( PDF ) A manipulação durante o período neonatal altera a preferência alimentar e o perfil metabólico de ratos na vida adulta

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS:

PEDIATRIA

A MANIPULAÇÃO DURANTE O PERÍODO

NEONATAL ALTERA A PREFERÊNCIA ALIMENTAR

E O PERFIL METABÓLICO DE RATOS NA VIDA

ADULTA

CARLA DA SILVA BENETTI

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Porto Alegre, Brasil, 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS:

PEDIATRIA

A MANIPULAÇÃO DURANTE O PERÍODO

NEONATAL ALTERA A PREFERÊNCIA ALIMENTAR

E O PERFIL METABÓLICO DE RATOS NA VIDA

ADULTA

CARLA DA SILVA BENETTI

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Zubaran Goldani

Co-orientadora: Profª. Drª. Carla Dalmaz

A apresentação desta dissertação é

exigência do Programa de Pós-

Graduação em Ciências Médicas:

Pediatria, da Universidade Federal do

Rio Grande do Sul, para obtenção do

título de Mestre.

Porto Alegre, Brasil, 2007

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Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA

222

B465m Benetti, Carla da Silva

A manipulação durante o período neonatal altera a preferência

alimentar e o perfil metabólico de ratos na vida adulta / Carla da

Silva Benetti ; orient. Marcelo Zubaran Goldani ; co-orient. Carla

Dalmaz. – 2007.

72 f.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal Rio Grande

do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em

Ciências Médicas: Pediatria. Porto Alegre, BR-RS, 2007.

1. Preferências alimentares 2. Animais recém-nascidos 3.

Modelos animais de doenças 4. Metabolismo 5. Ratos I. Goldani,

Marcelo Zubaran II. Dalmaz, Carla III. Título.

NLM: QT 235

AGRADECIMENTOS

Ao Marcelo, meu orientador, pela confiança, apoio, pela imensa motivação e

paciência, assim como pelos ensinamentos, oportunidades, pelo exemplo de profissionalismo

e pelo afeto, desde o princípio desta minha trajetória.

À Carla, minha co-orientadora, pelo acolhimento no laboratório 11, pela delicadeza,

sensibilidade e carinho, pela atenção e disponibilidade, sempre vibrando a cada novo achado e

incentivando novas idéias. Agradeço também pelo aprendizado e pelo exemplo de

profissionalismo.

Aos meus queridos colegas e amigos do laboratório 11 pela receptividade,

colaboração, companheirismo, alegria e amizade.

Aos meus pais, Sílvia e Carlos, e à minha irmã, Cátia, pelo amor, carinho, pela

compreensão nos momentos de estresse e pelo apoio na superação das dificuldades.

Ao Roger, pelo amor, estímulo, companheirismo e atenção, e pela compreensão nos

momentos em que estive ausente.

Aos queridos amigos Patrícia e André que foram fundamentais para a minha inserção

no laboratório 11, sempre depositando confiança e motivação sobre todas as idéias propostas,

incentivando a superar obstáculos, criando oportunidades, e compondo uma excelente

parceria de trabalho e um forte laço de amizade.

À professora Sandra Machado, pela injeção de estímulo, disponibilidade para discutir

idéias, pelo apoio, confiança e carinho.

À Universidade (UFRGS) e ao Programa de Pós-Graduação (PPGCM: Pediatria) pela

oportunidade.

Ao CNPq por viabilizar este trabalho.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................................01

1.1 EVENTOS PRECOCES E ALTERAÇÃO DO PADRÃO SAÚDE-DOENÇA NA

VIDA ADULTA........................................................................................................................01

1.2 INTERAÇÃO MATERNO-INFANTIL...........................................................................02

1.3 ESTRESSE NEONATAL..................................................................................................03

1.4 EXPOSIÇÃO A GLICOCORTICÓIDES E PREFERÊNCIA ALIMENTAR............04

1.5 COMPORTAMENTO ALIMENTAR E ALTERAÇÕES METABÓLICAS..............07

1.6 SÍNDROME METABÓLICA ...........................................................................................08

2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................10

3 OBJETIVOS..........................................................................................................................11

4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................12

4.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS..........................................................................................12

4.2 CÁLCULO DO TAMANHO AMOSTRAL.....................................................................13

4.3 MODELO DE MANIPULAÇÃO NEONATAL..............................................................14

4.4 HABITUAÇÃO AO ALIMENTO NOVO .......................................................................14

4.5 EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO ALIMENTO PALATÁVEL NA CAIXA-MORADIA....

....................................................................................................................................................15

4.6 COLETA DE SANGUE E DISSECÇÃO DA GORDURA ABDOMINAL..................15

4.7 ANÁLISES BIOQUÍMICAS.............................................................................................16

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................16

RESULTADOS (ARTIGO).....................................................................................................17

5 DISCUSSÃO..........................................................................................................................45

CONCLUSÃO...........................................................................................................................51

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................53

LISTA DE ABREVIATURAS

ACTH: Hormônio adrenocorticotrófico

GCs: Glicocorticóides

HDL: High-density lipoprotein

HPA: Hipotálamo-pituitária-adrenal

RNA: Ácido ribonucléico

SNC

: Sistema nervoso central

RESUMO

Estudos prévios demonstraram que ratos manipulados no período neonatal apresentavam um

maior consumo de alimento doce na vida adulta, em comparação com ratos não manipulados,

quando esse alimento lhes é oferecido durante curtos períodos de tempo. O objetivo deste

trabalho foi avaliar os efeitos da manipulação neonatal sobre o padrão metabólico de animais

adultos expostos cronicamente a uma dieta hipercalórica e palatável (chocolate). Desta forma,

foram medidos o consumo de alimentos (ração padrão e chocolate), ganho de peso corporal,

depósito de gordura abdominal, peso das glândulas adrenais e parâmetros bioquímicos como

lipídios, glicose, insulina, e corticosterona plasmáticos em ratos adultos que foram expostos

ou não à manipulação neonatal (10 min/dia, nos 10 primeiros dias de vida). Ratos que foram

manipulados no período neonatal apresentaram uma ingestão de chocolate aumentada, porém

este consumo diminuiu com o passar do tempo, atingindo níveis semelhantes aos dos animais

não manipulados. Ratos machos manipulados apresentaram maior peso corporal, assim como

maior eficiência calórica e níveis de triglicerídeos diminuídos no plasma, independentemente

da dieta, enquanto que ratas fêmeas não manipuladas que receberam chocolate apresentaram

depósito de gordura abdominal aumentado. Também foi observado, nas ratas fêmeas, maior

depósito de gordura abdominal, níveis mais elevados de colesterol total e de glicose, bem

como níveis mais baixos de insulina, quando comparadas com ratos machos. O consumo de

chocolate reduziu o peso das glândulas adrenais tanto nos animais manipulados quanto nos

controles. Assim, esses achados sugerem que a manipulação neonatal induz um padrão

metabólico particular, o qual parece proteger os animais dos efeitos deletérios de uma dieta

hiperpalatável e hipercalórica, e ainda, a manipulação parece afetar diferentemente ratos

machos e fêmeas.

PALAVRAS CHAVE: manipulação neonatal, estresse neonatal, dieta palatável, padrão

metabólico.

SUMMARY

Previous studies have already observed that neonatal handled rats consume more sweet food

compared to non-handled ones in adult life, when this type of food is offered during short

intervals of time. The aim, in this study, was to assess the effects of neonatal handling on the

metabolic pattern of adult rats chronically exposed to a palatable diet (chocolate). We

measured the consumption of foods (standard lab chow and chocolate), body weight gain,

abdominal fat deposition, adrenal glands’ weight and biochemical measures such as plasma

lipids, glucose, insulin, and corticosterone in adult rats which had been exposed or not to

neonatal handling (10 min/day, 10 first days of life). An increased intake of chocolate in

handled rats was found, but this consumption decreases as the days passed by, reaching the

same levels as non-handled animals. Handled male animals presented higher body weight,

higher caloric efficiency and lower plasma triglycerides levels, independently of the diet,

while non-handled females rats receiving chocolate presented increased abdominal fat

deposition. Female rats also presented increased abdominal fat deposition, higher total

cholesterol and glucose levels as well as lower insulin in comparison to males. Interestingly,

chocolate consumption diminished adrenal glands’ weight in both groups. These findings

suggest that neonatal handling induces a particular metabolic pattern, which seems to protect

the animals against deleterious effects of a highly palatable, highly caloric diet, and also it

seems to differentially affect females and males.

KEY WORDS: neonatal handling, neonatal stress, palatable diet, metabolic pattern.

1 INTRODUÇÃO

1.1 EVENTOS PRECOCES E ALTERAÇÃO DO PADRÃO SAÚDE-DOENÇA NA

VIDA ADULTA

Desde a década de 70, estudos avaliando crescimento e desenvolvimento infantil vêm

despertando o interesse de pesquisadores, na busca de uma melhor compreensão do impacto

de um evento precoce sobre a morbidade mais tarde na vida, assim como dos mecanismos

envolvidos nessa relação causal.

Durante a vida fetal, órgãos e tecidos do corpo passam pelo chamado período crítico

do desenvolvimento (WIDDOWSON, MCCANCE, 1975). Assim, um estímulo ou insulto

manifestado neste período pode prejudicar a função de uma estrutura ou ajustar um sistema

fisiológico (BARKER et al., 1993; LUCAS, 1994; SINGHAL, LUCAS, 2004), e os efeitos de

um insulto precoce podem ser observados ao longo de toda a vida (LUCAS, 1991;

BENEDIKTSSON et al., 1993). Dessa forma surge, então, o conceito de “programação”, a

qual é definida como o resultado da evolução das respostas adaptativas, pelas quais o feto

altera sua fisiologia e estrutura, na expectativa de um ambiente futuro que ele encontrará após

o nascimento (BARKER, 1998; GLUCKMAN, HANSON, 2004).

Eventos ocorridos durante um período precoce do desenvolvimento programam

alterações nos parâmetros metabólico, fisiológico e estrutural (BARKER, 1995), e esses

efeitos produzidos apresentam-se de forma profunda e permanente na vida adulta, podendo,

ainda, afetar gerações seguintes (METCALFE, MONAGHAN, 2001).

Estudos realizados em humanos demonstram que eventos ocorridos durante a vida

fetal estão associados com a ocorrência de diabetes do tipo II (FORSEN et al., 2000),

diminuída sensibilidade à insulina (SOTO, MERICQ, 2005) e maior vulnerabilidade para o

desenvolvimento de obesidade abdominal (LAITINEN et al., 2004).

Outros autores abordam a influência de um ambiente uterino adverso sobre o aumento

da pressão arterial (LAW et al., 2002), dos níveis séricos de colesterol (DAVIES et al., 2004),

bem como do risco para o desenvolvimento de síndrome metabólica (KANAKA-

GANTENBEIN et al., 2003) e doença cardiovascular (ERIKSSON et al., 2001; SYDDALL et

al., 2005) na vida adulta. De forma semelhante, estudos envolvendo animais demonstram que

eventos precoces programam alterações no desenvolvimento endócrino-metabólico (LESAGE

et al., 2001), assim como na fisiologia cardiovascular (O'REGAN et al., 2004) na vida adulta.

Adicionalmente, a literatura aborda que um crescimento acelerado em períodos

cruciais do desenvolvimento pode ter importantes conseqüências adversas sobre a saúde,

incluindo alterações metabólicas persistentes (FEWTRELL et al., 2000; PARSONS et al.,

2001). Algumas evidências demonstram que indivíduos expostos a um ambiente uterino

adverso e que, posteriormente, apresentam um padrão de crescimento compensatório nos

primeiros anos de vida, têm um risco aumentado para o desenvolvimento de resistência à

insulina (ERIKSSON et al., 2002), diabetes tipo II (FORSEN et al., 2000), hipertensão

(BARKER et al., 2002), síndrome metabólica (FAGERBERG et al., 2004) e evento

cardiovascular (REMACLE et al., 2004) mais tarde na vida.

Já que eventos precoces têm efeitos determinantes sobre o padrão de saúde-doença na

vida adulta, dessa forma, caberia investigar a possibilidade desses eventos protegerem contra

alterações desse padrão, quando animais adultos são desafiados com uma exposição crônica a

uma dieta hipercalórica e hiperpalatável.

1.2 INTERAÇÃO MATERNO-INFANTIL

A relação materno-infantil desempenha um papel determinante em diversos aspectos

relacionados à saúde mental (NIEMI et al., 2004

a,b

), comportamento, incluindo

comportamento alimentar (WRIGHT et al., 2006

, BURDETTE et al., 2006) e metabolismo

(BURDETTE et al., 2006; WRIGHT et al., 2006

; FAITH et al., 2003). Em mamíferos, a mãe

representa o principal estímulo ambiental, assim como o mais importante provedor para o seu

descendente, de forma que determinadas variáveis associadas com a mãe correlacionam-se

com desfechos observados na criança mais tarde na vida (SAVINO et al., 2006). Além disso,

o cuidado materno exerce um efeito profundo, persistente, o qual pode, ainda, estender-se

entre gerações em animais (ZHANG et al., 2006; CHAMPAGNE et al., 2001) e humanos

(PRUESSNER et al., 2004).

Estudos experimentais abordando comportamento materno demonstram que filhotes

de mães mais cuidadoras, apresentam reduzida resposta a um estresse agudo quando adultos,

em razão da aumentada expressão de RNA mensageiro para receptores de glicocorticóides no

hipocampo (LIU et al., 1997), o que aumenta a retroalimentação negativa. Adicionalmente,

esses animais apresentam menor medo, maior exploração quando expostos a um ambiente

novo e menor latência para consumir um novo alimento (FRANCIS et al., 1999; CALDJI et

al., 1998). Dessa forma, o cuidado materno durante a infância parece ter um papel

fundamental na programação das respostas comportamentais e neuroendócrinas ao estresse na

vida adulta (CAMERON et al., 2005; LIU et al., 1997; CIRULLI et al., 2003).

Considerando a importância do cuidado materno no início da vida e suas implicações

subseqüentes, tem se observado um crescente incentivo à prática do contato precoce materno-

infantil nas maternidades, através da criação de Programas de Saúde Pública direcionados

para os benefícios gerados por essa interação. Efeitos do contato materno-infantil têm sido

demonstrados sobre a modulação do sistema motor do recém-nascido (FERBER,

MAKHOUL, 2004), desenvolvimento cognitivo e neurológico (CHARPAK et al., 2005;

FELDMAN, EIDELMAN, 2003), além de prepará-lo para o enfrentamento do ambiente

extra-uterino e seus estímulos.

1.3 ESTRESSE NEONATAL

Hans Selye, pioneiro na pesquisa sobre efeitos biológicos da exposição a um estímulo

estressor, introduziu o conceito de estresse em 1936. Conforme este pesquisador, “estresse” é

definido como uma resposta do organismo a um estressor, sendo o objetivo da resposta ao

estresse manter a estabilidade do sistema fisiológico, ou seja, a homeostase. Tal resposta

envolve a liberação de epinefrina pela medula adrenal e de glicocorticóides (GCs) pelo córtex

da adrenal. Segundo Goldstein and McEwen (2002), “estresse” refere-se à resposta causada

por uma sucessão de eventos que desafia a homeostase.

Define-se “estressor” como um desafio ao indivíduo, que perturba a homeostase e

requer uma resposta adaptativa ou, ainda, que pode ser interpretado equivocadamente como

ameaça e resultar em uma resposta comportamental ou hormonal (MCEWEN, 2002).

O período neonatal de um rato, constituído pelas duas primeiras semanas de vida,

corresponde ao período perinatal em humanos. Neste período, o desenvolvimento de várias

estruturas e sistemas, como o sistema nervoso central (SNC), ainda se faz presente.

Denominado de período hiporresponsivo ao estresse (SAPOLSKY, MEANEY, 1986), os

primeiros 15 dias após o nascimento são caracterizados por uma fase de diminuída resposta

adrenocortical ao estímulo estressor, na qual é observada uma realçada sensibilidade à

retroalimentação negativa dos glicocorticóides na hipófise (WALKER et al., 1986) e

diminuída responsividade ao ACTH na adrenal (YOSHIMURA et al., 2003).

Sendo este período na vida do rato um período crítico do desenvolvimento, a

submissão precoce a um estressor determina alterações neuroquímicas e comportamentais

identificáveis ao longo da vida. Além disso, outras experiências precoces, tais como a relação

mãe-filhote, interagem com fatores endógenos para determinar a resposta do organismo a um

estímulo estressor durante a vida adulta (PANAGIOTAROPOULOS et al., 2004). Dessa

forma, algumas abordagens experimentais foram desenvolvidas para estudar a relevante

interação mãe-filhote, assim como os efeitos de intervenções precoces sobre o comportamento

na vida adulta. Dentre elas está a manipulação neonatal, que será enfatizada neste trabalho.

O modelo de manipulação (LEVINE et al., 1967) é caracterizado por uma breve,

repetida e aparentemente inócua separação da mãe durante o período neonatal. Este protocolo

é conhecido por produzir um aumento no cuidado materno (BRANCHI et al., 2001; PRYCE

et al., 2001), e tal comportamento é observado no momento em que os filhotes retornam para

a caixa-moradia, após um curto período de separação.

Na vida adulta, animais submetidos à manipulação no período neonatal demonstram

menor medo, maior atividade e exploração quando expostos a um ambiente novo (LEVINE et

al., 1967) e a uma situação de perigo potencial, como quando exploram um ambiente

desconhecido na presença de um predador (PADOIN et al., 2001); esses animais também

apresentam diminuída reatividade ao estresse (LEVINE et al., 1967, ADER, GROTA, 1969;

PADOIN et al., 2001, PANAGIOTAROPOULOS et al., 2004), maior concentração de

receptores para glicocorticóides no hipocampo, que está relacionada com a exacerbação do

mecanismo de retroalimentação negativa dos GCs (MEANEY et al., 1989; ADER, GROTA,

1969), diminuição do padrão reprodutivo (PADOIN et al., 2001; GOMES et al., 2005) e

aumento no consumo de alimentos palatáveis (SILVEIRA et al., 2004).

A exposição crônica aos glicocorticóides está associada com a ocorrência de doenças

metabólicas tais como obesidade, hipertensão, hiperglicemia e alterações nos lipídios

sangüíneos, características clássicas da síndrome metabólica (BOULLU-CIOCCA et al.,

2005; BRUNNER et al., 2002; DUCLOS et al., 2005). Uma vez que os animais manipulados

apresentam diferente reatividade ao estresse, estando expostos a níveis mais baixos de GCs,

poderiam apresentar uma menor predisposição para essas doenças de origem metabólica, pois

esses animais seriam menos suscetíveis aos efeitos prejudiciais decorrentes da exposição a

elevados níveis de GCs.

1.4 EXPOSIÇÃO A GLICOCORTICÓIDES E PREFERÊNCIA ALIMENTAR

Aguda ou cronicamente, a exposição aos glicocorticóides ou a certos modelos de

estresse crônico está relacionada com um aumento no consumo de alimentos palatáveis em

ratos adultos (ELY et al., 1997; PECORARO et al., 2004; SILVEIRA et al., 2004), talvez

relacionado com uma alteração do estado de ansiedade destes animais (ELY et al., 1997). O

consumo de alimentos palatáveis reduz a resposta do eixo HPA, sendo uma resposta

adaptativa ao estresse (PECORARO et al., 2004). Assim, os glicocorticóides agem

estimulando a ingestão de alimentos com elevado valor energético e alterando os estoques de

gordura abdominal (PECORARO et al., 2005; DALLMAN et al., 2005). Da mesma forma,

em humanos, elevados níveis de GCs após estresse aumentam o consumo de alimentos

altamente calóricos e estão associados com o comportamento de comer compulsivo (EPEL et

al., 2001; FREEMAN, GIL, 2004). Alterações na atividade do eixo HPA estão relacionadas

com distúrbios alimentares como bulimia e anorexia nervosa (FICHTER et al., 1990; KAYE

et al., 1988).

A atividade do eixo HPA também pode ser influenciada pelo tipo de alimento

consumido. Uma dieta hipercalórica, rica em alimento doce e gordura, provoca uma redução

na resposta do eixo ao estresse (PECORARO et al., 2004), sugerindo um efeito metabólico-

periférico da dieta sobre o cérebro (DALLMAN et al., 2003). Entretanto, uma dieta contendo

alto teor de gordura realça os níveis de glicocorticóides basal e induzido por estresse,

possivelmente agindo como um fator estressor (TANNENBAUM et al., 1997; KAMARA et

al., 1998).

Animais submetidos a estresse no período neonatal, quando se utiliza a simples

manipulação do animal durante um curto período de tempo (10 minutos) também apresentam,

quando adultos, alterações na preferência alimentar (SILVEIRA et al., 2004). Assim, além de

apresentarem uma atividade diferencial do eixo HPA (LEVINE et al., 1967), esses animais

também mostram alteração no comportamento alimentar, aumentando o consumo de doce

quando este é oferecido durante breves períodos (3 minutos) em um outro ambiente fora da

caixa-moradia, por 6 dias consecutivos. Esse efeito é observado com o animal submetido à

restrição alimentar e também com o animal alimentado ad libitum (SILVEIRA et al., 2004). O

fato do animal ser exposto ao alimento doce de forma aguda influencia o seu comportamento

frente a este alimento, já que existe um maior interesse pela novidade, o qual é refletido no

alterado consumo do alimento palatável. No entanto, não está ainda determinado se esses

animais manipulados no período neonatal também apresentariam aumento do consumo se

houvesse uma oferta crônica de alimentos palatáveis.

1.5 COMPORTAMENTO ALIMENTAR E ALTERAÇÕES METABÓLICAS

A dieta pode afetar a saúde do organismo. Por exemplo, sabe-se que a ingestão

excessiva de alguns nutrientes da dieta está relacionada com maior risco para determinadas

doenças, como hipertensão e diabetes (GROSS et al. 2004, KROUSEL-WOOD et al., 2004).

Foi estabelecido que o consumo de ácidos graxos trans e de carboidratos simples está

associado com aumentado risco para doença coronariana (DYERBERG et al., 2004; LIU et

al., 2000

). O consumo de alimentos com alto índice glicêmico também contribui para um

aumento no risco de doença cardiovascular (BELL, SEARS, 2003) e alguns tipos de câncer

(TAVANI et al., 2006).

O fato de que diferentes dietas podem afetar a saúde também é observado quando se

considera um maior consumo de frutas e vegetais, combinado com um consumo reduzido de

gordura saturada, situação que produz efeito protetor contra a mortalidade por doença

coronariana (TUCKER et al., 2005). Outros trabalhos demonstram que somente uma maior

ingestão de frutas e vegetais reduz o risco de doença cardiovascular (LIU et al., 2000

). Além

disso, uma diminuição no consumo de carboidratos, principalmente complexos, melhora os

parâmetros sangüíneos característicos da síndrome metabólica (SHARMAN et al., 2004).

Os hábitos alimentares são estabelecidos no início da vida. Sabe-se que a alimentação

na infância é um fator determinante da dieta na vida adulta e desempenha um importante

papel na prevenção de doenças (MIKKILA et al., 2004). Escolhas dietéticas saudáveis na

infância, como uma dieta rica em vegetais, estão associadas com uma alimentação saudável

mais tarde na vida (MAYNARD et al., 2005) e com menor risco de evento cardiovascular

(NESS et al., 2005). Assim sendo, intervenções no início da infância capazes de levar a

alterações na preferência alimentar mais tarde na vida devem ser consideradas como

potenciais fatores modificadores da dieta do organismo, e o conhecimento de seus efeitos e

mecanismos nos permitirá ações preventivas e, quando necessário, um tratamento adequado

para esses indivíduos.

1.6 SÍNDROME METABÓLICA

A síndrome metabólica caracteriza-se por um conjunto de anormalidades metabólicas

sendo definida pela presença de pelo menos 3 dos seguintes componentes:

NCEP ATP III

Glicemia de jejum

Circunferência cintura

Triglicerídeos

HDL - colesterol

Hipertensão

≥ 110 mg/dl

≥ 102 cm (homens), ≥ 88 cm (mulheres)

≥ 150 mg/dl

< 40 mg/dl (homens), < 50 mg/dl (mulheres)

≥ 130/ ≥ 85 mmHg

NCEP ATP III: National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III - 2001.

Uma série de distúrbios metabólicos freqüentemente observados em pacientes com

resistência à insulina e diabete do tipo 2 estão individualmente associados com risco

aumentado para doença coronariana (LARSEN et al., 2003). Desta forma, a síndrome

metabólica está relacionada com o desenvolvimento de diabete melito do tipo 2 e doença

cardiovascular (GROSS et al., 2004; MEERARANI et al., 2006). Por sua vez, o diabete do

tipo 2 tem sido associado com aumentado risco para morbi-mortalidade cardiovascular,

independentemente de outros fatores de risco (LARSEN et al., 2003; SMIT, ROMIJN, 2006).

Algumas abordagens têm demonstrado associação entre hiperinsulinemia, importante

componente da síndrome metabólica (LAMOUNIER-ZEPTER et al., 2006; LARSEN et al.,

2003), e aumento no risco para doença coronariana (HANLEY et al., 2002; DESPRES et al.,

1996). A resistência à insulina pode causar disfunção endotelial vascular, provocada por um

desequilíbrio entre vasodilatadores e vasoconstritores endoteliais, e hipertensão (POTENZA

et al., 2005). Além disso, esta disfunção pode determinar o desenvolvimento de aterosclerose

e como conseqüência, aumentar o risco de evento cardiovascular (HSUEH, QUINONES,

2003).

Alterações nas concentrações de lipídios plasmáticos também estão relacionadas com

maior risco cardiovascular, visto que níveis elevados de triglicerídios e diminuídos de HDL

contribuem para um estado pró-inflamatório, promovendo a formação de placas

ateroscleróticas e aumentando o risco de evento cardiovascular (MEERARANI et al., 2006).

Aumentos observados no índice colesterol total/HDL-c estão relacionados com a síndrome

metabólica e, conseqüentemente, com elevado risco cardiovascular (REAL et al., 2006).

Foi demonstrado que o acúmulo de gordura abdominal está independentemente

associado com síndrome metabólica (CARR et al., 2004; SALMENNIEMI et al., 2004), e

risco aumentado para diabete do tipo 2 e doença coronariana (DESPRES, 2006). Além disso,

o aumento da gordura abdominal está relacionado com diminuída sensibilidade à insulina,

sendo um importante determinante desta sensibilidade e função das células-beta pancreáticas

(UTZSCHNEIDER et al., 2004).

2 JUSTIFICATIVA

Eventos precoces ocorridos na fase de desenvolvimento e crescimento somático

podem influenciar o padrão de saúde e doença na idade adulta. Há fortes evidências

associando a ocorrência de experiências estressantes precoces com desempenho metabólico

precário em indivíduos adultos. Neste caso temos como exemplo, a associação da restrição de

crescimento intra-uterino com a obesidade e a hipercolesterolemia no adulto. Contudo, não há

na literatura evidências sobre intervenções precoces que confiram proteção contra desfechos

metabólicos inadequados. Portanto, este trabalho se propõe a estudar esta lacuna avaliando a

influência de uma possível intervenção protetora para alterações metabólicas em animais

submetidos a um evento nutricional de risco.

3 OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivo verificar os efeitos da manipulação neonatal sobre o

padrão metabólico de animais adultos expostos cronicamente a uma dieta hipercalórica e

palatável (chocolate). Assim, foi avaliado o consumo de alimentos, peso corporal e depósito

de gordura abdominal bem como níveis plasmáticos de glicose, insulina, lipídios e

corticosterona. A hipótese do presente trabalho era de que a manipulação neonatal esteja

associada com um padrão diferencial de alimentação e ganho de peso e, possivelmente, com

uma particular adaptação metabólica a este tipo de dieta.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Ratas Wistar prenhes provenientes do Biotério do Instituto de Biociências da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (Brasil), foram randomicamente selecionadas. As

ratas permaneceram, individualmente, em caixas-moradia, confeccionadas em Plexiglas

medindo 65 x 25 x 15 cm, com assoalho recoberto de maravalha, e foram mantidas em um

ambiente controlado: ciclo normal claro/escuro de 12 horas, temperatura de 22 + 2°C, limpeza

das caixas uma vez por semana, água e ração padrão ad libitum. Todas as ninhadas foram

padronizadas em oito filhotes nas primeiras 24hs após o nascimento e mantidas intactas,

exceto para os procedimentos de manipulação que foram realizados entre às 09:00hs e às

11:00hs.

Mais de uma ninhada foi submetida ao procedimento de manipulação no mesmo dia;

assim, neste período de 2 horas de procedimento estava incluído o tempo para: instalar a

incubadora, trazer as caixas-moradia do biotério para a sala de experimentos, habituar

brevemente as genitoras à nova sala, remover cuidadosamente os filhotes da ninhada, fazer a

manipulação em si, e em seguida, retornar os filhotes para a mãe e, novamente após um breve

período, retornar a caixa-moradia para o biotério. O pesquisador tinha o cuidado de trocar as

luvas entre a manipulação de cada ninhada, para evitar a dispersão de qualquer tipo de odor de

uma ninhada para outra.

O dia do nascimento foi considerado o dia 0 (zero). As ninhadas foram desmamadas e

separadas por sexo no dia 21 pós-natal. Foram utilizados no máximo dois filhotes do mesmo

sexo e da mesma ninhada para o mesmo grupo. Após o desmame, os animais foram mantidos

em torno de quatro a cinco por caixa. Os animais tinham livre acesso à ração padrão e água,

exceto durante o período de exposição à dieta palatável quando grupos específicos também

receberam chocolate na caixa-moradia.

A linha do tempo esquematizada abaixo demonstra a ordem em que os procedimentos

experimentais foram realizados, nos diferentes momentos da vida dos animais:

4.2 CÁLCULO DO TAMANHO AMOSTRAL

O número de animais utilizados foi estimado a partir de experimentos prévios

(SILVEIRA et al., 2004, 2006), nos quais ratos manipulados no período neonatal consomem

aproximadamente 60% mais alimento palatável que ratos controles. Considerando o desvio-

padrão de 0,6 gramas proveniente desses estudos, adotando um nível de significância de 5% e

um poder de 80%, foi determinado o número de caixas necessárias para avaliar o consumo.

Para as outras variáveis, foi estabelecida uma possível diferença de 20% entre os grupos,

estimando um desvio-padrão semelhante ao observado previamente (SILVEIRA et al., 2006),

adotando novamente um nível de significância de 5% e um poder de 80%. Assim, um total de

83 animais foi utilizado em diferentes experimentos, derivados de 25 ninhadas. Todos os

procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande

do Sul – UFRGS, Brasil.

Dias de vida pós-natal

1 10 21 60 83 90 120

Manipulação

Neonatal

Desmame e

Sexagem

Habituação

ao chocolate

Randomização

Exposição

crônica ao

chocolate

Sacrifício

Nascimento

4.3 MODELO DE MANIPULAÇÃO NEONATAL

Grupo não-manipulado: Filhotes permaneceram com a mãe, sem manipulação

neonatal, até o desmame. A limpeza rotineira das caixas foi interrompida durante esse

período.

Grupo manipulado: Este procedimento foi realizado conforme anteriormente descrito

(SILVEIRA et al., 2004). A mãe foi gentilmente afastada para um lado da caixa-moradia e os

filhotes foram removidos do ninho e colocados dentro de uma caixa limpa forrada com papel

toalha. Então, a ninhada foi colocada em uma incubadora ajustada para manter uma

temperatura ambiente de 30-32°C (temperatura da água de 34

C), enquanto a genitora foi

mantida na caixa-moradia posicionada ao lado da incubadora. Após 10 minutos, os filhotes

retornaram para sua respectiva mãe. Este procedimento foi realizado do dia 1 ao dia 10 pós-

natal, em seguida, os filhotes foram mantidos com a mãe, sem manipulação, até o dia 21 pós-

natal.

4.4 HABITUAÇÃO AO ALIMENTO NOVO

A partir do dia 60 de vida, os ratos foram habituados a um novo ambiente contendo

um alimento novo. Neste experimento, os animais foram colocados em uma caixa retangular

medindo 40 x 15 x 20 cm, com partes inferior e laterais revestidas em madeira e parte

superior em vidro transparente. Uma porção de chocolate pesada previamente (chocolate ao

leite – Neugebauer®) foi colocada em uma das extremidades da caixa-corredor. Os animais

foram habituados a esse ambiente por 5 dias, durante 3 minutos cada dia, sob restrição

alimentar (recebendo em torno de 80% do consumo habitual). No 6º dia, os ratos foram

testados para o consumo de alimento palatável, após terem recebido ração padrão ad libitum

nas 24 horas prévias. Esses procedimentos foram realizados para verificar se os animais

comeriam chocolate da mesma forma que eles comumente ingerem outros tipos de alimentos

palatáveis (SILVEIRA et al., 2004), com e sem restrição alimentar. Após esse período de

habituação, os animais receberam ração padrão ad libitum. Todos os procedimentos seguintes

foram realizados com os animais em estado alimentado.

4.5 EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO ALIMENTO PALATÁVEL NA CAIXA-MORADIA

No 83º dia de vida, todos os animais foram pesados e randomizados em diferentes

grupos do mesmo sexo, sendo colocados em números de 3 a 4 por caixa. Os grupos foram

subdivididos em 1) Não-manipulado + ração padrão, 2) Não-manipulado + chocolate + ração

padrão, 3) Manipulado + ração padrão e 4) Manipulado + chocolate + ração padrão. Uma

semana depois, grupos específicos começaram a receber chocolate ad libitum na caixa-

moradia. Durante 30 dias, porções previamente pesadas de chocolate e de ração padrão foram

oferecidas, e a quantidade restante foi medida diariamente para avaliar o consumo. Os animais

foram pesados uma vez por semana ao longo do período de exposição à dieta. Passados 30

dias de exposição à dieta palatável, os ratos foram sacrificados por decapitação após 6 horas

de jejum. O consumo de alimentos foi medido por caixa e então dividido pelo número de

animais em cada caixa para determinar o consumo médio por animal. Na análise estatística do

consumo de alimentos, n representa o número de caixas. A Tabela 1 (ver artigo) descreve a

composição nutricional das dietas usadas no estudo.

4.6 COLETA DE SANGUE E DISSECÇÃO DA GORDURA ABDOMINAL

O sangue do tronco foi coletado em tubos heparinizados para determinação de

insulina, glicose, colesterol total, HDL-colesterol, triglicerídios e corticosterona. Os tubos

foram centrifugados a 4ºC e o plasma foi separado e congelado a - 20ºC até o dia das análises.

As glândulas adrenais foram cuidadosamente dissecadas e pesadas. As duas maiores

porções da gordura abdominal (gonadal e retroperitoneal) foram dissecadas e pesadas

separadamente. Tanto as glândulas adrenais quanto os depósitos de gordura abdominal foram

pesados utilizando uma balança com precisão de 0,0001g.

4.7 ANÁLISES BIOQUÍMICAS

O plasma foi extraído com acetato de etila, e o extrato evaporado e dissolvido para

avaliação da corticosterona utilizando um kit ELISA (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI,

EUA). Os níveis de insulina plasmática também foram mensurados utilizando ELISA (Alpco

Diagnostics, Mercodia AB, Uppsala, Suécia). A glicemia foi medida pelo método de glicose-

oxidase (BioSystems, Barcelona, Espanha). Os níveis de colesterol total e de triglicerídios

foram medidos com kits comerciais (Laborclin, Pinhais, PR, Brasil). O HDL–colesterol foi

mensurado usando um kit proveniente do laboratório Wiener, Rosário, Argentina.

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram expressos em média + erro padrão da média, e foram analisados por

ANOVA de duas vias, três vias, ou por ANOVA de medidas repetidas, seguidas pelo teste

post-hoc de Duncan, quando indicado. O nível de significância estabelecido foi de 5%. O

tamanho amostral foi calculado como descrito acima.

RESULTADOS

Artigo:

Could preference for palatable foods, in neonatally handled rats, alter metabolic pattern

in adult life? Artigo aceito para publicação na revista Pediatric Research.

Artigo 18

Artigo: A preferência por alimentos palatáveis, em ratos manipulados no período

neonatal, altera os padrões metabólicos na vida adulta?

RESUMO

Estudos prévios demonstram que ratos manipulados no período neonatal consomem mais

alimento doce na vida adulta comparados com ratos não manipulados. O objetivo do presente

estudo foi avaliar os efeitos da manipulação neonatal sobre o padrão metabólico de ratos

adultos expostos cronicamente a uma dieta hiperpalatável e hipercalórica (chocolate). Dessa

forma, foram medidos o consumo de alimentos (ração padrão e chocolate), ganho de peso

corporal, depósito de gordura abdominal bem como níveis de lipídios plasmáticos, glicemia,

insulinemia, e corticosterona de ratos adultos manipulados (10 min/dia, nos 10 primeiros dias

de vida) ou não manipulados no período neonatal. Animais manipulados apresentaram um

consumo aumentado de chocolate, porém esse consumo diminuiu com o passar do tempo de

exposição. Ratos machos manipulados exibiram maior peso corporal e maior eficiência

calórica, além de níveis mais baixos de triglicerídios plasmáticos. Fêmeas não manipuladas,

que foram expostas cronicamente à dieta hipercalórica, apresentaram depósito de gordura

abdominal aumentado quando comparadas com fêmeas manipuladas. Ratas fêmeas

demonstraram depósito de gordura abdominal aumentado, níveis mais elevados de colesterol

total e glicose no plasma, assim como níveis mais baixos de insulina em comparação com

ratos machos. O consumo de chocolate diminuiu o peso das glândulas adrenais tanto nos

animais manipulados quanto nos controles. Assim, essas observações sugerem que a

manipulação neonatal induz um padrão metabólico particular, e ainda, parece afetar

diferentemente ratos machos e fêmeas.

PALAVRAS CHAVE: manipulação neonatal, estresse neonatal, dieta palatável, padrão

metabólico.

ABREVIAÇÕES: HPA, eixo hipotálamo-pituitária-adrenal.

Artigo 19

INTRODUÇÃO

A interação materno-infantil tem uma importante influência sobre a programação do

padrão comportamental (1,2) e metabólico (2,3) dos descendentes que pode persistir durante a

vida adulta. Em mamíferos, a mãe é o principal estímulo ambiental e a fonte provedora para a

criança, sabe-se também que o cuidado materno tem um efeito profundo, permanente, que

pode estender-se entre gerações em animais (4,5) e humanos (6).

Algumas abordagens experimentais foram desenvolvidas para melhor estudar essa

interação. Uma dessas abordagens é a manipulação neonatal, que caracteriza-se por uma

breve, repetida e aparentemente inócua separação da mãe durante o período neonatal. A

manipulação neonatal modula o desenvolvimento do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal

(HPA) e está associada com diminuída reatividade ao estresse na vida adulta (7,8) e com

maior consumo de alimentos palatáveis (9).

Os glicocorticóides estão envolvidos no desenvolvimento de distúrbios alimentares

(10,11); eles também modulam a saliência para o consumo de um alimento palatável e

influenciam a distribuição de gordura abdominal (12). Além disso, uma exposição crônica aos

glicocorticóides está associada com características clássicas da síndrome metabólica

(13,14,15). Visto que a manipulação neonatal leva a uma função diferencial do eixo HPA e

também afeta o comportamento alimentar, possivelmente esses ratos poderiam exibir uma

adaptação especial quando expostos a um desafio em específico, neste caso, a exposição

crônica a uma dieta hiperpalatável.

Assim, o objetivo desse estudo foi verificar os efeitos da manipulação neonatal sobre o

padrão metabólico de ratos adultos expostos cronicamente a uma dieta hiperpalatável e

hipercalórica (chocolate). Para isso o consumo de alimentos, peso corporal e depósito de

gordura abdominal foram medidos. Níveis plasmáticos de glicose, insulina, lipídios e

corticosterona também foram analisados. Nossa hipótese era de que a manipulação neonatal

esteja associada com um padrão diferencial de alimentação e ganho de peso e, possivelmente,

com uma particular adaptação metabólica a este tipo de dieta.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Animais experimentais:

Ratas Wistar prenhes provenientes do Biotério do Instituto de Biociências da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (Brasil), foram randomicamente selecionadas.

Em seguida, foram mantidas individualmente na caixa-moradia em um ambiente controlado,

com água e ração padrão ad libitum. Todas as ninhadas foram padronizadas em oito filhotes

Artigo 20

nas primeiras 24hs após o nascimento e mantidas intactas, exceto para os procedimentos de

manipulação que foram realizados entre às 09:00hs e às 11:00hs. O pesquisador tinha o

cuidado de trocar as luvas entre a manipulação de cada ninhada, para evitar a dispersão de

qualquer tipo de odor de uma ninhada para outra.

O dia do nascimento foi considerado o dia 0 (zero). As ninhadas foram desmamadas e

separadas por sexo no dia 21 pós-natal. Foram utilizados no máximo dois filhotes do mesmo

sexo e da mesma ninhada para o mesmo grupo. Após o desmame, os animais foram mantidos

em torno de quatro a cinco por caixa. Um total de 83 animais foi utilizado em diferentes

experimentos, derivados de 25 ninhadas. O número de animais utilizados foi estimado a partir

de experimentos prévios (9, 16), nos quais ratos manipulados no período neonatal consomem

aproximadamente 60% mais alimento palatável que ratos controles. Considerando o desvio-

padrão de 0,6 gramas proveniente desses estudos, adotando um nível de significância de 5% e

um poder de 80%, foi determinado o número de caixas necessárias para avaliar o consumo.

Para as outras variáveis, foi estabelecida uma possível diferença de 20% entre os grupos,

estimando um desvio-padrão semelhante ao observado previamente (16), adotando novamente

um nível de significância de 5% e um poder de 80%. Todos os procedimentos foram

aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS,

Brasil.

Modelo de Manipulação Neonatal:

Grupo não-manipulado: Filhotes permaneceram com a mãe, sem manipulação

neonatal, até o desmame. A limpeza rotineira das caixas foi interrompida durante esse

período.

Grupo manipulado: Este procedimento foi realizado conforme anteriormente descrito

(9). A mãe foi gentilmente afastada para um lado da caixa-moradia e os filhotes foram

removidos do ninho e colocados dentro de uma caixa limpa forrada com papel toalha. Então, a

ninhada foi colocada em uma incubadora ajustada para manter uma temperatura ambiente de

30-32°C (temperatura da água de 34

C). Após 10 minutos, os filhotes retornaram para suas

respectivas mães. Este procedimento foi realizado do dia 1 ao dia 10 pós-natal, em seguida, os

filhotes foram mantidos com a mãe, sem manipulação, até o dia 21 pós-natal.

Artigo 21

Habituação ao alimento novo:

A partir do dia 60 de vida, os ratos foram habituados a um novo ambiente contendo

um alimento novo. Uma porção de chocolate pesada previamente (chocolate ao leite –

Neugebauer®) foi colocada em uma das extremidades da caixa-corredor. Os animais foram

habituados a esse ambiente por 5 dias, durante 3 minutos cada dia, sob restrição alimentar

(recebendo em torno de 80% do consumo habitual). No 6º dia, os ratos foram testados para o

consumo de alimento palatável, após terem recebido ração padrão ad libitum nas 24 horas

prévias. Esses procedimentos foram realizados para verificar se os animais comeriam

chocolate da mesma forma que eles comumente ingerem outros tipos de alimentos palatáveis

(9), com e sem restrição alimentar. Após esse período de habituação, os animais receberam

ração padrão ad libitum.

Exposição crônica ao alimento palatável na caixa-moradia: