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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
DANIELA BALZ HARA
ESTUDO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NAS RESPOSTAS
CONTRÁTEIS INDUZIDAS POR AGONISTAS B
1
E B
2
PARA AS
CININAS EM CÓLONS DE CAMUNDONGOS: INFLUÊNCIA DA
COLITE INDUZIDA POR TNBS
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em
Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Santa Catarina, como
requisito parcial para obtenção do título de
Doutor em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. João B. Calixto
Florianópolis
2007
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HARA, Daniela Balz. Estudo dos mecanismos envolvidos nas respostas
contráteis induzidas por agonistas B
1
e B
2
para as cininas em cólons de
camundongos: Influência da colite induzida por TNBS. Florianópolis, 2007, 171p.
Tese (Doutorado em Farmacologia)- Curso de Pós-Graduação em Farmacologia,
Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientador: Prof. Dr. João Batista Calixto
Defesa: 26/07/2007
O presente estudo analisou através de técnicas farmacológicas alguns mecanismos
envolvidos na resposta contrátil induzida pelas cininas em cólons normais ou com colite por
TNBS. Foi constatado que a contração induzida pela BK e análogos é mediada por
receptores do tipo B
2
e não por receptores do tipo B
1
. Além disso, foi demonstrado que a
resposta contrátil à BK é mediada pelo influxo de cálcio externo, ativação de canais de
cálcio do tipo L e N, liberação neuronal de acetilcolina, pela participação de neuropeptídeos,
prostanóides, leucotrienos e pelo TRPV1. Também foi demonstrado que o receptor B
1
pode
ser induzido in vitro após a montagem das preparações alcançando respostas contráteis
máximas em 6-8 h. Também foi evidenciado que a colite promove aumento da resposta
contrátil à BK e a des-Arg
9
-BK sugerindo a indução dos receptores B
1
e B
2
. Essa hipótese foi
confirmada através da realização do ensaio de união específica com os ligantes [
3
H]-BK ou
[
3
H]-des-Arg
10
-calidina, os quais revelaram aumento na densidade de ambos os receptores
sem, no entanto, causar alteração da afinidade desses receptores pelo agonista. Ademais,
foi constatado que na colite ocorreu aumento da expressão do RNAm para os receptores
das cininas. Confirmou-se também, pela utilização de animais com deleção gênica para os
receptores B
1
ou B
2
, que ambos são necessários para a indução do dano tecidual colônico.
Por outro lado, foi verificada que a indução in vivo do receptor B
1
é dependente de síntese
protéica, PI3Kγ, NF-κB, TNFα e da participação da iNOS. Os estudos também indicam que a
resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK envolve o influxo de cálcio externo, a ativação
de canais de cálcio do tipo L, da degradação do ácido araquidônico bem como de seus
metabólitos, de enzimas iNOS e eNOS e proteínas quinases PKA, PKC, PI3Kγ e MEK. Os
resultados do presente trabalho contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos
envolvidos nas respostas contráteis mediadas pelos receptores B
1
e B
2
, bem como o papel
desses receptores na colite ulcerativa.
Palavras Chaves: Bradicina, des-Arg
9
-BK, colite ulcerativa, resposta contrátil,
densidade de receptores, RNAm, peptídeos pró-inflamatórios.
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Mensagem
“Por mais que a situação seja
desesperadora, sempre brilha a luz da
esperança”.
Daisaku Ikeda
Dedicatória
Dedico este trabalho a minha mãe
Beatriz Albana Rettore,
minha irmã Andréia Balz
e ao meu marido
Américo Hiroyuki Hara.
Agradecimentos
Agradecimentos:
À mina mãe Beatriz Albana Rettore, minha irmã Andréia Balz e ao meu amigo
Ronaldo José da Silva, pelo amor, carinho e apoio recebido.
Ao meu marido Americo Hiroyuki Hara pelo amor, apoio, paciência,
compreensão e por toda nossa grande família.
Aos Professores Dra. Ana Lúcia Severo Rodrigues e Dr. Adair Roberto
Soares dos Santos por terem me acolhido quando cheguei a Florianópolis para
estudar. Agradeço imensamente o apoio e o incentivo.
Ao professor Dr. João Batista Calixto pela oportunidade de ter sido sua
orientanda e por compartilhar seu conhecimento. Obrigado por tornar esses anos,
inesquecíveis e tão importantes tanto no profissional como no pessoal.
À professora Dra. Maria Martha Campos pelo apoio na realização desta tese,
conhecimento, compreensão e amizade.
Ao professor Dr. Antonio de Pádua Carobrez por sua amizade, por seu
entusiasmo de educador.
Ao professor Dr. Jamil Assreuy por ter sido coordenador da Pós-Graduação,
por seu apoio, compreensão, conhecimento e dedicação.
Ao professor Dr. Giles Alexander Rae
por sua amizade, conhecimento como
professor e pesquisador, dicas, apoio, exemplo de cavalheirismo. O Sr é um
gentleman.
À professora Dra. Rosa Maria Ribeiro do Valle Nicolau por seu exemplo como
pesquisadora e educadora, por seu apoio e incentivo.
Aos professores do Departamento de Farmacologia, por todo o conhecimento
compartilhado.
À Patrícia, pelo apoio, por sempre estar pronta para ajudar, sem você a
entrega do projeto de doutorado não teria acontecido. Lembra!
Agradecimentos
À Adenir por ter me ensinado a trabalhar com a técnica de órgão isolado, pela
amizade, carinho, por nossas conversas inesquecíveis.
À Aline e Juliana, sem vocês esse trabalho certamente não teria sido
realizado. Obrigada por todo o apoio técnico, amizade e compreensão.
Ao Pedro por ser tão dedicado e prestativo. Obrigada pelo apoio.
Ao Rafael por seu apoio, amizade e carinho. Saudade!
Ao Sr.Toninho considerado um super-herói, obrigada por sempre estar pronto
para ajudar, consertar e remendar qualquer peça do equipamento de órgão isolado.
Muito obrigada por seu apoio.
Aos meus colegas de laboratório, todos sem exceção, que me apoiaram,
incentivaram e colaboraram para que esse trabalho fosse possível. Obrigada pela
colaboração e amizade.
Aos colegas e ex-colegas de laboratório, Dra. Daniela Ferraz Pereira Leite,
Giselle Fazzioni Passos, Dra. Elizabeth Soares Fernandes, Dr. Rodrigo Medeiros,
Dr. Valfredo Schelemper, Dr. Octávio de Menezes Lima Júnior, Dra. Mariem El
Sayah e Dra. Daniela de Almeida Cabrini por terem me ajudado com dicas,
correções na tese, apoio e carinho.
A Diana por seu apoio, dedicação à pós-graduação em farmacologia e
amizade.
A todos os funcionários do departamento de farmacologia incluindo o serviço
terceirizado de vigilância.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
apoio financeiro.
Sumário
Abreviaturas.................................................................................................................................... i
Lista de Figuras............................................................................................................................... iii
Lista de Tabelas.............................................................................................................................. vi
Resumo............................................................................................................................................ vii
Abstract............................................................................................................................................ viii
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................................. 01
1.1. Doenças inflamatórias intestinais............................................................................................... 01
1.2. O sistema calicreína-cininas e o trato gastrointestinal............................................................... 11
1.2.1. Histórico das cininas............................................................................................................... 11
1.2.2. Síntese e degradação das cininas.......................................................................................... 13
1.2.3. Os receptores para as cininas................................................................................................ 14
1.2.4. Receptores para as cininas e suas vias de transdução.......................................................... 17
1.2.5. Indução dos receptores B
1
...................................................................................................... 18
1.2.6. As cininas e a IBD................................................................................................................... 19
1.3. Modelos animais para o estudo da IBD..................................................................................... 21
1.4. Os tratamentos da IBD............................................................................................................... 22
2. OBJETIVOS.................................................................................................................................. 25
2.1. Objetivo geral............................................................................................................................. 25
2.2. Objetivos específicos................................................................................................................. 25
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................................. 27
3.1. ANIMAIS.................................................................................................................................... 27
3.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DAS CININAS IN VITRO EM
CÓLONS DE CAMUNDONGOS.......................................................................................................
28
3.2.1. Montagem dos cólons para estudo in vitro............................................................................. 28
3.2.2. Análise das respostas contráteis induzidas pelas cininas em cólons de camundongos... 29
3.2.3. Caracterização funcional dos possíveis mecanismos envolvidos na resposta contrátil
induzida pela BK em cólons de camundongos.................................................................................
30
3.2.3.1. Participação do cálcio extracelular e de canais de cálcio nas respostas contráteis
induzidas pela BK no cólon de camundongos..................................................................................
30
Sumário
3.2.3.2. Envolvimento do sistema colinérgico e de canais de sódio nas respostas contráteis
induzidas pela BK em cólons de camundongos...............................................................................
31
3.2.3.3. Participação dos metabólitos derivados da via do ácido araquidônico nas respostas
contráteis induzidas pela BK em cólons de camundongos...............................................................
32
3.2.3.4. Influências dos neuropeptídeos e o CGRP nas respostas contráteis induzidas pela BK
em cólons de camundongos.............................................................................................................
32
3.2.3.5. Estudo da contribuição dos receptores vanilóides nas respostas contráteis induzidas
pela BK em cólons de camundongos................................................................................................
33
3.2.4. Estudo da indução in vitro do receptor B
1
para as cininas em preparações de cólons de
camundongos....................................................................................................................................
33
3.2.4.1. Avaliação temporal das respostas contráteis induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de
camundongos....................................................................................................................................
33
3.2.4.2. Efeito de antagonistas seletivos para o receptor B
1
e B
2
nas respostas contráteis
induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos................................................................
34
3.3. PADRONIZAÇÃO DA COLITE EXPERIMENTAL...................................................................... 34
3.3.1. Indução da colite experimental em camundongos.................................................................. 34
3.3.2. Avaliação do dano macroscópico após a indução da colite experimental por
TNBS.................................................................................................................................................
35
3.3.2.1. Análise temporal do dano macroscópico após a indução de colite com TNBS em
camundongos....................................................................................................................................
36
3.3.2.2. Características externas dos cólons com colite para posterior montagem no órgão
isolado e viabilidade..........................................................................................................................
37
3.3.3. Estudo do dano microscópico após a indução da colite experimental por
TNBS.................................................................................................................................................
39
3.3.3.1. Caracterização do dano microscópico ocasionado após a indução da colite por TNBS
em camundongos..............................................................................................................................
40
3.3.4. Influência da colite induzida por TNBS sobre a migração celular: atividade da MPO........... 40
3.4. ESTUDO FUNCIONAL, BIOQUÍMICO E MOLECULAR DAS CININAS E SEUS
RECEPTORES NA RESPOSTA INFLAMATÓRIA DO CÓLON.......................................................
41
Sumário
3.4.1. Análise temporal das respostas contráteis induzida pela BK e pela des-Arg
9
-BK em cólons
de camundongos com colite.............................................................................................................
41
3.4.2. Estudo da densidade e afinidade dos receptores B
1
e B
2
em cólons de camundongos com
ou sem colite experimental: ensaio de união específica ..................................................................
42
3.4.2.1. Preparação das membranas de cólon................................................................................. 42
3.4.2.2. Ensaio de união específica (binding de saturação)............................................................. 43
3.4.3. Quantificação do RNA mensageiro para os receptores B
1
e B
2
das cininas em cólons de
camundongos com colite experimental.............................................................................................
44
3.4.3.1. Extração do RNA total.......................................................................................................... 45
3.4.3.2. Confecção do c-DNA (Reação de Transcrição Reversa).................................................... 46
3.4.3.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR dos c-DNAs obtidos)............................................ 46
3.4.4. Estudo da colite experimental em animais com deleção gênica para os receptores B
1
e B
2
47
3.5. POSSÍVEIS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA INDUÇÃO DO RECEPTOR B
1
NA COLITE
POR TNBS........................................................................................................................................
48
3.5.1. Papel da síntese protéica na indução do receptor B
1
e nas respostas contráteis induzidas
pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite...............................................................
49
3.5.2. Possível participação da via fosfatidil inositol-3-kinase
γ
(PI3K
γ
) na indução do receptor B
1
em cólons de camundongos com colite............................................................................................
50
3.5.3. Participação do NF-κB na indução do receptor B
1
em cólons de camundongos submetidos
à colite experimental.........................................................................................................................
50
3.5.4. Investigação da participação da citocina TNFα sobre a indução do receptor B
1
em cólon
de camundongos na colite experimental por TNBS..........................................................................
51
3.5.5. Estudo da participação da iNOS na indução do receptor B
1
em cólons de camundongos
na colite experimental induzida por TNBS........................................................................................
52
3.6. POSSÍVEIS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA RESPOSTA CONTRÁTIL
DESENCADEADA PELA ATIVAÇÃO DO RECEPTOR B
1
EM CÓLONS DE CAMUNDONGOS
COM COLITE....................................................................................................................................
53
3.6.1. Participação dos receptores B
1
e B
2
na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em
cólons de camundongos com colite..................................................................................................
53
Sumário
3.6.2. Influência do cálcio extracelular e de canais de cálcio do tipo L nas respostas contráteis
induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite..............................................
53
3.6.3. Possível envolvimento da liberação de ácido araquidônico, das enzimas COX, LOX e seus
subprodutos eicosanóides nas respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de
camundongos com colite..................................................................................................................
55
3.6.4. Participação da via do óxido nítrico nas respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK
em cólons de camundongos com colite............................................................................................
56
3.6.5. Influência das proteínas quinases nas respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em
cólons de camundongos com colite..................................................................................................
56
3.7. DROGAS E REAGENTES......................................................................................................... 57
3.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................................... 59
4. RESULTADOS............................................................................................................................. 60
4.1. Caracterização da resposta contrátil induzida pelas cininas em cólons de camundongos...... 60
4.2. Participação do cálcio extracelular e de canais de cálcio na resposta contrátil induzida pela
BK em cólons de camundongos.......................................................................................................
65
4.3. Estudo do envolvimento do sistema colinérgico e de canais de sódio na resposta contrátil
induzida pela BK em cólons de camundongos.................................................................................
67
4.4. Contribuição dos metabólitos derivados da via do ácido araquidônico nas respostas
contráteis induzidas pela BK em cólons de camundongos...............................................................
69
4.5. Participação dos neuropeptídeos e do CGRP nas respostas contráteis induzidas pela BK
em cólons de camundongos.............................................................................................................
71
4.6. Contribuição dos receptores vanilóides sobre a resposta contrátil induzida pela BK em
cólons de camundongos...................................................................................................................
73
4.7. Avaliação da indução in vitro do receptor B
1
para as cininas em cólons de camundongos..... 74
4.8. Estudo dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas na resposta contrátil
induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos..................................................................
75
4.9. Caracterização da colite experimental induzida por TNBS em cólons de camundongos......... 78
4.10. Avaliação da expressão dos receptores para as cininas em cólons de camundongos com
colite induzida por TNBS...................................................................................................................
81
4.11. Papel dos receptores para as cininas na colite induzida por TNBS....................................... 86
Sumário
4.12. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na colite induzida
pelo TNBS em cólons de camundongos: papel dos inibidores de síntese protéica........................
87
4.13. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na colite induzida
pelo TNBS em cólons de camundongos: papel da fosfatidil inositol-3-quinase γ (PI3Kγ)...............
89
4.14. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na colite induzida
pelo TNBS em cólons de camundongos: papel do fator nuclear-κB (NF-κB)..................................
91
4.15. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na colite induzida
pelo TNBS em cólons de camundongos: papel do fator de necrose tumoral- α (TNFα).................
93
4.16. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na colite induzida
pelo TNBS em cólons de camundongos: papel da óxido nítrico sintase indutível (iNOS)...............
96
4.17. Efeito dos antagonistas seletivos dos receptores B
1
e B
2
sobre a resposta contrátil induzida
pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS............................
98
4.18. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo agonista B
1
, des-
Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por TNBS: papel do cálcio extracelular
e de canais de cálcio do tipo L..........................................................................................................
99
4.19. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo agonista B
1
, des-
Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por TNBS: papel da via do ácido
araquidônico......................................................................................................................................
101
4.20. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo agonista B
1
, des-
Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por TNBS: papel do óxido nítrico (NO)
104
4.21. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo agonista B
1
, des-
Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por TNBS: papel das proteínas
quinases............................................................................................................................................
106
5. DISCUSSÃO................................................................................................................................ 108
5.1. Respostas contráteis induzidas pela BK e seus análogos em cólons de
camundongos....................................................................................................................................
108
5.2. Avaliação das cininas e seus receptores B
1
e B
2
em cólons de camundongos com colite
induzida por TNBS...........................................................................................................................
118
5.3. Estudo de alguns dos mecanismos envolvidos na indução do receptor B
1
em cólons de
camundongos com colite induzida por TNBS...................................................................................
123
Sumário
5.4. Análise das respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos
obtidos após a indução da colite por TNBS......................................................................................
134
6. SUMÁRIO E CONCLUSÕES....................................................................................................... 143
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................ 146
8. ANEXOS...................................................................................................................................... 170
9. PUBLICAÇÕES........................................................................................................................... 171
Abreviaturas
i
APCs: Célula apresentadora de antígeno
antigen-presenting cell
AZA: Azatioprina
BK: Bradicinina
B
1
R
-/-
: Animal com deleção gênica para o receptor B
1
B
2
R
-/-
: Animal com deleção gênica para o receptor B
2
CD: Crohn’s disease
CCh: Carbacol
CGRP: Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina
COX: Ciclooxigenase
DAG: Diacilglicerol
DAK: des-Arg
10
-Kallidin
DNAc: DNA complementar
FDA: Food and Drug Administration
IBD: Inflammatory Bowel Disease
ICAM: Intercellular Adhesion Molecule
IL: Interleucina
IP3: Inositol-trifosfato
LPS: Lipopolissacarídeo
LOX: Lipooxigenase
MPO: Mieloperoxidase
MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase
mRNA: Ácido ribonucleico mensageiro
NFκB: Fator Nuclear- κ B
Nuclear Factor-κ B
NIH: National Institute of Health
NO: Óxido nítrico
Nitric Oxide
NOD: Nucleotide-Binding Oligomerization Domain
NSAIDs: Antiinflamatórios não esteroidais
non steroidal anti-inflammatory drugs
OCTN: Organic Cation Transporter
PAF: Fator de ativação plaquetária
PI3Kγ: Fosfatidilinositol-3-quinase γ
Abreviaturas
ii
RT-PCR: Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polymerase
reverse transcriptase - polymerase chain reaction
SNC: Sistema Nervoso Central
SNE: Sistema Nervoso Entérico
SNP: Sistema Nervoso Periférico
T
H
: T helper cell
TNF: Fator de Necrose Tumoral
TNBS: Ácido-2,4,6 trinitrobenzeno-sulfônico
TTX: Tetrodotoxina
UC: Ulcerative Colitis
VCAM : Vascular-cell adhesion molecule
6-MP: 6-mercaptopurina
Lista de Figuras
iii
Figura 1. Características dos cólons para montagem no órgão isolado.................
38
Figura 2. Protocolo de indução da colite por TNBS em camundongos juntamente
com os tratamentos in vivo.......................................................................................
48
Figura 3. Análise das respostas contráteis induzidas pelas cininas em cólons
isolados de camundongos.......................................................................................
62
Figura 4. Efeito dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas na
resposta contrátil induzida pela BK em cólons de camundongos............................
64
Figura 5. Papel do cálcio extracelular e de canais de cálcio na resposta contrátil
induzida pela BK em cólons isolados de camundongos..........................................
66
Figura 6. Papel do sistema colinérgico e de canais de sódio na resposta contrátil
induzida pela BK em cólons isolados de camundongos..........................................
68
Figura 7. Papel dos derivados da via do ácido araquidônico sobre a resposta
contrátil induzida pela BK em cólons isolados de camundongos............................
70
Figura 8. Papel dos neuropeptídeos e do CGRP na resposta contrátil induzida
pela BK em cólons isolados de camundongos........................................................
72
Figura 9. Papel do receptor vanilóide TRPV1 na resposta contrátil induzida pela
BK em cólons isolados de camundongos.................................................................
73
Figura 10. Avaliação da indução in vitro do receptor B
1
para as cininas em cólons
de camundongos......................................................................................................
Figura 11. Efeito dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas na
resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de
camundongos...........................................................................................................
75
76
Figura 12. Efeito dos antagonistas seletivos para o receptor B
1
das cininas sobre
a resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de
camundongos..........................................................................................................
77
Figura 13. Avaliação do dano macroscópico e da atividade da MPO em cólons
de camundongos com colite experimental induzida pelo TNBS..............................
79
Figura 14. Avaliação do dano microscópico em cólons de camundongos com
colite induzida pelo TNBS........................................................................................
80
Figura 15. Análise da resposta contrátil induzida pelas cininas em cólons de
camundongos controle ou com colite induzida por TNBS.......................................
82
Figura 16. Avaliação da união específica para os receptores das cininas em
cólons de camundongos controle ou com colite induzida por TNBS.......................
84
Lista de Figuras
iv
Figura 17. Avaliação da expressão do RNAm para os receptores das cininas em
cólons de camundongo com colite induzida por TNBS...........................................
85
Figura 18. Avaliação do dano macroscópico e da atividade da MPO em cólons
de camundongos com deleção gênica para os receptores das cininas com colite
induzida por TNBS...................................................................................................
86
Figura 19. Efeito dos inibidores de síntese protéica sobre a indução do receptor
B
1
in vivo em cólons de camundongos com colite induzida pelo
TNBS.......................................................................................................................
88
Figura 20. Efeito do inibidor da fosfatidil inositol-3-quinase γ (PI3Kγ) sobre a
indução do receptor B
1
in vivo em camundongos com colite induzida pelo
TNBS.......................................................................................................................
90
Figura 21. Efeito do inibidor do fator nuclear κB (NF-κB) sobre a indução do
receptor B
1
in vivo em cólons de camundongos com colite induzida
peloTNBS.................................................................................................................
92
Figura 22. Papel do fator de necrose tumoral-α (TNFα) sobre a indução do
receptor B
1
in vivo em cólons de camundongos com colite induzida pelo
TNBS.......................................................................................................................
95
Figura 23. Papel da óxido nítrico sintase indutível (iNOS) sobre a indução do
receptor B
1
in vivo em cólons de camundongos com colite induzida pelo
TNBS.......................................................................................................................
97
Figura 24. Efeito dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas
sobre a resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos
com colite induzida pelo TNBS.................................................................................
99
Figura 25. Papel do cálcio extracelular e canais de cálcio na resposta contrátil
induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida pelo
TNBS.......................................................................................................................
100
Figura 26. Efeito dos inibidores da fosfolipase na resposta contrátil induzida pela
des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida pelo
TNBS.......................................................................................................................
102
Figura 27. Efeito dos inibidores das ciclooxigenases e do antagonista do
receptor de LTD
4
na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de
camundongos com colite induzida pelo TNBS.........................................................
103
Figura 28. Efeito dos inibidores das NOS na resposta contrátil induzida pela des-
Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS.....................
105
Figura 29. Efeito dos inibidores das proteínas quinases na resposta contrátil
induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida
peloTNBS..................................................................................................................
107
Lista de Figuras
v
Figura 30. Vias de transdução de sinal que estão associadas às respostas das
cininas.......................................................................................................................
141
Figura 31. Exemplo de algumas vias de sinalização celular, que podem
influenciar na indução dos receptores B
1
e B
2
para as cininas na colite por
TNBS........................................................................................................................
142
Lista de Tabelas
vi
Tabela 1. Modelos animais de inflamação intestinal crônica..................................
21
Tabela 2. Escala usada para avaliação do dano macroscópico na colite induzida
por TNBS.................................................................................................................
36
Tabela 3. Escala utilizada para avaliação do dano microscópico na colite
induzida por TNBS..................................................................................................
39
Tabela 4. Ordem de potências relativas para diferentes agonistas cininérgicos
em preparações de cólons isolados de camundongos ..........................................
63
Resumo
vii
Resumo:
O objetivo do presente estudo foi analisar através de técnicas farmacológicas alguns
dos possíveis mecanismos envolvidos na resposta contrátil induzida pelas cininas
em cólons normais ou com colite por TNBS, bem como, avaliar a contribuição das
cininas na inflammatory bowel disease (IBD). No presente trabalho foi constatado
que a contração induzida pela BK e análogos é mediada por receptores do tipo B
2
e
não por receptores do tipo B
1
indicando assim que esses receptores não são
expressos de maneira constitutiva nessa preparação. Além disso, foi demonstrado
que a resposta contrátil à BK é mediada pelo influxo de cálcio externo, ativação de
canais de cálcio do tipo L e N, liberação neuronal de acetilcolina, pela participação
de neuropeptídeos, prostanóides, leucotrienos e pelo TRPV1. Este estudo
demonstrou que o receptor B
1
pode ser induzido in vitro após a montagem das
preparações alcançando respostas contráteis máximas nos tempos de 6-8 h. Os
resultados também mostraram que a colite promove aumento da resposta contrátil à
BK e a des-Arg
9
-BK sugerindo a indução dos receptores B
1
e B
2
. Essa hipótese foi
confirmada através da realização do ensaio de união específica com os ligantes [
3
H]-
BK ou [
3
H]-des-Arg
10
-calidina, os quais revelaram aumento na densidade de ambos
os receptores B
1
e B
2
sem, no entanto, causar alteração da afinidade desses
receptores pelo agonista. Ademais, foi constatado que na colite ocorreu aumento da
expressão do RNAm para os receptores das cininas. Além disso, confirmou-se
também, pela utilização de animais com deleção gênica para os receptores B
1
ou B
2
,
que ambos os receptores são necessários para a indução do dano tecidual colônico.
Por outro lado, foi verificada que a indução in vivo do receptor B
1
é dependente de
síntese protéica, PI3Kγ, NF-κB, TNFα e da participação da iNOS. Finalmente, os
estudos também indicam que a resposta contrátil induzida pelo agonista B
1
a des-
Arg
9
-BK envolve o influxo de cálcio externo, a ativação de canais de cálcio do tipo L,
da degradação do ácido araquidônico bem como de seus metabólitos, de enzimas
iNOS e eNOS e proteínas quinases PKA, PKC, PI3Kγ e MEK. Os resultados do
presente trabalho contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos
envolvidos nas respostas contráteis mediadas pelos receptores B
1
e B
2
, bem como o
papel desses receptores na colite ulcerativa contribuindo assim para o
desenvolvimento de uma nova terapia para a IBD
Abstract
viii
Abstract:
The present study aimed to analyze, using pharmacological approaches, some of the
mechanisms involved in kinin-induced contractile responses of the normal and
inflamed mouse colon, as well as evaluate the contribution of the kinin system into
inflammatory bowel disease. In the present work we demonstrated that the BK-
induced contraction in the mouse colon is mediated by the B
2
receptor, whereas the
selective B
1
receptor agonist des-Arg
9
-BK had no effect. The BK-induced contraction
revealed the involvement of the external calcium influx, activation of L-and N-type
voltage-gated calcium channels, neural release of acetylcholine, the participation of
neuropeptides, prostanoids, leukotrienes and TRPV1. This study also demonstrated
that the B
1
receptor is not constitutive expressed in the mouse colon, however 6-8 h
after set up of the preparations, time-dependent induction of this receptor occurs.
Ours results revealed that TNBS-induced colitis was associated with a striking
increase of both B
1
and B
2
receptor-mediated contractile responses and suggest that
colitis is capable of causing an enhancement of kinin receptor population. This data
also was assessed by means of saturation binding studies using [
3
H]-BK or [
3
H]-des-
Arg
10
-kallidin which revealed a marked increase in B
1
and B
2
densities, without
alterations of affinities. Moreover, it was demonstrated that colitis leads to an
increase of B
1
and B
2
receptors mRNA expression and by use of knockout mice was
also confirmed that both B
1
and B
2
receptors are essential to colon damage. This
study provided evidences on the relevance of protein synthesis, PI3Kγ, NF-κB, TNFα
and the participation of iNOS in the in vivo induction of B
1
receptors. Besides, it was
demonstrated that the des-Arg
9
-BK-induced contraction following colitis can be
modulated by external calcium influx, activation of voltage-gated L calcium channels,
the derivatives of the araquidonic acid, the iNOS and eNOS as well as the
contribution of PKA, PKC, PI3Kγ e MEK. Together, these results leads to a better
comprehension into the mechanisms involved in kinin B
1
and B
2
mediated contraction
and the role of these receptors in the genesis and maintenance of ulcerative colitis,
contributing to the future therapeutic options for treating inflammatory bowel
diseases.
Key-words: Bradykinin, des-Arg
9
-BK, inflammatory bowel disease, contractile
mechanisms, receptor densities, mRNA expression, pro-inflammatory peptides.
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doenças inflamatórias intestinais
A função intestinal varia bastante, não apenas de um indivíduo para outro,
mas também no mesmo indivíduo em momentos diferentes. A homeostasia intestinal
pode ser afetada pela dieta, estresse, medicação, doenças e por padrões culturais e
sociais (Lerebours et al., 2006). As patologias que acometem o trato gastrointestinal
têm merecido maior atenção nas últimas décadas, pois, de forma generalizada
podem desencadear desconforto, quadros de depressão e até a invalidez do
indivíduo (Schottenfeld e Beebe-Dimmer, 2006; Varghese et al., 2006; Baumgart e
Carding, 2007).
As doenças conhecidas como doenças inflamatórias do intestino (do inglês,
Inflammatory Bowel Disease, IBD), são clinicamente classificadas em doença de
Crohn (do inglês Crohn’s disease, CD) e colite ulcerativa (do inglês ulcerative colitis,
UC). A primeira descrição médica de uma patologia que envolveria o intestino
(denominada mais tarde como CD) foi realizada pelo médico alemão Wilhelm Fabry
em 1623. Anos depois, houve a descrição da colite ulcerativa em 1859, com a
publicação feita pelo Doutor Samuel Wilks. Posteriormente, em 1932, com a
publicação dos Doutores Burrill B. Crohn, Gordon Oppenheimer e Leon Ginzburg, a
inflamação intestinal passou a ser denominada de doença de Crohn (para revisão
ver: Lichtenstein, 2006; Baumgart e Carding, 2007). Desde as primeiras descrições,
estabeleceu-se que a doença de Crohn pode afetar qualquer parte do trato
gastrointestinal, enquanto que a colite ulcerativa é restrita ao cólon e o reto (Bouma
e Strober, 2003; Lichtenstein et al., 2006). Ambas as doenças possuem sintomas
Introdução
2
bastante similares incluindo dor abdominal, sangramento retal, diarréia,
desidratação, perda de peso, letargia, dispepsia e em alguns casos ocorrendo ainda
problemas de erupções cutâneas, inflamações oculares (uveíte), problemas de
ordem psico-social como a depressão e disfunções endócrinas (Hanauer e Present,
2003; Varghese et al., 2006).
Quanto à localização geográfica, a CD e a UC apresentam-se como doenças
gastrointestinais de países desenvolvidos. Estudos populacionais sobre a
prevalência da IBD sugerem que aproximadamente um em duzentos e cinqüenta
europeus, está ou poderá ser afetados pela IBD durante a vida (Shivananda et al.,
1996; Bouma e Strober, 2003). Contudo, até a última década, uma baixa prevalência
da doença foi encontrada em outras partes do mundo, incluindo Europa Oriental,
América do Sul, Ásia e a região do Oceano Pacífico. No entanto, novos estudos
indicam que a epidemiologia da IBD está em ascensão em áreas consideradas de
baixa incidência, enquanto que em outras como o oeste da Europa e a América do
norte tem-se observado uma aparente estabilização no número de casos de IBD
(Lakatos, 2006; Baumgart e Carding, 2007).
A etiologia da IBD ainda não está completamente esclarecida. Algumas
hipóteses postulam que a IBD é uma doença multifatorial. Os fatores que estariam
envolvidos compreenderiam: respostas imunes inapropriadas da mucosa intestinal
envolvendo antígenos provenientes da flora bacteriana comensal, susceptibilidade
genética, alterações relevantes na composição da flora bacteriana (inclusão de
patógenos até então não identificados), deficiência no sistema imune inato, defeitos
na camada epitelial intestinal, apresentação anormal de antígenos intraluminais por
células apresentadoras de antígenos (do inglês antigen-presenting cells, APCs),
desregulação das respostas das células mononucleares da lâmina própria,
Introdução
3
exposição exacerbada a mediadores pró-inflamatórios e exposição ambiental
inadequada (Podolsky, 2002; Bouma e Strober, 2003; Bamias e Cominelli, 2007;
Baumgart e Carding, 2007).
Muitos dados obtidos de pacientes com doenças intestinais e trabalhos
publicados com modelos animais de inflamação intestinal sugerem que a CD e a UC
resultam de respostas imunes inadequadas frente a patógenos entéricos em
indivíduos susceptíveis (para revisão ver: Farrell e Peppercorn, 2002). Essa
predisposição não envolveria somente fatores genéticos, mas também o ambiente
ao qual o indivíduo é exposto. Esses fatores ambientais incluiriam o estresse
psicológico, a intolerância a alguns fármacos, como as drogas antiinflamatórias não
esteroidais (do inglês non steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs), infecções
excessivas e o não recebimento de leite materno na infância (Theis e Boyko, 1994;
Wurzelmann et al., 1994; Corrao et al., 1998). Trabalhos como o de Qiu et al., (1999)
demonstraram que o estresse provocado em camundongos aumenta a
permeabilidade intestinal, o que pode colaborar para a instalação de um quadro
infeccioso. Contudo, no que diz respeito aos fatores ambientais e a IBD, o aspecto
mais curioso envolve o ato de fumar cigarros, onde devido à nicotina, fumantes
parecem desenvolver uma proteção contra o desenvolvimento de UC, mas não para
a CD. Tem sido demonstrado que o ato de fumar cigarros, concomitante à exposição
à nicotina afeta a imunidade celular (inibindo respostas do tipo T
H
2, reduzindo a
concentração de citocinas pró-inflamatórias), aumenta a produção de muco no cólon,
reduz a motilidade intestinal, mas não afeta a permeabilidade intestinal (Sher et al.,
1999).
Dentre os diversos fatores que estão associados à IBD, os genéticos
colaboram grandemente para o entendimento da doença. Primeiramente, estudos
Introdução
4
com gêmeos monozigóticos e dizigóticos indicaram que a CD e a UC apresentam
maior correlação entre gêmeos monozigóticos do que dizigóticos (Tysk et al., 1988;
Orholm et al., 1991). Além disso, Hugot et al., (1996) realizaram o mapeamento de
um locus do cromossomo 16 relacionado à susceptibilidade à CD. Dessa forma, foi
possível avaliar, através de dados epidemiológicos a alta herdabilidade associada à
IBD, com uma ocorrência familiar para parentes de primeiro grau variando entre 2 e
22 %. Nos últimos anos, muito se tem descoberto acerca dos genes que podem
estar associados à IBD. Em particular, o primeiro gene específico associado com a
CD identificado foi o membro 15 da família dos domínios de ativação e recrutamento
de caspases (do inglês caspase activation and recruitment domain molecule 15,
CARD15; também conhecido como NOD2, do inglês nucleotide-binding
oligomerization domain 2) (Hugot et al., 2001; Ogura et al., 2001). Progressivamente,
seguiram-se identificações de regiões do genoma humano através de mapeamento
de ligações usando-se marcadores microsatélites com graus variados de influência
sobre a susceptibilidade à IBD; dessa forma foi possível a identificação de 9 loci
denominados IBD 1-9. Entretanto, alguns loci parecem ser específicos para a CD
como o IBD 1, ou para a UC como IBD 2 e outros como o IBD 3 estão associados
com ambas CD e UC, no que diz respeito à inflamação na região do cólon.
Interessantemente, a região IBD 5 está sendo sugerida como uma possível região
de susceptibilidade à CD em pacientes jovens, devido à presença dentro dela de
variantes gênicas; esses genes são chamados de transportadores de cátions
orgânicos (do inglês organic cation trasnsporter, OCTN; com modificações quanto a
posição, sendo atribuída a nomenclatura OCTN1 e OCTN2) (para revisão ver: Gaya,
2006; Baumgart e Carding, 2007).
Introdução
5
Outros dois grupos de genes têm demonstrado um potencial de ligação com
IBD, são eles, o da resistência a múltiplas drogas (do inglês multidrug resistence
member 1, MDR1, também conhecido como ABCB1, do inglês ATP-binding cassette
subfamily B member 1) e o drosophila disc large homologue 5 gene (DLG5). Quanto
ao gene da MDR1, sabe-se que camundongos com deleção gênica para essa
proteína produzem enterocolite espontânea (Ho et al., 2006). Entretanto, a possível
participação do gene DLG5 surgiu de pesquisas realizadas por Stoll et al., (2004) em
pacientes europeus com diagnóstico de IBD. Nesses pacientes foram descobertas
mutações no gene DLG5 postulado como sendo importante na manutenção de
células epiteliais e adequada permeabilidade intestinal. Mutações nesse gene
aumentariam o risco para o desenvolvimento de IBD.
Intrinsecamente relacionados aos fatores ambientais e genéticos estão os que
podem direcionar a resposta inflamatória; dentre esses se encontra o fator de
transcrição nuclear κB (do inglês nuclear factor-κB, NF-κB). Esse fator nuclear foi
primeiramente identificado como sendo regulador da expressão do gene que codifica
a cadeia leve chamada de kappa (daí a simbologia κ da sigla NF-κB) em linfócitos B
de murinos (Sen e Baltimore, 1986). Posteriormente, sua expressão foi identificada
em diferentes tipos celulares. O NF-κB, se apresenta comumente como um
heterodímero que usualmente consiste de duas proteínas, a subunidade p65
(também chamada de relA) e a subunidade p50. Outras subunidades como rel, relB,
vrel e p52, também são encontradas na forma ativa do NF-κB e ativam diferentes
genes. Em células não estimuladas, o NF-κB é encontrado no citoplasma ligado a
duas proteínas chamadas de IκBα e IκBβ que impedem a migração desnecessária
do NF-κB para o núcleo celular (Baldwin, 1996). Na ocorrência de um estímulo
específico, a proteína quinase IKK fosforila as proteínas IκB, sinalizando para uma
Introdução
6
subseqüente degradação proteosomal, e assim, o NF-κB é direcionado até o núcleo,
onde se liga em seqüências de regiões promotoras de genes específicos (Bauerle e
Baltimore, 1996; Ghosh e Karin, 2002). Vários estímulos podem desencadear a
ativação do NF-κB, incluindo vírus, citocinas, proteínas quinases como a proteína
quinase C (PKC), espécies reativas de oxigênio, dentre outros. Sua ativação está
grandemente relacionada à ativação de genes para muitas citocinas, quimiocinas,
enzimas e moléculas de adesão, todas importantes para a sinalização e
perpetuação da inflamação (Barnes et al., 1997; Ben-Neriah e Schmidt-Supprian,
2007). Contudo, muitos mediadores formados pela ativação do NF-κB promovem
nova ativação no NF-κB, constituindo um sistema de amplificação e continuidade do
processo inflamatório (Barnes et al., 1997; Ben-Neriah e Schmidt-Supprian, 2007;
Nenci et al., 2007).
No que diz respeito à IBD, o NF-κB aumenta a expressão de enzimas como a
sintase do óxido nítrico indutível (do inglês inducible nitric oxide synthase, iNOS) em
células epiteliais do cólon em pacientes com UC (Lundberg et al., 1994). Outro
exemplo de regulação pelo NF-κB é o aumento da expressão da ciclooxigenase-2
com conseqüente aumento da produção de prostaglandinas em processos
inflamatórios como a artrite sinovial e a IBD (Croffort et al., 1994; Subbaramaiah et
al., 2004). O NF-κB, em parte, é fundamental para que ocorra o recrutamento e a
adesão de neutrófilos, eosinófilos e linfócitos T da circulação para o sítio da
inflamação em doenças inflamatórias crônicas. Na IBD e em outras patologias, o NF-
κB regula a expressão de mais de 200 genes responsáveis pela transcrição de
citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão como às moléculas de adesão
intercelulares 1 (do inglês intercellular adhesion molecule 1, ICAM1) e moléculas de
adesão de células vasculares (do inglês vascular-cell adhesion molecule 1, VCAM1)
Introdução
7
e E-selectinas (Barnes e Karin, 1997). Desse modo, o papel do NF-κB, na IBD tem
sido revisto e trabalhos recentes, como o de Ben-Neriah e Schmidt-Supprian (2007),
merecem destaque. Nesse estudo tem-se a idéia de que a estabilização do NF-κB
em experimentos realizados em animais com deficiência gênica para a IKK (IKKα,
IKKβ ou a IKKγ também conhecida como NEMO, do inglês NF-κB essential
modulator), conduz a um processo inflamatório redirecionado para a ativação de
células dendríticas, com um aumento de citocinas como IL-12 e IL-23 que
colaborariam para uma resposta do tipo T
H
1, com produção de INFγ e IL-17, o que
culminaria na ativação de macrófagos, acumulação de neutrófilos e dano tecidual.
Além disso, as citocinas desempenham um importante papel no
direcionamento da resposta inflamatória na IBD. Essas realizam importantes funções
na modulação do sistema imune. As citocinas são rapidamente sintetizadas e
secretadas por células inflamatórias mediante estimulação e induzem a expressão
de moléculas de adesão e a produção de outros mediadores inflamatórios
(Cominelli, 2004). As citocinas que têm merecido maior atenção na última década
em relação à IBD são: citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12,
TNFα e INFγ, bem como citocinas antiinflamatórias, como o antagonista do receptor
da interleucina 1 (IL-1ra), IL-4, IL10, TGFβ e IL-11 (para revisão ver: Rogler e Andus,
1998; Cominelli, 2004).
Muitas dessas citocinas constituem alvo potencialmente relevante para o
desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. No entanto, as que trouxeram
até o momento os melhores resultados são o TNFα e a IL-12. A terapia com anti-
TNFα em pacientes com CD, utilizando o infliximab (anticorpo monoclonal quimérico
anti-TNFα), que aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) em 1998, ou
drogas como a talidomida (inibidor da produção de TNFα), não proporcionaram a
Introdução
8
cura, mas permitiram a remissão da doença em muitos dos casos (Ehrenpreis et al.,
1999; Kim et al., 2004). Em relação à terapia com anti-IL-12, essa contribuiu para
uma melhora significativa do quadro clínico de pacientes com CD (Mannon et al.,
2004). Entretanto, atualmente novas pesquisas estão sendo direcionadas a citocinas
até então pouco exploradas na IBD, como a IL-7 e seu receptor IL-7R, uma vez que
animais com deleção gênica para essa citocina não desenvolvem UC (para revisão
ver: Ogata e Hibi, 2003) e a IL-23, que está sendo apresentada como a citocina que
coordenaria as respostas imunes do intestino e seria a responsável pela
perpetuação da inflamação intestinal (para revisão ver: Neurath, 2007).
Paralelamente ao estudo das vias pró-inflamatórias ou antiinflamatórias que
envolvem as citocinas na IBD, outros estudos estão sendo conduzidos procurando
avaliar alguns dos mecanismos intracelulares de ativação da resposta inflamatória,
como por exemplo, as proteínas quinases ativadas por mitógenos (do inglês mitogen
activated protein kinases, MAPK). As MAPKs constituem a principal cascata pró-
inflamatória abrangendo desde a membrana celular até o núcleo celular e, portanto,
representam um importante alvo para a imuno-modulação. Estas são subdivididas
em três principais módulos de sinalização: ERK1/2, JNK e p38-MAPK (Waetzig e
Schereiber, 2003). A sinalização ERK 1/2 está envolvida na regulação do
crescimento celular, na proliferação, na sobrevivência e em processos inflamatórios;
já a sinalização através da JNK está envolvida na proliferação celular e na apoptose,
enquanto que a via da p38-MAPK está associada com o crescimento celular,
diferenciação, morte celular e o processo inflamatório (Waetzig e Schreiber, 2003).
Além disso, foram encontrados altos níveis de expressão da JNK e da p38-MAPK
em biópsias de intestino de pacientes com CD, quando em comparação com os
respectivos controles (Waetzig et al., 2001, 2002). Foi também demonstrado que o
Introdução
9
tratamento de pacientes com CD com o inibidor CNI-1493 (um gyanylhydrazone,
inibidor da p38-MAPK e da JNK) proporcionou significante melhora clínica e
atenuação da severidade da doença (Hommes et al., 2002). Ademais, em trabalhos
recentes, como o de Hollembach et al., (2005) foi possível estabelecer uma
importante relação entre a p38-MAPK e a UC - nesse trabalho, o tratamento com o
SB 203580 (inibidor da p38-MAPK) em camundongos com colite experimental
induzida por ácido-2,4,6 trinitrobenzeno-sulfônico (TNBS) foi capaz de atenuar a
resposta inflamatória de maneira significativa.
Investigações sobre a relação entre o óxido nítrico (NO) e a inflamação
intestinal tiveram início nos anos 90. Entretanto, até o momento, são controversos os
dados que indicam seus benefícios ou malefícios. No entanto, no trato
gastrointestinal o NO é grandemente sintetizado pelas enzimas eNOS (óxido nítrico
sintase endotelial) e nNOS (óxido nítrico sintase neuronal) e também pela iNOS
(óxido nítrico sintase indutível), presente constitutivamente pois, o tubo digestivo é
exposto diretamente a antígenos e a diversos produtos bacterianos que funcionam
como estímulo para sua indução (Nathan e Xie, 1994). No trato gastrointestinal, o
NO possui diversas funções, contudo a mais relevante é a de modular a
permeabilidade da mucosa intestinal (Kubes, 1992). Quanto à IBD, os dados mais
substanciais se referem à iNOS e seu papel no processo inflamatório intestinal. Em
trabalhos com modelo animal (cobaia) de colite induzida por TNBS os resultados
indicam que o tratamento oral com a N
G
-Nitro-L-arginine methyl ester hydrocloride (L-
NAME) diminuiu todos os sinais inflamatórios avaliados, como adesão tecidual,
ulceração e migração celular (Miller et al., 1993). Já no modelo de colite espontânea
com o macaco Rhesus, o inibidor N
6
-(1-Iminoethyl)-L-lysine hidrocloride (L-NIL)
proporcionou a redução da diarréia (Ribbons et al., 1995). Entretanto, pesquisas
Introdução
10
complementares foram realizadas incluindo não somente a iNOS mas a eNOS e a
nNOS, na tentativa de se elucidar o papel do NO na colite. O trabalho de Sasaki et
al., (2003), utilizando camundongos com deleção gênica para a eNOS (eNOS
-/-
),
sugere um papel fundamental da eNOS na proteção contra os danos da mucosa
intestinal e na diminuição da exacerbada migração celular no modelo de colite por
dextran sulfato de sódio (DSS); sugerindo assim, novos investimentos científicos
para uma terapia que envolva a eNOS. No que se refere à eNOS, de modo
interessante, também é descrito na literatura que indivíduos com IBD não
apresentam sua expressão alterada quando comparado com indivíduos saudáveis
(Dijkstra et al., 1998; Kubes e MacCafferty 2000; Sasaki et al., 2003). Quanto à
nNOS, é demonstrado na literatura seu papel protetor na colite por DSS em
camundongos, uma vez que animais com deleção gênica para essa enzima
apresentam quadros de colite severa (Beck et al., 2004).
A regulação das funções intestinais é delineada por uma série de sistemas
que permeiam várias classes de neurotransmissores e neuromoduladores. Os
neuropeptídeos como a substância P (SP), a neurocinina A (NKA), o peptídeo
relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), o polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP)
e o neuropeptídeo Y, participam do controle da motilidade, da secreção de eletrólitos
e fluídos, na circulação e na homeostasia tecidual intestinal. Fármacos que modulam
o sistema de taquicininas (juntamente com seus receptores NK
1
, NK
2
e NK
3
) e o
CGRP têm despertado grande interesse quanto à IBD, pois, estes são conhecidos
por ações antiespasmódicas, antidiarréicas, antiinflamatórias e no alívio da dor
visceral (para a revisão ver: Holzer, 1998). Alguns poucos estudos têm demonstrado
que na colite experimental, antagonistas para os receptores NK
1
e NK
3
possuem
efeitos benéficos na proteção contra o dano tecidual, na redução da diarréia, na
Introdução
11
diminuição da hiperalgesia e na redução significativa da infiltração de neutrófilos
(Stucchi et al., 2000; Moriarty et al., 2001).
1.2. O sistema calicreína-cininas e o trato gastrointestinal
1.2.1. Histórico das cininas
Os primeiros registros sobre as ações das cininas surgiram em 1909, quando
Abelous e Bardier (1909) descreveram que a injeção endovenosa de uma fração da
urina humana insolúvel em álcool produzia queda transitória da pressão sanguínea
em cães. Entretanto, somente anos mais tarde, com os trabalhos de Frey et al.,
(1926), foi verificada que essa fração da urina humana gerava hipotensão em
diferentes espécies animais. Contudo, esse efeito hipotensor foi atribuído na época a
uma substância caracterizada por ser termolábil e não dializável presente na urina.
Estudos posteriores de Kraut et al., (1930) denominaram tal substância como sendo
um hormônio circulante encontrado principalmente em órgãos como o pâncreas.
Posteriormente, essa substância foi chamada de calicreína (do grego: kallikreas para
pâncreas). Werle et al., (1937) observaram que a calicreína, quando incubada no
plasma, liberava uma potente substância estimuladora do músculo liso, sendo que
essa substância não era derivada da quebra da calicreína, mas sim, da quebra de
uma proteína plasmática; dessa forma, foi concluído que este produto
farmacologicamente ativo era liberado de um precursor através da ação proteolítica
da enzima calicreína. Esse produto com atividade farmacológica foi denominado de
calidina.
Introdução
12
Anos mais tarde, Rocha e Silva et al., (1949) observaram que a incubação do
veneno da serpente Bothrops jararaca, ou de tripsina, com a fração pseudoglobulina
do plasma, causava a liberação de um potente agente hipotensor e contracturante.
Esse novo agente foi definido como sendo um polipetídeo produzido por ação
enzimática, a partir de proteínas plasmáticas. Essa nova substância produzia uma
resposta contrátil lenta em relação àquela causada por histamina ou acetilcolina,
quando avaliada em preparações de íleo isolado de cobaia. Desse modo, os autores
sugeriram o nome bradicinina (BK) para definir esse novo agente (do grego: bradys
para lento; kinesia para movimento). Na realização de novas pesquisas, Werle e
Maier, (1952) observaram que a BK e a calidina (Lys-BK) eram formadas em
condições similares e apresentavam as mesmas ações farmacológicas, sugerindo
que ambas poderiam estar relacionadas ao mesmo substrato. Posteriormente,
Boissonas et al., (1960), na tentativa de elucidar a similaridade da BK e da Lys-BK,
determinaram a seqüência correta para a BK e assim, sintetizaram o nonapetídeo
composto por: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Desse modo, com a
possibilidade de se produzir BK sinteticamente, iniciou-se a caracterização fisiológica
e farmacológica da BK e seus análogos.
Os primeiros estudos realizados demonstraram que a BK produzia contração
em diversas preparações com musculatura lisa, vasodilatação, aumento da
permeabilidade vascular e dor (Lewis, 1964). Contudo, o processo rápido de
inativação das cininas na circulação levou ao desenvolvimento de substâncias
capazes de inibir a atividade das cininases. Inicialmente verificou-se que o veneno
extraído da serpente Bothrops jararaca era capaz de potencializar a contração do
íleo de cobaia ou a resposta hipotensora causada pela BK (Ferreira, 1965). O fator
responsável por este efeito foi chamado de fator potencializador da BK e sua
Introdução
13
atividade foi correlacionada com a inibição da inativação enzimática das cininas
(Ferreira e Vane, 1967). A partir desse fator foi desenvolvido o primeiro inibidor da
cininase II, o captopril (Ondetti et al., 1977).
Entretanto, somente em 1980 foi determinado que as ações das cininas são
mediadas pela ativação de receptores específicos localizados na membrana celular.
Esses receptores foram denominados B
1
e B
2
, sendo essa classificação proposta
por Regoli e Barabé (1980), com base na determinação da ordem de potência dos
seus agonistas em diversos tecidos isolados. Atualmente, são descritos inúmeros
outros papéis relevantes para a BK e outras cininas a ela relacionadas (Marceau et
al., 1998; Calixto et al., 2000; Gabra et al., 2003; Marceau e Regoli, 2004).
1.2.2. Síntese e degradação das cininas
As cininas são formadas em resposta a estímulos fisiológicos, ou durante o
processo inflamatório, a partir de precursores denominados cininogênios, que podem
ser α-globulinas de alto peso molecular (120 KDa) ou de baixo peso molecular (66
KDa), através da ação de enzimas chamadas de cininogenases conhecidas também
como calicreínas (Bhoola et al., 1992). A ação da calicreína plasmática sobre o
cininogênio de alto peso molecular resulta na formação do nonapeptídeo BK. No
entanto, a calicreína tecidual pode agir sobre cinogênios de alto e baixo peso
molecular, originando o decapeptídeo calidina (Lys-BK). A calidina pode ser
convertida em BK através da clivagem da porção N-terminal, pela ação da
aminopeptidase plasmática (Steranka et al., 1988).
Uma vez formadas, as cininas circulantes se difundem através da parede dos
vasos linfáticos aos tecidos, onde são rapidamente inativadas por várias peptidases,
Introdução
14
denominadas de cininase I, cininase II e encefalinase. O grupo das cininases I é
representado pelas enzimas carboxipeptidase N (plasma) e carboxipeptidase M
(membrana), as quais removem o aminoácido arginina da porção C-terminal das
moléculas de BK e da calidina, formando os compostos ativos des-Arg
9
-BK e a des-
Arg
10
-calidina, respectivamente (Erdös, 1990; Marceau, 1995). Por outro lado, a
cininase II é responsável por clivar o dipeptídeo da porção C-terminal da BK,
transformando-a em um metabólito inativo (Bhoola et al., 1992). E por último, a
encefalinase ou endopetidase neutra, uma metalopeptidase presente especialmente
em células epiteliais, capaz de clivar o dipeptídeo C-terminal da molécula da BK, de
maneira semelhante à cininase II (para revisão ver: Proud e Kaplan, 1988; Leeb-
Lundberg et al., 2005).
1.2.3. Os receptores para as cininas
As cininas, depois de formadas, exercem suas ações através da interação
com receptores de membrana denominados B
1
e B
2
(Regoli e Barabé, 1980;
Pesquero et al., 1996). Os receptores para as cininas pertencem à família de
receptores compostos por sete unidades transmembranares regulados e acoplados
à proteína G (Menke et al., 1994; Pesquero et al., 1996). No entanto, apesar de
serem acoplados aos mesmos mecanismos transducionais, os receptores B
1
e B
2
apresentam somente 36% de homologia na seqüência de aminoácidos, sendo essa
homologia mais evidente nas regiões transmembranares (Marceau et al., 1997; Hess
et al., 2001). Os receptores do tipo B
1
são ativados preferencialmente pelos
fragmentos des-Arg
9
-BK e pela des-Arg
10
-calidina produzidos a partir da degradação
da BK e da calidina, respectivamente. Os receptores B
1
, comumente não são
Introdução
15
expressos de forma constitutiva (com poucas exceções). Dessa forma, apresentam a
capacidade de serem induzidos em certas ocasiões como o trauma tecidual, longos
períodos de incubação in vitro, infecções, após tratamento com endotoxinas
bacterianas, citocinas pró-inflamatórias, luz ultravioleta, estresse térmico ou durante
a inflamação crônica como a IBD (Marceau e Bachvarov, 1998; Ahluwalia e Perretti,
1999; Calixto et al., 2000; Stadnicki et al., 2005). A indução dos receptores B
1
pode
ser observada na maioria das preparações in vitro com ou sem a adição de um
agente indutor (como por exemplo, o LPS). Na literatura é referida a indução desses
receptores em diversos tecidos, como íleo e aorta de ratos, cólon humano e íris de
porco (Marceau, 1995; Medeiros et al., 2004; El Sayah et al., 2006).
Diferentemente dos receptores B
1
, os receptores B
2
estão distribuídos ao
longo dos sistemas nervoso central e periférico de maneira constitutiva (Hall e
Morton, 1997) e medeiam várias respostas fisiológicas (contração da musculatura
lisa, vasodilatação, broncoconstrição, hipotensão, dor e hiperalgesia) induzidas pela
BK. As ações fisiológicas das cininas e seus respectivos receptores, principalmente,
o envolvimento desses em diversas patologias, tem sido verificado através da
utilização de antagonistas e radioligantes. Os primeiros antagonistas seletivos e
competitivos para os receptores B
2
tiveram sua estrutura baseada no protótipo [D-
Phe
7
]-BK (Vavrek e Stewart, 1985). Posteriormente, houve a síntese de antagonistas
como o Hoe 140 (conhecido como icatibante), NPC17731 e o NPC17761 (Kyle et al.,
1991). Na última década, foram desenvolvidos os antagonistas não peptídicos
seletivos para o receptor B
2
, entre eles o WIN64338, o FR173657, o FR167344, o
FR190997, o NPC18884 e o bradizide (Sawutz et al., 1994; Griesbacher et al., 1998;
De Campos et al., 1999; Gobeil et al., 1999; Watanabe et al., 1999; Burguess et al.,
Introdução
16
2000; Griesbacher e Legat, 2000; Stewart, 2003; Campos et al., 2006); testados
principalmente em processos inflamatórios e como agentes anti-câncer.
Do mesmo modo, também foi de fundamental importância para o estudo dos
receptores B
1
a síntese de antagonistas seletivos. O primeiro antagonista seguiu o
protótipo [Leu
8
]-des-Arg
9
-BK (Regoli et al., 1977; Regoli e Barabé, 1980); e sendo
assim, novos antagonistas surgiram como o [des-Arg
10
]-HOE140 e a des-Arg
9
-
NPC17731, o R715, o B9958 e o antagonista misto B
1
/B
2
, o B9430 (Stewart et al.,
1999; Regoli et al., 1998; Campos et al., 2006). Recentemente, uma nova geração
de antagonistas (quarta geração) para o receptor B
1
tem despertado grande
interesse. Esses compostos caracterizam-se pela natureza não peptídica, por
produzirem ações duradouras e por terem viabilidade para o tratamento oral. Fazem
parte dessa nova classe de antagonistas do receptor B
1
das cininas o composto
benzodiazipínico 1 (BZ-1), os compostos dihidroquinoxalinona, o 2,3-diaminopiridina,
o SSR240612, o 2-alquilamina-5-sulfamoilbenzamida e o LF220542 (Wood et al.,
2003; Gougat et al., 2004; Kuduk et al., 2004; Marceau e Regoli, 2004; Ritchie et al.,
2004; Campos et al., 2006; Porreca et al., 2006). Interessantemente, o conjunto dos
antagonistas do receptor B
1
conta com um antagonista de origem natural o
composto Velutinol A (também conhecido como MV08), que apresentou
características anti-edematogênicas e antinociceptivas quando testado em modelos
animais (Calixto et al., 1998; Mattos et al., 2006a e 2006b; Campos et al., 2006).
Ademais, estudos de união específica (binding) com radioligantes como o
[
3
H]-BK, ligante do receptor B
2
e o [
3
H]-des-Arg
10
-calidina, ligante do receptor B
1
, tem
contribuído grandemente para a caracterização das propriedades farmacológicas
desses receptores em diversas preparações teciduais e em cultura de células (Hess,
1997; Hall e Morton, 1997). Complementarmente, estudos de biologia molecular e
Introdução
17
seqüênciamento de genes realizados por McEachern et al., (1991) culminaram com
a identificação e clonagem do receptor B
2
a partir do DNA complementar (cDNA)
obtido do útero de ratas. Em seguida, este receptor foi clonado em humanos e em
camundongos (Menke et al., 1994; Pesquero et al., 1996). O receptor B
2
clonado em
humanos apresenta uma seqüência de 364 aminoácidos, possuindo 81 a 84% de
homologia com os receptores do rato e do camundongo. O receptor B
1
foi clonado
em humanos (Menke et al., 1994) e posteriormente clonado em coelhos,
camundongos, ratos, cães e macacos, apresentando uma homologia de 69 a 97%
na seqüência de aminoácidos (MacNeil et al., 1995; Pesquero et al., 1996; Ni et al.,
1998; Hess et al., 2001, 2002; Prado et al., 2002). Os receptores B
1
e B
2
foram
mapeados em humanos, no cromossomo 14q32.
Após os estudos de clonagem e seqüênciamento dos receptores B
1
e B
2
, foi
possível o desenvolvimento de linhagens de camundongos com deleção gênica para
esses receptores. Os estudos posteriores a esse advento constataram que os
receptores B
2
são importantes para o processo de inflamação, hiperalgesia,
contração e relaxamento da musculatura lisa e na modulação da pressão arterial
(Borkowski et al., 1995; Boyce et al., 1996). Já, a deleção do receptor B
1
permitiu
constatar sua importância no desenvolvimento de respostas dolorosas e
inflamatórias (Pesquero et al., 2000; Araújo et al., 2001; Ferreira et al., 2005).
1.2.4. Receptores para as cininas e suas vias de transdução
As respostas funcionais mediadas pelos receptores das cininas podem
envolver múltiplas vias de transdução e sistemas de segundos mensageiros. Os
receptores B
1
e B
2
para as cininas são preferencialmente acoplados ao mesmo tipo
Introdução
18
de proteína Gαi e Gαq (Gutowski et al., 1991; Prado et al., 2002) e na maioria das
vezes sua ativação está relacionada com a estimulação da fosfolipase C, com
conseqüente formação de inositol-trifosfato (IP
3
) e diacilglicerol (DAG). O aumento
dos níveis de IP
3
resulta em influxo de cálcio intracelular enquanto que a formação
de DAG promove ativação de isoformas específicas da proteína quinase A e C
(Schanstra et al., 1999). Os eventos celulares estimulados pelos receptores para
cininas podem ainda envolver a mobilização de cálcio, ativação de canais de
potássio sensíveis ao cálcio, transporte de íons cloreto, a ativação da adenil ciclase,
formação de NO, aumento expressivo dos níveis de prostanóides em resposta à
ativação da fosfolipase A
2
ou, ainda, ativação da via colinérgica e de proteínas
específicas como as MAPKs (Fuller et al., 1987; Reynolds et al., 1999; Schanstra et
al., 1999; Gabra et al., 2003). Ademais, outros trabalhos demonstraram que a
ativação dos receptores B
1
e B
2
pode resultar na estimulação de outras quinases,
como tirosina-quinase, fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e a esfingosina-6-quinase
(Liebmann e Böhmer, 2000; Liebmann, 2001).
1.2.5. Indução dos receptores B
1
Como mencionado anteriormente no item (1.2.3.), a indução dos receptores
B
1
tem sido evidenciada em diversas condições in vitro e in vivo, e pode ser
observada em preparações in vitro obtidas de coelhos, ratos, camundongos, suínos
e também de humanos (Marceau et al., 1998; Zhang et al., 2004). A resposta
funcional mediada através do receptor B
1
parece depender da síntese de novo de
proteínas, uma vez que na primeira hora de avaliação, comumente, essa resposta
funcional está ausente; sendo também essa resposta bloqueada em tecidos tratados
Introdução
19
com inibidores de transcrição de RNA e de tradução protéica (Campos e Calixto,
1994; Haddad et al., 2000; Sardi et al., 2000; Zhang et al., 2004). Além disso, outros
estudos in vitro mostram que certas citocinas (TNFα), fatores de crescimento e
agentes como LPS (o qual leva a síntese de citocinas) amplificam a resposta
mediada pelos receptores B
1
, em conseqüência do isolamento tecidual e da
incubação in vitro (McLean et al., 1999; Zhang et al., 2004). Alguns compostos,
como o LPS, causam a expressão do receptor B
1
quando administrados tanto in vivo
quanto in vitro (McLean et al., 1999; Calixto et al., 2004).
Desta forma, tem sido sugerido que o fenômeno de indução do receptor B
1
envolve a ativação de fatores transcricionais, incluindo o fator nuclear NF-κB. Dados
da literatura têm demonstrado que citocinas pró-inflamatórias ou o LPS induzem a
fosforilação do inibidor endógeno IκB, promovendo a ativação do NF-κB, modulando
a síntese dos receptores B
1
(Passos et al., 2004; Medeiros et al., 2004). Esse dado
passou a ser confirmado na identificação de sítios de ligação para diversos fatores
de transcrição, como AP-1, CREB e NF-κB, na região promotora do gene do
receptor B
1
(Ni et al., 1998; Leeb-Lundberg et al., 2005).
1.2.6. As cininas e a IBD
As ações das cininas no trato gastrointestinal têm sido demonstradas não
somente em animais como o rato e o gato, mas também em humanos (para revisão
ver: Clements, 1989). As cininas estão envolvidas em diferentes processos no trato
gastrointestinal como a secreção de água e eletrólitos, no transporte de íons através
do epitélio, causando aumento da permeabilidade, vasodilatação capilar, na
estimulação sensorial, hiperalgesia, na motilidade intestinal e na estimulação da
Introdução
20
produção de eicosanóides e NO (Cuthbert e Margolius, 1982; Gaginella e Kachur,
1989; Chen et al., 1995; Stadnicki, 2005b). Devido às ações exercidas pelas cininas
no trato gastrointestinal e principalmente decorrente de suas respostas inflamatórias,
nos últimos anos alguns trabalhos tentaram relacionar o sistema calicreínas-cininas
com doenças intestinais como a CD e a UC. Inicialmente, no trabalho de Zeitlin e
Smith (1973), foi demonstrada a presença de calicreínas na fase aguda da UC em
humanos e sugerida sua participação nessa patologia. Anos mais tarde, Stadnick et
al., (1996) comprovaram a melhora da inflamação intestinal em ratos com a
utilização do inibidor P8720, específico para calicreínas do plasma. Posteriormente,
trabalhos como o de Arai et al., (1999) e Kamata et al., (2002) demonstram que o
tratamento de animais com o antagonista Hoe140 ou com o FR173657 em diferentes
estudos de inflamação intestinal (colite e enterocolite), ambos os antagonistas, foram
capazes de atenuar o processo inflamatório, causar diminuição do infiltrado celular e
redução da mortalidade.
Além disso, estudos realizados recentemente por Stadnick et al., (2005)
investigaram a expressão do RNAm e a localização dos receptores para as cininas
em biópsias de intestino humano, inflamado ou não. Nesse estudo foi constatada a
presença de ambos os receptores B
1
e B
2
no epitélio intestinal não inflamado
(sugerindo um papel fisiológico não somente para o receptor B
2
, mas também para o
receptor B
1
), a expressão desses receptores nos enterócitos com localização apical
dos receptores B
1,
o aumento significativo da expressão do RNAm para o receptor
B
1
quando comparado com o receptor B
2,
o aumento significativo na concentração
protéica do receptor B
1
na UC evidenciado pela imunohistoquímica. Desse modo, foi
sugerido que o receptor B
1
parece exercer um papel importante na IBD e que as
Introdução
21
cininas podem constituir um novo e promissor alvo terapêutico para essa doença
(Stadnick et al., 2005).
1.3. Modelos animais para o estudo da IBD
Modelos animais de CD e de UC têm colaborado de maneira importante para
o entendimento da inflamação intestinal. Esses modelos são divididos em quatro
categorias: modelos de colite espontânea, modelos de colite induzida em
camundongos com respostas imunes normais (como o emprego do TNBS), modelos
de transferência adaptativa e modelos de modificação genética (deleção gênica e
transgenia) como descritos na Tabela 1 (Hibi et al., 2002; Borm e Bouma, 2004).
Tabela 1. Modelos animais de inflamação intestinal crônica
Modelos de modificação genética
Modelos de deleção gênica em camundongos
IL-2 e IL-2Rα; IL-10; STAT3; camundongo mutante para o receptor de célula T
TNF-3’ UTR; Trefoil factor (fator que confere proteção à mucosa)
Modelos de camundongos e ratos transgênicos
IL-7; STAT-4; HLA B27(rato)
Modelos de colite espontânea
Camundongos: C3H/HeJBir; SAMP/Yit. Macacos:
Rhesus monkey
Modelos de colite induzida
TNBS; Oxazolona; DSS; Carragenina; peptidoglicano-polisacarídeo
Modelos de transferência adaptativa
Transferência de células T CD4
+
/CD45RB
Células T CD8 específicas-hsp 60
IL, interleucina; IL-R, receptor para interleucina; TNF, fator de necrose tumoral; UTR, região
untranslated (não traduzida); hsp, proteínas heat-shock. Tabela adaptada de Hibi et al., (2002).
Introdução
22
Apesar de suas limitações, de forma geral, essas técnicas têm contribuído
para o entendimento dos mecanismos imunológicos, patológicos e fisiológicos, além
de serem importantes ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.
Contudo, mesmo que muitos destes modelos sejam de grande valor para a análise
experimental dos mecanismos envolvidos na IBD, poucos deles parecem reproduzir
a IBD observada em pacientes. Por esse motivo, o desenvolvimento de novos
modelos que permitam avaliar as alterações da IBD principalmente quanto à
cronicidade da doença ainda são necessários (Bouma e Strouber, 2003).
O modelo experimental escolhido para a realização deste trabalho foi o de
colite induzida quimicamente por TNBS; idealizado inicialmente por Wallace et al.,
(1989), é realizado pela administração intra-colônica da mistura de dois diferentes
compostos, o etanol, que tem a função de quebrar a barreira epitelial, e o agente
TNBS, um composto ácido inorgânico conhecido como um hapteno, que ao se ligar
a proteínas teciduais de alto peso molecular torna-se nocivo e desencadeia uma
série de respostas imunológicas.
1.4. Os tratamentos da IBD
O tratamento da CD e da UC depende de fatores distintos que incluem
principalmente a localização intestinal, a severidade e a presença ou não de
complicações (úlceras e necrose tecidual). O tratamento de cada paciente deve ser
individualizado, baseado na sintomatologia e na tolerância aos medicamentos. As
terapias hoje disponíveis tratam a fase aguda das doenças e mantém a remissão,
mas não curam definitivamente. Em casos como os de lesões pré-cancerígenas ou
Introdução
23
complicações supurativas (que podem levar à sepse) é aconselhada intervenção
cirúrgica (Lichtenstein et al., 2006; Baumgart e Carding, 2007).
Muito se tem investido na procura de uma terapêutica eficaz para o
tratamento da IBD. Contudo, as medicações existentes ainda não permitem um
tratamento satisfatório (Baumgart e Carding, 2007). Entre as alternativas
terapêuticas destacam-se: os aminosalicilatos, (compostos que liberam o ácido 5-
amino-salicílico) que correspondem à primeira classe de fármacos utilizados na IBD,
por suas ações antiinflamatórias, (Podolsky, 2002); os corticosteróides, potentes
agentes antiinflamatórios (Amsterdam et al., 2002; Lichtenstein et al., 2006); os
compostos imunomoduladores azatioprina (AZA) ou 6-mercaptopurina (6-MP),
utilizados comumente após a terapia dos corticosteróides para manutenção da
remissão da doença (Lennard, 1992; Linchtenstein, 2004); o metotrexato,
(desenhado a partir da estrutura tridimensional da enzima dihidrofolato redutase)
(Feagan et al., 1995; Lichtenstein et al., 2006); o micofenolato mofetil (MMF), inibidor
da proliferação de linfócitos por ser bloqueador seletivo da síntese de nucleotídeos
de guanosina (inibição da síntese de purinas e pirimidinas) em células T
(Papadimitriou et al., 2003; Dalle et al., 2005); a ciclosporina, descoberta nos anos
70, a qual revolucionou a terapia que tornava possível os transplantes de órgãos foi
capaz de proporcionar a manutenção da remissão da IBD sendo necessária sua
administração juntamente com 6-MP ou AZA (Cohen, 2001); na mesma linha de
ação farmacológica demonstrada para a ciclosporina, encontra-se o tacrolimus
(FK506), um derivado de Streptomyces com atividade imunossupressora, utilizado
somente nos casos onde há intolerância à ciclosporina (Lowry et al., 1999); a
talidomida, composto utilizado inicialmente como sedativo e anti-emético o qual
possui atividade anti-inflamatória e imunomoduladora sendo também um importante
Introdução
24
inibidor da produção de TNFα (Ehrenpreis et al., 1999); o infliximab, um anticorpo
monoclonal quimérico anti-TNFα, que representa uma das alternativas terapêuticas
mais promissoras, pois, em muitos pacientes (não na totalidade) proporciona a
redução dos sintomas da CD e da UC, bem como promove a manutenção da
remissão desses sintomas (Rutgeerts et al., 2004); e finalmente os antibióticos e pró-
bióticos, que servem para tratar e prevenir a IBD.
Por outro lado, o acesso à terapêutica disponível nem sempre é fácil, o que
tem causado grande interesse científico e clínico no desenvolvimento de novos
fármacos que sejam mais efetivos, seguros e baratos para o tratamento e a
manutenção da remissão da IBD (Lichtenstein et al., 2006; Baumgart e Carding,
2007). Interessantemente, estudos recentes (para revisão ver: Stadnicki, 2005)
passaram a introduzir o conceito de que o sistema calicreína-cininas pode contribuir
de maneira importante na patogênese da CD e da UC, por ser fisiologicamente
importante para as funções intestinais e por suas ações nos processos inflamatórios
e dolorosos; sendo que os receptores B
1
e B
2
estão presentes e possuem suas
expressões aumentadas no epitélio intestinal quando este se encontra inflamado.
Essas observações sugerem uma maior investigação acerca do papel das cininas e
seus receptores no trato gastrointestinal e propõem também, o envolvimento das
cininas na IBD.
Objetivos
25
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo geral do presente trabalho foi analisar, através de estudos
farmacológicos, alguns dos mecanismos envolvidos nas respostas contráteis
induzidas pelos agonistas dos receptores B
1
e B
2
para as cininas, em preparações
de cólon isolado de camundongos, bem como investigar, com o emprego de técnicas
bioquímicas e de biologia molecular a possível participação das cininas na colite
experimental induzida por TNBS.
2.2. Objetivos específicos
X Caracterizar, através do uso de agonistas e antagonistas seletivos, alguns dos
mecanismos envolvidos na resposta contrátil induzida pela BK em cólons isolados
de camundongos;
X Avaliar o perfil temporal do aumento da resposta contrátil induzida pela des-
Arg
9
-BK em cólons de camundongos;
X Estudar, as respostas funcionais, a densidade, o RNAm para os receptores B
1
e
B
2
durante a colite induzida por TNBS, bem como investigar a participação desses
receptores na gênese da UC em camundongos;
Objetivos
26
X Investigar, com o emprego de inibidores seletivos, a possível participação da
síntese protéica, da via fosfatidilinositol-3-quinase γ (PI3Kγ), do NF-κB, do TNFα, e
da iNOS na indução do receptor B
1
, na colite induzida por TNBS em camundongos;
X Analisar, com o emprego de inibidores de enzimas e de canais iônicos, alguns
dos mecanismos envolvidos nas respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em
cólons de camundongos com colite induzida por TNBS.
Material e Métodos
27
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. ANIMAIS
Para os experimentos, foram utilizados camundongos Swiss machos
provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina,
pesando entre 30 e 40 g. Além disso, utilizou-se camundongos machos com deleção
gênica para os receptores B
1
ou B
2
para as cininas (B
1
R
-/-
e B
2
R
-/-
, respectivamente)
(Pesquero et al., 2000), obtidos da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e
camundongos com deleção gênica para o receptor p55 do TNFα (TNF p55
-/-
) (Rothe
et al., 1993) ou para a enzima iNOS (iNOS
-/-
) (MacMicking et al., 1995), obtidos da
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Camundongos machos, selvagens
da linhagem C57/BL6 foram utilizados como controle.
Os animais foram mantidos em câmaras individualizadas com ar filtrado
ALESCO
®
, com temperatura e umidade controladas (22 ± 1°C, 60 a 80% de
umidade), em ciclo claro escuro de 12 h, com livre acesso a ração marca BioBase
®
e
água filtrada. Os animais Swiss tiveram um período de adaptação no biotério
laboratorial de uma semana, já os com deleção gênica permaneceram no biotério
laboratorial desde sua chegada até a fase experimental. Os experimentos foram
realizados geralmente entre as 8 e 18 h, a temperatura de 24-25°C.
Todos os procedimentos experimentais realizados neste estudo seguiram as
recomendações do Guia de Uso e Cuidados com Animais Laboratoriais do National
Institute of Health (NIH) dos Estados Unidos da América (NIH, Publicação número
85-23, revisado em 1996) e foram aprovados pelo Comitê de Ética para uso de
Material e Métodos
28
Animais da Universidade Federal de Santa Catarina (CEUA, Protocolo PP00032,
2006).
3.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DAS CININAS IN
VITRO EM CÓLONS DE CAMUNDONGOS
3.2.1. Montagem dos cólons para estudo in vitro
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e em seguida os
cólons (4 cm) foram cuidadosamente removidos e posicionados em uma placa de
vidro coberta com papel filtro umedecido com solução de Krebs-Henseleit (mM:
NaCl, 113; KCL, 4,7; CaCl
2
, 2,5; NaHCO
3
, 25; MgSO
4
, 1,1; KH
2
PO
4
, 0,9 and D-
glucose, 11; pH 7.4) aquecida à 37º C para remoção dos resíduos fecais e retirada
dos tecidos conectivos.
Para a montagem dos seguimentos de cólon na câmara para órgão isolado,
manteve-se a integridade do órgão (não foram abertos longitudinalmente) e porções
de 1,5 cm localizadas preferencialmente na região mediana do cólon, foram
montadas verticalmente em cubas individuais, banhadas com solução de Krebs-
Henseleit mantida à 37º C em um volume de 5 ml. O sistema manteve-se
constantemente aquecido e aerado com uma mistura carbogênica (5% de CO
2
em
95% de O
2
). As preparações foram submetidas a um período de equilíbrio de pelo
menos 45 min durante o qual a solução do banho foi renovada a cada 15 minutos.
Durante o experimento, os órgãos foram mantidos sob uma tensão basal de 1g. As
variações de tensão isométrica (contrações) foram registradas através de
transdutores F-60 (Narco Biosystems
®
) em polígrafo. Os experimentos foram
Material e Métodos
29
realizados com no mínimo seis animais por grupo, sendo que cada cólon rendeu no
máximo duas preparações.
Para a verificação da viabilidade das preparações de cólon, realizou-se
previamente curvas concentração-resposta cumulativas para o carbacol (CCh)
através das quais determinou-se o valor ideal (100% de contração ou resposta
máxima R
máx
). A concentração de CCh que proporcionou uma resposta homogênea
e reprodutível foi a de 100 µM, passando a ser adotada em todos os experimentos
subseqüentes para a certificação da viabilidade dos tecidos.
Todos os experimentos com a BK ou com seus peptídeos análogos foram
realizados na presença de captopril (3 µM), por 20 min, a fim de evitar sua
degradação pela ação da cininase II.
3.2.2. Análise das respostas contráteis induzidas pelas cininas em cólons de
camundongos
Após a montagem dos cólons e decorrido o período de equilíbrio, verificação
e registro da viabilidade dos mesmos, as preparações foram lavadas com solução de
Krebs-Henseleit por no mínimo três vezes até o retorno à linha de base. Curvas
concentração-resposta baseadas no método cumulativo de Van Rossum, (1963)
foram obtidas para a BK (0,1-10.000 nM) ou para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em
90 min. Com o objetivo de estabelecer um número máximo de curvas por
experimento para a BK (0,1-10.000 nM) e verificar o fenômeno de dessensibilização
dos receptores B
2
, foram realizadas, curvas concentração-resposta cumulativas
consecutivas em 90, 180 e 270 min após a montagem dos tecidos.
Material e Métodos
30
Na tentativa de se estabelecer a ordem das respostas máximas dos agonistas
para cininas, curvas concentração-resposta cumulativas foram realizadas para os
agonistas seletivos dos receptores B
2
para as cininas: BK, Hyp
3
-BK, Lys-BK, Met-
Lys-BK, Tyr
8
-BK e dos receptores B
1
des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM).
Em outra série de experimentos, com o objetivo de verificar quais subtipos de
receptores estariam envolvidos nas respostas contráteis induzidas pela BK no cólon
de camundongo, foram realizadas após o período de equilíbrio, curvas
concentração-resposta cumulativas para a BK, na ausência ou presença dos
antagonistas seletivos para o receptor B
2
Hoe 140 (3-30 nM), FR173657 (10-100
nM) ou do receptor B
1
a
des-Arg
9
-[Leu
8
]-BK (1 µM) (Drummond e Cocks, 1995; El
Sayah e Calixto, 2003a). Os antagonistas foram adicionados 10 min antes da
realização das curvas cumulativas aos agonistas.
3.2.3. Caracterização funcional dos possíveis mecanismos envolvidos na
resposta contrátil induzida pela BK em cólons de camundongos
3.2.3.1. Participação do cálcio extracelular e de canais de cálcio nas respostas
contráteis induzidas pela BK no cólon de camundongos
A fim de avaliar a contribuição do cálcio externo na resposta contrátil induzida
pela BK em cólons de camundongos, após a obtenção de uma curva concentração-
resposta cumulativa para BK, (curva controle) em solução de Krebs-Henseleit
contendo cálcio, as preparações passaram a receber uma solução de Krebs-
Henseleit modificada, ausente de cálcio e contendo o quelante de cálcio
etilenoglicol-bis (β-amino-etil éster) (EGTA 1 mM). Os cólons permaneceram nesta
Material e Métodos
31
nova solução nutritiva por 20 min sendo renovada a cada 5 min. Em seguida,
realizou-se uma curva concentração-resposta à BK, nesse meio modificado. Após o
registro dessa curva, as preparações foram novamente transferidas para a solução
de Krebs-Henseleit com cálcio, por cerca de 40 min, e realizou-se uma nova curva
concentração-resposta à BK (0,1-10.000 nM) (Campos e Calixto, 1994).
Em outro grupo experimental, avaliou-se também a participação de canais de
cálcio dependentes de voltagem na resposta contrátil induzida pela BK em cólons de
camundongos. Para tanto, curvas concentração-resposta cumulativas à BK (0,1-
10.000 nM) foram obtidas na ausência e na presença de nicardipina (antagonista de
canais de cálcio do tipo L, 1 µM) ou ω-conotoxina GVIA (bloqueador seletivo de
canais de cálcio do tipo N, 0,1 µM). As drogas foram pré-incubadas nas preparações
por 20 min, em experimentos distintos (El Sayah e Calixto, 2003b).
3.2.3.2. Envolvimento do sistema colinérgico e de canais de sódio nas
respostas contráteis induzidas pela BK em cólons de camundongos
Com o intuito de avaliar o possível envolvimento da transmissão colinérgica
nas respostas contráteis induzidas pela BK em cólons de camundongos, as
preparações foram incubadas com a atropina (agente anticolinérgico, 1 µM). Em
outro grupo experimental, a fim de verificar a participação de canais de sódio as
preparações de cólon foram incubadas com o bloqueador de canal de sódio, a
tetrodotoxina (TTX) (1 µM) (El Sayah e Calixto, 2003a). Ambas as drogas foram
incubadas por 20 min, e em seguida foram realizadas curvas concentração-resposta
cumulativas à BK (0,1-10.000 nM).
Material e Métodos
32
3.2.3.3. Participação dos metabólitos derivados da via do ácido araquidônico
nas respostas contráteis induzidas pela BK em cólons de camundongos
Para analisar o envolvimento dos metabólitos derivados da via do ácido
araquidônico, as preparações de cólons foram incubadas primeiramente com a
indometacina (inibidor não seletivo para COX-1 e 2, 1 µM) ou com o rofecoxibe
(inibidor seletivo da COX-2, 1 µM). A seguir, utilizou-se o SC 560 (inibidor
preferencial da COX-1, 1 µM) e também o MK 571 (antagonista seletivo para o
receptor de leucotrieno D
4
, 100 nM) (Cabrini et al., 1995; El Sayah e Calixto, 2003a).
Em grupos experimentais diferentes, as drogas mencionadas foram incubadas
durante 20 min, decorrido esse período realizou-se curvas concentração-resposta
cumulativas à BK (0,1-10.000 nM).
3.2.3.4. Influência dos neuropeptídeos e o CGRP nas respostas contráteis
induzidas pela BK em cólons de camundongos
Com o objetivo de verificar o papel dos neuropeptídeos nas respostas
contráteis induzidas pela BK, em cólons de camundongos, foram construídas curvas
concentração-resposta cumulativas na presença ou na ausência dos inibidores
seletivos dos receptores NK1 (R116301, 100 nM), NK2 (SR 48968, 100 nM) e NK3
(SR 142801, 100nM). Em outro grupo experimental, investigou-se a participação do
CGRP na resposta contrátil induzida pela BK através da utilização do fragmento (8-
37) do CGRP (antagonista do receptor para o CGRP, 1 µM) (Geppetti et al., 1990).
Em ambos os experimentos, as drogas foram incubadas por 20 min antes da
realização das curvas concentração-resposta cumulativas à BK (0,1-10.000 nM).
Material e Métodos
33
3.2.3.5. Estudo da contribuição dos receptores vanilóides nas respostas
contráteis induzidas pela BK em cólons de camundongos
Para avaliar o possível envolvimento dos receptores vanilóides nas respostas
contráteis induzidas pela BK, as preparações de cólons foram incubadas, por 20 min
com o antagonista competitivo dos receptores vanilóides, a capsazepina (1 µM) ou
com o SB 366791 (antagonista do receptor TRPV1, 10 µM) (Andrade et al., 2006).
Posteriormente à incubação, foram realizadas as curvas concentração-resposta
cumulativas à BK (0,1-10.000 nM).
3.2.4. Estudo da indução in vitro do receptor B
1
para as cininas em
preparações de cólons de camundongos
3.2.4.1. Avaliação temporal das respostas contráteis induzida pela des-Arg
9
-BK
em cólons de camundongos
A fim de acompanhar a possível indução temporal do receptor B
1
, cólons de
camundongos foram montados em cubas para órgão isolado e desafiados com o
agonista des-Arg
9
-BK (1 µM) em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 horas após a montagem das
preparações. Os cólons foram testados frente ao agonista B
1
por somente uma única
vez. As viabilidades dos tecidos foram testadas 30 minutos após a exposição ao
agonista.
Material e Métodos
34
3.2.4.2. Efeito de antagonistas seletivos para o receptor B
1
ou B
2
nas respostas
contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos
Com o objetivo de investigar o perfil farmacológico dos receptores B
1
e uma
possível participação dos receptores B
2
na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-
BK, curvas concentração-resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK foram realizadas
6 horas após a montagem na ausência ou presença do antagonista seletivo para o
receptor B
1
R 715 (1-10 nM) ou do antagonista dos receptores B
2
o FR 173657 (100
nM). Em outra série de experimentos, as preparações de cólons após 6 horas de
montagem foram incubadas com os antagonistas seletivos para o receptor B
1
, a des-
Arg
9
-Leu
8
-BK (30 µM), o SSR 240612 (30 nM) e com o composto benzodiazepínico-
1 (BZ-1) (30 nM) antes do desafio à des-Arg
9
-BK (1 µM) (Gougat et al., 2004; El
Sayah et al., 2006; Campos et al., 2006). Nesses experimentos, os antagonistas
foram incubados nas preparações de cólons por 10 min e as viabilidades foram
testadas 30 minutos após a utilização do agonista.
3.3. PADRONIZAÇÃO DA COLITE EXPERIMENTAL
3.3.1. Indução da colite experimental em camundongos
Para a indução de um quadro inflamatório no cólon, foi utilizado o modelo da
colite ulcerativa induzida por TNBS. Este modelo experimental foi descrito
anteriormente por Wallace et al., (1989) e McCaferty et al., (1999) e adaptado com
algumas modificações às nossas condições experimentais. Na execução do
protocolo experimental, os animais foram aleatoriamente divididos em grupos (n=6
Material e Métodos
35
animais), mantidos em jejum sólido total (sem ração e sem a realização de
coprofagia) em caixas onde o fundo foi revestido com uma grade metálica. Os
animais tiveram somente acesso ad libitum à solução de glicose 5%.
Após um período de jejum de cerca de 18-24 horas, os animais foram
anestesiados com 2,2,2-tribromoethanol (0,125 g/kg, i.p.) e então, uma cânula P50
de 4 cm conectada a uma seringa foi cuidadosamente inserida via intra-retal a qual
alcançou todo o cólon. Para auxiliar a entrada da cânula, foi aplicado gel a base de
água nos ânus dos animais. Para a indução da colite, 0,1 ml do composto TNBS (2,5
mg em 50% etanol), que tem o papel de quebrar a barreira epitelial intestinal, foi
lentamente administrado dentro do lúmen do cólon. Em seguida, os animais foram
posicionados de cabeça para baixo a 45° por 2 min e após a indução da colite,
retornaram às caixas. Decorridas 8 horas após a realização da colite, os animais
receberam ração e água filtrada.
3.3.2 Avaliação do dano macroscópico após a indução da colite experimental
por TNBS
Após a indução da colite, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical, os cólons foram coletados e os tecidos conectivos retirados. Os cólons
foram abertos longitudinalmente em toda a extensão, e cuidadosamente limpos
internamente com solução salina (0,9%) pré-aquecida a 37°C utilizando-se hastes
flexíveis com pontas de algodão. A severidade do dano no cólon foi avaliada
usando-se uma escala de dano macroscópico (Tabela 2). Este sistema de avaliação
de dano inclui características da presença de inflamação como: hiperemia, dano
Material e Métodos
36
visível (úlceras), diarréia, adesões, espessamento da parede e estreitamento do
lúmen.
Tabela 2. Escala usada para avaliação do dano macroscópico na colite
induzida por TNBS.
Grade
numérica
Parâmetros
0 Ausência de danos
1 Hiperemia sem úlceras
2 Hiperemia e espessamento da parede do intestino sem a presença de
úlceras.
3 Um sítio de úlceração sem espessamento da parede do intestino.
4 Dois ou mais sítios de úlceração ou inflamação.
5 0.5 cm de inflamação e presença de dano “importante”.
6-10 1 cm de dano “importante”. O score é aumentado em 1 para cada 0,5 cm
de dano observado chegando ao máximo de 10.
0 ou 1 Ausência ou presença de diarréia
0 ou 1 Ausência ou presença de estreitamento (estreitamento do lúmen
dificultando a passagem).
0,1, ou 2 Ausência ou presença de adesão média ou severa.
A partir da observação de cada cólon, a colite foi avaliada e quantificada. Método adaptado às nossas
condições experimentais a partir de Wallace et al.,(1989) e McCafferty et al.,(1999).
O resultado foi o somatório equivalente ao dano observado, sendo esse
chamado de escore (do inglês, score). Os cólons onde o score atingiu valores de 4
ou acima foram considerados como acometidos de colite.
3.3.2.1. Análise temporal do dano macroscópico após a indução de colite com
TNBS em camundongos
No intuito de obter um score de colite como o evidenciado na literatura,
realizou-se a indução da colite conforme descrito no item (3.3.1.). Após a indução, a
Material e Métodos
37
coleta dos cólons ocorreu em diferentes tempos de 6-96 horas. Em cada tempo
realizou-se o score dos cólons coletados. Assim, os tecidos foram cuidadosamente
limpos em solução salina pré-aquecida à 37°C, abertos no sentido longitudinal para
a realização do score macroscópico. O animal controle correspondeu ao que
recebeu somente solução salina (0,9%). Dessa forma, foi possível a identificação
temporal dos scores de colite ulcerativa.
3.3.2.2. Características externas dos cólons com colite para posterior
montagem no órgão isolado e viabilidade
Após a indução da colite como descrito anteriormente (3.3.1.), em 72 horas os
cólons foram coletados, mergulhados em solução de Krebs-Henseleit aquecida,
removidos os tecidos conectivos, cuidadosamente limpos (com o auxílio de uma
pinça côncava), não foram abertos longitudinalmente e tiveram analisadas as suas
características externas. A aparência do tecido foi de fundamental importância pois,
os cólons com poucas evidências de inflamação foram excluídos. O tecido colônico
normal demonstrou ser homogêneo, sem aumento de espessura e com coloração
rósea. O tecido com colite caracterizou-se pela presença de espessamento da
parede, inflamação, diarréia e em alguns casos necrose tecidual. Nos cólons com
colite, foi observado que a inflamação muitas vezes não ocorreu de forma
homogênea, acometendo somente algumas porções do órgão. Sendo assim, foi
utilizado somente o pedaço inflamado (1,5 cm). No tecido com ampla área
necrosada foi utilizado o pedaço adjacente sendo que as partes com necrose foram
desprezadas. De cada colón com colite, foi obtida uma única preparação para
Material e Métodos
38
montagem no órgão isolado. A Figura 1 demonstra aspectos gerais dos cólons
normais e inflamados.
Figura 1. Características dos cólons para montagem no órgão isolado. (A) cólon inteiro, sem
colite. (B) cólon inteiro obtido 72 horas após a indução da colite. (C) pedaço de cólon sem colite. (D,
E, F, G) pedaços de cólons inflamados obtidos 72 horas após a indução da colite. (H) pedaço de
cólon com colite e necrose tecidual. (I) pedaço de cólon com necrose tecidual em estágio avançado.
Imagem ampliada 2 vezes.
Para a verificação da viabilidade dos cólons obtidos 72 h após a indução da
colite, após a montagem em cubas para órgão isolado e decorrido o período de
equilíbrio, as preparações foram contraídas com CCh (100 µM). A resposta contrátil
máxima resultante dos cólons com colite caracterizou-se por ser menor (1,3 vezes)
do que a observada em cólons normais, característica essa, já identificada na
literatura em órgãos submetidos à inflamação como o íleo de rato e o íleo de cão
(Martinolle et al., 1997; Shi e Sarna, 1999; Goldhill et al., 1999).
Material e Métodos
39
3.3.3. Estudo do dano microscópico causado pela indução da colite
experimental por TNBS
O dano microscópico dos cólons com colite experimental induzida por TNBS
foi avaliado através da confecção de lâminas histológicas. Para tal, a colite foi
induzida, os tecidos foram cuidadosamente limpos com solução salina (0,9%) pré-
aquecida à 37 °C e colocados em uma solução de Formol a (10%) para posterior
emblocamento em parafina e montagem de lâminas histológicas coradas com
hematoxilina e eosina. O emblocamento em anéis, corte das lâminas e coloração
foram realizados externamente, por empresa terceirizada (Macro e Micro
®
-
Florianópolis/SC). O escore microscópico foi realizado segundo a metodologia
descrita por Neurath et al., (1995) onde o grau do dano tecidual foi analisado,
podendo alcançar valores de 0 a 4. Como demonstrado na Tabela 3.
Tabela 3. Escala utilizada para avaliação do dano microscópico na colite
induzida por TNBS.
Score
Histológico
Descrição
0 Sem sinais de inflamação (infiltração normal no tecido)
1 Praticamente sem dano e pouca infiltração
(pouquíssima diferença em relação ao normal)
2 Infiltração moderada de leucócitos
3 Grande quantidade de infiltração de leucócitos;
Aumentada densidade vascular;
Espessamento da parede do intestino (mais grosso do que o normal).
4 Infiltração transmural;
Perda de células goblet (dano importante);
Aumento da densidade vascular;
Espessamento da parede do cólon (dano importante).
Metodologia descrita por Neurath et al., (1995).
Material e Métodos
40
3.3.3.1. Caracterização do dano microscópico ocasionado após a indução da
colite por TNBS em camundongos
Com o objetivo de identificar o dano microscópico causado pelo TNBS em
cólons de camundongos, a colite experimental foi realizada como descrito no item
(3.3.1.) e os cólons coletados em 24 h e 72 h. O animal controle recebeu somente
solução salina (0,9%). Decorridos os tempos de colite, os cólons foram coletados,
separados dos tecidos conectivos aderentes e cuidadosamente limpos em solução
salina (0,9%) pré-aquecida a 37 °C; os cólons não foram abertos, mas sim,
imediatamente colocados em solução de Formol (10%) para posterior
processamento da técnica histológica.
3.3.4. Influência da colite induzida por TNBS sobre a migração celular:
atividade da MPO
Para verificação indireta da migração de células polimorfonucleares em
cólons com colite, as coletas dos cólons foram feitas em tempos de 6-96 horas após
a indução e posteriormente realizada a metodologia para avaliação da
mieloperoxidase (MPO).
A preparação dos tecidos inflamados para a avaliação da migração celular
procedeu-se conforme a metodologia descrita por Passos et al., (2004) com
pequenas adaptações. Resumidamente, os cólons foram coletados, cortados em
pedados pequenos (5 mm), homogeneizados a 5 % (peso/volume) em tampão
EDTA/ NaCl/ Na
2
PO
4
(pH 4,7) e centrifugados a 10.000 r.p.m., por 15 min, 4
o
C. O
precipitado (pellet) foi ressuspenso em tampão contendo brometo de hexadecil-
Material e Métodos
41
trimetilamônio (HTAB) 0,5 % (pH 5,4). Logo após, as amostras de cólon processadas
foram congeladas e descongeladas 3 vezes em nitrogênio líquido. Depois do último
descongelamento, as amostras foram centrifugadas novamente (10.000 r.p.m., 15
min, 4
o
C). O sobrenadante resultante foi utilizado no ensaio de determinação da
mieloperoxidase (MPO). A atividade da MPO foi avaliada em cólons de animais
controle ou com colite. Uma alíquota de 25 µl do sobrenadante obtido da preparação
das amostras foi utilizada para o ensaio. A reação enzimática foi realizada na
presença de tetrametilbenzidina (TMB) (1,6 mM), Na
2
PO
4
(80 mM) e peróxido de
hidrogênio (0,3 mM). A absorbância foi medida em 650 nm e os resultados foram
expressos em densidade óptica (DO) por mg de tecido.
3.4. ESTUDO FUNCIONAL, BIOQUÍMICO E MOLECULAR DAS CININAS E SEUS
RECEPTORES NO CÓLON INFLAMADO
3.4.1. Análise temporal das respostas contráteis induzidas pela BK e pela des-
Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite
Com o objetivo de verificar as possíveis alterações nas respostas contráteis
para as cininas em cólons inflamados, preparações de cólons com colite por TNBS
foram desafiadas com a BK ou com a des-Arg
9
-BK em grupos experimentais
distintos. Primeiramente, a colite foi induzida como descrito anteriormente e em
tempos diferentes (6-96 horas), os cólons foram coletados, retirados os tecidos
conectivos e porções de 1,5 cm foram montadas verticalmente no órgão isolado.
Após o período de equilíbrio e a verificação da viabilidade, os cólons foram
desafiados com BK (1 µM). Em outro grupo experimental, curvas concentração-
Material e Métodos
42
resposta cumulativas à BK (0,1-10.000 nM) foram realizadas em cólons obtidos após
72h de inflamação tecidual.
Para avaliar a indução dos receptores B
1
na colite induzida por TNBS, cólons
de camundongos foram montados em diferentes tempos (6-96 horas) após a
indução da inflamação e decorrido o período de equilíbrio foram desafiados com o
agonista des-Arg
9
-BK (1 µM). Nesse protocolo as viabilidades foram testadas 30 min
após o termino da resposta contrátil para que o teste da viabilidade não interferisse
na resposta do receptor. Seguindo o mesmo objetivo, cólons obtidos após 72h de
inflamação colônica foram montados e posteriormente realizadas curvas
concentração-resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM). Novamente,
para que não houvesse nenhuma interferência, as viabilidades foram avaliadas 30
min após o termino da resposta contrátil ao agonista B
1
.
3.4.2. Estudo da densidade e afinidade dos receptores B
1
e B
2
em cólons de
camundongos com ou sem colite experimental: ensaio de união específica
3.4.2.1. Preparação das membranas de cólon
Para a preparação das membranas foram utilizados 6 cólons obtidos 72 h
após a administração de TNBS (com score de 4 a 10) e 6 cólons controle. A
preparação dos tecidos foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Cox
et al., (1986) e Scherrer et al., (1999) com algumas modificações. Primeiramente, os
cólons foram homogeneizados em 4 ml de solução de sacarose gelada (0,25 M) e
centrifugados a 4.900 rpm, por 10 min, à temperatura de 4°C. O primeiro
sobrenadante obtido foi cuidadosamente retirado e guardado separadamente. O
Material e Métodos
43
precipitado (pellet) resultante foi ressuspenso em 4 ml de solução de sacarose
gelada (0,25 M), homogeneizado e novamente centrifugado a 4.900 rpm, por 10 min,
à temperatura de 4°C. O segundo sobrenadante resultante foi misturado com o
primeiro, e foram adicionados 10 ml de tampão ((N-tris-hydroxy-methyl)methyl-2-
aminoethane sulfonic acid, TES) 25 mM e fenantrolina 1 mM, pH 6,8), sendo a
mistura centrifugada a 21.000 rpm por 30 min, à temperatura de 4°C. O precipitado
resultante foi diluído em 2 ml de tampão de ligação (TES 25 mM, fenantrolina 1mM,
dithiothreitol (DTT) 1 mM, bacitracina 140 µg/mL, captopril 10 µM e albumina sérica
bovina 0,1%, pH 6,8). Os níveis protéicos foram determinados de acordo com o
método de Bradford (1976) e a concentração utilizada foi de 0,8 mg/ml. Depois de
processadas, as membranas foram utilizadas apenas uma vez.
3.4.2.2. Ensaio de união específica (binding de saturação)
O experimento de união específica para os receptores B
2
utilizou: 125 µl de
membranas (previamente processadas como descrito no item anterior) as quais
foram incubadas com tampão de ligação (composição descrita acima), à 25°C, com
concentrações crescentes de [prolyl
2,3
-3,4(n)-
3
H]-BK ([
3
H]-BK, com atividade
específica de 94,0 Ci/mmol) (0,03-10 nM). Para avaliar a ligação não específica foi
utilizada BK não marcada, adicionada em tubos separados a uma concentração final
de 1 µM.
O protocolo de união específica para os receptores B
1
foi semelhante ao
utilizado anteriormente para os receptores B
2
seguindo-se: 125 µl de membranas as
quais foram incubadas com tampão de ligação, à 25°C, com concentrações
crescentes de [
3
H]-des-Arg
10
-kallidin ([
3
H]-des-Arg
10
-KD, com atividade específica de
Material e Métodos
44
82,0 Ci/mmol) (0,03-10 nM). Para avaliar a ligação não específica, foi utilizado o
antagonista des-Arg
9
-Leu
8
-BK não marcado e adicionado em tubos separados a
uma concentração final de 1 µM.
Em ambos os protocolos, após 90 min de incubação as membranas foram
transferidas para filtros previamente umedecidos com polyethyleneimine 0,1% e
então lavadas sobre uma superfície individual com vácuo, por oito vezes, com 1 ml
de Tris-HCl gelado (50 mM, pH 7,4).
Para avaliar a quantidade de peptídeos marcados ligados, os filtros foram
imersos em líquido de cintilação e a radioatividade foi avaliada com uso de um
cintilador Packard
®
. A união específica foi definida pela diferença entre os valores
obtidos na leitura do total menos a leitura inespecífica. Dessa forma, foi possível o
cálculo da união específica, saturação máxima B
máx
e a constante de dissociação
(K
d
). O número de experimentos realizados para cada radioligante variou entre 5 e 8.
3.4.3. Quantificação do RNA mensageiro para os receptores B
1
e B
2
das cininas
em cólons de camundongos com colite experimental
Com o objetivo de verificar o efeito da colite sobre a indução dos receptores
B
1
e B
2
para as cininas, foram quantificados os níveis de ácido ribonucléico
mensageiro (RNAm) para estes receptores em diferentes tempos após a indução da
colite, através da técnica da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da
polimerase (RT-PCR, do inglês reverse transcriptase - polymerase chain reaction),
baseando-se na metodologia descrita por Trevisani et al., (1999) e Campos et al.,
(2002) com algumas adaptações.
Material e Métodos
45
3.4.3.1. Extração do RNA total
Cólons de animais controle ou com colite experimental de 6, 12, 24, 48, 72 e
96 h, foram coletados em capela de fluxo laminar em condições livres de RNAse e
armazenados em tubos siliconizados (do tipo Eppendorf) contendo 1,5 ml de TRIzol
(Invitrogen, Scotland, UK). As amostras de cólon foram congeladas em nitrogênio
líquido e armazenadas à -70°C. Para a extração do RNA total, as amostras foram
descongeladas e transferidas individualmente para tubos de plástico (do tipo Falcon)
onde foram homogeneizadas. Nesse procedimento, foram tomados cuidados
específicos como a completa higienização do homogeneizador com NaOH 0,5 M e
água ultra pura em cada troca de tecido. A extração foi realizada conforme a
determinação do fabricante e teve início com a transferência individual de cada
homogenato para tubos siliconizados (do tipo Eppendorf), com posterior adição de
200 µl de clorofórmio. Em seguida os tecidos foram centrifugados a 10.000 rpm por
15 min a 4°C. A fase aquosa resultante dessa centrifugação foi retirada e
acondicionada em outro tubos siliconizados (do tipo Eppendorf). Para o início da
precipitação do RNA total, ao sobrenadante foi acrescentado 500 µl de
isopropanolol. Essa nova mistura foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 min a 4°C.
Posteriormente, o sobrenadante resultante foi removido por inversão e ao
precipitado (pellet) foi adicionado 1 ml de etanol 75 % gelado. Essa mistura foi
centrifugada a 5.000 rpm por 5 min a 4°C. Por inversão, o conteúdo de etanol foi
retirado e o precipitado que corresponde ao RNA total foi dissolvido em 20 µl de
água ultra pura. Desse modo, o RNA resultante da extração pode então ser
quantificado com o uso de espectrofotômetro HITACHI
®
, através dos valores obtidos
pelas absorbâncias em 260 nm e 280 nm e pela razão das absorbâncias 260/280
Material e Métodos
46
nm. Razões acima de 1,7 foram consideradas satisfatórias para a realização dos
experimentos. O RNA total foi aliqüotado e estocado a - 70°C até o momento do uso.
3.4.3.2. Confecção do c-DNA (Reação de Transcrição Reversa)
A reação de transcrição reversa foi realizada utilizando-se a enzima
transcriptase reversa M-MLV (200 U, Invitrogen, Scotland, UK). Essa reação foi
realizada utilizando-se: 5 µg de RNA; 0,5 ng de oligo dT; 0,5 mM de dNTP mix; 40 U
de RNAse OUT (Invitrogen, Scotland, UK); 0,01 mM de DTT mais tampão de reação
da M-MLV para um volume final de reação de 20 µl. O c-DNA foi preparado de
acordo com as especificações do fabricante da enzima transcriptase reversa. Os c-
DNAs obtidos foram armazenados a 4°C até a realização da reação em cadeia da
polimerase (PCR).
3.4.3.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR dos c-DNAs obtidos)
A reação em cadeia da polimerase foi realizada utilizando-se a enzima Taq-
Polimerase (Luwig, Porto Alegre, Brazil), seguindo-se as especificações do
fabricante. Para cada reação foram utilizados: 2,5 µl de tampão; 0,75 µl de MgCl
2
(50
mM); 0,5 µl de dNTP (mistura 10 mM); 19,5 µl de água ultra pura; 0,5 µl de primer
sense (10 µM); 0,5 µl de primer anti-sense (10 µM); 0,25 µl da enzima Taq-
Polimerase (5 U) e 0,5 µl do c-DNA específico. Perfazendo-se um volume total de
25 µl cada reação. Os primers utilizados foram: para o receptor B
1
o anti-sense 5’-
CGCAGGTTGTGCAGGCCGAT-3’ e o sense 5’-GTAGAGTTCCGGGATTAC-3’; para
o receptor B
2
o anti-sense 5’-ATCCTCACTCCTCTTTGTC-3’ e o sense 5’-
Material e Métodos
47
GGTCCTGAACACCAACATGG-3’ e para a β-actina o anti-sense 5’-
CGTCTCCGGAGTCCATCACA-3’ e o sense 5’-TCCTTCGTTGCCGGTCCACA-3’.
Para a realização da PCR, foi utilizado um termociclador de DNA (Eppendorf
Mastercycler Personal, Hamburg, Germany). As condições para a PCR foram: 5 min
a 95°C seguidos por ciclos com repetições seqüenciais de 15 segundos a 95°C, 30
segundos a 52°C e 1 min e meio a 72°C. Durante a padronização experimental foi
variado o número de ciclos da PCR entre 27 e 39. Desse modo, foi possível a
identificação do número de ciclos ideal para a visualização e quantificação de cada
banda. Para o receptor B
1
e para a β-actina foram utilizados 31 ciclos, para o
receptor B
2
, 35 ciclos. Os produtos da PCR foram fracionados por eletroforese em
gel de agarose 1,8 % contendo GoldView
TM
. O tamanho e a localização das bandas
foram confirmados pelo uso de um DNA Ladder (Invitrogen, Scotland, UK) com 50
pb. As bandas que identificaram os receptores B
1
, B
2
e a β-actina possuíam 646,
624 e 508 pares de base (pb), respectivamente. A análise semi-quantitativa foi
realizada pela medida da densidade óptica das bandas correspondentes ao receptor
B
1
ou ao receptor B
2
, dividida pelo valor da densidade óptica obtida para a β-actina.
As densidades ópticas foram obtidas com o programa Scion Image
®
.
3.4.4. Estudo da colite experimental em animais com deleção gênica para os
receptores B
1
e B
2
Com o intuito de avaliar a contribuição dos receptores B
1
e B
2
na gênese da
colite foram utilizados animais com deleção gênica para os receptores (B
1
R
-/-
e B
2
R
-/-
).
Como linhagem controle, utlizou-se animais C57/BL6 (n=5 para animais com
deleção gênica e controles). A colite foi induzida como descrito no item (3.3.1) e
Material e Métodos
48
após 72 horas de inflamação colônica induzida por TNBS foi realizado o score
macroscópico. A seguir, os cólons foram congelados à -70°C para posterior
avaliação da migração celular com a da técnica da MPO descrita no item (3.3.4.).
3.5. POSSÍVEIS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA INDUÇÃO DO RECEPTOR B
1
NA COLITE POR TNBS
Os experimentos descritos nessa seção seguiram o protocolo abaixo:
Figura 2. Protocolo de indução da colite por TNBS em camundongos juntamente com os
tratamentos in vivo. Em (A) protocolo de indução da colite, do jejum até 72 h de inflamação colônica
induzida por TNBS para posterior montagem dos cólons no órgão isolado; (B) protocolo de indução
da colite desde o jejum onde foram iniciados os tratamentos até 72 h de inflamação induzida por
TNBS, posteriormente os cólons foram montados no órgão isolado.
Jejum
Tratamento
Indução
Tratamento
24 h
Tratamento
48 h
Tratamento
72 h
Tratamento
Colite
Jejum
Indução
24 h
48 h
72 h
Colite
Montagem
do órgão
B
A
Montagem
do órgão
Material e Métodos
49
3.5.1. Papel da síntese protéica na indução do receptor B
1
e nas respostas
contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite
Na tentativa de relacionar o processo de síntese protéica com a indução dos
receptores B
1
na colite por TNBS, os inibidores foram administrados in vivo para
posterior montagem e desafio in vitro. Grupos distintos de animais, ambos com
indução de colite, receberam ou não tratamento desde o jejum, com cicloheximida
(2,5 mg/kg, 2 vezes ao dia, i.p.) ou com dexametasona (1 mg/kg, 2 vezes ao dia,
s.c.) (Rejdak et al., 2001). Setenta e duas horas após a indução da inflamação no
cólon, os tecidos foram coletados, montados no órgão isolado e desafiados na
realização de curvas concentração-resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-
10.000 nM). Com o intuito de verificar o efeito dos tratamentos sobre a progressão
da colite, foi também realizada análise histológica nos tecidos dos animais
previamente tratados.
Em outro grupo experimental, para avaliar o papel da síntese protéica nas
respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK, preparações de cólons obtidas 72
horas após a indução da colite foram montadas e incubadas com a cicloheximida
(inibidor de síntese protéica e de transdução, 70 µM), ou com a dexametasona
(inibidor de síntese protéica e da transcrição gênica, 100 µM) (Campos e Calixto,
1994). Ambos inibidores foram incubados por 20 min e decorrido esse período foram
realizadas curvas concentração-resposta cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000
nM).
Material e Métodos
50
3.5.2. Possível participação da via fosfatidil inositol-3-quinaseγ (PI3Kγ) na
indução do receptor B
1
em cólons de camundongos com colite
A fim de verificar se a via da PI3Kγ poderia estar envolvida no processo de
indução do receptor B
1
no cólon, os animais foram tratados com o inibidor AS
605240 (inibidor seletivo da PI3Kγ). Para tanto, os animais foram divididos em
diferentes grupos, nos quais procedeu-se o protocolo de indução de colite descrito
no item (3.3.1) sendo que o tratamento com o AS 605240 (10 mg/kg, 2 vezes ao dia,
v.o.) teve início no jejum e se estendeu até 72 h (Camps et al., 2005). Após 72 h da
indução da inflamação colônica as preparações de cólons foram montadas no órgão
isolado e foram realizadas curvas concentração-resposta cumulativas para des-Arg
9
-
BK (0,1-10.000 nM). Tecidos colônicos obtidos a partir dos animais de ambos os
grupos (tratados e não tratados) foram submetidos à análise histológica.
3.5.3. Participação do NF-κB na indução do receptor B
1
em cólons de
camundongos submetidos à colite experimental
Com o objetivo de avaliar a participação do fator de transcrição NF-κB na
regulação da indução do receptor B
1
em cólons de camundongos com colite
experimental, realizou-se o protocolo de indução da colite por TNBS em grupos
distintos tratados ou não desde o jejum com PDTC (inibidor do NF-κB, 30 mg/kg, 1
vez ao dia, i.p.) (Cuzzocrea et al., 2002). Após a indução da colite e o concomitante
tratamento, os tecidos foram montados em câmaras para órgão isolado e realizaram-
se curvas concentração-resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM). Com
o intuito de determinar um possível efeito do tratamento com o PDTC sobre o dano
Material e Métodos
51
tecidual, cólons de camundongos que passaram pelo mesmo protocolo experimental
foram submetidos à análise histológica.
3.5.4. Investigação da participação da citocina TNFα sobre a indução do
receptor B
1
em cólon de camundongos na colite experimental por TNBS
Nesta série de experimentos foram utilizadas ferramentas farmacológicas e
genéticas para investigar a participação da citocina TNFα na indução do receptor B
1
in vivo. Sendo assim, diferentes grupos de animais separados em tratados ou não
tratados foram submetidos ao protocolo experimental de indução de colite. Os
distintos grupos tratados colite, receberam desde o jejum talidomida (inibidor da
citocina TNFα, 50 mg/kg, 1 vez ao dia, v.o.) (Rodrigues et al., 2007) ou o infliximab
(anticorpo quimérico anti-TNFα, 2 mg/kg, 1 vez ao dia, s.c.) (Steed et al., 2003).
Decorridas 72 h após a indução da colite os tecidos colônicos foram isolados e
montados como descrito anteriormente. A seguir, foi avaliada a resposta contrátil
para a des-Arg
9
-BK na realização de curvas concentração resposta cumulativas (0,1-
10.000 nM). Para ambos os grupos experimentais, a talidomida ou o infliximab
realizaram-se também as análises histológicas dos cólons.
Seguindo o mesmo objetivo, camundongos com deleção gênica para o
receptor p55 do TNFα (TNF p55
-/-
) e seus respectivos controles da linhagem
C57/BL6 foram submetidos ao protocolo experimental de indução de colite. Setenta
e duas horas após a indução, procederam-se em ambos os grupos a avaliação da
resposta contrátil frente à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM).
Material e Métodos
52
3.5.5. Estudo da participação da iNOS na indução do receptor B
1
em cólons de
camundongos na colite experimental induzida por TNBS
Com o objetivo de avaliar o envolvimento da iNOS na indução do receptor B
1
na colite induzida por TNBS, um grupo de animais recebeu desde o jejum o inibidor
1400 W (inibidor seletivo iNOS, 10 mg/kg, 2 vezes ao dia, s.c.) (Girard et al., 2005).
Seguindo-se o cronograma de tratamentos, após 72 h de colite os cólons foram
montados em câmaras para órgão isolado e realizadas curvas concentração-
resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM). Para verificar um possível
efeito protetor tecidual decorrente do tratamento com o inibidor 1400 W, após a
realização do tratamento, os cólons foram submetidos à análise histológica.
A fim de confirmar a participação da enzima iNOS no processo de indução do
receptor B
1
, o protocolo experimental de indução de colite foi realizado em
camundongos com deleção gênica para iNOS (iNOS
-/-
) e seus respectivos controles
da linhagem C57/BL6. Os cólons provenientes dos animais iNOS
-/-
e seus controles
C57/BL6 foram coletados 72 h após a indução da colite, montados e então curvas
concentração-resposta cumulativa para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) foram
realizadas.
Material e Métodos
53
3.6. POSSÍVEIS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA RESPOSTA CONTRÁTIL
DESENCADEADA PELA ATIVAÇÃO DO RECEPTOR B
1
EM CÓLONS DE
CAMUNDONGOS COM COLITE
3.6.1. Participação dos receptores B
1
e B
2
na resposta contrátil induzida pela
des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite
Com o intuito de investigar o perfil farmacológico dos receptores B
1
em cólons
com colite, após inflamação colônica de 72 horas, os tecidos foram montados e em
seguida, foram realizadas curvas concentração-resposta cumulativas para a des-
Arg
9
-BK na ausência ou presença do antagonista seletivo para o receptor B
1
R 715
(1-10 nM). Em outra série de experimentos, com o objetivo de avaliar uma possível
participação dos receptores B
2
na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK,
preparações de cólons após 72 horas de colite foram pré-incubadas com o
antagonista FR 173657 (100 nM). A seguir, realizaram-se curvas concentração-
resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) (El Sayah et al., 2006). Ambos
os antagonistas foram pré-incubados nas preparações por 10 min antes do desafio à
des-Arg
9
-BK.
3.6.2. Influência do cálcio extracelular e de canais de cálcio do tipo L nas
respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos
com colite
Após indução da colite por TNBS, os cólons foram coletados em 72 horas e
montados em cubas para órgão isolado; em seguida obteve-se uma curva
Material e Métodos
54
concentração-resposta cumulativa para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM), curva
denominada controle em solução de Krebs-Henseleit. Com o objetivo de avaliar a
contribuição do cálcio externo na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK, as
preparações passaram a ser banhadas com solução de Krebs-Henseleit modificada
sem cálcio, contendo o quelante de cálcio etilenoglicol-bis (β-amino-etil éster) (EGTA
1 mM). Os cólons permaneceram nesta solução nutritiva modificada por 20 min
sendo a mesma renovada a cada 5 min. Terminado esse período, realizou-se uma
curva concentração-resposta cumulativa à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM). Depois de
registradas as respostas contráteis, as preparações foram novamente banhadas em
solução Krebs-Henseleit contendo cálcio por cerca de 40 min, e uma nova curva
concentração-resposta à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) foi realizada (Campos e
Calixto, 1994).
Em outro grupo experimental em cólons de camundongos obtidos após 72
horas de inflamação colônica induzida por TNBS, avaliou-se a participação de canais
de cálcio do tipo L na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK. Desse modo,
curvas concentração-resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) foram
realizadas na ausência e na presença de nicardipina (antagonista de canais de
cálcio do tipo L, 1 µM) (El Sayah e Calixto, 2003b). O antagonista foi incubado nas
preparações por 20 min.
Material e Métodos
55
3.6.3. Possível envolvimento da liberação de ácido araquidônico, das enzimas
COX, LOX e seus subprodutos eicosanóides nas respostas contráteis
induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite
Com objetivo de verificar o envolvimento de fosfolipases de membrana,
responsáveis pela liberação do ácido araquidônico nas respostas contráteis
induzidas pela des-Arg
9
-BK, cólons de camundongos obtidos após 72 horas de
inflamação colônica induzida por TNBS foram incubados com o PACOCF
3
(inibidor
da fosfolipase A
2
(PLA
2
), 10 µM) ou com o U73122 (inibidor da fosfolipase C (PLC),
300 nM). Decorrido o período de pré-incubação (20 min), foram realizadas curvas
concentração-resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM). A seguir,
utilizando-se novos grupos experimentais com inflamação colônica de 72 horas, as
preparações foram incubadas com os seguintes inibidores: Indometacina (inibidor
não seletivo para COX-1 e 2, 1 µM), DFU (inibidor seletivo da COX-2, 1 µM), SC 560
(inibidor preferencial da COX-1, 1 µM) e MK 571 (antagonista seletivo para o
receptor de leucotrieno D
4
, 100 nM) (Cabrini e Calixto, 1997; El Sayah e Calixto,
2003a; Schlemper et al., 2005). Em grupos experimentais distintos, os inibidores
foram incubados por 20 min, após esse período, realizaram-se então, as curvas
concentração-resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM).
Material e Métodos
56
3.6.4. Participação da via do óxido nítrico nas respostas contráteis induzidas
pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite
Para avaliar o possível envolvimento do NO nas respostas contráteis
induzidas pela des-Arg
9
-BK em tecidos colônicos obtidos após 72 horas de
inflamação induzida por TNBS, os mesmos, foram montados em cubas para órgão
isolado e incubados por 20 min com aminoguanidina (inibidor da óxido nítrico sintase
(NOS),10 µM) (Schlemper et al., 2005), L-NIO (inibidor da enzima óxido nítrico
sintase endotelial (eNOS),10 µM) (Rees et al., 1990) e 1400 W (inibidor da iNOS, 10
µM) (Mulè et al., 2006). Após o término da incubação com os inibidores (20 min),
foram realizadas curvas concentração-resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK (0,1-
10.000 nM).
3.6.5. Influência das proteínas quinases nas respostas contráteis induzidas
pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite
No intuito de investigar alguns dos mecanismos intracelulares envolvidos na
resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite,
foi verificada a participação de algumas proteínas quinases (PKs). Para tanto, cólons
de camundongos após 72 horas de inflamação colônica induzida por TNBS foram
montados em cubas para órgão isolado e a seguir incubados com os seguintes
inibidores: KT5720 (inibidor da proteína quinase A (PKA), 100 nM), GF109203X
(inibidor da proteína quinase C (PKC), 1 µM), AS605240 (inibidor seletivo da
phosphoinositide 3-quinase subunidade gama (PI3Kγ), 10 µM) e PD98059 (inibidor
da MEK, 10 µM) (Medeiros et al., 2004; Schlemper et al., 2005; Camps et al., 2005).
Material e Métodos
57
Ao término do período de incubação (20 min), curvas concentração-resposta
cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) foram realizadas.
3.7. DROGAS E REAGENTES
Foram utilizadas as seguintes drogas e reagentes: ω-conotoxin GVIA
(Alamone Labs, Jerusalem, Israel); [prolyl
2,3
-3,4(n)-
3
H] BK ([
3
H]-BK) (Amersham
Biosciences, UK); Hoe 140 (D-Arg
0
-[Hyp
3
, Thi
5
, D-Tic
7
, Oic
8
]-BK (icatibant) (Aventis
Pharma Deutschland, Frankfurt Main, Germany); capsazepina (Cayman Chemical
Company, Ann Arbor, Ml, USA); ((E)-3-(6-acetamindo-3-pyridyl)-N [N-2-4-dichloro-3-
[(2-methyl-8-quinolinyl)oxy-methyl]phenyl]-N-methylamino-carbonyl-ethyl]crylamide)
(FR 173657) (gentilmente doado pela Fujisawa Pharmaceutical Co., Osaka, Japan);
agarose, TRIzol (Invitrogen, Scotland, UK); (2R-trans)-4-[1-[3,5-
bis(trifluoromethyl)benzoyl]-2-(phenylmethyl)-4-piperidinyl]-N-(2,6-dimethylphenyl)-1-
acetamide(S)-hydroxybutanedioate (R116301) (Janssen Pharmaceutica, Beerse,
Belgium); benzodiazepínico-1 (BZ-1), 5,5-dimetil-3-(3-fluorofenil)-4-(4-metilsulfonil)
(fenil2(5H) furanona (DFU), (3-(3-(2-(7-chloro-2-quinolinyl) ethenyl) phenyl ((3-
dimethyl amino-3oxo-propyl)thio) methyl)) propanoic acid (MK-571) 4-(4’-
methylsulphonylphenyl)-3-phenyl-2-(5H)-furanone (Rofecoxibe) sulfato de atropina,
(Merck- Kirkland, Quebec, Canada and Darmstadt, Germany); Infliximab
(Remicade®); [
3
H]-des-Arg
10
-Kallidin (PerkinElmer Life and Analytical Science, Paris,
França); PD 98059 (Research Biochemical International, RBI, MA, EUA); (S)-N-(1-(3-
(1-benzoyl-3-(3,4-dichlorophenyl)piperidin-3-y1)propyl)-4-phenylpiperidin-4-y1)-N-
methylacetamide(SR 142801), (S)-N-methyl-N-[4-(4-acetylamino-4-phenylpiperidino)-
2-(3,4-dichlorophenyl)butyl]benzamide (SR 48968), [(2R)-2-[((3R)-3-(1,3-
Material e Métodos
58
Benzodioxol-5-yl)-3-{[(6-methoxy-2-naphthyl)sulfonyl]amino}propanoil)amino]-3-(4-
{[2R,6S)-2,6-dimethylpiperidinyl]methyl}phenyl)-N-isopropyl-N-ethylpropanamide
hydrochloride] (SSR240612) (gentilmente doado pela Sanofi Recherche, Montpellier,
France); albumina sérica bovina (BSA), bacitracina, BK, fragmento 8-37 relacionado
ao gene da calcitonina (CGRP), captopril, carbacol (CCh), cicloheximida, des-Arg
9
-
BK, des-Arg
9
-[Leu
8
]-BK, dexametasona, dithiothreitol (DTT), etilenoglicol-bis (β-
amino-etil éster) (EGTA), Hyp
3
-BK, solução de formaldeído, indometacina, Lys-BK,
Met-Lys-BK, nicardipina, fenantrolina, GF109203X, hexadecil-trimetilamônio (HTAB),
KT 5720, polyethylenimine, pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC), R715, 5-(4-
chlorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole (SC 560), (N-tris-
(hydroxy-methyl)methyl-2-aminoethane sulfonic acid (TES), tetrametilbenzidina
(TMB) tetrodotoxina (TTX), 2,2,2-tribromoethanol, 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic
acid (TNBS), Trizma base, Tyr
8
-BK, (todos provenientes da Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO, USA); Aminoguanidina hidrochloride, EDTA, N
5
-(1-Iminoethyl)-L-
ornithine dihydrocloride (L-NIO), N-[[3-(Aminomethyl)phenyl]methyl]-ethanimidamide
dihydrochloride (1400W), 1,1,1-trifluoro-2-heptadecanona (PACOCF3), 4’-chloro-3-
methoxycinnamanilide (SB 366791), Talidomida, U73122, (Tocris Bioscience, Ellis-
Ville, USA). Todos os reagentes e sais utilizados possuíam pureza analítica de
origem Merck ou Vetec.
O composto AS605240 foi sintetizado pelo químico Paulo Leal, da
Universidade Federal de Santa Catarina, segundo a patente WO 2004/007491 A1.
As soluções estoque para os peptídeos foram preparadas em PBS (1-10 mM),
em tubos siliconizados, mantidas a -18°C e diluídas nas concentrações desejadas
no dia dos experimentos. Em algumas diluições, a concentração final de etanol ou
DMSO não excedeu 0,05%. Em todos os grupos experimentais, foram realizados
Material e Métodos
59
experimentos controle na presença do veículo utilizado para a diluição da droga. Os
veículos utilizados não tiveram ação farmacológica sobre as respostas contráteis.
3.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.),
exceto para as CE
50
(concentração do agonista que produz 50% do efeito máximo),
que são apresentadas como médias geométricas acompanhadas de seus
respectivos intervalos de confiança abrangendo 95%.
Na maior parte das vezes, a análise estatística dos resultados foi realizada
por meio do teste “t” de Student, não pareado. Em alguns casos fez-se necessária a
utilização da análise de variância ANOVA, seguida pelo teste de Student-Newman-
Keul’s (SNK). Os valores de P menores que 0,05 foram considerados como
significativos.
Resultados
60
4. RESULTADOS
4.1. Caracterização da resposta contrátil induzida pelas cininas em cólons de
camundongos
Com o objetivo de avaliar o efeito das cininas em preparações de cólons
isolados de camundongos foram realizadas curvas concentração-resposta
cumulativas para diferentes agonistas cininérgicos (Figura 3). Como demonstrado
na figura 3 A, o agonista seletivo do receptor B
2
para as cininas, bradicinina (BK;
0,1-10.000 nM), foi capaz de promover resposta contrátil de maneira concentração-
dependente 90 min após a montagem das preparações. A resposta máxima (R
máx
)
produzida pela BK foi 61,4 ± 1,3 % em relação à contração induzida pelo carbacol
(CCh), enquanto que a concentração efetiva 50 % (CE
50
) para esse peptídeo foi
102,9 (62.9 - 168,3) nM. Por outro lado, a adição de concentrações crescentes do
agonista seletivo do receptor B
1
para as cininas, des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM), 90
min após a montagem dos cólons de camundongos resultou em R
máx
de apenas 5,2
± 1,5 % em relação a resposta contrátil produzida pelo CCh (Figura 3 A). A resposta
contrátil induzida pela BK foi significantemente maior do que àquela produzida pela
des-Arg
9
-BK, sendo a relação R
máx
(BK/des-Arg
9
-BK) igual a 11,8.
Inúmeros estudos reportam a propriedade de dessensibilização dos
receptores B
2
para as cininas em diferentes tipos celulares depois de repetidas
estimulações pela BK (Praddaude et al., 1995; Smith et al., 1995; Bartus et al., 1996;
Mathis et al., 1996). Para avaliar se tal característica ocorre no cólon de
camundongos foram realizadas curvas concentração-resposta cumulativas para a
BK após diferentes intervalos de tempo em uma mesma preparação. Os dados da
Resultados
61
figura 3 B demonstram que curvas concentração-resposta cumulativas consecutivas
construídas em 90, 180 e 270 min após a montagem não diferem no padrão da
resposta contrátil à BK, sugerindo ausência de dessensibilização do receptor B
2
no
cólon de camundongos nesses tempos e nessas condições experimentais.
No intuito de determinar a ordem das respostas máximas para diferentes
agonistas cininérgicos em preparações de cólons isolados de camundongos foram
realizadas curvas concentração-resposta cumulativas para a BK, Lys-BK, Hyp
3
-BK,
Tyr
8
-BK, Met-Lys-BK e des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) 90 min após a montagem dos
tecidos. Como demonstrado na figura 3 C e na tabela 4, os agonistas analisados
apresentaram a seguintes respostas máximas no cólon isolado de camundongos: BK
> Lys-BK > Hyp
3
-BK > Tyr
8
-BK > Met-Lys-BK > des-Arg
9
-BK.
Resultados
62
Figura 3. Análise das respostas contráteis induzidas pelas cininas em cólons isolados de
camundongos. (A) Resposta contrátil induzida pela BK (0,1-10.000 nM) ou pela des-Arg
9
-BK (0,1-
10.000 nM) obtida 90 min após a montagem dos tecidos. (B) Curvas concentração-resposta
cumulativas para a BK (0,1-10.000 nM) realizadas nos mesmos tecidos 90, 180 e 270 min após a
montagem dos tecidos. (C) Curvas concentração-resposta cumulativas para a BK, Lys-BK, Hyp
3
-BK,
Tyr
8
-BK, Met-Lys-BK e des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) obtidas 90 min após a montagem dos tecidos.
Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). **P<0,01 comparado ao grupo BK
(teste “t” de Student não pareado).
Resultados
63
Tabela 4. Ordem de potências relativas para diferentes agonistas cininérgicos
em preparações de cólons isolados de camundongos
Agonistas
cininérgicos
(0,1-10.000 nM)
Resposta
máxima
(% CCh)
CE
50
(limite de confiança de 95%, nM)
BK
61,4 ± 1,3 102,9 (62,9-168,3)
Lys-BK
55,0 ± 4,1 448,9 (267,3-753,3)
Hyp
3
-BK
52,0 ± 4,5 826,0 (514,0-1,327.3)
Tyr
8
-BK
48,4 ± 3,9 304,0 (112,9-839,4)
Met-Lys-BK
44,4 ± 3,9 587,6 (368,9-1,177.6)
Des-Arg
9
-BK
3,4 ± 0,3 -
Cada grupo representa a média de seis experimentos independentes.
A fim de caracterizar os subtipos de receptores envolvidos na contração
induzida pela BK no cólon de camundongos, foram realizadas curvas concentração-
resposta cumulativas para a BK (0,1-10.000 nM) 90 min após a montagem das
preparações na ausência ou na presença do antagonista seletivo para o receptor B
2
,
Hoe 140 (3-30 nM) ou FR173657 (10-100 nM), ou na presença do antagonista
seletivo do receptor B
1,
a des-Arg
9
-[Leu
8
]-BK (1 µM). Os resultados da figura 4
demonstram que tanto o Hoe140 (Figura 4 A) quanto o FR173657 (Figura 4 B)
foram capazes de reduzir de maneira concentração-dependente a resposta contrátil
induzida pela BK. Além disso, foi possível verificar tanto para o Hoe 140 como para o
FR173657 o antagonismo competitivo com características de irreversibilidade
(insuperável) dentro do intervalo de tempo para a obtenção das curvas
concentração-resposta cumulativas. Contudo, a administração do antagonista
seletivo do receptor B
1
a des-Arg
9
-[Leu
8
]-BK não foi capaz de alterar
significativamente a resposta contrátil induzida pela BK (0,1-10.000 nM) em cólons
isolados de camundongos (Figura 4 C).
Resultados
64
Figura 4. Efeito dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas sobre a resposta
contrátil induzida pela BK em cólons de camundongos. Curvas concentração-resposta
cumulativas obtidas para a BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos na ausência ou na
presença de (A) Hoe140 (3-30 nM), (B) FR173657 (10-100 nM) ou (C) des-Arg
9
-[Leu
8
]-BK (1
µ
M) 90
min após a montagem das preparações. Os resultados foram calculados em relação à contração
máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N
= 6).
Resultados
65
4.2. Participação do cálcio extracelular e de canais de cálcio na resposta
contrátil induzida pela BK em cólons de camundongos
Com o objetivo de avaliar a participação do cálcio externo na resposta
contrátil induzida pela BK, após a obtenção de uma curva concentração-resposta
cumulativa para a BK (0,1-10.000 nM), em solução de Krebs-Henseleit contendo
cálcio, as preparações passaram a ser banhadas com solução de Krebs-Henseleit
modificada, ausente de cálcio, contendo o quelante de cálcio etilenoglicol-bis (β-
amino-etil éster) (EGTA 1 mM). Os cólons permaneceram nesta nova solução
nutritiva por 20 min, sendo a mesma renovada a cada 5 min. Nessas condições, a
contração induzida pela BK em cólons de camundongos foi completamente abolida
(Figura 5 A). Entretanto, quando as preparações foram reequilibradas em solução
Krebs-Henseleit contendo cálcio a resposta contrátil induzida pela BK foi novamente
restabelecida (dados não mostrados).
Além disso, foi investigada a possível participação de canais de cálcio na
resposta contrátil induzida pela BK em cólons isolados de camundongos. Curvas
concentração-resposta cumulativas para a BK foram obtidas 90 min após a
montagem das preparações na ausência ou presença do bloqueador de canais de
cálcio do tipo L, a nicardipina (1 µM) ou do bloqueador seletivo de canais de cálcio
do tipo N, a ω-conotoxina GVIA (0,1 µM). Como demonstrado na figura 5, tanto a
nicardipina (Figura 5 B) quanto à ω-conotoxina GVIA (Figura 5 C) reduziram
significativamente a resposta contrátil induzida pela BK. A redução na R
máx
da BK
em cólons isolados de camundongos pela nicardipina e ω-conotoxina GVIA foi de
34,87 ± 6,53 e 23,50 ± 1,95 %, respectivamente.
Resultados
66
Figura 5. Papel do cálcio extracelular e de canais de cálcio na resposta contrátil induzida pela
BK em cólons isolados de camundongos. (A) Curvas concentração-resposta cumulativas para a
BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos realizadas em solução de Krebs-Henseleit com
cálcio ou sem cálcio mais EGTA (1 mM). Curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-
10.000 nM) em cólons isolados de camundongos obtidas na ausência ou presença de (B) nicardipina
(1
µ
M) ou (C)
ω
-conotoxina GVIA (0,1
µ
M) 90 min após a montagem dos tecidos. Os resultados foram
calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão
expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t”
de Student não pareado).
Resultados
67
4.3. Estudo do envolvimento do sistema colinérgico e de canais de sódio na
resposta contrátil induzida pela BK em cólons de camundongos
Com o intuito de estudar o envolvimento da transmissão colinérgica e de
canais de sódio nas respostas contráteis induzidas pela BK em cólons isolados de
camundongos, curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-10.000
nM) foram realizadas na ausência ou na presença do agente anticolinérgico atropina
(1 µM) ou do bloqueador de canal de sódio tetrodotoxina (TTX, 1 µM), 90 min após a
montagem das preparações. Os resultados da figura 6 A demonstram que a
atropina (1 µM) foi capaz de reduzir significativamente a contração induzida pela BK
no cólon de camundongo, causando inibição da R
máx
para a BK de 57,28 ± 4,83 %.
Além disso, a incubação de preparações de cólons isolados de camundongos com
TTX (1 µM) reduziu significativamente a R
máx
induzida pela BK em 39,58 ± 4,52 %
(Figura 6 B).
Resultados
68
Figura 6. Papel do sistema colinérgico e de canais de sódio na resposta contrátil induzida pela
BK em cólons isolados de camundongos. Curvas concentração-resposta cumulativas para BK
(0,1-10.000 nM) em cólons isolados de camundongos realizadas na ausência ou presença de (A)
atropina (1
µ
M) ou (B) tetrodotoxina (TTX; 1
µ
M) 90 min após a montagem dos tecidos. Os resultados
foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores
estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle
(teste “t” de Student não pareado).
Resultados
69
4.4. Contribuição dos metabólitos derivados da via do ácido araquidônico nas
respostas contráteis induzidas pela BK em cólons de camundongos
Com o objetivo de verificar a possível participação dos derivados da via do
ácido araquidônico na resposta contrátil induzida pela BK em cólons de
camundongos, curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-10.000
nM) foram obtidas 90 min após a montagem das preparações, na ausência ou
presença do inibidor não seletivo das COXs indometacina (1 µM), do inibidor seletivo
da COX-2 rofecoxibe (1 µM), do inibidor preferencial da COX-1 SC560 (1 µM) ou do
antagonista do receptor de leucotrieno D
4
MK571 (100 nM). Os dados da figura 7
indicam que os inibidores indometacina (Figura 7 A), rofecoxibe (Figura 7 B) ou o
SC560 (Figura 7 C), foram capazes de reduzir significativamente (41,90 ± 4,00;
37,34 ± 5,70 e 23,25 ± 5,10 %, respectivamente) a resposta contrátil induzida pela
BK em cólons de camundongos. Além disso, a incubação das preparações com o
MK571 inibiu significativamente a resposta contrátil induzida pela BK, reduzindo a
R
máx
para a BK em 16,36 ± 2,04 % (Figura 7 D).
Resultados
70
Figura 7. Papel dos derivados da via do ácido araquidônico sobre a resposta contrátil induzida
pela BK em cólons isolados de camundongos. Curvas concentração-resposta cumulativas para a
BK (0,1-10.000 nM) em cólons isolados de camundongos obtidas na ausência ou presença de (A)
indometacina (1
µ
M), (B) rofecoxibe (1
µ
M), (C) SC560 (1
µ
M) ou (D) MK571 (100 nM) 90 min após a
montagem dos tecidos. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo
carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e
**P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Resultados
71
4.5. Participação dos neuropeptídeos e do CGRP nas respostas contráteis
induzidas pela BK em cólons de camundongos
Na continuidade dos estudos, foi avaliada a participação dos neuropeptídeos,
incluindo a substância P, a neurocinina A, a neurocinina B e o CGRP sobre a
resposta contrátil induzida pela BK em cólons isolados de camundongos. Para tanto,
foram construídas curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-10.000
nM) 90 min após a montagem das preparações, na ausência ou presença do inibidor
seletivo do receptor NK
1
R116301 (100 nM), NK
2
SR48968 (100 nM) ou NK
3
SR142801 (100 nM). Os resultados evidenciados na figura 8 mostram que somente
o antagonista NK
1
R116301 (Figura 8 A) e o antagonista NK
3
SR142801 (Figura 8
C) foram capazes de reduzir de forma significativa a resposta contrátil induzida pela
BK em cólons de camundongos (redução da R
máx
de 34,62 ± 7,36 % e 18,70 ± 1,29
%, respectivamente). No entanto, o antagonista NK
2
SR48968 (Figura 8 B) não
alterou a contração induzida pela BK em preparações de cólons de camundongos.
Além disso, em outro grupo experimental foi avaliada a possível participação
do CGRP na resposta contrátil induzida pela BK em cólons de camundongos. Para
tal, as preparações foram incubadas com o antagonista do receptor para o CGRP, o
fragmento CGRP
(8-37)
(1 µM). O resultado da figura 8 D demonstra que o fragmento
CGRP
(8-37)
reduziu significativamente a R
máx
para a BK em 49,30 ± 7,52 %.
Resultados
72
Figura 8. Papel dos neuropeptídeos e do CGRP na resposta contrátil induzida pela BK em
cólons isolados de camundongos. Curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-
10.000 nM) em cólons isolados de camundongos obtidas na ausência ou presença dos antagonistas
(A) NK
1
R116301 (100 nM), (B) NK
2
SR48968 (100 nM), (C) NK
3
SR142801 (100 nM) ou (D) CGRP
fragmento CGRP
(8-37)
(1
µ
M) 90 min após a montagem dos tecidos. Os resultados foram calculados
em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos
como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student
não pareado).
Resultados
73
4.6. Contribuição dos receptores vanilóides sobre a resposta contrátil induzida
pela BK em cólons de camundongos
Com o objetivo de verificar a possível participação do receptor vanilóide
TRPV1 na resposta contrátil induzida pela BK em cólons de camundongos foram
realizadas curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-10.000 nM) 90
min após a montagem das preparações, na ausência ou na presença dos
antagonistas vanilóides capsazepina (1 µM) ou SB366791 (10 µM). Os resultados da
figura 9 indicam que ambos os antagonistas capsazepina (Figura 9 A) e SB366791
(Figura 9 B) foram capazes de reduzir de maneira significativa a resposta contrátil
induzida pela BK, com inibição da R
máx
de 32,32 ± 4,73 e 40,26 ± 3,55 %,
respectivamente.
Figura 9. Papel do receptor vanilóide TRPV1 na resposta contrátil induzida pela BK em cólons
isolados de camundongos. Curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-10.000 nM)
em cólons isolados de camundongos obtidas na ausência ou presença dos antagonistas (A)
capsazepina (1 µM) ou (B) SB366791 (10
µ
M) 90 min após a montagem dos tecidos. Os resultados
foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores
estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle
(teste “t” de Student não pareado).
Resultados
74
4.7. Avaliação da indução in vitro do receptor B
1
para as cininas em cólons de
camundongos
Inúmeros estudos indicam a propriedade do receptor B
1
para as cininas de ser
induzido durante a incubação in vitro em preparações obtidas de diferentes tecidos,
sendo que este fenômeno normalmente ocorre de maneira tempo-dependente (para
revisão ver: Calixto et al., 2004). Para verificar se tal processo também ocorre no
cólon isolado de camundongo, foram realizadas curvas concentração-resposta
simples de contração para o agonista seletivo do receptor B
1
a des-Arg
9
-BK (1 µM)
após diferentes intervalos de tempo após a montagem das preparações (1, 2, 3, 4, 5,
6, 7 e 8 horas; as preparações foram testadas com o agonista uma única vez). Os
resultados da figura 10 mostram aumento da resposta contrátil à des-Arg
9
-BK de
maneira tempo-dependente, sugerindo a ativação do processo de indução in vitro do
receptor B
1
no cólon isolado de camundongo. Nos tempos avaliados foi observada
resposta contrátil máxima em 6 horas, sendo que esta resposta manteve-se
sustentada até pelo menos 8 horas.
Resultados
75
Figura 10. Avaliação da indução in vitro do receptor B
1
para as cininas em cólons de
camundongos. Foram realizadas curvas concentração-resposta simples de contração para a des-
Arg
9
-BK (1
µ
M) após diferentes intervalos de tempo de montagem das preparações. Os resultados
foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores
estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle
(teste “t” de Student não pareado).
4.8. Estudo dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas na
resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos
A fim de caracterizar os subtipos de receptores envolvidos na contração
induzida pela des-Arg
9
-BK no cólon de camundongos foram realizadas curvas
concentração-resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) 6 horas
após a montagem das preparações, na ausência ou na presença do antagonista
seletivo para o receptor B
1
o R715 (1-10 nM) ou do antagonista seletivo para o
receptor B
2
, o FR173657 (100 nM). Os dados da figura 11 A indicam que o
antagonista do receptor B
1
R715 (1-10 nM) promoveu redução na R
máx
à des-Arg
9
-
BK de maneira concentração-dependente. Além disso, foi observado na presença do
R715 o antagonismo do tipo competitivo com características de irreversibilidade. Por
Resultados
76
outro lado, a avaliação da resposta contrátil à des-Arg
9
-BK na presença do
antagonista do receptor B
2
o FR173657 não interferiu de forma significativa na
resposta contrátil no cólon isolado de camundongo (Figura 11 B).
Figura 11. Efeito dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas na resposta
contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos. Curvas concentração-resposta
cumulativas obtidas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos na ausência ou
na presença de (A) R715 (1-10 nM) ou (B) FR173657 (100 nM) 6 horas após a montagem das
preparações. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol
(CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6).
Visando analisar a resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK (1 µM), em
cólons de camundongos após 6h de montagem, na presença de outros antagonistas
seletivos para o receptor B
1
, as preparações de cólons foram incubadas com os
antagonistas des-Arg
9
-Leu
8
-BK (30 µM), SSR 240612 (30 nM) ou com o composto
Benzodiazepínico-1 (BZ-1) (30 nM).
Os resultados da Figura 12 demonstram que os antagonistas seletivos para o
receptor B
1
foram capazes de reduzir de forma significativa a resposta contrátil
Resultados
77
induzida pela des-Arg
9
-BK (1 µM) em cólons de camundongos com inibição da R
máx
de 58,64 ± 5,55 ; 68,50 ± 2,36 ; 45,02 ± 5,34 %, respectivamente.
Figura 12. Efeito dos antagonistas seletivos para o receptor B
1
das cininas sobre a resposta
contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos. Respostas contráteis obtidas
para a des-Arg
9
-BK (1
µ
M) em cólons de camundongos na ausência ou na presença de (A) des-Arg
9
-
Leu
8
-BK (30
µ
M), (B) SSR 240612 (30 nM) ou (C) Benzodiazepínico-1 (BZ-1) (30 nM) 6 horas após a
montagem das preparações. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima
induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6).
*P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Resultados
78
4.9. Caracterização da colite experimental induzida por TNBS em cólons de
camundongos
A fim de caracterizar a evolução da colite induzida pelo TNBS em
camundongos foi avaliado o dano macroscópico e a migração celular após
diferentes intervalos de tempo (0,5 - 96 horas) após a indução. A administração
intra-colônica de TNBS causou dano tecidual nos cólons dos camundongos, sendo
que a intensidade das lesões aumentou em função do tempo do tratamento (Figura
13 A). De maneira similar, a avaliação da atividade da MPO indicou ativação tempo-
dependente do processo de migração celular após a indução da colite por TNBS
(Figura 13 B). Durante as condições basais o cólon apresentou ausência de lesões
e reduzida quantidade de células. Todavia, a partir de 30 min foi verificado aumento
significativo no score macroscópico, indicando dano tecidual. Esta resposta atingiu
efeito máximo em 8 horas, permanecendo elevada por pelo menos 72 h após a
administração de TNBS. Por sua vez, a migração de leucócitos para o cólon
aumentou 2 horas após a administração do TNBS, atingindo resposta máxima em 12
horas e mantendo-se significativamente elevada por pelo menos 96 h após a
indução da colite.
Resultados
79
Figura 13. Avaliação do dano macroscópico e da atividade da MPO em cólons de
camundongos com colite experimental induzida pelo TNBS. (A) Avaliação temporal do dano
tecidual (score macroscópico) em cólons de camundongos após a administração intra-retal de TNBS.
(B) Avaliação temporal da atividade da MPO após a indução da colite pelo TNBS. Os valores estão
expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo salina (post-hoc
Newman-Keul’s).
Com o intuito de identificar o dano tecidual microscópico provocado pela
indução da colite por TNBS, foram realizados cortes histológicos em amostras de
cólons normais ou com colite de 24 ou 72 h, como demonstrado na figura 14. Os
resultados ilustrados na figura 14 D indicam um aumento significativo do score
Resultados
80
microscópico em 24 e 72 h. O aumento do score microscópico evidenciado em 72 h
foi 1,32 vezes maior que o em 24 h e 12,77 vezes maior que o valor encontrado no
grupo salina.
A
B
C
Figura 14. Avaliação do dano microscópico em cólons de camundongos com colite induzida pelo
TNBS. Imagem representativa da análise histológica do cólon de camundongos tratados com (A) salina,
(B) TNBS por 24 h e (C) TNBS por 72 h. Imagens com aumento de 4 x em A e C e 10 x em B. (D) Score
microscópico das lesões induzidas pelo TNBS em cólons de camundongos. Os valores estão expressos
como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo salina;
#
P<0,05 comparado ao
grupo TNBS 24 h (post-hoc Newman-Keul’s).
Resultados
81
4.10. Avaliação da expressão dos receptores B
1
e B
2
para as cininas em cólons
de camundongos com colite induzida por TNBS
Com o objetivo de estudar possíveis alterações nas respostas contráteis à BK
em cólons inflamados, a colite foi induzida por TNBS em diferentes tempos de 6-96
h. Nos devidos tempos, os cólons foram montados em cubas para órgão isolado e
testados com BK (1µ M). A figura 15 A demonstra aumento na resposta contrátil
tempo dependente onde a R
máx
para a BK (1µ M) (108,01 ± 4,57 %) foi encontrada
na colite de 72 h, essa resposta foi 2,6 vezes maior do que aquela observada em
cólons de animais controle. Em um novo grupo experimental, foram realizadas
curvas concentração-resposta cumulativas para a BK (0,1-10.000 nM) em cólons
controle (sem colite) e com colite obtidos 72 h após a indução. Os resultados da
figura 15 B evidenciam aumento de cerca de 1,75 vezes na resposta contrátil à BK
no grupo colite de 72 h, quando comparado com o grupo controle (R
máx
de 98,33 ±
5,20 e 56,25 ± 2,82 %, respectivamente). Os valores das CE
50s
obtidos foram 30,92
(7,63-125,31) nM em preparações com colite e de 83,37(33,41-207,50) nM em
preparações controle.
Visando analisar a resposta funcional mediada pelo receptor B
1
na colite
induzida por TNBS, respostas contráteis para a des-Arg
9
-BK (1µ M) foram obtidas
em diferentes tempos após a indução da colite (6 -96 h). A figura 15 C demonstra
aumento tempo-dependente da resposta contrátil onde a R
máx
para a des-Arg
9
-BK
(1µ M) (55,50 ± 4,90 %) foi evidenciada em cólons obtidos 72 h após a indução da
colite. Na realização de curvas concentração-resposta cumulativas para a des-Arg
9
-
BK (0,1-10.000 nM) (Figura 15 D) foi evidenciado aumento de 20,12 vezes na
resposta contrátil dos cólons com colite de 72 h quando comparado com a resposta
Resultados
82
dos cólons controle. O valor da CE
50
para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) na colite
foi 18,1 (3,2 – 101,8) nM.
Figura 15. Análise da resposta contrátil induzida pelas cininas em cólons de camundongos
controle ou com colite induzida por TNBS. (A) Respostas contráteis obtidas para a BK (1µM) em
cólons de camundongos em diferentes tempos de colite experimental (6-96 h). (B) Curvas
concentração-resposta cumulativas obtidas para BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos
sem colite (controle) ou com colite experimental após 72 h de indução. (C) Avaliação das respostas
contráteis obtidas para a des-Arg
9
-BK (1µM) em cólons de camundongos em diferentes tempos de
colite experimental (6-96 h). (D) Curvas concentração-resposta cumulativas obtidas para des-Arg
9
-BK
(0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos sem colite (controle) ou com colite experimental após 72
h de indução. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol
(CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01
comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Resultados
83
Posteriormente, foram analisadas as possíveis alterações na afinidade dos
receptores para as cininas pelos seus ligantes, bem como, possíveis mudanças na
expressão destes receptores, 72 horas após a administração intra-colônica de TNBS
(Figura 16). Através do ensaio de união específica utilizando a [
3
H]-BK (0,03-10 nM)
foi possível verificar que membranas celulares obtidas de cólons de animais tratados
com salina (controle) apresentaram B
máx
de 57,63 ± 16,09 fmol/mg de proteína e K
d
de 1,1 (0,57-1,91nM; com intervalo de confiança de 95%). Entretanto, as membranas
celulares provenientes de animais com colite apresentaram B
máx
de 129,89 ± 27,15
fmol/mg de proteína e K
d
de 0,83 (0,25 - 2,63 nM; com intervalo de confiança de
95%). Tais resultados demonstram que a colite induzida pelo TNBS (após 72 h)
causou aumento de 2,25 vezes no número de receptores B
2
, sem modificar
significativamente a afinidade entre ligante-receptor (Figura 16 A).
Complementando os dados funcionais, a análise de união específica com o
ligante para o receptor B
1
radiomarcado ([
3
H]-des-Arg
10
-calidina; 0,03 - 10 nM)
demonstrou que membranas celulares de cólons controles apresentam B
máx
de 2,85
± 0,47 fmol/mg de proteína e K
d
de 4,14 (2,86 - 6,01, nM; com intervalo de confiança
de 95%). Todavia, a análise dos cólons obtidos após 72 h de colite por TNBS
apresentou B
máx
de 5,33 ± 0,41 fmol/mg de proteína e K
d
de 3,65 (3,49 - 3,82 nM;
com intervalo de confiança de 95%). Os resultados desse experimento indicam que
durante a colite houve aumento de 1,9 vezes na densidade dos receptores B
1
, sem
modificar a afinidade entre ligante-receptor (Figura 16 B).
Resultados
84
Figura 16. Avaliação da união específica para os receptores das cininas em cólons de
camundongos controle ou com colite induzida por TNBS. (A) Valores da união específica obtidos
na utilização da [
3
H]-BK (0,03-10 nM) em membranas de cólons sem colite (controles) ou em cólons
obtidos após 72 h de indução da colite. (B) Valores da união específica obtidos na utilização da [
3
H]-
DAK (0,03-10 nM) em membranas de cólons sem colite (controles) ou em cólons obtidos após 72 h
de indução da colite. Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 5-8). *P<0,05 e
**P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Finalmente, com o objetivo de confirmar o processo de indução dos
receptores B
1
e B
2
durante a colite experimental induzida pelo TNBS, os níveis de
RNAm para esses receptores foram quantificados após diferentes tempos de colite
(6-96 h). Os resultados da Figura 17 (A e B) indicam que durante condições basais
os níveis de RNAm para o receptor B
2
encontraram-se elevados, confirmando seu
caráter tecidual constitutivo. Contudo, após a indução da colite pelo TNBS foi
observado aumento nos níveis do RNAm para o receptor B
2
, sendo a expressão
máxima observada 12 h após a indução. Por outro lado, na condição basal, o cólon
de camundongo expressa níveis baixos de RNAm para o receptor B
1
. Entretanto, a
análise temporal indica aumento significativo desses níveis em cólons obtidos após 6
h de indução da colite, estando reduzidos em cólons obtidos em 96 h após o início
da colite (Figura 17 C e D).
Resultados
85
Figura 17. Avaliação da expressão do RNAm para os receptores das cininas em cólons de
camundongo com colite induzida por TNBS. (A) Fotografia das bandas obtidas na eletroforese
para análise semi-quantitativa do RNAm para o receptor B
2
. (B) Razão entre o RNAm do receptor B
2
e o da β-actina. (C) Fotografia das bandas obtidas na eletroforese para análise semi-quantitativa do
RNAm para o receptor B
1
. (D) Razão entre o RNAm do receptor B
1
e o da β-actina.(N=3).
C
0 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h PM
350 pb
B
1
R (646 pb)
β-actin (509 pb)
B
2
R (624 pb)
β-actin (508 pb)
0 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h PM
350 pb
A
Resultados
86
4.11. Papel dos receptores para as cininas na colite induzida por TNBS
Para avaliar a possível contribuição dos receptores B
1
e B
2
para as cininas na
indução da colite por TNBS, foi realizada análise macroscópica e atividade da MPO
em cólons de camundongos com deleção gênica para os receptores B
1
(B
1
R
-/-
) ou B
2
(B
2
R
-/-
) obtidos 72 h após a indução da colite com TNBS. Os resultados da figura 18
A demonstram redução significativa dos escores macroscópicos em ambos os
animais B
2
R
-/-
(46,77 ± 3,45 %) ou B
1
R
-/-
(55,24 ± 3,63 %) quando em comparação
aos animais da linhagem controle (C57/BL6). Ademais, na avaliação da atividade da
MPO foi observada redução significativa na atividade enzimática somente nos cólons
inflamados provenientes dos camundongos B
1
R
-/-
(redução de 54,08 ± 7,05 %)
quando comparados aos controles C57/BL6 (Figura 18 B). Em conjunto, esses
dados sugerem a possível contribuição de ambos os receptores para as cininas
durante o processo de colite induzida pelo TNBS.
Figura 18. Avaliação do dano macroscópico e da atividade da MPO em cólons de
camundongos com deleção gênica para os receptores das cininas com colite induzida por
TNBS. Avaliação (A) do dano tecidual e (B) da atividade da MPO em cólons obtidos 72h após a
indução da colite. Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01
comparado ao grupo C57/BL6 (post-hoc Newman-Keul’s).
Resultados
87
4.12. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na
colite induzida pelo TNBS em cólons de camundongos: papel dos inibidores
de síntese proteíca
Com o objetivo de avaliar alguns dos mecanismos intracelulares envolvidos
na indução do receptor B
1
durante a colite por TNBS, os animais foram tratados in
vivo (desde o jejum) com o glicocorticóide dexametasona (1 mg/kg, 2 vezes ao dia,
s.c.) ou com o inibidor da síntese protéica cicloheximida (2,5 mg/kg, 2 vezes ao dia,
i.p.). Setenta e duas horas após a indução da colite com TNBS, os cólons foram
montados em cubas para órgão isolado e após 60 min, realizadas curvas
concentração-resposta cumulativas para o agonista seletivo do receptor B
1
a des-
Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) ou realizada análise histológica nos cólons. Os resultados
da figura 19 demonstram que o tratamento com dexametasona (Figura 19 A) ou
com a cicloheximida (Figura 19 B) foi capaz de reduzir significativamente a
contração induzida pela des-Arg
9
-BK, com inibição da R
máx
em 83,23 ± 1,83 e 38,74
± 5,65 % em relação aos animais controle (colite sem tratamento), respectivamente.
Além disso, a análise histológica revelou que ambos os tratamentos com
dexametasona ou com cicloheximida, foram capazes de reduzir o dano tecidual
induzido pela administração do TNBS no cólon dos camundongos (Figura 19 C-E).
Complementarmente, em outra série de experimentos, foi estudado o efeito in
vitro da dexametasona ou da cicloheximida em cólons de animais com colite obtidos
após 72 h de inflamação. Para tal, foram realizadas curvas concentração-resposta
cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM), 60 min após a montagem das
preparações, na ausência ou na presença de dexametasona (100 µM) ou de
cicloheximida (70 µM). Como esperado, os resultados obtidos desses experimentos
Resultados
88
demonstraram que a adição in vitro de dexametasona ou cicloheximida não alterou a
resposta contrátil à des-Arg
9
-BK (resultados não mostrados), confirmando que o
receptor B
1
foi sintetizado in vivo após a indução da colite com TNBS.
Figura 19. Efeito dos inibidores de síntese protéica sobre a indução do receptor B
1
in vivo em
cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-resposta
cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons provenientes de camundongos tratados
com (A) dexametasona (1 mg/kg, 2 vezes ao dia, s.c.) ou (B) cicloheximida (2,5 mg/kg, 2 vezes ao
dia, i.p.) obtidos 72 horas após a indução da colite pelo TNBS. As respostas contrateis à des-Arg
9
-BK
foram realizadas 60 min após a montagem das preparações. Os resultados foram calculados em
relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100 µM). Os valores estão expressos como
a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (colite) (teste “t” de
Student não pareado). Fotografias representativas da análise histológica do cólon de camundongos
tratados com (C) salina, (D) dexametasona (1 mg/kg, 2 vezes ao dia, s.c.) ou (E) cicloheximida (2,5
mg/kg, 2 vezes ao dia, i.p.) avaliadas 72 horas após a indução da colite pelo TNBS. Imagens com
aumento de 4 x.
C
D
E
Resultados
89
4.13. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na
colite induzida pelo TNBS em cólons de camundongos: papel da fosfatidil
inositol-3-quinase γ (PI3Kγ)
Com o intuito de avaliar a participação da via PI3Kγ na indução do receptor B
1
pelo TNBS, os animais foram tratados desde o jejum in vivo com o inibidor seletivo
da PI3Kγ o AS605240 (10 mg/kg, 2 vezes ao dia, v.o.). Após o tratamento,
seguimentos de os cólons obtidos 72 h após a indução da colite foram montados em
cubas para órgão isolado e realizadas curvas concentração-resposta cumulativas
para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM). Os resultados da Figura 20 A demonstram
redução na R
máx
conferida pelo tratamento com AS605240 (47,02 ± 4,40 %) quando
comparado ao controle (colite sem tratamento). Ademais, a análise microscópica
revelou que o tratamento com AS605240 foi capaz de reduzir a lesão induzida pela
colite com o TNBS nos cólons dos camundongos (Figura 20 B e C).
Resultados
90
Figura 20. Efeito do inibidor da fosfatidil inositol-3-quinase
γ
(PI3K
γ
) sobre a indução do
receptor B
1
in vivo em camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-
resposta cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons provenientes de camundongos
tratados com (A) AS605240 (10 mg/kg, 2 vezes ao dia, v.o.) 72 horas após a indução da colite pelo
TNBS. As curvas de contração à des-Arg
9
-BK foram realizadas 60 min após a montagem das
preparações. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol
(CCh, 100 µM). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01
comparado ao grupo controle (colite) (teste “t” de Student não pareado). Fotografias representativas
da análise histológica do cólon de camundongos tratados com (B) salina ou (C) AS605240 (10 mg/kg,
2 vezes ao dia, v.o.) avaliadas 72 horas após a indução da colite pelo TNBS. Imagens com aumento
de 4 x.
B
C
BB
CC
Resultados
91
4.14. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na
colite induzida pelo TNBS em cólons de camundongos: papel do fator nuclear-
κB (NF-κB)
Na seqüência, foi avaliado o possível envolvimento da via de sinalização
intracelular do NF-κB na indução do receptor B
1
durante a colite induzida pelo TNBS,
através do tratamento in vivo (desde o jejum) com o inibidor PDTC (30 mg/kg, 1 vez
ao dia, i.p.). Os resultados da Figura 21 A demonstram que o tratamento com o
PDTC foi capaz de reduzir significativamente a contração induzida pela des-Arg
9
-BK
(0,1-10.000 nM), com redução da R
máx
em 53,90 ± 5,24 % em relação aos animais
colite (controles). Além disso, a análise histológica demonstrou que o tratamento
com PDTC reduziu o dano tecidual provocado pela administração de TNBS no cólon
dos camundongos (Figura 21 B e C).
Resultados
92
Figura 21. Efeito do inibidor do fator nuclear
κ
B (NF-
κ
B) sobre a indução do receptor B
1
in vivo
em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-resposta
cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons provenientes de camundongos tratados
com (A) PDTC (30 mg/kg, 1 vez ao dia, i.p.) obtidos 72 horas após a indução da colite pelo TNBS. As
curvas de contração à des-Arg
9
-BK foram realizadas 60 min após a montagem das preparações. Os
resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100 µM).
Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo
controle (colite) (teste “t” de Student não pareado). Fotografias representativas da análise histológica
do cólon de camundongos tratados com (B) salina ou (C) PDTC (30 mg/kg, 1 vez ao dia, i.p.)
avaliadas 72 horas após a indução da colite pelo TNBS. Imagens com aumento de 4 x.
B CB CC
Resultados
93
4.15. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na
colite induzida pelo TNBS em cólons de camundongos: papel do fator de
necrose tumoral- α (TNFα)
Com o objetivo de avaliar a possível participação da citocina TNFα na indução
do receptor B
1
durante a colite induzida pelo TNBS, os animais foram tratados desde
o jejum in vivo com o inibidor do TNFα a talidomida (50 mg/kg, 1 vez ao dia, v.o.) ou
com o anticorpo quimérico anti-TNFα o infliximab (2 mg/kg, 1 vez ao dia, s.c.). Os
resultados da figura 22 demonstram que o tratamento com a talidomida (Figura 22
A) ou com o infliximab (Figura 22 B) foi capaz de reduzir significativamente a
contração induzida pela des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM), com redução da R
máx
em
46,45 ± 6,02 e 38,09 ± 4,92 % em relação aos controles (colite não tratados),
respectivamente. Além disso, a análise histológica revelou que ambos os
tratamentos, talidomida ou infliximab, foram capazes de reduzir a lesão induzida pela
administração de TNBS no cólon dos camundongos (Figura 22 C-E).
Posteriormente, a fim de comprovar a participação do TNFα no processo de
indução do receptor B
1
durante a colite foram utilizados animais com deleção gênica
para o receptor p55 do TNFα (TNFαp55
-/-
). Os resultados da figura 22 F
demonstram que cólons com colite obtidos de animais TNFαp55
-/-
apresentaram
resposta contrátil reduzida à des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em relação aos cólons
com colite de animais da linhagem controle C57/BL6, em 72 h após a administração
de TNBS. A R
máx
para a des-Arg
9
-BK foi 55,04 ± 6,79 % menor nos animais
TNFαp55
-/-
quando comparados aos animais C57/BL6.
Resultados
94
C
D
E
C
D
E
Resultados
95
Figura 22. Papel do fator de necrose tumoral-
α
(TNF
α
) sobre a indução do receptor B
1
in vivo
em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-resposta
cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons provenientes de camundongos tratados
com (A) talidomida (50 mg/kg, 1 vez ao dia, v.o.) ou (B) infliximab (2 mg/kg, 1 vez ao dia, s.c.) obtidos
72 horas após a indução da colite pelo TNBS. Fotografias representativas da análise histológica do
cólon de camundongos tratados com (C) salina, (D) talidomida (50 mg/kg, 1 vez ao dia, v.o.) ou (E)
infliximab (2 mg/kg, 1 vez ao dia, s.c.) avaliadas 72 horas após a indução da colite por TNBS.
Imagens com aumento de 4 x. (F) Curvas concentração-resposta cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-
10.000 nM) em cólons de camundongos controle (C57/BL6) ou TNF
α
p55
-/-
obtidos 72 horas após a
indução da colite pelo TNBS. As curvas de contração à des-Arg
9
-BK foram realizadas 60 min após a
montagem in vitro. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo
carbacol (CCh, 100 µM). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e
**P<0,01 comparado ao grupo controle com colite (teste “t” de Student não pareado).
Resultados
96
4.16. Estudo dos mecanismos envolvidos na indução in vivo do receptor B
1
na
colite induzida pelo TNBS em cólons de camundongos: papel da óxido nítrico
sintase indutível (iNOS)
Com o objetivo de avaliar a possível participação da enzima iNOS na indução
do receptor B
1
durante a colite induzida pelo TNBS, foram utilizados ferramentas
farmacológicas e genéticas. Quanto à primeira, animais foram tratados desde o
jejum in vivo com o inibidor seletivo da iNOS 1400W (10 mg/kg, 2 vezes ao dia, s.c.).
Além disso, foram utilizados animais com deleção gênica para a enzima iNOS
(iNOS
-/-
). Os resultados da figura 23 demonstram que tanto o tratamento
farmacológico com 1400W (Figura 23 A) quanto a deleção gênica da iNOS (Figura
23 D), foram capazes de reduzir significativamente a contração induzida pela des-
Arg
9
-BK, com redução da R
máx
em 32,85 ± 4,21 e 44,84 ± 4,80 % em relação aos
cólons dos animais controle (colite sem tratamento ou colite nos animais C57/BL6),
respectivamente. Além disso, a análise histológica revelou que o tratamento com
1400W foi capaz de reduzir a lesão tecidual induzida pela administração de TNBS
nos cólons dos camundongos (Figura 23 B e C).
Resultados
97
Figura 23. Papel da óxido nítrico sintase indutível (iNOS) sobre a indução do receptor B
1
in
vivo em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-resposta
cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons provenientes de camundongos tratados
com (A) 1400W (10 mg/kg, 2 vezes ao dia, s.c.) obtidos 72 horas após a indução da colite pelo TNBS.
Fotografias representativas da análise histológica do cólon de camundongos tratados com (B) salina
ou (C) 1400W (10 mg/kg, 2 vezes ao dia, s.c.) avaliadas 72 horas após a indução da colite pelo
TNBS. Imagens com aumento de 4 x. (D) Curvas concentração-resposta cumulativas para des-Arg
9
-
BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos controle (C57/BL6) ou iNOS
-/-
obtidos 72 horas após
a indução da colite pelo TNBS. As curvas de contração à des-Arg
9
-BK foram realizadas 60 min após a
montagem in vitro. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo
carbacol (CCh, 100 µM). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e
**P<0,01 comparado ao grupo controle com colite (teste “t” de Student não pareado).
B
C
B
CC
Resultados
98
4.17. Efeito dos antagonistas seletivos dos receptores B
1
e B
2
sobre a resposta
contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite
induzida pelo TNBS
A fim de caracterizar os subtipos de receptores envolvidos na resposta
contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK no cólon de camundongos após a administração
intra-colônica de TNBS, foram realizadas curvas concentração-resposta cumulativas
para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons obtidos 72 horas após a indução da
colite na ausência, ou na presença do antagonista seletivo para o receptor B
1
R715
(1-10 nM) ou do antagonista seletivo para o receptor B
2
FR173657 (100 nM). Os
dados da figura 24 A indicam que o antagonista do receptor B
1
R715 (1-10 nM)
promoveu redução da R
máx
para a des-Arg
9
-BK de maneira concentração-
dependente. Além disso, novamente constataram-se características de antagonismo
do tipo competitivo irreversível. Por outro lado, a avaliação da resposta contrátil à
des-Arg
9
-BK na presença do antagonista do receptor B
2
FR173657 não interferiu de
forma significativa na resposta contrátil no cólon isolado de camundongo (Figura 24
B).
Resultados
99
Figura 24. Efeito dos antagonistas seletivos para os receptores das cininas sobre a resposta
contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida pelo
TNBS. Curvas concentração-resposta cumulativas obtidas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em
cólons de camundongos obtidos após 72 h de indução da colite com TNBS, na ausência ou na
presença de (A) R715 (1-10 nM) ou (B) FR173657 (100 nM) 60 min após a montagem das
preparações. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol
(CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6).
4.18. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo
agonista B
1
, des-Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por
TNBS: papel do cálcio extracelular e de canais de cálcio do tipo L
Com o objetivo de avaliar a possível participação do cálcio externo na
resposta contrátil induzida pelo agonista do receptor B
1
des-Arg
9
-BK, foram
realizadas curvas concentração-resposta cumulativas em cólons de camundongos
obtidos 72 h após a indução da colite na ausência ou na presença de cálcio. Para
tal, após a obtenção da curva concentração-resposta cumulativa para a des-Arg
9
-BK
(0,1-10.000 nM) em solução de Krebs-Henseleit contendo cálcio, as preparações
passaram a ser banhadas em solução de Krebs-Henseleit modificada, ausente de
cálcio e contendo o quelante de cálcio etilenoglicol-bis-(β-amino-etil éster) (EGTA 1
Resultados
100
mM). Os cólons permaneceram nesta nova solução nutritiva por 20 min, sendo a
mesma renovada a cada 5 min. Nessas condições, a contração induzida pela des-
Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) nos cólons isolados de camundongos com inflamação
colônica por TNBS foi completamente abolida (Figura 25 A). Além disso, curvas
concentração-resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) foram
obtidas 60 min após a montagem das preparações de cólons inflamados na
ausência ou presença do bloqueador de canais de cálcio do tipo L, a nicardipina (1
µM). Na figura 25 B, a nicardipina reduziu significativamente a resposta contrátil
induzida pela des-Arg
9
-BK; redução da R
máx
de 45,05 ± 8,03 %, quando comparada
com a resposta controle.
Figura 25. Papel do cálcio extracelular e canais de cálcio na resposta contrátil induzida pela
des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. (A) Curvas
concentração-resposta cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos
obtidos 72h após a indução da colite por TNBS realizadas em solução de Krebs-Henseleit com cálcio
ou sem cálcio mais EGTA (1 mM). (B) Curvas concentração-resposta cumulativas para des-Arg
9
-BK
(0,1-10.000 nM) em cólons isolados de camundongos obtidas na ausência ou presença de
nicardipina (1
µ
M) 60 min após a montagem dos tecidos. Os resultados foram calculados em relação
à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a
média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não
pareado).
Resultados
101
4.19. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo
agonista B
1
, des-Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por
TNBS: papel da via do ácido araquidônico
O papel das fosfolipases de membrana, responsáveis pela liberação do ácido
araquidônico na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK foram também
avaliadas em cólons obtidos 72 horas após a indução da colite pelo TNBS. Curvas
concentração-resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) foram
realizadas na ausência ou presença do inibidor da fosfolipase A
2
(PLA
2
) PACOCF3
(10 µM) ou do inibidor da fosfolipase C (PLC) U73122 (300 nM). Os dados da figura
26 mostram redução significativa da R
máx
para a des-Arg
9
-BK nos tecidos incubados
com os inibidores PACOCF3 e U73122 (41,07 ± 9,24; 38,22 ± 7,63 %,
respectivamente) quando comparados com os respectivos grupos controles.
Resultados
102
Figura 26. Efeito dos inibidores da fosfolipase na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK
em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-resposta
cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos obtidos 72 h após a
indução da colite por TNBS realizadas na ausência ou presença de (A) PACOCF3 (10 µM) ou (B)
U73122 (300 nM) 60 min após a montagem dos tecidos. Os resultados foram calculados em relação à
contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média
± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Com o intuito de ampliar as evidências acerca do envolvimento dos
metabólitos derivados da via do ácido araquidônico sobre as respostas contráteis
mediadas pelo receptor B
1
, em cólons de camundongos, curvas concentração-
resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) foram realizadas em
cólons de camundongos obtidos 72 h após a indução da colite com TNBS, na
ausência ou na presença do inibidor não seletivo para as COXs indometacina (1
µM), do inibidor seletivo da COX-2 DFU (1 µM), do inibidor preferencial da COX-1
SC560 (1 µM) ou antagonista do receptor de leucotrieno D
4
MK571 (100 nM). Os
resultados da figura 27 demonstram que os inibidores das COXs Indometacina
(Figura 27 A), DFU (Figura 27 B) e SC560 (Figura 27 C) foram capazes de reduzir
significativamente a resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em 28,61 ± 8,47;
Resultados
103
36,10 ± 8,19 e 39,45 ± 4,06 %, respectivamente. Além disso, foi verificado que o
MK571 (100 nM, Figura 27 D) não alterou significativamente a contração induzida
pela des-Arg
9
-BK.
Figura 27. Efeito dos inibidores das ciclooxigenases e do antagonista do receptor de LTD
4
na
resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida
pelo TNBS. Curvas concentração-resposta cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons
de camundongos obtidos 72 h após a indução da colite por TNBS realizadas na ausência ou
presença de (A) indometacina (1 µM), (B) DFU (1 µM), (C) SC560 (1 µM) ou (D) MK571 (100 nM) 60
min após a montagem dos tecidos. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima
induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6).
*P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Resultados
104
4.20. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo
agonista B
1
, des-Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por
TNBS: papel do óxido nítrico (NO)
A fim de avaliar a possível participação do NO na resposta contrátil mediada
pelo receptor B
1
, curvas concentração-resposta cumulativas para a des-Arg
9
-BK
(0,1-10.000 nM) foram realizadas em cólons obtidos 72 h após a indução da colite
por TNBS na ausência ou na presença do inibidor não seletivo da óxido nítrico
sintase (NOS) aminoguanidina (10 µM), do inibidor da óxido nítrico sintase endotelial
(eNOS) L-NIO (10 µM) ou do inibidor seletivo da iNOS 1400W (10 µM). Os
resultados ilustrados na figura 28 indicam que os inibidores aminoguanidina (Figura
28 A), L-NIO (Figura 28 B) e 1400W (Figura 28 C) foram capazes de reduzir a
resposta contrátil à des-Arg
9
-BK de maneira significativa. As porcentagens de
redução da R
máx
foram 31,19 ± 5,89; 39,56 ± 6,47; 46,12 ± 8,01 %, respectivamente.
Resultados
105
Figura 28. Efeito dos inibidores das NOS na resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em
cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-resposta
cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons obtidos 72 h após a indução da colite por
TNBS realizadas na ausência ou presença de (A) aminoguanidina (10
µ
M), (B) L-NIO (10
µ
M) ou (C)
1400W (10
µ
M) 60 min após a montagem dos tecidos. Os resultados foram calculados em relação à
contração máxima induzida pelo carbacol (CCh, 100
µ
M). Os valores estão expressos como a média
± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Resultados
106
4.21. Estudo dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil mediada pelo
agonista B
1
, des-Arg
9
-BK, em cólons de camundongos com colite induzida por
TNBS: papel das proteínas quinases
Visando analisar o possível envolvimento das proteínas quinases nas
respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons de
camundongos obtidos 72 h após a indução da colite por TNBS; as preparações
foram incubadas na ausência ou presença do inibidor da proteína quinase A (PKA)
KT5720 (100 nM), do inibidor da proteína quinase C (PKC) GF109203X (1 µM), do
inibidor seletivo da phosphoinositide 3-quinase γ (PI3Kγ) AS605240 (10 µM) ou do
inibidor da MEK1/2 PD98059 (10 µM). Os resultados da figura 29 mostram redução
significativa da R
máx
induzida pela des-Arg
9
-BK na presença dos inibidores KT5720,
GF109203X, AS605240 e PD98059 com inibições de 53,21 ± 6,87; 50,44 ± 1,69;
40,41 ± 9,93 e 49,44 ± 8,05 %, respectivamente.
Resultados
107
Figura 29. Efeito dos inibidores das proteínas quinases na resposta contrátil induzida pela des-
Arg
9
-BK em cólons de camundongos com colite induzida pelo TNBS. Curvas concentração-
resposta cumulativas para des-Arg
9
-BK (0,1-10.000 nM) em cólons de camundongos obtidos 72 h
após a indução da colite por TNBS, realizadas na ausência ou presença de (A) KT5720 (100 nM), (B)
GF109203X (1
µ
M), (C) AS605240 (10
µ
M) ou (D) PD98059 (10
µ
M) 60 min após a montagem dos
tecidos. Os resultados foram calculados em relação à contração máxima induzida pelo carbacol (CCh,
100
µ
M). Os valores estão expressos como a média ± e.p.m. (N = 6). *P<0,05 e **P<0,01 comparado
ao grupo controle (teste “t” de Student não pareado).
Discussão
108
5. DISCUSSÃO
5.1. Respostas contráteis induzidas pela BK e seus análogos em cólons de
camundongos
As cininas representam um grupo de peptídeos endógenos, que agem
localmente como hormônios, produzidos no plasma ou em tecidos periféricos em
resposta a estímulos fisiológicos ou traumáticos. As cininas são produzidas a partir
de precursores endógenos denominados de cininogênios os quais sofrem a ação
das enzimas calicreínas. As cininas exercem múltiplas ações em diferentes tecidos,
como contração e relaxamento da musculatura lisa, controle da pressão sanguínea,
dilatação venular, dor, hiperalgesia e no processo inflamatório (Marceau e Regoli,
2004). As ações exercidas pelas cininas são mediadas pela ativação de dois
receptores, chamados de B
1
e B
2
. Os receptores do tipo B
2
são expressos
constitutivamente em vários tipos celulares e estão amplamente distribuídos no SNC
e no SNP. Esses receptores apresentam alta afinidade pela BK e pela calidina e são
responsáveis por mediarem muitas das ações fisiológicas das cininas. Entretanto, os
receptores do tipo B
1
, demonstram não serem constitutivos, com poucas exceções,
havendo a necessidade de indução; os receptores B
1
possuem alta afinidade por
metabólitos da BK como a des-Arg
9
-BK e a des-Arg
10
-calidina (Marceau e
Bachvarov, 1998; Marceau e Regoli, 2004).
A atividade enzimática das calicreínas tem sido descrita no trato
gastrointestinal de ratos, gatos e seres humanos (Clements, 1989). No cólon, tem
sido referido, que essas enzimas estão localizadas em células goblet, e que
possuem origem pancreática e sub-maxilar (Schachter et al., 1983, 1986; Skagen e
Discussão
109
Andersen, 1986). Alguns estudos têm demonstrado que as cininas modulam
diversas ações fisiológicas no intestino como a dilatação de veias e arteríolas -
interferindo assim no fluxo sanguíneo, na secreção de muco e eletrólitos, na
motilidade, na permeabilidade intestinal, nas respostas dolorosas viscerais e na
inflamação (Cuthbert e Margolius, 1982; Schachter et al., 1983; Cuthbert e
MacVinish, 1986; Clements, 1989; Gaginella e Kachur, 1989). No entanto, são
escassos os trabalhos dedicados a caracterizar os mecanismos farmacológicos
envolvidos nas respostas mediadas pelas cininas no tecido colônico.
Os resultados do presente estudo demonstram que a BK e outros agonistas
do receptor B
2
, induzem resposta contrátil concentração-dependente em
preparações de cólons de camundongos, sem que ocorra, o fenômeno da
dessensibilização observado em células do endotélio vascular (Smith et al., 1995) e
células vasculares do músculo liso (Mathis et al., 1996). Essa resposta contrátil do
cólon de camundongos vem novamente confirmar o caráter constitutivo dos
receptores B
2
amplamente mencionado nos estudos das cininas (Regoli e Barabé,
1980; Bhoola et al., 1992; Prado et al., 2001). Contudo, em relação à ordem de
potências relativas para os agonistas seletivos do receptor B
2
, nessa preparação, os
agonistas analisados apresentaram a seguinte ordem de R
máx
: BK > Lys-BK > Hyp
3
-
BK > Tyr
8
-BK > Met-Lys-BK > des-Arg
9
-BK. Dessa forma, os resultados
apresentados estão de acordo com a literatura e demonstram que o receptor B
2
é o
principal responsável por mediar respostas contráteis para as cininas em diversos
órgãos de diferentes espécies animais em estados não inflamatórios (Bhoola et al.,
1992). Por outro lado, o agonista seletivo dos receptores B
1
a des-Arg
9
-BK, nessas
condições, não foi capaz de promover resposta contrátil expressiva no cólon,
Discussão
110
reforçando a idéia da ausência constitutiva de receptores do tipo B
1
e da sua
necessidade de indução.
Investigou-se a seguir, com o emprego de antagonistas seletivos, o perfil
farmacológico dos receptores B
2
em cólons de camundongos. Para tal, foram
utilizados antagonistas peptídicos e não peptídicos seletivos para o receptor B
2
,
incluindo o Hoe 140 e o FR 173657, respectivamente. Os resultados obtidos indicam
que ambos os antagonistas apresentaram um perfil de ação de maneira dose-
dependente, contudo, considerando que os antagonistas causaram redução
significativa na R
máx
o antagonismo observado não pareceu ser do tipo não-
competitivo, mas sim, do tipo competitivo irreversível, em relação à resposta contrátil
induzida pela BK (para revisão ver: Vauquelin e Szczuka, 2007). Entretanto, foi
demonstrado também que o antagonista seletivo dos receptores B
1
a des-Arg
9
-Leu
8
-
BK, não foi capaz de alterar a resposta contrátil induzida pela BK. Esses resultados
sugerem novamente uma maior participação de receptores do tipo B
2
do que do tipo
B
1
nessas condições em cólons de camundongos. Ademais, alguns dados da
literatura reportam que o Hoe 140 e o FR 173657 podem apresentar antagonismo do
tipo competitivo ou não-competitivo dependendo do tecido e da condição
experimental estudada (Griesbacher e Lembeck,1992; Griesbacher et al., 1997).
Estudos bioquímicos e farmacológicos têm descrito que apesar das
diferenças entre os receptores B
1
e B
2
das cininas, na maioria das vezes, as vias de
transdução de sinal desencadeadas por ambos os receptores parecem ser
semelhantes (Prado et al., 2002; Leeb-Lundberg et al., 2005). Os receptores para as
cininas pertencem à família de receptores acoplados a proteína G (Gαi e Gαq),
podendo sua ativação estar relacionada à estimulação direta ou indireta de
diferentes vias de sinalização intracelular. Algumas dessas vias incluem: fosfolipase
Discussão
111
C, fosfolipase D, aumento de cálcio intracelular, ativação de isoformas específicas
da proteína quinase C, estimulação de canais de potássio, transporte de íons
cloreto, ativação da adenilato ciclase, formação de óxido nítrico, aumento expressivo
dos níveis de prostanóides e a ativação de MAPKs (Schanstra et al., 1999;
Liebmann e Böhmer, 2000; Liebman 2001; Leeb-Lumsberg et al., 2005).
Trabalhos como o de Bascands et al., (1994), têm demonstrado a importante
participação do cálcio nas respostas mediadas pelas cininas, indicando que a
ativação de células mesangiais pela BK resulta no aumento de inositol 1,4,5-
trifosfato e de cálcio citosólico livre. Outros trabalhos realizados em preparações
isoladas como em íleo de cobaias e íris de porco (Calixto e Medeiros,1991; Medeiros
e Calixto, 1993; El Sayah e Calixto 2003b), confirmam que a contração induzida pela
BK é dependente do influxo de cálcio do meio extracelular. Os resultados obtidos no
presente estudo demonstram que em preparações obtidas de cólons de
camundongos a contração induzida pela BK também é dependente do influxo de
cálcio extracelular uma vez que é praticamente abolida em preparações banhadas
em meio nutritivo livre de cálcio e contendo o quelante de cálcio EGTA.
No presente trabalho investigou-se alguns subtipos de canais de cálcio
dependentes de voltagem envolvidos na resposta contrátil induzida pela BK em
cólons de camundongos. Inicialmente, o papel dos canais de cálcio do tipo L foi
observado com o uso do bloqueador seletivo a nicardipina. Os resultados
demonstraram que a incubação das preparações com este bloqueador resulta em
uma significativa redução da resposta contrátil à BK, confirmando assim a
importância de canais de cálcio tipo L nessa resposta contrátil. De fato, os canais de
cálcio do tipo L estão amplamente distribuídos na musculatura lisa intestinal e estão
Discussão
112
envolvidos na motilidade e contratilidade do cólon (Kinoshita et al., 2003). No
presente estudo investigou-se ainda a participação dos canais de cálcio do tipo N,
envolvidos na liberação de neurotransmissores tanto no sistema nervoso central
como no periférico (McNaughton e Randall, 1997). Os resultados obtidos nas
preparações de cólons incubadas com o bloqueador seletivo ω-conotoxina GVIA
evidenciaram a participação desses canais na resposta contrátil à BK, uma vez que
a contratilidade foi reduzida significativamente na presença deste bloqueador.
Resultados semelhantes acerca do envolvimento de ambos os canais de cálcio na
contração induzida pela BK foram descritos em preparações obtidas de estômago de
rato e íris de porco (Cabrini et al., 1996; El Sayah e Calixto, 2003b).
Alguns trabalhos da literatura têm descrito que, no intestino, o
neurotransmissor excitatório acetilcolina é capaz de evocar respostas contráteis,
aumentar a amplitude dessas respostas e controlar a motilidade (para revisão ver:
Lecci et al., 2002). A acetilcolina produz contrações no músculo liso visceral através
da estimulação de cinco subtipos de receptores conhecidos como M
1
-M
5
. Entretanto,
o músculo liso visceral colônico expressa predominantemente os subtipos M
2
e M
3
(Eglen, 2001).
A estimulação desses receptores está associada à ativação de
fosfolipase C
β
que leva à liberação de Ca
2+
intracelular via IP
3
e a ativação da
proteína quinase C (α, β ou ε). A inibição dessas enzimas reduz as contrações
induzidas pela acetilcolina no tecido colônico normal (Eglen, 2001; Ali e Sarna,
2002). Além disso, experimentos utilizando cólon de cobaia isolado demonstraram
que a atropina e a tetrodotoxina (TTX) reduzem as ondas rítmicas da musculatura
longitudinal, sugerindo um importante papel do sistema colinérgico e de canais sódio
voltagem dependentes sensíveis à TTX na contratilidade muscular espontânea do
tecido colônico (Spencer et al., 2002). Desse modo, investigou-se no presente
Discussão
113
estudo a possível participação do sistema colinérgico e de canais de sódio
dependentes de voltagem sensíveis à TTX nas respostas contráteis induzidas pela
BK em cólons de camundongos. Para tal, utilizou-se o antagonista muscarínico
atropina, capaz de bloquear de forma não seletiva os receptores muscarínicos, ou o
bloquedor de canal de sódio TTX, uma toxina conhecida por inibir, de maneira
abrangente, a liberação de neurotransmissores. Os resultados obtidos em cólons de
camundongos demonstram que em ambos os estudos, houve significativa redução
da resposta contrátil induzida pela BK, confirmando a importante participação desses
sistemas nessa resposta contrátil.
Desde o advento da BK sintética, na década de sessenta, têm sido sugerida a
participação das cininas na liberação de mediadores envolvidos nos processos
inflamatórios e de dolorosos em diversos tipos teciduais (Regoli e Barabé 1980;
Calixto et al., 2000, 2004). Ademais, evidências experimentais sugerem o
envolvimento dos produtos das enzimas ciclooxigenases e lipooxigenases nas ações
causadas pelas cininas no trato gastrointestinal e em preparações de cólons de
coelhos, cobaias e ratos (Musch et al., 1982; Hall e Morton 1997), sendo escassos
os estudos em cólons de camundongos. Parte dos resultados obtidos no presente
estudo indicam que a contração induzida pela BK em cólons de camundongos foi
significativamente reduzida na presença do antiinflamatório não esteroidal,
indometacina; do inibidor seletivo da COX-2, rofecoxibe; do inibidor preferencial da
COX-1, SC560; ou do inibidor do receptor de leucotrieno D
4,
o MK571, confirmando
o envolvimento da produção de prostanóides e do leucotrieno D
4
na resposta
contrátil à BK em cólons de camundongos.
A fisiologia do sistema gastrointestinal, bem como sua regulação pelo sistema
nervoso entérico (SNE), depende grandemente da modulação promovida por
Discussão
114
compostos neuroefetores, sendo alguns conhecidos como neuropeptídeos incluindo
a substância P, a neurocinina A, a neurocinina B e o CGRP (Holzer, 1998; Lecci et
al., 2002). Esses neuropeptídeos participam do controle da motilidade
gastrointestinal, da secreção de muco e eletrólitos, do controle do fluxo sanguíneo,
bem como da homeostasia tecidual intestinal. Além disso, tem sido descrito o
importante papel exercido pelas neurocininas no controle da motilidade intestinal
tanto em humanos como em animais, pois antagonistas do receptor NK
1
levam ao
desencadeamento de diarréia em humanos, por bloquearem a função neuroefetora
da SP no plexo mientérico do SNE (Goldstein et al., 2001; Campos, et al., 2001). De
maneira interessante, tem sido observado que a inibição concomitante dos
receptores NK
1
, NK
2
e NK
3
em cobaias torna mais lento o peristaltismo colônico
(Tonini et al., 2001). O presente estudo amplia os dados da literatura e confirma a
participação das neurocinas e do CGRP na resposta contrátil induzida pela BK no
cólon de camundongos, uma vez que o antagonista seletivo do receptor NK
1
R116301, o antagonista seletivo do receptor NK
3
SR142801 ou o antagonista do
receptor para o CGRP, o fragmento CGRP
(8-37)
, causaram redução dessa resposta.
A liberação de neuropeptídeos nos terminais de neurônios sensoriais é
regulada por receptores expressos na membrana destas células, em especial pelos
receptores TRPV1 (Clapham, 2003), canais de cátion não seletivos, capazes de
integrar informações sensoriais, químicas, físicas e inflamatórias (Jordt et al., 2003;
Myers e Julius 2007). Evidências têm apontado um papel importante para esse
receptor no trato gastrointestinal, em especial na constipação crônica, na IBD e na
síndrome do intestino irritável (IBS) (Yiangou et al., 2001; Fujino et al., 2006; Hicks,
2006; Storr, 2007). A redução da resposta contrátil à BK em preparações de cólons
de camundongos observada na presença dos antagonistas vanilóides capsazepina
Discussão
115
ou SB366791 sugere uma importante interação entre as cininas e o sistema
vanilóide, corroborando com observações anteriores realizadas em outras
preparações como a íris isolada de porco (El Sayah e Calixto, 2003b).
Em seguida, após o estudo de alguns dos mecanismos envolvidos nas
respostas contrateis induzidas pela BK mediadas pelos receptores do tipo B
2
, foi
avaliada a possível indução dos receptores do tipo B
1
em preparações de cólon.
Como descrito na parte introdutória desse trabalho, os receptores B
1
para as cininas
são raramente expressos de modo constitutivo, mas sua síntese pode ser
estimulada após trauma tecidual ou durante processos inflamatórios (para revisão
ver: Marceau e Bachvarov 1998; Calixto et al., 2000, 2004). Contudo, em alguns
músculos lisos, os receptores B
1
parecem ocorrer constitutivamente, como por
exemplo, no duodeno isolado de rato (Boschov et al., 1984), na veia porta isolada de
rato (Campos e Calixto, 1994), no ducto deferente isolado de camundongo (Maas et
al., 1995) e no fundo de estômago de ratos (Cabrini et al., 1996). Uma característica
bastante interessante acerca das respostas mediadas pela ativação dos receptores
B
1
é que elas podem ser induzidas após o trauma tecidual, após longos períodos de
incubação in vitro, ou através de procedimentos farmacológicos, como a adição de
alguns agentes nocivos, como LPS, acetato miristato de forbol, bem como alguns
fatores de crescimento epidermal, dentre outros (Hall e Morton, 1997; Campos e
Calixto, 1994; Marceau e Bachvarov, 1998).
Para avaliar a indução in vitro do receptor B
1
em cólons de camundongos, o
agonista seletivo para os receptores B
1
des-Arg
9
-BK (1 µM) foi adicionado às
preparações em diferentes intervalos de tempo após a montagem. Dessa forma, foi
possível constatar um aumento tempo-dependente da resposta contrátil mediada
pelo agonista do receptor B
1
a des-Arg
9
-BK
nesta preparação. A resposta contrátil
Discussão
116
observada foi máxima entre os tempos de 6-8 h, não havendo diferenças
significativas entre eles. O aparecimento de respostas contráteis à des-Arg
9
-BK em
diferentes tempos após a montagem dos tecidos na ausência de estímulos
específicos foi observada também em preparações de artéria mesentérica de coelho
(Deblois e Marceau, 1987), aorta de coelho (Audet et al., 1994), de veia umbilical
humana (Sardi et al., 1997), artéria mesentérica de coelho (Deblois e Marceau,
1987) e na veia porta de rato (Medeiros et al., 2004).
Com o objetivo de verificar o possível envolvimento do sistema cininérgico na
resposta à des-Arg
9
-BK em preparações de cólons de camundongo após 6 h de
montagem, as mesmas foram testadas na ausência e na presença do antagonista
seletivo para o receptor B
1
o R715 ou do antagonista seletivo para o receptor B
2
o
FR173657. Os resultados obtidos na presença do antagonista seletivo para o
receptor B
1
demonstram uma redução da resposta contrátil (associado a um
achatamento das curvas), caracterizando assim um antagonismo do tipo competitivo
irreversível. Por outro lado, o antagonista do receptor B
2
não interferiu de forma
significativa com a resposta contrátil à des-Arg
9
-BK no cólon isolado de
camundongo, indicando a predominância de uma resposta contrátil evocada pelos
receptores do tipo B
1
. Esse resultado condiz com o perfil farmacológico evidenciado
em outros tecidos como a íris isolada de porco (El Sayah et al., 2006). Os resultados
obtidos na presença do R715 foram confirmados com o uso de outros antagonistas
seletivos para o receptor B
1
, como a des-Arg
9
-Leu
8
-BK, considerada membro da
primeira geração de antagonistas, além do SSR 240612 e do composto
Benzodiazepínico-1 (BZ-1), considerados membros da quarta geração de
antagonistas (Campos et al., 2006). Como esperado, os antagonistas testados em
Discussão
117
preparações de cólons de camundongos foram capazes de promover significativa
redução na resposta contrátil à des-Arg
9
-BK.
Analisados em conjunto, este primeiro bloco de resultados demonstra que a
resposta contrátil induzida pela BK e análogos, em preparações de cólons de
camundongos, é mediada pela ativação dos receptores B
2
. Em relação à
caracterização farmacológica, ambos os antagonistas seletivos para o receptor B
2
estudados, o Hoe 140 e o FR 173657, foram capazes de reduzir as respostas
contráteis à BK, caracterizando um antagonismo do tipo competitivo irreversível.
Ademais, a resposta contrátil induzidas pela BK em preparações colônicas,
demonstrou ser dependente do influxo de cálcio do meio extracelular, de canais de
cálcio voltagem dependentes do tipo L e N, do sistema colinérgico, de canais de
sódio sensíveis à TTX, de metabólitos derivados da via do ácido araquidônico, da
participação de neuropeptídeos como SP, neurocinina B e o CGRP e finalmente
demonstrou ser mediadas pela interação com receptores do tipo TRPV1. No entanto,
diferentemente da resposta constitutiva mediada pelos receptores B
2
, a resposta
contrátil evidenciada em cólons de camundongos pelos receptores B
1
in vitro,
demonstrou sofrer um aumento tempo-dependente. A caracterização farmacológica
da resposta contrátil induzida para o agonista B
1
foi realizada inicialmente com o
antagonista R 715, que causou redução da resposta contrátil evidenciando
novamente um antagonismo do tipo competitivo irreversível. Além disso, na
utilização de outros antagonistas B
1
como a des-Arg
9
-Leu
8
-BK, o SSR 240612 e o
composto Benzodiazepínico-1, em preparações de cólons após a indução in vitro do
receptor B
1
, novamente constatou-se redução da resposta contrátil.
Discussão
118
5.2. Avaliação das cininas e seus receptores B
1
e B
2
em cólons de
camundongos com colite induzida por TNBS
A IBD é clinicamente descrita pela doença de Crohn e pela colite ulcerativa,
que são patologias caracterizadas por inflamação crônica do trato gastrointestinal. A
doença de Crohn pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal e geralmente
está associada com lesões na parede do intestino, enquanto que, na colite ulcerativa
a inflamação é restrita ao cólon e ao reto, e é caracterizada por inflamação em
camadas mais superficiais e pela presença de ulcerações ou abscessos. A etiologia
da IBD ainda não está totalmente esclarecida e parece haver a contribuição de
fatores como infecções bacterianas persistentes e regulação inapropriada das
respostas do sistema imune, com o envolvimento de diversos mediadores
inflamatórios (Podolsky, 2002; Bouma e Strober 2003; Danese e Fiocchi, 2006;
Baumgart e Carding, 2007).
O sistema calicreína-cininas faz parte do sistema de defesa humoral e
participa ativamente de respostas inflamatórias (Colman, 1999). Nos últimos anos
tem sido proposto que as cininas estão envolvidas nas respostas inflamatórias e nos
sintomas da IBD, uma vez que estes peptídeos são capazes de facilitar a abertura
das junções epiteliais das células intestinais - aumentando assim a permeabilidade
capilar, estimular terminações nervosas sensoriais causando dor, além de estimular
a síntese de eicosanóides e óxido nítrico. Ademais, os receptores para as cininas,
que colaboram grandemente para a inicialização e perpetuação dessas respostas,
estão presentes no epitélio intestinal modulando as respostas inflamatórias tanto no
íleo como no cólon (Chen et al., 1995). Recentemente, Stadnicki et al., (2005)
descreveram alterações nos níveis de proteína e RNAm dos receptores B
1
e B
2
em
Discussão
119
pacientes com IBD, quando comparados com os respectivos controles, e dessa
forma sugeriram que os receptores para as cininas poderiam contribuir para a
gênese desta patologia. Entretanto, ainda existem poucos estudos correlacionando
as cininas, seus receptores e a IBD.
Como descrito na seção anterior, os receptores para as cininas
principalmente o receptor B
1
pode ser induzido em preparações isoladas através do
dano tecidual decorrente da montagem in vitro (por exemplo, montagem da veia
porta de ratos; Medeiros et al., 2004), ou por diversos agentes nocivos como o LPS
(por exemplo, incubação de LPS em preparações de íris de porco (El Sayah et al.,
2006). Além disso, têm sido referido, que os receptores B
1
podem ser induzidos in
vivo, na ocorrência de infecções, lesões ou ainda em doenças inflamatórias crônicas.
Dados da literatura demonstram a indução in vivo do receptor B
1
após o tratamento
sistêmico de macacos com LPS e no tratamento local na pata de ratos (Deblois e
Horlick, 2001; Passos et al., 2004), após injeção intradermal de tripomastigotas (que
irão causar a infecção por Trypanosoma cruzi) em camundongos (Todorov et al.,
2003), em modelos de isquemia e reperfusão cardíaca realizada em coelhos e
camundongos, ou na isquemia pancreática realizada em ratos (Mazenot et al., 2001;
Lagneux et al., 2002; Kuebler et al., 2003; Souza et al., 2004), em modelos de asma
brônquica induzida por ovoalbumina em ratos e camundongos (Huang et al., 1999;
Landgraf et al., 2003), no modelo de diabetes por estreptozotocina em ratos
(Campos et al., 2002; Vianna et al., 2003) e em alguns tipos de câncer como o de
próstata (Taub et al., 2003).
Nesse sentido, após a padronização da colite ulcerativa por TNBS em
camundongos, passou-se a estudar, com o auxílio de técnicas farmacológicas,
Discussão
120
bioquímicas e de biologia molecular o envolvimento das cininas e seus receptores na
colite ulcerativa.
Na indução da colite por TNBS, observou-se aumento expressivo, tempo-
dependente nas respostas contráteis tanto para a BK como para a des-Arg
9
-BK em
cólons obtidos em diferentes intervalos de tempo após a administração do TNBS. A
resposta máxima causada por ambos os peptídeos foi observada em cólons obtidos
72 h após a indução da colite. Esse aumento dos receptores B
1
e B
2
em tecidos
colônicos de camundongos com colite experimental está de acordo com estudos
anteriores realizados em ratos (Stadnicki et al., 1998) e em humanos (Devani et al.,
2005; Stadnicki et al., 2003, 2005).
Com o intuito de confirmar o aumento da expressão dos receptores para as
cininas na colite experimental induzida por TNBS, realizaram-se experimentos de
união específica (binding de saturação), utilizando-se os radioligantes [
3
H]-BK,
ligante do receptor B
2
ou [
3
H]-des-Arg
10
-calidina, ligante do receptor B
1
, em tecidos
colônicos obtidos de camundongos controle (sem colite) ou com colite induzida por
TNBS após o tempo de 72 h. Os resultados obtidos em ambos os experimentos com
os radioligantes [
3
H]-BK e [
3
H]-des-Arg
10
-calidina demonstraram um aumento
significativo no B
máx
, sem alteração significativa do K
d
. Assim, foi constatado que na
colite induzida por TNBS em cólons de camundongos ocorre aumento na densidade
tantos dos receptores B
1
como B
2
sem, no entanto, causar alteração significativa da
afinidade dos receptores pelo ligante. Resultados semelhantes foram observados na
bexiga urinária de rato após a indução de cistite por ciclofosfamida (Lecci et al.,
1999), onde ocorre um aumento na densidade dos receptores B
1
e B
2
na cistite em
comparação com os respectivos tecidos controles. Ademais, aparentemente, o
resultado de união específica obtido em cólons de camundongos, parece ser, o
Discussão
121
segundo relato da literatura que avalia, através dessa técnica, os receptores do tipo
B
1
em tecidos inflamados.
Além da determinação da densidade dos receptores cininérgicos em tecidos
com o uso de técnicas de ensaio de união específica, técnicas de biologia molecular
que permitem avaliar a expressão do RNAm para esses receptores têm contribuído
expressivamente para o melhor entendimento da participação desses receptores nos
processos patofisiológicos (Luccarini et al., 1998; Medeiros et al., 2004; Marceau e
Regoli, 2004). Na IBD, Stadnicki et al., (2005) demonstraram aumento na expressão
do RNAm para ambos os receptores B
1
e B
2
em enterócitos de intestino humano,
bem como aumento significativo na expressão dos receptores B
1
na região apical
desses enterócitos (por imunohistoquímica). Os resultados obtidos no presente
estudo em cólons de camundongos em diferentes tempos após a indução de colite
por TNBS, estão de acordo com aqueles descritos por Stadnicki et al., (2005), uma
vez que também na colite experimental ocorre um aumento significativo da
expressão do RNAm para os receptores B
1
e B
2
. Esse aumento do RNAm para
ambos os receptores B
1
e B
2
, caracterizou-se por ser variável para o receptor B
2
e
por apresentar um pico de expressão até as primeiras 24 h, mas mantendo-se
elevado até 96 h para o receptor B
1
. Desse modo, pode-se inferir que a expressão
aumentada do RNAm para os receptores cininérgicos na colite experimental induzida
em camundongos, resulta em aumento do número destes receptores na membrana
celular observado nos estudos funcionais e de união específica.
Após os estudos de clonagem e seqüênciamento dos receptores B
1
e B
2
,
tornou-se possível o desenvolvimento de linhagens de camundongos com deleção
gênica para esses receptores. Em animais com deleção gênica para o receptor B
2
foi
possível comprovar a participação desse receptor nos processos de inflamação, dor,
Discussão
122
contração e relaxamento da musculatura lisa e na modulação da pressão arterial
(Borkowski et al., 1995; Boyce et al., 1996). Já em animais com deleção gênica para
o receptor B
1
foi demonstrada a importância desses receptores em respostas
dolorosas (dor neuropática) e inflamatórias, na apoptose de neutrófilos e na
hipotensão (Pesquero et al., 2000; Araújo et al., 2001; Ferreira et al., 2005).
Finalmente, em camundongos com deleção gênica para ambos os receptores B
1
e
B
2
(duplo nocaute), foi possível constatar que esses animais são férteis e não
possuem anormalidades cardíacas, além disso, apresentam proteção contra a
hipotensão induzida pelo LPS no choque endotóxico (Cayla et al., 2007).
Considerando os animais com deleção gênica para os receptores cininérgicos
como importantes ferramentas para o estudo acerca do papel destes receptores,
passou-se a investigar com o uso destes animais a contribuição dos receptores B
1
e
B
2
na indução da colite ulcerativa por TNBS e na migração celular em cólons
inflamados. Os resultados obtidos demonstram claramente uma redução marcante
no dano tecidual nos cólons dos animais com deleção gênica para os receptores B
1
e B
2
, sendo essa resposta mais expressiva nos animais com deleção gênica para o
receptor B
1
, quando comparada com os animais controles (animais C57/BL6 com
colite). Vários trabalhos têm demonstrado a capacidade das cininas de promover a
migração celular em processos inflamatórios (Hall e Morton, 1997; Marceau e
Bachvarov, 1998; Calixto et al., 2000; Passos et al., 2004); sendo assim, quanto à
migração celular, avaliada indiretamente pela atividade da MPO em animais com
deleção gênica para os receptores B
1
e B
2
, observou-se uma significativa redução
da atividade dessa enzima em cólons inflamados obtidos de animais com deleção
gênica para o receptor B
1
, comparado com os animais controle (animais C57/BL6
com colite). De maneira interessante, não foi observada redução significativa na
Discussão
123
migração celular em camundongos com deleção gênica para o receptor B
2
,
sugerindo dessa forma, que nos animais nocaute para o receptor B
2
, a migração
celular está sendo modulada por outros fatores. Tais resultados obtidos concordam
com os dados da literatura (Devani et al., 2002, 2005; Isordia-Salas et al., 2002;
Stadnicki et al., 1998, 2003, 2005), que sugerem uma importante participação dos
receptores B
1
e B
2
na gênese e na manutenção da UC e da CD, bem como, a direta
participação principalmente dos receptores B
1
nas respostas inflamatórias do cólon.
Assim, analisados em conjunto, este segundo bloco de resultados evidenciou
o aumento da resposta contrátil induzida tanto pela BK quanto pela des-Arg
9
-BK em
cólons de camundongos com colite por TNBS, sendo essa resposta tempo-
dependente, alcançando valores máximos em cólons obtidos 72 h após a indução da
colite. Além disso, foi possível verificar aumento na densidade dos receptores para
as cininas em cólons de camundongos obtidos após 72 h de colite, bem como
aumento nos níveis do RNAm para ambos os receptores B
1
e B
2
na colite.
Finalmente, a partir dos resultados obtidos em animais com deleção gênica para os
receptores B
1
e B
2
é possível sugerir com maior clareza a participação destes
receptores, em especial dos receptores B
1
, na gênese da colite ulcerativa.
5.3. Estudo de alguns dos mecanismos envolvidos na indução do receptor B
1
em cólons de camundongos com colite induzida por TNBS
Dados da literatura têm demonstrado aumento da expressão dos receptores
B
1
in vivo após a indução de estresse térmico em ratos (Lagneux e Ribuot, 1997), na
administração endovenosa de IL-1β em camundongos (McLean et al., 2000), ou
ainda em suínos e macacos, após o tratamento com LPS (Siebeck et al., 1998;
Discussão
124
Deblois e Horlick, 2001). Campos et al., (1998) demonstraram que a injeção
intradérmica de citocinas pró-inflamatórias como a IL-1β e o TNFα produziu rápido
aumento do edema de pata induzido pela des-Arg
9
-BK em ratos. Esse mesmo efeito
também pode ser observado em ratos e camundongos pré-tratados com LPS ou
com o fator de agregação plaquetária (PAF) (Campos et al., 1998, 2002; Fernandes
et al., 2003; Passos et al., 2004; Rocha et al., 2005). Além disso, o aumento dos
receptores B
1
também foi descrito em modelos crônicos como o de diabetes do tipo I
induzida pelo tratamento com estreptozotocina (Cloutier e Couture, 2000; Campos et
al., 2001).
Evidências acerca da indução dos receptores B
1
, demonstram que a
expressão desses receptores está associada ao aumento do seu RNAm e de sua
proteína, sendo controlada principalmente pela produção de citocinas e de fatores
preferencialmente produzidos durante o trauma ou estresse tecidual (Larrivée et al.,
1998; Marceau et al., 1998; Calixto et al, 2000; 2004). Um dado interessante, é que
os receptores B
1
parecem ser induzidos sobre as mesmas condições descritas para
a indução de enzimas pró-inflamatórias como a COX-2 e iNOS; nesse mesmo
sentido, os estímulos e vias de sinalização celular (transducionais e pós-
transducionais ) que são capazes de aumentar a expressão do receptor B
1
parecem
ser os mesmos que regulam as enzimas COX-2 e iNOS (Dixon, 2004). No entanto,
tem sido amplamente demonstrado que compostos farmacológicos que modulam a
síntese protéica são capazes de inibir a expressão dos receptores B
1
em vários
estudos in vivo e in vitro (Marceau et al., 1998; Sardi et al., 2000; Calixto et al.,
2004).
Desse modo, a fim de melhor caracterizar alguns dos mecanismos envolvidos
na indução dos receptores B
1
em cólons de camundongos, animais submetidos ao
Discussão
125
protocolo de indução da colite experimental por TNBS foram tratados desde o jejum
com o glicocorticóide dexametasona ou com o inibidor de síntese protéica
cicloheximida. Os resultados obtidos demonstraram que ambos os tratamentos
foram capazes de reduzir significativamente a resposta contrátil induzida pela des-
Arg
9
-BK in vitro, indicando que a síntese de novo é um evento importante para o
aumento dos receptores B
1
na colite. Ademais, a administração in vivo da
dexametasona e da cicloheximida resultou em redução significativa no dano tecidual
observado no tecido colônico. De maneira interessante, quando as mesmas drogas
(dexametasona e cicloheximida) foram incubadas in vitro em preparações de cólons
obtidos após 72 h de indução da colite, não foram observadas alterações
significativas nas respostas contráteis à des-Arg
9
-BK, sugerindo que os receptores
B
1
estariam nesta situação já previamente induzidos. Os resultados obtidos no
presente estudo estão de acordo com aqueles observados por Ni et al., (1998)
obtidos em células da musculatura lisa vascular de rato, onde o tratamento com a
dexametasona foi capaz de inibir significativamente a indução do receptor B
1
por
atuar diretamente na transcrição gênica do receptor. Nesse mesmo sentido, o
trabalho de Lecci et al., (1999) demonstrou que a administração in vivo da
dexametasona foi capaz de reduzir significativamente a resposta contrátil à des-
Arg
9
-BK em preparações de bexiga urinária obtidas tanto de ratos controle quanto de
ratos com cistite. Complementarmente, Cabrini et al., (2001) demonstraram que a
retirada cirúrgica da glândula adrenal ou a lesão química pelo tratamento com
mitotane (agente adrenocorticolítico), induz aumento da expressão dos receptores
B
1
, sugerindo dessa forma que os glicocorticóides endógenos controlam as
respostas inflamatórias bem como a expressão dos receptores B
1
. Quanto à
cicloheximida, trabalhos como o de Campos e Calixto, (1994), Cabrini e Calixto,
Discussão
126
(1997) e El Sayah et al., (2006) demonstraram que a incubação de preparações de
veia porta de rato, vesícula biliar ou da íris de porco na presença deste inibidor
resultou em uma significativa redução das respostas contráteis à des-Arg
9
-BK,
indicando que a da síntese de novo do receptor B
1
é importante para o aumento das
respostas funcionais mediadas por este receptor também in vitro. Portanto, os
resultados obtidos no presente estudo indicam que a expressão dos receptores B
1
e
a evolução do dano tecidual observado na colite por TNBS dependem
significativamente do processo de síntese protéica.
Convencionalmente, o tratamento de inflamações crônicas, como a IBD, está
fortemente relacionado com o uso de drogas antiinflamatórias, que abrangem
estudos científicos envolvendo citocinas pró-inflamatórias, fatores como o NF-κB e
enzimas como as MAPKs. Diferentemente dos alvos já estudados na CD e na UC,
no presente trabalho optou-se por estudar uma nova via, a da PI3Kγ (quinase
citoplasmática, encontrada principalmente em células do sistema hematopoiético),
de forma geral estudada até então somente em modelos de patologias crônicas
como lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatóide (Barber et al., 2005; Camps et
al., 2005).
As PI3Ks (fosfatidil inositol-3-quinases) são proteínas intracelulares que têm
um importante papel no desenvolvimento da resposta imune, inflamação e
crescimento tumoral (para revisão ver: Ohashi e Woodgett, 2005; Hawkins et al.,
2006). Baseando-se nas características estruturais e especificidade ao substrato a
família das PI3Ks, pode ser dividida em três classes: I (subdividida em IA e IB), II e
III. Todas as isoformas, independente da classe, são capazes de fosforilar lipídios de
PI (fosfatidilinositol) na posição D
3
do anel inositol, gerando uma variedade de
segundos mensageiros (Hawkins et al., 2006). A classe I A consiste nas isoformas
Discussão
127
PI3Kα, PI3Kβ e PI3Kδ e a classe I B consiste somente na isoforma PI3Kγ; essas
isoformas controlam muitas funções celulares como proliferação, crescimento,
sobrevivência, apoptose, migração e adesão celular. As PI3Ks possuem um
importante papel na sinalização de leucócitos e conseqüentemente representam um
alvo promissor na intervenção da via de sinalização onde estão envolvidos
processos inflamatórios e de doenças auto-imunes. A classe II contém três membros
PI3K-C2α, PI3K-C2β e PI3K-Cγ e a classe III apresenta um único membro o qual é
homólogo da Saccharomyces cerevisiae Vps34p (Chen et al., 2005).
Após estimulação celular as PI3Ks são recrutadas para a superfície da
membrana plasmática. E desse modo, quimiocinas MCP-1 ou fator de complemento
C5a ligados a receptores acoplados a proteína G (GPCRs) desencadeiam o
aumento da atividade da PI3Kγ, e das PI3Kα,β e δ que são ativadas por receptores
tirosina quinase (RTKs) através da ligação com o fator estimulador de colônia (CSF-
1). A ativação dessas PI3Ks leva à formação de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato
(PIP3) por fosforilação da fosfatidilinositol-3,4-bifosfato (PIP2). A interação entre
proteína quinase B (PKB) com PIP3 na membrana da célula estimula a fosforilação
de alvos essenciais que promovem múltiplas conseqüências biológicas, incluindo o
processo inflamatório e a sobrevivência celular. Os poucos trabalhos publicados até
então, Camps et al., (2005) e Barber et al., (2005) mostraram que os compostos AS-
605240 (5-quinoxalina-6-ylmetileno-thiazolidina-2,4-diona) e AS-604850 (5-(2,2
difluorobenzo{1,3}dioxol-5-ylmetileno)-thiazolidina-2,4-diona) bloqueiam a (PI3K)γ,
mas não a (PI3K)α,β e δ. Experimentos utilizando AS605240 na artrite e lúpus
eritematoso sistêmico (Barber et al., 2005) demonstraram significativa redução do
processo inflamatório em ambos os casos.
Discussão
128
Na seqüência do presente estudo, a fim de investigar a participação da PI3Kγ
na indução do receptor B
1
na colite induzida por TNBS e no dano tecidual colônico,
os animais foram tratados desde o jejum, com o composto AS605240. Os
resultados observados em cólons provenientes de animais tratados com o inibidor
seletivo da PI3Kγ demonstram uma significativa redução da resposta contrátil à des-
Arg
9
-BK, bem como uma redução significativa no dano tecidual colônico em
comparação com os respectivos controles (colite sem tratamento). Dessa forma, é
possível sugerir que a via da PI3Kγ, pouco explorada até então no que diz respeito à
IBD e as cininas, contribui para a indução dos receptores B
1
bem como ao dano
tecidual característico da colite por TNBS. Desse modo, pode-se sugerir que a via da
PI3Kγ constitui um alvo promissor a ser amplamente explorado na IBD e no sistema
calicreína-cininas.
Diversos estudos têm descrito que o fator transcricional NF-κB é um
componente crucial na mediação de respostas inflamatórias, promovendo a indução
de genes de mais de duas centenas de proteínas, incluindo algumas pró-
inflamatórias como citocinas, quimiocinas, enzimas que geram mediadores
inflamatórios, moléculas de adesão e diversos tipos de receptores (Barnes e
Karin,1997; Li e Verma, 2002). Dessa forma, essa via tem sido amplamente
relacionada a várias doenças inflamatórias como a artrite reumatóide, asma, sepse,
aterosclerose, colite ulcerativa e diversos tipos de câncer (Baldwin, 2001).
Quanto à IBD, uma ativação sustentada do NF-κB parece estar intimamente
relacionada à inflamação intestinal crônica, sendo essa ativação identificada também
na lâmina própria intestinal de pacientes com CD e em modelos murinos de colite
por TNBS (Rogler et al., 1998; Schreiber et al., 1998; Neurath et al., 1996).
Recentemente, têm sido descrito nos trabalhos de Nenci et al., (2007), Zaph et al.,
Discussão
129
(2007) e Ben-Neriah e Smidt-Supprian (2007), que o NF-κB parece ser o principal
mecanismo a interferir na integridade epitelial intestinal, controlando dessa forma,
alguns genes cujos produtos irão promover a interação entre as defesas imunes da
mucosa e a microflora intestinal. Em relação às cininas, alguns trabalhos
demonstram que o fenômeno da indução dos receptores B
1
envolve a ativação de
fatores transcricionais. Essas evidencias são confirmadas por dados que revelam a
presença de seqüências na região promotora do gene do receptor B
1
candidatas à
ligação de fatores de transcrição incluindo AP-1, CREB, SP-1, PEA-3, NF-κB, entre
outros (Ni et al., 1998; Yang et al., 1998; Angers et al., 2000 ). Trabalhos como o de
Ni et al., (1998) demonstraram que o sítio para ligação do NF-κB na região
promotora do receptor B
1
é suficiente para a indução do receptor em resposta ao
estímulo por LPS, IL-1β ou TNFα. Resultados obtidos em outros trabalhos
demonstram a participação do NF-κB no aumento das respostas mediadas pelos
receptores B
1
na aorta de coelho (Medeiros et al., 2001), em tecidos obtidos em
animais adrenolectomizados (Cabrini et al., 2001), ou ainda em patas de ratos
injetadas com o agente quimiotático PAF ou LPS (Fernandes et al., 2003; Passos et
al., 2004). Assim, passou-se a investigar a participação do fator NF-κB na indução
do receptor B
1
na colite induzida por TNBS em cólons de camundongos tratados ou
não desde o jejum com o inibidor da ativação do NF-κB, o PDTC. Além disso, foram
realizadas análises histológicas dos cólons provenientes destes animais. Os
resultados do presente estudo mostram redução das respostas contráteis à des-
Arg
9
-BK em cólons obtidos de animais tratados com PDTC, bem como redução do
dano tecidual. Esses dados funcionais e histológicos ampliam a noção de que o NF-
κB é crucial para a expressão dos receptores B
1
in vivo, exercendo um importante
papel na indução do dano tecidual observado na colite.
Discussão
130
Inúmeras evidências têm sugerido que diversas citocinas antiinflamatórias e
pró-inflamatórias são de extrema importância para a IBD. O clássico paradigma
entre as respostas T
H
1 e T
H
2 consiste no fato de que algumas citocinas como o
TNFα, a IL-12 e o INFγ classicamente conhecidas como T
H
1 iniciariam as respostas
inflamatórias na CD e na UC. No entanto, ambas as respostas T
H
1 e T
H
2 estariam
envolvidas tanto no início quanto na cronicidade da IBD (Podolky, 2002; Bouma e
Strober 2003). Através desse conhecimento, citocinas como o TNFα e a IL-12, que
parecem atuar em todas as fases da IBD tornaram-se os exemplos de maior
sucesso quanto à intervenção terapêutica (Cominelli, 2004). O TNFα é uma citocina
sintetizada durante o processo inflamatório por diferentes tipos celulares, como
macrófagos e mastócitos em resposta a vários estímulos inflamatórios como
espécies reativas de oxigênio e NO; suas ações podem ser bloqueadas com a
utilização de estratégias que incluem inibição da sua síntese, liberação ou atividade
biológica (Bobin-Dubigeon et al., 2001). Dos inibidores de TNFα, a talidomida e o
infliximab são os que têm trazido os resultados mais interessantes. A talidomida por
reduzir a meia-vida do seu RNAm inibe a produção de TNFα (Moreira et al., 1993;
Bobin-Dubigeon et al., 2001; Kim et al., 2004) e o infliximab, por ser um anticorpo
monoclonal quimérico bloqueia a atividade do TNFα e induz a apoptose de células
inflamatórias, melhorando dessa forma, o quadro clínico de muitos pacientes com
IBD (Bickston e Cominelli, 1998; D’Haens et al., 1999; Ogata e Hibi, 2003; Cominelli,
2004; Lichtenstein et al., 2006). Entretanto, alguns resultados acerca da utilização do
infliximab são controversos pois, têm sido descrito em alguns casos, o surgimento de
complicações como tuberculose, lúpus eritematoso e linfoma (Ogata e Hibi, 2003;
Cominelli, 2004).
Discussão
131
Por outro lado, tem sido amplamente descrito a participação de citocinas pró-
inflamatórias e células inflamatórias na modulação das respostas mediadas pelos
receptores B
1
das cininas (Fernandes et al., 2003; Gama Landgraf et al., 2004;
Passos et al., 2004). Trabalhos como o de Fernandes et al., (2005) têm demonstrado
que na seqüência de eventos que levam a expressão do receptor B
1
na pata de rato,
após estímulo nocivo com PAF, estão os aumentos de citocinas pró-inflamatórias
como o TNFα e a IL1-β. Desse modo, passou-se a investigar no presente trabalho
se a citocina TNFα poderia estar modulando a indução in vivo do receptor B
1
, bem
como, o dano tecidual na colite. Para tanto, animais foram tratados desde o jejum
com o inibidor do TNFα a talidomida ou com o anticorpo quimérico anti-TNFα o
infliximab. Os resultados obtidos em preparações de cólons de animais submetidos
aos respectivos tratamentos indicam que a citocina TNFα contribui
significativamente para a resposta contrátil à des-Arg
9
-BK, bem como o dano
tecidual na colite, uma vez que o bloqueio da produção ou dos receptores de TNF-α
reduziu a contração induzida pelar des-Arg
9
-BK, bem como o dano tecidual causado
pelo TNBS. Tais resultados sugerem que na colite induzida por TNBS a expressão
do receptor B
1
pode ser modulada por essa citocina. A fim de comprovar a
participação do TNFα na indução do receptor B
1
na inflamação intestinal, realizou-se
a indução da colite em animais com deleção gênica para o receptor p55 do TNFα
(TNFαp55
-/-
) para posterior montagem e desafio dos cólons frente à des-Arg
9
-BK. Os
resultados demonstraram que as respostas contráteis à des-Arg
9
-BK obtidas após
72 h da indução da colite foram significativamente menores do que as observadas
em animais controles (colite em animais C57/BL6), confirmando a participação do
TNFα na indução dos receptores B
1
na colite bem como ampliando a noção da
importância desta citocina para o sistema calicreína-cininas.
Discussão
132
Finalmente, outra via avaliada foi a do óxido nítrico (NO). O NO é gerado a
partir da oxidação de elétrons do aminoácido L-arginina, podendo ser produzido por
diversas células incluindo endotélio vascular, neurônios do SNC e SNE e células do
sistema imune (Moncada, 1992; Nathan e Xie, 1994). O NO é produzido por enzimas
chamadas de óxido nítrico sintases (NOS), dentre elas, existem duas isoformas que
se encontram expressas constitutivamente a NOS neural (nNOS) e a NOS endotelial
(eNOS) cujas denominações fazem a alusão ao tecido onde foi descrito. A terceira
isoforma é a NOS indutível (iNOS ou NOS II), tipicamente expressa em resposta a
estímulos nocivos (Nathan e Xie, 1994). O NO, depois de liberado, se difunde
rapidamente do local onde foi sintetizado podendo permear membranas celulares e
interagir com sítios de moléculas intracelulares. Além disso, o NO possui
instabilidade intrínseca, propriedade essa que elimina a necessidade de receptores
extracelulares ou alvos de degradação (Moncada, 1992; Nathan e Xie, 1994).
Alterações na regulação do NO têm sido descritas em muitas doenças do trato
gastrointestinal; mais especificadamente a produção de NO apresenta-se
aumentada na UC, na CD, no megacólon, na diverticulite e na diarréia, bem como
em modelos de inflamação intestinal (Boughton-Smith et al., 1993; Iwashita et al.,
1995). Entretanto, a contribuição das três isoformas da NOS na regulação das
respostas inflamatórias no trato gastrointestinal ainda são desconhecidas (Beck et
al., 2004). No intestino, é atribuído ao NO a função de regular a permeabilidade
intestinal e diferentemente de outros tecidos, a presença da iNOS como uma enzima
constitutiva se deve ao fato de que a mucosa intestinal é exposta a diversos
antígenos como bactérias e sub-produtos de bactérias que servem de estímulo para
sua expressão (Kubes, 1992). Foi também demonstrado que as enzimas iNOS,
eNOS e nNOS possuem um papel crucial na homeostasia do trato gastrointestinal
Discussão
133
sendo de extrema importância para a progressão da IBD. Trabalhos como o de
Zingarelli et al., (1999) reportam proteção tecidual e sobrevivência significativamente
maior em animais com deleção gênica para a iNOS
-/-
no modelo de colite crônica por
TNBS quando comparado com os respectivos controles. Sasaki et al., (2003)
demonstraram que em animais deleção gênica para a eNOS
-/-
ocorre exacerbada
resposta inflamatória na colite por DSS, sugerindo um papel protetor para a eNOS.
Por outro lado, Beck et al., (2004) descrevem que animais com deleção gênica para
a nNOS são mais suscetíveis ao dano tecidual produzido pelo DSS apresentando
também maior índice de mortalidade.
Quanto às cininas, têm sido amplamente descrito que a expressão dos
receptores B
1
pode sofrer importante influência pela ação de enzimas pró-
inflamatórias como a COX2 e a iNOS, sendo que estímulos que são capazes de
aumentar a expressão dos receptores B
1
são também descritos como necessários
para a regulação dessas enzimas (Zhou et al., 1998; 1999; Dixon et al., 2000;
Haddad et al., 2000; Lasa et al., 2001; Dixon, 2004; Calixto et al., 2004). Desta
forma, na continuidade dos estudos, foi avaliado o papel da iNOS na indução dos
receptores B
1
, e no dano tecidual na colite induzida por TNBS. Para isso, os animais
foram tratados desde o jejum com o inibidor seletivo da iNOS 1400W e foram
realizadas curvas concentração-resposta cumulativas à des-Arg
9
-BK em cólons
obtidos 72 h após o início da colite por TNBS. Os resultados demonstram que o
tratamento com 1400W foi capaz de reduzir a resposta contrátil à des-Arg
9
-BK,
quando comparado ao grupo controle (colite sem tratamento) sugerindo assim, que a
iNOS poderia participar na indução dos receptores B
1
na colite. Ademais, na
observação histológica, foi possível constatar que o tratamento com 1400W
promoveu proteção tecidual. Para confirmar a importância da iNOS na indução in
Discussão
134
vivo dos receptores B
1
na colite, passou-se a utilizar animais com deleção gênica
para a iNOS (iNOS
-/-
). Os resultados obtidos demonstraram que houve significativa
redução da resposta contrátil à des-Arg
9
-BK em cólons provenientes de animais
iNOS
-/-
submetidos a colite experimental por TNBS quando comparado com os
animais controles (colite em animais C57/BL6). Em conjunto, esses resultados
confirmam e estendem os dados da literatura acerca da contribuição da enzima
iNOS na indução dos receptores B
1
bem como no dano tecidual característico da
colite por TNBS.
Nesta terceira série de resultados discutidos, foi observado que a indução in
vivo dos receptores B
1
, bem como o dano tecidual evidenciado na colite, dependem
necessariamente de diversos fatores como indução da síntese protéica, participação
da via da PI3Kγ, do fator transcrição nuclear NF-κB, citocinas pró-inflamatórias como
TNFα e finalmente da participação da enzima iNOS. Esses resultados
complementam dados da literatura acerca da indução dos receptores B
1
principalmente na IBD.
5.4. Análise das respostas contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de
camundongos obtidos após a indução da colite por TNBS
De forma relevante, os estudos que envolvem o papel dos receptores B
1
na
dor e na inflamação tiveram início depois dos estudos de clonagem e
seqüênciamento desse receptor. Sendo assim, os primeiros trabalhos realizados,
demonstraram que os receptores B
1
possuíam uma expressão in vivo regulada por
citocinas pró-inflamatórias (como discutido na seção anterior) ou por estímulos
traumáticos (Calixto et al., 2004). Diversos estudos têm indicado a existência de
Discussão
135
importante interação entre os receptores B
1
e B
2
e demonstram que a persistente
estimulação dos receptores B
2
pode resultar na indução dos receptores B
1
(Rashid et
al., 2004). Ademais, tem sido proposto, que os receptores B
2
na ocorrência de
estimulação causam transitório aumento da concentração de Ca
2+
que colaboraria
para o fenômeno da dessensibilização desse receptor; entretanto, isto parece não
ocorrer com os receptores B
1
. Recentes estudos têm demonstrado que o receptor B
1
ao contrário dos receptores B
2
não é internalizado após a estimulação com o
agonista, mas sim, se transloca através de mecanismos mediados por cavéolas,
provavelmente esse fato é o responsável por facilitar a reciclagem e a amplificação
das respostas mediadas pelo receptor B
1
(Campos et al., 1996; Hayashi et al., 1998;
Modéer et al., 1998; Pan et al., 1998; Phagoo et al., 1999; 2000; Sabourin et al.,
2002; Calixto et al., 2004; Marceau e Regoli 2004).
De acordo com a literatura onde na colite ocorre aumento dos receptores B
1
(Stadnicki, 2005), procurou-se investigar alguns dos mecanismos que estariam
envolvidos na resposta do receptor B
1
após indução da colite por TNBS.
Inicialmente, com o objetivo de analisar o perfil farmacológico mediado pelo agonista
do receptor B
1
, foram utilizados antagonistas seletivos das cininas nessa
preparação. Desse modo utilizou-se o antagonista para o receptor B
1
o R715 e para
o receptor B
2
o FR 173657. Os resultados obtidos em preparações de cólons
montadas após 72 h de inflamação colônica demonstraram que o antagonista R715
causou redução da resposta contrátil ao agonista B
1
de maneira concentração-
dependente, apresentando um perfil farmacológico de antagonismo competitivo
irreversível. Entretanto, o antagonista seletivo para o receptor B
2
o FR 173657 não
foi capaz de modificar a resposta contrátil induzida pela des-Arg
9
-BK em cólons
inflamados. Esses resultados novamente confirmam a presença dos receptores B
1
Discussão
136
após a indução da colite por TNBS e estão de acordo com os descritos em outras
preparações teciduais como na íris isolada de porco após incubação com LPS (El
Sayah et al., 2006).
Resultados anteriores descritos para o receptor B
2
em conjunto com dados da
literatura (Campos e Calixto, 1994; El Sayah e Calixto 2003b) demonstram a
importante participação do Ca
2+
nas respostas funcionais induzidas pela ativação
dos receptores das cininas. No presente estudo, procurou-se também investigar a
participação do Ca
2+
e de canais de cálcio do tipo L na resposta contrátil induzida
pela des-Arg
9
-BK em cólons inflamados de camundongos. Para tal, cólons obtidos
72 h após a indução da colite foram montados e testadas suas respostas contráteis
à des-Arg
9
-BK na presença ou na ausência de cálcio (líquido nutritivo de Krebs-
Henseleit ausente de cálcio acrescido do quelante de cálcio EGTA, 1mM). Além
disso, também foram testadas preparações de cólons com colite na presença da
nicardipina (bloqueador de canal de cálcio do tipo L). Os resultados obtidos
revelaram a total dependência do cálcio externo nas respostas contráteis induzidas
pela des-Arg
9
-BK, bem como a participação de canais de cálcio do tipo L. Esses
resultados estão de acordo com dados anteriores obtidos para o receptor B
1
em
preparações de vesícula biliar após 6 h de montagem (Cabrini e Calixto, 1997), pois
foi demonstrado que o cálcio externo e os canais de cálcio do tipo L também
participam das respostas induzidas pela des-Arg
9
-BK nesse tecido.
Trabalhos têm demonstrado, que o dano tecidual causado na CD e na UC
está diretamente associado aos mediadores que conduzem e amplificam a resposta
inflamatória. Tem sido proposto que, na fase de amplificação da resposta
inflamatória, ocorre migração celular (também evidenciada na padronização da colite
por TNBS em camundongos pela atividade da MPO), produção de diversos
Discussão
137
mediadores pró-inflamatórios principalmente eicosanóides (prostaglandinas (PGs),
tromboxanos (TXs), leucotrienos (LTs)) e citocinas (Yang, 1996; Wallace e Ma,
2001). Esses diferentes eicosanóides são potentes mediadores do processo
inflamatório intestinal e a inibição da sua produção tem sido referida como uma
possível alternativa terapêutica (Greaves e Camp, 1998; Krimsky et al. 2003). Os
eicosanóides constituem duas principais famílias de derivados da via do ácido
araquidônico, que são os derivados da via das ciclooxigenases (COX1 e 2) que irão
produzir PGs e TXs e os derivados da via das lipooxigenases (LOX) que irão
produzir LTs e os ácidos hidroxieicosatetraeinóicos (HETEs). Ademais, tem sido
proposto que as cininas são potentes indutores da liberação de prostanóides por
causarem ativação citosólica da PLA
2
, em um processo dependente de cálcio
citosólico livre, o que conseqüentemente leva à liberação, na membrana celular, de
ácido araquidônico para posterior formação de prostanóides (Tanaka, 1995;
Schlemper et al., 2005). Desse modo, neste trabalho, também procurou-se investigar
o envolvimento da via do ácido araquidônico nas respostas contráteis induzidas pela
des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos obtidos 72 h após a colite por TNBS. Os
resultados obtidos com a utilização dos inibidores da fosfolipase A
2
(PLA
2
)
PACOCF3, do inibidor da fosfolipase C (PLC) U73122, do inibidor não seletivo para
as COXs indometacina, do inibidor seletivo da COX-2 DFU ou do inibidor
preferencial da COX-1 SC560, nessa preparação, mostraram significativa redução
da resposta contrátil à des-Arg
9
-BK, confirmando assim o envolvimento da via do
ácido araquidônico e seus metabólitos nas respostas funcionais dos receptores B
1
na colite por TNBS. No entanto, um desses resultados, o que se refere ao
antagonista seletivo do receptor de leucotrieno D
4
o MK571, difere dos dados
obtidos anteriormente para o receptor B
1
, bem como dos observados em
Discussão
138
preparações de vesícula biliar onde a resposta contrátil à des-Arg
9
-BK mostrou ser
dependente da liberação e ativação de leucotrienos D
4
(Cabrini e Calixto, 1997).
Entretanto, este resultado merece ser revisto, uma vez que no trabalho de Wardle et
al., (1993), foram descritos níveis elevados de leucotrieno D
4
em meios contendo
biopsias de pacientes com colite ulcerativa - sugerindo dessa forma que a via do
LTD
4
é importante na colite.
Diversos estudos têm demonstrado que a ativação dos receptores das cininas
leva a produção de agentes vasoativos como o NO (Regoli e Barabé, 1980; Vane e
Botting et al., 1987; Cahil et al., 1988; Ahluwalia e Perretti, 1999). Como
demonstrado na série de experimentos discutidos no presente estudo, o NO e as
enzimas que são responsáveis pela sua síntese parecem exercer grande influência
na inflamação colônica e na indução dos receptores B
1
(Kubes e McCafferty, 2000;
Dixon, 2004; Calixto et al., 2004). Complementando estas evidências, na seqüência,
investigou-se o papel das isoformas da NOS na resposta à des-Arg
9
-BK em tecidos
colônicos montados após 72 h de colite por TNBS. Os resultados obtidos após a
incubação com o inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase (NOS)
aminoguanidina, ou do inibidor da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) L-NIO, ou
do inibidor seletivo da iNOS 1400W, mostram significativa redução da resposta
contrátil à des-Arg
9
-BK, sugerindo assim a participação dessas enzimas na
regulação da resposta funcional dos receptores B
1
em preparações de cólons com
colite.
Diversos estudos têm confirmado que a fosforilação de proteínas exerce
importante papel na regulação de muitos processos celulares incluindo a expressão
de genes e a síntese protéica (Hunter, 1995). Entretanto, tem sido sugerido que a
ativação de MAPKs é essencial para a indução do receptor B
1
. Estudos como o de
Discussão
139
Larrivée et al., (1998) demonstraram que tanto a indução do receptor B
1
após trauma
tecidual, quanto à induzida por IL-1β, em aorta de coelhos, é significativamente
sensível a inibidores de tirosina quinase. Adicionalmente, Schanstra et al., (1998),
demonstram que a ativação da PKC regula a expressão do RNAm dos receptores B
1
em fibroblastos de pulmão humano. Entretanto, recentemente foi sugerida a
regulação in vitro do RNAm dos receptores B
1
, pela p38-MAPK e a c-Jun NH
2
-
terminal quinase (JNK) na veia porta de ratos (Medeiros et al., 2004). No presente
trabalho, foi investigado também o envolvimento de algumas proteínas quinases nas
respostas contrateis induzidas pela des-Arg
9
-BK em cólons de camundongos. Os
resultados obtidos na utilização dos inibidores da proteína quinase A (PKA) KT5720,
da proteína quinase C (PKC) GF109203X, da phosphoinositide 3-quinase γ (PI3Kγ)
AS605240 ou da MEK1/2 PD98059, em preparações de cólon montadas após 72 h
da indução da colite por TNBS, mostraram significativa redução das respostas
contráteis induzidas pela des-Arg
9
-BK indicando o envolvimento dessas quinases na
resposta funcional mediada pelos receptores B
1
.
Analisados em conjunto, os resultados deste quarto e último bloco de
resultados confirmam e estendem as evidências acerca da participação dos
receptores B
1
nas respostas contráteis do cólon de camundongos com colite.
Ademais, dentre os diversos mecanismos que estariam envolvidos nas respostas
transducionais mediadas após a ativação dos receptores B
1
em preparações de
cólons de camundongo com colite, é possível sugerir que as respostas funcionais
mediadas por esse receptor, nessa preparação, envolvem o influxo de cálcio do
meio extracelular, bem como de canais de cálcio voltagem dependente do tipo L, a
via dos metabólitos do ácido araquidônico, a participação da NOS e das isoformas
Discussão
140
iNOS e eNOS bem como a via de sinalização intracelular das proteínas quinases
envolvendo PKA, PKC, PI3Kγ e MEK.
Embora os componentes do sistema calicreína-cininas vêm sendo estudados
desde 1909, pesquisas relacionadas a esses peptídios são de grande interesse, pois
as cininas parecem exercer funções fundamentais para a homeostasia de diversos
processos fisiológicos. Recentes trabalhos têm descrito a participação do sistema
calicreína-cininas na IBD bem como, o aumento da expressão dos receptores B
1
e
B
2
nessa patologia. No entanto, até o momento, são escassos os trabalhos que se
propõem a investigar o papel das cininas na UC, bem como analisar os mecanismos
envolvidos nas respostas contráteis das cininas no cólon. Os resultados do presente
trabalho contribuem para o entendimento do papel das cininas na IBD, bem como
avalia alguns dos possíveis mecanismos envolvidos nas respostas contráteis
induzidas pelas cininas em cólons de camundongos normais ou com colite por
TNBS. Desse modo, é sugerido, que o sistema das cininas constitui um alvo
promissor para uma nova alternativa terapêutica na IBD.
Discussão
141
Figura 30. Vias de transdução de sinal que estão associadas às respostas das cininas. As setas
em rosa claro exemplificam as vias que podem ser moduladas pela ativação dos receptores B
1
e B
2
.
As setas em roxo demonstram alguns dos mecanismos envolvidos nas respostas das cininas.
Discussão
142
Figura 31. Exemplo de algumas vias de sinalização celular, que podem influenciar na indução
dos receptores B
1
e B
2
para as cininas na colite por TNBS. Em (A), possíveis mecanismos que
corroboram para a indução do receptor B
2
das cininas após a indução da colite. Em (B), possíveis
mecanismos envolvidos na indução do receptor B
1
das cininas após a indução da colite.
Conclusões
143
6. SUMÁRIO E CONCLUSÕES
O presente estudo demonstrou, através de técnicas farmacológicas,
bioquímicas e de biologia molecular que:
X A resposta contrátil induzida pela BK e análogos, em preparações de cólons de
camundongos, é mediada pela ativação de receptores B
2
constitutivos e não pelos
receptores B
1
. No entanto pode ser evidenciado um aumento tempo-dependente,
nas respostas mediadas pelos receptores B
1
in vitro;
X A resposta contrátil à BK no cólon de camundongo demonstrou ser dependente
do influxo de cálcio do meio extracelular, de canais de cálcio dependentes de
voltagem do tipo L e N, do sistema colinérgico, de canais de sódio sensíveis a TTX,
de metabólitos derivados da via do ácido araquidônico, da participação de
neuropeptídeos como SP, neurocinina B e o CGRP e finalmente demonstrou ser
mediadas pela interação com receptores do tipo TRPV1;
X
O aumento da resposta contrátil induzida tanto pela BK quanto pela des-Arg
9
-BK
em cólons de camundongos com colite por TNBS, foi tempo-dependente e está
relacionada com o aumento nos níveis de RNAm e da população (densidade) de
ambos os receptores B
1
e B
2
para as cininas;
Conclusões
144
X Animais com deleção gênica para os receptores B
1
ou B
2
para a cininas
apresentaram reduzido dano tecidual após colite por TNBS, sugerindo assim a
participação dos receptores para as cininas principalmente dos receptores B
1
na
gênese da colite ulcerativa;
X
A indução in vivo dos receptores B
1
, bem como o dano tecidual evidenciado na
colite, depende de fatores como indução da síntese protéica, participação da via da
PI3Kγ, do fator transcrição nuclear NF-κB, de citocinas pró-inflamatórias como TNFα
e da participação da enzima iNOS;
X As respostas funcionais mediadas pelo receptor B
1
envolvem o influxo de cálcio
do meio extracelular, canais de cálcio o tipo L, a via do ácido araquidônico, a
participação da NOS e das isoformas da iNOS e eNOS bem como pela via de
sinalização intracelular PKA, PKC, PI3Kγ e MEK;
X Quando preparações de cólons foram analisadas quanto ao perfil farmacológico
com os antagonistas dos receptores B
2
Hoe 140 ou FR173657, observou-se
diminuição das respostas contráteis, concentração-dependente, caracterizando
antagonismo do tipo competitivo irreversível. Além disso, preparações avaliadas 6h
após a montagem ou preparações de cólons obtidas 72 h após colite por TNBS,
quando incubadas com o antagonista dos receptores B
1
o
R715 também
demonstraram diminuição das respostas contráteis, concentração-dependente
evidenciando antagonismo do tipo competitivo irreversível;
Conclusões
145
X Os resultados analisados em conjunto contribuem para uma melhor
compreensão acerca do envolvimento das cininas e de seus receptores B
1
e B
2
na
colite experimental induzida por TNBS. Esses resultados sugerem fortemente o
possível emprego de antagonistas seletivos das cininas, especialmente para o
receptor B
1
, no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da IBD.
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Anexo
170
Registro típico ilustrando a viabilidade testada na adição de CCh e curvas
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