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Renata Cristina Picão
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA ACURÁCIA DE
DIFERENTES TESTES FENOTÍPICOS PARA A DETECÇÃO
DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE
METALO-β-LACTAMASES
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina para obtenção do Título
de Mestre em Ciências.
São Paulo
2007
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Renata Cristina Picão
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA ACURÁCIA DE
DIFERENTES TESTES FENOTÍPICOS PARA A DETECÇÃO
DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE
METALO-β-LACTAMASES
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina para obtenção do Título de
Mestre em Ciências pelo programa de
pós graduação em Infectologia.
Orientador: Ana Cristina Gales
São Paulo
2007
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Picão, Renata Cristina
AvaliaçãoComparativadaAcuráciadeDiferentesTestesFenotípicosparaaDetecção
deAmostrasProdutorasdeMetalo‐β‐Lactamases./RenataCristinaPicão‐‐SãoPaulo,2007.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação Ciências Básicas em Infectologia.
Título em Inglês: Comparative evaluation of the accuracy of different phenotypic
tests to detect metallo-β-lactamase-producing strains.
1.Metalo-β-Lactamases. 2. Detecção fenotípica 3.Disco combinado. 4. Disco
aproximação
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
Departamento de Medicina
Disciplina de Infectologia
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Emília Inoue Sato
Chefe do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Jair de Jesus Mari
iv
Renata Cristina Picão
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA ACURÁCIA DE
DIFERENTES TESTES FENOTÍPICOS PARA A DETECÇÃO
DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE
METALO-β-LACTAMASES
Presidente da banca:
Prof. Dr. Ana Cristina Gales
Banca examinadora:
Titular: Prof. Dr. Carlos Emílio Levy
Titular: Prof. Dr. Caio Marcio Mendes Figueiredo
Titular: Prof. Dr. Antonia Maria de Oliveira Machado
Suplente: Prof. Dr. Marinês Dalla Valle Martino
v
Dedico este trabalho aos meus pais que me presentearam com muito amor,
carinho e apoio incondicional, em todos os momentos da minha vida.
v
vi
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Prof. Dr. Ana Cristina Gales, por dividir comigo suas
experiências e por ter reconhecido minha dedicação. Muito obrigada por ter confiado
em mim e me proprocionado tamanha realização pessoal e profissional.
À toda minha família que me oferece apoio e carinho inestimáveis, especialmente
meus pais Flademir e Maria Lúcia, minha irmã Maira, meu cunhado Hugo e meu
sobrinho Victor Hugo.
Às amigas Eloiza e Adriana, que me ajudaram muito na realização deste trabalho,
que não foi simples, porém vocês o tornaram muito mais fácil. Obrigada por tudo!
Aos amigos e tutores Mariana Castanheira e Rodrigo Elisandro Mendes, por todos
os adoráveis momentos de amizade e aprendizado vividos durante este curto tempo
de convivência.
À Soraya, por todo incentivo, suporte, disponibilidade e atenção. Não consigo
imaginar a finalização deste trabalho sem sua participação, muito obrigada!
À minha grande amiga Tharcila, pelo incondicional companheirismo e por acreditar
tanto na minha vitória. Tharci, você é muito especial!
Às amigas Laura e Débora, por me proporcionarem tantos momentos alegres em
nossa casa, e fora dela também. Obrigada por vocês existirem!
Ao meu grande companheiro Frank, que apesar de ter entrado em minha vida
recentemente, teve sempre muita paciência e um arsenal de doces palavras para
me acalmar nos momentos difíceis. Você me faz enxergar a vida de uma forma
muito mais bonita!
Aos meus grandes amigos Fernando e Danilo que, juntamente com a Família
Ritorna, me forneceram numerosos e agradáveis momentos de trabalho
extralaboratorial.
Ao Paulo e Rodrigo, pelo carinho com o qual dedicaram seu tempo para a criteriosa
revisão deste manuscrito.
Aos amigos do Laboratório ALERTA, Anderson, Tarcísio, Paula, Lorena, Andréia e
Ana Paula, pelo apoio moral, técnico, científico, emocional, e também por tantos
momentos agradáveis que fizeram do mestrado uma etapa muito mais prazerosa.
vii
A todos os amigos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica, Aline,
Andreinha, Fernanda Inowe, Fernanda Marques, Gabriela, Gustavo, Hamilton,
Jacira, Jussimara, Kelly, Martha, Neide, Rosana e Thaís por todo apoio e também
pelas alegres conversas nos momentos de descontração.
Aos professores e funcionários da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias
da Escola Paulista de Medicina – UNIFESP e do Instituto Paulista de Doenças
Infecciosas e Parasitárias, especialmente ao Charlys, pela ajuda e apoio em todos
os momentos necessários.
Esse trabalho foi realizado com auxílio técnico e científico da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, processo número 2006/07197-0)
viii
SUMÁRIO
1 Introdução ............................................................................................................... 1
1.1 Objetivos ............................................................................................................ 3
1.1.1 Objetivo principal ......................................................................................... 3
1.1.2 Objetivos específicos .................................................................................. 3
2 Revisão da Literatura ............................................................................................. 4
2.1 Metalo-β-Lactamases (MBL) .............................................................................. 4
2.2 Epidemiologia das MBLs no Brasil .................................................................... 7
2.3 Contexto genético e a eficiência da disseminação das MBLs móveis ............... 8
2.4 Detecção laboratorial da produção de MBL ..................................................... 10
2.5 Aplicação da curva ROC como ferramenta estatística para a avaliação de
testes diagnósticos ................................................................................................ 16
3 Materiais e Métodos ............................................................................................. 21
3.1 Amostras bacterianas ...................................................................................... 21
3.1.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 24
3.2 Seleção da concentração ideal de inibidor de MBL para os testes de detecção
fenotípica de MBL .................................................................................................. 25
3.3 Avaliação da ação bactericida de diferentes quantidades de IMBL ................. 26
3.4 Avaliação da hidrólise dos β-lactâmicos, ceftazidima e imipenem, pelos IMBL
............................................................................................................................... 28
3.5 Detecção fenotípica da produção de MBL ....................................................... 28
3.5.1 Disco Aproximação para a detecção de amostras produtoras de MBL ..... 29
3.5.2 Disco combinado para a detecção de amostras produtoras de MBL ........ 30
3.5.2.1 Padronização da metodologia para o preparo dos discos
combinados ....................................................................................................... 30
3.5.2.2 Disco combinado para a detecção de MBL e análise dos resultados 32
3.5.3 Análise estratificada dos resultados dos testes fenotípicos ...................... 33
ix
4 Resultados ............................................................................................................ 35
4.1 Seleção da concentração ideal de IMBL para os testes de detecção fenotípica
de MBL .................................................................................................................. 35
4.2 Avaliação da ação bactericida de diferentes quantidades dos IMBL ............... 36
4.3 Avaliação da hidrólise dos β-lactâmicos, ceftazidima e imipenem, pelos IMBL
............................................................................................................................... 38
4.4 Detecção fenotípica da produção de MBL ....................................................... 39
4.4.1 Disco Aproximação para a detecção de amostras produtoras de MBL ..... 39
4.4.2 Disco combinado para a detecção de amostras produtoras de MBL ........ 44
4.5.2.1 Padronização da metodologia para o preparo dos discos
combinados ........................................................................................................ 44
4.5.2.2 Disco combinado para a detecção de MBL e análise dos resultados .... 47
5 Discussão ............................................................................................................. 66
6 Conclusões ........................................................................................................... 83
7 Anexos .................................................................................................................. 85
8 Referências ......................................................................................................... 124
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Curva ROC hipotética apresentando os diferentes tipos de modelos: (A)
com perfeito poder discriminatório, (B) com poder discriminatório intermediário
e (C) não discriminatório. ................................................................................ 20
Figura 2. Halos de inibição produzidos por distintos discos contendo diferentes
concentrações de EDTA, MPA e MAC sobre o crescimento da cepa P.
aeruginosa ATCC 27583 semeada em ágar Müeller-Hinton. (A) EDTA 500
mM, (B) EDTA 100 mM, (C) MPA puro, (D) MPA 1,4 mM, (E) MAC puro e (F)
MAC 1,2 mM. .................................................................................................. 36
Figura 3. Resultados de disco aproximação utilizando EDTA e MPA como IMBLs, e
ceftazidima (CAZ) e imipenem (IMI) como substratos, empregando 2,0 cm de
distância entre os discos, para as cepas Acinetobacter spp. A129046 (A) e P.
aeruginosa 144 (B). ........................................................................................ 43
Figura 4. Resultado de difícil interpretação, considerado como positivo pela técnica
de disco aproximação utilizando EDTA como IMBL e imipenem e ceftazidima
como substratos, a 1,5 cm de distância entre os discos, para a cepa de K.
pneumoniae 222. ............................................................................................ 43
Figura 5. Curvas ROC originadas com as combinações (A) MET/ceftazidima, (B)
MET/imipenem, (C) FEN/ceftazidima e (D) FEN/imipenem, para os diferentes
volumes de cada IMBL, frente a todas as amostras incluídas no estudo. ...... 49
Figura 6. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E)
ceftazidima/MAC e (F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada
IMBL, frente a todas as amostras incluídas no estudo. .................................. 50
Figura 7. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E)
xi
ceftazidima/MAC e (F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada
IMBL, frente aos isolados de Acinetobacter spp. ............................................ 56
Figura 8. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E)
ceftazidima/MAC e (F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada
IMBL, frente aos isolados de P. aeruginosa. .................................................. 57
Figura 9 Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E)
ceftazidima/MAC e (F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada
IMBL, frente às amostras de enterobactérias. ................................................ 58
Figura 10. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E)
ceftazidima/MAC e (F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada
IMBL, frente aos isolados produtores de IMP. ................................................ 62
Figura 11. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E)
ceftazidima/MAC e (F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada
IMBL, frente aos isolados produtores de SPM. ............................................... 63
Figura 12. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E)
ceftazidima/MAC e (F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada
IMBL, frente aos isolados produtores de VIM. ................................................ 64
Figura 13. Maiores percentuais de sensibilidade e especificidade obtidos com as
técnicas de disco aproximação (DA) e disco combinado (DC), estratificados
por patógenos (A) e por tipo de enzima produzida (B), sendo P. aeruginosa
(PSA), Acinetobacter spp. (ACB) e enterobactérias (ENT); ............................ 65
xii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Amostras submetidas aos testes fenotípicos para a detecção de MBL, as
enzimas por elas produzidas e seu perfil de sensibilidade frente a ceftazidima
e imipenem, por disco difusão. ....................................................................... 22
Tabela 2. Gene alvo, oligonucleotídeos utilizados como iniciadores e tamanho do
amplicom para a detecção dos genes codificadores de MBL por PCR. ......... 25
Tabela 3. Efeito bactericida dos inibidores de metalo-β-lactamases (IMBL): média do
diâmetro das zonas de inibição produzidos por diferentes quantidades dos
IMBL, frente a amostras produtoras e não produtoras de MBL ...................... 37
Tabela 4. Variação na taxa de absorbância em razão do tempo, de ceftazidima e
imipenem pelos diferentes inibidores testados. .............................................. 39
Tabela 5. Valores de sensibilidade (SN) e especificidade (SP) resultantes da análise
geral e estratificada por subgrupos para a detecção fenotípica de metalo-β-
lactamase por disco aproximação, utilizando mercaptoetanol (MET) e
fenantrolina (FEN) como inibidores, frente aos substratos ceftazidima e
imipenem . ...................................................................................................... 40
Tabela 6. Maiores percentuais de sensibilidade (SN) e especificidade (SP) e
respectivas condições experimentais, resultantes da análise geral e
estratificada por subgrupos para a detcção de metalo-β-lactamase pela
tácnica de disco aproximação. ........................................................................ 44
Tabela 7. Média do aumento do halo de inibição do crescimento bacteriano das
amostras produtoras de MBL, causado pelas diferentes combinações de
ceftazidima e imipenem com diferentes volumes dos inibidores EDTA, MPA,
MAC, MET e FEN ........................................................................................... 45
Tabela 8. Freqüência de resultados positivos para produção de MBL entre os
controles positivos e correspondente porcentagem de concordância entre os
testes realizados com discos combinados imediatamente preparados (IP) e
testes utilizando os discos previamente preparados (PP) .............................. 46
xiii
Tabela 9. Média do aumento do halo produzido pelas diferentes combinações
IMBL/β-lactâmico e respectivo poder discriminatório da combinação para
detecção de MBL por disco combinado. ......................................................... 48
Tabela 10. Valores de área abaixo da curva (AAC), erro padrão e o valor de p,
calculados para as curvas ROC desenhadas com todas as combinações β-
lactâmicos/IMBL, frente todas as amostras incluídas no estudo .................... 51
Tabela 11. Maiores percentuais de sensibilidade (SN) e especificidade (SP) e
respectivas condições experimentais, resultantes da análise geral e
estratificada por subgrupos para a detecção de metalo-β-lactamase pela
técnica de disco combinado. ........................................................................... 53
Tabela 12. Valores de área abaixo da curva (AAC), erro padrão e o valor de p,
calculados para as curvas ROC desenhadas com todas as combinações β-
lactâmicos/IMBL, frente aos subgrupos Acinetobacter spp., P. aeruginosa e
enterobactérias. .............................................................................................. 55
Tabela 13. Valores de área abaixo da curva (AAC), erro padrão e o valor de p,
calculados para as curvas ROC desenhadas com todas as combinações β-
lactâmicos/IMBL, frente aos subgrupos de isolados produtores de IMP, SPM e
VIM. ................................................................................................................ 61
xiv
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAC – área abaixo da curva
ATCC – American Type Culture Collection
CDC – Center for Disease Control
CIM – Concentração inibitória Mínima
CLSI – Clinical Laboratory Standards Institute
DPA – ácido dipicolínico
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
ESBL – Extanded Spectrum Beta Lactamase
EUA – Estados Unidos da América
FEN – Fenantrolina
GIM – German Imipenemase
IMBL – Inibidor de Metalo-beta-Lactamase
IMP – Imipenemase
IP – Imediatamente Preparado
MAC – Ácido Mercaptoacético
MBL – Metalo-beta-Lactamase
MET – Mercaptoetanol
MPA – Ácido Mercaptopropiônico
OXA – Oxacilinase
PBP – Penicillin Binding Protein
xv
PCR – Polymerase Chain Reaction
PP – Previamente Preparado
ROC – Receiver Operating Characteristcs
SIM – Seul Imipenemase
SMA – Mercaptoacetato de Sódio
SME – Serratia marcescens enzyme
SN – Sensibilidade
SP – Especificidade
SPM – São Paulo Metalo-beta-lactamase
UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo
UTI – Unidade de Terapia Intensiva
VIM – Verona Imipenemase
VPN – Valor Preditivo Negativo
VPP – Valor Preditivo Positivo
xvi
RESUMO
Objetivo: Avaliar a acurácia de diferentes testes fenotípicos para a detecção da
produção de MBL entre amostras produtoras de IMP, VIM, SPM, GIM, ou SIM,
incluindo Pseudomonas, Acinetobacter spp. e enterobactérias. Métodos: Foram
testadas 46 bactérias não relacionadas geneticamente e produtoras de diferentes
tipos de MBL. Dezenove amostras não produtoras de MBL foram incluídas como
controles negativos. Foi avaliada a capacidade do inibidor de MBL (IMBL) em inibir o
crescimento bacteriano e em realizar a hidrólise do substrato. Os isolados foram
submetidos aos testes de disco aproximação e disco combinado para adetecção da
produção de MBL, utilizando imipenem e ceftazidima em combinação com diferentes
IMBLs. Resultados: Foi obtido 100% de sensibilidade e especificidade para a
detecção da produção de MBL por disco aproximação utilizando ácido
mercaptopropiônico como IMBL, em combinação com ceftazidima e imipenem, para
P. aeruginosa e Acinetobacter spp., respectivamente. A técnica de disco combinado
utilizando imipenem e EDTA apresentou os mesmos resultados para detectar
enterobactérias produtoras de MBL, considerando-se como ponto de corte o
aumento de pelo menos 5,0 mm na zona de inibição do crescimento bacteriano.
Conclusões: Nossos resultados indicam que ambos os métodos fenotípicos para a
detecção de MBL, disco aproximação e disco combinado, devem ser escolhidos
após a identificação da bactéria-teste. Adicionalmente, devem ser considerados a
prevalência local de bactérias que apresentem este determinante de resistência,
assim como a habilidade de técnicos especializados em interpretar corretamente a
inibição de MBL.
Introdução 1
1 INTRODUÇÃO
A resistência antimicrobiana, além de constituir um desafio clínico, é,
atualmente, considerada um grande problema de saúde pública. As bactérias gram-
negativas têm à sua disposição uma diversidade de mecanismos para driblar a ação
bactericida dos β-lactâmicos. Entre os mecanismos já descritos destacam-se: i) os
mecanismos de impermeabilidade às drogas, seja por alteração das proteínas de
membrana externa ou por bombas de efluxo; ii) alteração do sítio de ação, como a
alteração de proteínas ligadoras de penicilinas e iii) a produção de β-lactamases,
enzimas capazes de clivar o núcleo ativo destes agentes, permitindo assim que a
parede bacteriana possa ser formada apropriadamente (Walsh et al., 2005).
A produção de β-lactamases do tipo AmpC, de β-lactamases de espectro
ampliado (ESBL), de serino-carbapenemases ou de metalo-β-lactamases (MBL)
desempenham papéis importantes na resistência aos β-lactâmicos, os quais
constituem a principal terapia antimicrobiana utilizada para o tratamento de
infecções causadas por bactérias gram-negativas. Entretanto, dentre as diferentes
classes de enzimas acima citadas, as MBL são notáveis por seu amplo espectro de
atividade contra os β-lactâmicos, incluindo os carbapenens; pela resistência que
essas enzimas apresentam aos inibidores de β-lactamases e pela sua capacidade
de disseminação intra e inter-espécies (Laraki et al., 1999). O surgimento e a rápida
disseminação de MBL em patógenos de grande importância clínica, como
Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e enterobactérias apresenta sérias
implicações clínicas e epidemiológicas. No entanto, esse quadro não foi
acompanhado pela padronização de um método acurado para a detecção
Introdução 2
laboratorial da produção de MBL (Cornaglia et al., 2007).
Embora muitos trabalhos que tratem da detecção fenotípica de MBL
tenham revelado valores de especificidade e sensibilidade acima de 90%, a grande
maioria deles apresenta sérias limitações, como amostragem insatisfatória,
restringindo o estudo a poucos gêneros de bacilos Gram-negativos (Lee et al.,
2003; Migliavaca et al., 2002); ou a diferentes organismos, porém produtores de um
mesmo subtipo específico de MBL (Arakawa et al., 2000, Lee et al., 2003). Além
disso, em nenhum dos trabalhos disponíveis foram incluídas amostras produtoras
de SPM, a principal MBL disseminada em diversos hospitais brasileiros (Gales et
al., 2003). Neste contexto, a ausência de um consenso entre os diferentes autores
dificulta a comparaçaõ dos resultados obtidos por diferentes estudos, e a
padronização de uma técnica acurada para a detecção fenotípica de MBL
(Cornaglia et al., 2007).
Introdução 3
1.1 Objetivos
1.1.1 Objetivo principal
Avaliar a acurácia dos testes de disco aproximação e disco combinado, e
modificações dos mesmos, para a detecção fenotípica de MBLs em bacilos gram-
negativos de diferentes gêneros, produtores de tipos variados de MBL.
1.1.2 Objetivos específicos
1. Avaliar a capacidade de inibidores de MBL em interferir com o
crescimento bacteriano e em hidrolisar o substrato β-lactâmico.
2. Avaliar o impacto de diferentes metodologias para a preparação dos
discos combinados na detecção fenotípica de MBL.
3. Avaliar os resultados dos testes de disco aproximação e de disco
combinado para a detecção fenotípica de MBL de maneira geral, estratificada por
patógenos e por tipo de enzima produzida.
Revisão da Literatura 4
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Metalo-β-Lactamases (MBL)
As MBLs receberam essa denominação por necessitarem de íons zinco
ou outros cátions divalentes como cofatores no síitio ativo. São enzimas agrupadas
na classe B de AMBLER e na classe 3 de BUSH-JACOBY-MEDEIROS (Ambler,
1980; Bush, 2001), que possuem atividade contra grande parte dos β-lactâmicos,
incluindo os carbapenens, embora não hidrolisem os monobactans. Adicionalmente,
são enzimas resistentes aos inibidores de serino-β-lactamases disponíveis
comercialmente, tais como o ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam.
O mecanismo de hidrólise do anel β-lactâmico é distinto entre as MBLs e
as serino-β-lactamases. As MBLs invariavelmente possuem a seqüência histidina-
X-histidina-X-ácido aspártico (HXHXD), que facilita a organização dos íons zinco no
sítio ativo (Murphy et al., 2003). O mecanismo proposto para a hidrólise dos β-
lactâmicos é de que o sítio ativo orienta e polariza a ligação com o antimicrobiano,
facilitando assim o ataque nucleofílico ao anel β-lactâmico pela ligação do zinco a
uma molécula de água (Walsh et al., 2005).
As MBLs enzimas são produzidas intrinsecamente por determinados
patógenos, tais como Stenotrophomonas maltophilia (Crowder et al., 1998, Avison
et al., 2001; Spencer et al., 2001), Bacillus cereus (Thompson et al., 1990),
Chryseobacterium meningosepticum (Rossolini et al., 1998), Chryseobacterium
indologenes, Legionella gormanii, Caulobacter crescentus (Simm et al., 2001) e
Aeromonas spp. (Walsh et al., 1998; Massidda et al., 1991; Walsh et al.,, 1996).
Revisão da Literatura 5
Contudo, desde o início da década de 90, novos genes que codificam MBLs têm
sido descritos em patógenos clinicamente importantes, tais como Pseudomonas
spp., Acinetobacter spp., e em membros da família Enterobacteriaceae (Cornaglia
et al., 2007; Galani et al., 2007; Guerin et al., 2005; Hirakata et al, 2003; Ktari et al.,
2006; Lee at al., 2002; Luzzaro et al., 2004; Poirel et al., 2000; Shiroto et al., 2005;
Tognim et al., 2006; Toleman et al., 2006; Weile et al., 2007). Estes novos genes
que codificam MBLs estão inseridos em estruturas genéticas móveis, sendo assim,
as enzimas codificadas por tais genes são conhecidas como MBLs móveis ou
também MBLs adquiridas. Atualmente são conhecidas cinco sub-classes de MBL
adquiridas, IMP (imipenemase), VIM (Verona imipenemase), SPM (São Paulo
metalo-β-lactamase), GIM (German imipenemase) e, mais recentemente, SIM (Seul
imipenemase) (Castanheira et al., 2004; Lauretti et al., 1999; Lee et al., 2005;
Osano et al., 1994; Toleman et al., 2002).
Em 1991, ocorreu o primeiro relato de uma MBL transferível em uma
cepa de P. aeruginosa isolada no Japão (Watanabe et al., 1991). Os autores
caracterizaram esta enzima bioquimicamente, entretanto, não a seqüenciaram ou
nomearam. A enzima IMP-1 (imipenemase) foi formalmente isolada e descrita de
um isolado de S. marcescens também proveniente do Japão no mesmo ano (Osano
et al., 1994). Diversas variantes desta enzima foram então descritas em P.
aeruginosa, Acinetobacter spp e enterobactérias (Da Silva et al., 2002; Iyobe et al.,
2002; Lee et al., 2003a; Mendes et al., 2006; Mendes et al., 2004; Nakamura et al.,
2002; Nakano et al., 2001; Shiroto et al., 2005; Towner et al., 2002; Yamasaki et al.,
2003; Yan et al., 2002; Yan et al., 2001; Yomoda et al., 2003). Em 1999, a segunda
subclasse descrita de MBL adquirida foi denominada VIM-1. Esta enzima foi
observada em uma amostra de P. aeruginosa originária de Verona, Itália, isolada
Revisão da Literatura 6
em 1999 (Lauretti et al., 1999). Muitas variantes de VIM já foram descritas, tanto em
microrganismos fermentadores da glicose, quanto em não fermentadores.
Posteriormente, diversos relatos reportaram a presença de MBL do tipo VIM em
microrganismos isolados em países da Comunidade Européia (Galani et al., 2005;
Giakkoupi et al., 2003; Giske et al., 2006; Libisch et al., 2006; Mavroidi et al., 2000;
Patzer et al., 2004; Pitout et al., 2007; Riccio et al., 2005; Sardelic et al., 2003;
Scoulica et al., 2004; Weile et al., 2007). No entanto, variantes de VIM também
foram relatadas na Ásia (Yan et al.,2002; Yatsuyanagi et al., 2004; Yum et al., 2002)
nos EUA (Toleman et al., 2004), Chile, Venezuela (Mendes et al., 2004), Colômbia
(Crespo et al., 2004; Villegas et al., 2006) e Argentina (Pasteran et al., 2005).
A terceira subclasse de MBL adquirida, SPM-1 (São Paulo metallo-β-
lactamase), foi encontrada em amostra de P. aeruginosa isolada em 2001,
recuperada do trato urinário de uma criança hospitalizada no Hospital São
Paulo/UNIFESP, São Paulo - SP (Toleman et al., 2002). Esse gene parece estar
especificamente relacionado à P. aeruginosa, uma vez que, até o momento, não foi
encontrado em demais espécies bacterianas (Gales et al., 2003; Poirel et al., 2004).
Posteriormente, a quarta subclasse de MBL adquirida, denominada GIM-
1 foi descrita de cinco cepas de P. aeruginosa isoladas de pacientes hospitalizados
em Dusseldorf, Alemanha, em 2002 (Castanheira et al., 2004).
Finalmente, em 2005, Lee e colaboradores (2005) descreveram uma
nova MBL adquirida em sete isolados clínicos de A. baumannii na Coréia. A enzima
SIM-1 é a MBL que apresenta maior identidade com as enzimas do tipo IMP, 69%
com IMP-12 e 64% com IMP-9.
Revisão da Literatura 7
2.2 Epidemiologia das MBLs no Brasil
Em 2003, Gales e colaboradores descreveram uma cepa de A.
baumannii isolada no complexo Hospital São Paulo/UNIFESP (São Paulo, SP)
produtora de IMP-1 (Gales et al., 2003). Em outro trabalho, este mesmo grupo
investigou a presença de MBL adquirida em amostras clínicas de Acinetobacter spp.
isoladas de pacientes internados no Hospital São Paulo entre o período de maio de
1993 a novembro de 2001. Entre as amostras que apresentaram resistência ou
sensibilidade reduzida aos carbapenens, 54,8% (40/73) eram produtoras de IMP-1,
sendo que a primeira amostra clínica que apresentou este determinante de
resistência foi isolada em 1998. Além disso, após esse ano, a produção de MBL
adquirida foi o único mecanismo de resistência a carbapenem detectado nas
amostras avaliadas, que apresentavam variedade genética embora dois genótipos
fossem mais abundantes (Tognim et al., 2006). Um estudo mais recente que avaliou
cepas clínicas deste mesmo hospital, isoladas durante os anos de 2002 e 2003,
constatou que o gene bla
IMP-1
estava presente em sete cepas de Acinetobacter spp.
e em uma cepa de P. aeruginosa (Castanheira et al., 2003; Sader et al., 2005).
Em 2001, na cidade de Salvador, BA, foram isoladas amostras de P.
aeruginosa que produziam uma variante do gene bla
IMP
. O seqüenciamento deste
gene revelou tratar-se de bla
IMP-18
, localizado em um integron de classe 1 (Xavier et
al., 2006).
Em 2002, uma amostra de P. aeruginosa com fenótipo de resistência a
todos β-lactâmicos foi isolada de um paciente internado no Hospital de Base de
Brasília. Estudos posteriores revelaram tratar-se de uma nova variante de IMP,
designada IMP-16 (Mendes et al., 2004).
Revisão da Literatura 8
Mais recentemente, uma amostra clínica de Klebsiella pneumoniae,
recuperada no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, foi
caracterizada como produtora de IMP-1 (Lincopan et al., 2005). Este foi o primeiro
relato de MBL adquirida em membros da família Enterobacteriaceae na América
Latina. Entre 2003 e 2004, também foi evidenciada a primeira ocorrência de um
surto hospitalar em uma UTI, causado por um clone de K. pneumoniae resistente a
carbapenem e, mais tarde, confirmado como produtor de IMP-1 (Grimbaum et al.,
2004).
Após a caracterização de SPM-1, amostras produtoras desta enzima
foram isoladas em diferentes centros no Brasil, tais como São Paulo, Brasília,
Salvador, Fortaleza, Santo André, Londrina, Curitiba e Maringá. Nestes isolados,
SPM-1 foi encontrada tanto em cepas pertencentes ao mesmo clone, como em
isolados com perfis genéticos distintos (Gales et al., 2003). Em Recife, também
foram encontradas amostras de P. aeruginosa produtoras de SPM-1 Poirel et al.,
2004). Um estudo que avaliou 200 amostras de cinco hospitais diferentes do Rio de
Janeiro entre 1999 e 2000 reportou a disseminação inter-hospitalar de um mesmo
clone de P. aeruginosa multirresistente. Este estudo apresentou o perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos e a caracterização genética das amostras, sendo
que a caracterização das mesmas como produtoras de SPM-1 foi feita em estudos
posteriores (Carvalho et al., 2006).
2.3 Contexto genético e a eficiência da disseminação das MBLs móveis
Diversos fatores contribuíram para o êxito das MBLs como determinantes
de resistência, no entanto destaca-se a grande capacidade de disseminação dos
Revisão da Literatura 9
genes que codificam essas β-lactamases.
O gene que codifica a enzima SPM-1 encontra-se inserido em um
plasmídeo de aproximadamente 100 Kb (Poirel et al., 2004; Toleman et al., 2002).
As demais MBL adquiridas são codificadas por genes localizados em integrons de
classe 1 (Arakawa et al., 1995; Castanheira et al., 2004; Giakkoupi et al., 2003; Lee
et al., 2005; Shibata et al., 2003) os quais podem estar inseridos em plasmídeos ou
no DNA cromossomal (Bennett et al., 1999).
Os integrons são estruturas envolvidas na captura de cassetes gênicos
por um evento de recombinação sítio-específica. Apresentam seqüências
conservadas em cada uma de suas extremidades. A extremidade 5’, é composta
por; (i) um gene intI1 que codifica uma integrase de classe 1, responsável pela
integração e excisão de genes, (ii) um sítio de recombinação attI1, onde os genes
serão preferencialmente inseridos e (iii) um promotor, envolvido na expressão dos
genes localizados entre as duas regiões conservadas, 3’ e 5’. A extremidade 3’ é
constituída pela estrutura truncada qacE
Δ
1/sul1 que codifica resistência aos
compostos de amônio quaternário e sulfonamidas (Bennett et al., 1999). Entre as
duas seqüências conservadas, podem existir genes que confiram resistência a
diferentes classes de drogas. Muitos são os relatos de MBLs ancoradas em
integrons de classe 1 que adicionalmente apresentavam genes que codificavam
enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (Aboufaycal et al., 2007; Da Silva et al.,
2002; Doi et al., 2007; Mendes et al., 2004; Riccio et al., 2005; Walsh et al., 2005).
A grande capacidade de disseminação de elementos genéticos nos quais
as MBL são comumente encontradas é preocupante, uma vez que estes eventos
poderiam alcançar maiores proporções de disseminação, até mesmo entre
Revisão da Literatura 10
diferentes espécies. Isto acarretaria um importante impacto clínico, pois limitaria as
opções terapêuticas para os casos de infecção nosocomial causada por bacilos
gram-negativos, tais como P. aeruginosa, Acinetobacter spp. e enterobactérias,
restringindo-as às polimixinas. Além disso, são escassos os dados clínicos acerca
do tratamento de infecções causadas por bactérias produtoras de MBL (Cornaglia et
al., 2007).
Diante disto, faz-se necessário que laboratórios de microbiologia clínica e
demais profissionais envolvidos busquem métodos que possam auxiliar a detecção
de microrganismos produtores de MBL para fins diagnósticos e epidemiológicos,
uma vez que o detalhado conhecimento das dimensões deste problema pode ser
útil para limitar a sua disseminação.
2.4 Detecção laboratorial da produção de MBL
O “Clinical Laboratory Standards Institute” (CLSI, antigo NCCLS) ainda
não recomenda a realização rotineira de testes para detecção de MBL, uma vez que
esse mecanismo de resistência não é prevalente nos EUA (Clinical Laboratory
Standards Institute, 2007). No entanto, recentemente, foi constatado que 36 das 82
(43,9%) amostras de P. aeruginosa resistentes a carbapenens, isoladas do hospital
São Paulo, eram produtoras de MBL (Sader et al., 2005), evidenciando uma
realidade diferente daquela encontrada nos EUA e, enfatizando a necessidade da
realização de testes de detecção para este fenótipo de resistência em nossos
laboratórios de microbiologia clínica.
Embora a identificação do gene que codifica a respectiva MBL por
técnicas moleculares e a avaliação espectrofotométrica da hidróise de carbapenens
Revisão da Literatura 11
sejam, respectivamente, os testes padrão-ouro para detecção genotípica e
fenotípica da produção de MBL, estas são técnicas laboriosas, dispendiosas,
necessitam de técnicos experientes e equipamentos especiais, nem sempre
disponíveis nos laboratórios de rotina brasileiros.
Vários métodos fenotípicos estão disponíveis para a detecção de
bactérias produtoras de MBL e todos esses métodos são baseados na inativação
e/ou inibiçao das MBL. Uma vez que essas enzimas necessitam de cátions
divalentes no sítio ativo para atuarem adequadamente, elas podem ser inibidas por
agentes quelantes, como ácido etilenodiaminotretacético (EDTA). Adicionalmente,
as MBLs também são sensíveis à inibição por agentes que alteram a conformação
do sítio ativo, como os derivados do tiol e ácido dipicolínico (Boerzel et al., 2003;
Goto et al., 1997; Kurosaki et al., 2006; Payne et al., 1997; Payne et al., 1997a;
Siemann et al., 2003),
Um teste amplamente utilizado para a detecção fenotípica de MBL é a
disco aproximação, descrito por Arakawa e colaboradores (2000). Para a realização
deste teste, um disco com um substrato β-lactâmico e um disco com um inibidor de
MBL são dispostos em uma placa de ágar Müeller-Hinton previamente inoculada
com a bactéria teste. A deformação do halo do antimicrobiano em direção ao disco
contendo o inibidor, ou o aparecimento de uma zona fantasma entre os dois discos
é o critério positivo para atestar a produção de MBL. Os autores utilizaram
ceftazidima como substrato e EDTA e derivados do tiol, ácido mercaptopropiônico
(MPA), ácido mercaptoacético (MAC) e mercaptoetanol (MET), como inibidores. A
ceftazidima foi utilizada com o intuito de aumentar a sensibilidade do teste, em
razão de algumas amostras produtoras de MBLs apresentarem baixo grau de
resistência a carbapenens. Segundo os autotes deste estudo, MPA apresentou,
Revisão da Literatura 12
entre todos os inibidores, os melhores resultados.
O teste de disco combinado proposto por Yong e colaboradores (2002)
consiste na comparação do tamanho dos halos formados por discos de imipenem e
discos do mesmo substrato contendo um IMBL. O aumento de pelo menos 7 mm na
zona de inibição produzida pelo disco combinado é o critério positivo adotado para a
produção de MBL. Segundo os autores, discos de imipenem combinados com 750
μg de EDTA foram altamente sensíveis para a detecção de MBL em diferentes
isolados.
O E-test
®
para MBL tem se mostrado um teste sensível para a detecção
de MBLs em isolados de Acinetobacter spp., P. aeruginosa, Serratia spp., S.
maltophilia e B. fragilis. Esta fita de um lado é impregnada com imipenem (4-256
μg/ml) e, do lado oposto, com imipenem (1-64 μg/ml) associado ao EDTA (320
μg/ml), são consideradas produtoras de MBL as amostras que apresentarem uma
redução do concentração inibitória mínima (CIM) de imipenem ≥ 3 diluições (Walsh
et al., 2002).
O teste de microdiluição para a detecção de MBL foi descrito por
Miglivacca e colaboradores. Em placa de microdiluição de 96 células foi pipetado
100 μl de caldo Müeller-Hinton inoculado com uma suspensão da bactéria teste
contendo 5x10
4
unidades formadoras de colônia. O teste foi realizado em caldo
puro e acrescido de EDTA (0,4 mM) juntamente com fenantrolina (FEN 0,04 mM). A
CIM obtida foi comparada entre os meios com e sem os inibidores. Os autores
observaram 100% de sensibilidade e 97% de especificidade para o teste cujo ponto
de corte foi estabelecido como a diminuição de 4 diluições na CIM, quando
associado aos inibidores. Considerando a diminuição de 8 e 16 diluições como
Revisão da Literatura 13
ponto de corte, a sensibilidade/especificidade do teste foi 95%/99% e 86%/100%,
respectivamente (Migliavacca et al., 2002).
A partir da descrição dos testes fenotípicos para a detecção de MBLs,
muitos grupos de pesquisa concentraram seus esforços em identificar qual das
metodologias é a mais acurada e reprodutível para a aplicação em laboratórios
clínicos.
Lee e colaboradores (2003) realizaram a disco aproximação para a
detecção de MBL em amostras de P. aeruginosa produtoras de VIM-2 e
Acinetobacter spp produtores de VIM-2 e IMP-1. Os autores utilizaram EDTA, MPA
e mercaptoacético sódico (SMA) como inibidores de MBL e ceftazidima e imipenem
como substrato para as enzimas. Segundo os autores, imipenem foi o melhor
substrato, independente do organismo testado. EDTA foi o melhor inibidor para
detectar MBL em P. aeruginosa e derivados do tiol apresentaram maior capacidade
para detectar MBL em Acinetobacter spp.
Um grupo de pesquisadores tailandeses comparou as técnicas de disco
aproximação, disco combinado e E-test
®
segundo os valores de sensibilidade e
especificidade para a detecção fenotípica de MBL em K. pneumoniae (IMP-8),
Enterobacter. Cloacae (IMP-8), Citrobacter freundii (VIM-2), Pseudomonas spp.
(IMP-1, VIM-1, VIM-2 e VIM-3) e A. baumannii (IMP-2). Discos de ceftazidima e
ceftazidima+clavulanato, cefepima e cefepima+clavulanato, e imipenem foram
testados contra MPA para disco aproximação e EDTA para disco combinado. A
sensibilidade e especificidade para a técnica de disco aproximação variou de
acordo com as espécies testadas. Porém, em comparação com as outras técnicas,
esta foi a mais sensível para a detecção fenotípica de MBL em todas as especies
Revisão da Literatura 14
bacterianas testadas. Os substratos ceftazidima-clavulanato e
cefepima+clavulanato foram mais sensíveis para enterobactérias. Disco combinado
e E-test
®
demonstraram ser úteis para detectar MBL somente em amostras
resistentes a imipenem (Yan et al., 2004).
Kimura e colaboradores (2005) reportaram a utilização de ácido
dipicolínico (DPA) para a detecção de MBL por disco difusão utilizando discos de
aztreonam, ceftazidima e imipenem, e por microdiluição, utilizando aztreonam,
ceftazidima, imipenem e meropenem. O aumento do halo frente ao DPA,
comparado ao meio sem o inibidor, foi observado para as amostras de P.
aeruginosa produtoras de VIM-1, VIM-2 ou IMP-1, para o teste de disco difusão
empregando discos de ceftazidima e imipenem. No entanto, apenas uma discreta
alteração foi notada quando o disco de aztreonam foi utilizado. À microdiluição,
houve diminuição de ≥ 8 diluições da concentração inibitória mínima com a
associação de DPA à ceftazidima (em 100% dos casos), imipenem (92%) e
meropenem (100%). Para aztreonam, os autores observaram apenas redução de 2
diluições na presença do inibidor.
Em 2005, foi publicado um trabalho alertando para a ocorrência de
resultados falso-positivos para a detecção de MBL utilizando EDTA como inibidor.
Neste estudo, três isolados de P. aeruginosa apresentaram teste positivo para
produção de MBL por E-test
®
e disco combinado. Contudo, não foi observado
sinergismo ao teste de disco aproximação. A reação de PCR para os genes bla
IMP
e
bla
VIM
também não resultou em qualquer amplificação (Chu et al., 2005).
No mesmo ano, pesquisadores franceses realizaram a técnica de disco
combinado utilizando imipenem e meropenem em associação com 930 μg de EDTA
Revisão da Literatura 15
para a detecção de MBL em amostras de P. aeruginosa produtoras de IMP e VIM.
O teste de disco combinado empregando imipenem apresentou sensibilidade de
96% e especificidade de 91% para a detecção MBL, sendo o critério positivo o
aumento de 7 mm para o disco contendo o β-lactâmico associado ao inibidor em
comparação ao halo de inibição produzidos por discos contendo somente o
antimicrobiano. Meropenem, no entanto, revelou ser mais sensível (100%) e
específico (97%) para atestar a produção de MBL por disco combinado. As mesmas
amostras foram então testadas por E-test
®
, que apresentou os mesmos resultados
de sensibilidade e especificidade apresentadas pela técnica de disco combinado
utilizando imipenem (Pitout et al., 2005).
Frankling e colaboradores (2006) reportaram a utilização do teste de
disco combinado para discos de imipenem acrescidos de 292 μg de EDTA. O
critério positivo adotado por esse grupo foi 4 mm de aumento na zona de inibição,
na presença do inibidor. Diferentes espécies bacterianas produtoras de MBL foram
testadas: S. marcescens (IMP-4), P. aeruginosa (IMP-4 e (IMP-4 e VIM-4), P.
stutzeri (VIM-2), K. pneumoniae (IMP-4), K. oxytoca (IMP-4), Escherichia coli (IMP-
4), E. cloacae (IMP-4), C. koser (IMP-4)i, A. junii (IMP-4) e A. baumannii (IMP-1). A
modificação proposta para o teste resultou em 100% de sensibilidade e 98% de
especificidade.
Ainda que existam muitos trabalhos a respeito deste assunto, a ausência
de um consenso entre os diferentes autores dificulta a escolha inequivocada e
definitiva de uma técnica para a detecção fenotípica de MBL (Cornaglia et al.,
2007). Além disso, em nenhum dos trabalhos disponíveis foram incluídas amostras
produtoras de SPM, MBL disseminada em diferentes estados brasileiros (Gales et
al., 2003).
Revisão da Literatura 16
Recentemente, foi demonstrado que pacientes infectados por amostras
de P. aeruginosa produtoras de MBL apresentavam maior mortalidade que àqueles
infectados por amostras de P. aeruginosa não produtoras de MBL. Os autores
reportaram que aumento da mortalidade provavelmente não estava relacionado à
presença de fatores de virulência como inicialmente foi advogado, mas
provavelmente ao emprego da terapia empírica inadequada (Marra et al., 2006;
Zavascki et al., 2006). Assim, a detecção laboratorial de cepas produtoras de MBL é
de extrema importância para fins diagnósticos e epidemiológicos, mais
especificamente, com o intuito de instituir terapia adequada ao tratamento das
infecções, bem como o de implementar medidas que visem reduzir a disseminação
deste mecanismo de resistência no ambiente hospitalar. Para tal, os laboratórios de
rotina de microbiologia clínica necessitam, em caráter de urgência, de um teste
diagnóstico para a detecção de MBL que seja de fácil implementação, e que
apresente elevada acurácia para detectar este fenótipo de resistência em diferentes
gêneros (Cornaglia et al., 2007).
2.5 Aplicação da curva ROC como ferramenta estatística para a avaliação de
testes diagnósticos
Os métodos mais comumente utilizados para avaliar a acurácia
diagnóstica de um teste baseiam-se na classificação do evento como uma variável
binária, na qual o resultado é a ocorrência ou não do evento (Linden, 2006). Desta
mesma maneira acontece com os testes para a identificação de um fenótipo de
resistência. Assim, os testes para a detecção fenotípica de MBL são reportados
como positivos para os produtores, e negativos para os não produtores, de acordo
com os critérios adotados por cada autor (Arakawa et al., 2000; Migliavacca et al.,
Revisão da Literatura 17
2002; Walsh et al., 2002; Yong et al., 2002).
A acurácia dos testes é então avaliada pelos valores de sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo, segundo a
classificação das amostras por um teste padrão-ouro, neste caso, a detecção de um
gene que codifica uma MBL por PCR ou a avaliação da hidrólise de carbapenens
pela amostra, por meio de ensaios espectrofotométricos (Walsh et al., 2002).
A sensibilidade de um teste significa a capacidade da modalidade em
classificar como positivos os casos em que o evento em estudo está
verdadeiramente presente, e especificidade é traduzida como a capacidade do teste
em classificar corretamente os verdadeiros negativos como tal. Os valores de
sensibilidade e especificidade são então calculados pela fórmula A/(A+C)x100 e
D/(B+D)x100, respectivamente, sendo A o número de amostras corretamente
classificadas como positivas (verdadeiros positivos), B o número de amostras
erroneamente classificadas como positivas (falsos positivos), C o número de
amostras positivas, porém classificadas como negativas (falsos negativos), e D as
amostras corretamente classificadas como negativas (verdadeiros negativos) (Eng,
2005; Linden, 2006).
Valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) de um
teste diagnóstico são os indicadores da aplicabilidade do mesmo em uma dada
população. Estes valores representam a probabilidade de existir o evento se o
resultado do teste for positivo (VPP) e a propabilidade de não existir o evento caso
o resultado seja negativo (VPN). Tratam-se de indicadores que dependem da
prevalência do evento no grupo de amostras estudadas. Este fato, se não levado
em conta, pode resultar em recomendações equivocadas sobre a aplicabilidade do
Revisão da Literatura 18
teste diagnóstico em avaliação. Os valores preditivos positivo e negativo são
obtidos pelas fórmulas A/(A+B)x100 e D/(D+C)x100, respectivamente (Marcopito&
Santos, 2007).
Para testes que necessitam de pontos de corte para classificar as
amostras como positivas ou negativas, os resultados de sensibilidade e
especificidade são diretamente influenciados pelo ponto de corte adotado. Assim,
para testes no qual se deseja testar as amostras de forma a não perder qualquer
caso que possa ser positivo, o ponto de corte deve ser estabelecido de forma a
favorecer maiores valores de sensibilidade, porém prejudicando automaticamente a
especificidade do teste, permitindo assim que ocorram resultados falso-positivos.
Da mesma maneira para testes no qual se deseja identificar todas as amostras
verdadeiramente positivas, ou seja, excluindo a possibilidade de ocorrer resultados
falso-positivos, o ponto de corte deve ser estabelecido de forma a priorizar a
especificidade do teste. Neste caso, o observador pode perder resultados positivos,
porém poucos serão os casos negativos erroneamente classificados como positivos
(Eng, 2005; Greiner, Pfeiffer,Smith, 2000; Linden, 2006).
Assim, para aperfeiçoar os testes diagnósticos que envolvem o
estabelecimento de um ponto de corte, o teste deve ser avaliado para todos os
possíveis pontos de corte e correspondentes resultados de sensibilidade e
especificidade. Porém, nem sempre essa análise é de fácil realização. Portanto, as
medidas convencionais de acurácia apresentam limitações que podem ser
superadas se avaliadas por meio de uma ferramenta estatística, a curva ROC, de
“Receiver Operator Characteristics” (Eng, 2005; Greiner, Pfeiffer,Smith, 2000;
Linden, 2006).
Revisão da Literatura 19
A curva ROC é o resultado da plotagem dos resultados de sensibilidade
(eixo y) e especificidade subtraída de 1 (eixo x), para diferentes pontos de corte.
A área abaixo da curva (AAC) é comumente utilizada como uma medida
do desempenho do teste, podendo ser traduzida como a probabilidade do
observador em classificar amostras corretamente ou como a sensibilidade média
entre toda a faixa de valores possíveis de sensibilidade. Assim, para uma curva na
qual a AAC é igual a 1, o teste é 100% sensível e específico, e a chance de o
observador errar ao utilizar o teste para caracterizar uma determinada amostra é
nula. Se o teste não for discriminatório, a AAC aproxima-se a 0,5, o que significa
50% de probabilidade de o observador acertar ao classificar uma amostra por esse
método, ou seja, a classificação é realizada ao acaso (Eng, 2005).
A Figura 1 ilustra uma curva ROC hipotética. Em um teste perfeitamente
discriminatório, a curva passa pela extremidade superior e esquerda do gráfico.
Neste caso, todos os verdadeiros positivos serão identificados e não serão
detectados falso-positivos. Ao contrário, um teste no qual a curva está posicionada
na diagonal, apresenta completa incapacidade de discriminar amostras segundo a
presença ou ausência do evento em estudo (Linden, 2006). Assim, a inspeção
visual da curva associada aosvalores de AAC permite o observador identificar qual
o ponto de corte no qual o teste apresenta melhor desempenho (Eng, 2005;
Greiner, Pfeiffer, Smith, 2000; Linden, 2006).
Revisão da Literatura 20
Figura 1. Curva ROC hipotética apresentando os diferentes tipos de modelos: (A)
com perfeito poder discriminatório, (B) com poder discriminatório intermediário e (C)
não discriminatório.
A
da
p
tado de Linden, A. 2006.
1 - Especificidade
1.00.75.50.250.00
Sensibilidade
1.00
.75
.50
.25
0.00
(C)
(B)
(A)
1 - Especificidade
1.00.75.50.250.00
Sensibilidade
1.00
.75
.50
.25
0.00
1 - Especificidade
1.00.75.50.250.00
Sensibilidade
1.00
.75
.50
.25
0.00
(C)
(B)
(A)
(C)
(B)
(A)
Materiais e Métodos 21
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Amostras bacterianas
As sessenta e cinco amostras de bacilos Gram-negativos selecionadas
para o estudo, sendo 46 sabidamente produtoras de MBL (controles positivos) e 19
não produtoras de MBL (controles negativos), estavam bancadas em TSB com
glicerol 15% a - 20ºC, no banco de microrganismos do Laboratório Especial de
Microbiologia Clínica (LEMC). Estas amostras foram subcultivadas por duas vezes
em ágar sangue antes de serem submetidas aos testes fenotípicos, para a garantia
da viabilidade e da pureza das amostras. As bactérias selecionadas para o estudo,
e suas respectivas características, podem ser visualizadas na Tabela 1.
A escolha dos controles positivos buscou contemplar isolados de
diferentes gêneros, produtores de MBL e previamente classificados como não
relacionados geneticamente por tipagem molecular, pela técnica de ribotipagem
automatizada e/ou pulsed field gel eletrophoresis.
Entre os bacilos Gram-negativos não fermentadores foram selecionados
39 isolados: 10 amostras de Acinetobacter spp., sendo nove produtores de IMP-1, e
um produtor de SIM-1 (n=1); 28 amostras de P. aeruginosa produtoras de IMP-1
(n=10), IMP-13 (n=1), IMP-16 (n=1), IMP-18 (n=2), GIM-1 (n=1), VIM-1 (n=1), VIM-2
(n=1), VIM-7(n=1), SPM-1 (n=10); e uma amostra de P. putida produtora de IMP-1.
Adicionalmente, 7 amostras de enterobctérias produtoras de MBL foram incluídas: 2
isolados de K. pneumoniae produtores de IMP-1, 4 amostras de E. cloacae
produtores de IMP-1 (n=1) e VIM-1 (n=3) e 1 isolado de S. marcescens produtor de
Materiais e Métodos 22
IMP-1. A produção de MBL pelas amostras utilizadas como controles positivos foi
confirmada através da reação em cadeia da polimerase (PCR) para os genes
codificadores dessas enzimas.
Tabela 1. Amostras submetidas aos testes fenotípicos para a detecção de MBL, as
enzimas por elas produzidas e seu perfil de sensibilidade frente a ceftazidima e
imipenem, por disco difusão.
N
o
da Cepa Gênero/espécie MBL
a
Ceftazidima Imipenem Referência
48-696D
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Sensível (Mendes et al., 2007)
A695
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Sensível (Tognim et al., 2006)
A68
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Sensível
(Tognim et al., 2006)
A4861
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Resistente
(Tognim et al., 2006)
A4764
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Sensível
(Tognim et al., 2006)
A4468
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Resistente
(Tognim et al., 2006)
A3880
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Sensível
(Tognim et al., 2006)
A3035
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Intermediário
(Tognim et al., 2006)
A129046
Acinetobacter spp. IMP-1
Resistente Sensível
(Tognim et al., 2006)
YMC03/9/T104
Acinetobacter spp. SIM-1
Resistente Resistente (Lee et al., 2005)
-
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Intermediário (Jones et al., 2005)
98
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Resistente (Takano et al., 2006)
128
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Resistente
(Takano et al., 2006)
130
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Resistente
(Takano et al., 2006)
131
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Sensível
(Takano et al., 2006)
137
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Resistente
(Takano et al., 2006)
143
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Resistente
(Takano et al., 2006)
144
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Sensível
(Takano et al., 2006)
145
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Resistente
(Takano et al., 2006)
183
P. aeruginosa
IMP-1
Resistente Resistente
(Takano et al., 2006)
84-14571
P. aeruginosa
IMP-13
Resistente Resistente (Toleman et al., 2003)
101-4704
P. aeruginosa
IMP-16
Resistente Resistente (Mendes et al., 2004)
3486
P. aeruginosa
IMP-18
Resistente Resistente (Mendes et al., 2007)
3489
P. aeruginosa
IMP-18
Resistente Resistente (Xavier et al., 2006)
48-1994A
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente (Toleman et al., 2002)
A3300
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente (Mendes et al., 2007)
A2526
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente (Mendes et al., 2007)
73
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
75
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
76
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
83
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
194
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
196
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
197
P. aeruginosa
SPM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
179
P. aeruginosa
VIM-1
Resistente Resistente (Toleman et al., 2005)
Materiais e Métodos 23
Tabela 1 (continuação)
N
o
da Cepa Gênero/espécie MBL
a
Ceftazidima Imipenem Referência
A1254
P. aeruginosa
VIM-2
Resistente Resistente (Mendes et al., 2007)
07-406
P. aeruginosa
VIM-7
Resistente Sensível (Tolemanet al., 2004)
75-5671
P. aeruginosa
GIM-1
Resistente Resistente (Castanheira et al., 2004)
48-12346A
P.putida
IMP-1
Resistente Resistente (Mendes et al., 2007)
A199
E. cloacae
IMP-1
Resistente Sensível
(Mendes et al., 2007)
75-10433A
E. cloacae
VIM-1
Resistente Sensível
(Mendes et al., 2007)
ECL-3
E. cloacae
VIM-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
ECL-4
E. cloacae
VIM-1
Resistente Sensível
(Castanheira et al., 2006)
KPN1
K. pneumoniae
IMP-1
Resistente Resistente
(Castanheira et al., 2006)
KPN2
K. pneumoniae
IMP-1
Resistente Intermediário
(Castanheira et al., 2006)
-
S. marcescens
IMP-1
Resistente Resistente (Jones et al., 2005)
216
Acinetobacter spp.
CN
b
Resistente Resistente Este estudo
210
Acinetobacter spp.
CN
Resistente Resistente Este estudo
211
Acinetobacter spp.
CN
Resistente Resistente Este estudo
212
Acinetobacter spp.
CN
Resistente Resistente Este estudo
213
Acinetobacter spp.
CN
Resistente Resistente Este estudo
215
Acinetobacter spp.
CN
Resistente Resistente Este estudo
209
P.aeruginosa
CN
Resistente Resistente Este estudo
227
P.aeruginosa
CN
Intermediário Resistente Este estudo
226
P.aeruginosa
CN
Resistente Intermediário Este estudo
230
P.aeruginosa
CN
Resistente Resistente Este estudo
237
P.aeruginosa
CN
Resistente Resistente Este estudo
238
P.aeruginosa
CN
Resistente Resistente Este estudo
189
K. pneumoniae
CN
Resistente Sensível Este estudo
222
K. pneumoniae
CN
Intermediário Sensível Este estudo
223
K. pneumoniae
CN
Resistente Sensível Este estudo
221
E. cloacae
CN
Resistente Intermediário Este estudo
224
M. Morgannii
CN
Intermediário Sensível Este estudo
190
S. marcescens
CN
Sensível Resistente Este estudo
1065
S. marcescens
CN
Sensível Resistente (Gales et al., 2001)
a
– Metalo-β-lactamase
b
– CN: controles negativos, não produtores de metalo-β-lactamase.
Os controles negativos, sabidamente não produtores de MBL, foram
selecionados por pertencerem ao mesmo gênero dos controles positivos e por
apresentarem resistência ou diminuição da sensibilidade a ceftazidima e/ou
imipenem, por disco difusão. Assim, foram incluídos representantes dos gêneros
Acinetobacter spp. (n=6), P. aeruginosa (n=6), K. pneumoniae (n=3), E. cloacae
(n=1), Morganella morgannii (n=1) e S. marcescens (n=2). A ausência da produção
Materiais e Métodos 24
de MBL nestas amostras também foi confirmada pela pesquisa dos genes IMP,
VIM, SPM, GIM e SIM. As amostras de número 216, 226, 227 e 1065, apesar de
não produzirem qualquer MBL, produziam as enzimas OXA-23, GES-5, GES-1 e
SME, respectivamente, e foram incluídas como controles negativos.
3.1.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A técnica de PCR foi aplicada para confirmar a presença ou a ausência
dos genes que codificam as MBL, utilizando iniciadores específicos para os genes
IMP, VIM, SPM, SIM e GIM (Tabela 2). Todos os oligonucleotídeos utilizados foram
desenhados no Laboratório Alerta, e posteriormente encaminhados para síntese
(IDT - Integrated DNA Tecnologies Inc., Coralville, EUA).
As amostras foram cultivadas em ágar nutriente contendo de 4 a 10
μg/ml de ceftazidima e, após isolamento de colônias puras, três a cinco colônias de
cada amostra foram transferidas para um tubo de microcentrífuga contendo 200 μl
de água destilada estéril. Esta suspensão foi utilizada diretamente para a etapa de
amplificação do gene. Em fluxo laminar, uma solução-mãe foi preparada contendo:
H
2
O deionizada estéril, tampão MgCl
2
1,5 mM, tampão NH
4
Cl 50 mM,
desoxinucleotídeo trifosfato 0,2 mM (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 2,5 unidades/L
de Taq DNApolimerase e iniciadores na concentração de 2 μM. A solução mãe foi
mantida a aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve agitação 45 μl foi
transferido para cada tubo de amplificação, que já continha 5 μl da suspensão
celular. As condições para amplificação do DNA foram: denaturação a 94º C por 10
minutos, seguidos por 35 ciclos de 94º C por 1 minuto, 55º C por 1 minuto, 72º C
por 1 minuto. A etapa de extensão final foi realizada por 10 minutos a 72º C. Após
Materiais e Métodos 25
amplificação do DNA, a revelação do produto amplificado foi realizada por
eletroforese em gel de agarose a 1% e visualizada sob luz ultravioleta.
Tabela 2. Gene alvo, oligonucleotídeos utilizados como iniciadores e tamanho do
amplicom para a detecção dos genes codificadores de MBL por PCR.
Gene
Alvo
Iniciador Sequência (5’- 3’)
Tamanho do
amplicom
bla
IMP
IMP-1F
TGAGCAAGTTATCTGTATTC
600 pb
IMP-1R
TTAGTTGCTTGGTTTTGATG
bla
VIM
VIM-1F
TTATGGAGCAGCAACGATGT
600 pb
VIM-1R
CAAAAGTCCCGCTCCAACGA
bla
SPM
SPM-1F
CGCTGCGAACGTGAGTGTAA
600 pb
SPM-1 R
CGATCGCGGCCTATGTTTGA
bla
SIM
SIM-1F
GTACAAGGGATTCGGCATCG
567 pb
SIM-1R
TGGCCTGTTCCCATGTGAG
bla
GIM
GIM-1F
TCAATTAGCTCTTGGGCTGAC
72 pb
GIM-1R
CGGAACGACCATTTGAATGG
3.2 Seleção da concentração ideal de inibidor de MBL para os testes de
detecção fenotípica de MBL
Os inibidores de MBL (IMBL) podem interferir com o crescimento
bacteriano. Por isto, sua ação bactericida foi avaliada primeiramente testando-se,
por disco difusão, quatro diferentes concentrações dos cinco inibidores utilizados,
contra o crescimento da cepa American Type Culture Collection (ATCC) de P.
aeruginosa 27853. Esse teste foi realizado segundo as recomendações do CLSI
para o teste de disco difusão em ágar (Clinical Standards and Laboratory Institute,
2007). As placas contendo ágar Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra)
foram semeadas com swab estéril umidecidos em suspensão da bactéria-teste, de
Materiais e Métodos 26
turbidez correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Em seguida, os discos de
papel sem impregnação foram posicionados sob a superfície do ágar. A cada disco
foi adicionado 5 μl da solução de IMBL. As placas foram então incubadas a 35
o
C,
por 18 a 24 horas.
Os compostos utilizados como IMBL foram: ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA, Sigma, Steinheim Alemenha), ácido 2-
mercaptopropiônico (MPA, Sigma), ácido mercaptoacético (MAC, Sigma),
mercaptoetanol (Gibco, Nova Yorque, EUA) e fenantrolina (FEN, Sigma). As
concentrações dos inibidores testadas foram:
EDTA: 50 mM, 100 mM, 300 mM, e 500 mM
MPA: 11,2 mM, 5,6 mM, 2,8 mM , e 1,4 mM
MET: 55 mM, 27,5 mM, 13,2 mM, e 7,0 mM
MAC: 14,4 mM, 7,2 mM, 3,6 mM e 1,2 mM
FEN: 8 mM, 4 mM, 2 mM, e 1 mM.
Para cada inibidor, a solução cuja concentração apresentou o menor halo
de inibição foi selecionada para a realização dos experimentos subseqüentes.
3.3 Avaliação da ação bactericida de diferentes quantidades de IMBL
A atividade inibitória dos IMBL sobre o crescimento dos controles
positivos e negativos foi avaliada pela técnica de disco difusão, com o objetivo de
inferir se apenas a ação bactericida do IMBL sobre a célula bacteriana seria
suficiente para determinar a ocorrência de resultados falso-positivos para a
detecção de MBL por disco combinado. Para tal, 2 a 10 μl das soluções de IMBL
Materiais e Métodos 27
previamente selecionadas como ideais, foram aplicadas a discos sem impregnação
posicionados em placas previamente inoculadas com a bactéria-teste. A
quantidade, em microgramas, de IMBL empregados nos discos para os respectivos
volumes adicionados, foi:
- EDTA 100 mM: 74 µg (2 µl), 148 µg (4 µl), 222 µg (6µl), 297 µg (8 µl) e
370 µg (10 µl).
- MPA 1,4 mM: 0,295 µg (2 µl), 0,592 µg (4 µl), 0,888 µg (6 µl), 1,184 µg
(8 µl) e 1,48 µg (10 µl).
- MET 55 mM: 8,58 µg (2 µl), 17,16 µg (4 µl), 25,74 µg (6 µl), 34,32 µg (8
µl) e 42,92 µg (10 µl).
- MAC 1,2 mM: 0,221 µg (2 µl), 0,441 µg (4 µl), 0,662 µg (6 µl), 0,883 µg
(8 µl) e 1,104 µg (10 µl).
- FEN 8 mM: 3,17 µg (2 µl), 6,34 µg (4 µl), 9,51 µg (6 µl), 12,68 µg (8µl) e
15,85 µg (10 µl).
A zona de inibição produzida por cada volume de IMBL foi aferida após
incubação a 35
o
C por 18 horas.
A média do halo produzido por cada volume de IMBL foi calculada para
ambos os grupos, controles negativos e positivos. A diferença entre as medias dos
grupos foi obtida utilizando o Teste t de Student.
Materiais e Métodos 28
3.4 Avaliação da hidrólise dos β-lactâmicos, ceftazidima e imipenem, pelos
IMBL
A hidrólise dos agentes β-lactâmicos, ceftazidima e imipenem, pelos
inibidores de MBL foi avaliada pelo monitoramento na variação da taxa de
absorbância da solução do respectivo agente β-lactâmico na presença e na
ausência dos IMBL, no espectrofotômetro Biomate 5 UV-Visible, (Thermo
Spectronic, Cambridge, Inglaterra).
As soluções de imipenem e ceftazidima foram preparadas em tampão
fosfato pH 7,0 de forma a obter 1,8 a 2,0 unidades de absorbância. Em cubeta de
quartzo foi adicionado 900 μl da solução do β-lactâmico e 100 μl da solução do
IMBL, na concentração previamente selecionada. O monitoramento da absorbância
da solução foi realizada por 1 minuto em espectrofotômetro a um comprimento de
onda de 299 nm para imipenem e a 260 nm para ceftazidima.
A diminuição gradativa da absorbância e valores negativos de variação
de absorbância, ΔAbs/min, calculada através da diferença entre o valor de
absorbância final e absorbância inicial após um minuto, foram considerados
resultados positivos de hidrólise do agente β-lactâmico pelo IMBL.
3.5 Detecção fenotípica da produção de MBL
Os testes fenotípicos para a detecção de MBL foram realizados conforme
as recomendações do CLSI para teste de disco difusão. Os discos de ceftazidima
(30 µg) e imipenem (10 µg) (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) e os discos em branco,
ou seja, não impregnados com IMBL, foram posicionados antes que se completasse
Materiais e Métodos 29
15 minutos da semeadura.
3.5.1 Disco Aproximação para a detecção de amostras produtoras de MBL
Após a inoculação da placa de ágar Müeller-Hinton com a suspensão da
bactéria-teste, os discos sem impregnação foram aplicados sobre a superfície do
ágar, em linha reta. Posteriormente, os discos de ceftazidima e imipenem, utilizados
como substratos, foram posicionados a 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 cm de distância
(centro a centro) dos discos sem impregnação, aos quais foram pipetados 5 μl da
solução de cada IMBL, como proposto por Arakawa et al.(2000). Para que a leitura
dos testes não fosse influenciada pelo conhecimento da amostra, foram atribuídos
códigos às bactérias, de modo que os três responsáveis por esta função não
soubessem qual era a amostra em análise. O teste foi considerado positivo para a
produção de MBL quando houve o aparecimento de deformações no halo de
inibição do crescimento bacteriano produzido pelo antimicrobiano ou de zonas
fantasmas entre os discos de IMBL e de β-lactâmicos. Os resultados de difícil
interpretação também foram considerados como positivos.
Os resultados foram analisados segundo os valores de sensibilidade
(SN), especificidade (SP), valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo
(VPN), obtidos para as cinco distâncias avaliadas: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 cm.
Os valores de SN, SP, VPP e VPN foram calculados como a/(a+c) x 100,
d/(b+d) x 100, a/(a+b) x 100, e d/(c+d) x 100, respectivamente, sendo “a” o total de
isolados corretamente identificados como produtores de MBL (verdadeiramente
positivos); "b" o número de isolados incorretamente classificados como produtores
de MBL (falso-positivos); "c" o número de verdadeiros produtores de MBL mas
Materiais e Métodos 30
classificados como não produtores (falso-negativos) e "d" o total de isolados não
produtores de MBL e corretamente classificados como tal pelo teste
(verdadeiramente negativos).
3.5.2 Disco combinado para a detecção de amostras produtoras de MBL
3.5.2.1 Padronização da metodologia para o preparo dos discos combinados
Com o objetivo de selecionar a técnica utilizada para a padronização do
disco combinado, conduzimos um estudo paralelo no qual estimamos o efeito da
preparação dos discos para a detecção de MBL e a concordância entre duas
técnicas distintas, segundo a capacidade de indicar a produção de MBL.
Doze isolados foram incluídos nesta fase, sendo cinco amostras
produtoras de IMP-1 (1 P. aeruginosa, 1 Acinetobacter spp., 1 S. marscecens, 1 E.
cloacae, e 1 K. pneumoniae), 2 E. cloacae produtores de VIM-1, 1 P. aeruginosa
produtora de SPM-1, 1 P. aeruginosa produtora de GIM-1 e 1 A. baumannii produtor
de SIM-1. Dois isolados (1 P. aeruginosa e 1 Acinetobacter spp.) resistentes a
imipenem, porém não produtores de MBL, foram incluídos como controles
negativos.
Para o teste de disco combinado utilizando discos imediatamente
preparados (IP), os discos de imipenem e ceftazidima foram posicionados na placa
de ágar Müeller-Hinton previamente inoculada com a bactéria-teste e, em seguida,
2, 4, 6, 8 e 10 μL de cada solução de IMBL foi adicionado diretamente aos discos
contendo o β-lactâmico. Para o teste no qual os discos combinados foram
Materiais e Métodos 31
previamente preparados (PP), as soluções de IMBLs (2 a 10 μl) foram
anteriormente incorporadas aos discos contendo ceftazidima e imipenem, e
subseqüentemente secos à temperatura ambiente e estocados por 18 a 24 horas a
-20
o
C. Esses discos foram então aplicados às placas de meio de cultura,
previamente inoculadas com a bactéria-teste.
Após incubação a 35
o
C por 18 a 24 horas, o tamanho da zona de inibição
produzido pelos discos de β-lactâmico contendo 2, 4, 6, 8 e 10 μl da solução
selecionada de cada inibidor foi medido e comparado ao tamanho do halo de
inibição produzido pelo disco contendo somente o agente antimicrobiano, para as
duas metodologias, PP e IP. O aumento na zona de inibição de pelo menos 7, 8, 9
ou 10 mm, produzido pelo disco combinado, em comparação ao disco contendo
apenas o antimicrobiano, foi considerado resultado positivo para a detecção de
MBL. Estes pontos de corte foram estabelecidos baseados em estudos prévios que
utilizaram a técnica de disco combinado para a detecção de MBL (Petropoulou et
al., 2006; Pitout et al., 2005; Yong et al., 2002). A média do aumento do halo de
inibição para os discos combinados preparados com os diferentes volumes de cada
IMBL, foi calculada para os controles negativos e positivos.
Uma análise comparativa foi conduzida com o objetivo de avaliar a
concordância dos resultados produzidos pelas diferentes metodologias, para os
controles positivos. Quando ambos os testes, PP e IP, classificaram uma cepa
como produtora de MBL, eles foram considerados concordantes, (a). Se uma cepa
foi classificada como produtora de MBL por um teste, e não produtora por outro, os
resultados foram considerados discordantes, (b). A porcentagem de concordância
entre os testes foi então calculada como a/(a+b) x 100. Adicionalmente, foi
calculada a freqüência de resultados positivos para produção de MBL, por PP e IP,
Materiais e Métodos 32
caso os pontos de corte estabelecidos (7, 8, 9 e 10 mm) fossem os padronizados. A
análise dos dados foi realizada com o auxílio do programa SPSS 10.0 para
Windows
®
.
A metodologia que apresentou a maior freqüência de resultados positivos
para produção de MBL e a maior média para o aumento do halo de inibição, foi a
selecionada para a realização da técnica de disco combinado.
3.5.2.2 Disco combinado para a detecção de MBL e análise dos resultados
Estabelecida a maneira para a preparação dos discos, as 65 amostras
incluídas no estudo foram submetidas à detecção fenotípica de MBL por disco
combinado. Os discos de imipenem e ceftazidima foram posicionados na placa de
ágar Müeller-Hinton previamente inoculada com a bactéria-teste e, em seguida, 2,
4, 6, 8 e 10 μL de cada solução de IMBL foi adicionado diretamente aos discos
contendo o β-lactâmico. A quantidade, em microgramas, de IMBL nos discos de
antimicrobianos, após a adição dos diferentes volumes de IMBL foi:
- EDTA 100 mM: 74 µg (2 µl), 148 µg (4 µl), 222 µg (6µl), 297 µg (8 µl) e
370 µg (10 µl).
- MPA 14 mM: 0,295 µg (2 µl), 0,592 µg (4 µl), 0,888 µg (6 µl), 1,184 µg
(8 µl) e 1,48 µg (10 µl).
- MET 55 mM: 8,58 µg (2 µl), 17,16 µg (4 µl), 25,74 µg (6 µl), 34,32 µg (8
µl) e 42,92 µg (10 µl).
- MAC 1,2 mM: 0,221 µg (2 µl), 0,441 µg (4 µl), 0,662 µg (6 µl), 0,883 µg
(8 µl) e 1,104 µg (10 µl).
Materiais e Métodos 33
- FEN 8 mM: 3,17 µg (2 µl), 6,34 µg (4 µl), 9,51 µg (6 µl), 12,68 µg (8µl) e
15,85 µg (10 µl).
Para avaliar a técnica de disco combinado foi necessário o
estabelecimento de um ponto de corte que indicasse a produção de MBL. A
escolha do aumento no tamanho do halo, que produzisse os melhores resultados de
sensibilidade e especificidade, foi realizada pela análise das curvas ROC,
considerando a influência do IMBL, isoladamente, sobre o aumento do halo de
inibição da bactéria. Para cada combinação de IMBL/β-lactâmico, os valores de
sensibilidade e especificidade foram calculados sucessivamente de acordo com a
variação da zona de inibição comparada entre os grupos de controles positivos e
negativos. Os resultados de sensibilidade foram então plotados contra os valores
correspondentes a 1 - especificidade, gerando a curva ROC. Os valores de área
abaixo da curva (AAC) e erro padrão foram calculados e a significância estatística
foi determinada pelo método não-paramétrico. A diferença entre as AAC,
correspondentes às variações realizadas no teste, foram avaliadas por comparação
do intervalo de confiança (95%).
3.5.3 Análise estratificada dos resultados dos testes fenotípicos
Os resultados de disco aproximação e disco combinado para a detecção
de MBL foram estratificados em sete subgrupos, de acordo com o microrganismo
testado e o tipo de MBL produzido.
Assim, a análise geral contemplou todos os microrganismos incluídos no
estudo. O subgrupo Acinetobacter spp. incluiu apenas os isolados pertencentes a
este gênero, tanto para os controles negativos, como positivos. Da mesma forma,
Materiais e Métodos 34
para o subgrupo P. aeruginosa, foram analisados apenas representantes desta
espécie. O subgrupo Enterobacteriaceae contemplou as bactérias pertencentes a
essa família, K. pneumoniae, S. marcescens, E. cloacae e M. morgannii.
Finalmente, os resultados foram agrupados de acordo com as enzimas
produzidas, gerando os subgrupos IMP, VIM e SPM. Nestas estratificações, todos
os controles negativos disponíveis foram incluídos (n=19). Os organismos
produtores de SIM-1 e GIM-1 não puderam ser agrupados devido à
indisponibilidade de amostras, uma vez que dispúnhamos de apenas um isolado
bacteriano produtor de cada uma dessas enzimas.
As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio dos programas
SPSS 10.0 para Windows
®
e Epi Info (“Center for Disease Control”, CDC), versão
6.04. Todos os valores de p reportados são bilaterais, e valores inferiores a 0,05
foram considerados estatisticamente significantes.
Resultados 35
4 RESULTADOS
4.1 Seleção da concentração ideal de IMBL para os testes de detecção
fenotípica de MBL
O crescimento da cepa ATCC de P. aeruginosa 27583 não sofreu
interferência frente às diferentes concentrações de MET e de FEN testadas, não
havendo a formação de halo de inibição para esses IMBL. Por esta razão, as
maiores concentrações destes inibidores, foram as selecionadas para a realização
dos demais experimentos.
Diferentes concentrações de EDTA, MAC e MPA foram capazes de inibir
o crescimento bacteriano. As soluções de EDTA nas concentrações de 500 mM,
300 mM, 100 mM e 50 mM apresentaram halos de inibição com diâmetro de 16 mm,
11 mm, 6 mm e 6 mm, respectivamente. Portanto, as soluções de EDTA nas
concentrações de 50 mM e 100 mM não apresentaram interferência no crescimento
bacteriano. Os halos de inibição do crescimento bacteriano produzidos por MAC
nas concentrações 14.4 mM, 7.2 mM, 3,6 mM e 1.2 mM, foram 20 mm, 15 mm, 12
mm e 6 mm, respectivamente. Para MPA, as soluções de 11,2 mM, 5,6 mM, 2,8 mM
e 1,4 mM produziram zonas de inibição do crescimento bacteriano de 22 mm, 16
mm, 12 mm e 8 mm, respectivamente.
Baseados no menor halo de inibição do crescimento bacteriano, as
seguintes soluções foram selecionadas para a realização dos demais experimentos:
EDTA 100 mM; MPA 1,4 mM; MAC 1,2 mM; MET 55 mM e FEN 8 mM. A Figura 2
ilustra as diferenças na inibição do crescimento bacteriano da cepa de P.
aeruginosa ATCC 27583, realizado pelas mais altas concentrações de EDTA, MPA
Resultados 36
e MAC, e suas respectivas diluições selecionadas para a realização dos testes
fenotípicos.
Figura 2. Halos de inibição produzidos por distintos discos contendo diferentes
concentrações de EDTA, MPA e MAC sobre o crescimento da cepa P. aeruginosa
ATCC 27583 semeada em ágar Müeller-Hinton. (A) EDTA 500 mM, (B) EDTA 100
mM, (C) MPA puro, (D) MPA 1,4 mM, (E) MAC puro e (F) MAC 1,2 mM.
4.2 Avaliação da ação bactericida de diferentes quantidades dos IMBL
A atividade inibitória dos IMBL sobre o crescimento das 65 amostras
incluídas no estudo foi mensurada pelo cálculo da média do diâmetro do halo de
inibição produzido por cada concentração de IMBL, e comparada entre os controles
positivos e negativos. Os resultados desta análise estão apresentados na Tabela 3.
Resultados 37
Tabela 3. Efeito bactericida dos inibidores de metalo-β-lactamases (IMBL): média do
diâmetro das zonas de inibição produzidos por diferentes quantidades dos IMBL,
frente a amostras produtoras e não produtoras de MBL
a
– IMBL: inibidor de Metalo-β-lactamase; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido
mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético; MET: mercaptoetanol; FEN: fenantrolina;
* - p não pode ser calculado já que a variância do tamanho dos halos, entre controles
positivos e negativos, foi zero.
Os inibidores EDTA, MET e FEN apresentaram fraca atividade
Volume de
IMBL
a
Média da zona de inibição (mm)
Controles
positivos
Controles
negativos
valor de p
EDTA
a
2
μ
l
6 6 *
EDTA 4
μ
l
6,1 6 *
EDTA 6
μ
l
6,4 6 *
EDTA 8
μ
l
6,7 6 *
EDTA 10
μ
l
7 6 *
MPA
a
2
μ
l
7.3 6.3 0.1
MPA 4
μ
l
10.8 10.9 0.9
MPA 6
μ
l
13.5 14.4 0.78
MPA 8
μ
l
16.1 16.7 0.3
MPA 10
μ
l
18.4 18.2 0.8
MAC
a
2
μ
l
6.1 6 *
MAC 4
μ
l
7.6 7.5 0.76
MAC
6
μ
l
10.6 9.6 0.12
MAC 8
μ
l
12.6 11.7 0.24
MAC
10
μ
l
14.9 13.1 0.05
MET
a
2
μ
l
6 6.2 *
MET 4
μ
l
6.8 6.3 0.35
MET 6
μ
l
7.5 7.2 0.8
MET 8
μ
l
8 7.2 0.6
MET 10
μ
l
8 7.4 0.65
FEN
a
2
μ
l
6 6 *
FEN 4
μ
l
6.2 6 *
FEN 6
μ
l
6.5 6.3 0.8
FEN 8
μ
l
6.9 6.4 0.3
FEN 10
μ
l
7.6 7.3 0.78
Resultados 38
bactericida. A média do tamanho da zona de inibição para esses IMBL variou de 6 a
8 mm. Ao contrário, MPA e MAC apresentaram elevada atividade bactericida, sendo
que a média do halo de inibição produzidos por esses IMBL variou de 6,3 a 18,4
mm e 6,0 a 14,9 mm, respectivamente (Tabela 3).
A comparação das médias do diâmetro das zonas de inibição produzidas
pelos IMBLs frente aos controles positivos e negativos revelou não haver diferença
entre o tamanho dos halos produzidos em amostras produtoras e não produtoras de
MBL, exceto para os discos contendo 10 μl de MAC (p=0.05, Tabela 3).
A média do tamanho dos halos foi diferente para cada IMBL avaliado.
Adicionalmente, maiores tamanhos de halos de inibição foram observados conforme
aumentamos o volume de IMBL dispensado nos discos, para os controles positivos
e negativos, independente do IMBL empregado.
4.3 Avaliação da hidrólise dos β-lactâmicos, ceftazidima e imipenem, pelos
IMBL
A variação na taxa de absorbância (ΔAbs/min) para o teste de hidrólise
de ceftazidima e imipenem pelas soluções de EDTA 100 mM, MPA 1,4 mM, MAC
1,2 mM, MET 55mM e FEN 8,0 mM, estão apresentados na Tabela 4.
Valores negativos de ΔAbs/min foram observados para imipenem quando
associado a EDTA, MPA, MAC e MET. No entanto, a diminuição de quatro unidades
de absorbância, observado para imipenem e EDTA, não aconteceu de forma
gradativa, como observado para este antimicrobiano associado a MPA, MAC e
MET. Assim, podemos observar que imipenem somente sofreu hidrólise pela ação
dos IMBLs derivados de tiol, MPA, MAC e MET. Ceftazidima permaneceu estável à
Resultados 39
hidrólise por todos os IMBLs testados.
Tabela 4. Variação na taxa de absorbância em razão do tempo, de ceftazidima e
imipenem pelos diferentes inibidores testados.
Taxa de hidrólise (ΔAbs/min)
EDTA
a
MPA
a
MAC
a
MET
a
FEN
a
Ceftazidima 0,002 0,002 0,000 0,000 0,000
Imipenem -0,004 -0,078 -0,047 -0,017 0,008
a
– EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido mercaptopropiônico; MAC: ácido
mercaptoacético; MET: mercaptoetanol; FEN: fenantrolina
.
4.4 Detecção fenotípica da produção de MBL
4.4.1 Disco Aproximação para a detecção de amostras produtoras de MBL
Os agentes quelantes MET e FEN demonstraram atividade inibitória
insuficiente sobre a maioria das MBL produzidas pelos microrganismos testados.
Embora tenhamos observado, à análise geral e para a maioria das estratificações,
resultados de especificidade de 100% para distâncias superiores a 2,0 cm entre os
disco de β-lactâmicos e estes IMBL, os valores de sensibilidade obtidos não
superaram 20%, independente do substrato utilizado. A Tabela 5 apresenta os
valores de sensibilidade e especificidade para esses IMBLs frente aos
microrganismos testados, utilizando ceftazidima e imipenem como substrato.
Excepcionalmente, para enterobactérias MET e FEN apresentaram valores de
sensibilidade próximos a 43% e 57%, respectivamente. Igualmente, FEN
apresentou sensibilidade próxima a 57% para a detecção de MBL em Acinetobacter
spp. (Tabela 5).
Resultados 40
Os IMBL EDTA, MPA e MAC apresentaram, de forma geral, desempenho
satisfatório para a detecção de MBL por disco aproximação entre os
microrganismos testados. Porém, observamos grande variação nos valores de
sensibilidade e especificidade conforme foram realizadas modificações na técnica,
seja na distância entre os discos, no microrganismo testado, no IMBL ou no
substrato utilizado. No anexo 1 estão apresentados todos os resultados de
sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo
gerais e estratificados por subgrupos, para a detecção fenotípica de MBL por disco
aproximação utilizando EDTA, MPA e MAC e os substratos ceftazidima e imipenem.
Tabela 5. Valores de sensibilidade (SN) e especificidade (SP) resultantes da análise
geral e estratificada por subgrupos para a detecção fenotípica de metalo-β-
lactamase por disco aproximação, utilizando mercaptoetanol (MET) e fenantrolina
(FEN) como inibidores, frente aos substratos ceftazidima e imipenem .
Ceftazidima Imipenem
Distância
(cm)
MET
a
FEN
a
MET FEN
SN SP SN SP SN SP SN SP
Análise Geral
1,0 13,0 89,5 4,3 84,2 17,4 89,5 19,6 68,4
1,5 13,0 89,5 0,0 84,2 17,4 94,7 15,2 84,2
2,0 13,0 100,0 0,0 94,7 15,2 94,7 8,7 94,7
2,5 13,0 100,0 0,0 100,0 10,9 94,7 2,2 100,0
3,0 13,0 100,0 0,0 100,0 8,7 100,0 0,0 100,0
Acinetobacter
spp.
1,0 10,0 100,0 0,0 100,0 20,0 100,0 50,0 83,3
1,5 10,0 100,0 0,0 100,0 10,0 100,0 30,0 83,3
2,0 10,0 100,0 0,0 100,0 10,0 100,0 30,0 100,0
2,5 10,0 100,0 0,0 100,0 10,0 100,0 0,0 100,0
3,0 10,0 100,0 0,0 100,0 10,0 100,0 0,0 100,0
Pseudomonas
aeruginosa
1,0 10,7 100,0 7,1 100,0 10,7 100,0 0,0 100,0
1,5 10,7 100,0 0,0 100,0 10,7 100,0 0,0 100,0
2,0 10,7 100,0 0,0 100,0 7,1 100,0 0,0 100,0
2,5 10,7 100,0 0,0 100,0 7,1 100,0 0,0 100,0
3,0 10,7 100,0 0,0 100,0 3,6 100,0 0,0 100,0
Enterobactérias
1,0 14,3 71,4 0,0 57,1 28,6 71,4 57,1 28,6
1,5 14,3 71,4 0,0 57,1 42,9 85,7 57,1 71,4
2,0 14,3 100,0 0,0 85,7 42,9 85,7 14,3 85,7
2,5 14,3 100,0 0,0 100,0 14,3 85,7 14,3 100,0
3,0 14,3 100,0 0,0 100,0 14,3 100,0 0,0 100,0
Resultados 41
Tabela 5 (continuação)
Ceftazidima Imipenem
Distância
(cm)
MET
a
FEN
a
MET FEN
SN SP SN SP SN SP SN SP
IMP
1,0 10,7 89,5 3,6 84,2 14,3 89,5 17,9 68,4
1,5 10,7 89,5 0,0 84,2 10,7 94,7 10,7 84,2
2,0 10,7 100,0 0,0 94,7 10,7 94,7 7,1 94,7
2,5 10,7 100,0 0,0 100,0 10,7 94,7 0,0 100,0
3,0 10,7 100,0 0,0 100,0 7,1 100,0 0,0 100,0
SPM
1,0 0,0 89,5 0,0 84,2 0,0 89,5 0,0 68.4
1,5 0,0 89,5 0,0 84,2 0,0 94,7 0,0 84.2
2,0 0,0 100,0 0,0 94,7 0,0 94,7 0,0 94.7
2,5 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 94,7 0,0 100,0
3,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0
VIM
1,0 16,7 89,5 16,7 84,2 33,3 89,5 50,0 68,4
1,5 16,7 89,5 0,0 84,2 50,0 94,7 50,0 84,2
2,0 16,7 100,0 0,0 94,7 33,3 94,7 16,7 94,7
2,5 16,7 100,0 0,0 100,0 0,0 94,7 16,7 100,0
3,0 16,7 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0
a
– MET: mercaptoetanol; FEN: fenantrolina.
A associação EDTA e imipenem não produziu resultados satisfatórios
pela técnica de disco aproximação, como era esperado para o subgrupo de
Acinetobacter spp. Altos valores de sensibilidade foram observados testando-se
menores distâncias entre os discos. Porém, este resultados estavam associados a
baixos valores de especificidade, situação que se reverteu com o aumento das
distâncias entre os discos (Anexo 1). Valores de sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo e valor preditivo negativo de 100% foram alcançados no subgrupo
de Acinetobacter spp. somente quando o MPA foi utilizado como IMBL e o
imipenem como substrato, testando-se 1,5 e 2,0 cm de distância entre os discos
(Figura 3A, Tabela 6).
Para o subgrupo de P. aeruginosa, resultados idênticos foram
alcançados utilizando o mesmo IMBL, e a ceftazidima como substrato, e distâncias
de 2,0 e 2,5 cm (Tabela 6). Para este subgrupo EDTA apresentou resultados
inferiores ao MPA pela técnica de disco aproximação (Figura 3B, Anexo 1).
Resultados 42
Para a detecção fenotípica de MBL entre as enterobactérias pela técnica
de disco aproximação, os maiores valores de sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo e valor preditivo negativo foram 100%, 85,7%, 85,7% e 100%,
respectivamente. Esses resultados foram observados para ambos IMBL, EDTA e
MAC, às distâncias de 1,5 e 2,0 cm dos discos de imipenem, respectivamente
(Tabela 6). No entanto, nestas condições experimentais, pudemos observar a
ocorrência de resultados de difícil interpretação, os quais foram considerados
positivos para a cepa de K.pneumoniae 222, não produtora de MBL, como mostra a
Figura 4.
Os resultados da técnica de disco aproximação para o subgrupo produtor
de SPM foram similares aos obtidos com o subgrupo de P. aeruginosa. Ceftazidima
e MPA, a 2,5 cm, apresentou sensibilidade de 100% e especificidade próxima a
90%. Os mesmos resultados foram observados para este subgrupo utilizando o
MPA e o imipenem, a 1,5 cm de distância.
Para as amostras produtoras de VIM, sensibilidade de 100% e
especificidade de 84,7% foram somente obtidas com a combinação EDTA e
imipenem, a 1,5 cm.
Já o subgrupo produtor de IMP, ainda que tenha apresentado valores de
sensibilidade de 92,9% para diferentes combinações, apresentou especificidade
próxima a 90% apenas, quando foram testados os discos contendo MPA a 1,5 cm
do disco de imipenem (Tabela 6, Anexo 1).
Resultados 43
Figura 3. Resultados de disco aproximação utilizando EDTA e MPA como IMBLs, e
ceftazidima (CAZ) e imipenem (IMI) como substratos, empregando 2,0 cm de
distância entre os discos, para as cepas Acinetobacter spp. A129046 (A) e P.
aeruginosa 144 (B).
Figura 4. Resultado de difícil interpretação, considerado como positivo pela técnica
de disco aproximação utilizando EDTA como IMBL e imipenem e ceftazidima como
substratos, a 1,5 cm de distância entre os discos, para a cepa de K. pneumoniae
222.
Resultados 44
Tabela 6. Maiores percentuais de sensibilidade (SN) e especificidade (SP) e
respectivas condições experimentais, resultantes da análise geral e estratificada por
subgrupos para a detcção de metalo-β-lactamase pela tácnica de disco
aproximação.
Subgrupo
SN
(%)
SP
(%)
Condições experimentais
Combinação β-
lactâmico/IMBL
Distância
(cm)
Geral 82,6 89,5 Ceftazidima/MPA
a
2,5
Acinetobacter spp. 100 100 Imipenem/MPA 1,5
100 100 Imipenem/MPA 2,0
Pseudomonas aeruginosa
100 100 Ceftazidima/MPA 2,0
100 100 Ceftazidima/MPA 2,5
enterobactérias 100 85,7 Imipenem/EDTA
a
1,5
100 85,7 Imipenem/MAC
a
2,0
IMP 92,9 89,5 Imipenem/MPA 1,5
SPM 100 89,5 Ceftazidima/MPA 2,5
VIM 100 84,2 Imipenem/EDTA 1,5
a
– MPA: ácido mercaptopropiônico; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MAC: ácido
mercaptoacético.
4.4.2Disco combinado para a detecção de amostras produtoras de MBL
4.4.2.1 Padronização da metodologia para o preparo dos discos combinados
O estudo preliminar para avaliar qual entre as metodologias para
preparação dos discos combinados seria a mais adequada para a realização dos
testes fenotípicos revelou diferentes resultados, de acordo com a combinação β-
lactâmico/IMBL utilizada. A média do aumento do halo de inibição do crescimento
bacteriano dos controles positivos e negativos, causado pelo grupo de discos
combinados contendo diferentes volumes de IMBL, está apresentada na Tabela 7.
De forma geral, os discos IP produziram maiores halos de inibição do que os discos
Resultados 45
PP.
Tabela 7. Média do aumento do halo de inibição do crescimento bacteriano das
amostras produtoras de MBL, causado pelas diferentes combinações de ceftazidima
e imipenem com diferentes volumes dos inibidores EDTA, MPA, MAC, MET e FEN
a
– IMBL: inibidor de Metalo-β-lactamase; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido
mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético; MET: mercaptoetanol; FEN: fenantrolina;
MBL: metalo-β-lactamase
A análise da freqüência de resultados positivos para a produção de MBL
obtidas por disco combinado, envolveu 50 observações para cada combinação β-
lactâmico/IMBL (cinco volumes de IMBL para cada uma das dez amostras
produtoras de MBL). A freqüência de classificação dos controles positivos como
produtores de MBL utilizando os discos IP e PP, e a correspondente porcentagem
de concordância entre as diferentes metodologias, estão dispostas na Tabela 8. Os
resultados apresentados nesta tabela representam o grupo de discos combinados
contendo as diferentes concentrações de IMBL para cada combinação com os β-
lactâmicos.
Combinação
β-lactâmico/IMBL
a
Média do aumento do halo de
inibição (mm)
Amostras
produtoras de
MBL
a
(n = 10)
Amostras não
produtoras de
MBL (n = 2)
PP IP PP IP
Ceftazidima/EDTA
a
8,9 10,6 7,3 5,3
Ceftazidima/MPA
a
13,4 15,4 6,6 10,1
Ceftazidima/MAC
a
8,7 13,8 10,5 5,8
Ceftazidima/MET
a
4,4 5,9 1,1 0,0
Ceftazidima/FEN
a
2,2 2,9 3,7 2,7
Imipenem/EDTA 8,0 8,0 2,0 3,0
Imipenem/MPA 3,0 5,0 1,0 3,0
Imipenem/MAC 4,0 3,0 4,0 5,0
Imipenem/MET 0,0 4,0 0,0 0,0
Imipenem/FEN 1,0 1,0 1,0 0,0
Resultados 46
Tabela 8. Freqüência de resultados positivos para produção de MBL entre os
controles positivos e correspondente porcentagem de concordância entre os testes
realizados com discos combinados imediatamente preparados (IP) e testes
utilizando os discos previamente preparados (PP)
Combinação β-
lactâmico/IMBL
a
Freqüência de resultados
positivos para produção de MBL
de acordo com a metodologia
(%)
Concordância (%)
PP/IP
Ponto de corte Ponto de corte
7 mm 8 mm 9 mm 10 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm
Ceftazidima/EDTA
a
62/70 58/66 54/64 42/64 88 88 86 74
Ceftazidima/MPA
a
82/84 80/84 76/84 74/84 94 96 92 90
Ceftazidima/MET
a
62/88 60/84 58/82 52/78 74 76 72 66
Ceftazidima/MAC
a
28/28 24/28 18/28 14/28 84 88 86 82
Ceftazidima/FEN
a
10/22 10/12 10/10 10/8 72 82 78 62
Imipenem/EDTA 58/70 50/66 42/44 30/28 82 80 62 74
Imipenem/MPA 22/34 22/26 14/22 12/18 80 84 84 90
Imipenem/MAC 28/20 24/14 14/12 14/12 76 82 90 90
Imipenem/MET 0/24 0/22 0/18 0/14 76 78 82 86
Imipenem/FEN 0/0 0/0 0/0 0/0 100 100 100 100
a
– IMBL: inibidor de Metalo-β-lactamase; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido
mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético; MET: mercaptoetanol; FEN: fenantrolina.
A análise dos resultados revelou haver diferenças para detecção de MBL
utilizando as duas metodologias, dependendo da combinação empregada. Para
ceftazidima/EDTA, ceftazidima/MPA, ceftazidima/MET, imipenem/EDTA,
imipenem/MPA e imipenem/MET, a porcentagem de resultados positivos entre as
amostras sabidamente produtoras de MBL foi maior para a técnica que utilizou os
discos IP que para aquela que utilizou os discos PP, para todos os pontos de corte
analisados. Ao contrário, para as combinações empregando MAC, a maior
porcentagem de classificação das amostras como produtoras de MBL foi obtida
empregando os discos PP.
Resultados 47
Para todas as combinações β-lactâmico/IMBL e pontos de corte
analisados, as técnicas PP e IP não apresentaram 100% de concordância para a
classificação das amostras como produtoras de MBL. As combinações que
apresentaram resultados concordantes maior ou igual a 90% foram
ceftazidima/MPA (para todos os pontos de corte analisados), imipenem/MPA (10
mm) e imipenem/MAC (9 e 10 mm).
Uma vez que os discos IP apresentaram, para a maioria das
combinações, os maiores halos de inibição e a maior freqüência de resultados
positivos para a classificação correta das amostras produtoras de MBL, esta
metodologia de preparo dos discos foi a selecionada para a realização da detecção
fenotípica de MBL por disco combinado em todas as amostras incluídas no estudo.
4.4.2.2 Disco combinado para a detecção de MBL e análise dos resultados
Assim como observado para a técnica de disco aproximação, os
inibidores FEN e MET também não foram capazes de discriminar os isolados
quanto à produção de MBL pela metodologia de disco combinado. Por outro lado,
EDTA, MPA e MAC apresentaram, à análise geral, bom poder discriminatório para a
detecção de MBL por disco combinado. A Tabela 9 apresenta a média do aumento
do halo produzido pelas diferentes combinações β-lactâmico/IMBL, utilizando 2, 4,
6, 8 e 10 μl de cada inibidor. A diferença entre as médias dos halos de inibição dos
controles positivos e dos negativos representa o poder discriminatório do teste.
Resultados 48
Tabela 9. Média do aumento do halo produzido pelas diferentes combinações β-
lactâmico/IMBL e respectivo poder discriminatório da combinação para detecção de
MBL por disco combinado.
IMBL
a
Volume
(μl)
Media do aumento do halo
Poder discriminatório
Ceftazidima Imipenem
MBL
a
+ MBL- MBL+ MBL- Ceftazidima Imipenem
EDTA
a
2 6,5 0,6 6,3 1,2 5,9 5,1
4 9,8 1,8 7,6 2,0 8,0 5,6
6 10,9 2,7 8,1 2,8 8,2 5,3
8 11,6 3,2 8,6 3,3 8,4 5,3
10 12,3 4,4 9,2 3,7 7,9 5,5
MPA
a
2 15,3 2,3 2,6 0,1 13,0 2,5
4 15,9 3,6 4,0 1,3 12,3 2,7
6 17,4 6,9 4,9 3,7 10,5 1,2
8 18,0 7,8 6,0 4,4 10,2 1,6
10 19,0 9,8 7,3 5,7 9,2 1,6
MAC
a
2 11,2 0,6 3,1 0,0 10,6 3,1
4 13,2 1,8 2,8 0,1 11,4 2,7
6 14,0 3,7 3,8 0,7 10,3 3,1
8 14,5 5,5 5,2 2,7 9,0 2,5
10 14,8 6,5 5,8 3,9 8,3 1,9
MET
a
2 1,6 0,4 1,2 0,4 1,2 0,8
4 2,2 0,4 2,2 0,4 1,8 1,8
6 2,4 0,3 2,5 0,4 2,1 2,1
8 3,1 0,5 2,9 0,4 2,6 2,5
10 3,0 0,2 3,1 0,5 2,8 2,6
FEN
a
2 0,3 0,5 1,1 1,0 -0,2 0,1
4 1,0 1,1 0,9 1,6 -0,1 -0,7
6 1,8 1,7 0,8 1,7 0,1 -0,9
8 2,4 2,6 1,5 2,1 -0,2 -0,6
10 2,8 3,1 1,9 2,7 -0,3 -0,8
a
– IMBL: inibidor de Metalo-β-lactamase; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido
mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético; MET: mercaptoetanol; FEN: fenantrolina;
MBL: metalo-β-lactamase.
A Figura 5 mostra as curvas ROC construídas a partir do aumento no
tamanho do halo obtido com as combinações empregando os IMBL MET e FEN.
Independente do volume de IMBL e substratos testados, estas combinações
produziram curvas que acompanharam a linha de referência. Uma vez que os
inibidores MET e FEN produziram curvas com baixas AACs e altos valores de p
(Tabela 10), e portanto demonstraram baixa capacidade de inibir as MBLs
estudadas, estes inibidores foram excluídos das análises estratificadas dos
Resultados 49
resultados de disco combinado.
Figura 5. Curvas ROC originadas com as combinações (A) MET/ceftazidima, (B)
MET/imipenem, (C) FEN/ceftazidima e (D) FEN/imipenem, para os diferentes
volumes de cada IMBL, frente a todas as amostras incluídas no estudo.
Curvas altas e à esquerda foram produzidas com os resultados de ceftazidima
utilizando EDTA, MPA e MAC. A combinação imipenem/EDTA gerou curvas mais
baixas que aquelas obtidas para esse IMBL em combinação com ceftazidima.
Entretanto, as curvas para MAC e MPA associados ao imipenem apresentaram-se
próximas à linha de referência, indicando o baixo poder discriminatório desta
combinação para a detecção de MBL (Figura 6).
A)
B)
C)
D)
Resultados 50
Figura 6. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E) ceftazidima/MAC e
(F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada IMBL, frente a todas as
amostras incluídas no estudo.
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Resultados 51
Como demonstrado nas Figuras 5 e 6, a variação no volume de IMBL
aplicados aos discos não gerou resultados discrepantes à análise geral, exceto para
as combinações imipenem/MPA e imipenem/MAC.
Tabela 10. Valores de área abaixo da curva (AAC), erro padrão e o valor de p,
calculados para as curvas ROC desenhadas com todas as combinações β-
lactâmicos/IMBL, frente todas as amostras incluídas no estudo
IMBL
a
Volume
(µl)
Ceftazidima Imipenem
AAC
Erro
padrão
Valor de
p
AAC
Erro
padrão
Valor de
p
EDTA
a
2 0,768 0,057 0,001 0,819 0,051 0,000
4 0,876 0,043 0,000 0,820 0,051 0,000
6 0,880 0,042 0,000 0,824 0,051 0,000
8 0,890 0,040 0,000 0,819 0,051 0,000
10 0,883 0,041 0,000 0,804 0,055 0,000
MPA
a
2 0,890 0,041 0,000 0,720 0,062 0,006
4 0,877 0,043 0,000 0,718 0,065 0,006
6 0,866 0,044 0,000 0,602 0,077 0,199
8 0,874 0,043 0,000 0,597 0,078 0,220
10 0,868 0,044 0,000 0,566 0,077 0,407
MAC
a
2 0,870 0,042 0,000 0,728 0,061 0,004
4 0,876 0,043 0,000 0,724 0,061 0,005
6 0,845 0,048 0,000 0,703 0,064 0,011
8 0,846 0,046 0,000 0,600 0,069 0,210
10 0,836 0,047 0,000 0,583 0,071 0,296
MET
a
2 0,540 0,077 0,614 0,479 0,079 0,795
4 0,541 0,077 0,604 0,485 0,078 0,846
6 0,552 0,076 0,512 0,497 0,078 0,971
8 0,540 0,076 0,614 0,497 0,078 0,868
10 0,531 0,077 0,692 0,465 0,079 0,655
FEN
a
2 0,440 0,081 0,449 0,406 0,080 0,234
4 0,475 0,079 0,756 0,339 0,076 0,043
6 0,463 0,075 0,644 0,374 0,080 0,111
8 0,443 0,074 0,471 0,378 0,077 0,125
10 0,467 0,077 0,676 0,362 0,077 0,082
a
– IMBL: inibidor de Metalo-β-lactamase; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido
mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético; MET: mercaptoetanol; FEN: fenantrolina.
O erro padrão, o valor de p, e a AAC calculados para as curvas ROC
desenhadas com todas as amostras incluídas no estudo, estão dispostos na Tabela
Resultados 52
10. As curvas ROC construídas com o aumento no tamanho do halo para os
subgrupos Acinetobacter spp., P. aeruginosa, enterobactérias, IMP, SPM e VIM,
utilizando EDTA, MPA e MAC em combinação com ceftazidima e imipenem estão
apresentados nos Anexos 7, 8, 9, 10, 11 e 12, respectivamente.
Todos os valores de sensibilidade e especificidade fornecidos pelas
curvas ROC e as condições experimentais correspondentes, estão dispostos no
Anexo 8. Uma vez que as variadas curvas resultaram em uma grande quantidade
de valores de sensibilidade e especificidade, e, por ser o objetivo deste estudo a
seleção de um teste de triagem para a produção de MBL, apenas estão
apresentados os resultados de sensibilidade superior a 80%. Na Tabela 11 estão
apresentados os maiores valores de sensibilidade e especificidade obtidos para a
detecção de MBL por disco combinado, para a análise geral e estratificada por
subgrupos, assim como as respectivas condições experimentais. A análise das
curvas ROC de acordo com a estratificação por microrganismo, traduzida pelos
valores de AAC, erro padrão e valor de p para as diferentes combinações de β-
lactâmico/IMBL(2 a 10 μl), está disposta na Tabela 12. Os respectivos valores para
os subgrupos SPM, IMP e VIM estão apresentados na Tabela 13.
À análise geral, as combinações de ceftazidima com EDTA, MAC e MPA,
e de imipenem com EDTA, resultaram em curvas ROC com significância estatística
para discriminar produtores e não produtores de MBL (p < 0,001). A AAC para
essas combinações variou entre 0,768 e 0,890. No entanto, a curva foi menos
discriminatória para MPA e MAC combinados com imipenem, evidenciado por
menores AAC e maiores valores de p. A piora do desempenho dos discos contendo
imipenem/MPA e imipenem/MAC foi proporcional ao aumento do volume de IMBL
adicionado (Tabela 10). Porém, a melhor performance da técnica de disco
Resultados 53
combinado, à análise geral, foi obtida pela combinação ceftazidima/EDTA(10 µl),
utilizando, como ponto de corte, o aumento de 9 mm no halo de inibição para os
discos contendo o IMBL e o β-lactâmico, quando comparados ao disco contendo
somente ceftazidima (83% sensibilidade e 90% especificidade, Tabela 9)
Tabela 11. Maiores percentuais de sensibilidade (SN) e especificidade (SP) e
respectivas condições experimentais, resultantes da análise geral e estratificada por
subgrupos para a detecção de metalo-β-lactamase pela técnica de disco combinado.
Subgrupo
SN
(%)
SP
(%)
Condições experimentais
Combinação β-
Lactâmico/IMBL
a
Volume de
IMBL (µl)
Ponto de
corte
(mm)
Geral 83 90 Ceftazidima/EDTA
a
10 9,0
Acinetobacter spp. 80 100 Imipenem/MAC
a
2 1,0
Pseudomonas aeruginosa
96 100 Ceftazidima/EDTA 6 8,0
96 100 Ceftazidima/EDTA 8 8,0
96 100 Ceftazidima/MPA
a
8 14,0
Enterobacteriaceae 100 100 Imipenem/EDTA 2 3,0
100 100 Imipenem/EDTA 4 4,0
100 100 Imipenem/EDTA 6 4,0
100 100 Imipenem/EDTA 8 4,0
100 100 Imipenem/EDTA 10 5,0
IMP 86 89 Ceftazidima/MPA 2 9,0
SPM 100 100 Ceftazidima/EDTA 6 8,0
100 100 Ceftazidima/EDTA 8 9,0
100 100 Ceftazidima/MPA 2 13,0
100 100 Ceftazidima/MPA 4 15,0
100 100 Ceftazidima/MPA 6 17,0
100 100 Ceftazidima/MPA 8 17,0
100 100 Ceftazidima/MAC 4 10,0
100 100 Ceftazidima/MAC 6 12,0
100 100 Ceftazidima/MAC 10 14,0
VIM 83 100 Imipenem/EDTA 2 4,0
a
– IMBL: inibidor de metalo-β-lactamase; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido
mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético.
Resultados 54
Para Acinetobacter spp., a técnica de disco combinado utilizando
ceftazidima resultou em maior número de curvas altas e à esquerda quando
comparadas àquelas utilizando imipenem, independente do IMBL testado (Figura 7).
Entretanto, os maiores valores de sensibilidade e especificidade obtidos para esse
grupo de microrganismos foram 80% e 100%, respectivamente (Tabela 11),
utilizando imipenem e 2 µl de MAC (AAC = 0,9, Tabela 12). No entanto, o ponto de
corte empregado para gerar esses resultados foi o aumento de 1 mm na zona de
inibição dos discos combinados, em relação aos discos contendo imipenem
isoladamente.
Para o subgrupo P. aeruginosa, a técnica de disco combinado resultou
em curvas altas e à esquerda para as combinações ceftazidima/EDTA (exceto para
EDTA 2 μl), imipenem/EDTA, ceftazidima/MPA, e ceftazidima/MAC (Figura 8). Para
esta espécie, os maiores valores de sensibilidade e especificidade (96% e 100%,
respectivamente) foram obtidos com as combinações ceftazidima/EDTA e
ceftazidima/MPA (Tabela 11).
Para as enterobactérias as combinações ceftazidima/EDTA, MPA e MAC
produziram curvas semelhantes, porém menos discriminatórias que as geradas por
imipenem/EDTA, de perfeito poder discriminatório (Figura 9). Esta última, foi a única
combinação, entre os subgrupos de patógenos, a apresentar valores de
sensibilidade e especificidade de 100% (Tabela 11), e AAC de 1,000 (p=0,002,
Tabela 12), independente da quantidade do IMBL adicionada aos discos.
Resultados 55
Tabela 12. Valores de área abaixo da curva (AAC), erro padrão e o valor de p, calculados
para as curvas ROC desenhadas com todas as combinações β-lactâmicos/IMBL, frente aos
subgrupos Acinetobacter spp., P. aeruginosa e enterobactérias.
IMBL
Volume
(μl)
Ceftazidima Imipenem
AAC
Erro
padrão
Valor de
p
AAC
Erro
padrão
Valor de
p
Acinetobacter
spp.
EDTA
a
2 0,065 0,138 0,329 0,567 0,145 0,664
4 0,800 0,119 0,051 0,433 0,145 0,664
6 0,717 0,129 0,159 0,333 0,141 0,278
8 0,758 0,121 0,093 0,317 0,136 0,233
10 0,750 0,131 0,104 0,375 0,142 0,416
MPA
a
2 0,800 0,112 0,051 0,900 0,082 0,009
4 0,650 0,145 0,329 0,542 0,149 0,786
6 0,658 0,144 0,303 0,367 0,149 0,386
8 0,692 0,135 0,212 0,350 0,149 0,329
10 0,625 0,143 0,416 0,242 0,122 0,093
MAC
a
2 0,800 0,112 0,051 0,900 0,082 0,009
4 0,867 0,097 0,017 0,692 0,133 0,212
6 0,675 0,137 0,255 0,458 0,153 0,786
8 0,625 0,145 0,416 0,217 0,126 0,065
10 0,692 0,133 0.212 0,175 0,118 0,034
Pseudomonas
aeruginosa
EDTA
2 0,801 0,075 0,023 0,821 0,070 0,015
4 0,958 0,033 0,001 0,848 0,065 0,008
6 0,964 0,035 0,000 0,899 0,054 0,002
8 0,964 0,035 0,000 0,893 0,055 0,003
10 0,952 0,038 0,001 0,881 0,058 0,004
MPA
2 0,976 0,023 0,000 0,574 0,119 0,572
4 0,964 0,029 0,000 0,744 0,111 0,064
6 0,946 0,037 0,001 0,539 0,150 0,769
8 0,982 0,020 0,000 0,604 0,144 0,429
10 0,970 0,026 0,000 0,580 0,135 0,542
MAC
2 0,923 0,047 0,001 0,643 0,107 0,278
4 0,946 0,039 0,001 0,768 0,083 0,042
6 0,923 0,047 0,001 0,780 0,095 0,034
8 0,893 0,055 0,003 0,729 0,087 0,082
10 0,887 0,056 0,003 0,661 0,090 0,223
Enterobactérias
EDTA
2 0,796 0,128 0,064 1,000 0,000 0,002
4 0,724 0,146 0,160 1,000 0,000 0,002
6 0,796 0,135 0,064 1,000 0,000 0,002
8 0,765 0,136 0,097 1,000 0,000 0,002
10 0,755 0,138 0,110 1,000 0,000 0,002
MPA
2 0,714 0,152 0,180 0,857 0,112 0,025
4 0,755 0,138 0,110 0,571 0,158 0,655
6 0,724 0,145 0,160 0.571 0,158 0,655
8 0,673 0,159 0,159 0,673 0,155 0,277
10 0,714 0,148 0,180 0,684 0,152 0,250
MAC
2 0,724 0,146 0,160 0,786 0,131 0,074
4 0,663 0,161 0,307 0,571 0,158 0,655
6 0,663 0,161 0,307 0,571 0,158 0,655
8 0,745 0,143 0,125 0,490 0,160 0,949
10 0,745 0,143 0,125 0,612 0,159 0,482
a
- EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético
Resultados 56
Figura 7. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E) ceftazidima/MAC e
(F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada IMBL, frente aos isolados de
Acinetobacter spp.
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Resultados 57
Figura 8. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E) ceftazidima/MAC e
(F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada IMBL, frente aos isolados de
P. aeruginosa.
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Resultados 58
Figura 9 Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E) ceftazidima/MAC e
(F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada IMBL, frente às amostras
de enterobactérias
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Resultados 59
Para a detecção das amostras produtoras de MBL do tipo IMP, as
combinações que associaram ceftazidima a qualquer um dos IMBL apresentaram
curvas ROC com os maiores valores de AAC (Tabela 13). Entretanto, foi a curva
produzida pela combinação ceftazidima/MPA que gerou os melhores resultados de
sensibilidade e especificidade, 86% e 89%, respectivamente (Tabela 11). Entre as
combinações utilizando imipenem como substrato, as curvas geradas empregando
EDTA como IMBL foram as mais discriminatórias (Figura 10). Somente as
combinações de imipenem/MPA(4 e 6 μl) e imipenem/MAC(4 e 6 μl) produziram
curvas sem significância estatística para o grupo de bactérias produtoras de IMP
(Tabela 13).
Para a detecção das amostras produtoras de SPM, ceftazidima com
EDTA (exceto 2 μl), MPA e MAC, e imipenem com EDTA produziram curvas altas e
à esquerda. Os maiores valores de AAC foram obtidos utilizando EDTA 6 e 8 μl,
MPA 2-8 μl e MAC 4-10 μl com ceftazidima (AAC=1,0 e p=0,000). Para estas
combinações, os resultados de sensibilidade e especificidade foram 100% (Tabela
11). As combinações utilizando imipenem como substrato apresentaram os
melhores valores de AAC (0,997) quando associando EDTA (4 e 8 µl).
Imipenem/MAC(6, 8 e 10 μl) apresentou melhor desempenho quando comparado a
imipenem/MPA (Figura 11). Adicionalmente, a maioria das outras combinações
apresentou curvas com p≤0,05, exceto aquelas produzidas por ceftazidima/EDTA(2
µl), imipenem/MPA(10 μl) e imipenem/MAC(2 µl) (Tabela 13).
Para as amostras produtoras de MBL do tipo VIM as curvas produzidas
com MPA e MAC, exceto ceftazidima/MAC(2 μl), mantiveram-se próximas à linha de
referência, independente do substrato (Figura 12). Neste grupo de bactérias,
Resultados 60
valores de AAC acima de 0,9 foram atingidos utilizando imipenem em combinação
com 2, 4, 6 e 8 μl de EDTA (p≤0,05, Tabela 13). No entanto, os discos combinados
contendo imipenem e 2 µl de EDTA atingiram os maiores valores de sensibilidade e
especificidade (83% e 100%, respectivamente, Tabela 11).
Os maiores valores percentuais de sensibilidade e especificidade, obtidos
para as diferentes estratificações em ambas as técnicas disco aproximação e disco
combinado, cujas conduções experimentais estão dispostas nas tabelas 6 e 11,
respectivamente, estão representados na Figura 13.
Resultados 61
Tabela 13. Valores de área abaixo da curva (AAC), erro padrão e o valor de p, calculados
para as curvas ROC desenhadas com todas as combinações β-lactâmicos/IMBL, frente aos
subgrupos de isolados produtores de IMP, SPM e VIM.
a
- EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido mercaptopropiônico; MAC: ácido mercaptoacético
IMBL
Volume
(μl)
Ceftazidima Imipenem
AAC
Erro
padrão
Valor de
p
AAC
Erro
padrão
Valor de
p
SPM
EDTA
2 0,668 0,117 0,142 0,887 0,081 0,001
4 0,989 0,013 0,000 0,997 0,005 0,000
6 1,000 0,000 0,000 0,992 0,011 0,000
8 1,000 0,000 0,000 0,997 0,005 0,000
10 0,979 0,021 0,000 0,963 0,034 0,000
MPA
2 1,000 0,000 0,000 0,734 0,110 0,041
4 1,000 0,000 0,000 0,821 0,083 0,005
6 1,000 0,000 0,000 0,787 0,085 0,012
8 1,000 0,000 0,000 0,742 0,096 0,035
10 0,989 0,014 0,000 0,718 0,100 0,057
MAC
2 0,929 0,063 0,000 0,700 0,114 0,081
4 1,000 0,000 0,000 0,842 0,093 0,003
6 1,000 0,000 0,000 0,971 0,029 0,000
8 1,000 0,000 0,000 0,971 0,026 0,000
10 1,000 0,000 0,000 0,955 0,036 0,000
IMP
EDTA
2 0,810 0,063 0,000 0,754 0,072 0,003
4 0,914 0,043 0,000 0,717 0,076 0,012
6 0,890 0,049 0,000 0,727 0,076 0,009
8 0,914 0,043 0,000 0,722 0,075 0,011
10 0,916 0,043 0,000 0,724 0,074 0,010
MPA
2 0,916 0,046 0,000 0,729 0,072 0,008
4 0,905 0,048 0,000 0,706 0,076 0,018
6 0,882 0,053 0,000 0,572 0,086 0,404
8 0,905 0,045 0,000 0,564 0,087 0,461
10 0,893 0,047 0,000 0,539 0,087 0,649
MAC
2 0,897 0,049 0,000 0,714 0,074 0,013
4 0,914 0,044 0,000 0,698 0,075 0,022
6 0,871 0,053 0,000 0,648 0,080 0,089
8 0,859 0,054 0,000 0,508 0,085 0,922
10 0,846 0,056 0,000 0,509 0,086 0,914
VIM
EDTA
2 0,763 0,133 0,056 0,952 0,050 0,001
4 0,605 0,170 0,445 0,947 0,047 0,001
6 0,693 0,167 0,162 0,943 0,051 0,001
8 0,636 0,165 0,324 0,912 0,064 0,003
10 0,618 0,168 0,390 0,868 0,073 0,008
MPA
2 0,671 0,145 0,215 0,649 0,146 0,279
4 0,645 0,163 0,294 0,561 0,154 0,656
6 0,579 0,162 0,567 0,434 0,144 0,633
8 0,539 0,174 0,775 0,509 0,144 0,949
10 0,544 0,158 0,750 0,443 0,148 0,679
MAC
2 0,614 0,149 0,408 0,833 0,122 0,016
4 0,456 0,169 0,750 0,649 0,146 0,279
6 0,421 0,175 0,567 0,605 0,146 0,445
8 0,482 0,164 0,899 0,434 0,159 0,633
10 0,469 0,166 0,824 0,351 0,143 0,279
Resultados 62
Figura 10. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E) ceftazidima/MAC e
(F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada IMBL, frente aos isolados
produtores de IMP.
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Resultados 63
Figura 11. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E) ceftazidima/MAC e
(F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada IMBL, frente aos isolados
produtores de SPM.
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Resultados 64
Figura 12. Curvas ROC originadas com as combinações (A) ceftazidima/EDTA, (B)
imipenem/EDTA, (C) ceftazidima/MPA, (D) imipenem/MPA, (E) ceftazidima/MAC e
(F) imipenem/MAC, para os diferentes volumes de cada IMBL, frente aos isolados
produtores de VIM
A) B)
C)
D)
E)
F)
Resultados 65
Figura 13. Maiores percentuais de sensibilidade e especificidade obtidos com as
técnicas de disco aproximação (DA) e disco combinado (DC), estratificados por
patógenos (A) e por tipo de enzima produzida (B), sendo P. aeruginosa (PSA),
Acinetobacter spp. (ACB) e enterobactérias (ENT);
A)
B)
Discussão 66
5 DISCUSSÃO
A técnica padrão-ouro para a detecção fenotípica de uma amostra como
produtora de MBL é a identificação espectrofotométrica da hidrólise de
carbapenens, que é inibida após incubação com EDTA, a partir da obtenção do
extrato protéico bacteriano (Walsh, 2005). Porém, esta é uma técnica laboriosa, que
necessita de técnicos experientes e equipamentos especiais.
A identificação do gene que codifica MBL por PCR, seguida ou não do
seqüenciamento do respectivo gene, é a técnica padrão-ouro para a detecção
genotípica de MBL. Apesar de mais rápida, esta técnica também requer
equipamentos específicos, reagentes dispendiosos e apenas pode ser realizada
para a pesquisa de MBL codificadas por genes já descritos. Além disso, a presença
do gene não necessariamente indica que o mesmo seria expresso. No entanto, a
identificação da produção de MBL é imprescindível para a implementação de
terapia adequada e medidas de controle de infecção (Cornaglia et al., 2007).
Recentemente, Marra e colaboradores (2006) reportaram que a maior
taxa de mortalidade em pacientes infectados por P. aeruginosa produtoras de MBL,
quando comparado a pacientes infectados por amostras não produtoras de MBL,
provavelmente era relacionada ao uso empírico de terapia antimicrobiana
inadequada. Por essas razões, é necessário o desenvolvimento de um teste
fenotípico de fácil realização de alta acurácia para a identificação dos isolados
produtores de MBL pelo laboratório de microbiologia clínica (Cornaglia et al., 2007).
Existem muitos relatos acerca da detecção fenotípica de MBL.
Porém, os estudos que abordam estes testes apresentam importantes limitações,
tais como:
Discussão 67
• amostragem insatisfatória, incluindo pequeno número de isolados
bacterianos, muitas vezes produtores de um mesmo subtipo de enzima
(Arakawa et al., 2000; Franklin et al., 2006; Lee et al., 2003; Walsh et al.,
2002); ou amostras nas quais não foram realizados tipagem molecular com
o objetivo de excluir possíveis clones (Kimura et al., 2005; Yan et al., 2004,
Yong et al., 2002);
• nenhum dos estudos publicados para a detecção fenotípica da produção de
MBL incluiu cepas produtoras de GIM, SIM ou SPM, sendo esta última, a
enzima mais prevalente em diferentes hospitais brasileiros (Arakawa et al.,
2000; Franklin et al, 2006; Jesudason et al., 2005; Kimura et al., 2005; Lee
at al., 2001; Lee at al., 2003; Marchiaro et al., 2005; Payne at al., 1994;
Petropoulou et al., 2006; Walsh et al., 2002; Yan et al., 2004).
• os estudos apresentam critérios conflitantes quanto a quais amostras
deveriam ser triadas para a produção de MBL, aquelas resistentes à
ceftazidima (Arakawa et al., 2000) ou aos cabapenens (Lee et al., 2003).
Muitas vezes, amostras classificadas como sensíveis pelos pontos de corte
estabelecidos pelo CLSI podem ser produtoras de MBL (Frankling et al.,
2006).
• ausência de testes que avaliem a interferência da ação bactericida dos
IMBLs sobre o crescimento bacteriano (Arakawa et al., 2000; Lee et al.,
2003). Além disto, Kimura et al. (2005) ressalta em seu trabalho que muitos
estudos não consideram que alguns inibidores são capazes por si só de
hidrolisar os agentes β-lactâmicos, podendo gerar resultados falso-
positivos;
• a ausência de resultados estratificados por espécie ou gênero. Na maioria
Discussão 68
dos casos, os trabalhos apresentam resultados de sensibilidade e
especificidade que refletem a performance global para todos os organismos
incluídos no estudo (Arakawa et al., 2000; Frankling et al., 2006; Marchiaro
et al., 2005; Walsh et al., 2002).
• A análise dos resultados é realizada, muitas vezes, de forma subjetiva, sem
a validação por um método estatístico. Adicionalmente, não existem
trabalhos que reportem os valores preditivos positivos e negativos para os
testes estudados (Franklin et al., 2006; Petropoulou et al., 2006; Yong et
al., 2002).
No presente trabalho realizamos a detecção fenotípica de MBL utilizando
65 amostras bacterianas de diferentes gêneros e espécies, não relacionadas
geneticamente, que apresentavam perfis de sensibilidade a ceftazidima e a
imipenem distintos, e que eram originárias de diferentes regiões geográficas. Entre
os controles positivos, foram avaliadas 46 amostras, contemplando os cinco tipos
de MBL já descritos: IMP, VIM, SPM, GIM e SIM. Entre os controles negativos,
foram selecionadas 19 bactérias também de diferentes gêneros, com sensibilidade
reduzida à ceftazidima e/ou imipenem, porém sabidamente não produtores de MBL.
Neste grupo de controles foram incluídas amostras produtoras de outras enzimas,
como SME-1, OXA-23 e GES-5 que, apesar de possuírem a capacidade de
hidrolisar imipenem, não são MBLs.
A produção de MBL para os controles positivos e a não produção, para
os controles negativos, foi confirmada pela amplificação ou não dos respectivos
genes. A importância de selecionar amostras produtoras de diferentes enzimas e
que não apresentassem relação genética entre si para a avaliação da acurácia de
um teste diagnóstico está relacionada com a possibilidade de mimetizar a
Discussão 69
variabilidade da população bacteriana na qual o teste será aplicado, quando
padronizado na rotina de um laboratório de microbiologia.
As amostras bacterianas foram submetidas a duas metodologias
diferentes para a detecção fenotípica da produção de MBL, disco aproximação e
disco combinado. Modificações das técnicas originalmente propostas foram
realizadas para avaliar a acurácia dos testes. Estas modificações contemplaram,
para o teste de disco aproximação, a inclusão do substrato imipenem e do inibidor
fenantrolina, e o teste de diferentes distâncias (1,0 a 3,0 cm) entre os discos de β-
lactâmicos e IMBL. Para a técnica de disco combinado, diferentes quantidades de
IMBLs foram adicionados aos discos contendo os β-lactâmicos e a análise dos
resultados foi feita considerando diferentes pontos de corte. Os antimicrobianos β-
lactâmicos ceftazidima e imipenem foram os substratos utilizados frente a cinco
IMBLs: EDTA, MPA, MAC, MET e FEN, pelas duas técnicas acima citadas.
Independente da metodologia, o fundamento dos testes fenotípicos para
a detecção de MBL é a maior inibição do crescimento bacteriano ocasionado pela
associação do IMBL ao substrato, comparado à ação do antimicrobiano
isoladamente. Porém, as soluções de IMBL podem apresentar efeito bactericida,
dependendo da concentração utilizada. Assim, a associação substrato/IMBL pode
gerar maiores zonas de inibição do crescimento bacteriano, não necessariamente
devido à inibição da atividade da MBL. Este fato foi observado anteriormente,
quando EDTA e MPA foram utilizados como IMBLs para a detecção fenotípica de
MBL (Chu et al., 2005; Lee at al., 2003). No presente estudo, diferentes
concentrações de IMBLs foram avaliadas segundo a capacidade de inibir o
crescimento bacteriano da cepa ATCC de P. aeruginosa 27583, com o objetivo de
selecionar as concentrações que apresentassem menor efeito bactericida e evitar
Discussão 70
assim, a ocorrência de possíveis resultados falso-positivos.
Outra característica de alguns IMBLs é a capacidade de diminuir a
atividade de certos antimicrobianos, o que poderia implicar em resultados falso-
negativos pela ausência do substrato, caso ambos fossem associados em um teste
para a detecção de MBL. Kimura e colaboradores (2005) descreveram a
capacidade de MPA em hidrolisar imipenem, mas não ceftazidima, ampicilina e
aztreonam. Entretanto, a ação hidrolítica de EDTA, MAC, MET e FEN sobre
imipenem e ceftazidima não foi discutida até o momento. Assim, realizamos ensaios
espectrofotométricos para avaliar a ação das soluções de IMBLs sobre ceftazidima
e imipenem. Os inibidores EDTA e FEN não foram capazes de inativar os
antimicrobianos. No entanto, como observado por Kimura e colaboradores,
imipenem sofreu inativação por MPA. Essa atividade não foi restrita a esse inibidor,
uma vez que os outros IMBLs derivados do tiol, MAC e MET, também apresentaram
atividade inibitória sobre imipenem. Ainda que os testes utilizando derivados de tiol
e imipenem poderiam ter sido prejudicados pela inativação da droga, essas
combinações foram incluídas na realização dos testes fenotípicos para a detecção
de MBL. Adicionalmente, ao contrário do obervado para imipenem, ceftazidima se
mostrou estável à hidrólise por todos os inibidores.
Embora muitos estudos tenham realizado a detecção fenotípica de MBL
utilizando amostras de Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e/ou enterobactérias,
alguns deles não avaliaram os resultados estratificados pelo gênero ou espécie
bacteriana. Nestes casos, os resultados de sensibilidade e especificidade
apresentados por estes estudos refletem o desempenho geral de todos os isolados
e podem não ser ideais para determinado gênero ou espécie (Arakawa et al., 2000;
Franklin et al., 2006; Marchiaro et al., 2005; Walsh et al., 2005). Outros estudos
Discussão 71
apresentam os resultados divididos por espécie, contudo os autores não
especificam se apenas controles negativos representantes daquela espécie ou
gênero foram considerados para o cálculo de sensibilidade e especificidade (Lee et
al., 2003; Yan et al., 2004). É importante considerar a forma pela qual os resultados
são analisados uma vez que observamos diferentes valores de sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo, de acordo com o
subgrupo analisado. Uma vez que a amostra que será testada para detecção de
MBL já foi devidamente identificada pelo laboratório de microbiologia clínica, é
desejável que a seleção do teste a ser realizado seja baseada em estudos que
apresentaram bons resultados, especificamente para aquele microrganismo. Neste
estudo apresentamos os resultados globais e estratificados por microrganismo e
enzima produzida, para cada modificação de ambas as técnicas, disco combinado e
disco aproximação.
Os agentes MET e FEN demonstraram fraca capacidade inibitória sobre
as MBL testadas, uma vez que os resultados de sensibilidade produzidos por esses
agentes foram inferiores a 60%, independente da técnica utilizada, do substrato e
do subgrupo considerado. Os IMBL derivados de compostos tiolados podem
apresentar, em pH neutro, diferentes grupos funcionais: aniônicos, catiônicos ou
neutros. MAC e MPA apresentam grupos aniônicos, enquanto que MET apresenta
características neutras. Siemann e colaboradores (2003) demostraram que a
inibição da atividade das MBL por compostos tiolados aniônicos acontece
imediatamente após o contato entre o IMBL, a enzima e o substrato. Em
contrapartida, IMBL com característica neutra apresentam inibição tardia, de forma
que a maior atividade é obtida preincubando o IMBL e a enzima, antes da adição do
substrato. Assim, a fraca atividade inibitória apresentada por MET pode ser
Discussão 72
explicada pela ausência de uma etapa de preincubação durante a realização da
detacção fenotípica de MBL.
A técnica de disco aproximação, que consiste na aproximação de um
disco contendo substrato e outro contendo IMBL, é amplamente utilizada para a
detecção fenotípica de MBL (Chu et al., 2005; Lee et al., 2001; Lee et al., 2003; Yan
et al., 2004). Essa técnica, proposta por Arakawa e colaboradores (2000), indica
produção de MBL com o surgimento de deformações do halo do antimicrobiano
ceftazidima em direção ao disco contendo o inibidor, ou o aparecimento de uma
zona fantasma entre os dois discos. Os autores utilizaram distâncias de 1,0 a 2,5
cm (centro a centro) entre os discos de ceftazidima e os de inibidores, EDTA, MPA,
MAC, MET. No entanto, apesar de o trabalho indicar que MPA é o melhor IMBL, a
melhor distância entre os discos para a detecção de amostras produtoras de MBL
não foi estabelecida. Neste estudo, realizamos algumas modificações da técnica
originalmente proposta: adicionamos imipenem como substrato e FEN como IMBL.
Distintas distâncias 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 cm entre os centros dos discos de β-
lactâmicos e dos IMBLs foram testadas.
Para a técnica de disco aproximação, a hidrólise de MPA sobre imipenem
demonstrou não interferir com a detecção de MBL, uma vez que essa combinação,
utilizando distâncias de 1,5 cm entre os discos, gerou os melhores resultados de
sensibilidade e especificidade (93,5% e 89,5%, respectivamente). Esses resultados
refletem o grupo total de amostras incluídas no estudo. No entanto, melhores
valores de sensibilidade e especificidade foram observados quando as análises
foram estratificadas por patógeno e enzima produzida.
Para P. aeruginosa e Acinetobacter spp., os melhores resultados de
Discussão 73
sensibilidade e especificidade (100%) foram observados quando MPA foi utilizado
como IMBL. Porém, independente do tipo de enzima produzida, ceftazidima foi
melhor substrato para a detecção das amostras de P. aeruginosa produtoras de
MBL (à distância de 2,0 e 2,5 cm entre os discos), enquanto imipenem foi o melhor
substrato para detectar a produção de MBL entre as amostras de Acinetobacter
spp. (à distância de 1,5 e 2,0 cm).
Para as enterobactérias, o desempenho da técnica de disco aproximação
não foi satisfatório como aquele observado para os grupos de P. aeruginosa e
Acinetobacter spp. O teste utilizando EDTA ou MAC associado a imipenem resultou
em 100% de sensibilidade, porém os valores de especificidade não superaram 86%.
Os baixos valores de especificidade apresentados pelos testes de disco
aproximação testando-se enterobactérias refletem os resultados falso-positivos
comumente observados entre amostras não produtoras de MBL (Yan et al., 2004).
Muitas vezes, esses achados são conseqüentes à intersecção das zonas de
inibição entre os discos de imipenem e IMBL, fruto da subjetividade da interpretação
deste teste. Já a diferença de especificidade entre os substratos para cada grupo de
microrganismos pode ser explicada pela maior atividade que imipenem exerce
sobre amostras de enterobactérias e Acinetobacter spp., e da mesma forma, pela
maior atividade que ceftazidima exerce sobre amostras de P. aeruginosa, quando
comparada à atividade do imipenem. Esta característica foi reportada por diferentes
estudos que avaliaram a atividade de β-lactâmicos contra bactérias de importância
clínica (Blondeau et al., 1999; Pfaller et al., 1999; Yamaguchi et al., 1999).
Os testes que apresentaram alta sensibilidade e especificidade para a
detecção de MBL por disco aproximação, também apresentaram altos valores
preditivos positivos e negativos, sendo que esses últimos indicadores estão
Discussão 74
intimamente relacionados à prevalência do evento sob investigação
(Marcopito&Santos, 2007). Neste trabalho, incluímos 34 amostras de P. aeruginosa,
das quais 82% eram produtoras de MBL; 14 enterobactérias das quais 50%
produziam MBL e 16 Acinetobacter spp., sendo 62,5% produtoras de MBL. Assim,
para aquelas modalidades nas quais os resultados de sensibilidade, especificidade,
valor preditivo positivo e valor preditivo negativo foram 100%, esses resultados
seriam reprodutíveis em outras localidades, ainda que a prevalência da produção de
MBL variasse. Contudo, se considerarmos o teste de disco aproximação para
enterobactérias utilizando imipenem e EDTA, a 1,5 cm de distância entre os discos,
e calcularmos os valores preditivos considerando 10 000 amostras, em uma
situação hipotética na qual a prevalência de amostras produtoras de MBL fosse
10% entre as amostras resistentes a carbapenens, teoricamente, os valores de
sensibilidade, especificidade e valor preditivo negativo continuariam os mesmos
(100%, 87,5% e 100%, respectivamente). Porém, o valor preditivo positivo seria
47% ao invés de 87,5%. Isto significaria que a probabilidade de existir a produção
de MBL em uma amostra, cujo teste foi positivo seria de apenas 47%. Por isso, faz-
se necessário o conhecimento da epidemiologia da instituição, bem como o estudo
da reprodutibilidade do teste a ser adotado pelo laboratório de microbiologia clínica
de rotina antes que se realize a seleção de um teste de triagem apropriado para a
detecção fenotípica de MBL.
A análise dos resultados de disco aproximação estratificados de acordo
com a enzima produzida não gerou resultados de sensibilidade e especificidade tão
elevados quando comparado àqueles estratificados por patógenos. Esses achados
podem ser explicados pelo agrupamento de amostras com diferentes
especificidades de substrato, como mencionado acima. A única enzima que
Discussão 75
apresentou 100% de sensibilidade foi SPM. No entanto, até o momento, a produção
de SPM encontra-se restrita a P. aeruginosa e, então, esse resultado pode ser
reflexo daquele obtido para este grupo de microrganismo. A diferença de
especificidade entre P. aeruginosa (100%) e SPM (89,5%) pode ser explicada pela
inclusão dos controles negativos, que contemplou apenas P. aeruginosa no primeiro
grupo e todos os organismos no segundo. Assim podemos inferir que a identificação
bacteriana assume maior importância que a produção de SPM, IMP ou VIM para a
detecção da produção de MBL pelo teste de disco aproximação.
A detecção de MBL por disco combinado é fundamentada na maior zona
de inibição apresentada pelos discos de agentes β-lactâmicos contendo IMBL,
quando comparada àquela produzida pelos discos de β-lactâmico isoladamente.
Este teste apresenta a vantagem de não apresentar subjetividade de interpretação,
o que o torna mais aplicável à rotina laboratorial (Franklin, 2006). No entanto,
diferentes estudos que reportaram essa técnica para a detecção de MBL utilizaram
metodologias distintas para a preparação dos discos contendo ambos o agente β-
lactâmico e o IMBL. Alguns estudos realizaram a preparação prévia dos discos
(PP), adicionando o IMBL ao disco comercial de β-lactâmico, que era seco à
temperatura ambiente e estocado à -20
o
C (Chu et al., 2005; Franklin et al, 2006;
Lee et al., 2003; Yan et al., 2004). Outros realizaram a preparação imediata (IP) à
realização do teste fenotípico, nos quais o IMBL foi adicionado ao disco contendo o
agente β-lactâmico já colocado na placa de meio de cultura inoculada com a
bactéria-teste (Kimura et al., 2005; Yong et al., 2002). Outra variável deste teste, é a
ausência de padronização para o aumento no tamanho do halo de inibição a ser
considerado como ponto de corte para determinar a produção de MBL.
Discussão 76
No presente trabalho, foi avaliada a performance de discos PP e IP para
a indicar a presença de MBL em amostras sabidamente produtoras destas enzimas.
Para tal, foram escolhidos quatro pontos de corte: 7, 8, 9 e 10 mm, baseado em
estudos prévios que utilizaram a técnica de disco combinado para a detecção de
MBL (Petropoulou et al., 2006; Pitout et al., 2005; Yong et al., 2002). As amostras
foram então categorizadas pela produção de MBL de acordo com esses pontos de
corte. O reduzido número de amostras incluídos nesta fase do estudo inviabilizou a
utilização de curvas ROC para a seleção de um ponto de corte apropriado. Porém,
é importante ressaltar que o objetivo desta etapa não era determinar qual entre as
metodologias PP e IP era a melhor para determinar a produção de MBL, mas
apenas avaliar se os resultados obtidos eram influenciados pela a técnica com a
qual o disco era preparado.
A comparação das técnicas para preparação dos discos combinados, PP
e IP, revelou haver diferenças no tamanho dos halos produzidos para uma mesma
amostra, dependendo da maneira pela qual os discos com IMBL foram preparados.
De forma geral, os halos produzidos pelos discos imediatamente preparados foram
maiores que por aqueles previamente preparados. Possivelmente, os halos
menores sejam resultantes da perda de IMBL e/ou substrato durante a secagem e
estocagem dos discos PP. Somente a combinação imipenem/EDTA apresentou
resultados similares entre as diferentes técnicas empregadas.
Conseqüentemente, o ponto de corte para considerar produção ou não
de MBL também é diretamente influenciado pela preparação dos discos. Por essa
razão, não existe concordância total entre as diferentes metodologias para
determinar a produção de MBL. No entanto, acreditamos que ambas as maneiras
de preparo dos discos possam ser utilizadas para detectar MBL, desde que a
Discussão 77
realização dos testes respeite a padronização da técnica. Assim, para que os
resultados da literatura possam ser reproduzidos e comparados pelos laboratórios
clínicos, é necessário que os autores descrevam detalhadamente o protocolo da
técnica, e que os microbiologistas realizem os testes exatamente como eles foram
descritos.
Freqüentemente, a ação bactericida dos IMBL é considerada um
interferente para a realização da técnica de disco combinado, já que poderia gerar
resultados falsos-positivos por inibição direta do crescimento bacteriano ao invés da
inibição de MBL pelo IMBL (Arakawa et al., 2000; Chu et al., 2005; Kimura et al.,
2005; Lee et al., 2003). Entretanto, nenhum dos trabalhos que utilizaram o disco
combinado para a detecção de MBL mensurou a magnitude da interferência da
ação bactericida dos IMBL sobre a acurácia do teste. Para tal, submetemos todas
as amostras incluídas no estudo à disco difusão na qual discos de filtro foram
impregnados com as mesmas quantidades de IMBL utilizadas no teste de disco
combinado. O diâmetro dos halos de inibição do crescimento bacteriano foram
medidos e comparados entre o grupo de controles positivos e negativos. Não houve
variação da média do tamanho dos halos produzidos pelos IMBL frente aos isolados
produtores e aos não produtores de MBL, com exceção de MAC (10 µl).
Uma vez que não existe diferença no tamanho do halo produzido pelo
IMBL entre os controles negativos e positivos, a inibição produzida pelo IMBL
isoladamente é anulada em um teste que apresente altos valores de sensibilidade e
especificidade,. Por isso, a ação bactericida dos IMBL não fará diferença para a
análise da acurácia do teste. É importante ressaltar que o teste será sensível e
específico dependendo do ponto de corte adotado, que deve superar o tamanho
dos halos de inibição, produzido pelo substrato e inibidor nos controles negativos.
Discussão 78
A detecção de MBL por disco combinado já foi descrita por diferentes
autores (Berges et al., 2007; Franklin et al., 2006; Yan et al., 2004; Yong et al.,
2002). No entanto, muitas vezes esses autores não consideram testar diferentes
pontos de corte para determinar a produção de MBL e assim, seus resultados de
sensibilidade e especificidade são obtidos para pontos de corte arbitrários,
baseados na observação da zona de inibição apresentada por aquela combinação
sem uma análise estatística que valide os resultados (Lee et al., 2001; Petropoulou
et al., 2006; Yong et al., 2002). Nossos resultados de disco combinado para a
detecção de MBL foram avaliados com a utilização da curva ROC. A grande
vantagem de utilizar esta ferramenta estatística, neste caso, foi a possibilidade de
avaliar diferentes pontos de corte, de 3 mm a 18 mm, para cada combinação β-
lactâmico/IMBL,. No entanto, a desvantagem da utilização da curva ROC foi a
ausência dos valores preditivos positivos e negativos para avaliar as diferentes
modificações da técnica de disco combinado.
Diferentes trabalhos previamente publicados descrevem altos valores de
sensibilidade e especificidade para a detecção de MBL em amostras de
Acinetobacter spp. por disco combinado utilizando imipenem e EDTA (Franklin et
al., 2006, Yong et al., 2002). Entretanto, no presente estudo este teste não
apresentou bom desempenho para detectar a produção de MBL entre amostras de
Acinetobacter spp. Os melhores valores de sensibilidade e especificidade obtidos
para esse grupo foram de 80% e 100%, respectivamente, utilizando 2 µl de MPA
em combinação com imipenem. No entanto, o ponto de corte para que esse
resultado fosse alcançado seria o aumento de apenas 1,0 mm no halo de inibição
do crescimento de amostras MBL positivas, uma medida pouco discriminatória,
difícil de mesurar e que prejudicaria a reprodutibilidade do teste. Uma vez que pela
Discussão 79
técnica de disco aproximação o melhor substrato e IMBL para a detecção de
amostras de Acinetobacter spp. produtoras de MBL, foi imipenem e MPA,
respectivamente, seria esperado que a mesma combinação gerasse os melhores
resultados para a técnica de disco combinado. Porém, como o MPA apresenta a
capacidade de hidrolisar imipenem e o tempo de interação do IMBL com o substrato
é maior para a técnica de disco combinado do que para a disco aproximação, a
detecção de MBL para o subgrupo Acinetobacter spp. pode ter sido prejudicada
pela diminuição da atividade do substrato.
Para o subgrupo de P. aeruginosa, os IMBL que geraram os melhores
resultados para a detecção da produção de MBL foram MPA (8 µl, ponto de corte =
14 mm) e EDTA (8 µl, ponto de corte = 8 mm). Para ambos os IMBL, ceftazidima foi
o melhor substrato, como observado para a técnica de disco aproximação. Apesar
de não existirem trabalhos que descrevam o disco combinado para detecção de
MBL em P. aeruginosa utilizando MPA como IMBL, nossos resultados são similares
aos obtidos por Hemalatha et al. (2005), já que EDTA em combinação com
ceftazidima apresentou melhor desempenho que quando esse IMBL foi combinado
ao imipenem.
A detecção de MBL no grupo Enterobacteriaceae apresentou os
melhores resultados de sensibilidade e especificidade pela técnica de disco
combinado (100%), utilizando EDTA (2µl a 10µl) e imipenem, para os diferentes
pontos de corte analisados pela curva ROC. Assim, a escolha da quantidade de
EDTA a ser incorporada aos discos de antimicrobiano deve ser selecionada
considerando o maior aumento na zona de inibição do crescimento, de forma a
obter o ponto de corte mais discriminatório. Portanto, adicionando-se 10 µl de EDTA
100 mM aos discos de imipenem, obtemos 100% de sensibilidade e especificidade
Discussão 80
para a detecção de MBL em enterobactérias, adotando como ponto de corte o
aumento de 5 mm na zona de inibição do crescimento bacteriano. Neste estudo, o
teste de disco combinado apresentou melhor desempenho que o teste de disco
aproximação para a detecção de MBL em enterobactérias. Estes resultados são
concordantes com aqueles reportados por Frankling et al. (2006). Entretanto, como
dispusemos de apenas sete controles positivos e negativos para este grupo, novos
estudos que utilizem maior número de enterobactérias são necessários para
confirmar nossos resultados.
Diferente dos resultados observados para a técnica de disco
aproximação, o tipo de enzima produzida pela bactéria pareceu influenciar no
resultado de sensibilidade e especificidade do teste de detecção de MBL pela
técnica de disco combinado. Apesar de não termos obtido 100% de sensibilidade e
especificidade entre as amostras produtoras de IMP e VIM, pudemos observar
estes resultados para a detecção de amostras produtoras de SPM. No entanto, o
mesmo resultado não foi observado para o subgrupo de P. aeruginosa. Portanto,
podemos inferir que as amostras de P. aeruginosa produtoras de IMP e VIM
influenciaram de forma negativa a sensibilidade e especificidade do teste para esse
grupo. Neste caso, a utilidade do teste de disco combinado para a detecção de
MBL em bactérias produtoras de SPM assumiria um valor meramente
epidemiológico, de aplicabilidade restrita a pesquisadores, uma vez que para o
laboratório de microbiologia clínica é mais relevante determinar a produção ou não
de MBL do que conhecer o tipo de enzima produzida pela amostra.
Os resultados estratifficados por tipo de enzima produzida não pode
contemplar as variantes GIM-1 e SIM-1, para as duas técnicas empregadas, disco
aproximação e disco combinado, uma vez que dispusemos de apenas uma amostra
Discussão 81
produtora de cada enzima. Por esta razão estudos adicionais que incluam um maior
número de isolados produtores de GIM e SIM são necessários para estimar a
acurácia de testes fenotípicos para a detecção de amostras produtoras destas
variantes de MBL.
A análise dos resultados nos permitiu perceber uma visível correlação
entre a distância dos discos (disco aproximação) ou o ponto de corte (disco
combinado) e os resultados de sensibilidade e especificidade dos testes. Distâncias
e pontos de corte maiores estavam associados a menores valores de sensibilidade,
mas também a maiores valores de especificidade. Dessa maneira, melhores
resultados de especificidade são obtidos prejudicando a sensibilidade do teste.
Além disso, a interpretação dos resultados da técnica de disco
aproximação é mais subjetiva que disco combinado. Dessa maneira, a detecção de
MBL por disco aproximação depende diretamente da experiência do técnico em
diferenciar o sinergismo verdadeiro da intersecção de zonas de inibição. Porém,
para a técnica de disco combinado, diferentes pontos de corte devem ser utilizados
para a interpretação dos resultados obtidos para a detecção de MBL em bactérias
distintas, o que dificulta sua implantação em laboratórios de rotina.
A a seleção de um dos testes para a detecção de MBL deve levar em
consideração principalmente o objetivo do pesquisador. No entanto, uma vez que a
não detecção de amostras produtoras de MBL pode ter sérias implicações clínica
(Marra et al., 2006; Zavascki et al., 2006), os laboratórios de microbiologia devem
sempre favorecer a seleção de métodos mais sensíveis. Adicionalmente, o
conhecimento da epidemiologia da instituição, bem como o estudo da
reprodutibilidade do teste a ser adotado pelo laboratório de microbiologia clínica de
Discussão 82
rotina, são imprescindíveis para a seleção de um teste de triagem apropriado para a
detecção fenotípica de MBL (Cornaglia et al., 2007).
Conclusões 83
6 CONCLUSÕES
• Concentrações mais altas dos IMBL avaliados inibiram de maneira significativa o
crescimento bacteriano; o que poderia afetar significativamente a interpretacção dos
resultados pela técnica de disco aproximação;
• Para a técnica de disco combinado, a inibição do crescimento bacteriano
causado pelo IMBL não interferiu na acurácia do teste para a detecção de MBL, uma
vez que o crescimento das amostras produtoras e não produtoras dessas enzimas
foi igualmente afetado por estes compostos;
• Os IMBL derivados do tiol, MPA, MAC e MET foram capazes inibir a atividade
antimicrobiana do imipenem; porém, não inibiram a atividade da ceftazidima. Os
inibidores EDTA e FEN não interferiram com a ação antimicrobiana dos agentes β-
lactâmicos testados;
• Na técnica de disco combinado, diferenças na metodologia de preparação dos
discos de β-lactâmicos associados a IMBL, com exceção dos discos de
imipenem/EDTA, pode gerar resultados distintos para a detecção de MBL;
Conclusões 84
• O teste de disco aproximação, utilizando MPA como IMBL a 2,0 cm de distância
de discos de ceftazidima e imipenem, respectivamente, constituiu um bom método
para detecção das amostras de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. produtoras de
MBL, podendo ser recomendado para a triagem da produção de MBL em amostras
clínicas;
• Entre as enterobactérias, o teste mais acurado para detectar a produção de MBL
foi o de disco combinado utilizando imipenem associado a 10 μl de uma solução de
EDTA a 100 mM, e considerando-se 5 mm como ponto de corte
Anexos 85
7 ANEXOS
Anexo 1 86
Anexo 1. Resultados percentuais de sensibilidade (SN), especificidade (SP), valor preditivo
positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) resultantes da análise geral e estratificada
por subgrupos para a detecção fenotípica de metalo-β-lactamase por disco aproximação,
utilizando EDTA, MPA e MAC frente aos substratos ceftazidima e imipenem.
Ceftazidima
EDTA
a
MPA
a
MAC
a
Distância
(cm) SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN
Análise
Geral
1,0 76,1 57,9 81,4 50 87 52,6 81,6 62,5 87 52,6 81,6 62,5
1,5 67,4 84,2 91,2 51,6 89,1 52,6 82 66,7 80,4 68,4 86 59,1
2,0 45,7 94,7 95,5 41,9 87 84,2 93 72,7 82,6 84,2 92,7 66,7
2,5 10,9 100 100 31,7 82,6 89,5 95 68 69,6 89,5 94,1 54,8
3,0 0 100 - 29,2 65,2 100 100 54,3 26,1 100 100 35,8
Imipenem
1,0 97,8 47 81,8 90 93,5 57,9 84,3 78,6 87 63,2 85,1 66,7
1,5 82,6 84,2 92,7 66,7 93,5 89,5 95,6 85 82,6 84,2 92,7 66,7
2,0 50 94,7 95,8 43,9 91,3 84 93,3 80 80,4 94,7 97,4 66,7
2,5 13 100 100 32,2 67,4 94,7 96,9 54,5 39,1 94,9 97,4 39,1
3,0 4,3 100 100 30,2 28,3 100 100 36,5 19,6 100 100 33,9
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Distância
(cm) SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN
Acinetobacter
spp.
1,0 30 100 100 46,2 70 100 100 66,7 70 100 100 66,7
1,5 10 100 100 40 70 100 100 66,7 70 100 100 66,7
2,0 0 100 - 37,5 70 100 100 66,7 60 100 100 60
2,5 0 100 - 37,5 50 100 100 54,5 50 100 100 54,5
3,0 0 100 - 37,5 20 100 100 42,9 10 100 100 40
Imipenem
1,0 100 33,3 71,4 100 100 50 76,9 100 90 66,7 81,8 80
1,5 90 66,7 81,8 80 100 100 100 100 90 100 100 85,7
2,0 60 100 100 60 100 100 100 100 90 100 100 85,7
2,5 10 100 100 40 90 100 100 85,7 50 100 100 54,5
3,0 10 100 100 40 60 100 100 60 30 100 100 46,2
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Distância
(cm) SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN
Pseudomonas
aeruginosa
1,0 92,9 33,3 86,7 50 96,4 33,3 87,1 66,7 96,4 50 90 75
1,5 85,7 66,7 92,3 50 100 33,3 87,5 100 89,3 66,7 92,6 57,1
2,0 57,1 100 100 33,3 100 100 100 100 96,4 100 100 85,7
2,5 14,3 100 100 20 100 100 100 100 82,1 100 100 54,5
3,0 0 100 - 17,6 82,1 100 100 54,5 39,3 100 100 26,1
Imipenem
1,0 96,4 33,3 87,1 66,7 89,3 83,3 96,2 62,5 82,1 100 100 54,5
1,5 75 100 100 46,2 89,3 100 100 66,7 75 100 100 46,2
2,0 35,7 100 100 25 85,7 100 100 60 71,4 100 100 42,9
2,5 10,7 100 100 19,4 53,6 100 100 31,6 28,6 100 100 23,1
3,0 0 100 - 17,6 10,7 100 100 19,4 10,7 100 100 19,4
Anexo 1 (continuação) 87
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Distância
(cm) SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN
Enterobactérias
1,0 71,4 42,9 55,6 60 71,4 28,6 50 50 71,4 14,3 45,5 33,3
1,5 71,4 85,7 83,3 75 71,4 28,6 50 50 57,1 42,9 50 50
2,0 57,1 85,7 80 66,7 57,1 57,1 57,1 57,1 57,1 57,1 57,1 57,1
2,5 14,3 100 100 53,8 57,1 71,4 66,7 62,5 42,9 71,4 60 55,6
3,0 0 100 - 50 57,1 100 100 70 0 100 - 50
Imipenem
1,0 100 71,4 77,8 100 100 42,9 63,6 100 100 28,6 58,3 100
1,5 100 85,7 87,5 100 100 71,4 67,8 100 100 57,1 70 100
2,0 85,7 85,7 85,7 85,7 100 57,1 70 100 100 85,7 87,5 100
2,5 28,6 100 100 58,3 85,7 85,7 85,7 85,7 57,1 85,7 80 66,7
3,0 14,3 100 100 53,8 57,1 100 100 70 42,9 100 100 63,6
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Distância
(cm) SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN
IMP
1,0 75 57,9 72,4 61,1 89,3 52,6 73,5 76,9 92,9 52,6 74,3 83,3
1,5 67,9 84,2 86,4 64 89,3 52,6 73,5 76,9 92,9 68,4 81,3 86,7
2,0 50 94,7 93,3 56,3 89,3 84,2 89,3 84,2 89,3 84,2 89,3 84,2
2,5 7,1 100 100 42,2 85,7 89,5 92,3 81 82,1 89,5 92 77,3
3,0 0 100 - 40,4 71,4 100 100 70,4 32,1 100 100 50
Imipenem
1,0 96,4 47,4 73 90 92,9 57,9 76,5 84,6 85,7 63,2 77,4 75
1,5 89,3 84,2 89,3 84,2 92,9 89,5 92,9 89,5 85,7 84,2 88,9 80
2,0 53,6 94,7 93,8 58,1 92,9 84,2 89,7 88,9 85,7 94,7 96 81,8
2,5 10,7 100 100 43,2 78,6 94,7 95,7 75 50 94,7 96,3 56,3
3,0 7,1 100 100 42,2 39,3 100 100 52,8 28,6 100 100 48,7
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Distância
(cm) SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN SN SP VPP VPN
SPM
1,0 90 57,9 52,9 91,7 100 52,6 52,6 100 100 52,6 52,6 100
1,5 70 84,2 70 84,2 100 52,6 52,6 100 80 68,4 57,1 86,7
2,0 30 94,7 75 72 100 84,2 76,9 100 100 84,2 76,9 100
2,5 10 100 100 67,9 100 89,5 83,3 100 60 89,5 75 81
3,0 0 100 - 65,5 70 100 100 86,4 10 100 100 67,9
Imipenem
1,0 100 47,4 50 100 100 57,9 55,6 100 100 63,2 58,8 100
1,5 50 84,2 62,5 76,2 100 89,5 83,3 100 80 84,2 72,5 88,9
2,0 20 94,7 66,7 69,2 90 84,2 75 94,1 70 94,7 87,5 85,7
2,5 0 100 - 65,5 40 94,7 80 75 10 94,7 50 66,7
3,0 0 100 - 65,5 0 100 - 66,5 0 100 - 65,5
Anexo 1 (continuação) 88
a
: EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; MPA: ácido mercaptopropiônico; MAC: ácido
mercaptoacético
.
-: Os valores não puderam ser calculados por resultarem em divisão por zero.
Ceftazidime
EDTA MPA MAC
Distance
(cm) SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
VIM
1,0 66,7 57,9 33,3 84,6 50 52,6 25 76,9 50 52,6 25 76,9
1,5 66,7 84,2 57,1 88,9 66,7 52,6 30,8 83,3 33,3 68,4 25 76,5
2,0 50 94,7 75 85,7 50 84,2 50 84,2 33,3 84,2 40 80
2,5 16,7 100 100 79,2 50 89,5 60 85 33,3 89,5 50 81
3,0 0 100 - 76 33,3 100 100 82,6 16,7 100 100 79,2
Imipenem
1,0 100 47,4 37,5 100 83,3 57,9 38,5 91,7 66,7 63,2 36,4 85,7
1,5 100 84,2 66,7 100 83,3 89,5 71,4 94,4 66,7 84,2 57,1 88,9
2,0 83,3 94,7 83,3 94,7 83,3 84,2 62,5 94,1 66,7 94,7 80 90
2,5 50 100 100 86,4 66,7 94,7 80 90 33,3 94,7 66,7 81,8
3,0 0 100 - 76 16,7 100 100 79,2 16,7 100 100 79,2
Anexo 2 89
Anexo 2. Resultados de sensibilidade (SN) e especificidade (SP) e os
correspondentes pontos de corte para a detecção de metalo-β-lactamases por disco
combinado: análise geral e estratificada por subgrupos.
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Volume
(µl)
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Análise Geral
2 - - - 5,0 85 79 - - -
4 3,0 85 74 6,0 83 74 2,0 85 42
6 5,0 78 74 10,0 85 63 2,0 85 21
8 6,0 80 84 11,0 83 68 2,0 93 21
10 9,0 83 90 14,0 85 68 6,0 87 37
Imipenem
2 2,0 80 63 - - - - - -
4 2,0 87 32 - - - - - -
6 4,0 78 58 - - - - - -
8 4,0 80 53 - - - - - -
10 5,0 80 63 - - - - - -
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Volume
(µl)
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Acinetobacter
spp.
2 - - - - - - - - -
4 3,0 70 83 - - - - - -
6 4,0 70 50 - - - 3,0 80 17
8 4,0 80 33 8,0 80 50 - - -
10 4,0 80 17 13,0 80 33 - - -
Imipenem
2 - - - 1,0 70 100 1,0 80 100
4 - - - - - - - - -
6 - - - - - - - - -
8 - - - - - - - - -
10 - - - - - - - - -
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Volume
(µl)
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Pseudomonas
aeruginosa
2 - - - 9,0 93 100 5,0 82 83
4 7,0 93 83 11,0 93 83 6,0 93 83
6 8,0 96 100 16,0 89 100 8,0 89 67
8 8,0 96 100 14,0 96 100 9,0 93 50
10 9,0 96 83 14,0 96 83 11,0 89 67
Imipenem
2 3,0 82 50 - - - - - -
4 5,0 82 83 1,0 82 67 - - -
6 6,0 82 83 3,0 86 33 - - -
8 7,0 86 100 4,0 82 33 - - -
10 8,0 82 100 6,0 82 33 - - -
Anexo 2 (continuação) 90
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Volume
(µl)
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Enterobactérias
2 - - - - - - - - -
4 - - - - - - - - -
6 - - - 1,0 86 29 - - -
8 - - - 1,0 86 14 2,0 86 43
10 - - - 3,0 100 29 3,0 86 43
Imipenem
2 3,0 100 100 - - - - - -
4 4,0 100 100 - - - - - -
6 4,0 100 100 - - - - - -
8 4,0 100 100 - - - - - -
10 5,0 100 100 - - - - - -
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Volume
(µl)
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
IMP
2 - - - 8,0 86 89 5,0 82 95
4 3,0 89 74 6,0 86 74 4,0 86 84
6 4,0 89 63 10,0 86 63 6,0 82 74
8 5,0 86 63 11,0 86 68 8,0 82 64
10 7,0 86 68 14,0 86 68 - - -
Imipenem
2 - - - - - - - - -
4 1,0 82 21 - - - - - -
6 1,0 82 21 - - - - - -
8 1,0 86 16 - - - - - -
10 1,0 86 16 - - - - - -
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Volume
(µl)
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
SPM
2 - - - 13,0 100 100 3,0 90 89
4 7,0 90 95 15,0 100 100 10,0 100 100
6 8,0 100 100 17,0 100 100 12,0 100 100
8 9,0 100 100 17,0 100 100 9,0 100 84
10 9,0 100 90 18,0 100 95 14,0 100 100
Imipenem
2 3,0 90 79 - - - - - -
4 5,0 100 95 1,0 90 68 - - -
6 5,0 100 90 5,0 100 68 3,0 100 89
8 7,0 100 95 6,0 90 68 6,0 100 84
10 8,0 100 90 8,0 80 68 8,0 80 89
Anexo 2 (continuação) 91
Ceftazidima
EDTA MPA MAC
Volume
(µl)
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
Ponto de
corte (mm)
SN SP
VIM
2 - - - - - - - - -
4 - - - - - - - - -
6 - - - 1,0 83 11 - - -
8 - - - 1,0 83 11 2,0 83 21
10 - - - - - - 3,0 83 16
Imipenem
2 4,0 83 100 - - - - - -
4 4,0 83 90 - - - - - -
6 5,0 83 90 - - - - - -
8 5,0 100 68 - - - - - -
10 5,0 100 63 - - - - - -
Anexo 3 92
Anexo 3 (continuação) 93
Anexo 3 (continuação) 94
Anexo 4 95
Anexo 4. Artigo submetido para publicação no periódico Journal of Clinical
Microbiology, em 17 de abril de 2007.
Metallo-β-Lactamase Detection: Comparative Evaluation of Double-Disk
Synergy versus Combined Disk Tests for IMP, GIM, SIM, SPM or VIM-
producing isolates
Running Title: Detecting Metallo-β-Lactamases among Gram-negative rods
Renata C. Picão
1
Soraya S. Andrade
2
Adriana Gianinni Nicoletti
1
Eloiza H. Campana
1
Gabriela C. Moraes
1
Rodrigo E. Mendes
1
Ana C. Gales
1,2
1. Laboratório ALERTA, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil;
2. Laboratório Especial de Microbiologia Clínica, Universidade Federal de São
Paulo, São Paulo, Brazil;
Keywords: Metallo-β-lactamase detection, Double-Disk Synergy Test, Combined
Disk Test
Corresponding author: Renata Cristina Picão.
Rua Pedro de Toledo, 781
São Paulo, SP 04039-032
Brazil
Phone/Fax: + 55-11-5084-6538
Email: [email protected]
Abstract
The emergence of metallo-β-lactamase (MBL)-producing isolates is a challenge to routine
Anexo 4 (continuação) 96
microbiology laboratories, since there are no standardized methods for detecting such
isolates. The aim of this study was to evaluate the accuracy of different phenotypic methods
to detect MBL production among Pseudomonas, Acinetobacter spp and enterobacterial
isolates, including GIM-, IMP-, SIM-, SPM-, and VIM- variants. A total of 46 genetically
unrelated P. aeruginosa, P. putida, Acinetobacter spp. and enterobacterial strains producing
distinct MBLs were tested. Nineteen strains were included as negative controls. The
inhibition of bacterial growth and β-lactam hydrolysis caused by MBL-inhibitors (IMBL) were
also evaluated. The isolates were tested for MBL production by both double disk synergy test
(DDST) and combined disk (CD) using imipenem and ceftazidime as substrates in
combination with distinct IMBL. One hundred percent sensitivity and specificity was achieved
by DDST using 2-mercaptopropionic acid in combination with ceftazidime and imipenem for
detection of MBL production among P. aeruginosa and Acinetobacter spp isolates,
respectively. CD showed the same results for detecting MBL-producing enterobacteria by
combining imipenem and EDTA with a 5.0 mm breakpoint increase in the inhibition zone. Our
results indicate that both phenotypic methods to detect MBL-producing isolates should be
based on the genera to be tested regardless of the enzyme produced by such isolates as
well as the local prevalence of MBL producers and on the ability of specialized technicians to
correctly interpret MBL inhibition.
Anexo 4 (continuação) 97
INTRODUCTION
Since the early 1990s, new metallo-β-lactamase (MβL) encoding genes have been
reported all over the world in clinically important pathogens, such as Pseudomonas spp.,
Acinetobacter spp., and members of the Enterobacteriaceae family (19,27,35,40). The
emergence of MBL-encoding genes is worrisome since they are usually carried by mobile
genetic structures with great ability to spread (3,5,18,24,36). Moreover, increased mortality
rates have been documented for patients infected with MBL-producing P. aeruginosa
especially due to inadequate empirical therapy (39). Early detection of MBL-producing
organisms is therefore crucial to establish appropriate antimicrobial therapy and to prevent
their inter- and intra-hospital dissemination (10,35).
Several phenotypic methods based on the MBL inhibition by EDTA or thiol-based
compounds have been published. Although they are simple to perform and cheaper than
genotypic methods, they have shown discordant results depending on the employed
methodology, β-lactam substrates, MBL inhibitors (IMBL) and bacterial genus tested
(11,14,17,21,26). In addition, SPM-, GIM- and SIM-producing pathogens have never been
evaluated by these studies.
The high diversity and prevalence of MβL-producing P. aeruginosa, Acinetobacter
spp. and Enterobacteriaceae isolates have motivated the search for an accurate MBL
screening test. The aim of this study was to evaluate the accuracy of the double-disk synergy
test (DDST) and combined disk assay (CD) to screen for MBL-producing isolates among P.
aeruginosa, Acinetobacter spp. and selected Enterobacteriaceae isolates producers of either
IMP, GIM , SIM, SPM, or VIM enzymes.
MATERIAL AND METHODS
Bacterial isolates. All strains tested in this study are described in Table 1.
MBL positive controls:
Atotal of forty-six MBL-producing isolates, including Acinetobacter
spp. (n=10), P. aeruginosa (n=28), P. putida (n=1) and enterobacterial isolates (n=7) were
selected as positive controls. All 46 isolates had their genotype previously characterized by
Anexo 4 (continuação) 98
PCR and sequencing. When applicable, these isolates were also molecular typed to ensure
genetically unrelated isolates were selected. Additionally, all isolates showed resistance or
reduced susceptibility to imipenem and resistance to ceftazidima, according to Clinical
Laboratory Standards Institute (CLSI) breakpoints (9).
MBL negative controls:
Nineteen non-MBL-producers, previously screened for the presence
of MBL genes (bla
IMP
, bla
GIM
, bla
SIM
, bla
SPM
, and bla
VIM
), were included as negative controls
(23). In addition, to exclude the possible presence of other not yet described MBL enzymes,
imipenemase activity of cell sonicates from overnight broth culture were determined by
spectrophotometric assays, using BioMate 5 UV-Visible Spectrophotometer. This was carried
out with 150 µM imipenem as substrate at 299 nm. All selected negative control isolates also
showed reduced susceptibility to ceftazidime and/or imipenem and were genetically
unrelated by random amplification of polymorphic DNA (data not shown).
IMBL growth inhibition activity .
The bacterial growth inhibition was initially evaluated by disk diffusion testing 5 µl of different
concentrations of each IMBL against Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. The IMBL
used were EDTA (Sigma, Steinheim Germany), mercaptopropionic acid (MPA - Sigma);
mercaptoacetic acid (MAC - Sigma); mercaptoethanol (MET - Gibco, New York USA); and
phenanthroline (PHEN - Sigma). The tested IMBL concentrations were: i) EDTA: 50 mM, 100
mM, 300 mM, and 500 mM; ii) MPA: 11.2 mM (undiluted), 5.6 mM (1:2), 2,8 mM (1:4), and
1,4 mM; iii) MET: 55 mM (undiluted), 27.5 mM (1:2), 13.2 mM (1:4) , and 7.0 mM (1:8); iv)
MAC: 14.4 mM (undiluted), 7.2 mM (1:2), 3.6 mM (1:4) , 1.2 mM (1:12); and v) PHEN: 8 mM,
4 mM, 2 mM, and 1 mM.
The IMBL solution presenting the lowest inhibition zone, in the absence of β-lactam agents,
was selected to perform DDST assay using 5 µl. Different amounts of the same solution were
employed to perform the CD test, ranging from 2 to 10 µl of each IMBL.
The evaluation of the interference of IMBL itself on the growth of each one of the isolates
used in this study was also performed by dropping on a blank disk the same volumes of each
Anexo 4 (continuação) 99
IMBL employed for the CD assay. The inhibition zone was measured after overnight
incubation at 35
o
C, and means of inhibition zones were calculated.
Hydrolysis tests.
To assess the β-lactam hydrolysis by each IMBL, hydrolysis rates of β-lactams were
measured with BioMate 5 UV-Visible Spectrophotometer. The antimicrobial powder was
diluted to obtain 1.8 to 2.0 U of absorbance. Briefly, 100 μL of the each selected IMBL
solution was added to 900 μl of antimicrobial solution. Experiments were carried out at
299nm and 260nm to imipenem and ceftazidime, respectively.
Phenotypic Detection of MBL.
DDST
The phenotypic tests were performed following the CLSI recommendations for disk diffusion
method (9). Briefly, a 0.5 McFarland bacterial suspension was inoculated on a Mueller-
Hinton (MH) agar plate (Oxoid, Basingstoke, England). Imipenem and ceftazidime disks were
aligned around blank filter disks containing 5 µl of the chosen inhibitor solution added directly
on the disk already placed on the MH agar plate. The following distances between the
inhibitor and the substrates were tested: 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, and 3.0 cm (from center to center).
The appearance of either an enhanced or a phantom zone between the antimicrobial agents
and the inhibitor disk was considered a positive result and indicative of MBL production. The
best substrate, IMBL and distance between the antimicrobial and the IMBL disks to detect
MBL producers were selected considering the highest sensitivity and specificity results.
CD
For the combined disk assay, ceftazidime and imipenem disks were initially placed on the
inoculated MH plates with a 0.5 McFarland bacterial suspension, and 2, 4, 6, 8 or 10 μL of
each inhibitor solution was directly added to the disks (1). The amount, in micrograms, of
each IMBL solution added to the disks corresponding to 2, 4, 6, 8 and 10 μL were,
respectively: i) EDTA: 74 µg, 148 µg, 222 µg, 297 µg and 370 µg; ii) MPA: 0.295 µg, 0.592
µg, 0.888 µg, 1.184 µg and 1.48 µg; iii) MET: 8.58 µg, 17.16 µg, 25.74 µg, 34.32 µg and
Anexo 4 (continuação) 100
42.92 µg; iv) MAC:0.221µg, 0.441 µg, 0.662 µg, 0.883 µg and 1.104 µg; and v) PHEN:3.17
µg, 6.34 µg, 9.51 µg, 12.68 µg and 15.85 µg. After a 18-24h incubation period at 35
o
C, the
increase of the disk diffusion zone obtained with the combined disk compared to that of the
antimicrobial disk alone was measured. The positive criteria for classifying an isolate as MBL
producer is described below.
Statistical analysis.
The inhibition zone (mm) produced by each IMBL alone was measured for each
tested concentration, and differences among means (positive and negative controls) were
assessed by the student´s t test.
Sensitivity (SN), specificity (SP), positive (PPV) and negative (NPV) predictive values were
calculated for the DDST for each β-lactam/IMBL combination for the five distances
evaluated: 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 and 3.0 cm. PCR results for MBL were considered gold-
standard, and isolates were considered true MBL producers if positive for bla
IMP
, bla
GIM
,
bla
SIM
, bla
SPM
, or bla
VIM.
SN, SP, PPV and NPV values were calculated as a/(a+c), d/(b+d), a/(a+b), and
d/(c+d), respectively. In these ratios, "a" represents the number of isolates correctly identified
as MBL producers by the DDST, "c" is the number of true MBL producers (positive controls)
incorrectly assigned as MBL non-producers by DDST, "d" is the number of true isolates non-
MBL producers (negative controls) correctly identified by DDST, and "b" is the number of
isolates incorrectly identified as MBL producers.
Results from CD phenotypic method were characterized by ROC (receiver operating
characteristic) curves to choose the best cutoff values for indicating MBL production. For
each IMBL, sensitivity (SN) and specificity (SP) of all five different concentrations were
calculated successively, according to the variation of inhibition zones of MBL-producing and
non-producing isolates. The resulting sensitivity values were then plotted against the
corresponding values of (1-SP), producing a ROC curve. The area under the ROC curve
(AUC) and its standard error were calculated, and its statistical significance was then
Anexo 4 (continuação) 101
evaluated by the nonparametric method. Differences between variable’s AUCs were
evaluated through a comparison of the 95% CI of the corresponding areas.
CD and DDST analyses were also stratified into seven groups according to pathogen
species and MBL type produced: i) General group including all isolates tested; ii)
Acinetobacter spp. group iii) P. aeruginosa group; iv) enterobacterial group; v) IMP-producing
isolates group; vi) VIM-producing isolates group; and vii) SPM-producing isolates. For the
analysis of the MBL types groups (IMP, VIM, and SPM), all 19 negative controls were
included. On the other hand, only negative controls representative of the same
genus/species or bacterial family were selected for the pathogen (groups ii-iv) analysis. For
example, the analysis of P. aeruginosa included all 28 MBL-producing P. aeruginosa and the
six non-MBL-producing P. aeruginosa isolates.
Statistical analysis was performed by SPSS 10.0 for Windows
®
, and Epi Info (CDC)
version 6.04. All reported p-values were two-sided and values below 0.05 were considered to
be statistically significant.
RESULTS
IMBL growth inhibition activity.
PHEN and MET showed no growth inhibition activity over P. aeruginosa ATCC 27583
at all tested concentrations. On the other hand, EDTA, MPA, and MAC differently inhibited
the bacterial growth of P. aeruginosa ATCC 27583. The following IMBL concentrations, 100
mM EDTA, 1.4 mM MPA, 55 mm MET, 1.2 mM MAC, 8 mM PHEN, were chosen to be tested
against the 65 genetically unrelated isolates since they showed the lowest inhibition over the
bacterial growth (Table 2). Overall, EDTA, PHEN, and MET presented weak bactericidal
activity, with increase of inhibition zones varying from 0 mm to 2 mm. In contrast, MPA
produced larger increase in inhibition zones, varying from 0.3 to 12.4 mm (Table 2).
Regardless of increasing IMBL volumes applied to the blank disks, the mean inhibition zone
was similar among MBL-producing and non-producing strains (p>0.05), except for MAC 10μl
(p = 0.05). Therefore, the bactericidal effect of IMBLs was not influenced by the production of
Anexo 4 (continuação) 102
IMP, VIM, SPM, GIM or SIM, making no difference to calculate SN and SP values.
Hydrolysis tests
Hydrolysis tests results showed that EDTA and PHEN were not able to hydrolyze the
antimicrobial agents tested, while MAC, MET, and MPA demonstrated hydrolytic activity
against imipenem, but not against ceftazidime (data not shown). Hydrolysis of Imipenem,
ceftazidime, ampicillin, and aztreonam by MPA has been already observed (14); however,
the ability of other IMBLs to hydrolyze β-lactam agents has not been accessed previously.
Phenotypic MBL detection by DDST
Table 3 shows the results of SN, SP, PPV, and NPV for DDST. According to the
statistical analysis, PHEN and MET demonstrated very poor ability to detect the tested MBL-
producing strains, providing SN results inferior to 20% for all 46 MBL-producing isolates
(data not shown). Surprisingly, four isolates [GIM, IMP-18 (isolate 3489), VIM-1-producing P.
aeruginosa, and SIM-1-producing Acinetobacter spp.] were categorized as MBL producers
by MET, even when the distance between MET and the β-lactam disks was 3.0 cm. Further
studies including an increasing number of SIM- and GIM-producing isolates would be
important to confirm the capability MET for MBL phenotypic detection.
When all 46 MBL-producing isolates (general group) were analyzed, MPA provided
the best results using imipenem as substrate. SN, SP, PPV, and NPV values at 1.5 cm,
were, respectively, 93.5, 89.5, 95.6, and 85.0%. However, better SN and SP were achieved
after stratifying the results into groups. The Acinetobacter spp. group had SP, SN, PPV, and
NPV values of 100% when imipenem was placed at 1.5 or 2.0 cm from MPA disks. For P.
aeruginosa group, identical DDST results were obtained using ceftazidime as a substrate
and MPA as the IMBL, at 2.0 or 2.5 cm.
Among the enterobacterial isolates, identical SN (100.0%), SP (85.7%), PPV (85.7%),
and NPV (100.0%) results were detected with either EDTA/imipenem or MAC/imipenem at
1.5 and 2.0 cm, respectively, by DDST (Table 3).
Distinct results for EDTA and MPA were observed for the IMP and VIM groups (Table
Anexo 4 (continuação) 103
3). For the IMP group, SN and SP results close to 90% were only achieved for
MPA/imipenem at 1.5 cm. For VIM, a 100% SN was only achieved using EDTA/imipenem at
1.5 cm. SPM group results were similar to the P. aeruginosa group, in which
MPA/ceftazidime provided 100% SN and nearly 90% SP by using a 2.5 cm distance. The
same values were also achieved for detecting SPM using MPA/imipenem combination at 1.5
cm (Table 3). Since many SPM, VIM, and IMP isolates are P. aeruginosa, we have also
performed a second analysis, including only P. aeruginosa as positive and negative controls
for each MBL subgroups. For SPM, VIM and IMP-producing P. aeruginosa, 100% of SN and
SP were obtained for 2.0 and 2.5 cm distances, using MPA/ceftazidime (data not shown).
We have also selected all IMP-producing Acinetobacter spp. to perform a stratified
analysis. In comparison with only non-MBL-producing Acinetobacter spp., SN and SP results
reached 100% using MPA/imipenem at 1.5 and 2.0 cm (data not shown). These results were
identical to the Acinetobacter spp. group (Table 3).
Phenotypic MBL detection by CD
All the CD test results were applied in the construction of ROC curves to establish the
best breakpoint (increase in mm) for MBL detection. Table 4 shows selected CD results.
Since the study’s priority was to select a screening test yielding the lowest number of false
negative results, only SN results greater than 80% were included in Table 4. By analyzing
the general group, CD test resulted in SN values greater than 80% for EDTA/Imipenem and
EDTA/MPA/ceftazidime. However, SP results varied greatly from 31.6% to 89.5%.
Acinetobacter spp. group was not accurately classified by the CD test (Figure 1 and
Table 4). The best SN and SP results were 80.0% and 100.0%, respectively, for 2 μl of MPA
associated with imipenem using a breakpoint of 0.5mm (AUC=0.9). However, the increase of
0.5 mm is considered a non-discriminatory cutoff since it cannot be adequately measured by
visual inspection. All other AUCs displayed results from 0.24 to 0.54.
The P. aeruginosa group showed SN results close to 100% and SP of 100% (Table 4)
for ceftazidime in combination with EDTA or MPA using 8mm as breakpoint. Figure 2 shows
Anexo 4 (continuação) 104
the ROC graphs for ceftazidime in combination with EDTA and MPA. The best AUC (0.98)
was achieved testing 8 μl of MPA. All AUC results for EDTA and MPA were statistically
significant (p<0.05, data not shown).
Surprisingly, the CD results for the enterobacterial group achieved 100% SN and
100% SP for several of the breakpoints analyzed by the ROC curve for the imipenem/EDTA
combination (AUC= 1.0) (Table 4).
Among the MBLs groups, the combination of ceftazidime associated with EDTA (6
and 8μl) or MPA (2 to 8μl) resulted in 100% SN and 100% SP for detecting the SPM-
producing isolates (Table 4).
DISCUSSION
The detection of MBL-producing isolates by PCR methodology is more expensive,
requires specialized technicians and instruments, and, more importantly, is only able to
detect previously described MBL encoding genes. In addition, the cost of implementing this
technique might not be justified in medical centers that have low prevalence of MBL
producers. These factors make the implementation of such tests by routine clinical
microbiology laboratories difficult. However, the detection of MBL phenotype of resistance is
of crucial importance for selecting the most appropriate therapy and applying infection control
measures. For these reasons, an accurate and easy to perform phenotypic test is desirable
and urgently necessary in hospitals with high prevalence of MBL-producing isolates (10,35).
Many authors have published distinct phenotypic techniques for screening MBL-
producing isolates; however, these studies have important limitations such as: i) inclusion of
a low number of MBL-producing isolates, sometimes harboring the same type of enzyme
(2,36) ii) absence of molecular typing to exclude the influence of a single clone in the
interpretation of their results (28); iii) lack of tests evaluating the interference of IMBL activity
over the bacterial growth and β-lactam hydrolysis (2,11,26,34,37); iv) no inclusion of SPM- or
GIM-producing P. aeruginosa isolates as well as SIM-producing Acinetobacter spp. isolates
(11,14,17,21,25); v) lack of results stratified according to pathogen/species, in which SN and
Anexo 4 (continuação) 105
SP values reflect the overall performance of all isolates (2,14,17); vi) accurate statistical
analysis is usually not carried out to interpret and validate their results (2,11,21,37,38).
This is the first study to assess the accuracy of phenotypic methods to detect all
major types of mobile MBLs described, GIM, IMP, SIM, SPM, and VIM produced by diverse
bacterial genera with distinct imipenem susceptibility patterns. The inclusion of genetically
unrelated strains isolated on three distinct continents suggests that these results would be
useful for regions where such resistance mechanism is frequent. Depending on the tested
concentration, IMBLs may possess their own bactericidal activity, which may result in
expanded inhibition zones not associated with truly MBL production (8). This finding may
lead to false positive MBL detection results by both, CD and DDST, and has been
considered a disadvantage of employing EDTA and MPA as IMBL (16). To exclude such
interference on phenotypic detection of MBL, we have tested the activity of distinct dilutions
of IMBLs over the growth of P. aeruginosa ATCC 27853. In addition, the influence of IMBL
inhibitory activity over the substrate was taken into consideration in the analysis of SN and
SP results for screening MBL-producing isolates. False-negative results might arise due to
the imipenem hydrolysis caused by thiol derivatives (14). Many studies have performed
phenotypic MBL detection using Pseudomonas, Acinetobacter spp. and/or enterobacterial
isolates, but some of them did not present SP and SN results stratified by pathogen/species,
reflecting the global performance of all isolates, and not for a specific pathogen (11). Other
studies did stratify according to species, but it is not clear if only negative controls from the
same pathogen/species were included to calculate SN and SP results (21,37). This is a very
important issue that must be taken into consideration when selecting a MBL phenotypic test,
as we have observed in this study different SP and SN values according to the group
analyzed. Moreover, a rigorous statistical analysis of our data was performed.
In this study PHEN and MET showed poor results for detecting MBL producers under
the tested conditions. The IMBLs derivatives of thiol compounds may possess anionic,
cationic or neutral functional groups at neutral pH. MAC and MPA are classified under the
Anexo 4 (continuação) 106
anionic group, while the MET belongs to the neutral group. Siemann et al. have shown that
the inhibition of MBL activity by the anionic IMBL starts immediately. In contrast, neutral
IMBLs have a pronounced lag prior starts its inhibitory activity, i.e, best inhibitory results are
achieved after preincubating the IMBL with MBL before adding the substrate. In this manner,
the worst activity of MET in this study could be explained by the absence of the preincubation
step while performing the phenotypic detection (28).
The standardization of a phenotypic method to screen MBL-producing isolates is of
crucial importance (10). Most previous studies evaluating MBL phenotypic detection were
performed under distinct experimental conditions, jeopardizing the comparison of their results
(2,11,14,15,21,25,26). The size of inhibition zones produced by β-lactam/IMBL combinations
may vary according to the way that IMBL is incorporated into the β-lactam disks (1). Since
the selection of an appropriate breakpoint for screening MBL-producing isolates is directly
influenced by the inhibition zone values, the methodology used for preparing the combined
disks should always be described in such phenotypic reports. In the current study, we have
added the IMBL solutions directly on β-lactam disks already placed on the agar plate (1),
while some authors previously prepare and freeze IMBL/β-lactams disks, thus results of our
CD assay may be comparable among studies using the same methodology.
In addition, a number of authors have also raised concerns on the influence of the
bactericidal effect of IMBLs alone, claiming that it could not be distinguished from the
antimicrobial effect of β-lactam/IMBLs (2,8,14,16). Fortunately, we have addressed this
issue, since we have documented that the best SN and SP results for CD were achieved by
establishing breakpoints greater than the mean inhibition zone produced by all IMBL
themselves. When choosing the best MPA volume, we should take into consideration the
inhibitory effect of MPA itself over the bacterial growth. According to Table 2, the mean
increase of inhibition zone caused by MPA itself (excluding the diameter of the blank disk –
6mm) varied from 1.3 mm (2 μl) to 12.4 mm (10 μl). We recommend the addition of 2 μl of
MPA in the ceftazidime disk since this volume produced a significant increase in the
Anexo 4 (continuação) 107
inhibition zone (13 mm), while exerting a minimal inhibitory effect of MPA itself over the
bacterial growth when testing SPM-producing isolates.
A ROC curve consists of a graph containing the relation between sensitivity and the
specificity of a test, calculated for all possible cut-off values. Thus, in this case, each curve
plots the true positive rate versus the false positive rate for each volume of IMBL/β-lactam
combination. Since the ROC graph is a result of sensitivity versus 1-specificity, the most
accurate test to discriminate between MBL- and non-MBL-producing isolates would pass
through the upper left hand corner of the graphic. On the other hand, the closer the curve
comes to the 45-degree diagonal, the less accurate is the test. Additionally, the area under
the curve (AUC) is a measure of the test accuracy and it is useful to compare different tests.
For example, an area of 1 represents an ideal test (SN and SP of 100%), while an area of
0.5 reflects poor results of SN and SP (20). The greatest advantage of using ROC curves in
this case was the possibility of visualizing a wide range of breakpoints for each IMBL/β-
lactam combination by the CD test. When studying different IMBLs, many authors usually do
not consider testing a wide range of breakpoints. SN and SP results are usually only
calculated for a narrow range of breakpoints, chosen randomly or according to previous
published results (38). Moreover, many studies have established the best breakpoints only
by observing inhibition zones produced by IMBL/β-lactam (11,38). Thus, SN and SP values
of all possible and different breakpoints may not be presented, and are not known by the
readers. In our study, a wide range of results were documented and chosen based on ROC
curve results, ranging from 3mm (for Enterobacteriacea/Imipenem/EDTA) to 18mm (for
SPM/MPA/ceftazidime). If we had tested only the breakpoint of 7mm, for example, we would
have obtained less accurate results for enterobacterial isolates (SN of 71.4 instead of 100%)
and SPM-producing isolates (SP of 31.6 instead of 100%). Since higher SP results can only
be obtained by jeopardizing SN values, researchers should always consider their main
objective when selecting a screening method to detect MBLs. However, due to the possible
clinical implications of false negative MBL results, microbiology laboratories should always
Anexo 4 (continuação) 108
favor the selection of more sensitive methods.
Our results show that DDST was the most accurate phenotypic test to detect MBL
production in P. aeruginosa and Acinetobacter spp. when using 1.4 mM MPA as IMBL
positioned at 2 cm of distance from the β-lactam disk. However, the choice of the best
substrate depended upon the bacterial species tested: ceftazidime and imipenem for P.
aeruginosa and Acinetobacter spp., respectively. By CD assay, no breakpoint achieved
100% SN and SP for the nonfermenting Gram-negative bacilli. In contrast, among the
enterobacterial isolates, CD test showed identical results (100%SN, 100% SP, and AUC
equal 1) for different EDTA volumes combined to imipenem. Thus, we suggest that 10 μl of
EDTA 100mM applied to the imipenem disk would be a good option to discriminate MBL-
producing isolates since it produced the largest increase in the inhibition zone (5 mm). Due
the paucity of MBL-producing Enterobacteriaceae, only 7 positive controls were included,
and we believe that further studies evaluating an increased number of MBL isolates are
needed to corroborate our results.
CONCLUDING REMARKS
By DDST, MPA proved to be an excellent IMBL choice for detecting MBL among both
P. aeruginosa and Acinetobacter spp. Although the best distance has varied depending on
the bacterial species, the distance of 2.0 cm could be standardized since 100% SN and
100% SP was achieved for both pathogens. Since bacterial identification is determined
before susceptibility testing by routine clinical laboratories and the type of MBL is yet
unknown, the same solution of MPA could be applied on a blank disk at 2.0 cm from
imipenem (for Acinetobacter spp.) or ceftazidime (for P. aeruginosa). Among enterobacterial
isolates, CD test with imipenem associated with 10μl of EDTA 100 mM was the most
accurate combination to detect MBL-production considering a breakpoint of 5.0 mm.
We believe that the interpretation of DDST results is more subjective than the CD
assay (37) because the DDST depends upon the technician’s expertise to discriminate true
synergism from intersection of inhibition zones. However, the CD assay did not show a good
Anexo 4 (continuação) 109
performance for screening MBL-producing Acinetobacter spp.
It is desirable that the selection of the appropriate MBL test to be performed are
based upon studies providing SN and SP results for that specific pathogen. Thus, we
suggest that the selection of the best MBL screening method should be based on the
isolated species, the local prevalence of MBL producers and on the ability of specialized
technicians to correctly interpret MBL inhibition.
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to Ana Lúcia S. Andrade for assistance in study design. We also thank
Timothy R. Walsh, Mark A. Toleman, Yoshichika Arakawa,
and Yunsop Chong for kindly
providing some of the MBL-harboring
clinical isolates included in this study.
The study was
financially supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP, process number 2006/07197-0). Ana C. Gales is a researcher of CNPq (Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, process number
307714/2006-3),
Brasília, Brazil.
Anexo 4 (continuação) 110
Table 1. MBL-producing isolates and non-MBL producing isolates used in this study as
positive and negative controls, respectively.
Species (Number tested) MBL
a
Country Strain Number Reference
MBL-
producing
isolates
Acinetobacter spp. (7) IMP-1 Brazil
A3035; A4861; A3880; A68;
A4764; A4468; A129046
(30)
Acinetobacter spp. (2) IMP-1 Brazil A695; A696; This study
Acinetobacter spp. (1) SIM-1 Korea
YMC 03/9/T104 (18)
P.aeruginosa (9) IMP-1 Brazil
131; 144; 137; 98; 128; 130;
143; 145; 183
(29)
P.aeruginosa (1) IMP-1 Japan PSA 320
(13)
P.aeruginosa (1) IMP-13 Italy 86-10079 (31)
P.aeruginosa (1) IMP-16 Brazil 101-4704
(24)
P.aeruginosa (1) IMP-18 Brazil 3486
(36)
P.aeruginosa (1) IMP-18 Brazil 3489
This study
P.aeruginosa (1) GIM-1 German 73-5671 (7)
P.aeruginosa (1) VIM-1 Italy 179
This study
P.aeruginosa (1) VIM-2 Brazil 225
This study
P.aeruginosa (1) VIM-7
United
States
07-406 (32)
P.aeruginosa (1) SPM-1 Brazil
48-1997 A (33)
P.aeruginosa (9) SPM-1 Brazil
14; 44 73;75; 76; 83; 194; 196;
197
(6)
P. putida (1)
IMP-1
Brazil
48-12346A (22)
K. pneumoniae (2) IMP-1 Brazil KPN1; KPN2
(5)
E. cloacae (1) VIM-1 Italy 75-10344
(3)
E. cloacae (2) VIM-1 Italy ECL3; ECL4
(5)
E. cloacae (1) IMP-1 Brazil 199
(4)
S. marcescens (1) IMP-1 Japan SM 319
(13)
non-MBL-
producing
isolates
Acinetobacter spp.(1)
(OXA-
23)
Brazil 216
This study
Acinetobacter spp.(5) NA
b
Brazil 210; 211; 212; 213; 215
This study
P.aeruginosa (6) NA
b
Brazil 209; 227; 230; 224; 237; 238
This study
K. pneumoniae (3) NA
b
Brazil 189; 222; 223
This study
E. cloacae (1) NA
b
Brazil 221
This study
Morganella Morganii (1) NA
b
Brazil 224
This study
S. marcescens (1) NA
b
Brazil 190
This study
S. marcescens (1)
SME US 1065 (12)
a
Metallo-β-lactamase
b
NA, Not applicable.
Anexo 4 (continuação) 111
Table 2. Inhibition of bacterial growth due to metallo-β-lactamase inhibitors. Comparison of
mean inhibition zones produced for MBL and non-MBL producers
Mean Inhibition Zone (mm)
IMBL
a
volume
MBL
positive
b
(n=46)
MBL negative
c
(n=19) P value
EDTA
d
2 μl
6.0
e
6.0 -
f
EDTA 4μl 6,1 6.0 -
EDTA 6μl
6,4 6.0 -
EDTA 8μl 6,7 6.0 -
EDTA 10μl
7 6.0 -
MPA
d
2μl
7.3 6.3 0.1
MPA 4μl 10.8 10.9 0.9
MPA 6μl
13.5 14.4 0.78
MPA 8μl 16.1 16.7 0.3
MPA 10μl
18.4 18.2 0.8
MAC
d
2μl
6.1 6.0 -
MAC 4μl 7.6 7.5 0.76
MAC
6μl
10.6 9.6 0.12
MAC 8μl 12.6 11.7 0.24
MAC
10μl
14.9 13.1 0.05
MET
d
2μl
6.0 6.2 -
MET 4μl 6.8 6.3 0.35
MET 6μl
7.5 7.2 0.8
MET 8μl 8.0 7.2 0.6
MET 10μl
8.0 7.4 0.65
PHEN
d
2μl
6.0 6.0 -
PHEN 4μl 6.2 6.0 -
PHEN 6μl
6.5 6.3 0.8
PHEN 8μl 6.9 6.4 0.3
PHEN 10μl
7.6 7.3 0.78
a
IMBL, Metallo-β-lactamase inhibitor
b
MBL +, MBL-producing isolates (positive controls)
c
MBL -, Non-MBL-producing isolates (negative
controls)
d
EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid; MAC,
mercaptoacetic acid; MPA, mercaptopripionic acid ;
MET, mercaptoethanol ; and PHEN, phenanthroline
e
No inhibition zone was detected since the size of
a paper disk is 6 mm;
f
. - P value could not be calculated due to null
variation in the means of inhibition zones.
Anexo 4 (continuação) 112
Table 3. MBL detection by DDST: Results of sensitivity, specificity, positive predictive and
negative predictive values stratified into seven groups according to pathogen species and
MBL type produced.
Ceftazidime
EDTA
a
MPA
a
MAC
a
Distance
(cm) SN
b
SP
b
PPV
b
NPV
b
SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
General group
1.0 76.1 57.9 81.4 50 87 52.6 81.6 62.5 87 52.6 81.6 62.5
1.5 67.4 84.2 91.2 51.6 89.1 52.6 82 66.7 80.4 68.4 86 59.1
2.0 45.7 94.7 95.5 41.9 87 84.2 93 72.7 82.6 84.2 92.7 66.7
2.5 10.9 100 100 31.7 82.6 89.5 95 68 69.6 89.5 94.1 54.8
3.0 0 100 -
c
29.2 65.2 100 100 54.3 26.1 100 100 35.8
Imipenem
1.0 97.8 47 81.8 90 93.5 57.9 84.3 78.6 87 63.2 85.1 66.7
1.5 82.6 84.2 92.7 66.7 93.5 89.5 95.6 85 82.6 84.2 92.7 66.7
2.0 50 94.7 95.8 43.9 91.3 84 93.3 80 80.4 94.7 97.4 66.7
2.5 13 100 100 32.2 67.4 94.7 96.9 54.5 39.1 94.9 97.4 39.1
3.0 4.3 100 100 30.2 28.3 100 100 36.5 19.6 100 100 33.9
Ceftazidime
EDTA MPA MAC
Distance
(cm) SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
Acinetobacter
spp.
1.0 30 100 100 46.2 70 100 100 66.7 70 100 100 66.7
1.5 10 100 100 40 70 100 100 66.7 70 100 100 66.7
2.0 0 100 - 37.5 70 100 100 66.7 60 100 100 60
2.5 0 100 - 37.5 50 100 100 54.5 50 100 100 54.5
3.0 0 100 - 37.5 20 100 100 42.9 10 100 100 40
Imipenem
1.0 100 33.3 71.4 100 100 50 76.9 100 90 66.7 81.8 80
1.5 90 66.7 81.8 80 100 100 100 100 90 100 100 85.7
2.0 60 100 100 60 100 100 100 100 90 100 100 85.7
2.5 10 100 100 40 90 100 100 85.7 50 100 100 54.5
3.0 10 100 100 40 60 100 100 60 30 100 100 46.2
Ceftazidime
EDTA MPA MAC
Distance
(cm) SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
Pseudomonas
aeruginosa
1.0 92.9 33.3 86.7 50 96.4 33.3 87.1 66.7 96.4 50 90 75
1.5 85.7 66.7 92.3 50 100 33.3 87.5 100 89.3 66.7 92.6 57.1
2.0 57.1 100 100 33.3 100 100 100 100 96.4 100 100 85.7
2.5 14.3 100 100 20 100 100 100 100 82.1 100 100 54.5
3.0 0 100 - 17.6 82.1 100 100 54.5 39.3 100 100 26.1
Imipenem
1.0 96.4 33.3 87.1 66.7 89.3 83.3 96.2 62.5 82.1 100 100 54.5
1.5 75 100 100 46.2 89.3 100 100 66.7 75 100 100 46.2
2.0 35.7 100 100 25 85.7 100 100 60 71.4 100 100 42.9
2.5 10.7 100 100 19.4 53.6 100 100 31.6 28.6 100 100 23.1
3.0 0 100 - 17.6 10.7 100 100 19.4 10.7 100 100 19.4
Anexo 4 (continuação) 113
Table 3 (cont.)
Ceftazidime
Distance
(cm)
EDTA MPA MAC
SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
enterobacterial
group
1.0 71.4 42.9 55.6 60 71.4 28.6 50 50 71.4 14.3 45.5 33.3
1.5 71.4 85.7 83.3 75 71.4 28.6 50 50 57.1 42.9 50 50
2.0 57.1 85.7 80 66.7 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1
2.5 14.3 100 100 53.8 57.1 71.4 66.7 62.5 42.9 71.4 60 55.6
3.0 0 100 - 50 57.1 100 100 70 0 100 - 50
Imipenem
1.0 100 71.4 77.8 100 100 42.9 63.6 100 100 28.6 58.3 100
1.5 100 85.7 87.5 100.0. 100 71.4 67.8 100 100 57.1 70 100
2.0 85.7 85.7 85.7 85.7 100 57.1 70 100 100 85.7 87.5 100
2.5 28.6 100 100 58.3 85.7 85.7 85.7 85.7 57.1 85.7 80 66.7
3.0 14.3 100 100 53.8 57.1 100 100 70 42.9 100 100 63.6
Ceftazidime
EDTA MPA MAC
Distance
(cm) SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
IMP
1.0 75 57.9 72.4 61.1 89.3 52.6 73.5 76.9 92.9 52.6 74.3 83.3
1.5 67.9 84.2 86.4 64 89.3 52.6 73.5 76.9 92.9 68.4 81.3 86.7
2.0 50 94.7 93.3 56.3 89.3 84.2 89.3 84.2 89.3 84.2 89.3 84.2
2.5 7.1 100 100 42.2 85.7 89.5 92.3 81 82.1 89.5 92 77.3
3.0 0 100 - 40.4 71.4 100 100 70.4 32.1 100 100 50
Imipenem
1.0 96.4 47.4 73 90 92.9 57.9 76.5 84.6 85.7 63.2 77.4 75
1.5 89.3 84.2 89.3 84.2 92.9 89.5 92.9 89.5 85.7 84.2 88.9 80
2.0 53.6 94.7 93.8 58.1 92.9 84.2 89.7 88.9 85.7 94.7 96 81.8
2.5 10.7 100 100 43.2 78.6 94.7 95.7 75 50 94.7 96.3 56.3
3.0 7.1 100 100 42.2 39.3 100 100 52.8 28.6 100 100 48.7
Ceftazidime
EDTA MPA MAC
Distance
(cm) SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
SPM
1.0 90 57.9 52.9 91.7 100 52.6 52.6 100 100 52.6 52.6 100
1.5 70 84.2 70 84.2 100 52.6 52.6 100 80 68.4 57.1 86.7
2.0 30 94.7 75 72 100 84.2 76.9 100 100 84.2 76.9 100
2.5 10 100 100 67.9 100 89.5 83.3 100 60 89.5 75 81
3.0 0 100 - 65.5 70 100 100 86.4 10 100 100 67.9
Imipenem
1.0 100 47.4 50 100 100 57.9 55.6 100 100 63.2 58.8 100
1.5 50 84.2 62.5 76.2 100 89.5 83.3 100 80 84.2 72.5 88.9
2.0 20 94.7 66.7 69.2 90 84.2 75 94.1 70 94.7 87.5 85.7
2.5 0 100 - 65.5 40 94.7 80 75 10 94.7 50 66.7
3.0 0 100 - 65.5 0 100 - 66.5 0 100 - 65.5
Anexo 4 (continuação) 114
Table 3 (cont.)
Ceftazidime
EDTA MPA MAC
Distance
(cm) SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV SN SP PPV NPV
VIM
1.0 66.7 57.9 33.3 84.6 50 52.6 25 76.9 50 52.6 25 76.9
1.5 66.7 84.2 57.1 88.9 66.7 52.6 30.8 83.3 33.3 68.4 25 76.5
2.0 50 94.7 75 85.7 50 84.2 50 84.2 33.3 84.2 40 80
2.5 16.7 100 100 79.2 50 89.5 60 85 33.3 89.5 50 81
3.0 0 100 - 76 33.3 100 100 82.6 16.7 100 100 79.2
Imipenem
1.0 100 47.4 37.5 100 83.3 57.9 38.5 91.7 66.7 63.2 36.4 85.7
1.5 100 84.2 66.7 100 83.3 89.5 71.4 94.4 66.7 84.2 57.1 88.9
2.0 83.3 94.7 83.3 94.7 83.3 84.2 62.5 94.1 66.7 94.7 80 90
2.5 50 100 100 86.4 66.7 94.7 80 90 33.3 94.7 66.7 81.8
3.0 0 100 - 76 16.7 100 100 79.2 16.7 100 100 79.2
a
– EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid ; MPA, mercaptopripionic acid ; MAC
mercaptoacetic acid
b
– SN, sensitivity; SP specificity; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive
value
c
– Results could not be calculated, since denominator values were zero
Anexo 4 (continuação) 115
Table 4. MBL detection by CD: Results of sensitivity, specificity according to the respective
breakpoints for the seven groups, stratified according to pathogen species and MBL type
produced.
Ceftazidime
General group
EDTA
a
MPA
a
MAC
Volume
(uL)
Breakpoint
b
(mm)
SN
c
(%)
SP
c
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
2 - - - 5.0 85 79
- - -
4 3.0 85 74 6.0 83 74
2.0 85 42
6 5.0 78 74 10.0 85 63
2.0 85 21
8 6.0 80 84 11.0 83 68
2.0 93 21
10 9.0 83 90 14.0 85 68
6.0 87 37
Imipenem
2 2.0 80 63 - - -
- - -
4 2.0 87 32 - - -
- - -
6 4.0 78 58 - - -
- - -
8 4.0 80 53 - - -
- - -
10 5.0 80 63 - - -
- - -
Acinetobacter
spp.
Ceftazidime
EDTA MPA
MAC
Volume
(uL)
Breakpoint
(mm)
SN
c
(%)
SP
c
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
2 - - - - - -
- - -
4 3.0 70 83 - - -
- - -
6 4.0 70 50 - - -
3.0 80 17
8 4.0 80 33 8.0 80 50
- - -
10 4.0 80 17 13.0 80 33
- - -
Imipenem
2 - - - 1.0 70 100
1.0 80 100
4 - - - - - -
- - -
6 - - - - - -
- - -
8 - - - - - -
- - -
10 - - - - - -
- - -
Pseudomonas
aeruginosa
Ceftazidime
EDTA MPA
MAC
Volume
(uL)
Breakpoint
(mm)
SN
c
(%)
SP
c
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
2 - - - 9.0 93 100
5.0 82 83
4 7.0 93 83 11.0 93 83
6.0 93 83
6 8.0 96 100 16.0 89 100
8.0 89 67
8 8.0 96 100 14.0 96 100
9.0 93 50
10 9.0 96 83 14.0 96 83
11.0 89 67
Imipenem
2 3.0 82 50 - - -
- - -
4 5.0 82 83 1.0 82 67
- - -
6 6.0 82 83 3.0 86 33
- - -
8 7.0 86 100 4.0 82 33
- - -
10 8.0 82 100 6.0 82 33
- - -
Anexo 4 (continuação) 116
Table 4 (cont.)
enterobacterial
group
Ceftazidime
EDTA MPA
MAC
Volume
(uL)
Breakpoint
(mm)
SN
c
(%)
SP
c
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
2 - - - - - -
- - -
4 - - - - - -
- - -
6 - - - 1.0 86 29
- - -
8 - - - 1.0 86 14
2.0 86 43
10 - - - 3.0 100 29
3.0 86 43
Imipenem
2 3.0 100 100 - - -
- - -
4 4.0 100 100 - - -
- - -
6 4.0 100 100 - - -
- - -
8 4.0 100 100 - - -
- - -
10 5.0 100 100 - - -
- - -
IMP
Ceftazidime
EDTA MPA
MAC
Volume
(uL)
Breakpoint
(mm)
SN
c
(%)
SP
c
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
2 - - - 8.0 86 89
5.0 82 95
4 3.0 89 74 6.0 86 74
4.0 86 84
6 4.0 89 63 10.0 86 63
6.0 82 74
8 5.0 86 63 11.0 86 68
8.0 82 64
10 7.0 86 68 14.0 86 68
- - -
Imipenem
2 - - - - - -
- - -
4 1.0 82 21 - - -
- - -
6 1.0 82 21 - - -
- - -
8 1.0 86 16 - - -
- - -
10 1.0 86 16 - - -
- - -
SPM
Ceftazidime
EDTA MPA
MAC
Volume
(uL)
Breakpoint
(mm)
SN
c
(%)
SP
c
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
2 - - - 13.0 100 100
- - -
4 7.0 90 95 15.0 100 100
- - -
6 8.0 100 100 17.0 100 100
3.0 100 89
8 9.0 100 100 17.0 100 100
6.0 100 84
10 9.0 100 90 18.0 100 95
8.0 80 89
Imipenem
2 3.0 90 79
3.0 90,0 89,0
4 5.0 100 95 1.0 90 68
10.0 100 100
6 5.0 100 90 5.0 100 68
12.0 100 100
8 7.0 100 95 6.0 90 68
9.0 100 84
10 8.0 100 90 8.0 80 68
14.0 100 100
Anexo 4 (continuação) 117
Table 4 (cont.)
VIM
Ceftazidime
EDTA MPA
MAC
Volume
(uL)
Breakpoint
(mm)
SN
c
(%)
SP
c
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
Breakpoint
(mm)
SN
(%)
SP
(%)
2 - - - - - -
- - -
4 - - - - - -
- - -
6 - - - 1.0 83 11
- - -
8 - - - 1.0 83 11
2.0 83 21
10 - - - - - -
3.0 83 16
Imipenem
2 4.0 83 100 - - -
- - -
4 4.0 83 90 - - -
- - -
6 5.0 83 90 - - -
- - -
8 5.0 100 68 - - -
- - -
10 5.0 100 63 - - -
- - -
a
– EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid ; MPA, mercaptopripionic acid
b
– Breakpoint: increase of inhibition zone, in mm.
c
– SN, sensitivity; SP specificity
Anexo 4 (continuação) 118
Figure 1. ROC curve employing different volumes of MPA in combination with imipenem for
Acinetobacter spp.
Figure 2. ROC curve employing different volumes of EDTA (A) and MPA (B) in combination
with ceftazidime, for P. aeruginosa
1 - Specificity
1.00.75.50.250.00
Sensitivity
1.00
.75
.50
.25
0.00
10
μ
l
8
μ
l
6
μ
l
4
μ
l
2
μ
l
1 - Specificity
1.00.75.50.250.00
Sensitivity
1.00
.75
.50
.25
0.00
1 - Specificity
1.00.75.50.250.00
Sensitivity
1.00
.75
.50
.25
0.00
4
μ
l
10
μ
l
8μl
6
μ
l
2
μ
l
(A) (B)
Anexo 4 (continuação) 119
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Abstract 136
ABSTRACT
The emergence of metallo-β-lactamase (MBL)-producing isolates is a challenge to
routine microbiology laboratories, since there are no standardized methods for
detecting such isolates. The aim of this study was to evaluate the accuracy of
different phenotypic methods to detect MBL production among Pseudomonas,
Acinetobacter spp and enterobacterial isolates, including GIM-, IMP-, SIM-, SPM-,
and VIM- variants. A total of 46 genetically unrelated P. aeruginosa, P. putida,
Acinetobacter spp. and enterobacterial strains producing distinct MBLs were tested.
Nineteen strains were included as negative controls. The inhibition of bacterial
growth and β-lactam hydrolysis caused by MBL-inhibitors (IMBL) were also
evaluated. The isolates were tested for MBL production by both double disk synergy
test (DDST) and combined disk (CD) using imipenem and ceftazidime as substrates
in combination with distinct IMBL. One hundred percent sensitivity and specificity was
achieved by DDST using 2-mercaptopropionic acid in combination with ceftazidime
and imipenem for detection of MBL production among P. aeruginosa and
Acinetobacter spp. isolates, respectively. CD showed the same results for detecting
MBL-producing enterobacteria by combining imipenem and EDTA with a 5.0 mm
breakpoint increase in the inhibition zone. Our results indicate that both phenotypic
methods to detect MBL-producing isolates should be based on the genera to be
tested regardless of the enzyme produced by such isolates as well as the local
prevalence of MBL producers and on the ability of specialized technicians to correctly
interpret MBL inhibition.
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