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THOMAS CARDOSO CHAGAS NETO
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE
ISOLADOS CLÍNICOS DE Trichosporon spp.
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
SÃO PAULO
2007
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THOMAS CARDOSO CHAGAS NETO
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE
ISOLADOS CLÍNICOS DE Trichosporon spp.
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
Co-Orientador: Dr. Guilherme Maranhão
Chaves
São Paulo
2007
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emília Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobie Dias
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório Especial de Micologia, da
Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina,
aprovado pelo Comitê de Ética (01730/05), contando com o apoio
financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP)
iii
THOMAS CARDOSO CHAGAS NETO
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ISOLADOS CLÍNICOS
DE Trichosporon spp.
Presidente da banca:
Dr.: Arnaldo Lopes Colombo
Prof. Titular do Departamento de Medicina
Disciplina de Infectologia – Escola Paulista de Medicina - UNIFESP
___________________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
Drª. Ângela Maria da Silva
Profª. Adjunta da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias
Departamento de Medicina - Universidade Federal de Sergipe - UFS
Drª. Analy Sales de Melo
Pós-doutoranda – Departamento de Medicina
Escola Paulista de Medicina - UNIFESP
Prof. Dr. Carlos Pelleschi Taborda
Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biomédicas - USP
SUPLENTE
Drª. Cristina Viana Niero
Pós doutoranda – Departamento de Microbiologia, Parasitologia e Imunologia
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP
iv
Se acreditássemos, porém, que tudo é tão efêmero e
impermanente quanto à morte é previsível e inevitável,
seríamos mais previdentes em nossas opções, mais
dignos em nossos atos, mais honestos em nossas
atitudes, mais generosos em nossas palavras, mais
humildes em nossos gestos, enfim, mais humanos nos
testemunhos de nossas ações.
Jácome Góis
v
DEDICATÓRIA
À minha mãe,
Almerinda Sá
Por ser a minha fonte de determinação e exemplo de vida em todos os
sentidos. E por me mostrar que eu posso ir muito mais longe depois de
pensar que não se pode mais.
Aos meus irmãos,
Sobretudo, Adilene Sá e Ana de Lourdes Sá
Que foram o grande alicerce de mais um sonho realizado e que estiveram
presentes nos momentos mais importantes da minha vida.
À minha tia,
Ada
Meu porto seguro, meu oráculo, a minha segunda mãe. Por todos os
conselhos sempre bem aplicados.
À minha irmã de coração,
Cledja Soarem de Amorim
Amiga de todas as horas e grande exemplo de vida.
Muito obrigado por estarem presente nos momentos mais difíceis!
vi
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Edméa Helena de Oliveira
Pelo grande apoio, persistência e paciência nas leituras dos ensaios
laboratoriais das assimilações de carboidratos. Quantas leituras fizemos juntos!
Quantos risos! E quantos momentos difíceis ficaram mais fáceis, devido a sua
presença.
Guilherme Maranhão Chaves
Por acreditar neste trabalho, que parecia impossível e me ajudar a torná-lo
real.
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por mais uma oportunidade de crescimento profissional e espiritual.
Ao Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo, pela excelente orientação,
disponibilidade, compreensão, atenção, em fim pela grande oportunidade de
evolução profissional.
À Rossana Cahino Pereira, que sempre esteve presente nos momentos
mais decisivos da minha vida.
Às minhas amigas Luciana Barros de Santana e Jussimara Monteiro, que
sempre me incentivaram na minha carreira acadêmica.
À Drª. Ângela Maria da Silva, responsável por despertar meu interesse em
Micologia e pela minha chegada ao LEMI.
Ao meu cunhado, Adenilson Oliveira Barroso, pelo apoio oferecido na
minha chegada em São Paulo.
À Leila Paula de Almeida, que mesmo “desconfiada e assustada com minha
presença, abriu a porta do LEMI e ouviu minha longa história”. Hoje, grande
responsável por várias páginas desta dissertação e da minha vida profissional.
Aos meus amigos, Daniel Archimedes da Matta e Viviane Reis, por me
ensinarem muito do que sei sobre Micologia e amizade.
A todos os amigos do LEMI, em especial: Ana Carolina Azevedo, Fernanda
Pahim, Fernando, Gisela, Patrício Godoy, Mara Stort, Rosângela, Thaís
Guimarães, Thelma Alves, Vinicius Ponzio e Zelinda Nakagawa, que
compartilharam comigo toda a trajetória da minha tese e muitos momentos de
alegria.
viii
À Analy Sales de Azevedo Melo, responsável pela minha inicialização na
Biologia Molecular e por me mostrar que tipo de profissional pretendo ser.
À Eliete de Miranda Frigatto, por acreditar no meu potencial, pelos
conselhos e além de tudo pela grande amizade.
À Drª. Antônia Maria Machado, pelo constante incentivo e pelas inúmeras
oportunidades profissionais.
À minha família do Laboratório Central, em especial: Ademir Medeiros, Ana
Paula Toledo, Cecília Godoy, Cida Gomes, Clarice Yume, Clayde Barqueta,
Elza, Fernando Pereira, Flávia Palomo, Jorge Oliveira, Laíde Santos, Lisete
Liviero, Lourdes, Luciene, Luíza Reis, Madalena, Márcia Pozo, Mirella, Neide,
Regina Corrêa, Vivian Mota e a todos que mesmo não citados me apoiaram e
ouviram meus desabafos, sem vocês nada disso teria sido possível.
À Drª. Márcia Melhem e ao grupo do Instituto Adolfo Lutz, pelo apoio na
aquisição de alguns carboidratos utilizados nos experimentos.
Ao Recni Mohamad Ibrahim, Kafah Mohamad Ibrahim e Marta Younes por
me acolher nos momentos mais complicados e pelo apoio nos momentos finais
deste trabalho.
Ao Charles, Cássia, Mirian, André, Wancler por todo apoio oferecido
durante a elaboração desta tese.
À Maria de Jesus Lima dos Santos e Maria de Fátima de Souza
Nascimento, por estarem sempre solícitas e pelos momentos de boas risadas.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a minha formação
acadêmica e me ajudaram a vencer mais uma etapa importante da minha vida.
Muito obrigado!
ix
SUMÁRIO
Dedicatória .....................................................................................................
v
Agradecimentos especiais.............................................................................
vi
Agradecimentos .............................................................................................
vii
Listas ...............................................................................................................
xii
Resumo ...........................................................................................................
xvi
Abstract...........................................................................................................
xvii
1
Introdução
.................................................................................
1
1.1
Biologia do gênero Trichosporon e sua relevância clínica ...........
2
1.2
Infecções causadas pelo gênero Trichosporon ............................
4
1.3 Caracterização microbiológica dos casos de infecções por
Trichosporon no Brasil ..................................................................
7
1.4 Dificuldades na identificação de espécies de isolados de
Trichosporon .................................................................................
7
1.4.1
Métodos fenotípicos .....................................................................
8
1.4.2 Uso de ferramentas moleculares na identificação de
Trichosporon spp. .........................................................................
11
1.5 Desafios terapêuticos e dificuldades na realização de testes de
sensibilidade in vitro de amostras de Trichosporon spp. ..............
13
2
Objetivos
...................................................................................
17
21.
Objetivo geral................................................................................
18
2.2
Objetivos específicos.....................................................................
18
3
Material e Métodos
.................................................................
19
3.1
Seleção das amostras ..................................................................
21
3.2
Identificações fenotípicas e genotípicas dos isolados clínicos......
21
3.2.1
Avaliação da pureza e viabilidade das amostras .........................
21
x
3.2.2
Perfil fenotípico..............................................................................
21
3.2.2.1
Avaliação de características morfológicas....................................
22
3.2.2.2
Características bioquímicas da levedura.......................................
24
3.3
Identificação molecular de espécies de Trichosporon.....................
25
3.3.1
Formação de protoplastos e extração do DNA genômico...............
25
3.3.2
Tratamento do DNA com RNAse....................................................
27
3.3.3
Quantificação do DNA....................................................................
27
3.3.4
Seleção dos oligonucleotídeos para genotipagem........................
28
3.3.5
Reação de PCR.............................................................................
28
3.3.6
Eletroforese de DNA em gel de agarose.......................................
29
3.3.7 Purificação dos produtos de PCR para a reação de
seqüênciamento............................................................................
30
3.3.8
Reação de seqüenciamento..........................................................
31
3.3.9
Precipitação do DNA e eliminação dos reagentes de PCR.............
31
3.3.10
Análise e interpretação da qualidade das seqüências....................
32
3.3.11
Análise das seqüências por comparação em bancos genômicos...
32
3.4
Avaliação do perfil de sensibilidade a antifúngicos.......................
32
3.4.1
Preparo do meio de cultura...........................................................
33
3.4.2
Preparação de drogas antifúngicas...............................................
33
3.4.3
Preparo das placas ensaios de microdiluição em caldo................
34
3.4.4
Preparo do inóculo........................................................................
34
3.4.5
Realização do ensaio de sensibilidade aos antifúngicos..............
35
3.4.6
Leitura e interpretação dos resultados..........................................
36
3.4.7
Caracterização dos resultados das CIMs para os antifúngicos.....
36
4
Resultados
................................................................................
38
4.1
Identificação..................................................................................
39
xi
4.1.1
Identificação fenotípica..................................................................
39
4.1.2
Identificação genotípica.................................................................
41
4.1.2.1 Identificação molecular do gênero Trichosporon por técnica de
PCR...............................................................................................
41
4.1.2.2 Identificação molecular de espécies de Trichosporon por
seqüenciamento da região IGS1 do rDNA....................................
43
4.1.3
Comparação entre as identificações fenotípica e genotípica........
44
4.2
Perfil de sensibilidade aos antifúngicos.........................................
46
4.2.1
Avaliação dos testes de sensibilidade a Anfotericina B................
46
4.2.1.1
Padronização dos métodos de Etest® e microdiluição em caldo.
46
4.2.1.2 Comparação da sensibilidade a anfotericina B de isolados
clínicos de Trichosporon por microdiluição em caldo e Etest®.....
47
4.2.1.3 Impacto do tempo de leitura no padrão de sensibilidade de
Trichosporon spp. à anfotericina B................................................
49
4.2.1.4 Impacto do tempo de leitura no padrão de sensibilidade de
Trichosporon spp. aos azólicos, caspofungina e 5-fluorocitosina.
50
5
Discussão
..................................................................................
52
6
Conclusões
...............................................................................
65
7
Referências Bibliográficas
..................................................
67
8
Anexos
.......................................................................................
78
xii
Lista de tabelas
1.
Dificuldades na identificação de espécies de isolados de Trichosporon.....
9
2.
Cepas de referência utilizadas neste estudo...............................................
21
3. Perfil bioquímico esperado para identificação fenotípica de espécies de
Trichosporon segundo adaptação da literatura...........................................
23
4. Resultados de ensaios bioquímicos encontrados neste estudo com
cepas de referência CBS e de isolados clínicos de hemoculturas de
Trichosporon spp. .......................................................................................
40
5.
Identificação fenotípica dos isolados de Trichosporon spp. .......................
41
6.
Identificação genotípica dos isolados de Trichosporon spp. ......................
44
7. Identificação dos isolados de Trichosporon spp. por dois diferentes
métodos: clássico e molecular.....................................................................
45
8. Variação das CIMs dos antifúngicos por microdiluição e Etest® das
cepas de referência.....................................................................................
47
9. Comparação da sensibilidade a anfotericina B de isolados clínicos de
Trichosporon por microdiluição em caldo e Etest®.....................................
48
xiii
Lista de figuras
1. Representação esquemática do locus do rDNA. Os retângulos azuis
indicam regiões transcritas funcionais. Adaptada de Sugita, et al.
(2002).........................................................................................................
28
2.
Géis de agarose da PCR utilizando os oligonucleotídios TRF e TRR.......
42
3. Géis de agarose da PCR utilizando-se os oligonucleotídios 26SF e
5SR............................................................................................................
43
4. Regressão linear das CIMs de na anfotericina B para os 23 isolados de
Trichosporon spp. obtidas por Etest® e microdiluição em caldo...............
49
5. Comparação da sensibilidade dos 23 isolados de hemoculturas de
Trichosporon spp. à anfotericina B pelos métodos de microdiluição em
caldo e Etest®...........................................................................................
50
6. Perfil de sensibilidade dos 23 isolados de hemoculturas de
Trichosporon spp. frente aos antifúngicos pelo método de microdiluição
em caldo....................................................................................................
51
xiv
Lista de abreviaturas e símbolos
ATCC American Type Culture Collection
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
C Citosina
C Carbono
o
C Graus Celsius
CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures
CIM Concentração inibitória mínima
CIM
0
Concentração inibitória mínima de crescimento visual proeminente
CIM
2
Concentração inibitória mínima com completa inibição visual
CIMs Concentrações inibitórias mínima
CIM
50
Concentração inibitória mínima de antifúngico capaz de inibir o
crescimento de 50% dos isolados
CIM
90
Concentração inibitória mínima de antifúngico capaz de inibir o
crescimento de 90% dos solados
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
DO Densidade óptica
EPM Escola Paulista de Medicina
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EUA Estados Unidos da América
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
et al. E outros
G Guanina
g Gramas
g/L Grama por litro
h Hora
HCl Ácido clorídrico
IGS1 Intergenic spacer 1
ITS1 Internal transcriber spacer 1β
ITS2 Internal transcriber spacer 2
LEMI Laboratório Especial de Micologia
LSU Large subunit
NCBI National Center for Biotechnology Information
mg Miligrama
mL Mililitro
mM Milimolar
MOPS Ácido morfolinopropanolsulfônico
N Nitrogênio
N Normal
xv
N° Número
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
ng Nanogramas
nm Nanômetros
pb Pares de bases
PCR Reação de polimerase em cadeia
pH Potencial hidrogeniônico
pmol Picomol
R Resistente
rDNA DNA ribossomal
RNA Ácido ribonucléico
rpm Rotações por minuto
RPMI Roswell Park Memorial Institute
S Sensível
SDD Sensível dependendo da dose
SDS Dodecil sulfato de sódio
spp. Espécies
SSU Small subunit
TBE Tris bórico EDTA
UFC Unidade formadora de colônia
µL Microlitro
µm Micrômetro
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
UV Ultravioleta
YEPD Yeast Extract Pepton Dextrose
w/v Weight/volume
® Marca registrada
x Vezes
≤ Menor ou igual a
≥ Maior ou igual a
% Por cento
± Mais ou menos
xvi
Resumo
Introdução: Trichosporon tem sido descrito como patógeno oportunista
emergente relacionado às infecções disseminadas em pacientes
imunocomprometidos, sobretudo em indivíduos apresentando neutropenia
intensa. É bastante evidente que há poucas informações disponíveis sobre as
características das infecções por este patógeno principalmente nos hospitais
brasileiros, sendo necessária a realização de estudos que permitam a
caracterização do seu perfil epidemiológico. Objetivos: 1) Identificar por métodos
fenotípicos e genotípicos as espécies de Trichosporon isoladas de hemoculturas
obtidas de pacientes hospitalizados; 2) Adaptar a metodologia do CLSI para a
avaliação da sensibilidade a antifúngicos de isolados de Trichosporon spp.; 3)
Avaliar Etest® para predizer a sensibilidade à anfotericina B; 4) Avaliar o perfil de
sensibilidade de diferentes espécies do gênero Trichosporon, em relação a seis
antifúngicos. Material e Métodos: Foram utilizadas 23 cepas de Trichosporon
spp. isoladas de hemoculturas provenientes de dois hospitais terciários da cidade
de São Paulo e coletadas entre os anos de 1995 e 2004. As leveduras foram
identificadas em nível de espécie através de características morfológicas e
bioquímicas, sendo esta identificação confirmada por estudos moleculares. Para
tanto, foi amplificada a região 18S do rDNA para a confirmação da identificação
do gênero e realizado o seqüenciamento da região IGS1 para confirmação da
identificação de espécie. A avaliação da sensibilidade aos antifúngicos foi
realizada por dois diferentes métodos: microdiluição em caldo e difusão em ágar
por Etest®. Resultados: A identificação fenotípica foi comparada com a
genotípica demonstrando algumas incongruências quanto às duas metodologias.
Três isolados foram erroneamente identificados como: T. asteroides
(identificação molecular: T. asahii var. asahii); T. inkin (identificação molecular:
T.asahii var. asahii) e T. asahii (identificação molecular: T. asteroides), enquanto
que quatro isolados não foram identificados em nível de espécie pelo método
fenotípico. Houve 61 % de concordância entre as duas metodologias, sendo T.
asahii a espécie mais freqüentemente identificada na presente série. Anfotericina
B foi o único antifúngico testado pelas duas metodologias. As CIMs da
microdiluição em caldo apresentaram-se distribuídas em menor espectro de
diluições, enquanto que no Etest® as CIMs apresentaram-se num largo espectro.
Os isolados de T. asahii apresentaram CIMs mais elevadas e menores índices de
sensibilidade a anfotericina B, por ambos os métodos, quando comparados com
isolados de T.não-asahii. Houve elevada sensibilidade aos azólicos. Em
contrapartida, 5-fluorocitosina e caspofungina não apresentaram atividade in vitro
contra estes isolados. Conclusão: O seqüenciamento da região IGS1 foi
suficiente para a identificação de todos os isolados clínicos incluindo espécies
geneticamente relacionadas. Mesmo utilizando número limitado de cepas,
observamos que os triazólicos apresentara
m melhor padrão de atividade antifúngica
contra os isolados de Trichosporon spp.
xvii
Abstract
Introduction: The genus Trichosporon has been described as an emergent
opportunistic pathogen related to disseminated infections in immunocompromised
patients, specifically those individuals with intense neutropenia. It is highly evident
that there is not enough information available about the characteristics of the
infection caused by this pathogen, mainly in Brazilian hospitals. Therefore, it is
important to investigate trichosporonosis epidemiology. Objectives: 1) To identify
strains isolated from blood cultures using phenotypic and genotypic methods. 2) To
adapt CLSI methodology for the evaluation of Trichosporon spp. sensitivity to
antifungal drugs. 3) To evaluate Etest® for predicting sensitivity to Amphotericin B.
To evaluate the sensitivity profile of different Trichosporon species to 6 antifungal
drugs. Material and methods: We analyzed 23 strains of Trichosporon spp.
recovered from blood cultures of two tertiary hospitals in São Paulo and collected
between 1995 and 2004. The yeasts were identified to species level based on their
morphological and biochemical characteristics and subsequently by molecular
biology. For those purposes, we amplified the18S rDNA region to confirm genus
identification and sequenced the IGS1 region of rDNA to confirm species phenotypic
identification. We used two different methods to investigate sensitivity to antifungal
drugs: broth microdilution and agar-diffusion disk test using Etest®. Results: We
observed some incongruences between the phenotypic and genotypic methods used
for identification. Three isolates were misidentified as T. asteroids (molecular
identification: T. asahii var. asahii). T. inkin (molecular identification: T. asteroids),
while four isolates could not be identified to species level using phenotypic methods.
The two different methods agreed on 61% of the cases. T. asahii was the most
commonly isolated species in the present study. Amphotericin B was the only
antifungal drug tested with both methodologies. Broth microdilution MICs were less
variable within different dilutions, while Etest® MICS showed broader variation. T.
asahii isolates had higher MICs values and were less susceptible to Amphotericin B
for both methods than Non-Asahii Trichosporon. The isolates were highly sensitive to
azoles. Nevertheless, 5-fluorocitosin and caspofungin had no in vitro activity against
the clinical isolates analyzed. Conclusion: The IGS1 region sequencing was enough
to identify all the clinical isolates, including closely related species. Although the
number of strains tested was small, we observed that triazoles had better antifungal
activity against Trichosporon spp. isolates.
1. INTRODUÇÃO
__________________________________
Introdução 2
1.1- Biologia do gênero Trichosporon e sua relevância clínica
Leveduras do gênero Trichosporon estão amplamente distribuídas na
natureza, sendo encontrados predominantemente em zonas tropicais e
temperadas. Usualmente, este fungo basidiomiceto é encontrado em materiais
procedentes do meio ambiente principalmente no solo e madeiras em
decomposição. Ocasionalmente, pode fazer parte da microbiota permanente do
trato gastrointestinal, da microbiota transitória da pele e do trato respiratório de
humanos (Walsh, et al., 1990; Walsh, et al., 1992; Lussier, et al., 2000; Walsh,
et al., 2004).
O gênero Trichosporon é caracterizado por apresentar artroconídios e
blastoconídeos, além de hifas e pseudo-hifas. No entanto, algumas espécies
possuem outras características que as diferenciam morfologicamente, como
apressoria e macroconídios, ou conidiação meristemática. Todas as espécies
deste gênero são capazes de assimilar grande número de carboidratos e
nitrogênio, além de degradar a uréia. A cultura em ágar Sabouraud dextrose
permite o crescimento de colônias leveduriformes com matiz de coloração que
varia do branco ao bege, apresentando, na maioria das vezes, aspecto
característico com sulcos cerebriformes radiados em sua superfície (De Hoog,
et al., 2000).
O gênero Trichosporon foi criado em 1890, para posicionar alguns
fungos causadores de micoses superficiais em humanos, Trichos = pêlos e
sporon = esporos. Este gênero, assim como a espécie Trichosporon beigelli, foi
descrito originalmente a partir da observação clínica de pacientes com nódulos
em cabelos e pêlos. Durante anos as micoses superficiais foram consideradas
menos importantes na micologia médica. T. beigelli era conhecido como um
fungo saprófita ambiental, apenas ocasionalmente encontrado como agente de
piedra branca, sendo a primeira publicação de infecção sistêmica causada por
Trichosporon spp. descrita em 1970 (Watson & Kallichurum, 1970).
Introdução 3
Passaram-se mais de três décadas para a importância médica desse
fungo ser reconhecida (Hoy, et al., 1986; Walsh, et al., 1986; Anaissie, et al.,
1989; Walsh, et al., 1989; Herbrecht, et al., 1992).
Trata-se de um gênero estritamente anamórfico, com história complexa
quanto à sua nomenclatura, o que tem gerado grandes controvérsias. A
primeira descrição de possíveis isolados clínicos de Tichosporon spp. foi feita
em 1867, a partir do cultivo de nódulos de piedra branca, onde foram
observadas células arredondadas, tendo sido o agente etiológico
equivocadamente designado como uma alga, Pleirococcus beigelli
(Rabenhorst, 1867). Posteriormente, Behrend (1890) descreveu
detalhadamente o fungo isolado de piedra branca de barba, com o nome de
Trichosporon ovoides. Desde então, outros isolados de Trichosporon spp.
foram relatados. Em 1902, Vuillemin considerou todas as espécies de
Trichosporon como Trichosporon beigelli, que significa levedura artrosporada
(Guého, De Hoog, Smith, 1992).
Em 1910, Beurmann cultivou um fungo isolado de lesão cutânea
denominando-o Oidium cutaneum. Este foi subseqüentemente renomeado de
Tricosporon cutaneum por Ota em 1926. Contudo, Diddens e Lodder (1942)
consideraram T. beigelli e T. cutaneum como sendo da mesma espécie. Esta
situação levou a uma drástica simplificação do gênero para somente dois
nomes com relevância clínica, considerados sinônimos e usados
rotineiramente, a saber: Trichosporon beigelli, adotado por clínicos e
Trichosporon cutaneum, preferido por micologistas ambientais (Guého, De
Hoog, Smith, 1992).
A utilização de critérios macromorfológicos, micromorfológicos,
ecológicos e fisiológicos não são suficientes para permitir maior caracterização
do gênero Trichosporon, visto que aglutina no mesmo taxon, isolados de
comportamento genético muito heterogêneo. Este gênero abrangia
tradicionalmente poucas espécies, até a revisão taxonômica realizada por
Guého, et al., (1992), baseada em estudos moleculares de ácidos nucléicos,
correlacionado às características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas. Os
Introdução 4
critérios utilizados para reclassificar as espécies de Trichosporon, baseados
nos novos conceitos taxonômicos, foram: a análise da ultra-estrutura dos poros
septais, conteúdo Guanina-Citosina (mol % G - C), valores de reassociação do
ácido desoxirribonucléico (DNA), perfil nutricional e seqüência parcial da região
26S do DNA ribossomal (rDNA). As seqüências do rDNA e os valores de
reassociação DNA/DNA, foram usados como os critérios mais importantes para
a demarcação de espécie.
O taxon T. beigelli não foi mantido e como resultado foram propostas
seis espécies patogênicas para substituir tal designação. T. beigelli foi
considerado um dos taxa mais heterogêneos. (Gueho, et al., 1992; Sugita, et
al., 1994; Sugita, et al., 1995). Consequentemente, a utilização de ferramentas
moleculares foi fundamental para permitir maior consistência na nova
taxonomia deste gênero.
Posteriormente, Guého, et al., (1994) e Sugita, et al., (1994, 1995)
fizeram uma revisão de espécies clinicamente significativas e propuseram uma
nova classificação. Com estes trabalhos, 17 espécies e 5 variedades foram
aceitas para o gênero Trichosporon. Estes autores sugeriram ainda que o taxon
Trichosporon beigelli englobasse seis patógenos para a espécie humana:
Trichosporon cutaneum, Trichosporon asahii, Trichosporon asteróides,
Trichosporon mucoides, Trichosporon inkin e Trichosporon ovoides. Em estudo
recente Sugita et al., (2002) propuseram 25 espécies para o gênero
Trichosporon, sendo que entre estas espécies 8 teriam relevância na Micologia
Médica, incluindo duas espécies emergentes em infecções invasivas: T.
pullulans e T. loubieri.
1.2- Infecções causadas pelo gênero Trichosporon
Trichosporon tem sido descrito como patógeno oportunista emergente
relacionado às infecções disseminadas em pacientes imunocomprometidos,
sobretudo em indivíduos apresentando neutropenia intensa (Groll, Walsh,
2001; Walsh, et al., 2004).
Introdução 5
As espécies de Trichosporon estão associadas a um amplo espectro de
infecções, incluindo, na maioria das vezes, lesões superficiais benignas como
piedra branca, predominantemente causada por T. inkin (em pêlos pubianos) e
por T. ovoides (em cabelos) ou infecções cutâneas superficiais, onde as
espécies mais isoladas são T. cutaneum e T. asteroides. Podem causar ainda
infecções invasivas onde os agentes mais associados são T. asahii, seguido de
T. mucoides. No Japão, diversos autores têm documentado que T. asahii pode
causar quadros de pneumonia alérgica (Thérizol-Ferley et al., 1994; Kataoka-
Nishimura, et al., 1997; Nishiura, et al., 1997; Yoo, et al., 1997, Groll, Walsh,
2001). Duas espécies emergentes também relacionadas a infecções,
habitualmente superficiais em humanos têm sido descritas na literatura:
Trichosporon pullulans e Trichosporon loubieri (Lascaux, et al., 1998; Krcmery,
et al., 1999; Padhye, et al., 2003).
Trichosporon é o agente mais comum de piedra branca, que se
caracteriza pela presença de nódulos irregulares ao longo dos pêlos
acometidos, sendo necessário cultivo para diagnóstico diferencial de
Corynebacterium spp (Lacaz, et al., 2002). Estes nódulos podem apresentar-se
de cor branca ou marrom clara. Piedra branca é uma infecção cosmopolita que
pode ser encontrada nos pêlos da barba, bigode, axilas e genitálias (Arêa
Leão, 1940; Thérizol – Ferley et al., 1994; Kataoka-Nishimura, et al., 1997;
Groll, Walsh, 2001). Outros tipos de infecções superficiais causadas por
Trichosporon spp. incluem onicomicoses e otomicoses (Reirsol, 1955; Fusaro,
Miller, 1984).
A incidência de micoses invasivas por fungos patogênicos oportunistas
tem crescido consideravelmente ao longo das últimas décadas (Trick, et al.,
2002; Ostrosky-Zeichner, et al., 2003; Pfaller, et al., 2004; Walsh, et al., 2004;
Karabay, et al., 2006). Este fato está provavelmente relacionado a alguns
fatores: a maior ocorrência de doenças degenerativas e neoplásicas, o grande
número de transplantes de órgãos realizados, a maior utilização de terapias
imunossupressoras, quimioterapia e uso de antimicrobianos de amplo espectro,
bem como a realização de maior número de procedimentos médicos invasivos
(Beck-Sagüe, Jarvis, 1993; Reiss, et al., 1998; Blumberg, et al., 2001; Hajjeh, et
Introdução 6
al., 2004; Walsh, et al., 2004). Vale destacar que, geralmente, as infecções
fúngicas invasivas estão associadas com alta mortalidade e prognóstico
reservado (Tashiro, et al., 1994).
As infecções invasivas por Trichosporon spp. são geralmente precedidas
da colonização do trato respiratório ou gastrointestinal, sendo comum nestes
pacientes a presença de cateter venoso em posição central (Walsh, et al.,
1990; Walsh, et al., 1992; Lussier, et al., 2000; Walsh, et al., 2004). O gênero
Trichosporon tem sido relatado como a segunda causa mais comum de
infecções por leveduras após o gênero Candida, em pacientes com doenças
hematológicas malignas, casos onde a mortalidade é da ordem de 80%,
mesmo na vigência terapêutica com anfotericina B (Krcmery et al., 1999;
Flemming, et al., 2002; Walsh, et al., 2004).
As infecções disseminadas por Trichosporon spp. possuem distribuição
mundial, sendo conhecidos relatos de casos em diferentes cenários clínicos.
Kataoka-Nishimura, et al., (1997) relataram 11 casos de fungemia por
Trichosporon cutaneum num Hospital de Tokio entre 1986 e 1996 onde 9
pacientes eram portadores de doença hematológica maligna. Manzella, et al.,
(1982) reportaram um caso de fungemia com disseminação cutânea por
Trichosporon spp. em um indivíduo com leucemia granulocítica, enquanto que
no caso descrito por Itoh et al., (1996), a paciente apresentava como doença
de base leucemia linfocítica. Outros relatos de tricosporonose invasiva foram
publicados por Kirmani, et al., (1980), Hebwick, et al., (1992), Kataoka-
Nishimura, et al., (1998); Kim, et al., (2001), Meyer, et al., (2002), Yang, et al.,
(2002), Rodrigues, et al., (2006). Segundo estes autores a maioria dos
pacientes com este tipo de infecção apresentava neutropenia intensa. As
manifestações clínicas descritas nos casos de disseminação hematogênica
incluem febre, múltiplas lesões cutâneas, presença de infiltrados pulmonares,
envolvimento neurológico, corioretinites e até mesmo choque séptico com
falência renal. Aparentemente, a espécie mais associada a este tipo de
infecção é T. asahii (Walsh, et al., 1986; Hoy, et al., 1986; Walsh, et al., 1989;
Herbrecht, et al., 1992).
Introdução 7
1.3- Caracterização microbiológica dos casos de infecções por
Trichosporon no Brasil
No Brasil, em concordância com a literatura, a maioria dos estudos tem
relatado a ocorrência de infecções superficiais por Trichosporon spp., incluindo
casos de onicomicoses e piedra branca. Entretanto, na maioria das vezes, a
identificação em categoria de espécie não é realizada (Pontes, et al., 2002a;
Pontes, et al., 2002b). Febré, et al., (1999) caracterizaram 2 amostras de
Trichosporon isoladas de urina de pacientes no centro de tratamento intensivo
(CTI) em uso de sonda vesical. As amostras eram de T. inkin e T. ovoides,
ambas resistentes a anfotericina B. Em 2002, Neves, et al. isolaram uma cepa
de cavidade oral. O isolado foi identificado como T. pullulans, porém não foi
realizado teste de sensibilidade a antifúngicos.
Em relação a episódios de doença invasiva, Rodrigues, et al., (2006)
relataram 22 casos clínicos de tricosporonoses por T. asahii isolados de 30
amostras clínicas (sendo: 23 de urina, 3 de sangue, 2 de líquido de ascite, 1 de
líquido de diálise e 1 de líquido pleural) num período de 1999 a 2005. Moretti-
Branchini, et al., (2001) postularam 2 casos de infecção invasiva por
Trichosporon em pacientes transplantados de medula óssea no Hospital das
Clínicas da Universidade de Campinas, do Estado de São Paulo (Unicamp).
Um dos portadores apresentou cultura de ponta de cateter e swab anal
positivos para T. inkin, sendo o mesmo tratado com fluconazol e apresentando
sucesso terapêutico. O segundo paciente desenvolveu neutropenia intensa
devido à quimioterapia, apresentando em seguida hemocultura positiva em que
o isolado foi identificado primeiramente como Candida spp. Posteriormente
verificou-se que se tratava de Trichosporon asahii var. asahii. O paciente foi
tratado com anfotericina B, mas evoluiu para óbito.
1.4- Dificuldades na identificação de espécies de isolados de
Trichosporon
Vários métodos para a identificação de espécies de Trichosporon têm
sido relatados, incluindo desde a caracterização morfológica e bioquímica, até
Introdução 8
o uso de ferramentas moleculares. Os métodos fenotípicos são utilizados em
laboratórios de rotina, mas sua acurácia parece limitada (Gueho, et al., 1992;
Sugita, et al., 1994; Sugita, et al., 1995; Walsh, et al., 2004). Por outro lado,
métodos moleculares oferecem maior exatidão na identificação, mas ainda são
pouco compatíveis com as exigências de custos e praticidade de laboratórios
de rotina (Sugita, et al., 2002; Rodriguez-Tudela, et al., 2005).
1.4.1- Métodos fenotípicos
Os métodos fenotípicos disponíveis são baseados em análises
micromorfológicas e bioquímicas, e freqüentemente apresentam resultados
inconsistentes para identificação de espécies de Trichosporon. Vale ressaltar
que a maioria destes métodos não contempla as novas categorias taxonômicas
em seus bancos de dados. Além disso, para laboratórios interessados em
realizar identificação pelas provas clássicas, alguns substratos recomendados
para provas bioquímicas não são comercialmente disponíveis, a exemplo de
DL-lactato e D-glucosamina (Dooley, Beckius, Jefrey, 1994; Fenn, et al., 1994;
Ramani, et al., 1998).
A Tabela 1 demonstra as inconsistências de resultados esperados para
provas bioquímicas envolvendo diferentes substratos, cujos resultados são
utilizados na definição de uma chave de identificação. Observam-se diferenças
significativas no padrão de leitura destas provas quando são realizadas por
diferentes autores. Neste contexto, é esperado que a acurácia e
reprodutibilidade de métodos fenotípicos sejam bastante limitadas na
identificação destes patógenos .
Introdução 9
Tabela 1. Utilização de diferentes substratos na caracterização bioquímica das
espécies de Trichosporon com relevância clínica, segundo a experiência de 3
investigadores.
Cepas
T. asahii
CBS
(2530)
T.cutaneum
CBS (2466)
T.inkin CBS
(5585)
T. mucoides
CBS (7625)
T.ovoides
CBS (7556)
T. asteroides
CBS (2481)
Provas Autores
1 2 3 1 2 3
1 2 3 1 2 3 1 2 3
1 2
3
L-arabnose
+ + + + + +
- - v + + + - v - + +
+
Sorbitol
v - v v + v
v - v + + + v - V
v v
v
Melibiose
- - - - + +
- - - + + + - - - + -
-
Assimilação
Inositol v - v + + +
+ v + + + + + - +
+ +
+
Crescimento a 37°C
+ + + - - -
+ + + + + + v v +
v +
v
Crescimento em presença de
0,1 % ciclohexamida
n + - n - -
n v v n + v n + - n v
n
Formação de apressoria
- - - - - -
+ + + - - - + + +
- - n
1- De Hoog, et al., 2000; 2- Sugita, et al., 1995; 3 – Kurtzman, et al., 1998; (+) positivo; (-
) negativo; (v) variável; n= não
informado.
Entre os sistemas comerciais não automatizados, a identificação de
espécies do gênero Trichosporon é apresentada de forma simplificada e
incompleta no banco de dados e chaves classificatórias para identificação final
deste microrganismo. Os métodos comerciais mais utilizados em laboratórios
de rotina são os seguintes:
API 20C AUX (BioMérieux – Vitek, Inc., Hazelwood, Mo.): metodologia
baseada na assimilação de 20 carboidratos, requer provas adicionais como
macro e micromorfologia, produção de urease e, em sua base de dados não
constam as novas categorias taxonômicas do gênero Trichosporon, utiliza-se,
portanto, a única e antiga denominação: Trichosporon beigelli (Espinel-Ingrof,
et al., 1998; Ramani, et al., 1998).
ID 32C (BioMérieux – Marcy I’Etoile – França): metodologia baseada na
assimilação de 32 carboidratos, adicionado ao teste de sensibilidade à
ciclohexamida. Necessita de provas adicionais de macro e micromorfologia.
Este método apresenta dificuldade para este tipo de identificação visto que a
codificação das provas bioquímicas pode resultar em identificações
inconsistentes (Fricker-Hidalgo, et al., 1996, Ramani, et al., 1998).
Introdução 10
RapID Yeast Plus System (Innovative Diagnostic System, Norcross, Ga.,
EUA): é um método baseado em reações enzimáticas e substratos
cromogênicos para a identificação de leveduras clinicamente importantes.
Espinel-Ingrof, et al., (1998a). Kitch, et al., (1996) avaliaram a habilidade desta
técnica em identificar 304 isolados clínicos em 4 horas. Nesta metodologia, 12
isolados clínicos que foram identificados previamente como diferentes espécies
de Trichosporon foram identificadas exclusivamente como Trichosporon beigelli
(taxon que consta na base de dados).
Quanto aos sistemas automatizados, mesmo antes da revisão da
taxonomia do gênero Trichosporon, já eram conhecidas limitações de sua
acurácia:
Vitek System® (BioMérieux Vitek, Hazelwood, EUA): este sistema é
baseado em testes de assimilação de carbono e nitrogênio, utiliza provas
enzimáticas e de sensibilidade à ciclohexamida. A leitura se faz por
espectrofotômetro com tempo de incubação entre 24 e 48 horas para a versão
1 e de 15 horas para a versão 2. Necessita provas adicionais de
micromorfologia. Seu banco de dados está progrmado para identificar somente
3 espécies, T. asahii, T. inkin e T. mucoides. Além disso, foram reportadas
incongruências nas identificações de T. inkin, erroneamente identificadas como
sendo Trichosporon asahii por este sistema (Fenn, et al., 1994; Huang, et al.,
2001; Ahmad, et al., 2005).
Baxter MicroScan® (Baxter MicroScan, West Sacrament, EUA): permite
a identificação de leveduras em 4 horas. Este método avalia o perfil enzimático
do organismo. A leitura é fluorométrica e espectrofotométrica e pode requisitar
macro e micromorfologias como testes adicionais. A acurácia desta técnica é
menor que a obtida no Vitek. Vários pesquisadores experimentaram
dificuldades com a identificação de Trichosporon spp. utilizando esta
metodologia, devido a limitações do seu banco de dados que ainda contempla
exclusivamente Trichosporon beigelli (Dooley, Beckius, Jefrey, 1994; Fenn, et
al., 1994).
Introdução 11
Diante de todas as limitações mencionadas para a identificação em nível
de espécie por diferentes métodos fenotípicos, além das incongruências entre
os resultados gerados por diferentes autores, muitas publicações a respeito de
Trichosporon spp. caracterizam os isolados clínicos apenas como T. asahii e T.
não-asahii. Portanto, torna-se necessária a identificação acurada de todas as
espécies a fim de avançarmos no real entendimento da epidemiologia deste
agente, bem como de suas peculiaridades terapêuticas (Walsh, et al., 1990;
Perparim, et al., 1996; Uzun, et al., 2000; Arikan & Hasçelik, 2002).
1.4.2- Uso de ferramentas moleculares na identificação de Trichosporon
spp.
Na tentativa de melhorar a acurácia da identificação deste
microrganismo, métodos baseados no estudo do DNA para identificação de
espécies têm sido propostos como uma alternativa precisa e segura, já que
apresentam maior estabilidade dos caracteres ao longo do tempo, alta
reprodutibilidade e objetividade na interpretação dos resultados (Pfaller, et al.,
1995).
Alguns autores sugerem que comparação direta de seqüências de
nucleotídeos possa ser um método objetivo para a resolução dos problemas de
taxonomia e identificação fenotípica de espécies de Trichosporon. Para este
tipo de abordagem as sequências mais conservadas e espécies-específicas
são representadas por genes ribossomais. Estes genes têm regiões muito
conservadas, alternadas por regiões variáveis, ideais para comparações intra-
específica e interespecífica (Sugita, et al., 1997, 1998).
Nos últimos anos, métodos de biologia molecular têm mudado a
taxonomia do gênero Trichosporon de forma significativa (Gueho, et al., 1992;
Sugita, et al., 1994). Sugita et al., (1998) descreveram uma árvore filogenética
para as espécies deste gênero, construída a partir da comparação das
seqüências de nucleotídeos da subunidade menor (small subunit - SSU) e da
subunidade maior (large subunit - LSU) do rDNA (DNA ribossomal). Para
tanto, seqüências da região SSU do rDNA de leveduras patogênicas obtidas de
bibliotecas de DNA foram alinhadas. Os oligonucleotídios TRF (5’ – AGA GGC
Introdução 12
CTA CCA TGG TAT CA – 3’) e TRR (5’ – TAA GAC CCA ATA GAG CCC TA –
3´), que amplificam parte da região SSU do rDNA, foram utilizados para a
confirmação da identificação do gênero Trichosporon, já que estes
oligonucleotídios não hibridizam em regiões conservadas do gene ribossômico
de outras leveduras de importância médica (Sugita, et al., 2002).
Posteriormente, na tentativa de classificar cepas em nível de espécie,
Sugita, et al., (1999) seqüenciaram e analisaram as regiões dos genes
espaçadores transcritos internos (internal transcriber spacer - ITS1 e ITS2) de
Trichosporon spp. e propuseram 17 espécies e cinco variedades dentro do
gênero Trichosporon. Com estas informações, os autores concluíram que as
seis espécies clinicamente relevantes poderiam ser identificadas por suas
seqüências de ITS.
Em estudo recente, Sugita et al., (2002) determinaram a seqüência da
região espaçadora intergênica (intergenic spacer - IGS1) que está localizada
entre os genes 26S e 5S do rDNA em 25 espécies de Trichosporon. A
seqüência da região IGS1 variou em comprimento de 195 pares de base (pb) a
704 pb. A análise comparativa das seqüências de nucleotídios sugeriu que
estas variações eram maiores na região IGS1 que as das regiões de ITS. Além
disso, estes autores também puderam identificar cinco diferentes genótipos de
T. asahii em 43 cepas desta espécie. Estes autores observaram ainda que a
maioria dos isolados do Japão pertencia ao genótipo 1 e as cepas originárias
das Américas (incluindo duas cepas brasileiras) pertenciam ao genótipo 3 ou 5,
ressaltando a importância do método no estudo das relações filogenéticas. A
utilização desta região do rDNA para seqüenciamento tem grande potencial
como ferramenta diagnóstica e epidemiológica nas tricosporonoses, além de
estudos sobre filogenia.
Diaz, et al., (2004) utilizaram o método de citometria de fluxo baseado na
tecnologia do Luminex 100 xMAP na identificação das espécies de
Trichosporon através de sondas espécie-específicas. A tecnologia é baseada
no uso de microesferas de colorações fluorescentes múltiplas variando em
proporção de vermelho e infravermelho criando um arranjo de até 100
Introdução 13
diferentes intensidades de cores. O ensaio se baseia na adição de sondas
espécie-específicas adicionadas às microesferas que se ligam aos produtos de
PCR do DNA alvo ligado a uma molécula de biotina. Através da adição de uma
molécula “reporter” (estreptavidina R-ficoeritrina), todos os amplicons espécie-
específicos hibridizados pela sua seqüência complementar presente nas
microesferas são reconhecidos através da intensidade da fluorescência da
estreptavidina quando ligada às moléculas de biotina. Os autores utilizaram
sondas obtidas das seqüências de DNA das regiões D1/D2 e ITS. Entretanto, a
região IGS foi utilizada para a construção das sondas para aquelas espécies
onde as regiões D1/D2 e ITS não são suficientementes discriminatórias para a
identificação, por exemplo, para a diferenciação das espécies T. asahii, T.
japonicum e T. asteroides. Apesar desta metodologia representar uma
ferramenta eficiente para identificação de espécies de Trichosporon de
importância médica, a realização desta técnica requer a aquisição de um
citômetro de fluxo, o que a torna inviável para a aplicação em laboratórios de
rotina.
1.5- Desafios terapêuticos e dificuldades na realização de testes de
sensibilidade in vitro de amostras de Trichosporon spp.
A terapia antifúngica com anfotericina B tem resultados controversos em
tricosporonoses. Estudos laboratoriais demonstram que muitos organismos
deste gênero são relativamente resistentes a esta droga (Anaissie, et al.,
1992). Alguns isolados podem ser inibidos em concentrações seguramente
aceitáveis no soro, mas a atuação fungicida da droga não tem sido observada
em pacientes granulocitopênicos (Walsh, et al., 1990).
Falhas terapêuticas utilizando fluconazol, anfotericina B e combinações
de ambas as drogas têm sido relatadas. Da mesma forma, há relatos de
isolados de T. asahii naturalmente resistentes a anfotericina B, fluconazol,
itraconazol e 5-fluorocitosina (Wolf, et al., 2001; Paphitou, et al., 2002;
Makimura, et al., 2004). Além disso, as equinocandinas apresentam pouca
atividade contra Trichosporon spp. não sendo recomendadas terapeuticamente
(Walsh, et al., 2004).
Introdução 14
Relatos de tricosporonose disseminada apresentam prognóstico
reservado, com mortalidade superior a razão de 80 % (Krcmery, et al., 1999).
Numa série de 25 pacientes granulocitopênicos que desenvolveram
tricosporonose sistêmica e foram tratados com anfotericina B, somente quatro
deles sobreviveram, possivelmente devido à recuperação da neutropenia (Hoy,
et al., 1986). Rodrigues, et al., (2006) analisaram 22 casos de tricosporonoses,
destes somente 9 sobreviveram, vale salientar que 7 destes apresentavam
somente lesões superficiais.
Davies, et al., (2006) relataram um caso de fungemia em uma paciente
com 71 anos de idade após cirurgia cardíaca e o agente foi identificado como
T. inkin quatro dias após o óbito mesmo na vigência de fluconazol iniciada 2
dias antes do óbito (400mg/dia).
Trichosporon spp. foi isolado de cultura de líquido sinovial de paciente
após o 6° dia de transplante de medula óssea mesmo com terapia de
manutenção com acetato de caspofungina. Entretanto, este paciente obteve
êxito na terapia com fluconazol (Goodman, et al., 2002).
Matsue, et al., (2006) postularam 4 casos de tricosporonose invasiva por
T. asahii no Japão, sendo que 3 pacientes apresentavam como doença de
base leucemia mielóide aguda e 1 síndrome mielodisplásica, todos tratados
com micafungina (150 mg/dia). No entanto, uma melhora clínica foi observada
apenas em um dos casos citados após recuperação da neutropenia e terapia
com voriconazol.
Apesar dos relatos de tricosporonose invasiva presente em pacientes
apresentando neutropenia, em estudo realizado por Karabay, et al., (2006) nos
Estados Unidos evidenciou-se um caso de fungemia por T. asahii em paciente
não-granulocitopênco e sem doença hematológica maligna tratado com
fluconazol. Neste caso, o isolado que foi identificado somente no 4° dia após o
óbito do paciente, era resistente a fluconazol e caspofungina.
Introdução 15
Em contrapartida, Fournier, et al., (2002) e Assada, et al., (2006)
obtiveram sucesso no tratamento de infecção disseminada por T. asahii em
pacientes com leucemia mielóide aguda utilizando voriconazol como
monoterapia. Estes dados confirmam sugestões de Paphitou, et al., (2002) que
sugeriram que os novos triazólicos (voriconazol, ravuconazol e posaconazol)
são superiores a anfotericina B e a demais antifúngicos no tratamento de
tricosporonoses.
Apesar do freqüente aumento dos casos de tricosporonose e relatos de
infecção refratária à terapêutica convencional, estudos sobre a sensibilidade in
vitro de Trichosporon spp. ainda são bastante restritos. As dificuldades na
caracterização de diferentes espécies do gênero, bem como a falta de
padronização para testes de sensibilidade in vitro, contribuem para a limitada
informação disponível a este respeito.
No protocolo de microdiluição em caldo do Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI – antigo, National Committee for Clinical Laboratory Standards -
NCCLS) não está incluído o gênero Trichosporon spp. Contudo, os poucos
estudos sobre a sensibilidade in vitro aos antifúngicos de espécies de
Trichosporon utilizam como referência as normas do CLSI (2002),
padronizadas para Candida spp. e Cryptococcus neoformans (Arikan &
Hasçelik, 2002).
Vários autores sugerem que a metodologia de microdiluição em caldo
apresenta dificuldades na detecção de isolados resistentes a anfotericina B
visto que tal método gera estreita variação entre as concentrações inibitórias
mínima (CIMs) obtidas com diferentes amostras clínicas. Conseqüentemente,
valores de corte para este antifúngico ainda não foram estabelecidos até hoje.
(Chaturvedi, et al., 2004; Hospenthal, et al., 2004).
O uso do Etest para determinar a sensibilidade a anfotericina B tem sido
preconizado por alguns autores. O Etest, aparentemente, detecta melhor os
isolados resistentes a anfotericina B quando comparado com o teste de
Introdução 16
microdiluição em caldo do CLSI (Pfaller, et al., 1990; Arikan & Hasçelik, 2002;
Paphitou, et al., 2002).
Estes resultados de estudos in vitro e in vivo sugerem que infecções por
Trichosporon spp. podem ser refratárias às principais drogas disponíveis
comercialmente, tornando este cenário clínico um desafio terapêutico a ser
vencido. Recentemente, há indícios de que voriconazol seja uma opção
terapêutica para infecções por Trichosporon spp. (Fourneir, et al., 2002;
Paphitou, et al., 2002).
Torna-se evidente que há poucas informações disponíveis sobre as
características das infecções por este patógeno principalmente nos hospitais
brasileiros, sendo necessária a realização de estudos que permitam a
caracterização do perfil epidemiológico da infecção por Trichosporon no Brasil,
identificando as espécies mais prevalentes, bem como suas peculiaridades de
sensibilidade aos antifúngicos afim de sua implementação em laboratório de
rotina para contribuir para o sucesso terapêutico nas tricosporonoses.
2. OBJETIVOS
__________________________________
Objetivos 18
2.1- Objetivo geral
Este trabalho tem por finalidade identificar fenotipicamente e
genotipicamente 23 amostras clínicas isoladas de hemoculturas de
Trichosporon spp. de pacientes hospitalizados, além de avaliar a sua
sensibilidade a seis antifúngicos.
2.2- Objetivos específicos
2.2.1- Identificar fenotipicamente as espécies de Trichosporon isoladas de
hemoculturas obtidas de pacientes hospitalizados;
2.2.2- Confirmar genotipicamente a identificação destas amostras utilizando os
oligonucleotídeos TRF e TRR específicos ao gênero e sequenciamento da
região IGS1 para a identificação da espécie;
2.2.3- Adaptar a metodologia do CLSI para avaliação da sensibilidade a
antifúngicos de isolados de Trichosporon spp.;
2.2.4- Avaliar a acurácia da técnica de Etest® para predizer a sensibilidade à
anfotericina B entre isolados clínicos de Trichosporon spp. ;
2.2.5- Comparar o perfil de sensibilidade de diferentes espécies do gênero
Trichosporon, em relação a seis antifúngicos.
3. MATERIAL E MÉTODOS
__________________________________
Material e Métodos
20
3.1- Seleção das amostras
Foram utilizadas 23 cepas de Trichosporon spp. isoladas de
hemoculturas e coletadas entre os anos de 1995 e 2004. As amostras clínicas
envolvidas no estudo foram oriundas dos seguintes centros médicos
brasileiros: Hospital São Paulo e Hospital do Servidor Público Estadual, ambos
na cidade de São Paulo-SP, Brasil. Estes isolados foram encaminhados para o
Laboratório Especial de Micologia (LEMI/UNIFESP-EPM), sendo
posteriormente armazenados no banco de microrganismos congelados a -70°C
em meio caldo de Yeast Extract Pepton Dextrose (YEPD - Peptona Oxoid 20
g/L; dextrose 20 g/L; Extrato de leveduras Oxoid 10 g/L) acrescido de 20 % de
glicerol.
Além dos isolados clínicos, foram utilizadas em cada ensaio de testes de
sensibilidade aos antifúngicos uma cepa de Candida parapsilosis (ATCC
22019) outra de C. krusei (ATCC 6258) como organismos-controle para análise
destes ensaios, visto que seus resultados das concentrações inibitórias
mínimas (CIM) são previamente conhecidos. As cepas de Trichosporon asahii
(CBS 2479 e CBS 2530), Trichosporon mucoides (CBS 7625), Trichosporon
inkin (CBS 5585), Trichosporon asteroides (CBS 2481) e Trichosporon ovoides
(CBS 7556) foram utilizadas como parâmetros de comparação para os estudos
fenotípicos e moleculares de identificação de espécies, bem como para avaliar
a reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos antifúngicos para isolados
de Trichosporon spp. Além disso, as cepas de Candida albicans (ATCC 90028)
e C. parapsilosis (ATCC 22019) foram utilizadas para confirmar a
especificidade dos oligonucleotídios Trichosporon-específicos (Tabela 2).
Material e Métodos
21
Tabela 2. Cepas de referência utilizadas neste estudo.
3.2- Identificações fenotípicas e genotípicas dos isolados clínicos
As leveduras foram identificadas em nível de espécie através de
características micromorfológicas e bioquímicas (identificação fenotípica),
sendo esta identificação confirmada por estudos moleculares (identificação
genotípica).
3.2.1- Avaliação da pureza e viabilidade das amostras
As amostras armazenadas a -70° C foram semeadas em meio
cromogênico seletivo CHROMagar Candida® (Microbiology Paris), para
certificação da pureza do cultivo e viabilidade das colônias. Após 48 h de
incubação a 35° C, foram selecionadas as colônias d e mesma cor, sendo em
seguidas subcultivadas, com 2 repiques sucessivos após 48 h de incubação a
35° C cada, em ágar Sabouraud dextrose (enzimatic digest casein 20 g/L,
dextrose 40 g/L, ágar bacteriológico15 g/L e cloranfenicol 0,05 g/L- Difco,
Becton, Dickinson and Company, EUA) para posterior identificação.
3.2.2- Perfil fenotípico
A identificação inicial do gênero foi baseada em aspectos micro e
macromorfológicos da colônia. A identificação fenotípica em nível de espécie
foi baseada em resultados de testes bioquímicos de assimilação e fermentação
N° da coleção de cultura de origem Espécie
CBS 2530 T. asahii var. asahii
CBS 2479 T. asahii var. asahii
CBS 7625 T. mucoides
CBS 5585 T. inkin
CBS 7556 T.ovoides
CBS 2481 T. asteroides
ATCC 90028 C. albicans
ATCC 6258 C. krusei
ATCC 22019 C. parapsilosis
* Centraalbureau voor Schimmelcultures
** American Type Culture Collection
Material e Métodos
22
de carboidratos e assimilação de compostos nitrogenados. Para a interpretação
do perfil bioquímicos das culturas, na busca de identificação de espécie,
utilizamos os resultados resumidos na Tabela 3 que foi constituída com dados
obtidos pelo trabalho de Rodriguez-Tudela, et al., 2005 e na base de dados do
CBS (http://www.cbs.knaw.nl/databases).
3.2.2.1- Avaliação de características morfológicas
Sob o ponto de vista macroscópico, observaram-se colônias com
aspecto cerebriforme. Na análise microscópica destas culturas foram
pesquisadas a presença de: artroconídios, blastoconídios, formação de
apressoria, células gigantes apicais e células em forma de barril. Para tanto, foi
realizado microcultivo: com auxílio de alça de platina, a colônia de levedura
suspeita de Trichosporon spp. foi semeada em três estrias paralelas em placa
de Petri contendo o meio ágar fubá adicionado de Tween 80 (fubá 40 g, Tween
80 - Inlab 10 mL, água destilada q.s.p. 1.000 mL), para estimular a produção de
conídios e filamentação. As estrias foram cobertas com lamínula estéril e em
seguida as placas foram incubadas a 30° C, durante 48-72 h. Após o período
de incubação, as placas foram observadas ao microscópio óptico (Olympus)
em aumentos de 100 X e 400 X de magnificação sendo realizada a pesquisa
de hifas hialinas artrosporadas, artroconídios, blastoconídeos e apressoria
(Hazen, 1995; Sidrim, Rocha, 2004).
Material e Métodos
23
Espécies
Testes
T.asahii
T.asteroides
T.cutaneum
T.inkin
T.ovoides
T.mucoides
T. dermatis T. jirovecci
Prova da urease
+ + + + + + + +
Assimilação de L-Arabnose
+ v + - - + + +
Assimilação de Galactitol - - - - - + v +
Assimilação de Inositol
- + + + - + + +
Assimilação de Melibiose
- - + - - + + +
Assimilação de Raffinose - - + - v + + +
Assimilação de Rhamnose
+ v + - + + + +
Assimilação de Ribose
v - + - - + + v
Assimilação de Xylitol
v v + - v + + v
Crescimento a 37°C
+ v - + v + + -
Formação de Apressoria
- - - + + - - -
(+) teste positivo; (
-
) teste negativo; (v) teste variável; N/I não informado.
Tabela 3. Perfil bioquímico esperado para identificação fenotípica de espécies de Trichosporon segundo adaptação
da literatura.
Material e Métodos
24
3.2.2.2- Características bioquímicas da levedura
a) Assimilação de carboidratos e de Nitrogênio (auxanograma)
Para o teste de assimilação de carboidratos, foi utilizado meio C (sulfato
de amônio 5 g; fosfato de potássio monobásico 1 g; sulfato de magnésio 0,5 g;
ágar bacteriológico 20 g - Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA e água
destilada – q.s.p. 1000 mL) destituído de qualquer fonte de Carbono, ao qual foi
adicionada suspensão da levedura a ser testada, com turbidez previamente
ajustada à escala n° 0,5 de McFarland. Após a solid ificação do meio, alíquotas
de diferentes açúcares foram distribuídas de forma eqüidistante sobre o ágar.
Para controle positivo do teste utilizou-se dextrose. As placas de Petri foram
incubadas a 30° C por 72 horas, por um período de a té 2 semanas. De forma
complementar, foram realizadas as provas de assimilação de Nitrogênio e
aminoácidos, utilizando-se a mesma metodologia previamente descrita para o
teste de assimilação de carboidratos, utilizando-se o meio N (dextrose 20 g;
fosfato de potássio monobásico 0,5 g; ágar bacteriológico 16,5 g; água
destilada q.s.p. 100 mL) e adicionado de alíquotas de compostos nitrogenados,
onde foram realizadas leituras seqüenciais a cada 24 horas por um período de
até 1 semana. Para controle positivo do teste utilizou-se peptona (Difco,
Becton, Dickinson and Company, EUA). A positividade para ambos os testes foi
avaliada pelo surgimento de halo de turbidez na área correspondente a cada
substrato adicionado (Lacaz, et al., 2002; Sidrim, Rocha, 2004).
b) Fermentação de açúcares (zimograma)
Para a realização dos testes de fermentação, foi utilizado um meio basal
(extrato de levedura 0,5 g; peptona 0,5 g; 1 g do açúcar; água destilada 100
mL; indicador de pH púrpura de bromocresol, 100 µL a 1,6 % - Difco, Becton,
Dickinson and Company, EUA) isento de qualquer fonte de Carbono
dispensado em 6 diferentes tubos de ensaio contendo tubos de Durham
submersos e invertidos adicionados de um carboidrato diferente em cada tudo.
Foram utilizados seis substratos: dextrose, maltose, sacarose, lactose,
galactose e trealose. Em seguida, foram acrescentados 200 µL de solução
inóculo de leveduras em concentração ajustada à escala n° 5 de McFarland a
tubo contendo 4 mL do meio basal acrescido do açúcar (descrito
Material e Métodos
25
anteriormente). Os tubos foram incubados a 30° C po r até três semanas.
Foram realizadas leituras seqüenciais a cada 24 horas na 1° semana, e 2
leituras por semana posteriormente. A positividade do teste foi avaliada pela
presença de bolhas de gás na parte superior dos tubos de Durham indicando
ter ocorrido fermentação de carboidratos (Lacaz, et al., 2002; Sidrim, Rocha,
2004).
c) Prova de hidrólise da uréia
O teste da urease foi realizado utilizando-se o meio de Christensen –
Probac do Brasil (peptona 1 g; cloreto de sódio 5 g; fosfato de potássio
monobásico 2 g; glicose 5 g ágar bacteriológico 20 g - Difco, Becton, Dickinson
and Company, EUA; água destilada - q.s.p. 100 mL). As amostras foram
semeadas no referente meio com o objetivo de se observar produção de
urease. A ocorrência de hidrólise da uréia foi observada através da mudança
da coloração do ágar, do amarelo para róseo intenso, indicado pelo vermelho
de fenol (indicador de pH) devido à alcalinização do meio de cultura. Os tubos
foram incubados a 30° C e observados por até 48 hor as (Lacaz, et al., 2002;
Sidrim, Rocha, 2004).
3.3- Identificação molecular de espécies de Trichosporon
Os 23 isolados de hemocultura, previamente identificadas por métodos
fenotípicos, foram submetidas a métodos moleculares para confirmação da
identificação de espécie.
3.3.1- Formação de protoplastos e extração do DNA genômico
Uma unidade formadora de colônia (UFC) de cada levedura foi semeada
em placa de ágar Sabouraud dextrose e incubada a 30° C durante 48 horas.
Para a extração de DNA genômico, foi utilizado o protocolo de Wach, et.
al., (1994) com algumas modificações. Para obtenção do pré-inóculo, uma UFC
de cada amostra foi posteriormente transferida a tubos Falcon (Corning, México)
de 15mL contendo 2 mL de caldo YEPD e incubados a 30° C sob agitação
Material e Métodos
26
constante durante 12 horas a 200 rpm, 35° C. Posteriormente, foram transferidos
200 µL do pré-inóculo de cada amostra para tubos Falcon de 15 mL contendo 2
mL de YEPD, em triplicata com a finalidade de obter-se maior quantidade de
massa celular. Os tubos foram incubados por mais 12 h a 35° C, 200 rpm. Em
seguida, células dos três tubos referentes a cada amostra foram transferidas para
um único tubo, sendo o mesmo posteriormente centrifugado e desprezado o
sobrenadante. Alíquota de 1,3 mL do sedimento da cultura foi transferida para um
tubo de microcentrifugação, com capacidade para 1,5 mL (Eppendorf, Hamburgo,
Alemanha), sendo o mesmo centrifugado a 6.000 rpm durante 3 minutos. O meio
de cultura remanescente foi removido e as células lavadas em 1 mL de água milli-
Q esterilizada por duas vezes sob as mesmas condições de centrifugação
previamente citadas.
As células foram homogeneizadas em 200 mL de tampão protoplasto (10
µL de β-mercaptoetanol Pharmacia Biotech; 100 µL de Tris-HCl pH 7,5 100 mM;
20 µL de EDTA 10 mM e 0,2 mg de zymoliase 20.000 ICN Biomedical Inc.
adicionada na hora do uso e 870 µL de H
2
O miliQ esterilizada) e incubadas por
3 horas a 37° C. Alíquota de 200 µL de tampão de lise (20 µL de NaOH 10 N; 100
µL de SDS 10 %; 40 µL de proteinase K - 20 U/mL, INVITROGEN; 880 µL de
H
2
O miliQ esterilizada) foi adicionada à suspensão celular, sendo o tubo incubado
a 65° C por 1 hora e em seguida resfriado rapidamente no gelo. Para precipitar as
proteínas e restos celulares, foram adicionados 200 µL de acetato de potássio 5M
pH 5,4 ao tubo de microcentrifugação sendo este incubado no gelo por 15
minutos. A suspensão foi centrifugada a 13.400 rpm por 10 minutos e o
sobrenadante transferido para outro tubo de microcentrifugação. Quando
necessário, a centrifugação foi repetida sob as mesmas condições previamente
descritas.
Foram adicionados 500 µL de isopropanol (Merck, Kennzeichnung,
Alemanha) ao tubo de microcentrifugação, sendo o mesmo posteriormente
misturado gentilmente por inversão e incubado “overnight” à temperatura
ambiente para melhor precipitação do DNA. Após centrifugação (13.400 rpm
durante 5 minutos), o sobrenadante foi desprezado e 1 mL de etanol a 70 %
(Merck, Kennzeichnung, Alemanha) foi adicionado ao pellet. O pellet foi lavado
Material e Métodos
27
por inversão do tubo e incubado à temperatura ambiente por 10 minutos e
novamente centrifugado por 10 minutos a 13.400 rpm, temperatura ambiente.
A lavagem com etanol foi repetida, o pellet seco por 10 minutos à
temperatura ambiente e o DNA dissolvido em 50 µL de água milli-Q esterilizada.
3.3.2- Tratamento do DNA com RNAse
Para remoção de RNA, os tubos contendo 50µL de DNA foram
adicionados de 48 µL de água milli-Q esterilizada, 1 µL de tris-HCl 1 M pH 7,5 e 1
µL de RNAse a 10 mg/mL (MPbio, Qbiogene, EUA) e colocados em banho-maria
a 37° C por 1 hora. O DNA foi precipitado com a adi ção de 10 µL de acetato de
sódio 3 M e 22 0µL de etanol absoluto gelado. A suspensão foi homogeneizada
por inversão do tubo, e incubada por 10 minutos no gelo e centrifugada por 15
minutos em 14.000 rpm a 4° C. O etanol foi retirado e o precipitado seco por 10 a
15 minutos à temperatura ambiente. A dissolução completa do DNA foi realizada
em 50 µL de água milli-Q esterilizada.
3.3.3- Quantificação do DNA
Alíquotas de 5 µL de DNA foram diluídas em tubos contendo 1 mL de água
destilada. Em seguida, a absorbância foi aferida em espectofotômetro
(GeneQuantpro, Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, Inglaterra) em
DO
260nm
de comprimento de onda. Segundo Sambrook et al. (1989) a
absorbância igual a 1 contém uma concentração de 50 µg/mL de DNA de fita
dupla. Também foi medida a absorbância em DO
280nm
para verificar a presença
de proteínas e calcular a pureza do DNA. A razão entre as leituras
DO
260nm
/DO
280nm
permite uma estimativa da pureza do DNA, cujo ideal encontra-
se entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de 1,6 indica grande quantidade de proteínas e
contaminantes, e na sua ocorrência, a extração foi realizada novamente.
Material e Métodos
28
3.3.4- Seleção dos oligonucleotídeos para genotipagem
Dois pares de oligonucleotídios foram selecionados para serem
utilizados em ensaio de PCR para identificação final em nível de espécie dos
isolados de Trichosporon. A seleção desses oligonucleotídios foi baseada em
revisões bibliográficas publicadas nos últimos anos, tendo sido os mesmos
previamente utilizados para mesma finalidade. Os oligonucleotídios TRF (5’ –
AGA GGC CTA CCA TGG TAT CA – 3’) e TRR (5’ – TAA GAC CCA ATA GAG
CCC TA – 3´), que amplificam parte da região SSU do rDNA, foram utilizados
para a confirmação da identificação do gênero Trichosporon, já que estes
oligonucleotídios não hibridizam em regiões conservadas do gene ribossômico
de outras leveduras de importância médica (Sugita, et al., 1998). Os
oligonucleotídios 26F (5´- ATC CTT TGC AGA CGA CTT GA- 3´) e 5SR (5´-
AGC TTG ACT TCG CAG ATC GG - 3’), que amplificam a região IGS1
(intergenic spacer region 1) do rDNA, foram utilizados para confirmar a
identificação da espécie (Figura 1). No gênero Trichosporon, a seqüência da
região IGS1 varia em comprimento de 195 pares de base (pb) a 704 pb. A
análise comparativa destas seqüências em Trichosporon spp. sugere maior
variação que nas das regiões de ITS1 e ITS2 - inter spacer region 1 e 2,
respectivamente (Figura 1; Rodriguez-Tudela, et al., 2005).
3.3.5- Reação de PCR
Para as reações de PCR foram adicionados em tubos de
microcentrifugação de 0,2 mL de capacidade os seguintes componentes: 25 uL
18S 5.8S
IGS1
ITS1
IGS2
ITS2
28S
5S 18S
TRF TRR
26SF
5SR
Figura 1
. Representação esquemática do locus do rDNA. Os retângulos
azuis indicam regiões transcritas funcionais. Adaptada de Sugita
et al
. (2002).
Material e Métodos
29
de PCR Master Mix 2X, PROMEGA [Taq DNA polimerase 50 u/mL;
deoxinucleotídios (dATP,dGTP,dCTP,dTTP, 400 µM cada); MgCl
2
3 mM] 1 uL
de cada oligonucleotídio na concentração inicial de 100 pmol/µL; 2 uL do DNA
diluído a 40 ng/uL, 22 uL de água milli-Q esterilizada livre de nucleases
(PROMEGA), totalizando um volume de 50 uL.
As amplificações foram realizadas em um termociclador (Gene Amp
PCR System 9600, Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT, EUA) com os
seguintes programas: para os oligonucleotídeos TRF e TRR, foram utilizados
os seguintes ciclos de PCR: ciclo de desnaturação inicial de 94° C por 3
minutos seguido de 30 ciclos a 94° C - 1 minuto (de snaturação); 55° C - 1
minuto (hibridização); 72° C - 1 minuto (extensão). Para o ciclo de extensão
final, foi utilizada a temperatura de 72° C por 5 minutos. Para os
oligonucleotídios 26F e 5SR, foram utilizados os seguintes ciclos de PCR: ciclo
de desnaturação inicial de 94° C por 5 minutos segu ido de 40 ciclos a 94° C – 1
minuto (desnaturação); 57° C - 1 minuto (hibridizaç ão); 72° C - 2 minutos
(extensão). Para o ciclo de extensão final, foi utilizada a temperatura de 72 °C
por 5 minutos. Para ambas as reações de PCR utilizando os dois diferentes
pares de oligonucleotídeos, o termociclador foi resfriado para 4° C até a
retirada das amostras do aparelho.
3.3.6- Eletroforese de DNA em gel de agarose
Para preparação do gel de agarose, a agarose (Ultra Pure Agarose-
Invitrogen) foi preparada na concentração de 1,0% (w/v), dissolvida em solução
tampão Tris bórico EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) 0,5X (TBE – 90
mM Tris base; 90 mM ácido bórico; 2 mM EDTA bisódico) e aquecida em
microondas. Posteriormente ao resfriamento do meio a 60° C, foram
adicionados 3 µL de brometo de etídio (0,5 ug/mL) - USB Corporation,
Cleveland, EUA, a cada 100 mL de agarose dissolvida em TBE. As amostras
de DNA foram coradas com 2 µL de Orange G (0,01%) (Sigma Chemical -
EUA). Para estimativa do tamanho das bandas de DNA, marcadores de peso
molecular (100 pb, INVITROGEN) foram corridos paralelamente às amostras a
serem testadas (2 µL de peso molecular; 2 µL de Orange G e 8 µL de H
2
O
Material e Métodos
30
miliQ). Foram adicionadas 10 µL da reação diluída a cada orifício do gel, sendo
o mesmo submetido à corrente elétrica de 80 volts por 3 horas.
As bandas contidas nos géis foram visualizadas em um transiluminador
de raios UV (UVP – BioDoc – it
TM
System), sendo a imagem capturada e
transferida para um disquete (no formato JPEG) para análise posterior.
3.3.7- Purificação dos produtos de PCR para a reação de seqüênciamento
Os produtos de PCR foram purificados dos restos de oligonucleotídios,
dNTPs e outros reagentes utilizando-se o kit Charge Switch® PCR Clean-Up
(Invitrogen), baseado em cromatografia de troca iônica. Para tanto, foram
adicionados em um tubo com capacidade para 1,5 mL (Eppendorf) 50 µL do
produto de PCR da cepa testada, o mesmo volume do tampão de purificação
(N5) e 10 µL de pérolas magnéticas Charge Switch®. O conteúdo do tubo foi
homogeneizado gentilmente, por pipetação, sem formar bolhas, sendo o
mesmo incubado por 1 minuto em temperatura ambiente. Subseqüentemente,
o tubo foi colocado em coluna MagnaRack
TM
até formação do pellet. Logo em
seguida, sem remover o tubo da coluna, o sobrenadante foi cuidadosamente
removido por pipetação.
Para lavar o DNA, foram adicionados ao tubo contendo o pellet, 150 µL
do tampão de lavagem (W12). O pellet foi ressuspenso e cuidadosamente
homogeneizado e colocado novamente na coluna por mais 1 minuto.
Posteriormente, o sobrenadante foi gentilmente desprezado e o procedimento
de lavagem repetido sob as mesmas condições previamente descritas. Em
seguida, 50 µL de tampão de eluição E5 foram adicionados ao tubo, o mix foi
homogeneizado gentilmente sem formar bolhas e o mesmo incubado a
temperatura ambiente por 1 minuto ou até formação de pellet. O sobrenadante
contendo o produto de PCR purificado foi cuidadosamente transferido para
outro tubo estéril evitando ressuspenssão do pellet. Os tubos foram
armazenados em freezer a -20° C até o momento da re ação de
seqüenciamento.
Material e Métodos
31
3.3.8- Reação de seqüenciamento
A reação de seqüenciamento foi realizada em placas (Applied
Biosystem, Foster City, CA, EUA) contendo 96 poços. Em cada poço foram
adicionados 6µL do produto de PCR purificado da cepa a ser testada (0,1 – 0,2
pmol/µL), 2 µL do kit VG30001 Cy5.5, 3 µL de cada oligonucleotídio 26SF e
5SR (2 pmol/µL) e 4 µL do tampão de seqüenciamento (Applied Biosystem,
Foster City, CA, EUA). Após a preparação do mix, as amostras foram
colocadas em termociclador (GENE Amp® PCR System 9700 – Applied
Biosystem, Foster City, CA, EUA). A reação foi realizada com uma
desnaturação inicial a 95° C por 4 minutos, seguida de 25 ciclos de 95° C
(desnaturação) por 20 segundos, 50° C por 15 segund os (hibridização) e 60° C
por 60 segundos (extensão). Para o ciclo de extensão final, foi utilizada a
temperatura de 72° C por 10 minutos.
3.3.9- Precipitação do DNA e eliminação dos reagentes de PCR
Cada poço (da placa) contendo a reação de seqüenciamento foi
adicionado de 90 µL de etanol 70 % à temperatura ambiente, agitado
brevemente em vortex e mantido estaticamente por 15 minutos protegido da
luz. Em seguida, as placas foram centrifugadas por 45 minutos a 4000 rpm,
temperatura ambiente. Subseqüentemente, o etanol foi totalmente desprezado
por inversão da placa. Adicionou-se 15 µL de formamida HiDi (Applied
Biosystem, Foster City, CA, EUA), previamente descongelada, para separar as
duas fitas de DNA, em cada poço sendo a placa selada e homogeneizada. Em
seguida a placa foi mantida em termociclador a 95 °C por 3 minutos seguidos
de choque térmico em gelo por 1 minuto (para evitar a reassociação do DNA) e
colocada no seqüenciador (ABI PRISM 3100 – Applied Biosystem, Foster City,
CA, EUA).
Material e Métodos
32
3.3.10- Análise e interpretação da qualidade das seqüências
Os critérios utilizados para certificação da qualidade do alinhamento e
interpretação correta da identificação da espécie foram realizados de acordo
com números de bases idênticas (porcentagem de identidade) com outras
seqüências da região IGS1 armazenadas no banco genômico. O valor do E-
value que corresponde à probabilidade ao acaso da seqüência em questão ter
se alinhado com outra seqüência também foi analisado. Neste caso, valores do
E-value menores que 10
-5
refletem que este alinhamento não se deu ao acaso,
portanto, de alta confiabilidade.
Também foram levados em consideração os números de “gaps”
(espaços introduzidos em um alinhamento para compensar inserções e
deleções em uma seqüência com relação à outra) presentes no alinhamento.
Quanto menor o número de gaps presentes em alinhamentos obtidos por
análise BLAST, maior a confiabilidade da seqüência em análise.
3.3.11- Análise das seqüências por comparação em bancos genômicos
A análise das seqüências em bancos genômicos foi realizada através do
site “National Center for Biotechnology Information (NCBI) disponível
eletronicamente em: http://ncbi.nlm.nih.gov” utilizando-se o serviço Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST). Esta ferramenta se caracteriza por programas
de procura de similaridade que podem ser utilizados para identificar e classificar
os homólogos em potencial para uma determinada seqüência. Estes programas
são capazes de analisar seqüências de DNA e aminoácidos.
3.4- Avaliação do perfil de sensibilidade a antifúngicos
A avaliação da sensibilidade aos antifúngicos foi realizada por dois
diferentes métodos: microdiluição em caldo (CLSI) e difusão em ágar por
Etest®.
Material e Métodos
33
3.4.1- Preparo do meio de cultura
Para a microdiluição em placas, foi utilizado o meio de cultivo sintético
Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) com L-glutamina, preparado da
seguinte forma: 46,5 g/L de RPMI-1640 (Cultilab), 20 g/L de glicose e 34,5 g de
ácido morfolinopropanolsulfônico (MOPS). O pH foi aferido para 7,0. O meio de
cultivo foi esterilizado por filtração a vácuo, utilizando-se filtro biológico 0,22 µm
(Millipore). Frascos contendo 1litro do meio foram conservados em refrigerador
a 4° C.
Para o Etest®, foram preparadas placas de Petri com 90 mm de
diâmetro contendo 20 mL de ágar RPMI-1640. Para tanto, o meio RPMI-1640,
preparado como previamente descrito, foi adicionado de 1,5 % de ágar
bacteriológico (Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA).
3.4.2- Preparação de drogas antifúngicas
Para microdiluição em caldo, soluções-estoque foram preparadas a
partir do pó puro de cada antifúngico dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO -
Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo. E.U.A.) e mantidas a -20° C até sua
utilização por período máximo de até 6 meses. Foram utilizados seis
antifúngicos: voriconazol e fluconazol (Pfizer Inc., New York, N. Y.), itraconazol
(Jansen Pharmaceutica, Titusville, N. J.), anfotericina B (Sigma Chemical Co.
St. Louis, Mo. E.U.A), 5-fluorocitosina (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo.
E.U.A) e caspofungina (Merck Co., Whyte House Station, Pa. E.U.A.).
O ensaio com Etest® foi realizado apenas para anfotericina B. As fitas
de Etest® de anfotericina B foram adquiridas através da AB BIODISK, (Solna,
Suécia). As mesmas contém um gradiente de concentrações variando de 0,02
a 32 µg/mL, presentes no verso da tira. Estas fitas foram armazenadas a -20°C
até serem utilizadas, respeitando o prazo de validade informado pelo fabricante
(AB BIODISK, Solna, Suécia).
Material e Métodos
34
3.4.3- Preparo das placas ensaios de microdiluição em caldo
Previamente à realização dos ensaios, as drogas foram diluídas em dez
diferentes concentrações finais seriadas variando de 0,125 a 64 µg/mL para
fluconazol e 5-fluorocitosina e de 0,03 a 16 µg/mL para as demais drogas.
Estas diluições foram preparadas ao dobro da concentração final sendo
dispensados 100 µL de cada concentração nas placas de microtitulação de
fundo chato (Falcon 3072, Becton Dickinson, Lincoln Park, N.J.) Cada placa
continha 12 colunas numeradas de um a doze e 8 linhas identificadas de A à H.
Concentrações progressivas da droga foram dispensadas seqüencialmente nas
placas de microtitulação nos poços pertencentes às colunas numeradas de
dois a dez, utilizando-se pipeta multicanal (Digital Multichanel Pipette,
Labsystem, Helsinki, Finland). Os poços pertencentes à coluna identificada
com o número 1 foram utilizados como controles de esterilidade, contendo
apenas 200 µL do meio RPMI-1640. Os poços de número 12 foram utilizados
como controles de crescimento, contendo neles 100 µL de RPMI-1640 e
dispensados, no dia do experimento 100 µL do inóculo da levedura a ser
testada. As placas foram mantidas a -70° C até sua utilização por período
máximo de seis meses.
3.4.4- Preparo do inóculo
As leveduras selecionadas foram cultivadas em ágar Sabouraud-
dextrose (Difco Laboratories, Detroit, MI), com ao menos 2 repiques sucessivos
de 24 horas (48 horas para cepas com crescimento mais lento), realizados
previamente ao experimento. As células de algumas colônias foram suspensas
em água deionozada esterilizada e a transmitância do inóculo ajustada a 90 %
(escala n° 0,5 de McFarland), em espectrofotômetro (comprimento de onda a
530 nm). Tendo em vista obter-se solução padronizada de inóculo-meio RPMI-
1640 para o experimento, a preparação inicial de cada microrganismo foi
diluída 1:50 em água deionizada esterilizada e, em seguida, 1:20 em RPMI-
1640. Esta preparação de solução de inóculo foi realizada para obter-se o
dobro de sua concentração final desejada, visto que esta foi adicionada a igual
volume de solução contendo droga antifúngica presente na placa. Para Etest®,
Material e Métodos
35
100 µL do inóculo foram plaqueados objetivando concentração final de 0,5 a
2,5 x 10
3
UFC/mL para cada amostra.
3.4.5- Realização do ensaio de sensibilidade aos antifúngicos
O teste de sensibilidade aos antifúngicos por microdiluição em caldo dos
isolados de Trichosporon spp. foi realizado por adaptação do documento M-27-
A2 padronizado pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2002) para
Candida spp. e Cryptococcus neoformans. Além dos isolados clínicos, foram
incluídos em cada dia do ensaio, dois micorganismos-controle, Candida
parapsilosis ATCC 22019 como previamente descrito no item 3.1 (Wanger, et
al., 1995; Rex, et al., 1996; CLSI, 2002).
Para a realização dos testes, as placas de microdiluição preparadas
conforme procedimentos descritos anteriormente, foram retiradas do freezer e
mantidas em estufa a 35° C, por 30 minutos para des congelamento.
Subseqüentemente, volumes de 100µL de solução padronizada de inóculo-
meio RPMI-1640 foram dispensados na placa de microdiluição, nas posições
de 2 a 12. O poço 1 foi reservado para controle de esterilidade do meio, como
mencionado anteriormente. As placas foram incubadas a 35° C, por 72 horas.
Para o ensaio de Etest®, as placas de ágar RPMI-1640 e fitas de Etest
de anfotericina B foram mantidas à temperatura ambiente por 30 minutos antes
do início do ensaio. Um volume de 100 µL referente a cada inóculo foi
dispensado sobre a superfície do ágar e distribuído de forma homogênea, em
quatro direções diferentes, com auxílio de zaragatoa. A seguir, as placas foram
deixadas abertas, em fluxo laminar, por 15 minutos ao menos, para absorção
do inóculo pelo ágar. Assim, a fita de Etest contendo a droga foi
cuidadosamente colocada sobre o ágar, de modo a não permitir qualquer
mudança de posição da fita após seu contato com a superfície do mesmo. As
placas foram incubadas em estufa a 35° C por 72 hor as.
Material e Métodos
36
3.4.6- Leitura e interpretação dos resultados
Para leitura do teste de microdiluição em caldo, as placas foram
colocadas em suporte contendo espelho, permitindo a observação clara do
reverso das mesmas. Foram realizadas três leituras visuais, após 24, 48 e 72
horas de incubação. A CIM foi definida para azólicos como a menor
concentração capaz de induzir proeminente inibição (em torno de 50%) do
crescimento da levedura testada, em relação ao poço controle. Para
anfotericina B, a CIM foi definida como a menor concentração que
apresentasse ausência de crescimento visualmente detectável (CLSI, 2002).
A leitura do Etest® foi realizada conforme orientação técnica fornecida
pelo fabricante (AB BIODISK). A CIM lida com 24, 48 e 72h de incubação foi
considerada a concentração em que o limite da área de inibição de crescimento
do microrganismo interceptou a fita de Etest.
3.4.7- Caracterização dos resultados das CIMs para os antifúngicos
Para os triazólicos e caspofungina, as CIMs foram apresentadas de
forma descritiva em termos de variação, CIM
50
(concentração de antifúngico
capaz de inibir 50% dos isolados) e CIM
90
(concentração de antifúngico capaz
de inibir 90% dos isolados).
Para comparação dos resultados gerados para anfotericina B por Etest®
e microdiluição em caldo foram comparadas de forma descritiva em termos de
variação, CIM
50
e CIM
90
. Comparação “cabeça a cabeça” e análise de
concordância ± 1 diluição. A análise de correlação entre as CIMs pelos dois
métodos através foi realizada através de representação cartesiana destes
valores e cálculo do coeficiente de Person.
A análise da resistência para voriconazol, fluconazol e 5-fluorocitosina foi
realizada de acordo com os pontos de corte do CLSI (padronizado para
Candida spp e C. neoformans, para anfotericina B, apesar da ausência de
consenso, optou-se por utilizar como corte a CIM ≥ 1µg/mL conforme sugerido
Material e Métodos
37
por e Nguyen, et al. (1998) e Clancy et al. (1999) para outras leveduras.
Caspofungina foi análise apenas de forma descritiva.
4. RESULTADOS
__________________________________
Resultados
39
4.1- Identificação
Os 23 isolados clínicos de Trichosporon spp. foram selecionados e
purificados por técnica de esgotamento no meio de cultura cromogênico
CHROMagar Candida®, onde foram analisados o aspecto e a cor e das
colônias obtidas. Estes isolados foram identificados primeiramente pelo método
clássico (microcultivo, zimograma e auxanograma) e posteriormente utilizando-
se técnicas de Biologia Molecular, a identificação do gênero foi confirmada
através de técnica de PCR utilizando os oligonucleotídeos Trichosporon-
específicos TRF e TRR. Para confirmar a especificidade destes
oligonucleotídeos na identificação do gênero Trichosporon spp. foram utilizadas
as seguintes cepas-controle CBS: Trichosporon asahii (2479) e T. asahii
(2530), Trichosporon mucoides (7625), Trichosporon inkin (5585), Trichosporon
asteroides (2481) e Trichosporon ovoides (7556). Como controle negativo de
amplificação, foram utilizadas duas cepas-controle ATCC do gênero Candida:
Candida parapsilosis (22019) e Candida albicans (90028). A identificação final
dos isolados clínicos no taxon de espécie foi realizada através do
seqüenciamento da região IGS1 do rDNA utilizando-se os oligonucleotídeos
26SF e 5SR.
4.1.1- Identificação fenotípica
A padronização da identificação por métodos fenotípicos foi baseada em
estudos anteriores e do perfil bioquímico e características morfológicas
(Rodrigues-Tudela, et al., 2005).
Apesar do número limitado de amostras, foram observadas variações de
cores nas colônias dos isolados de Trichosporon spp. quando semeadas em
meio cromogênico CHROMágar Candida®, incluindo tons variados de azul (na
maioria do isolados) e róseos.
A análise micromorfológica baseou-se na presença de apressoria nos
isolados de T. inkin e T. ovoides, células gigantes apicais nos isolados de T.
asteroides e células com forma de barril em T. mucoides.
Resultados
40
Uma vez aplicados os testes fenotípicos aos isolados de cepas de
referência CBS e dos isolados clínicos obtidos de hemoculturas, obtiveram-se
os seguintes resultados ilustrados na Tabela 4.
Utilizando-se testes bioquímicos e fisiológicos, bem como observando-se
ao microscópio células de Trichosporon spp. após microcultivo, foi possível
identificar 19 (82,6 %) isolados em taxon de espécie. A Tabela 4 demonstra o
comportamento de todos os isolados em função dos testes bioquímicos
relacionados no ensaio. Vale dizer que as cepas-controle foram identificadas de
forma acurada quando utilizado este painel bioquímico.
Tabela 4. Resultados de ensaios bioquímicos encontrados neste estudo com
cepas de referência CBS e de isolados clínicos de hemoculturas de
Trichosporon spp.
Quanto ao perfil bioquímico evidenciaram-se algumas limitações, a
saber: difícil interpretação, pouco poder discriminatório para identificar isolados
de espécies semelhantes como o T. mucoides e o T. dermatis (Tabela 5).
Cepas de referência Isolados clínicos*
T. asahii CBS 2479
T. asahii CBS2530
T. asteroides CBS 2481
T. inkin CBS 5585
T. ovoides CBS 7556
T. mucoides CBS 7625
T. asahii (14)
T. inkin (1)
T. asteroides (3)
T. muc./derm. (1)
Trichosporon spp. (4)
Hidrólise da uréia
+ + + + + + 14 1 3 1 4
L-Arabnose
+ + + - - + 14 0 2 1 1
Galactitol
- - - - - + 1 0 0 1 1
Inositol
- - + + - + 0 1 3 1 0
Melibiose
- - - - - + 0 0 0 1 1
Raffinose
- - - - - + 0 0 0 1 1
Rhamnose
+ + + - + + 14 0 2 1 1
Ribose
+ + - - - + 7 0 0 1 1
Assimilação
Xylitol
+ + - - - + 11 1 1 1 2
Crescimento a 37° C
+ + + - - + 14 1 3 1 4
Formação de Apressoria
- - - + - - 0 0 0 0 0
* número de cepas com resultado positivo; (+) teste positivo; (-) teste negativo; muc.
(mucoides); derm. (dermatis).
Amostras
Testes
Resultados
41
Vale realçar que 4 amostras não tiveram qualquer identificação de
espécie definitiva segundo critérios bioquímicos, a saber: S10, S13, S18 e S22
(Tabela 5).
4.1.2- Identificação genotípica
4.1.2.1- Identificação molecular do gênero Trichosporon por técnica de
PCR
Previamente à identificação molecular por seqüenciamento da região
IGS1, optamos por confirmar genotipicamente a correta identificação do gênero
Trichosporon. Para tanto, foram utilizados os oligonucleotídios Trichosporon-
específicos TRF e TRR que amplificam parte da seqüência de nucleotídios
N° das amostras Identificação fenotípica
T. asahii CBS 2479 T. asahii
T. asahii CBS 2530 T. asahii
T. asteroides CBS 2481 T. asteroides
T. inkin CBS 5585 T. inkin
T. ovoides CBS 7556 T. ovoides
T. mucoides CBS 7625 T. mucoides
S1
T. asahii
S3
T. asahii
S4
T. asahii
S5
T. asahii
S6
T. asteroides
S7
T. asahii
S8
T. mucoides/dermatis
S9
T. asteroides
S10
Trichosporon spp.
S11
T. asahii
S12
T. asahii
S13
Trichosporon spp.
S14
T. asahii
S15
T. asahii
S16
T. inkin
S18
Trichosporon spp.
S19
T. asahii
S20
T. asteroides
S21
T. asahii
S22
Trichosporon spp.
S23
T. asahii
S24
T. asahii
S25
T. asahii
Tabela 5.
Identificação
fenotípica
dos isolados de
Trichosporon
spp.
Resultados
42
correspondente a subunidade menor do rDNA (18S) deste microrganismo.
Após a amplificação por PCR, foram obtidas bandas de aproximadamente 170
pb correspondentes aos isolados de Trichosporon spp. Desta forma, foi
possível concluir que os isolados clínicos, bem como as cepas de referência
utilizadas como controle tratavam-se realmente de Trichosporon spp. Além
disso, quando estes oligonucleotídios foram utilizados para amplificar o DNA
obtido por cepas de Candida spp. (controle-negativo), não foram observadas
bandas específicas e de mesmo tamanho que as de Trichosporon spp.
confirmando serem os oligonucleotídios descritos suficientemente
discriminatórios para o gênero Trichosporon como sugerido por Sugita, et al.,
1998. Os produtos de PCR amplificados podem ser visualizados na Figura 2.
Figura 2: Géis de agarose da PCR utilizando os oligonucleotídios TRF e TRR, que
amplificam parte da região 18S do rDNA de Trichosporon spp. PM=Peso Molecular.
Amostras:1= C. albicans ATCC90028; 2= C. parapsilosis ATCC 22019; 3= T. asahii
var. asahii CBS 2479; 4= T. asahii var. asahii CBS 2530; 5= T. inkin CBS 5585; 6= T.
ovoides CBS 7556; 7= T. mucoides CBS 7625; 8= T. asteroides CBS 2481; 9= S1; 10=
S3; 11= S4; 12= S5; 13= S6; 14= S7; 15= S8; 16= S9; 17= S10; 18= S11; 19= S12;
20= S13; 21= T. asahii var. asahii CBS 2479; 22= T. asahii var. asahii CBS 2530; 23=
T. inkin CBS 5585; 24= T. ovoides CBS 7556; 25= T. mucoides CBS 7625; 26= T.
asteroides CBS 2481; 27= S14; 28= S15; 29= S16; 30= S18; 31= S19; 32= S20; 33=
S21; 34= S22; 35= S23; 36= S24 e 37= S25. Notar que não houve bandas de
amplificação referentes às cepas-controle C. albicans ATCC 90028 e C. parapsilosis
ATCC 22019.
PM
4 63 5 1
0
7 8 1
2
9 1
1
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3
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1
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600pb
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2
9 1
1
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3
1
4
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5
1
6
1
7
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24 2623 25 3027 28 3229 312221 33 34 35 36 37
PM
PM
4 63 5
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7 8
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PM 4 63 5 107 8 12 PM112
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2
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21 1
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7 8
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600pb
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13
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16 17 192018
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PM 4 63 5 107 8 12 PM112
1
13 14 15 16 17 19 20189
Resultados
43
4.1.2.2- Identificação molecular de espécies de Trichosporon por
seqüenciamento da região IGS1 do rDNA.
Para identificação de espécie foram amplificados fragmentos da região
IGS1 utilizando-se os oligonucleotídeos 26SF e 5SR. O tamanho das bandas
obtido variou em aproximadamente 450 a 700 pb (Figura 3).
Com relação às bandas de amplificação obtidas, é importante ressaltar
que é impossível distinguir as espécies em questão pelo tamanho das mesmas.
Observar que alguns isolados apresentaram bandas de mesmo tamanho (5, 13
e 15) quando a região IGS1 do mesmo foi amplificada (Figura 3).
Figura 3: Géis de agarose da PCR utilizando-se os oligonucleotídios 26SF e 5SR.
Amostras: 1= T. asahii var. asahii CBS 2479; 2= T. asahii var. asahii CBS 2530; 3= T.
inkin CBS 5585; 4= T. asteroides CBS 2481; 5=T. mucoides CBS 7625; 6= T. ovoides
CBS 7556; 7= S1; 8= S3; 9= S4; 10= S5; 11= S6; 12= S7; 13= S8; 14= S9; 15= S10;
16= S11; 17= S12; 18= S13; 19= S14; 20= S15; 21= S16; 22= S18; 23= S19; 24= S20;
25= S21; 26= S22; 27= S23; 28= S24 e 29= S25.
Os produtos de PCR de DNA genômico utilizando o par de
oligonucleotídios 26F e 5SR foram seqüenciados e a análise destas seqüências
foram comparadas com bancos genômicos através do site “National Center for
Biotechnology Information (NCBI) disponível eletronicamente em:
http://ncbi.nlm.nih.gov” utilizando-se o serviço Basic Local Alignment Search Tool
P
M
43 5 107
8
12
P
M
11
21 13 14 15 16 17 18 19
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1500pb
116 8 9
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43 5 107 12
PM
11
21 13 14 15 16 17 18 19116 8 9
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21
600pb
1500pb
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10
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2120
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22
23 24
25
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21
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10
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26 27 28 29
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10
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43 5 107 12
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21 13 14 15 16 17 18 19116 8 9
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21 13 14 15 16 17 18 19116 8 9
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21
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3 4 5 6 7 8 9
10
PM
2120
PM
22 23 24 25 26 27 28 29
Resultados
44
(BLAST). Esta ferramenta se caracteriza por programas de procura de
similaridade que podem ser utilizados para identificar e classificar os homólogos
em potencial para uma determinada seqüência. Estes programas são capazes de
analisar seqüências de DNA e aminoácidos.
A Tabela 6 abaixo, apresenta a identificação genotípica das cepas de
referência CBS, confirmando a especificidade dos oligonucleotídios, e dos
isolados clínicos. Os valores do E-value e a porcentagem de gaps de todas as
seqüências confirmam a alta qualidade das seqüências, sugerindo que a
probabilidade ao acaso da seqüência em questão ter se alinhado ao acaso foi
praticamente nula.
4.1.3- Comparação entre as identificações fenotípica e genotípica
A identificação fenotípica foi comparada com a genotípica demonstrando
algumas incongruências quanto às duas metodologias (Tabela 7). Três
isolados foram erroneamente identificados como: S9, T. asteroides
Tabela
6
.
Identificação
genotípica
dos isolados de
Trichosporon
spp.
N° da Amostra Identificação genotípica Nº de Acesso Identidade (%) Gaps (%) E-value
T. asahii CBS 2479 T. asahii var. asahii
AB081514.1 100 0/585 (0) 0
T. asahii CBS 2530 T. asahii var. asahii AB081514.1 100 6/584 (1) 0
T. asteroides CBS 2481 T. asteroides
AB081515.1 100 0/309 (0) 0
T. inkin CBS 5585 T. inkin
AB066425.1 99 0/486 (0) 0
T. ovoides CBS 7556 T. ovoides
AB066434.1 99 2/498 (0) 0
T. mucoides CBS 7625 T. mucoides
AB066433.1 100 0/357 (0) 0
S1
T. asteroides
AB081515.1 96 8/591 (1) 0
S3
T. asahii var. coremiiforme
AB066410.1 100 0/478 (0) 0
S4 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/619 (0) 0
S5
T. asahii var. asahii
AB081514.1 99 1/619 (0) 0
S6 T. asteroides AB081515.1 96 10/569 (1) 0
S7
T. asahii var. asahii
AB081514.1 99 1/604 (0) 0
S8 T. dermatis AB072613.1 100 0/357 (0) 0
S9
T. asahii var. asahii
AB081514.1 97 6/627 (0) 0
S10 Trichosporon jirovecii AB066427.1 92 1/328 (0) 8x10
-120
S11 T. asahii var. asahii AB081514.1 98 1/622 (0) 0
S12 T. asahii var. asahii AB081514.1 100 1/436 (0) 0
S13 T. asteroides AB081515.1 96 7/591 (1) 0
S14 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/622 (0) 0
S15 T. asahii var. asahii AB081514.1 100 1/436 (0) 0
S16 T. asahii var. asahii AB081514.1 100 1/436 (0) 0
S18 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/619 (0) 0
S19 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/619 (0) 0
S20 T. asteroides AB081515.1 96 8/588 (1) 0
S21 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/618 (0) 0
S22 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/618 (0) 0
S23 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/619 (0) 0
S24 T. asteroides AB081515.1 97 6/568 (1) 0
S25 T. asahii var. asahii AB081514.1 99 1/622 (0) 0
Resultados
45
(identificação molecular: T. asahii var. asahii); S16, T. inkin (identificação
molecular: T.asahii var. asahii) e S24, T. asahii (identificação molecular: T.
asteroides). Houve 61 % de concordância entre as duas metodologias, sendo
T. asahii a espécie mais freqüentemente identificada na presente série. Deste
modo, vimos que ferramentas fenotípicas para identificação de Trichosporon
spp. em nível de espécie não são acuradas.
Tabela 7. Identificação dos isolados de Trichosporon spp. por dois diferentes
métodos: clássico e molecular.
N° da Amostra Identificação fenotípica Identificação genotípica
T. asahii CBS 2479 T. asahii var. asahii T. asahii var. asahii
T. asahii CBS 2530 T. asahii var. asahii T. asahii var. asahii
T. asteroides CBS 2481 T. asteroides T. asteroides
T. inkin CBS 5585 T. inkin T. inkin
T. ovoides CBS 7556 T. ovoides T. ovoides
T. mucoides CBS 7625 T. mucoides T. mucoides
S1
T. asahii
T. asteroides
S3 T. asahii
T. asahii var. coremiiforme
S4 T. asahii
T. asahii var. asahii
S5
T. asahii
T. asahii var. asahii
S6
T. asteroides T. asteroides
S7 T. asahii T. asahii var. asahii
S8 T. mucoides/dermatis T. dermatis
S9
T. asteroides T. asahii var. asahii
S10 Trichosporon spp. Trichosporon jirovecii
S11
T. asahii
T. asahii var. asahii
S12
T. asahii
T. asahii var. asahii
S13 Trichosporon spp. T. asteroides
S14 T. asahii
T. asahii var. asahii
S15
T. asahii
T. asahii var. asahii
S16
T. inkin T. asahii var. asahii
S18 Trichosporon spp. T. asahii var. asahii
S19 T. asahii T. asahii var. asahii
S20
T. asteroides T. asteroides
S21
T. asahii T. asahii var. asahii
S22 Trichosporon spp. T. asahii var. asahii
S23 T. asahii
T. asahii var. asahii
S24
T. asahii
T. asteroides
S25
T. asahii
T. asahii var. asahii
Resultados
46
4.2- Perfil de sensibilidade aos antifúngicos
As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de fluconazol, itraconazol,
voriconazol, 5-fluorocitosina e caspofungina foram determinadas pela
metodologia de microdiluição em caldo por adaptação do método preconizado
pelo CLSI para leveduras. As CIMs de anfotericina B foram obtidas por
microdiluição em caldo e Etest®. Para ambas as metodologias, a leitura da CIM
foi realizada com 24, 48 e 72 horas de incubação a 35°C.
4.2.1- Avaliação dos testes de sensibilidade a Anfotericina B
4.2.1.1- Padronização dos métodos de Etest® e microdiluição em caldo
Após adaptação da metodologia de microdiluição em caldo do CLSI para
Trichosporon spp. no LEMI, verificou-se a reprodutibilidade do método com
cepas de referência CBS de Trichosporon spp. sendo os ensaios repetidos 6
vezes em dias diferentes sobre mesmas condições de execução da técnica e
de interpretação dos resultados. Em cada repetição dos experimentos descritos
acima, foram realizados ensaios com Etest® para anfotericina B com as
mesmas cepas paralelamente (Tabela 8).
Os resultados gerados utilizando as cepas de referência CBS
apresentaram boa reprodutibilidade, sem mudança da categoria de
sensibilidade em testes independentes com os mesmos isolados
independentemente do tempo de leitura e do antifúngico testado. A maioria dos
testes apresentou concordância de + 1 log
2
da CIM (Tabela 8).
Resultados
47
Tabela 8. Variação das CIMs dos antifúngicos por microdiluição e Etest® das
cepas de referência.
Cepas de referência
Tempo -
CBS 2479
T. asahii
CBS2530
T. asahii
CBS 2481
T. asteroides
CBS 5585
T. inkin
CBS 7556
T. ovoides
CBS 7625
T. mucoides
Variação (µg/m)
Anfotericina B (Etest®)
24h 0,012 - 0,03 0,01 - 0,125 0,125 - 0,5 0,04 - 0,19 0,094 - 0,25 0,125 - 0,25
48h 0,02 - 0,5 0,01 - 0,125 0,125 - 0,5 0,19 - 0,25 0,38 - 0,5 0,125 - 0,38
72h 0,02 - 2 0,016 - 0,25 0,125 - 0,5 0,19 - 0,38 0,38 - 1 0,125 - 0,38
Anfotericina B (MC*)
24h 0,25 -1 0,125 - 0,5 0,125 - 0,5 0,25 - 0,5 0,25 - 0,5 0,25 - 0,5
48h 0,5 - 1 0,25 - 0,5 0,5 0,25 - 0,5 0,25 - 1 0,25 – 0,5
72h 0,5 - 1 0,25 - 0,5 0,5 - 1 0,25 - 1 0,25 - 1 0,25 - 1
5-Fluorocitosina (MC*)
24h 2 - 16 2 - 16 4 8 - 16 8 - 16 4 - 64
48h 8 - 32 2 - 32 4 - 8 8 - 32 16 8 - >64
72h 16 - 64 4 - 32 8 8 - 64 16 - 32 8 - >64
Caspofungina (MC*)
24h 8 - >16 16 16 8 - >16
16 - >16 16 - >16
48h 16 - > 16 16 - > 16
16 16 - > 16 16 - >16 16 - >16
72h >16 16 - > 16
>16
> 16 >16 >16
Fluconazol (MC*)
24h
0,5 - 4
0,25 - 0,5 0,5 - 2 1 - 2
0,25 - 0,5 1 - 8
48h
0,5 - 4 0,25 - 2 1 - 2
1 - 4
0,25 - 0,5 2 - 8
72h
0,5 - 4 0,25 - 2 1 - 2
1 - 4
0,25 - 0,5 2 - 8
Itraconazol (MC*)
24h 0,03 - 0,125
0,03 - 0,06
0,03 - 0,06
0,03 - 0,06
0,03 - 0,125 0,03 - 0,125
48h
0,06 - 0,125 0,03 - 0,06
0,06
0,03 - 0,06
0,06 - 0,125
0,03 - 0,125
72h
0,125 0,03 - 0,06
0,06
0,03 - 0,125
0,06 - 0,125
0,03 - 0,125
Voriconazol (MC*)
24h 0,03 - 0,06
0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 - 0,06
48 0,03 - 0,06
0,03 0,03 - 0,06 0,03 0,03 - 0,06 0,03 - 0,125
72 0,06
0,03 0,03 - 0,06 0,03 0,03 - 0,06 0,03 - 0,125
* MC = microdiluição em caldo
Amostras
Antifúngicos
Após otimização de ambas as metodologias para teste de sensibilidade
utilizando cepas de referência CBS, estes testes foram realizados com os 23
isolados de Trichosporon spp. obtidos de hemoculturas. As CIMs de todos os
isolados encontra-se no anexo 1.
4.2.1.2- Comparação da sensibilidade a anfotericina B de isolados clínicos
de Trichosporon por microdiluição em caldo e Etest®.
Anfotericina B foi o único antifúngico testado pelas duas metodologias.
As CIMs da microdiluição em caldo apresentaram-se distribuídas em menor
espectro de diluições, enquanto que no Etest® as CIMs apresentaram-se num
Resultados
48
largo espectro. O Etest® apresenta maior polarização de resultados na análise
das cepas, sendo que nas leituras de 24, 48 e 72 h há variação das CIMs de
anfotericina B de 0,012-16 µg/mL, contribuindo para melhor evidenciar os
isolados sensíveis, principalmente entre cepas com sensibilidade “borderline”
pela microdiluição em caldo. Em relação à microdiluição em caldo, variação
ampla de CIMs foram documentadas apenas após 72 h de leitura (Tabela 9).
Os isolados de T. asahii apresentaram CIMs mais elevadas e menores
índices de sensibilidade a anfotericina B, por ambos os métodos, quando
comparados com isolados de T.não-asahii (Tabela 9).
A Figura 4 avalia o impacto do tempo de leitura na concordância entre os
valores de CIM para anfotericina B gerados por 23 isolados testados
simultaneamente por Etest® e microdiluição em caldo.
Através da análise de regressão linear pode-se observar, de maneira
geral, uma tendência de correlação entre os valores de CIMs obtidas pelos dois
métodos. Entretanto, analisando-se os valores de coeficiente de Pearson é
possível afirmar que a melhor correlação entre os dois métodos foi obtida nas
leituras de 48 horas (R
2
= 0,653).
Microdiluição em caldo Etest®
Tempo
CIM50
(µg/mL)
CIM90
(µg/mL)
Variação
(µg/mL)
Sensib.
(%)
CIM50
(µg/mL)
CIM90
(µg/mL)
Variação
(µg/mL)
Sensib.
(%)
T. asahii (16)
24h 1 1 0,5-2 93,75 0,25 2 0,012-2 81,25
48h 1 2 0,5-4 56,25 2 >16 0,094->16 37,5
72h 2 4 2-16 0 >16 >16 0,25->16 31,25
T. não-asahii (7)
24h 1 1 0,25-1 100 0,25 0,25 0,125-0,25 100
48h 1 2 0,5-4 71,4 1 8 0,125-8 57,1
72h 2 4 1-16 28,6 1 >16 0,125->16 57,1
Tabela
9
.
Comparação da sensibilidade a anfotericina B de isolados clínicos de
Trichosporon por microdiluição em caldo e Etest®.
Resultados
49
4.2.1.3- Impacto do tempo de leitura no padrão de sensibilidade de
Trichosporon spp. à anfotericina B.
A Figura 5 ilustra que há impacto significativo no resultado de CIMs em
função do tempo de leitura em ensaios com anfotericina B. Neste sentido a
porcentagem de isolados susceptíveis a anfotericina B caiu de 97 % para 39 %
de 24 a 72 horas para Etest® e de 96 % para 9 % para microdiluição em caldo.
Figura 4.
Regressão linear das CIMs de anfotericina B pa
ra os 23 isolados de
Trichosporon spp. obtidas por Etest® e microdiluição em caldo. As linhas
pontilhadas horizontais e verticais indicam o ponto de corte sugerido para este
antifúngico (≥ 1µg/mL).
Obs.: Os resultados das CIMs de todos os isolados clínicos avaliados encontram-se na Tabela
10, na seção de anexos.
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
2
1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
2
1
1
1
y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
2
1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
2
1
1
1
y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL (24h)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
2
1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
2
1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
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1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
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1
1
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1
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0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
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y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
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0,03
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0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
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y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
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3
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0
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0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
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1
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241
5
2
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y = 1,2086x - 3,8457
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0,03
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0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
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y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
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0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
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0
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1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
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2
2
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2
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1
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y = 2,3886x - 8,2057
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0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
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2
2
2
1
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1
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y = 2,3886x - 8,2057
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0,25
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1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 1,6546x - 5,6701
R
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= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
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0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
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1
1
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y = 1,6546x - 5,6701
R
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= 0,3431
0
0,03
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0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
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1
1
2
1
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1
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0
0,03
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0,125
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1
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4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
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1
1
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3
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y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
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0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
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3
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0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
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y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
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0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL (24h)
2
3
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1
241
5
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y = 2,3886x - 8,2057
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4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
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0,125
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0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
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y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
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0,06
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0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
4
1
1
2
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y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
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0,03
0,06
0,125
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0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
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1
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y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
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0,06
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1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
8
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1
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1
y = 1,6546x - 5,6701
R
2
= 0,3431
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL (24h)
EtestCIM µg/mL(24h)
3
1
1
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1
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0
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1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
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3
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y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
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4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
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2
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16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
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y = 1,2086x - 3,8457
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1
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4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL (24h)
2
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1
1
241
5
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8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
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2
2
2
1
2
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1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
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0,125
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0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
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y = 2,933x - 9,8763
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1
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4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
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1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
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0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
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y = 2,933x - 9,8763
R 2 = 0,5457
0
0,03
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0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(24h)
EtestCIM µg/mL(48h)
2
2
2
2
1
1
1
6
3
3
2
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
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1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
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0,03
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2
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16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL (24h)
2
3
1
1
241
5
2
1
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3
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL (24h)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL
(24)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 1,2086x - 3,8457
R 2 = 0,3302
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdilui ção em caldo CIM µg/mL (48)
Etest
CIM µ
g/mL (24h)
2
3
1
1
241
5
2
1
1
3
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
y = 2,3886x - 8,2057
R2 = 0,653
0
0,03
0,06
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
0 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Microdiluição em caldo CIM µg/mL(48h)
EtestCIM µg/mL(48h)
4
3
3
3
2
2
2
2
1
2
1
1
1
Resultados
50
4.2.1.4- Impacto do tempo de leitura no padrão de sensibilidade de
Trichosporon spp. aos azólicos, caspofungina e 5-fluorocitosina.
A Figura 6 representa o impacto do tempo de leitura no perfil de
sensibilidade dos 23 isolados de hemocultura de Trichosporon frente a cinco
antifúngicos, demonstrando que houve elevada sensibilidade aos azólicos. Em
contrapartida, 5-fluorocitosina e caspofungina não apresentaram atividade
contra estes isolados. O histograma com azólicos deixa claro que não houve
mudanças significativas no perfil de sensibilidade em relação aos azólicos,
caspofungina e 5-fluorocitosina. Por outro lado, amostras de Trichosporon spp.
mostraram-se sensíveis aos azólicos e com maior perfil de resistência a
caspofungina e 5-fluorocitosina.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Susceptibilidade %
24 horas 48 horas 72 horas
Metodologia/Tempo de leitura
Microdiluição em caldo
Etest®
Figura 5
. Comparação da sensibilidade dos 23 isolados de hemoculturas de
Trichosporon spp. à anfotericina B pelos métodos de microdiluição em caldo e Etest®
Resultados
51
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Susceptibilidade %
24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72
Fluco Itral Voric 5-FC Caspo
Antifúngicos / Tempo de leitura (h)
Fluconazol
Itraconazol
Caspofungina
5-Fluorocitosina
Voriconazol
Microdiluição em caldo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Susceptibilidade %
24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72
Fluco Itral Voric 5-FC Caspo
Antifúngicos / Tempo de leitura (h)
Fluconazol
Itraconazol
Caspofungina
5-Fluorocitosina
Voriconazol
Microdiluição em caldo
Figura
6
.
Perfil de sensibilidade dos 23 isolados de hemoculturas de
Trichosporon spp. frente aos antifúngicos pelo método de microdiluição em
caldo.
5. DISCUSSÃO
__________________________________
Discussão
53
Espécies de Trichosporon são patógenos que geralmente causam
infecções superficiais em humanos. Entretanto, nos últimos anos, estes fungos
emergiram como causa de micoses disseminadas em pacientes
imunocomprometidos, particularmente naqueles com neutropenia intensa
(Rhee, et al., 1999; Fleming, et al., 2002; Walsh, et al., 2004).
A taxonomia do gênero Trichosporon foi revista por Guého, et al. 1992;
1994 e Sugita, et al. 1994 que incorporaram vários taxa a este gênero
utilizando critérios moleculares. Nesta revisão, 6 espécies foram descritas
como relevantes para a Micologia Médica. Estas espécies apresentam
peculiaridades em termos de reservatório, história natural da infecção no
homem e sensibilidade aos antifúngicos (Sugita, et al., 2002; Fell & Scorzetti,
2004, Walsh, et al., 2004).
Tricosporonoses disseminadas estão associadas na maioria das vezes a
T. asahii, porém, outras espécies do mesmo gênero como T. asteroides, T.
inkin, T. loubieri e T. mucoides têm sido relatadas como causadoras deste tipo
de infecção (Kustimur, et al., 2002; Marty, et al., 2003; Padhye, et al., 2003;
Ramos, et al., 2004).
A identificação das leveduras patogênicas em laboratórios de Micologia
Médica baseia-se em sua caracterização fenotípica a partir da análise de
aspectos macroscópicos e microscópicos das colônias, provas de assimilação
e fermentação de nutrientes, hidrólise da uréia e tolerância do organismo a
diferentes temperaturas (Barnett, et al., 2000; Chen, et al., 2001; Middelhoven,
et al., 2004). Aplicando-se estas metodologias fenotípicas para identificação de
leveduras do gênero Trichosporon, verificamos que os isolados provenientes
de coleções de cultura tiveram a sua identificação confirmada, neste estudo.
Entretanto, na tentativa de identificação de isolados clínicos utilizando-se a
mesma metodologia, houve uma dificuldade na interpretação dos resultados,
tais como: inconsistência e dificuldade na interpretação de provas de
assimilação, assim como grande variabilidade de resultados na assimilação de
açúcares impossibilitando a definição clara de um perfil bioquímico
característico para as espécies do gênero.
Discussão
54
Utilizando as ferramentas fenotípicas, entre os 23 isolados clínicos foi
possível identificar em nível de espécie 83 % dos isolados. T. asahii foi a
espécie mais predominantemente isolada (aproximadamente 61 %), seguido de
T. asteroides, com 13 % e as demais espécies com 26 %. Dos 23 isolados
testados, cerca de 17 % não apresentaram consistência na identificação final
em nível de espécie devido à variabilidade obtida nos testes de assimilação de
carboidratos.
Estudo conduzido por Rodriguez-Tudela, et al. (2005) utilizando o
método clássico de identificação fenotípica incluindo características
bioquímicas, fisiológicas e morfológicas, conseguiram identificar em nível de
espécie, 49 (100 %) dos isolados de Trichosporon spp. Entretanto, os
resultados por métodos fenotípicos neste estudo não foram totalmente
equivalentes com a identificação por seqüênciamento da região IGS1. Dos
isolados testados por Rodriguez-Tudela, et al. (2005), 22 % (11/49) foram
identificados como T. asahii. Entretanto, estes autores utilizaram amostras
clínicas obtidas de diferentes sítios, dentre os quais somente 8 foram
recuperados de hemoculturas. Desta forma, justifica-se, portanto, um menor
isolamento de T. asahii.
Existem poucos trabalhos relacionados à identificação fenotípica de
isolados clínicos de Trichosporon spp. pelo método clássico, provavelmente
porque que esta levedura é emergente em infecções invasivas e os
laboratórios de rotina não estão preparados para identificação acurada de
espécies deste gênero (Vasta, et al., 1993; Hazen, et al., 1995). Além disso,
poucos trabalhos foram realizados utilizando a metodologia fenotípica para
identificação de Trichosporon após a subdivisão de T. beigelli em 6 espécies
distintas patogênicas ao homem.
No sentido de superar as desvantagens dos métodos de identificação
fenotípica de isolados clínicos de Trichosporon spp. vários estudiosos vêm
empregando procedimentos moleculares na identificação destas leveduras,
levando-se em consideração a acurácia e especificidade destas ferramentas,
Discussão
55
além do grande potencial discriminatório de espécies altamente relacionadas
geneticamente (De Hoog, et al., 2000).
Desta forma, decidimos utilizar métodos moleculares para a identificação
dos isolados de Trichosporon spp. Inicialmente, houve uma dificuldade na
extração de DNA das amostras. As células crescidas por 12 h apresentavam
baixa quantidade de massa celular, resultando em baixa quantidade de DNA.
Este problema foi resolvido com o crescimento de cada amostra em triplicata,
tendo conseqüentemente conseguido altas quantidades de DNA. A extração
também foi otimizada através de um maior período de incubação das células
no tampão de lise adicionado de proteinase K. Sendo assim, o DNA das
amostras obtido apresentou grau de pureza elevado, estando totalmente livre
de contaminação por proteínas. Conseqüentemente, foi possível assegurar
DNA de ótima qualidade para as subseqüentes etapas de amplificação por
PCR e seqüenciamento.
Inicialmente, confirmamos a identificação correta das amostras em nível
de gênero. Utilizamos a metodologia proposta por Sugita, et al. (1998) baseada
em oligonucleotídios que amplificam um fragmento da subunidade 18S do
rDNA deste microrganismo (TRF e TRR). A reação de PCR foi realizada
utilizando PCR Master Mix da PROMEGA®, portanto algumas modificações
foram feitas, de maneira que as etapas de amplificação se adequassem às
condições do Master Mix, tais como: aumento dos tempos de desnaturação,
anelamento e extensão; aumento da temperatura de anelamento e redução do
tempo de extensão final.
Obtivemos bandas bem definidas com tamanho esperado de 170 pb. A
ausência de amplificação de bandas com 170 pb nas cepas controle C.
albicans e C. parapsilosis comprova a eficácia do método na identificação
molecular do gênero Trichosporon.
Para a escolha do alvo de amplificação para identificação de espécie
consultamos a literatura em relação à possibilidade da utilização da região
ITS.do rDNA. Entretanto, acredita-se que a região ITS não seja suficientemente
Discussão
56
discriminatória para permitir a identificação de todos os isolados em nível de
espécie de Trichosporon (Sugita, et al., 2002). Estes autores reportam que as
seqüências da região IGS1, em Trichosporon spp. podem variar de 195 a 704
pb, enquanto que a região ITS inteira incluindo o gene 5,8S, varia de 445 a 470
pb. Sendo assim, haveria uma probabilidade maior de acúmulo de mutações
para a região IGS1.
Empregamos neste trabalho o método de seqüenciamento da região
IGS1 para a identificação final das espécies de Trichosporon. Para tanto,
utilizamos a metodologia descrita por Sugita, et al. (2002) com algumas
modificações. O aumento do tempo de extensão para um minuto resultou em
bandas com mais alta intensidade; para alguns isolados, houve a necessidade
de aumentar para 40 ciclos as etapas de desnaturação, anelamento e
extensão, bem como dobrar a quantidade de DNA na reação de PCR (80ng).
Além disso, purificações de bandas foram realizadas, quando necessário,
eliminando-se as bandas inespecíficas. Bandas de alta intensidade foram
obtidas em geral. Desta forma, pudemos garantir a qualidade dos produtos de
PCR que seriam posteriormente utilizados para a reação de seqüenciamento.
Ao avaliar a qualidade das seqüências de nucleotídios obtidas com o
seqüênciamento da região IGS1, verificamos que o E-value apresentou-se de
forma altamente satisfatória em todas as amostras de DNA, ou seja, todos os
isolados apresentaram E-value igual ou bastante aproximado a zero, indicando
que estas seqüências não se alinharam ao acaso quando comparadas com
seqüências depositadas no BLAST. Em 96 % (22/23) das vezes estas foram
idênticas às seqüências depositadas no banco de dados do NCBI. Além disso,
o número de gaps foi igual ou inferior a 1 % em todas as amostras.
Comparando as duas metodologias de identificação empregadas neste
estudo (fenotípica e molecular) observamos que os testes fenotípicos
permitiram identificar corretamente em nível de espécie aproximadamente 61%
(14/23) dos isolados quando comparados com a identificação molecular por
seqüenciamento da região IGS1. Rodriguez-Tudela, et al. (2005), utilizando as
mesmas metodologias fenotípicas e genotípicas empregadas, obtiveram
Discussão
57
apenas 37% de concordância entre as duas metodologias. Vale salientar que
estes autores utilizaram isolados oriundos de diferentes amostras clínicas,
sendo somente 8 isolados de hemoculturas. Destes, sete foram identificados
como T. asahii e um como T. dermatis. No presente trabalho, todos os isolados
foram provenientes de hemoculturas. Espera-se que haja um maior isolamento
de T. asahii pelo fato desta espécie ser mais associada à fungemia dentro do
gênero Trichosporon (Walsh, et al. 2004). Como T. asahii é mais facilmente
identificada por métodos fenotípicos do que as demais espécies de
Trichosporon, justifica-se o fato de que em nosso trabalho foi possível obter
maior percentagem de compatibilidade dos resultados obtidos entre os
métodos fenotípicos e genotípicos quando comparados com os resultados
obtidos por Rodriguez-Tudela, et al. (2005).
A metodologia genotípica empregada no presente estudo conseguiu
identificar 4 isolados que não haviam sido previamente identificados pela
metodologia fenotípica. Além disso, um isolado de T. dermatis apresentou perfil
fenotípico idêntico ao de T. mucoides. Rodriguez-Tudela, et al. (2005),
identificaram seis isolados de T. dermatis por seqüênciamento da região IGS1.
Destes seis isolados, cinco haviam sido previamente identificados utilizando-se
a metodologia clássica de identificação de leveduras como T. mucoides e um
como T.cutaneum. O mesmo ocorreu no estudo anteriormente descrito por
Gunn, et al. (2006), onde um isolado de T. dermatis identificado por seqüência
da região IGS1 foi previamente identificado por metodologia fenotípica
utilizando os sistemas Vitek 1 e 2 como sendo T. mucoides. Mais uma vez,
torna-se claro que o uso da ferramenta molecular foi de fundamental
importância para a identificação correta das espécies no presente estudo,
corroborando os resultados obtidos por Sugita, et al. (2002); Rodriguez-Tudela,
et al. (2005) e Gunn, et al. (2006).
No nosso estudo a identificação genotípica evidenciou que a espécie
mais freqüentemente isolada foi T. asahii com 69,6 %, seguido de T. asteroides
com aproximadamente 22 % e as demais espécies com 8,7 %. Estes dados
nos permitem inferir que tal resultado deve estar relacionado ao fato desta
espécie fazer parte da microbiota normal do trato gastrointestinal dos humanos.
Discussão
58
Por conseguinte, poderá ocorrer translocação e posteriormente disseminação,
principalmente em pacientes imunossuprimidos (Walsh, et al. 2004).
Ainda por análise dos resultados obtidos com o seqüenciamento da
região IGS1 encontramos no presente estudo um isolado de T. jirovecci, o
primeiro relato desta espécie como causadora de fungemia descrito Brasil.
Além disso, não encontramos nenhum outro relato de caso na literatura de
fungemia por T. jirovecci no mundo. Vale ressaltar que é possível que este
isolado não tenha sido descrito anteriormente como causador de infecção
disseminada em humanos, devido à dificuldade encontrada nos laboratórios de
rotina para identificação desta espécie utilizando ferramentas fenotípicas. Além
disso, é importante ressaltar que antes de 1992, a maioria dos isolados de
Trichosporon spp. foram apenas considerados como T. beigelli (Guého, et al.,
1992). Rodriguez – Tudela, et al. (2005) reportaram dois isolados de T.
jirovecci, sendo um isolado de urina e outro de pele.
Identificamos também no presente estudo, um isolado de T. dermatis.
Em levantamento bibliográfico, encontramos somente dois relatos na literatura
de tricosporonemia por T. dermatis. Gunn, et. al. (2006) reportaram o
isolamento de cepa de T. dermatis de hemocultura em uma criança do sexo
feminino portadora de doença autoimune. Esta identificação só foi possível
devido à utilização da técnica de seqüenciamento da região IGS1. Rodriguez-
Tudela, et al. (2005) também reportaram fungemia por T. dermatis utilizando a
mesma metodologia.
Deste modo, torna-se evidente que testes fenotípicos são imprecisos.
Sabendo que os resultados obtidos ao utilizar as chaves de identificação
atualmente disponíveis para Trichosporon spp. geram identificações de
diferentes espécies com mesmo perfil fenotípico, sendo na maioria das vezes
inconclusivos ou presuntivos, torna-se necessário o uso de técnicas
moleculares, que se mostraram altamente eficientes na identificação das
amostras clínicas utilizadas no presente trabalho.
Discussão
59
Com a finalidade de se avaliar a sensibilidade aos 6 antifúngicos por
microdiluição em caldo dos isolados de Trichosporon spp., adaptou-se o
documento M27-A2 do CLSI. Mantiveram-se as mesmas diluições de drogas e
tamanho do inóculo das leveduras. Também foi utilizada a técnica de Etest®
para avaliar a sensibilidade a anfotericina B. Para ambas as metodologias, o
tempo de leitura da sensibilidade foi realizado com intervalos de 24 h até 72 h.
Para anfotericina B, houve impacto significativo no resultado das CIMs
em função do tempo de leitura tanto para Etest® quanto para microdiluição em
caldo. Em apenas 24 horas, o Etest® demonstrou que três isolados (13 %)
apresentaram CIM ≥ 2 µg/mL. Na microdiluição em caldo, um isolado (4 %)
apresentou CIM ≥ 2 µg/mL. Vale ressaltar que houve dificuldade para
determinação do “endpoint” visual com leituras de 24 horas devido ao baixo
crescimento fúngico. Porém, com 48 horas houve crescimento celular
satisfatório, sendo possível definir os “endpoints”. Deste modo, as leituras com
48 horas evidenciaram que o tempo apresenta impacto significativo para
definição das CIMs de anfotericina B para Trichosporon spp., sendo que para
Etest® 57 % dos isolados apresentaram CIMs ≥ 2 µg/mL, contra 39 % para
microdiluição. As leituras com 72 horas não demonstraram diferença
significativa para leituras com Etest®.
Analisando os dados obtidos da avaliação do crescimento fúngico, a
estabilidade das CIMs e o coeficiente de Pearson, é possível observar que a
melhor leitura foi obtida com 48 horas de incubação das amostras. A melhor
correlação das leituras dos testes entre os dois métodos também foi obtida com
48 horas, sendo as CIMs relativamente altas para ambos T. asahii e T. não-
asahii. Porém, Etest® e microdiluição em caldo para anfotericina B
apresentaram-se pouco concordantes. O Etest® demonstrou CIMs com
variação maior que as obtidas por microdiluição, contribuindo para evidenciar a
sensibilidade de isolados com CIM próxima ao ponto de corte adotado no
presente trabalho, quando utilizada leitura por microdiluição em caldo. Nossos
resultados confirmam os dados de Arikan, et al. (2002) que estudando 43
isolados de Trichosporon spp. verificaram baixa concordância entre os dois
métodos, sendo a melhor concordância com 48 horas de incubação.
Discussão
60
Neste estudo, as cepas de T. asahii apresentaram maior redução da
sensibilidade a anfotericina B. Com 48 h, aproximadamente 63 % e 44% dos
isolados apresentaram CIMs ≥ 2µg/mL (por Etest® e microdiluição em caldo,
respectivamente), enquanto que para os isolados de T. não-asahii a redução
da sensibilidade a anfotericina B para mesmo valor de CIMs e tempo de
incubação ocorreu em 43 % e 29% dos isolados para Etest® e microdiluição
em caldo, respectivamente.
Estes dados estão corroborando com os resultados obtidos por
Paphitou, et al. (2002) onde isolados de T. asahii apresentaram CIMs maiores
para anfotericina B. Além disso, a distribuição dos valores das CIMs para este
antifúngico para esta espécie deixa claro que após 24 horas de incubação a
variação das CIMs com Etest® é bastante mais ampla e discriminatória que
aquela obtida com microdiluição em caldo.
Rodriguez-Tudela, et al. (2005) demonstrarm que 100 % dos isolados de
T. asahii (n=15) exibiram CIMs ≥ 2,0 µg/mL para anfotericina B com 48 horas
de incubação. Entretanto, a metodologia utilizada por estes autores foi a
microdiluição em caldo baseada em documentos do European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing
(
EUCAST). Mesmo apresentando algumas
diferenças na execução deste método, como o diferente inóculo da levedura a
ser testada (0,5 a 2,5 x 10
5
UFC/mL contra 0,5 a 2,5 x 10
3
UFC/mL em nosso
estudo), as cepas apresentaram CIMs com resultados semelhantes aos
nossos.
A maioria dos trabalhos envolvendo testes de sensibilidade em
Trichosporon spp. ainda consideram a antiga nomenclatura, T. beigelli, o que
dificulta o efeito comparativo dos mesmos com o presente estudo. Por
exemplo, estudos realizados por Hata, et al. (1996); Perparim, et al. (1996);
Uchida, et al. (2000) e Uzun, et al. (2000) demonstraram CIMs elevadas com
redução da sensibilidade de Trichosporon beigelli a anfotericina B por
microdiluição em caldo.
Discussão
61
A variação das CIMs de anfotericina B para isolados de T.asahii foi de
0,5 – 4,0 µg/mL por microdiluição em caldo e de 0,094 - > 16,0 µg/mL para
Etest®. Com relação a T. não-asahii, as CIMs variaram de 0,5 – 4,0 µg/mL
para microdiluição em caldo e de 0,125 - 8,0 µg/mL para Etest®. Nossos dados
corroboram com os obtidos por Arikan, et al. (2002) para T. asahii, onde os 43
isolados avaliados apresentaram variações das CIMs de anfotericina B por
microdiluição em caldo de 0,5 – 4,0 µg/mL e de 0,125 - > 8,0 µg/mL para
Etest®.
Nossos resultados sugerem que Etest® para avaliar a sensibilidade de
isolados de Trichosporon spp. à anfotericina B apresenta maior variação das
CIMs quando comparados com o método de microdiluição em caldo,
corroborando com os resultados obtidos por Paphitou, et al. (2002). Contudo,
são necessários estudos de correlação clínica aos dados obtidos in vitro para a
validação deste método.
Quanto aos azólicos, não houve impacto do tempo de leitura tanto para
T. asahii quanto para T. não-asahii. Observamos ainda que todos os isolados
clínicos apresentaram-se sensíveis aos azólicos com CIMs relativamente
baixas. Houve variação das CIMs entre as três drogas, sendo que as menores
CIMs foram vistas com voriconazol. Nossos resultados foram diferentes dos
encontrados por Arikan, et al. (2002) e Paphitou, et al. (2002) que relataram
maiores CIMs de azólicos para T. não-asahii quando comparadas com T.
asahii. Entretanto, o número de isolados utilizados no presente estudo foi
limitado, restringindo a comparação.
Dados semelhantes aos obtidos no presente trabalho foram relatados
por Metin, et al. (2005) para antifúngicos azólicos por microdiluição em caldo
utilizando uma adaptação do CLSI em 27 isolados clínicos de Trichosporon
spp. Estes isolados apresentaram CIM
90
de fluconazol de 4,0 µg/mL e de
0,125µg/mL para voriconazol. Estes valores encontram-se em apenas uma
diluição acima dos nossos resultados. Entretanto, não houve mudança da
categoria de sensibilidade.
Discussão
62
Ostroskly-Zeichner, et al. (2000) apud Arikan, et al. (2002) obtiveram
resultados equivalentes aos encontrados no presente estudo onde as CIMs de
fluconazol e itraconazol, por microdiluição em caldo variaram respectivamente
de 0,125 – 16 µg/mL e 0,06 – 0,25 µg/mL em 30 isolados de T. asahii.
Arikan, et al. (2002) reportaram variações das CIMs de 43 isolados de T.
asahii sendo 0,25 – 16,0 µg/mL e CIM
90
de 8,0 µg/mL para fluconazol e 0,06 -
4,0 µg/mL com CIM
90
de 1,0 µg/mL para itraconazol. Estas CIMs são
ligeiramente mais elevadas que as obtidas no nosso estudo, considerando que
a CIM de fluconazol de 16,0 µg/mL pode representar sensibilidade dependendo
da dose.
Em contrapartida, Wolf, et al. (2001) encontraram CIMs elevadas de
fluconazol (obtidas por microdiluição em caldo), frente a 6 isolados clínicos de
T. asahii, apresentando variação de 16 – 64µg/mL. Neste estudo também
foram adotados os pontos de corte estabelecidos pelo CLSI para Candida spp.
Todos os isolados foram resistentes a fluconazol, sendo as CIMs de itraconazol
obtidas por Etest® com variação de 1,0 - 2,0 µg/mL. Rodriguez-Tudela, et al.
(2005) encontraram variação das CIMs de fluconazol por microdiluição
(EUCAST) para os 49 isolados de Trichosporon spp. de 0,12 - 128 µg/mL.
Em estudo realizado por Falk, et al. (2003), 6 isolados de T. asahii
resistentes a anfotericina B, 5-fluorocitosina, itraconazol, cetoconazol e
fluconazol, apresentaram-se sensíveis a voriconazol, confirmando que este
antifúngico pode ser uma alternativa terapêutica viável contra esta levedura.
Estes dados corroboram com os resultados in vitro obtidos para voriconazol no
presente estudo.
No nosso estudo, os azólicos apresentaram maior atividade antifúngica
in vitro que anfotericina B, sobretudo voriconazol que se apresentou muito
eficaz com CIMs inferiores a 0,125 µg/mL. Contudo, são necessários estudos
de correlação in vivo para se estabelecer os pontos de corte destes
antifúngicos contra isolados clínicos de Trichosporon spp.
Discussão
63
Para 5-fluorocitosina, aproximadamente 87% dos isolados apresentaram
CIMs ≥ 16 µg/mL com 48 horas de incubação, demonstrando que este
antifúngico não apresentou atividade contra os isolados clínicos de
Trichosporon spp. Nossos dados confirmam os resultados obtidos por Wolf, et
al. (2001) que relataram seis isolados de T. asahii com CIMs de ≥ 128,0 µg/mL
de 5-fluorocitosina por microdiluição em caldo, assim como os resultados
mostrados por Rodriguez-Tudela, et al. (2005) que demonstram CIMs elevadas
à 5-fluorocitosina variando de 2,0 – 128,0 µg/mL para 49 isolados clínicos de
Trichosporon spp.
Nosso estudo demonstrou que caspofungina não foi eficaz para nenhum
dos isolados, apresentando CIMs ≥ 16,0 µg/mL. Nossos dados in vitro
correlacionam-se com os dados clínicos obtidos por Goodman, et al. (2002)
que descreveram um relato de tricosporonemia em paciente transplantado de
medula óssea, sob terapia de profilaxia com caspofungina. Outros autores
reportaram que caspofungina não apresenta atividade confiável para
tratamento de tricosporonoses (Espinel-Ingroff, et al., 1998b; Cornely, et al,
2002; Walsh, et al., 2004).
Raros são os relatos sugerindo que caspofungina possa atuar em
Trichosporon spp. Madariaga, et al. (2003) descreveram um caso de T. inkin
isolado de líquido peritonial não responsivo a outros antifúngicos, onde o
paciente obteve cura apenas quanto tratado com caspofungina. Bassetti, et al.
(2004) descreveram que caspofungina pode ser eficaz no tratamento de
tricosporonemia. Bassetti, et al. (2004) descreveram um caso de fungemia por
T.asahii em paciente com neutropenia intensa portador de leucemia mielóide
aguda. Este paciente não obteve melhora clínica quando tratado com
fluconazol, voriconazol e anfotericina B em formulação lipossomal. Entretanto,
apresentou sucesso terapêutico com caspofungina combinada à anfotericina B
lipossomal. Não foi informado neste trabalho se o paciente se recuperou da
neutropenia. A utilização de terapia combinada dificulta a análise de qual teria
sido o real valor terapêutico da caspofungina.
Discussão
64
De forma geral, em relação à anfotericina B, parece haver comumente
menor atividade em isolados de T. asahii quando comparados com T. não-
asahii. Quanto aos azólicos, apesar da literatura inferir que T. não-asahii
apresentam CIMs mais elevadas que T. asahii, não encontramos tal diferença
no nosso estudo.
Concluindo, é fundamental que os laboratórios de referência em
Micologia Médica passem a utilizar métodos moleculares para tornar a
identificação de Tichosporon spp. mais acurada.
Baseando-se nos dados in vitro podemos demonstrar que azólicos,
sobretudo, voriconazol, apresentam atividade antifúngica maior que
caspofungina, 5-fluorocitosina e mesmo anfotericina B.
Deste modo, os resultados obtidos no presente estudo nos permitiram
concluir que é de grande relevância clínica que os laboratórios de Micologia
Médica estejam preparados para realizar, além da identificação final da
espécie, o perfil de sensibilidade do isolado em questão, com o objetivo de
detectar o surgimento de isolados resistentes aos antifúngicos e
conseqüentemente contribuir na orientação terapêutica contra tricosporonoses.
São ainda necessários mais estudos clínicos e epidemiológicos para que seja
possível melhor caracterizar a epidemiologia destes agentes emergentes de
infecção oportunista.
6. CONCLUSÕES
_________________________________
Conclusões
6
6
1- O método de identificação fenotípica não foi suficiente para identificação
final em nível de espécie de todos os isolados clínicos incluídos no
presente estudo;
2- A amplificação da região 18S do rDNA foi eficaz na identificação do
gênero de todos os isolados clínicos;
3- O seqüenciamento da região IGS1 foi suficiente para a identificação de
todos os isolados clínicos incluindo espécies geneticamente
relacionadas;
4- Descreveu-se o primeiro caso de fungemia por Trichosporon jirovecci
mostrando que este agente pode adaptar-se ao hospedeiro humano
causando doença invasiva;
5- Quanto ao teste de sensibilidade aos antifúngicos, a correlação entre
microdiluição em caldo e Etest® para anfotericina B foi baixa, sendo a
melhor concordância nas leituras com 48 horas. Os resultados obtidos
sugeriram que Etest® apresentou maior poder discriminatório para
avaliar a sensibilidade de isolados de Trichosporon spp. à anfotericina B;
6- Mesmo utilizando número limitado de cepas, observamos que
caspofungina e 5-fluorocitosina não apresentaram atividade in vitro
contra os isolados clínicos analisados. Os triazólicos apresentaram
melhor padrão de atividade antifúngica, voriconazol demonstrou-se mais
eficaz in vitro que fluconazol e itraconazol contra os isolados de
Trichosporon spp.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. ANEXOS
__________________________________
Anexos
79
Fluconazol Itraconazol 5-Fluorocitosina Voricoconazol Caspofungina
N° da amostra
Espécies
24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h
S1 T. asteroides 0,5 1 1 0,125 0,125 0,125 8 16 32 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
S3 T. coremiiforme 0,125 1 1 0,06 0,125 0,125 2 16 32 0,03 0,03 0,03 8 >16 >16
S4 T. asahii var. asahii 0,5 2 4 0,125 0,125 0,125 8 16 32 0,03 0,03 0,06 >16 >16 >16
S5 T. asahii var. asahii 0,5 2 4 0,125 0,125 0,125 16 32 64 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
S6 T. asteroides 0,125 1 1 0,06 0,06 0,06 8 16 64 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
S7 T. asahii var. asahii 0,5 1 2 0,125 0,125 0,125 32 >64 >64 0,03 0,03 0,06 >16 >16 >16
S8 T. dermatis 0,5 1 2 0,06 0,06 0,06 32 >64 >64 0,06 0,06 0,06 >16 >16 >16
S9 T. asahii var. asahii 2 8 8 0,125 0,125 0,25 16 64 >64 0,03 0,03 0,06 >16 >16 >16
S10 Trichosporon jirovecii 0,5 1 2 0,06 0,06 0,125 0,5 4 8 0,03 0,03 0,03 8 16 >16
S11 T. asahii var. asahii 0,25 0,25 1 0,03 0,03 0,03 16 64 >64 0,03 0,03 0,03 16 16 >16
S12 T. asahii var. asahii 0,5 0,5 1 0,06 0,06 0,06 16 64 >64 0,03 0,03 0,03 16 16 >16
S13 T. asteroides 0,5 0,5 1 0,03 0,03 0,06 8 16 32 0,03 0,03 0,03 16 >16 >16
S14 T. asahii var. asahii 0,5 0,5 1 0,03 0,03 0,06 16 32 >64 0,03 0,03 0,03 8 >16 >16
S15 T. asahii var. asahii 1 2 2 0,06 0,06 0,06 16 32 >64 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
S16 T. asahii var. asahii 1 2 2 0,06 0,06 0,06 16 32 >64 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
S18 T. asahii var. asahii 1 1 2 0,06 0,06 0,125 16 32 64 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
S19 T. asahii var. asahii 1 1 2 0,03 0,06 0,125 4 8 32 0,03 0,03 0,06 >16 >16 >16
S20 T. asteroides 0,5 1 1 0,03 0,06 0,125 8 16 32 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
S21 T. asahii var. asahii 8 8 8 0,125 0,125 0,25 8 16 32 0,03 0,03 0,125 >16 >16 >16
S22 T. asahii var. asahii 0,5 1 2 0,125 0,125 0,25 8 16 32 0,06 0,06 0,125 >16 >16 >16
S23 T. asahii var. asahii 1 2 4 0,125 0,125 0,25 4 4 8 0,03 0,03 0,03 8 >16 >16
S24 T. asteroides 0,125 0,5 1 0,06 0,06 0,125 8 16 32 0,03 0,03 0,03 2 >16 >16
S25 T. asahii var. asahii 0,5 0,5 1 0,03 0,06 0,125 16 64 >64 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
% Sensibilidade
100 100 100 100 100 82,6 17,4 8,7 0 100 100 100 0 0 0
CIM50
0,5 1 2 0,06 0,06 0,125 8 16 64 0,03 0,03 0,03 >16 >16 >16
CIM90
1 2 4 0,125 0,125 0,25 16 64 >64 0,03 0,03 0,06 >16 >16 >16
Range
0,125->8 0,25->8 01,-08 0,03-0,125 0,03-0,125 0,03-0,25 0,5->32 4->64 8->64 0,03-0,06 0,03-0,06 0,03-0,125 2->16 16->16 >16
Anexo 1. CIMs dos antifúngicos por microdiluição em caldo e Etest® para os isolados clínicos de
Trichosporon spp.
Chagas-Neto, Thomas Cardoso
Caracterização microbiológica de isolados clínicos de Trichosporon spp. /
Thomas Cardoso Chagas Neto – São Paulo, 2007.
xvii 77f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista
de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Microbiological caracterization of clinical isolates of
Trichospororn spp.
1. Trichosporon spp. 2. Identificação fenotípica 3. Identificação genotípica 4.
Etest® 5. Microdiluição em caldo
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