof. Sérgio Luis Pinto da Matta Prof. Sérgio Oliveira de Paula
Profª. Maria Cristina Dantas Vanetti
(Orientadora)
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"Se as coisas são inatingíveis... ora!
Não é motivo para não querê-las...
Que tristes os caminhos se não fora
A mágica presença das estrelas."
(Das Utopias - Mário Quintana)
A Deus.
Ao meu pai.
À minha mãe.
Aos meus irmãos e sobrinhos,
Com amor, dedico.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de
Microbiologia.
Ao CNPq, pelo financiamento do projeto.
A Capes e à Fapemig, pela concessão das bolsas de estudos que
permitiram a realização deste trabalho.
À Profa. Maria Cristina Dantas Vanetti, pela orientação acadêmica
durante toda a minha trajetória pela UFV - aperfeiçoamento, mestrado e
doutorado, que juntos somam quase 10 anos de convivência e constante
aprendizado. Muito obrigada, em especial, pela paciência e compreensão
nos momentos em que mais necessitei.
Ao Prof. Jacques Robert Nicoli (ICB/UFMG), pela co-orientação, pelas
sugestões imprescindíveis durante todo o período experimental, pela valiosa
oportunidade de treinamento e troca de experiências com seus estudantes e,
em especial, pela receptividade, paciência e boa vontade com as quais
sempre me recebeu em seu laboratório.
Ao Prof. José Mário da Silveira Mezêncio (DBG/UFV), pelo
aconselhamento, pelos conhecimentos transmitidos e por ter despertado em
mim, já durante a graduação, o gosto pela disciplina Imunologia.
Ao Prof. Paulo Roberto Cecon (DPI/UFV), por participar ativamente na
montagem de todo o delineamento experimental utilizado.
iii
Ao Prof. Sérgio Luis Pinto da Matta (DBG/UFV), por compor a banca
de defesa, por ter aberto as portas de seu laboratório para mim, desde o
início das atividades, incluindo o treinamento inicial na vivessecação de
animais; pela ajuda e pelas sugestões durante todo o período do curso.
Ao Prof. Sérgio Oliveira de Paula (DBG), por compor a banca de
defesa, pelas sugestões no trabalho, pela ajuda imprescindível durante os
ensaios imunoenzimáticos e por ser um amigo sempre disposto a ajudar.
À Profa. Rosa Arantes (ICB/UFMG), por tão gentilmente ter realizado
as análises histopatológicas de que necessitávamos, para finalizar este
trabalho.
A minha mãe, pela paciência, por aceitar minhas eternas idas e
vindas da sua casa, por compreender meu mau-humor constante durante os
piores momentos dessa trajetória, por ouvir calada todas as minhas
reclamações e, mesmo assim, continuar me amando.
Ao meu saudoso pai, sempre presente em minha vida, por meio de
meus pensamentos.
Aos meus irmãos, por comemorarem comigo cada pequeno acerto,
por agüentarem minha falta de paciência quando tudo dava errado, por
tentarem entender todos os obstáculos que eu tentava transpor durante os
experimentos e por terem ouvido por mais de quatro e “intermináveis longos”
anos a palavra “tese” repetida exaustivamente em nossas conversas.
Aos meus sobrinhos queridos, Larissa, Melissa, Giovanni, Vitória e
Vinícius. Aos pequeninos, pela graça característica da infância, aos
grandinhos pela paciência comigo e por torcerem para eu “terminar logo de
uma vez este doutorado”.
Ao Dr. Expedito Leão, por ter aceitado ser meu “avô” querido e por ter
sempre palavras de incentivo e encorajamento para me dizer.
Aos queridos e sempre presentes colegas, ex-colegas e eternos
amigos do laboratório de Microbiologia de Alimentos, Patógenos Alimentares
e Microbiologia de Anaeróbios - todos, sem exceção, foram especiais e
importantes à sua maneira: Adriana Ponce, Adriana Santos, Aline, Ana
Andréa, Ana Diolina, André, Andréa, Carol Rezende, Cláudia Lúcia, Eliane,
Eliseth, Emilene, Esther, Fernanda, Janaína, Maurílio, Marcelão, Marcelim,
iv
Marília, Rafael, Renata, Rodrigo, Simone Paes, Simone Quintão, Tássia e
Uelinton.
A todos os vários amigos dos demais laboratórios do DMB que tive a
felicidade de conquistar nesse período.
Aos amigos Lucilene Rezende (estagiária), Rosinéia de Paula, Flávia
Floresta, Vinícius Albano, Inês Helena, Leonardo Bhering, Marcos de Lucca,
Renato Moreira Nunes e Thiago Santos.
Aos colegas dos laboratórios de Biologia Estrutural do DBG da UFV e
de Fisiologia e Ecologia Microbiana do ICB da UFMG.
A todos os queridos funcionários do DMB, pela disposição em ajudar
e, especialmente, pelos bate-papos agradáveis, pela amizade e pelo carinho
que sempre me dispensaram.
Aos funcionários Pedro (Oficina de Hialotecnia), Pardal (Oficina de
Eletrônica) e Marcinho (Laboratório de Biologia e Controle de Protozoários e
Vetores/BIOAGRO).
À Profa. Carminha Pelúzio (DNS, UFV), pela amizade e por
disponibilizar o Biotério Central para a realização dos experimentos.
Aos funcionários do Biotério Central, Adão e Juliano, pela solicitude e,
especialmente, por me tratarem com carinho e respeito.
A todos os professores do sistema público de ensino que participaram
da minha formação, em especial, aos meus queridos e eternos mestres,
Prof. Gilberto Paixão Rosado (DNS, UFV) e Prof. Jorge Luis Cavalcante
Coelho.
A todos os professores do DMB e, em especial, à Profa. Célia Alencar
de Moraes, por todos os conhecimentos transmitidos e por acreditar em mim
quando nem eu mesma o fazia.
A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, comigo durante
esta etapa de minha vida.
v
BIOGRAFIA
Elisabete Fantuzzi, filha de Alzira Lima Ramos Fantuzzi e Dante
Fantuzzi, nasceu em Viçosa-MG.
Concluiu o segundo grau no Colégio Universitário (COLUNI), em
Viçosa-MG.
Em 1992, ingressou no Curso de Nutrição, pela Universidade Federal
de Viçosa. Durante parte da graduação, foi bolsista de iniciação científica, no
Departamento de Nutrição e Saúde (PIBIC-CNPq). Colou grau em setembro
de 1996.
Foi bolsista de aperfeiçoamento do CNPq, no Laboratório de
Microbiologia de Alimentos do Departamento de Microbiologia, no período de
agosto de 1996 a fevereiro de 1997.
Em março de 1997, ingressou no Mestrado em Microbiologia Agrícola,
na área de Microbiologia de Alimentos, defendendo tese a 7 de julho de
1999.
Foi coordenadora e professora do curso de Nutrição da Universidade
Católica Dom Bosco, em Campo Grande, MS, no período de julho de 2000 a
fevereiro de 2001.
Iniciou o Curso de Doutorado em Microbiologia Agrícola em setembro
de 2002, defendendo a tese em abril de 2007.
vi
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................... XI
ABSTRACT .................................................................................................... XIII
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................1
2 REVISÃO DE LITERATURA...........................................................................3
2.1 O sistema imunológico..............................................................................3
2.1.1 Resposta imune...................................................................................3
2.1.2 Tecido linfóide associado ao intestino (GALT) ....................................4
2.1.3 Citocinas..............................................................................................6
2.1.4 Imunoglobulina A secretora (IgAs).......................................................6
2.2 Cogumelos medicinais..............................................................................8
2.2.1 Agaricus blazei ....................................................................................8
2.2.2 Modificadores da resposta biológica (BRMs) ....................................10
2.3 Translocação bacteriana.........................................................................12
2.3.1 Fatores que induzem a translocação bacteriana ...............................15
2.3.2 Translocação de Salmonella .............................................................16
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................19
vii
CAPÍTULO 1
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DE Agaricus blazei EM
CAMUNDONGOS IMUNODEPRIMIDOS .........................................................29
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................29
2 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................32
2.1 Camundongos.........................................................................................32
2.2 Extrato do A. blazei.................................................................................33
2.3 Administração da ciclofosfamida.............................................................33
2.4 Determinação da dose imunodepressora de ciclofosfamida...................34
2.5 Grupos de estudo e tratamentos.............................................................34
2.6 Eutanásia................................................................................................35
2.7 Análise de translocação bacteriana ........................................................35
2.8 Índice esplênico ......................................................................................35
2.9 Determinação de IgA secretora (IgAs) no conteúdo do intestino
delgado ...................................................................................................35
2.10 Determinação de citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-10) no soro ..................36
2.11 Análises histopatológicas do intestino delgado, baço e fígado .............36
2.12 Análises estatísticas .............................................................................37
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................38
4 CONCLUSÕES..............................................................................................48
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................49
CAPÍTULO 2
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DE Agaricus blazei EM
CAMUNDONGOS DESAFIADOS COM Salmonella TYPHIMURIUM.............54
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................54
2 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................57
2.1 Camundongos.........................................................................................57
2.2 Extrato do Agaricus blazei ......................................................................58
2.3 Microrganismo ........................................................................................58
viii
2.4 Grupos de estudo e tratamentos.............................................................58
2.5 Eutanásia................................................................................................59
2.6 Análise de translocação bacteriana ........................................................59
2.7 Índice esplênico ......................................................................................60
2.8 Determinação de IgA secretora (IgAs) do conteúdo do intestino
delgado ...................................................................................................60
2.9 Determinação de citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-10) no soro ....................60
2.10 Análises histopatológicas do intestino delgado, baço e fígado .............60
2.11 Análises estatísticas .............................................................................60
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................61
3.1 Peso dos animais....................................................................................61
3.2 Índice esplênico ......................................................................................62
3.3 Secreção de IgAs no intestino delgado...................................................63
3.4 Secreção de citocinas séricas.................................................................64
3.5 Translocação de S. Typhimurium ...........................................................65
3.6 Alterações histopatológicas ....................................................................67
4. CONCLUSÕES.............................................................................................70
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................71
ix
LISTA DE ABREVIAÇÕES
APC – célula apresentadora de antígeno
BRM – modificador da resposta biológica
CP – placa das criptas (cryptopatches)
FAE – epitélio associado ao folículo
GALT – sistema linfóide associado ao intestino
GF – livre de germes (germ-free)
IEL – linfócitos intraepiteliais
IFN-γ – interferon gamma
IL-10 – interleucina 10
ILF – folículo linfóide isolado
MLN – linfonodo mesentérico
pIgR- receptor de imunoglobulina polimérica
PP – placa de Peyer
SPF – livres de patógenos específicos (specific-pathogen-free)
SPI-1 – ilha de patogenicidade 1
SPI-2 – ilha de patogenicidade 2
TNF-α – fator de necrose tumoral alpha
x
RESUMO
FANTUZZI, Elisabete D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, abril de 2007.
Avaliação do efeito imunomodulador do extrato aquoso de Agaricus
blazei e sua relação com a translocação bacteriana em modelo
animal. Orientadora: Maria Cristina Dantas Vanetti. Co-orientadores:
Jacques Robert Nicoli e José Mário da Silveira Mezencio.
O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos imunomoduladores
do extrato aquoso de Agaricus blazei e sua relação com a translocação de
bactérias autóctones e a translocação de Salmonella enterica Typhimurium
(10
6
UFC mL
-1
), em modelo animal. Extrato aquoso de A. blazei foi
administrado ad libitum e por gavage intragástrica a camundongos de 6 a 7
semanas, duas semanas antes da primeira dose de ciclofosfamida e até o
23
o
dia do experimento. No experimento utilizando S. Typhimurium para
desafiar os animais, o extrato aquoso de A. blazei foi administrado
diariamente por 16 dias antes do desafio e até o 22
o
dia, quando os animais
foram eutanasiados. Não houve diferença significativa (P>0,05) no ganho de
peso (g) dos animais entre os grupos testados durante a avaliação semanal,
no entanto, observou-se uma redução similar no peso dos animais
submetidos ao tratamento dos grupos imunodeprimidos com 200 mg kg
-1
de
ciclofosfamida na última semana de avaliação, independente da
administração ou não do extrato aquoso de A. blazei ad libitum e por gavage
intragástrica. Não foi observada translocação de bactérias Gram-negativas
autóctones em nenhum dos animais, no experimento envolvendo
xi
imunodepressão. Os animais imunodeprimidos apresentaram índice
esplênico inferior aos dos animais controles, mas, não houve diferença
significativa (P>0,05) entre aqueles grupos tratados ou não com extrato
aquoso de A. blazei. Não foram observadas diferenças na secreção de IgAs
no intestino delgado nem nas secreções séricas de TNF-α, IFN-γ e IL-10 dos
animais submetidos ao tratamento com o extrato aquoso de A. blazei,
imunodeprimidos ou não. A administração de ciclofosfamida não alterou a
histologia do íleo e fígado em comparação com os controles, porém, no baço
dos animais imunodeprimidos examinados observou-se redução dos
folículos linfóides e depleção linfocitária, sendo que a administração do
extrato aquoso de A. blazei não alterou esse aspecto. No experimento
envolvendo desafio microbiano, os valores de índice esplênicos dos animais
desafiados com S. Typhimurium não foram diferentes (P>0,05) daqueles
encontrados em animais não desafiados ou nos animais em que se
administrou extrato de A. blazei. A secreção de IgAs no intestino delgado
dos camundongos assim como as secreções de TNF-α, IFN-γ e IL-10 não
foram afetadas (P>0,05) pela administração do extrato aquoso de A. blazei
ou pelo desafio microbiano. Colônias típicas de S. Typhimurium foram
recuperadas do fígado, baço e linfonodos mesentéricos (MLNs) dos animais
desafiados nas análises conduzidas no quinto dia após a inoculação de
10
6
UFC mL
-1
por animal. Contudo, não ocorreu diferença significativa
(P>0,05) na translocação observada nos animais desafiados nos grupos
tratados ou não com o extrato aquoso de A. blazei. No grupo desafiado com
S. Typhimurium, as análises histopatológicas evidenciaram pequenos e
difusos focos de infiltrado inflamatório misto no parênquima hepático,
compatíveis com translocação. O baço dos animais desafiados também
apresentou discreta hiperplasia reacional, com discreto aumento dos
folículos linfóides e dos centros germinativos. O tratamento com o extrato
aquoso não modificou a resposta do baço ou do fígado no grupo desafiado.
À semelhança do grupo que recebeu apenas água e gavage intragástrica
com Salmonella, o íleo dos animais tratados com o extrato aquoso de A.
blazei não apresentou alterações significativas. O extrato aquoso de A.
blazei utilizado neste estudo, portanto, não influenciou nenhuma das
variáveis selecionadas para analisar seus efeitos imunomoduladores in vivo.
xii
ABSTRACT
FANTUZZI, Elisabete D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, April 2007.
Assessement of immunomudulators effects of Agaricus blazei water
extract and its relation to bacterial translocation in animal model.
Adviser: Maria Cristina Dantas Vanetti. Co-Advisers: Jacques Robert
Nicoli and José Mário da Silveira Mezencio.
The goal of this work was to investigate the immunomodulator effects of
Agaricus blazei water extract and its relation with the translocation of
autochthones bacteria as well as of Salmonella enterica Typhimurium (10
6
CFU mL
-1
), in animal model. A. blazei water extract was administrated ad
libitum and by intragastric gavage in mice of six to seven weeks, two weeks
before the first dose of cyclosphosphamide and until the 23
th
day of
experiment. In the experiment using S. enterica Typhimurium to challenge
the animals, A. blazei water extract was administrated daily for 16 days
before the challenge and until the 22
th
day, when the animals were sacrificed.
It was not verified significant difference (P>0.05) in the weight gain (g) of the
animals among the tested groups during the weekly evaluation; however it
was observed a similar reduction in the weight of animals submitted to the
treatments of immunodeppressive groups with cyclosphosphamide
200 mg kg
-1
in the last week of evaluation, independently if A. blazei water
extract was administrated or not ad libitum and by intragastric gavage. It was
not observed translocation of autochthones Gram-negative bacteria in none
xiii
of the evaluated animals, in the experiment involving immunodeppression.
The immunodeppressed animals exhibited spleenic index lower than the
control animals, however it was not verified significant difference (P>0.05)
among the groups treated or not with A. blazei water extract. It was not
observed differences in the secretion of IgAs in the thin intestine as well as in
the serum secretions of TNF-α, IFN-γ and IL-10 of the animals submitted to
the treatment with A. blazei water extract independent if they were
immunodeppressed or not. The administration of cyclosphosphamide did not
change the histology of ileum and liver compared to the control samples,
however, in the spleen of the immunodeppressed animals evaluated, it was
observed a reduction of the lymphoid follicles and lymphocytic depletion, and
the administration of A. blazei water extract did not change this aspect. In the
experiment involving microbial challenge, the values of spleenic index of the
defied animals with S. enterica Typhimurium were not different (P>0.05) from
that found in animals not defied or in animals witch received the extract of A.
blazei. The secretion of IgAs in the small intestine of mice as well as the
secretions of TNF-α, IFN-γ and IL-10 were not affected (P>0.05) by the
administration of A. blazei water extract or by microbial defy. Typical colonies
of S. enterica Typhimurium were recovered from liver, spleen and mesenteric
linfonods (MLNs) of the defied animals in the analyses conduced in the fifth
day after inoculation of 10
6
CFU mL
-1
per animal. Nevertheless, significant
difference (P>0.05) did not occur in the translocation observed in the defied
animals of groups treated or not treated with A. blazei water extract. In the
defied group with S. enterica Typhimurium the histopatologic analyses
showed small and diffuse focuses of mixed inflammatory infiltrates in the
hepatic parenchyma compatible with translocation. The spleen of defied
animals also exhibited discreet reactional hyperplasia, with discreet increase
lymphoid follicles
and discrete increase of the germinal centers. The
treatment with water extract did not modify the spleen and liver reply in the
defied group. Similar to the group witch received only water and intragastric
gavage with Salmonella, the ileum of treated animals with A. blazei water
extract did not exhibit significant changes. The water extract of A. blazei used
in this study, therefore, did not influence none of the selected variable to
analyze its effect immunomodulators in vivo.
xiv
1 INTRODUÇÃO
O sistema imunológico contribui na homeostase dos vertebrados,
por atuar como defesa contra microrganismos invasores e outros agentes
agressores. Esse sistema é composto por várias células e moléculas
sinalizadoras e pode ser dividido em sistema imune inato e sistema imune
adaptativo. A resposta do sistema imune inato envolve o reconhecimento
não-específico do agente agressor, enquanto a resposta imune adaptativa
inclui o reconhecimento específico de epítopos do agente agressor e o
posterior envolvimento de uma série de células e citocinas que, por sua vez,
induzirão uma resposta imune celular e, ou humoral.
Os basidiomicetos superiores têm sido estudados com o objetivo
não apenas nutricional, mas também medicinal, visando encontrar
alternativas para a profilaxia ou terapêutica de doenças de etiologias
diversas, como câncer, estresse, hipercolesterolemia, hipertensão, hepatite,
dentre outras. Muitos trabalhos relatam que os cogumelos possuem
substâncias que podem estimular o mecanismo de defesa do hospedeiro e,
assim, podem auxiliar na prevenção e no tratamento das doenças ou de
sintomas destas.
Dentre os cogumelos mais estudados, encontra-se o Agaricus
blazei. Este cogumelo desperta atenção não apenas por suas características
nutricionais, mas também por suas propriedades medicinais. Como
cogumelo medicinal, A. blazei pode ser estudado como substância
1
modificadora da resposta biológica (BRM) ou imunomoduladora e na
profilaxia de potenciais microrganismos invasores da mucosa intestinal,
membros da microbiota autóctone ou não. Assim, o objetivo deste trabalho
foi avaliar o potencial imunomodulador do extrato aquoso de A. blazei e sua
relação com a translocação de bactérias autóctones e Salmonella
Typhimurium em animais.
2
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O sistema imunológico
2.1.1 Resposta imune
O sistema imunológico é um sistema de defesa, em vertebrados,
que protege o hospedeiro contra microrganismos patogênicos invasores e
outros agentes agressores, por meio de uma variedade de células e
moléculas dinâmicas capazes de reconhecer, especificamente, e de eliminar
uma grande diversidade de antígenos (ANDERSEN et al., 2006). Após o
reconhecimento de um patógeno, ocorre uma resposta apropriada visando à
eliminação ou neutralização dessa ameaça por uma série de células e
moléculas do sistema imune. A exposição subseqüente ao mesmo
patógeno, por sua vez, induz uma resposta de memória imunológica, que é
caracterizada por ser uma reação imune mais rápida, intensa e específica
(ANDERSEN et al., 2006).
A imunidade inclui componentes não-específicos, que compõem a
imunidade inata e, específicos, que fazem parte da imunidade adaptativa,
que operam juntos para iniciar uma efetiva resposta imunológica (NETEA et
al., 2005; ANDERSEN et al., 2006).
3
2.1.2 Tecido linfóide associado ao intestino (GALT)
O intestino tem um sistema imune mucoso complexo, que torna
possível tolerar uma carga massiva de antígenos dietéticos e
microrganismos comensais que colonizam o trato gastrintestinal. Ao mesmo
tempo, porém, é capaz de reconhecer e rejeitar microrganismos que podem
desafiar as defesas do corpo (BOURLIOUX et al., 2003). O tecido linfóide
associado ao intestino (GALT) representa a maior massa de tecido linfóide
no corpo humano. Conseqüentemente, ele constitui importante elemento da
capacidade imunológica total do hospedeiro (ISOLAURI et al., 2001).
Aproximadamente, 70% de todos os linfócitos do corpo humano estão dentro
do GALT e a maioria dos anticorpos produzidos em indivíduos saudáveis é
IgA, que é secretada através da membrana mucosa do intestino (MÜLLER e
MacPHERSON, 2006).
O GALT é dividido em sítios indutores e efetores (McCRACKEN e
LORENZ, 2001; NAGLER-ANDERSON, 2001; NEWBERRY e LORENZ,
2005). Os sítios indutores incluem as estruturas mais organizadas, tais como
linfonodos mesentéricos (MLNs), placas de Peyer (PP), folículos linfóides
isolados (ILFs) e placas das criptas (cryptopatches - CPs). Os sítios efetores
incluem a lâmina própria e linfócitos intraepiteliais (NEWBERRY e LORENZ,
2005). Supõe-se, de acordo com Newberry e Lorenz (2005), que as
estruturas organizadas no trato gastrintestinal possam desempenhar a
função de órgãos linfóides primários, suportando o desenvolvimento extra-
tímico de linfócitos T (CPs), de órgãos linfóides secundários envolvidos na
indução da resposta imune mucosa (PPs) e estruturas linfóides terciárias,
cuja função está sob debate, como o caso dos folículos linfóides isolados
(ILFs). Assim, a apresentação de antígenos às células imunes efetoras é
concentrada em folículos linfóides organizados da mucosa (SPAHN e
KUCHARZIK, 2004).
As placas de Peyer são folículos linfóides altamente especializados
na parede do intestino delgado que contêm células B virgens, células
dendríticas foliculares e áreas ricas em linfócitos T (SPAHN e KUCHARZIK,
2004). As placas de Peyer são cobertas pelo epitélio associado ao folículo
(FAE), que contêm células epiteliais especializadas, as células M (SPAHN e
4
KUCHARZIK, 2004; NEWBERRY e LORENZ, 2005). Assim, as placas de
Peyer são diferentes de outras estruturas linfóides secundárias, visto que
não possuem vasos linfáticos aferentes e a amostragem de antígeno é
controlada pelas células M (NEWBERRY e LORENZ, 2005). O FAE, por sua
vez, tem várias diferenças, quando comparado com o epitélio intestinal que
cobre os vilos, é deficiente em células caliciformes e células de Paneth, tem
mais enterócitos cubóides, além de possuir concentrações reduzidas de
enzimas hidrolases digestivas e outras da borda em escova (NEWBERRY e
LORENZ, 2005).
As células dendríticas localizadas nas PPs também exercem uma
importante função na apresentação de antígenos luminais. Rescigno et al.
(2001) relataram que as células dendríticas são capazes de captar antígenos
luminais, diretamente, através do espaço intercelular. Esses autores
verificaram que as células dendríticas são capazes de “abrir” as junções
oclusivas entre as células epiteliais e, pelo fato de também expressarem
proteínas dessas junções, a integridade da barreira epitelial é preservada.
Os folículos linfóides isolados (ILFs) foram descritos pela primeira
vez por Hamada et al. (2002). Esses autores os identificaram como
agrupamentos de 100 a 200 linfócitos, localizados ao longo do intestino
delgado de camundongos. Segundo esses mesmos autores, os ILFs são
compostos por uma grande área de linfócitos B, incluindo centro germinal e
uma cobertura de FAE contendo células M. Os ILFs também estão
presentes no cólon, mas a maioria dos estudos têm examinado o intestino
delgado (NEWBERRY e LORENZ, 2005).
As placas das criptas (CPs) são agrupamentos organizados de
aproximadamente 1.000 células localizadas na base das criptas intestinais
(NEWBERRY e LORENZ, 2005). A função das CPs é matéria de
controvérsia, mas, logo que elas foram identificadas, consideraram-nas
como o sítio de desenvolvimento extra-tímico de linfócitos intraepiteliais
(NEWBERRY e LORENZ, 2005).
Os linfonodos encontrados no mesentério do intestino delgado são
os maiores linfonodos encontrados no corpo e são os primeiros a se
desenvolverem durante a embriogênese (NEWBERRY e LORENZ, 2005).
Os linfonodos mesentéricos (MLNs) funcionam como uma segunda linha de
5
defesa dos tecidos linfóides organizados, filtrando o conteúdo dos vasos
linfáticos mesentéricos (SPAHN e KUCHARZIK, 2004).
Os tecidos linfóides difusos são compostos de plasmócitos
produtores de IgA e células T maduras (BOURLIOUX et al., 2003). As
células efetoras encontram-se dispersas pela mucosa intestinal, sendo que a
maioria dos linfócitos T intraepiteliais tem o fenótipo CD8 (citotóxicos ou
supressores), enquanto os linfócitos T da lâmina própria apresentam o
fenótipo CD4 (auxiliares) (BOURLIOUX et al., 2003). A lâmina própria
também contém linfócitos da linhagem B, células B de memória e
plasmócitos, sendo 70 a 90% desses produtores de IgA (BOURLIOUX et al.,
2003).
2.1.3 Citocinas
As citocinas são glicoproteínas, que são reguladoras intercelulares
cruciais e mobilizadoras de células engajadas na imunidade bem como na
resposta inflamatória adaptativa do hospedeiro, crescimento, diferenciação e
morte celular; angiogênese e processos de desenvolvimento e reparo que
auxiliam a restauração da homeostase (ECKMANN et al, 2001;
OPPENHEIM, 2001). Embora as citocinas sejam ocasionalmente produzidas
constitutivamente, elas são, geralmente, produzidas por qualquer tipo celular
nucleado em resposta a um estímulo ofensivo (OPPENHEIM, 2001).
2.1.4 Imunoglobulina A secretora (IgAs)
A IgA é a classe de anticorpo predominante em muitas secreções
externas e tem muitas funções, diretas e indiretas, que servem para prevenir
agentes infecciosos, tais como bactérias e vírus, de romper a barreira
mucosa (FAGARASAN e HONJO, 2002; WOOF e MESTECKY, 2005). Além
disso, grande parte da IgA secretada na mucosa intestinal, diariamente, é
dirigida contra a microbiota comensal, em uma via independente do auxílio
6
de linfócitos T, sendo também considerada parte do sistema imune inato
(MacPHERSON et al., 2000). Os plasmócitos na lâmina própria e outros
sítios da mucosa secretam mais de 40 mg kg
-1
dia
-1
de IgA, mais que
qualquer outro isotipo de anticorpo no corpo humano (McCRACKEN e
LORENZ, 2001). De acordo com Bollinger et al. (2003) e Everett et al.
(2004), a IgA secretora (IgAs) é um dos principais fatores que previnem a
translocação bacteriana, que pode resultar em sepse e morte no hospedeiro.
A IgA nas secreções é composta de pelo menos dois monômeros de
moléculas de IgA covalentemente ligadas por meio da cadeia J e do
componente secretor (SC) (PHALIPON et al., 2002). As células epiteliais
intestinais são responsáveis por mediar a transcitose da IgA dimérica,
através do receptor de imunoglobulina polimérica (pIgR) (FERNANDEZ et
al., 2003; WOOF e KERR, 2004). Durante esse processo, o pIgR é clivado e
o componente maior permanece covalentemente ligado à IgA dimérica.
Dessa forma, o SC é um componente integral da molécula de IgA liberada
nas secreções, e acredita-se que ajuda a proteger o anticorpo da
degradação (WOOF e KERR, 2004). Por outro lado, por razões que
permanecem incertas, a IgA sérica é principalmente monomérica em
humanos (e possivelmente em outros primatas), mas é principalmente
dimérica em outros animais (WOOF e KERR, 2004).
De acordo com Fernandez et al. (2003), a proteção da barreira
epitelial por IgAs pode ser disparada por dois tipos de mecanismos distintos;
primeiro por prevenir a infecção bacteriana, que limita a invasão de bactérias
por exclusão imune; e, segundo, por prevenção da doença, ou seja, por
proteger da inflamação que destrói o tecido. A IgA é relativamente não-
inflamatória, pois não ativa o complemento e, dessa forma, previne uma
resposta inflamatória excessiva a antígenos microbianos e dietéticos
ubíquos (McCRACKEN e LORENZ, 2001).
Wijburg et al. (2006) relataram o papel de IgAs contra infecção por
S. Typhimurium em experimentos in vivo e in vitro. Esses autores desafiaram
camundongos nocaute para o receptor de imunoglobulina polimérica, que
são incapazes de ligar e ativamente transportar IgA dimérica e IgM
pentamérica para a mucosa, com 10
7
UFC de S. Typhimurium. Uma invasão
significativamente maior das placas de Peyer e da mucosa intestinal foi
7
observada, em comparação com o grupo controle, composto de
camundongos selvagens. Em relação à rota oral-fecal de disseminação de
S. Typhimurium, esses pesquisadores também demonstraram que
imunoglobulinas secretoras podem também reduzir a disseminação de
patógenos e infecção entre os indivíduos. Esta última observação, segundo
os autores, sugere que as imunoglobulinas secretoras têm um papel
evolucionário importante, protegendo não apenas o indivíduo, mas também
toda a população contra infecções.
2.2 Cogumelos medicinais
Atualmente, os basidiomicetos superiores têm-se tornado assunto de
grande interesse, por seu valor nutricional e propriedades farmacológicas.
Com fins medicinais, eles têm sido consumidos com objetivo de prevenir
câncer e doenças cardíacas, melhorar a circulação sangüínea e reduzir o
colesterol (WASSER e WEIS, 1999). Além disso, esses cogumelos são
usados para combater o estresse físico e emocional, para estimular a
imunidade, melhorar a qualidade de vida de diabéticos, para combater
doenças como osteoporose, úlcera gástrica e hepatite crônica (MENOLI et
al., 2001; GUTERREZ et al., 2004; ANGELI et al., 2006; CHOI et al., 2006;
GRIND et al.; 2006). Porém, estudos científicos sobre suas propriedades
biológicas ainda são insuficientes (MENOLI et al., 2001; GUTERREZ et al.,
2004).
2.2.1 Agaricus blazei
O basidiomiceto Agaricus blazei Murrill é um cogumelo comestível
nativo do sudeste do Brasil, popularmente conhecido como “cogumelo do
sol”, que vem sendo produzido e consumido em grande escala como
alimento e, principalmente, como chá (MIZUNO, 1995; MENOLI et al., 2001;
DELMANTO et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; BARBISAN et al., 2002;
8
BELLINI et al., 2003; RODRIGUES et al, 2003; GUTERREZ et al., 2004).
Desde 1965, essa estirpe é exportada do Brasil para o Japão, onde é
popularmente conhecida como “Himematsutake” ou “Kawariharatake”, sendo
hoje amplamente cultivada e estudada nesse país (MENOLI et al., 2001).
De acordo com Mizuno (1995), o corpo de frutificação de A. blazei
contém 85 a 87% de água e, quando desidratado, é rico em proteínas (40 a
45%), carboidratos (38 a 45%), fibras (6 a 8%), resíduos totais (5 a 7%),
lipídios (3 a 4%) e vitaminas (em mg%), tais como B
1
(0,3 mg), B
2
(3,2 mg) e
niacina (49,2 mg). Ele também contém quantidade relativamente grande de
ergosterol (0,1 a 0,2%), que é convertido em vitamina D
2
após exposição à
luz ou cozimento. Dentre os minerais, o potássio é o principal componente
de A. blazei. Além desses nutrientes, A. blazei também pode ser
considerado como fonte de substâncias biológica e fisiologicamente ativas
(TSAI et al., 2007).
Kawagish et al. (1989), em um estudo sobre o fracionamento do
resíduo insolúvel em água do corpo de frutificação de A. blazei e sua
atividade antitumoral contra sarcoma 180 em camundongos, encontraram
que, dentre as frações obtidas, a mais ativa foi a FIII-2-b, um complexo de
carboidratos (50,2%), (1→6)-β-D-glucano, ligado a proteínas (43,3%). Este
foi o primeiro trabalho que associou a atividade antitumoral com um glucano
contendo somente resíduos β-(1→6) ligados. Posteriormente, Kawagish et
al. (1990) tentaram separar a fração FIII-2-b em seus dois componentes e
avaliar a atividade antitumoral dos produtos resultantes. Apesar destes
autores não terem obtido êxito em conseguir a proteína livre do carboidrato,
eles puderam observar que o carboidrato isolado não exibiu uma forte
atividade antitumoral e concluíram que o componente protéico era essencial
para essa atividade.
Mizuno et al. (1998) observaram aumento nas subpopulações de
células T após a administração oral, em camundongos, de α-1,6-glucano e
α-1,4-glucano, polissacarídeos isolados de A. blazei. Componentes das
frações de A. blazei, obtidas por extrações com diferentes concentrações de
etanol, apresentaram a capacidade de ativar macrófagos in vitro e aumentar
a expressão de mRNA de IL-8 e TNF-α (SORIMACHI et al., 2001). Estas
observações levaram os autores a concluir que o fato de certos pacientes
9
com câncer, aparentemente, recuperarem da doença, após a ingestão de
extratos de Agaricus, pode ser devido à ativação do sistema imune, ao invés
do efeito direto destes nas células neoplásicas. Nakajima et al. (2002)
também investigaram as atividades imunopotencializadoras do extrato
solúvel de A. blazei em água fervente. Eles observaram aumento na
expressão de mRNA de IL-6 e mRNA de IL-1β nos macrófagos isolados da
cavidade peritoneal e nas células de baço dos camundongos que receberam
injeção intraperitoneal do extrato de A. blazei (25 mg/kg). Esses últimos
autores concluíram, então, que o extrato de A. blazei Murrill pode ser uma
importante substância para aumento do mecanismo de defesa imune e
prevenção de várias doenças.
O aumento nas concentrações de citocinas MIP-2 e TNF-α no soro
de camundongos que receberam o extrato de A. blazei foi constatado e
resultou em proteção contra infecção sistêmica por Streptococcus
pneumoniae, devido ao envolvimento do sistema imune inato
(BERNARDSHAW et al., 2005).
Além dos estudos que identificaram a atividade antitumoral dos
complexos polissacarídeos-proteína isolados de A. blazei, em roedores, a
atividade antimutagênica também foi demonstrada nos extratos aquosos
deste (DELMANTO et al., 2001; MENOLI et al., 2001; RODRIGUES et al,
2003; GUTERREZ et al., 2004). Takaku et al. (2001) reportaram a ação do
ergosterol, isolado da fração lipídica de A. blazei, como responsável pela
atividade antitumoral contra sarcoma 180 em camundongos. A atividade
antitumoral, segundo os mesmos autores, pode ser atribuída à inibição direta
da angiogênese, o que resultou na morte das células tumorais.
2.2.2 Modificadores da resposta biológica (BRMs)
Os modificadores da resposta biológica (BRMs) são substâncias que
aumentam a resposta imune e podem ser produzidos endogenamente no
corpo por células imunes ou podem ser derivados de bactérias, fungos,
algas e plantas (LEUNG et al., 2006). Uma substância imunomoduladora,
BRMs ou agente bioterapêutico, é importante para o tratamento de câncer e
10
doenças infecciosas (HARADA et al., 2002a; HARADA, 2002b; HARADA et
al., 2006). Entre os BRMs exógenos, os polissacarídeos são de maior
ocorrência na natureza e, entre os principais BRMs derivados de fungos,
estão o β-glucano e α-mananas (KIM et al., 2006; LEUNG et al., 2006).
Os β-glucanos, carboidratos e principais componentes da parede
celular de leveduras, fungos filamentosos e cereais, como aveia e cevada,
têm sido extensivamente investigados por suas atividades
imunomoduladoras (YUN et al., 2003). β-glucanos com variados pesos
moleculares e estruturas secundárias, isolados de várias fontes naturais, são
reconhecidos pela sua capacidade de ativar mecanismos de defesa imune
contra infecções parasíticas e microbianas (YUN et al., 2003). Burgaleta e
Golde (1977) observaram que a administração intraperitoneal de glucano,
um produto parcialmente purificado da parede celular de Saccharomyces
cerevisiae, aumentou a produção de granulócitos e monócitos em
camundongos, sugerindo que, quando glucano é usado como agente
imunoterapêutico, pode ocorrer o aumento no número de células efetoras
disponíveis. O glucano isolado de S. cerevisiae também foi avaliado quanto
à sua capacidade protetora em infecções respiratórias em ratos e
camundongos (KIMURA et al., 1983). A administração intravenosa de
glucano, em ratos, antes da infecção com aerossóis de Staphylococcus
aureus e Klebsiella pneumoniae, aumentou as taxas de morte bacteriana,
possivelmente em razão do aumento nas taxas de fagocitose pelos
macrófagos pulmonares. No entanto, os efeitos de proteção induzidos pelo
glucano foram menos claros em camundongos. Kogan et al. (1989)
administraram, por via intravenosa ou subcutânea, em camundongos,
diferentes doses de glucano isolado de S. cerevisiae e obtidos por diferentes
processos. Posteriormente, inocularam esses animais intraperitonealmente
com K. pneumoniae e observaram aumento do tempo médio de
sobrevivência dos camundongos. Com base nos resultados, os autores
concluíram que os derivados solúveis do glucano particulado originado da
parede celular de S. cerevisiae, com pesos moleculares relativamente
baixos, podem servir como agentes antiinfecciosos e podem ser usados em
terapias veterinária e humana.
11
O glucano isolado do fungo Sparassis crispa exerceu efeitos
imunoestimuladores diferenciados em várias estirpes de camundongos
(HARADA et al., 2002a). Esses autores não observaram indução na
secreção de IFN-γ, in vitro, em esplenócitos isolados na maioria das estirpes
testadas, porém, a concentração de IFN-γ foi significativamente aumentada
nos camundongos DBA/2 e DBA/1, na presença do glucano.
O aumento no número de linfócitos intraepiteliais (IEL) e a produção
espontânea de IFN-γ no intestino de camundongos, após administração oral
e diária de β-glucano, isolado de levedura, durante uma semana (25
mg/dia/camundongo) também foram observados (TSUKADA et al., 2003).
Esses resultados sugeriram, portanto, que o β-glucano pode potencializar a
imunidade da mucosa do trato digestivo. Yun et al. (2003) constataram
aumento da atividade fagocítica em macrófagos isolados da cavidade
peritoneal de camundongos, promovida pelo β-glucano extraído de aveia.
Por meio dos estudos in vivo, eles concluíram que o tratamento oral ou
parenteral com β-glucano, isolado de aveia, aumenta a resistência à
infecção por S.aureus ou Eimeria vermiformes, em camundongos.
2.3 Translocação bacteriana
O trato gastrintestinal adulto abriga um ecossistema complexo
composto por um conjunto onde o epitélio gastrintestinal, células imunes
subjacentes e a microbiota autóctone interrelacionam-se (McCRACKEN e
LORENZ, 2001). Embora cada componente dessa aliança seja capaz de
certo grau de desenvolvimento independente dos outros membros, todos os
três são essenciais para a função completa e o desenvolvimento da
maturidade desse ecossistema. Os fatores ambientais, tais como a
composição do alimento e o pH luminal, influenciam a porção transitória da
microbiota, porém, a porção autóctone de um adulto consiste de uma
comunidade clímax de microrganismos que permanece relativamente
estável ao longo da vida (BERG, 1996; WIEST e RATH, 2003). O
conhecimento sobre a ecologia microbiana do intestino dos mamíferos, no
12
entanto, é limitado, sendo fundamentado somente em estudos de
microrganismos que podem sobreviver fora do intestino (HOOPER, 2004).
A microbiota intestinal autóctone exerce efeitos pronunciados no
desenvolvimento anatômico, fisiológico e imunológico do hospedeiro;
estimula o sistema imune a responder mais rapidamente ao desafio de
patógenos e, por meio do antagonismo bacteriano, inibe a colonização do
trato gastrintestinal por patógenos externos (BERG, 1996). No entanto, na
microbiota autóctone também existem patógenos oportunistas que podem
translocar através da barreira mucosa, causando infecções sistêmicas em
hospedeiros debilitados (BERG, 1996).
O termo translocação foi usado inicialmente por Wolochow et al.
(1966) e Fuller e Jaine-Williams (1970) para descrever a passagem de
microrganismos do trato gastrintestinal para órgãos extra-intestinais. Berg e
Carlington (1979) usaram pela primeira vez o termo translocação bacteriana
para descrever a passagem de certas bactérias autóctones do trato
gastrintestinal para o complexo de linfonodos mesentéricos e outros órgãos
extra-intestinais de camundongos isentos de germes (GF-germ-free) que
haviam sido previamente inoculados com o conteúdo cecal de camundongos
isentos de patógenos específicos (SPF-especific-pathogen-free). Dessa
forma, o termo translocação bacteriana inicialmente foi empregado para
descrever a passagem somente de bactérias autóctones do trato
gastrintestinal para órgãos extra-intestinais. Em 1990, Alexander et al.
propuseram que o termo fosse redefinido para incluir toda a translocação
microbiana, incluindo a passagem de microrganismos viáveis e não viáveis,
e também de produtos microbianos, tais como endotoxinas. Portanto,
atualmente, de acordo com Wiest e Rath (2003), translocação microbiana
engloba a passagem, através do epitélio intestinal, de microrganismos
viáveis e não viáveis, bem como de produtos microbianos.
As bactérias classificadas como patógenos intracelulares
facultativos, ou seja, aquelas que são capazes de sobreviver dentro de
leucócitos e macrófagos após a fagocitose, como por exemplo espécies de
Salmonella, parecem translocar mais rapidamente (WIEST e RATH, 2003).
As bactérias autóctones, por sua vez, translocam continuamente, em baixo
número mesmo em hospedeiros saudáveis (BERG, 1992; BERG, 1995;
13
WIEST e RATH, 2003). No entanto, são inativadas nos órgãos linfóides pelo
sistema fagocítico mononuclear do hospedeiro e, com isso, outros órgãos
extra-intestinais permanecem estéreis (BERG, 1992; BERG, 1995; WIEST e
RATH, 2003). Portanto, as bactérias autóctones que translocam
continuamente do trato gastrintestinal, não são capazes de estabelecer uma
infecção persistente nos linfonodos ou outros sítios extra-intestinais de
animais saudáveis imunocompetentes. Segundo Berg (1996), essa
translocação “fisiológica” seria responsável pela função de imunomodulação
que, juntamente com a resistência à colonização e a contribuição nutricional,
são as três grandes funções benéficas oferecidas pela microbiota indígena
ao hospedeiro que a aloja. Componentes antigênicos provenientes da
microbiota seriam assim, continuamente apresentados ao sistema imune,
permitindo a sua manutenção em estado de alerta para poder responder
mais rapidamente e de forma adequada, em caso de agressão infecciosa.
A função da microbiota intestinal na resistência à colonização e
conseqüente redução da translocação foi demonstrado por Berg e Owens
(1979). Estes autores inocularam camundongos isentos de germes com a
microbiota autóctone antagonista obtida do ceco de camundongos SPFs.
Posteriormente, desafiaram estes mesmos camundongos com E. coli e
observaram que a translocação cessou em 24 horas, possivelmente devido
à ação da microbiota competidora. Porém, o tratamento de camundongos
com penicilina, clindamicina ou metronidazol, por via oral, durante apenas
quatro dias, rompeu o equilíbrio ecológico da microbiota, permitindo o
supercrescimento de bacilos Gram-negativos no ceco de camundongos
SPFs, possibilitando a translocação bacteriana (BERG, 1981). Além disso, o
efeito sinérgico do supercrescimento bacteriano e da imunodepressão do
hospedeiro, obtidos por meio da administração combinada de antibióticos
orais e drogas imunodepressoras, promoveu a translocação bacteriana do
trato gastrintestinal que resultou em sepse letal em camundongos, após 12
dias (BERG et al., 1988).
A translocação bacteriana para os linfonodos mesentéricos, que são
os primeiros órgãos encontrados na rota de translocação a partir do lúmen
intestinal, é rapidamente promovida pelo supercrescimento microbiano
(BERG, 1995). O grau de translocação de certas espécies de
14
Enterobacteriaceae para os linfonodos mesentéricos é diretamente
relacionado à sua concentração no intestino delgado e ceco (STEFFEN e
BERG, 1983). Além disso, das várias espécies de bactérias autóctones nem
todas translocam do trato gastrintestinal para os linfonodos mesentéricos ou
outros órgãos extra-intestinais com a mesma eficiência (STEFFEN et al.
1988). As bactérias que translocam com mais eficiência, a partir do trato
gastrintestinal para os linfonodos mesentéricos de camundongos
gnotobióticos monoassociados (germ-free colonizados com uma única
estirpe bacteriana), são Pseudomonas aeruginosa e Enterobacteriaceae
Gram-negativas, anaeróbias facultativas, tais como K. pneumoniae,
Escherichia coli e Proteus mirabilis (STEFFEN et al. 1988). Além destas,
também translocam, mas com menor eficência, espécies de Enterococcus,
Streptococcus, Lactobacillus, como também Candida albicans e,
possivelmente, S. aureus (WELLS, 1990). Curiosamente, esses
microrganismos são os mais freqüentemente associados com complicações
infecciosas em pacientes hospitalizados severamente doentes (WELLS,
1990; WIEST e RATH, 2003). Na ordem decrescente de capacidade de
translocação bacteriana encontram-se, portanto, bactérias Gram-negativas
anaeróbias facultativas, bactérias Gram-positivas anaeróbias facultativas e,
finalmente, bactérias anaeróbias estritas (BERG, 1995).
2.3.1 Fatores que induzem a translocação bacteriana
Existem três mecanismos primários que promovem a translocação
bacteriana do trato gastrintestinal: (1) supercrescimento bacteriano no
intestino, (2) deficiências nas defesas imunes do hospedeiro e (3) aumento
da permeabilidade ou dano na barreira do epitélio intestinal (BERG, 1992;
BERG 1995; BERG, 1999; WIEST e RATH, 2003). Vários modelos animais
têm sido utilizados para estudar a translocação bacteriana (BERG, 1995;
BERG, 1999; WIEST e RATH, 2003). A administração oral de antibióticos a
camundongos enquadra-se dentro do modelo de supercrescimento
bacteriano, enquanto a injeção de agentes imunossupressores em
camundongos é um dos modelos de enfraquecimento das defesas imunes
15
do hospedeiro (BERG, 1995; BERG, 1999). A ciclofosfamida é uma droga
usada para o tratamento de doenças neoplásicas e como agente
imunossupressor em diversas doenças como artrite reumatóide, lupus
eritematoso sistêmico, glomerulonefrite, esclerose múltipla e outras doenças
não-malignas, bem como em transplantes de órgãos, porém, é também
carcinogênica e produz tumores secundários (ANDERSON et al., 1995). De
acordo com as características imunossupressoras, geralmente, a
ciclofosfamida é usada para induzir leucopenia em animais experimentais
(HUANG et al., 2007; HOU et al., 2007) e como droga promotora de
translocação microbiana em modelos animais (BERG, 1983; SUZUKY et al.,
1996; PÉRET FILHO et al., 1996). A ciclofosfamida tem vários efeitos que
prejudicam a resistência do hospedeiro, mas o descréscimo no número de
granulócitos circulantes é, provavelmente, um dos mais importantes fatores
para seu uso em diferentes modelos animais, visto que pode ocasionar
infecção severa e sepse nestes (ZULUAGA et al., 2006).
O dano físico à mucosa intestinal constitui uma terceira alternativa
para promover a translocação bacteriana em modelos animais e pode ser
provocado pela administração oral de ácido ricinoléico, pela indução de
endotoxemia e por injúria térmica, dentre outros (BERG, 1995; BERG, 1999).
Contudo, em situações clínicas, mais de um mecanismo, freqüentemente,
atua para promover a translocação bacteriana a partir do trato gastrintestinal
(BERG, 1999).
2.3.2 Translocação de Salmonella
As infecções gastrintestinais são um dos principais problemas de
saúde pública em vários países, não apenas naqueles em desenvolvimento,
mas também em países da Europa e nos Estados Unidos, onde esta
incidência atinge valores superiores a 10 % anualmente (BOVEE-
OUDENHOVEN et al., 2003). Entre os microrganismos, Salmonella se
destaca como uma das principais causas de infecções gastrintestinais em
humanos (HAPFEILMEIR e HARDT, 2005; KALUPAHANA et al., 2005; LEE
et al., 2006; SASHINAMI et al., 2006). Em camundongos, Salmonella
16
enterica sorotipo Typhimurium causa infecção sistêmica, semelhante à
patogênese da febre tifóide em humanos (OHL e MILLER, 2001;
KALUPAHANA et al., 2005; SASHINAMI et al., 2006). A virulência da
Salmonella é dada por diversos agrupamentos de genes de virulência,
chamados ilhas de patogenicidade, SPI-1 e SPI-2, que são importantes para
a adesão à mucosa, invasão das células epiteliais e estimulação da
secreção de fluidos, que causa os sintomas diarréicos (SASHINAMI et al.,
2006). Após exposição à bactéria, diversas respostas são direcionadas
contra a infecção bacteriana e uma delas é a produção de citocinas
inflamatórias, como interferon gamma (IFN-γ) e fator de necrose tumoral
alpha (TNF-α) (SASHINAMI et al, 2006).
O uso de antibióticos é a principal estratégia para a erradicação de
Salmonella e os agentes antimicrobianos são usados rotineiramente como
terapêuticos e profiláticos em salmoneloses humana e animal (LEE et al.,
2006). Com o aumento da resistência a essas drogas, novas alternativas
têm sido pesquisadas contra essa doença, tais como o uso de probióticos
(RODRIGUES et al., 1996; LIMA-FILHO et al., 2004; SILVA et al., 2004),
plantas medicinais (LEE et al., 2006; STEFANOVA et al., 2007) e modulação
dietética por meio de alimentos funcionais (VAN DER MEER e BOVEE-
OUDENHOVEN, 1998; BOVEE-OUDENHOVEN et al., 2003; TEN
BRUGGENCAT et al., 2004).
Alguns estudos também têm avaliado a utilização de substâncias da
medicina alternativa no combate à infecção por Salmonella. Lee et al. (2006)
examinaram o efeito de Schizandrae fructus contra infecção por S.
Typhimurium, em camundongos e concluíram que a administração do
extrato metanólico teve efeitos na mortalidade e no número de S.
Typhimurium viáveis nas fezes dos animais inoculados. Além disso, somente
um animal do grupo que recebeu o extrato havia morrido, quatro dias após a
infecção, enquanto todos os camundongos do grupo controle sucumbiram
pela infecção. Esses autores não detectaram sinais clínicos e danos
histológicos nos animais tratados com o extrato de S. fructus. Stefanova et
al. (2007) observaram redução da contagem de S. Typhimurium no fígado e
baço de camundongos, 24 horas, três e cinco dias após a inoculação
intraperitoneal da bactéria e administração de cumarina. Outras substâncias
17
imunomoduladoras em potencial, como os extratos de basidiomicetos,
também podem ser pesquisadas com o objetivo de protegerem o hospedeiro
contra infecção por Salmonella.
18
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28
CAPÍTULO 1
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DE Agaricus blazei EM
CAMUNDONGOS IMUNODEPRIMIDOS
1 INTRODUÇÃO
Os cogumelos têm sido estudados com finalidades nutricionais e
também medicinais e muitas substâncias antitumorais e imunomoduladoras
foram identificadas, constituindo-se, em especial, de polissacarídeos
(ZHANG et al., 2007). Com fins medicinais, eles têm sido consumidos com
objetivo de prevenir câncer e doenças cardíacas, melhorar a circulação
sangüínea e reduzir o colesterol (WASSER e WEIS, 1999). Além disso,
alguns cogumelos são usados para combater o estresse físico e emocional,
para estimular a imunidade, melhorar a qualidade de vida de diabéticos e
para combater doenças como osteoporose, úlcera gástrica e hepatite crônica
(MENOLI et al., 2001; GUTERREZ et al., 2004; ANGELI et al., 2006; CHOI,
et al., 2006; GRIND et al., 2006).
O basidiomiceto Agaricus blazei Murrill é um cogumelo comestível,
nativo do sudeste do Brasil, popularmente conhecido como “cogumelo do
sol”, que é produzido e consumido em grande escala como alimento e,
29
principalmente, como chá (MIZUNO, 1995; MENOLI et al., 2001;
DELMANTO et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; BARBISAN et al., 2002;
BELLINI et al., 2003; RODRIGUES et al., 2003; GUTERREZ et al., 2004).
Desde 1965 esta estirpe é exportada do Brasil para o Japão, onde é
popularmente conhecida como “Himematsutake” ou “Kawariharatake”, sendo
hoje amplamente cultivada e estudada nesse país (MENOLI et al., 2001).
Embora A. blazei seja usado popularmente para combater várias
doenças, incluindo o câncer, a sua composição química ainda não foi
completamente estabelecida. Kawagish et al. (1989) encontraram que,
dentre as frações obtidas do corpo de frutificação de A. blazei, a mais ativa
contra sarcoma 180 em camundongos foi a FIII-2-b, um complexo de
carboidratos (50,2%), (1→6)-β-D-glucano, ligado a proteínas (43,3%). Este
foi o primeiro trabalho que associou a atividade antitumoral com um glucano
contendo somente resíduos β-(1→6) ligados. Mizuno et al. (1998)
observaram aumento nas subpopulações de células T após a administração
oral de α-1,6-glucano e α-1,4-glucano, polissacarídeos isolados de A. blazei,
em camundongos. Sorimachi et al. (2001) reportaram que componentes das
frações de A. blazei, obtidas por extrações com diferentes concentrações de
etanol, possuíam a capacidade de ativar macrófagos in vitro e aumentar a
expressão de mRNA de IL-8 e TNF-α. Essas observações os levaram a
concluir que o fato de certos pacientes com câncer, aparentemente,
recuperar da doença após tomarem extratos de Agaricus, pode ser devido à
ativação do sistema imune ao invés do efeito direto destes nas células
neoplásicas. O aumento na expressão de mRNA de IL-6 e mRNA de IL-1β
foi observado nos macrófagos isolados da cavidade peritoneal e nas células
do baço dos camundongos que receberam injeção intraperitoneal do extrato
de A. blazei (25 mg/kg) (NAKAJIMA et al., 2002). Esses autores sugeriram
que o aumento detectado na produção de anticorpos pode ter sido induzido
pela produção de IL-1β e IL-6 a partir de células T ativadas e macrófagos, o
que resultou em diferenciação das células B. Portanto, de acordo com esses
últimos autores, o extrato de A. blazei Murrill pode conter substâncias
importantes para aumento do mecanismo de defesa imune e prevenção de
várias doenças. Bernardshaw et al. (2005) também observaram um aumento
nos níveis de citocinas MIP-2 e TNF-α no soro de camundongos que
30
receberam o extrato de A. blazei, o que acarretou uma proteção contra
infecção sistêmica por Streptococcus pneumoniae, devido ao envolvimento
do sistema imune inato. Nesse último trabalho, pioneiro sobre os efeitos
antiinfeciosos do A. blazei in vivo, os autores sugeriram que o extrato desse
cogumelo pode ser útil como tratamento profilático e terapêutico contra
infecções bacterianas e possivelmente outras infecções, em humanos.
31
2 MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado nos Laboratórios de Microbiologia
de Alimentos e Patógenos Alimentares, do Departamento de Microbiologia, e
no Biotério Central, do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da
Universidade Federal de Viçosa-MG.
2.1 Camundongos
Foram utilizados camundongos albinos suíços, machos, com seis a
sete semanas de vida, pesando, em média, 29 g. Todos os animais foram
obtidos das matrizes do Biotério Central da Universidade Federal de Viçosa
e foram mantidos sob temperatura e umidade constantes, com um ciclo de
12 horas escuro/ luz, com acesso livre à dieta padrão para roedores (Purina,
Brasil) e água ad libitum, exceto para os grupos que receberam o extrato
aquoso de A. blazei ad libitum. Todos os procedimentos envolvendo
camundongos foram conduzidos de acordo com as recomendações do
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA - Brasil).
32
2.2 Extrato do A. blazei
Amostras de A. blazei desidratadas foram adquiridas da Associação
dos Produtores de Cogumelo do Norte de Minas e Vale do Jequitinhonha
(APROCONOVA, Montes Claros, MG, Brasil).
Os extratos aquosos foram preparados segundo modificações nas
metodologias descritas por Delmanto et al. (2001) e Barbisan et al. (2002).
Os cogumelos desidratados foram triturados até obter-se um pó. O extrato
foi preparado acrescentando-se 2,5 g do pó em 100 mL de água destilada
(2,5 % p/p), mantendo-o por 2 h em temperatura ambiente. O extrato foi
filtrado em papel de filtro. A solução, referida como extrato aquoso de A.
blazei, foi preparada diariamente antes da administração aos animais. Essa
solução é considerada a forma popular de uso para efeitos benéficos na
saúde (BARBISAN et al., 2002). Para os grupos experimentais nos quais se
oferecia o extrato ad libitum aos animais, os recipientes contendo o extrato
aquoso foram revestidos com papel alumínio para prevenir decomposição
pela luz (BARBISAN et al., 2001). Nos demais grupos, os camundongos
receberam 0,6 mL de extrato dia
-1
animal
-1
, por gavage intragástrica
(DELMANTO et al., 2001).
2.3 Administração da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (Genuxal
®
, ASTA MÉDICA AG, Frankfurt,
Alemanha) foi diluída em solução salina 0,85 % estéril, conforme instruções
do fabricante, e a dosagem foi calculada como miligrama de ciclofosfamida
por quilo de peso corporal dos camundongos de cada grupo. A via de
administração foi intraperitoneal, nos dias 15, 17, 19 e 21 do experimento.
33
2.4 Determinação da dose imunodepressora de ciclofosfamida
As amostras de sangue dos camundongos foram coletadas por
punção cardíaca, em tubos heparinizados (Vacutainer
®
System, Becton,
Dickinson e Company, EUA), 24 h após a quarta administração das doses
de 100 mg kg
-1
, 200 mg kg
-1
e 300 mg kg
-1
de ciclofosfamida, por via
intraperitoneal. Os animais do grupo controle receberam injeção
intraperitoneal de solução salina 0,85 %. A contagem de leucócitos foi
realizada no Laboratório de Análises Clínicas de Viçosa (Viçosa - MG), em
microscópio (ABX Micro 60), utilizando-se o corante Panótico rápido
(Laborclin, Paraná, Brasil).
2.5 Grupos de estudo e tratamentos
Os animais foram separados aleatoriamente em oito grupos,
conforme a Tabela 1.
Tabela 1 - Grupos de estudo e tratamentos experimentais.
GRUPOS DE
ESTUDO
TRATAMENTOS
1 Água ad libitum e injeção intraperitoneal (IP) de solução salina 0,85 %
2 Água ad libitum e injeção IP de ciclofosfamida (200 mg Kg
-1
)
3
Extrato aquoso de A. blazei ad libitum e injeção IP de solução salina
0,85 %
4
Extrato aquoso de A. blazei ad libitum e injeção IP de ciclofosfamida
(200 mg Kg
-1
)
5
Água por gavage intragástrica (0,6 mL dia
-1
) e injeção IP de solução
salina 0,85 %
6
Água por gavage intragástrica (0,6 mL dia
-1
) e injeção IP de
ciclofosfamida (200 mg Kg
-1
)
7
Extrato aquoso de A. blazei por gavage intragástrica (0,6 mL dia
-1
) e
injeção IP de solução salina 0,85 %
8
Extrato aquoso de A. blazei por gavage intragástrica (0,6 mL dia
-1
) e
injeção IP de ciclofosfamida (200 mg Kg
-1
)
34
Todos os animais foram pesados no início do experimento e uma
vez a cada semana até o término do período experimental.
2.6 Eutanásia
Os animais foram anestesiados com éter e eutanasiados para coleta
dos órgãos e do sangue, no 24
o
dia do período experimental.
2.7 Análise de translocação bacteriana
No 24
o
dia de experimento, os animais foram eutanasiados e o
fígado, o baço e os linfonodos mesentéricos foram removidos
assepticamente, pesados e homogeneizados em tubos de vidro com solução
salina 0,85 % e, quando necessário, foram feitas diluições seriadas. O
plaqueamento foi realizado em ágar MacConkey (Merck, Alemanha) para
detecção de enterobactérias Gram-negativas, seguido de incubação a 37º C,
por 48 h.
2.8 Índice esplênico
Os baços dos animais eutanasiados foram pesados e os resultados
foram expressos como peso do órgão (mg) por unidade de peso corporal (g)
(LEE et al., 2003).
2.9 Determinação de IgA secretora (IgAs) no conteúdo do intestino
delgado
A IgAs total do intestino delgado dos camundongos foi determinada
por ELISA, de acordo com Rodrigues et al. (2000). Os camundongos foram
35
eutanasiados, o intestino delgado foi removido, os conteúdos foram
retirados, pesados e diluídos em tampão salina fosfato (PBS) na proporção
de 500 mg de conteúdo intestinal para 2,0 mL de PBS. Após centrifugação a
2000 g, por 30 min, o fluido sobrenadante foi coletado e mantido
a -70 ºC até o uso. As amostras dos fluidos intestinais foram diluídas 1:10
em PBS e diluições seriadas foram adicionadas em triplicata aos poços de
placas de ELISA. A IgAs total do fluido intestinal foi determinada usando IgA
de cabra anti-IgA de camundongo (A90-103A, Bethyl Laboratories,
Montgomery, EUA) e IgA de cabra anti-camundongo conjugada com
peroxidase (A90-103P, Bethyl Laboratories, Montgomery, EUA). O
desenvolvimento de cor se deu com o uso de ο-fenileno-diamino
(1,2–benzenodiamino) (Fast
®
OPD, Sigma, Saint Louis, Missouri) e a medida
da absorbância foi realizada a 420 nm em leitor de ELISA (Thermoplater -
TP reader). A concentração de IgAs total foi determinada por meio de uma
curva-padrão, utilizando-se uma IgA padrão purificada de camundongo (106-
01, Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, EUA).
2.10 Determinação de citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-10) no soro
As concentrações de TNF-α, IFN-γ e IL-10 no soro dos animais foram
determinadas por ELISA de captura. As amostras de sangue dos animais
foram coletadas por punção cardíaca e submetidas à centrifugação, a
1000 g, por 10 min. O soro obtido do sobrenadante foi congelado a
-70 ºC até as análises. As citocinas foram determinadas usando kits
comerciais e seguindo o protocolo do fabricante (DuoSet, R & D Systems,
Minneapolis, MN, EUA).
2.11 Análises histopatológicas do intestino delgado, baço e fígado
Os fragmentos dos órgãos dos animais, ao final do experimento,
foram fixados em solução fixadora Karnovsky e processados por inclusão
36
em parafina. Seções histológicas de 5 µm foram obtidas em micrótomo,
codificadas e examinadas ao microscópio de luz, por um único indivíduo que
não teve acesso aos códigos, no laboratório de Histopatologia do Instituto de
Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB - UFMG,
Belo Horizonte, MG).
2.12 Análises estatísticas
Os dados foram analisados por meio de análises de variância e
regressão. Para o fator qualitativo, as médias foram comparadas utilizando-
se o teste de Tukey, adotando-se o nível de 5 % de probabilidade. Para o
fator quantitativo (tempo), os modelos foram escolhidos com base na
significância dos coeficientes de regressão, utilizando-se o teste t, adotando-
se o nível de até 10 % de probabilidade, no coeficiente de determinação e no
fenômeno biológico. Para se proceder às análises estatísticas, foi utilizado o
software SAEG (Sistema para Análises Estatísticas), versão 8.0
(UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA, 1999). Para análise dos
resultados de IgAs no conteúdo intestinal e de citocinas no soro, foi utilizado
o software Genes (CRUZ, 2006).
37
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não ocorreram variações significativas no peso dos animais
submetidos aos diferentes tratamentos, nem ao longo do tempo nem entre
os tratamentos, independente da via de administração usada (Figura 1). No
entanto, na última semana de avaliação, observou-se redução similar no
peso dos animais dos grupos submetidos ao tratamento imunodepressor
(grupos 2, 4, 6 e 8), independente da administração ou não do extrato
aquoso de A. blazei ad libitum ou por gavage intragástrica. A perda de peso
dos animais imunodeprimidos, verificada no 21
º
dia do experimento, é um
efeito reconhecido da imunodepressão relatada por outros autores. Péret
Filho et al. (1998) verificaram que camundongos imunodeprimidos com
quatro doses de 100 mg Kg
-1
de ciclofosfamida, em dias alternados,
perderam peso ao final do período experimental, independente da dose do
probiótico Saccharomyces boulardii. Hou et al. (2007) observaram que ratos
imunodeprimidos com doses diárias de 10 mg Kg
-1
de ciclofosfamida
também perderam peso ao final de 30 dias de experimento, o que foi um
sinal de toxicidade geral da droga, apesar dos animais não terem
apresentado sinais de estresse, desnutrição ou mortalidade.
38
12345678
0
10
20
30
40
Dia 1
Dia 7
Dia 14
Dia 21
Grupos experimentais
Peso (g)
Figura 1 - Variações de peso dos animais submetidos aos tratamentos
experimentais durante 21 dias. Os grupos experimentais estão
descritos na metodologia. Os dados são médias ± desvio
padrão.
A perda de peso observada nos animais imunodeprimidos neste
trabalho também está associada com os valores de índice esplênico (SI)
obtidos, o que reforça a constatação do caráter imunossupressor da droga
utilizada.
O valor do SI não aumentou nos animais tratados com o extrato
aquoso de A. blazei ad libitum (grupo 3), quando comparado com os animais
do grupo controle (grupo 1), constituídos pelos animais não-
imunodeprimidos (Figura 2). Por outro lado, houve um decréscimo
significativo (P < 0,05) no SI dos animais imunodeprimidos (grupos 2, 4, 6 e
8), independente da administração do extrato aquoso de A. blazei e da via
de administração usada, em relação aos animais não-imunodeprimidos.
Esses resultados estão de acordo com aqueles previamente reportados na
literatura. Anton (1993) observou um decréscimo nos valores de SI em
camundongos, das estirpes C57BL/6 e DBA/2, um dia após a administração
de uma dose de 300 mg kg
-1
de ciclofosfamida. Chen et al. (2007) também
verificaram que a administração de uma dose de
150 mg Kg
-1
de ciclofosfamida reduziu, significativamente, o SI em
camundongos, em relação aos animais do grupo controle não-
imunodeprimidos. A redução nos valores de SI foi relacionada com a
39
redução do número de esplenócitos e não apenas com o resultado da perda
de volume fluido ou tecido conectivo desse órgão (HILBURGER et al., 1997).
12345678
0
1
2
3
4
5
Grupos experimentais
Índice esplênico (mg baço/ g peso
corporal)
a
d
abc
cd
ab
bcd
a
cd
Figura 2 - Índice esplênico dos animais. Os grupos experimentais estão
descritos na metodologia. Os dados são médias ± desvio
padrão. Nas barras que apresentam pelo menos uma mesma
letra, os tratamentos não diferem entre si, em 5% de
probabilidade, pelo Teste Tukey.
Os animais que receberam ciclofosfamida apresentarm número de
leucócitos totais entre 450 a 100 mm
-3
. Esses valores representam entre
2 % e 10 % da faixa normal de leucócitos para camundongos, que é por
volta de 1.000 a 5.000 células mm
-3
(ZULUAGA et al., 2006). Apesar de os
animais apresentarem um quadro clínico leucopênico compatível com a
imunodepressão, 24 h após a 4
a
dose de 200 mg kg
-1
(Figura 3), não foi
detectada translocação de bactérias Gram-negativas autóctones para os
MLNs, fígado e baço dos animais, em quaisquer dos grupos avaliados, pela
análise microbiológica em ágar MacConkey. Estes resultados não
corroboram aqueles encontrados por Berg (1983). Esse autor observou que
uma única injeção intraperitoneal de ciclofosfamida, em diferentes doses
(100 a 400 mg kg
-1
), promoveu a translocação de bactérias autóctones da
microbiota para os MLNs, o baço e o fígado de camundongos livres de
40
patógenos específicos (SPF), após uma semana da administração. Berg
(1983) ressaltou, contudo, que não existia uma relação direta entre as
propriedades imunossupressoras das diferentes drogas usadas em seu
estudo, dentre elas a ciclofosfamida, e a capacidade das mesmas em
promover a translocação bacteriana. As drogas poderiam ter acarretado
manifestações tóxicas no trato intestinal que permitiram a translocação de
bactérias autóctones através de lesões na mucosa, segundo esse autor.
Porém, mesmo com a imunodepressão constatada nos animais deste
estudo, não foram observadas alterações histopatológicas nos fragmentos
de íleo coletados. Com base nesses últimos resultados e na inferência de
Berg (1983), pode se supor que a ausência de translocação nesta pesquisa
poderia ser parcialmente explicada pela ausência de alterações
histopatológicas no íleo deses animais, tais como úlceras ou alterações da
arquitetura. Outro fato relevante que deve ser apontado é que a metodologia
utilizada neste experimento foi diferente daquela usada por Berg (1983).
Este autor realizou uma etapa de pré-enriquecimento dos órgãos coletados
em caldo BHI (Infusão de cérebro e coração), a 37 ºC, por 48 h, antes do
plaqueamento em três meios de cultura, todos diferentes do usado nesta
pesquisa.
0 mg 100 mg 200 mg 300 mg
0
1000
2000
3000
Dose de ciclofosfamida
Número de Leucócitos mm
-3
Figura 3 - Número de leucócitos totais mm
3
em amostras de sangue de
camundongos imunodeprimidos com diferentes doses de
ciclofosfamida. Os dados são valores médios.
41
Suzuky et al. (1996), por sua vez, verificaram a inibição da
translocação de Escherichia coli C25 para os MLNs de animais SPFs,
descontaminados com antibióticos, e animais germ-free (GF), que
receberam diferentes doses de ciclofosfamida, em diferentes esquemas de
imunodepressão. Esses autores constataram a redução do número de
células linfóides, especialmente células B, nas Placas de Peyer, MLNs e
baço dos animais e sugeriram que a inibição da translocação bacteriana
pode ter sido o resultado de mudanças morfológicas e fisiológicas nas
células M, independente de mudanças na função imunológica dos animais.
Neste estudo, não foram avaliadas as Placas de Peyer, contudo, a hipótese
levantada por Suzuky et al. (1996) também pode ser umas das supostas
explicações para os resultados encontrados.
A administração do extrato aquoso de A. blazei ad libitum e por
gavage intragástrica aumentou significativamente (P<0,05) a secreção de
IgAs no intestino delgado dos animais não-imunodeprimidos (grupos 3 e 7)
somente em comparação com o grupo imunodeprimido tratado com água ad
libitum (grupo 2). Contudo, o extrato aquoso de A. blazei não exerceu uma
estimulação na produção de IgAs na mucosa intestinal dos animais, pois a
concentração desse anticorpo no conteúdo intestinal dos animais
imunodeprimidos (grupos 4, 6 e 8) foi a mesma encontrada nos animais
tratados apenas com água (grupos 1 e 5) (Figura 4). Estes resultados
demonstram não ter ocorrido uma proteção local da mucosa dos
camundongos, pois a IgA é a classe de anticorpo predominante em muitas
secreções externas e tem muitas funções, diretas e indiretas, que servem
para prevenir agentes infecciosos, tais como bactérias e vírus, de romper a
barreira mucosa (FAGARASAN e HONJO, 2002; WOOF e MESTECKY,
2005). Além da proteção contra agentes infecciosos, grande parte da IgA
secretada na mucosa intestinal, diariamente, é dirigida contra a microbiota
comensal, em uma via independente do auxílio de linfócitos T, sendo
também considerada parte do sistema imune inato (MacPHERSON et al.,
2000). De acordo com Bollinger et al. (2003) e Everett et al. (2004), a IgA
secretora (IgAs) é um dos principais fatores que previnem a translocação
bacteriana. Alverdy e Ayos (1991) verificaram aumento na incidência de
translocação bacteriana para os MLNs de ratos que tiveram uma redução na
42
secreção de IgAs causada pela administração de corticóide. O aumento na
secreção de IgA também foi relacionado com o aumento da imunidade local
em estudos de utilização de probióticos em modelos animais (RODRIGUES
et al., 2000; LIMA-FILHO et al., 2004).
12345678
0
1000
2000
3000
Grupos experimentais
IgAs (ng) mL
-1
total do conteúdo
intestinal
ab
b
a
ab
a
ab
ab
ab
Figura 4 - Concentrações de IgAs totais no conteúdo do intestino delgado
dos camundongos. Os grupos experimentais estão descritos na
metodologia. Os dados são médias ± desvio padrão. Os
resultados foram expressos como médias da concentração de
IgAs (ng) mL
-1
do conteúdo intestinal. As barras verticais
representam o desvio padrão da média. Nas barras que
apresentam pelo menos uma mesma letra, os tratamentos não
diferem entre si, em 5% de probabilidade, pelo Teste Tukey.
Não foram detectadas variações significativas (P < 0,05) na
secreção das citocinas séricas TNF-α, IFN-γ e IL-10 nos animais
experimentais (Figura 5). Ellertsen et al. (2006) reportaram que o extrato
aquoso de A. blazei comercial teve efeitos drásticos na expressão gênica em
linhagens de células de monócitos humanos. Esses autores observaram
que, após 24 h de exposição dos monócitos ao extrato aquoso de A. blazei,
ocorreu uma indução da resposta T
H
1, como indicado pelo aumento na
expressão de IL-8, IL-1β, IL-12β e TNF-α.
43
12345678
0
50
100
150
Grupos experimentais
TNF -
α
(pg mL
- 1
) soro
12345678
0
100
200
Grupos experimentais
IFN -
γ
(pg mL -
1
) soro
12345678
0
100
200
Grupos experimentais
IL - 10 (pg mL
-1
) soro
Figura 5 - Concentrações de TNF-α, IFN-γ e IL-10 do soro de
camundongos. Os grupos experimentais estão descritos na
metodologia Os resultados foram expressos como médias das
concentrações de citocinas (pg) mL
-1
do soro.
.
44
Além disso, nenhuma citocina típica de resposta T
H
2 foi expressa.
No entanto, os resultados apresentados não confirmam o aumento, in vivo,
na secreção de citocinas T
H
1, como verificado pela dosagem sérica de TNF-
α e IFN-γ, nem da citocina reguladora IL-10. Ressalta-se, contudo, que a
coleta de sangue dos animais foi feita em apenas um momento do período
experimental e pode não ter evidenciado as supostas alterações no padrão
de secreção das citocinas. Além disso, os estudos de expressão das
citocinas são mais sensíveis e específicos que os de secreção (NAKAJIMA
et al., 2003). Outro fator que interfere nos resultados são as variações na
forma de extração do A. blazei usadas nos experimentos, o que dificulta a
comparação de resultados. Por outro lado, Grind et al. (2006) também não
observaram efeitos sistêmicos do extrato aquoso de A. blazei, administrado
oralmente, em pacientes portadores do vírus da hepatite C. Segundo esses
últimos autores, possivelmente, isso ocorreu pelo fato do β-glucano, o
suposto agente responsável pelos efeitos na secreção de citocinas in vitro,
não ter sido absorvido pelo intestino dos pacientes.
Não foram detectadas diferenças nas análises histopatológicas entre
os grupos de animais tratados com extrato aquoso de A. blazei ad libitum ou
por gavage intragástrica, e também nos animais controles que receberam
apenas água ad libitum ou por gavage intragástrica. A administração de
ciclofosfamida não alterou a histologia do íleo e fígado em comparação com
os controles não-imunodeprimidos.
A redução constatada no índice esplênico foi reforçada pela análise
histopatológica do baço dos animais imunodeprimidos quando verificou-se
uma redução nos folículos linfóides e uma depleção linfocitária, que não foi
atenuada pela administração do extrato aquoso de A. blazei (Figura 6). Pelo
fato do baço ser um órgão linfóide, que produz linfócitos e anticorpos como
funções relacionadas ao sistema imunológico (ROSS et al., 1993), as
alterações observadas pela análise histopatológica são compatíveis com o
quadro de imunodepressão ocasionado pela ciclofosfamida.
45
A
B
C
Figura 6 - Aspectos histopatológicos do parênquima esplênico (100 X) dos
animais experimentais. A, animais não-imunodeprimidos (G1);
B, animais imunodeprimidos (G2) e C, animais imunodeprimidos
tratados com o extrato aquoso de A. blazei (G4). Hematoxilina-
eosina.
46
Neste trabalho, não foram observados efeitos do extrato de A. blazei
nos parâmetros avaliados, como índice esplênico, alterações
histopatológicas, secreção de IgA e de citocinas no modelo animal estudado.
A literatura, por sua vez, descreve efeitos in vivo e in vitro dos extratos de A.
blazei em tumores (KAWAGISH et al., 1989; TAKAKU et al., 2001; LEE et
al., 2003), em parâmetros do sistema imunológico (MIZUNO et al., 1998,
SORIMACHI et al., 2000, NAKAJIMA et al., 2002, KASAI et al., 2004,
ELLERTSEN et al., 2006) e em mutações induzidas (DELMANTO et al.,
2001; MENOLI et al., 2001; GUTERREZ et al., 2004). A ausência de efeitos
também é relatada em outros trabalhos, como nos de Luiz et al. (2003) e
Guterrez et al. (2004), nos quais não foi observada atividade antimutagênica
do extrato aquoso de A. blazei, in vitro, e no de Grind et al. (2006), no qual o
extrato aquoso não foi recomendado para o tratamento de paciente
portadores de hepatite C. Além disso, foi reportada forte relação causal entre
disfunção hepática severa em pacientes com câncer que faziam uso do
extrato aquoso de A. blazei (MUKAI et al., 2006). Assim, necessita-se de
mais estudos visando estabelecer os supostos efeitos do extrato de A. blazei
in vivo, antes de o mesmo ser usado, indiscriminadamente, como terapia
complementar e alternativa, especialmente, tratando-se do caso de
indicações a pessoas portadoras de enfermidades diagnosticadas pela
medicina alopática.
47
4 CONCLUSÕES
O modelo animal utilizado apresentou-se adequado aos estudos dos
fenômenos biológicos propostos. O extrato aquoso de A. blazei não
imunoestimulou os animais experimentais nem foi verificado aumento na
proteção local da mucosa intestinal. As secreções de TNF-α, IFN-γ e IL-10
não foram alteradas, independente do tratamento experimental aplicado aos
animais. A dose de ciclofosfamida utilizada foi capaz de imunodeprimir os
animais, mas não acarretou a translocação de bactérias Gram-negativas
autóctones. O baço dos animais imunodeprimidos apresentou uma redução
nos folículos linfóides e uma depleção linfocitária, como resultado dos efeitos
imunodepressivos da ciclofosfamida, efeito este que também não foi
atenuado pela administração do extrato aquoso de A. blazei.
48
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53
CAPÍTULO 2
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DE Agaricus blazei EM
CAMUNDONGOS DESAFIADOS COM Salmonella TYPHIMURIUM
1 INTRODUÇÃO
Entre os microrganismos, Salmonella se destaca como uma das
principais causas de infecções gastrintestinais em humanos (HAPFEILMEIR
e HARDT, 2005; KALUPAHANA et al., 2005; LEE et al., 2006; SASHINAMI
et al., 2006). Em camundongos, S. enterica sorotipo Typhimurium causa
infecção sistêmica semelhante à patogênese da febre tifóide em humanos
(KALUPAHANA et al., 2005; SASHINAMI et al., 2006, STEFANOVA et al.,
2007). Essa bactéria resiste ao pH baixo do estômago, penetra na barreira
intestinal, via células M, coloniza as placas de Peyer (STEFANOVA et al.,
2007) e, subseqüentemente, vai para os linfonodos de drenagem e pode se
disseminar, via circulação sangüínea para o baço e fígado e, neste último,
pode ser encontrada dentro de hepatócitos e células fagocíticas (RICHTER-
DAHLFORS et al., 1997). A virulência da Salmonella é dada por diversos
agrupamentos de genes de virulência, chamados ilhas de patogenicidade,
SPI-1 e SPI-2, que são importantes para a adesão à mucosa, invasão das
54
55
células epiteliais e estimulação da secreção de fluidos, que causa os
sintomas diarréicos (SASHINAMI et al, 2006). Após exposição à bactéria,
diversas respostas são direcionadas do hospedeiro contra a infecção
bacteriana e uma delas é a produção de citocinas inflamatórias como
interferon gamma (IFN-γ) e fator de necrose tumoral alpha (TNF-α).
(SASHINAMI et al., 2006). Os mecanismos de defesa do hospedeiro contra
Salmonella são complexos e envolvem a imunidade inata e adaptativa
(STEFANOVA et al., 2007)
O uso de antibióticos é a principal estratégia para a erradicação de
Salmonella e os agentes antimicrobianos são usados rotineiramente como
terapêuticos e profiláticos em salmoneloses humana e animal (LEE et al.,
2006). Com o aumento da resistência a essas drogas, novas alternativas
têm sido pesquisadas contra essa doença, tais como o uso de probióticos
(RODRIGUES et al., 1996; LIMA-FILHO et al., 2004; SILVA et al., 2004) e
plantas medicinais (LEE et al., 2006; STEFANOVA et al., 2007). Substâncias
imunomoduladoras, como modificadores da resposta biológica (BRMs),
também têm o potencial para serem usados na terapia de doenças
infecciosas (OHNO et al., 2001).
A modulação da secreção de citocinas pode se constituir em um
procedimento para tratamento de diversas doenças e uma forma estratégica
potencial para essa modulação pode ser por meio da utilização de plantas
medicinais. Segundo Spelman et al. (2006), os imunomoduladores
fitoterápicos podem ser definidos como produtos originários de plantas que
alteram a atividade do sistema imune por meio da regulação dinâmica de
moléculas informacionais, como citocinas, hormônios, neurotransmissores e
outros peptídeos. Os fungos são comumente usados com essa função na
fitoterapia, apesar de não serem plantas.
Os BMRs são substâncias que aumentam a resposta imune e
podem ser produzidos endogenamente no corpo por células imunes, ou
podem ser derivados de bactérias, fungos, algas e plantas (LEUNG et al.,
2006). Entre os BMRs exógenos, os polissacarídeos possuem a maior
ocorrência na natureza e, entre os principais BMRs derivados de fungos,
estão o β-glucano e α-mananas (LEUNG et al., 2006).
Segundo Zhang et al. (2007), os cogumelos têm sido avaliados
quanto
a suas funções nutricionais e também medicinais, e os polissacarídeos
presentes no corpo de frutificação são as substâncias mais reconhecidas por
possuírem atividade antitumoral e imunomoduladora. Porém, apesar de o
processo de isolamento, caracterização e atividade antitumoral desses
polissacarídeos ter sido bastante investigado nas últimas três décadas, a
relação entre a atividade antitumoral e a composição química e estrutural
desses componentes ativos ainda não são bem estabelecidas.
O basidiomiceto Agaricus blazei Murrill é um cogumelo comestível e
vem sendo produzido e consumido em grande escala como alimento e,
principalmente, como chá (MIZUNO, 1995; MENOLI et al., 2001;
DELMANTO et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; BARBISAN et al., 2002;
BELLINI et al., 2003; RODRIGUES et al, 2003; GUTERREZ et al., 2004).
Esse cogumelo possui o potencial para ser estudado como BRM em
infecções por microrganismos patogênicos, com finalidades medicinais
(BERNARDSHAW et al., 2005).
Alguns estudos também têm avaliado a utilização de substâncias
alternativas no combate à infecção por Salmonella. Lee et al. (2006)
examinaram o efeito de Schizandrae fructus contra infecção por S.
Typhimurium, em camundongos. Esses pesquisadores verificaram que a
administração do extrato metanólico de S. fructus teve efeitos marcantes na
mortalidade e no número de S. Typhimurium viáveis nas fezes dos animais
inoculados. Além disso, somente um animal do grupo que recebeu o extrato
havia morrido quatro dias após a infecção, enquanto todos os camundongos
do grupo controle sucumbiram pela infecção. Lee et al (2006) também não
detectaram sinais clínicos e danos histológicos nos animais tratados com o
extrato de S. fructus. Stefanova et al. (2007), em um estudo sobre os efeitos
imunomoduladores de cumarina, observaram redução da contagem de S.
Typhimurium no fígado e baço de camundongos, 24 horas, três e cinco dias
após a inoculação intraperitoneal da bactéria.
O presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito
imunomodulador do extrato aquoso de A. blazei em aspectos do sistema
imunológico de animais experimentais desafiados com Salmonella
Typhimurium, considerando o interesse da utilização do mesmo na profilaxia
ou terapêutica de diversas condições patológicas.
56
2 MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado nos Laboratórios de Microbiologia
de Alimentos e Patógenos Alimentares, do Departamento de Microbiologia, e
no Biotério Central, do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da
Universidade Federal de Viçosa-MG.
2.1 Camundongos
Foram utilizados camundongos albinos suíços, machos, recém-
desmamados, pesando, em média, 18 g. Todos os animais foram obtidos
das matrizes do Biotério Central da Universidade Federal de Viçosa e foram
mantidos sob temperatura e umidade constantes, com um ciclo de 12 h
escuro/luz, com acesso livre à dieta padrão para roedores (Purina, Brasil) e
água ad libitum. Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram
conduzidos de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA - Brasil).
57
2.2 Extrato do Agaricus blazei
Amostras de A. blazei desidratadas foram obtidas da Associação
dos Produtores de Cogumelo do Norte de Minas e Vale do Jequitinhonha
(APROCONOVA, Montes Claros, MG, Brasil). A metodologia de extração foi
realizada como descrito no capítulo 1, item 2.2.
2.3 Microrganismo
Esse estudo foi conduzido com S. enterica sorotipo Typhimurium, de
origem humana, isolada na fundação Ezequiel Dias (FUNED, Belo
Horizonte, MG), gentilmente cedida pelo Prof. Jacques Robert Nicoli, do
Laboratório de Ecologia e Fisiologia Microbiana, do Instituto de Ciências
Biológicas, da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB - UFMG, Belo
Horizonte, MG). A bactéria foi mantida a - 80º C em meio BHI (Infusão de
Cérebro e Coração, Oxoid) contendo glicerol 20%.
2.4 Grupos de estudo e tratamentos
Os animais receberam 0,6 mL
-1
dia
-1
de extrato aquoso de A. blazei
e 10
6
UFC mL
-1
de Salmonella Typhimurium, ambos por gavage
intragástrica. Os animais foram separados aleatoriamente em quatro grupos,
de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1 - Grupos de estudo e tratamentos
Grupos de estudo Tratamentos
1 Água (0,6 mL dia
-1
)
2
Água (0,6 mL dia
-1
) e 0,1 mL de solução salina contendo
10
6
UFC mL
-1
de S. Typhimurium
3 Extrato aquoso de A. blazei
4
Extrato aquoso de A. blazei (0,6 mL dia
-1
) e 0,1 mL de solução
salina contendo 10
6
UFC mL
-1
S. Typhimurium
58
Todos os animais foram pesados no início do experimento e uma
vez a cada semana até o término do período experimental.
2.5 Eutanásia
Os animais foram anestesiados com éter e eutanasiados no 22
º
dia
do período experimental.
2.6 Análise de translocação bacteriana
No quinto dia após o desafio microbiano e 17 dias após o início da
administração do extrato aquoso de A. blazei, os animais foram
eutanasiados e o fígado, o baço e os linfonodos mesentéricos foram
removidos assepticamente, pesados e homogeneizados em tubos de vidro
com solução salina 0,85 %. Quando necessário, foram feitas diluições
seriadas em solução salina. O plaqueamento foi realizado em ágar
MacConkey (Merck) para detecção de colônias típicas de Salmonella,
seguido de incubação a 37 ºC, por 48 h.
Com objetivo de confirmar a translocação de Salmonella para os
órgãos dos animais experimentais, as colônias típicas de Salmonella em
ágar MacConkey foram transferidas, pela técnica de plaqueamento de
réplica (MADIGAN et al., 2004), para placas de ágar BPLS (ágar verde
brilhante vermelho de fenol, lactose, sacarose, Merck). As colônicas típicas
em ágar BPLS foram transferidas para placas de ágar TSA (ágar tripticase
de soja, Oxoid) e incubadas a 37 ºC, por 48 h. Posteriormente, foi realizada
análise sorológica (soro polivalente de Salmonella, Probac, Brasil) dessas
colônias subcultivadas em ágar TSA.
59
2.7 Índice esplênico
Os baços dos animais eutanasiados, no 22
o
dia do experimento,
foram pesados, e os resultados foram expressos como peso do órgão (mg)
por unidade de peso corporal (g) (LEE et al., 2003).
2.8 Determinação de IgA secretora (IgAs) do conteúdo do intestino
delgado
Os camundongos foram eutanasiados, o intestino delgado foi
removido e os conteúdos foram retirados, pesados e diluídos em tampão
salina fosfato (PBS) na proporção de 500 mg de conteúdo intestinal para
2,0 mL de PBS, de acordo com Rodrigues et al. (2000), conforme descrito no
capítulo 1, item 2.9.
2.9 Determinação de citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-10) no soro
As concentrações de TNF-α, IFN-γ e IL-10 no soro dos animais
foram determinadas por ELISA de captura, conforme descrito no capítulo 1,
item 2.10.
2.10 Análises histopatológicas do intestino delgado, baço e fígado
A metodologia de análise foi realizada conforme descrito no capítulo
1, item 2.11.
2.11 Análises estatísticas
As análises foram realizadas conforme apresentado no capítulo 1,
item 2.12.
60
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Peso dos animais
O peso de, em média, 11 g por animal ao longo de 21 dias de
duração do experimento, não variou (P>0,05) entre os animais dos
diferentes grupos experimentais (Figura 1). Van der Meer e Bovee-
Oudenhoven (1998) também não verificaram alterações significativas no
ganho de peso em ratos desafiados com 10
9
UCF mL
-1
de S. enteritidis, ao
longo de 12 dias. Nesta pesquisa, também não foram verificados sinais de
infecção nos animais desafiados com Salmonella. Porém, em outros
trabalhos, foram encontrados resultados diferentes do reportado neste.
Bovee-Oudenhoven et al. (2003) verificaram perda de peso, como
manifestação da infecção sistêmica, em ratos desafiados com S. enteritidis e
tratados com frutooligossacarídeos. Lee et al. (2006) observaram que a
inoculação de 10
5
UFC de Salmonella, em camundongos, causou sinais
clínicos de infecção, como letargia. Portanto, a ausência de sinais de
infecção e a manutenção da taxa de ganho de peso nos animais deste
estudo indicam que o número de células de Salmonella pode não ter sido
suficiente para causar sintomas da doença, como diarréia e letargia.
Contudo, a dose de Salmonella utilizada para desafiar animais experimentais
varia entre os autores, em função da estirpe bacteriana avaliada; da espécie
61
de roedor estudada; das condições de criação dos animais, germ free ou
convencional e do BRM em estudo, entre outros (RODRIGUES et al., 1996;
VAN DER MEER e BOVEE-OUDENHOVEN, 1998; BOVEE-OUDENHOVEN
et al., 2003; LIMA-FILHO et al., 2004; SILVA et al., 2004; TEN
BRUGGENCAT et al., 2004; LEE et al., 2006).
1234
0
10
20
30
40
Dia 1
Dia 7
Dia 14
Dia 21
Grupos experimentais
Peso (g)
Figura 1 - Variações de peso dos animais submetidos aos tratamentos
experimentais, durante 21 dias. Os grupos experimentais estão
descritos na metodologia. Os dados são médias ± desvio-
padrão.
3.2 Índice esplênico
Não ocorreram variações significativas no índice esplênico (SI) dos
animais experimentais (P>0,05), mas pode-se observar que houve uma
tendência dos animais dos grupos desafiados (2 e 4) apresentarem um valor
superior aos demais, indicando que ocorreu uma resposta imunológica do
animal à Salmonella, independente da administração do extrato aquoso de
A. blazei. Alterações nos valores de SI se devem às funções
desempenhadas pelo baço, como órgão imune. O baço é um órgão linfóide,
que produz linfócitos e anticorpos como funções relacionadas ao sistema
imunológico (ROSS et al., 1993), além de agir como um filtro do sangue para
microrganismos e antígenos circulantes (SILVA et al., 2004). Bin Hafeez
62
(2003), apesar de ter encontrado efeitos imunoestimulatórios do extrato da
planta feno-grego em camundongos, como aumento da atividade fagocítica
de macrófagos, também não verificaram efeitos significativos nos valores de
SI dos animais. Com isso, pode-se inferir que o discreto aumento detectado
nos valores de SI nos animais desafiados, pode estar relacionado à resposta
fisiológica dos animais, visto que, nem sempre há a associação direta entre
aumento da imunidade, verificado por algum indicador de função
imunológica, e aumento significativo neste índice.
1234
0.0
2.5
5.0
7.5
Grupos experimentais
Índice esplênico (mg baço/g peso
corporal)
a
a
a
a
Figura 2 - Índice esplênico dos animais. Os grupos experimentais estão
descritos na metodologia. Os dados são médias ± desvio-
padrão. Nas barras que apresentam pelo menos uma mesma
letra, os tratamentos não diferem entre si, em 5% de
probabilidade, pelo Teste Tukey.
3.3 Secreção de IgAs no intestino delgado
A secreção de IgAs no intestino delgado dos camundongos não foi
afetada pela administração do extrato aquoso de A. blazei ou pelo desafio
microbiano (Figura 3). Estes resultados demonstram, portanto, não ter
ocorrido uma proteção local da mucosa dos camundongos, pois a IgA é a
classe de anticorpo predominante em muitas secreções externas e tem
muitas funções, diretas e indiretas, que servem para prevenir agentes
infecciosos, tais como bactérias e vírus, de romper a barreira mucosa
(FAGARASAN e HONJO, 2002; WOOF e MESTECKY, 2005). De acordo
63
com Bollinger et al. (2003) e Everett et al. (2004), a IgA secretora (IgAs) é
um dos principais fatores que previne a translocação bacteriana, que pode
resultar em sepse e morte no hospedeiro. O aumento na secreção de IgA
também foi relacionado com o aumento da imunidade local contra S.
Typhimurium em animais tratados com probióticos (RODRIGUES et al.,
1996; LIMA-FILHO et al., 2004; SILVA et al., 2004), um efeito que não foi
verificado nesta pesquisa.
1234
0
2500
5000
7500
10000
Grupos experimentais
IgAs total (ng) mL
-1
do conteúdo
intestinal
a
a
a a
Figura 3 - Concentração de IgAs no conteúdo do intestino delgado dos
camundongos. Os grupos experimentais estão descritos na
metodologia. Os dados são médias ± desvio-padrão. Nas barras
que apresentam pelo menos uma mesma letra, os tratamentos
não diferem entre si, em 5% de probabilidade, pelo Teste Tukey.
3.4 Secreção de citocinas séricas
Os valores de TNF-α, IFN-γ e IL-10 foram similares em todos os
animais avaliados (P>0,05). Estes resultados são diferentes dos obtidos por
Bernardshaw et al. (2005), que verificaram um aumento de citocinas MIP-2 e
TNF-α no soro de camundongos aos quais foi administrado extrato de A.
blazei. Porém, esses mesmos autores não verificaram efeito na secreção de
64
IL-10 e IL-4 nas mesmas condições experimentais. Com esses resultados,
esses pesquisadores sugeriram que o extrato deste cogumelo pode ser útil
como tratamento profilático e terapêutico contra infecções bacterianas e,
possivelmente, outras infecções.
As razões para as diferenças nos resultados encontrados neste
experimento e àqueles reportados na literatura podem ser várias, como
diferenças na forma de determinação da suposta imunoestimulação,
diferenças na metodologia de preparo do extrato do cogumelo, diferenças
nas estratégias experimentais, entre outras. Em geral, os experimentos que
visam caracterizar o potencial imunomodulador de A. blazei pela detecção
de citocinas são realizados in vitro (SORIMACHI et al., 2001; NAKAJIMA et
al., 2003; ELLERTSEN et al., 2006) e não por meio de estudos de secreção
como os realizados na presente pesquisa. Considera-se que condições in
vitro asseguram mais sensibilidade e especificidade (NAKAJIMA et al.,
2003). A via de administração do extrato de A. blazei utilizada também varia
(NAKAJIMA et al., 2003) e, como ressaltaram Grind et al. (2006), o suposto
agente responsável pelos efeitos na secreção de citocinas in vitro pode não
ser absorvido pelo intestino e, assim, não atingir a circulação sangüínea,
onde exerceria efeito. Além disso, as variações na forma de extração do A.
blazei também dificultam a comparação de resultados, sendo que, em várias
pesquisas o extrato é adquirido comercialmente e não há informações sobre
a forma em que foi produzido (BERNARDSHAW et al., 2006; ELLERTSEN et
al., 2006).
3.5 - Translocação de S. Typhimurium
Colônias típicas de S. Typhimurium foram recuperadas do fígado,
baço e MLNs dos animais desafiados nas análises conduzidas no quinto dia
após a inoculação de 10
6
UFC mL
-1
por animal (Figura 4). Esses resultados
confirmam a ocorrência de infecção por Salmonella, pois, segundo
Stefanova et al. (2007), esta infecção é caracterizada por colonização do
fígado e baço. Contudo, não ocorreu diferença significativa (P>0,05) na
translocação de Salmonella entre os animais do grupo tratado ou não com o
65
extrato aquoso de A. blazei (Figura 4). As colônias típicas de Salmonella
observadas no ágar MacConkey e que foram transferidas, pela técnica de
plaqueamento em réplica, para placas de ágar BPLS, apresentaram também
características culturais típicas dessa bactéria. Além disso, todas as
colônias, subcultivadas em ágar TSA, também, apresentaram sorologia
positiva para Salmonella.
0
1
2
3
4
5
1234
Grupos experimentais
Log UFC g
-1
Fígado
Baço
MLNs
Figura 4 - Translocação de S. Typhimurium para órgãos dos animais. Os
grupos experimentais estão descritos na metodologia. Os dados
são médias ± desvio-padrão.
Os resultados obtidos nas análises de translocação bacteriana, com
a utilização de modelos animais desafiados com Salmonella e a associação
com algum tipo prévio de tratamento supostamente profilático, são variáveis
e mesmo conflitantes entre os autores. Bovee-Oudenhoven et al. (2003)
administraram 10
9
células mL
-1
de S. enteritidis, em ratos, e observaram
aumento significativo da translocação bacteriana para fígado, baço e MLNs,
após o tratamento prévio dos animais com frutooligossacarídeos. Stefanova
et al. (2007), por outro lado, observaram um efeito profilático da
administração oral de cumarina, isolada de planta, em camundongos
desafiados intraperitonealmente com S. Typhimurium. Esses autores
verificaram uma redução da contagem bacteriana de Salmonella no fígado e
66
baço dos animais desafiados tratados com a substância. Outras variváveis,
além da utilização de estirpes, doses e rotas infecciosas diferentes, podem
ter contribuído para obtenção de resultados profiláticos aparentemente
paradoxais entre os autores.
Ainda como alternativa aos agentes antimicrobianos usuais, o uso
de probióticos também tem sido investigado quanto à prevenção de infecção
por S. Typhimurium (RODRIGUES et al., 1996; LIMA-FILHO et al., 2004;
SILVA et al., 2004).
3.6 Alterações histopatológicas
As análises morfológicas do fígado, do baço e do íleo dos animais
experimentais não indicaram diferenças entre o grupo 1, tratado apenas com
água, e o grupo 3, tratado com extrato aquoso de A. blazei. No grupo
desafiado com S. Typhimurium (grupo 2), as análises histopatológicas
evidenciaram pequenos e difusos focos de infiltrado inflamatório misto
(granulo e mononuclear) no parênquima hepático, compatíveis com
translocação (Figuras 5 A-D).
O baço dos animais desafiados (grupo 2) também apresentou
discreta hiperplasia reacional, com discreto aumento dos folículos linfóides e
dos centros germinativos. Estes resultados estão de acordo com aqueles
reportados por Lee et al. (2006) que observaram alterações histológicas nos
rins, no fígado e baço de animais desafiados com 10
5
células de S.
Typhimurium, como infiltrados de leucócitos polimorfonucleados (PMNs) no
fígado dos animais.
67
A
B
C
D
Figura 5 - Aspectos histológicos do fígado (100 X) dos animais
experimentais. A, grupo 1 (controle tratado com água); B,
grupo 2 (desafiado com S. Typhimurium); C, grupo 3 (tratado
com A. blazei) e D, grupo 4 (desafiado com S. Typhimurium
e tratado com A. blazei). As setas em B e D indicam os focos
de infiltrado inflamatório misto, difusos. Hematoxilina-eosina.
68
O tratamento com o extrato aquoso não modificou a resposta do
baço ou do fígado no grupo desafiado (Figuras 5 C e D). À semelhança do
grupo que recebeu apenas água e gavage intragástrica com Salmonella, o
íleo dos animais tratados com o extrato aquoso de A. blazei não apresentou
alterações significativas. Lee et al. (2006), por outro lado, observaram
destruição e necrose isquêmica na mucosa do intestino delgado nas
análises histopatológicas realizadas em camundongos desafiados com S.
Typhimurium.
69
4. CONCLUSÕES
O modelo animal utilizado apresentou-se adequado aos estudos dos
fenômenos biológicos propostos. O extrato aquoso de A. blazei não
promoveu imunoestimulação no modelo animal estudado, visto que não
afetou os valores das variáveis selecionadas para essa aferição, bem como
não exerceu efeito profilático na infecção por Salmonella. Não foi verificado
efeito significativo no aumento do índice esplênico dos animais desafiados
ou não-desafiados com S. Typhimurium, após administração do extrato
aquoso de A. blazei. Não ocorreu uma proteção local da mucosa intestinal
nos animais, como verificado pela ausência de diferença significativa na
secreção de IgAs no intestino delgado dos camundongos desafiados ou não-
desafiados, submetidos ao tratamento com o extrato aquoso de A. blazei. A
secreção de citocinas também não foi alterada pela administração do extrato
aquoso de A. blazei, conforme determinações das concentrações de TNF-α,
IFN-γ e IL-10 séricas. O extrato aquoso de A. blazei não foi capaz de
prevenir a infecção sistêmica nos animais desafiados com Salmonella, como
detectado pelas análises de translocação. As análises histopatológicas do
baço e do fígado dos animais apresentaram-se compatíveis com o quadro
de translocação bacteriana nos animais dos grupos desafiados com
Salmonella.
70
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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