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Universidade Federal Fluminense
Centro de Ciências Médicas
Faculdade de Medicina
Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas
Avaliação da qualidade nutricional de duas variedades de soja
e a influência de seu consumo nos indicadores de doenças
cardiovasculares em ratos senis
JULIO BELTRAME DALEPRANE
Niterói
2007
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JULIO BELTRAME DALEPRANE
Avaliação da qualidade nutricional de duas variedades de soja
e a influência de seu consumo nos indicadores de doenças
cardiovasculares em ratos senis
Programa de Pós–Graduação em Ciências Médicas
Área de Concentração: Ciência da Saúde
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense para a
obtenção do grau de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. GILSON TELES BOAVENTURA
Co-orientador: Prof. Dr. MAURICIO ALVES CHAGAS
Niterói
2007
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D 139 Daleprane, Julio Beltrame
Avaliação da qualidade nutricional de duas variedades de
soja e a influência de seu consumo nos indicadores de doenças
cardiovasculares em ratos senis./ Julio Beltrame Daleprane/
Niterói, 2007.
P135,30cm
Dissertação Mestrado (Programa de Pós –Graduação em
Ciências Médicas). Universidade Federal Fluminense,2007
Bibliografia: p. 95
1 soja, alimento funcional, doença cardiovascular I. Título
CDD 613.28
JULIO BELTRAME DALEPRANE
Avaliação da qualidade nutricional de duas variedades de soja
e a influência de seu consumo nos indicadores de doenças
cardiovasculares em ratos senis
Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação
em Ciências Médicas da Universidade Federal
Fluminense para a obtenção do grau de Mestre.
Aprovada em 06 de julho de 2007.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________
Prof Dr Luiz Antonio dos Anjos
Departamento de Nutrição Social/UFF
____________________________________________________
Prof
a
Dr
a
Renata Brum Martucci
Instituto de Nutrição/UERJ
____________________________________________________
Prof
a
Dr
a
Sílvia Maria Custódio das Dôres
Departamento de Nutrição e Dietética
___________________________________________________
Orientador: Prof. Dr.Gilson Teles Boaventura
Departamento de Nutrição e Dietética/UFF
___________________________________________________
Co-Orientador: Prof. Dr.Mauricio Alves Chagas
Departamento de Morfologia/UFF
Niterói
2007
Dedico este trabalho a uma das pessoas mais
maravilhosas do mundo. Uma pessoa que viu este
sonho crescer e comemorou com minhas vitórias, e
certamente está vibrando com mais esta. Ofereço
este trabalho a minha mãe, Vera Lucia Beltrame
Daleprane, que com sua simplicidade e sabedoria
soube educar seus filhos, muitas vezes em
detrimento de suas realizações. No entanto, sei que
hoje você também esta vibrando comigo pois sabe
que isto é fruto do seu amor e dedicação, te amo
mãe.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador e amigo Gilson Teles Boaventura, que durante todos estes anos de
trabalho, me ensinou que as dificuldades de se fazer pesquisa devem ser vistas como um
desafio e não uma barreira. Gostaria de deixar o meu mais sincero agradecimento pela
contribuição a minha formação profissional e compartilhar mais uma vitória, das muitas
que virão. Muito obrigado Prof.
Aos meus pais, Vera Lucia Beltrame Daleprane e Nelson José Daleprane, pelo exemplo
de vida e encorajamento nos momentos de fraqueza. Sempre me apoiando em busca dos
meus sonhos.
Aos meus irmãos Melania Beltrame Daleprane Nascimento, Olívio Beltrame Daleprane e
Paulo Henrique Magliano Nascimento pelo incentivo e amizade. Agradeço ainda a coisa
mais linda do mundo, meu sobrinho Henrique que nos encanta a cada dia.
À minha linda família a qual sem ela nada disso seria possível, o meu mais sincero
agradecimento aos meus tios, tias, amigos e amigas.
Ao meu amor Irene Chaves dos Santos por todo o carinho, dedicação e compreensão
durante esta jornada, sabendo dividir os momentos de alegria e tristeza e me aturando
com os meus ratinhos. Agradeço também Sandra Vasconcellos Chaves, Helena Chaves
dos Santos e Marie Chaves dos Santos, assim como toda família, pelo carinho e apoio
nestes anos de convivência.
Ao Laboratório de Nutrição Experimental, assim como todos que trabalham e já passaram
por lá, que de alguma forma compartilharam um pouquinho de sua sabedoria conosco.
Agradeço a Juliana Tomaz, Tatiana Feijó, Carolina Fogel, Carolina Meano, Lavínia
Soares, Ana Maria Lucas, Rose, Seu Arindo, Clésio, Solange. Infelizmente não tenho
como colocar o nome de todos, mas gostaria de agradecer do fundo do coração aos bons
e maus momentos compartilhados neste laboratório, que sem dúvida se tornou minha
segunda casa.
Ao Co-orientador Prof. Maurício, pela ajuda e atenção prestada durante este trabalho,
assim como todos funcionários e alunos do Laboratório de Biomorfologia Celular e
Extracelular/UFF, principalmente a bolsista Laís Lisboa.
Aos Professores, e hoje colegas de trabalho, da Faculdade de Nutrição/UFF, pela força e
incentivo dado durante esta caminhada.
Às instituições de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) pela bolsa; A Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio de Janeiro pelo financiamento, processo n°
E26/171173/2002/APQ1;
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
financiamento, processo n° 479452/0004-2
Descobri como é bom chegar
quando se tem paciência. E para se
chegar, onde quer que seja, aprendi
que não é necessário dominar a
força, mas sim a razão. É preciso,
antes de mais nada querer.”
(Amyr Klink)
Sumário pág
CAPA...................................................................................................................
i
FOLHA DE ROSTO.............................................................................................
ii
FOLHA DE APROVAÇÃO...................................................................................
iii
DEDICATÓRIA………………………………………………………………………...
iv
AGRADECIMENTOS...........................................................................................
v
EPÍGRAFE...........................................................................................................
vi
SUMÁRIO............................................................................................................
viii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES..................................................................................
ix
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................
x
RESUMO.............................................................................................................
xi
ABSTRACT..........................................................................................................
xii
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................
13
2. REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................
16
3. OBJETIVOS.....................................................................................................
35
3.1 Objetivo Geral............................................................................................
35
3.2 Objetivos Específicos................................................................................
35
4.MATERIAS E MÉTODOS.................................................................................
36
4.1 Animais......................................................................................................
36
4.2 Delineamento Experimental.......................................................................
37
4.3 Rações.......................................................................................................
37
4.4 Composição centesimal e determinação de isoflavonas..........................
41
4.5 Métodos de avaliação biológica.................................................................
43
4.6 Métodos Bioquímicos................................................................................
44
4.7 Métodos Histológicos.................................................................................
49
4.8 Método Estatístico................................... .................................................
50
5. RESULTADOS................................................................................................
51
5.1 Caracterização das matérias primas utilizadas como fonte de proteína.......
51
5.2 Caracterização das rações usadas no experimento......................................
52
5.3 Consumo de ração, proteína, isoflavonas, energia e variação de peso
corporal........................................................................................................
56
5.4 Avaliação biológica das proteínas.................................................................
60
5.5 Dados bioquímicos........................................................................................
64
5.6 Histologia......................................................................................................
66
6. DISCUSSÃO....................................................................................................
74
7.CONCLUSÃO...................................................................................................
94
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................
95
9. APÊNDICE .....................................................................................................
118
9.1 Artigo1........................................................................................................
119
10. ANEXO..........................................................................................................
131
10.4 Aprovação do Comitê de ética e Pesquisa...............................................
132
Lista de Ilustrações Pág.
Figura 1 Fluxograma do tratamento térmico aplicado aos grãos de soja.................... 39
Figura 2 Representação gráfica do cromatograma da solução contendo padrões de
daidzina, glicitina, genistina, daidzeína e genisteína....................................
54
Figura 3 Representação gráfica dos cromatogramas das duas diferentes rações à
base de soja, utilizadas no experimento........................................................
55
Figura 4 Gráfico dos valores de PER dos grupos ao 28° dia de
experimento....................................................................................................
61
Figura 5 Gráfico dos valores de IC dos grupos no 291° dia de
experimento...................................................................................................
62
Figura 6 Representação gráfica dos valores de IC dos grupos no 455° dia de
experimento....................................................................................................
63
Figura 7 Reprodução das fotomicrografias das túnicas da aorta dos grupos
estudados......................................................................................................
68
Figura 8 Espessura (µm) tecidual da camada média e intima da artéria aorta
coronariana...................................................................................................
69
Figura 9 Espessura (µm) tecidual da camada adventícia da artéria aorta
coronariana....................................................................................................
70
Figura 10 Espessura (µm) da artéria aorta (intima, média e adventícia) coronariana
dos grupos estudados....................................................................................
71
Figura 11 Reprodução das fotomicrografias dos ventrículos esquerdos dos grupos
estudados.......................................................................................................
72
Figura 13 Porcentagem (%) de colágeno presente no VE dos animais.........................
73
Tabela 01 Percentual de nutrientes adicionadas para o preparo das rações durante a
experimentação e valor calórico total das respectivas rações
(g/100g)..........................................................................................................
40
Tabela 02 Composição centesimal (%) de macronutrientes da caseína, farinha de
soja orgânica e a farinha da soja geneticamente
modificada......................................................................................................
52
Tabela 03 Composição química centesimal das rações utilizadas no experimento
representada em g/100g de dieta..................................................................
53
Tabela 04. Concentrações das isoflavonas (daidzina, glicitina, genistina, daidzeína e
genisteína) nas rações à base de soja (µ/g de ração)...................................
55
Tabela 05 Consumo de ração (g) e peso corporal (g) dos momentos correspondentes
ao 0°, 28°, 291° e 455° dias de experimento................................................
57
Tabela 06 Consumo de proteína no 28°, 291° e 455° dia de experimento e consumo
médio diário de energia por peso corporal (Kcal/g/dia).................................
58
Tabela 07
Consumo médio diário de Isoflavonas (daidzina, glicitina, genistina,
daidzeína e genisteína) no período de 455 dias dos grupos que
consumiram ração à base de soja (µg/dia)....................................................
59
Tabela 08 Valores das análises bioquímicas de hematócrito, hemoglobina, albumina,
proteínas totais, colesterol, triglicerídeos, insulina e glicose dos grupos
experimentais ao final do experimento (455
dias)................................................................................................................
65
Tabela 09 Valores de peso (g) do coração, ventrículo esquerdo (VE), relação
coração/peso corporal, relação VE/coração e peso da gordura perirenal,
periepididimal e retroabdominal.....................................................................
66
Lista de Abreviaturas
WHO World Health Organization
CP4 EPSPS enolpiruvilchimato-3-fosfato-sintetase
rr
RoundUP Ready
OGM
Organismo Geneticamente Modificado
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
RNA
Ácido Ribonucléico
MEC
Matriz Extra Celular
PER Protein Efficiency Ratio
IC
Índice de Crescimento
TG
Triglicerídeos
HDL
Lipoproteína de alta densidade
LDL
Lipoproteína de baixa densidade
VLDL
Lipoproteína de muito baixa densidade
VE
Ventrículo Esquerdo
LABNE
Laboratório de Nutrição Experimental
UFF
Universidade Federal Fluminense
GC
Grupo Controle
GO
Grupo Soja Orgânica
GG
Grupo Soja Transgênica
RPM
Rotações por Minuto
VE
Ventriculo Esquerdo
AIN American Institute of Nutrition
FDA Food and Drug Administration
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TNF-β
Fator de crescimento transformador beta
EGF
Fator de crescimento epidérmico
PDGF
Fator de crescimento plaquetário
PTK
Proteína tirosina quinase
TBARS
Ácidos tiobarbiturico
LOX
Lipooxigenase
UFF
Universidade Federal Fluminense
Resumo
O processo de envelhecimento do organismo promove alterações morfofisiológicas que
propiciam o aparecimento de doenças, dentre elas as relacionadas ao sistema
cardiovascular. A alimentação exerce grande influência neste processo, sendo consenso
que o consumo de soja pode agir como um fator protetor na prevenção destas doenças. O
objetivo desse estudo foi avaliar a qualidade nutricional de duas variedades de soja
(orgânica e geneticamente modificada) bem como a influência do seu consumo e de suas
propriedades funcionais nos indicadores de doenças cardiovasculares. Foram utilizados
30 ratos, divididos em 3 grupos (n=10), sendo: GC-recebendo ração à base de caseína;
GO- recebendo ração à base de soja orgânica; GG- recebendo ração à base de soja
geneticamente modificada. Todos consumiram água e rações ad libtum durante todo o
período. Para o preparo das rações foi realizada a composição centesimal das matérias
primas e dos constituintes das rações, assim como as concentrações de isoflavonas das
rações, sendo as rações isocalóricas e isoprotéicas. Foram coletados dados de peso,
consumo de ração e de proteína 3x por semana para determinar o Protein Efficacy Ratio
(PER) e o Índice de Crescimento (IC). Ao final de 455 dias, os animais foram sacrificados
para a determinação das concentrações séricas de colesterol total, triglicerídeos,
hematócrito, hemoglobina, proteínas totais e albumina (Kits da BIOCLIN) , insulina e
glicose (Kits da Gold Analiza). Retirou-se ainda um segmento da aorta, para determinação
da espessura das túnicas e do coração, para aferição da área ocupada por colágeno
(V
vi(i%)
) existente no ventrículo esquerdo, para tal utilizou-se a grade M-42. Ambos os
tecidos foram fixados em formalina de Millonnig e sofreram processamento até a
coloração, onde logo foram capturadas imagens para posterior análise. Aos resultados
aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis ao nível de p 0,05 através do software S-Plus Versão
6.0. Observou-se que as sojas utilizadas para o experimento possuíam composição
centesimal semelhantes e que as rações ofertadas tinham o mesmo percentual de
macronutrientes assim como teor semelhante de isoflavonas. Aos 28 dias de experimento
o PER do GO foi superior (p<0,00008) ao GG, sendo o GC superior a ambos. Já no 291° o
IC dos grupos a base de soja (GO e GG) foram semelhantes ao GC, o mesmo foi
observado no 455° dia. Ao final do experimento, as concentrações de hematócrito
(p<0,04) e hemoglobina (p<0,03) foram inferiores nos grupos à base de soja, em relação
ao GC. Já os valores de proteínas totais, albumina e insulina não tiveram diferença entre
os grupos.Os dados de colesterol (p<0,0001), triglicerideos (p<0,0072) e glicose
(p<0,0013) foram inferiores no GO e no GG comparados ao GC. As túnicas da aorta dos
grupos GO e GG foram inferiores (p<0,0095) ao GC, no entanto apresentavam a mesma
quantidade de colágeno no ventrículo esquerdo. Concluiu-se que ambas as sojas foram
eficazes na substituição da proteína animal na fase que compreende a senilidade não
apresentando diferenças entre as duas variedades. A soja mostrou-se como uma
importante alternativa para a prevenção de doenças cardiovasculares.
Palavras-chave: soja orgânica, soja geneticamente modificada, proteína, doenças
cardiovasculares
Abstract
The organism’s aging process promotes morphophysiological alterations that lead to
diseases including those related to the cardiovascular system. Nutrition has a great
influence in this process, and it is a consensus that the consumption of soybean can act as
a protection factor in preventing these diseases. The objective of this study was to evaluate
the nutritional quality of two varieties of soybean (organic and genetically modified) as well
as the influence their consumption has and their functional properties in cardiovascular
disease indicators. Thirty rats were used, divided into 3 groups (n = 10): GC-casein-based
ration; GO-organic soybean-based ration; GG-genetically modified soybean-based ration.
They all received water and rations ad libtum throughout the entire period. For the
preparation of the rations, the centesimal composition of the raw substances and the
constituent of the rations were carried through, as well as the concentrations of isoflavones
of the rations, that were isocaloric and isoproteic. Data were collected on weight, ration
consumption and protein three times per week to determine PER and IC. At the end of 455
days, the animals were sacrificed to determine the seric concentrations of cholesterol,
triglycerides, hematocrit, hemoglobin, total proteins and albumin (BIOCLIN Kits), insulin
and glucose (Gold Analiza Kits). A segment of the aorta was also removed to determine
tunic and heart thickness. Grade M-42 was used to check the collagen’s area (V
vi(i%)
) in the
left ventricle. Both tissues were fixed in Milong formalin and underwent processing until
coloration, when images were taken for subsequent analysis. The Kruscal-Walis test was
applied to the results at a p 0.05 level using S-Plus R 1.5 Version 6.0 software. We
observed that the soybeans used in the experiment were similar and that the rations had
the same composition of macro-nutrients as well as isoflavones. After 28 days of the
experiment the GO’s PER was higher (p<0.00008) than the GG’s, and GC’s was higher
than both. On the 291
st
day we observed that the IC of the soybean-based group (GO and
GG) were similar to GC, which was also observed on the 455
th
day. At the end of the
experiment, the hematocrit (p<0.04) and hemoglobin (p<0.03) levels were lower in the
soybean-based groups compared to the GC. The values for total proteins, albumin and
insulin showed no difference among the groups. The cholesterol (p<0.0001), triglyceride
(p<0.0072) and glucose (p<0.0013) data were lower in GO and GG compared to GC. The
histology revealed that the endothelium in the GO and GG groups were lower (p<0.0095)
than the GC, however they presented the same amount of collagen in the left ventricle. We
concluded that both soybeans were effective in replacing animal protein in the phase that
encompasses senility and no differences were revealed in the two varieties. The soybean
also proved to be an important alternative for the prevention of cardiovascular disease.
Key words: organic soybean, genetically modified soybean, protein, cardiovascular
disease.
1 INTRODUÇÃO
Uma das maiores mudanças observadas na área da saúde, no século XX, foi o
aumento da longevidade do ser humano, sendo que hoje a expectativa de vida equivale a
quase o dobro da idade alcançada no início do século passado. Os avanços na área da
saúde proporcionam o aumento da representatividade dos idosos na pirâmide etária e,
segundo a World Health Organization (WHO, 2000) com o passar dos anos, haverá
mudança na distribuição demográfica mundial caracterizada principalmente pelo aumento
da porcentagem da população idosa.
Com isso, é imprescindível uma adaptação da sociedade a essa nova realidade,
possibilitando uma melhor qualidade de vida para os idosos, atendendo principalmente
suas necessidades na área da saúde. Todos os processos vinculados ao envelhecimento
encontram-se relacionados à diminuição dos mecanismos envolvidos na manutenção da
homeostase, implicando num decréscimo da viabilidade ou aumento da vulnerabilidade ao
estresse (Knight, 2000).
Dentre as alterações encontradas com o avanço da idade observa-se a queda na
eficiência de algumas funções fisiológicas, como ocorre com o sistema cardiovascular,
onde pode ser observado aumento da pressão arterial, hipercolesterolemias, hipertrofia
ventricular esquerda, remodelamento de artérias, dentre outras (Wickens, 2001).
A dieta possui um importante papel na atenuação e no aparecimento destas
doenças. Assim, manter uma alimentação equilibrada com o consumo regular de frutas e
verduras oferece benefícios em longo prazo, trazendo consigo uma melhor qualidade de
vida. Por isso, há um grande interesse da comunidade científica em estudar alimentos que
apresentem grande influência na prevenção e/ou tratamento de doenças crônicas, dentre
elas as que se desenvolvem de acordo com a idade.
Dentre os alimentos mais pesquisados está a soja, esta leguminosa apresenta
fibras, alta qualidade protéica e fitoestrógenos denominados isoflavonas. Existem
evidencias científicas que a soja atua na prevenção e/ou terapêutica de uma série de
doenças dentre elas vários tipos de câncer (mama, útero, próstata), diabetes tipo II,
doença renal crônica e doenças cardiovasculares. Por este motivo, a soja é considerada
um alimento funcional (Pereira & Abdala, 2006).
Estes benefícios à saúde vêm sendo verificados na soja convencional e orgânica.
Esta última é cultivada livre de produtos químicos e desperta grande interesse por parte de
consumidores que se sentem desconfortáveis em consumir alimentos que contenham
produtos sintéticos, ou que tenham passado por algum tipo de modificação genética, como
é o caso da soja Roundup Ready
®
(rr). A esta variedade foi inserido um gene que lhe
confere características especiais, no entanto pouco se sabe sobre seus aspectos
nutricionais e seus efeitos no organismo humano e no meio ambiente. Ainda há dúvidas se
a modificação genética causaria efeitos adversos em gerações futuras.
Devido à falta de estudos que apresentem informações das conseqüências do
consumo da soja orgânica e geneticamente modificada quando consumida durante toda
vida e suas possíveis ações terapêuticas. Este estudo avaliará a influência do consumo
destas variedades de soja sobre o crescimento, desenvolvimento e indicadores de
doenças cardiovasculares de ratos Wistar senis quando utilizada em substituição a
proteína animal.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ENVELHECIMENTO
O envelhecimento pode ser visto como uma inadequação dos mecanismos
homeostáticos que progressivamente diminuem a adaptação do organismo às alterações
do meio, culminando na falência do sistema e consequentemente na sua morte (Fontana
& Klein, 2007).
Os motivos e as formas pela quais estas alterações ocorrem ainda não são
conhecidos, mas algumas teorias tentam elucidar o processo de envelhecimento, como é
o caso da teoria dos eventos estritamente programados (Fu et al., 2002), segundo a qual o
envelhecimento e a morte seriam estágios programados numa seqüência que se inicia
com a fertilização; e a dos acúmulos de erros ao acaso (Slowinska & Wadolowska, 2003),
que justifica o envelhecimento como o resultado do acúmulo de erros durante a síntese de
macromoléculas ou do material genético que, quando ampliados, levam à morte do
organismo. Apesar das duas teorias serem distintas, elas não são totalmente excludentes,
podendo-se postular a complementação de uma teoria pela outra.
Várias outras linhas de pesquisa também se propõem a explicar o envelhecimento
baseando-se nas falhas do controle genético e do sistema imunológico, mutações
somáticas, formação exarcebada de radicais livres, ligações cruzadas (“cross-linkage”) e
em causas metabólicas (Hashimoto et al., 2002).
A teoria baseada no acúmulo de erros recebeu grande estímulo a partir da “Teoria
da Catástrofe” postulada por Orgel em 1970. O autor propôs que erros na síntese de
proteínas poderiam ser ampliados, levando a um aumento na síntese de proteínas
alteradas e, consequentemente, à inviabilidade celular. Sabe-se que a alteração de
componentes intracelulares importantes leva a uma modificação da funcionalidade celular.
Apesar da ocorrência desses erros já estar conhecida no tocante ao processamento da
informação genética (DNA, RNA, proteínas), nenhum trabalho conseguiu evidências de
que estes erros seriam os únicos responsáveis pelo envelhecimento. É certo, no entanto,
que uma gama de anormalidades cromossômicas é encontrada em células de indivíduos
senescentes (Knight, 2000).
A formação de radicais livres, substâncias altamente instáveis e de alto potencial de
oxidação, também pode apresentar-se aumentada pelas modificações enzimáticas da
célula, ou pela influência de fatores externos como doenças, cigarro, drogas e radiação.
Da mesma forma, os mecanismos enzimáticos de neutralização dos radicais livres (como
as enzimas Superóxido dismutase, Glutationa peroxidase e Catalase) podem se encontrar
danificados. O desequilíbrio entre a produção e neutralização dos radicais livres e o
conseqüente estresse oxidativo gerado pode levar a lesão de diversas moléculas como
proteínas, ácidos graxos e ácidos nucléicos. De acordo com Wickens (2001) a ação dos
radicais livres pode explicar grande parte das mudanças ocorridas no organismo com o
passar dos anos. Assim, o acúmulo destas moléculas alteradas pode promover ou
exacerbar o processo de envelhecimento.
Dentro de todos os ciclos de vida de um organismo, as fases sucedem-se de forma
harmoniosa e interdependente. Quando certa estabilidade orgânica é atingida, como
ocorre na fase adulta, à tendência natural é iniciar-se uma etapa regressiva, ocorrendo
assim a diminuição lenta e progressiva da reserva funcional dos sistemas orgânicos.
Assim, alguns autores definem o envelhecimento ou senescência como sendo os
processos que direcionam para a perda progressiva das condições fisiológicas e
consequente diminuição da capacidade funcional geral (Fujino et al., 2006, Gachon et al.,
2006, Gauger & Sancar, 2005).
Já são bem descritas pela literatura as alterações fisiológicas no sistema
cardiovascular decorrentes do envelhecimento e dentre elas destacam-se a diminuição do
débito cardíaco (DC) e da diferença artério venosa de oxigênio (A-
V
O
2
dif) com
conseqüente diminuição do consumo máximo de oxigênio (
V
O
2
máx), hipertrofia ventricular
esquerda, aumento da síntese de colágeno, espessamento das túnicas, redução da
elasticidade arterial e aumento da resistência vascular periférica. (Crasset et al., 2001;
Migliaro et al., 2001; Catai et al., 2002; Talbot et al., 2000).
2.2 DOENÇAS CARDIOVASCULARES
O miocárdio é formado por uma estrutura tridimencional de colágeno fibrilar que tem
uma série de funções importantes para a integridade do tecido, eficiência da bomba
sistólica muscular e função da bomba de sucção diastólica. O acúmulo adverso de
proteína estrutural na Matriz Extra Celular (MEC) compromete a rigidez do tecido e afeta
adversamente a viscoelasticidade do miocárdio, isto leva a disfunção ventricular diastólica
e sistólica (Burlew & Weber, 2000).
Além disso, a distribuição da população de cardiomiócitos, que depende do
equilíbrio do processo de proliferação, migração e redução celular (apoptose), para se dar
de forma harmônica, depende de que meio extracelular ou a MEC também se desenvolva,
acompanhando e garantindo a distribuição espacial dos cardiomiócitos (Scott et al., 2003;
Tsuruda et al., 2004; de Souza et al., 2003; Gonzáles et al., 2002).
No coração, a MEC consiste de uma rede de fibras de colágeno que se distribuem
de forma quase paralelas e estão intimamente conectadas com os miócitos. A modulação
do desenvolvimento dos colágenos da MEC do coração ocorre basicamente pela síntese
de colágeno através de fibroblastos e por sua digestão através da ação de
metaloproteinases de matriz. Tal processo de modulação, acúmulo ou redução de
colágeno, é dependente da idade (ou fase de desenvolvimento), da nutrição e do gênero.
Uma vez que cada modulação seja alterada, ocorre inadequação da população de
cardiomiócitos em relação ao seu tecido de sustentação, que pode levar, em alguns
casos, a hipertrofia ventricular e a falência cardíaca (Tsuruda et al., 2004; de Souza et al.,
2003; Gonzáles et al., 2002).
O colágeno é uma que mostra mudanças definidas conforme a idade, e ainda
relação direta com o processo de envelhecimento. O aumento no conteúdo total de
colágeno de certos tecidos tem se relacionado com o aumento da idade (Benedicto &
Bombonato, 2003).
Segundo Consolim-Colombo & Atala (2004), o ventrículo esquerdo (VE) é a
estrutura de maior comprometimento em cardiopatias compensatórias, onde sua estrutura
composta por cardiomiócitos e matriz extracelular pode sofrer grande modificação na
forma e quantidade destes componentes. Estes mesmos autores observaram aumento de
26% no peso do VE em pacientes com hipertensão arterial, em relação ao grupo controle,
pessoas saudáveis.
Knaapen et al. (2004) estudando o tecido muscular cardíaco de 12 individuos e , em
especial, as fibras de colágeno, demonstrou que há diferenças na quantidade e tipos de
fibras de colágeno entre corações de jovens e velhos. A perda de miócitos poderia ser
uma causa da acumulação de colágeno, outro possível mecanismo para acumulação de
colágeno com a idade poderia ser uma inibição de degradação de colágeno. Assim, o
aumento do colágeno miocárdico pode contribuir para a diminuição da elasticidade
ventricular com a idade.
De acordo com o avanço da idade, as alterações cardiovasculares são também
evidentes na aorta e nas grandes artérias. Estas apresentam paredes muito elásticas que
se distendem com a sístole e impulsionam o sangue para as artérias, artériolas, capilares
e veias, fenômeno que se dá durante a sístole ventricular e continua durante a diástole
ventricular. Isto representa na prática, um segundo impulso de grande importância até os
50 anos de idade, quando então a aorta e as grandes artérias vão perdendo a sua
elasticidade e aumentam a rigidez pela infiltração do colágeno (Luna et al., 2002).
A elasticidade dos vasos mantém a pressão sistólica em níveis normais, e a perda
dessa capacidade contribui para a elevação dos níveis pressóricos na idade mais
avançada. Este fenômeno tornou-se mais importante quando recentes estudos mostraram
que a rigidez desses vasos, condiciona o aumento da pressão arterial sistólica, enquanto a
pressão arterial diastólica tende a ficar normal ou até baixar devido à redução da
complacência dos vasos de grande capacitância (Bertelmann et al., 2006), conduzindo a
níveis de hipertensão mais comum nos idosos, chamada de hipertensão sistólica isolada.
Ainda de acordo com Jun et al. (2005) e Heiss et al. (2006), o envelhecimento leva
a alteração na estrutura e função vascular através da hiperplasia da camada íntima do
vaso e do desarranjo na ordem da disposição da elastina na camada média do vaso. Em
função disso verifica-se um espessamento da parede arterial o que aumenta os níveis de
pressão arterial.
Segundo Li et al., (2007) vários fatores interferem para o agravamento destes
processos, dentre estes está o estilo de vida, com grande influência da alimentação. A
qualidade e quantidade do alimento ingerido vão influênciar diretamente em situações
adaptativas, podendo gerar danos irreversíveis através de sobrecargas em órgãos
essenciais.
Temos ainda, de acordo com alguns autores (Aoyama et al., 2000; Madani et al.,
2000), a clara associação entre dislipidemia e aumento do risco de morte por doenças
cardiovascular. A elevação dos níveis plasmáticos de colesterol de baixa densidade (LDL-
c), a redução dos níveis de colesterol de alta densidade (HDL-c) e também o aumento dos
triglicérides (TG) são fatores de risco para eventos cardiovasculares, sendo esta a
principal causa de morte no mundo (Magalhães et al. 2004). O Brasil acompanha este
fenômeno internacional, apresentando estatísticas onde as principais causas de morte são
as doenças cardiovasculares, com valores percentuais em torno de 25%, repensáveis por
cerca de 250.000 mortes ao ano (Chiara et al., 2002).
Grande parte do colesterol circulante é sintetizado no próprio organismo a partir de
ácidos graxos, sendo que aproximadamente 1/3 é proveniente da dieta (Stipanuk, 2000).
O controle da concentração sérica do colesterol ocorre principalmente através da
regulação da captação das LDL-c, que são umas das principais transportadoras do
colesterol endógeno. O aumento da quantidade de LDL-c (que pode ser monitorado pela
dosagem da sua proteína, a apoB-100), bem como o aumento da quantidade de colesterol
que as mesmas carream, representam igualmente um quadro de risco para gênese da
aterosclerose (Dietschy, 1997). Os mecanismos envolvidos no desenvolvimento e na
progressão da aterosclerose continuam incertos. Nos últimos anos, várias evidências
experimentais têm mostrado que a modificação oxidativa da LDL-c e de outras
lipoiproteínas é uma etapa crucial na patogênese da aterosclerose (Esterbauer et al.,
1992; Ye et al., 2006).
Assim, as dislipidemias são distúrbios metabólicos que afetam os níveis das
lipoproteínas circulantes. Quando neste quadro está aumentado a concentração sérica de
colesterol pode-se dizer que o indivíduo tem uma hipercolesterolemia. As dislipidemias
podem estar associadas a fatores genéticos ou ambientais, como tabagismo,
sedentarismo, abuso de álcool e principalmente dieta incorreta.
2.3 DIETA X DOENÇAS CARDIOVASCULARES
As mais recentes recomendações do National Cholesterol Education Program
(NCEP, 2002) sobre as modificações da dieta, se tornaram ainda mais exigentes do que
as anteriormente adotadas (NCEP, 1987); Com adoção da ingestão diária máxima de 7%
da energia na forma de ácidos graxos saturados (anteriormente 10%) e de menos de 200
mg de colesterol (anteriormente 300 mg). Além disso passa a recomendar o consumo de
fibra alimentar solúvel (10-25% mg/dia) e fitoesteróis (2 mg/dia) como agentes redutores
de LDL-c , pricipal alvo das terapias redutoras de riscos de doenças cardiovasculares.
Embora o colesterol da dieta não represente um fator considerável do nível
plasmático de colesterol, devido aos mecanismos de controle de sua síntese, vários outros
fatores dietéticos podem colaborar para o controle desse nível.
Componentes da dieta como as fibras solúveis (em especial a Beta-glucana
presente na fibra da aveia), o perfil de ácidos graxos (mono e poliinsaturados), as várias
substâncias com efeito antioxidante oriundas de vegetais (isoflavonas de soja, fitoesteróis,
tocotrienóis, alicina) e proteínas de origem vegetal têm sido relacionados a um efeito
hipolipemiante (ou especificamente hipocolesterolemizante), (Bidlack, 2000).
A ação da proteína de vegetais na diminuição do colesterol em ratos, hamsters e
coelhos, vêm sendo relatados e, mais recentemente, testes em humanos substituindo
proteína animal por proteína de soja, têm alcançado valores significativos de redução de
lipídeos plasmáticos. No entanto, os mecanismos deste efeito são ainda controversos
(Sarwar & Ratnayake, 2000).
Diversos trabalhos investigam os efeitos de diferentes fontes protéicas no perfil
lipídico de animais experimentais. A maioria destes trabalhos encontrou um efeito
hipocolesterolemizante das proteínas de soja quando comparado com a caseína do leite
(Anderson et al., 1995; Aoyama et al., 2000; Carrol & Kurowska, 1995; Madani et al.,
2000).
Estudos em que uma mistura de aminoácidos reproduzia a composição da proteína
da soja não alcançaram os mesmos efeitos nos níveis de colesterol dos animais,
sugerindo que algum outro componente não-protéico estaria presente nos isolados de soja
parcialmente purificados (Nagata et al., 1982; Tasker & Porter, 1993). Mandani et al.
(2000) preparam um isolado protéico de soja altamente purificado, e não obtiveram
diminuição na colesterolemia total em ratos, embora algumas alterações no número de
partículas LDL-c e HDL-c tenham sido observadas. Segundo Terpstra et al. (1984) os
fitoestrógenos reduzem as concentrações de LDL-c e a taxa de colesterol total sanguíneo
em animais e humanos.
Kirk et al. (1998) conduziram um estudo para determinar se as isoflavonas de soja
conferem proteção contra a arteroesclerose em camundongos e se elas reduzem os níveis
de colesterol sérico e oxidação de lipoproteínas. Camundongos deficientes em receptores
para LDL-c (LDL-r-null) e camundongos C57BL/6 foram alimentados com dietas baseadas
em proteína de soja, ricas em gordura e com isoflavonas presentes (IF+), ou dietas nas
quais as isoflavonas e possivelmente outros componentes, foram extraídos (IF-). Devido
ao fato de os animais LDL-r-null desenvolverem arteroesclerose e hipercolesterolemia
após um tempo mínimo de exposição à dietas ricas em gorduras, eles foram alimentados
por 6 semanas enquanto que os C57BL/6 foram alimentados por 10 semanas. Os níveis
plasmáticos de colesterol não diferiram entre LDL-r-null alimentados com IF- e aqueles
alimentados com IF+, mas foram 30% menores nos camundongos C57BL/6 alimentados
com dieta IF+ do que naqueles alimentados com dieta IF-. A susceptibilidade da LDL-c à
modificações oxidativas, não foi alterada pelo consumo de isoflavonas. Todos os animais
desenvolveram arteroesclerose, mas a área de lesão foi significativamente menor nos
camundongos C57BL/6 alimentados com dieta IF+ quando comparados com aqueles
alimentados com dieta IF-. Estes resultados sugerem que as isoflavonas de soja podem
reduzir níveis de colesterol pelo aumento da atividade do receptor LDL-c, e como
conseqüência deste mecanismo, oferecer proteção contra a arteroesclerose.
2.4 SOJA E SEU CONSUMO
O grão da soja dá origem a produtos e subprodutos utilizados atualmente pela
agroindústria de alimentos e indústria química. A proteína de soja dá origem a produtos
comestíveis para humanos (ingredientes de padaria, massas, produtos de carne, cereais,
misturas preparadas, bebidas, alimentação para bebês, confecções e alimentos
dietéticos), animais e vegetais (ração e adubo respectivamente) e para indústria de uma
forma geral, atuando como formulador de espumas (emulsificante), fabricação de fibra de
revestimento, papel emulsão de água para tintas e produção de tecidos (Pan &
Tangratanavalee, 2003).
Já o seu consumo direto, por parte da população, ainda é discreto, mas aponta para
uma crescente utilização devido às descobertas dos benefícios da soja cada vez mais
divulgadas pelos meios de comunicação e a tentativa de vários profissionais e empresas
com programas para incentivar a inserção da soja no cardápio do brasileiro. O principal
objetivo destes programas é dar ao grão uma função mais nobre, a de complementar a
alimentação da população brasileira. Pronta para atender às necessidades energético-
proteicas da dieta das famílias, a soja é, também, alternativa para diminuir os índices de
desnutrição, principalmente entre as crianças (Pessanha, 2004).
Mas, apesar de ser uma boa fonte protéica, a soja contém antinutrientes que
limitam sua utilização. Estes antinutrientes apresentam especificidade de inibir enzimas
proteolíticas e, conseqüentemente, reduzem a digestão protéica do alimento,
proporcionando diminuição no ganho de massa e crescimento de animais (Carvalho et al.,
2002; Miura et al., 2001). O que levar a uma hipertofria do pâncreas devido a necessidade
aumentada da produção das enzimas gástricas, tripsina e quimotripsina, para digestão das
proteínas. (Monteiro et al., 2004).
Os mais importantes e extensivamente investigados dos antinutrientes protéicos
foram os inibidores de proteases de soja, que são constituídos pelo Inibidor de Tripsina
Kunitz (KTI) e pelo inibidor de tripsina e quimotripsina Bowman-Birk (BBI). Cerca de 80%
da inibição da atividade tríptica de grãos de soja é causada pela ação do KTI. (Monteiro et
al,. 2004; Carvalho et al. 2002).
Desta forma, para aumentar o aproveitamento do valor nutricional da soja e seus
produtos, há necessidade de processos que possam inativar estes antinutrientes (Miura et
al., 2001). O tratamento térmico tem sido usado para melhorar o aproveitamento do valor
nutricional da soja, porém este tratamento deve ser controlado para evitar a destruição de
aminoácidos importantes e a redução da biodisponibilidade de outros nutrientes
(Vasconcellos et al., 2001).
Genovese & Lajolo (1998) determinaram a atividade inibitória de tripsina em
produtos comerciais de soja consumidos pela população, tais como bebidas à base de
extrato de soja, e fórmulas não lácteas à base de proteína isolada de soja e concluíram
que, excetuando-se os produtos à base de extrato de soja, os demais apresentavam
valores baixos para atividade inibitória de tripsina, em torno de 5% encontrado para farinha
desengordurada.
Segundo Carvalho (2002), na nutrição humana tais fatores antinutricionais têm
pequena conseqüência, pois são termolábeis e geralmente são destruídos nas condições
normais de preparo, doméstico ou industrial, dos alimentos. No entanto a utilização cada
vez maior de alimentos naturais ou o uso de baixas temperaturas de cozimento podem
expor a população aos seus efeitos, limitando o aproveitamento da soja.
2.5 A SOJA COMO ALIMENTO FUNCIONAL
A soja, hoje, não é considerada, por alguns autores (Souza et al., 2000; Morais
Silva, 2000), somente um alimento de alta qualidade protéica, mas também um alimento
funcional, podendo ser usado na prevenção e tratamento de várias doenças. Assim, a soja
pode atuar em outras funções além das nutricionais agindo no metabolismo geral,
equilibrando, desempenhando ou modulando funções metabólicas que conduzem a um
beneficio máximo a saúde, ao bem estar, à longevidade e, em muitos casos à prevenção
de doenças.
O termo alimento funcional é recente, tendo sido introduzido no Japão em meados
de 1980, referindo-se a alimentos processados que, além da nutrição, contém ingredientes
que ajudam em funções corporais específicas (Biatright & Lei, 1999).
A portaria nº. 398 de 30/04/99, da Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da
Saúde do Brasil (Brasil, 1999) define alimentos funcionais como: “todos os alimentos ou
ingredientes, que além das funções nutricionais básicas, quando consumidos como parte
da dieta usual, produzam efeitos metabólicos e/ou fisiológicos e/ou efeitos benéficos à
saúde, devendo ser seguros para consumo, sem supervisão médica”.
Dentre os compostos funcionais da soja podem ser citados os fitoesteróis, as
saponinas, os ácidos fenólicos e os isoflavonóides ou fitoesteróides, também chamados
de isoflavonas. Destes compostos, as isoflavonas são as mais importantes. Estudos em
humanos, animais e sistemas de culturas de células sugerem que as isoflavonas,
especificamente a genisteína e a daidzeína desempenham papel importante na prevenção
e tratamento de doenças crônicas tais como osteoporose, doenças do coração, câncer e
diabetes (Esteves Monteiro, 2001).
As isoflavonas apresentam-se entre as classes que possuem maior atividade
estrogênica e são encontradas em vários vegetais e produtos manufaturados. Alguns
produtos que são fonte de isoflavonas e suas concentrações em miligramas (mg), por
100g do produto, são descritos a seguir: gérmen de grãos da soja (151,17), flor da soja
(148,61), proteína da soja isolada (97,43), sopa de missô (60,39), tempeh (43,52), tofu
(27,91), leite de soja (9,65), lentilha (0,01) e outros, como brotos de alfafa e sementes de
linhaça (USDA, 1999).
Dentre as isoflavonas, os principais compostos são formados por genisteína (4’,5,7-
trihidroxisoflavona), dadzeína (4’,7-dihidroxisoflavona), biochanina A (4’-methoxi-5,7-
dihidroxisoflavona) e formononetina (4’-metoxi-7-hidroxisoflavona) (Nachtigall, 2001;
Wender & Campos, 2001; Lethaby et al., 2002).
As isoflavonas encontradas principalmente nos vegetais e leguminosas
apresentam-se biologicamente inativas, ligadas a uma molécula de açúcar, sob as formas
de malonil e β-glicosídeo. Após o processamento industrial ou o metabolismo orgânico,
com a remoção do resíduo de açúcar (flavona), são formados os derivados ativos
denominados acetil e agliconas. No organismo a remoção desta molécula de açúcar
ocorre através de biotransformação em nível intestinal denominada desconjugação,
promovida pela ação da glucoroniltransferase e sufotransferase. Neste processo
metabólico há formação de fenóis heterocíclicos que conferem a biodisponibilidade
intestinal das isoflavonas (Dornstauder et al., 2001; Alves & Silva, 2002).
Partes destas formas ativas serão absorvidas como isoflavonas livres e exercerão
suas atividades no organismo, e a outra será fermentada e transformada em metabólitos,
sendo a daidzeína convertida em equol e O-des-metil-angilensina (O-DMA) e a genisteína
convertida em ρ-ethyl phenol. Estas substâncias poderão ser excretadas ou absorvidas no
intestino, exercendo também atividade metabólica (Dornstauder et al., 2001; Alves & Silva,
2002).
As formas ativas, genisteína e daidzeína, também podem ser derivadas de
precursores como a biochanina A e formononetina, respectivamente, através de
demetilação hepática. A excreção ocorre principalmente por via renal, sendo que uma
pequena parte é eliminada através da vesícula biliar e intestino (Alves & Silva, 2002).
As ações das isoflavonas nos tecidos alvos parecem ocorrer através de dois
mecanismos classificados como genômico e não genômico. Os efeitos expressos pelo
mecanismo genômico são determinados pela ligação com receptores nucleares e podem
ser tanto estrogênico como antiestrogênico (Dornstauder et al., 2001). O mecanismo não
genômico, por outro lado, é observado através da proliferação celular e da inibição
enzimática. Estas ações parecem estar relacionadas à ação inibitória da fosforilação da
proteína tirosina quinase (PTK), importante na alteração da expressão de oncogenes. A
diminuição dos receptores para fatores de crescimento celular epidérmico (EGF),
plaquetário (PDGF) e de crescimento tumoral (TGF) também são efeitos encontrados.
Outras importantes ações não genômicas são a ativação do fator de necrose tumoral
(TNF-α), inibição da angiogênese e efeito antioxidante, através da redução da formação
de óxido nítrico por citocinas e radicais livres (Boersma et al., 2001; Lian et al., 2001).
Também são descritas ações de inibição da expressão e transcrição de alguns genes
como o c-fos, c-jun, clusterin RNAm, antígeno de proliferação celular Ki-67 e o
complemento C3 (Hale et al., 2001), que através de ações sobre o DNA topoisomerase (I
e II) e quinase ribossomal S6, promovem a regulação da proliferação, diferenciação e
apoptose celular (Lian et al., 2001).
Pollard & Suckow (2006) sugeriram que devido ao seu efeito inibidor da proteína
tirosina quinase, a genisteína pode atuar como um composto regulador da secreção de
insulina. Estes autores demonstraram que a atividade de várias enzimas, principalmente a
topoisomerase II e as tirosina quinases, é inibida pela genisteína e, em alguns casos, por
outras isoflavonas. Outros estudos têm demonstrado propriedades anti-carcinogênicas,
anti-oxidativas, efeitos anti-estrogênicos e anti-proliferativos das isoflavonas. Sugerindo
que estas moléculas podem agir de maneiras diferentes, promovendo a inibição da
carcinogênese.
Estudos adicionais têm demonstrado que as isoflavonas não só desempenham um
papel importante na regulação de lipoproteínas, reduzindo LDL-c e aumentando HDL-c,
mas também protegem contra o desenvolvimento de placas de ateroma (Anthony et al.,
1996). Pereira & Abdala (2005), avaliando a influência das isoflavonas daidzeína e
genisteina na redução de proteínas de choques induzidas por arterosclerose experimental,
observaram que ambas as isoflavonas modulam alguns caminhos de processos
autoimunes e inflamatórios no processo aterogênico.
He et al. (2005) afirmam que a suplementação com a proteína de soja resulta na
redução da pressão sitólica e diastólica. E sugerem que o aumento do consumo desta
proteína seja uma importante ferramenta para prevenção e tratamento da hipertensão
arterial. Yang et al. (2005) ao realizarem um estudo longitudinal envolvendo 45.694
participantes encontraram relação inversa entre à pressão arterial e o consumo de soja,
achado mais evidente em mulheres idosas.
Dado todos estes achados sobre as propriedades funcionais da soja, o Food and
Drug Administration (FDA) aprovou uma declaração de que o consumo de 25 gramas de
proteína de soja ao dia, ao lado de uma dieta pobre em gorduras saturadas, pode reduzir
o risco das doenças cardiovasculares (North American Menopause Society Advisory
Panel, 2000).
2.6 VARIEDADES DA SOJA
Com o grande interresse científico e econômico gerado pela soja, surgiram diversos
programas de melhoramento genético, que vêm desenvolvendo variedades melhoradas
desta leguminosa com altos rendimentos e adaptadas às condições agroclimáticas e aos
desejos dos produtores brasileiros. Moreira et al. (2005), utilizando tecnicas
biotecnológicas, buscaram inserir um gene que suporta uma maior carga protéica, sem
queda no rendimento das lavouras. Assim, cada vez mais, a engenharia genética visa
atender as necessidades dos clientes e às próprias perspectivas econômicas do produtor
e detentores desta biotecnologia.
Biotecnologia pode ser definida como um processo tecnológico que permite a
utilização de material biológico para fins industriais (Grimes, 2003). Hoje a maior
discussão gira em torno da modificação genética da soja RoundUp Ready (rr), cuja
liberação para o plantio, ocorrida no final de 1998, recebeu um aval favorável pela
Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), um órgão vinculado ao
Ministério da Ciência Tecnologia. Essa comissão é responsável pela avaliação de todos
os produtos originários da biotecnologia e pela emissão de parecer técnico sobre a
biossegurança de cada um desses produtos, antes que eles sejam encaminhados para
registro nos órgãos competentes no tocante à comercialização. Assim, até então restrito
aos meios científicos, o tema dos alimentos transgênicos ocupa a mídia e desperta
interesse de setores cada vez mais amplos da população.
A criação desta nova variedade de soja se deu por meio da produção da proteína
CP4 enolpiruvilchiquimato-3-fosfato-sintetase (EPSPS). Esta enzima que faz parte da via
de chiquimato que está envolvida na produção de aminoácidos aromáticos e outros
compostos aromáticos em plantas. Quando as plantas convencionais são tratadas com
glifosato não conseguem produzir aminoácidos necessários para sua sobrevivência. A
soja rr desenvolvida por meio de utilização da biotecnologia moderna, produz a proteína
CP4 EPSPS, que é derivada de uma bactéria comumente encontrada no solo. Essa
proteína é naturalmente menos sensível à inibição pelo glifosato e assim, as plantas que
expressam esta proteína tornam-se tolerantes ao herbicida Roudup (Corbisier et al.,
2005).
Larck (2002), Cavali (2001) e Kim & Krishnan (2004) afirmam que a inserção de
novos genes pode causar processos de sensibilização ao organismo e promover alergia
através do consumo de alimentos geneticamente modificados, já que o alimento pode
conter partículas protéicas de vírus, bactérias e fungos e ainda reduzir o aproveitamento
protéico devido às mudanças estruturais na proteína.
Segundo Nodari & Guerra (2001) a verdade atual é a falta de dados científicos que
possam permitir uma avaliação conclusiva para a liberação do plantio e consumo e que a
tecnologia está sendo colocada à frente da ciência. Neste sentido, os lançamentos de
organismos geneticamente modificados (OGM’s) devem ser precedidos por estudos
nutricionais e toxicológicos de longa duração. Esta cautela poderia evitar conseqüências
danosas que eventualmente um produto possa apresentar se liberado apressadamente.
Em uma visão oposta aos alimentos geneticamente modificados está a agricultura
orgânica, onde se tenta manter a maior integridade in natura do alimento. Assim,
considera-se sistema orgânico de produção agropecuária todo aquele em que se adotam
técnicas específicas, mediante a otimização do uso de recursos naturais e
socioeconômicos disponíveis e o respeito à integridade cultural das comunidades rurais. O
sistema tem como objetivo a sustentabilidade econômica e ecológica, a maximização dos
benefícios sociais, a minimização da dependência de energia não renovável, empregando,
sempre que possível, métodos culturais, biológicos e mecânicos, em contraposição ao uso
de materiais sintéticos, a eliminação do uso de organismos geneticamente modificados e
radiações ionizantes, em qualquer fase do processo de produção, processamento,
armazenamento, distribuição e comercialização, e a proteção do meio ambiente (Brasil,
2003).
A produção de soja em sistemas orgânicos tem apresentado crescente demanda
por parte de países da Comunidade Européia e Japão tanto para consumo humano como
para a alimentação de animais em sistemas orgânicos. Esse quadro se dá através de
vantagens econômicas, devido aos preços de compra diferenciados, aliadas ao crescente
apelo em relação à conservação ambiental e aumento na demanda mundial por alimentos
de melhor qualidade e têm atraído o interesse de vários produtores (de Luis et al., 2006).
No Brasil a abertura para o mercado orgânico é recente. Esse movimento nasceu
com apoio da mídia e aceitação da população (Penteado, 2000). Expandindo-se a partir
da criação da Associação de Agricultura Orgânica, em 1989 (Borguini et al., 2003) hoje há
um grande mercado para esses produtos.
3 OBJETIVOS
3. 1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência do consumo da soja orgânica e geneticamente modificada no
aproveitamento protéico e nos indicadores de doenças cardiovasculares de ratos senis.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a composição química centesimal de ambas as sojas e das rações
preparadas com as mesmas;
Determinar o conteúdo de isoflavonas presentes nas rações;
Avaliar a qualidade protéica de ambas as sojas, através de métodos biológicos, na
fase de crescimento, adulta e velhice;
Determinar as concentrações de hemoglobina, proteínas totais, albumina,
colesterol, triglicerídeos, insulina, glicose assim como o percentual de hematócrito, em
ratos senis;
Quantificar o remodelamento da aorta e a aferição da área ocupada por colágeno
(V
vi(i%)
) de colágeno presente no ventrículo esquerdo (VE) dos animais;
Avaliar as possíveis diferenças entre as duas variedades de soja utilizadas como
fonte protéica neste estudo.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados Rattus norvegicus, variedade Albinus, linhagem Wistar, machos,
recém desmamadas ao início do experimento (21 dias), oriundos da colônia do Laboratório
de Nutrição Experimental (LABNE) do Departamento de Nutrição e Dietética da Faculdade
de Nutrição, Universidade Federal Fluminense (UFF). Esses animais correspondem à
segunda geração de animais (geração F1) alimentados com as rações experimentais
durante toda a vida.
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal
Fluminense, sob o parecer n
0
23069.030748/2002-18. Para o desenvolvimento do ensaio
biológico foi seguido o protocolo de normas estabelecidas no Guide for Care and Use of
Laboratory Animals publicada por US National Institutes of Health (NIH Publication N°85-
23, revisada em 1985).
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O ensaio biológico foi desenvolvido utilizando 30 ratos, divididos em três grupos
(n=10): que receberam as seguintes rações desde o desmame (21 dias de vida):
Grupo Controle (GC): recebendo ração exclusivamente à base de caseína;
Grupo Soja Orgânica (GO): recebendo ração exclusivamente à base de soja
orgânica.
Grupo Soja Geneticamente Modificada (GG): recebendo ração
exclusivamente à base de soja geneticamente modificada.
O ensaio com as dietas experimentais foi desenvolvido em 455 dias, o que
corresponde a 1 ano e 4 meses de vida destes animais.
Durante todo o experimento, os animais receberam água e ração ad libtum, e foram
mantidos em gaiolas de polipropileno, em ambiente com temperatura controlada a 21±1ºC
e período de claro/escuro de 12h. Foram coletados dados de massa corporal (g) e
consumo de ração (g) em dias alternados.
4.3 RAÇÕES
As amostras de soja transgênica foram fornecidas pela Jasmine Alimentos Integrais
(Curitiba, PR, Brasil) e as de soja orgânica pela BUNGE alimentos (Porto Alegre, RS,
Brasil). As origens dos demais componentes das dietas foram: amido de milho Maizena
Duryea da Unilever Bestfoods Brasil Ltda (Granhuns, Recife, PE, Brasil), açúcar refinado
União (Rio de Janeiro, RJ, Brasil), óleo de soja Liza da Cargill Agrícola SA (Mairinque, SP,
Brasil), celulose Microcel da Blanver Ltda (Cotia, SP, Brasil). L-Cistina, bitartarato de
colina, caseína e mistura de vitaminas e minerais da Rhoster Comércio e Indústria Ltda
(Vargem Grande Paulista, SP, Brasil).
4.3.1 Preparo das rações
Para a preparação da farinha, utilizada como fonte protéica, primeiramente foi
realizada a metodologia descrita por Soares et al. (2005), onde foi feita a catação manual
das sojas, pesagem em balança digital Toledo (São Paulo, SP, Brasil) com precisão de
0,1g. A soja foi seca em estufa ventilada Fabbe-Prima (São Paulo, SP, Brasil) a 60ºC por
30 minutos e posteriormente foi adicionada água fervente por 3 minutos, então
desprezada para a retirada das cascas sob água corrente, ficando em remolho por 4
horas, sendo a água do remolho desprezada. As sojas foram coccionadas por 30 minutos,
descartando novamente a água, e então colocadas na estufa ventilada por 12h a 60ºC. Só
aí foram moídas em moinho Fritsch Pulverisette 14 para a obtenção da farinha de soja,
utilizada como fonte de proteína para o preparo das rações.
Estufa
Ventilada
(60°C/30m)
Figura 1. Fluxograma do tratamento térmico aplicado aos grãos de soja.
Todas as rações foram preparadas no LABNE e continham 10,3% de proteína
(1,65 % de nitrogênio) e 363,95 kcal/100g, adicionadas das misturas de vitaminas e
minerais segundo as normas do Commitee on Laboratory Animal Diets, 1979, modificadas
segundo as recomendações do American Institute of Nutrition-93 (Reeves et al., 1993). Os
ingredientes utilizados para o preparo das rações (Tabela 1) foram pesados e
homogeneizados em batedeira industrial Hobart
®
, com água fervente. A massa obtida foi
transformada em pelletes e seca na estufa ventilada a 60ºC por 24h, e após a
identificação, armazenada sob refrigeração a temperatura de ± 8°C até seu uso.
Catação
Manual
dos grãos
de soja
Imersão
em água
Fervente
(100°C/ 3min)
Retirada
da casca
em água
corrente
Cocção
dos grãos
(100°C/ 30
min)
Remolho
(4h)
Estufa
Ventilada
(60°C/12h)
Moinho
Fritsch
Pulverisette
14
Farinha
Integral
do grão
Embalagem em saco plástico
com retirada do ar com
auxilio de uma bomba
manual de vácuo
Estocagem
em
geladeira
(4°C)
Tabela 1. Percentual de nutrientes adicionadas para o preparo das rações durante a
experimentação (g/100g).
Ingredientes
(g/100g)
Ração
Controle
1
Ração Soja
Orgânica
2
Ração Soja
Geneticamente
Modificada
3
Fonte Protéica 11,54 20,96 20,28
Amido
4
61,41 57,23 58,04
Açúcar
5
10,00 10,00 10,00
Mistura de
minerais
6
3,50 3,50 3,50
Mistura de
vitaminas
7
1,00 1,00 1,00
Óleo
8
7,00 2,81 2,94
Celulose
9
5,00 3,95 3,99
Bitartarato de
Colina
10
0,25 0,25 0,25
L- Cistina
10
0,30 0,30 0,00
Total 100,00 100,00 100,00
1
Caseína-Comercial Rhosther Industria e Cormécio LTDA.
2
Jasmine Alimentos LTDA,
3
Bunge
Alimentos.,
4
Maisena,
5
União,
6
Preparada segundo a AIN-93 (Rhosther),
7
Preparada segundo a
AIN-93 ( Rhosther),
8
Liza®,
9
Macrocel®, Blanver LTDA,
10
Fabricante Rhosther.
4.4 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL E CONCENTRAÇÃO DE ISOFLAVONAS DAS
MATÉRIAS PRIMAS E RAÇÕES EXPERIMENTAIS.
4.4.1 Composição Centesimal
Para a análise química das rações, foram mensurados a umidade, o teor de cinzas, o
extrato etéreo, as proteínas, fibras e carboidratos, conforme detalhamento abaixo. As
dosagens foram realizadas em triplicata, na mesma amostra, onde foi registrada a média
encontrada. A seguir seguem os métodos utilizados:
-Umidade: determinada por gravimetria, em estufa a 105
o
C, até a obtenção de peso
constante (AOAC, 1984).
- Cinzas: determinada por gravimetria, utilizando-se mufla a 550
o
C (AOAC,1984).
-Extrato etéreo: determinado utilizando o extrator de Soxhlet, utilizando como solvente o
éter etílico e o éter de petróleo (AOAC, 1984).
-Proteína: determinada pelo método de Micro-Kjeldahl para nitrogênio total, onde o fator
6,25 foi utilizado para a conversão em proteína, a partir do percentual de nitrogênio
encontrado nas dietas em estudo.
-Fibra total: A fração de fibra total foi determinada a partir de uma mistura homogenia
triturada com diluição de 1:30, utilizando água destilada como solvente, com métodos
analíticos descritos por Carvalho et al. (1990)
-Fração Nifext: A determinação da fração Nifext, que corresponde aos carboidratos, foi
realizada pela diferença, após a determinação das frações anteriores.
4.4.2 Isoflavonas
A derterminação dos teores de isoflavonas nas rações experimentais foi feita de
acordo com a metodologia descrita por Stephen et al., (2001). As amostras das rações de
soja foram moídas, secas em estufa a vácuo em temperatura de 60ºC e desengordurados
com hexano, durante 10 horas em extrator de Soxhlet
®
. A extração das isoflavonas foi
realizada misturando-se 0,5g de amostra seca e desengordurada a 8 ml de metanol a 80%
e 2ml de HCl 20% (v/v), levados a agitação por 2 horas em agitador magnético. A seguir,
as amostras foram centrifugadas a 9000 rpm, por 10 minutos a 4ºC, em centrífuga
refrigerada (Eppendorf®, mod 5403). O sobrenadante foi filtrado em membrana de acetato
de celulose de 25 mm de diâmetro e com porosidade de 0,45µ, da marca Corning®.
Finalmente, um volume de 5ml do filtrado foi evaporado em corrente de N2. Os resíduos
foram ressuspensos em etanol a 90%, utilizando-se 0,5 mL para as amostras. A seguir
foram filtrados em membrana de acetato de celulose de 25 mm de diâmetro, com
porosidade de 0,22µ (Corning®). Alíquotas de 20 µl foram tomadas para injeção no
cromatógrafo líquido procedente da Shimadzu® serie LC-10AT.
A separação das isoflavonas foi realizada em coluna C18 de 3,9 x 300mm, da
Shimadzu. A taxa de fluxo foi de 0,7 ml/minuto e temperatura da coluna de 30ºC. A técnica
empregada foi de gradiente linear, com tempo total da análise de 35 minutos com as
seguintes características: Fase Móvel, solvente A, consistiu de uma mistura de ácido
acético em água (10:90 v/v) enquanto que o solvente B usado, foi uma mistura de
metanol/acetonitrila/diclorometano (10:5:1 v/v/v). O gradiente inicial foi de B em A, a 10%
por 5 min, de 10% para 70% por 20 min e de 70% para 10% por 3 min, permanecendo
nessas condições por mais 7 min.
Os sinais foram monitorados em detector de fotodiodo - UV em 262 nm. A
identificação e quantificação das isoflavonas foram realizadas a partir de padrões externos
das formas agliconas (genisteína e daidzeína) e beta-glicosiladas (glicitina, genistina e
daidzina) da marca Indofine®. Todas as amostras foram analisadas em triplicata.
4.5 MÉTODO DE AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DAS RAÇÕES
Para determinação dos métodos biológicos foi realizada a pesagem dos animais
três vezes na semana em balança FILIZOLA
®
, com capacidade máxima de 3Kg e precisão
de 0,5g para avaliar variações de massa corporal e crescimento. Os animais eram
pesados individualmente, suspensos pelo terço distal caudal e colocados em recipiente de
polipropileno com a balança previamente tarada. As rações foram ofertadas e pesadas em
balança TOLEDO
®
com capacidade máxima de 3Kg e precisão de 0,05g, em dias
alternados para verificar a quantidade ingerida de cada animal. Contabilizou-se a oferta e
o resto de ração de cada animal. As medidas aferidas na balança eram registradas em
planilhas padronizadas pelo LABNE e logo após eram transferidas para formulários
eletrônicos.
Com os dados de variação de massa (g) e consumo de ração (g) foram calculados
o Protein Efficacy Ratio (PER) e o Índice de Crescimento (IC) para avaliação biológica da
qualidade protéica como descrito por Angelis (1995). Assumindo-se que ocorre variação
do total de proteína corporal motivada por diferenças da qualidade protéica de dietas, é
comum medir-se a variação de massa corporal como um reflexo global da atuação da
proteína ingerida. Estes índices ainda são aceitos pela maioria dos investigadores como
métodos de boa validade, sendo que o tempo de experimentação sugerido para o teste de
PER é de 4 semanas (28 dias). Quando o tempo de experimentação é maior que este
período, denomina-se IC, que é calculado como:
É valido ressaltar que no presente estudo calculou-se o IC em dois momentos, no
291º dia de vida, considerando que os animais apresentavam-se na fase adulta e no 455º
dia de vida, considerando os animais já na fase que comprende a senilidade.
4.6 MÉTODOS BIOQUÍMICOS
4.6.1 Coleta de sangue e preparo das amostras
Após 455 dias de experimento os animais foram anestesiados em campânula de vidro por
inalação com Éter Etílico. Depois de anestesiados, a coleta de sange foi realizada por
punção cardíaca, utilizando-se agulhas Vaccueete
®
e tubos (10 e 5 mL) a vácuo. O
sangue foi coletado em três diferentes tubos, sendo um tubo heparinisado (para
determinação do hematócrito, hemoglobina), um tubo com fluoreto (para dosagem de
glicose e insulina) e um tubo sem reagentes para dosagem de albumina, proteínas totais e
da fração lipidica. Para separação das frações e obtenção do soro, o tubo sem reagentes
foi centrifugado em centrífuga (Sigma) durante 30 minutos a 3500 rotações por minuto
(Miller et al., 1977). As análises de proteínas totais, albumina, hematócrito, hemoglobina,
colesterol e triglicerídeos foram realizados com a utilização de kits da BIOCLIN (Indústria
Quibasa – Química Básica Ltda/ Belo Horizonte-MG) e para a determinação de glicose e
insulina utilizou-se kits da Gold Analizsa Diagnósticos
®
.
4.6.2 Proteínas Totais (g/dl)
Foi determinada através de amostra do soro, utilizando o método de reagente de
biureto em teste colorimétrico (Miller, 1977). A leitura deu-se em espectofotômetro (Spec
20 MV) em 545 nanômetros(nm). Logo foi aplicado o cálculo: Proteínas Totais
(g/dl)=(Absorbância da Amostra / Absorbância do Padrão) x 4
4.6.3 Albumina (g/dl)
Foi determinada no soro utilizando-se o método Verde de Bromo Cresol (Miller et
al., 1977). Com a leitura em espectofotômetro (Spec 20 MV) em 630 nanômetros (nm) foi
aplicado o cálculo para determinação de albumina:Albumina (g/dl) = (Absorbância da
Amostra / Absorbância do Padrão) x 3,8.
4.6.4 Hemoglobina(Hb g/dl)
Foi determinada através da amostra de sangue total, pelo método de
Cianometahemoglobina modificada. Foi feita a leitura em espectofotômetro (Spec 20 MV)
em 540 nanômetros (nm). Após, foi realizado o cálculo da determinação de hemoglobina:
Hemoglobina g%=(densidade óptica do sangue teste/densidade óptica do padrão) x F.C
(Fator de Calibração).
4.6.5 Hematócrito (Ht%)
Foi determinado com amostra de sangue total (com EDTA), utilizando a técnica do
microhematócrito através de microcapilales descartáveis. Estes microcapilares foram
centrifugados (centrífuga Sigma) durante 15 minutos à 3500 RPM (rotações por minutos)
(Lima et al., 1977). Após, foi realizada leitura em escala graduada em percentuais para Ht
%.
4.6.6 Métodos de análise da fração lipídica (Colesterol e Triglicerídeos)
Foram realizados através de diagnóstico in vitro. Para análise de cada indicador
bioquímico foi realizada uma média de 3 repetições para cada amostra do soro obtido de
cada animal. A quantificação do volume das amostras foi realizada através de pipetas de
precisão automática de volume ajustável (Kacil) e ponteiras descartáveis. Após a
realização da metodologia de colesterol e triglicerídeos, as leituras foram feitas em
espectofotômetro (Spec 20 MV) ajustado para os nanômetros específicos de cada
indicador.
4.6.7 Método para determinação da Glicose e Insulina sérica
Avaliou-se a glicemia plasmática, via método enzimático-colorimétrico
manufaturado pela empresa Gold Analizsa Diagnósticos
®
. A concentração plasmática de
insulina, foi obtida via Radioimunoensaio (RIA)
(n=10 para cada grupo) segundo Hosoda et
al., 1996.
4.6.7.1 Glicose
Para as dosagens da glicose (Lote: 30815), seguiu-se o seguinte procedimento:
utilizou-se 1ml do reagente de cor 2 em todos os tubos, os da curva padrão, incluindo o
tubo zero, e todos os tubos com as amostras. Para a montagem da curva padrão utilizou-
se onze pontos, o ponto 0% (sem o reagente de cor 1), o ponto 100% (com 10l do
reagente de cor 1) e mais nove pontos, dos 90% aos 10% (reduzindo a concentração a
10% em cada tubo). Para a dosagem das amostras, aplicou-se 10l de cada amostra nos
tubos com 1ml do reagente de cor 2. Os testes foram realizados em triplicata, incluindo a
curva e dosados no espectrofotômetro microprocessado 800M manufaturado pela
Analyser
com comprimento de ondas ajustado para 500nm (Moura et al, 2002).
4.6.7.2 Insulina
A insulina plasmática foi determinada através da reconstituição da insulina
–125
I
liofilizada com 5 ml de água destilada onde foi deixada a temperatura ambiente por 60
minutos. Misturou-se a solução de insulina
–125
I e a solução tampão do kit. A solução de
insulina foi diretamente adicionada em um erlenmeyer. Lavou-se o vial do traçador três
vezes com a solução tampão. Foram adicionadas as lavagens anteriores ao erlenmeyer. O
tampão restante foi homogenizado rigorosamente. Para estoque a solução deve foi
aliquotada e congelada (- 20° C). Todos os padrões, tubos e traçador foram colocados a
temperatura ambiente. Adicionou-se 100 L dos padrões, controles e amostras nos
respectivos tubos, somando 900 L da solução tampão com traçador em todos os tubos.
Logo vortexamos os tubos intensamente e incubamos a temperatura ambiente por 18 h.
Os tubos foram invertidos e foi retirado o excesso em papel absorvente. Cada tubo foi
lavado com 4 mL de água deionizada. A contagem foi realizada em contador calibrado
para
125
I (1 minuto).
4.7 MÉTODOS HISTOLÓGICOS
Após a retirada do sangue, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical, e através de uma toracotomia o coração foi retirado juntamente com a aorta, logo
a artéria foi separa do coração seccionando-a junto ao arco aórtico.
A aorta foi seccionada transversalmente onde foram feitos cortes transversos
sempre no terço distal da secção. O coração foi pesado interiro em balança analítica de
(XP-3000-Quinmis Instruments) com precisão de 0,0001g e posteriormente seccionado
transversalmente abaixo do sulco coronário para a separação dos átrios e ventrículos,
incluindo o septo intraventricular. O ventriculo esquerdo (VE) foi retirado e pesado
separadamente.
Após terem sido seccionados, os pedaços de VE e aorta foram fixados em formol
tamponado (formalina de Millonnig) por 24h, processados em água, em concentrações
crescentes de álcool etílico em água (80%, 95% e 100%), em concentrações crescentes
de xilol em álcool etílico (50% e 100%) e em parafina, seguida da inclusão definitiva, como
utilizado por Pereira et al. (1998). Após a inclusão, os blocos de parafina contendo
pedaços de VE e aorta foram cortados, no micrótomo CUT 4050 (Microtec
®
), em seções
de 5µm e montados em lâminas padrão para microscopia ótica.
As lâminas de aorta foram coradas com Hematoxilina de Haris (coloração der
núcleo), Fucsina Resorcina de Weigert (coloração de fibra elástica) e Fucsina ácida van
Gieson (coloração de fibra colágena) e posteriormente foi feita a captura de imagens pelo
programa HonestechTV2.5
®
e a mensuração das estruturas da aorta (Intima, Média e
Adiventicia) foi realizada utilizando o programa Image J
®
.
As lâminas que continham o tecido do VE foram coradas com Picro-sirius red como
utilizado por Shirani et al., (2000) para detecção dos núcleos e citoplasma dos miócitos e,
para coloração fibrilar do colágeno da matriz-extra celular, respectivamente. As imagens
foram capturas para um aparelho televisor TOSHIBA 14 polegadas, onde através de
leitura em campo M42 foi realizada a contagem da área ocupada por colágeno (V
vi(i%)
).
As imagens das seções do VE e aorta foram capturadas por videomicroscopia no
microscópio BX40 Olympus
®
, com uma câmera de vídeo digital optronics, usando-se
objetiva com aumento de 10X com imersão em óleo .
4.8 MÉTODO ESTATÍSTICO
Os resultados estão apresentados na forma de média + desvio padrão. Utilizou-se
o teste de análise de variância não paramétrico de Kruskal-Wallis. Em caso de
constatação de diferenças significativas, aplicou-se o teste post hoc U de Mann-Whitney
para comparação dois a dois através do Sofware S-Plus versão 6.0, com o nível de
significância de p≤ 0,05.
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS MATÉRIAS PRIMAS UTILIZADAS COMO FONTE DE
PROTEÍNA
Ambas as variedades de sojas foram utilizadas após tratamento térmico e
transformadas em farinha para sua utilização como fonte protéica. No entanto é válido
ressaltar que seus macronutrientes, assim como a caseína, foram considerados para o
balanceamento das dietas. Os resultados da composição centesimal das farinhas de soja
e da caseína são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Composição centesimal (%) de macronutrientes da caseína, farinha de soja
orgânica e a farinha da soja geneticamente modificada.
Amostras Umidade
(%)
Lipídios
(%)
Cinzas
(%)
Proteína
(%)
†
Fibras
(%)
Carboidrato
(%)*
Caseína 3,43
0,18
0,02
0,00
0,95
0,51
86,6
3,6
0 8,96
Soja
Orgânica
6,54
0,24
17,61
0,11
2,36
0,45
47,7
2,2
4,31
2,01
21,44
Soja
Geneticamente
Modificada
5,21
0,12
19,54
0,23
1,94
0,36
49,3
3,0
4,59
1,98
19,40
Os valores estão apresentados na forma de média ± desvio padrão; Os valores apresentados referem-se
às médias e desvios padrões de 3 determinações; *calculado pela diferença;
†
fator de conversão de
6,25.
As sojas utilizadas para a formulação das rações experimentais apresentavam
percentuais médios de proteína que variaram de 47% a 49%, tendo uma grande
representabilidade dentre os macronutrientes. Já a caseína apresentou, em média, 86%
de proteína bruta em sua amostra.
5.2 CARACTERIZAÇÃO DAS RAÇÕES USADAS NO EXPERIMENTO
As médias dos valores encontrados na composição centesimal das rações
preparadas para o ensaio estão apresentadas na Tabela 3. Observou-se que os teores de
proteínas variaram de 10,95% a 12,96%, carboidratos de 73,66% a 77,87%, lipídios de
7,88% a 8,53%, umidade 2,17% a 2,72% e cinzas de 1,67% a 2,14% dentre todas as
rações experimentais.
Tabela 03. Composição química centesimal das rações utilizadas no experimento
representada em g/100g de dieta.
Rações Umidade
(%)
Lipídios
(%)
Cinzas
(%)
Proteína
(%)
†
Fibras
(%)
Carboidrato
(%)*
GC 2,618
0,518
7,883
0,123
1,672
0,008
10,956
0,438
4,785
0,754
73,87
GO 2,174
0,014
8,175
0,115
2,145
0,060
11,053
0,313
5,012
0,367
69,45
GG 2,723
0,065
8,536
0,146
2,110
0,083
12,965
1,189
4,889
0,434
69,66
Os valores estão apresentados na forma de média ± desvio padrão. GC – ração à base de caseína; GO
– ração à base de soja orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada; Os valores
apresentados referem-se às médias e desvios padrões de 3 determinações; *calculado pela diferença;
†
fator de conversão de 6,25.
Para obtenção dos valores das concentrações das isoflavonas, foram utilizadas
soluções contendo os seguintes padrões de isoflavonas: daidzina, glicitina, genistina,
daidzeína e genisteína , em concentrações adequadas para a análise, cujo cromatograma
é apresentado na Figura 2.
Figura 2. Representação gráfica do cromatograma da solução contendo padrões de
daidzina, glicitina, genistina, daidzeína e genisteína.
Os cromatogramas referentes as isoflavonas contidas nas rações à base das duas
variedades de soja encontram-se representados na Figura 3. Os dados quantitativos
relativos a concentração de isoflavonas (daidzina, glicitina, genistina, daidzeína e
genisteína) nas diferentes rações estão apresentados na Tabela 4.
AU
Figura 3. Representação gráfica dos cromatogramas das duas diferentes rações à base de
soja, utilizadas no experimento.
Não houve diferença significativa entre as concentrações de isoflavonas nas duas
rações estudas, no entanto a concentração de Genistina foi numericamente superior às
outras isoflavonas. As isoflavonas agliconas (Daidzeína e Ginesteína) presentes em
menor concentração, só estando superior a Glicitina, que entre as isoflavonas foi a que
apresentou a mais baixa concentração (Tabela 4).
Tabela 4. Concentrações das isoflavonas (daidzina, glicitina, genistina, daidzeína e
genisteína) nas rações à base de soja (µ/g de ração).
Ração
Daidzina
µg/g
Glicitina
µg/g
Genistina
µg/g
Daidzeína
µg/g
Genisteína
µg/g
Soja
Orgânica
67 ± 0,8 18 ± 0,1 235 ± 0,6 30 ± 0,4 34 ± 1,3
Soja GMO* 63 ± 1,2 14 ± 0,2 249 ± 0,9 32 ± 0,3 38 ± 09
Os valores apresentados em triplicata na forma de média ± desvio padrão.*soja geneticamente modificada
É válido ressaltar que na ração à base de caseína não foi analisada a concentração
de isoflavonas, pois não há nenhum componente adicionado a esta ração que seja fonte
evidente destes fitocompostos.
5.3 CONSUMO DE RAÇÃO, PROTEÍNA, ISOFLAVONA, ENERGIA E VARIAÇÃO DE
MASSA CORPORAL
Os valores de massa corporal de todos os grupos experimentais no momento inicial
eram semelhantes, com massa corporal média de 55,18 ± 1,70. Ao 28° dia de experimento
observou-se que os grupos à base de soja possuíam menor massa corporal (p<0,00047)
em relação ao GC, sendo o GO apresentava cerca de 70% da massa corporal do GC e o
GG 62,3%. No 291° e 455° dia, os grupos à base de soja permaneceram com massa
corporal inferior quando comparados ao GC (Figura 4).
Tabela 5. Consumo de ração (g) e massa corporal (g) dos momentos correspondentes ao
0°, 28°, 291° e 455° dias de experimento.
0° dia
28° dia
291° dia
455° dia
Grupos
Massa
corporal
(g)
Consumo
de ração
(g)
Massa
corporal
(g)
Consumo
de ração
(g)
Massa
corporal
(g)
Consumo
de ração
(g)
Massa
corporal
(g)
GC
56,5
± 5,03
482,95
a
± 36,4
232,45
a
± 17,87
6587,00
a
± 482,78
546,43
± 60,40
7837,30
± 724,65
976,71
a
±45,14
GO
55,95
± 4,57
402,75
b
± 44,96
160,10
b
± 19,20
5060,13
b
± 440,93
526,70
±45,52
7320,63
± 514,68
862,90
b
±24,03
GG
53,10
±4,75
438,35
b
± 45,06
145,00
b
± 14,62
4935,95
b
± 568,25
515,25
± 42,17
7267,40
± 642,76
854,60
b
± 35,13
Os valores estão apresentados na forma de média ± desvio padrão. GC – ração à base de caseína; GO –
ração à base de soja orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada; Letras distintas em
uma mesma coluna denotam significância estatística ao nível de p ≤0,05.
O consumo de ração até o 291° dia foi semelhante entre o GO e o GG, no entanto
sempre inferiores (p<0,0007) ao GC. No entanto, observou-se que ao final do
experimento, 455° dia, o consumo entre todos os grupos foi semelhante.
Dado que as rações eram isoprotéicas, com uma média percentual de 10,3% de
proteína, o consumo de proteína se reflete no consumo de ração. Sendo assim, a Tabela 6
exprime os valores de consumo de proteína por grama de massa corporal ao final do
experimento e o consumo médio diário de energia por massa corporal (Kcal/g/dia).
Tabela 6. Consumo de proteína no 28°, 291° e 455° dia de experimento e consumo médio
diário de energia por massa corporal (Kcal/g/dia).
Grupos
Consumo de
proteína até o
28° dia
(g)
Consumo de
proteína até o
291° dia
(g)
Consumo de
proteína até 455° o
dia
(g)
Consumo médio
de energia diário
por massa
corporal
(Kcal/g/dia)
GC 49,74 ± 3,74
a
678,46 ± 49,72
a
807,24 ± 74,63 62,05 ± 5,07
GO 41,48 ± 4,63
b
521,19 ± 45,41
b
754,02 ± 53,01 58,70 ± 4,12
GG 45,15 ± 4,64
b
508,40 ± 58,53
b
748,54 ± 66,20 58,71 ± 5,19
* Os valores estão apresentados na forma de média ± desvio padrão. GC – ração à base de caseína; GO –
ração à base de soja orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada; Letras distintas em
uma mesma coluna denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
Observou-se que ambos os grupos à base de soja apresentaram consumo de
proteína inferior ao GC no 28° e 291° dia. O consumo de proteína no 455° dia de
experimento foi semelhante para todos os grupos, o mesmo ocorreu entre a média do
consumo de energia diário relacionada à massa corporal ao final do experimento.
Tabela 7. Consumo médio diário de Isoflavonas (daidzina, glicitina, genistina, daidzeína e
genisteína) no período de 455 dias dos grupos que consumiram ração à base
de soja (µg/dia).
Daidzina
(µg/dia)
Glicitina
(µg/dia)
Genistina
(µg/dia)
Daidzeína
(µg/dia)
Genisteína
(µg/dia)
GO
1077,58
± 389,02
289,61
±102,09
3780,98
± 976,34
482,68
± 276,67
547,04
± 89,78
GG
1006,26
± 456,79
223,61
±98,15
3977,10
± 1004,78
511,11
±56,45
606,95
± 105,34
Os valores estão apresentados na forma de média ± desvio padrão. GO – ração à base de soja
orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada; Letras distintas em uma mesma
coluna denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
A Tabela 7 apresenta a média dos valores das isoflavonas consumidas por dia
pelos animais durante todo o experimento. Observamos que o consumo diário das
isoflavonas apresentou-se homogêneo dentre os grupos à base de soja. Já o consumo de
Genistina foi superior ao das outras isoflavonas e o de Glicitina foi inferior ao consumo de
todas as outras.
5.4 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DAS PROTEÍNAS
As realizações de bioensaios são importantes porque mostram essencialmente a
medida de aminoácidos limitantes utilizáveis pelo animal, ou seja, a biodisponibilidade dos
aminoácidos das proteínas dos alimentos.
Ao 28° dia de experimento os animais estão em intensa fase de crescimento e
desenvolvimento, assim foi determinado o Protein Efficacy Ratio (PER) onde o GG (3,1 ±
0,25) apresentou resultados inferiores significativamente (p<0,003) em relação ao GO (3,7
± 0,31). Ambos os grupos foram inferiores (p<0,00008) ao GC que apresentou PER de 4,7
± 0,15 (Figura 4). Ao utilizar o PER relativo (%), considerando o desempenho do grupo
controle (GC) como sendo 100%, o GO apresentou PER de 81% em relação ao GC e o
GG 64% em relação AO per deste mesmo grupo.
Figura 4. Gráfico dos valores de Protein Efficacy Ratio (PER) dos grupos ao 28° dia de
experimento.
GC GG GO
Grupos
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
PER
Letras distintas denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
No 291° dia de experimento (animais na fase adulta da vida) foi determinado
o Índice de Crescimento (IC). Nesta fase, o grupo de animais que consumiu ração à
base de soja geneticamente modificada (GG) apresentou IC semelhante ao grupo
que consumiu soja orgânica suplementada com 0,3% L-cistina (GO) e ambos foram
iguais ao GC (Figura 5).
a
b
c
Protein Efficacy Ratio
Figura 5. Gráfico dos valores de Índice de Crescimento (IC) dos grupos no 291° dia
de experimento.
GC GSG GSO
Grupos
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
IC291
Letras distintas denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
No 455° dia de experimento, fase em que os quais são considerados senis,
obserervou-se que o IC foi semelhante para os grupos com ração à base de soja (Figura
06), sendo o GO apresentado valor de 1,07 ± 0,07 e o GG valor de 1,07 ± 0,12 e estes
também foram semelhantes ao GC (1,14 ± 0,12).
GC GG GO
Grupos
Índice de Crescimento
291 dias
Figura 6. Representação gráfica dos valores do Índice de Crescimento (IC) dos
grupos no 455° dia de experimento.
GC GSG GSO
Grupos
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
IC455
Letras distintas denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
GC GG GO
Grupos
Índice de Crescimento
455
dias
5.5 DADOS BIOQUÍMICOS
Os dados relativos à bioquímica do ensaio biológico estão apresentados na Tabela
8. O GO e GG apresentaram valores inferiores de hematócrito (p<0,04) e hemoglobina
(p<0,03) em relação ao GC. Já as concentrações séricas de albumina e proteínas totais
não apresentaram diferença entre os grupos.
Observando as médias referentes as concentrações séricas de colesterol, os
grupos que receberam ração à base de soja, sendo eles o GO e GG apresentaram
concentrações inferiores (p<0,0001) ao GC, obtendo uma redução média de 33,60% nos
níveis de colesterol plamático em relação ao GC. As concentrações séricas de
triglicerídeos também foram semelhantes nos grupos que consumiram ração à base de
soja. Ambos os grupos foram inferiores (p<0,0072) ao GC, que apresentou média de 25%
superior em relação ao GO e ao GG.
Na concentração sérica de insulina nenhum dos grupos mostrou-se diferente. Já o
GC apresentou média superior (p<0,0013) para as concentrações séricas de glicose, em
relação aos grupos GO e GG. Não foi encontada nenhua diferença significativa quando
realizado o indice glicose/insulina.
Tabela 8. Valores das análises bioquímicas de hematócrito, hemoglobina, albumina,
proteínas totais, colesterol, triglicerídeos, insulina e glicose dos grupos experimentais ao
final do experimento (455 dias).
GC GO GG
P-valor
Hematócrito (%) 47,10 ± 1,29
a
44,80 ± 0,60
b
44,15 ± 1,02
b
0,0485
Hemoglobina (g/dL) 15,21 ± 1,28
a
12,17 ± 0,81
b
13,67 ± 0,74
b
0,0310
Albumina (g/dL) 4,41 ± 0,25 4,50 ± 0,42 4,63 ± 0,37 0,3316
Proteínas
Totais (g/dL)
8,10 ± 0,77 8,04 ± 0,40 7,66 ± 0,35 0,1566
Colesterol (mg/dL) 119,56 ± 20,98
a
79,41 ± 9,27
b
79,27 ± 8,38
b
0,0001
Triglicerídeos (mg/dL)
154,02 ± 19,53
a
112,85 ± 22,37
b
122,32 ± 21,86
b
0,0072
Insulina (µU/mL) 71,33 ± 11,41 62,58 ± 14,36 62,39 ± 6,09 0,0562
Glicose (mg/dL) 86,33 ± 3,30
a
73,52 ± 4,94
b
73,31 ± 3,06
b
0,0013
Glicose/Insulina 1,21 ± 0,10 1,19 ± 0,16 1,18 ± 0,12 0,7158
Os valores estão apresentados na forma de média ± desvio padrão; GC – ração à base de caseína; GO –
ração à base de soja orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada; Letras distintas em
uma mesma linha denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
5.6 HISTOLOGIA
Na tabela 9, observa-se que os grupos GO e GG apresentaram um peso do
coração inferior (p<0,0027) em relação ao GC. Não houve distinção entre os valores de
peso de VE e das relações entre o coração e o peso corporal e o peso do VE e o peso do
coração dos grupos experimentais comparados ao GC.
Houve uma grande diferença nos depósitos de gordura corporal analisado dos
grupos estudados, sendo o GO e GG apresentando valores semelhantes, porém
significativamente inferiores (p<0,0022) ao GC.
Tabela 9. Valores de peso do coração, ventrículo esquerdo (VE), relação coração/massa
corporal, relação VE/coração e peso da gordura perirenal, periepididimal e retroabdominal.
GC GO GG
P-valor
Peso Coração (g) 1,7084
a
± 0,0998
1,6042
b
± 0,1572
1,4792
b
± 0,0134
0,0027
Peso do
Ventriculo Esquerdo
(VE) (g)
1,1892
± 0,1068
1,0836
± 0,1775
1,0460
± 0,1263
0,0598
Relação
coração/massa
corporal final
0,1722
± 0,0096
0,1861
± 0,0199
0,1736
± 0,0204
0,1959
Relação
VE/coração (%)
69,58
± 4,27
67,47
± 7,64
71,00
± 8,24
0,4465
Gordura perirenal,
epididimal e
retroabdominal (%)
36,5069
a
± 3,0776
26,9647
b
± 1,1669
27,6478
b
± 1,8757
0,0022
Os valores estão apresentados na forma de média ± desvio padrão; GC – ração à base de caseína; GO
– ração à base de soja orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada; Letras distintas
em uma mesma linha denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
A aorta é composta por três túnicas, sendo elas a íntima, média e adventícia como
observamos na Figura 7. A espessura destas túnicas, graficamente representada na
Figura 8, demonstra que os grupos que consumiram soja apresentaram espessura da
intima e média (já que foram avaliadas juntas) inferiores (p<0,00034) ao GC. A adventícia
(Figura 9) se mostrou semelhante a íntima e a média, sendo inferior (p<0,0095) nos
grupos GO e GG em relação ao GC. Ao somar os valores das túnicas para obter o valor
real da espessura da parede da artéria (Figura 10), observou-se que a tendência se
manteve e o GC apresentou uma maior espessura (P<0,0103) em relação ao GO e ao
GG.
Figura 7. Reprodução das fotomicrografias das túnicas da aorta dos grupos estudados.
As imagens foram capturadas com objetivas de imersão (10x); GC – ração à base de caseína; GO –
ração à base de soja orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada
GO
GC
GG
Intima e Média
Adventicia
Figura 08. Espessura (µm) tecidual da camada média e intima da artéria aorta
coronariana.
Letras distintas denotam significância estatística ao nível de p≤0,05.
*
GC GG GO
Grupos
300
500
700
900
Media.e.Intima
Espessura (µm) da camada Íntima e Média
a
b
b
Figura 10. Espessura (µm) tecidual da camada adventícia da artéria aorta coronariana.
GC GG GO
Grupos
100
150
200
250
300
350
Adventicia
Letras distintas denotam significância estatística ao nível de p≤0,05
b
b
a
Espessura (µm) da camada Adventicia
Figura 10. Espessura (µm) da artéria aorta (intima, média e adventícia) coronariana dos
grupos estudados.
GC GG GO
Grupos
500
700
900
1100
1300
I.M.A
Letras distintas denotam significância estatística ao nível de p≤0,05
b
b
a
Espessura (µm) da camada Íntima, Média e Adventicia
Na Figura 11 estão representadas as fotomicrografias do VE dos grupos estudados.
A pocentagem da área ocupada pelo colágeno no VE dos grupos experimentais foi
semelhante a do grupo controle, como apresentado na Figura 12. Sendo que a proporção
de colágeno variou em média de 27,12% para o GO, 26,60% para o GG e 30,15% para o
GC.
Figura 11. Fotomicrografia do ventrículo esquerdo (VE) dos grupos estudados.
As imagens foram capturadas com objetivas de imersão (10x); GC – ração à base de caseína; GO – ração à
base de soja orgânica; GG – ração à base de soja geneticamente modificada.
GC GG GO
Figura 12. Porcentagem de área ocupada por colágeno (V
vi(i%)
) presente no VE
dos animais.
GC GG GO
Grupos
10
20
30
40
Colageno
Letras distintas denotam significância estatística ao nível de p≤0,05
Área ocupada por colágeno (V
vi(i%)
)
6 DISCUSSÃO
6.1 COMPOSIÇÃO DAS MATÉRIAS PRIMAS UTILIZADAS PARA CONFECÇÃO DAS
RAÇÕES
Para formulação de rações experimentais se faz necessário conhecer a composição
de todo e qualquer produto adicionado para o preparo destas, principalmente das matérias
primas utilizadas como fonte de proteína. Para tal realizou-se a composição centesimal
das amostras de soja orgânica, soja geneticamente modificada e caseína.
Observou-se que os valores médios da composição centesimal das duas
variedades de soja no presente estudo estão de acordo com a literatura atual. Gomes et
al., (2000) ao avaliarem o teor protéico da farinha de soja produzido com grãos torrados,
encontraram um percentual de 49,66% de proteína. Os resultados deste trabalho ainda
corroboram com valores médios encontrados por Lima et al., (1999) para farinha de soja
com teor de proteína igual a 45%. Já Monteiro et al., (2004) encontraram um valor de 38-
42% de proteína no grão. Observamos ainda que o teor de umidade, cinzas e extrato
etério e fibras nas duas variedades de soja foram semelhantes
A caseína é uma proteína de origem animal recomendada pelo American Intitute of
Nutrition (Reeves et al., 1993) para ser utilizada como proteína padrão em ensaios
experimentais que utilizem animais de laboratório. Neste estudo utilizou-se a caseína
adquirida comercialmente, onde em sua composição existem outros componentes, por
tanto não se apresenta na sua forma 100% purificada. Em nossas análises foi relatado um
teor médio de 86% de proteína, informação que está de acordo com o informado pelo
fabricante.
Ensaios biológicos descritos por Sgarbieri (1987) mostram que a composição das
dietas e a biodisponibilidade dos nutrientes essenciais nelas contidos, são proporcionais
ao índice indicativo do valor nutritivo das rações. Para tal realizou-se a composição
centesimal das rações já balanceadas segundo as recomendações do American Institute
of Nutrition (Reeves et al., 1993). As rações utilizadas neste ensaio podem ser
consideradas isoprotéicas, já que apresentavam concentrações semelhantes de proteína.
Sabe-se que, de uma forma geral, a concentração de isoflavonas nos grãos de soja
é geneticamente controlada e influenciada pelas condições ambientais, sendo a
temperatura durante o desenvolvimento do grão o fator de maior influência (Carrão-Panizzi
et al., 1998; Tsukamoto et al., 1998). Assim fez-se necessário à dosagem destes
fitocompostos nas rações, dado que tanto a procedência e a localidade do plantio das
amostras de soja eram desconhecidas quanto a quantidade de isoflavonas presentes nas
rações, já que estas eram intrínsecas ao grão e não foram adicionadas as rações ou
administardas isoladamente.
Mesmo sendo duas variedades distintas de soja, estas se apresentaram com
concentrações de isoflavonas semelhantes. Góes-Favoni et al. (2004), ao estudarem a
influência do tratamento térmico na concentração de isoflavonas em farinha de soja,
encontraram a isoflavona Glicitina como limitante, ou seja, em menor concentração, sendo
a Daidzeína e a Genisteína presente em quantidades inferiores a Genistina e Dadzina,
fato que também foi observado em nosso estudo.
6.2 VARIAÇÃO DE PESO, CONSUMO E INDICADOR BIOLÓGICO DE PROTEÍNA
Ao 28° dia de experimento as rações à base de soja não foram suficientes para
promover um crescimento e desenvolvimento semelhante ao GC, que recebeu ração à
base de caseína. É sabido que os primeiros 49 dias de vida dos animais, que
compreendem 21 dias até o desmame e 28 dias após este, é um período de extrema
importância para o animal, onde se faz necessário um aporte protéico suficiente para
promover um crescimento e desenvolvimento adequado.
Bressani (1975) encontrou valores de PER igual a 2,44 para o isolado de soja e um
PER de 2,23 para farinha de soja, onde os grãos foram tratados termicamente. Já
Monteiro et al. (2004) encontraram em média um PER de 1,3 ao estudarem linhagens de
soja com ausência do inibidor de Tripsina Kunitz e das isoenzimas Lipoxigenases. Miura et
al. (2001), relataram em estudo similar um PER de 2,24, Sarwar et al. (1989) fazendo a
avaliação biológica de soja encontraram um valor de 2,49.
Freidman (1996), na sua revisão de literatura sobre o valor de proteínas de
diferentes fontes alimentares, descreveu que geralmente o valor de PER acima de 2,00
está relacionado com proteína de boa qualidade e o valor de PER abaixo de 1,50, com
proteína de qualidade baixa a pobre.
Observamos que mesmo suplementada com L-cistina, a soja orgânica (GO) obteve
um aproveitamento protéico inferior à caseína (GC). Vale ressaltar, que neste período os
grupos que receberam ração à base desta leguminosa, apresentaram um menor consumo
em relação ao GC. O GG, que não recebeu esta suplementação, apresentou o menor
valor de PER, sugerindo que a suplementação com L-cistina em dietas à base de soja
torna-se essencial, no período que compreende a infância, para gerar um crescimento e
desenvolvimento satisfatório. Já que o GO apresentou um PER de 3,7 ± 0,3, sendo
superior ao GG.
Segundo Angelis (1995) a deficiência de alguns aminoácidos, principalmente o
triptofano, segundo aminioácido limitante da soja, ou tirosina, pode ter influência
acentuada na capacidade de os animais selecionarem os alimentos (apetite específico),
sendo estes efeitos mediados tanto pela serotonina (do qual o tripitofano é precursora)
como pela catecolamina (da qual a tirosina é precursora). Há sugestões também que tanto
a serotonina quanto a catecolamina têm influência no apetite dirigido na escolha de
alimentos. Esta também dependeria de relações entre aminoácidos que atravessam a
barreira hematoencefálica também regulada pela quantidade de carboidratos e gorduras.
De acordo com Monteiro et al., (2004) além de a soja apresentar a metionina como
seu aminoácido limitante, as proteínas de soja apresentam estruturas mais organizadas
que a caseína. Os que as tornam mais resistentes ao ataque enzimático, logo
proporcionam uma menor digestibilidade, conseqüentemente um menor aproveitamento
desta proteína.
Sgarbieri (1996), afirma que as enzimas lipooxigenases (LOX) presentes no grão de
soja oxidam rapidamente ácidos graxos poli-insaturados gerando peróxidos de ácidos
graxos que se degradam em aldeídos e cetonas voláteis. Com isso há formação do beany
flavor, conseqüentemente alteração da palatabilidade da ração. Assim pode-se sugerir que
o menor consumo dos grupos a base de soja, em relação ao grupo controle, pode estar
relacionado à alteração do sabor devido à atuação destas enzimas. As enzimas LOX são
intrínsecas aos grãos de soja e dificilmente são completamente inativados com o
tratamento térmico e a modificação genética (Martins et al., 2002).
Marlett et al. (2002) afirmam que as fibras solúveis desenvolvem alta viscosidade,
que é freqüentemente associada com os efeitos da fibra na diminuição do esvaziamento
gástrico, promovendo a sensação de saciedade. Provavelmente reduzindo o consumo e
conseqüentemente o ganho de massa corporal. Isso pode justificar a redução do consumo
de dieta, no presente trabalho, com aumento do fornecimento de fibras solúveis que são
intrínsecos do grão da soja, que pode ter tido uma conseqüência na redução do ganho de
massa dos animais. Já que cerca de 46% das fibras presentes nos grãos de soja se
apresentam na forma de fibras solúveis (Monteiro et al., 2004).
Segundo Oliverira & Angelis (2001), ao estudarem requerimentos protéicos em
animais com idade média de 300 dias, relataram que é provável que a proporção de
aminoácidos requeridos se altere com a maturidade do animal, visto que a necessidade de
aminoácidos individuais depende do tipo e da quantidade de tecidos a serem sintetizados
e mantidos. E que, proporcionalmente ao total de proteína da dieta, há menor necessidade
de lisina e maior de sulfurados, principalmente cisteína, com envelhecimento.
Assim, nossos resultados vão contra estes autores, já que os indicadores de
aproveitamento protéico dos grupos experimentais foram semelhante ao grupo controle
somente na fase adulta e na velhice. Ficando claro que a não suplementação de L-cistina
na dieta da soja geneticamente modificada, comprometeu o crescimento dos animais na
principal fase de crescimento 28 dias após o desmame.
No entanto, observou-se que ao 291° dia de experimento, fase adulta dos animais,
mesmo que o consumo de proteína dos grupos à base de soja, tenham apresentado-se
inferior ao GC, estes possuíam massa corporal semelhante com IC iguais. Na fase adulta
os animais que se alimentaram com dieta à base de soja já haviam compensado o baixo
aproveitamento protéico obtido na infância. Em estudo prévio em nosso laboratório,
Soares et al. (2005) encontraram resultados similares para ratos Wistar fêmeas com 291
dias de idade. Neste mesmo trabalho, o autor sobressaltou a importância do controle da
massa de gordura corporal no aparecimento de doenças cardiovasculares.
Ao final dos 455 dias, animais senis, os grupos GO e GG mostravam-se com massa
corporal inferior ao GC, no entanto apresentavam IC semelhante ao GC. Indicando que os
animais que receberam ração à base de soja, obtiveram um crescimento e
desenvolvimento satisfatório, entretanto com menor massa corporal.
A gordura visceral (perirenal, periepididimal e retroabdominal) dos animais,
observou-se uma maior reserva de tecido adiposo nos grupos que receberam dieta à base
de caseína. O GC apresentou em média, um valor percentual de 28% superior aos grupos
que consumiram soja. Novamente, assim como na fase adulta, os animais chegaram à
velhice com uma menor massa corporal e ainda com um menor depósito de gordura
visceral. Tal fato nos faz considerar que dietas balanceadas à base de soja em
substituição a proteína animal, podem ser vistas como um auxilio no tratamento da
obesidade.
6.3 BIOQUÍMICA
O plasma humano contém diversas proteínas que representam papel importante na
manutenção da pressão osmótica em diferentes funções como proteínas carreadoras,
anticorpos, enzimas, inibidores enzimáticos, fatores de coagulação, entre outras. As
determinações de suas concentrações séricas são de grande auxílio na avaliação do
estado nutricional e de doenças sistêmicas agudas ou crônicas (Oliveira & Angelis, 2001;
Doweiko et al., 1991; Santos et al., 2004).
No presente trabalho as concentrações séricas de albumina e proteínas totais não
diferiram dos grupos GO e GG para o GC. Este resultado corrobora com McVeigh et al.
(2006), que ao avaliar a influência do consumo de soja e isoflavonas no aparecimento de
cancer de próstata em homens, observou a normalidade e manutenção dos níveis séricos
de albumina e proteínas totais, relatando que uma dieta balanceada à base de soja
consegue manter a homeostase na concentração de proteínas séricas que desempenham
funções vitais do organismo. Observou-se que as dietas à base de soja forneceram um
aporte energético-protéico suficiente para promover um equilíbrio na produção de
proteínas plasmáticas dos animais que as consumiram.
Dados de ingestão são de grande importância na análise dos resultados
hematológicos, uma vez que a dieta fornece tanto inibidores quanto promotores da
absorção de ferro, além de ser determinante do estado nutricional do indivíduo. Várias
medidas são utilizadas para aferir o estado nutricional de micronutrientes, as quais estão
os níveis séricos de hematócrito e hemoglobina como marcadores do estado nutricional de
ferro (Sant’ana et al., 2006).
No presente estudo, os grupos alimentados com dietas à base de soja
apresentaram concentrações séricas de hematócrito e hemoglobina inferiores ao GC.
Segundo alguns autores a biodisponibilidade do ferro oriundo da ferritina tem sido alvo de
grandes controversias. Vários estudos têm mostrado que ferro provindo da soja , o qual
grande parte está presente na forma de ferritina (Ambe et al., 1997; Burton et al.,1998),
possui uma ótima utilização pelo organismo (Murray-Kolb et al., 2003; Beard et al.,1996;
Davila-Hicks et al., 2004), no entanto não discutem a influência das elevadas
concentrações de fitato (Waldo et al., 1995), um quelante natural do ferro e de outros
minerais. Outros estudos envolvendo soja, onde as concentrações de ferritina e fitato eram
elevadas, sugerem uma baixa biodisponibilidade de ferro (Davila-Hicks et al., 2004;
Layrisse et al., 2005).
Sant’Ana et al. (2000), estudando o valor nutritivo da soja, verificaram que esta é
fonte potencial de minerais, como o ferro, cálcio e zinco, entretanto pouco, ou quase nada,
se sabe sobre sua biodisponibilidade, que pode estar comprometida pela presença de
fitatos, oxalatos e inibidor de tripsina.
O ferro também estabelece interações negativas com constituintes dietéticos, como
cobre, zinco e cálcio, com os quais compete pelo sítio de ligação para absorção. Vários
estudos têm reportado a incontestável inibição exercida por algumas substâncias químicas
sobre a absorção de ferro não-heme, proveniente de alimentos de origem vegetal. Entre
essas substâncias, citam-se fitatos, oxalatos, taninos e polifenóis, que formam complexos
insolúveis com o ferro na luz intestinal (Zijp et al., 2000).
As rações experimentais não tinham como fonte exclusiva os minerais contidos na
soja, pois estas foram balanceadas segundo o AIN-93 (Reeves et al., 1993). No entanto,
os animais dos grupos GO e GG apresentaram uma leve depleção nas concentrações de
hematócrito e hemoglobina, sugerindo que a exposição de uma dieta à base de soja
desde a infância até a velhice promoveu um possível comprometimento no aproveitamento
do ferro ingerido.
Ao estudar animais que foram recuperados do estado de desnutrição, Lucas (2005)
observou que grupos que se alimentaram com dietas à base destas mesmas sojas
suplementadas com L-cistina, apresentaram níveis plasmáticos de hematócrito e
hemoglobina semelhantes ao grupo controle. No entanto a aferição dos níveis séricos
destes marcadores ocorreu ao 63° dias de vida destes animais.
Resultado semelhante foi encontrado por Kobayashi et al. (2006), que ao avaliar a
influência de polissacarídeos (SPS) presentes no Shoyu, resultante da fermentação
incompleta de bactérias na transformação do grão de soja para o molho Shoyu,
observaram que o SPS é capaz de aumentar a solubilização do ferro, consequentemente
aumentado sua absorção. Relatou ainda que animais anêmicos que consumiram dieta
isenta de ferro durante 14 dias, se recuperaram do estado de anemia instaurada
apresentando em média um hematócrito de 39% e níveis de hemoglobina de 13%.
A adição de soja na dieta ou a utilização da proteína vegetal em substituição da
proteína animal tem despertado um interesse científico devido a uma redução nas
concentrações plasmáticas de colesterol total e triglicerideos em animais de laboratório e
em humanos (Demonty et al.,2002; Favier et al., 1998).
Os valores das concentrações plasmáticas de colesterol foram inferiores para os
grupos que consumiram dietas à base de soja, que apresentavam redução média de 34%
em relação ao GC. Este achado corrobora com a literatura, onde diversos estudos
atribuem à soja um poder hipocolesterolemiante (Carr et al. 2003; Perez-Rodrigo et al.,
2006).
Numerosas tentativas têm sido feitas para explicar os mecanismos pelos quais a
soja, suas proteínas e seus aminoácidos poderiam alterar a concentração plasmática de
colesterol total (Carrol, 1991; Carr & Jesch, 2006). Potter (1995) fez importante revisão
sobre estes mecanismos, e cita que os três possíveis são através do aumento da
excreção de ácidos biliares; efeitos no metabolismo hepático do colesterol, afetando a
atividade da enzima HMG-CoA redutase e efeitos endócrinos, envolvendo insulina,
glucagon e hormônios tireoidianos.
Quando coelhos foram alimentados com proteína de soja notou-se que a principal
alteração ao nível hormonal foi à diminuição da relação insulina/glucagon. Isto porque,
uma baixa relação de lisina/arginina diminui a secreção de insulina e aumenta a de
glucagon. A relação inversa, ou seja, alto teor de insulina/glucagon é estimulante da
lipogênese e, portanto, aumenta o risco de doença cardiovascular (Potter, 1996).
O mecanismo de aumento da excreção fecal de ácidos biliares e esteróis neutros
pelas fezes, proposto por Huff & Carrol (1980), foi verificado principalmente em coelhos e
ratos, sendo em humanos os resultados menos consistentes. Beynen et al. (1985)
sugerem que a proteína de soja agiria como fibra na redução do colesterol sérico,
interrompendo a reabsorção e recirculação entero-hepática de sais biliares. Sugerem que
a ativação dos receptores LDL-C seria apenas um efeito secundário.
Sugano et al. (1993) concluíram que uma fração não digerível da proteína de soja
tem efeito hipocolesterolemizante em ratos alimentados com dieta rica em colesterol ou
isenta do mesmo. Quando esta fração indigerível foi submetida a um processo de digestão
e administrada aos animais, o efeito hipocolesterolemizante foi reduzido. Uma das
hipóteses sugeridas seria que uma seqüência de peptídeos poderia alterar a absorção de
colesterol e ácidos biliares. Estes mesmos autores relataram em 1990 (Sugano et
al.,1990) que esta fração indigerível foi capaz de aumentar a excreção fecal de esteróis
neutros em 65-95% e de ácidos biliares em 80-170% quando comparada a proteína de
soja integral. Quando a fração protéica indigerível de alto peso molecular (APM) foi
desengordurada com metanol (duas vezes por 1 hora em temperatura ambiente), a
capacidade de aumentar a excreção de esteróis nas fezes desapareceu, tanto no grupo
tratado com o peptídeo, quanto o tratado com extrato; e a capacidade de reduzir o
colesterol plasmático também não foi intensa, quanto hidrolisado antes da extração. Como
mesmo após a reconstituição de uma fração em outra, nem a capacidade
hipocolesterolemizante nem a excreção de esteróis fossem semelhantes à da APM,
imagina-se que o processamento tenha interferido desnaturando os peptídeos o que
resultou em menor capacidade de ligar ácidos biliares (Sugano et al., 1990).
Uma menor eliminação e o concomitante aumento na captação de ácidos biliares
deveriam levar a hipercolesterolemia, uma vez que o aumento na chegada de colesterol
no fígado levaria a uma diminuição da síntese de ácidos biliares a partir do colesterol,
provocando seu acúmulo e diminuição da síntese de receptores para LDL-C
(Kuyvenhoven et al., 1986). Estes autores sugerem que a redução da excreção de esteróis
nos coelhos alimentados com caseína seria causa e não a conseqüência.
A maior excreção de ácidos biliares estaria relacionada a algum ligante intestinal ou
a maior retenção dos mesmos devido à viscosidade do meio assim como ocorre com
fibras solúveis, no intestino delgado (Vahouny, 2003). Além disso, poderia ser resultado de
um aumento na síntese de ácidos biliares, que também ocorre como mecanismo de ação
hipocolesterolemizante das fibras (Moundras et al. 1997). No entanto, em alguns relatos,
não foi observado aumento da excreção de ácidos biliares nas fezes nestas dietas
redutoras de colesterol (Arjmandi et al. 1992; Carr et al. 2003).
Sabe-se ainda que dietas ricas em frutas e vegetais previnem contra diversas
patologias e, particularmente, doenças cardiovasculares (Perez-Rodrigo et al., 2006).
Substâncias antioxidantes presentes na dieta, bem como a presença de fibras alimentares
são, provavelmente, os responsáveis por esse efeito protetor (Ross & Kasum, 2002).
Estudos epidemiológicos têm evidenciado a relação inversa entre a ingestão habitual de
fibras alimentares e o risco de doenças cardiovasculares (Anderson & Hanna, 1999). As
fibras alimentares, especialmente as fibras solúveis, efetivamente reduzem os níveis
plasmáticos de colesterol, o que pode contribuir de maneira direta na proteção contra as
doenças cardiovasculares (Fernandez, 2001).
As fibras solúveis e insolúveis podem adsorver os ácidos biliares, reduzindo a
formação de micelas, com conseqüências na redução da absorção intestinal de colesterol
com reflexo na colesterolemia (Favier et al., 1998). Além disso, as fibras solúveis são
fermentadas pela microbiota do intestino grosso em graus variáveis produzindo ácidos
graxos de cadeia curta os quais atingem a circulação por meio de veia porta. Uma vez no
fígado esses ácidos graxos podem influênciar o metabolismo lipídico, causando efeito
hipocolesterolêmico (Sembries et al., 2003). Tais ácidos graxos, principalmente
propionato, acetato e butirato, reduzem a atividade da HMG-CoA redutase a enzima
hepática que limita a síntese do colesterol (Yokoyama et al., 2003).
Dados na literatura atual reportam que dentre as principais causas de
desenvolvimento de doenças cardiovasculares está na alta concentração dos lipídeos
séricos. E que uma dieta à base de proteína de origem animal, pode aumentar as
concentrações séricas de triglicerídeos em relação a uma dieta à base de proteína
vegetal, rica em fibras e fitoestrógenos (Akbartabartoori et al., 2007; Oharaa et al., 2007).
Este trabalho indicarou claramente que o consumo de uma dieta à base de soja
comparada com caseína reduz os níveis séricos de triglicerídeos. Estudando isoflavonas
de soja, Nogowski et al. (1998) também encontrou redução nas concentrações
plasmáticas de triglicerídeos em ratos Wistar quando adicionado Genisteína a uma dieta
purificada em uma concentração de 0,1%. Em humanos foi encontrada uma relação
inversa entre concentrações de triglicerídeos séricos e excreção urinária de Genisteína,
sugerindo que o consumo de isoflavonas exerça influência sobre a trigliciridemia,
reduzindo os níveis séricos de triglicerídeos (Sirtori et al., 2002).
Em contraste, Anthony et al. (1996) comparando os efeitos de dietas baseadas em
proteínas isoladas de soja e proteínas isoladas de soja com extração das isoflavonas
utilizando etanol, mostraram que ambas as dietas não exerceram efeitos na trigliceridemia
de macacas. Demonty et al. (2002) relataram que adição de isoflavonas (Genisteína e
Daidzeína) em uma dieta à base de caseína conseguiu reproduzir o efeito
hipotrigliceridemiante. Sugerindo ainda, que o balanço energético, que se reproduziu na
massa corporal inferior ao grupo controle teve uma relação direta com os níveis séricos de
triglicerídeos.
No presente estudo, foi observado que os animais que se alimentaram com dieta à
base de soja, contendo a soja como fonte de proteína e as isoflavonas intrínsecas a elas,
além de obterem menor massa corporal, obtiveram concentrações séricas de triglicerídeos
inferiores ao grupo que consumiu caseína como fonte de proteína.
Já é bem documentado na literatura (Barzillai et al.,1998; Atzmon et al., 2002;
Bluher et al.,2003) que o envelhecimento está associado a um progressivo aumento das
concentrações plasmáticas de insulina, resistência à insulina e à intolerância a glicose.
As dosagens das concentrações séricas de insulina mostrou que não houve
diferença significativa entre os grupos, no entanto os animais que consumiram dietas à
base de soja, apresentaram concentrações de insulina numericamente inferiores ao GC,
sugerindo uma tendência a hiperinsulinemia neste grupo. Em relação à concentração
sérica de glicose, os grupos alimentados à base de soja, apresentavam menor
concentração sérica de glicose em relação aos animais que consumiram caseína.
Alguns autores relatam que o aparecimento da resistência à insulina, desenvolvido
com a idade, é uma conseqüência do aumento do tecido adiposo, em especial o tecido
adiposo intraabdominal. Catalano et al. (2005), observaram que ratos de 24 meses que
durante toda a vida passaram por um esquema de restrição calórica, apresentavam cerca
de 40% menos gordura intraabdominal do que animais jovens que consumiram dietas ad
libtum. Percebeu-se ainda que estes animais apresentavam níveis regulares de insulina e
glicose.
Segundo Shimazu et al. (2007) a soja oferece benefícios na prevenção do diabetes
e na gerência clínica do diabético. O consumo de soja, bem como outras leguminosas,
reduz o risco de desenvolver diabetes, da mesma maneira que em outros estudos foi
relacionada com a prevenção da obesidade, dado que esta leguminosa em questão
apresenta elevados teores de fibras, boa qualidade lipidica e baixo índice glicemico. Em
diversos estudos os pesquisadores observaram uma associação inversa significativa entre
o consumo de fibras totais e o risco de desenvolvimento do diabetes tipo 2 (Ezaki et al.,
2007; Ristic et al., 2007).
Os animais dos grupos GO e GG, apresentaram menor quantidade de gordura
intraabdominal com cerca de 28% a menos desta gordura em relação ao GC. Levando em
consideração que os animais eram considerados senis, as dietas à base de ambas as
variedades de soja foi capaz de promover na fase de envelhecimento melhores
concentrações de insulina e glicose nestes animais. Fato que nos leva a considerar um
possível efeito benéfico do consumo de soja na regulação e manutenção da homeostase
glicemica.
6.4 PESO DO CORAÇÃO E HISTOLOGIA DA AORTA E VENTRICULO ESQUERDO
Sendo o rato Wistar um animal albino, eles possuem uma vida média de
aproximadamente 18 meses, e somente uma porcentagem pequena vive até a idade de 3
anos, que é considerada a extensão normal máxima de vida dos ratos albinos (Gerrity
Cliff, 1972). É evidente que fatores como dieta e condições de sobrevida têm um papel
importante na sobrevivência além de 18 meses da idade. Este estudo trabalhou com ratos
de até 14 meses de idade, o que segundo Águila et al. (2002) aponta para um animal com
idade avançada, assim o período de 14 meses é suficiente para considerar animais
envelhecidos.
O envelhecimento está geralmente com associado a mudanças no sistema
cardiovascular, em especial nas estruturas e função das artérias. Segundo alguns autores
o processo de envelhecimento e mudanças estruturais e funcionais nas artérias ficam bem
evidenciados, quando, junto com o processo de envelhecimento, é administrada a longo
prazo uma dieta com alta concentração de colesterol, causando hipertrofia cardíaca,
fibrose miocárdica e espessamento das artérias com acumulo de colágeno no tecido
cardíaco dos animais (Águila & Mandarim-mandarim-de-Lacerda, 2000; Águila e
Mandarim-mandarim-de-Lacerda, 2001).
A importância dos níveis plasmáticos de colesterol na patogênese das doenças
cardiovasculares, particularmente da aterosclerose, tem sido reportada por inúmeros
autores (Ozkan, 2007; Wang et al., 2007; Ardern & Janssen, 2007) . O aumento dos níveis
de colesterol plasmático leva a um aumento na produção dos radicais livres (Ismail et al.,
1999), que podem causar danos no DNA, nas proteínas e lipídios de membrana (Halliwell,
1994) e reações locais na parede vascular (Berk, 2001). Esses danos podem ser críticos
no desenvolvimento do câncer, diabetes, inflamações crônicas e aterosclerose (Halliwell,
1994; Griendling & Harrison, 1999). Como resposta a esses fatores, as células podem
sofrer hiperplasia (aumento no número) ou hipertrofia (aumento no tamanho sem alterar o
DNA). Assim, a aterosclerose e a hipertensão podem promover remodelamento vascular
pela interação entre as células endoteliais e as musculares lisas vasculares (Berk, 2001).
De fato, a injúria na carótida pode levar ao espessamento da camada íntima desse
vaso em ratos (Clowes et al., 1983), porcos, camundongos, macacos e humanos e em
outras artérias, tais como aorta, ilíaca, femoral e braquial (Rudic et al., 1998). Muitas
moléculas que regulam o crescimento das células musculares lisas vasculares têm sido
estudadas e os resultados sugerem importante papel para o óxido nítrico (Rudic et al.,
1998) e para estímulos (O
2
-
, H
2
O
2
e OH
-
) oriundos do estresse oxidativo (Konneh et al.,
1995; Gong et al., 1996; Berk, 2001) que pode, promover hipertrofia celular (Rao & Berk,
1992; Berk, 2001).
Guida-Cardoso et al. (2004) estudaram hamsters alimentados com dieta
hipercolesterolêmica e observaram que estes animais apresentaram aumento na
peroxidação lipídica em decorrência do aumento das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS), sugerindo assim, aumento nos níveis de radicais livres e
remodelamento aortico, com espessura da intima, média e adventícia aumentada nestes
animais.
O aumento na produção de radicais livres pode estar associado com a inativação
do óxido nítrico, importante modulador biológico envolvido não apenas no controle da
musculatura lisa vascular, mas também em inúmeras funções regulatórias como por
exemplo, mecanismos de inibição da proliferação do músculo liso vascular (Boulanger,
1999; Vaziri et al., 2000; Scott et al., 2001; Pinto et al., 2003).
O remodelamento do vaso que leva a hipertrofia pode ser definido como um
processo de redução do diâmetro no lúmen conseqüente ao espessamento da parede
desse vaso, como ocorre na hipertensão arterial (Mulvany et al., 1996).
A morfométria da aorta evidenciou um menor remodelamento na parede vascular
dos ratos alimentados com dieta à base das duas variedades de soja, com um menor
espessamento na musculatura lisa vascular da aorta desses animais. Sugerindo que uma
dieta à base de soja, rica em fitoestrógenos reduz o remodelamento aórtico em ratos
Wistar senis. Vale ressaltar que o remodelamento foi menor nos grupos que apresentavam
as menores concentrações de colesterol e triglicerídeos plasmáticos.
Alguns autores (Adams et al., 2004; Adams et al., 2007; Knock et al., 2006) relatam
que estes benefícios vasculares não se devem apenas devido à redução dos níveis de
colesterol e triglicerídeos, mas também a uma combinação de fatores intrínsecos à soja,
como sua isoflavonas, pepitídeos 7S e 11S além do seu perfil aminoacidico que estimula a
produção de óxido nítrico pelas células endoteliais.
Mujumdar et al. (2001) demonstraram que existe relação intíma entre a diminuição
na produção do óxido nítrico vascular e hipertrofia vascular, com conseqüente
espessamento da camada média da aorta em ratos.
O coração é composto, fundamentalmente, por miócitos, vasos e matriz intersticial
colágena. Esses três compartimentos, em equilíbrio, contribuem para a manutenção da
forma e da função cardíaca. Alterações nas composições desses compartimentos refletem
o processo de remodelação miocárdica que está intimamente associado com a disfunção
cardíaca. Essa remodelação ocorre em resposta a estímulos desencadeados por agentes
mecânicos ou humorais sobre o tecido cardíaco (Brilla et al., 1996; Swynghedauw, 1999;
Weber, 2000).
Na prática clínica, observa-se hipertrofia mais freqüentemente associada à
sobrecarga hemodinâmica imposta pela hipertensão arterial ou aumento de volume
decorrente de alguma doença ou em função da idade avançada. Na sobrecarga de
pressão há estímulo para síntese de sarcômeros em paralelo com aumento da espessura
da parede ventricular, sendo esse fenômeno denominado de hipertrofia concêntrica. Na
sobrecarga de volume ocorre aumento de sarcômeros em série, associado ao
deslizamento de feixes de miócitos, resultando em hipertrofia excêntrica. A hipertrofia
cardíaca, quando presente, constitui fator independente de maior morbidade e mortalidade
por eventos cardiovasculares (Deverux, 2000; Ciardullo et al., 2004).
Nessa condição, é descrito que o aumento desproporcional da matriz intersticial
colágena pode ocasionar disfunção miocárdica pela diminuição da complacência
ventricular, bem como pela modificação da geometria cardíaca (Janicki, 1992).
Freeman et al. (1994), avaliaram a variação de massa corporal e do coração, em
ratos, e observaram que existe redução da massa miocárdica correlacionada com a perda
de massa corporal, o que foi confirmado no presente trabalho, pois a relação entre massa
cardíaca e massa corporal e a relação da massa do VE e a massa do coração, não foram
estatisticamente significativa entre os grupos estudados.
O miocárdio do homem adulto normal consiste de cerca de 80% de miócitos e 20%,
de matriz extracelular, tecido conjuntivo e vasos sanguineos. Esta proporção é distinta em
diferentes fases do desenvolvimento. Há aumento do volume relativo do miócitos nas
idades mais precoces da vida. Em outros casos, tais como durante a hipertrofia patológica,
a proporção de colágeno e células que não são miócitos também aumentam no interstício
cardíaco (Kajstura et al. 1996).
Nos indivíduos idosos, com a perda de miócitos ocorre a simultânea queda da
reserva funcional do coração, o que favorece a disfunção ventricular e a falência cardíaca
nesta fase da vida. A perda crônica dos miócitos reduz a capacidade do coração idoso
suportar variações de pressão arterial e a sobrecarga de volume ventricular (Austin et al.,
1995).
Observou-se que mesmo o GC apresentando porcentagem ocupada pela área de
colágeno superior ao GO e GG, este foi semelhante. Sendo o GO e o GG apresentando
faixa média de 27% de colágeno e conseqüentemente uma população média de 83% de
cardiomiócitos, vasos e estroma. Já o GC obteve, em média, um valor de 32% ocupado
por colágeno.
A razão da perda de miócito devida à idade ainda não é conhecida, mas alguns
estudos apontam que, no miocárdio, a morte celular pode ocorrer por dois mecanismos:
necrose (processo acidental e passivo) e apoptose (processo programado e ativo)
(Brömme & Holtz, 1996;).
Segundo Agrotis et al. (2005) e Swaney et al. (2005) o Fator de Crescimento
Transformador beta (transforming growth factor-β / TGF-β) está envolvido no
desenvolvimento de várias desordens cardiovasculares fibróticas, no regulamento da
síntese de colágeno e na formação do miofibroblasto. Adicionalmente, os níveis séricos
reduzidos do TGF-β foram associados com avançado estado de artereoesclerose em
seres humanos.
Gardiner et al. (2005) relatou em seu estudo in vitro, que a exposição de células
endoteliais a Genisteína aumentou a produção de TGF-β e que in vivo reduziu o
remodelamento secundário do VE juntamente com a redução do colágeno matricial em
ratas que haviam sofrido um crônico aumento do volume vascular como descrito por
Brower et al. (2001). Em nosso estudo não avaliamos o volume vascucar do tecido
cardíaco, mas observamos um possível efeito protetor de ambas as sojas no tecido
referente ao VE dos animais que as consumiram.
7 CONCLUSÃO
A soja orgânica e a soja geneticamente modificada apresentaram composição
centesimal semelhantes.
As rações ofertadas neste estudo foram semelhantes em relação ao conteúdo de
macronutrientes e possuíam concentrações semelhantes de isoflavonas.
A soja orgânica e a soja geneticamente modificada não devem ser administradas
como única fonte protéica na infância.
Nos períodos que compreendem a fase adulta e velhice, a soja pode ser utilizada
como fonte exclusiva de proteína em substituição a proteína animal.
Ambas as variedades de soja atuaram na redução dos marcadores bioquímicos de
doenças cardiovasculares.
As sojas, orgânica e geneticamente modificada, atuaram como fator de proteção
vascular, reduzindo o remodelamento aórtico sem influenciar na formação do colágeno
cardíaco.
A modificação genética não alterou as propiedades da soja em relação aos
aspectos estudados.
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9 APÊNDICE
9.1 ARTIGO 01
“Growth consequences of life long exposure to dietary organic and genetically modified soy
in old male rats”
Encaminhado para revista Nutrition Research
Data d
e envio: 23/02/2007
Correção: 11/03/2007
Situação atual: em análise
Growth consequences of life long exposure to dietary organic and genetically modified soy in old
male rats
Julio Beltrame Daleprane
1,2†
, Gilson Teles Boaventura
2
1
Master in Medical Sciences, College of Medicine, Federal Fluminense University-RJ/Brazil;
2
Experimental Nutrition Laboratory, College of Nutrition, Federal Fluminense University, Rua São
Paulo 30/5ºandar, CEP 24 015 110, Niterói-Centro, RJ/Brazil.
†
Corresponding author. Tel.: + 55 21 26299860; fax: + 55 21 26299847
E-mail address: julio[email protected]m (Daleprane JB)
Abbreviation List
Genetically modified organism, GMO;
Genetically modified soy, GMS;
Organic soy, OS;
5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,CP4 EPSPS;
RoundUp Ready soy, RRS;
Organic soy group, OG;
Genetically modified group, GG;
Control group, CG;
Laboratory of Experimental Nutrition, LabNE;
American Institute of Nutrition-1993, AIN-93
Growth rate, GR,
Body Weight, BW
Abstract
We evaluated the protein quality of organic and genetically modified soy fed to rats throughout life.
Thirty male Wistar rats were divided into three groups (n = 10): organic soy group (OG) receiving
an organic soy-based diet, genetically modified soy group (GG) receiving a transgenic soy-based
diet, and a control group (CG) receiving a casein-based diet. All animals received water and an
isocaloric diet (10% protein), ad libitum for 455 days. After that, the weight of the GG group was
the same as the OG. Protein intake was similar for OG and GG, and significantly lower (p<0.0005)
than the CG. Growth Rate was similar for all groups. In addition to providing good protein intake
and inducing less weight gain, both types of soy were utilized in a manner similar to that of casein,
suggesting that soy’s protein quality is similar to that of the standard protein casein. The groups fed
the soy-based diet gained less weight, which may be considered beneficial for health. We conclude
that organic and genetically modified soy can be fed throughout the rat’s life in place of animal
protein, because they contain high quality protein and do not cause a marked increase in body
weight.
Key words: Soybean; Genetically modified ; Organic; Growth; Rats
1. Introduction
Soybean is a legume with high protein content (~35–40%) in comparison with most other
legumes. Soy protein, after correcting for digestibility, provides amino acids equal to or in excess of
requirements and receives a protein digestibility corrected amino acid score of 1, indicating it is able
to meet the protein needs of infants and adults when consumed as the only source of protein at the
recommended level of protein intake [1].
The soy (Glycine Max (L.) Merril) is an important plant for human and animal nutrition, as well
as for industrial purposes, approximately 60% of all processed food products contain ingredients
derived from soy. Soy contains large amounts of protein despite its deficiency in sulfur-containing
amino acids such as methionine and cystine. Although rich in protein, soy contains antinutritional
factors commonly found in plants, which reduce the bioavailability of proteins ingested by the
organism [2]. Of these, the most important and most extensively studied are the protease inhibitors,
which inhibit proteolytic enzymes and consequently reduce the food digestion [3]. Antinutritional
factors can be minimized but not completely eliminated by heat treatment. In general, commercial
soy products are submitted to heat treatment, so that they present 20% less trypsin inhibitory activity
than raw soy [4]. Today there is a tendency to use soy in substitution of animal protein, as
traditionally done in countries like Japan and China.
Because of increased soy consumption, genetically modified soy has been created by genetic
engineering. This is a genetically modified organism (GMO) to which three foreign genes were
added from a bacterium like 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) found in
the RoundUp Ready soy (RRS). The advantage of this modification is that the plant becomes
resistant to glyphosate herbicides used to destroy weeds, which end up being harmful to the crop
itself. With the genetic modification, this problem does not occur, with consequent increased
production and reduced costs [5]. However, some studies report that this modification could cause
toxicity or allergic reactions, resistance to antibiotics and risks to the environment [6]. There are still
many doubts about the possible risks of genetically modified soy (GMS) regarding consumption and
the environment and more studies are necessary to elucidate such questions. Organic soy (OS) is
grown in an ecological manner without chemical products, and does not pollute the soil and does not
contaminate the producer. This process, however, implies a significant loss in productivity and
profit [7].
Animal protein is considered to be complete because it contains all 22 amino acids needed to
maintain the human body. However, soy protein, although not as complete as protein of animal
origin, probably due to the antinutrients, is the highest quality plant protein. Moreover, it has a
preventive and/or therapeutic action on a series of diseases, and is known as a functional food. This
term is applied to foods or ingredients that, besides having basic nutritional functions, produce
metabolic and/or physiological effects that are beneficial to health when consumed as part of the
usual diet, being safe for consumption without the need for medical supervision [8,9]. For example,
it may promote protection from chronic diseases of aging, involve antioxidant activities,
mitochondrial stabilizing functions, and other effects [10]. In addition to its high nutritional value,
among all plants, soy has the highest content of isoflavones, compounds that are very similar in
structure to estrogen, suggesting it could exert similar activities. [11]. Soy is a food with low fat
content and it also contains a large amount of fiber which helps control body weight (BW) and is
considered to be beneficial for health [12].
The objective of the present study was to determine the ability of organic and genetically
modified soy to replace animal protein throughout life in rats, and their effects on the growth and
maintenance of BW.
2. Methods and Materials
2.1. Experimental protocol
This study was approved by the Ethics Committee of the Antônio Pedro University Hospital,
Fluminense Federal University (protocol # 57/02) and it followed the norms for Care and the Use of
Laboratory Animals. The biological assay was conducted on 30 male Wistar rats aged 21 days (after
lactation) with 55.18 ± 1.82 at the beginning of the experiment from the Laboratory of Experimental
Nutrition (LabNE) of the Department of Nutrition and Dietetics, Nutrition College, Fluminense
Federal University, Niterói, RJ, Brazil.
The rats were divided into three groups of ten animals each, which received the experimental
diets for 455 days, as follows: the control group (CG) was fed a casein-based diet, the organic soy
group (OG) was fed an organic soy-based diet supplemented with 0.3 g cysteine, and the genetically
modified soy group (GG) received a transgenic soy-based diet. All animals were fed the above diets
exclusively, and were the offspring of parents (preceding generation) who also received the same
diet. The rats were kept in polypropylene cages, in an environment with controlled temperature at
22ºC and a 12-h light/dark period. Water and diets were offered ad libitum, and food consumption
and animal weight were recorded daily.
2.2. Animal diets
GMS was supplied by Jasmine Integral Foods (Curitiba, PR, Brazil) and OS was supplied by
Bunge Foods (Porto Alegre, RS, Brazil). The suppliers of the other components of the diets were:
Maizena starch by Refinements of Maize Ltda. (Granhuns, Recife, PE, Brazil), refined sugar by
União (Rio de Janeiro, RJ, Brazil), Liza soil oil by Cargill Agricultural Ltda. (Mairinque, SP,
Brazil), Microcel cellulose by Blanver Ltda. (Cotia, SP, Brazil), and cysteine, choline bitartrate,
casein, and mixtures of vitamins and minerals by Rhoster Commerce and Industry Ltda. (Vargem
Grande Paulista, SP, Brazil).The soybeans used for the flour preparation were treated as described
for Soares et al [13].
All diets were prepared at LabNE and contained 10% protein (1.75% nitrogen) and 363.95 kcal
per 100 g, added to the mixtures of vitamins and minerals according to the rules of the Committee
on Laboratory Animal Diets, 1979, modified according to the recommendations of the American
Institute of Nutrition-93 [14]. The diet ingredients (Table 1) were homogenized in an industrial
mixer with boiling water. The resulting mass was transformed into tablets, which were dried in a
ventilated oven at 60ºC for 24 h, properly identified and stored under refrigeration until time for use.
2.3. Biological determination of protein
We used the Growth Rate (GR) as a criterion for protein quality. Assuming that variations in total
body protein occur due to differences in diet protein quality, it is common to measure body weight
variations as a global indicator of the ingested protein's performance. This rate is accepted by the
majority of nutritionists as a valid method and is defined as GR = weight variation/protein intake
[15].
2.4. Statistical analysis
Data are reported as means ± standard and the results were analyzed statistically by multiple
comparison one-way analysis of variance, with the level of significance set at p<0.05. When a
statistically significant difference was detected between variables, the Scheffé test was applied using
the Bonferroni coefficient for multiple comparisons. All statistical analyses were performed using
Stratigraphics Software plus 6.0.
3. Results and discussion
Knowing there is a variation in total body protein caused by differences in diet protein quality, it
is justified to observe the variation in body weight as an overall reflection of ingested protein action
[15]. In Table 2 we can see that the means weight of the groups receiving soy-based diets were
lower, with OG being similar to GG, while the mean weight of the CG was significantly
(p<0.0005) higher, about 20%, in relation to the other groups at the end of 455 days of assay (rats
aged 576 days). OG protein intake was similar to that of GG, and significantly lower (p<0.04) than
that of CG.
Analysis of GR showed that this parameter was statistically similar in all groups, i.e., 1.07 ± 0.07
for OG, 1.07 ± 0.12 for GG, and 1.14 ± 0.12 for the CG (Table 2). Consequently, the GR of the
groups that received the experimental diets was similar to the GR of the CG, which received a diet
based on animal protein of high biological value. Anderson and Hoie [16] reported that soy protein
intake has favorable effects on BW and fat distribution in experimental animals. Soares et al. [13]
studied female Wistar rats that had consumed soy diet and presented a lower corporal weight,
however these rats had gotten GR similar to the control group, that consumed a casein diet.
In accordance with Oliveira and Angelis [17], as the animal ages and its growth declines, the
increase in corporal protein synthesis that usually follows ingestion increases (above the required for
maintenance), becomes gradually less. The limit would be reached in the adult when an increase in
ingestion, above what is necessary for nitrogen balances, would have little effect in the level of
protein synthesis.
On this basis, we conclude that soy protein may have a better performance during the
maintenance stage when compared to casein, since the GR of CG was similar to that of the other
groups despite the higher protein intake by the animals. Furthermore, even though the groups fed the
soy-based diet consumed smaller amounts of protein, they utilized it more efficiently.
It is known that soy is rich in antinutritional factors which reduce the bioavailability of foods.
However, in the present experiment it was observed that these antinutrients do not alter soy’s protein
quality, which can be used as an alternative to animal protein. The GMS and OS had similar GR.
The present results show that the life-long use of soy promoted a GR similar to that of the CG,
indicating that soy is an effective food with high protein quality, which can be used in substitution
of animal protein in rats. Since a large amount of protein is not necessary during adulthood, soy is
also recommended because it does not cause a marked increase in BW.
Acknowledgment
This study was carried out under the auspices of the State of Rio de Janeiro Research Assistance
Foundation (FAPERJ), National Council for Scientific and Technological Development (CNPq).
We thank all the subjects who participated in the study.
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10 ANEXOS
10.1 ANEXO 01
Aprovação do Comitê de Ética da Universidade Federal Fluminense.
Livros Grátis
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Milhares de Livros para Download:
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