( PDF ) Cultivo em estado sólido: modelagem e quantificação de biomassa em biorreator cilíndrico horizontal agitado

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

ESCOLA DE ENGENHARIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

Cultivo em Estado Sólido: Modelagem e

Quantificação de Biomassa em Biorreator

Cilíndrico Horizontal Agitado

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Marcus Darci Rutsatz

Porto Alegre

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

ESCOLA DE ENGENHARIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

Cultivo em Estado Sólido: Modelagem e

Quantificação de Biomassa em Biorreator

Cilíndrico Horizontal Agitado

Marcus Darci Rutsatz

Dissertação de Mestrado apresentada como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre em Engenharia

Orientador:

Prof. Dr. Argimiro Resende Secchi

Co-orientador:

Prof. Dr. Marco Antônio Zacchia Ayub

Porto Alegre

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

ESCOLA DE ENGENHARIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação Cultivo em Estado

Sólido: Modelagem e Quantificação de Biomassa em Biorreator Cilíndrico Horizontal

Agitado, elaborada por Marcus Darci Rutsatz, como requisito parcial para obtenção do Grau

de Mestre em Engenharia.

Comissão Examinadora:

Prof. Drª. Marla Azário Lansarin

Prof. Dr. Maurício Moura da Silveira

Prof. Drª. Rosane Rech

Agradecimentos

A Deus, por sempre iluminar meu caminho.

À UFRGS, instituição da qual faço parte há quase uma década, e à qual devo alguns

dos melhores momentos da minha vida.

Ao Professor Argimiro Resende Secchi, meu orientador. Como falei há alguns dias a

um colega novo no mestrado: “O Arge nunca vai te deixar na mão.” Creio que isto define bem

o que ele representou durante o trabalho.

Ao Professor Marco Antônio Zacchia Ayub, que se revelou um ótimo amigo, uma

pessoa de posições claras, sempre se preocupando com a qualidade do trabalho.

Ao Professor João Henrique Zimnoch dos Santos, do Instituto de Química, cuja

ajuda foi bem além das dúvidas sobre cromatografia.

Ao futuro engenheiro químico Wagner Bertuol Casagrande, que foi meu fiel

escudeiro durante os experimentos, enfrentando comigo os momentos de decepção e

compartilhando os de alegria.

Aos colegas do Bioteclab e do PPGEQ. Prefiro não citá-los individualmente, para

evitar cometer uma injustiça. O apoio mútuo entre os colegas é, sem dúvida, uma das

principais forças motrizes do trabalho.

A meu pai, minha mãe e minhas irmãs, que me incentivaram a cursar o mestrado.

Sem seu apoio, certamente eu não teria sequer iniciado esta jornada.

À Siomara, meu amor e companheira, o melhor motivo que tenho para querer ser

melhor. Dividimos, juntos, a experiência do mestrado, sempre ajudando um ao outro, sendo

compreensivos mesmo nos fins de semana em que não podíamos estar juntos.

Finalmente, à CAPES, pelo apoio financeiro.

Resumo

Em bioprocessos, cultivo em estado sólido (CES) pode ser definido como o cultivo

envolvendo sólidos insolúveis na ausência, ou quase, de água livre. Desta forma, o CES se

distingue dos cultivos submersos (CSm), nos quais os substratos e microrganismos

encontram-se dissolvidos ou suspensos em grande quantidade de água. Muitos aspectos

importantes de engenharia de processo ainda precisam ser desenvolvidos em CES, como a

quantificação de biomassa, a cinética de reações e as transferências de massa e energia. Neste

trabalho, estudou-se um processo de cultivo em estado sólido em biorreator de tambor agitado

utilizando um resíduo industrial fibroso de soja (RIFS) como substrato para o crescimento da

bactéria Bacillus circulans BL53.

Inicialmente, foram realizados testes de mistura utilizando corantes alimentícios para

avaliar a eficiência da homogeneização promovida pelas pás agitadoras. O teste utilizando

corantes espelha-se em outros encontrados na literatura, porém o substrato aqui utilizado tem

natureza pastosa, contra os de natureza particulada de outros trabalhos. Concluiu-se que a

homogeneização é satisfatória.

Foi realizada a estimação da biomassa no cultivo através da taxa de produção de

, analisado por cromatografia gasosa. Com o uso de um modelo de correlação, obteve-se

bons resultados para as primeiras horas de cultivo, porém os erros de estimação tornaram-se

muito grandes após 20 horas de cultivo. Este é um resultado comum também em outros

trabalhos semelhantes encontrados, já que o erro da estimação é cumulativo, e o único

parâmetro monitorado (produção de CO

) pode falhar na detecção de mudanças do

metabolismo microbiano.

Além disso, foi desenvolvido um modelo cinético, que relaciona as concentrações de

biomassa, açúcares redutores totais e acetato, além da produção de CO

, no cultivo. O acetato

é um produto metabólico com efeito bactericida. Por conseqüência deste efeito, houve queda

na contagem de células viáveis após aproximadamente 15 horas de cultivo. No geral, houve

boa correlação com dados experimentais, porém outros desenvolvimentos são necessários

para aprimorar o modelo. A produção de CO

, por exemplo, não foi bem descrita pelo

modelo. A inclusão de medições de consumo de oxigênio, uma estequiometria de reação

definida e balanços de massa e energia podem trazer melhorias significativas às predições e à

aplicabilidade do modelo.

Abstract

Solid state cultivations (SSC) may be defined as the cultivation involving insoluble

solids in the absence, or near absence, of free water. Therefore, SSC is distinguished from

submerged cultivations (SmC), where substrates and microrganisms are dissolved or

suspended in large quantities of water. Many important engineering aspects of SSC are still to

be developed, like biomass quantification, reaction kinetics, mass and energy transfers. This

work dealt with a solid state cultivation process carried out in an agitated drum bioreactor,

using an industrial fibre soybean residue (IFSR) as substrate for the growth of the bacterium

Bacillus circulans BL53.

Mixing tests were carried out in order to evaluate the efficiency of the

homogeneization promoted by the mixing paddles. Common food grade dyes were used in

these experiments, similary to other works in the literature. However, the viscous nature of

ISFR greatly differs from the particulates used in other works. Homogeneization was

concluded to be satisfactory.

Biomass was estimated through the CO

production rate, which was determined by

gas chromatography. Using a correlation model, good results were obtained for the first hours

of the cultivation, but the estimation errors became too large after 20 hours. This is a common

result also in other works, since the estimation error is cumulative, and the only monitored

parameter (CO

production) may fail the detection of metabolic changes of the microrganism.

A kinetic model of the process was also developed, relating biomass, total reducing

sugars and acetate concentrations, in addition to CO

production. Acetate is a metabolic

product which has bactericidal effect. As a consequence, viable cell count dropped after

approximately 15 hours cultivation. A general good correlation with experimental data was

obtained, but the model may be further improved. For example, the model was unable to

describe the CO

production satisfactory. The inclusion of oxygen uptake measurements, a

defined reaction stoichiometry, together with mass and energy balances may significantly

improve model predictions and applicability.

VII

Sumário

Resumo.............................................................................................................................V

Abstract...........................................................................................................................VI

Sumário ..........................................................................................................................VII

Lista de figuras..............................................................................................................IX

Lista de tabelas ..............................................................................................................X

Lista de símbolos..........................................................................................................XI

Introdução.........................................................................................................................1

Fundamentos e Revisão Bibliográfica......................................................................4

2.1 Cultivo em Estado Sólido ........................................................................................4

2.1.1 Uso de bactérias em CES................................................................................9

2.1.2 O pH em CES ...............................................................................................10

2.2 Quantificação de Biomassa em Cultivo em Estado Sólido ...................................11

2.2.1 Métodos diretos ............................................................................................13

2.2.2 Métodos indiretos - Medida de componentes da biomassa..........................14

2.2.2.1 Nitrogênio e Proteína...........................................................................15

2.2.2.2 Ácidos nucléicos..................................................................................16

2.2.2.3 Glicosamina .........................................................................................16

2.2.2.4 Ergosterol.............................................................................................17

2.2.3 Métodos indiretos – Medidas de atividade metabólica.................................18

2.2.3.1 Respirometria.......................................................................................18

2.2.3.2 Massa seca do leito ..............................................................................21

2.2.3.3 Produção de enzimas extracelulares ....................................................21

2.2.3.4 Medidas de fluorescência ....................................................................22

2.2.3.5 ATP ......................................................................................................22

2.2.3.6 Ácidos orgânicos .................................................................................23

2.2.4 Outras técnicas..............................................................................................23

2.3 Modelagem Matemática de Biorreatores para Cultivo em Estado Sólido.............24

2.3.1 Biorreatores de leito fixo ..............................................................................26

2.3.2 Biorreatores de bandejas...............................................................................30

2.4 Biorreatores de leito fluidizado .......................................................................33

2.5 Biorreatores de tambor rotatório......................................................................34

2.6 Biorreatores de Tambor Agitado .....................................................................37

2.7 Metabolismo e crescimento .............................................................................38

2.8 Estimação de biomassa através dos gases de saída .........................................43

VIII

Materiais e Métodos....................................................................................................45

3.1 Instalações e equipamentos....................................................................................45

3.2 Biorreator cilíndrico horizontal agitado (BCHA)..................................................46

3.3 Microrganismo.......................................................................................................47

3.4 Preservação da cultura ...........................................................................................47

3.5 Preparo de inóculo .................................................................................................47

3.6 Preparo do meio de cultivo ....................................................................................48

3.7 Condições do cultivo .............................................................................................49

3.8 Água do encamisamento do biorreator ..................................................................49

3.9 Quantificação de biomassa ....................................................................................50

3.10 pH do meio de cultivo..........................................................................................50

3.11 Análises do extrato aquoso ..................................................................................51

3.11.1 Preparo do extrato aquoso ..........................................................................51

3.11.2 Açúcares redutores......................................................................................51

3.11.3 Acetato........................................................................................................51

3.12 Medição da umidade relativa do ar de saída do biorreator..................................52

3.13 Análise de umidade do meio de cultura...............................................................52

3.14 Análise do CO

liberado no cultivo .....................................................................52

3.14.1 Análise por Cromatografia Gasosa.............................................................52

3.14.2 Calibração da medida de CO

no CG.........................................................53

3.14.3 Análise de CO

e O

em analisador de gases..............................................53

3.15 Testes de mistura no biorreator............................................................................54

3.16 Estimação de biomassa através da produção de CO

..........................................55

3.17 Modelagem do crescimento microbiano..............................................................57

3.18 Resolução dos modelos e estimação de parâmetros............................................57

3.19 Seleção e estimação de parâmetros......................................................................58

Resultados e Discussão............................................................................................60

4.1 Calibração da medida de CO

no cromatógrafo a gás ...........................................60

4.2 Testes de mistura ...................................................................................................61

4.3 Temperatura da água de encamisamento...............................................................63

4.4 Umidade do leito ao longo dos cultivos ................................................................64

4.5 Observações gerais durante os cultivos .................................................................65

4.6 pH do meio de cultivo............................................................................................66

4.7 Quantificação de biomassa por contagem em placas ............................................67

4.8 Açúcares Redutores ...............................................................................................70

4.9 Modelagem do crescimento microbiano................................................................71

4.10 Estimação da biomassa através da taxa de produção de CO

..............................72

4.11 Desenvolvimento de modelo cinético..................................................................75

4.12 Estimação dos parâmetros do modelo cinético....................................................77

Conclusões e Perspectivas.......................................................................................85

Referências Bibliográficas........................................................................................88

Obras Consultadas .......................................................................................................94

Apêndice A - Problemas enfrentados durante os experimentos....................96

Anexo I – Algoritmo SELEST..................................................................................100

Lista de figuras

Figura 2.1: Árvore decisória para validação de método indireto baseado em componente da

biomassa. ....................................................................................................................15

Figura 2.2: Exemplo do aumento do erro de estimação da biomassa.......................................20

Figura 2.3: Classificação dos biorreatores de CES em função das características de

agitação e aeração.......................................................................................................26

Figura 2.4: Descrição dos fenômenos de transferência de energia em biorreatores de leito

fixo tradicional e Zymotis. .........................................................................................27

Figura 2.5: Comparação entre modelos para biorreatores de bandejas. ...................................31

Figura 2.6: Esquema de biorreator de leito fluidizado. ............................................................33

Figura 2.7: Efeitos considerados em modelos de biorreatores de leito fluidizado. ..................34

Figura 2.8: Possíveis regimes de movimentação do leito em biorreatores de tambor

rotatório. .....................................................................................................................35

Figura 2.9: Efeitos considerados em modelo para biorreator de tambor rotatório. ..................35

Figura 2.10: Os vários perfis cinéticos empíricos utilizados em CES......................................40

Figura 3.1: Visões externa e interna do BCHA. .......................................................................46

Figura 3.2: Disposição inicial da fibra nos testes de mistura. ..................................................55

Figura 3.3: Descrição simplificada do algoritmo SELEST. .....................................................59

Figura 4.1: Curva de calibração obtida para análise de CO

em CG........................................60

Figura 4.2: Comparação entre as medidas de concentração de CO

(em %) obtidas pelo

cromatógrafo a gás e pelo analisador de gases...........................................................61

Figura 4.3: Aspecto do biorreator ao início e após 15 minutos no teste de mistura radial. ......62

Figura 4.4: Aspecto do biorreator ao início e após 45 minutos no teste de mistura axial. .......62

Figura 4.5: Temperatura de entrada e saída da água de encamisamento..................................64

Figura 4.6: Evolução da umidade no meio de cultivo ..............................................................65

Figura 4.7: Variação do pH ao longo dos cultivos. ..................................................................67

Figura 4.8: Evolução da biomassa ao longo dos cultivos.........................................................67

Figura 4.9: Evolução do pH e da concentração de biomassa ao longo dos cultivos. ...............68

Figura 4.10: Comparação entre concentração de biomassa e de ácido acético. .......................69

Figura 4.11: Comparação entre concentração de biomassa e de açúcares redutores................71

Figura 4.12: Ajuste dos dados de biomassa ao modelo logístico. ............................................72

Figura 4.13: Exemplo de cromatograma obtido na análise de CO

no ar de saída do

biorreator. ...................................................................................................................72

Figura 4.14: Taxa de produção de CO

. ...................................................................................73

Figura 4.15: Resultados da estimação de biomassa a partir da taxa de produção de CO

para três experimentos................................................................................................74

Figura 4.16: Predições do modelo desenvolvido em comparação com os dados

experimentais..............................................................................................................81

Figura 4.17: Predições do modelo com relação à produção de CO

. .......................................82

Figura 4.18: Estimação de biomassa através dos parâmetros

XCO

m do modelo

cinético. ......................................................................................................................83

Figura A.1: Curva de porcentagem de CO

no ar de saída do biorreator apresentando efeito

da variação da vazão de ar..........................................................................................97

Figura A.2: Aspecto de colônias colabadas de Bacillus circulans BL53. ................................99

Lista de tabelas

Tabela 2.1: Comparação entre CES e CSm................................................................................6

Tabela 2.2: Algumas aplicações de CES. ...................................................................................7

Tabela 3.1: Composição do Luria Broth...................................................................................47

Tabela 3.2: Composição do RIFS.............................................................................................48

Tabela 3.3: Composição do meio mineral................................................................................48

Tabela 3.4: Composição do meio PCA utilizado......................................................................50

Tabela 3.5: Modelos cinéticos de crescimento em CES ...........................................................57

Tabela 4.1: Parâmetros do modelo cinético presentes nos balanços de biomassa, açúcares

redutores e acetato. .....................................................................................................78

Tabela 4.2: Parâmetros estimados para o modelo cinético.......................................................79

Tabela 4.3: Efeito dos parâmetros sobre as saídas do modelo cinético....................................79

Tabela 4.4: Matriz de correlação para os parâmetros estimados do modelo cinético ..............80

Tabela 4.5: Parâmetros

XCO

m estimados para o modelo cinético. .............................81

Lista de símbolos

Símbolo Unidade Significado

A................g

-1

.............. Taxa para reação enzimática de hidrólise de polissacarídeos

.............m

.................. Área de troca convectiva de calor entre leito e headspace do

biorreator

.............m

.................. Área de troca convectiva de calor entre leito e parede do biorreator

Ac..............g

-1

............ Concentração de acetato

.............m

.................. Área de troca convectiva de calor entre parede e headspace do

biorreator

.............m

.................. Área de troca convectiva de calor entre parede do biorreator e o

exterior

...............m

.................. Área superficial do leito

...............m

-1

................. Área da interface ar/biofilme por unidade de volume do biorreator

...............[adim]............ Constante da equação de Hougen-Watson

b ................°C .................. Parâmetro de sensibilidade da taxa de crescimento à mudança de

temperatura

Bi...............[adim]............ Número de Biot

...............K

-1

................. Constante empírica da equação de Ratkowsky

...............K

-1

................. Constante empírica da equação de Ratkowsky

C ..........g

CO2

-1

.......... Concentração de CO

C ..........L

CO2

-1

....... Concentração de CO

no ar de entrada

out

C ..........L

CO2

-1

....... Concentração de CO

no ar de saída

C ...........g

-1

............ Concentração de O

C ............g

gás

-1

........ Concentração de O

na fase gás

C ...........L

-1

......... Concentração de O

no ar de entrada

out

C ...........L

-1

......... Concentração de O

no ar de saída

............g

-1

............ Concentração de O

no biofilme

............g

gás

-1

........ Concentração de O

no headspace entre bandejas

............g

-1

............ Concentração de O

no leito

............J.g

-1

......... Calor específico do ar

XII

............J.g

-1

......... Calor específico médio do leito

............J.g

-1

......... Calor específico da fase gasosa

............J.g

-1

......... Calor específico parede do biorreator

.............J.g

-1

......... Calor específico das partículas sólidas

VAP

.........J.g

-1

......... Calor específico do vapor de água

............J.g

-1

......... Calor específico da água

VAP

...........g

-1

............. Concentração de vapor de água nos poros do leito

CPR...........g

CO2

-1

..... Taxa de produção de CO

.............g

-1

............. Concentração de água no leito

...........m

-1

............. Difusividade efetiva do O

nos poros do leito

VAP

D ..........m

-1

............. Difusividade efetiva do vapor de água no leito

..............J.mol

-1

........... Energia de ativação para o decaimento (morte ou inativação)

celular

..............J.mol

-1

........... Energia de ativação para o crescimento celular

f .................K

-1

................. Coeficiente linear na aproximação à equação de Antoine.

F................g.h

-1

............... Vazão de ar

..............L.h

-1

............... Vazão de entrada de ar

out

.............L.h

-1

............... Vazão de saída de ar

..............g.h

-1

............... Vazão de água (entrando ou saindo)

∆G

...........J.mol

-1

........... Variação de energia livre para inativação celular

h ................J.h

-1

-2

-1

... Coeficiente de troca convectiva de calor

H ...............J..................... Entalpia

..............m ................... Altura do leito

..............J.h

-1

-2

-1

... Coeficiente de troca convectiva de calor entre leito e headspace do

biorreator

..............J.h

-1

-2

-1

... Coeficiente de troca convectiva de calor entre leito e parede do

biorreator

..............J.h

-1

-2

-1

... Coeficiente de troca convectiva de calor entre parede e headspace

do biorreator

..............J.h

-1

-2

-1

... Coeficiente de troca convectiva de calor entre parede do biorreator

e o exterior

H ...........[adim]............ Constante da Lei de Henry para o O

k.................h

-1

.................. Constante de decaimento exponencial de primeira ordem

K................UFC.g

-1

.... Taxa de crescimento linear

...............(g

-1

)

-n

-1

.. Taxa de reação de inativação celular devido ao acetato

...............(g

-1

)

-p

-1

.. Taxa de reação de hidrólise de polissacarídeos

XIII

..............m.h

-1

.............. Coeficiente de transferência mássica de O

na interface ar/biofilme

...............J.h

-1

... Condutividade térmica do ar

...............J.h

-1

... Condutividade térmica média do leito

...............h

-1

.................. Velocidade específica de decaimento (morte ou inativação) celular

exp

.............[adim]............ Parâmetro empírico

...............g

-1

.............. Constante de inibição pelo substrato

................J.h

-1

... Condutividade térmica dos sólidos secos

..............g

-1

.............. Constante de Monod para o substrato S

K ...........g

-1

............ Constante de Monod para o O

...............g.m

-2

-1

......... Coeficiente de transferência de massa

L................[adim]............ Razão entre a taxa de crescimento específico no início da fase de

desaceleração e a taxa de crescimento específico na fase de

aceleração

m ...............g.UFC

-1

.... Taxa de produção/consumo para manutenção (não-associada ao

crescimento)

.............g .................... Massa do leito

.............g .................... Massa da fase gasosa

..............g .................... Massa seca do leito

m ..........g.UFC

-1

.... Velocidade específica de produção de CO

para manutenção celular

(não-associada ao crescimento)

m ...........g.UFC

-1

.... Velocidade específica de consumo de O

para manutenção celular

(não-associada ao crescimento)

M .........g.mol

-1

........... Massa molar do CO

M ..........g.mol

-1

........... Massa molar do O

n ................[adim]............ Ordem da reação de morte celular em relação ao acetato

p ................[adim]............ Ordem da reação de hidrólise de polissacarídeos em relação à

biomassa

R................J.mol

-1

..... Constante universal dos gases

r.................m ................... Coordenada radial

...............m ................... Raio do leito

................UFC.g

-1

.... Taxa de crescimento

...............J.m

-3

-1

......... Taxa de geração de energia metabólica

...........g.h

-1

............... Taxa de geração metabólica de água

r .............g

-1

....... Taxa de consumo de O

S ................g

-1

.............. Concentração de substrato

XIV

T................°C .................. Temperatura

t .................h .................... Tempo

................h .................... Instante de tempo de troca de fase de crescimento (da aceleração

rápida para a desaceleração lenta)

...............°C .................. Temperatura do ar

...............°C .................. Temperatura do leito

..............°C .................. Temperatura do ar na entrada

max

............°C .................. Temperatura máxima para crescimento

min

............°C .................. Temperatura mínima para crescimento

opt

.............°C .................. Temperatura ótima para crescimento

out

.............°C .................. Temperatura do ar na saída

...............°C .................. Temperatura da parede do biorreator

viz

.............°C .................. Temperatura da vizinhança

..............°C .................. Temperatura da água de resfriamento

V................L.................... Volume utilizado do biorreator

...............m

.................. Volume da parede do biorreator

...............m.h

-1

.............. Velocidade superficial do ar na direção vertical

v ...........L.mol

-1

.......... Volume molar do CO

v .............L.mol

-1

.......... Volume molar do O

W...............g

-1

............. Umidade do leito (em base seca)

X................UFC.g

-1

......... Concentração de biomassa

x.................m ................... Coordenada cartesiana horizontal

max

...........UFC.g

-1

......... Concentração máxima de biomassa na equação logística

...............g

-1

............. Concentração de vapor no ar do headspace

.............g

-1

............. Concentração de vapor em equilíbrio com o leito

...............g

-1

............. Concentração de vapor no ar na entrada

out

.............g

-1

............. Concentração de vapor no ar na saída

Ac/X

...........g

.UFC

-1

...... Razão de produção de acetato por biomassa formada

/OX

Y .........UFC.g

-1

...... Razão de formação de biomassa por O

consumido

/COX

Y ........UFC.g

CO2

-1

.... Razão de formação de biomassa por CO

produzido

X/P

............UFC.g

-1

........ Razão de biomassa formada por produção/consumo de

produto/substrato

Q/X

............J.UFC

-1

.......... Razão de geração de calor metabólico por biomassa formada

S/X

............g

.UFC

-1

........ Razão de consumo de substrato por biomassa formada

z.................m ................... Coordenada vertical

α................g

.UFC

-1

...... Parâmetro de proporcionalidade entre redução da concentração de

acetato e a velocidade de morte celular

∈................[adim]............ Emissividade das paredes do biorreator

ε.................[adim]............ Porosidade do leito

..............J.g

-1

................ Calor latente de evaporação da água

µ................h

-1

.................. Velocidade específica de crescimento

max

...........h

-1

.................. Velocidade específica máxima de crescimento

opt

.............h

-1

.................. Velocidade específica de crescimento microbiano sob condições

ótimas

µ ............h

-1

.................. Velocidade específica de crescimento na temperatura de referência

...............g.m

-3

.............. Massa específica do ar

...............g.m

-3

.............. Massa específica média do leito

...............g.m

-3

.............. Massa específica da parede do biorreator

...............g.m

-3

.............. Massa específica dos sólidos secos

σ................J.h

-1

-2

-4

.... Constante de Stefan-Boltzmann

Capítulo 1

Introdução

Nas últimas décadas, o crescimento populacional, com o conseqüente aumento do

consumo dos limitados recursos naturais do planeta, tem obrigado o homem a buscar

alternativas aos processos produtivos tradicionais. Estas alternativas devem-se caracterizar

pela substituição de fontes não-renováveis por renováveis, pela minimização do uso de

energia e da geração de resíduos, e pela eficiência produtiva.

Nesse contexto, os bioprocessos têm-se apresentado como uma alternativa aos

tradicionais processos químicos estudados na Engenharia Química, com a vantagem de serem

mais ecologicamente corretos e utilizarem recursos naturais renováveis.

Entretanto, a viabilidade econômica dos bioprocessos depende, a exemplo dos

processos químicos, de um entendimento da relação entre a cinética de reação e os fenômenos

de transporte associados à conversão de reagentes em produtos, tanto em micro como em

macro escala. Assim, é importante perceber o papel que engenheiros químicos, juntamente

com biólogos, devem desempenhar no desenvolvimento desses processos.

INTRODUÇÃO 2

Esta aplicação de princípios de engenharia química aos processos biológicos é

importante especialmente no caso de produtos de baixo valor agregado e grande volume de

produção, nos quais o sucesso depende de pequenos ganhos que se pode obter no processo.

Os cultivos em estado sólido (CES) se caracterizam por utilizarem substratos

insolúveis, em geral resíduos agro-industriais, e reduzida quantidade de água. Assemelham-

se, assim, aos processos fermentativos que ocorrem na natureza. Apresentam algumas

vantagens em relação aos cultivos submersos (CSm), que utilizam grande quantidade de água

e substratos mais refinados.

Por outro lado, ainda é necessário ampliar muito o desenvolvimento tecnológico dos

CES, especialmente quanto à engenharia do processo. Exatamente os aspectos de cinética de

reação e fenômenos de transporte, tão importantes para a viabilidade da produção, estão muito

pouco caracterizados para as condições de CES.

O Brasil é um dos maiores produtores agrícolas do mundo, e a agro-indústria

brasileira teve forte expansão nos últimos anos, destacando-se como grande exportadora e

geradora de renda longe dos tradicionais centros metropolitanos, levando assim dinamismo

econômico para as regiões do interior do território, outrora economicamente dormentes. Logo,

nosso país também é um importante gerador de resíduos agro-industriais, que, em geral, ainda

estão subaproveitados, por vezes configurando inclusive problemas ambientais.

Além disso, o Brasil é líder mundial na produção de produtos biotecnológicos de

grande volume, devido ao álcool combustível. Há décadas o País tem-se destacado na busca

de fontes alternativas de energia, produzidas a partir de fontes renováveis, sendo o álcool o

principal exemplo, seguido pelos recentes investimentos na produção de biodiesel.

Analisando esses argumentos, fica claro o grande potencial apresentado por nosso

país no ramo da biotecnologia industrial, em especial para os cultivos em estado sólido. Estes

processos ainda estão muito pouco desenvolvidos, mas surgem como uma alternativa muito

INTRODUÇÃO 3

promissora. Desta forma, o esforço de trabalhos como este se justifica pela necessidade de

maior entendimento dos aspectos de engenharia envolvidos nestes cultivos.

Este trabalho teve por objetivo estudar um processo de cultivo em estado sólido que

utiliza um resíduo agroindustrial como substrato para o desenvolvimento de uma bactéria do

gênero Bacillus, isolada de ambiente amazônico, produtora de enzimas de interesse comercial.

Especificamente, objetivou-se:

− estudar a transferência de massa e a dinâmica de mistura em um biorreator cilíndrico

horizontal agitado (BCHA), utilizando um substrato sólido pastoso, diferente daqueles já

estudados na literatura, que são particulados.

− desenvolver metodologia para estimação da biomassa no processo a partir da sua taxa de

produção de CO

− monitorar o comportamento de diferentes parâmetros mensuráveis durante o cultivo,

buscando o entendimento dos fenômenos físicos e químicos envolvidos no processo.

− iniciar o desenvolvimento de modelos matemáticos para descrever o processo, baseando-se

nas variáveis monitoradas nos experimentos.

Esta dissertação foi dividida em 5 capítulos, um apêndice e um anexo, sendo que esta

Introdução corresponde ao primeiro capítulo. O Capítulo 2 compõe-se de uma revisão

bibliográfica sobre cultivos em estado sólido, quantificação de biomassa e modelagem

matemática destes processos. O terceiro capítulo trata da metodologia adotada nos

experimentos em laboratório e durante a fase de modelagem do sistema, enquanto o quarto

traz os resultados obtidos e a discussão de seu significado. No Capítulo 5, são apresentadas as

conclusões do trabalho e perspectivas para trabalhos futuros. Finalmente, no Apêndice A

estão listados alguns problemas enfrentados na realização do trabalho, que prejudicaram os

resultados finais; e no Anexo I há uma informação adicional sobre a metodologia do trabalho.

Capítulo 2

Fundamentos e Revisão Bibliográfica

2.1 Cultivo em Estado Sólido

Mitchell e Lonsane (1992) já apontavam a dificuldade de se definir precisamente o

conceito de “cultivo em estado sólido”. Pandey (2003) definiu cultivo em estado sólido (CES)

como o cultivo de microrganismos em substratos sólidos insolúveis na ausência (ou quase

ausência) de água livre. Esta definição, ainda que um tanto vaga e incapaz de delimitar

fronteiras claras entre cultivos sólidos e submersos (CSm), estabelece a diferença básica entre

estes dois conceitos: a quantidade de água (Mitchell et al., 2000).

Exemplos clássicos de CES são as fermentações do pão e de alguns queijos. Já o

conceito de CSm está representado nas fermentações alcoólicas para produção de bebidas ou

álcool combustível.

Nos CES, uma matriz sólida adsorve a quantidade (limitada) de água que é fornecida

para o processo, diferentemente dos CSm, em que os substratos e microrganismos se

encontram dissolvidos ou suspensos em grande quantidade de água. Entretanto, também em

CES, o substrato deve conter umidade suficiente para sustentar o crescimento e o

2.1 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 5

metabolismo microbiano (Pandey, 2003), mas a água encontra-se fundamentalmente

adsorvida em uma matriz sólida.

O CES imita o crescimento de microrganismos na natureza em sólidos úmidos e é

considerado responsável pelo início das técnicas fermentativas na Antigüidade (Mitchell e

Lonsane, 1992).

Gervais e Molin (2003) lembram que, mesmo em CES, os microrganismos estão em

meio líquido, já que as transferências de massa ocorrem em um filme líquido que circunda os

microrganismos. Assim, em geral, três fases estão presentes nos CES (sólido, líquido e gás),

em oposição aos sistemas bifásicos (gás + líquido) do CSm. Os autores apontam ainda que

uma das principais diferenças entre CES e CSm é a possibilidade de agitação. Os cultivos

líquidos costumam ser tratados como reações em meio homogêneo, perfeitamente misturado,

enquanto a alta viscosidade do meio no CES reduz a possibilidade de agitação, já que as

tensões de cisalhamento originadas poderiam danificar o microrganismo.

Múltiplos termos já foram utilizados na literatura em referência a cultivos em estado

sólido, p.ex.: fermentação em meio sólido, fermentação em fase sólida, processo em estado

sólido, fermentação de sólidos úmidos, fermentação semi-sólida, cultivo semi-sólido, cultura

de superfície, fermentação “koji”, entre outros (Mitchell e Lonsane, 1992).

Pandey (1994) aponta que, embora os registros da utilização de CES venham desde a

Antigüidade, na fabricação de pães, queijos e koji (alimento fermentado típico do Extremo

Oriente), os processos em meio sólido foram completamente negligenciados no Ocidente a

partir da década de 1940, em benefício dos processos submersos. O autor afirma ainda que

não houve uma razão clara para esta opção, mas talvez tenha sido decorrência do sucesso da

produção da penicilina em CSm. Conforme Mitchell e Lonsane (1992), não foi realizada

nenhuma comparação entre os aspectos econômicos das duas técnicas ao se optar pelo

desenvolvimento em CSm. Pandey (1994) complementa que, nas décadas seguintes, poucos

2.1 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 6

trabalhos foram realizados em CES, até que na década de 1980 ressurgiu o interesse por estes

processos.

A Tabela 2.1 apresenta algumas diferenças importantes entre cultivos submersos e

cultivos em estado sólido.

Tabela 2.1: Comparação entre CES e CSm

Cultivo em estado sólido Cultivo submerso

Meio de cultivo não é fluido Meio de cultivo é fluido

Profundidade do leito costuma ser limitante Profundidade sempre é maior

Substrato sólido adsorve água, e nutrientes

consumidos provêm destes sólidos úmidos

Nutrientes estão dissolvidos na água

A formação de gradientes de concentração e

temperatura é comum nos processos

Agitação garante uniformidade do meio.

Quantidade de água é restrita, apenas

suficiente para manter os níveis de

crescimento.

A água é abundante, sem uma

padronização.

Sistema envolve três fases: sólido, líquido e

gás.

Sistema envolve apenas fases líquida e

gasosa.

Fase líquida é descontínua Fase líquida é contínua

Inóculo grande

Inóculos menores, a não ser que o processo

demande.

Bactérias e leveduras crescem aderindo-se

às partículas de substrato

Células ficam uniformemente distribuídas

no líquido em culturas agitadas.

Exemplos: pão, queijos Exemplos: bebidas alcoólicas

Fonte: Adaptado de Mitchell e Lonsane, 1992.

Vários processos de cultivo em estado sólido têm sido pesquisados e desenvolvidos.

As aplicações são bastante diversificadas, indo das de baixa tecnologia, como o aumento de

valor nutricional e produção de biomassa, e chegando até algumas de alta tecnologia como

produção de enzimas, compostos orgânicos e antibióticos. Os tipos de resíduos agroindustriais

utilizados também são extremamente diversificados. A Tabela 2.2 apresenta algumas

aplicações desenvolvidas de CES.

2.1 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 7

Tabela 2.2: Algumas aplicações de CES.

Aplicação/Produto Substrato Microrganismo Referência

Enriquecimento

protéico

Palha de trigo

Trichoderma reesei

e Endomycopsis

fibuliger

Laukevics et al.

(1984)

Amiloglucosidase

Farelo de trigo e farinha

de milho

Aspergillus niger Ghildyal et al. (1985)

Celulase Farelo de trigo

Trichoderma reesei

e Sporotrichum

cellulophilum

Kim et al. (1985)

Delignificação

Madeira de vidoeiro

(bétula)

Phanerochaete

chrysosporium

Mudgett e Paradis

(1985)

α-amilase Farelo de trigo

Bacillus

licheniformis

Lonsane e Ramesh

(1990)

Delignificação Palha de trigo

Trametes versicolor

e Pleurotus ostreatus

Valmaseda et al.

(1991)

Etanol

Meio líquido adsorvido

em bagaço de cana

Schwanniomyces

castellii

Saucedo-Castañeda et

al. (1992a)

Protease Farelo de trigo Aspergillus niger

Padmanabhan et al.

(1993)

β-galactosidade

Soro de leite

desproteinado adsorvido

em grits de milho ou

farelo de trigo

Kluyveromyces lactis

Becerra e González

Siso (1996)

Inulinase

Farelos de arroz e trigo,

bagaço de côco e farinha

de milho

Staphylococcus sp. e

Kluyveromyces

marxianus

Selvakumar e Pandey

(1999)

Ácido giberélico

Meio líquido adsorvido

em amberlite

Gibberela fujikuroi Gelmi et al. (2002)

Ácido cítrico Bagaço de mandioca Aspergillus niger Prado et al. (2004)

Xilanase Fibra de soja Bacillus coagulans Heck et al. (2005)

Robinson et al. (2001) afirmam que o CES tem potencial para, no futuro, substituir

com vantagens o CSm na produção de metabólitos secundários.

Vários trabalhos apontam vantagens na utilização de CES em comparação a CSm

(Mitchell e Lonsane, 1992; Lonsane, 1994; Raimbault, 1998), como:

2.1 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 8

− utilização de substratos mais baratos (que não precisam ser solúveis), em geral, resíduos

agro-industriais;

− como a atividade de água (Aw) é mais baixa que em CSm, há menor risco de

contaminação, reduzindo a necessidade de condições assépticas (por vezes o substrato sequer

é esterilizado), e também a necessidade de mão-de-obra especializada;

− menor gasto energético;

− menor uso de água, que leva a uma menor geração de efluentes líquidos, além de menor

volume de equipamento e, conseqüentemente, menor capital inicial;

− maior transferência de oxigênio, favorecendo processos aeróbios;

− maior concentração final de produtos, reduzindo custos do processamento downstream;

− alguns parâmetros não precisam ser controlados com o mesmo rigor que em CSm;

Ramesh e Lonsane (1991) relatam que a produção de α-amilase por Bacillus

licheniformis M27 em CES minimizou o efeito de inibição por substrato que era observado

em CSm.

Apesar de a redução de custos ser muito citada por aqueles que defendem os CES,

falta na literatura um número maior de comparações de ordem econômica entre CES e CSm

(Mitchell e Lonsane, 1992; Raimbault, 1998), ficando como exemplo o trabalho de Ghildyal

et al. (1985), sobre a produção de amiloglucosidase por Aspergillus niger. Estes autores

concluíram que, para este caso, o processo em CES era economicamente vantajoso.

Entretanto, Mitchell e Lonsane (1992) e Pandey (2003) também apontam algumas

desvantagens nos CES em comparação aos CSm:

− o cultivo em estado sólido é restrito a microrganismos que se adaptem às condições de

baixa disponibilidade de água;

2.1 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 9

− a transferência de massa e energia é menos efetiva no meio sólido, o que pode gerar

gradientes consideráveis de concentração e temperatura, que podem vir a limitar o

crescimento;

− os tempos de cultivo costumam ser mais longos;

− extratos obtidos pela lixiviação (leaching) dos produtos do cultivo costumam ser bastante

viscosos, o que pode dificultar algumas etapas downstream;

− muitos importantes aspectos científicos e de engenharia ainda estão pouco caracterizados

em CES, sendo a maior parte do trabalho ainda qualitativa ou empírica, devido às dificuldades

encontradas na quantificação de parâmetros importantes do cultivo, como biomassa;

− vários tipos de sensores (pH, concentração) utilizados em CSm são inadequados para

CES;

− ainda não há informação suficiente sobre a cinética de reações em CES e a modelagem

dos processos ainda precisa ser muito estudada;

Raimbault (1998) afirma que, devido à dificuldade em medir e controlar os

parâmetros ambientais, como é feito em CSm, os microrganismos que têm sido selecionados

para CES são mais tolerantes em relação às condições de cultivo.

2.1.1 Uso de bactérias em CES

Os trabalhos desenvolvidos em CES estão ligados principalmente à utilização de

fungos filamentosos. Este fato deve-se principalmente à idéia de que as técnicas de CES não

seriam aplicáveis ao cultivo de bactérias, devido ao maior requerimento de água por parte

destas. Além disso, fungos são capazes de formar hifas que penetram nos poros dos substratos

sólidos, enquanto bactérias, em geral, não têm esta habilidade (Lonsane e Ramesh, 1990).

Mitchell (1992a) afirma que os processos de CES envolvendo bactérias e leveduras

são poucos em número, mas são de grande importância na natureza e na indústria de

alimentos. Exemplos são a compostagem (bactérias termofílicas), a ensilagem (Lactobacilli),

2.1 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 10

a produção de alimentos orientais como o natto (Bacillus subtilis), a microflora secundária de

queijos (Lactobacillus e Propionibacterium) e a produção de pão (levedura Saccharomyces).

O desenvolvimento de processos não-tradicionais com bactérias ainda é escasso,

destacando-se processos para produção de α-amilase com bactérias do gênero Bacillus

(Ramesh e Lonsane, 1991) e a produção de inulinase por Staphylococcus sp (Pandey et al.,

2000).

2.1.2 O pH em CES

O pH do meio de cultura pode variar em resposta ao metabolismo microbiano. O

caso mais óbvio é a excreção de ácidos orgânicos, como acético ou lático, que farão o pH cair.

Por outro lado, o consumo destes mesmos ácidos presentes no meio pode causar o aumento do

pH (Prior et al., 1992).

A utilização da fonte de nitrogênio também pode causar alteração no pH. Com sais

de amônio (

NH ), o pH tende a cair durante o cultivo, já que o metabolismo deste cátion

libera um íon hidrogênio. Por outro lado, quando a fonte de nitrogênio é nitrato (

−

NO ), íons

hidrogênio do meio são consumidos para reduzir o nitrato a

−

NHR . O pH também aumenta

quando aminas orgânicas são deaminadas (Prior et al., 1992).

Normalmente, o pH em CES é determinado pela medida tomada em suspensões ou

extratos aquosos da amostra sólida (Raghavarao et al., 2003).

Conforme Prior et al. (1992), em alguns trabalhos, utiliza-se pH baixo como meio de

impedir o desenvolvimento de contaminantes, especialmente em processos onde o substrato

não é esterilizado.

Os mesmos autores afirmam ainda que o controle de pH pela adição de soluções

concentradas de ácido ou base, como comumente se faz em CSm, é impraticável em CES.

Porém é possível obter certo grau de controle de pH em CES utilizando diferentes proporções

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 11

de sais de amônio e uréia no substrato (Raimbault, 1998). O nitrato de amônio (NH

isoladamente, também tem sido utilizado para este fim. Os mesmos autores afirmam ainda

que os maiores problemas em termos de controle de pH podem-se dar em biorreatores

estáticos, onde é difícil evitar mudanças locais de pH.

Muitos trabalhos, entretanto, não apresentam nenhum tipo de preocupação com o

controle do pH. Considera-se que o próprio substrato sólido possui propriedades tamponantes,

o que eliminaria a necessidade do controle (Lonsane e Ramesh, 1990).

Prado et al. (2004), estudando a produção de ácido cítrico em CES, adicionaram

uréia ao meio para controle do pH nas primeiras 24h, quando se formava a maior parte da

biomassa. Após este período, o pH do meio começava a cair.

Considerando estes aspectos, pode-se afirmar que a dificuldade em controlar o pH

em CES configura outra desvantagem em relação aos CSm, já que a falta deste controle pode

impedir a obtenção de alguns produtos específicos, de alto valor agregado.

2.2 Quantificação de Biomassa em Cultivo em Estado

Sólido

A biomassa é um parâmetro fundamental na caracterização do crescimento

microbiano, logo, sua medida é essencial para estudos cinéticos de cultivos em estado sólido.

Entretanto, a medida direta da biomassa em CES é bastante difícil, devido à dificuldade de

separar o microrganismo do substrato, especialmente no caso de fungos filamentosos

(Mitchell, 1992b), e pela natureza insolúvel do meio de cultivo, que impede o uso de técnicas

tradicionais dos CSm, como peso-seco e turbidimetria (Madrid e Felice, 2005). A cinética e a

modelagem matemática do crescimento fúngico em CES têm recebido pouca atenção devido à

dificuldade em estimar a biomassa (Lekha e Lonsane, 1994).

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 12

Mitchell (1992b) aponta ainda a questão de como expressar a quantidade de

biomassa em CES: em termos absolutos (gramas de peso seco) ou como concentração (grama

de peso seco por grama de meio de cultivo). Esses valores irão diferir porque normalmente a

massa do meio diminui significativamente ao longo do cultivo devido à conversão do

substrato em dióxido de carbono. Além disso, há a questão de se usar base seca ou úmida para

a concentração de biomassa no meio. De qualquer forma, é importante que o método de

expressar estes valores seja cuidadosamente descrito, para que comparações possam ser feitas.

Segundo o mesmo autor, métodos ideais para estimar biomassa em CES devem

apresentar as seguintes características:

− obtenção de resultados com rapidez, de forma a permitir tomada de decisões durante o

processo.

− ser barato, tanto em termos de aparelhagem como de reagentes.

− ser simples em sua execução, já que operadores deverão precisar apenas de treinamento

básico.

− ser reprodutível, preciso e não-suscetível à interferência por componentes do substrato.

Há uma grande variedade de metodologias que são utilizadas para quantificar

biomassa, a grande maioria se destina aos cultivos envolvendo fungos filamentosos. Percebe-

se que cada trabalho pode exigir uma metodologia diferente, de acordo com o sistema

trabalhado (substrato, microrganismo).

As metodologias utilizadas se encaixam basicamente nestas categorias (Lekha e

Lonsane, 1994; Mitchell, 1992b; Raimbault, 1998):

− Métodos diretos:

− Separação direta da biomassa da matriz sólida;

− Métodos indiretos:

− Medida de algum componente da biomassa; e

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 13

− Medidas de atividade metabólica.

2.2.1 Métodos diretos

Em geral, envolvem a separação da biomassa do substrato e, por isso, dificilmente

podem ser utilizados para fungos filamentosos. No caso de culturas com bactérias e leveduras,

a quantificação de biomassa pode ser mais fácil, já que a separação de microrganismo e

substrato é mais simples (Lekha e Lonsane, 1994). Entretanto, os métodos diretos são todos

destrutivos e não-aplicáveis on-line.

Saucedo-Castañeda et al. (1992a) produziram etanol com a levedura

Schwanniomyces castellii em meio líquido absorvido num suporte inerte de bagaço de cana

moído com granulometria de 0,3-0,8 mm. Para a quantificação de biomassa, o meio era

sonicado com água esterilizada e filtrado em peneira de 50 µm, sendo o filtrado utilizado para

contagem de células em hemocitômetro e para determinar peso seco. A granulometria

controlada do suporte inerte permitia o uso desta técnica.

Sugama e Okazaki (1979) utilizaram técnica semelhante. Para quantificação de

biomassa, o seu substrato, farinha de arroz, foi digerido com um preparado enzimático e então

filtrado. Entretanto, resíduos não-digeríveis do substrato interferiam na estimação, e este

método não é apropriado para substratos com teores consideráveis de insolúveis.

Sato et al. (1983) homogeneizaram amostras de Candida lipolytica cultivadas em

arroz. A suspensão foi filtrada para remover os sólidos e as células de levedura foram

quantificadas por contagem em placas ou hemocitômetro.

Alguns estudos levaram ao desenvolvimento de meios de cultivo modelo, nos quais é

possível recuperar totalmente a biomassa, mas cuja aplicabilidade se limita à pesquisa

laboratorial, como na calibração de métodos indiretos. Mitchell et al. (1989) utilizaram

cultivos em membranas, as quais retiam a biomassa, enquanto permitiam a passagem de

nutrientes do substrato. Weber et al. (1999) desenvolveram um meio sólido à base de κ-

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 14

carragena, o qual pode ser solubilizado com água desmineralizada, permitindo a recuperação

total da biomassa.

Estudos em escala laboratorial, utilizando placas de Petri, permitem estimar a

biomassa fúngica pela extensão linear do micélio. Smits et al. (1996) utilizaram esta medida

para validar métodos indiretos de estimação da biomassa em CES.

Para bactérias e leveduras, apesar do reduzido número de trabalhos que utilizam estes

microrganismos em CES, diversos autores concordam que os métodos de contagem em placas

são apropriados para quantificar biomassa (Mitchell, 1992b; Lekha e Lonsane, 1994;

Raimbault, 1998). Madrid e Felice (2005) classificam a contagem em placas, juntamente com

peso-seco, como métodos de referência para desenvolvimento de técnicas de estimação de

biomassa. Pirt (1975) afirma que a contagem em placas é o método mais sensível para

quantificar biomassa, e que deve-se utilizar meio rico nas placas ao invés de meio mínimo.

Cita como desvantagem do método, entretanto, erros inevitáveis de amostragem.

Mitchell (1992b) frisa que as técnicas de contagem em placas também já foram

testadas para fungos filamentosos, porém, os resultados são questionáveis, uma vez que não

há uma relação direta entre a quantidade de biomassa e o número de fragmentos de micélio

formados durante a homogeneização. Além disso, este processo levaria à morte de muitos

fragmentos de micélio. Por fim, esporos fúngicos contariam como células vivas, apesar de

estarem inativas no momento da amostragem.

2.2.2 Métodos indiretos - Medida de componentes da biomassa

No caso do cultivo de fungos, que representa a grande maioria dos trabalhos em

CES, a biomassa não pode ser estimada de forma confiável pelos métodos diretos, e por isso

foram desenvolvidas metodologias que quantificam um determinado componente do

microrganismo e relacionam à quantidade total de biomassa. Tomaselli Scotti et al. (2001)

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 15

apontam que as metodologias que se baseiam na medida de um componente da biomassa

devem satisfazer algumas condições, conforme mostrado na Figura 2.1.

Figura 2.1: Árvore decisória para validação de método indireto baseado em componente da biomassa.

Fonte: Adaptado de Tomaselli Scotti et al. (2001).

2.2.2.1 Nitrogênio e Proteína

São os componentes da biomassa de medição mais imediata. Diferentes métodos já

foram testados: Kjeldahl, Lowry e Biureto. Não é considerado um método muito apropriado,

já que a proteína presente no substrato interfere na medida, e diferentes trabalhos mostram

que o conteúdo protéico da biomassa não é constante (Mitchell, 1992b). Só é recomendado

para substratos com baixo teor de proteína. Como exemplo, há o trabalho de Carrizales et al.

(1981), que utilizaram farinha de mandioca, de baixo conteúdo protéico, suplementada com

sulfato de amônio como única fonte de nitrogênio, o que permitia separar nitrogênio orgânico

de inorgânico durante a análise.

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 16

2.2.2.2 Ácidos nucléicos

Bajracharya e Mudgett (1980) utilizaram a medida de DNA para estimar biomassa de

Aspergillus oryzae em arroz. O conteúdo inicial de DNA do substrato foi descontado das

medidas, já que pôde ser provado que o fungo não produzia DNA-ases extracelulares. Porém,

em cultivos submersos, percebeu-se que o conteúdo de DNA da biomassa do fungo caía na

fase estacionária. Assim, para o CES, os autores utilizaram a quantidade média para converter

a medida de DNA em biomassa.

Métodos baseados na determinação de DNA ou RNA, além de serem caros, só são

viáveis se o substrato não contiver quantidades significativas destes componentes, nem

interferentes (Lekha e Lonsane, 1994). Exemplos de substrato seriam alguns materiais

celulósicos. Ainda assim, não há trabalhos recentes utilizando esta técnica.

Conforme Priest (1977) bactérias do gênero Bacillus são produtoras de várias

enzimas hidrolíticas extracelulares, incluindo nucleases, enquanto o RIFS, por ser um resíduo

de componentes vegetais, certamente possui ácidos nucléicos. Estes fatos já impedem a

utilização dessa técnica neste trabalho.

2.2.2.3 Glicosamina

A N-acetilglicosamina (NAG) é o monômero da quitina (poli-N-acetilglicosamina),

componente da parede celular de fungos. A medida envolve a hidrólise química da quitina e

quantificação da glicosamina liberada (Lekha e Lonsane, 1994).

Pode ocorrer interferência na medida no caso do cultivo em resíduos agrícolas

complexos, que podem conter glicosamina em glicoproteínas. Nestes substratos, entretanto, a

quantidade de glicosamina presente deve permanecer constante (Mitchell, 1992b).

A precisão do método depende de se estabelecer um fator de conversão confiável

entre o conteúdo de glicosamina e o peso seco da biomassa. A principal desvantagem do

método é exatamente que este fator de conversão varia de acordo com o meio e as condições

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 17

de cultivo, e fatores obtidos de cultivos submersos podem não ser apropriados para o cultivo

em meio sólido. Além disso, o procedimento analítico é longo e tedioso, podendo levar até 24

horas (Lekha e Lonsane, 1994).

Ooijkaas et al. (1998) verificaram aumento no conteúdo de glicosamina em

Coniothyrium minitans, cultivado em placas de Petri, ao longo do tempo de cultivo.

Ainda assim, é o método mais comumente utilizado para estimar biomassa fúngica

em CES.

Recentemente, alguns trabalhos de modelagem em CES têm utilizado o conteúdo de

glicosamina diretamente como parâmetro de biomassa, sem fazer uso de fatores de conversão

(Smits et al., 1996; Smits et al., 1998).

Na literatura não é citado nenhum componente celular de bactérias que possa ser

utilizado como parâmetro de biomassa em CES com a mesma eficiência que a glicosamina de

fungos.

2.2.2.4 Ergosterol

Ergosterol é o esterol predominante na membrana celular de fungos. Compostos da

membrana celular são interessantes para realizar estimação de biomassa, já que costumam ser

rapidamente degradados após a morte celular e porque se assume que a área da membrana é

bem correlacionada ao volume celular. Além disso, o conteúdo de esteróis parece manter-se

aproximadamente constante na biomassa fúngica. Assim, o ergosterol é bastante utilizado

para determinar biomassa fúngica no solo, em grãos de cereais e em material em

decomposição (Olsson et al., 2003), bem como em CES (Lekha e Lonsane, 1994).

Matcham et al. (1985) compararam diferentes técnicas de estimação de biomassa

para Agaricus bisporus e afirmaram que a análise de ergosterol é mais simples e rápida do que

a de glicosamina, já que aquele pode ser separado por cromatografia líquida (HPLC) e

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 18

quantificado facilmente por espectrofotometria em UV. Além disso, afirmam ainda que o

método do ergosterol foi mais sensitivo para níveis baixos de crescimento do micélio.

Entretanto, outros trabalhos indicam que o conteúdo específico de ergosterol pode

variar muito com idade da cultura, composição do meio e condições de cultivo, tornando a

técnica inadequada (Mitchell, 1992b).

2.2.3 Métodos indiretos – Medidas de atividade metabólica

2.2.3.1 Respirometria

A respiração é o processo metabólico pelo qual os microrganismos aeróbios obtêm a

maior parte de sua energia para o crescimento, consumindo O

e produzindo CO

. Estas

atividades são, portanto, associadas ao crescimento e podem ser utilizadas para a estimação da

biomassa (Mitchell, 1992b; Raimbault, 1998).

A determinação do consumo de O

(OUR – oxygen uptake rate) e da produção de

(CPR – carbon dioxide production rate) envolve a medida da concentração destes gases

no ar de entrada e de saída do biorreator. Conhecendo-se a vazão de ar que entra e que sai,

além da quantidade de meio de cultivo contida no biorreator, obtém-se os valores de OUR e

CPR.

Tem a grande vantagem de ser uma técnica on-line e não-destrutiva (Raimbault,

1998), mas para ser utilizada na estimação de biomassa, precisa ser calibrada por algum outro

método de referência.

Conforme Mitchell (1992b), as medidas do consumo de O

ou da produção de CO

são mais poderosas quando acopladas a um modelo matemático para correlação. O termo

modelo de correlação indica um modelo que relacione a quantidade de biomassa a um

parâmetro mensurável. Modelos de correlação não são, assim, modelos de crescimento, já que

não fazem predição sobre o comportamento do parâmetro medido. A utilidade destes modelos

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 19

reside no fato de que, acompanhando-se o perfil do parâmetro medido, pode-se construir um

perfil de biomassa.

Já que CO

e O

são produto gerado e substrato consumido pelo metabolismo celular,

a correlação entre CPR ou OUR e biomassa costuma ser descrita por variantes do modelo de

Luedeking-Piret (Luedeking e Piret, 1959), considerando um termo associado ao crescimento

e outro termo de manutenção, não associado ao crescimento (Sugama e Okazaki, 1979; Sato

et al., 1983; Mitchell, 1992b), conforme as Equações 2.1 e 2.2:

CPR

COX

⋅+⋅=

(2.1)

OUR

⋅+⋅=

(2.2)

Raimbault (1998) afirma que a razão entre produção de CO

e consumo de O

chamado de quociente respiratório (RQ), pode mudar com a fase de crescimento. E, segundo

Sato et al. (1983), se o RQ não é constante, então os parâmetros do modelo de correlação

entre OUR ou CPR e biomassa também não seriam constantes, o que representa uma

limitação da técnica.

Trabalhando em CSm, Petkov e Davis (1996) desenvolveram uma taxa de consumo

de oxigênio modificada (OUR

), que levava em conta dois diferentes estados da biomassa de

Corynebacterium glutamicum: crescimento puro (RQ = 1,05) e fase de produção de L-lisina

(RQ = 2,0). A Equação 2.2 foi reescrita utilizando esta taxa modificada (Equação 2.3).

OUR

⋅











−

05,10,2

0,2

(2.3)

OUR

⋅+⋅=

(2.4)

Conforme Lekha e Lonsane (1994), o CPR sozinho falha em reconhecer o início da

fase estacionária no desenvolvimento de fungos, sendo a precisão da técnica maior nos

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 20

estágios iniciais do crescimento. De fato, o erro na estimativa tende a aumentar ao longo do

processo (Figura 2.2) pela natureza cumulativa deste erro; visto que, utilizando os modelos

apresentados, a estimativa da biomassa em qualquer instante de tempo dependerá sempre das

estimativas feitas nos instantes de tempo anteriores.

Figura 2.2: Exemplo do aumento do erro de estimação da biomassa.

A região hachurada representa o intervalo de confiança da estimação, que aumenta ao longo do tempo.

Fonte: Adaptado de Biagiola et al. (2001).

De qualquer forma, o monitoramento do consumo de O

e da produção de CO

produz uma ótima medida da atividade metabólica do microrganismo, sendo muito

interessante como ferramenta inclusive no controle do processo. Saucedo-Castañeda et al.

(1992b) desenvolveram sistema de controle para um biorreator de leito fixo, tendo como

parâmetro de controle a taxa de aeração do leito, de forma a manter a concentração de CO

ar de saída constante em níveis baixos e assim conseguir rendimentos ótimos na produção de

biomassa em todas as alturas do leito.

A concentração de oxigênio pode ser medida através de medidores específicos,

paramagnéticos ou polarográficos. Em experimentos de escala laboratorial, Ramstack et al.

(1979) e Ooijkaas et al. (1998) utilizaram cromatógrafo a gás conectado on-line ao processo,

equipado com coluna tipo peneira molecular 5Å e detector de condutividade térmica (TCD).

É possível também utilizar o método manométrico, como Kim et al. (1985), onde a amostra é

colocada em uma câmara que contém ainda uma solução alcalina. O metabolismo microbiano

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 21

irá consumir O

e liberar CO

. Este último será absorvido pela solução alcalina, gerando uma

queda de pressão na câmara, que pode ser relacionada então à OUR.

O método mais indicado para medir a concentração de CO

é um medidor por

infravermelho, por sua resposta rápida (Saucedo-Castañeda et al., 1992b). A análise por

cromatografia a gás também é viável em escala laboratorial (Ramstack et al., 1979; Saucedo-

Castañeda et al., 1992a; Ooijkaas et al., 1998). Sugama e Okazaki (1979) e Carrizales et al.

(1981) borbulharam o ar de saída do biorreator em soluções alcalinas, as quais absorviam o

e eram posteriormente tituladas para se obter a quantidade de gás carbônico liberada pelo

sistema.

É interessante notar que a maioria dos trabalhos na literatura utiliza a medição de

apenas um dos dois gases (oxigênio e gás carbônico) na estimação de biomassa.

2.2.3.2 Massa seca do leito

Terebiznik e Pilosof (1999) relacionaram biomassa à perda de massa seca do leito.

Esta relação é esperada, uma vez que, conforme Smits et al. (1996 e 1998), a perda de massa

seca do leito é diretamente proporcional à produção de CO

. Entretanto, esta técnica tem

pouca aplicabilidade para sistemas maiores que a escala laboratorial.

2.2.3.3 Produção de enzimas extracelulares

Vários autores apontam relações lineares entre a produção de determinadas enzimas

extracelulares, em geral hidrolases, e o crescimento microbiano (Mitchell, 1992b). Entretanto,

poucos trabalhos utilizam a atividade enzimática diretamente para estimar biomassa.

Matcham et al. (1985) apontam que a produção da enzima laccase por Agaricus

bisporus em CES foi proporcional à extensão do micélio ao longo de 30 dias de cultivo. Smits

et al. (1996) concluíram que as atividades de protease e xilanase de uma linhagem de

Trichoderma reesei em farelo de trigo estavam associadas ao crescimento da biomassa ao

longo das 125 horas de cultivo.

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 22

2.2.3.4 Medidas de fluorescência

Fluorescência é o resultado de um processo em três estágios que ocorre em certas

moléculas (em geral, hidrocarbonetos poliaromáticos ou heterocíclicos) chamadas de corantes

fluorescentes. O processo responsável pela fluorescência está relacionado aos níveis de

energia das moléculas e ao “salto” de um elétron de um estado de alta energia para um de

energia mais baixa, emitindo simultaneamente um fóton (Madrid e Felice, 2005).

A absorção de radiação UV por uma molécula excita um elétron a um estado de

energia mais elevado. A molécula tende a rapidamente perder este excesso de energia, por

exemplo por colisões com moléculas vizinhas. A fluorescência ocorre quando a molécula

retorna ao estado fundamental pela liberação de um fóton.

Conforme Madrid e Felice (2005), fluroescência é a técnica on-line de determinação

de biomassa mais utilizada. Pode ser utilizada in-situ nos cultivos submersos.

Hisiger e Jolicoeur (2005) utilizaram sensores de fluorescência para quantificar

NAD(P)H, triptofano e riboflavinas em cultivo submerso. As concentrações destas

substâncias puderam ser correlacionadas à concentração de biomassa.

Outra forma de utilizar a fluroescência envolve a marcação do meio com algum

corante fluorescente adicionado ao meio de cultura. Soderstrom (1977) utilizou diacetato de

fluorosceína (FDA). Esta substância não é fluorescente até ser enzimaticamente hidrolisada

por esterases. Esta técnica é, portanto, uma medida de atividade enzimática, e apenas regiões

ativas do micélio irão fluorescer. Várias culturas fúngicas foram testadas isoladamente, e uma

boa correlação pôde ser obtida entre a fluorescência, crescimento e respiração.

2.2.3.5 ATP

Assumindo que células vivas de determinado microrganismo possuam quantidade

aproximadamente constante de ATP, o qual é rapidamente perdido quando da morte celular,

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 23

esta medição pode ser um bom parâmetro para estimar biomassa. Uma forma rápida de

quantificar ATP é por bioluminescência (Madrid e Felice, 2005).

Entretanto, Mitchell (1992b) afirma que a medida de ATP no CES pode fornecer

apenas uma estimativa grosseira da biomassa, já que algumas regiões da biomassa podem

estar mais ativas que outras.

2.2.3.6 Ácidos orgânicos

Raimbault (1998) afirma que, freqüentemente, a produção de ácidos orgânicos está

associada ao crescimento. A medida pode ser efetuada pelo monitoramento do pH, por

titulação ou análise em HPLC de extratos aquosos.

Porém, não há trabalhos que utilizem esta medida diretamente como parâmetro para

estimar a biomassa.

2.2.4 Outras técnicas

Peñaloza et al. (1991) estimaram o crescimento micelial baseando-se na diferença de

condutividade elétrica entre substrato e biomassa, obtendo boa correlação e propondo um

modelo.

Auria et al. (1993) estudaram a relação entre a queda de pressão do ar soprado em

um biorreator de leito fixo e o crescimento de um fungo filamentoso. O aumento do micélio

reduz porosidade do leito, aumentando a perda de carga do ar. Foi possível criar uma relação

entre o crescimento microbiano e a queda de pressão, que é um parâmetro facilmente

mensurável on-line. Um ponto interessante da técnica é o fato de ser sensível ao início da

formação dos conídios. Sua aplicabilidade, porém, é bastante restrita.

Dubey et al. (1998) desenvolveram um método ELISA (enzyme-linked

immunosorbent assay), que quantifica a reatividade de um anti-corpo contra o micélio de

Aspergillus niger. O método foi avaliado como rápido, específico e bastante sensível.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 24

Bellon-Maurel et al. (2003), em seu artigo de revisão, apontam várias técnicas que

poderiam servir à estimação de biomassa em CES, algumas já testadas, outras apenas

idealizadas, como:

− SEM (Microscopia Eletrônica de Varredura), que permitiria acompanhar visualmente

crescimento do microrganismo.

− FT–IR (Infra-Vermelho) e FT–IR PAS (Foto-Acústico) podem ser utilizados para

quantificar determinados compostos presentes no meio, como um componente da biomassa

que possa ser relacionado ao crescimento. Conforme Lekha e Lonsane (1994), a ligação

amida das proteínas produz uma absorção característica no espectro infra-vermelho. São

utilizados on-line em CSm, mas em CES ainda demandam amostragem do meio.

− a visão artificial, com o uso de um analisador de imagens, permitiria acompanhar

crescimento dos microrganismos, e poderia ainda ser acoplada à utilização de marcadores

fluorescentes.

− sensores de aroma, como narizes artificiais (e-noses) ou cromatógrafos a gás, para

quantificar produtos voláteis associados ao crescimento.

− sensores capazes de realizar tomografia, ou seja, o mapeamento 3-D do cultivo, utilizando

ressonância magnética, por exemplo.

2.3 Modelagem Matemática de Biorreatores para Cultivo em

Estado Sólido

Mitchell et al. (2000a) revisaram os fenômenos que devem ser levados em conta no

desenvolvimento de modelos para processos de cultivo em estado sólido, dividindo-os em de

micro e macroescala.

a) Fenômenos em microescala:

− Crescimento microbiano e taxa de morte em resposta às condições ambientais.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 25

− A forma de crescimento microbiana, especialmente se o crescimento ocorrer na forma de

um micélio ou de um biofilme de organismos unicelulares.

− O efeito do crescimento microbiano sobre o ambiente, pela liberação de enzimas e

produtos, e pelo consumo de nutrientes.

− Difusão intra-partículas de compostos como O

, CO

, prótons (pH), enzimas, nutrientes

solúveis, produtos de hidrólise e do metabolismo.

− Transferência entre as regiões interparticulares e a partícula de substrato ou biomassa de

compostos como O

, CO

, água, e produtos voláteis do metabolismo.

− Destruição da partícula devido ao crescimento, se a fonte de carbono contribui à estrutura

física da partícula sólida.

b) Fenômenos em macroescala:

− Fluxo de ar para dentro e para fora do biorreator, levando energia e compostos como O

, e água.

− Se o bioreactor é operado com aeração forçada ou agitação, fluxo de ar no espaço inter-

partículas, levando energia e compostos como O

, CO

e H

− Convecção natural, difusão, e condução, que são normalmente sem importância na direção

de corrente de ar, mas podem ser importante na direção normal à corrente de ar ou na

ausência de aeração forçada.

− Condução pela parede do biorreator e resfriamento convectivo para a vizinhança, que

pode ser ar ou uma camisa de água.

− Efeitos de cisalhamento causados pela agitação dentro do biorreator, inclusive dano para o

microrganismo em si, ou para a integridade das partículas de substrato.

Os modelos apresentados na literatura utilizam várias simplificações destes

fenômenos, até porque muitos são de difícil quantificação. Os trabalhos na área têm se

preocupado principalmente com o balanço energético. Muitos ignoram os balanços de massa,

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 26

seja de substrato, seja de água, no leito. As cinéticas de crescimento e a estequiometria dos

processos também têm recebido atenção limitada.

Vários tipos de biorreatores têm sido utilizados em CES. Conforme sua construção e

operação (agitação, aeração, etc.), os modelos utilizados para descrevê-los mudam bastante. A

Figura 2.3 apresenta uma classificação simples de biorreatores para CES de acordo com as

características de agitação do leito (infreqüente ou ausente, ou contínua) e aeração (forçada ou

não-forçada).

Figura 2.3: Classificação dos biorreatores de CES em função das características de agitação e aeração.

As setas retas indicam o sentido da aeração.

Fonte: Adaptado de Mitchell et al. (2000a).

2.3.1 Biorreatores de leito fixo

Os biorreatores de leito fixo representam um dos tipos mais simples de biorreatores

para CES. A natureza estática do leito o torna próprio para o desenvolvimento de organismos

sensíveis às tensões de cisalhamento decorrentes da agitação, como os fungos. Sua

aplicabilidade em escala industrial, porém, ainda é difícil, mas boas alternativas, como o

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 27

biorreator Zymotis, têm surgido (Mitchell et al., 2000a). As dificuldades para scale-up surgem

da própria natureza estática do leito, reduzidas transferências de massa e energia, e da

compactação do substrato em leitos de grandes dimensões.

A Figura 2.4 apresenta um esquema dos fenômenos de transferência de massa e

energia comuns em biorreatores de leito fixo. A ocorrência de gradientes de temperatura no

leito é praticamente inevitável, e o grande desafio de engenharia é minimizar estes gradientes.

Figura 2.4: Descrição dos fenômenos de transferência de energia em biorreatores de leito fixo tradicional e

Zymotis.

Fonte: Mitchell et al. (2003).

No caso de leitos cilíndricos, costuma-se ignorar a condução axial, já que os

gradientes de temperatura mais pronunciados estão na direção radial, e a transferência axial se

dá principalmente pela advecção do ar. No biorreator Zymotis, onde placas resfriadoras

verticais estão colocadas paralelamente a pequena distância, para manter uma maior

homogeneidade de temperatura no leito, a condução na direção vertical é desprezível frente à

horizontal.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 28

O balanço energético macroscópico em coordenadas cilíndricas, segundo

Sangsurasak e Mitchell (1998), é dado por:

( )

Qbbzwaabb

rrz

VfCp

Cp +













∂

⋅+

























∂

⋅⋅

∂

⋅=













∂

⋅⋅⋅+⋅+













∂

⋅⋅

λρρ (2.5)

Os termos da Equação 2.5 correspondem à variação de entalpia no leito, remoção de

calor pelo ar e por evaporação de água, condução nas direções radial e axial e geração de

calor metabólico.

Conforme Mitchell et al. (2003), caso o leito seja largo o suficiente, a condução

radial pode ser insignificante para a remoção de calor, e o termo entre colchetes na Equação

2.5 pode ser eliminado.

Considera-se que o ar mantém-se saturado em vapor ao longo do leito, e o termo

f⋅λ

, presente nos balanços de massa e energia, surge desta consideração, já que a evaporação

de água aumenta o calor específico aparente do ar. Esta relação deveria ser descrita pela

equação de Antoine, mas a aproximação linear é aceitável em uma faixa de variação de

temperatura de aproximadamente 20°C, como nos cultivos (Mitchell et al., 2003).

O balanço está sujeito às seguintes condições de contorno:

Na base do leito (entrada de ar):

TTz =→=0 (2.6)

No topo do leito (saída do ar):

∂

→=

(2.7)

No centro do biorreator:

00 =

∂

→=

r (2.8)

Na parede do biorreator:

( )

−⋅=

∂

→= (2.9)

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 29

Sendo:

⋅

= (2.10)

As propriedades devem ser calculadas como médias ponderadas dos valores no ar e

no sólido:

(

)

sab

ρερερ ⋅−+⋅= 1 (2.11)

(

)

sab

kkk ⋅−+⋅= εε 1 (2.12)

(

)

(

)

(

)

sswaa

CpfCp

⋅

−

⋅

(2.13)

Para o biorreator de leito-fixo do tipo Zymotis, entretanto, este balanço deve ser feito

em coordenadas retangulares, conforme Mitchell e Meien (2000). A condução axial é

desprezada, já que as placas resfriadoras removem a maior parte do calor gerado.

( )

Qbzwaabb

VfCp

Cp +













∂

⋅=













∂

⋅⋅⋅+⋅+













∂

⋅⋅

λρρ (2.14)

Este balanço está sujeito às seguintes condições de contorno:

Na base do leito (entrada de ar):

TTz =→=0 (2.15)

No centro do espaço entre placas:

00 =

∂

→=

x (2.16)

Na superfície das placas:

( )

TTh

kLx −⋅−=

∂

⋅→= (2.17)

Os biorreatores de leito fixo, se ainda encontram dificuldade de aplicação na escala

industrial, são extremamente úteis em escala laboratorial, nas fases iniciais de

desenvolvimento de processos, podendo fornecer valiosas informações sobre cinética de

crescimento e metabolismo do microrganismo.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 30

2.3.2 Biorreatores de bandejas

Biorreatores de bandejas consistem em uma câmara, que pode ser pequena como

uma incubadora ou grande como uma sala, na qual são colocadas bandejas de substrato

inoculado. O ambiente é controlado através da temperatura e da umidade do ar que é soprado

para dentro da câmara. Constituem, portanto, sistemas não-agitados com aeração não-forçada.

Bastante simples, são empregados há séculos no Oriente na fabricação de alimentos

tradicionais (shoyu, miso). A dificuldade em automatizar o trabalho com as bandejas,

entretanto, cria uma demanda por grande quantidade de mão-de-obra (Mitchell et al., 2000a).

Conforme Mitchell et al. (2003), os primeiros modelos de biorreatores de bandejas

assumiam estado pseudo-estacionário para escrever os balanços de oxigênio ou energia no

leito. Os modelos mais recentes, de Rajagopalan e Modak (1994) e Smits et al. (1999)

consideram os balanços de massa e energia, sem assumir o estado pseudo-estacionário.

O modelo de Rajagopalan e Modak (1994) considera uma bandeja com aeração não

forçada. O fluxo de ar passa no topo da bandeja, na direção x

(Figura 2.5), e o oxigênio

difunde para dentro do leito poroso. Admite-se a existência de um biofilme de biomassa

cobrindo as partículas no leito, e o consumo de O

no biofilme foi equacionado através de

uma aproximação do estado pseudo-estacionário. A taxa de crescimento seguiu uma equação

logística, considerando ainda o oxigênio como único limitante, segundo cinética de Monod.

As equações para representar este modelo são:

∂

⋅−

∂

⋅−=

∂

2222

(2.18)

( )

OOOxa

CHCaK

222

⋅−⋅⋅−

∂

⋅=

∂

⋅∂ ε

(2.19)

(

)

XXOs

OOOxa

rYCHCaK ⋅⋅=⋅−⋅⋅

2222

ρ (2.20)

( )













−⋅⋅

⋅=

max

(2.21)

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 31

∂

(2.22)

Na Equação 2.19, a transferência de oxigênio para dentro do leito se dá por difusão,

apenas, enquanto a concentração do gás na superfície do biofilme está em equilíbrio com a

concentração nos poros seguindo a lei de Henry.

Figura 2.5: Comparação entre modelos para biorreatores de bandejas.

A – Rajagopalan e Modak (1994); B – Smits et al. (1999).

1) Difusão de O

, 2) transferência de O

entre o meio e o biofilme, 3) difusão e consumo de O

no biofilme,

4) liberação de calor metabólico, 5) condução de calor, 6) difusão de O

, 7) evaporação, 8) difusão de água,

9) condução de calor, 10) consumo de O

e produção de água e calor na reação de crescimento.

Fonte: Mitchell et al. (2003).

Conforme Mitchell et al. (2000b), assumir a existência de um biofilme na superfície

das partículas é mais apropriado para microrganismos unicelulares (bactérias e leveduras) do

que para fungos.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 32

Note-se que a porosidade do leito pode ser descrita como variável no tempo. No

trabalho em questão, um balanço semelhante foi desenvolvido para o CO

A taxa específica de crescimento máxima foi considerada dependente da temperatura

e descrita por uma equação polinomial de quinta ordem.

Nenhum balanço de água foi escrito e o balanço de energia envolvia apenas

condução e geração metabólica de calor, conforme Equação 2.23.

Qbss

Cp +

∂

⋅=

∂

⋅⋅

ρ (2.23)

As condições de contorno para o problema são:

Na superfície do leito:

= (2.24)

( )

TTh

−⋅=

∂

⋅− (2.25)

Já o modelo de Smits et al. (1999) não utiliza o conceito de biofilme (Figura 2.5) e

faz uma descrição mais simples do balanço de O

no leito (Equação 2.26), novamente

havendo apenas difusão para dentro do leito, com consumo pelo microrganismo. Apresenta,

entretanto, um avanço no sentido de levar em conta as possíveis mudanças na umidade,

incluindo um balanço de água (Equação 2.27), composto de geração metabólica de água,

variação na concentração de vapor no ar dos poros devido à variação de temperatura

(considera-se que o ar se mantém saturado) e difusão de vapor d’água nos poros. Por fim,

condução, geração metabólica de calor e evaporação de água entram no balanço entálpico

(Equação 2.28).

−

∂

⋅=

∂

(2.26)













∂

⋅−

∂

−=

∂

VAP

(2.27)

VAP

VAPWQb

∂

⋅⋅++

∂

⋅=

∂

λ (2.28)

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 33

O balanço de água, entretanto, é de necessidade duvidosa, uma vez que as

simulações mostraram que a difusão de água pode ser pouco significativa (Smits et al., 1999).

2.4 Biorreatores de leito fluidizado

Neste biorreator, as partículas de substrato são fluidizadas por ar (ou outro gás)

soprado verticalmente a uma velocidade suficientemente alta. É importante notar que este

design não é aplicável a todos os tipos de substrato, uma vez que a aplicabilidade depende das

características de fluidização das partículas (Mitchell et al., 2000a).

Este modelo consiste basicamente de uma câmara vertical, a qual é alargada na parte

superior para impedir que as partículas sejam carregadas para fora do biorreator. Na parte

inferior costuma haver um misturador, que quebra eventuais agregados de partículas que se

formam. Um esquema deste tipo de biorreator pode ser visualizado na Figura 2.6.

Figura 2.6: Esquema de biorreator de leito fluidizado.

Fonte: Mitchell et al. (2000b).

Segundo Mitchell et al. (2000a), já foram construídos biorreatores de leito fluidizado

para CES relativamente grandes, utilizados industrialmente. Entretanto, há poucos trabalhos

na literatura aberta que utilizam este tipo de equipamento.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 34

A modelagem é bastante simplificada, já que o alto fluxo de ar sobre partículas

pequenas torna a transferência de calor intensa no leito, enquanto que eventuais perdas de

umidade podem ser repostas por aspersão. A preocupação maior nos modelos são os

fenômenos intra-partícula. A Figura 2.7 apresenta de forma simplificada os efeitos

comumente considerados no desenvolvimento de modelos para biorreatores de leito

fluidizado.

A praticidade no estudo deste tipo de biorreator, pela possibilidade de utilizar

modelos mais simplificados, é contrabalançada por um aumento nos custo de operação devido

às altas taxas de aeração necessárias, o que pode tornar o processo menos interessante

(Mitchell et al., 2000a).

Figura 2.7: Efeitos considerados em modelos de biorreatores de leito fluidizado.

1 – Entrada de ar; 2 – Geração metabólica de calor; 3 – Mistura; 4 – Transferência convectiva de calor através

das paredes do biorreator; 5 – Saída de ar; 6 – Evaporação de água.

Fonte: Mitchell et al. (2000a).

2.5 Biorreatores de tambor rotatório

Os biorreatores de tambor rotatório consistem de um cilindro horizontal que gira ao

redor de seu eixo. A entrada de ar costuma ser localizada em uma das extremidades do

cilindro, e a saída na oposta. Este tipo de equipamento tem despertado interesse porque

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 35

proporciona uma agitação suave no leito, o que é muito importante quando se trabalha com

fungos filamentosos, por exemplo.

Hardin et al. (2002) estudaram a dinâmica de mistura nestes biorreatores e citaram

seis possíveis regimes de movimentação do leito, cuja ocorrência dependente da velocidade

de rotação do cilindro. Estes regimes são apresentados na Figura 2.8.

Figura 2.8: Possíveis regimes de movimentação do leito em biorreatores de tambor rotatório.

Fonte: Adaptado de Hardin et al. (2002).

A literatura apresenta modelos que dividem o espaço interno do biorreator em leito

sólido, headspace e parede (Hardin et al., 2002; Mitchell et al., 2003), conforme apresentado

na Figura 2.9.

Figura 2.9: Efeitos considerados em modelo para biorreator de tambor rotatório.

1 – Entrada de ar; 2 – Geração de calor metabólico; 3 – Transferência advectiva de calor entre leito e o ar;

4 – Evaporação de água do leito, com retirada de energia; 5 – Condução entre leito e parede do biorreator;

6 – Advecção entre ar e parede do biorreator; 7 – Perda advectiva de calor para o ambiente; 8 – Saída de ar;

9 – Mistura no leito; 10 – Mistura no ar; 11 – Homogeneidade térmica na parede do biorreator.

Fonte: Mitchell et al. (2000a).

Conforme Mitchell et al. (2003), para esta situação, o balanço de energia no leito

fica:

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 36

( )

(

)

( )

[ ]

VAPabWWbaEQbaW

abbabapbbpbpQ

CpTTCpTyyAk

TTAhTTAhr

MTd

WCpCp

⋅−−+⋅⋅−⋅⋅−

+−⋅⋅−−⋅⋅−=

⋅

⋅⋅+

(2.29)

O termo do lado esquerdo da Equação 2.29 descreve a variação de entalpia do leito.

Os termos do lado direito representam a geração de calor metabólico, as trocas convectivas do

leito com a parede do biorreator e o ar de headspace, e a remoção de calor por evaporação de

água.

O balanço de energia no ar de headspace é:

( )

(

)

( )

appapaabbaba

VAPaaEQbaW

aVAPGouta

inVAPGinin

aVAPG

TTAhTTAh

CpTyyAk

yCpCpFT

MTd

yCpCp

−⋅⋅+−⋅⋅+

+⋅⋅−⋅⋅+

+⋅+⋅⋅−

+⋅+⋅⋅=

⋅

⋅⋅+

(2.30)

Novamente, o termo do lado esquerdo descreve a variação de entalpia do sistema

considerado. Já os dois primeiros termos do lado direito representam a entrada e saída de

energia com o ar, o terceiro termo, a energia adquirida através da água evaporada do leito, e

os dois últimos contabilizam as trocas convectivas do ar com o leito e a parede do biorreator.

Na parede, considerando as trocas convectivas com o leito, o ar de headspace e ainda

com o meio externo, o seguinte balanço de energia foi escrito:

( ) ( ) ( )

eppepeappapapbbpbp

ppp

TTAhTTAhTTAh

CpV −⋅⋅−−⋅⋅−−⋅⋅=⋅⋅⋅ρ (2.31)

O balanço de água no leito, considerando evaporação e geração metabólica, é:

(

)

( )

OHaEQbaW

ryyAk

WMd

+−⋅⋅−=

⋅

(2.32)

Já o balanço de água no ar de headspace pode ser descrito pela Equação 2.33, que

leva em conta a entrada e a saída de água com o ar e a evaporação de água do leito.

(

)

( )

aEQbaWaoutinin

yyAkyFyF

yMd

−⋅⋅+⋅−⋅=

⋅

(2.33)

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 37

Hardin et al. (2002) desenvolveram um modelo que levava em conta o tipo de

agitação e o conseqüente regime de movimentação do leito (conforme Figura 2.8). Além

disso, compararam diferentes formas para descrever o comportamento do ar de headspace:

− mistura perfeita;

− considerando plug-flow;

− empregando o conceito de Central Jet Residence Time Distribution (RTD), que divide o

headspace em duas regiões: uma central de plug-flow, ao longo do eixo de rotação, e uma

zona morta junto às paredes;

Concluíram que o conceito de Central Jet RTD oferece uma alternativa mais simples

e realista para a solução do problema.

2.6 Biorreatores de Tambor Agitado

Biorreatores de tambor agitado possuem pás para agitação interna, promovendo uma

maior homogeneização dos perfis de temperatura e de concentração no leito. Apesar de seu

grande potencial para aplicação em escala industrial, têm recebido pouca atenção em termos

de modelagem para CES. Conforme atesta Mitchell et al. (2000a), apenas tambores rotatórios

têm recebido atenção, pois o tipo de movimento destes causa menor dano ao micélio de

fungos filamentosos. Entretanto, bactérias são menos sensíveis à tensão de cisalhamento

gerada pelo movimento das pás, e tambores agitados apresentam-se como uma alternativa

bastante viável neste caso. É interessante notar que vários elementos considerados na

modelagem de tambores rotatórios também são aplicáveis em tambores agitados.

Muitas vezes, biorreatores de tambor permitem a instalação de bicos aspersores de

água, além de encamisamento. Estes dispositivos, junto com a própria agitação, permitem um

melhor controle e homogeneidade da temperatura no leito (Nagel et al., 2001), através do

resfriamento evaporativo e troca convectiva nas paredes.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 38

Boa parte da modelagem fenomenológica destes biorreatores pode se basear nas

considerações aplicadas aos tambores rotatórios: três regiões homogêneas (leito, headspace e

parede) que trocam massa e energia entre si. Assim, modelos similares ao representado pelas

Equações 2.29 a 2.33 podem ser utilizados.

Pena y Lillo et al. (2001) utilizaram um modelo que assume mistura perfeita,

utilizando medições on-line (temperatura e umidade relativa do ar que entra e sai do

biorreator) para estimar o conteúdo de água do leito. O balanço de energia utilizado foi:

(

)

(

)

( ) ( )

( )

[ ]

)(

exp

bwwwvizbvizbS

inoutwinoutbVAP

ininoutoutVAPinouta

TTCpFTTTTAh

yyyyTCp

TyTyCpTTCp

kCp

−⋅⋅+−⋅∈⋅+−⋅⋅−













−⋅−−⋅⋅−

⋅−⋅⋅+−⋅

⋅−=⋅⋅

λ (2.34)

Este balanço considera geração metabólica de calor, diferenças na entalpia do gás na

entrada e na saída do biorreator, resfriamento evaporativo, trocas convectivas e radiativas, e o

último termo da equação conta por escoamento de água saindo e adição de água por aspersão

à temperatura T

. A inclusão do parâmetro empírico k

exp

foi necessária para corrigir distorções

produzidas pela consideração de homogeneidade do leito.

No mesmo trabalho, o balanço de água no leito foi expresso por:

(

)

( )

inoutwOH

yyFFr

WMd

−⋅−+=

⋅

(2.35)

Leva-se em conta, assim, a geração metabólica de água, entrada por aspersão e saída

por escoamento, evaporação e alteração no conteúdo sólido seco no biorreator.

2.7 Metabolismo e crescimento

Sendo os microrganismos os operários em ação durante um cultivo, consumindo a

matéria-prima para gerar os produtos de interesse, o conhecimento de sua cinética de

crescimento e de metabolismo torna-se importante para a modelagem matemática de

processos biotecnológicos. Entretanto, o desenvolvimento deste tipo de trabalho têm se dado à

base de equações essencialmente empíricas.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 39

Basicamente, 4 tipos de cinéticas de crescimento são utilizadas em modelagem de

CES (Mitchell et al., 2004):

− Linear

= (2.36)

onde K é a taxa de crescimento linear.

− Exponencial

⋅= µ (2.37)

onde µ é a taxa de crescimento específico.

− Logística













−⋅⋅=

max

µ (2.38)

onde X

max

é a máxima quantidade de biomassa possível.

− Duas fases (aceleração rápida e desaceleração lenta)

⋅=→< µ (2.39)

( )

[

]

XeL

ttk

⋅⋅⋅=→≥

−⋅−

µ (2.40)

onde t

é o instante de tempo de troca de fase de crescimento (da aceleração rápida

para a desaceleração lenta), L é a razão entre a taxa de crescimento específico no início da

fase de desaceleração e a taxa de crescimento específico na fase de aceleração, e k é uma

constante de decaimento exponencial de primeira ordem, a qual causa a desaceleração do

crescimento.

Essas equações de crescimento produzem curvas como as apresentadas na Figura

2.10.

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 40

Ainda segundo os mesmos autores, a maioria dos pesquisadores tem empregado

equações logísticas para descrever cinéticas de crescimento.

Além da forma da equação cinética, é importante também levar em consideração a

influência dos fatores ambientais sobre os parâmetros de crescimento. Estes fatores incluem

concentração das fontes de nutrientes (carbono e nitrogênio, p.ex.), concentração de oxigênio,

concentração de produtos, temperatura, pH e atividade de água (Mitchell et al., 2000a). A

influência ambiental comumente é incluída no valor da taxa de crescimento microbiano (µ).

Figura 2.10: Os vários perfis cinéticos empíricos utilizados em CES.

(A) exponencial, (B) logístico, (C) linear, (D) duas fases.

Fonte: Adaptado de Mitchell et al. (2004).

Diferentes propostas existem para o equacionamento desta influência. A equação

mais conhecida é a de Monod, onde um único nutriente é considerado como limitante do

crescimento:

⋅=

max

µµ (2.41)

onde µ

max

é a taxa máxima de crescimento específico, S é a concentração do nutriente

limitante e K

é a constante de saturação de Monod.

Nessa equação, caso o nutriente seja inibidor do crescimento a altas concentrações,

pode-se incluir um termo de inibição por substrato, através da constante de inibição pelo

substrato, K

(Andrews, 1968):

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 41

max

⋅=µµ (2.42)

Para a temperatura, considerada em muitos casos o principal limitante do

crescimento em CES, as propostas existentes costumam se relacionar à tradicional equação de

Arrhenius, como a equação de Hougen-Watson, utilizada por Mitchell e Meien (2000):













⋅

∆−

⋅+













⋅

−

⋅

⋅=

exp1

exp

max

µµ (2.43)

onde E

representa a energia de ativação para o crescimento celular, e ∆G

variação de energia livre para a inativação celular.

Szewczyk e Myszka (1994) dividiram a biomassa em viva e morta, incluindo um

termo de morte relacionado à temperatura.













⋅

−

⋅−













⋅

−

⋅=

expexp

µµ

(2.44)

Smits et al. (1998) cita a equação de Ratkowsky (Ratkowsky et al., 1983):

(

)

(

)

(

)

[

]

{

}

max2min1max

exp1 TTcTTcµµ −⋅−⋅−⋅⋅= (2.45)

onde T

max

e T

min

são as temperaturas máxima e mínima, além das quais teoricamente

não é possível haver crescimento, e c

e c

são parâmetros empíricos.

Sangsurasak e Mitchell (1998) propuseram as seguintes equações empíricas para

descrever o efeito da temperatura sobre a taxa de crescimento:

optopt

TT µµ =→≤ (2.46)

(

)

( )

(

)

( )













−+

−⋅

⋅













−

−+

=→≤≤

TTb

TTT

opt

max

(2.47)

max

=→≥ µTT (2.48)

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 42

onde o parâmetro b representa a sensibilidade da taxa de crescimento à mudança de

temperatura, T

opt

é a temperatura ótima para o crescimento e µ

opt

a taxa de crescimento

específico nesta temperatura.

Os efeitos de atividade de água (Aw) e pH são ainda mais complexos para

equacionar, e raramente são levados em conta nos modelos. Costumam ser deixados de lado, e

os modelos consideram que os cultivos ocorrem sem variação nestes parâmetros. Outras áreas

de estudo, como a Microbiologia de Alimentos, modelam a influência do pH no

desenvolvimento de microrganismos através de relações polinomiais (Gibson e Hocking,

1997), parabólicas (Pitt, 1993) ou lineares (Ratkowsky et al., 1982).

A combinação de efeitos sobre a taxa de crescimento é possível, mas surge a questão

de como realizar esta operação. Tipicamente, os efeitos são multiplicados, utilizando-se a

forma da Equação 2.49 (Mitchell et al., 2000a):

)()()()()()(

2max

AwfpHfTfOfXfSf ⋅⋅⋅⋅⋅⋅µ=µ (2.49)

Além disso, não se pode esquecer a própria influência do microrganismo sobre o

meio, como pela geração de calor metabólico. Este efeito deve ser considerado para os

balanços energéticos e costuma ser descrito por uma equação que o associa ao crescimento

(Sangsurasak e Mitchell, 1998):

( )

XQsQ

⋅⋅−⋅=

1 ερ (2.50)

onde ρ

é a massa específica seca do leito, ε é a porosidade do leito, e Y

Q/X

representa

a geração de calor metabólico na reação de crescimento.

Cooney et al. (1968) mostraram que a geração de calor metabólico relaciona-se

linearmente com a produção de CO

e o consumo de O

, em diferentes microrganismos (E.

coli, C. intermedia, B. subtilis, A. niger).

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 43

2.8 Estimação de biomassa através dos gases de saída

O consumo de oxigênio e produção de dióxido de carbono resultam da respiração, o

processo metabólico pelo qual microrganismos aeróbios obtém a maior parte de sua energia

para o crescimento. Sendo assim, estas atividades metabólicas estão associadas ao

crescimento e podem ser utilizadas para estimar a formação de biomassa (Raimbault, 1998).

As quantidades de CO

produzido e O

consumido podem ser quantificadas pelo

acompanhamento dos gases de saída do biorreator.

Conforme Mitchell (1992b), as medidas de CPR ou OUR são mais úteis quando

associadas à utilização de um “modelo de correlação”. A aplicação destes modelos, que

envolvem predição do crescimento através do CPR e do OUR, demanda o uso de métodos

numéricos para resolver as equações diferenciais geradas (Raimbault, 1998).

Considerando que o CO

é um produto metabólico e o O

um nutriente consumido,

costuma-se utilizar modelos do tipo Luedeking-Piret (Luedeking e Piret, 1959). Descreve-se a

produção e o consumo de substâncias pelo metabolismo microbiano utilizando uma única

equação, composta de um termo associado ao crescimento e um termo de manutenção.

Ydt

⋅+⋅=

(2.51)

ou então:

Ydt

⋅













(2.52)

Para o caso da produção de gás carbônico e consumo de oxigênio, obtém-se:

Ydt

CPR

COX

⋅+⋅==

(2.53)

Ydt

CPR

COX

⋅













+==

(2.54)

2.3 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO 44

Ydt

OUR

⋅+⋅=−=

(2.55)

Ydt

OUR

⋅













+=−=

(2.56)

As considerações do modelo assim construído são, basicamente:

§ Fluxos de entrada e de saída de ar são iguais.

§ CO

e O

não se acumulam no meio.

Koutinas et al. (2003) calcularam a CPR e a OUR, em meio líquido, por:

)(

out

CCF

CPR ⋅

−⋅

= (2.57)

)(

out

CCF

OUR ⋅

−⋅

= (2.58)

Para o meio sólido, substitui-se o volume do biorreator (V) pela massa do leito (M

que é mais representativa neste sistema.

)(

out

CCF

CPR ⋅

−⋅

= (2.59)

)(

out

CCF

OUR ⋅

−⋅

= (2.60)

A análise de gases de saída é uma técnica on-line de estimação de biomassa em CES,

e suas grandes vantagens são a natureza não-intrusiva e não-destrutiva da técnica, as

possibilidades de controlar o quociente respiratório, garantindo um nível ótimo de oxidação

do substrato, e de incorporar controles automáticos para o processo através da taxa de aeração

(Raimbault, 1998).

Capítulo 3

Materiais e Métodos

Para atingir os objetivos propostos, foram realizados alguns experimentos em

biorreator, procurando estudar a dinâmica da mistura e a relação entre crescimento do

microrganismo, produção e consumo de alguns compostos durante o cultivo.

3.1 Instalações e equipamentos

O trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Biotecnologia (BioTecLab) I e II do

Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos (ICTA) e no Laboratório de Computação da

Pós-Graduação (LACOP) do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal

do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Leituras de ensaios espectrofotométricos foram realizadas em aparelho marca

“Hitachi” modelo U-1100 (Japão). Este aparelho foi utilizado na análise de açúcares redutores

totais e na padronização do inóculo.

Equipamentos, materiais e meios de cultura foram esterilizados em autoclaves

verticais: Phoenix Equipamentos modelo AV75 (Brasil) ou Ralf Winter (Brasil).

3.2 BIORREATOR CILÍNDRICO HORIZONTAL AGITADO (BCHA) 46

Operações que demandam ambiente estéril, como o preparo de inóculo e a análise de

contagem em placa, foram realizadas em capela de fluxo marca Trox (Technik do Brasil).

3.2 Biorreator cilíndrico horizontal agitado (BCHA)

O biorreator utilizado nos experimentos é do tipo tambor horizontal agitado e está

apresentado na Figura 3.1. Fabricado por uma metalúrgica da região, a partir de projeto

desenvolvido no Laboratório, compõe-se de um corpo cilíndrico em aço inox 304, com

encamisamento que permite circulação de água para o controle de temperatura. As dimensões

do cilindro são 40cm de comprimento e 20cm de diâmetro, perfazendo um volume interno de

aproximadamente 12 litros. O volume aproximado do encamisamento é de 2,5 litros.

Há pás de agitação retas, sem inclinação, ligadas a um eixo central. Por este eixo

central entra também o fluxo de ar, que é distribuído ao longo de todo o comprimento do

cilindro. A aeração é, assim, não forçada, já que o ar não é impulsionado através do leito.

Figura 3.1: Visões externa e interna do BCHA.

Através de duas escotilhas localizadas no corpo do biorreator é possível, com uma

concha longa e esterilizada, retirar amostras do meio de cultivo.

3.3 MICRORGANISMO 47

3.3 Microrganismo

O microrganismo utilizado neste trabalho foi Bacillus circulans BL53, isolado de

ambiente amazônico e já utilizado em outros estudos no laboratório (Heck, 2001; Heck,

2005).

3.4 Preservação da cultura

Para estocagem prolongada, o microrganismo foi inicialmente cultivado em meio

Luria-Bertani (LB) por 18 horas, e 0,5 mL deste meio foi adicionado a 0,5 mL de glicerol

previamente esterilizado em tubos Eppendorf e estocado a -20°C. O microrganismo também

foi mantido em tubos de ágar inclinado contendo meio LB, a partir dos quais realizava-se a

inoculação nos experimentos.

A composição do meio LB está apresentada na Tabela 3.1.

Tabela 3.1: Composição do Luria Broth

Peptona 10,0 g.L

-1

Extrato de levedura 5,0 g.L

-1

NaCl 5,0 g.L

-1

3.5 Preparo de inóculo

O inóculo foi preparado em meio LB. O meio foi esterilizado a 121°C por 15min,

resfriado à temperatura ambiente e inoculado com Bacillus circulans BL53. O inóculo cresceu

durante 18 a 20h em incubadora orbital agitada (Nova Técnica Ind. e Com. Ltda. - Brasil) a

37°C com agitação orbital.

3.6 PREPARO DO MEIO DE CULTIVO 48

3.6 Preparo do meio de cultivo

O meio de cultivo utilizado foi o resíduo industrial fibroso de soja (RIFS),

subproduto da produção de proteína isolada de soja, que foi obtido junto a uma empresa da

região. A composição do RIFS, determinada por Heck (2001), está apresentada na Tabela 3.2.

Tabela 3.2: Composição do RIFS

Proteína 29,4%

Carboidratos 56,7%

Hemicelulose 23,5%

Celulose 16,3%

Açúcares totais 16,9%

Umidade 10,1%

Fonte: Adaptado de Heck (2001)

O preparo do meio de cultivo foi realizado de forma similar à apresentada por Heck

(2005): 800g de RIFS (granulometria média mesh 30) adicionados a 4000mL de meio

mineral. O meio foi transferido para o biorreator e o conjunto foi esterilizado a 120°C por

30min.

O meio mineral é composto de sais dissolvidos em água de acordo com a Tabela 3.3.

O meio foi resfriado até 37°C, sendo então adicionados 800mL de inóculo

padronizado à OD

620

= 1,0.

Tabela 3.3: Composição do meio mineral

MgSO

⋅7H

O 0,41 g.L

-1

CaCl

0,02 g.L

-1

1,00 g.L

-1

HPO

1,00 g.L

-1

1,00 g.L

-1

FeCl

⋅6H

O 0,05 g.L

-1

Fonte: Heck (2005)

3.7 CONDIÇÕES DO CULTIVO 49

3.7 Condições do cultivo

A agitação do biorreator foi ajustada a 4 rpm, o fluxo de água no encamisamento foi

mantido a 37°C, e a aeração foi feita com ar estéril umidificado a 37°C, a uma vazão de

4L.min

-1

. O ar foi aquecido pela passagem em uma serpentina de cobre (3mm de diâmetro

interno por 2m de comprimento) mergulhada em banho termostático a 37°C, e umidificado

pelo borbulhamento em um frasco contendo água destilada estéril, colocado dentro de uma

estufa mantida a 37°C. A mangueira de ar possuía 2 metros de comprimento dentro da estufa,

de forma a garantir a temperatura do ar, e um pequeno trecho externo (aproximadamente

20cm), que foi coberto com isolante, até o biorreator.

Em intervalos regulares, pequenas amostras (30 a 50 g) foram retiradas do biorreator

para quantificação de biomassa, determinação de pH, de umidade do meio e demais análises

off-line.

Para garantir a ausência de microrganismos contaminantes no cultivo, realizou-se

teste de Gram, e, além disso, foi observada a morfologia das colônias desenvolvidas nas

placas de contagem.

3.8 Água do encamisamento do biorreator

A água para controle de temperatura no encamisamento do biorreator foi fornecida

por um banho termostático Frigomix B (B.Braun Int. - Alemanha), mantido a 37°C. As

temperaturas de entrada e saída da água do encamisamento foram medidas automaticamente a

cada 2 minutos por 2 termorresistências Pt-100 e armazenadas em um sistema de aquisição de

dados LogBox Standard (Novus – Brasil) para coleta posterior.

3.9 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA 50

3.9 Quantificação de biomassa

A quantificação de biomassa foi realizada através da contagem em placas. Em capela

de fluxo, tomaram-se 3g da amostra do cultivo, que foram adicionados a 27mL de água

peptonada previamente esterilizada em tubo de ensaio. A mistura foi agitada em sonicador

(B.Braun Int. - Alemanha) por 3 minutos, de forma a garantir que a biomassa fosse separada

da fibra e suspensa no líquido. Deste tubo tomou-se 1mL para novo tubo com 9mL de água

peptonada, procedendo-se assim diluição seriada até 10

-6

ou 10

-7

. O plaqueamento foi feito em

triplicata em meio PCA (Plate Count Agar) pela técnica de espalhamento com alça de

Drigalski. As placas foram armazenadas em estufa a 37°C, a contagem das colônias foi feita

após 12 e 18h, e a biomassa foi expressa em termos de unidades formadoras de colônias

(UFC) por grama de meio úmido.

A composição do meio PCA utilizado está apresentada na Tabela 3.4.

Tabela 3.4: Composição do meio PCA utilizado

Peptona 5,0 g.L

-1

Extrato de levedura 2,5 g.L

-1

Glicose 1,0 g.L

-1

Ágar bacteriológico 24,0 g.L

-1

3.10 pH do meio de cultivo

O pH foi analisado em amostra do meio de cultivo ressuspendida a 10% em água

destilada (Instituto Adolfo Lutz, 1985). As medidas foram feitas em potenciômetro da marca

"Renè Graf".

3.11 ANÁLISES DO EXTRATO AQUOSO 51

3.11 Análises do extrato aquoso

3.11.1 Preparo do extrato aquoso

Seguindo a metodologia de Heck (2001), o extrato aquoso foi produzido através da

extração de componentes solúveis presentes no meio de cultivo, incluindo-se substâncias

como as enzimas hidrolíticas e açúcares redutores. Para tanto, 10g da amostra do cultivo

foram adicionados de igual quantidade de água destilada a 4°C em erlenmeyer de 125mL.

Após 30 minutos em agitador orbital Certomat MO (B.Braun Int. – Alemanha) a 240rpm, a

mistura foi centrifugada a 2.500g por 20 minutos na temperatura de 4°C em centrífuga Sygma

modelo 4K15 (Alemanha). O sobrenadante foi recolhido e congelado para posterior análise.

3.11.2 Açúcares redutores

Os açúcares redutores foram quantificados no extrato aquoso pelo método do ácido

3,5-dinitrosalicílico (DNS). Adicionaram-se 100µL de amostra a 1mL de solução de DNS,

agitou-se a mistura rapidamente e levou-se a banho de água fervente por 10 minutos. Após

resfriamento, leu-se a absorbância da amostra a 570nm (Chaplin, 1986). Curvas-padrão foram

construídas utilizando glicose.

3.11.3 Acetato

A análise de acetato foi realizada por cromatografia gasosa, com técnica adaptada de

Williams e Onwudili (2005). Utilizou-se cromatógrafo a gás marca Shimadzu modelo GC-

14B, equipado com coluna capilar Carbowax de 60m x 0,25mm e detector de chama ionizante

(FID). O gás de arraste utilizado foi H

, a 100kPa. O perfil de temperatura na coluna foi 1

minuto a 100°C; aquecimento a 5°C por minuto até 200°C; manutenção nessa temperatura por

3 minutos. O acetato era eluído em aproximadamente 6,5 minutos. O volume de amostra

injetado foi de 1µL. A calibração da medida foi realizada pela técnica de padrão externo

(Smith, 1988).

3.12 MEDIÇÃO DA UMIDADE RELATIVA DO AR DE SAÍDA DO BIORREATOR 52

3.12 Medição da umidade relativa do ar de saída do

biorreator

Para monitorar a umidade relativa e temperatura na saída do biorreator foi utilizado

um termo-higrômetro marca Center modelo 310, ligado a um computador para aquisição de

dados on-line. O sensor foi instalado no primeiro trap, logo após a saída do biorreator, o qual

foi envolvido com isolante térmico, bem como o curto trajeto até ele (alguns centímetros).

Para determinar a umidade relativa do ar de entrada, realizou-se um teste no qual o

medidor de umidade relativa e temperatura foi instalado após os umidificadores, na posição

onde estaria o biorreator. Esta umidade relativa foi considerada constante ao longo da duração

do cultivo, como foi possível verificar durante esse teste.

3.13 Análise de umidade do meio de cultura

A umidade do leito foi medida conforme método descrito em Carvalho e Jong

(2002). Tomaram-se aproximadamente 5g de amostra, que foram misturados com areia

tratada em cápsula previamente seca (mínimo 3h em estufa a 80°C) e pesada. A cápsula, após

pesada com amostra, foi levada à estufa a 80°C por 6 horas, resfriada em dessecador e

novamente pesada. Essa operação foi repetida até se obter pesagens consecutivas iguais. A

diferença entre o peso inicial e o peso seco foi atribuída à umidade da amostra.

3.14 Análise do CO

liberado no cultivo

3.14.1 Análise por Cromatografia Gasosa

O ar de saída do biorreator foi continuamente conduzido a um cromatógrafo a gás

(CG) modelo Shimadzu GC-14B, equipado com uma válvula de injeção automática marca

VICI, coluna Supelco Carboxen 1006 Plot 30m x 0,53mm, detector TCD (a 230°C). O gás de

3.14 ANÁLISE DO CO2 LIBERADO NO CULTIVO 53

arraste e referência utilizado foi hélio a 30mL.min

-1

(arraste) e 10mL.min

-1

(referência),

medidos com a coluna a 35°C. O perfil de temperatura na coluna iniciou com 6 minutos a

35°C, seguindo-se aquecimento de 25°C.min

-1

até 110°C. Esta temperatura era mantida por 3

minutos. Nessas condições, o tempo de retenção do CO

foi de aproximadamente 4 minutos.

A amostragem automática do gás de saída do biorreator foi realizada a cada 20 minutos.

Para garantir condições padronizadas do ar que era amostrado pelo CG, a saída de ar

do biorreator foi conectada a dois traps: um primeiro para reter material sólido que

eventualmente saía do biorreator e outro resfriado para condensação de água. Em seguida, o

ar passava ainda por uma coluna de sílica, que retirava a umidade ainda não condensada, de

forma a enviar apenas ar seco ao cromatógrafo.

Para quantificar o CO

no ar que entra no biorreator, necessário para calcular a taxa

de produção do gás, foram feitas análises cromatográficas do ar vindo do compressor antes e

depois do cultivo.

3.14.2 Calibração da medida de CO

no CG

A calibração do CG para a medição do CO

foi realizada pela técnica de padrão

externo (Smith, 1988), com injeção de volumes conhecidos de gás puro (Dióxido de Carbono

USP – White Martins, Brasil), utilizando-se seringa de injeção comum de cromatografia. O

volume injetado foi convertido em concentração de CO

dividindo-se pelo volume do loop do

injetor automático (280µL). Assim, o sinal gerado no cromatograma foi relacionado com a

concentração de CO

. Para obter maior precisão, as injeções foram repetidas várias vezes para

cada volume utilizado.

3.14.3 Análise de CO

e O

em analisador de gases

O ar conduzido até o CG foi também analisado utilizando-se um analisador de gases

Mocon Pac Check Model 650 (Minneapolis, EUA). Este instrumento, comumente utilizado

3.15 TESTES DE MISTURA NO BIORREATOR 54

para análise de gás em embalagens de alimentos, realiza medições simultâneas de CO

e O

A concentração do primeiro é determinada por um eletrodo infra-vermelho, e a do segundo,

por um eletrodo polarimétrico de óxido de zircônio.

As análises utilizando este aparelho foram realizadas em intervalos de

aproximadamente 1 hora, durante os cultivos.

Entretanto, o uso do analisador de gases ficou prejudicado devido à baixa resolução

das medições do aparelho, da ordem de décimos de %, enquanto que as variações na

concentração de CO

e O

durante o processo não passavam de 1%.

3.15 Testes de mistura no biorreator

Com o objetivo de obter uma avaliação qualitativa da agitação proporcionada pelas

pás do biorreator, foram realizados testes de mistura utilizando corantes alimentícios, de

forma a desenvolver trabalho semelhante aos de Nagel et al. (2001) e Schutyser et al. (2001).

Nesses trabalhos, entretanto, os substratos utilizados eram particulados (grãos de trigo), o que

diferencia este trabalho daqueles.

Utilizaram-se duas porções de 400g de RIFS com 2000mL de água. Uma foi colorida

com 0,3g de corante azul brilhante, e a outra com 0,3g de corante amarelo tartrazina. Após

esterilização a 120°C por 20min, ambas foram resfriadas até a temperatura ambiente.

Adicionaram-se mais 400mL de água a cada porção, misturando bem. Este procedimento

buscava reproduzir aquele normalmente adotado nos cultivos, sem inoculação de

microrganismo.

Dois tipos de teste de mistura foram realizados, buscando qualificar as velocidades

de mistura radial e axial.

Para avaliar a mistura radial, as porções de fibra reconstituída foram distribuídas,

sem se misturar, no sentido longitudinal dentro do biorreator. No caso da avaliação da mistura

3.16 ESTIMAÇÃO DE BIOMASSA ATRAVÉS DA PRODUÇÃO DE CO2 55

axial, as porções de fibra foram distribuídas na outra direção, conforme mostrado na Figura

3.2.

Em ambos os casos, o biorreator foi fechado e a agitação foi ajustada a 4rpm (rotação

normal utilizada nos cultivos). Em intervalos regulares, parou-se a agitação e observou-se o

grau de mistura das duas cores (azul e amarelo) dentro do biorreator. Fotografias foram

obtidas utilizando uma câmera digital Olympus C-960 Zoom.

Este teste simples forneceu dados qualitativos sobre os padrões de mistura do

biorreator.

Figura 3.2: Disposição inicial da fibra nos testes de mistura.

Esquerda: teste de mistura radial; Direita: teste de mistura axial.

3.16 Estimação de biomassa através da produção de CO

A relação entre a taxa de produção de CO

e a biomassa foi descrita por uma equação

do tipo Luedeking-Piret (Luedeking e Piret, 1959), como comumente é feito na literatura

(Sugama e Okazaki, 1979; Sato et al., 1983; Mitchell, 1992b).

CPR

COX

⋅+⋅==

(3.1)

3.16 ESTIMAÇÃO DE BIOMASSA ATRAVÉS DA PRODUÇÃO DE CO2 56

Ressalte-se que a forma apresentada pela Equação 2.54 não seria aplicável aqui, pois

os dados experimentais permitiriam a obtenção apenas de uma taxa de crescimento específica

(µ) aparente. O uso da forma que inclui a derivada da quantidade de biomassa em relação ao

tempo é mais apropriada, pois se reorganiza a Equação 3.1 para isolar a taxa de crescimento,

obtendo-se:

( )

XmCPRY

COCOX

⋅−⋅=

(3.2)

O valor da taxa de produção de CO

foi calculado conforme Koutinas et al. (2003):

)(

out

CCF

CPR ⋅

−⋅

= (3.3)

As considerações do modelo são, basicamente:

1. CO

não se acumula no meio.

2. Fluxos de entrada de ar e de saída de gás são iguais.

3. A massa do leito não se altera significativamente durante o cultivo.

A primeira consideração é bastante plausível, dada a baixa solubilidade do gás.

A segunda costuma ser utilizada na literatura e, neste trabalho, produz um erro

inferior a 2%, pois a taxa de produção de CO

é baixa ao longo de todo o cultivo, e é, ao

menos em parte, contrabalançada por consumo de O

. Medir o fluxo de gás na saída do

biorreator, neste caso, além de naturalmente impreciso seria prejudicado pela existência de

vazamentos de gás no biorreator (ver Apêndice).

A terceira consideração justifica-se novamente pela baixa produção de CO

. Ao

longo de 40 horas de cultivo, a quantidade acumulada de CO

gerado foi de aproximadamente

65g. Mesmo considerando diferentes rotas metabólicas possíveis, esta quantidade de gás

corresponderia à perda de menos de 1% da massa seca inicial do leito. Complementando isto,

as análises mostraram que a umidade do leito não se alterou significativamente ao longo do

tempo (ver Capítulo 4).

3.17 MODELAGEM DO CRESCIMENTO MICROBIANO 57

3.17 Modelagem do crescimento microbiano

Os dados de biomassa obtidos nos experimentos foram ajustados aos quatro

diferentes modelos cinéticos citados por Mitchell et al. (2004) para CES (Tabela 3.5):

Tabela 3.5: Modelos cinéticos de crescimento em CES

Tipo de modelo Forma diferencial Parâmetros a estimar

Linear

Exponencial X

⋅= µ

Logístico













−⋅⋅=

1µ

µ , X

Duas fases

( )

[ ]

XeL

ttk

⋅⋅⋅=→≥

⋅=→<

−⋅−

µ , L , k , t

Fonte: Mitchell et al. (2004)

3.18 Resolução dos modelos e estimação de parâmetros

Os modelos, constituídos por sistemas de equações diferenciais ordinárias, foram

resolvidos utilizando-se o método da retrodiferenciação (BDF) com ordem e passo variável

(Brenan et al., 1995), com tolerância relativa de 10

-5

e tolerância absoluta de 10

-6

nas

variáveis.

Para todos os modelos testados, a estimação dos parâmetros foi realizada de forma a

minimizar a soma dos quadrados dos erros de predição, utilizando o método Particle Swarm

Optimization (PSO) de busca aleatória para obtenção de soluções aproximadas, refinadas pelo

método de Levenberg-Marquardt com atualização da matriz Hessiana pela técnica de BFGS

(Edgar e Himmelblau, 1988), ambos implementados em MATLAB v.5.3. Utilizou-se uma

tolerância relativa de 10

-6

para as variáveis de decisão e para a função-objetivo.

3.19 SELEÇÃO E ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS 58

A utilização de um método de busca aleatória, nestes problemas de estimação,

justifica-se, pois os modelos, e, por conseqüência, as funções-objetivo, são relativamente

simples, mas apresentam mínimos locais, o que pode prejudicar o desempenho dos métodos

de busca multivariável e analíticos, muito dependentes de uma boa estimativa inicial.

3.19 Seleção e estimação de parâmetros

As estimativas dos parâmetros foram refinadas pelo uso do algoritmo SELEST,

desenvolvido por Secchi et al. (2006). Com base na matriz de sensibilidade do sistema, o

algoritmo calcula o efeito de cada parâmetro nas variáveis medidas e a sua independência

linear em relação aos demais parâmetros. O produto destas duas grandezas é definido como a

identificabilidade (identifiability) do parâmetro, a qual pode ser entendida como a capacidade

que se tem, com os dados experimentais disponíveis, de estimar o parâmetro com precisão.

A maior identificabilidade determina qual parâmetro será estimado em cada etapa do

processo. O algoritmo prevê critérios de parada quando as condições do sistema já não

permitirem uma estimação precisa dos parâmetros.

A Figura 3.3 apresenta uma descrição simples dos passos do algoritmo SELEST.

Uma descrição mais detalhada é fornecida no Anexo I.

3.19 SELEÇÃO E ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS 59

Figura 3.3: Descrição simplificada do algoritmo SELEST.

Modelo identificado

com np parâmetros

Estimação inicial

dos parâmetros

Cálculo das médias dos

valores experimentais e da

matriz de covariância

Matriz de

sensibilidade global

Decomposição em valores

singulares ou característicos

Cálculo do efeito do

parâmetro sobre as medidas

Seleção de

parâmetro

Estimação do

parâmetro

Índices de degradação da

predição e de correlação

dos parâmetros

Critérios de

parada

Fim

Medida de

independência linear

Índice de

identificabilidade

Sim

Não

Capítulo 4

Resultados e Discussão

4.1 Calibração da medida de CO

no cromatógrafo a gás

A Figura Erro! Fonte de referência não encontrada. mostra a curva de calibração

para a medição de CO

no CG, obtida pelo método de calibração com padrão externo, com

injeção de volumes conhecidos de gás puro. O método mostrou-se bastante reprodutível, o

que foi comprovado pelo alto coeficiente de correlação.

0 2000 4000 6000 8000 10000

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

%CO

= 1,46.10

-4

x Area + 0,232

= 0,993

(%)

Área de pico (µV.s)

Figura 4.1: Curva de calibração obtida para análise de CO

em CG.

4.2 TESTES DE MISTURA 61

Medições de CO

realizadas paralelamente no cromatógrafo e no analisador de gases

vieram a confirmar a boa qualidade da calibração feita no primeiro, conforme mostrado na

Figura 4.2.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

= 0,992

Analisador de Gases

Cromatógrafo

Figura 4.2: Comparação entre as medidas de concentração de CO

(em %) obtidas pelo cromatógrafo a gás e

pelo analisador de gases.

4.2 Testes de mistura

Nos testes de mistura, verificou-se que o biorreator possui ótima capacidade de

mistura na direção radial, sendo que em menos de 15 minutos de agitação a 4 rpm (total de 60

revoluções) não há mais diferenças de cor no leito, conforme pode ser observado na Figura

4.3.

Porém, foram identificadas zonas mortas dentro do biorreator, que não são atingidas

pelas pás e, por isso, acumulam pequena quantidade de substrato que não se mistura muito

rapidamente com o resto do leito. Estas zonas mortas localizam-se na fina camada que reveste

as paredes do biorreator, com aproximadamente 3mm de espessura e nas extremidades do

eixo. Entretanto, estima-se que estas regiões correspondam a menos de 5% do volume do

leito.

4.2 TESTES DE MISTURA 62

Figura 4.3: Aspecto do biorreator ao início e após 15 minutos no teste de mistura radial.

Já na direção axial, a mistura é mais lenta, conforme esperado devido à configuração

das pás. A Figura 4.4 mostra o aspecto interno do biorreator aós 45 minutos de agitação a 4

rpm (180 revoluções). Percebe-se que a massa está bem misturada, entretanto, as zonas

mortas, como o fundo do cilindro, ainda não se misturaram. Esta mistura mais completa só

será obtida após quase duas horas de agitação.

Figura 4.4: Aspecto do biorreator ao início e após 45 minutos no teste de mistura axial.

Estes resultados concordam com os de Nagel et al. (2000), que também perceberam

que a homogeneização na direção radial se dá muito mais rapidamente que na direção axial.

Entretanto, cabe ressaltar que a mistura completa no sistema particulado daquele trabalho se

deu muito mais rapidamente (6 revoluções em teste de mistura radial e 120 revoluções em

4.3 TEMPERATURA DA ÁGUA DE ENCAMISAMENTO 63

teste de mistura axial), já que foram usadas pás em “V” e o substrato era particulado (grãos de

trigo).

Com estes resultados, decidiu-se, a exemplo dos demais trabalhos encontrados na

literatura (Nagel et al., 2000; Heck, 2005), tratar o leito do biorreator como homogêneo, pois

a dinâmica da mistura no biorreator é mais rápida que a dinâmica de processos biológicos. O

fato da mistura axial ser mais lenta que a radial é compensado pela distribuição do ar de

entrada ao longo de toda a extensão do cilindro e pela homogeneidade inicial do biorreator.

Este resultado, entretanto, é unicamente qualitativo, já que não era possível fazer

nenhum tipo de quantificação do grau de mistura do sistema. Tentando aprimorar este

aspecto, entrou-se em contato com o Laboratório de Processamento de Sinais e Imagens

(LAPSI) da UFRGS, para avaliar a possibilidade de desenvolver um trabalho visando

quantificar o grau de mistura ao longo do tempo.

Instalando-se uma câmera com uma fonte de luz em uma das escotilhas, poder-se-

iam obter imagens em intervalos regulares, as quais seriam processadas para determinar a

freqüência de ocorrência de cada tonalidade entre o amarelo e o azul. A partir daí, seria

necessário desenvolver uma regra que determinasse o grau de mistura a partir da distribuição

de freqüência de ocorrência de cada tonalidade.

Até o momento, foi realizado apenas um teste com fotografias tiradas com uma

câmera digital comum, no qual já foi confirmada a viabilidade do trabalho.

4.3 Temperatura da água de encamisamento

As medições de temperatura da água na entrada e na saída do encamisamento do

biorreator mostraram que a camisa se mantém praticamente constante a 37°C (Figura 4.5).

Variações nas medições são atribuídas à imprecisão do instrumento. Devido ao alto fluxo de

4.4 UMIDADE DO LEITO AO LONGO DOS CULTIVOS 64

água (aproximadamente 6 L.min

-1

, correspondente a uma velocidade linear de 70 cm.s

-1

mangueira), a diferença de temperatura entre entrada e saída foi praticamente nula.

Além disso, verifica-se que não houve nenhum pico de temperatura da água. Espera-

se um pico de geração de calor metabólico no instante de máximo crescimento da biomassa

(Mitchell e Meien, 2000; Mitchell et al., 2000; Mitchell et al., 2003), o qual poderia se refletir

na temperatura da água de encamisamento, caso a transferência de calor fosse limitada.

A partir desta observação pode-se concluir que a utilização de um modelo isotérmico

para descrever o biorreator é adequada.

0 10 20 30 40 50

Temperatura (°C)

Tempo (h)

0,0

3,0x10

6,0x10

9,0x10

1,2x10

1,5x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Figura 4.5: Temperatura de entrada e saída da água de encamisamento.

Linha pontilhada: Temperatura na entrada; Linha contínua: Temperatura na saída;

Linha contínua com círculos: Biomassa

4.4 Umidade do leito ao longo dos cultivos

A umidade do leito é muito importante em CES. A Figura 4.6 apresenta os resultados

obtidos para este parâmetro durante os cultivos. A umidade do leito manteve-se estável dentro

4.5 OBSERVAÇÕES GERAIS DURANTE OS CULTIVOS 65

de uma faixa estreita, entre 85% e 88%. Algumas considerações utilizadas nos modelos

desenvolvidos baseiam-se na constância da umidade do leito.

0 5 10 15 20 25 30

Umidade (%)

Tempo (h)

Figura 4.6: Evolução da umidade no meio de cultivo

Resultados são a média de três experimentos.

4.5 Observações gerais durante os cultivos

Vários aspectos interessantes do processo puderam ser observados, de forma

basicamente qualitativa, durante os experimentos.

Ao início dos experimentos, o substrato apresentava-se como uma pasta úmida,

porém consistente. Ao longo do cultivo, entretanto, o substrato foi se tornando mais

liquefeito, apesar de o teor de umidade manter-se praticamente inalterado.

Esta alteração de aspecto do substrato pode ser explicada pela ação das enzimas

hidrolíticas (celulases, xilanases, proteases), que hidrolisaram componentes do RIFS,

reduzindo sua capacidade de retenção de água. O microrganismo Bacillus circulans BL53 é

sabidamente produtor destas enzimas (Heck, 2001 e 2005).

Conforme Mitchell et al (2000), estas alterações estruturais do substrato são comuns

em CES, e, no caso de trabalhos de modelagem do processo, pode ser necessário levar este

fato em consideração. Uma conseqüência desta alteração é a redução dos espaços vazios no

4.6 PH DO MEIO DE CULTIVO 66

meio de cultivo (porosidade), o que, segundo os mesmos autores, prejudicaria a transferência

de oxigênio.

Os extratos produzidos a partir das amostras do cultivo apresentaram certa

viscosidade, o que, segundo Mitchell e Lonsane (1992), representa inclusive uma

desvantagem comum em CES, que pode trazer dificuldades no processamento downstream.

Entretanto, Heck (2005) purificou a enzima xilanase a partir deste mesmo extrato, utilizando

procedimentos de precipitação fracionada com sulfato de amônio, cromatografia e gel-

filtração. Nenhuma menção foi feita a dificuldades encontradas devido à viscosidade do

extrato.

4.6 pH do meio de cultivo

Foi observada variação significativa no pH do meio de cultivo ao longo dos

experimentos (Figura 4.7). O inóculo, produzido em meio líquido LB, chegava ao final da

incubação com pH entre 7,5 e 8,0. Após a inoculação, o cultivo iniciava-se com pH do meio

em 6,5. Após aproximadamente 10 horas de cultivo, nas quais o pH foi estável, verificou-se

sistematicamente a queda do pH do meio para valores próximos a 5,5. Cabe ressaltar que a

natureza do substrato, sólido e de composição complexa, impede o controle do pH como

realizado em cultivos submersos (Prior et al., 1992).

4.7 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA POR CONTAGEM EM PLACAS 67

0 5 10 15 20 25 30

5,0

5,2

5,4

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

Tempo (h)

Figura 4.7: Variação do pH ao longo dos cultivos.

Resultados são a média de três experimentos.

4.7 Quantificação de biomassa por contagem em placas

Paralelamente à queda de pH, observou-se também, em todos os experimentos, que a

contagem de UFC no meio de cultivo atingia um máximo após aproximadamente 15 horas de

cultivo, e então passava a declinar, conforme se observa na Figura 4.8. Há certa variabilidade

nos resultados, mas pode-se distinguir claramente que a biomassa atingiu um valor máximo a

aproximadamente 15 horas de cultivo, passando a um declínio pouco depois.

0 5 10 15 20 25 30

0,0

4,0x10

8,0x10

1,2x10

1,6x10

2,0x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

Figura 4.8: Evolução da biomassa ao longo dos cultivos.

Resultados são média de três experimentos.

4.7 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA POR CONTAGEM EM PLACAS 68

Unindo os gráficos das Figuras 4.7 e 4.8, pode-se visualizar como a queda do pH está

associada ao crescimento do microrganismo, conforme preconiza a literatura (Figura 4.9).

Estas quedas no pH e na concentração de biomassa não eram esperados, mas

repetiram-se em todos os experimentos, e então buscou-se possíveis explicações para o

fenômeno.

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

3,0x10

6,0x10

9,0x10

1,2x10

1,5x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

5,0

5,2

5,4

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

Figura 4.9: Evolução do pH e da concentração de biomassa ao longo dos cultivos.

¡ = biomassa (UFC.g

-1

); w = pH

Resultados são a média de três experimentos.

A queda no pH poderia inibir o crescimento do microrganismo, mas o pH alcançado

(5,5) não seria capaz de causar morte celular.

É também pouco provável que a carência de algum nutriente essencial tenha causado

este fenômeno. Havia ainda grande quantidade de fibra não consumida, o que garante fonte de

carbono e nitrogênio (proteína). Porém a biodisponibilidade destes recursos não pode ser

garantida. Por outro lado, ainda, devido à perda de estrutura da fibra, é provável que a

transferência de oxigênio no meio de cultivo tenha se tornado limitante.

Vários micronutrientes são fornecidos pela adição do meio mineral. Alguns destes

sais são pouco solúveis, como o CaCl

e o FeCl

, e poderiam estar presentes no meio em

concentração de fato menor que a desejada. Entretanto, outros trabalhos utilizando bactérias

do gênero Bacillus não se preocupam em fornecer tantos micronutrientes minerais ao

microrganismo (Paavilainen et al., 1995; Asensi et al., 1997; Paavilainen et al., 1999).

4.7 QUANTIFICAÇÃO DE BIOMASSA POR CONTAGEM EM PLACAS 69

A explicação mais provável para a queda da biomassa parece ser a produção de

algum metabólito tóxico durante o cultivo. Paavilainen et al. (1995 e 1999) estudaram as rotas

metabólicas de Bacillus circulans var. alkalophilus e concluíram que a utilização de glicose

ocorria quase que exclusivamente (90-93%) pela rota de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP),

sendo que o piruvato formado era convertido principalmente a ácido acético e fórmico. Asensi

et al. (1997) identificaram que o ácido acético tem efeito bactericida in vitro sobre Bacillus

subtilits, uma espécie próxima ao B. circulans. Este efeito é dependente do pH, sendo que, em

pH 5,5, uma concentração de 17,4 µM (1 mg.L

-1

) já produziu ação bactericida in vitro,

enquanto que em pH 6 esta mesma concentração não se apresenta tóxica. Os autores

procuraram explicar o efeito pela alteração do pH intracelular, causada pela entrada de

moléculas de ácido não-dissociadas pela membrana, as quais se dissociam no ambiente neutro

do citoplasma, reduzindo o pH interno da célula.

De fato, análise em extratos de um dos cultivos apontou a produção de acetato

durante a fase de crescimento, chegando à concentração de 1,86 g.L

-1

no extrato aquoso

(correspondendo a 3,71 g.kg

-1

no leito do biorreator) às 18 horas de cultivo, momento em que

também se iniciou a queda da contagem de microrganismos, conforme Figura 4.10.

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

3,0x10

6,0x10

9,0x10

1,2x10

1,5x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

0,0

4,0x10

-4

8,0x10

-4

1,2x10

-3

1,6x10

-3

2,0x10

-3

Acetato (g

-1

)

Figura 4.10: Comparação entre concentração de biomassa e de ácido acético.

¡ = biomassa (UFC.g

-1

); w = acetato (g.kg

-1

) no leito.

4.8 AÇÚCARES REDUTORES 70

Cabe ressaltar, porém, que a queda na concentração de biomassa não é acompanhada

de alteração na tendência da curva de produção de CO

, como seria esperado, uma vez que se

afirma relação entre produção de gás carbônico e crescimento microbiano. Esta discrepância

conduz à idéia de possíveis erros de amostragem no biorreator. Biorreatores de tambor

agitado têm sido tradicionalmente estudados como sistemas homogêneos, mas cultivos

sólidos, por definição, caracterizam-se por heterogeneidade do meio.

O microrganismo poderia estar se desenvolvendo mais rapidamente junto às paredes

do biorreator, numa fina camada (aproximadamente 3mm) formada pela fibra no início do

cultivo, e mais lentamente no bulk do leito, onde era realizada a amostragem. Esta camada de

parede poderia ter melhor acesso ao oxigênio. Porém, ao longo dos cultivos percebeu-se que a

fibra perdia a capacidade de aderir às paredes do biorreator, desaparecendo a camada de

parede.

Uma outra possibilidade levantada para explicar o fenômeno seria a formação de

aglomerados de microrganismos não desmanchados com a agitação no sonicador. Estes

aglomerados dariam origem a apenas uma colônia nas placas de contagem, ainda que

formados por um número maior de células.

4.8 Açúcares Redutores

A variação da concentração de açúcares redutores no meio de cultivo acompanhou,

aproximadamente, o desenvolvimento da biomassa, conforme pode ser observado na Figura

4.11. Desta observação conclui-se que a hidrólise dos polissacarídeos presentes no RIFS

ocorre a velocidade maior que o consumo dos açúcares redutores formados pelo metabolismo

bacteriano.

Apesar de não ter sido realizada a quantificação das enzimas hidrolíticas (celulases,

xilanases) no meio, pode-se inferir, pela geração de açúcares redutores, que a produção

4.9 MODELAGEM DO CRESCIMENTO MICROBIANO 71

daquelas está associada ao crescimento, como é citado em alguns trabalhos na literatura

(Mitchell, 1992b; Matcham, 1985; Smits et al., 1996).

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

5,0x10

-3

1,0x10

-2

1,5x10

-2

2,0x10

-2

2,5x10

-2

0,0

3,0x10

6,0x10

9,0x10

1,2x10

1,5x10

Açúcares Redutores (g

-1

)

Tempo (h)

Biomassa (UFC.g

-1

)

Figura 4.11: Comparação entre concentração de biomassa e de açúcares redutores.

¡ = biomassa (UFC.g

-1

); ¡ = açúcares redutores (g.kg

-1

) no leito.

4.9 Modelagem do crescimento microbiano

A queda na quantidade de biomassa medida, após algumas horas de cultivo,

prejudica o ajuste da curva de crescimento aos modelos normalmente utilizados em trabalhos

de modelagem de CES. O modelo logístico obtém resultados satisfatórios somente nas

primeiras 20 horas, ou seja, antes da queda da biomassa (Figura 4.12), uma vez que não é

capaz de descrever este tipo de comportamento. Os parâmetros µ e X

max

assim estimados

foram:

µ = 0,780 ± 0,0386 h

-1

max

= 1,40⋅10

± 6,07⋅10

UFC.g

-1

Os demais modelos citados por Mitchell et al. (2004) apresentaram-se ainda menos

adequados para descrever a cinética observada, pois nenhum deles inclui um termo de morte

microbiana.

4.10 ESTIMAÇÃO DA BIOMASSA ATRAVÉS DA TAXA DE PRODUÇÃO DE CO2 72

0 5 10 15 20 25 30

0,0

4,0x10

8,0x10

1,2x10

1,6x10

2,0x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

Figura 4.12: Ajuste dos dados de biomassa ao modelo logístico.

¡ = dados experimentais; Linha = predição do modelo

4.10 Estimação da biomassa através da taxa de produção

de CO

Os cromatogramas obtidos para o CO

tiveram resolução satisfatória. Um exemplo

está apresentado na Figura 4.13.

Figura 4.13: Exemplo de cromatograma obtido na análise de CO

no ar de saída do biorreator.

A Figura 4.14 mostra os resultados obtidos para a taxa de produção de CO

durante

os cultivos. As curvas de CPR foram bastante reprodutíveis e seguiram o mesmo padrão

apresentado por outros trabalhos encontrados na literatura (Sato et al., 1983; Kim et al., 1985;

Smits et al., 1996; Koutinas et al., 2003; Prado et al., 2004): um rápido aumento inicial,

4.10 ESTIMAÇÃO DA BIOMASSA ATRAVÉS DA TAXA DE PRODUÇÃO DE CO2 73

atingindo máximo com aproximadamente 8 horas de cultivo (próximo à metade da fase de

crescimento), seguido de uma lenta redução, que se prolongava por dias. Em alguns

experimentos, pode-se acompanhar esta lenta redução na taxa de produção de CO

, que

continuou por pelo menos mais seis dias, até atingir praticamente zero.

0 5 10 15 20 25 30

0,0

2,0x10

-4

4,0x10

-4

6,0x10

-4

8,0x10

-4

1,0x10

-3

CPR (g

-1

)

Tempo (h)

Figura 4.14: Taxa de produção de CO

Resultados são média de três experimentos.

Os resultados de uma triplicata do cultivo em BCHA foram utilizados para estimar os

parâmetros do modelo representado pela Equação 3.2, que relaciona a produção de CO

biomassa.

Os valores obtidos para os parâmetros foram:

XCO

= 2,76⋅10

-12

CO2

.UFC

-1

m = 2,36⋅10

-13

CO2

.UFC

-1

Os gráficos da Figura 4.15 comparam os resultados preditos pelo modelo, a partir dos

dados de produção de CO

, com a biomassa medida para três experimentos. Percebe-se que o

modelo só conseguiu descrever satisfatoriamente a evolução da curva de biomassa durante as

primeiras 20h de cultivo, ou seja, até a fase estacionária. Após este período, foi observada

queda na contagem de células viáveis, o que o modelo utilizado não foi capaz de descrever.

4.10 ESTIMAÇÃO DA BIOMASSA ATRAVÉS DA TAXA DE PRODUÇÃO DE CO2 74

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

CPR (g

-1

)

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

0,0

2,0x10

-4

4,0x10

-4

6,0x10

-4

8,0x10

-4

1,0x10

-3

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

0,0

2,0x10

-4

4,0x10

-4

6,0x10

-4

8,0x10

-4

1,0x10

-3

CPR (g

-1

)

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

0,0

2,0x10

-4

4,0x10

-4

6,0x10

-4

8,0x10

-4

1,0x10

-3

CPR (g

-1

)

Figura 4.15: Resultados da estimação de biomassa a partir da taxa de produção de CO

, para três experimentos.

Linha sólida = predição do modelo (UFC.g

-1

); ¡ = biomassa medida (UFC.g

-1

);

w = taxa de produção de CO

CO2

-1

)).

Este é um resultado comum nos trabalhos que buscam estimar biomassa em CES a

partir de dados de atividade metabólica (produção de CO

, consumo de O

, atividade

enzimática). Mitchell (1992) já apontava a dificuldade de estimar a biomassa a partir dos

dados de produção de CO

após a fase de crescimento exponencial.

Matcham et al. (1984) mostraram que a atividade da enzima laccase é bom parâmetro

para estimação de biomassa de Agaricus bisporus apenas nas primeiras 56h de cultivo.

Smits et al. (1996), utilizando também um modelo do tipo Luedeking-Piret para

estimar biomassa a partir da produção de CO

e a produção de O

, encontraram desvios entre

a estimativa da equação e as medidas experimentais nos pontos de baixa e alta concentração

de biomassa. Os primeiros, devido à menor dimensão, têm pouco efeito sobre a estimação da

biomassa ao longo do cultivo e foram atribuídos a erro experimental. Entretanto, os autores

não encontraram explicação para os desvios nas altas concentrações de biomassa e sugeriram,

para trabalhos futuros, extender a equação para compensar tais desvios.

4.11 DESENVOLVIMENTO DE MODELO CINÉTICO 75

4.11 Desenvolvimento de modelo cinético

A partir dos dados experimentais de biomassa, açúcares redutores, acetato e

produção de CO

, foi desenvolvido um modelo cinético para descrever a evolução destas

grandezas.

As seguintes observações puderam ser realizadas a partir dos resultados obtidos

experimentalmente:

− A curva de crescimento do microrganismo atingiu um máximo após aproximadamente 15

horas de cultivo, passando a declinar.

− Sugere-se que este declínio esteja relacionado ao acúmulo de acetato no meio de cultivo,

estando este fenômeno de acordo com outros trabalhos da literatura.

− A concentração de açúcares redutores no meio aumenta juntamente com a biomassa, sendo

fruto da atividade enzimática do microrganismo.

− O leito não sofre alterações significativas de massa seca e umidade ao longo do cultivo.

Com base nestas observações, foi desenvolvido o modelo, cujas principais

considerações são:

1) Microrganismo possui cinética de crescimento do tipo Monod, sendo os açúcares

redutores seu substrato limitante.

2) Os açúcares redutores são consumidos pelos microrganismos e, concomitantemente,

produzidos pela atividade enzimática (xilanases, celulases) destes.

3) Os produtos finais do metabolismo microbiano considerados são o gás carbônico e o ácido

acético, sendo que este possui efeito bactericida.

4) Leito do biorreator não sofre alterações significativas de massa seca, umidade ou atividade

de água ao longo do cultivo.

5) Influências do pH sobre a velocidade de crescimento e do metabolismo microbiano sobre

o pH são desprezadas.

4.11 DESENVOLVIMENTO DE MODELO CINÉTICO 76

Com base nestas considerações, foi desenvolvido o equacionamento do modelo. A

biomassa cresce dependente do nutriente limitante (açúcares redutores), com a velocidade

específica de inativação celular dependente da concentração de acetato no meio.

XkX

⋅−⋅=µ (4.1)

⋅=

max

µµ (4.2)

Ackk ⋅=

(4.3)

Os açúcares redutores são consumidos pelo microrganismo e produzidos pela sua

atividade enzimática, que é considerada proporcional somente à concentração de biomassa.

Portanto, os polissacarídeos hidrolisados por esta atividade enzimática são considerados em

excesso, o que gera uma simplificação da equação da velocidade de reação (A).

AXY

+⋅⋅−= µ

(4.4)

XkA ⋅=

(4.5)

O acetato é produzido pelo metabolismo microbiano, mas possui efeito bactericida

descrito pela Equação 4.3. A curva experimental de acetato, entretanto, apresentou queda na

concentração da substância a partir das 18 horas de cultivo (Figura 4.10). Para tentar explicar

este fenômeno, foi introduzido um termo para representar esta redução da quantidade de

acetato no meio, sendo o efeito proporcional à inibição causada pelo acetato no crescimento.

XkXY

dAc

DXAc

⋅⋅−⋅⋅= αµ

(4.6)

Este termo α mostrou-se indispensável para que o modelo conseguisse se aproximar

dos dados experimentais.

O gás carbônico é produzido pelo metabolismo microbiano, estando associado ao

crescimento e à manutenção.

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 77

YCPR

COXCO

⋅+⋅==

(4.7)

Aqui a utilização da Equação 2.54 seria justificada, e provavelmente até mais

indicada. Entretanto, este balanço de CO

não influencia os demais, e, como será explicado

mais adiante o uso da Equação 4.7 permite melhores comparações com os resultados obtidos

para a estimação da biomassa a partir da taxa de produção de CO

4.12 Estimação dos parâmetros do modelo cinético

Os parâmetros

XCO

m foram estimados separadamente dos demais parâmetros

do modelo, utilizando a predição de biomassa obtida com o modelo. Este procedimento

facilitou a resolução do problema de estimação, sem prejuízos à qualidade da solução, uma

vez que o balanço de CO

não influencia os demais. Por este motivo, a discussão sobre a

estimação dos parâmetros também iniciará pelos balanços de biomassa, açúcares redutores e

acetato; para depois lidar com o balanço de CO

Assim, inicialmente se tinha um sistema de três equações diferenciais (Equações 4.1,

4.4 e 4.6) e nove parâmetros a estimar, que são apresentados na Tabela 4.1.

No processo de estimação, percebeu-se que, mesmo impondo limites máximos e

mínimos para os parâmetros, era possível obter vários conjuntos de valores diferentes para os

nove parâmetros, sendo que o modelo apresentava resposta similar em todos os casos, ou seja,

erros de predição semelhantes.

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 78

Tabela 4.1: Parâmetros do modelo cinético presentes nos balanços de biomassa, açúcares

redutores e acetato.

Parâmetro Significado

max

Velocidade específica máxima de crescimento

Constante de saturação de Monod

Taxa de reação de inativação celular devido ao acetato

n Ordem da reação de morte celular em relação ao acetato

S/X

Razão de consumo de substrato por biomassa formada

Taxa de reação de hidrólise de polissacarídeos

Ordem da reação de hidrólise de polissacarídeos em relação à

biomassa

Ac/X

Razão de produção de acetato por biomassa formada

Parâmetro de proporcionalidade entre redução da

concentração de acetato e taxa de morte celular

A análise realizada com o algoritmo SELEST revelou alto grau de correlação entre

os parâmetros, ou seja, imprecisões da estimação de um parâmetro são “compensadas” por

imprecisões nas estimações dos demais, de forma que o modelo forneça uma resposta que,

com os dados disponíveis, parece satisfatória. A reduzida quantidade de dados experimentais

disponíveis é que permite esta distorção e prejudica a estimação. Esta carência de dados

aproveitáveis é explicada por problemas enfrentados durante os experimentos, descritos no

Apêndice.

O algoritmo apontou que o parâmetro µ

max

, por exemplo, possui grande efeito sobre

as saídas do modelo. Isto é esperado, uma vez que a velocidade específica de crescimento µ,

que aparece nas três equações diferenciais, é diretamente proporcional a µ

max

. Entretanto, a

alta correlação deste parâmetro com os demais faz com que sua identificabilidade seja a mais

baixa e ele não possa ser estimado com precisão.

Buscando melhorar a estimativa dos parâmetros, decidiu-se fixar o valor de µ

max

0,78 h

-1

, valor este que fora obtido anteriormente no ajuste ao modelo de crescimento

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 79

logístico, para estimar somente os outros oito parâmetros, com mais precisão. Esta medida

surtiu efeito, e sete parâmetros puderam ser estimados com boa precisão (Tabela 4.2). Apenas

o parâmetro K

não pode ser refinado, permanecendo com uma estimativa grosseira. De

qualquer forma, este é o parâmetro de menor efeito sobre as saídas do sistema (Tabela 4.3), o

que é uma garantia de que, ainda assim, as incertezas do modelo estão minimizadas.

Tabela 4.2: Parâmetros estimados para o modelo cinético

Parâmetro Valor Unidade

max

0,78

-1

0,674

⋅g

-1

0,154

± 1,06⋅10

-2

-1

n 1,50

± 6,84⋅10

-2

S/X

9,75⋅10

-8

± 1,27⋅10

-9

⋅UFC

-1

7,10

± 0,941 g

⋅h

-1

p 1,01

± 3,13⋅10

-3

Ac/X

1,02⋅10

-9

± 6,97⋅10

-11

⋅UFC

-1

α 8,92⋅10

-10

± 7,26⋅10

-11

⋅UFC

-1

Tabela 4.3: Efeito dos parâmetros sobre as saídas do modelo cinético.

Parâmetro Efeito

p 0,8318

0,3615

n 0,3593

Ac/X

0,0346

0,0275

S/X

0,0244

α 0,0208

0,0151

A Tabela 4.4 representa a matriz de correlação dos parâmetros estimados com o

algoritmo SELEST. O diagnóstico final foi de que os parâmetros são muito correlacionados.

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 80

Ressalte-se ainda que, caso K

ou µ

max

também tivessem sido estimados, as correlações

aumentariam consideravelmente.

O parâmetro p foi o que apresentou o menor grau de correlação em relação aos

demais. Aliando-se isso ao seu alto efeito sobre as saídas do modelo, este parâmetro torna-se

o de maior identificabilidade. Além disso, o valor de p, praticamente igual a 1, mostra que a

velocidade da reação de hidrólise dos polissacarídeos é controlada pela transferência de massa

no leito.

Os parâmetros k

e Y

S/X

possuem alta correlação pois, uma vez que o valor de p é

quase igual a 1 (e p é o parâmetro de maior identificabilidade), eles se contrabalançam na

equação dos açúcares redutores. O aumento de um implica o aumento do outro, para manter o

equilíbrio. Isto remete a um problema já na proposição do modelo, que não foi previsto. É

semelhante a explicação para o caso do par Y

Ac/X

e α, fortemente correlacionados por se

compensarem no balanço de acetato.

Já k

e n, que também apresentam forte correlação, possuem dependência inversa: os

aumentos de um acarretam redução do outro. A causa da forte correlação é o fato e o modo de

ambos participarem da equação que define a taxa de morte, k

Tabela 4.4: Matriz de correlação para os parâmetros estimados do modelo cinético

p k

n Y

Ac/X

S/X

p 1 0,150 0,028 0,185 -0,049 0,212 0,190

0,150 1 -0,525 0,377 0,544 0,998 0,381

n 0,028 -0,525 1 -0,829 -0,979 -0,514 -0,826

Ac/X

0,185 0,377 -0,829 1 0,812 0,380 0,995

-0,049 0,544 -0,979 0,812 1 0,531 0,799

S/X

0,212 0,998 -0,514 0,380 0,531 1 0,385

α 0,190 0,381 -0,826 0,995 0,799 0,385 1

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 81

Os resultados obtidos na simulação do modelo podem ser confrontados com os dados

experimentais na Figura 4.16. Percebe-se que o modelo proposto apresentou boa concordância

com os dados experimentais, conseguindo descrever de forma satisfatória o comportamento

das variáveis biomassa, açúcares redutores e acetato no sistema.

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

3,0x10

6,0x10

9,0x10

1,2x10

1,5x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

4,0x10

-3

8,0x10

-3

1,2x10

-2

1,6x10

-2

2,0x10

-2

Açúcares redutores (g

-1

)

Tempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

1,0x10

-3

2,0x10

-3

3,0x10

-3

4,0x10

-3

Acetato (g

-1

)

Tempo (h)

Figura 4.16: Predições do modelo desenvolvido em comparação com os dados experimentais.

¡ = Dados experimentais; Linhas = Predições do modelo.

As predições da biomassa do modelo cinético, obtidas na primeira fase da estimação,

conforme foi descrito, foram utilizadas para estimar os parâmetros

XCO

m . Os valores

obtidos constam na Tabela 4.5. Percebe-se que ambos divergem ligeiramente dos valores

estimados diretamente a partir dos dados experimentais.

Tabela 4.5: Parâmetros

XCO

m estimados para o modelo cinético.

CO2/X

2,11⋅10

-12

CO2

⋅UFC

-1

CO2

4,92⋅10

-13

CO2

⋅UFC

-1

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 82

A Figura 4.17 apresenta a comparação entre a produção de CO

verificada

experimentalmente e a predição feita pelo modelo. A curva obtida não acompanhou

satisfatoriamente as tendências desenvolvidas pela curva experimental.

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

3,0x10

-3

6,0x10

-3

9,0x10

-3

1,2x10

-2

1,5x10

-2

CPR Acumulado (g

-1

)

Tempo(h)

Figura 4.17: Predições do modelo com relação à produção de CO

= Dados experimentais; Linhas = Predições do modelo.

A dificuldade em descrever satisfatoriamente a produção de CO

pode ser

decorrência direta do ainda limitado poder de caracterização dos sistemas em CES. A

descrição ofertada pelo modelo é bastante simples em comparação com a complexidade do

processo.

Possíveis problemas difusionais, causados pela alteração da estrutura do RIFS

durante o cultivo, poderiam levar à limitação de oxigênio no processo. Isto, juntamente com a

composição complexa do meio de cultivo, implica em diferentes rotas metabólicas utilizadas

pelo microrganismo, as quais não poderiam ser corretamente consideradas no modelo pelas

próprias limitações analíticas ainda presentes nos estudos de processo de CES.

Com os parâmetros

XCO

m , aqui obtidos para o modelo cinético, foi realizada

a estimação indireta da biomassa, como comparação ao resultado apresentado anteriormente,

quando esses parâmetros foram estimados diretamente a partir das medições experimentais de

biomassa. A Figura 4.18 apresenta os resultados obtidos.

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 83

0 5 10 15 20 25 30 35

0,0

3,0x10

6,0x10

9,0x10

1,2x10

1,5x10

Biomassa (UFC.g

-1

)

Tempo (h)

0,0

2,0x10

-4

4,0x10

-4

6,0x10

-4

8,0x10

-4

1,0x10

-3

CPR (g

-1

)

Figura 4.18: Estimação de biomassa através dos parâmetros

XCO

m do modelo cinético.

¡ = Medições de biomassa; w = Medições de CPR.

Linha pontilhada = Biomassa predita pelo modelo cinético.

Linha contínua = Biomassa estimada através dos parâmetros

XCO

m do modelo cinético.

De acordo com o procedimento utilizado para a estimação dos parâmetros

XCO

m , a biomassa estimada deveria coincidir com aquela predita pelo modelo cinético.

Entretanto, os resultados foram pouco satisfatórios, o que pode ser decorrência da já

mencionada desvinculação do balanço de CO

em relação aos demais presentes no modelo.

Além disso, o meio sólido contém várias fontes de carbono diferentes, cujo consumo gera

, mas apenas o teor de açúcares redutores foi monitorado.

Está claro, assim, que o modelo proposto pode ser aperfeiçoado. Além da

necessidade de mais dados experimentais, o modelo ainda carece de relações estequiométricas

para melhor descrever o sistema. As produções de acetato e CO

, conforme o modelo,

ocorrem sem haver uma relação direta com o consumo de substrato.

O próprio substrato, que é complexo, constituído de polissacarídeos e seus derivados

por hidrólise, é apresentado de forma bastante simplificada: açúcares redutores derivados de

polissacarídeos presentes em excesso. A caracterização extremamente simplificada do

4.12 ESTIMAÇÃO DOS PARÂMETROS DO MODELO CINÉTICO 84

substrato, ou até a falta de caracterização, é comum nos modelos propostos para CES, o que

nos remete a uma das desvantagens do CES em relação ao CSm: a dificuldade na

quantificação de parâmetros importantes do cultivo (Mitchell e Lonsane, 1992; Pandey,

2003).

Capítulo 5

Conclusões e Perspectivas

Apesar de os cultivos em estado sólido apresentarem, por definição,

heterogeneidades, os testes de mistura realizados mostraram que o biorreator utilizado realiza

uma homogeneização adequada para os propósitos do trabalho. Os poucos trabalhos

encontrados na literatura que também utilizavam este tipo de biorreator adotaram igualmente

a consideração de homogeneidade do leito.

A quantificação de biomassa, apesar de ser um parâmetro fundamental para o

desenvolvimento de bioprocessos, ainda tem de ser muito estudada em CES. As técnicas

desenvolvidas têm-se destinado basicamente aos processos envolvendo fungos filamentosos,

enquanto a análise por contagem em placas, tradicionalmente recomendada para bactérias,

ainda não mostra a precisão desejada. A literatura carece do desenvolvimento de trabalhos

que apontem componentes da biomassa bacteriana de fácil medição e que sejam adequados na

estimação indireta de biomassa.

Neste trabalho, a estimação de biomassa através da produção de CO

apresentou

bons resultados nas primeiras horas do cultivo, mas a queda na contagem de microrganismos

não foi acompanhada por similar queda na produção de CO

. De qualquer forma, é sempre

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 86

esperado que a estimação da biomassa através da atividade metabólica perca eficiência ao

longo do tempo nos experimentos, quer pela natureza cumulativa do erro de estimação, quer

por mudanças metabólicas do microrganismo, que não são corretamente detectadas quando se

tem um único parâmetro mensurável.

Alguns trabalhos, em geral em CSm, já procuram utilizar um maior número de

medições on-line simultaneamente para gerar uma estimativa melhor da biomassa. A

obtenção de tais medições depende do desenvolvimento de sensores adequados, e a tecnologia

disponível para CES ainda está aquém da utilizada em CSm.

O modelo cinético desenvolvido para representar o processo apresentou resultados

satisfatórios, realizando boas predições das concentrações de biomassa, açúcares redutores e

acetato no meio. A predição da produção de CO

, por outro lado, não apresentou a mesma

qualidade.

Porém, ficou claro que o modelo ainda pode ser bastante aprimorado, como pela

obtenção de uma maior quantidade de dados experimentais. Além disso, o estabelecimento de

relações estequiométricas no processo pode tornar o modelo mais parcimonioso, reduzindo o

número de parâmetros a estimar.

Cabe ressaltar que, neste trabalho, procurou-se desenvolver o conhecimento ligado a

alguns dos pontos que a literatura cita como desvantagens dos CES em relação aos CSm: a

pouca caracterização de aspectos de engenharia do processo, dificuldade de medição de

parâmetros do processo (biomassa, substrato, produtos), cinética de reações e modelagem

matemática.

Por fim, os resultados deste trabalho podem servir como guias para o

desenvolvimento de novos estudos que aprofundem mais o conhecimento dos aspectos de

engenharia dos cultivos em estado sólido, para que estes atinjam o mesmo nível tecnológico já

alcançado pelos cultivos submersos.

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 87

O trabalho apresentado nesta dissertação serve como um primeiro esforço no sentido

de desenvolver modelos não-empíricos para o cultivo em estado sólido utilizando o resíduo

industrial fibroso de soja para o crescimento de bactérias. Novos estudos são possíveis a partir

deste trabalho.

Para desenvolver o estudo da transferência de massa no biorreator, está sendo

estudada a possibilidade do uso de análise de imagens nos testes de mistura com corantes,

para determinar um coeficiente efetivo de transferência de massa. Esta informação seria útil

no momento de propor modelos adequados para descrever os fenômenos de transferência de

massa no processo.

Na estimação de biomassa, sugere-se o desenvolvimento de novos métodos indiretos

de estimação, através de componentes da biomassa, que sejam aplicáveis a bactérias. A

literatura cita apenas exemplos para fungos (glicosamina e ergosterol).

Medições on-line de O

, com a precisão necessária, acopladas às medições atuais de

, podem permitir uma estimação de biomassa mais precisa e robusta que a obtida

atualmente.

O modelo cinético desenvolvido seria bastante aprimorado se fosse possível

estabelecer uma estequiometria do processo. A própria incorporação de um balanço de

oxigênio ao modelo atual pode auxiliar nesse intuito.

Um número maior de experimentos utilizando este sistema, porém variando-se as

condições de cultivo (temperatura, pH inicial, umidade relativa do ar, umidade inicial do

leito) pode representar uma grande evolução no modelo atual, com a incorporação de

balanços de massa (água) e energia.

Referências Bibliográficas

ANDREWS, J.F. A mathematical model for the continuous culture of microorganisms

utilizing inhibitory substrate. Biotechnology and Bioengineering, v.10, p.707-723, 1968.

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Apêndice A - Problemas enfrentados durante

os experimentos

Durante a execução dos experimentos, houve vários problemas com o aparato

experimental, que dificultaram o desenvolvimento do trabalho. Alguns deles, juntamente com

uma breve discussão sobre suas conseqüências, serão apresentados aqui.

O compressor responsável pelo fornecimento de ar para o biorreator tem

funcionamento intermitente, ou seja, trabalha para gerar uma determinada pressão de ar na

linha e pára, sendo novamente acionado quando a pressão cai abaixo de determinado nível.

Como o aparato experimental não contava com válvulas reguladoras de pressão, apenas

válvulas simples e rotâmetros, ocorriam leves variações na pressão e, conseqüentemente, na

vazão de ar no biorreator. Como efeito, nos gráficos da porcentagem de CO

no ar de saída,

medida pelo CG, observa-se um perfil em forma de serrote, com periodicidade, inclusive.

Entretanto, a amplitude das variações provocadas por este fenômeno é pequena, como

observado na Figura A.1.

O biorreator utilizado impedia a instalação de sensores de temperatura em contato

direto com o leito, para monitorar a temperatura do meio de cultura ao longo do cultivo. As

pás de agitação não deixam nenhum espaço entre suas trajetórias, e apenas 3 mm para a

parede do cilindro.

Através de um teste de submersão do corpo do biorreator, percebeu-se que ele possui

pontos de vazamento de ar. O principal é no eixo, mas pode vazar ar também pelas escotilhas

e pela tampa do biorreator. A grande preocupação neste caso é que os pontos de vazamento se

tornem pontos de entrada de microrganismos contaminantes.

APÊNDICE A - PROBLEMAS ENFRENTADOS DURANTE OS EXPERIMENTOS 97

0 10 20 30 40

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

(%)

Tempo (h)

Figura A.1: Curva de porcentagem de CO

no ar de saída do biorreator apresentando efeito da variação da vazão

de ar.

De fato, a despeito das afirmações de vários autores sobre a menor possibilidade de

contaminação em CES, vários experimentos foram perdidos devido ao desenvolvimento de

microrganismos estranhos.

As operações de amostragem do biorreator ofereciam uma boa oportunidade para a

entrada de contaminantes, já que era necessário abrir uma escotilha do biorreator e introduzir

uma colher para coleta da amostra. Por mais que se utilizasse material esterilizado, e o

procedimento fosse feito junto à chama, a possibilidade de contaminação era alta, pois não era

possível realizar a amostragem numa capela de fluxo.

O próprio teste de Gram, comumente utilizado para identificar contaminantes em

meio de cultivo, não é muito adequado quando se trata de CES, exatamente pela grande

quantidade de sólidos que dificultam a visualização ao microscópio. A forma que foi mais

utilizada para detectar a presença de contaminantes foi a observação das colônias formadas

nas placas de contagem.

A saída de ar do biorreator consistia de um pequeno orifício com aproximadamente 7

mm de diâmetro. Por várias vezes, verificou-se que a fibra acabava entrando neste orifício e

causando seu entupimento. Isto ocorria principalmente nas primeiras horas do cultivo, quando

APÊNDICE A - PROBLEMAS ENFRENTADOS DURANTE OS EXPERIMENTOS 98

a fibra ainda tinha maior capacidade de retenção de água e consistência. Para desentupir a

saída de ar podia ser necessário abrir o sistema, o que possibilitava novamente a entrada de

contaminantes.

O Campus do Vale da UFRGS também sofre eventuais quedas de energia, que,

muitas vezes, acabam encerrando experimentos precocemente.

Na etapa final do trabalho, o motor do biorreator começou a apresentar problemas.

Por vezes, não respondia ao acionamento, rodava em velocidade lenta ou até mesmo parava

sozinho. Isto acabou impedindo que mais experimentos pudessem ser realizados.

O termo-higrômetro utilizado também apresentou problemas no funcionamento.

Primeiramente, tais medidores já costumam perder precisão nas condições de alta umidade

relativa do ar utilizadas nos experimentos. Além disso, nesta situação de ar saturado, pode

ocorrer condensação de água no sensor. De fato, estas condições às quais ele foi exposto

durante os cultivos parecem ter afetado o aparelho, o qual, aparentemente, perdia a calibração

após algumas horas de medição, marcando valores de temperatura e umidade relativa

sabidamente incorretos. Em outras oportunidades, o aparelho simplesmente acusava erro de

medição, e, por fim, perdeu a estabilidade das medições, que variavam continuamente, sem

estabilizar em um valor.

O controle de umidade relativa no ar de entrada do biorreator, que fora planejado,

acabou não funcionando. Embora fosse possível ajustar a umidade relativa do ar por meio de

soluções saturadas de sais, o pequeno trecho (aproximadamente 20 cm) de mangueira de ar

fora da estufa era suficiente para reduzir um pouco a temperatura do ar. Esta pequena redução

na temperatura era suficiente para causar um aumento significativo na umidade relativa do ar.

A própria análise de contagem de colônias em placas mostrou peculiaridades no caso

do Bacillus circulans BL53. A bactéria apresentou crescimento muito rápido no meio PCA,

com suas colônias aumentando de tamanho rapidamente, chegando ao ponto de se juntarem,

APÊNDICE A - PROBLEMAS ENFRENTADOS DURANTE OS EXPERIMENTOS 99

dificultando a contagem (Figura A.2). Por este motivo era necessário realizar a contagem das

colônias já com apenas 12 horas de incubação.

Há trabalhos na literatura tratando deste crescimento das colônias de Bacillus

circulans (Eiha et al, 2002; Komoto et al, 2003). As colônias desta bactéria são capazes de

migrar sobre o meio de cultura, e inclusive formar subcolônias. Komoto et al (2003)

concluíram que o aumento da quantidade de ágar no meio de cultura reduz esta capacidade,

pois o ágar cria uma rede que impede o deslocamento das células.

Com esta informação, decidiu-se aumentar a quantidade de ágar adicionada aos

meios de cultura utilizados neste trabalho.

Figura A.2: Aspecto de colônias colabadas de Bacillus circulans BL53.

Anexo I – Algoritmo SELEST

A seguir são descritos em detalhe os passos do algoritmo SELEST, utilizado na

estimação e no cálculo de desvios-padrão dos parâmetros. Adaptado de Secchi et al. (2006),

com autorização.

Partindo-se de um sistema dinâmico:

(

)

(

)

(

)

);,(

; ; 0;,,,

θθθ

uxHy

xtxuxxtF

(I.1)

onde x, x

∈ ℜ

são as variáveis de estado e suas derivadas em relação à variável

independente, t; u ∈ ℜ

são as entradas do sistema (variáveis cujo valor é controlado à parte

do sistema considerado, p.ex., temperatura); y ∈ ℜ

são as saídas medidas e θ ∈ ℜ

são os

parâmetros do modelo.

1) Avaliam-se os valores médios de y e u para cada experimento com r repetições:

Nny

⋅

ℜ∈=

∑

(I.2)

Nny

⋅

ℜ∈=

∑

(I.3)

E a matriz de covariância experimental normalizada (V

∈ ℜ

ny·N × ny·N

yyyy

,1,1

)1)(1(

−

⊗

−

⋅−⋅−

= (I.4)

onde ⊗

-1

significa divisão elemento-por-elemento,

r,1

1 é um vetor-coluna de “uns”, e

y ∈ ℜ

ny·N

× r

2) Calcula-se a matriz de sensibilidade normalizada das saídas do sistema em relação

aos parâmetros, S ∈ ℜ

ny·N × np

, utilizando uma estimativa inicial dos parâmetros do modelo, θ

SSSS ][

(I.5)

ANEXO I – ALGORITMO SELEST 101

onde

ojjj

SyS θ◊◊=

−

)

(

∈ ℜ

ny × np

, ◊(⋅) é a matriz diagonal de um vetor,

∈ ℜ

é a

predição do modelo para o j-ésimo ponto experimental, utilizando a média dos valores das

entradas

u :

);,(

)0(,0);,,,(

ojj

oojj

uxHy

xxuxxtF

(I.6)

é a matriz de sensibilidade normalizada das saídas do sistema em relação aos

parâmetros avaliada no j-ésimo ponto:

∂

(I.7)

A matriz de sensibilidade dos estados em relação aos parâmetros,

∂

, é obtida

resolvendo-se o seguinte problema de valor inicial para processos dinâmicos:

θθ ∂

∂

xxx

)0(,0

(I.8)

ou o sistema linear:

θ∂

∂













∂

−=

−

(I.9)

para processos estacionários.

3) Toma-se m = min {np, ny ⋅ N} e procede-se a decomposição em valores singulares

da S ponderada pelo desvio-padrão das medições,

iiyi

)(=σ

(

)

VUS ⋅Σ⋅=⋅◊

−1

(I.10)

ou, de forma similar, procede-se a decomposição em valores característicos da matriz

de informação de Fisher:

Σ⋅Σ=Λ⋅Λ⋅=⋅◊⋅=

− TT

VVSVSF ; )(

(I.11)

onde ◊V

é a matriz diagonal composta pelos elementos da diagonal de V

. Então,

determina-se o efeito de cada parâmetro nas saídas utilizando os primeiros m componentes

ANEXO I – ALGORITMO SELEST 102

principais (primeiros m vetores coluna da matriz V, designados por V

∈ ℜ

np × m

) e a medida

de magnitude E:

E ℜ∈

⋅

∑

(I.12)

onde |V

| é a matriz dos valores absolutos de V

, e λ são os primeiros m maiores

valores característicos em Λ.

4) Seleciona-se o parâmetro de maior efeito p

= {θ

| E

= max

}, ajusta-se o

número de parâmetros selecionados para n = 1 e o vetor-índice dos parâmetros Ω

= {k},

representando o vetor-índice dos melhores parâmetros possíveis de estimar com os dados

disponíveis (em ordem decrescente).

5) Calcular matriz de informação de Fisher reduzida, F

, em relação aos parâmetros

selecionados p e as matrizes de covariância dos parâmetros, V

, e da predição,

nNny

SVSF

×⋅

Ω

−

Ω

ℜ∈◊= )(

(I.13)

1−

(I.14)

SVSV

ΩΩ

(I.15)

onde S

Ω

é a sub-matriz de S contendo apenas as colunas Ω

. Além disso, calcula-se

os coeficientes de correlação destas matrizes de covariância,

ρ e

ρ , e o condicionamento

κ da F

pppp

VVV ◊◊⊗=

−1

∞

−= ||||

npp

Iρρ (I.16)

yyyy

VVV

ˆˆ

◊◊⊗=

−

∞

−= ||||

ˆˆ

nyyy

Iρρ (I.17)

VF ⋅=κ (I.18)

ANEXO I – ALGORITMO SELEST 103

onde I

é a matriz identidade de tamanho n, e

∞

⋅|||| designa o maior elemento de

valor absoluto de uma matriz. Com esta definição de norma,

ρ é a maior correlação entre os

parâmetros.

6) Mantendo os demais parâmetros com a estimativa inicial θ

, obtém-se novo vetor

estimativa

para os parâmetros p através de estimação por mínimos quadrados (ou máxima

verossimilhança). Também se calculam os resíduos normalizados, ξ; o índice de degradação

da preditabilidade, ψ

, e o índice de degradação por correlação de parâmetros η

Nny

nkk

ypyy

⋅−

ℜ∈⊗−=

∑

)]ˆ(ˆ[

(I.19)

∞

+= ||||

ξρψ

(I.20)

npn ,1

δρη += (I.21)

onde δ

i,j

é a função delta de Kronecker. A adição de δ

1,n

na Equação I.21 é necessária

para impedir uma parada prematura no passo 7 quando n = 2.

7) Aplicam-se os seguintes critérios de parada, definindo a máxima correlação dos

parâmetros permitida, ρ

max

7.a) Se n > 1 e (((ψ

n-1

< 1 ou (η

n-1

< ρ

max

e η

> ρ

max

)) e ψ

n-1

< ψ

) ou κ

-1

< ε), então

Ω

n-1

é o vetor-índice da solução e

−n

p é o vetor de parâmetros estimados correspondente,

terminando-se o algoritmo. ε é a precisão computacional da máquina.

7.b) Se n = np, então Ω

n-1

é o vetor-índice da solução e

−n

p é o vetor de parâmetros

estimados correspondente, terminando-se o algoritmo.

8) Se n < m, então se calcula a medida de independência linear d

para cada

parâmetro em relação aos anteriormente selecionados:

||||||||

cossin Ω∉∀

























⋅

Ω

−

sVs

(I.22)

ANEXO I – ALGORITMO SELEST 104

onde

(

)

SSSSV

Ω

−

ΩΩΩΩ

. Caso contrário, i.e., n ≥ m, calcula-se a medida de

independência linear d

q,j

para cada parâmetro restante em relação a todos os possíveis (m−1)-

tuplos Ω

dos parâmetros previamente selecionados, para

)!1()!1(

+−−

≤≤

mnm

q , (I.23)

onde Ω

⊂ Ω

e |Ω

| = m−1, utilizando a Equação I.24:

||||||||

cossin Ω∉∀

























⋅

Ω

−

sVs

jqj

(I.24)

onde

(

)

qqq

SSSSV

Ω

−

ΩΩΩΩ

. Determina-se, então, o pior valor, que é a menor

independência linear: d

= min

q,j

9) Calcula-se o índice de identificabilidade I

para cada parêmetro θ

remanescente:

= E

⋅d

∀ j ∉ Ω

. (I.25)

Seleciona-se o próximo melhor parâmetro p

n+1

= {θ

| I

= max

}, ajusta-se o

número de parâmetros selecionados para n = n + 1, o vetor-índice para Ω

= {Ω

n-1

, k}, e

retorna-se ao passo 5.

É ainda possível adicionar os seguintes diagnósticos nas condições de parada do

passo 7, avaliadas no estágio (n – 1) (7.a) ou n (7.b):

max

ρρ ≥

max

ρρ <

, então as saídas estão muito correlacionadas devido a

possível alta correlação nas entradas;

max

ρρ ≥

max

ρρ ≥

, então as saídas estão muito correlacionadas devido à alta

correlação dos parâmetros;

max

ρρ ≥

então os parâmetros estão muito correlacionados.

ANEXO I – ALGORITMO SELEST 105

A constante ρ

max

do algoritmo é um limite superior para o grau de correlação dos

parâmetros. Este limite é muito mais fácil de determinar do que um limite para o índice de

identificabilidade I

, cujo valor depende mais de experimentos do que de valores estatísticos.

Ao final do algoritmo, o desvio-padrão (σ) da estimativa de cada parâmetro n

selecionado pode ser obtido a partir dos valores da diagonal principal da matriz ρ

, calculada

no passo 5:

pn ΩΩ

)(ρσ (I.26)

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