( PDF ) Estudo da identificação de Haplótipos e a relação com as manifestações clínicas em pacientes com anemia Falciforme

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO: CIÊNCIAS MÉDICAS

ESTUDO DA IDENTIFICAÇÃO DE HAPLÓTIPOS E A RELAÇÃO COM AS

MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME

MARIA APARECIDA LIMA DA SILVA

ORIENTADORA: Profa. Dra. Lúcia Mariano da Rocha Silla

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. José Artur Bogo Chies

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO: CIÊNCIAS MÉDICAS

ESTUDO DA IDENTIFICAÇÃO DE HAPLÓTIPOS E A RELAÇÃO COM AS

MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME

MARIA APARECIDA LIMA DA SILVA

ORIENTADORA: Profa. Dra. Lúcia Mariano da Rocha Silla

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. José Artur Bogo Chies

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

2006

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Silva, Maria Aparecida Lima

Estudo da Identificação de Haplótipos e a Relação com as

Manifestações Clínicas em Pacientes com Anemia Falciforme/105f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande

do Sul. Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas.

Título em Inglês: Haplotypes identification study and its

relationship to

clinical course in sickle cell disease.

1. Hemoglobinopatias 2. Haplótipos 3. Anemia Falciforme 4.

Hemoglobina S

AGRADECIMENTOS

Esta dissertação é o término de uma caminhada dolorosa e de muita luta

que me fez crescer através deste grande aprendizado. Em cada palavra, em cada

linha, está impressa a vontade da realização de um sonho, combustível que me

alimentou para eu chegasse ao fim do caminho.

Quero agradecer a todos aqueles que de uma forma ou de outra me

auxiliaram a chegar aqui, aliviando as dores desta caminhada.

A grande Força do Universo por me conduzir ao crescimento.

Ao maior tesouro que tenho nesta vida, meus irmãos: Isa, Vera, Sônia,

Noêmia, Flávio, Beto, sobrinhos, cunhado, cunhada, que me alimentaram com o

seu apoio e amor nos momentos de dificuldade. Sem falar do patrocínio.

As duas jóias mais preciosas deste tesouro, meu pai Andris Luis e minha

mãe Engracia, que me sustentaram com o seu amor incondicional e que me

ensinaram entre tantos, os sublimes valores da honestidade e respeito.

Ao Dr. Carlos Novaes, um amigo, um irmão, um pai que me trouxe conforto

nos momentos mais dolorosos com seus sábios conselhos.

Aos pacientes do ambulatório de Hemoglobinopatias do HCPA que

consentiram na coleta das amostras, tornando possível este trabalho.

Ao Dr.João Ricardo Friedrisch e Drª Christina Bittar por intermediar o

acesso aos pacientes.

A Drª Meide Urnau que auxiliou no levantamento dos dados clínicos junto

aos prontuários dos pacientes.

Aos colegas de pós-graduação pelo incentivo.

Aos amigos que me apoiaram, em especial à Iara Nunes sempre com o seu

alto astral.

Á Rosângela, que muito mais que amiga é uma irmã, que está sempre por

perto nos momentos difíceis.

Aos colegas do Laboratório de Cultura e Análise Molecular de Células

Hematopoiéticas: Valéria, Daniela, Rafael, Silvana, Amanda, Jóice, Vanessa,

Elvira e Cláudio pelo auxílio diverso.

Ao Imunopovo do laboratório de Imunogenética, que me apoiaram,

incentivaram e com quem muito aprendi.

Á equipe do Serviço de Hematologia e Transplante de Medula Óssea do

HCPA pelo incentivo e colaboração.

A Neusa Laydner, pela ajuda e pela paciência com o meu estresse.

À Associação dos Amigos da Hematologia do HCPA, pelos recursos

financeiros obtidos para aquisição de reagentes.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. José Artur Bogo Chies, que não hesitou em

auxiliar na padronização das técnicas, nos contagiando com a sua paixão pelo que

faz. Com a sua porta sempre aberta para nos receber com carinho e atenção nos

momentos de incertezas.

À minha orientadora, Profª. Dra. Lúcia Mariano da Rocha Silla, pelo carinho,

pela oportunidade, pela confiança e por acreditar no meu trabalho.

É na experiência da vida

Que o homen evolui.

Harver Spencer Leinz

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ...............................................................................6

LISTA DE FIGURAS...........................................................................................8

LISTA DE TABELAS..........................................................................................9

INTRODUÇÃO .................................................................................................10

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..........................................................................12

1.1 HEMOGLOBINA........................................................................................ 12

1.2 ONTOGENIA DAS HEMOGLOBINAS .......................................................... 13

1.3 GENÉTICA MOLECULAR DA HEMOGLOBINA ............................................ 14

1.4 HEMOGLOBINA S E A ANEMIA FALCIFORME ........................................... 16

1.4.1 A HISTÓRIA DA ANEMIA FALCIFORME................................ ................... 18

1.4.2 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS DA ANEMIA FALCIFORME....... ................... 19

1.4.3 FISIOPATOLOGIA DA ANEMIA FALCIFORME .......................................... 20

1.4.4 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA ANEMIA FALCIFORME.......................... 24

1.5 HAPLÓTIPOS DO AGRUPAMENTO

(CLUSTER) DO GENE BETA GLOBINA....................................................... 26

1.6 A ANEMIA FALCIFORME E OS HAPLÓTIPOS ............................................. 34

1.7 DIAGNÓSTICO DA ANEMIA FALCIFORME.................................................. 39

1.8 TRATAMENTO ........................................................................................... 43

1.9 PERFIL ECONÔMICO................................................................................. 46

2 JUSTIFICATIVA...........................................................................................47

3 OBJETIVOS.................................................................................................48

REFERÊNCIAS................................................................................................49

ARTIGO EM INGLÊS........................................................................................55

ARTIGO EM PORTUGUÊS............................................................. ..................76

ANEXOS..........................................................................................................98

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Hemoglobina Normal ...........................................................................12

Figura 2 – Localização dos genes nos cromossomos e tipos de hemoglobina.........14

Figura 3 – Troca de Aminoácidos que altera a hemoglobina ..................................17

Figura 4 – Distribuição mundial da anemia falciforme............................................18

Figura 5 – Polímero de HbS .................................................................................22

Figura 6 – Vaso-oclusão ......................................................................................23

Figura 7 – Úlcera de membros inferiores ..............................................................25

Figura 8 – Haplótipos HbS ...................................................................................27

Figura 9 – Distribuição dos haplótipos na África e Ásia .........................................28

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Principais síndromes falcêmicas relacionadas com suas

características laboratoriais........................................................... 41

Tabela 2 – Alterações laboratoriais específicas na anemia falciforme............... 42

LISTA DE ABREVIATURAS

A – Adenina

AF – Anemia Falciforme

AVC – Acidente Vascular Cerebral

CAR – República da África Central

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

Hb – Hemoglobina

Hb A – Hemoglobina tipo A

Hb F – Hemoglobina Fetal

Hb S – Hemoglobina Falciforme

HCPA – Hospital de Clínicas de Porto Alegre

Hct – Hematócrito

HU - Hidroxiuréia

Kb – kilobase

MTD – Dose Máxima Tolerada

MSH – Estudo Multicêntrico da Hidroxiuréia

pb – pares de bases

PCR – Reação em cadeia da polimerase

T – Timina

TCTH – Transplante de Células Tronco Hematopoéticas

Th – Células T auxiliares

VCM – Volume Corpuscular Médio

INTRODUÇÃO

O termo anemia identifica o número reduzido de eritrócitos ou nível de

hemoglobina inferior ao normal. As causas que determinam esta condição podem

ser: destruição precoce dos eritrócitos, perdas de sangue ou a deficiência na

produção de eritrócitos. As desordens da hemoglobina que levam à deformidade

dos eritrócitos causam anemia através da sua destruição precoce.

Estima-se que aproximadamente 7% da população mundial seja portadora

de desordens na hemoglobina, e que 300.000 a 400.000 bebês nascem a cada

ano com formas graves dessas desordens. Embora essas condições ocorram com

maior freqüência em regiões tropicais, a migração de populações tem assegurado

que elas sejam hoje encontradas em muitos países. Algumas dessas desordens

hemoglobínicas hereditárias, se não tratadas, resultam em morte nos primeiros

anos de vida (WEATHERALL & CLEGG, 2001).

A anemia falciforme (AF) é uma doença hereditária cuja principal

característica é a deformidade que causa nos eritrócitos, os quais mudam da

forma normal arredondada para a forma de foice, quando em baixa tensão de

oxigênio, origem do nome falciforme. O defeito genético constitui-se basicamente

da substituição do aminoácido Ácido Glutâmico por uma Valina na posição 6 da

cadeia beta da hemoglobina. Essa é uma das alterações genéticas mais comuns

em todo o mundo, afetando indivíduos Afro-descendentes e populações

mediterrâneas (DUTRA, 2002).

As hemoglobinopatias constituem uma das principais e mais freqüentes

doenças genéticas que acometem seres humanos e, dentre elas, a AF é a forma

mais freqüente no Brasil. Apesar de sua prevalência ser maior em pessoas da

raça negra, estudos populacionais têm demonstrado a crescente presença de

Hemoglobina S (Hb S) em indivíduos caucasóides. Na infância, a AF tem sido

associada com alta morbidade e mortalidade devido a crises de infarto ósseo,

sepse bacteriana, seqüestração esplênica e síndrome torácica aguda, além de

efeitos deletérios no desenvolvimento fisiológico e intelectual do indivíduo (SILLA,

1999).

Sabe-se que na AF ocorre uma variabilidade na gravidade do quadro

clínico, que pode ser determinada por alguns fatores como o nível de hemoglobina

fetal, a co-herança com outras hemoglobinas anormais e a presença de

determinados haplótipos herdados de acordo com a origem étnica do paciente.

Apesar dos grandes avanços no entendimento da patologia molecular,

patofisiologia, controle e manejo das desordens hereditárias das hemoglobinas,

milhares de crianças com estas doenças morrem por falta de cuidados médicos

apropriados (WEATHERALL & CLEGG, 2001).

A identificação precoce da doença, bem como de seus determinantes de

gravidade clínica, pode contribuir para que o indivíduo com maior risco seja

acompanhado com mais presteza e vigor. Este trabalho visa verificar se os

haplótipos Hb S são indicadores de gravidade clinica em nosso meio.

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 A HEMOGLOBINA

A hemoglobina é a principal proteína dos eritrócitos, sendo responsável pelo

transporte de oxigênio dos pulmões para os tecidos (OSÓRIO & ROBINSON, 1993). É uma

proteína de estrutura globular e quaternária composta por quatro cadeias polipeptídicas, ou

cadeias de globina, e um grupo prostético heme (um pigmento contendo ferro que se

combina com o oxigênio e confere à molécula sua capacidade de transportar oxigênio)

ligado a cada uma das cadeias de globina. Duas globinas alfa (alfa²) e duas beta (beta²)

compõem a hemoglobina A (Figura 1) e, de forma semelhante, combinações entre as

diferentes globinas determinam os seis tipos de hemoglobinas humanas produzidas nas

fases do desenvolvimento caracterizadas como embrionária, fetal e pós-nascimento

(NAOUM, 1997; THOMPSON & THOMPSON, 1991; PITOMBEIRA & NETO, 2003).

Figura 1 – Hemoglobina Normal

Fonte: Adaptado de: fig.cox.miami.edu/.../ chemistry/hemoglobin.jpg

Cadeia polipeptídica

Cadeia β

Cadeia α

Hemoglobina

Heme

1.2 ONTOGENIA DAS HEMOGLOBINAS

Durante o desenvolvimento intra-uterino, o oxigênio transportado pela

hemoglobina é fornecido pelo sangue materno através da placenta. Com o

nascimento, ocorrem grandes modificações respiratórias e o oxigênio passa a ser

captado nos pulmões diretamente do ar atmosférico. Dadas essas condições

respiratórias tão diferentes, explica-se a existência de tipos diferentes de

hemoglobinas, adequados aos períodos intra e extra-uterinos de vida (Figura 2)

(OSÓRIO & ROBINSON, 1993).

No início do desenvolvimento embrionário existem três hemoglobinas

resultantes da expressão dos genes embrionários de hemoglobina. Essas

hemoglobinas (Gower-1, Gower-2 e Portland) deixam de ser produzidas no início

do desenvolvimento fetal, e sua síntese não é mais reativada. A hemoglobina fetal

(Hb F), predomina durante a fase fetal, acompanhada de pequena quantidade de

hemoglobina do adulto (Hb A). Esta situação se inverte quando, próximo ao

nascimento, a síntese de Hb A é intensamente ativada, e a produção de Hb F vai

sendo progressivamente desativada. No momento do nascimento, a síntese de Hb

F ainda constitui cerca de 60% do total, mas a substituição continua e está quase

completa entre o terceiro e o sexto mês de vida. Em adultos normais, há

resquícios da produção de Hb F, correspondendo a menos de 1% do total de

hemoglobina (ZAGO et al, 2001a).

Figura 2 – Localização dos genes nos cromossomos e tipos de hemoglobina.

Fonte: Adaptado de: imiloa.wcc.havaii.edu/.../present/icture17/img022.jpg

1.3 GENÉTICA MOLECULAR DA HEMOGLOBINA

Existem pelo menos oito loci bem conhecidos comandando a síntese das

globinas: alfa 1(α

), alfa 2(α

), beta(β), delta(δ), gama A(γ

), gama G(γ

épsilon(ε) e zeta(ζ) (Figura 2). Cada locus é responsável pela estrutura de um tipo

de cadeia polipeptídica. Um outro locus foi detectado, o do gene teta (θ), que seria

ativo no saco vitelino e no fígado fetal, mas seu produto ainda não foi identificado.

Os genes das globinas α e β fazem parte de famílias multigênicas, que são

agrupamentos de muitos genes, alguns deles não transcritos (OSÓRIO &

ROBINSON, 1993).

A síntese das globinas do grupo alfa inclui as globinas zeta e alfa, e é

obtida por um grupo de genes localizados no braço curto do cromossomo 16, na

região 16p13.3. Esse grupo de genes é constituído por dois genes alfa estruturais,

Adulto

Feto

Embrião

Nome

Fórmula

Hemo

lobina

Polipeptídicas

Subunidades

Produzidos no:

Cromossomo

Adulto

Embrião

Feto

Gene

separados um do outro por 3Kb, e denominados α¹ e α², que permanecem sendo

expressos durante toda a vida do indivíduo. Outros genes pertencentes a esse

complexo gênico são os genes zeta (ζ²) de expressão somente na fase

embrionária, três pseudogenes (Ψζ², Ψα², Ψα¹) e um gene com função ainda

não bem definida, o gene teta(θ) (Figura 2) (NAOUM, 1997).

Esse agrupamento de genes do grupo alfa engloba uma extensão de

aproximadamente 30Kb. O locus do gene zeta é o primeiro a funcionar durante as

primeiras cinco semanas da fase embrionária, e a primeira hemoglobina

sintetizada é a Hemoglobina Gower-1(ζ² ε²), seguida da hemoglobina Portland(ζ²

γ²). A partir da sexta semana de vida intra-uterina, a produção de globina zeta

decresce; ao mesmo tempo que são ativados os genes α¹ e α², que passam a

atuar durante o período fetal, e por toda a vida após o nascimento (ZAGO et al,

2001a).

A síntese das globinas tipo beta é mais heterogênea e abrangente do que a

do tipo alfa, pois envolve a produção das globinas beta, delta, gama e épsilon.

Esse grupo de genes está localizado no braço curto do cromossomo 11, em uma

região com mais de 60Kb, e é constituído por cinco genes estruturais (Figura 2)

(ZAGO et al, 2001a).

O gene ε é expresso na fase embrionária, enquanto os genes γ

(gama-

alanina) e γ

(gama-glicina) são característicos do período fetal. Os genes δ e β

são atuantes a partir do período fetal e se expressam por toda a vida após o

nascimento. Pelo fato da espécie humana ser diplóide, podemos representar a

presença normal dos diferentes genes para um indivíduo da seguinte forma: β/β,

γ/γ, δ/δ e α

/α

(NAOUM,1997; PITOMBEIRA & NETO, 2003).

Anormalidades genéticas podem dar origem a variantes estruturais de

hemoglobina, e podem impedir a produção de uma cadeia polipeptídica, ou ambas.

A grande maioria das anormalidades estruturais resulta de substituições isoladas

de aminoácidos como conseqüência de substituições de nucleotídeos únicos.

Variantes estruturais raras se originam da deleção de um nucleotídeo, o que

resulta em um desvio da fase de leitura no sentido descendente, com conseqüente

alteração da seqüência de aminoácidos ou, por outro lado, extensão da cadeia

polipeptídica porque o códon da terminação está alterado. Dependendo do tipo e

do local onde ocorre uma substituição de aminoácido em uma cadeia de globina,

esta poderá ou não alterar o comportamento da molécula de hemoglobina. Se a

anormalidade estrutural produz manifestações clínicas, o paciente apresenta uma

hemoglobinopatia. Mutações que alteram quantitativamente a síntese de uma das

cadeias da globina originam as síndromes talassêmicas (RAPAPPORT, 1990).

Há quase 600 variantes de hemoglobina já descritas, porém poucas estão

associadas a manifestações clínicas e alterações hematológicas. O melhor

exemplo é a hemoglobina S (OSÓRIO & ROBINSON, 1993).

1.4 HEMOGLOBINA S E A ANEMIA FALCIFORME

A AF envolve uma herança autossômica recessiva, caracterizada pela

presença da hemoglobina variante Hb S do gene da β-globina (INATI et al, 2003;

ASHLEY et al, 2000).

A hemoglobina falciforme Hb S é causada pela substituição de uma

adenina (A) por uma timina (T), no sexto códon do gene da β-globina

(GAG→GTG), ocasionando a substituição do ácido glutâmico normal pela valina

na posição do sexto aminoácido da cadeia β-globina (Figura 3) (GONÇALVES et

al, 2003; MAGAÑA et al 2002; INATI et al, 2003; ASHLEY et al, 2000).

A Hb S (α

) polimeriza quando em baixa tensão de oxigênio (INATI et al,

2003; ASHLEY et al, 2000). Quando quantidades críticas de polímeros de Hb S

acumulam-se dentro dos eritrócitos falcizados, ocorre lesão celular (STEINBERG

& RODGERS, 2001).

Figura 3 – Troca de aminoácidos que altera a Hemoglobina

Fonte: Adaptado de: www.emedicine.com/.../24681132med2126-05.jpg

A AF, com ampla distribuição mundial (Figura 4), é causada pela

homozigose do alelo β

(SS), e a Hb S é a principal hemoglobina presente nos

eritrócitos anormais (GONÇALVES et al, 2003).

Indivíduos afetados que possuem uma cópia da hemoglobina variante Hb S

e uma cópia de outra variante do gene β-globina, como por exemplo, Hb C, são

heterozigotos compostos. Indivíduos portadores (traço falciforme) têm uma cópia

da Hb S e uma cópia do alelo normal (Hb AS). Indivíduos com o traço falciforme

parecem estar protegidos de infecção por malária (ASHLEY et al, 2000). O

mecanismo deste efeito protetor ainda está em debate, embora possíveis fatores

incluem: (a) uma falcização seletiva do eritrócito parasitado, resultando em sua

efetiva remoção pelo sistema reticulo-endotelial; (b) inibição do crescimento do

parasita devido à perda de potássio e baixo pH dos eritrócitos falcizados e (c)

aumento da aderência endotelial dos eritrócitos parasitados (SERJEANT, 2001).

Acredita-se que a alta freqüência da variante Hb S em determinadas populações

seja o resultado deste efeito protetor (ASHLEY et al, 2000; AIDOO et al, 2002).

Seqüência

de DNA

Seqüência

de aminoácidos

adas

Seqüência

de aminoácidos

Seqüência

de DNA

Mutante

Normal

A ocorrência da mutação da AF e a vantagem de sobrevivência conferida ao

indivíduo heterozigoto, determinam a distribuição primária do alelo falciforme na

África equatorial (SERJEANT, 2001).

Desordens hereditárias da estrutura da hemoglobina, atualmente não tem

cura em pacientes adultos. Transplante de medula óssea em crianças tem

mostrado ser uma possibilidade de cura para pacientes com AF (BALLAS, 2001).

Figura 4 – Distribuição Mundial da Anemia Falciforme

Fonte: Adaptado de: www.unc.edu/~/Viscrst/mystery/map.gif

1.4.1 A História da Anemia Falciforme

Esta doença surgiu nos países do centro-oeste africano, na India e no leste

da Ásia, de 50 a 100 mil anos, entre os períodos paleolítico e mesolítico

(PITOMBEIRA & NETO, 2003).

As primeiras observações científicas da doença das células falciformes

datam de aproximadamente um século. Herrick em 1910 observou a forma

anormal dos eritrócitos do sangue periférico de um estudante negro procedente da

Jamaica portador de um grave quadro anêmico acompanhado de icterícia,

América do

Norte

América

do Sul

Euro

Distribuição Geográfica da HbS no Mundo

complicações pulmonares e úlceras de membros inferiores (STUART & NIGEL,

2004).

O termo doença falciforme foi empregado pela primeira vez em 1922, por

Mason. Em 1927, Hahn e Gillespie demonstraram a dependência do fenômeno da

falcização com a tensão de oxigênio, atribuindo o defeito à hemoglobina, e não

somente ao eritrócito. Em 1935, Diggs e Bill notaram que algumas dessas células

se mantinham na forma falcizada, mesmo após a reoxigenação. Ham e Castle, um

ano depois, propuseram um papel para o eritrócito falcizado na fisiopatologia da

AF. Em 1949, Pauling e seus colaboradores demostraram a diferença entre o

eritrócito falcizado e o normal por meio da mobilidade eletroforética e atribuíram

esse fenômeno à mudança de carga da globina. Em 1956, Ingram, utilizando a

técnica de “fingerprint” (eletroforese bidimensional, associada à cromatografia),

demonstrou que a anormalidade química da Hb S era devida à substituição do

ácido glutâmico pela valina, na posição 6 da cadeia beta, produzindo a perda de

duas cargas negativas por molécula da hemoglobina (NAOUM, 1997).

1.4.2 Dados Epidemiológicos da Anemia Falciforme

Segundo a Organização Mundial da Saúde, aproximadamente 5% da

população mundial é portadora de genes de distúrbios da hemoglobina com algum

grau de repercussão clínica e, 50% destes tem o traço falciforme. Cerca de

370.000 homozigotos gravemente afetados ou heterozigotos compostos nascem a

cada ano (MAGAÑA et al, 2002).

Nos Estados Unidos e Jamaica, o pico de incidência de morte em crianças

afetadas parece ser entre 1-3 anos de idade, geralmente devido a infecções.

Dados dos Estados Unidos sugerem que, em adultos afetados, a média de idade

de morte é 42 anos para homens e 48 anos para mulheres (WEATHERALL &

CLEGG, 2001).

A AF afeta milhões de pessoas no mundo todo (Figura 4), e ocorre em 1 a

cada 500 nascimentos de afro-americanos e, em 1 a cada 1.000-4.000

nascimentos de hispano-americanos (GONÇALVES et al, 2003). Mais de 50.000

americanos são afetados pela doença, tornando-a uma das desordens genéticas

mais prevalentes nos Estados Unidos (ASHLEY et al, 2000).

No Brasil estima-se que existam cerca de quatro milhões de pessoas

portadoras do traço falciforme, ou hemoglobina S heterozigota, e perto de 30.000

com a forma grave, incluindo AF (SS), doença Hb SC, e interação entre Hb S e

talassemia beta (NAOUM, 1997). Estima-se ainda, que 5,0-6,0% da população é

portadora do gene da hemoglobina S, e ocorram 700 a 1000 novos cases de AF

por ano (LYRA et al, 2005). Entre afro-descendentes brasileiros, o traço falciforme

é encontrado em freqüências que variam de 6,9 a 15% (GONÇALVES et al, 2003).

O maior estudo de prevalência e distribuição de hemoglobinopatias

realizado no Brasil, analisou uma amostra de 55.217 indivíduos, em 40 cidades,

com idades entre um mês e 90 anos, provenientes de centros de saúde, escolas e

bancos de sangue. Neste estudo, 3,08% tinham hemoglobinas anormais. A

condição Hb AS foi a mais prevalente entre os indivíduos portadores destas

hemoglobinas anormais, com 60,95% e a freqüência de Hb SS na população total

foi de 0,04% (NAOUM et al, 1987).

Daudt et. al 2002 determinaram a freqüência das hemoglobinopatias entre 1615

recém-nascidos do HCPA, provenientes da cidade de Porto Alegre e região metropolitana,

submetidos à Triagem Neonatal para Distúrbios Metabólicos. A freqüência de bebês recém

nascidos portadores do alelo da AF foi estimada em 1,2% (DAUDT et al, 2002).

1.4.3 Fisiopatologia da Anemia Falciforme

A troca do ácido gutâmico pela valina que caracteriza a Hb S, cria uma instabilidade

que leva à polimerização da hemoglobina sob baixa tensão de oxigênio. Esse é o evento

primário indispensável na patogênese molecular da AF e depende da concentração intra-

eritrocitária das Hb S e Hb F, do grau de desoxigenação e do pH. A presença de

concentrações elevadas de Hb F diminui a polimerização intracelular da Hb S

(STUART & NIGEL, 2004; BUNN, 1997).

O polímero de Hb S (Figura 5) é uma fibra que se alinha com outras para

formar um feixe, alterando o eritrócito para uma forma clássica de foice. O

restabelecimento das condições físico-químicas adequadas devolve a solubilidade

da hemoglobina. Células irreversivelmente falcizadas são células densas que não

retornam à forma normal mesmo quando reoxigenadas, devido a dano irreversível

sobre a membrana (STUART & NIGEL, 2004).

Essas células que permanecem irreversivelmente falcizadas após episódios

repetidos de hipóxia e re-oxigenação são destruídas prematuramente, o que

caracteriza a AF como uma anemia hemolítica: aumento de bilirrubina indireta e

de reticulócitos em crises hemolíticas. Podem ocorrer crises aplásticas, por

exaustão da medula óssea, durante as quais há um agravamento da anemia,

diminuindo a quantidade de reticulócitos no sangue periférico (OSÓRIO e

ROBINSON, 1993).

A forma falcizada é originalmente a causa da obstrução da microcirculação,

resultando em crise vaso-oclusiva (STUART & NIGEL, 2004). A vaso-oclusão de

pequenos e algumas vezes de grandes vasos é a principal marca da AF,

contribuindo muito para sua morbidade e mortalidade (Figura 6) (ROSSE et al,

2000).

Além da presença de células rígidas e deformadas levando à obstrução

mecânica da micro-vasculatura, o eritrócito que contém Hb S expressa um

conjunto de moléculas que favorece a sua adesão ao endotélio vascular. A adesão

leucócito-endotelial com formação de agregados hetero-celulares (leucócitos e

células falcizadas), também contribui para a obstrução, resultando em hipóxia

local, aumento na formação de polímeros de Hb S e propagação da oclusão à

vasculatura adjacente (STUART & NIGEL, 2004).

Figura 5 – Polímero de HbS

Fonte: www.cmmr.uah.edu/protein/summary.html

A vaso-oclusão e a isquemia tecidual na AF envolvem não somente a

polimerização da Hb S, mas também interações entre os eritrócitos, endotélio,

plaquetas, leucócitos e fatores do plasma. A polimerização da Hb S é o mais

importante fator no ciclo da falcização e um aumento nos níveis de Hb fetal

diminui a polimerização intracelular da Hb S (VICHINSKI, 2002).

Os fenômenos vaso-oclusivos acontecem principalmente em órgãos com

circulação sinuosa, onde o fluxo de sangue é lento e a tensão de oxigênio e o pH

são baixos. A hipóxia decorrente da oclusão vascular gera infartos teciduais e

orgânicos e proporciona, principalmente, sintomatologia de dor ou danos teciduais

crônicos irreversíveis em alguns órgãos (NAOUM, 1997).

Figura 6 – Vaso-Oclusão

Fonte: www.emedicine.com/.../24681132med2126-05.jpg

A homeostase anormal de cátions também está envolvida no evento

patogênico (STUART & NAGEL, 2004). Os mais importantes contribuintes para a

desidratação das células falciforme são o co-transporte dos íons potássio-cloreto

e o efluxo de K+ ativado pelo Ca++ (Canal de Gardos) (BUNN, 1997).

As deformações celulares que alteram as trocas iônicas e afetam a

permeabilidade celular, têm como conseqüência lesões na membrana, o que

também contribui para encurtar a vida das células. Os eritrócitos falcizados são

rapidamente retirados da circulação, principalmente por macrófagos do sistema

monocítico-macrofágico com conseqüente hemólise precoce (NAOUM, 1997).

Fatores como mediadores inflamatórios que ativam as células endoteliais e,

portanto, acentuam a adesão das células, também desencadeiam episódios vaso-

oclusivos (ROSSE et al, 2000).

Moléculas pró-inflamatórias induzem a ativação do canal de Gardos, o qual

pode explicar a associação entre inflamação, vaso-oclusão, e hemólise

aumentada, algumas vezes vista durante quadros infecciosos (STUART & NIGEL,

Célula

Falcizada

Vasos

sangüíneos

Normal

2004). Durante estresse inflamatório, a adesão das células falciformes ao

endotélio pode aumentar como resultado do aumento de proteínas do plasma, bem

como devido ao aumento da expressão de moléculas de adesão do tipo integrinas

(BUNN, 1997).

A transmigração de neutrófilos pelas junções endoteliais também aumenta a

inflamação na microvasculatura. Recente atenção tem sido dada a desregulação

do tônus vasomotor pela perturbação em mediadores vasodilatadores como o

óxido nítrico (STUART & NIGEL, 2004).

Segundo Chies & Nardi, 2001 a AF deve ser considerada uma doença

inflamatória crônica, onde a gravidade das manifestações clinicas seriam

determinadas por um estado pró-inflamatório amplificado, contribuindo para os

episódios vaso-oclusivos, desempenhando assim, um importante papel na

patofisiologia da doença.

1.4.4 Manifestações Clínicas da Anemia Falciforme

Apesar de todos os indivíduos com AF terem a mesma mutação no DNA, a

severidade das manifestações clínicas e hematológicas é extremamente variável,

podendo ir de uma doença grave a uma condição quase assintomática detectada

apenas acidentalmente. Suas características hematológicas, bem como gravidade

clínica são influenciadas por variações nos níveis de hemoglobina fetal, presença

simultânea de alfa talassemia, deficiência na glucose-6-fosfato desidrogenase e

os haplótipos ligados ao grupamento do gene da β-globina (INATI et al, 2003;

MORENO et al, 2002). Sintomas clínicos mais leves têm sido descritos em

pacientes que apresentam α-2 talassemia e altos níveis de hemoglobina fetal (Hb

F), ligados à presença de haplótipos específicos (GONÇALVES et al, 2003).

A morbidade na AF surge de eventos vaso-oclusivos ou danos teciduais

resultantes da obstrução do fluxo sangüíneo. A oclusão, principalmente em

pequenos vasos, determina a grande maioria dos sinais e sintomas presentes no

quadro clínico dos pacientes com AF, tais como: crises álgicas, crises hemolíticas,

úlceras de membros inferiores (Figura 7), síndrome torácica aguda, seqüestro

esplênico, priapismo, necrose asséptica de fêmur, retinopatia, insuficiência renal

crônica, auto-esplenectomia, AVC, entre outros (ASHLEY et al, 2000;

PITOMBEIRA & NETO, 2003; STEINBERG, 2005).

Figura 7 - Úlcera de membros inferiores

Fonte: www.meddcan.uc.edu/.../phyabn/imag12.jpg

A co-herança da α-talassemia entre indivíduos com AF parece ter um efeito

protetor contra algumas complicações, tais como a síndrome torácica aguda,

anemia e isquemia. Entretanto, aumenta a suscetiblidade para outras

complicações como as crises álgicas (ASHLEY et al, 2000).

As manifestações clínicas em pacientes árabes são geralmente mais leves

que as manifestações clínicas em africanos, em parte devido à freqüente co-

herança de elevados níveis de Hb F, que inibe a polimerização da Hb S (INATI et

al, 2003).

Ambos aspectos clínico e laboratorial da AF são influenciados pela

concentração dos níveis de Hb F. Pacientes com níveis mais altos de Hb F

apresentam menos episódios álgicos e maior sobrevida (STEINBERG et al, 1997;

WARE et al, 2002).

Crianças com AF são particularmente mais suscetíveis a complicações

sérias tais como AVC, síndrome torácica aguda, anemia aplástica severa, crises

de seqüestro esplênico, infecção e falência múltipla dos órgãos (JENKINS, 2002).

Asplenia funcional em pacientes jovens, autoesplectomia em adultos e defeito na

opsonização, são os maiores fatores reconhecidos de predisposição a infecções

bacterianas em pacientes com AF (RAGHUPATHY et al, 2000).

Pessoas com AF apresentam retardo na puberdade em ambos os sexos, e

mulheres apresentam problemas reprodutivos (SALZANO & BORTOLINI, 2002).

1.5 HAPLÓTIPOS DO AGRUPAMENTO (CLUSTER) DO GENE BETA GLOBINA

É do conhecimento geral que indivíduos são geneticamente diferentes, e

que algumas das diferenças entre as pessoas representam alterações genéticas

patológicas. O locus β está localizado no cromossomo 11, em uma região que tem

sofrido uma série de transformações através do tempo. Usando uma série de

enzimas de restrição, que identifica alterações específicas do DNA, é possível

verificar a constituição das regiões adjacentes ao locus beta. Uma determinada

ordem de marcadores herdada em bloco, observada em um cromossomo particular

é denominada haplótipo. Haplótipos específicos são encontrados no cromossomo

portador do alelo β

(Figura 8) (SALZANO & BORTOLINI, 2002).

Figura 8 – Haplótipos HbS

Fonte: Naoum, 1997

Os haplótipos tem sido úteis marcadores para estudos antropológicos e

para a definição do fluxo do alelo β

em populações humanas. Em cada uma das

quatro regiões da África e uma da Ásia onde o alelo β

é altamente prevalente, o

alelo anormal está associado com um haplótipo diferente do agrupamento do gene

beta. Isso significaria que a mutação falciforme ocorreu pelo menos cinco vezes

durante a evolução humana (MAGAÑA et al, 2002; INATI et al, 2003). Essa

interpretação tem sido proposta, em contradição a uma explicação alternativa de

que a mutação da Hb S ocorreu uma vez na África e provavelmente uma vez na

Índia. Após sua extensão inicial na África, o alelo anormal fixou-se em diferentes

haplótipos pela conversão gênica sofrida pela seleção local da malária. Isto

explicaria a predominância de haplótipos distintos em diferentes regiões. Exceto

para a Índia e Arábia, a presença do alelo falciforme fora da África é conseqüência

da migração voluntária ou forçada (ZAGO et al, 1999).

Os haplótipos β

representam potencialmente diferentes origens étnicas e

geográficas; o haplótipo Benin (Ben) originado na costa oeste Africana, alcança o

norte da África (Argélia e Tunísia), oeste da Arábia e sul da Europa (Portugal,

Sicília e Grécia). O haplótipo Bantu foi originalmente identificado na República da

África Central (por essa razão, é algumas vezes conhecido como haplótipo CAR) e

após, em várias populações de dialeto Bantu, em regiões geográficas separadas

do sul da África. O haplótipo Senegal (Sen) originado no oeste da África Atlântica,

o Camarão (Cam) ao longo da costa oeste da África e o haplótipo Árabe-indiano

ocorre no sub-continente Indiano e a leste da península Arábe, sendo também

chamado haplótipo Indo-Árabe (Figura 9) (ZAGO et al, 1999; GONÇALVES et al,

2003; MAGAÑA et al, 2002; INATI et al, 2003).

Figura 9 - Distribuição dos haplótipos na África e Ásia

Fonte: Adaptado de: www.starmfront.org/.../african_haplotype.gif

Continente Africano

Do século XVI ao XIX, aproximadamente 10 milhões de escravos Africanos

foram trazidos da África para as Américas; deste total, aproximadamente 400.000

foram para os Estados Unidos e 3 milhões para o Brasil. Nos Estados Unidos e

Jamaica o haplótipo Benin é mais freqüente, seguido pelo CAR e Senegal em

proporções equivalentes, devido a um tráfico escravo originado principalmente na

costa oeste da África Central, nas regiões chamadas Costa Dourada, Golfo de

Benin e Golfo de Biafra, correspondendo a uma região que hoje se estende de

Gana ao Cabo Lopez no Gabão (ZAGO et al, 1999).

A doença vista nas Américas do Norte e Sul, no Caribe e no Reino Unido é

predominantemente de origem africana e a maior parte dos afetados é do

haplótipo Benin, embora o CAR seja mais freqüente no Brasil (ZAGO et al,1992).

Além disso, o alelo causador da AF também esta espalhado em volta do

Mediterrâneo, ocorrendo na Sicília, sudeste da Itália, norte da Grécia e costa sul

da Turquia, embora todos esses sejam do haplótipo Bantu (SERJEANT, 2001).

O haplótipo Camarão foi identificado em Guadalupe, Venezuela e Suriname,

com uma baixa freqüência (3%). Neste ponto está uma marcada diferença nas

freqüências relativas dos haplótipos CAR e Benin, se nós compararmos a América

Central, Venezuela e Suriname com o Brasil. Enquanto no grupo anterior de

nações, o haplótipo Benin é o mais freqüente, o contrário é verificado no Brasil,

onde o CAR é o mais prevalente. O haplótipo Senegal mostra uma distribuição um

pouco irregular na América Latina, com alta prevalência em Cuba, Guadalupe,

Venezuela e Nordeste do Brasil (SALZANO e BORTOLINI, 2002). Ainda em

relação ao haplótipo Camarão, este pode ser encontrado em 50% dos países

americanos. Na África sua distribuição está restrita à região Centro-Oeste, mais

especificamente ao grupo étnico Ethom de Camarão (BORTOLINI & SALZANO,

1999).

O Brasil, um grande país continental, tem uma interessante distribuição de

hemoglobinopatias, resultado do influxo de muitos grupos imigrantes diferentes e

do comércio escravo dos séculos XVIII e XIX (FIGUEIREDO et al, 1996). A

população brasileira tem origem étnica heterogênea e está desigualmente

distribuída neste país de dimensões continentais. Até o fim da 2ª Guerra Mundial o

Brasil recebeu quase cinco milhões de imigrantes europeus, que se fixaram

principalmente no Sul e Sudeste. Todos estes grupos raciais foram gradualmente

se miscigenando, embora as diferenças regionais sejam ainda notórias. Essa

característica da população brasileira tem conseqüências importantes para as

doenças hereditárias que estão associadas com etnia: suas freqüências são

diferentes em várias regiões do país, refletindo uma variedade de origens étnicas

com variável grau de miscigenação (ZAGO et al, 1999).

Segundo Salzano & Bortolini 2002, para o novo mundo, a mutação Hb S foi

introduzida na América principalmente pelo fluxo gênico dos Africanos, durante a

época da escravatura, e a caracterização dos haplótipos pode fornecer uma

indicação do local de origem desta migração forçada.

O primeiro estudo para determinação de haplótipos entre pacientes com AF

no Brasil foi realizado por Zago et al em 1992, e demonstrou que as freqüências

dos tipos mais comuns de haplótipos β

entre pacientes da raça negra, eram

diferentes daquelas observadas nos Estados Unidos, onde o haplótipo Benin é o

mais prevalente. Esta diversidade biológica seria a conseqüência de diferentes

padrões do comércio escravo para as Américas do Norte e do Sul. Neste estudo,

foram incluídos 37 pacientes homozigotos para a AF, regularmente acompanhados

em um hospital universitário do estado de São Paulo. Dos 74 cromossomos

estudados 66.2% eram do tipo CAR, 23% do tipo Benin e foi encontrado apenas

um cromossomo do tipo Senegal. Haplótipos atípicos foram encontrados em 9,5%

dos cromossomos estudados. As combinações genotípicas mais comuns

encontradas foram CAR/CAR (19 pacientes) e CAR/Benin (9 pacientes) (ZAGO et

al, 1992).

Em 1994, Costa et al compararam as freqüências dos haplótipos β

entre

73 pacientes com AF dos Estados de São Paulo e da Bahia. As amostras de São

Paulo apresentaram 61% de cromossomos do tipo CAR, 38% do tipo Benin e

apenas um haplótipo atípico. Entre as amostras da Bahia, 49% eram do tipo CAR

e 51% eram do tipo Benin. Este estudo demonstrou dois padrões distintos de

distribuição de haplótipos para os dois grupos de pacientes, que também diferem

das freqüências observadas nos Estados Unidos, Jamaica e África (COSTA et al,

1994). Nesse mesmo ano, também em São Paulo, Gonçalves et al determinaram

os haplótipos em 74 pacientes homozigotos para AF. Dos 148 cromossomos

estudados, 62,2% eram do tipo CAR, enquanto 33,8% eram do tipo Benin. Os

haplótipos atípicos foram encontrados com uma freqüência de 4% (GONÇALVES

et al, 1994).

Para comparar as características da AF no Brasil com outras localidades,

Figueiredo et al estudaram em 1996, os efeitos dos haplótipos

e da α-

talassemia sobre as características clínicas e hematológicas em 85 pacientes

homozigotos para AF do Hospital Universitário do Estado de Campinas

(UNICAMP) e do Hospital Universitário da Escola Paulista de Medicina. Dos 85

pacientes analisados, 50 eram do sexo feminino e 35 do sexo masculino. Suas

idades variaram entre 4 e 49 anos. As freqüências dos haplótipos encontradas

neste estudo foram: 36,5% CAR/CAR, 44,7% CAR/Benin, 11,7% Benin/Benin,

5,8% CAR/Atípico e 1,2% Benin/Atípico. Dos 170 cromossomos analisados

61,76% eram do tipo CAR, 34,71% do tipo Benin e 3,53% Atípicos (FIGUEIREDO

et al, 1996).

Os estudos citados acima parecem demonstrar a prevalência do haplótipo

CAR entre os pacientes com AF do estado de São Paulo.

Em 1996, Wagner et al estabeleceram a freqüência dos haplótipos β

em 27

pacientes (54 cromossomos) com anemia falciforme do Hospital de Clínicas de

Porto Alegre, Rio Grande do Sul, e encontraram 72% de cromossomos do tipo

Bantu, 17% do tipo Benin, 2% do tipo Senegal e aproximadamente 5% de

cromossomos Atípicos (WAGNER et al, 1996).

Pante-de-Sousa et al investigou em 1998 30 pacientes com AF do Centro de

Hematologia e Hemoterapia do Estado do Pará. A combinação de haplótipos

encontrada foi: 43% CAR/CAR, 47% CAR/Benin, 7% Benin/Benin e 3%

Senegal/Senegal. Essas freqüências não diferiram significativamente daquelas

observadas no Estado de São Paulo (PANTE-DE-SOUSA et al, 1998). Em 1999,

os mesmos autores analisaram os haplótipos do gene da beta globina em

indivíduos afro-descendentes de três comunidades da região Amazônica. Entre os

20 cromossomos β

estudados na amostra total, 60% tinham o haplótipo do tipo

CAR, 10% do tipo Benin e 30% do tipo Senegal. Este estudo evidenciou uma

maior freqüência do haplótipo Senegal e menor freqüência do haplótipo Benin

entre afro-descentes da região Amazônica comparada a outras regiões do Brasil

(PANTE-DE-SOUSA et al, 1999).

No Rio de Janeiro em 2001, Fleury estudou 74 pacientes com AF

acompanhados no Instituto de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti –

HEMORIO, de ambos os sexos, com idades variando entre 2 e 51 anos,

encontrando 63,6% CAR/Benin, 21,6% CAR/CAR, 12,2% Benin/Benin, 1,3%

CAR/Senegal e 1,3% Benin/Senegal. Dos 148 cromossomos analisados 54% eram

do tipo CAR, 44,6% do tipo Benin e 1,4% do tipo Senegal. A predominância do

haplótipo CAR parece estar de acordo com os outros estudos realizados no Brasil

(FLEURY, 2001).

Gonçalves et al., 2003, analisaram 80 pacientes AF recrutados na Fundação

Hemocentro da Bahia – HEMOBA e no Hospital Universitário Professor Edgar

Santos em Salvador, Bahia. A idade dos pacientes variou entre 1,6 e 51,5 anos,

sendo 40 do sexo masculino e 40 do sexo feminino. Neste estudo, as freqüências

dos haplótipos encontradas foram 21,24% CAR/CAR, 21,25% Benin/Benin, 46,25%

CAR/Benin, 7,5% CAR/Atípico, 1,25% Benin/Atípico, 1,25% Benin/Senegal e

1,25% Atípico/Atípico. Interessantemente, neste estudo os genótipos homozigotos

CAR e Benin foram encontrados em freqüências similares (GONÇALVES et al,

2003).

Recentemente, em 2005, Lyra et al estudaram 71 pacientes pediátricos,

sendo 31 de São Paulo e 40 de Salvador. A idade desses pacientes variou entre 3

e 18. Entre os pacientes de São Paulo, 15 pacientes do sexo masculino e 16 do

sexo feminino e, entre os pacientes de Salvador, 15 eram do sexo masculino e 25

do sexo feminino. Dos 126 cromossomos estudados nas duas cidades, a

distribuição dos haplótipos foi: Benin/CAR (54% Salvador x 40% São Paulo),

CAR/CAR (32% São Paulo x 20% Salvador) e os haplótipos atípicos foram mais

freqüentes em São Paulo (18% São Paulo x 6% Salvador). Neste estudo, o

cromossomo Benin predominou em Salvador e o CAR teve maior freqüência em

São Paulo (LYRA et al, 2005).

Estes dados revelam uma heterogeneidade dentro do país, com uma

proporção similar de haplótipos CAR e Benin na Bahia quando comparadas ao

Sudeste, e o haplótipo CAR é predominante em todas as outras regiões.

Finalmente o haplótipo Senegal está irrgularmente distribuído no Brasil, uma

conseqüência do pequeno tráfico de escravos provenientes de Senegambia

(Senegal, Gambia, Serra Leoa e Guiné). Apesar de moderadas variações em

relação à origem dos escravos que vieram para cada região geográfica do Brasil,

o haplótipo CAR predomina por todo o país, devido ao efeito miscigenante

introduzido pelo tráfico escravo interno e, mais recentemente, pela migração

interna (Zago et al, 1999).

A maioria dos cromossomos com o alelo β

tem um dos cinco haplótipos

comuns, embora em uma grande série de pacientes com AF há uma minoria de

cromossomos (~5%) associados com haplótipos menos comuns, geralmente

denominados haplótipos atípicos (ZAGO et al, 2001b).

Segundo Zago et al 2000, os haplótipos atípicos observados em associação

com o gene β

são gerados por diversos mecanismos genéticos: (a) mudança de

um nucleotídeo em um dos sítios polimórficos de restrição; (b) simples e duplo

Crossing-over entre dois haplótipos β

típicos, ou mais freqüentemente entre um

típico haplótipo β

e um haplótipo β

diferente; e (c) transferência não recíproca

de seqüência (conversão). Romana et al 2000, verificaram que 15 dos 20

diferentes haplótipos atípicos teriam se originado por recombinação (SALZANO &

BORTOLINI, 2002).

Um estudo envolvendo 244 pacientes com AF (156 brasileiros e 88 de

Benin) analisou 488 cromossomos, sendo que destes, 15 (3,1%) eram haplótipos

atípicos. A freqüência de haplótipos atípicos observada na amostra brasileira foi

de 3,9% e na amostra de Benin foi de 2,2%. O percentual de haplótipos atípicos

encontrados nas duas populações variou entre 5,3 e 7,0% (ZAGO et al, 2001b).

A natureza do comércio escravo praticado no continente Americano

desintegrou a estrutura familiar escrava, permitindo uma mistura entre pessoas de

diferentes grupos étnicos Africanos. A mistura com não Africanos ou populações

descendentes de não Africanos, pode ser estimada a uma razão de 1,3%, 2,5% e

3% por geração nos Estados Unidos, Brasil e Cuba, respectivamente. Este alto

grau de miscigenação pode ter favorecido o aparecimento de haplótipos atípicos

por recombinação (BORTOLINI & SALZANO, 1999).

1.6 A ANEMIA FALCIFORME E OS HAPLÓTIPOS

Nigel 1984 levantou a possibilidade que três diferentes padrões clínicos

podem estar associados com os três principais haplótipos. Assim, a AF poderia

ser tipo Senegalês, Benin ou CAR. Essa possibilidade torna a expressão clínica

da AF muito variável e seqüências polimórficas podem ocorrer dentro do cluster β,

que podem modular a expressão da doença. Existem evidências que o nível de

hemoglobina fetal determina, em parte, o nível de células densas em pacientes

com AF, por isso, a modulação da síntese da hemoglobina fetal pode ter um efeito

significativo no quadro clínico. Como cada haplótipo pode estar associado com

diferentes seqüências controladoras da expressão da hemoglobina fetal (NIGEL,

1984).

A severidade clínica ou fenótipo da anemia falciforme estaria relacionado

aos haplótipos β

, estando os haplótipos Senegal e Indo-Árabe associados a um

quadro clínico moderado, Bantu a um quadro clínico grave e, Benin e Camarão,

intermediário. Os haplótipos Senegal e Indo-Árabe apresentariam níveis mais

elevados de Hemoglobina fetal (Hb F), com uma média de 15-30%. Os níveis de

Hb F nos outros haplótipos ficariam abaixo de uma média de 5-15% (ADEKILE,

2005).

Alguns autores como Powars et al, 1990 e Ashley et al, 2000, entre outros,

concordam que a variabilidade da expressão clínica da AF não pode ser explicada

somente pela substituição da valina pelo ácido glutâmico na cadeia β

. A

severidade da expressão da AF poderia resultar de diversos polimorfismos do

cluster β

e sua interação com alfa talassemia. Dependendo da combinação do

haplótipo do gene β

e da posição do gene α, há uma divergência das

manifestações patofisiológicas da doença.

Na África, bem como nos Estados Unidos, pacientes falcêmicos com o

haplótipo CAR têm um risco aumentado em duas vezes de complicações e morte

quando comparados com pacientes de outros haplótipos (ASHLEY et al, 2000). Na

presença do haplótipo Senegales, a saúde geral do paciente é melhor; com o

CAR, é sempre pior, e com o Benin é intermediária. Pacientes homozigotos para o

haplótipo Senegal e alfa talassemia tem raramente crises falcêmica durante a sua

vida. Contrariamente, em pacientes com um haplótipo CAR e uma deleção no

gene α, a alfa talassemia diminui o grau de prejuízo aos tecidos, mas pode ocorrer

uma séria lesão óssea (POWARS et al, 1990).

Os haplótipos do agrupamento do gene β-globina podem estar associados

com aspectos clínicos especiais e hematológicos específicos da AF. Entretanto, o

possível papel dos haplótipos β

é controverso, visto que diferentes trabalhos

sugerem que os haplótipos tem pouca influência no quadro clínico e hematológico

da AF (FIGUEIREDO et al, 1996).

Para comparar as características da AF no Brasil com outros locais,

Figueiredo et al 1996, estudaram os efeitos dos haplótipos do cluster do gene β-

globina e alfa talassemia sobre os aspectos clínicos e hematológicos de 85

pacientes com AF no Brasil. Não foram encontradas diferenças nos valores da

concentração de hemoglobina entre os vários haplótipos, e nem no Volume

Corpuscular Médio (VCM). Entretanto houve uma diferença estatisticamente

significativa (p<0,05) nos níveis de Hb F entre os haplótipos CAR e Benin. Em

relação aos aspectos clínicos examinados (AVC, necrose asséptica, úlcera de

pernas, litíase biliar), não houve diferença estatística significativa entre os grupos.

Foi concluído que, no grupo estudado, os haplótipos do cluster do gene β

parecem não influenciar a concentração de hemoglobina ou as manifestações

clínicas selecionadas da AF. Não houve diferenças estatisticamente significativas

na freqüência das complicações clínicas entre pacientes com o haplótipo CAR e

pacientes com o haplótipo Benin. Outros relatos mostram que, com o alto nível de

hemoglobina fetal que ocorre em portadores de haplótipos Senegal e Arábia

Saudita, a hemólise é menor, e consequentemente há menos anemia. Nestes

relatos, o haplótipo CAR foi acompanhado por alta prevalência de úlceras nas

pernas, comparado ao haplótipo Benin homozigoto. Ainda, em outros estudos, os

níveis médios de hemoglobina fetal foram mais baixos no haplótipo CAR

homozigoto que no haplótipo Benin homozigoto, ou naqueles com haplótipos

CAR/Benin. Os baixos níveis de hemoglobina fetal em pacientes com o haplótipo

CAR mostram estarem associados com as características clínicas mais severas da

doença (FIGUEIREDO et al, 1996).

Um estudo realizado em 2001, com o objetivo de elucidar os fatores de

risco associados com AVC em crianças SS, avaliou a prevalência da alfa-

talassemia e a distribuição dos haplótipos β

entre 700 crianças no Hospital

Infantil de Michigan. Neste estudo, o AVC acometeu 6% das crianças, ocorrendo

mais freqüentemente em meninas e sendo mais prevalente entre pacientes

Benin/CAR. Além disso, os autores sugerem que haplótipos CAR e atípico podem

ser mais preditivos de gravidade da doença do que outros haplótipos. Para os

autores deste estudo, os dados sugerem que meninas neonatas com quatro ou

mais genes α cujo haplótipo β

é Benin/CAR ou atípico e, meninos com quatro

genes α em associação com o haplótipo CAR/CAR, parecem ter um maior risco

para AVC que outras combinações (SARNAIK & BALLAS, 2001).

Em um estudo onde foi avaliada a correlação entre as manifestações

clínicas em pacientes Libaneses com anemia falciforme e os haplótipos β

surpreendentemente, os níveis mais elevados de Hb F estavam associados aos

casos clínicos mais graves. Quando os valores de Hb F foram correlacionados às

crises de dor, os casos mais graves tinham valores elevados de Hb F (2).

No estudo realizado em 2005, Lyra et al avaliaram além da distribuição dos

haplótipos, os aspectos clínicos, hematológicos e moleculares de pacientes

pediátricos de São Paulo e Salvador. Pacientes com os genótipos CAR/Benin e

CAR/CAR apresentaram mais hospitalizações devido a vaso-oclusão em ambas as

cidades. Infecções foram associadas com Benin/CAR e Benin/Benin em Salvador e

Benin/CAR e CAR/CAR em São Paulo. AVC foi mais freqüente no genótipo

CAR/Benin em Salvador e CAR/CAR em São Paulo. Colelitíase foi associada com

o grupo atípico em Salvador e o genótipo CAR/CAR em São Paulo (LYRA et al,

2005).

Os estudos relatados acima demonstram que ainda existem controvérsias

quando relacionamos os haplótipos com as manifestações clínicas em pacientes

com AF, confirmando a necessidade de estudos complementares, bem como o

envolvimento de outras abordagens.

Todas as doenças humanas têm um fator genético de menor ou maior

influência. Além disso, o grau e a variabilidade do efeito pode ser modulado pelo

sexo e a origem étnica. A epistasia, interação entre dois ou mais genes de

diferentes loci (genes modificadores), é um tópico de interesse atual na genética.

Essa interação deve ter um efeito fenotípico como consequência: um gene

epistático pode amenizar ou reforçar a expressão de outro gene (WOLF et al,

2000).

A nível fenotípico, a AF é uma doença multigênica. Isto é clinicamente

evidente, pois cada paciente apresenta aproximadamente 3-5 das potenciais

complicações clássicas com significativas variações na intensidade das

manifestações. Além disso, genes pleiotrópicos (genes envolvidos em eventos

patofisiológicos secundários, cada um com potencial de modificação da gravidade

e das características da hemólise, reposição da medula, osteonecrose,

etc.).Assim, genes epistáticos modulam significativamente a patofisiologia da

doença em cada paciente em particular. Os eventos secundários são parte

importante do fenótipo e explicariam a intensa diferença entre os indivíduos na

severidade da doença (NIGEL, 2005).

Uma complicação em que efeitos epistáticos têm sido estudados é a

obstrução cerebrovascular, uma causa comum de morbidade e mortalidade na AF.

Aproximadamente 10% dos pacientes apresentam um AVC antes dos 20 anos de

idade, e outros 22% apresentam infarto silencioso detectado por Imagem por

Ressonância Magnética (MRI), que muitas vezes está acompanhado por

deficiências motoras e cognitivas. A variação fenotípica entre pacientes Hb SS

sugere uma influência de genes modificadores e/ou ambiental (DRISCOLL et al,

2003).

Na última década, um número de genes epistáticos e genes pleiotrópicos

tem sido definidos na AF, e muitos outros estão hoje na categoria de candidatos

potenciais. A tecnologia de expressão Microarray e o seqüenciamento prometem

acelarar o entendimento sobre a multigenicidade desta doença, com um conceito

individualizado (NIGEL, 2001a). O entendimento da influência dos genes

envolvidos na modulação da complexa patofisiologia da AF pode permitir a

predição do fenótipo do paciente e auxiliar no manejo das decisões terapêuticas

(NIGEL et al, 2001b).

Recentemente, alguns autores como Chies & Nardi, 2001, têm abordado a

AF como uma doença inflamatória crônica. A primeira indicação da existência de

uma condição inflamatória é a presença de leucocitose. De acordo com as

citocinas que produzem, as células T auxiliares (Th) podem ser divididas em dois

subgrupos: Th1 e Th2. As células Th1 agem principalmente na defesa mediada por

fagócitos contra infecções e são também relacionadas com inflamação, enquanto

que respostas Th2 estão envolvidas com reações alérgicas e supressão da

ativação de macrófagos. Pacientes propensos a uma maior resposta do tipo Th1

apresentam maior morbidade que aqueles propensos a Th2. Assim, a explicação

para a variabilidade clínica em pacientes com AF seria a tendência de cada

paciente a um nível de inflamação (CHIES & NARDI, 2001).

1.7 DIAGNÓSTICO DA ANEMIA FALCIFORME

O diagnóstico laboratorial das hemoglobinopatias falciformes é

relativamente simples. A eletroforese de Hb alcalina em acetato de celulose

continua sendo a metodologia básica para a qualificação de grande parte das

hemoglobinas mutantes. A existência de outras hemoglobinas mutantes que

podem imitar as características eletroforéticas da Hb S, obriga o uso de mais de

um método de análise, para assegurar a correta identificação. Métodos simples,

como o teste de falcização, a prova de solubilidade ou a eletroforese ácida em

ágar, podem ser utilizados para esse fim. Atualmente, a introdução de técnicas

alternativas, como a focalização isoelétrica e a cromatografia líquida de alta

performance têm permitido melhor análise das hemoglobinas variantes. Essas

técnicas devem ser aplicadas em conjunto com as informações da história e

exame físico, contagens automatizadas das células sangüíneas e análise do

esfregaço do sangue periférico. As contagens sangüíneas (Hb, HCT, VCM), bem

como os níveis de hemoglobinas (Hb S e Hb F), são muito variáveis dentro das

várias doenças que podem ser classificadas como doença falciforme (Hb SS,

HbSC, etc) (NAOUM, 1997).

Através da biologia molecular, utilizando a técnica de PCR (“Polymerase

Chain Reaction”), é possível multiplicar uma seqüência do DNA no qual se

encontra a mutação. Um diagnóstico baseado no genótipo pode ser estabelecido

usando-se a análise do DNA de alguma célula nucleada disponível como, por

exemplo, células de vilosidades coriônicas e de sangue periférico. Através de

células sangüíneas, o diagnóstico por DNA pode também ser aplicado para

triagem em sangue de cordão umbilical e para o diagnóstico de algumas

hemoglobinopatias S de difícil definição, especialmente na ausência de estudos

familiares (NAOUM, 1997).

Tabela 1

Principais síndromes falcêmicas relacionadas com suas

características laboratoriais

Síndrome

falcêmica

Hb g/dl

Média

(variação)

Htc %

Média

(variação)

VCM

Hb S

Hb F

Hb A

SS 7,5

(7-9)

(18-30)

N 90-100 2-10 -

S/β

8,0

(7-10)

(20-35)

↓

70-90 5-20 -

S/β

11,0

(9-11)

(25-40)

↓

50-80 5-10 10-40

SD 11,0

(9-13)

N 40-50 0 Hb D;

30-40

SS/Tal.α

11,0

(9-11)

(25-40)

↓

80-90 10-20 Hb H:

1 a 5%

SC 11,0

(9-13)

(25-40)

N 45-50 2-5 Hb C:

45-50

S/PHHF 12,0

(12-14)

(32-40)

N 60-80 15-30 -

AS 13,0

(12,16)

(38-50)

N 30-40 - 60-70

Fonte: NAOUM, P. C.; DOMINGOS, C.R.B. – Atualização de Técnicas para

Hemoglobinopatias Centro de Referência em hemoglobinopatias – UNESP – São José do

Rio Preto – SP – 1995.

A realização do hemograma, com especial atenção à morfologia

eritrocitária, contribui muito para se chegar a um resultado seguro. A tabela 2

mostra algumas alterações laboratoriais específicas para a AF (NAOUM, 1997).

Tabela 2

Alterações laboratoriais específicas na anemia falciforme

Concentração da Hb S: 90 a 100%

Dosagem de Hb Fetal: 2 a 10%

Tipo de anemia: Normocítica e normocrômica

Dosagem de Hb g/dl: 7-9

Reticulócitos: 5 a 30%

Leucócitos: Acima de 10 mil durante as crises.

Pode ocorrer desvio à esquerda

Plaquetas: Plaquetose, com formas anormais.

Fragilidade osmótica: Diminuída.

Fragilidade térmica e mecânica Aumentada.

Bilirrubina indireta: Elevada, acima de 5mg/dl.

Urobilinogênio urinário: Elevado.

Urobilinogênio fecal: Elevado.

Hematúria: Freqüente.

Ácido úrico sérico: Pode estar elevado.

Fosfatase alcalina sérica: Elevada nas crises.

Medula óssea: Hiperplasia das células eritróides.

Ferro sérico: Normal ou aumentado.

Fonte: NAOUM, 1997.

O diagnóstico precoce tem demonstrado significativo impacto na morbidade

e mortalidade dos pacientes, pois permite 1) introduzir precocemente os recém-

nascidos afetados em programas de assistência médica específica; 2) educar os

pais a identificar os primeiros sinais e sintomas das complicações de risco e como

proceder para procurar a intervenção médica apropriada; 3) iniciar precocemente

a profilaxia contra infecções pneumocócicas, uma das principais causas de

mortalidade nesses pacientes; 4) determinar o risco de outras complicações

graves como o AVC e instituir tratamento precoce correspondente; e 5) realizar

aconselhamento genético (SILLA, 1999).

1.8 TRATAMENTO

A expressão do fenótipo da AF varia amplamente entre diferentes

pacientes. O tratamento continua a ser primariamente de natureza paliativa,

sintomática e preventiva. Capacitação e educação são os maiores aspectos de um

apoio cuidadoso (BALLAS, 2002).

O tratamento sintomático inclui o controle da dor, transfusão de sangue e

tratamento da falência de órgãos. O tratamento da dor segue certos princípios que

incluem avaliação, individualização da terapia e utilização de analgésicos não

opióides e opióides para adequado alívio. A troca transfusional ou ex-sanguíneo

transfusão é indicada para pacientes com doença vascular grave, sobretudo

cerebral, garantindo um nível seguro de Hb A. A síndrome respiratória aguda é a

complicação clínica mais comum, e seu tratamento deve ser agressivo, incluindo

adequada ventilação, uso de múltiplos antibacterianos e simples transfusão de

sangue ou troca transfusional, dependendo de sua severidade (BALLAS, 2002).

A terapia preventiva inclui penicilina profilática em crianças, terapêutica

transfusional em pacientes com AVC, e hidroxiuréia em pacientes com freqüentes

episódios dolorosos ou complicações mais sérias (BALLAS, 2002).

A inibição da falcização tem incluído agentes anti-falcizantes como o

cianato e a hidroxiuréia. Estudos do cianato mostram, que este composto leva a

efetiva carbamilação das moléculas de Hb S e redução da falcização, mas não tem

efeito na freqüência das crises álgicas, além de poder apresentar potencialmente

sérios efeitos colaterais. A hidroxiuréia (HU) é um agente potencialmente menos

tóxico que aumenta os níveis de Hb F. Ambos os aspectos clínico e laboratorial da

anemia falciforme são influenciados pela concentração de Hb F. Pacientes com

níveis mais altos de Hb F apresentam menos episódios de dor e maior sobrevida

(SERJEANT, 2001).

A hidroxiuréia é uma terapia efetiva para adultos com AF. Em um Estudo

Multicêntrico da Hidroxiuréia (MSH) controlado, pacientes que recebiam a HU

tiveram uma taxa mais baixa de eventos dolorosos, síndrome respiratória aguda,

transfusões e hospitalizações comparadas com pacientes que receberam placebo.

A principal toxicidade observada neste estudo foi à depressão transiente de

leucócitos, plaquetas e concentração de hemoglobina (CHARACHE et al, 1995).

O Estudo Multicêntrico Fase I/II da HU em crianças com AF (HUG-KIDS),

planejado para determinar a dose máxima tolerada (MTD) da HU e tratar uma

coorte de 50 crianças gravemente afetadas por 1 ano, mostrou que a HU aumenta

significativamente a concentração de hemoglobina, o MCV, Hb F e o percentual de

células-F em relação aos valores pré-tratamento. Além disso, verificou-se que

pacientes pediátricos e adultos apresentaram toxicidade hematológica similar.

Nenhum efeito adverso sobre o crescimento foi observado durante o período de

tratamento (KINNEY et al, 1999).

Desde os primeiros resultados do MSH em pacientes adultos com AF, a HU

tem sido usada com sucesso em pacientes com crises dolorosas recorrentes e/ou

síndrome respiratória aguda. Além de seu efeito mielossupressor e da habilidade

para induzir a síntese de Hb F, a HU também tem mostrado reduzir a adesão dos

eritrócitos falcizados às células endoteliais e modular a ativação das mesmas e a

geração de óxido nítrico. O papel da HU em crianças muito jovens ainda requer

mais estudos, questões permanecem sem resposta a respeito da manutenção da

eficácia e segurança deste tratamento por longo tempo, especialmente em

crianças, as quais estão potencialmente expostas a HU por décadas. A inclusão

de pacientes no Registro Belga de Pacientes com Doença Falciforme tratados com

HU está em andamento, tendo sido aberto em 1993. Esse registro tem permitido a

reavaliação da eficácia e segurança da HU, especialmente em pacientes

pediátricos, e a avaliação da possível função na prevenção de AVC primário ou

recorrente. Esta experiência confirma até o momento, o benefício clínico do

tratamento com a HU, até mesmo em crianças muito jovens. A efetividade da HU

para prevenção primária ou secundária de AVC é possível, e deve continuar a ser

avaliada prospectivamente por meio de ensaios randomizados (GULBIS et al,

2005).

Pesquisas sobre o uso de terapias como inalação de óxido nítrico, L-

arginina, Ultra-sonografia Doppler Transcranial e o desenvolvimento de programas

de transfusão de sangue, estão levando a progressos na redução da morbidade e

mortalidade, melhorando a qualidade de vida de pacientes com AF (JENKINS,

2002).

Os componentes de um amplo cuidado incluem informações pais/paciente,

aconselhamento genético, serviço social, prevenção de infecções, recomendação

de dieta e suplementação, psicoterapia, cuidados médico (especialista renal e

outros), saúde da mãe e da criança, ortopedia e cirurgia geral, controle da dor,

fisioterapia, cuidados com os olhos e dentes, serviço de dependência de drogas e

enfermagem especializada em doenças falciformes. A cooperação das pessoas

afetadas é indispensável para um total cuidado. Os trabalhos em sociedade

envolvendo o hospital, o serviço comunitário de saúde e os agentes voluntários,

acentuam o sucesso da equipe multidisciplinar. O cuidado holístico melhora a

qualidade de vida das pessoas afetadas, reduz os números de hospitalizações e

comprometimentos. A morbidade é reduzida pela detecção prematura e tratamento

das complicações crônicas (OKPALA et al, 2002).

O diagnóstico neonatal é o melhor caminho para um tratamento prematuro

na prevenção de sérias doenças pneumocócicas, garantindo suficiente hidratação

e apropriada vigilância, bem como fornecimento de educação familiar. Muitos

progressos têm sido feitos na última década no tratamento prematuro de retinites,

litíases biliares, e necrose asséptica do quadril. É também importante garantir

exata prescrição para hidroxiuréia (BENGUE & CASTELLO, 2001).

Desordens hereditárias da hemoglobina atualmente não têm cura, em

pacientes adultos. O transplante de medula óssea tem mostrado ser uma

possibilidade de cura para crianças com AF (BALLAS, 2001).

Finalmente, a terapia gênica continua a ser investigada em nível de

modelos experimentais de camundongos transgênicos (BALLAS, 2002).

1.9 PERFIL ECONÔMICO

Sabe-se que populações pobres apresentam maiores taxas de mortalidade

por doenças em geral, principalmente aquelas infecto-contagiosas. A explicação

para tal fato é complexa e envolve diferentes aspectos. A dificuldade de adquirir

medicamentos e de apresentar condições de moradia adequadas, o acesso difícil

a serviços de saúde de qualidade, a deficiente compreensão acerca da prevenção,

diagnóstico das doenças e seus tratamentos, a falta de adesão às orientações

médicas, e talvez a presença de doenças com comportamento biológico mais

agressivo são as principais causas dessa associação (FISCHER, 2004). Como

citado anteriormente, pacientes portadores de anemia falciforme necessitam de

um amplo cuidado, o que evidentemente envolve condições econômicas que

permitam o seu acesso a terapia, alimentação, saneamento básico e cuidados

médicos adequados. A maioria dos pacientes atendidos no Centro de Atenção

Global para Pacientes Portadores de Anemia Falciforme e outras

hemoglobinopatias do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, são oriundos de Porto

Alegre, região metropolitana e cidades do interior do estado apresentando

diferentes perfis econômicos, o que pode ter importante influência no sucesso do

resultado terapêutico.

2 JUSTIFICATIVA

A AF é a doença monogênica mais comum no Brasil sendo considerada um

problema de saúde pública. A variabilidade clínica conferida pelos diferentes

haplótipos pode permitir que sejam detectados precocemente pacientes em risco

de desenvolver as complicações mais severas ou com risco elevado de

mortalidade precoce. Para tais pacientes, o Transplante de Células Tronco

Hematopoéticas (TCTH) poderia ser indicado.

O TCTH de medula óssea ou de cordão umbilical têm sido modalidade de

sucesso na terapia curativa em algumas crianças com AF. No entanto, a indicação

do TCTH deve ser muito criteriosa já que esta modalidade de tratamento se

acompanha de morbi-mortalidade considerável, sobretudo em indivíduos das

classes sociais D e E (Fischer, 2004). Considerando a relevância do trabalho de

Fischer, 2004 quanto a morbi-mortalidade que acompanha o TCTH, principalmente

em classes sócio-econômicas D e E, se torna fundamental a avaliação da

severidade do quadro clínico do paciente falcêmico frente aos riscos ou benefícios

dessa modalidade de tratamento.

A identificação precoce de determinantes de severidade do quadro clínico

da AF, pode contribuir para um manejo adequado da doença e conseqüente

aumento da sobrevida e melhor qualidade de vida do paciente falcêmico.

3 OBJETIVOS

3.1 Determinar a freqüência dos haplótipos do agrupamento do gene β-globina

em uma amostra de pacientes com anemia falciforme.

3.2 Relacionar a gravidade das manifestações clínicas dos pacientes com

anemia falciforme com os haplótipos encontrados e a casse sócio-

econômica.

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Silva, MAL

; Friedrisch, JR

; Bittar, CM

; Urnau, MD

; Chies, JAB

; Silla, LMR

Laboratory of Hematopoietic Cell Culture and Molecular Analysis, Hospital de

Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Laboratory of immunogenetics, Departamento de Genética, Universidade Federal

do Rio Grande do Sul.

Corresponding author: Lúcia Mariano da Rocha Silla

Address: Ramiro Barcelos, 2350 room 2235 Porto Alegre – RS - Brazil.

ZIP CODE 90035-903

Phone/Facsimile: 55 51 21 01 83 17

e-mail: [email protected]

Financial support: FIPE/Hospital de Clínicas de Porto Alegre; Associação

dos Amigos da Hematologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre -

HEMOAMIGOS – HCPA.

Short running title: A study of β

haplotypes in Porto Alegre

Abstract

Beta-globin gene haplotypes were analyzed in 75 sickle cell disease (SCD)

Brazilian patients who are assisted by the Global Attention Center for

Hemoglobinopathy Patients in Hospital de Clínicas de Porto Alegre (RS/Brazil) in

order to study the relationship between such haplotypes and SCD severity. The β

haplotype distribution found here (66%Bantu, 27% Benin and 7% others)

corroborates previously described frequencies in other Brazilian regions, that is, a

predominance of the Bantu haplotype, followed by Benin and others. The analysis

of polymorphic restriction sites (HindIII-γG, HindIII-γA and HincII-3’Ψβ) did not

identify any Senegal and Atypic haplotypes in the group of patients studied. When

the haplotypes were correlated with clinical parameters (disease severity, HbF

levels, cardiovascular complications), no significant associations were found. Most

of the patients in our sample belong to C (38,7%) and D (24%) social classes,

which have limited access to specialized care and present more severe clinical

manifestations.

Key words: hemoglobinopathy, sickle cell disease, β

haplotype,

hemoglobin S.

Introduction

Sickle cell disease (SCD) is caused by the substitution of an adenine (A) by

a thymine (T) in the sixth codon of the beta-globin gene, which causes the

substitution of glutamic acid by valine (1). The result of that mutation is the

production of hemoglobin S (HbS), which polymerizes under low oxygen tensions

(hypoxia) producing the characteristic sickle shape of erythrocytes, the main cause

of vaso-occlusion in SCD (2). This important pathophisiological aspect of SCD

triggers painful events and contributes largely for the morbidity and mortality of the

disease (3).

Hemoglobinopathies are among the most frequent human genetic diseases

and, amongst them, SCD is the most frequent form in Brazil. In spite of being more

frequent in Afro-derived populations, some studies have demonstrated that the

HbS frequency is rising in Euro-derived individuals. During childhood, SCD is

associated with high morbidity and mortality due to osteonecrosis, bacterial

infections, splenic failure and acute chest syndrome (ACS), as well as deleterious

effects in intelectual and phisiological development (4).

Although SCD is a monogenic disease, its phenotype is highly

heterogeneous. Many of the factors contributing to such heterogeneity are

genetically determined (β

haplotypes, alpha-thalassemia concomitance, HbF

levels), while others are of environmental or socio-economic nature (5, 6). Patients

that belong to lower social classes usually face difficulties to have a proper diet

and to follow treatment protocols.

According to Chies and Nardi (7), SCD is a chronic inflammatory disease,

where severe clinical manifestations are determined by an enhanced inflammatory

state, contributing to vaso-occlusive events and therefore playing an important role

in the pathophisiology of the disease.

A β

gene haplotype is defined as an association of restriction sites along

the group of beta-globin gene (8). These polymorphisms have provided important

anthropological data concerning the multiple origins of HbS (9). Currently,

evidences suggest that the β

mutation has had at least five independent origins

which correlate to different haplotypes: Senegal, Benin, Central Africa Republic

(CAR) or Bantu, Cameroon and Indian-Arabic (10, 11). Several studies suggest

that SCD clinical severity is correlated to β

haplotypes: Senegal and Indian-Arabic

haplotypes are associated to a mild clinical course, Bantu is associated to severe

clinical manifestations, while Benin and Cameroon present intermediary

phenotypes. Senegal and Indian-Arabic haplotypes present higher levels of fetal

hemoglobin (HbF), with average values of 15-30%. Other haplotypes show HbF

levels below average values of 5-15% (5). Powars et al. (12) suggest that the

Bantu haplotype is one of the main risk factors for the development of severe

clinical manifestations in SCD. Nevertheless, the possible influence of β

haplotypes in SCD severity is still a controversial issue, considering other studies

suggesting that β

haplotypes have little influence upon SCD clinical and

hematological pictures (9).

Millions of people are affected by SCD worldwide. In Brazil, a country with

great environmental and socio-economic diversity, it is estimated that 5,0-6,0% of

the population carries the HbS allele and that 700 to 1000 new cases of SCD occur

per year (13). Brazil is the biggest country in South America, with approximately

169 million people, according to the Brazilian Institute of Geography and Statistics

(IBGE) (14). It has had a great influx of African slaves and many different

immigrant groups (15). Until the end of World War II, for example, Brazil received

almost 5 million European immigrants, who settled mainly in the southeast and

south regions, forming an ethnically heterogenous population unevenly distributed

along this country of continental proportions (16).

A very useful tool that is employed to investigate the origins of American

Afro-derived populations is the analysis of DNA polymorphisms along the β-globin

gene, particularly those linked to the β

allele (17).

We have performed an analysis of such polymorphisms in a sample of SCD

Brazilian patients who are assisted by the Global Attention Center for

Hemoglobinopathy Patients in Hospital de Clínicas de Porto Alegre, following the

study of Wagner et al.(18) who determined the β

haplotypes in 27 SCD patients.

This study showed higher frequencies of the Bantu haplotype (72%), followed by

Benin (17%) and Senegal (2%), while approximately 5% of the chromosomes

presented atypical haplotypes. The authors did not study the relationship between

haplotypes and clinical course. Our study has increased the sample to determine

haplotypes in 75 patients and we have investigated the relationship between the

haplotypes found in this group and some clinical features of SCD (disease

severity, HbF levels), as well as demographic data and socio-economic profile.

Materials and Methods

A cross-sectional study was designed to evaluate the frequency of β

haplotypes in 75 SCD patients (39 male and 36 female individuals). After obtaining

informed consent, a blood sample was collected in Vacutainer

tubes with K

EDTA

(BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA) and stored at 4°C until manipulation.

Genomic DNA was isolated from blood samples as previously described (19) and

stored at –20°C. The SS genotype was confirmed by PCR (20) and haplotypes

were determined by PCR-RFLP with the following enzymes: HindIII-γG, HindIII-γA

and HincII-3’Ψβ. Primers and PCR conditions were described by Sutton et al. (21).

Severity criteria definition

A severe clinical course was attributed to those patients presenting two or

more painful crisis per year (≥2) (22, 23). We have evaluated HbF levels, gender,

age, cardiovascular complications (cardiomegaly, vasculopathy, and

cerebrovascular accident - CVA) and socio-economic profile of SCD patients. All

evaluations considered the period before the patient went on hydroxyurea (HU)

treatment. Hydroxyurea is a cytotoxic drug used to treat SCD patients for its

property of inducing HbF synthesis (24), which significantly reduces the frequency

of vaso-occlusive episodes in most SCD patients.

Socio-economic profile

We have employed the Brazil Economic Classification Criterion (CCEB),

which is used in Brazil since 1996.

Statistical methods

Due to data assimetry, we used descriptive statistics, where quantitative

variables were described as median and percentile 25-75. Qualitative variables

were described as relative and absolute frequencies. Association between

qualitative variables was evaluated by Pearson's or exact Fisher's chi-square

tests. Comparisons between age or HbF levels with haplotypes and cardiac

complications was performed by Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests,

respectively. Significance level was 5% and the analysis were performed in the

SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) software, version 10.0.

Results

From the 75 patients analyzed, 36 (48%) were females and 39 (52%),

males. Age ranged from 2-62 years, with a median of 18, 5 (9,8-28,5). More than

60% of the patients (66, 7%) presented 2 or more painful crisis per year,

characteristic of a severe clinical course, and 44% of them presented some cardiac

complication. The socio-economic profille analysis revealed that of 38,7% of the

patients belong to class C and 24% to class D. Among the 150 β

chromosomes

analyzed, 66% were Bantu, 27% Benin and 7%, others. The main genotypic

combinations are showed in Table 1. We did not observe any significant

association when haplotypes were correlated to pain rate, cardiac complications,

gender, age or HbF levels, as showed in Table 2. The relationship between pain

rate and HbF levels is showed in Table 3. In our sample, older patients presented

higher incidences of cardiac complications when compared to younger individuals,

as expected (P=0,013) (Figure 2). There was a borderline association between

haplotypes and HbF levels, where atypical haplotypes presented lower HbF levels

when compared to the others (P=0,051) (Figure 1).

Table 1. β

haplotype distribution in SCD patients.

Haplotype N %

Bantu/Bantu 35 46,7

Bantu/Benin 22 29,3

Benin/Benin 7 9,3

Bantu/Others 6 8,0

Benin/Others 5 6,7

Total 75 100

n = number of individuals

Table 2. Sample characterization according to haplotypes.

Haplotypes

Variables

Bantu/Bantu

(n=35)

Bantu/Benin

(n=22)

Benin/Benin

(n=7)

Others*

(n=11)

Pain rate – n (%)

≤ 1 **

9 (25,7) 10 (45,5) 2 (28,6) 4 (36,4)

≥ 2

26 (74,3) 12 (54,5) 5 (71,4) 7 (63,6) 0,478

HbF level – n (%)

≤ 2***

3 (9,7) 3 (15,8) 1 (14,3) 3 (27,3)

> 2 28 (90,3) 16 (84,2) 6 (85,7) 8 (72,7) 0,566

Cardiac complications – n (%)

Sim 13 (37,1) 10 (45,5) 4 (57,1) 6 (54,5)

Não 22 (62,9) 12 (54,5) 3 (42,9) 5 (45,5) 0,643

n= number of individuals

* Benin/others and Bantu/others

** pain episodes/year

*** g/dl

Table3. Pain rate and HbF levels

Hb F n(%) P

Pain rate

(painful crisis/year)

≤ 2g/dl > 2g/dl

≤ 1

3 (13) 20 (87)

≥ 2

7 (15,6) 38 (84,4) 1,000

n = number of individuals

Haplótipo

Outros tiposBen/BenBan/BanBan/Ben

Taxa de hemoglobina fetal (em mediana)

Figure 1: HbF levels and haplotypes

Complicações cardíacas

NãoSim

Idade na avaliação da hemoglobina fetal

Figure 2: Age and cardiac complications

P= 0,013

P=0,051

Age

Haplotype

HbF levels

(median)

Cardiac Complications

Discussion

The frequency of β

haplotypes was determined in 75 SCD Brazilian

patients who are assisted by the Global Attention Center for Hemoglobinopathy

Patients in Hospital de Clínicas de Porto Alegre through the analysis of

polymorphic restriction sites (HindIII-γG, HindIII-γA, HincII-3’Ψβ and HpaI-3’β). We

have also studied the correlation between the haplotypes found and the clinical

severity of the disease, HbF levels, cardia complications, age, gender and socio-

economic profile. In our sample of patients, there was a predominance of the

Bantu haplotype (66%), followed by Benin (27%) and others (7%). In 1996, Wagner

et al. (18) established the β

haplotype frequencies in 27 SCD patients from the

same hospital and found 72% of Bantu haplotypes, 17% of Benin, 2% of Senegal

and approximately 5% of atypical haplotypes. The authors did not study any

variable that could evaluate the correlation between haplotypes and disease

severity. In our study, where a greater number of patients was analyzed, we could

not find Senegal haplotypes. The analysis of only three polymorphic restriction

sites may have been unsufficient for us to determine Senegal or atypical

haplotypes among the group of other haplotypes that we have found.

Our data confirm the prevalence of the Bantu haplotype, followed by Benin,

observed by Wagner et al. (18) in the south region of Brazil, as well as data from

other Brazilian regions (25). At the same time, our data differ from North American

and Jamaican data, where Benin haplotypes are more commom among SCD

patients, which results from the preference of trafficking African slaves from

middle-east Africa to those regions during the British Atlantic slave trade (26). That

difference is observed due to the African ancestrally of our patients. The ethnic

origin of the Brazilian population is heterogenous and unevenly distributed.

Approximately 2,5-4,0 million Africans were brought as slaves to Brazil and

distributed in all regions of the country (27).

The gold exploitation in Minas Gerais, during the XVIII century, had a

fundamental importance in the development of the “charqueadas gaúchas”, which

were the source of meat to that region of the country. From that moment on,

slavery was more expressively instituted in Rio Grande do Sul (28).

The foundation of Rio Grande fortification, in 1737, transformed that region

into a great slave receptor center, participating also in the inter-region slave traffic.

African slaves were brought mainly from Rio de Janeiro, although there were some

coming from Bahia, Pernambuco and Santa Catarina. Those ports received slaves

coming mainly from Angola, Benguela and Congo, who belonged to the Bantu

linguistic group. Although the registry of slaves points to the nationality from the

port in which the individual was sent in Africa, we can affirm that most of them

came from the regions known today as Zaire and Angola. Consequently, the

gaucho slave was also coming from those African regions, at least in greater

proportions (28, 29). These historical registries seem to corroborate our data

concerning the prevalence of the Bantu haplotype among SCD patients from the

south region of Brazil.

Most of the chromosomes with the β

gene has one of the five commom

haplotypes, although in each series of SCD patients there is a small proportion of

chromosomes (5-10%) associated to less commom haplotypes, recognized as

atypical haplotyes (30). As previously stated, we did not identify among the 7% of

“other haplotypes” in our sample which ones could be atypical. Therefore we could

not establish whether the frequency of atypical haplotypes in our study is in

accordance to that found by Wagner et al. (18) or by studies in other Brazilian

regions (25).

The SCD patients studied here are either Afro-Brazilians or admixed

individuals. This classification was based in physical appearance (skin color).

Previous studies indicate that skin color and other phenotypical traits could be

poor predictors of genomic ancestrally (31). According to IBGE, in Brazil as a

whole, 53%, 6% and 38% of the persons are identified as White, Black, and Brown,

respectively. In Rio Grande do Sul (~10 million inhabitants), the numbers are

87.5%, 5%, 7%, respectively (14). According to Bortolini and Pena (32), about 148

million Brazilians present more than 10% of African nuclear genome ancestry, and

at least 89 millions of individuals have mtDNA lineages of African origin.

Those data demonstrate the extension of admixture in Brazil, characterizing

an unique genetic heterogeneity.

In the present study, 50 (66, 7%) patients presented a pain rate ≥ 2, which

characterizes a severe clinical course. Among them, 26 (74, 3%) presented the

Bantu/Bantu genotype, which does not indicate a greater morbity compared to

other haplotypes as reported by other studies (33).

As shown in Table 2, the frequency of pain rate ≥ 2 distributed among the

haplotypes was highly homogenous, suggesting the absence of relationship

between disease severity and the haplotypes found. The same trend is observed

when we compare haplotypes and HbF levels above 2%. Considering that our

group of patients belongs to a reference center for the attendance of SCD patients,

it would be expected a prevalence of individuals with a more severe clinical

course.

Although the evaluation of severity in SCD is defined by the number of

painful crisis per year, according to the literature, we believed it would be

interesting to evaluate also the frequency of other clinical manifestations, such as

priapism, ACS, CVA, osteonecrosis, leg ulcers, cardiopathy and severe anemia, in

order to investigate whether the severe clinical course defined by the pain rate

corresponds to a greater disease morbity.

In order to reinforce the analysis of disease severity we have evaluated the

incidence of cardiac complications, considering vasculopathy, CVA, and

cardiomegaly as one category of cardiac complications due to the low incidence of

such variables alone. Patients who are Bantu/other, Benin/other or Benin/Benin

seem to have more cardiac complications than the others, but that frequency did

not reach statistical significance (Table 2). As expected, we found a higher

frequency of cardiac complications among older patients (P=0,013) (Figure 2).

It is of commom knowledge that the HbF level is one of the main modulators

of the SCD clinical picture, both in children and adult patients. High HbF levels

have been associated to less vaso-occlusive events, less ACS episodes and

reduced mortality rate (24). We could not find any association between HbF levels

and number of painful crisis as showed in Table 3.

Interestingly, HbF levels are high in this group of patients, with a median of

4,73 (3,0-7,0). Twenty-eight (90.3%) Bantu/Bantu patients presented HbF levels

above 2%. A non-significant, but borderline, association indicated that Other

haplotypes present lower HbF levels when compared to the other haplotypes

(P=0,051). According to Steinberg et al. (23), HbF levels are extremely variable

among SCD patients. Gonçalves et al. (26) found a high concentration of HbF in

Bantu/Bantu individuals, who usually present average levels below 5% (34). In a

study conducted to evaluate the correlation between β

haplotypes and the clinical

course of SCD in Lebanon patients, higher levels of HbF were surprisingly

associated to more severe clinical cases: considering painful crisis, the more

severe cases had higher HbF levels (2).

Levels of HbF can be influenced by gender, age, number of α-globin gene

copies, β

haplotypes and the X-linked F locus, which regulates the production of

HbF-producing erythrocytes (F cells) (35).

Chang et al. (35) studied the F locus and demonstrated that it contributes to

40% of the total variation in HbF levels, while the β-globin gene haplotype was

associated to 14% of such variation. When the production of F cells was removed

from the analysis, approximately half of the variation could not be explained, which

demonstrates the need of more research.

The presence of elevated HbF levels in Bantu/Bantu patients, on the other

hand, could be explained by the variation in the regulatory sequence 5’ HS2 and

the 5’ flanking region of the γ-globin gene (36).

Recently, some authors such as Chies and Nardi (7) have approached SCD

as a chronic inflammatory disease, where the severity of the clinical picture would

be determined by an enhanced pro-inflammatory state, contributing to vaso-

occlusive events. The first indication of such inflammatory condition is the

presence of leukocytosis in SCD patients. Patients who are more prone to a Th1

immune response, which is related to inflammation, present more morbidity than

those who are Th2-prone, which involves alergic reactions and macrophage

suppression. Factors that activate endothelial cells, such as inflammatory

mediators, contribute to interactions between erythrocytes, endothelium,

leukocytes, platelets and plasma factors, which enhance adhesion and triggers

vaso-occlusive episodes (3, 37). Those inflammatory mediators induce the

activation of Gardos channels, which could help explain the association between

inflammation, vaso-occlusion and enhanced hemolysis, which is sometimes

observed in infeccious states (38).

Apart from the myelosupressive effect (represented by the reduction in

neutrophils) and the ability to induce HbF synthesis, HU seems to reduce the

adhesion between sickled erythrocytes and endothelial cells, modulating the

activation of the last ones (39). More studies suggest that neutrophil, monocyte

and reticulocyte reductions could also be important. Neutrophils of patients in

painful episodes seem to augment the adhesion of culture cells to endothelial

cells. Reducing blood neutrophils, HU could reduce the occurrence and severity of

vaso-occlusive events. The adhesion between sickled erythrocytes and endothelial

cells is reduced before a measurable rising in HbF levels occur, suggesting a

direct effect on the cell membrane or on the adhesive properties of endothelial

cells. Hydroxyurea could transform endothelial cells into a less atractive adhesion

site to sickled erythrocytes (3).

The variables considered in this study are relative to the period before the

treatment with HU, unfortunately we did not evaluate the pos-HU period. It would

be interesting to know whether these patients who presented high HbF levels and

severe clinical course have had any improvements with HU.

Chies et al. (40) observed that an SCD patient became asymptomatic after a

kidney transplant surgery. The authors speculate that it could be related to the

immunosupression imposed to the patient after the procedure. Considering our

data and the literature's we could hypotesise that, in the abscence of a full

functioning splen during childhood, the SCA patient develops an immune response

predominantly of the inflamatory type and its intensity is variable depending on the

degree of splen malfuction and antigen challenge. In that scenario, the patient

which is exposed to a variety of different antigens related to their pour enviroment

and lack of basic sanitarie conditions, as is the case of the pour patients, could

develop unpredictable clinical consequences. If that is true, the genotypical

influence of haplotype and/or of the level of fetal hemoglobin on the disease

course could be diminished.

Considering the socio-economic criteria analyzed the predominance of

patients from C and D social classes should be taken into account before an

indication of hematopoietic stem cell transplantation, because according to Fischer

(41), patients from those social classes present higher risks of morbi-mortality.

Conclusions

These data corroborate the prevalence of Bantu haplotypes among Afro-

Brazilians, which is consistent with the origins of African slaves brought to Brazil

during the slave trade. Our results did not show any relations between the

haplotypes found and the severity of SCD in this group of patients, including other

SCD severity markers, in order to evaluate that aspect. In our group of patients,

HbF levels did not correlate to disease severity. Immunosuppression could have an

additional effect to the high HbF levels in patients treated with HU.

Acknowledgements

We are thankful to Meide Daniele Urnau, Valéria Doliwa Wislocki, Jóice

Merzoni, Vanessa de Souza Valim and Rafael Teixeira de Souza for helping with

data and sample collection, and to Ceres Oliveira for helping with statistical

analysis. This study was funded by Fundo de Incentivo à Pesquisa do Hospital de

Clínicas de Porto Alegre (FIPE-HCPA), by Associação dos Amigos da Hematologia

do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HEMOAMIGOS-HCPA) and by

Laboratório de Imunogenética (Departamento de Genética –UFRGS).

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41 Fischer GB. Relação entre morbi-mortalidade do transplante alogênico de

medula óssea e perfil econômico dos receptores. Porto Alegre – UFRGS,

2004. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Rio Grande do Sul,

Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências

Médicas, 2004.

Estudo da Identificação de Haplótipo e a Relação com as Manifestações

Clínicas em Pacientes com Anemia Falciforme.

Silva, MAL

; Friedrisch, JR

; Bittar, CM

; Urnau, MD

; Chies, JAB

; Silla, LMR

Laboratório de Cultura e Análise Molecular de Células Hematopoéticas, Centro

de Pesquisas, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul.

Laboratório de Imunogenética, Departamento de Genética, Universidade Federal

do Rio Grande do Sul.

Autor para Correspondência: Lúcia Mariano da Rocha Silla

Endereço: Ramiro Barcelos, 2350 sala 2235 Porto Alegre – RS - Brasil.

CEP 90035-903

Fone Fax: 55 51 21 01 83 17

e-mail: [email protected]

Fontes de Financiamento: FIPE/Hospital de Clínicas de Porto Alegre; Associação

dos Amigos da Hematologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre -

HEMOAMIGOS – HCPA.

Título Abreviado: Um estudo sobre Haplótipos β

em Porto Alegre

Resumo

Os haplótipos do agrupamento do gene da beta globina foram analisados

em 75 pacientes brasileiros com anemia falciforme atendidos no Centro de

Atenção Global a Pacientes Portadores de Hemoglobinopatias do Hospital de

Clínicas de Porto Alegre, no Rio Grande do Sul, Brasil, com o objetivo de avaliar

se existe correlação com a severidade da doença. A distribuição dos

cromossomos com os haplótipos ligados ao alelo β

(66% Bantu, 27% Benin e 7%

Outros) corroborou freqüências anteriormente relatadas em outras populações

brasileiras como uma maior proporção de cromossomos com o haplótipo Bantu,

seguido pelo Benin e Outros. A análise dos sítios polimórficos de restrição

utilizados (HindIII-γG, HindIII-γA e HincII-3’Ψβ) não nos permitiu identificar

cromossomos Senegal e Atípicos no grupo estudado. Quando correlacionados os

haplótipos com a gravidade da doença, níveis de Hb F e complicações cardíacas,

nenhuma associação estatisticamente significativa foi encontrada. As maiorias dos

estudados pertencem às classes sociais C (38,7%) e D (24%). Classes sociais

com acesso limitado a cuidados especializados, nas quais as manifestações da

doença são mais graves.

Palavras-chave: Hemoglobinopatias, Anemia falciforme, Haplótipos β

Hemoglobina S.

Introdução

A anemia falciforme é causada pela substituição de uma adenina (A) por

uma timina (T) no sexto códon do gene da β-globina, ocasionando a substituição

do ácido glutâmico pela valina (1). O resultado desta mutação é a produção da Hb

S, que polimeriza quando em baixa tensão de oxigênio e produz a forma

característica de foice dos eritrócitos, sendo esta a principal causa dos eventos

vaso-oclusivos da doença (2). Este importante aspecto patofisiológico da anemia

falciforme,é responsável por desencadear os episódios dolorosos e contribuir

muito para a morbidade e mortalidade da doença (3).

As hemoglobinopatias constituem uma das principais e mais freqüentes

doenças genéticas que acometem seres humanos e, dentre elas, a anemia

falciforme é a forma mais freqüente no Brasil. Apesar de sua prevalência ser maior

em pessoas da raça negra, estudos populacionais têm demonstrado a crescente

presença de hemoglobina S (Hb S) em indivíduos caucasóides. Na infância, a

anemia falciforme tem sido associada com alta morbidade e mortalidade devido a

crises de infarto ósseo, sepse bacteriana, sequestração esplênica e síndrome

torácica aguda, além de efeitos deletérios no desenvolvimento fisiológico e

intelectual (4).

Embora a Anemia falciforme seja uma doença monogênica, seu fenótipo é

altamente heterogêneo. Muitos dos fatores que contribuem para este

heterogeneidade são geneticamente determinados (haplótipos ligados ao alelo β

co-herança com alfa talassemia e níveis de Hb F), enquanto outros são de

natureza ambiental e até mesmo sócio-econômica (5,6). Pacientes que pertencem

a classes sociais mais baixas podem apresentar dificuldades no acesso a uma

alimentação adequada e na aderência aos protocolos de tratamento.

Segundo Chies e Nardi, a anemia falciforme deve ser considerada uma

doença inflamatória crônica, onde a gravidade das manifestações clínicas seriam

determinadas por um estado pró-inflamatório amplificado, contribuindo para os

episódios vaso-oclusivos, desempenhando assim, um importante papel da

patofisiologia da doença (7).

Um haplótipo do gene da globina β

é definido por uma associação de sítios

de clivagem reconhecidos por endonucleases de restrição, localizados ao longo do

agrupamento do gene da globina β

(8). Esse conjunto de polimorfismos ligados à

mutação β

têm fornecido importantes informações antropológicas a respeito da

origem múltipla da Hb S (9). Atualmente, existem evidências de que a mutação β

teve pelo menos cinco origens independentes relacionadas a diferentes haplótipos

: Senegal, Benin, República da África Central (CAR) ou Bantu, Camarões e

Indo-árabe (10,11). Segundo a literatura, a severidade clínica ou fenótipo da

anemia falciforme estaria relacionado aos haplótipos β

; estando os haplótipos

Senegal e Indo-Árabe associados a um quadro clínico moderado, Bantu a um

quadro clínico grave e, Benin e Camarão, intermediário. Os haplótipos Senegal e

Indo-Árabe apresentariam níveis mais elevados de Hemoglobina fetal (Hb F), com

uma média de 15-30%. Os níveis de Hb F nos outros haplótipos ficariam abaixo de

uma média de 5-15% (5). Powars et al (12) sugeriram que o haplótipo Bantu seria

um dos principais fatores de risco para uma forma clinicamente grave de anemia

falciforme. Entretanto, o possível papel dos haplótipos β

na determinação da

gravidade da doença é controverso, considerando que outros estudos sugerem

que os haplótipos têm pequena influência no quadro clínico e hematológico da

doença (9).

Milhões de pessoas são afetadas pela anemia falciforme em todo o mundo.

No Brasil, um país com grande diversidade ambiental e sócio-econômica, estima-

se que 5,0-6,0% da população seja portadora do alelo Hb S e que 700 a 1000

novos casos novos ocorram por ano (13). O Brasil, o maior país da América do

Sul, com aproximadamente 169 milhões de pessoas, de acordo com o Instituto

Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) (14), teve um grande influxo de

escravos da África e muitos grupos imigrantes diferentes (15). Por exemplo, até o

fim da 2ª Guerra Mundial, o Brasil recebeu quase 5 milhões de imigrantes

europeus, que se fixaram principalmente na região sul e sudeste formando uma

população de origem étnica heterogênea desigualmente distribuída neste país de

dimensões continentais (16).

Uma ferramenta muito útil que tem sido utilizada para investigar a origem

das populações Afro-descendentes nas Américas, é a análise de polimorfismos no

DNA ao longo do agrupamento do gene da β-globina, particularmente aqueles

ligados ao alelo β

(17).

Realizamos uma análise dos polimorfismos em uma população de doentes

atendidos no Centro de Atenção Global aos Pacientes com Anemia Falciforme do

Hospital de Clínicas de Porto Alegre, dando continuidade ao estudo de Wagner et

al que determinaram os haplótipos β

em 27 pacientes (54 cromossomos). Neste

estudo, o haplótipo Bantu foi o mais freqüente (72%), seguido do Benin (17%) e do

Senegal (2%) e aproximadamente 5% dos cromossomos analisados apresentaram

haplótipos Atípicos (18). Os autores não estudaram a correlação com o quadro

clínico dos pacientes. No nosso estudo, ampliamos a amostra para determinarmos

os haplótipos em 75 pacientes (150 cromossomos), e investigamos se neste

grupo, existe alguma correlação dos haplótipos encontrados com a severidade

clínica da doença, nível de Hb fetal, dados demográficos e o perfil sócio-

econômico.

Materiais e métodos

Desenhou-se um estudo transversal para avaliar a freqüência dos

haplótipos do alelo β

em 75 pacientes (39 do sexo masculino e 36 do sexo

feminino). Após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido dos

pacientes ou de seus representantes legais, uma amostra do sangue periférico foi

coletada em tubos Vacutainer

BD com K

EDTA (BD Diagnósticos, Franklin Lakes,

NJ, USA) e estocadas a 4°C até a manipulação. O DNA genômico foi isolado dos

leucócitos do sangue periférico, como previamente descrito (19) sendo estocado a

–20°C. O genótico SS foi confirmado pela análise de seqüências amplificadas do

DNA (20), e os haplótipos foram determinados, por PCR-RFLP, através da

amplificação dos seguintes sítios polimórficos de restrição, seguido de digestão

com a enzima apropriada: HindIII-γG, HindIII-γA e HincII-3’Ψβ. Os primers e

condições utilizados foram descritos por Sutton et al (21).

Definição dos critérios de severidade

Um curso clínico severo foi atribuído aos pacientes que apresentaram dois

ou mais episódios dolorosos por ano (≥2) (22,23). Foram também avaliados níveis

de Hemoglobina fetal, sexo, idade, ocorrência de complicações cardiovasculares

(cardiomegalia, vasculopatia e Acidente Vascular Cerebral - AVC) e perfil sócio-

econômico dos pacientes. Todas as avaliações foram baseadas no período

anterior ao início do tratamento com a Hidroxiuréia (HU). A HU é uma droga

citotóxica utilizada no tratamento de pacientes com doença falciforme devido, se

acredita (24) a sua capacidade de indução de síntese de Hb F, o que diminui

significativamente, na maioria dos pacientes, a ocorrência de complicações vaso-

oclusivas.

Perfil sócio-econômico

Utilizamos o Critério de Classificação Econômica Brasil (CCEB), critério

utilizado no Brasil desde 1996.

Métodos estatísticos

Inicialmente foi realizada a estatística descritiva, onde as variáveis

quantitativas foram descritas através de mediana e percentis 25-75 devido à

assimetria dos dados. A análise, das qualitativas foi descrita através de

freqüências absolutas e relativas. A associação entre as variáveis qualitativas foi

avaliada pelo Teste Qui-Quadrado de Pearson ou Exato de Fisher. A comparação

da idade e níveis de hemoglobina fetal com os haplótipos e complicações

cardíacas foi realizada através dos testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney,

respectivamente. O nível de significância adotado foi de 5% e as análises foram

realizadas no programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão

10.0.

RESULTADOS

Dos 75 pacientes analisados, 36 (48%) eram do sexo feminino e 39 (52%)

do sexo masculino. As idades variaram entre 2-62 anos com mediana de 18,5 (9,8-

28,5). Mais da metade dos pacientes (66,7%), apresentavam 2 ou mais crises

álgicas por ano, caracterizando um curso clínico severo e 44% dos pacientes

apresentaram alguma complicação cardiovascular. Quanto ao perfil sócio-

econômico avaliado, 38,7% dos pacientes pertencem à classe C e 24% à classe D.

Entre os 150 cromossomos β

analisados, 66% eram Bantu, 27% Benin e 7%

Outros. As principais combinações genotípicas são mostradas na Tabela 1. Não

observamos nenhuma associação estatisticamente significativa quando

correlacionamos os haplótipos encontrados com a taxa de dor, complicações

cardíacas, sexo, idade e níveis de Hb F, como mostra a tabela 2. A relação entre a

taxa de dor e o nível de Hb F é mostrada na tabela 3. Na população estudada, os

pacientes mais velhos, como era esperado, apresentaram uma maior ocorrência

de complicações cardíacas em relação aos mais jovens (P=0,013) (Figura 2).

Houve uma associação não significativa, porém limítrofe entre os haplótipos e o

nível de Hb F, sendo que os haplótipos chamados Outros tinham menores níveis

de Hb F que os demais (P=0,051) (Figura 1).

Tabela 1. Freqüência da distribuição dos haplótipos β

na população estudada

Haplótipos N %

Bantu/Bantu 35 46,7

Bantu/Benin 22 29,3

Benin/Benin 7 9,3

Bantu/Outros 6 8,0

Benin/Outros 5 6,7

Total 75 100

n = números de indivíduos

Tabela 2 – Caracterização da amostra conforme o haplótipo

Haplótipos

Variáveis

Bantu/Bantu

(n=35)

Bantu/Benin

(n=22)

Benin/Benin

(n=7)

Outros*

(n=11)

Taxa de dor – n (%)

≤ 1**

9 (25,7) 10 (45,5) 2 (28,6) 4 (36,4)

≥ 2

26 (74,3) 12 (54,5) 5 (71,4) 7 (63,6) 0,478

Nível de Hb F – n (%)

≤ 2***

3 (9,7) 3 (15,8) 1 (14,3) 3 (27,3)

> 2 28 (90,3) 16 (84,2) 6 (85,7) 8 (72,7) 0,566

Complicações Cardíacas – n (%)

Sim 13 (37,1) 10 (45,5) 4 (57,1) 6 (54,5)

Não 22 (62,9) 12 (54,5) 3 (42,9) 5 (45,5) 0,643

n= número de indivíduos *Benin/Outros e Bantu/Outros

**episódios dolorosos/ano *** g/dl

Tabela 3 – Taxa de dor (p/ano) e o nível de Hb F

Hb F n(%) P

Taxa de dor

(crises p/ano)

2g/dl > 2g/dl

≤ 1

3 (13) 20 (87)

≥ 2

7 (15,6) 38 (84,4) 1,000

n = número de indivíduos

Haplótipo

Outros tiposBen/BenBan/BanBan/Ben

Taxa de hemoglobina fetal (em mediana)

Figura 1: Taxa de Hemoglobina Fetal e Haplótipo

Complicações cardíacas

NãoSim

Idade na avaliação da hemoglobina fetal

Figura 2: Idade e Complicações Cardíacas

DISCUSSÃO

A freqüência dos haplótipos β

foi determinada a partir de inferência

baseada em três sítios polimórficos de restrição (Hind III γG, Hind III γA e HincII 3’

Ψβ) em 75 pacientes (150 cromossomos) com anemia falciforme acompanhados

pelo Centro de Atenção Global aos pacientes Portadores de Hemoglobinopatias do

P= 0,051

P= 0,013

Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Também avaliamos a correlação entre os

haplótipos encontrados com a severidade clínica da doença, níveis de Hb fetal,

complicações cardíacas, idade, sexo e perfil sócio-econômico. Na amostra de

pacientes estudada, houve uma predominância de cromossomos com o haplótipo

Bantu (66%), seguido do Benin (27%) e Outros (7%). Em 1996, Wagner et al

estabeleceram a freqüência dos haplótipos β

em 27 pacientes (54 cromossomos)

com anemia falciforme do mesmo Hospital e encontraram 72% de cromossomos

do tipo Bantu, 17% do tipo Benin, 2% do tipo Senegal e aproximadamente 5% de

cromossomos Atípicos (18). Os autores não estudaram qualquer variável que

pudesse avaliar a existência de correlação dos haplótipos encontrados com a

gravidade clínica da doença. Em nosso estudo, onde um maior número de

pacientes foram analisados, não conseguimos identificar cromossomos com o

haplótipo Senegal. A análise de apenas três sítios polimórficos de restrição pode

ter sido insuficiente para que pudéssemos avaliar dentro do grupo que chamamos

de Outros, quais seriam cromossomos Atípicos ou possivelmente Senegal.

Nossos dados confirmam a prevalência do haplótipo Bantu seguido do

Benin encontrada por Wagner et al, na região Sul do Brasil, bem como os dados

encontrados em outras regiões do Brasil (25), mas diferem dos dados dos EUA e

Jamaica onde o Haplótipo do tipo Benin é mais comum entre os pacientes com

anemia falciforme, resultado da preferência pelo tráfico de Africanos do meio-

oeste para estas regiões durante o comércio escravo Atlântico Britânico (26). Esta

diferença observada é devido à ancestralidade africana de nossos pacientes. A

origem étnica da população brasileira é heterogênea e desigualmente distribuída.

Aproximadamente 2,5-4,0 milhões de Africanos foram trazidos como escravos para

o Brasil e distribuídos por todas as regiões do país (27).

A exploração do ouro em Minas Gerais, no século 18, teve importância

fundamental no desenvolvimento das charqueadas gaúchas, que se transformaram

na fonte abastecedora de carne para a região aurífera. A partir daí o escravismo

foi mais expressivamente implantado no Rio Grande do Sul (28).

A fundação do presídio (fortificação) de Rio Grande, em 1737, transformou

esta localidade em um grande centro receptor de escravos, fazendo parte também

do tráfico interprovincial. Vinham, em sua grande maioria, do Rio de janeiro,

embora houvesse um contingente oriundo da Bahia, Pernambuco e Santa

Catarina. Estes portos recebiam escravos em sua maioria oriundos de Angola,

Benguela e Congo, os quais pertenciam, portanto ao tronco lingüístico Bantu.

Embora os registros de escravos apontem a nacionalidade vinculada ao porto em

que o escravo era embarcado na África, podemos afirmar que, a maioria originava-

se das regiões onde hoje se localizam o Zaire e Angola. Consequentemente, o

escravo gaúcho, também, era procedente destas regiões da África, pelo menos em

maior número (28,29). Estes registros históricos parecem corroborar nossos dados

quanto a maior prevalência do haplótipo Bantu entre os pacientes com anemia

falciforme na região Sul do Brasil.

A maioria dos cromossomos com o gene β

possui um dos cinco tipos de

haplótipos comuns, embora em cada grande série de pacientes com anemia

falciforme há uma minoria de cromossomos (5-10%) associados com haplótipos

menos comuns, reconhecidos como atípicos (30). Como citado anteriormente, não

identificamos entre o percentual de 7% do que chamamos Outros haplótipos, quais

os que seriam Atípicos. Portanto, não pudemos estabelecer se a freqüência de

haplótipos atípicos de nosso estudo está de acordo com a encontrada por Wagner

et al e com as encontradas em outras regiões do Brasil (18,25).

Os pacientes analisados neste estudo são indivíduos Afro-Brasileiros ou

miscigenados. Esta classificação foi baseada na aparência física (cor da pele).

Estudos prévios indicam que a cor da pele e outros traços fenotípicos podem ser

pobres preditores de ancestralidade genômica (31). De acordo com o Instituto

Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) no Brasil, 53, 6 e 38% das pessoas

são classificadas como brancas, negras e pardas, respectivamente. No Rio

Grande do Sul (aproximadamente 10 milhões de habitantes), os números são 87,5,

5 e 7%, respectivamente (14). Segundo Bortolini e Pena, aproximadamente 148

milhões de Brasileiros apresentam mais que 10% de ancestralidade genômica

nuclear Africana e pelo menos 89 milhões de pessoas possuem linhagem de DNA

mitocondrial de origem Africana (32).

Estes dados demonstram a extensão da miscigenação na população

brasileira, caracterizando uma peculiar heterogeneidade genética.

No presente estudo, 50 (66,7%) pacientes apresentaram taxa de dor ≥ 2

crises por ano caracterizando um curso clínico grave. Destes, 26 (74,3%)

possuíam o genótipo Bantu/Bantu, o que não indica uma maior morbidade

comparado aos outros haplótipos como relatam outros estudos (33). Como

mostrado na tabela 2, a distribuição da freqüência da taxa de dor ≥ 2 entre os

haplótipos foi bastante homogênea, sugerindo ausência de relação entre a

gravidade do curso clínico da doença com os haplótipos encontrados. A mesma

homogeneidade pode ser observada quando analisamos os haplótipos com os

níveis de Hb F acima de 2%. Considerando que o grupo de pacientes estudados

pertence a um centro de referência para acompanhamento de pacientes com

anemia falciforme, seria esperada uma maior prevalência de pacientes com um

curso clínico de maior severidade.

Apesar da avaliação da gravidade do quadro clínico da anemia falciforme

ser realizada através do número de crises de dor por ano, como definido pela

literatura mundial, achamos que seria interessante também avaliar as freqüências

de complicações tais como priapismo, sídrome torácica aguda, necrose asséptica

da cabeça do fêmur, úlcera de perna, AVC, cardiopatia e anemia severa, e desta

maneira averiguar se a característica doença grave definida por duas ou mais

crises de dor por ano corresponde a uma maior morbidade da doença.

Para reforçarmos a análise de gravidade da doença, avaliamos a ocorrência

de complicações cardíacas onde agrupamos, devido à baixa incidência nesta

amostra vasculopatia, AVC e cardiomegalia como complicação cardio-vascular.

Pacientes Bantu/Outro, Benin/Outro e homozigotos para o haplótipo Benin

parecem ter maior freqüência de complicações cardiovasculares, mas sem

significância estatística (Tabela 2). Como era de se esperar, verificamos uma

maior ocorrência de complicações cardiovasculares entre os pacientes mais

velhos (P=0,013) (Figura 2).

É de conhecimento geral que o nível de Hb F é um dos mais importantes

modificadores da expressão clínica da anemia falciforme. O nível de Hb F

influencia as características clínicas em crianças e adultos. Um nível elevado de

Hb F tem sido associado significativamente a menor ocorrência de eventos vaso-

oclusivos dolorosos, episódios de síndrome torácica aguda e reduzida mortalidade

(24). Nós não encontramos associação entre os níveis de Hb F e número de crises

de dor neste estudo como mostra a Tabela 3.

Interessantes, são os níveis elevados de Hb F neste grupo de pacientes

com mediana de 4,73 (3,0-7,0). 28 (90.3%) pacientes com o genótipo Bantu/Bantu

apresentaram níveis de Hb F maiores que 2%. Uma associação não significativa,

porém limítrofe, indicou que os haplótipos que chamamos Outros apresentaram

um menor nível de Hb F comparado aos demais haplótipos (P=0,051) (Figura 1).

Segundo Steinberg et al 1997, os níveis de Hb fetal variam muito entre pacientes

com anemia falciforme (23). Gonçalves et al, encontraram em seu estudo uma

concentração elevada de Hb F entre indivíduos com o genótipo Bantu/Bantu, que

normalmente apresentam um valor médio abaixo de 5%(26, 34). Em um estudo

onde foi avaliada a correlação entre as manifestações clínicas em pacientes

Libaneses com anemia falciforme e os haplótipos β

, surpreendentemente, os

níveis mais elevados de Hb F estavam associados aos casos clínicos mais graves.

Quando os valores de Hb F foram correlacionados às crises de dor, os casos mais

graves tinham valores elevados de Hb F (2).

Sabe-se que os níveis de Hb F na anemia falciforme pode ser influenciado

pelo sexo, idade, número de genes da α-globina, haplótipos β

e pelo locus de

produção de células F ligado ao cromossomo X, que regula a produção de

eritrócitos contendo Hb F (células F) (35).

Chang et al avaliara o locus da produção de células F ligado ao

cromossomo X e demonstraram que este contribuiu com 40% da variação total dos

níveis de Hb F enquanto o haplótipo do gene β-globina foi associado com 14% da

variação de Hb F restante. Quando a produção de células F foi removida,

aproximadamente metade da variação dos níveis de Hb F permaneciam

inexplicáveis, demostrando a necessidade de mais estudos (35).

A presença de níveis de Hb F elevados no genótipo Bantu/Bantu, por outro

lado, pode ser explicada pela variação na seqüência de regiões regulatórias das

regiões 5’ HS2 e flanqueadora 5’ da expressão do gene γ-globina (36).

Recentemente, alguns autores como Chies e Nardi 2001, têm abordado a

anemia falciforme como uma doença inflamatória crônica, onde a gravidade do

quadro clínico seria determinada por um estado pró-inflamatório amplificado,

contribuindo para os episódios vaso-oclusivos. A primeira indicação da existência

de uma condição inflamatória é a presença de leucocitose. Pacientes propensos a

uma maior resposta imune do tipo Th1, relacionada com inflamação, apresentam

maior morbidade que aqueles Th2, envolvida com reações alérgicas e supressão

da ativação de macrófagos (7). Fatores como mediadores inflamatórios que ativam

as células endoteliais e, portanto, contribuem para interações entre os eritrócitos,

endotélio, plaquetas, leucócitos e fatores do plasma, acentuam a adesão

desencadeando episódios vaso-oclusivos (3,37). Esses mediadores inflamatórios

induzem a ativação do canal de Gardos, o qual pode explicar a associação entre

inflamação, vaso-oclusão e hemólise aumentada, algumas vezes vista durante

quadros infecciosos (38).

Além do efeito mielossupressor, representado pela diminuição de

neutrófilos, e da habilidade para induzir a síntese de hemoglobina fetal, a HU

parece reduzir a adesão entre os eritrócitos falcizados e as células endoteliais

modulando a ativação destas últimas (39). Mais estudos sugere que a redução nos

neutrófilos, monócitos e reticulócitos podem também ser importante. Os neutrófilos

de pacientes com episódios dolorosos parecem aumentar a aderência de células

em cultura às células endoteliais. Pela redução de neutrófilos no sangue, a HU

pode diminuir a ocorrência e a gravidade de eventos vaso-oclusivos. A adesão

entre as células endoteliais e os eritrócitos falcizados diminui antes que um

aumento mensurável nos níveis de Hb F ocorra, sugerindo um efeito direto sobre a

membrana celular ou sobre as propriedades adesivas das células endoteliais. A

HU pode tornar as células endoteliais um local menos atrativo para a aderência

dos eritrócitos falcizados (3).

As variáveis consideradas neste estudo são relativas ao período pré-

tratamento com a HU. Seria interessante sabermos se estes pacientes que

apresentam elevados níveis de Hb F e curso clínico grave tiveram alguma melhora

com a HU.

Chies et al observaram que uma paciente portadora de doença falciforme

tornou-se assintomática após ser submetida ao transplante renal. Os autores

especularam que este achado poderia ter relação com a imunossupressão mantida

nestes pacientes (40). Considerando os dados apresentados e a revisão da

literatura sugerimos que, talvez, e na ausência do baço, a imunidade do portador

de AF se desenvolva com o predomínio da resposta inflamatória. Tal resposta é

variável e leva a conseqüências imprevisíveis, sobretudo no indivíduo exposto a

uma enorme gama de agentes infecciosos como nos que convivem em ambientes

sem saneamento básico ou em condições precárias. Ainda, pode-se especular que

a magnitude da resposta inflamatória, dependendo do ambiente onde se encontra

o paciente, pode sobrepujar a influência do haplótipo e/ou nível da Hb fetal nas

características clínicas da doença.

Em relação aos critérios sócio-econômicos analisados, a predominância de

pacientes pertencentes às classes sociais C e D, deve ser considerada antes de

uma possível indicação para Transplante de Células Tronco Hematopoéticas, pois

segundo Fischer, pacientes pertencentes a estas classes sociais apresentam

maior risco de morbi-mortalidade (41).

CONCLUSÃO

Estes dados corroboram a prevalência de haplótipos Bantu entre Afro-

Brasileiros, consistentes com a origem dos escravos Africanos trazidos para o

Brasil durante o comércio escravo. Nossos resultados não evidenciaram qualquer

relação entre os haplótipos encontrados e a gravidade clínica da anemia

falciforme neste grupo de pacientes, indicando que mais pesquisas são

necessárias incluindo outros marcadores de severidade na anemia falciforme, com

o objetivo de análise deste aspecto.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Meide Daniele Urnau, Valéria Doliwa Wislocki, Jóice

Merzoni, Vanessa de Souza Valim e Rafael Teixeira de Souza pela ajuda na coleta

de dados e amostras. Á Ceres Oliveira pelo auxílio com as análises estatísticas.

Este trabalho recebeu o apoio do Fundo de Incentivo à Pesquisa do Hospital de

Clínicas de Porto Alegre (FIPE-HCPA), da Associação dos Amigos da Hematologia

do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HEMOAMIGOS-HCPA) e do Laboratório

de Imunogenética (Departamento de Genética –UFRGS).

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Cellular and Genetic Modifiers. Seminars in Hematology 2001: 38:299-306.

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Cluster Hapotypes Predominates

Among Brazilian Blacks. American Journal of Physical Anthropology 1992:

88: 295-298.

7. Chies JAB, Nardi NB. Sickle cell disease: a chronic inflammatory condition.

Medical Hypotheses 2001: 57: 46-50.

8 Steinberg MH, Nagel RL, Lawrence C, et al. β-Globin Gene Haplotype in Hb

SC Disease. American Journal Hematology 1996: 52:189-191.

9. Figueiredo MS, Kerbauy J, Gonçalves MS, et al. Effect of α-Thalassemia and

β-Globin Gene Cluster Haplotypes on the Hematological and Clinical Features

of Sickle-Cell Anemia in Brazil. American Journal of Hematology 1996: 53:

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10. Pagnier J, Mears JG, Dunda-Belkhodja O, et al. Evidence for the multicentric

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1984: 81: 1771-73.

11. Magaña MT, Ongay Z, Tagle J, et al. Analysis of β

and β

Genes in a

Mexican Population with African Roots. Blood cells, Molecules, and diseases

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12. Powars D, Chan LS, Schoroeder WA. The Variable Expression of Sickle Cell

Disease is Genetically Determined. Seminars in Hematology 1990: 27: 360-

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13. Lyra IM, Gonçalves MS, Pellegrinel JÁ, et al. Clinical, hematological, and

molecular characterization of sickle cell anemia pediatric patients from two

different cities in Brazil. Cadernos de Saúde Pública 2005: 21:1-6.

14. IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Censo Demográfico

2000. Características gerais da população. Resultado da amostra.Disponível:

http:/www.ibge.gov.br/home/estatística/população/censo2000/população/cens

o2000_população.pdf (acessado em janeiro 2006).

15. Gonçalves MS, Nechtman JF, Figueiredo MS, et al. Sickle Cell Disease in a

Brazilian Population from São Paulo: A Study of the β

Haplotypes. Hum

Hered 1994: 44: 322-327.

16. Zago MA, Silva Jr WA, Franco RF. Hemoglobinopathies and other hereditary

hematological diseases in the Brazilian population. Journal of the Brazilian

Association for the Advancement of Science 1999: 51: 226-234.

17. Pante-De-Souza G, Mousinho-Ribeiro RC, Dos Santos EJ, Guerreiro JF.

Beta-globin haplotype analysis in Afro-Brazilians from the Amazon region:

evidence for a significant gene flow from Atlantic West Africa. American

Journal of Human Biology 1999: 26: 365-373.

18. Wagner SC, Friedrisch JR, Job F, Hutz MH. Caracterização molecular da

anemia falciforme em pacientes de Porto Alegre. Rev Bras Genet (supl)

1996: 19: 244.

19. Lahiri DK, Nurnberger JI Jr. A rapid non-enzymatic method for the

preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Nucleic Acids Res

1991: 19:5444.

20. Huang SZ, Sheng M, Zhao JQ et al. Detection os sickle cell gene by analysis

of amplified DNA sequences. Yi Chuan Xue Bao 1989: 16: 475-82.

21. Sutton Millicent, Bouhassira EE, Nagel RL. Polymerase Chain Reaction

Amplification Applied to the Determination of β-like Globin Gene Cluster

Haplotypes. American Journal of Hematology 1989: 32: 66-69.

22. Charache S, Terrin ML, Moore RD, et al. Effect of Hydroxyurea on the

Frequency of Painful Crises in Sickle Cell Anemia. N Engl J Med 1995:

332:1317-22.

23. Kinney TR, Helms RW, O’Branski EE, et al. Safety of hydroxyurea in children

with sickle cell anemia: results of the HUG-KIDS study, a phase I/II trial.

Blood 1999: 94:1550-1554.

24. Ware RE, Eggleston B, Redding-Lallinger, et al. Predictors of fetal

hemoglobin response in children with sickle cell anemia receiving

hydroxyurea therapy. Blood 2002: 99: 10-14.

25. Cardoso GL, Guerreiro JF. The African gene flow to North Brazil as revealed

by HBB*S gene haplotype analysis. Am J Hum Biol 2006:18:93-8.

26. Gonçalves MS, Bomfim GC, Maciel E, Et al. β

-Hplotypes in sickle cell

anemia patients from Salvador, Bahia, Northeastern, Brazil. Braz J Med and

Biol Research 2003:36:1283-88.

27. Curtain PD. The Slave Atlantic Trade: A Census. University of Wisconsin

Press, Madison, WI, USA.

28. Faustino GG. O negro gaúcho e suas origens in Vera TRIUMPHO (org) Rio

Grande do Sul: Aspectos da Negritude. 1991 - Porto Alegre: Martins Livreiro-

Editor.

29 Projeto Cultural: O Povo Negro no Sul. Associação Riograndense de

Imprensa. Pág 12.

30 Zago MA, Silva Jr WA, Dalle B, et al. Atypical β

Haplotypes are Generated

by Diverse Genettic Mechanisms. American Journal of Hematology 2000: 63:

79-84.

31 Parra FC, Amado RC, Lambertucci JR, et al. Color and genomic ancestry in

Brazilians. Proc Natl Acad Sci USA 2003:100:177-82.

32 Bortolini MC, Pena SD, Pode a genética definir quem pode se beneficiar das

cotas universitárias e demais ações afirmativas? Estudos Avançados – USP

2004: 18: 1-22.

33 Bakanay SM, Dainer E, Clair B, et al. Mortality in sickle cell patients on

hydroxyurea therapy. Blood 2005:105: 545-47.

34 Powars DR. β

-gene cluster haplotypes in sickle cell anemia: clinical and

hematologic features. Hematology/Oncology Clinics of North America

1991:5:475-493.

35 Chang YP, Maier-Redelsperger M, Smith KD, et al. The relative importance of

the X-linked FCP locus and beta-globin haplotypes in determining

haemoglobin F levels: a study of SS patients homozygous for beta S

haplotypes. British Journal of Haematology 1997:96:806-14.

36 Adekile AD, Dimovski AJ, Oner C, et al. Haplotype specific sequence

variations in the locus control region (5’ hypersensitive sites 2, 3, 4) of beta S

chromossomes. Hemoglobin 1993:17:475-78.

37 Vichinsky E. New therapies in sickle cell disease. Lancet 2002:360:629-31.

38 Bunn HF. Pathogenesis and tratment of sickle cell disease. N E J of Medicine

1997:337:762-69.

39 Gulbis B, Habermann D, Dufour D, et al. Hydroxyurea for sickle cell disease

in children and for prevention of cerebrovascular events: the Belgian

experience. Blood 2005:105:2685-90.

40 Chies JAB, Dresch C, Silla LMR, et al. Immunosupressive therapy for kidney

transplant prevents vaso-oclusive crisis in a haemoglobin SC disease patient.

Medical Hypotheses 2005:64:174-176.

41 Fischer GB. Relação entre morbi-mortalidade do transplante alogênico de

medula óssea e perfil econômico dos receptores. Porto Alegre – UFRGS,

2004. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Rio Grande do Sul,

Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências

Médicas, 2004.

A N E X O S

ANEXO A

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

ESTUDO DA IDENTIFICAÇÃO DE HAPLÓTIPOS E A RELAÇÃO

COM MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM

ANEMIA FALCIFORME

Responsáveis: Dra. Lúcia Mariano da Rocha Silla

Maria Aparecida Lima da Silva

Consentimento Pós-Informação

O presente projeto de pesquisa tem como objetivo identificar a presença

de características herdadas de seus pais e antepassados, que possam nos

trazer conhecimentos sobre a anemia falciforme no estado do Rio Grande do

Sul. Descendentes dos povos africanos vieram de diferentes regiões da África e

nós sabemos que a doença se manifesta diferentemente de acordo com a

região de onde o paciente descende, sobretudo em termos de gravidade. Este

trabalho de pesquisa pretende estudar estas características no sentido de obter

informações sobre a doença e caracterizar a anemia falciforme de um grupo no

Sul do Brasil. A gravidade de cada caso será correlacionada com o grupo de

características herdadas, com vistas a avaliar o benefício potencial de um

programa de detecção dos portadores, seguido de aconselhamento genético e

diagnóstico pré-natal.

Os dados necessários para a realização do projeto serão obtidos através

de entrevistas com as famílias, análise dos prontuários e uma coleta de

aproximadamente duas colheres de sopa de sangue da veia. Este procedimento

provoca um desconforto semelhante ao de uma coleta de sangue para exames

100

de rotina, ou seja, a dor da picada da agulha e um pequeno hematoma (cor

roxa) na pele.

O material coletado será utilizado para caracterização de haplótipos e

suas variações, para fins de pesquisa de polimorfismos (características

herdadas de seus pais e antepassados), sendo garantido o anonimato das

informações obtidas, reservando ao paciente ou familiares acesso as mesmas.

Pelo presente Consentimento Pós-informação, declaro que fui informado,

de forma clara e detalhada, sobre o presente Projeto de Pesquisa. Os

pesquisadores responsáveis pelo projeto são a Dra. Lúcia Mariano da Rocha

Silla e a bióloga Maria Aparecida Lima da Silva ( tel.3316 83 17 ou 99 65 06

06).

Fui igualmente informado da garantia de receber resposta ou

esclarecimento sobre a pesquisa a ser realizada, da liberdade de não participar

do estudo, da segurança, do anonimato e do caracter confidencial das

informações.

Autorizo o armazenamento do material coletado (DNA) para pesquisas

futuras referentes a caracterização de haplótipos e suas possíveis variações

polimórficas:

( ) S I M ( ) N Ã O

Data: ________________________________________________________

Nome do responsável legal:_______________________________________

Assinatura do responsável legal:___________________________________

Pesquisador responsável:_________________________________________

101

ANEXO B

PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA

1. Transferir 5ml de sangue com EDTA, para um tubo de centrífuga de 15ml

2. Adicionar 5 ml de tampão TKM 1 (10 mM Tris HCl pH7,6, 10 mM KCl,

10 mM MgCl

, 2mM EDTA).

2. Adicionar 125ul de Nonidet P-40 (NP-40 Sigma). Misturar bem por

inversão várias vezes.

3. Centrifugar a 2200 rpm por 10 min a temperatura ambiente.

4. Descartar o sobrenadante cuidadosamente. Os núcleos celulares estão

aderidos nas paredes do tubo.

5. Lavar o precipitado com 5ml de TKM 1.

6. Centrifugar a 2200 rpm por 10 min a temperatura ambiente.

7. Descartar o sobrenadante cuidadosamente.

8. Ressuspender o precipitado em 800ul de TKM 2 ( 10 mM Tris HCl pH 7,6,

10mM KCl, 10 mM MgCl

, 2mM EDTA, 0,4M NaCl).

9. Adiconar 10ul de SDS 10%. Misturar por pipetação por várias vezes.

10. Incubar por 10 min a 55°C.

11. Adiconar 300ul de NaCl 6M. Misturar bem.

12. Centrifugar a 12000 rpm por 5 min.

13. Transferir o sobrenadante para outro tubo com aproximadamente 2ml de

etanol absoluto (em temperatura ambiente) e descartar o precipitado de

proteínas. Inverter o tubo várias vezes até o DNA precipitar.

14. Retirar o DNA precipitado com pipeta pasteur de vidro e colocar em

eppendorf contendo 1 ml de etanol 70% gelado.

15. Centrifugar a 12000 rpm por 5 min a 4°C.

102

16. Desprezar o sobrenadante. Deixar o eppendorf enborcado sobre o papel

toalha para evaporar todo o álcool.

17. Ressuspender em 300ul de água estéril e estocar em freezer.

103

ANEXO C

104

ANEXO D

PESQUISA DE CLASSE ECONÔMICA

Pesquisa de Classe Econômica – de acordo

com IBGE

Posse de itens

(marque a quantidade de itens que você

possui)

1. Televisão em cores.

( ) Não tem ( )Três

( ) Uma ( )Quatro

( ) Duas ( ) mais de quatro

2. Banheiro

( ) Não tem ( x ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

3. Máquina de Lavar

( ) Não tem ( ) Três

( ) Uma ( ) Quatro

( ) Duas ( ) mais de quatro

4. Empregada mensalista

( ) Não tem ( ) Três

( ) Uma ( ) Quatro

( ) Duas ( ) mais de quatro

5. Rádio

( ) Não tem ( ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

6. Automóvel

( ) Não tem ( ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

7. Aspirador de pó

( ) Não tem ( ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

8. Videocassete e/ou DVD

( ) Não tem ( ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

9. Geladeira

( ) Não tem ( ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

10. Geladeira de duas partes

( ) Não tem ( ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

11. Freezer ( ou geladeira duplex)

( ) Não tem ( ) Três

( ) Um ( ) Quatro

( ) Dois ( ) mais de quatro

Grau de Instrução do Chefe de família

( ) Analfabeto / primário incompleto

( ) Primário completo/ ginásio incompleto

( ) Ginásio completo/ colegial incompleto

( ) Colegial completo / superior incompleto

( ) superior completo

105

Antigo Anterior Novo

Primário 1° grau até 4°

série

Ensino

Fundamental até

4° série

Ginásio 1° grau da 4° até

8° série

Ensino

Fundamental da

4° até 8° série

Colegial 2° grau Ensino Médio

Superior Superior Superior

Classificação de classe por pontos e renda familiar

Classe Pontos Renda Familiar

A1 30 a 34 pontos 7.793

A2 25 a 29 pontos 4.648

B1 21 a 24 pontos 2.804

B2 17 a 20 pontos 1.669

C 11 a 16 pontos 927

D 6 a 10 pontos 424

E 0 a 5 pontos 207

SISTEMA DE PONTOS

TEM

Posse de Itens Não tem 1 2 3 4 ou

Televisão em cores 0 2 3 4 5

Rádio 0 1 2 3 4

Banheiro 0 2 3 4 4

Automóvel 0 2 4 5 5

Empregada mensalista 0 2 4 4 4

Aspirador de pó 0 1 1 1 1

Máquina de Lavar 0 1 1 1 1

Videocassete e/ou DVD 0 2 2 2 2

Geladeira 0 2 2 2 2

Freezer ( aparelho

independente ou parte da

geladeira duplex)

0 1 1 1 1

Grau de Instrução do Chefe de família

Analfabeto / Primário incompleto 0

Primário completo/ Ginasial incompleto 1

Ginasial completo/ Colegial incompleto 2

Colegial completo/Superior incompleto 3

Superior completo 5

CORTES DO CRITÉRIO BRASIL

Classe PONTOS TOTAL BRASIL (%)

A1 30-34 1

A2 25-29 5

B1 21-24 9

B2 17-20 14

C 11-16 36

D 6 – 10 31

E 0 - 5 4

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