( PDF ) Estudo sobre a patogênese da síndrome pulmonar e cardiovascular por Hantavirus e sua associação com polimorfismo genéticos

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

ESTUDO SOBRE A PATOGÊNESE DA SÍNDROME PULMONAR E

CARDIOVASCULAR POR HANTAVIRUS E SUA ASSOCIAÇÃO

COM POLIMORFISMOS GENÉTICOS

ALESSANDRA ABEL BORGES

Ribeirão Preto

2006

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ALESSANDRA ABEL BORGES

ESTUDO SOBRE A PATOGÊNESE DA SÍNDROME PULMONAR E

CARDIOVASCULAR POR HANTAVIRUS E SUA ASSOCIAÇÃO

COM POLIMORFISMOS GENÉTICOS

Ribeirão Preto

2006

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de

São Paulo, para obtenção do título de Doutor em

Ciências.

Área de concentração: Imunologia Básica e

Aplicada, opção Bioagentes Patogênicos.

ORIENTADOR: PROF. DR. LUIZ TADEU MORAES FIGUEIREDO

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FICHA CATALOGRÁFICA

Borges, Alessandra Abel

Estudo sobre a patogênese da Síndrome Pulmonar e

Cardiovascular por Hantavirus e sua associação com polimorfismos

genéticos. Ribeirão Preto, 2006.

p. 136 : il. ; 30cm

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/USP – Programa de Pós-graduação em Imunologia

Básica e Aplicada - Área de Concentração: Bioagentes Patogênicos.

Orientador: Figueiredo, Luiz Tadeu Moraes.

1. Hantavírus. 2. Patogênese. 3. Polimorfismo. 4.Síndrome

Pulmonar. 5. Citocinas. 6. HLA.; 7.HPA.

Esta vida é uma estranha hospedaria,

De onde se parte quase sempre às tontas,

Pois nunca as nossas malas estão prontas,

E a nossa conta nunca está em dia.

Mário Quintana

Dedico este trabalho ao meu pai, José Valdir Corrêa Borges, e à minha mãe,

Odila Abel Borges, pelo exemplo e pela educação, pelo apoio, sempre, e

por todo Amor!

Dedico também aos meus avós (in memorian): da Família Teixeira

Corrêa Borges, vô Ismael e vó Orayde, e da Família Brustolin Abel, a

“nonna” Concceta e o “nonno” Chico, minhas raízes!

Finalmente, dedico este trabalho também:

à minha irmã, Fernanda, pelo zêlo e carinho;

à minha sobrinha Ana Carolina – Luz em nossas vidas!

ao meu amor Carlos Alberto, pelo amor e apoio, incondicionais!

Ainda, à minha tia Maria Conceição Abel Machado

(in memorian), pelo exemplo de carreira acadêmica,

pelo carinho, e pelo apoio, desde o início.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela Vida, pela proteção e por guiar meus passos!

Agradeço, com muito carinho, ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes

Figueiredo, Virologista de prestígio, a quem admiro. Agradeço pela orientação e pelo

exemplo. Agradeço pelas oportunidades e ensinamentos. Agradeço a chance de realizar este

trabalho, não só pela sua experiência e pela infra-estrutura laboratorial, ofertadas sem

ostentação, na simplicidade que lhe é peculiar, mas também pelo voto de confiança, que o

fez aceitar-me como aluna em seu laboratório, onde cheguei trazida pelos ventos do Sul.

Agradeço ao Prof. Dr. Eduardo Antônio Donadi, pela colaboração e co-orientação

indispensáveis à realização deste trabalho. Agradeço o oferecimento de seu laboratório para

a realização das análises genéticas. Agradeço as horas de dedicação à discussão de meus

resultados e o seu bom humor, sempre.

Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

pelo financiamento deste trabalho e pelo fornecimento de minha Bolsa de estudos,

imprescindíveis.

Agradeço ao colega hantavirologista e amigo Dr. Marcos Lázaro Moreli, pelo

trabalho em conjunto, pelas discussões científicas, pela sua amizade.

Agradeço à Neifi, do Laboratório de Imunologia Molecular, pelo auxílio total na

realização das tipificações HLA.

Agradeço à colega hantavirologista e amiga Dra. Gelse Mazzoni Campos, pelo

fornecimento dos dados clínicos dos pacientes com SPCVH, pelo “recrutamento” dos

pacientes sobreviventes de quem pude recuperar amostras de DNA. Agradeço também pela

atenção e pela amizade, pelas divertidas viagens à Jardinópolis, e também pelos momentos

de lazer.

Agradeço aos 27 pacientes com SPCVH que participaram do estudo, doando suas

amostras biológicas. Agradeço aos 96 moradores de Jardinópolis que concordaram em

participar do estudo e que nos receberam em suas casas.

Agradeço aos doadores de sangue que colaboraram com este trabalho.

Agradeço ao colega hantavirologista Dr. Ricardo Luiz Moro de Souza, pela

colaboração, pelo fornecimento dos primeiros estoques virais de Rio Mamoré, pelo

exemplo de profissionalismo.

Agradeço ao patologista Dr. Fabiano Pinto Saggioro pelo pronto fornecimento das

amostras de casos fatais de SPCVH.

Agradeço ao Dr. Renato Cassiano Silveira, da Santa casa de Misericórdia de Passos

(MG), pelo fornecimento das amostras de pacientes com SPCVH do seu município, bem

como pelas informações dos protuários médicos, sempre com tanta simpatia e presteza.

Agradeço aos ilustres Prof. Dr. João Santana da Silva e Prof. Dr Eurico de Arruda

Neto, pelo uso de seus microscópios de fluorescência. Ao Prof. Eurico, ainda, agradeço

pela correção valiosa de meu artigo de revisão.

Agradeço ao Prof. Dr. Milton Cesar Foss pela permissão do uso do equipamento

Immulite®.

Agradeço ao Prof. Dr. Fernando Cunha pelo uso do seu leitor de placa de ELISA.

Agradeço à Soraya Jabur Badra, pela companhia e apoio nas coletas de amostras em

hospitais e, principalmente, em Jardinópolis. Obrigada pela credibilidade que depositas em

mim e por todo o serviço que prestas ao laboratório. Agradeço também aos outros

funcionários: Sueli, pelo cuidado com nosso material; Pavanelli, pelo trabalho com esmero;

Paulo pelo apoio nas variadas situações; Fernanda, Francisca e Stela, pela limpeza do

laboratório e por sua alegria.

Agradeço a Márcia Cristina Livonesi (Pink) pelo auxílio na realização dos ELISAs,

pelas discussões imunológicas, pelo cultivo das células Vero, pela amizade. Agradeço

também à Luzia Barreira, à Juliana Helena Chávez e à Veridiana Ester de Barros, que

também me ajudaram no dia “D” dos ELISAs!

Agradeço à Thalita Bonadio Coelho que doou seu sangue como controle negativo

nas reações de imunofluorescência. Agradeço também sua delicadeza e amizade.

Agradeço ao aluno de pós-doc Dr. Celso Teixeira Mendes Junior, pela realização

das análises estatísticas populacionais, pelos esclarescimentos em genética de populações,

pelo tempo dispensado às minhas dúvidas com tanta presteza.

Agradeço a Giuliana do laboratório do Prof. Dr. Fernando Cunha, pelo auxílio na

quantificação do óxido nítrico e pela leitura das placas de ELISA.

Agradeço ao amigo e colega virologista Prof. Dr. Victor Hugo Aquino, por sanar

tantas dúvidas “virológicas”, pelo ouvido amigo e conselhos valiosos.

Agradeço à Glauciane Garcia de Figueiredo, “pupila” que no último ano vem me

acompanhando no estudo da hantavirose e me ajudou muito nestes últimos meses.

Agradeço a Ana Cristine, da PG imuno, pela eficiência impecável com que sempre

cuida de tudo. Obrigada também pelo carinho!

Agradeço aos amigos que vieram de longe, mas que encontrei aqui: Janaína Crispin

Freitas, Paula Renata Lima Machado, Kleber Juvenal Silva Farias, Fábio Francisco

Marques e Vanessa Menjon Muller pela palavra amiga, pelo abraço confortante. Janaína,

muito obrigada pelo seu apoio e seu cuidado comigo.

Agradeço a minha amiga e colega do Mestrado na UFSC, Flávia Martinelo e à

Viviane Casagrande Marigella, que me receberam em suas casas por ocasião da realização

das provas para o doutorado, aqui em Ribeirão.

Agradeço ao amigo e companheiro de congresso, o divertido Lauro Juliano Marin,

pela hospitalidade, amizade sincera e simplicidade.

Agradeço à amiga Juliana Helena Chávez, cuja amizade foi muito importante num

momento difícil de minha vida. Agradeço o ouvido pronto e amigo, a companhia e os

momentos bons.

Agradeço a Paulinha Fernanda Gonçalves, pela amizade sincera e exemplo de

humildade.

Agradeço aos colegas do laboratório (ainda não citados acima): Laura, Aldo, Aline,

Raquel, Roberta, Thiago, Alberto, Liz, Andréia, Regina, Mariana, Luiza, Emiliana, Mayra,

Rafael, Camila, Maria Teresa, Patrícia, Cláudio, Dani e D.Maria que de uma forma ou de

outra contribuíram comigo, seja no trabalho, seja na convivência diária do laboratório, seja

em momentos de descontração. Ao Dr. Aldo Cunha, agradeço também por sempre

responder prontamente às minhas dúvidas “médicas” e pela sua amizade.

Agradeço ao meu cunhado Giulino Blanc Pierri, pela “força” e conselhos nos

problemas “computacionais”.

Agradeço, sinceramente, aos meus pais pela minha vida, pelo esmero na educação e

na formação do meu caráter, pelo apoio e amor irrestritos.

Agradeço com muita gratidão, ao meu namorado Carlos Alberto, o Boina, pelo

apoio sem o qual não sei se conseguiria chegar até o fim, pela resignação e paciência

fraternal, pelo ouvido atento, pelo coração acolhedor, pela minha ausência e pelo respeito

às minhas escolhas, pelo amor puro e sincero. Ah, e também pelo auxílio na tabulação dos

resultados. Muito obrigada!

SUMÁRIO

Lista de Figuras iii

Lista de Tabelas v

Resumo vi

Summary vii

1. INTRODUÇÃO

1.1. Gênero Hantavirus 1

1.1.1 Estrutura Viral 1

1.1.2 Histórico 2

1.1.3 Epidemiologia 4

1.1.4 Epidemiologia da hantavirose no Brasil 5

1.2 Síndrome Pulmonar e Cardiovascular por Hantavírus (SPCVH) 7

1.2.1 Características clínicas e achados laboratoriais 7

1.2.2 Achados anátomo-patológicos 11

1.2.3 Elementos envolvidos na patogênese da SPCVH 13

1.2.3.1 Viremia 13

1.2.3.2 Receptores celulares e Interações Célula-Hantavírus 13

1.2.3.3 Anticorpos neutralizantes 15

1.2.3.4 Quimiocinas, citocinas e resposta imune celular 16

1.3. Susceptibilidade genética e infecção por hantavírus 17

1.3.1. Polimorfismo dos Alo-antígenos Plaquetários Humanos 18

1.4.Justificativa

2. OBJETIVOS

2.1.Objetivo geral 20

2.2.Objetivos específicos 20

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. População de estudo 21

3.2. Coleta das amostras 23

3.3. Diagnóstico molecular da SPCVH 27

3.3.1. Produção de fluído infeccioso do hantavírus Rio Mamoré 30

3.4. Quantificação de mediadores inflamatórios e anti-inflamatórios plasmáticos 30

3.4.1. Ensaios imunoenzimáticos (ELISAs) para dosagens de IFN-, IFN-, TNF-,

IL-12, IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-

3.4.2. Ensaio quimioluminescente para dosagem de TNF-, IL-1, IL-6 e IL-2R

3.4.3. Quantificação de Óxido Nítrico (NO) 35

3.4.4. Quantificação de proteína C reativa 36

3.5. Análises de Polimorfismos Genéticos 37

3.5.1. Tipificação dos Genes HLA 38

3.5.2. Tipificação dos genes das citocinas TNF-, IFN-, TGF, IL-6 e IL-10

3.5.3. Tipificação dos aloantígenos plaquetários HPA-1, HPA-4 e HPA-6 40

3.6 Análise estatística 41

3.7 Cálculo da Pressão Arterial (P.A) Média 43

4. RESULTADOS

4.1. Diagnóstico molecular da SPCVH 44

4.2. Quantificações de mediadores plasmáticos 45

4.3. Correlações entre as citocinas e destas com parâmetros clínico-laboratoriais 57

4.4. Análises de polimorfismo genético 64

4.4.1. Tipificação do HLA-A 64

4.4.2. Tipificação do HLA-B 68

4.4.3. Tipificação do HLA-Cw 70

4.4.4. Tipificação do HLA-DR 71

4.4.5. Tipificação dos genótipos de TNF- na posição –308 da região promotora

4.4.6. Tipificação dos genótipos/fenótipos das citocinas IL-10 –1082, -819, -592; IFN

+874; IL-6 -174 e TGF codons 10, 25

4.4.7. Tipificação dos Sistemas de Alo-antígenos Plaquetários Humanos HPA-1, HPA-

4 e HPA-6

4.5. Correlação entre genotipagem e quantificação de citocinas 79

5. DISCUSSÃO

6.CONCLUSÕES

117

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

118

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1:

A) Representação esquemática da morfologia dos vírions da família

Bunyaviridae.

B) Microscopia eletrônica do vírus Hantaan (gênero Hantavirus)

Figura 2:

Evolução radiológica da paciente C.B. com SPCVH

Figura 3:

Coleta residencial de amostras sanguíneas e obtenção de dados

epidemiológicos dos indivíduos do grupo soropositivos para

hantavírus.

Figura 4:

Amplicons obtidos na RT-PCR para hantavírus.

Figura 5:

Níveis séricos de Fator de Necrose Tumoral-alpha (TNF-) em 11

indivíduos do grupo SPCVH e em 11 indivíduos controle

Figura 6:

Níveis séricos de Fator de Necrose Tumoral-beta (TNF-β) em 12

indivíduos do grupo SPCVH e em 27 indivíduos controle

Figura 7:

Níveis séricos de IL-6 em 10 indivíduos do grupo SPCVH e 24

indivíduos controle

Figura 8:

Níveis séricos de IL-12 em 12 indivíduos do grupo SPCVH e 29

indivíduos controle (A). Níveis séricos de IL-1 beta em 11

indivíduos do grupo SPCVH e 14 do controle (B).

Figura 9:

Níveis séricos de Interferon gama em 17 indivíduos do grupo

SPCVH e 21 indivíduos controle

Figura 10:

Níveis séricos de receptor solúvel de IL-2, em 11 indivíduos do

grupo SPCVH e em 13 indivíduos do grupo controle

Figura 11:

Níveis séricos de Interleucina-10 em 18 indivíduos do grupo

SPCVH e 22 indivíduos controle

Figura 12:

Níveis séricos de TGF-B em 16 indivíduos do grupo SPCVH e 23

indivíduos controle

Figura 13:

Níveis séricos de óxido nítrico, quantificado como nitrito, em 12

indivíduos do grupo SPCVH e em 25 indivíduos do grupo controle

Figura 14:

Análise de regressão linear entre as concentrações de TNF e IL-6,

no grupo do SPCVH.

Figura 15:

Análises de regressão linear entre as concentrações de IL-12 e IFN-γ

(A) e IL-10 (B) no grupo do SPCVH

Figura 16:

Análises de regressão linear entre as concentrações de IFN-γ e:

TNF-α (A) TNF- (B) e IL-10 (C), no grupo do SPCVH.

Figura 17:

Análise de regressão linear entre as concentrações de TNF-β e IL-10

no grupo do SPCVH.

Figura 18:

Análises de regressão linear entre as concentrações de NO e TNF-

(A); e NO e IL-6 (B), no grupo do SPCVH.

Figura 19:

Correlações positivas significantes, no grupo SPCVH, entre as

concentrações de IFN-γ (A), IL-10 (B), IL-12 (C) e IL-2R (D) e os

valores de hematócrito, por Regressão linear.

Figura 20:

Correlação positiva significante entre TNF-β e valores de

hematócrito (A); e Correlação negativa entre TNF-β e a média da

pressão arterial (B) no grupo SPCVH.

Figura 21:

Correlações negativas entre a média da pressão arterial e IL-6 (A);

IFN- (B) e IL-10 (C). Correlação positiva entre TGF- e a média da

pressão arterial (D), no grupo SPCVH.

Figura 22:

Correlações negativas entre a pressão de oxigênio e IL-2R (A) e

TNF- (B), no grupo SPCVH.

Figura 23:

Amplicons da SSP-PCR HLA-classe I (A, B, Cw).

Figura 24:

Amplicons da SSP-PCR HLA-DR.

Figura 25:

Frequência do alelo hipersecretor do TNF (TNF-2) em indivíduos

dos grupos: SPCVH, soropositivos, e controles.

Figura 26:

Amplicons da SSP-PCR de citocinas.

Figura 27:

Amplicons da ASP-PCR para Antígenos Plaquetários Humanos

Figura 28:

Correlação dos dados de genotipagem da região promotora do TNF-

 -308 com dados da quantificação do TNF- no soro de 10

participantes do grupo SPCVH e de 12 participantes do grupo

soropositivos.

Figura 29:

Correlação dos dados de genotipagem do gene da IL-6 na posição -

174 com dados da quantificação da IL-6 no soro de 9 participantes

do grupo SPCVH e de 11 participantes do grupo Soropositivos.

Figura 30:

Correlação dos dados de genotipagem na região promotora do gene

da IL-10 nas posições –1082, -819, -592 com dados da quantificação

da IL-10 no soro de 12 participantes do grupo SPCVH

Figura 31:

Correlação dos dados de genotipagem nos códons 10 e 25 do gene

do TGF- com dados da quantificação do TGF- no soro de 13

participantes do grupo SPCVH.

Figura 32:

Correlação dos dados de genotipagem no gene do IFN- na posição

+874 com dados da quantificação do IFN- no soro de 11

participantes do grupo SPCVH.

Figura 33:

Modelo esquemático sobre a participação de citocinas na patogênese

da SPCVH, segundo os resultados do presente trabalho.

116

LISTA DE TABELAS

Tabela 1:

Formas polimórficas conhecidas da GPIIIa (

integrina) de acordo

com suas denominações sorológicas e designações da nomenclatura

HPA.

Tabela 2:

Origem das amostras clínicas do grupo SPCVH.

Tabela 3:

Características epidemiológicas, evolutivas e do local de diagnóstico

dos pacientes participantes do grupo SPCVH e o tipo de amostra

coletada.

Tabela 4:

Sequência nucleotídica dos primers utilizados para amplificação do

genoma do hantavírus ARAV pela reação de RT-PCR e tamanho

dos respectivos amplicons

Tabela 5:

Condições de reação nos ensaios para quantificação das citocina

IFN-, IFN-, TNF-, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-.

Tabela 6:

Regiões alélicas polimórficas nos genes das citocinas indicadas,

onde anelam primers do kit Cytokine Genotyping Tray One lambda,

mostrando também a associação entre genótipo e fenótipo de

produção de citocinas.

Tabela 7:

Primers tipificadores de aloantígenos plaquetários.

Tabela 8:

Tabela de contingência 2 X 2

Tabela 9:

Quantificações de citocinas e óxido nítrico em 21 pacientes com

SPCVH.

Tabela 10:

Concentrações da proteína C Reativa em amostras de soro de

indivíduos com a SPCVH.

Tabela 11:

Parâmetros clínico-laboratoriais de 17 indivíduos do grupo SPCVH

Tabela 12:

Alelos do HLA-A, -B, Cw e –DR, e genotipos do TNF- -308, nos

indivíduos do grupo SPCVH, evidenciando em negrito os alelos que

exibiram significante diferença no grupo.

Tabela 13:

Freqüência de alelos HLA-A em indivíduos do grupo SPCVH e no

grupo controle.

Tabela 14:

Alelos HLA ausentes no grupo SPCVH , mas presentes no grupo

controle, e suas respectivas frequências

Tabela 15:

Freqüência de alelos HLA-B no grupo SPCVH e no grupo controle.

Tabela 16:

Freqüência de alelos HLA-Cw em indivíduos com SPCVH e no

grupo controle

Tabela 17:

Freqüência de alelos HLA-DR no grupo SPCVH e no grupo controle

Tabela 18:

Freqüência de genótipos de TNF- -308 nos grupos SPCVH,

soropositivos e controles.

Tabela 19:

Freqüência de fenótipos de citocinas nos grupos SPCVH,

soropositivos e controles.

Tabela 20:

Fenótipos de produção das citocinas TNF-, IL-6, IL-10, TGF- e

IFN- em cada indivíduo do grupo SPCVH informando as

quantificações séricas que foram realizadas.

Tabela 21:

Alelos dos Sistemas Antígenos Plaquetários HPA-1, -4 e –6 nos

indivíduos do grupo SPCVH.

Tabela 22:

Freqüência de genotipos de três sistemas HPA nos grupos: SPCVH,

soropositivos e controles

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo investigar aspectos da patogênese da Síndrome

Pulmonar e Cardiovascular por Hantavirus (SPCVH) e a sua associação com polimorfismos

em genes codificadores de proteínas envolvidas na resposta imune. Estudou-se um total de

27 pacientes com a síndrome. Foram quantificados mediadores pró- e anti-inflamatórios em

amostras séricas de indivíduos acometidos pela SPCVH. Encontrou-se níveis séricos

elevados de TNF-, TNF-, IL-6, IFN-, IL-12, IL-10 e de IL-2R,estes foram associados

com a hemoconcentração e a hipotensão, nos pacientes com SPCVH. A polarização da

resposta imune contra hantavírus parece ser para padrão TH1. Os níveis da citocina

supressora, TGF- estavam diminuídos nos pacientes com a SPCVH, sugerindo que ocorra

uma inibição na produção desta citocina durante a infecção por hantavírus. Assim, citocinas

da resposta inata e de padrão TH1 tem papel importante na patogênese da SPCVH. A

infecção por hantavirus pode inibir a secreção de TGF- e este poderia ser um dos

mecanismos responsáveis pela resposta imune exacerbada que ocorre na SPCVH.

Ainda, neste trabalho foram determinados os polimorfismos nos genes codificadores

de HLA, Antígenos Plaquetários Humanos (HPA) e citocinas, nos pacientes com a SPCVH.

As frequências dos alelos HLA-A*80, HLA-B*38, HLA-B*78 e HLA-Cw*03 estavam

aumentadas nos indivíduos com SPCVH quando comparadas com as da população,

sugerindo um fator de risco para a doença. Também, o alelo TNF-2, determinante da

hipersecreção do TNF-, foi encontrado de estar presente em maior frequência nos

indivíduos que desenvolveram a SPCVH do que em indivíduos que tiveram infecção

pregressa por hantavirus sem história clínica da doença, sugerindo que este alelo possa estar

envolvido no desenvolvimento da doença.

vii

SUMMARY

Hantaviruses are emerging viruses in the Americas that cause a Cardiopulmonary

Syndrome (HCPS) with high case fatality rate. Immune response against the hantavirus has

been thought to be involved in the respiratory failure and the cardiogenic shock of HCPS.

The aims of this work were, to study the immunopathogenesis of HCPS and to investigate

the association of polymorphisms in genes related to immune-response such as, Human

Leukocyte Antigens (HLA), cytokines genes and Humans Platelet Alloantigens (HPA)

alleles with severity of HCPS. Twenty seven HCPS patients participated of the study. Pro-

and anti-inflammatory cytokines were quantified in the blood samples of the patients. High

plasmatic levels of TNF-, TNF-, IL-6, IFN-, IL-12, IL-10 and soluble Interleukin-2

receptor (IL-2R) were observed. These results were associated to the hemoconcentration

and the low blood pressure observed in the HCPS cases. This cytokine pattern suggests that

a TH 1 immune response could occur in HCPS. Low levels of TGF- were observed in the

patients. It could be associated to a reduced production of this cytokine and to an

exacerbated immune response in HCPS.

We also analyzed genetic polymorphisms of HLA, HPA and cytokine genes in

the HCPS patients. The allelic frequencies of HLA-A*80, HLA-B*38, HLA-B*78 and

HLA-Cw*03 were higher than those observed in the general population, suggesting that

they could be HCPS risk factors. Likewise, the TNF-2 allele, related to TNF- high

production, was observed in a higher frequency in HCPS patients than in individuals that

were infected by hantavirus but without having HCPS. It suggests that the TNF-2 allelle

could be related to HCPS.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Gênero Hantavirus

1.1.1. Estrutura Viral

Os virions do gênero Hantavirus, família Bunyaviridae são esféricos ou ovóides,

com diâmetro de 80 a 120nm, e com projeções glicoprotéicas de superfície de 5 a 10nm, as

quais estão inseridas em um envelope de bicamada lipídica com aproximadamente 5 a 7nm

de espessura. As espículas consistem de heterodímeros de glicoproteínas virais, G1 e G2

(HEWLETT, 1991; SCHMALJOHN and HOOPER, 2001) (Figura 1A). As glicoproteínas

interagem para formar unidades morfológicas de superfície que variam entre os diferentes

gêneros. A estrutura de superfície dos vírus do gênero Hantavirus são distintamente

ordenadas conferindo uma aparência quadrangular com aspecto de rede (McCORMICK et

al., 1982) (Figura 1B).

O genoma dos Hantavirus consiste de três segmentos de RNA fita simples de

polaridade negativa, designados: grande (L), médio (M), e pequeno (S). O segmento S

codifica a proteína multifuncional do nucleocapsideo (N). O segmento M contém a

informação genética para produção de um precursor poliproteico (GPC) que é

posteriormente clivado nas duas glicoproteínas do envelope G1 e G2, também conhecidas

como Gn e Gc, respectivamente. Finalmente, o segmento L codifica a RNA polimerase

dependente de RNA (SIMMONS e RILEY, 2002). Todos os três segmentos genômicos do

vírus têm uma sequência nucleotídica consenso complementar em suas terminações 3’ e 5’.

As seqüências de nucleotídeos terminais são altamente conservadas entre os Bunyaviridae de

cada gênero, mas diferem dos vírus dos outros gêneros. O pareamento de bases dos

nucleotídeos terminais é previsto para formar estruturas estáveis e não covalentes de RNAs

circulares (HEWLETT et al., 1977). Os segmentos de RNA são complexados com proteínas

N para formar nucleocapsídeos individuais L, M, e S, os quais parecem ser helicoidais

(OBIJESKI et al., 1976) (Figura 1A).

Figura 1: A) Representação esquemática da morfologia dos vírions da família

Bunyaviridae. Os três segmentos genômicos de RNA (S, M, e L) são complexados com

proteínas do nucleocapsídeo para formar estruturas de ribonucleocapsídeos. Os

nucleocapsídeos e a RNA polimerase dependentes de RNA são empacotados dentro de um

envelope lipídico que contém glicoproteínas virais, G1 e G2. Não há proteína de matriz.

(Adaptado de SCHMALJOHN e HOOPER, 2001). B) Microscopia eletrônica do vírus

Hantaan (gênero Hantavirus), aumento de 135.000 x. (Adaptado de NICHOL, 2001)

1.1.2. Histórico

A descoberta dos hantavírus data de 1975 quando o agente etiológico da Febre

Hemorrágica com Síndrome Renal (FHSR) foi isolado dos pulmões do rato do campo

Apodemus agrarius, identificado como o roedor reservatório. O vírus foi identificado como

membro da família Bunyaviridae, apesar de não ser transmitido por artrópodos, como os

outros membros da família. Este vírus foi chamado de Hantaan devido à proximidade do

local de coleta do roedor com o Rio Han, em um vale (taan). Este se tornou o protótipo do

gênero Hantavirus (LEE e LEE, 1976; LEE et al., 1978; LEE, 1981a).

Ribonucleocapsídeos

Envelope

lipídico

Carbohidratos

N-ligados

Polimerase (L)

A FHSR foi inicialmente denominada Febre Hemorrágica Coreana, quando mais de

3.000 casos de doença febril aguda foram registrados, entre os anos de 1951-1954, em

tropas norte-americanas em combate no conflito entre a Coréia do Sul e a do Norte

(EARLE, 1954). Um caso típico de FHSR poderia exibir sintomas influenza-símile por

cerca de uma semana, seguidos por fase hipotensiva após a resolução febril, cursando com

trombocitopenia relacionada à ocorrência de petéquias e uma fase subsequente de

insuficiência renal, com choque em cerca de 10 a 15% dos pacientes (IISHII, 1942;

CHUMAKOV, 1963; LEE, 1989). Por muito tempo acreditou-se que a FHSR ocorria

apenas na Ásia, entretanto, há mais de 50 anos, uma doença similar, porém de menor

gravidade, chamada Nefropatia Epidêmica (NE) foi descrita na Escandinávia

(NIKLASSON e LeDUC, 1987). Após o isolamento do vírus Hantaan, observou-se que

soro de pacientes convalescentes de NE, também, apresentavam anticorpos que reagiam

contra este vírus. Hoje se sabe que a NE é causada pelos hantavírus Puumala (PUUV).

Outro hantavírus observado na Europa é o Dobrava, que causa uma zoonose endêmica na

Europa Central, Oeste da Rússia e Escandinávia (LEE et al, 1990; MUSTONEN et al,

1998; KLEMPA et al, 2004).

O maior evento recente na história dos hantavírus foi a descoberta da Síndrome

Pulmonar e Cardiovascular por Hantavírus (SPCVH) no sudeste dos Estados Unidos (EUA)

em 1993 (NICHOL, 1993). Vários casos identificados na região de Four Corners, na divisa

entre 4 estados americanos (Arizona, New Mexico, Utah, e Colorado), apresentavam uma

doença similar à influenza com febre, cefaléia, mialgias, e calafrios; a doença rapidamente

progredia com quadro respiratório grave associado a infiltrado pulmonar bilateral, falência

respiratória, choque e morte 2 a 10 dias após o início da doença, em quase 50% dos casos

(KHAN, 1996a). Neste surto um novo vírus foi identificado, o Sin Nombre (SNV) e este

foi implicado como o causador da SPCVH (NICHOL, 1993). Nos anos que se seguiram,

observou-se a ocorrência de SPCVH nas Américas, desde o Canadá até a Patagônia,

causada por pelo menos 10 distintos hantavírus, cada um associado a uma espécie diferente

de roedor (NICHOL, 2001).

1.1.3. Epidemiologia

A infecção humana por hantavírus ocorre principalmente pela inalação de aerossóis

contendo material infeccioso viral oriundo da urina e outras excretas de roedores

infectados. Entretanto, pode haver transmissão viral por ingestão de alimentos

contaminados ou por contato físico direto com os roedores (SCHMALJOHN & HJELLE,

1997; SIMMONS e RILEY, 2002). A transmissão inter-humana tem sido descrita para o

vírus Andes (ANDV) na Argentina e Chile (ENRIA et al, 1996; WELLS et al, 1997;

PADULA et al, 1998; MARTINEZ et al, 2005) e esta parece ocorrer durante a fase

prodrômica da doença (MARTINEZ et al, 2005). De modo geral, indivíduos adultos da área

rural apresentam maior risco de infecção (NICHOL, 2001).

A infecção de roedores, os reservatórios naturais dos hantavírus, parece ocorrer com

ausência de doença e nestes animais, estabelece-se infecção persistente que pode perdurar

por muitos meses ou anos (LEE, et al 1981a; LEE, et al 1981b; YANAGIHARA, et al.,

1985; GAVRILOVSKAYA, et al, 1990; NICHOL, 1999). A distribuição geográfica dos

hantavírus e os padrões epidemiológicos observados na FHSR e SPCVH refletem a

distribuição e as características da história natural dos hospedeiros roedores, com os quais,

acredita-se, hantavírus tenham co-evoluído em íntima associação. Seguindo o habitat do

roedor-reservatório, cada hantavírus limita-se a uma região geográfica. Infectam-se com

hantavírus, roedores das subfamílias Murinae, Arvicolinae e Sigmodontinae (PLYUSNIN,

2002). Atualmente existem 30 espécies de hantavírus oficialmente reconhecidas pelo

Comitê Internacional sobre Taxonomia Viral (LEDNICKY, 2003).

Nas Américas, a SPCVH é transmitida por roedores da subfamília Sigmodontinae

infectados com os vírus SNV, New York, Bayou, Black Creeck Canal na América do

Norte, vírus Choclo na América Central e os vírus Laguna Negra, ANDV, Lechiguanas,

Hu39694, Oran, Juquitiba, Araraquara (ARAV), Castelo dos Sonhos e Anajatuba na

América do Sul (LeDUC, 1987; NICHOL et al, 1993; SCHMALJOHN and HJELLE, 1997;

HJELLE et al, 1995; MORZUNOV et al, 1995; RAVKOV et al, 1995; JOHNSON et al,

1997; LÓPEZ et al, 1996; LEVIS et al, 1998; MONROE et al, 1999; JOHNSON et al,

1999a; PADULA et al, 2000a; ARMIEN et al, 2004; MENDES et al, 2004).

1.1.4. Epidemiologia da hantavirose no Brasil

No Brasil, os primeiros casos conhecidos de SPCVH ocorreram no município de

Juquitiba, situado a 80 km da cidade de São Paulo, em 1993. Do material clínico de casos

fatais, detectou-se parte do segmento genômico de M, na região codificadora da proteína

G2 de um hantavírus, que foi denominado Juquitiba (IVERSSON et al., 1994; DA SILVA

et al.; 1997; VASCONCELOS et al, 1997; MONROE et a, 1999). Em 1995 e 1996, apenas

três novos casos de SPCVH foram diagnosticados no país (JOHNSON et al., 1997). O

primeiro paciente suspeito de SPCVH, no ano de 1995, era da região Centro-Oeste, do

Vilarejo de Castelo dos Sonhos, estado do Pará e os dois restantes, no ano de 1996, eram

dos municípios de Araraquara e Franca, no estado de São Paulo. Estudos moleculares com

amostras destes indivíduos permitiram a detecção do genoma de duas linhagens de

hantavírus, Castelo dos Sonhos e ARAV (JOHNSON et al, 1999a). Mais recentemente,

novos hantavírus causadores de SPCVH foram identificados no Brasil, sendo denominados

de Anajatuba no estado do Maranhão e o previamente conhecido Laguna Negra foi

detectado em Mato Grosso (MENDES et al, 2004; ROSA et al, 2005; M.R. Elkhoury,

Ministério da Saúde, comunicação pessoal).

Desde 1993, casos de SPCVH tem sido diagnosticados em vários estados do Brasil

com ocorrência maior nas regiões Sul e Sudeste (SUZUKI et al., 2004). Mais de 700 casos

de SPCVH foram notificados no Brasil até julho de 2006 (M.R. Elkhoury, Ministério da

Saúde, comunicação pessoal).

Na região de Ribeirão Preto, desde 1998, foram diagnosticados 42 casos de SPCVH,

causados pelo ARAV com uma letalidade de 50%. A maioria dos indivíduos acometidos

era do sexo masculino, em idade produtiva e com atividade em área rural (L.T.M.

FIGUEIREDO, dados não publicados).

A sazonalidade da hantavirose no Brasil varia conforme a região estudada. Na região

Sudeste (Cerrado), observa-se a maior proporção de roedores (Bolomys lasiurus) infectados

no outono-inverno, quando são também registrados os maiores números de casos da

SPCVH. Inclui-se aqui a região de Ribeirão Preto, onde a infecção humana tem sido

associada à cultura do capim braqueárea e do milho, copiosas fontes de alimento para

Bolomys lasiurus e também, ao corte da cana-de-açúcar. Diferentemente, na região Sul,

especialmente no Paraná, os casos de SPCVH são mais frequentes na primavera-verão,

associados a roedores Oligoryzomys sp. e à cultura de milho e ao corte de Pinus. No ano de

2004, no estado de Santa Catarina, ocorreu um surto de hantavirose, com 26 casos,

ocasionado pelo grande aumento de roedores-reservatório em decorrência da floração da

taquara lixa, a ratada (AMORIM e CALDAS, 2005).

1.2. Síndrome Pulmonar e Cardiovascular por Hantavírus (SPCVH)

Quando ocorreram os primeiros casos de infecção por hantavírus nos EUA, os

proeminentes sintomas respiratórios da doença levaram à denominação Síndrome Pulmonar

por Hantavírus (SPH), entretanto, como a infecção produz extravasamento capilar e

também causa depressão miocárdica, a doença passou a ser referida, nos anos recentes,

como SPCVH. Desde então, há pouco mais de uma década, a SPCVH tem se estabelecido

como uma zoonose emergente Pan-americana e que vem causando crescente número de

casos, especialmente no Brasil (PETERS e KHAN, 2002; FIGUEIREDO et al, 2003).

1.2.1. Características clínicas e achados laboratoriais

A doença é caracterizada por um período de incubação que varia entre 9 e 33 dias,

com uma mediana de 14 a 17 dias, de acordo com uma revisão de 11 casos de pacientes

com SPCVH tendo uma exposição a roedores isolada e bem definida (YOUNG et al, 2000).

Outro estudo relatou um período de incubação de 3 semanas, baseado em dois meninos que

foram mordidos pelo mesmo roedor e desenvolveram a doença (JEOR, 2004). Após o

período de incubação, a SPCVH manifesta-se com dois acometimentos: pneumonia

intersticial grave e generalizada que leva à insuficiência respiratória e choque cardiogênico,

que é causa comum de óbito (FIGUEIREDO et al, 2000). Detalhadamente, entretanto, as

características clínicas da SPCVH podem ser divididas em quatro fases: fase febril,

cardiopulmonar, diurética e convalescente (ENRIA et al, 2001).

Fase Febril:

Este período prodrômico dura tipicamente 3 a 5 dias e é caracterizado por febre,

mialgia e mal estar. Outros sintomas podem estar presentes como cefaléia, vertigem,

anorexia, náusea, vômito, diarréia e dor abdominal. Nesta fase, o reconhecimento da SPCVH

é difícil e esta pode ser confundida com outras doenças virais. Entretanto, na SPCVH estão

ausentes sinais de acometimento do trato respiratório superior, como dor de garganta,

rinorréia, sinosite e dor de ouvido. Ao final desta fase prodrômica e início do edema

pulmonar, aparecem a tosse seca e a taquipnéia (ENRIA et al, 2001).

Fase Cardiopulmonar:

Esta fase é caracterizada pelo surgimento de edema pulmonar, que

pode progredir rapidamente (em 4 a 24h) e choque (ENRIA et al, 2001). A dispnéia surge no

3º ou 4º dia de doença manifestando-se, inicialmente, aos moderados esforços, mas

progredindo em 24 a 48 horas para dispnéia de repouso, concomitante a uma inundação de

alvéolos detectável por estertoragem crepitante disseminada ao exame dos pulmões.

Também, acompanha a inundação de alvéolos pulmonares, tosse freqüente com eliminação

de secreção pulmonar rósea. A dispnéia, desconfortável e incapacitante, leva o paciente a

procurar assistência médica, mais comumente no 4° dia de doença (FIGUEIREDO et al,

2000). A taquipnéia, a dispnéia estertoral e tosse seca são decorrentes do edema pulmonar.

Este edema é de origem não cardiogênica. Hipoxemia é uma caraterística comum (PO2 <70

mmHg). O progressivo extravasamento de líquido rico em proteínas dos capilares

sanguíneos para o interstício pulmonar e alvéolos resulta em hipovolemia, o que contribui

para o choque, assim como o baixo débito cardíaco, indicativo de falência miocárdica. Uma

vez que o edema esteja presente, a doença progride rapidamente, podendo levar ao óbito

dentro de 24h, sendo a hipóxia e o colapso circulatório as causas imediatas da morte. Este

colapso circulatório difere daquele observado no choque séptico, com baixo débito cardíaco,

alta resistência vascular periférica e hipotensão (ENRIA et al, 2001).

Fase Diurética:

Esta fase é caraterizada pelo rápido clareamento do edema pulmonar,

resolução da febre e do choque. A diurese espontânea é um sinal precoce da reabsorção dos

líquidos acumulados em conseqüência do extravasamento capilar. Assim, nesta fase, os

líquidos saem do interstício e voltam para o leito vascular sendo eliminados pela urina

(ENRIA et al, 2001).

Fase Convalescente:

Este período pode durar 2 meses, com recuperação aparentemente

completa dos pacientes. Contudo evidencias preliminares sugerem que disfunção pulmonar

pode estar presente precocemente, em alguns pacientes (G. M. CAMPOS, dados não

publicados).

Laboratorialmente, a infecção por hantavírus é acompanhada de trombocitopenia

abaixo de 130.000/mm

e hemoconcentração acima de 55%, na maioria dos pacientes

(FIGUEIREDO et al, 2000). A contagem de leucócitos pode estar normal ou elevada na

admissão e frequentemente é observada mais elevada nos casos fatais (ENRIA et al, 2001),

o que poderia ser usado como critério prognóstico (CAMPOS et al, 2005). Frequentemente

observa-se presença de neutrófilos jovens e a presença de linfócitos atípicos ou

imunoblastos (células mononucleares proeminentes, com mais de 180 de diâmetro, cujos

citoplasmas coram-se em azul escuro ao Giemsa), já na fase de edema pulmonar (ENRIA et

al, 2001). Níveis elevados de creatinina e uréia sanguíneos estão relacionados ao choque e à

hipovolemia, mas também podem estar relacionados à infecção por hantavírus da

microvasculatura renal incluindo a dos glomérulos. Outros achados incluem enzimas

hepáticas pouco elevadas, com níveis de bilirrubina normais, hipoalbuminemia e lactato

desidrogenase elevada em casos graves de acidose láctica. Muitos pacientes apresentam

tempo de tromboplastina parcial anormal e algumas vezes um tempo de protrombina

prolongado sugerindo a ocorrência de coagulopatia de consumo (ENRIA et al, 2001).

O exame radiográfico de tórax dos pacientes com SPCVH mostra-se altamente

sugestivo, portanto, de grande importância para o diagnóstico. Na Figura 2, a evolução

radiológica de uma paciente atendida no HC-FMRP-USP mostra pneumopatia com o

padrão típico da SPCVH. Acompanham o surgimento da febre e da dispnéia, em torno do

quarto dia de doença, imagens radiológicas de velamento pulmonar bilateral intersticial que

progride com tendência a confluir e a produzir infiltração alveolar. Concomitante com o

agravamento da insuficiência respiratória, o velamento pulmonar misto torna-se denso e

acometendo praticamente todos os campos pulmonares. Nesta fase, medidas terapêuticas de

oxigenação, como entubação e ventilação devem ser tomadas. Nos sobreviventes, após

aproximadamente três dias, o quadro radiológico começa a melhorar progressivamente

(FIGUEIREDO et al, 2000).

Figura 2: Evolução radiológica da paciente C.B. com SPCVH: no exame de 20/6/99,

observa-se velamento pulmonar de padrão misto, alveolar e intersticial, com áreas de

confluência nas bases; no exame de 22/6/99, observa-se aumento em extensão e densidade

dos velamentos que acometem completamente os pulmões; em 27/6/99, observa-se

remissão progressiva dos infiltrados e que em 30/6/99 apresentam-se como reticulações

apenas em bases pulmonares (Adaptado de FIGUEIREDO et al, 2000).

1.2.2. Achados anátomo-patológicos

O exame anátomo-patológico dos pulmões de casos fatais por SPCVH mostra

edema alveolar difuso, membranas hialinas e infiltrado intersticial mononuclear (ZAKI et

al, 1995; NOLTE et al, 1995). O estado preservado em que se encontram as células

endoteliais nos pulmões, associado à hemoconcentração e à presença, em alguns casos, de

derrames pleurais, sugere que a SPCVH manifeste-se com extravasamento de líquidos dos

capilares para o interstício e alvéolos. As células endoteliais não são lisadas pelos

hantavírus, embora células do sistema imune sejam recrutadas para o endotélio infectado

(ZAKI et al, 1995). Encontram-se células semelhantes a linfócitos atípicos, denominadas

imunoblastos, no sangue, nos interstícios pulmonares, nos espaços portais hepáticos e no

baço (ZAKI et al, 1995; NOLTE et al, 1995; FIGUEIREDO et al, 1999). Presença de

partículas virais e antígenos de hantavírus são descritos no interior do endotélio capilar de

seres humanos infectados, primariamente nos pulmões, mas também, no endotélio renal,

cardíaco e hepático, além de altas densidades de antígenos virais nos folículos linfóides

esplênico e em menor densidade nos linfonodos, pâncreas, músculo esquelético, intestino,

glândula adrenal, bexiga, cérebro e em tecido adiposo (NOLTE et al, 1995; ZAKI et al,

1995; SAGGIORO, 2004). Também, foram encontrados antígenos virais no interior de

macrófagos localizados nos pulmões, sinusóides hepáticos e medula óssea (ZAKI et

al,1995). Além das células endoteliais e macrófagos, as células dendríticas foliculares

(FDCs) e as células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos, do sangue periférico, e de

célula progenitora CD34+ também suportam a replicação de hantavírus in vivo e in vitro

(ZAKI et al, 1995; RAFTERY et al, 2002).

Os principais achados histopatógicos da SPCVH são a pneumonite intersticial e

infiltrado mononuclear (ZAKI et al, 1995; NOLTE et al, 1995) Em conseqüência da

pneumonite intersticial ocorreria extravasamento de líquidos e edema pulmonar levando à

insuficiência respiratória (ZAKI et al, 1995; ENNIS et al, 1997; MORI, et al, 1999). Os

estudos realizados por MORI et al (1999), através de técnicas de imunohistoquímica,

demonstraram a presença de células produtoras de citocinas - tanto monócitos/macrófagos

quanto linfócitos T ativados - nos tecidos dos pulmões, rins, fígado, e baço de pacientes que

foram a óbito por SPCVH associada a infecção por SNV. A maior concentração destas

células foi encontrada nos pulmões, onde detectaram-se as citocinas: IL-1, IL-1, IL-6, e

TNF-,IFN-, IL-2, IL-4, e TNF- no interior das paredes alveolares e nos espaços aéreos

alveolares.

Embora edema intra-alveolar de líquido seroso semelhante ao plasma sanguíneo

seja o principal elemento caracterizador da SPCVH, a mortalidade está frequentemente

relacionada a complicações cardiovasculares, ainda pouco estudas. Mais clareza sobre este

tema foi obtida com os resultados de um estudo realizado em Ribeirão Preto, o qual

procurou caracterizar alterações cardíacas em necrópsias de pacientes com SPCVH,

utilizando técnicas de imuno e histoquímica e de microscopia eletrônica (SAGGIORO,

2004). Neste estudo, encontrou-se, ao exame necroscópico de 7 corações, discreta dilatação

dos ventrículos com flacidez da parede miocárdica. A análise morfométrica dos corações

dos indivíduos com SPCVH evidenciou, nos cortes histológicos, expansão da área média

do interstício e redução da área do compartimento muscular, sugerindo que durante a fase

aguda da SPCVH ocorre expansão do espaço intersticial e consequente distanciamento de

fibras miocárdicas devido ao extravasamento capilar de líquido de edema para o interstício

(SAGGIORO, 2004).

Um número predominante de macrófagos produtores de TNF- foi detectado no

interstício do miocárdio de casos fatais da SPCVH, além de importante afluxo de células

linfomononucleares CD45 RO+ (SAGGIORO, 2004) - um fenótipo de linfócitos T CD8+ e

CD4+ ativados (van LIER et al., 2003). Além disso, o número de linfócitos T CD8+ nos

miocárdios da SPCVH apresentou correlação diretamente proporcional em relação ao

número de células Natural Killers (NK) (SAGGIORO, 2004). Tais achados indicam a

ocorrência de miocardite na SPCVH (SAGGIORO, 2004). O quadro de choque que ocorre

na SPCVH apresenta um padrão misto de choque hipovolêmico e choque cardiogênico com

alta resistência vascular periférica e baixo débito cardíaco (ao contrário do choque séptico

clássico) (JENISON et al, 1995; PETERS e KHAN, 2002).

1.2.3. Elementos envolvidos na patogênese da SPCVH

1.2.3.1. Viremia

Hantavírus tem sido observado no sangue de pacientes com a SPCVH durante a fase

aguda da doença (TERAJIMA et al, 1999; MORELI et al, 2004). TERAJIMA et al (1999)

estudou a carga de hantavírus no soro de pacientes com a SPCVH e encontrou que os

números de cópias de RNA viral eram maiores nos casos fatais do que nos sobreviventes

(10

6.7 1.4

versus 10

5.8  1.3

RNA cópias/ml), e as mais altas cargas virais foram

correlacionadas com valores mais altos de hematócrito e contagens mais baixas de

plaquetas. Deste modo, a carga viral parece estar associada com a gravidade da doença nos

pacientes com a SPCVH (TERAJIMA et al, 1999).

1.2.3.2. Receptores celulares e Interações Célula-Hantavirus

Os trabalhos de GAVRILOVSKAYA, et al (1998 e 1999) demonstraram que a

entrada do hantavírus na célula é mediada por receptores 

integrinas presentes na

superfície de células endoteliais, plaquetas, megacariócitos, macrófagos, células dendríticas

e células musculares lisas (PARASKEVAS, 1999; CLEMETSON et al, 1985; RAFTERY

et al, 2002; CHARO et al, 1994). As integrinas são proteínas heterodiméricas formadas por

polipeptídeos alfa e beta acoplados por ligações não covalentes - classificadas em famílias

de acordo com a cadeia beta que expressam -, que se encontram em diversos estados de

ativação, dependendo dos sinais estimuladores do ambiente (GORCYNSKI e STANLEY,

2001). Estas proteínas compõem as tight-junctions que unem as células endoteliais, fecham

a barreira alvéolo-capilar e são centrais para a regulação da função plaquetária e

permeabilidade vascular (MACKOW e GAVRILOVSKAYA, 2001). Os hantavírus

patogênicos utilizam as integrinas 

IIb



(CD41, CD61) e 



(CD51, CD61) como

receptores para infectar as células, enquanto os hantavírus não patogênicos parecem utilizar





(GAVRILOVSKAYA, et al, 1998; GAVRILOVSKAYA, et al, 1999; MACKOW e

GAVRILOVSKAYA, 2001). A integrina 



foi originalmente descrita como receptor

celular para a vitronectina (proteína da matriz extra-celular) (CHARO et al, 1990). A

ligação desse receptor com seus ligantes naturais (vitronectina, Fator von Willebrand,

fibrinogênio, e trombospondina) ocorre via reconhecimento das seqüências do tripeptídeo

RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) presentes nestes ligantes (PARASKEVAS, 1999).

Entretanto, os hantavírus causadores da SPCVH associam-se com 

IIb



e 



integrinas

através de interações independentes de RGD, o que é consistente com a ausência de

seqüência RGD nas glicoproteínas de superfície G1 e G2 de todos os hantavírus

(GAVRILOVSKAYA et al, 1998).

A SPCVH é associada a mudanças na permeabilidade vascular e a trombocitopenia

aguda, sugerindo o envolvimento de mudanças funcionais induzidas por hantavírus no

endotélio e nas plaquetas (NICHOL, 2001; ZAKI et al, 1995; NOLTE et al, 1995). Estas

mudanças podem estar relacionads ao uso das 

integrinas como receptor por hantavírus. A

migração de células endoteliais dirigida pela interação das 



integrinas com a

vitronectina na matriz extracelular é uma função essencial para o reparo dos vasos e a

manutenção da integridade vascular (PALECEK et al, 1999). GAVRILOVSKAYA et al

(2002) mostrou que a habilidade das células endoteliais em migrar sobre a vitronectina é

seletivamente inibida pela infecção com hantavírus patogênicos, mas não com hantavírus

não-patogênicos, indicando que hantavírus patogênicos inibem a função da 



integrina.

Assim, as interações hantavírus-integrina podem alterar as funções de barreira endotelial e

contribuir para a formação do edema na SPCVH (GAVRILOVSKAYA et al, 2002).

1.2.3.3. Anticorpos neutralizantes

A maioria, senão, todos os pacientes na fase prodrômica da SPCVH têm anticorpos

das classes IgM e IgG detectáveis contra os antígenos N e G1 dos vírus SNV, ANDV e

ARAV (JENISON et al, 1994; BHARADWAJ et al, 2000; TISCHLER et al, 2005;

MORELI, 2005a; MORELI et al, 2005b). Uma forte resposta de anticorpos neutralizantes é

provavelmente essencial para suprimir a disseminação de hantavírus e, consequentemente,

evitar a doença fatal (BHARADWAJ et al, 2000; BORGES et al, 2006). Estudos têm

mostrado que casos de SPCVH com altos títulos de anticorpos neutralizantes contra SNV e

ANDV na fase aguda da infecção apresentam um melhor prognóstico (BHARADWAJ et

al, 2000; TISCHLER et al, 2005). Uma intensa resposta de anticorpos neutralizantes contra

hantavírus pode predizer a eficácia no clearance viral e recuperação da infecção,

independentemente dos epítopos alvos (TISCHLER et al, 2005). Além de fornecer proteção

durante a infecção aguda, anticorpos neutralizantes podem também proteger contra a re-

infecção por hantavírus. Uma evidência de que a infecção induz uma resposta humoral

estável foi a presença de anticorpos neutralizantes com títulos entre 1:100 a 1:3.200 no

soro de indivíduos convalescentes da SPCVH em até 1.400 dias após a admissão hospitalar

(YE, et al, 2004).

1.2.3.4. Quimiocinas, citocinas e resposta imune celular

A infecção do endotélio pulmonar e cardíaco por hantavírus provavelmente resulta

na liberação de quimiocinas que atraem mononucleares, haja vista a pneumonite e

miocardite observadas na SPCVH (ZAKI et al, 1995; SAGGIORO, 2004). Níveis

detectáveis de quimiocinas RANTES e IP-10 foram observados nas células endoteliais

microvasculares pulmonares humanas (HMVEC-Ls) dentro de 72 horas após infecção com

SNV in vitro (SUNDSTROM et al, 2001). Tanto RANTES quanto IP-10 são

predominantemente quimiotáticas para monócitos/macrófagos e linfócitos, sendo que IP-10

pode promover a migração de sub-populações de linfócitos T ativados (CD4+, CD8+,

CD29+) e RANTES em altas concentrações é hábil em induzir ativação de células T de

modo similar aos mitógenos (APPAY et al, 2000).

A produção das citocinas localmente nos pulmões e coração, e também no sangue

periférico, por linfócitos T e monócitos ativados é provavelmente importante na patogênese

da SPCVH (MORI et al, 1999). Sabe-se que o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-)

desempenha um importante papel como causador do extravasamento capilar (TRACEY e

CERAMI, 1993; KELLEY, 1990), e a IL-2 também tem sido demonstrada como promotora

do aumento da permeabilidade vascular in vivo (THIJS et al, 1990). O interferon gama

(IFN-) produzido por linfócitos T ativados é conhecido por potencializar a produção de

TNF- e exacerbar o choque in vivo (NEDWIN et al, 1985). O excesso de TNF- e IFN- é

provavelmente crítico na patogênese da SPCVH (KILPATRICK et al, 2004).

1.3. Susceptibilidade genética e infecção por hantavírus

Uma pergunta que tem se mantido entre os estudiosos da SPCVH é a seguinte:

porque alguns indivíduos desenvolvem SPCVH fulminante e outros apresentam doença

menos grave? Um questionamento adicional pode ser feito no que diz respeito às infecções

por hantavirus na América do Sul - onde anticorpos contra hantavírus têm sido encontrados

na população geral, inclusive na cidade de Jardinópolis, na região de Ribeirão Preto-SP

(14,3%) em pessoas sem nenhuma história de SPCVH, (CAMPOS, et al 2003) - porque,

sendo a soroprevalência elevada, os casos clínicos confirmados de SPCVH são tão raros? A

resposta poderia estar, no nível de ativação da resposta imune individual. Neste sentido, os

alelos HLA (Antígenos Leucocitários Humanos) de indivíduos infectados são

provavelmente capazes de afetar a magnitude de ativação dos linfócitos T, com alguns

haplótipos representando respostas mais intensas do que outros (ENNIS et al, 1997).

Do mesmo modo, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes de

citocinas têm sido descritos que afetam o nível de secreção da citocina, e

consequentemente, seus efeitos biológicos (KNIGHT, 2001; KEEN, 2002). Os SNPs mais

frequentemente encontrados nos genes de citocinas e de seus receptores localizam-se na

região promotora, os quais podem afetar o sítio de ligação de fatores de trancrição, ou nas

regiões 3’ não codificadoras, podendo influenciar a estabilidade dos transcritos de RNA

(OLLIER, 2004). Desta forma, SNPs nos genes responsáveis pela produção das citocinas

poderia influenciar seus níveis de expressão e a resposta imune dele decorrente (BIDWELL

et al, 1999). A presença e a relevância dos SNPs nos genes de citocinas não foram

anteriormente investigadas em indivíduos com a SPCVH. A susceptibilidade genética

humana para desenvolver a SPCVH após a infecção poderia também envolver formas

polimórficas do receptor celular para hantavírus, descritas a seguir.

1.3.1. Polimorfismo dos Alo-antígenos Plaquetários Humanos (HPA)

O receptor celular para hantavírus patogênicos presente na superfície das plaquetas,



IIb



integrina (também chamada glicoproteína IIb/IIIa) (GAVRILOVSKAYA et al,

1998), contém epítopos que determinam os Aloantígenos Plaquetários Humanos (HPA)

(PHILLIPS et al, 1988; NEWMAN, 1994). Tratam-se de sistemas bialélicos determinados

pela troca de nucleotídeos no gene codificador da glicoproteína 

levando a troca de

aminoácidos na estrutura da cadeia 

do heterodímero 

IIb



(Tabela 1) (SHULMAN e

REID, 1994). Inúmeros sistemas HPA têm sido descritos, usualmente seguido da detecção

de anticorpos em pacientes com púrpura pós-transfusional (PTP) ou em mães de recém-

natos com trombocitopenia aloimune neonatal (McFARLAND, 1996; SCHROEDER,

1999).

O mais importante sistema de antígenos plaquetários é o HPA-1, (também

conhecido com PL

ou Zw). Outros sistemas bialélicos incluem HPA-4 (Pen, Yuk) e HPA-

6 (Ca/Tu) (SCHROEDER, 1999). Entretanto, a nomenclatura existente não é

completamente adequada à descrição deste sistema de antígenos, visto que as formas

alélicas HPA-1a, -4a e -6a são diferentes designações para uma estrutura idêntica a nível

molecular (referem-se ao mesmo epítopo); na realidade, os alelos variantes da GPIIIa são

os sistemas HPA-1b, -4b, -6b e (Tabela 1), cada um deles determinado por uma única

substituição de aminoácido (NEWMAN, 1994).

Uma vez que hantavírus utilizam 

integrina para entrar nas células alvo,

polimorfismos nesta glicoproteína poderiam afetar a entrada viral e estariam relacionados à

susceptibilidade à SPCVH.

Tabela 1: Formas polimórficas conhecidas da GPIIIa (

integrina) de acordo com suas

denominações sorológicas e designações da nomenclatura HPA.

Forma alélica Freqüência do gene Designação sorológica

GPIIIaLeu

Arg

143

Arg

489

0,85

(HPA-1a)

GPIIIaLeu

Arg

143

Arg

489

0,85 Pen

(HPA-4a)

GPIIIaLeu

Arg

143

Arg

489

0,85 Ca

/Tu

(HPA-6a)

GPIIIaPro

Arg

143

Arg

489

0,15 PL

(HPA-1b)

GPIIIaLeu

Gln

143

Arg

489

<0,01 Pen

(HPA-4b)

GPIIIaLeu

Arg

143

Gln

489

<0,01 Ca

/Tu

(HPA-6b)

As formas de GPIIa correntemente designadas de PL

, Pen

e Ca

/Tu

representam todas a mesma entidade molecular,

possuindo um freqüência genética de 0,85 em um pool de genes da população caucasiana (adaptado de NEWMAN, 1994).

1.4. Justificativa

A hantavirose é uma zoonose Pan-Americana emergente e altamente letal nos

quadros de SPCVH, tendo causado 4 dezenas de casos em nosso meio. A patogênese da

SPCVH não é totalmente conhecida e embora achados imunológicos e patológicos tenham

sido descritos na infecção por hantavírus norte-americanos, inexistem estudos sobre este

tema no Brasil. Além disso, supondo que as conseqüências da infecção por hantavírus e a

magnitude da resposta imune por ela induzida possam depender da constituição genética de

cada indivíduo, faz-se necessário testar esta hipótese. Por isso, acreditamos que um estudo

avaliando uma associação de genes ligados diretamente à resposta imune com a SPCVH,

contribuiria de forma importante para o conhecimento sobre esta grave doença. Finalmente,

um estudo dos mecanismos fisiopatológicos e genéticos da SPCVH poderia fornecer

subsídios ao tratamento, permitindo determinar, inclusive, fatores prognósticos e de risco

para a doença.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral:

Investigar aspectos da patogênese da SPCVH, com base na análise de citocinas e a

sua associação com polimorfismos genéticos.

2.2. Objetivos específicos:

1. Pesquisar e quantificar mediadores inflamatórios: citocinas, óxido nítrico e proteína

C reativa em amostras séricas de pacientes com SPCVH.

2. Verificar associação entre teores séricos de citocinas e aspectos clínicos da infecção

por hantavírus.

3. Determinar o polimorfismo dos Antígenos Leucocitários Humanos (HLA),

Antígenos Plaquetários Humanos (HPA) e genes de citocinas como TNF-, INF-,

IL-6, IL-10 e TGF-, em amostras clínicas de pacientes com hantavirose.

4. Verificar a eventual associação entre alelos polimórficos HLA, HPA, genes de

citocinas e a SPCVH.

3. MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi realizado no Centro de Pesquisa em Virologia da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) e também no

Laboratório de Imunologia Molecular, do Hospital das Clínicas da FMRP-USP (HCFMRP-

USP) e Laboratório de HLA do Hemocentro de Ribeirão Preto.

O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HCFMRP-USP, no

Processo n 2618/03, conforme parecer emitido em 03/06/03. O trabalho, também, foi

aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), registro 7830, processo

25000.057239/2003-33, parecer 1344/2003, Registro 7830, em 26/08/2003.

3.1. População de estudo

Os participantes deste estudo foram alocados em 3 grupos, conforme descrito

abaixo. Entre parênteses e sublinhada consta a denominação destes grupos que será citada

no texto, tabelas e figuras.

Grupo de pacientes com SPCVH (grupo SPCVH

): Os pacientes apresentando quadro

clínico suspeito de SPCVH foram incluídos no estudo após terem o genoma de hantavírus

detectado no sangue ou anticorpos contra o vírus detectado no soro. Vinte e sete indivíduos

com diagnóstico clínico e laboratorial confirmado de SPCVH foram incluídos neste grupo.

Dados da maioria destes pacientes foram coletados de seus prontuários médicos.

Grupo de indivíduos soropositivos para hantavírus mas que não tiveram SPCVH

(grupo soropositivos

): este grupo incluiu indivíduos que apresentaram sorologia positiva

para hantavírus - em estudo soroepidemiológico realizado em nosso laboratório no ano de

2001 - sem antecedente da SPCVH (CAMPOS et al, 2003). Em 2004, estes soropositivos,

em número de 117, foram visitados na residência, em área urbana ou rural do munícipio de

Jardinópolis (na Região de Ribeirão Preto-SP) e 96 deles concordaram em participar do

estudo, doando 15mL de sangue (Figura 3).

Populações-controle (grupo controle): Dependendo da análise realizada, utilizaram-se

distintas populações-controle, conforme segue:

Nas análises das quantificações de mediadores inflamatórios plasmáticos,

utilizaram-se no grupo controle as amostras de soro dos indivíduos do grupo soropositivos

e também, de 17 indivíduos voluntários, saudáveis, que quiseram participar do estudo, por

ocasião das visitas às residências dos soropositivos para hantavírus em Jardinópolis.

Para as análises de polimorfismo dos HLAs -A, -B e -DR foram utilizados como

grupo controle 1252 doadores de medula óssea

em Ribeirão Preto, que tiveram os HLAs

tipificados em um estudo anterior (SANSALONI, 2005). Para a análise do polimorfismo do

HLA-Cw, foram incluídos no grupo controle apenas 119 doadores de medula óssea, cujos

dados das tipificações HLA-Cw estavam armazenados no Laboratório de HLA do

Hemocentro de Ribeirão Preto.

Para as análises de polimorfismo dos antígenos plaquetários HPA, foram incluídos

como grupo controle 50 doadores de sangue

no Hemocentro de Ribeirão Preto, dos quais

coletou-se sangue entre os meses de outubro e novembro de 2003, após anuência em

participar do estudo.

Para as análises de polimorfismos nos genes das citocinas TNF-, IL-6, IL-10 e

IFN-, foram utilizados como grupo controle 13 doadores de sangue

(dos 50 acima citados)

e mais 87 outros doadores de sangue,

que tinham participado de dois estudos anteriores em

Ribeirão Preto (FERNANDES, 2003; FREITAS, 2003), totalizando 100 indivíduos no

grupo controle. Excepcionalmente, para a análise do polimorfismo do gene do TGF-,

como grupo controle foram incluídos apenas 33 doadores de sangue.

3.2. Coleta das amostras

Dos 27 participantes no grupo SPCVH, 22 se encontravam apresentando a doença

quando tiveram amostras de sangue colhidas. A internação de 9 destes pacientes ocorreu

nas Unidades de Terapia Intensiva da Unidade de Emergência ou Enfermarias de Doenças

Infecciosas e Tropicais do HCFMRP-USP ou nos seguintes hospitais: Beneficiência

Portuguesa de Ribeirão Preto, Hospital São Francisco de Ribeirão Preto, Santa Casa de

Ribeirão Preto e Santa Casa de Sertãozinho. Sete outros participantes do grupo SPCVH,

tiveram suas amostras de sangue (fase aguda) encaminhadas ao Centro de Pesquisa em

Virologia para fins diagnósticos, por Dra. Sheila de Almeida Santos (Hospital de Doenças

Tropicais de Goiânia-GO), Prof. Dr. Mario Leon Silva-Vergara (Faculdade de Medicina do

Triângulo Mineiro, Uberaba-MG), Dr. Renato Cassiano Silveira (Santa Casa de Passos-

MG), e Dr. Valter Ramos (Hospital Dom Bosco, Araxá-MG). Outros 6 indivíduos

estudados neste grupo tinham ido a óbito por SPCVH e tiveram suas amostras coletadas em

necropsia realizada por patologistas do Centro de Medicina Legal da FMRP-USP.

Finalmente, 5 indivíduos do grupo SPCVH tiveram amostras coletadas quando já estavam

curados (por ocasião do retorno, no seguimento dos pacientes sobreviventes da SPCVH). O

sangue destes últimos indivíduos foi utilizado apenas para as análises genéticas (Tabela 2).

Tabela 2: Origem das amostras clínicas do grupo SPCVH.

Participantes no grupo SPCVH número

Indivíduos com coleta de sangue durante a SPCVH 22

Indivíduos cuja coleta foi realizada pelo CPV* 9

Indivíduos cujas amostras foram enviadas ao CPV* 7

Indivíduos com amostras coletadas durante autópsia 6

Indivíduos com mais de uma amostra colhida na fase aguda 1

Indivíduos com amostras coletadas após a cura 5

Total de indivíduos estudados 27

*Centro de Pesquisa em Virologia

Dos 27 pacientes estudados, 18 tiveram o diagnóstico de SPCVH realizado por RT-

PCR em nosso laboratório e 9 tiveram diagnóstico de SPCVH realizado por ELISA ou

imunohistoquímica, no Instituto Adolpho Lutz de São Paulo (Tabela 3). De apenas um dos

indivíduos do grupo SPCVH foi possível coletar duas amostras sanguíneas, em diferentes

dias da fase aguda da doença, sendo uma no 5° dia e outra no 10° dia do início dos

sintomas. Dados relativos aos 27 participantes do grupo SPCVH estudados neste trabalho

encontram-se na Tabela 3.

Tabela 3: Características epidemiológicas, evolutivas e do local de diagnóstico dos

pacientes participantes do grupo SPCVH e o tipo de amostra coletada.

n°

Paciente

Idade Sexo Raça

Atividade Data de

início dos

sintomas

Coleta da

amostra

após início

dos

sintomas

Tipo de

Amostra

Evolu-

ção

Local

diagnós

-tico*

Procedência

1 GSP

‡

21 M

Mulato Lavrador

19/06/99 5 dias soro cura IAL Cássia dos

Coqueiros (SP)

2 JPM

39 M

Branco Eng.

agrônomo

23/04/01 # sangue cura CPV Batatais (SP)

3 ZCM

‡

45 F

Ignorado Do lar

07/06/01 8 dias ** soro óbito CPV Ribeirão Preto (SP)

4 AJB

38 M

Branco Cerealista

09/01/02 # sangue cura CPV Ribeirão Preto (SP)

5 AJS

‡

16 M

Mulato Agricultor

10/06/01 3 dias soro cura IAL Cássia dos

Coqueiros (SP)

6 DAZ

24 F

Branca Estudante

21/03/03 # sangue cura CPV Ribeirão Preto (SP)

7 JMP 27 M

Mulato Cerealista

20/05/03 12 dias sangue e soro cura CPV Dumont (SP)

8 ONS 35 M

Ignorado -

12/06/03

>7 dias sangue e soro cura IAL Goiânia (GO)

9 NRC 16 M

Mulato Estudante

07/06/03 5 dias sangue e soro cura CPV Ribeirão Preto (SP)

10 JVN 37 M

Branco Lavrador

03/06/03 28 dias sangue e soro cura CPV Cássias dos

Coqueiros (SP)

11 GQS

17 M

Branco Estudante

18/06/03 # sangue cura IAL Ribeirão Preto (SP)

12 AOC - M

Ignorado -

05/08/03

<7 dias soro cura IAL Uberaba (MG)

13 JEF - M

Ignorado -

05/08/03

<7 dias soro cura CPV Uberaba (MG)

14 ACC 42 M

Branco Mecânico

18/09/03 15 dias sangue e soro cura CPV Ribeirão Preto (SP)

15 NVTS 43 F

Mulata Vendedora

19/03/04 5 dias sangue e soro cura CPV Sertãozinho (SP)

16 JRGC 30 M

Mulato Lavrador

10/05/04 1 dia** sangue e soro óbito IAL Jaboticabal (SP)

17 TRO 14 M

Branco Estudante

25/06/04 2 dias*** sangue óbito CPV Ribeirão Bonito

(SP)

18 ASP 40 M

Branco Pedreiro

22/07/04 <7 dias sangue e soro cura CPV São João Batista do

Glória (MG)

19 PCA - M

Ignorado Pedreiro

06/08/04 <7 dias soro cura CPV São João Batista do

Glória (MG)

20 AGN 49 M

Branco Sitiante

07/08/04 6 dias sangue e soro cura CPV Batatais (SP)

21 AVVF 55 F

Branca Cozinheira

15/08/04 8 dias**

sangue e soro óbito CPV Cravinhos (SP)

22 AM 25 M

Ignorado -

03/09/04 >7 dias sangue e soro cura IAL São João Batista do

Glória (MG)

23 CEC 42 M

Negro Calheiro

20/09/04

>7 dias** sangue e soro óbito IAL Ribeirão Preto (SP)

24 JBA 31 M

Negro Lavrador

24/03/05 6 dias sangue e soro cura CPV Guariba (SP)

25 MBFN 31 M

Branco Lavrador

02/04/05 2 dias sangue e soro óbito CPV Pontal (SP)

26 MACG 21 F

Mulata Comerciária

20/08/05 5 dias

e 10 dias

sangue e soro cura CPV Araxá (MG)

27 JFSB

30 F

Branca Industriária

05/04/05 # sangue cura IAL Ribeirão Preto (SP)

* Centro de Pesquisa em Virologia (CPV); Instituto Adolpho Lutz (IAL);

‡

amostra estocada no banco de amostras do

CPV;

amostra coletada apenas para análises genéticas, por ocasião do retorno, no seguimento dos pacientes sobreviventes

da SPCVH. Pacientes nesta situação já estavam curados; ** amostra coletada post-morten, no mesmo dia do óbito;

data

da chegada da amostra ao CPV; *** amostra coletada post-morten, um dia após o óbito

Com relação à coleta das amostras de sangue no grupo SPCVH, sempre que

possível, 2 tipos foram colhidas por venopunção, 15 ml (em 3 tubos de 5mL) com

anticoagulante EDTA, e 10 ml (em 2 tubos de 5mL) sem anticoagulante, para obtenção de

soro. Volume de 300L dos sangues em EDTA tiveram RNA extraído imediatamente após

a coleta, para detecção genômica de hantavírus por RT-PCR. Ainda, do sangue colhido em

EDTA, 10 mL foram processados para extração do DNA genômico, idealmente no mesmo

dia da coleta, ou, em alguns casos, o sangue foi mantido em geladeira, a 4C, até o

procedimento. As amostras de sangue colhidas sem anticoagulante foram deixadas a

coagular, por até 30min, à temperatura ambiente (T.A.) e posteriormente, foram

centrifugadas a 4C, 3.000 rpm, por 5 min, para separar o soro. Alíquotas de soro foram

mantidas a -70C até o momento da análise quantificadora de citocinas.

Com relação ao grupo soropositivos

e aos voluntários, as amostras de sangue foram

colhidas nas residências destes indivíduos, em Jardinópolis (Figura 3). Coletaram-se de

cada participante deste grupo, 10 ml com EDTA e 5 ml sem anticoagulante. Estas amostras

foram transportadas em gelo até o laboratório onde os sangues com EDTA foram estocados

a 4C para extração de DNA genômico no dia seguinte. Os sangues colhidos sem

anticoagulante tiveram o soro separado por centrifugação a 4C, 3.000 rpm, por 5 min,

sendo aliquotados e estocados a -70C, até o momento da análise.

Com relação aos 50 doadores de sangue do grupo controle, que foram usados nas

análises de HPA, as amostras de 5 mL de sangue com EDTA foram coletadas no

Hemocentro de Ribeirão Preto por ocasião da doação de sangue, e foram processadas para a

extração do DNA genômico.

Figura 3: Coleta residencial de amostras sanguíneas e obtenção de dados epidemiológicos

dos indivíduos do grupo soropositivos para hantavírus, em Jardinópolis, 2004.

3.3. Diagnóstico molecular da SPCVH

Extração do RNA viral: as amostras de sangue total dos pacientes com suspeita de

SPCVH tiveram RNA extraído pelo método do Tryzol (Invitrogen, USA), seguindo o

protocolo descrito por BOWEN et al, 1997. A cada 300 l de amostra foram adicionados

1000 l de Tryzol. Em seguida, as amostras foram vigorosamente homogeneizadas e

adicionaram-se 200 l de uma solução de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de

24:1. Posteriormente, as amostras foram incubadas por 15 min em gelo e em seguida,

centrifugadas por 20 min a 14000 rpm, a 4°C. A fase aquosa (superior) foi transferida para

outro tubo onde adicionou-se igual volume de Isopropanol gelado. A seguir, a solução foi

homogeneizada levemente e permaneceu overnight a -70°C para a precipitação do RNA.

No dia seguinte, o material foi precipitado sob centrifugação a 15000 rpm, a 4°C, por 20

min, sendo o sobrenadante desprezado. O precipitado foi lavado com 200 l de etanol a

70% e seco a vácuo por 10 min. O RNA foi então dissolvido em 10 a 15 l de água tratada

com diethylpyrocarbonato (DEPC) (USB, EUA).

RT-PCR para amplificação de fragmentos genômicos de hantavírus: Para a transcrição

reversa (RT), foram preparadas misturas de reação em triplicata (uma para cada primer

complementar), no volume de 20 l, contendo 0,4l de dNTPs a 10 mM, 4 l do tampão 5x

(10mM Tris pH 8.9, 3mM MgCl

, 75mM KCl) e 1l (15M) dos primers complementares

S, G1 e G2 (Tabela 4). Adicionaram-se 5 l do extrato de RNA em teste e as misturas

foram aquecidas a 95 C por 30 seg, para linearização do RNA. A seguir, as misturas foram

colocadas em gelo por 2 min e então, adicionaram-se 40U do inibidor de RNAse

RNAaseOut (Invitrogen, EUA) e 20U da Transcriptase reversa MMLV - FPLC pure

(USB, EUA) por tubo. A seguir, incubaram-se as misturas por 2 h, a 37 C, para gerar os

cDNAs.

Realizaram-se 3 tipos de PCR e para tanto, prepararam-se misturas de reação com

volume final de 50l contendo: 1l dos dNTPs a 10 mM, 5l do tampão 10x [75 mM Tris

pH 9.0, 2mM MgCl2, 50mM KCl, 20mM (NH

)

)], 1l de cada primer S-comp e S-

sense ou G1-comp e G1-sense ou G2-comp e G2-sense (Tabela 4), a 15M, em seus

respectivos tubos e 1,25 U de Taq Polimerase (Biotools, Brasil). Três e meio microlitros do

produto da RT foram adicionados a cada mistura, e estas foram submetidas a uma

desnaturação inicial a 95°C por 2 min em termociclador (MiniCycler, MJ Research, EUA),

seguida de 35 ciclos a 95°C por 30 seg, 54°C por 1min e 72°C por 2min, com extensão final

de 5 min, a 72C.

Para visualizar os produtos amplificados (amplicons), 5 l dos mesmos foram

processados por eletroforese em gel de agarose a 1,8% corado com brometo de etídio

0,5g/ml. A eletroforese foi realizada a 140V, por 40 min, em tampão TBE (Tris 0,1 M, ác.

Bórico 0,1 M, EDTA 0,02M pH 8,3). Posteriormente, os géis foram visualizados à luz

ultravioleta e fotografados em sistema Kodak Digital Science™ (EUA). O tamanho dos

amplicons foi determinado por comparação com um marcador tipo escada de 100 pares de

bases (pb) (Invitrogen).

Como controle positivo nas reações de RT-PCR utilizou-se RNA extraído de cultura

de células infectadas com o hantavírus Rio Mamoré, vírus considerado de baixa

patogenicidade (item 3.3.1). Como controles negativos, foram utilizadas amostras dos soros

de pacientes com dengue e citomegalovirose, cedidos pelo laboratório de Virologia do

HCFMRP-USP. Os controles foram processados da mesma maneira que as amostras.

Considerava-se RT-PCR positiva para hantavírus quando, das 3 RT-PCRs realizadas,

obtinham-se, pelo menos, 2 amplicons de tamanho esperado.

Tabela 4: Sequência nucleotídica dos primers utilizados para amplificação do genoma do

hantavírus ARAV pela reação de RT-PCR e tamanho dos respectivos amplicons (MORELI,

2005a).

Primer Seqüência Tamanho do produto em

pares de bases

S comp 5’ CAA AAC CAG TTG ATC CAA CAG GG 3’

S sense 5’ GAT GAA TCA TCC TTG AAC CTT AT 3’

264

G1 comp 5’ GGG CAG TAA GTG CTG AAA C 3’

G1 sense 5’ ACA TTT AGC AGT TTG CCA TGG G 3’

324

G2 comp 5’ CCA GTT TGT GAA TAT CAG 3’

G2 sense 5’ GAG CCA TAA CAC ATT GCA 3’

350

3.3.1 Produção de fluído infeccioso do hantavírus Rio Mamoré

O hantavírus Rio Mamoré, foi utilizado como controle positivo nas reações de RT-

PCR. A estirpe Rio Mamoré (TVP 7557), gentilmente cedida pelo Dr. Robert Shope

(Universidade do Texas, EUA) foi propagada em monocamadas de células Vero do clone E6

(ATCC: CRL 1586; Rockville, MD), cultivadas em meio essencial mínimo (MEM) de

Eagle, suplementado com 2% (v/v) de soro fetal bovino inativado, 2mM de L-glutamina,

60mg/ml de penicilina, 100mg/ml de estreptomicina e 100U/ml de nistatina. Após infecção,

as culturas foram mantidas em estufa de CO

por 10 a 12 dias. A seguir, alíquotas com

300L destas culturas foram estocadas a –70°C até quando foram processadas para a

extração do RNA utilizando procedimento idêntico ao das amostras de sangue.

3. 4. Quantificação de mediadores inflamatórios e anti-inflamatórios plasmáticos

3.4.1 Ensaios imunoenzimáticos (ELISAs) para dosagens de Interferon-alfa (IFN-),

Interferon-gama (IFN-), Fator de Necrose Tumoral- (TNF-), Interleucina-12 (IL-

12); Interleucina-4 (IL-4); Interleucina-5 (IL-5); Interleucina-10 (IL-10) e Fator Beta

de Crescimento e Transformação (TGF-)

Níveis séricos de IFN-, IFN-, TNF-, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10 e TGF- foram

determinados em amostras dos participantes do grupo SPCVH, e dos soropositivos e/ou

voluntários como grupo Controle (Tabela 5). Para tanto, utilizou-se os kits Interferon Alpha

[(h)IFN



] Human, Biotrak

ELISA System; Interferon Gamma [(h)IFN



] Human, Biotrak

ELISA System; TNF-



Human, Biotrak Easy ELISA; Interleukin-12 [(h)IL-12] (p40 and

p70), Human, Biotrak

ELISA System; High Sensitivity Interleukin-4 [(h)IL-4], Human,

Biotrak

ELISA System; Interleukin-5 (IL-5) Human, Biotrak

ELISA System; Interleukin-

10 [(h)IL-10], Human, Biotrak

ELISA System e Transforming Growth Factor – Beta 1

(TGF



Human, Biotrak ELISA System (todos Amersham Biosciences,UK). Estes kits

permitem realizar ELISAs tipo sanduíche, que utilizam um anticorpo anti-citocina

sensibilizando microplacas. Apos adição do material clínico em teste obtinha-se o resultado

por inclusão de um anticorpo biotinilado ou conjugado com fluorocromo (FITC) para a

citocina e estreptavidina conjugada a peroxidase (Tabela 5).

Os ensaios foram realizados seguindo especificações do fabricante. Inicialmente,

foram reconstituídas as soluções padrão, para cada citocina, em água deionizada. Foram

preparadas diluições seriadas a partir das soluções padrão, visando a obter uma curva padrão

conforme mostra a Tabela 5. A seguir, as 96 cavidades das microplacas previamente

revestidas com anticorpo contra as citocinas IFN-, IFN- e IL-12, de cada kit foram

preenchidas com anticorpos: 50L/cavidade de anti-IFN- biotinilado, 50L/cavidade de

anti-IFN- biotinilado, e 100L/cavidade de anti-IL-12 ligado a FITC, respectivamente,

seguidos da adição imediata de 50L das diluições padrões ou das amostras de soro, em

duplicata, em suas respectivas cavidades.

Para as citocinas TNF-, IL-4, IL-5 e IL-10 as 96 cavidades das microplacas

previamente revestidas com anticorpo contra tais citocinas, de cada kit, foram preenchidas

com as diluições padrões ou as amostras de soro, em duplicata, em suas respectivas

cavidades, conforme os volumes indicados na Tabela 5.

Para a citocina TGF- as amostras foram pré-tratadas para ativar e liberar o TGF-

que é fisiologicamente secretado das células na forma de complexos latentes. Para que o

TGF- possa ligar-se a seus receptores é necessário liberá-lo desse complexo latente e ativá-

lo in vitro por tratamento ácido, seguido da neutralização com solução básica. Para tanto,

200 L de ácido acético 2,5 M foi adicionado a 200 L de cada soro a ser testado e

homogeneizado vigorosamente, seguido da incubação por 10 min a T.A. A seguir, as

amostras foram neutralizadas com 200 L de solução NaOH 2,7 M/ 1M HEPES (Sigma,

Alemanha). Desta mistura, adicionaram-se 100 L nos poços correspondentes da placa

previamente revestidos com anti-TGF-. Foram também preenchidos com as diluições-

padrão os poços destinados à curva de calibração.

Após adição das diluições-padrão e das amostras, em cada placa, estas foram

cobertas com fita adesiva e incubadas a temperaturas e tempos citados na Tabela 5.

As placas de citocinas: IFN-, IFN-, IL-12 e IL-10 foram lavadas 3 vezes com

soluções tampão wash buffer, fornecidas pelos kits, e as cavidades foram preenchidas com

100L do conjugado Streptavidina-HRP, e as placas foram incubadas (2° incubação) a T.A.

por 30 min. Em seguida, estas placas foram lavadas 3 vezes com wash buffer e foram

adicionados 100L por cavidade do substrato TBM, seguindo-se por incubação a T.A., 30

min, no escuro. Finalmente, as reações colorimétricas foram interrompidas por adição de

100L / cavidade de solução stop, fornecidas pelos kits, e as leituras espectrofotométricas

foram realizadas com filtro de 450nm em leitor de microplacas de ELISA EMAX (Molecular

Devices Corporation, EUA).

Para a placa de IL-4, após serem realizadas 3 lavagens com solução tampão, foram

adicionados 100 L de anticorpo biotinilado e a placa coberta com fita adesiva, foi incubada

por 90min, a T.A., sofrendo em seguida 3 lavagens com solução tampão. Então, adicionou-

se aos poços o reagente de amplificação de sinal Ambex, no volume de 100 L/poço. A placa

foi incubada por 30 min a T.A., sob agitação constante, em um agitador orbital, seguido de

mais 3 lavagens e da adição de 100 L de TBM, sendo incubada por 30 min a T.A., sob

contínua agitação. Finalmente, a reação colorimétrica foi interrompida com 100 L de

solução stop e as densidades óticas foram determinadas por espectrofotometria com filtro de

450 nm no leitor de microplacas.

Tabela 5: Condições de reação nos ensaios para a quantificação das citocinas IFN-, IFN-,

TNF-, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-.

Citocina

IFN- IFN- TNF-

IL-12 IL-4 IL-5 IL-10

TGF-

N° amostras

SPCVH

testadas

11 20 13 13 18 10 20 17

N° amostras

controle

testadas

27 21 27 29 23 32 22 23

Volume de

amostra

50L 50L 100L 50L 100L 50L 50L 100L pré-

tratados

Marcador do

Anticorpo

primário

biotina biotina biotina FITC biotina biotina biotina biotina

Fator de dil.

Curva padrão

1:2,5 1:2,5 1: 2 1:2,5 1: 2 1:2,5 1:2,5 1: 2

Pontos da curva

padrão (pg/mL)

1000, 400,

160, 64, 25,6

e 0

1000, 400,

160, 64,

25,6 e 0

1000; 500;

250; 125;

62,5; 31,3;

15,6 e 0

1000, 400,

160, 64,

25,6 e 0

40; 20; 10;

5; 2,5;

1,25 e 0

400,

160, 64,

25,6

10,24 e 0

600; 240;

96; 38,4;

15,36 e 0

1000; 500;

250; 125;

62,5; 31,3;

15,6 e 0

1° incubação

T.A; 2 h T.A; 2 h T.A; 4 h,

sob

agitação

T.A; 2 h T.A; 1 h,

sob

agitação

T.A;

1 h

T.A; 2 h 37°C; 1 h

A placa do TGF-, após a 1° incubação, foi lavada 4 vezes com solução tampão; a

seguir, assim como a placa da IL-5, adicionaram-se 50L do anticorpo biotinililado e

incubou-se por uma hora, a 37°C para a placa do TGF-, e a T.A. para a placa da IL-5.

Ambas placas foram lavadas por 3 vezes e adicionaram-se de 100L/ poço do conjugado

estreptavidina e incubou-se por 30 min, sendo a 37°C para a placa do TGF-, e a T.A. para a

placa da IL-5. A seguir, as placas foram lavadas por 3 vezes com solução tampão,

adicionadas de 100 L/ poço de TMB e incubadas por 30 min a T.A. Finalmente, as reações

colorimétricas foram interrompidas com 100 L de solução stop e as densidades óticas

foram determinadas por espectrofotmetria com filtro de 450nm em leitor de microplacas.

A placa do TNF-, após ter sido incubada por 4 horas com as amostras e os padrões,

foi lavada por 3 vezes com solução tampão, adicionada de 100 L/poço de TMB, coberta

com fita adesiva e incubada por 10 min em um agitador de placa a 200 rpm. A reação foi

parada com 100 L de solução stop por poço e as densidades óticas foram determinadas por

espectrofotmetria com filtro de 450nm em leitor de microplacas.

As concentrações séricas de cada citocina foram determinadas por comparação com

suas curvas-padrão.

3.4.2. Ensaio quimioluminescente para dosagem do Fator de Necrose Tumoral- (TNF-

), da Interleucina-1 beta (IL-1), da Interleucina-6 (IL-6) e do Receptor Solúvel de

Interleucina-2 (IL-2R)

Níveis séricos das citocinas TNF-, IL-1, IL-6 e do receptor IL-2R, foram

analisados em 11 amostras dos participantes do grupo SPCVH. Também, analisou-se como

grupo controles 16 amostras séricas de indivíduos soropositivos. As quantificações foram

realizadas, em duplicata, por metodologia de quimioluminescência, em equipamento

automatizado Immulite

1000 (DPC, EUA). Este imunoensaio quimioluminescente consiste

na detecção da reação citocina-anticorpo conjugado a uma enzima, onde uma molécula

sintética atuará como substrato emissor de luz. Um fluorômetro detecta a intensidade da luz,

convertendo-a em concentração da citocina pesquisada.

Inicialmente, o equipamento Immulite

1000 foi calibrado utilizando-se Immulite

TNF



Adjustosr, Immulite IL-1



Adjustors, Immulite IL-6 Adjustors, e Immulite IL-2R

Adjustors (DPC, EUA), componentes ajustadores, em dois níveis (alto e baixo), que fazem o

ajuste das curvas-padrão inclusas no software do aparelho. Os ajustes foram confirmados

utilizando-se Immulite Cytokine Control Module (DPC, EUA), reagente controle com pool

de citocinas de concentrações conhecidas, em dois níveis, e obteve-se os valores esperados

para cada citocina analisada. A seguir, foram acondicionados ao equipamento suportes

contendo cubetas de 650L dos soros a serem analizados, cada um deles seguido das

unidades de teste do equipamento TNF



Test Units, IL-1



Test Units, IL-6 Test Units, IL-2R

Test Units (DPC, EUA), cada uma delas contém uma esfera revestida com anticorpo

monoclonal contra a citocina a ser dosada. Os frascos contendo substrato

quimioluminescente LSUBX (DPC, USA) e a solução de lavagem LPWS2 (DPC, EUA)

foram acondicionados ao equipamento e as dosagens foram automaticamente realizadas,

fornecendo resultados em pg/mL. A sensibilidade dos kits, segundo o fabricante, é de

1,7pg/mL para o TNF-, 5pg/mL para IL-1, 2pg/mL para IL-6 e 5U/mL para IL-2R.

3.4.3. Quantificação de Óxido Nítrico (NO)

A quantificação de NO foi realizada em 12 amostras séricas de participantes do

grupo SPCVH e em amostras de 25 indivíduos soropositivos, utilizado neste caso como

grupo controle. Realizou-se para tanto, a reação colorimétrica de Griess (DAVIS et al,

2002), que detecta indicadores dos produtos finais da quebra de NO, nitrato (NO

) e nitrito

(NO

). Para esta quantificação, NO

é convertido em NO

após incubação com a enzima

Nitrato Redutase.

Para tanto, preparou-se uma solução padrão estoque de NaNO

a 200mM, visando à

construção da curva de calibração da reação. A seguir, preparou-se uma solução tampão de

reação para a enzima nitrato redutase conforme segue: 3000L de solução tampão KH

a 0,5M (pH 7,5); 1500L do co-fator da enzima, -Nicotinamida Nucleotide Phosphate,

Reduced Form (-NADPH) (Sigma, EUA); 2850L de água MiliQ, e 150L da enzima

Nitrate Reductase 20U (Roche, EUA). Em microplaca de 96 cavidades foram realizadas

diluições seriadas, a partir da solução padrão estoque de NaNO

, no volume final de

40L/cavidade, sendo a primeira concentração 200M, seguida por diluições duplas até

1/4096, o que permitiu definir 12 pontos na curva de calibração. A seguir, adicionaram-se

às demais cavidades, 40L de cada soro a ser testado, em duplicata e em seguida, 40L do

coquetel reagente. Incubou-se a placa tampada, orvernight, em estufa, a 37°C. No dia

seguinte, foram preparadas as soluções A e B da reação de Griess, conforme segue:

Solução A: 2% de Sulfanilamida (Sigma, USA) em H

a 5%

Solução B: 0,2% de alpha naphtyl-ethilenadiane (NEED) (Sigma, USA)

Finalmente, preparou-se uma mistura reagente contendo 3mL da solução A, 3mL da

solução B e 3mL de água MiliQ. Desta mistura, pipetou-se 80L em cada cavidade da

microplaca, para o desenvolvimento de cor, após incubação por 10min a TA. A leitura foi

realizada com filtro de 540nm em leitora de microplacas. A concentração de nitrito nas

amostras foi determinada a partir dos valores obtidos com a curva-padrão.

3.4.4. Quantificação de Proteína C Reativa

A quantificação de Proteína C Reativa foi realizada em 14 amostras séricas de

participantes do grupo SPCVH, por reação imunoturbidimétrica, na qual partículas de látex

recobertas com anticorpo anti-proteína C reativa aglutinam em presença da proteína, e a

aglutinação é proporcional à concentração de proteína C reativa na amostra. Para esta

quantificação, as amostras foram analisadas em equipamento automatizado KONELAB 60i

(Thermo Electron Corporation, Wiener Lab Group, Alemanha), utilizando o kit próprio do

aparelho PCR látex linea Turbitst AA (Wiener Lab Group, Alemanha). Estas determinações

foram realizadas no equipamento do Laboratório de Automação do HCFMRP-USP. Os

valores obtidos nos soros dos pacientes com SPCVH foram comparados aos de referência

fornecidos pelo kit.

3.5. Análises de Polimorfismos Genéticos

Para as análises de polimorfismo genético, o DNA genômico foi extraído das

amostras sanguíneas de indivíduos dos grupos: SPCVH, soropositivos, e controle, pelo

método salting out descrito por MILLER et al (1988), com algumas modificações. Desta

forma, 5 ou 10mL do sangue total foram transferidos para tubo de polipropileno de 50mL

ao qual adicionou-se solução tampão de lise I (0,3M sacarose; 10mM Tris-HCl pH7,5;

5mM MgCl; Triton X-100 1%) gelada, até o volume de 50mL. O hemolisado foi

homogeneizado por inversão, e centrifugado a 3.200 rpm, por 5min a 4C. O sobrenadante

foi desprezado e o processo repetido novamente, buscando obter um precipitado livre de

hemácias. Em seguida, adicionaram-se ao precipitado 4,5mL de solução tampão de lise II

(0,075M NaCl; 0,024M Na-EDTA pH8,0), 125L de SDS a 10% e 1,1mL de perclorato de

sódio a 5,0M. O tubo foi agitado vigorosamente por 10 seg e adicionaram-se 2mL de

solução salina saturada (NaCl 6,0M), para extração de proteínas. Em seguida, o tubo foi

vigorosamente homogeneizado, por 15seg e centrifugado a 3.300 rpm, por 5 min a 4C. O

sobrenadante (contendo o DNA) foi transferido para outro tubo de 50mL, onde adicionou-

se igual volume (7mL) de isopropanol absoluto (Merk, Alemanha), para precipitar o DNA.

O precipitado de DNA foi removido com pipeta Pasteur e transferido para um tubo

Eppendorf. O excesso de isopropanol foi retirado com pipeta e o precipitado, lavado com

1,5mL de etanol a 70% e após 10 min de centrifugação, a 10.000 rpm,a 4C. Em seguida,

desprezou-se o etanol e o DNA foi seco à temperatura ambiente, com tubo invertido, em

papel toalha. Finalmente, hidratou-se o DNA em 100 a 300L de água DEPC e

quantificou-se o mesmo em espectrofotômetro GeneQuantII (Pharmacia, EUA) com filtro

de 260nm. O material foi estocado a -20C até o momento da análise.

3.5.1. Tipificação dos Genes HLA por PCR-SSP (amplificação sequência-específica)

Foram determinados HLAs apenas nos participantes do grupo SPCVH. As

tipificações dos HLAs -A; -B; -Cw; e -DR foram realizadas utilizando kits Micro SSP HLA

DNA Typing (One Lambda, EUA). Os kits, mantidos a -20C, forneceram misturas prontas

(D-mix) de dNTPs e solução tampão de enzima, além de placas constituídas de 96 tubos

para PCR contendo primers pré-otimizados para a amplificação dos alelos dos genes

codificadores de HLA-A, HLA-B, HLA-Cw e HLA-DR (DRB1, DRB3, DRB4, DRB5),

além de primers para controle interno de reação (gene da  globina humana). Após

descongelamento da D-mix e das placas contendo os primers, 1l da mesma água utilizada

para diluir o DNA foi adicionado ao tubo corresponde ao controle negativo. A seguir,

adicionou-se ao tubo da D-mix, Taq polimerase na concentração de 5U/L, a amostra de

DNA na concentração de 100ng/l. Dispensou-se esta mistura nos tubos, em volumes de

10l, exceto naquele correspondente ao controle negativo. Finalmente, tamparam-se os

tubos com adesivo e procedeu-se a ciclos térmicos (1 ciclo de 94C por 130 seg, e 63C

por 60 seg; 9 ciclos de 94C por 10 seg, e 63C por 60 seg; e 20 ciclos de 94C por 10 seg,

59C por 50 seg; e 72C por 30 seg) em termociclador Perkin Elmer 9600 (EUA).

Para visualização dos amplicons, utilizou-se o sistema de Gel Micro SSP (One

Lambda, EUA) que permite processar no gel 96 produtos. Preparou-se estes géis de agarose

a 2,5%, em tampão TBE, contendo 15l de solução de brometo de etídeo a 8mg/mL. Foi

realizada a corrida eletroforética a 140-150V por 5 min. O gel foi finalmente visualizado

em transiluminador UV e fotografado em sistema Kodak Digital Science™.

3.5.2. Tipificação dos genes das citocinas TNF-, IFN-, TGF, IL-6 e IL-10, por PCR-

SSP

Analisou-se polimorfismos de genes de citocinas nos indivíduos dos grupos SPCVH,

soropositivos e controle (100 doadores de sangue). Os polimorfismos dos genes das

citocinas, conforme mostra a Tabela 6, foram determinados utilizando o kit Cytokine

Genotyping Tray (One Lambda, EUA). Este kit utiliza o mesmo princípio daquele para

tipificação de HLA, com múltiplos pares de primers que amplificam um segmento genômico

correspondente à fração polimórfica do gene de cada uma destas citocinas e os

procedimentos foram realizados de forma idêntica. Neste caso, variações térmicas incluem 1

ciclo de 96C por 130 seg, e 63C por 60 seg; seguido de 9 ciclos de 96C por 10 seg, e

63C por 60 seg; e de 20 ciclos de 96C por 10 seg, 59C por 50 seg e 72C por 30 seg.

Para visualização dos amplicons, foi utilizado o sistema de Gel Micro SSP (One

Lambda, EUA) foi realizado eletroforese com procedimento descrito no item 3.5.1. Na

Tabela 6 observa-se uma associação entre genótipo e fenótipo correlacionando a existência

de um determinado genótipo com padrão de produção da citocina. Para as análises

estatísticas foram considerados os fenótipos de produção de cada citocina, somando-se as

frequencias observadas de cada genótipo determinante de um mesmo fenótipo.

Tabela 6: Regiões alélicas polimórficas nos genes das citocinas indicadas, onde anelam

primers do kit Cytokine Genotyping Tray One lambda, mostrando também a associação

entre genótipo e fenótipo de produção de citocinas.

Polimorfismo de citocinas Genótipo Fenótipo de

produção

TNF- (-308)*

G/G

G/A, A/A

Baixo

Alto

TGF-1 (códons 10, 25)

T/T-G/G; T/C-G/C

T/C-G/C; C/C-G/G; T/T-G/C

C/C-G/C; C/C-C/C; T/T-C/C; T/C-C/C

Alto

Intermediário

Baixo

IL-10 (-1082, -819, -592)*

GCC/GCC

GCC/ACC; GCC/ATT

ACC/ACC; ACC/ATA; ATA/ATA

Alto

Intermediário

Baixo

IL-6 (-174)*

G/G; G/C

C/C

Alto

Baixo

IFN- (intron 1 +874)

T/T; T/A

A/A

Alto

Baixo

A= adenina; C=citosina; T= timina; G=guanina. *região promotora do gene

3.5.3. Tipificação por ASP-PCR (amplificação Alelo-específica) dos aloantígenos

plaquetários HPA-1A (PL

); HPA-1B (PL

); HPA-4A (Pen

); HPA-4B (Pen

); HPA-

6A (Ca

/Tu

) e HPA-6B (Ca

/Tu

)

A tipificação de três sistemas HPA foi realizada para amostras dos participantes dos

grupos SPCVH, soropositivos e controles negativos (doadores de sangue). Seguindo o

protocolo descrito por SKOGEN et al (1994), para a ASP-PCR de cada sistema HPA (1; 4;

6) foram preparadas 2 misturas de reação (1 para alelo “a” e 1 para alelo “b”), cada uma

contendo seus respectivos pares de primers (vide Tabela 7), com volume final de 50l e

contendo: 1l dos dNTPs a 10 mM; 5l da solução tampão 10x [75 mM Tris pH 9.0, 2mM

MgCl2, 50mM KCl, 20mM (NH

)

)]; 1l (25M) de cada primer específico (Tabela 7)

e 1l (5M) dos primers para controle interno HGH-1S e HGH-2as, que amplificam parte

do gene do hormônio do crescimento; e 1,25U de Taq DNA polymerase (Biotools, Brasil). A

cada mistura de reação adicionavam-se 125ng de DNA genômico. Submeteu-se as misturas à

desnaturação a 94°C, 5min, em termociclador (MiniCycler, MJ Research, USA), seguida

por 30 ciclos de 94°C 1min, 65°C 2min; e 72°C 1min, com extensão final a 72°C por 10min.

Os produtos de reação foram visualizados à luz UV, após eletroforese em gel de

agarose a 1,8%, com 5 l de cada amplicon e corados com brometo de etídeo 0,5g/ml. Os

géis foram fotografados em sistema Kodak Digital Science™.

Tabela 7: Primers tipificadores de aloantígenos plaquetários (SKOGEN et al.,1994).

Nome do primer Seqüência de nucleotídeos Tamanho do produto

amplificado (pb)

HPA-1a (PL

)

HPA-1aC

5’CTTACAGGCCCTGCCTCT3’

5’TGCTTCAGGTCTCTCCCC3’

244

HPA-1b (PL

)

HPA-1aC

5’CTTACAGGCCCTGCCTCC3’

5’TGCTTCAGGTCTCTCCCC3’

244

HPA-4a (Pen

)

HPA-4bC

5’CTGGCCACCCAGATGCG3’

5’GGTAGAAAGGAGCTATAGTTTGGC3’

252

HPA-4b (Pen

)

HPA-4bC

5’CTGGCCACCCAGATGCA3’

5’GGTAGAAAGGAGCTATAGTTTGGC3’

252

HPA-6a (Ca

/Tu

)

HPA-6b

5’GACGAGTGCAGCCCCCG3’

5’CCTATGTTTCCCAGTGGTTGCA3’

238

HPA-6b (Ca

/Tu

)

HPA-6bC

5’GGACGAGTGCAGCCCCCA3’

5’CCTATGTTTCCCAGTGGTTGCA3’

239

HGH-1S

HGH-2as

5’TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA3’

5’CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC3’

434

3.6. Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando métodos não paramétricos, uma

vez que as distribuições não eram Gaussianas (BETHELL et al, 1998; MORI et al, 1999).

Para analisar os teores de mediadores plasmáticos, foi utilizado o teste de Mann-Whitney.

Para verificar a correlação existente entre os diferentes mediadores plasmáticos utilizou-se

teste de regressão linear simples. Este mesmo teste, também, foi utilizado para verificar a

correlação entre mediadores plasmáticos e alguns parâmetros clínico-laboratoriais, como a

média da pressão arterial, contagem de plaquetas, leucócitos e hematócrito. Para comparar

os teores de citocinas entre 3 ou mais subgrupos de SPCVH, utilizaram-se análises de

variância (ANOVA), pelos testes de Kruskal-Wallis e o de comparações múltiplas de Dunn.

As análises foram realizadas em microcomputador com o software GraphPad Instat (EUA)

e os gráficos foram obtidos pelo software GraphPad Prism4 (EUA). Para todos os testes

utilizados, a hipótese de nulidade foi rejeitada, quando a possibilidade de ocorrência casual

das diferenças observadas não excedia 5 % (p<0,05).

As frequências dos genes de citocinas, dos HPAs e dos alelos de HLA classes I e II

observadas no grupo SPCVH e no controle, foram comparadas, utilizando o teste exato de

Fisher bicaudal. Os valores probabilísticos, quando inferiores a 0,05, foram corrigidos

multiplicando-se o p pelo número de especificifidades testadas (correção de Bonferroni),

isto para evitar erros do tipo I (falso +) (PAGANO e GAUVREAU, 2004). Além disso,

para avaliar probabilidade de desenvolver SPCVH nos diferentes padrões de alelos HLA

observados, determinou-se a Odds Ratio (OR), segundo a Tabela 8 e a fórmula, abaixo

(SVEJGAARD, 1986).

Tabela 8: Tabela de contingência 2 X 2

Alelo

População Presença Ausência Total

Pacientes a b a + b

Controles c d c + d

Total a + c b + d a + b + c + d

A OR indica qual a chance de a doença ocorrer em um grupo de indivíduos

portadores de uma certa especificidade gênica, comparando-o a um grupo de indivíduos

não portadores dessa especificidade. Essas análises foram realizadas pelo GraphPad Instat

(EUA) e seguindo como base os trabalhos de SVEJGAARD (1986) e DUBEY (1992),

sendo considerados significantes os valores de p corrigido (pc) menores do que 0,05.

Também, quando o valor de OR obtido foi >1, calculou-se a Fração Etiológica (FE) ou

risco atribuível em nível de população, seguindo a Tabela 8 e a formula (SVEJGAARD,

1986):

Para análise combinada de todos os alelos de um mesmo HLA entre os grupos

SPCVH e controle, utilizou-se um teste exato para diferenciação populacional que se

baseia nas frequências alélicas e no teste de Fisher (RAYMOND e ROUSSET, 1995a),

utilizando o software GENEPOP 3.4 (RAYMOND e ROUSSET, 1995b). Ainda, para

análise global de todos os loci HLA (-A, -B, -Cw, -DR) e do TNF- (-308) entre os grupos

SPCVH e controle, realizou-se análise multi-locus (over all loci) (com base no teste do

Qui-quadrado), utilizando o GENEPOP 3.4 (RAYMOND e ROUSSET, 1995b).

3.7. Cálculo da Pressão Arterial (P.A) Média

A P.A. média de indivíduos do grupo SPCVH foi calculada, quando possível, com

base em dados de prontuários referentes ao mesmo dia em que foi realizada a coleta do

sangue para este trabalho. Para cálculo da P.A. média utilizou-se a fórmula preconizada por

TAKALA et al, (2000), conforme segue: P.A. Média (mm de Hg) = [2 x pressão arterial

diastólica (em mm Hg)] + pressão arterial sistólica (em mm Hg) / 3.

OR =

a / (a + b) x [1 - (c / (c + d) ]

c / (c + d) x [1 - (a / (a + b) ]

FE =

OR - 1

x [ a / (a + b) ]FE =

OR - 1

x [ a / (a + b) ]

4. RESULTADOS

4.1. Diagnóstico molecular da SPCVH

Sessenta e oito amostras do sangue de pacientes suspeitos de SPCVH foram

processadas para a detecção de no mínimo duas regiões do genoma de hantavírus, pela

técnica da RT-PCR e destas, em 18 (26,5%) foi possível amplificar genoma viral em pelo

menos 2 PCRs, confirmando o diagnóstico de infecção por hantavírus. Um gel com os

amplicons de fragmentos genômicos do segmento S na região codificadora da proteína N

(264 pb) e do segmento M nas regiões codificadoras das proteínas G1 (324 pb) e G2 (350

pb) é mostrado na Figura 4. Confirmação adicional da infecção por hantavírus foi obtida

em 10 amostras, pelo sequenciamento nucleotídico e análise filogenética (MORELI,

2005a).

Figura 4: Amplicons obtidos na RT-PCR para hantavírus. Na linha 1 encontra-se marcador

de tamanho molecular com 100pb; linhas 2-4 controle negativo com primers G1, G2 e S;

linha 5 amplicon de G1, linha 6 amplicon de G2 e linha 7 amplicon de S a partir de amostra

sanguínea de um paciente com SPCVH; linhas 8-10 amplicons do controle positivo G1, G2,

e S, respectivamente.

324 pb

264 pb

350 pb

600 pb

500 pb

200 pb

100 pb

400 pb

300 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4.2. Quantificações de mediadores plasmáticos

Foram realizadas quantificações de citocinas plasmáticas e NO em amostras do soro

de indivíduos do grupo SPCVH e também, de indivíduos soropositivos e/ou voluntários,

como grupo controle. Soros testados para cada citocina constam da Tabela 9. Observa-se

que varia o número de amostras quantificadas para cada citocina, decorrente de limitações

nos volumes disponíveis para os testes e também, da realização destas quantificações em

duas etapas (1

etapa IFN-α,TNF-α, IL-1-β, IL-6, IL-2R; 2

etapa IFN-γ, TNF-β, IL-10,

TGF-β, IL-4, IL-5), que causou o esgotamento de algumas das amostras, sem remanescente

para as quantificações realizadas na segunda etapa. As quantificações de citocinas de cada

indivíduo do grupo SPCVH, constam na Tabela 9. Também, para melhor discriminar o

papel das citocinas na clínica e evolução dos pacientes do grupo SPCVH, estes foram

divididos em 4 subgrupos, com base na evolução clínica (cura ou óbito) e na época da

coleta amostral relacionada ao início dos sintomas, a saber, “cura e coleta <7 dias”, “cura e

coleta >7 dias”, “óbito e coleta <7 dias” e “óbito e coleta >7 dias”. Os 4 subgrupos SPCVH

foram comparados entre si e também com o grupo controle, para cada citocina.

IFN- não foi detectado nas 11 amostras testadas do grupo SPCVH, nem nas 27

amostras do grupo controle, utilizando um teste com sensibilidade de <3pg/mL (Tabela 9).

Tabela 9: Quantificações de citocinas e óxido nítrico em 21 pacientes com SPCVH

TNF

pg/mL

IL-6

pg/mL

IL-1

pg/mL

IL-12

pg/mL

IFN

pg/mL

TNF

pg/mL

IL-10

pg/mL

TGF

ng/mL

IL-4

pg/mL

IL-5

pg/mL

IFN

pg/mL

IL-2R

U/mL

M

V.R. 0-8,1 0-3,3 <5,0 50-400 0-1,5 <125 0-14,4 - 0-4,6 0-2,4 0 223-710 -

Sensibilidade

do método

1,7 2 <5 5 <2 7 <3 0,004 0,5 <2 <3 5 -

N° amostras

testadas:

SPCVH e

controles

Sobreviventes

1 J.M.P. 15,15 17,85 <5,00 0 22,67 30,8 0 0 0 1945 21,8

2 O.N.S. 23,3 3,8 <5,00 0 4972 25,2

3 N.R.C. 15,65 35,6 <5,00 49,4 2,10 49,06 135,1 26,6 0 0 0 2356 11,0

4 A.C.C. 0 25,62 32,6 0

5 N.V.T.S. 17,55 16,75 <5,00 27,1 0 25,02 95,66 14,9 0 0 0 2341 18,4

6 J.B.A. 0 0 1,25 7,31 46,8 0 0

7a M.A.C.G.

(1° amostra)

0 0 2,64 10,93 22,5 0 0

7b M.A.C.G.

(2° amostra)

14,1 0 0 4,36 44,6 0 0

8 P.C.A. 14,2 7,4 <5,00 0 103,1 0 924 25,2

9 A.G.N. 26,35 10,45 <5,00 154,1 8,09 0 76,09 21,7 0 0 0 2529 28,6

10 A.M. 12,9 5,95 <5,00 227,8 0 14,65 4,5 29,5 0 0 2467 23,3

11 J.V.N. 17,2 3,75 <5,00 194,5 2,90 0 15,09 34,1 0 0 0 1105 26,4

12 G.S.P. 0 0 0 4,76 40,5 0 0

13 J.E.F 40,1 0 39,39 220,7 35,8 0 0

14 A.O.C. 14,58 356,5 0

15 A.J.S. 96,94

16 A.S.P. 34,6

Fatais

17 C.E.C. 11,05 887 <5,00 0 0 12,86 141,6 74,3 0 0 0 3152 30,3

18 A.V.V.F. 23,8 11,5 22,06 21,7 0 3744 166,1

19 J.R.G.C. 10,65 1352 <5,00 23,3 0 489 40,1

20 M.B.F.N. 733,2 67,23 54,45 468,6 32,8 0 0

21 Z.C.M. 14,58

A concentração mediana de TNF- (16,0 pg/mL, amplitude 10,6 - 26,3) foi

significantemente maior no grupo SPCVH que no controle (6,5 pg/mL, amplitude 4,5 –

18,1) pelo U-test de Mann-Whitney (p=0,0002, Figura 5A). Não se observou diferença

quanto a teores de TNF- para os quatro subgrupos SPCVH (p=0,4885) e entre os

subgrupos e os controles (p=0,0584), por análise de variância (ANOVA), utilizando o teste

de Kruskal-Wallis, Figura 5B. Também, não houve diferença quanto à concentração

mediana de TNF- no grupo SPCVH entre casos fatais (11,1 pg/mL, amplitude 10,6 – 3,8)

e sobreviventes (16,4 pg/mL, amplitude 12,9 – 26,3), sendo p=0,3758 (Figura 5C).

Figura 5: Níveis séricos de Fator de Necrose Tumoral-alpha (TNF-) em 11 indivíduos do

grupo SPCVH e em 11 indivíduos controle (A). Análise de variância (ANOVA) para

quantificação do TNF-α no grupo controle e no grupo SPCVH dividido em 4 subgrupos:

cura ou óbito e coleta realizada anterior ou posteriormente ao sétimo dia do início dos

sintomas (B). Comparação dos níveis de TNF- entre indivíduos que sobreviveram e que

foram a óbito, no grupo SPCVH. A amplitude está também representada (C). O traço indica

a mediana dos grupos.

TNF



pg/mL

SPCVH controles

TNF-



pg/mL

*p=0.0002

p=0.0584

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.4885)

controles

SPCVH

Cura óbito

TNF-



pg/mL

(p=0.3758)

SPCVH

TNF



pg/mL

SPCVH controles

TNF-



pg/mL

*p=0.0002

p=0.0584

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.4885)

controles

SPCVH

Cura óbito

TNF-



pg/mL

(p=0.3758)

SPCVH

Com relação ao TNF-, a concentração plasmática mediana no grupo SPCVH foi

7,7 pg/mL (amplitude 0,0 – 54,4), e no grupo controle, 0,0 pg/mL (amplitude 0,0 – 47,8).

Estas concentrações, quando comparadas pelo U-test de Mann-Whitney, não foram

distintas, p=0,0539 (Figura 6A). Similarmente, a variância do TNF- entre os quatro

subgrupos SPCVH (p=0,3135) e também, entre os mesmos e o grupo controle não foi

significante (p=0,0919 pelo teste de Kruskal-Wallis; Figura 6B). Também, não houve

diferença quando à concentração mediana de TNF- no grupo SPCVH em casos fatais

(33,6 pg/mL, amplitude 12,9 – 54,4) e sobreviventes (1,9 pg/mL, amplitude 0,0 – 49,1),

sendo p=0,2727.

Figura 6: Níveis séricos de Fator de Necrose Tumoral-beta (TNF-β) em 12 indivíduos do

grupo SPCVH e em 27 indivíduos controle (A). Análise de variância (ANOVA) para

quantificação do TNF-β no grupo controle e no grupo SPCVH dividido em 4 subgrupos:

cura ou óbito e coleta realizada anterior ou posteriormente ao sétimo dia do início dos

sintomas (B). O traço indica a mediana dos grupos.

TNF



pg/mL

SPCVH controles

TNF-



pg/mL

p=0.0539

p=0.0919

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.3135)

controles

SPCVH

TNF



pg/mL

SPCVH controles

TNF-



pg/mL

p=0.0539

p=0.0919

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.3135)

controles

SPCVH

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.3135)

controles

SPCVH

Para IL-6, foi de 13,5 pg/mL (amplitude 4,0 – 1.353,0) a concentração mediana no

grupo SPCVH, sendo este valor significantemente maior que no grupo controle, 0,0 pg/mL

(amplitude 0,0 – 5,0; p<0,0001; Figura 7A). A análise de variância para IL-6 entre os

quatro subgrupos SPCVH acima citados e os controles foi significantemente diferente

(p=0,0004 pelo teste Kruskal-Wallis) mas não houve diferença quando se comparou os

quatro subgrupos de SPCVH entre si (p=0,0648), conforme mostra a Figura 7B. Também,

no grupo SPCVH, foi encontrada diferença na concentração mediana plasmática de IL-6

dos indivíduos que foram a óbito, mais elevada em relação aqueles que sobreviveram,

sendo de 1.119,8 pg/mL (amplitude 88,7 – 1.352,5) e 8,9 pg/mL (amplitude 3,7 – 35,6),

respectivamente (p=0,0444, Figura 7C). Ainda, analisando pontualmente as quantificações

de IL-6 no grupo SPCVH, chamou atenção que a concentração sérica mais elevada foi

observada em indivíduo que parece não ter apresentado sintomas prodrômicos da SPCVH,

tendo ocorrido o óbito horas após o início de sua doença (J.R.G.C., Tabela 9).

A concentração mediana de IL-12 (33,6 pg/mL, amplitude 0,0 – 733,1) no grupo

SPCVH não foi diferente daquela observada no grupo controle (54,9 pg/mL, amplitude

0,0–277,4; p=0,6158, Figura 8A). A análise de variância para IL-12 entre os quatro

subgrupos SPCVH (p=0,1364 pelo teste de Kruskal-Wallis) e também, entre os mesmos e o

grupo controle (p=0,0944), não foi significante. A comparação de concentrações medianas

da IL-12 em casos fatais e sobreviventes no grupo SPCVH, 366,6 pg/mL (amplitude 0,0 –

733,1) e 33,6 pg/mL (amplitude 0,0 – 227,8), respectivamente, não foi significante

(p=0,8295 pelo U-test de Mann-Whitney). Para IL-1, os níveis plasmáticos, tanto no grupo

SPCVH quanto no controle, estiveram abaixo do limite de detecção do método utilizado

(<5,0pg/mL), exceto para 2 amostras (Tabela 9). Portanto, não se encontrou diferenças

entre os grupos SPCVH e controle (p=0,9003, Figura 8B).

Figura 7: Níveis séricos de IL-6 em 10 indivíduos do grupo SPCVH e 24 indivíduos

controle (A). Análise de variância (ANOVA) para quantificação da IL-6 no grupo controle

e no grupo SPCVH dividido em 4 subgrupos: cura ou óbito e coleta realizada anterior ou

posteriormente ao sétimo dia do início dos sintomas. (B). Comparação dos níveis de IL-6

entre indivíduos que sobreviveram e que foram a óbito, no grupo SPCVH. A amplitude está

também representada (C). O traço indica a mediana dos grupos.

SPCVH controles

750

1000

1250

1500

IL-6 pg/mL

*p= <0.0001

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.0648)

controles

SPCVH

*p= 0,0004

Cura Óbito

500

1000

1500

IL-6 pg/mL

SPCVH

(*p=0.0444)

750

1000

1250

1500

IL-6 pg/mL

SPCVH controles

750

1000

1250

1500

IL-6 pg/mL

*p= <0.0001

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.0648)

controles

SPCVH

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.0648)

controles

SPCVH

*p= 0,0004

Cura Óbito

500

1000

1500

IL-6 pg/mL

SPCVH

(*p=0.0444)

750

1000

1250

1500

IL-6 pg/mL

Figura 8: Níveis séricos de IL-12 em 12 indivíduos do grupo SPCVH e 29 indivíduos

controle (A). Níveis séricos de IL-1 beta em 11 indivíduos do grupo SPCVH e 14 do

controle (B). O traço indica a mediana dos grupos.

Quanto à quantificação do IFN-, a concentração mediana no grupo SPCVH foi

0,0 pg/mL (média de 6,49 pg/mL 16,4 SD; amplitude 0,0 – 67,2), assim como no grupo

controle, 0,0 pg/mL (média de 0,14 pg/mL  0,6 SD; amplitude 0,0 – 2,9), sem diferença

significante (p=0,0941 pelo U-test de Mann-Whitney; Figura 9A). A variância observada

entre os quatro subgrupos SPCVH e o controle mostrou-se significante (p=0,0226 pelo teste

de Kruskal-Wallis), mas sem diferença quando consideraram-se apenas os 4 subgrupos

SPCVH (p=0,2197, Figura 9B). Também, não houve diferença quando a concentração

mediana de IFN- no grupo SPCVH foi comparada entre casos fatais (14,5 pg/mL,

amplitude 0,0 – 67,2) e sobreviventes (0,0 pg/mL, amplitude 0,0 – 14,6; p=0,1644 pelo U-

test de Mann-Whitney). Entretanto, é relevante destacar que um dos indívíduos do grupo

SPCVH, cuja coleta sanguínea foi realizada horas antes do óbito (M.B.F.N., Tabela 9),

apresentou teor elevado de IFN- (67,231 pg/mL), discrepante daquele dos demais

participantes do grupo SPCVH. No mesmo paciente, este alto teor de IFN- teve

SPCVH controles

100

150

200

250

400

600

800

IL-12 pg/mL

p=0,6158

SPCVH controles

IL-1



pg/mL

p=0.9003

SPCVH controles

100

150

200

250

400

600

800

IL-12 pg/mL

p=0,6158

SPCVH controles

IL-1



pg/mL

p=0.9003

correspondência com os teores também muito elevados de outras citocinas relacionadas ao

IFN-, como a IL-12 (733,1 pg/mL) e a IL-10 (468,58 pg/mL) (Tabela 9).

Figura 9: Níveis séricos de Interferon gama em 17 indivíduos do grupo SPCVH e 21

indivíduos controle (A). Análise de variância (ANOVA) para quantificação da IFN-γ no

grupo controle e no grupo SPCVH dividido em 4 subgrupos: cura ou óbito e coleta

realizada anterior ou posteriormente ao sétimo dia do início dos sintomas (B). O traço

indica a média dos grupos.

No grupo SPCVH, a concentração mediana do receptor solúvel de IL-2 (IL-2R), um

marcador da ativação de linfócitos T, foi de 2357,0 U/mL (amplitude 489 – 4973),

enquanto que, no grupo controle foi de 347,0 U/mL (amplitude 158 - 1086), sendo

significantemente maior no grupo SPCVH (p < 0.0001; Figura 10A). A variância de IL-2R

entre os 4 subgrupos SPCVH e o grupo controle mostrou-se significante (p=0,0018 pelo

teste de Kruskal-Wallis), mas não houve diferença quando se comparou apenas os quatro

subgrupos entre si (p=0,1745; Figura 10B). Também, foram significantemente diferentes as

médias encontradas nos subgrupos “cura e coleta >7 dias” e “óbito e coleta >7 dias”em

relação à média do grupo controle (p<0.05 pelo teste de Comparações Múltiplas de Duun;

Figura 10B). Não houve diferença quando se comparou níveis de IL-2R entre casos fatais

SPCVH controles

IFN-



pg/mL

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0,2197)

controles

SPCVH

*p=0,0226p=0,0941

IFN-



pg/mL

SPCVH controles

IFN-



pg/mL

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0,2197)

controles

SPCVH

*p=0,0226p=0,0941

IFN-



pg/mL

(mediana 3.152,0 pg/mL; amplitude 489,0 – 3.744,0) e sobreviventes (mediana 2348,8

pg/mL; amplitude 924,0 – 4.972,5) no grupo SPCVH (p=0,7758).

Figura 10: Níveis séricos de receptor solúvel de IL-2, em 11 indivíduos do grupo SPCVH

e em 13 indivíduos do grupo controle. O traço indica a mediana dos grupos. (A). Análise de

variância (ANOVA) para quantificação de IL-2R no grupo controle e no grupo SPCVH

dividido em 4 subgrupos: cura ou óbito e coleta realizada anterior ou posteriormente ao

sétimo dia do início dos sintomas. Os asteriscos indicam diferenças significativas (p<0,05)

entre os subgrupos assinalados. O traço indica a média dos grupos. (B).

A IL-10 teve concentração mediana de 50,8 pg/mL (amplitude 4,4 – 468,6) no

grupo SPCVH e foi significantemente maior quando comparada à do grupo controle, de 0,0

pg/mL (amplitude 0,0 – 57,3), com p<0,0001 (Figura 11A). A variância de IL-10 entre os 4

subgrupos SPCVH e o grupo controle, mostrou-se diferente (p<0,0001 pelo teste de

Kruskal-Wallis), conforme mostra a Figura 11B. Não houve diferença na comparação dos

quatro subgrupos SPCVH entre si (p=0,0984; Figura 11B), ou teores de IL-10 em casos

fatais (141,6 pg/mL; amplitude 22,1 – 468,6) e sobreviventes (25,6 pg/mL; amplitude 4,4 –

356,5) no grupo SPCVH (p=0,2034).

1000

2000

3000

4000

5000

IL-2R U/mL

SPCVH controles

1000

2000

3000

4000

5000

6000

IL-2R U/mL

*p<0,0001

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

SPCVH e controles (*p=0.0018)

controles

SPCVH (p=0,1745)

*p<0,05

1000

2000

3000

4000

5000

IL-2R U/mL

SPCVH controles

1000

2000

3000

4000

5000

6000

IL-2R U/mL

*p<0,0001

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

SPCVH e controles (*p=0.0018)

controles

SPCVH (p=0,1745)

*p<0,05

Figura 11: Níveis séricos de Interleucina-10 em 18 indivíduos do grupo SPCVH e 22

indivíduos controle (A). Análise de variância (ANOVA) para quantificação de IL-10 no

grupo controle e no grupo SPCVH dividido em 4 subgrupos: cura ou óbito e coleta

realizada anterior ou posteriormente ao sétimo dia do início dos sintomas. (B). O traço

indica a mediana dos grupos.

O TGF- apresentou concentração mediana significantemente menor no grupo

SPCVH (31,7 ng/mL; amplitude 14,9 – 74,3) que no controle (44,7ng/mL; amplitude 30,6–

77,3; p= 0.0007; Figura 12A). A variância do TGF- entre os subgrupos SPCVH acima

citados e os controles mostrou-se diferente (p=0,0119 pelo teste de Kruskal-Wallis), mas

não houve diferença quando se comparou apenas os quatro subgrupos entre si (p=0,8641;

Figura 12B). Também, não houve diferença quando se comparou níveis de TGF- entre

casos fatais (28,0 ng/mL; amplitude 21,7 – 74,3) e sobreviventes (31,7 ng/mL; amplitude

14,9 – 46,8) no grupo SPCVH (p>0,9999).

100

150

200

250

350

450

IL-10 pg/mL

SPCVH controles

100

150

200

250

350

450

IL-10 pg/mL

*p<0.0001

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.0984)

controles

SPCVH

*p<0,0001

100

150

200

250

350

450

IL-10 pg/mL

SPCVH controles

100

150

200

250

350

450

IL-10 pg/mL

*p<0.0001

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0.0984)

controles

SPCVH

*p<0,0001

Figura 12: Níveis séricos de TGF-B em 16 indivíduos do grupo SPCVH e 23 indivíduos

controle (A). Análise de variância (ANOVA) para quantificação de TGF-β no grupo

controle e no grupo SPCVH dividido em 4 subgrupos: cura ou óbito e coleta realizada

anterior ou posteriormente ao sétimo dia do início dos sintomas (B). O traço indica a

mediana dos grupos.

IL-4 e IL-5, não foram detectadas nas amostras testadas do grupo SPCVH e do

controle, sendo o limite de sensibilidade dos testes utilizados <0,5pg/mL e <2pg/mL,

respectivamente (Tabela 9).

As concentrações medianas de NO nos grupos SPCVH e controle foram 25,8µM de

(amplitude 11,0 – 166,1) e 29,0µM de NO

(amplitude 15,0 – 140,0), respectivamente.

Esta diferença não foi significante (p=0.4458 pelo U-test de Mann-Whitney; Figura 13A). A

variância para NO entre os quatro subgrupos SPCVH (p=0,1096) e também entre os

mesmos e o grupo controle (p=0,1680) não foi significante. Observou-se diferença na

concentração mediana plasmática de NO dos casos fatais e sobreviventes, 40,1 µM de NO

(amplitude 30,0 – 166,0) e 25,2 µM de NO

(amplitude 11,0 – 34,6), respectivamente

(p=0,0182; Figura 13B).

SPCVH controles

TGF



ng/mL

*p=0,0007

TGF-



ng/mL

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0,8641)

controles

SPCVH

*p=0,0119

SPCVH controles

TGF



ng/mL

*p=0,0007

TGF-



ng/mL

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0,8641)

controles

SPCVH

Cura

Coleta < 7d

Cura

Coleta > 7d

Óbito

Coleta < 7d

Óbito

Coleta > 7d

(p=0,8641)

controles

SPCVH

*p=0,0119

Figura 13: Níveis séricos de óxido nítrico, quantificado como nitrito, em 12 indivíduos do

grupo SPCVH e em 25 indivíduos do grupo controle (A). Comparação dos níveis de NO

entre indivíduos que sobreviveram e que foram a óbito, no grupo SPCVH. A amplitude está

também representada (B). O traço indica a mediana dos grupos.

A Proteína C Reativa mostrou-se significantemente aumentada em 13 amostras do

soro de indivíduos com SPCVH (mediana de 5,69 mg/dL; amplitude 0,30 – 17,38;

p=0,0001). Entretanto, não se observou diferença quando os 13 indivíduos foram divididos

com base na evolução clínica (cura ou óbito) e na época da coleta amostral em relação ao

início dos sintomas (p>0,05). Estes dados são mostrados na Tabela 10.

Cura Óbito

100

200



SPCVH controles

100



p= 0,4458

*p=0,0182

SPCVH

Cura Óbito

100

200



SPCVH controles

100



p= 0,4458

*p=0,0182

SPCVH

Tabela 10: Concentrações da proteína C Reativa em amostras de soro de indivíduos com a

SPCVH.

N° Paciente Coleta da Amostra Evolução Concentração de Proteína C Reativa

(mg/dL)

Valor de referência:

0 – 0,5

1 JMP 12 dias cura 8,12

2 NRC 5 dias cura 5,69

3 AOC <7 dias cura 17,38

4 ACC 15 dias cura 6,00

5 NVTS 5 dias cura 7,57

6 AGN 6 dias cura 6,09

7 AM >7 dias cura 0,30

8 CEC >7 dias (post-morten) óbito 0,56

9 JBA 6 dias cura 3,14

10 MBFN 2 dia óbito 8,66

11 MACG 5 dias (1° amostra) cura 1,07

12 MACG 10 dias (2° amostra) cura 2,22

13 GSP 5 dias cura 3,74

4.3. Correlação entre citocinas e destas com parâmetros clínico-laboratoriais

Análises de regressão linear para as citocinas que induzem síntese de outras

citocinas e de outros mediadores inflamatórios foram realizadas no grupo SPCVH. A

relação entre TNF- e IL-6 não se mostrou significante (p=0,0844). Entretanto, observou-

se uma tendência a correlação negativa entre estas citocinas (r=-0,5715; Figura 14).

Também, não se observou relação linear entre IL-6 e proteína C reativa (r= -0,5820;

p=0,2256).

A relação IL-12 e IFN- foi linear e direta (r= 0,9384; p<0,0001; Figura 15A), assim

como a relação IL-10 e IL-12 (r= 0,7473; p=0,0052, Figura 15B). A relação entre IFN- e o

TNF  também foi linear e direta (r= 0,9043; p= 0,0020; Figura 16A). Achado semelhante

foi observado para a relação IFN- e TNF-, mas sem significância (r=0,5605; p=0,0580;

Figura 16 B).

Figura 14: Análise de regressão linear entre as concentrações de TNF e IL-6, no grupo do

SPCVH.

Figura 15: Análises de regressão linear entre as concentrações de IL-12 e IFN-γ (A) e IL-

10 (B) no grupo do SPCVH.

Observou-se significante relação linear direta entre teores de IL-10 com IFN-γ (r=

0,7978; p=0,0002) e IL-10 e TNF- (r= 0,8271; p=0,0009; Figuras 16C e 17). Entretanto,

não foi observada associação significante entre TNF- e IL-10 (r= -0,2408; p=0,5325).

0 250 500 750 1000

IL-12

IFN



*p<0,0001

0 250 500 750 1000

100

200

300

400

500

IL-12

IL-10

*p=0,0052

10 15 20 25 30

-1000

1000

2000

TNF 

IL-6

p=0,0844

10 15 20 25 30

-1000

1000

2000

TNF 

IL-6

p=0,0844

Figura 16: Análises de regressão linear entre as concentrações de IFN-γ e: TNF-α (A)

TNF- (B) e IL-10 (C), no grupo do SPCVH.

Figura 17: Análise de regressão linear entre as concentrações de TNF-β e IL-10 no grupo

do SPCVH.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0

IFN

TNF



*p=0,0020

0 20 40 60 80

IFN 

TNF



p=0,0580

0 10 20 30 40 50 60 70 80

100

200

300

400

500

600

IFN 

IL-10

*p=0,0002

0 10 20 30 40 50 60

100

200

300

400

500

TNF 

IL-10

*p=0,0009

A relação dos teores de NO com os de TNF- não foi significante no grupo

SPCVH, embora tenha sido observada uma tendência para relação direta (r=0,3880;

p=0,2384; Figura 18 A). A relação de IL-6 com NO mostrou-se linear positiva e

significante (r=0,7417; p=0,0141; Figura 18B).

Figura 18: Análises de regressão linear entre as concentrações de NO e TNF- (A); e NO

e IL-6 (B), no grupo do SPCVH.

Finalmente, realizaram-se análises de regressão linear entre teores de citocinas e os

seguintes parâmetros clínico-laboratoriais de pacientes do grupo SPCVH: pressão arterial

média, hematócrito, número de leucócitos e de plaquetas por mm

de sangue e pressão de

oxigênio (Tabela 11).

0 250 500 750 1000 1250 1500

IL-6

*p=00141

10 15 20 25 30

100

150

200

TNF

p=0.2384

0 250 500 750 1000 1250 1500

IL-6

*p=00141

0 250 500 750 1000 1250 1500

IL-6

*p=00141

10 15 20 25 30

100

150

200

TNF

p=0.2384

Tabela 11: Parâmetros clínico-laboratoriais de 17 indivíduos do grupo SPCVH

Iniciais Data coleta

após início dos

sintomas

Hemató-

crito

Leucócitos

/mm

Plaquetas

/mm

P.A

mm Hg

P.A.

média

Mm Hg

SOBREVIVENTES

1 J.M.P 12 dias 44 24.000 72.000 120 x 80 93,3 82,0

2 N.R.C. 5 dias 55 18.600 111.000 80 x 50 60,0 48,6

3 A.C.C. 15 dias 44 8.900 244.000 110 x 70 83,3 -

4 N.V.T.S. 5 dias 50 8.600 75.000 90 x 60 70,0 73,4

5 J.B.A 6 dias 37,8 - 87.000 140 x 90 106,6 79,0

6a M.A.C.G. 1°

amostra

5 dias 33,2 31.900 59.000 110 x 60 76,6 -

6b M.A.C.G. 2°

amostra

10 dias 33,4 15.400 100.000 110 x 80 90,0 -

7 P.C.A. <7 dias 40 6.900 74.000 110 x 70 83.3 -

8 A.G.N. 6 dias 42 6.600 83.000 110 x 70 83,3 56,7

9 A.M. >7 dias 44 6.800 71.000 120 x 80 93.3 -

10 J.V.N. 28 dias 44 9.400 84.000 110 x 80 90,0 128,0

11 G.S.P. 5 dias 60 20.600 44.000 - 46,0

12 A.J.S. 3 dias 57 11.500 59.000 100 x 80 86,6 59,5

13 A.S.P. <7 dias 43 4.100 138.000 90 x 60 70,0 -

FATAIS

14 C.E.C. >7 dias 51 10.100 - - - 76,6

15 A.V.V.F. 8 dias 61 16.700 82.000 70 x 50 56,6 49,4

16 M.B.F.N. 2 dias 76 28.000 63.000 88 x 44 58,6 39,0

17 Z.C.M. 8 dias 26 7.000 85.000 90 x 60 70,0 25,0

Observou-se correlação positiva significante entre valores do hematócrito e níveis

de: IFN-γ (r= 0,5985; p= 0,0184; Figura 19A), IL-10 (r= 0,6962; p=0,0027; Figura 19B),

IL-12 (r=0,6647; p= 0,0257; Figura 19C) e IL-2R (r= 0,7539; p= 0,0190; Figura 19D).

Os teores de TNF-β correlacionaram-se positivamente com os valores de

hematócrito (r=0,7348; p=0,0100; Figura 20A) e negativamente com a média da pressão

arterial (r= -0,8260; p=0,0061; Figura 20B).

Figura 19: Correlações positivas significantes, no grupo SPCVH, entre as concentrações

de IFN-γ (A), IL-10 (B), IL-12 (C) e IL-2R (D) e os valores de hematócrito, por Regressão

linear.

Figura 20: Correlação positiva significante entre TNF-β e valores de hematócrito (A); e

Correlação negativa entre TNF-β e a média da pressão arterial (B) no grupo SPCVH.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

IFN  pg/mL

Hematócrito %

0 250 500 750 1000

IL-12 pg/mL

Hematócrito %

*p=0,0184

*p=0,0027

*p=0,0257

0 100 200 300 400 500

IL-10 pg/mL

Hematócrito %

*p=0,0190

0 1000 2000 3000 4000

IL-2R u/mL

Hematócrito %

0 10 20 30 40 50 60 70 80

IFN  pg/mL

Hematócrito %

0 250 500 750 1000

IL-12 pg/mL

Hematócrito %

*p=0,0184

*p=0,0027

*p=0,0257

0 100 200 300 400 500

IL-10 pg/mL

Hematócrito %

*p=0,0190

0 1000 2000 3000 4000

IL-2R u/mL

Hematócrito %

0 10 20 30 40 50 60

100

110

120

TNF- pg/mL

média P.A. mm Hg

0 10 20 30 40 50 60

TNF- pg/mL

Hematócrito %

*p=0,0100

*p=0,0061

0 10 20 30 40 50 60

100

110

120

TNF- pg/mL

média P.A. mm Hg

0 10 20 30 40 50 60

TNF- pg/mL

Hematócrito %

*p=0,0100

*p=0,0061

Os teores de IL-6 e os de IFN-, correlacionaram-se negativamente com a média da

pressão arterial, embora este último não tenha sido considerado significante (r= -0,7895,

p=0,0347 e r= -0,5493, p=0,0518, respectivamente; Figuras 21A e B).

Os níveis de IL-10 correlacionaram-se negativamente com a média da pressão

arterial nos pacientes do grupo SPCVH (r= -0,5615; p=0,0367; Figura 21C). Inversamente,

os níveis de TGF- correlacionaram-se positivamente com a média da pressão arterial

(r=0,6084; p=0,0358; Figura 21 D).

Figura 21: Correlações negativas entre a média da pressão arterial e IL-6 (A); IFN- (B) e

IL-10 (C). Correlação positiva entre TGF- e a média da pressão arterial (D), no grupo

SPCVH.

As concentrações plasmáticas de IL-2R correlacionaram-se negativamente com a

pressão de oxigênio (r= -0,7599; p=0,0474; Figura 22A). Achado similar foi a tendência à

0 10 20 30 40 50

100

110

120

TGF- ng/mL

média P.A. mmHg

0 10 20 30 40

100

IL-6 pg/mL

média P.A. mm Hg

*p=0,0347

0 10 20 30 40 50 60 70 80

100

110

120

IFN  pg/mL

média P.A. mmHg

p=0,0518

*p=0,0358

0 100 200 300 400 500

100

110

120

IL-10 pg/mL

média P.A. mmHg

*p=0,0367

0 10 20 30 40 50

100

110

120

TGF- ng/mL

média P.A. mmHg

0 10 20 30 40

100

IL-6 pg/mL

média P.A. mm Hg

*p=0,0347

0 10 20 30 40 50 60 70 80

100

110

120

IFN  pg/mL

média P.A. mmHg

p=0,0518

*p=0,0358

0 100 200 300 400 500

100

110

120

IL-10 pg/mL

média P.A. mmHg

*p=0,0367

correlação negativa entre teores de TNF-β e pressão de oxigênio, embora sem significância

(r= -0,6852; p=0,0894; Figura 22B).

Figura 22: Correlações negativas entre a pressão de oxigênio e IL-2R (A) e TNF- (B), no

grupo SPCVH.

4.4. Análises de polimorfismo genético

4.4.1. Tipificação do HLA-A

Dos 27 participantes do grupo SPCVH, 21 tiveram o DNA sanguíneo extraído e

analisado quanto ao polimorfismo de HLA-A. Dos outros 6 participantes não foi possível

obter DNA para análises de HLA. Um gel de eletroforese mostrando amplicons de alelos

do HLA-A, -B e -Cw é mostrado na Figura 23. Os alelos HLA-A de cada participante do

grupo SPCVH são mostrados na Tabela 12. As frequências dos alelos HLA-A no grupo

SPCVH foram comparadas com aquelas de 1245 indivíduos do grupo controle

(SANSALONI, 2005) pelo teste exato de Fisher e são mostradas na Tabela 13.

0 1000 2000 3000 4000

100

150

IL-2R U/mL

2 mm Hg

0 10 20 30 40 50 60

100

150

TNF- pg/mL

2 mm Hg

p=0,0894*p=0,0474

0 1000 2000 3000 4000

100

150

IL-2R U/mL

2 mm Hg

0 10 20 30 40 50 60

100

150

TNF- pg/mL

2 mm Hg

p=0,0894*p=0,0474

O alelo HLA-A*80 foi observado em 4,8 % dos participantes do grupo SPCVH e

em 0,1% nos do grupo controle, esta diferença mostrou-se significante (p=0,0329). A este

valor foi aplicada a correção de Bonferroni, multiplicando-se o valor de p pelo número de

alelos HLA-A encontrados no grupo SPCVH, igual a 15. O valor corrigido de p (pc) foi

0,4935, portanto não significativo. Entretanto, o Odds ratio (OR) foi de 62,200 indicando

que indivíduos que apresentam o alelo HLA-A*80 apresentam probabilidade 62,2 vezes

maior de desenvolver a doença do que aqueles sem este alelo. O intervalo de confiança (IC)

entre 1 e >1 indica o OR (o qual denota susceptibilidade) é significante. Além disso, o IC

indica que existe 95% de probabilidade de que o dado seja válido para a população.

Entretanto, a Fração Etiológica (FE) foi de 0,04, indicando que o alelo HLA-A*80

contribui em cerca de 4% para a susceptibilidade da população à SPCVH.

Os alelos HLA-A *33, *34, *44, *69 e *74, não foram encontrados em nenhum dos

indivíduos do grupo SPCVH (Tabela 13) apesar de estarem presentes nos controles como

mostra a Tabela 14. As frequências de cada alelo encontrado nos controles foram

comparadas com zero, a frequência encontrada no grupo SPCVH e o p obtido, >0,05,

sugere não haver resistência à SPCVH nos portadores destes alelos.

Uma análise combinada dos resultados de HLA-A foi realizada pelo teste exato de

diferenciação populacional, em que todos os alelos no grupo SPCVH foram comparados

em conjunto com aqueles do grupo controle e não observou-se diferença significante entre

os grupos (p=0,33710  0,00695 SD).

Figura 23: Amplicons da SSP-PCR HLA-classe I (A, B, Cw). Posição H1, controle

negativo; posições A1, B1, H2; C4, F6, G6, H6, A7, E8, D9, D10, E11, F11 e G12

amplicons de diferentes alelos HLA de um indivíduo (N.R.C.) com SPCVH; todas as linhas

exceto 1, amplicon de 750pb do controle interno da reação.

Tabela 12: Alelos do HLA-A, -B, Cw e –DR, e genotipos do TNF- -308, nos indivíduos

do grupo SPCVH, evidenciando em negrito os alelos que exibiram significante diferença no

grupo.

HLA-A HLA-B

HLA-Cw HLA-DR TNF-308 N° Iniciais

alelos alelos alelos Alelos genotipos

1 A. B. A*02, A*24 B*07, B*44 Cw*07, Cw*07 DRB1*3, DRB1*16, DR51, DR52 G

2 O. N. S. A*29, A*31 B*35, B*39 Cw*04, Cw*07 DRB1*9, DRB1*16, DR51, DR53 G G

3 N. R. C. A*23, A*24 B*15, B*49 Cw*03, Cw*07 DRB1*8, DRB1*11, DR52 G G

4 J. M. P. A*36, A*24 B*15, B*15 Cw*03, Cw*08 DRB1*4, DRB1*15, DR51, DR53 G G

5 G. Q.S. A*02, A*66 B*35, By

†

Cw*04, Cwy

†

DRB1*4, DRy, DRB1*53 G G

6 A. C.C. A*11, A*24 B*51, By

†

Cw*01, Cw*15 DR13, DR14, DR52 G

7 J.V.N A*02, A*24 B*44, B*35 Cw*04, Cw*05 DB1*16, DRB1*11, DRB3, DR5 G

8 N.V.T.S. A*02, A*03 B*57, By

†

Cw*02, Cw*07 DRB1*03, DRB1*15, DRB3, DR5 G G

9 J.R.G.C. A*01, A*02 B*51, B*15 Cw*03, Cw*15 DRB1*16, DRB1*04, DRB4, DRB5 G G

10 T.R.O. A*02, A*03 B*35, B*50 Cw*04, Cw*07 DRB1*11, DRB1*07, DRB3, DRB4 G

11 A.G.N. A*01, A*02 B*14, B*57 Cw*05, Cw*07 DRB1*01, DRB1*04, DRB4 G G

12 A.V.V.F A*02, A*24 B*27, B*35 Cw*02, Cw*03 DRB1*14, DRB1*13, DRB3 G G

13 A.S.P. A*02, A*68 B*51, B*58 Cw*03, Cw*16 DRB1*13, DRB1*11, DRB3 G

14 A.M. A*01, A*02 B*58, B*35 Cw*04, Cw*07 DRB1*13, DRB1*07, DRB3, DRB4 G G

15 C.E.C A*30, A*32 B*40, B*53 Cw*04, Cw*02 DRB1*11, DRB1*13, DRB3 G G

16 J.B.A. A*01, A*80 B*44, B*08 Cw*07, Cw*04 DRB1*03, DRB1*07, DR52, DR53 G

17 M.B.F.N. A*26, A*68

B*38, B*78

Cw*16, Cw*12 DRB1*04, DRB1*13, DR52, DR53 G G

18 M.A.C.G A*02, A*29 B*44, By

†

- DRB1*07, DRAy, DR53 G G

19 J.F.S.B. A*03, A*24 B*15, B*44 - DRB1*01, DRB1*11, DR52 G

20 D.Z. A*11, A*26 B*38, B*27 - DRB1*11, DRy, DR52 G G

21 J.P.M. A*01, A*26 B*08, B*38 - DRB1*03, DRB1*08, DR52 G

†

y: Indica que não foi possível tipificar o segundo alelo HLA, o que deve-se uma das seguintes razões: ou o conjunto de primers utilizado

pelo kit de tipificação não contempla o alelo em questão, ou trata-se de homozigoze do alelo que foi tipificado.

H G F E D C B A

Tabela 13: Freqüência de alelos HLA-A em indivíduos do grupo SPCVH e no grupo

controle.

Alelo HLA-A Frequência do

alelo

Frequência do

alelo

SPCVH

n=21

Controles

n=1245

Valor de p

Valor de pc

Odds ratio Intervalo de

confiança

A*01

5 (23,8%) 245 (19,7%) 0,5861 - 1,276 0,4627 a 3,516

A*02

11 (52,4%) 530 (42,6%) 0,3822 - 1,484 0,6255 a 3,521

A*03

3 (14,3%) 239 (19,2%) 0,7813 - 0,7015 0,2049 a 2,402

A*11

2 (9,5%) 142 (11,4%) 1,0000 - 0,8176 0,1884 a 3,548

A*23

1 (4,8%) 136 (10,9%) 0,7189 - 0,4077 0,05426 a 3,064

A*24

7 (33,3%) 246 (19,8%) 0,1627 - 2,030 0,8107 a 5,086

A*26

3 (14,3%) 69 (5,5%) 0,1125 - 2,841 0,8167 a 9,879

A*29

2 (9,5%) 121 (9,7%) 1,0000 - 0,9778 0,2250 a 4,3250

A*30

1 (4,8%) 131 (10,5%) 0,7161 - 0,4252 0,05657 a 3,196

A*31

1 (4,8%) 82 (6,6%) 1,0000 - 0,7091 0,09395 a 5,353

A*32

1 (4,8%) 73 (5,9%) 1,0000 - 0,8027 0,1062 a 6,068

A*36

1 (4,8%) 11 (0,9%) 0,1826 - 5,609 0,6905 a 45,566

A*66

1 (4,8%) 30 (2,4%) 0,4083 - 2,025 0,2630 a 15,593

A*68

2 (9,5%) 112 (9,0%) 0,7133 - 1,065 0,2448 a 4,632

A*80 1 (4,8%) 1 (0,1%) 0,0329** 0,4935 62,200 3,754 a 1030,5

Aplicando-se a correção de Bonferroni, apenas os valores de p<0,0033 são considerados significantes em nível de 5%.

Tabela 14: Alelos HLA ausentes no grupo SPCVH , mas presentes no grupo controle, e

suas respectivas frequências

Alelo

Frequência no grupo controle

HLA-A n=1245

*33

82 (6,6%)

*34

17 (1,4%)

*44

1 (0,08%)

*69

5 (0,4%)

HLA-B n=1248

*13

39 (3,1%)

*18

125 (0,1%)

*37

23 (1,8%)

*41

15 (1,2%)

*42

29 (2,3%)

*45

46 (3,6%)

*46

1 (0,08%)

*47

3 (0,2%)

*48

13 (1,0%)

*52

36 (2,8%)

*54

1 (0,08%)

*55

29 (2,3%)

*56

9 (0,7%)

*67

1 (0,08%)

*73

7 (0,6%)

*81

3 (0,2%)

HLA-Cw n=119

22 (18,4%)

*14

7 (5,8%)

*17

4 (3,3%)

HLA-DRB1 n=1241

*12

44 (3,5%)

*10

34 (2,7%)

4.4.2. Tipificação do HLA-B

O DNA genômico de 21 indivíduos do grupo SPCVH, foi analisado para o

polimorfismo do HLA-B e estes alelos, para cada participante do grupo SPCVH, são

mostrados na Tabela 12. As frequências dos alelos HLA-B nos indivíduos do grupo

SPCVH foram comparadas com aquelas de 1248 indivíduos controle (SANSALONI,

2005), analisadas pelo teste exato de Fisher. Estes resultados são mostrados na Tabela 15.

O alelo de HLA-B*38 foi observado em 14,3% dos participantes no grupo SPCVH, e em

3,4% no grupo controle, diferença significante (p= 0,0375) que não foi confirmada após a

correção de Bonferroni para 17 alelos (pc=0,6375). Também, a OR de 4,671 indica que

indivíduos que apresentam o alelo HLA-B*38 apresentam probabilidade 4,6 vezes maior de

desenvolver a doença do que aqueles sem este alelo. O IC (1,325 a 16,463) denota

susceptibilidade e significância. Ainda, a FE de 0,11 indica que o alelo HLA-B*38

contribui cerca de 11% para a susceptibilidade da população à SPCVH.

O alelo HLA-B*78 foi observado em 4,8% dos participantes no grupo SPCVH e em

0,3% no grupo controle (p= 0,0802). A OR de 15,550 indica que indivíduos que

apresentam o alelo HLA-B*78 tem probabilidade 15,5 vezes maior de desenvolver a

SPCVH que indivíduos sem este alelo. O IC, embora de grande amplitude (1,662 a 145,48),

indica que a OR é significativa, e a FE 0,04 indica que o alelo HLA-B*78 contribui cerca

de 4% para a susceptibilidade da população à SPCVH. Analisando pontualmente as

tipificações HLA, observou-se que um participante do grupo SPCVH (M.B.F.N., Tabela

12) expressava HLA-B*38 e B*78, dois alelos sugestivos de susceptibilidade à SPCVH. O

genótipo HLA-B 38/78 teve frequência zero nos 1248 indivíduos do grupo controle, a qual,

quando comparada à frequência 4,8% (1/21) no grupo SPCVH foi considerada significativa

(p=0,0165 pelo teste exato de Fisher), sendo OR 182,71, e IC de 7,220 a 4623,5.

Entretanto, a FE de 0,04, sugere que este genótipo contribui com apenas 4% para a

susceptibilidade populacional à SPCVH, probabilidade igual aquela encontrada para o alelo

HLA-B*78 sozinho e menor do que aquela para o alelo HLA-B*38.

Os alelos HLA-B *13, *18, *37, *41, *42, *45, *46, *47, *48, *52, *54, *55, *56,

*67, *73, *81 e *82 não foram encontrados em nenhum dos indivíduos do grupo SPCVH

(Tabela 15) apesar de estarem presentes nos do grupo controle nas frequências indicadas na

Tabela 14. As frequências de cada um destes alelos no grupo controle e no grupo SPCVH

mostrou-se similar (p >0,05).

A análise global dos resultados do HLA-B pelo teste exato de diferenciação

populacional no grupo SPCVH comparados a aqueles do grupo controle, não se mostrou

diferente (p=0,69135  0,00796 SD).

Tabela 15: Freqüência de alelos HLA-B no grupo SPCVH e no grupo controle.

Alelo

HLA-B

Frequência

do alelo

Freqüência

do alelo

SPCVH

n=21

Controles

n=1248

Valor de p

Valor de pc

Odds ratio Intervalo de

confiança

B*07

1 (4,8%) 157 (12,3%) 0,5019 - 0,3475 0,04628 a 2,608

B*08

2 (9,5%) 137 (11,0%) 1,0000 - 0,8536 0,1966 a 3,706

B*14

1 (4,8%) 121 (9,7%) 0,7132 - 0,4657 0,06193 a 3,502

B*15

5 (23,8%) 181 (14,5%) 0,2178 - 1,842 0,6665 a 5,092

B*27

2 (9,5%) 49 (3,9%) 0,2052 - 2,576 0,5833 a 11,373

B*35

6 (28,6%) 286 (22,9%) 0,6003 - 1,345 0,5172 a 3,500

B*38 3 (14,3%) 43 (3,4%) 0,0375** 0,6375 4,671 1,325 a 16,463

B*39

1 (4,8%) 70 (5,6%) 1,0000 - 0,8414 0,1113 a 6,364

B*40

1 (4,8%) 88 (7,0%) 1,0000 - 0,6591 0,08739 a 4,971

B*44

5 (23,8%) 287 (23,0%) 1,0000 - 1,046 0,3800 a 2,882

B*49

1 (4,8%) 72 (5,8%) 1,0000 - 0,8167 0,1080 a 6,174

B*50

1 (4,8%) 62 (5,0%) 1,0000 - 0,9565 0,1262 a 7,246

B*51

3 (14,3%) 207 (16,6%) 1,0000 - 0,8382 0,2446 a 2,872

B*53

1 (4,8%) 59 (4,7%) 1,0000 - 1,008 0,1329 a 7,640

B*57

2 (9,5%) 92 (7,4%) 0,6650 - 1,323 0,3033 a 5,769

B*58

2 (9,5%) 63 (5,0%) 0,2928 - 1,980 0,4510 a 8,691

B*78 1 (4,8%) 4 (0,3%) 0,0802 - 15,550 1,662 a 145,48

Aplicando-se a correção de Bonferroni, apenas os valores de p<0,0029 são considerados significantes em nível de 5%.

4.4.3. Tipificação do HLA-Cw

Dentre os 21 indivíduos do grupo SPCVH que tiveram DNA sanguíneo extraído

para testes com alelos HLA, por falta de reagentes, estudou-se HLA-Cw em apenas 17

indivíduos. Os alelos HLA-Cw de cada participante do grupo SPCVH são mostrados na

Tabela 12. As frequências alélicas do HLA-Cw nos do grupo SPCVH foram comparadas às

obtidas de 119 indivíduos do grupo controle e são mostradas na Tabela 16. O alelo de

HLA-Cw*03 foi observado em 29,4% dos participantes do grupo SPCVH e em 9,2%

daqueles do grupo controle (p= 0,0308). O valor corrigido por Bonferroni (10 alelos)

mostrou diferença estatisticamente não diferente para os 2 grupos. Entretanto, o valor da

Odds ratio de 4,091 indica que indivíduos apresentando o alelo HLA-Cw*03 apresentam

probabilidade 4 vezes maior de desenvolver SPCVH que indivíduos sem este alelo. O IC

(1,215 a 13,775) denota susceptibilidade e indica que a OR é significativa. Também, a FE

de 0,22 indica que o alelo HLA-Cw*03 contribui cerca de 22% para a susceptibilidade

populacional à SPCVH. Nenhum dos demais alelos HLA-Cw apresentaram frequências

diferentes no grupo SPCVH em relação ao grupo controle (p>0,05; Tabela 16).

Os alelos HLA-Cw *06, *14, *17, e *18 não foram encontrados em nenhum dos

indivíduos do grupo SPCVH apesar de presentes nos do grupo controle, nas frequências

indicadas na Tabela 14. As frequências de cada um destes alelos nos controles foram

comparadas a zero, frequência observada no grupo SPCVH (p >0,05).

Na análise global dos resultados do HLA-Cw pelo teste exato de diferenciação

populacional, comparou-se os alelos no grupo SPCVH e no controle sem a observacão de

diferença significante (p=0,26529  0,00544 SD).

Tabela 16: Freqüência de alelos HLA-Cw em indivíduos com SPCVH e no grupo controle

Alelos HLA-

Frequência do alelo Valor de p Valor de pc

Odds ratio Intervalo de

confiança

SPCVH

n=17

controles

n= 119

Cw*01

1 (5,9%) 2 (1,6%) 0,3322 - 3,656

0,3132 a 42,678

Cw *02

3 (17,6%) 10 (8,4%) 0,2087 - 2,336 0,5729 a 9,523

Cw *03 5 (29,4%) 11 (9,2%) 0,0308** 0,3080 4,091 1,215 a 13,775

Cw *04

7 (41,2%) 38 (31,9%) 0,5822 - 1,492 0,5273 a 4,222

Cw *05

2 (11,8%) 8 (6,7%) 0,6132 - 1,850 0,3585 a 9,547

Cw *07

9 (52,9%) 60 (50,4%) 1,0000 - 1,106 0,3996 a 3,062

Cw *08

1 (5,9%) 13 (10,9%) 1,0000 - 0,507 0,06232 a 4,167

Cw *12

1 (5,9%) 16 (13,4%) 0,6950 - 0,402 0,04985 a 3,247

Cw *15

2 (11,8%) 6 (5,0%) 0,2621 - 2,511 0,4638 a 13,594

Cw *16

2 (11,8%) 19 (15,9%) 1,0000 - 0,702 0,1482 a 3,324

Aplicando-se a correção de Bonferroni, apenas os valores de p<0,005 são considerados significantes em nível de 5%.

4.4.4. Tipificação do HLA-DR

O DNA genômico de 21 indivíduos do grupo SPCVH, foi analisado quanto ao

polimorfismo do HLA-DR. Um gel de eletroforese mostrando os amplicons de alelos do

HLA-DR é mostrado na Figura 24. Os alelos HLA-DR de cada participante do grupo

SPCVH são mostrados na Tabela 12. As frequências dos alelos do HLA-DRB1 no grupo

SPCVH foram comparadas às frequências obtidas em 1241 indivíduos do grupo controle

(SANSALONI, 2005), analisadas pelo teste exato de Fisher e são mostradas na Tabela 17.

Nenhuma das frequências dos alelos HLA-DRB1 no grupo SPCVH foi considerada

diferente daquelas observadas no grupo controle.

Os alelos HLA-DRB1 *12 e *10 não foram encontrados em nenhum dos indivíduos

do grupo SPCVH apesar de estarem presentes nos controles nas frequências indicadas na

Tabela 14. As frequências destes alelos nos controles foram comparadas às dos pacientes

do grupo SPCVH mostrando-se sem diferença (p >0,05).

A análise global dos resultados do HLA-DRB1 pelo teste exato de diferenciação

gênica, comparando grupo SPCVH com o controle, não mostrou diferença significante

(p=0,72340  0,00428).

Figura 24: Amplicons da SSP-PCR HLA-DR. Linha H1, controle negativo; linhas D1, B3,

D3 e F3 amplicons alelo-específicos do HLA-DR de um indivíduo com SPCVH; todas as

linhas exceto 1, amplicon de 750pb do controle interno da reação.

Tabela 17: Freqüência de alelos HLA-DR no grupo SPCVH e no grupo controle

Alelo

HLA-DRB1

Frequência do

alelo

Frequência do

alelo

SPCVH

n=21

Controles

n=1241

Valor de p

Odds ratio

Intervalo de

confiança

*01 2 (9,5%)

238 (19,2%) 0,4006 0,4436 0,1026 a 1,918

*03 4 (19,0%)

247 (19,9%) 1,0000 0,9469 0,3157 a 2,840

*04 5 (23,8%)

245 (19,7%) 0,5871 1,270 0,4608 a 3,502

*07 4 (19,0%)

338 (27,2%) 0,4699 0,6286 0,2100 a 1,882

*08 2 (9,5%)

115 (9,3%) 1,0000 1,031 0,2370 a 4,482

*09 1 (4,8%)

33 (2,7%) 0,4391 1,830 0,2384 a 14,054

*11 7 (33,3%)

296 (23,8%) 0,3084 1,596 0,6382 a 3,993

*13 6 (28,6%)

309 (24,9%) 0,7991 1,206 0,4639 a 3,137

*14 2 (9,5%)

92 (7,4%) 0,6661 1,315 0,3014 a 5,734

*15 2 (9,5%)

239 (19,2%) 0,4008 0,4413 0,1021 a 1,908

*16 4 (19%)

100 (8,0%) 0,0876 2,685 0,8861 a 8,134

Finalmente, foi realizada uma análise global, combinado-se simultaneamente todos

os loci HLA (-A, -B, Cw, DR) e do TNF- (-308) (item 4.4.5) entre o grupo SPCVH e o

grupo controle, análise multi-locus (over all loci), e não foi encontrada diferença

significante (0,5865).

4.4.5. Tipificação dos genótipos de TNF- na posição –308 da região promotora

750pb

200pb

750pb

175pb

250pb

200pb

H G

E D C B A

Realizaram-se tipificações dos genótipos de TNF- -308 em 21 indivíduos do grupo

SPCVH, em 96 indivíduos do grupo de soropositivos e em 100 indivíduos do grupo

controle. As tipificações dos genótipos de TNF- -308 em 21 indivíduos do grupo SPCVH

constam na Tabela 12. O genótipo G/G foi o mais frequente nos três grupos estudados,

sendo as frequências de 61,9%, 91,7% e 75,0%, respectivamente, enquanto que o genótipo

A/A foi o menos frequente (frequências de 0 a 1%) (Tabela 18). A frequência do alelo

TNF- -308A (nos genótipos G/A e A/A) do TNF-, chamado alelo hipersecretor ou

TNF-2, no grupo SPCVH foi comparada às frequências nos grupos soropositivos e

controle (Figura 25). A frequência do alelo hipersecretor no grupo SPCVH, de 38,1%, foi

significantemente maior que a encontrada no grupo de soropositivos (p= 0,0015). A OR

6,769, indica que indivíduos com o alelo TNF-2 tem probabilidade 6,7 vezes maior de

desenvolver SPCVH que indivíduos sem este alelo. O IC (2,164 a 21,171) denota

susceptibilidade e indica que a OR é significativa. A FE de 0,32, indica que o alelo TNF-2

contribui cerca de 32% para a susceptibilidade populacional à SPCVH. Entretanto, não

houve diferença quando compararam-se os grupos SPCVH e controle (p=0,1864).

Tabela 18: Freqüência de genótipos de TNF- -308 nos grupos SPCVH, soropositivos

e controles.

Gene Genótipo SPCVH

n=21

Soropositivos

n=96

Controles

n= 100

TNF--308

G/G

13 (61,9%) 88 (91,7%) 75 (75,0%)

G/A

8 (38,1%) 7 (7,3%) 24 (24,0%)

A/A

0 (0,0%) 1 (1,0%) 1 (1,0%)

Figura 25: Frequência do alelo hipersecretor do TNF (TNF-2) em indivíduos dos grupos:

SPCVH, soropositivos, e controles.

4.4.6. Tipificação dos genótipos/fenótipos das citocinas IL-10 –1082, -819, -592; IFN

+874; IL-6 -174 e TGF codons 10, 25

Foram realizadas análises de polimorfismos nos genes das citocinas IL-10

(promotor –1082, -819, -592); IFN (intron 1 +874); IL-6 (promotor -174) e TGF (codons

10, 25), nas posições do genoma humano indicadas entre parênteses. Estas análises foram

realizadas em 21 amostras do DNA do grupo SPCVH, com exceção da IL-6 que foi

realizada apenas em 20 amostras. Também, foram realizadas em 96 amostras do grupo

soropositivos e em 100 amostras do grupo controle, com exceção da genotipagem do TGF-

 do qual participaram apenas 33 controles. Um gel de eletroforese da tipificação de

citocinas de um paciente do grupo SPCVH é mostrado na Figura 26. Para a comparação

entre os diferentes grupos estudados utilizou-se dados dos fenótipos da produção de cada

citocina. Os fenótipos de produção das citocinas TNF-, IL-6, IL-10, TGF- e IFN- de

(8/21)

38,1%

(8/96)

8,3%

(25/100)

25%

*p=0,0015

p=0,1864

Soropositivos SPCVH Controles

100

TNF-2

TNF-1

n° indivíduos

cada indivíduo do grupo SPCVH constam na Tabela 20, bem como a informação se estes

indivíduos tiveram a quantificação da citocina realizada no soro, a qual foi usada nas

correlações genotipagem vs quantificação (item 4.2.). As freqüências dos fenótipos de

citocinas nos diferentes grupos estudados são mostradas na Tabela 19. A comparação das

frequências dos fenótipos das citocinas IL-10, IFN-, IL-6 e TGF- entre os três grupos não

mostrou diferenças significantes (p>0,05).

Figura 26: Amplicons da SSP-PCR de citocinas. Posição H1, controle negativo; posições

B1, C1, D1, E1 primers para alelos do TGF; posições F1 e G1 primers para alelos do

TNF; posições E2, F2, G2, H2 e A1, primers para alelos da IL-10; posições A2, B2, C2 e

D2 primers para alelos da IL-6. Amplicons alelo-específicos das citocinas de um indivíduo

com SPCVH são observados em todas as posições, exceto C1, G1, G2; todas as linhas

exceto 1, amplicon de 750pb do controle interno da reação.

Tabela 19: Freqüência de fenótipos de citocinas nos grupos SPCVH, soropositivos e

controles.

Gene Fenótipo de

produção da

citocina

SPCVH

n=21

Soropositivos

n=96

Valor de p Controles

n= 100

Valor de p

IL-10 Alto

1 (4,8%) 6 (6,3%) 1,0000 9 (9%) 1,0000

interm.

14 (66,6%) 46 (47,9%) 0,0920 44 (44%) 0,0912

Baixo

6 (28,6%) 44 (45,8%) 0,3351 47 (47%) 0,1501

IFN-

Alto

1 (4,8%) 23 (23,9%) 0,0704 18 (18%) 0,1906

interm.

9 (42,8%) 43 (44,8%) 1,0000 47 (47%) 0,8123

Baixo

11 (52,4%) 30 (31,3%) 0,0799 35 (35%) 0,1466

IL-6* alto

19 (95,0%) 89 (92,7%) 1,0000 94 (94%) 1,0000

baixo

1 (5,0%) 7 (7,3%) 1,0000 6 (6%) 1,0000

TGF-**

Alto

15 (71,4%) 80 (83,3%) 0,2239 16 (48,5%) 0,1577

interm.

5 (23,8%) 13 (13,6%) 0,3133 8 (24,2%) 1,0000

Baixo

1 (4,8%) 3 (3,1%) 0,5519 9 (27,3%) 0,0691

*O número de indivíduos do grupo SPCVH tipificados para IL-6 foi igual a 20.

** O número de controles tipificados para TGF- foi igual a 33.

H G F E D C B A

Tabela 20: Fenótipos de produção das citocinas TNF-, IL-6, IL-10, TGF- e IFN- em

cada indivíduo do grupo SPCVH informando as quantificações séricas que foram

realizadas.

iniciais Evolução Fenótipos de produção da citocina

N°

Quantificação da citocina

no soro

TNF-

Il-6 IL-10

TGF- IFN-

1 A. B. Cura NR* Alto NR* Interm. Alto Alto

2 O. N. S. Cura

TNF-, IL-6

Baixo Alto Interm. Interm. Baixo

3 N. R. C. Cura

TNF-, IL-6, IL-10,

TGF-, IFN-

Baixo Alto Baixo Alto Interm.

4 J. M. P. Cura

TNF-, IL-6, IL-10,

TGF-, IFN-

Baixo Baixo Interm. Alto Baixo

5 G. Q.S. Cura NR* Baixo Alto Alto Interm. Interm.

6 A. C.C. Cura

IL-10, TGF-, IFN-

Alto Alto Interm. Alto Interm.

7 J.V.N Cura

TNF-, IL-6, IL-10,

TGF-, IFN-

Alto Alto Interm. Alto Interm.

8 N.V.T.S. Cura

TNF-, IL-6, IL-10,

TGF-, IFN-

Baixo Alto Interm. Alto Interm.

9 J.R.G.C. Óbito

TNF-, IL-6, TGF-

Baixo Alto Baixo Alto Baixo

10 T.R.O. Óbito NR* Alto Alto Baixo Alto Baixo

11 A.G.N. Cura

TNF-, IL-6, IL-10,

TGF-, IFN-

Baixo Alto Interm. Interm. Baixo

12 A.V.V.F Óbito

TNF-, IL-10, TGF-

Baixo Alto Interm. Alto Interm.

13 A.S.P. Cura NR* Alto Alto Baixo Alto Interm.

14 A.M. Cura

TNF-, IL-6, IL-10,

TGF-, IFN-

Baixo Alto Baixo Baixo Interm.

15 C.E.C Óbito

TNF-, IL-6, IL-10,

TGF-, IFN-

Baixo Alto Interm. Alto Baixo

16 J.B.A. Cura

IL-10, TGF-, IFN-

Alto Alto Interm. Alto Baixo

17 M.B.F.N. Óbito

IL-10, TGF-, IFN-

Baixo Alto Interm. Interm. Baixo

18 M.A.C.G Cura

IL-10, TGF-, IFN-

Baixo Alto Interm. Interm. Interm.

19 J.F.S.B. Cura NR* Alto Alto Interm. Alto Baixo

20 D.Z. Cura NR* Baixo Alto Interm. Alto Baixo

21 J.P.M. Cura NR* Alto Alto Baixo Alto baixo

*NR: Não realizado

4.4.7. Tipificação dos Sistemas de Alo-antígenos Plaquetários Humanos HPA-1, HPA-

4 e HPA-6

O DNA genômico de 21 indivíduos do grupo SPCVH, foi analisado quanto ao

polimorfismo dos Alo-antígenos Plaquetários Humanos HPA-1, HPA-4 e HPA-6. Um gel

de eletroforese mostrando os amplicons de HPA é mostrado na Figura 27. Os alelos HPA

de cada paciente do grupo SPCVH são mostrados na Tabela 21. As frequências genotípicas

dos sistemas HPA-1, HPA-4 e HPA-6 nos indivíduos do grupo SPCVH foram comparadas

a aquelas observadas em 96 indivíduos do grupo soropositivos e em 50 do grupo controle,

analisadas pelo teste exato de Fisher e são mostradas na Tabela 22. Não se observaram

diferenças entre a freqüência de genótipos HPA no grupo SPCVH e nos outros grupos

estudados pelo teste exato de Fisher (Tabela 22).

Tabela 21: Alelos dos Sistemas Antígenos Plaquetários HPA-1, -4 e –6 nos indivíduos do

grupo SPCVH.

HPA-1 HPA-4 HPA-6 N° iniciais

alelos Alelos alelos

1 A. B. 1A 1B 4A - 6A -

2 O. N. S. 1A - 4A - 6A -

3 N. R. C. 1A 1B 4A - 6A -

4 J. M. P. 1A - 4A - 6A -

5 G. Q.S. 1A - 4A - 6A -

6 A. C.C. 1A - 4A - 6A -

7 J.V.N 1A - 4A - 6A -

8 N.V.T.S. 1A - 4A - 6A -

9 J.R.G.C. 1A - 4A - 6A -

10 T.R.O. 1A - 4A - 6A -

11 A.G.N. 1A - 4A - 6A -

12 A.V.V.F 1A 1B 4A - 6A -

13 A.S.P. 1A - 4A - 6A -

14 A.M. 1A - 4A - 6A -

15 C.E.C 1A 1B 4A - 6A -

16 J.B.A. 1A - 4A - 6A -

17 M.B.F.N. 1A - 4A - 6A -

18 M.A.C.G - 1B 4A - 6A -

19 J.F.S.B. 1A - 4A - 6A -

20 D.Z. 1A - 4A - 6A -

21 J.P.M. 1A 1B 4A - 6A -

Tabela 22: Freqüência de genotipos de três sistemas HPA nos grupos: SPCVH,

soropositivos e controles

SPCVH

n=21

soropositivos

n=96

Valor de p controles

n= 50

Valor de p

HPA 1a/1a

15 (71,4%) 62 (64,6%)

0,6198

37 (74%)

1,0000

HPA 1a/1b

5 (23,8%) 32 (33,3%)

0,6033

13 (26%)

1,0000

HPA 1b/1b

1 (4,8%) 2 (2,1%)

0,4507

0,2958

HPA 4a/4a

21 (100%) 96 (100%)

49 (98%)

1,0000

HPA 4a/4b

0 0

1 (2%)

1,0000

HPA 4b/4b

0 0

HPA 6a/6a

21(100%) 96 (96%)

50 (100%)

HPA 6a/6b

0 0

HPA 6b/6b

0 0

0 -

Figura 27:

Amplicons da ASP-PCR para Antígenos Plaquetários Humanos. A) linhas 2, 4,

6, 8 e 10 amplicons de 244pb do alelo HPA-1A de amostras do grupo controle; linha 15,

amplicon de 252pb do alelo HPA-4B da mesma amostra citada na linha 14 (indivíduo

heterozigoto); linhas 3, 5, 7, 9, 11 e 13 reações negativas com primer HPA-4 B.

B) linha 8

amplicon de 244pb do alelo HPA-1B

da mesma amostra mostrada em “A” linha 8

(indivíduo heterozigoto); linhas 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15 reações negativas com primer HPA-6

B. Nas fotos A e B, em todas as linhas, exceto linha 1, amplicons de 434pb correspondente

ao controle interno (HGH) das reações; linha 1, marcador de tamanho molecular.

500pb

400pb

300pb

200pb

434pb

252pb

244pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

500pb

400pb

300pb

200pb

434pb

244pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

4.5. Correlação entre genotipagem e quantificação de citocinas

Para melhor avaliar se os polimorfismos nos genes das citocinas TNF-, IL-6, IL-

10, TGF- e IFN- de fato estão associados a diferentes médias de produção destas

citocinas, os resultados obtidos nas tipificações dos genes de citocinas (itens 4.4.5 e 4.4.6)

no grupo SPCVH e quando possível, no grupo soropositivos, foram analisados em conjunto

com os resultados das quantificações das citocinas (item 4.2.) nos soros dos participantes

destes grupos.

Para o TNF-, dos 21 participantes do grupo SPCVH que tiveram a genotipagem

realizada, somente 10 tiveram TNF- quantificado no soro (Tabela 20), e dos 96

participantes do grupo soropositivos que tiveram a genotipagem realizada, somente 12

tiveram a quantificação do TNF- no soro. Assim, foram correlacionados os resultados de

genotipagem vs quantificação de 10 indivíduos do grupo SPCVH e de 12 indivíduos do

grupo soropositivos. Para tanto, divididiu-se os grupos conforme o resultados da

genotipagem: se possuíam o alelo hipersecretor do TNF- (subgrupo denominado “Alto

produtor”), ou se possuíam o alelo comum do TNF- (subgrupo denominado “Baixo

produtor”) e foram comparados em relação à quantificação do TNF-, conforme mostra a

Figura 28. Dentre os 10 participantes do grupo SPCVH, somente um foi alocado no

subgrupo “Alto produtor”, enquanto nove foram alocados no subgrupo “Baixo produtor”.

Dentre os 12 participantes do grupo Soropositivos, somente um foi alocado no subgrupo

“Alto produtor”, enquanto 11 foram alocados no subgrupo “Baixo produtor”. Utilizando o

teste de comparações múltiplas de Dunn as médias das quantificações do TNF nos

subgrupos “SPCVH Alto produtor” e “SPCVH Baixo produtor” foram comparadas, bem

como as médias nos grupos “Soropositivos Alto produtor” e “Soropositivos Baixo

produtor”, e não foram encontradas diferenças (p>0,05) entre os pares analisados (Figura

28), nem quando cada subgrupo foi combinado individualmente com os demais subgrupos

(p>0,05).

Figura 28: Correlação dos dados de genotipagem da região promotora do TNF- -308 com

dados da quantificação do TNF- no soro de 10 participantes do grupo SPCVH e de 12

participantes do grupo soropositivos. Os grupos foram divididos conforme resultado da

genotipagem, se portadores do alelo hipersecretor (“Alto produtor”) ou do alelo comum

(“Baixo produtor”).

Para IL-6, dos 20 participantes do grupo SPCVH, 9 tiveram quantificação da IL-6 no

soro (Tabela 20), e dos 96 participantes do grupo Soropositivos com genotipagem

realizada, somente 11 tiveram a quantificação de IL-6 no soro. Assim, foram

correlacionados os resultados de genotipagem vs quantificação de 9 indivíduos do grupo

SPCVH e de 11 indivíduos do grupo Soropositivos. Também, estes indivíduos, de ambos

os grupos, foram divididos conforme o resultados da genotipagem e comparados em

relação à quantificação da IL-6 conforme mostra a Figura 29.

Dentre os 9 participantes do

grupo SPCVH, 8 foram alocados no subgrupo “alto produtor”, e somente 1 foi alocado no

TNF



pg/mL

p >0,05

SPCVH

Alto produtor

SPCVH

Baixo produtor

Soropositivos

Alto produtor

Soropositivos

Baixo produtor

Genotipagem TNF- -308

p >0,05

TNF



pg/mL

p >0,05

SPCVH

Alto produtor

SPCVH

Baixo produtor

Soropositivos

Alto produtor

Soropositivos

Baixo produtor

Genotipagem TNF- -308

p >0,05

subgrupo “Baixo produtor”. Dentre os 11 participantes do grupo Soropositivos, 8 foram

alocados no subgrupo “Alto produtor”, enquanto 3 foram alocados no subgrupo “Baixo

produtor”. Utilizando o teste de comparações múltiplas de Dunn as médias das

quantificações da IL-6 nos subgrupos “SPCVH Alto produtor” e “SPCVH Baixo produtor”

foram comparadas, bem como as médias nos grupos “Soropositivos Alto produtor” e

“Soropositivos Baixo produtor”, e não foram encontradas diferenças estatísticas (p>0,05)

entre os pares analisados (Figura 29), nem quando cada subgrupo foi combinado

individualmente com os demais subgrupos (p>0,05).

Figura 29: Correlação dos dados de genotipagem do gene da IL-6 na posição -174 com

dados da quantificação da IL-6 no soro de 9 participantes do grupo SPCVH e de 11

participantes do grupo Soropositivos. Os grupos foram divididos conforme resultado da

genotipagem, se portadores do alelo hipersecretor (“Alto produtor”) ou do alelo comum

(“Baixo produtor”).

Para IL-10, dos 21 participantes do grupo SPCVH que tiveram a genotipagem

realizada, somente 12 tiveram a quantificação da IL-10 no soro (Tabela 20). Contudo, para

IL-10, não foi possível analisar a correlação genotipagem/quantificação no grupo

soropositivos porque estes não tiveram a citocina quantificada. Assim, foram

750

1000

1250

1500

IL-6 pg/mL

p >0,05

SPCVH

Alto produtor

SPCVH

Baixo produtor

Soropositivos

Alto produtor

Soropositivos

Baixo produtor

Genotipagem IL-6 -174

p >0,05

750

1000

1250

1500

IL-6 pg/mL

p >0,05

SPCVH

Alto produtor

SPCVH

Baixo produtor

Soropositivos

Alto produtor

Soropositivos

Baixo produtor

Genotipagem IL-6 -174

p >0,05

correlacionados os resultados de genotipagem vs quantificação de 12 indivíduos do grupo

SPCVH, divididos conforme o resultados da genotipagem: se possuíam alelo de produção

intermediária da IL-10 (subgrupo denominado “Produtor intermediário”), ou se possuíam o

alelo de baixa produção da IL-10 (subgrupo denominado “Baixo produtor”) e comparados

em relação à quantificação da IL-10 conforme mostra a Figura 30.

Nenhum dos indivíduos

do grupo SPCVH que tiveram a IL-10 quantificada eram portadores do alelo de alta

produção da IL-10 (Tabela 20). Dentre os 12 participantes do grupo SPCVH, 10 foram

alocados no subgrupo “Produtor intermediário”, e somente 2 foram alocados no subgrupo

“Baixo produtor”. Utilizando o U-test de Mann-Whitney as médias das quantificações da

IL-10 nos subgrupos “SPCVH Produtor intermediário” e “SPCVH Baixo produtor” foram

comparadas e não foram encontradas diferenças estatísticas (p=0,7576) entre os subgrupos

analisados (Figura 30).

Figura 30: Correlação dos dados de genotipagem na região promotora do gene da IL-10

nas posições –1082, -819, -592 com dados da quantificação da IL-10 no soro de 12

participantes do grupo SPCVH. O grupo foi dividido conforme resultado da genotipagem,

se portadores de polimorfismos associados com produção intermediária (“Produtor

intermediário”) ou associados com baixa produção (“Baixo produtor”) da citocina.

100

200

300

400

500

IL-10 pg/mL

SPCVH

Baixo produtor

SPCVH

Produtor Intermediário

Genotipagem IL-10 -1082

p=0,7576

100

200

300

400

500

IL-10 pg/mL

SPCVH

Baixo produtor

SPCVH

Produtor Intermediário

Genotipagem IL-10 -1082

p=0,7576

Para TGF-, dos 21 participantes do grupo SPCVH que tiveram a genotipagem

realizada, somente 13 tiveram a quantificação do TGF-, no soro (Tabela 20). Contudo,

para TGF-, não foi possível analisar a correlação genotipagem/quantificação no grupo

soropositivos porque estes não tiveram a citocina quantificada no soro. Assim, foram

correlacionados os resultados de genotipagem vs quantificação de 13 indivíduos do grupo

SPCVH, divididos conforme o resultados da genotipagem: se possuíam alelo de alta

produção do TGF- (subgrupo denominado “Alto produtor”), de produção intermediária

(subgrupo denominado “Produtor intermediário”), ou se possuíam o alelo de baixa

produção do TGF- (subgrupo denominado “Baixo produtor”) e comparados em relação à

quantificação do TGF- conforme mostra a Figura 31. Dentre os 13 participantes do grupo

SPCVH, 9 foram alocados no subgrupo “Alto produtor”, 2 no subgrupo “Produtor

intermediário”, e apenas 1 no subgrupo “Baixo produtor”. Utilizando o teste de Kruskal-

Wallis as médias das quantificações do TGF- nos 3 subgrupos foram comparadas e não

foram encontradas diferenças estatísticas entre os mesmos (p=0,7427; Figura 31).

Figura 31: Correlação dos dados de genotipagem nos códons 10 e 25 do gene do TGF-

com dados da quantificação do TGF- no soro de 13 participantes do grupo SPCVH. O

grupo foi dividido conforme resultado da genotipagem, se portadores de polimorfismos

associados com alta produção (“Alto produtor”), com produção intermediária (“Produtor

intermediário”) ou com baixa produção (“Baixo produtor”) da citocina.

Para IFN-, dos 21 participantes do grupo SPCVH que tiveram a genotipagem

realizada, somente 11 tiveram a quantificação do IFN- no soro (Tabela 20). Assim como

para IL-10 e TGF-, para o IFN-, não foi possível analisar a correlação

genotipagem/quantificação no grupo soropositivos porque estes não tiveram a citocina

quantificada no soro. Deste modo, foram correlacionados os resultados de genotipagem vs

quantificação de 11 indivíduos do grupo SPCVH, divididos conforme o resultados da

genotipagem: se possuíam alelo de produção intermediária do IFN- (subgrupo

denominado “Produtor intermediário”), ou se possuíam o alelo de baixa produção do IFN-

(subgrupo denominado “Baixo produtor”) e comparados em relação à quantificação do

IFN- conforme mostra a Figura 32.

Nenhum dos indivíduos do grupo SPCVH que tiveram

IFN- quantificado eram portadores do alelo de alta produção do IFN- (Tabela 20). Dentre

TGF-



ng/mL

SPCVH

Alto produtor

SPCVH

Baixo produtor

SPCVH

Produtor Intermediário

Genotipagem TGF- códons 10 e 25

p=0,7427

TGF-



ng/mL

SPCVH

Alto produtor

SPCVH

Baixo produtor

SPCVH

Produtor Intermediário

Genotipagem TGF- códons 10 e 25

p=0,7427

os 11 participantes do grupo SPCVH, 6 foram alocados no subgrupo “Produtor

intermediário”, e 5 no subgrupo “Baixo produtor”. Utilizando o U-test de Mann-Whitney

as médias das quantificações do IFN- nos 2 subgrupos foram comparadas e não foram

encontradas diferenças estatísticas entre os mesmos (p=0,6388; Figura 32).

Figura 32:

Correlação dos dados de genotipagem no gene do IFN- na posição +874 com

dados da quantificação do IFN- no soro de 11 participantes do grupo SPCVH. O grupo foi

dividido conforme resultado da genotipagem, se portadores de polimorfismos associados

com produção intermediária (“Produtor intermediário”) ou associados com baixa produção

(“Baixo produtor”) da citocina.

IFN-



pg/mL

SPCVH

Baixo produtor

SPCVH

Produtor Intermediário

Genotipagem IFN- +874

p=0,6388

IFN-



pg/mL

SPCVH

Baixo produtor

SPCVH

Produtor Intermediário

Genotipagem IFN- +874

p=0,6388

5. DISCUSSÃO

Há pouco mais de uma década, a hantavirose tem se estabelecido como uma

zoonose Pan-Americana, tendo ocorrido no Brasil mais de 700 casos conhecidos de

SPCVH. Considerando-se o caráter emergente e altamente letal desta doença, nos últimos

anos, têm-se empenhado esforços para desvendar o mecanismo pelo qual hantavírus

causam a SPCVH, buscando conhecer fatores prognósticos e um tratamento para a

síndrome. Sabe-se que alterações funcionais dos receptores celulares causadas pela ligação

do hantavírus, bem como a indução específica de citocinas, influem na patogênese da

SPCVH (GAVRILOVSKAYA et al, 2002; KSIAZEK et al, 1995; MORI et al, 1999;

SAGGIORO, 2004). Também, uma associação da suceptibilidade genética do hospedeiro

com SPCVH têm sido sugerida (KOSTER et al, 2001). Apesar disso, a patogênese da

SPCVH não é totalmente conhecida, embora existam evidências de que vários mecanismos

patogênicos possam estar nela envolvidos. Considerando a necessidade de melhor conhecer

os meios pelos quais hantavírus levam à SPCVH e a inexistência de estudos sobre este tema

no Brasil, que possui espécies de hantavírus distintas daquelas estudadas na América do

Norte, Argentina e Chile, este trabalho objetivou investigar, no país, aspectos da patogênese

da SPCVH, como a produção de citocinas por linfócitos T e monócitos ativados e a sua

associação com polimorfismos genéticos dos pacientes.

Para o estudo, inicialmente, foi necessário diagnosticar a SPCVH em pacientes com

a suspeita clínica (Figura 4). Assim, utilizando uma RT-PCR tripla, entre 2003 e 2006,

diagnosticou-se SPCVH em 18 pacientes. Foram 14 sobreviventes e 4 casos fatais. Estes

pacientes foram incluídos no grupo SPCVH deste trabalho juntamente com outros 7

indivíduos que tiveram o diagnóstico laboratorial realizado pelo Laboratório de Referência,

no Instituto Adolpho Lutz de São Paulo, utilizando técnica sorológica de ELISA e ainda,

incluiram-se 2 casos fatais que tiveram diagnóstico por imunohistoquímica de tecido

pulmonar. Portanto, foram estudados 27 indivíduos com SPCVH, sendo 21 sobreviventes e

6 casos fatais. Nesta casuística, a letalidade de 28,6%, mostrou-se inferior a aquela

observada na região de Ribeirão Preto, de 50% (21/42) (L.T.M. FIGUEIREDO,

comunicação pessoal). Isto porque, na fase inicial do trabalho tivemos mais acesso a coletas

amostrais em pacientes internados com SPCVH do que naqueles cujo diagnóstico foi

realizado post-morten. Também, naqueles casos em que não foi possível realizar a coleta

amostral na fase aguda da doença, a coleta de sangue – neste caso, exclusivamente para as

análises genéticas - pôde ser realizada em 5 indivíduos por ocasião do retorno para consulta

médica no HCFMRP-USP. Assim, dos 27 participantes do grupo SPCVH, foi possível

obter soro de fase aguda para quantificação de citocinas em apenas 21. Outra limitação

encontrada para a realização das quantificações de citocinas foi a coleta de volume

insuficiente do soro. Pacientes com SPCVH apresentam-se hemoconcentrados, em

decorrência do extravamento de líquidos da luz dos vasos sanguíneos para o interstício e

alvéolos pulmonares (NOLTE et al, 1995; FIGUEIREDO et al, 2000; PETERS e KHAN,

2002) e a recuperação de soro após centrifugação do sangue é baixa nestes materiais. Por

isso, o insuficiente volume sérico, limitou as análises de citocinas às realizadas nos soros

apresentados na Tabela 9.

Para melhor discriminar o papel das citocinas na clínica e evolução da SPCVH

decidiu-se comparar os teores de citocinas segundo a evolução para a cura ou óbito.

Também, os pacientes foram agrupados segundo a ocasião da coleta, antes ou após o sétimo

dia de doença, porque, em geral, até o 6° dia do início dos sintomas os pacientes ainda

apresentavam hemoconcentração e portanto, poderiam ser classificados como em plena

síndrome de extravasamento capilar. Também, sabe-se que 4 a 5 dias seria o tempo

necessário para que linfócitos virgens (naïve) fossem ativados completando a expansão

clonal (JANEWAY Jr., et al 2002), e ainda, 7 dias seriam suficientes para ocorrer mudança

fenotípica nos linfócitos T CD8+ vírus-específicos, de CD45RA+ para CD45RO+ (van

LIER et al, 2003), indicando ativação celular (APPAY e ROWLAND-JONES, 2004).

Deste modo, citocinas efetoras oriundas dos linfócitos vírus-específicos ativados poderiam

modificar o cenário da resposta imune a partir do 7° dia de doença.

Este é o primeiro trabalho quantificando citocinas séricas em pacientes com

SPCVH e nele, buscou-se pesquisar citocinas classicamente envolvidas nas respostas

imunes de padrão TH1 e TH2, bem como aquelas com ação regulatória. Assim, buscamos

conhecer o padrão de resposta imune adquirida nesta doença. A participação de citocinas na

patogênese da SPCVH foi previamente estudada por MORI et al (1999) e SAGGIORO

(2004) que, por imunohistoquímica, demonstraram a presença de células produtoras de

citocinas em tecidos de pulmão e coração de casos fatais por SPCVH.

Neste trabalho, a citocina pró-inflamatória TNF- mostrou-se em concentração

plasmática mediana aumentada nos pacientes com SPCVH (Figura 5A). O TNF- é

produzido principalmente por macrófagos, embora inúmeras outras células possam produzi-

lo, entre elas, monócitos, células NK e linfócitos T e B (MELDRUM, 1998; ZHANG e

TRACEY, 1998). Trata-se de um mediador tanto da imunidade inata quanto da adquirida e

é também, um importante elo entre as respostas imunes adquiridas e a inflamação aguda,

produzindo inúmeros efeitos biológicos (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000). A

correlação positiva entre os níveis de TNF- e IFN- observada neste trabalho (Figura

16A) exemplifica este elo de ligação entre as respostas imunes, além de corroborar o efeito

estimulador do IFN- na produção do TNF- (PHILIP e EPSTEIN 1986; ABBAS,

LICHTMAN e POBER, 2000). O TNF- pode induzir o rearranjo dos filamentos de actina

em células endoteliais levando ao dano celular e à perda das tight junctions, o que causa

extravasamento capilar (SATO et al, 1986; STOLPEN et al, 1986; STEPHENS et al, 1988).

Também, o TNF- exerce efeito negativo na contratilidade miocárdica, além de hipotensão

(PARKER et al, 1984; MELDRUM, 1998). O TNF- tem sido sugerido como um dos

principais mediadores solúveis envolvido no choque cardiogênico que ocorre na SPCVH

(ZAKI et al, 1995; NOLTE et al, 1995; PETERS e KHAN, 2002). Neste contexto,

SAGGIORO (2004), que estudou alterações cardíacas em necrópsias de 7 pacientes com

SPCVH, descreveu a ocorrência de miocardite onde predominavam macrófagos produtores

de TNF- em interstício miocárdico destes casos fatais. Tais achados reforçaram a idéia de

que TNF-, produzido localmente nos tecidos de pulmão e principalmente coração, seja o

mediador solúvel responsável pelo choque na SPCVH (ZAKI et al, 1995; NOLTE et al,

1995; MORI et al, 1999; SAGGIORO, 2004). Entretanto, no presente estudo, teores

plasmáticos de TNF- não foram diferentes entre os casos fatais de SPCVH e os que

evoluíram para cura (Figura 5C). Inclusive, os níveis de TNF- foram ligeiramente maiores

no grupo que sobrevivente. Tais achados sugerem que embora presente e desempenhando

papel na resposta imune contra hantavírus, o TNF- não seria a única e talvez, nem a

principal citocina envolvida na depressão cardíaca e choque observados na SPCVH. Para

fundamentar tal hipótese, analisamos 3 doenças que levam ao choque e que têm como

mediador principal deste evento o TNF-. Na Síndrome de Choque do Dengue (DSS)

observaram-se níveis plasmáticos de TNF- mais elevados nos casos fatais (154 pg/mL)

que nos sobreviventes (79 pg/mL) (BETHELL et al, 1998). Na Febre Hemorrágica por

Ebola (EHF), uma enfermidade em que também ocorre extravasamento capilar com

infecção de células endoteliais, observaram-se níveis plasmáticos médios de TNF- em

sobreviventes de 113 pg/mL, e naqueles que foram a óbito, de 236 pg/mL (VILLINGER et

al, 1999). Ainda, em pacientes com choque séptico bacteriano, os níveis plasmáticos

médios de TNF- nos casos fatais foram mais elevados (140 pg/mL) que nos sobreviventes

(123 pg/mL) (PINSKY et al, 1993). Chama atenção que os teores do TNF- nos pacientes

com DSS, EHF, e choque séptico foram bem mais elevados que aqueles observados nos

indivíduos com SPCVH analisados neste trabalho incluindo os sobreviventes (média 17,8

pg/mL e mediana 16,4 pg/mL) e casos fatais (média 15,2 pg/mL e mediana 11,1 pg/mL)

(Figura 5C). Portanto, estes dados sugerem que outros mediadores envolvidos seriam mais

importantes que o TNF-, na indução do choque na SPCVH.

Uma citocina associada e que age em sinergia com o TNF- é a IL-1. A IL-1, que

existe nas formas IL-1 e IL-1, é produzida principalmente por monócitos/macrófagos

ativados, embora células mesangiais, células NK, linfócitos B, linfócitos T, neutrófilos,

células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, astrócitos e células da micróglia

possam também produzi-la (VILCCEK, 1998). A IL-1 é uma citocina altamente

inflamatória e à semelhança do TNF-, possui efeitos biológicos na dependência da

quantidade liberada (DINARELLO, 1998; ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000). A IL-1

em baixa concentração media apenas a inflamação local, ao passo que, quando secretada

em alta concentração, cai na corrente sanguínea e produz efeitos inflamatórios sistêmicos

(ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000). No presente trabalho, as concentrações séricas de

IL-1 foram investigadas no grupo SPCVH, entretanto, com a exceção de uma amostra

neste grupo, níveis de IL-1 não foram detectados (<5 pg/mL) (Figura 8B). Considerando

que os efeitos inflamatórios potentes da IL-1, fazem com que sua produção seja finamente

regulada pelo sistema imune, sendo fortemente inibida pela IL-10 (DINARELLO, 1998;

ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; FIORENTINO et al, 1991a), é possível que este

mecanismo inibitório ocorra na SPCVH, uma vez que altos níveis de IL-10 foram

encontrados no grupo SPCVH (Figura 11A). Por outro lado, a produção local de IL-1 nos

tecidos pode ter importância na patogênese da SPCVH, como foi sugerido por MORI et al

(1999), que observou grande número de células produtoras de IL-1 e IL-1 nos pulmões,

rins, fígado e baço de casos fatais da SPCVH. Embora células produtoras de IL-1 não

tenham ainda sido investigadas no coração de indivíduos com a SPCVH fatal, é possível

que elas estejam presentes também neste órgão, da mesma forma que as células produtoras

de TNF-, já evidenciadas em estudo anterior (SAGGIORO, 2004). Nossos achados

sugerem que somente quando a resposta imune/inflamatória é muito intensa, como parece

ter ocorrido com a paciente AVVS, um caso fatal de SPCVH que, curiosamente, exibiu

níveis modestos de IL-10 (22,06 pg/mL; Tabela 9), é que seria possível detectar IL-1 na

corrente sanguínea. Ademais, esta citocina, em conjunto com o TNF- e a IL-6, poderia

deprimir a função cardíaca na SPCVH, uma vez que tal efeito biológico da IL-1 é bem

conhecido (HOSENPUD, 1993; DINARELLO, 1996).

A IL-6 é uma citocina multifuncional, produzida por macrófagos, linfócitos T

ativados, células endoteliais, fibroblastos e outras células em resposta à IL-1 e em menor

extensão, ao TNF- (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000). Dentre os efeitos da IL-6 na

resposta imune estão, indução da diferenciação de linfócitos B em plasmócitos e de

linfócitos citotóxicos antígeno-específicos, bem como a manutenção de sua função

citolítica, a amplificação da capacidade citolítica das células NK, a indução da biosíntese de

proteínas de fase aguda pelos hepatócitos e além disso, funciona como citocina anti-

inflamatória (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; TAKAI et al, 1988; GALANDRINI

et al, 1991; LUGER et al, 1989; XING et al, 1998). No presente trabalho, níveis

significativos de IL-6 foram encontrados no soro dos indivíduos do grupo SPCVH (Figura

7A). Interessantemente, quando este grupo foi divido em casos fatais e sobreviventes e

entre eles comparou-se a concentração média plasmática de IL-6, níveis significantemente

maiores foram observados nos que foram à óbito (Figura 7C). Em trabalho utilizando

modelo experimental murino, no qual avaliou-se a capacidade da IL-6 em induzir falência

miocárdica, sua administração diária, por 7 dias, produzindo concentração sérica de

765pg/mL, produziu falência cardíaca e discreta atrofia muscular esquelética (JANSSEN et

al, 2005). No presente estudo, os casos fatais por SPCVH apresentaram mediana 1.119,8

pg/mL de IL-6 no soro. Níveis séricos de IL-6 semelhantes e até menores, foram

encontrados em pacientes que foram à óbito por síndrome da angústia respiratória aguda

(ARDS) (mediana 252 pg/mL e média 600 pg/mL), doença na qual ocorre falência

miocárdica (SCHUTTE et al, 1996). Um trabalho com indivíduos em choque séptico

mostrou, naqueles que desenvolveram falência de órgãos, concentração plasmática mediana

da IL-6 de 595 pg/mL (amplitude de 125 a 20.800 pg/mL) (TAKALA et al, 1999). Ainda,

observou-se que altas concentrações de IL-6 podem levar à dilatação miocárdica

(JANSSEN et al, 2005). Curiosamente, no grupo SPCVH aqui estudado, um dos

participantes (JVN, Tabelas 3 e 17) que exibiu um quadro atípico, de sintomatologia

prolongada (cerca de 1 mês de duração), apresentou cardiomegalia. Este poderia ser um

efeito da produção prolongada de IL-6. Ademais, outro efeito relevante da IL-6 é a indução

da fosfolipase A

enzima envolvida na síntese de prostaglandina e leucotrieno, e também

na hipotensão do choque séptico (CROWL et al, 1991; PFEILSCHIFTER et al, 1997;

PEILOT et al, 2000). Tal mecanismo poderia explicar porque, no presente trabalho, os

níveis da IL-6 correlacionaram-se à queda da pressão arterial (Figura 21A).

Portanto, os resultados obtidos com a IL-6 neste estudo sugerem para esta citocina

um papel importante, inibindo a função cardíaca e induzindo hipotensão na SPCVH.

Assim, a magnitude da expressão de IL-6 poderia ser determinante na evolução dos

indivíduos infectados por hantavírus.

Neste trabalho, foi também avaliada a relação existente entre TNF- e IL-6. Sabe-se

que o TNF- atua sobre células mononucleares estimulando a secreção de IL-1 e IL-6 na

circulação, numa cascata ordenada de produção (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000).

Entretanto, diferente do esperado, os resultados obtidos para TNF- e IL-6 tenderam a uma

correlação negativa (Figura 14), o que pode ser explicado pelo efeito inibitório que a IL-6

exerce sobre o TNF- (ADERKA et al, 1989; SCHINDLER et al, 1990; TILG et al, 1994).

A IL-6 inibe a produção do TNF- in vitro e in vivo, além de induzir a síntese do

antagonista do TNF-, TNFsRp55 (ADERKA et al, 1989; BEMELMANS et al, 1993;

TILG et al, 1994). Entretanto, a capacidade inibitória da IL-6 sobre a produção do TNF-

parece ser confinada à periferia, ou seja, à produção sistêmica, não afetando a produção

local tecidual (SANTO et al, 1997). Considerando que em casos fatais de SPCVH

observou-se número elevado de células produtoras de TNF- e IL-6 em pulmões (MORI et

al, 1999) e de células produtoras do TNF- no coração (SAGGIORO, 2004), mais estudos

seriam necessários avaliando nestes locais o papel inibitório da IL-6 sobre o TNF-.

Ainda, sobre o papel do TNF- e da IL-6 na SPCVH, uma visão contrária aos

efeitos deletérios do TNF- e até da IL-6, poderia ser especulada. A inibição da produção

do TNF- pela expressão aumentada da IL-6, foi associada com redução do clearance viral

na infecção por vírus da encefalomiocardite (EMCV) e com agravamento da miocardite

(TANAKA et al, 2001). Sabe-se que o TNF-, em conjunto com IFN-, tem efeito benéfico

no clearance viral (CZARNIECKI, 1993; GUIDOTTI e CHISARI, 2001). Sugere-se que

baixos níveis de IL-6 seriam benéficos à resposta imune na infecção viral, enquanto que

níveis excessivos seriam deletérios (TANAKA et al, 2001). Isto tem sido demonstrado em

modelos experimentais murinos nos quais verificou-se que animais deficientes de IL-6 são

mais susceptíveis à infecção viral e que a administração de baixas doses da IL-6, mas não

de alta doses, reduz esta susceptibilidade (LEBLANC et al, 1999; TANAKA et al, 2001).

Entretanto, na infecção por hantavírus tais efeitos não puderam ainda ser testados em

modelo animal (HOOPER et al, 2001; MILAZZO et al, 2002) e melhor compreensão do

balanço TNF- / IL-6 na SPCVH poderia ser obtida correlacionando-se teores destas

citocinas com carga virêmica. Também poder-se-ia correlacionar a intensidade da

imunomarcação de hantavírus em pulmão e coração dos casos fatais com número de células

produtoras destas citocinas nestes tecidos.

Finalmente, as análises de variância para TNF- e IL-6 entre os subgrupos SPCVH

“cura e coleta <7 dias”, “cura e coleta >7 dias”, “óbito e coleta <7 dias” e “óbito e coleta >7

dias” não mostraram diferenças (Figuras 5B e 7B), provavelmente pelo pequeno número de

pacientes analisados em cada grupo. Os subgrupos “óbito e coleta <7 dias” e “óbito e coleta

>7 dias” somaram juntos apenas 3 indivíduos, não permitindo cálculo do desvio padrão, o

que, provavelmente, prejudicou a análise estatística dos mesmos. Portanto, nos pacientes

com SPCVH, não foi possível detectar diferenças em níveis de TNF- e IL-6 antes e após

7 dias do início dos sintomas.

Avaliamos, também, os níveis plasmáticos de NO e proteína C reativa, dois

mediadores inflamatórios que têm produção associada às respostas inatas de macrófagos e à

produção de TNF- e IL-6 (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; JANEWAY Jr., et al

2002; MELDRUM, 1998). Contrário ao esperado, os níveis plasmáticos de NO no grupo

SPCVH não foram diferentes daqueles encontrados no grupo controle (Figura 13A),

chegando até a níveis ligeiramente menores no primeiro grupo. Entretanto, prejudica esta

análise o uso de medicamentos anti-hipertensivos, conhecidos por induzirem aumento de

NO sistêmico, por alguns dos indivíduos controle (KOHNO et al, 1999; SUDA et al, 2006).

Contudo, os maiores níveis de NO foram observados nos casos fatais de SPCVH (Figura

13B). Resultado semelhante foi observado por DAVIS et al (2002) em pacientes com

SPCVH, norte-americanos. Naquele estudo, os pacientes que necessitaram de entubação e

que foram a óbito mostraram maiores teores de NO em relação aos controles, o que não

ocorreu com os que tiveram doença branda (DAVIS et al, 2002). Ainda, células produtoras

de iNOS (enzima envolvida na biosíntese do NO) foram encontradas no miocárdio de casos

fatais por SPCVH no estudo realizado por SAGGIORO (2004). Também, nos pacientes

com SPCVH analisados no presente trabalho, encontramos correlação positiva entre teores

de IL-6 e NO (Figura 18B). Ambos mediadores estavam em maiores concentrações no

sangue dos indivíduos dos casos fatais. De fato, um dos mecanismos pelos quais a IL-6

exerce efeito inotrópico negativo é através da indução de NO (FINKEL et al, 1992). Não

observamos correlação entre TNF- e NO (Figura 18A). Este resultado foi inesperado, pois

sabe-se que o TNF- é um forte indutor de NO (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000;

JANEWAY Jr., et al 2002; MELDRUM, 1998; FINKEL et al, 1992). Aventamos que a

análise estatística neste caso tenha sido prejudicada pelo pequeno número de amostras

analisadas (11 amostras). O resultado obtido nos casos fatais de SPCVH do presente

trabalho, em acordo com os de DAVIS et al (2002) e SAGGIORO (2004), sugerem que

NO, quando produzido em excesso, pode contribuir para a gravidade da SPCVH e o óbito,

provavelmente, devido aos conhecidos efeitos cardio-depressores do NO (RUBANYI,

1998; FINKEL et al, 1992).

A proteína C reativa é uma proteína de fase aguda inflamatória produzida por

hepatócitos e regulada por inúmeros fatores, inclusive IL-1, TNF- e IL-6 (HIRANO,

1998; ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; JANEWAY Jr., et al 2002). Esta proteína é

produzida em resposta a infecção, queimaduras, trauma e neoplasias (ABBAS,

LICHTMAN e POBER, 2000), aumentando a susceptibilidade das células endoteliais à

citotoxicidade mediada por célula T e exercendo efeito pró-inflamatório direto nestas

células (NAKAJIMA et al, 2002; PASCERI et al, 2000). Neste trabalho, observamos níveis

elevados de proteína C reativa nos pacientes com SPCVH (Tabela 10). Níveis plasmáticos

elevados desta proteína foram observados em pacientes com choque séptico bacteriano

(mediana 19,3 mg/dL; amplitude 6,9 – 44,1) e em um paciente com falência múltipla de

órgãos por infecção com hantavírus PUUV. Neste paciente o aumento progressivo deste

mediador (de 4 mg/dL a 36 mg/dL) correlacionou-se com o agravamento dos sintomas, em

6 dias, da doença ao óbito (HOIER et al, 2006). Entretanto, no presente estudo, não

encontramos diferença nos teores de proteína C reativa entre sobreviventes e casos fatais

por SPCVH, sugerindo que este marcador inflamatório não teria valor prognóstico na

SPCVH.

Neste trabalho, a produção sistêmica de IFN- foi também avaliada. O IFN- e o

IFN- (IFNs do tipo I) são citocinas antivirais, diretamente induzidas pela infecção viral

(JANEWAY Jr. et al, 2002; KATZE et al, 2002). Os IFN do tipo I exercem seu efeitos anti-

virais por inúmeros mecanismos e são considerados a primeira linha de defesa nestas

infecções (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; KATZE et al, 2002). Apesar disso, no

presente trabalho, não foi detectado IFN- no soro dos pacientes com SPCVH (<3 pg/mL;

Tabela 9). Não há consenso sobre a produção de interferons do tipo I na infecção por

hantavírus (PENSIERO et al, 1992; TEMONEN et al, 1995; FRESE et al, 1996;

KANERVA et al, 1996; GEIMONEN et al, 2002; NAM et al, 2003; KRAUS et al, 2004;

KHAIBOULLINA et al, 2005a; PRESCOTT et al, 2005). Embora haja consenso de que a

proteína MxA-induzida por IFN seja expressa nas células infectadas por hantavírus, a

indução da transcrição do gene desta proteína e de outros genes ISG (interferon-stimulated

genes) parece ocorrer por uma via independente de IFN-/ (PRESCOTT et al, 2005).

Suportando nosso resultado, PENSIERO et al (1992) e KRAUS et al (2004) demonstraram

que hantavírus induz a produção de IFN- em células endoteliais, mas não IFN-.

PRESCOTT et al (2005) observaram que a infecção in vitro por hantavírus em células

endoteliais, não induz a transcrição dos genes de IFN-/. Entretanto, IFN- é induzido em

baixas concentrações, em monócitos/macrófagos infectados por PUUV in vitro

(TEMONEN et al, 1995). Também, altas concentrações de IFN- são produzidas por DCs

infectadas por vírus Hantaan in vitro (RAFTERY et al, 2002). Deste modo, a indução de

IFN- por hantavírus parece depender do tipo celular estudado. Portanto, a produção de

IFN- pelas DCs infectadas por hantavírus, se de fato ocorre in vivo, deve ser de forma

parácrina, no interior dos órgãos linfóides, uma vez que não foi detectada esta citocina na

circulação dos pacientes com SPCVH por nós estudados. Finalmente, caso haja produção

sistêmica de IFN-, isto ocorreria em fase precoce da infecção por hantavírus. Mais estudos

são necessários para esclarecer o papel do IFN- na SPCVH.

Além do TNF-, IL-1 e IL-6, outras citocinas pró-inflamatórias - como o TNF-,

IFN- e IL-12 - foram avaliadas no presente estudo. O TNF-, também chamado de

Linfotoxina-, é 30% homólogo ao TNF-, embora com alto nível de conservação na

estrutura tri-dimensional e compete com o TNF- pela ligação aos mesmos receptores de

superfície celular (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; WARE, SANTEE e GLASS,

1998). O TNF- tem efeitos semelhantes aos do TNF-, embora seja menos potente

(MELDRUM et al, 1998). Também, diferentemente do TNF- que é produzido

principalmente por macrófagos, o TNF- é produzido principalmente por linfócitos T

ativados (TH1), embora linfócitos B e células NK possam também produzi-lo (GRAY et al,

1984; WARE, SANTEE e GLASS, 1998). O TNF- é capaz de ativar macrófagos e

neutrófilos e é diretamente citotóxico para algumas células (JANEWAY Jr. et al, 2002). No

presente estudo, níveis elevados de TNF- foram encontrados no grupo SPCVH, apesar da

grande variação entre as amostras (amplitude de 0 a 54,45 pg/mL; Tabela 9), sendo a média

de 16,6 pg/mL e a mediana de 7,7 pg/mL (Figura 6A). Achado semelhante foi obtido na

quantificação do IFN-, em que apesar da mediana ser igual a zero, a concentração média

no grupo SPCVH foi de 6,49 pg/mL (amplitude de 0 a 67,23 pg/mL; Tabela 9; Figura 9A).

Não se encontrou diferenças estatísticas significantes para os níveis de TNF- e IFN- entre

os grupos SPCVH e controle, o que poderia ser explicado pelo pequeno número de

amostras analisadas no grupo SPCVH (n=17 e n=12, respectivamente) e principalmente

pelas diferentes fases da doença em que as coletas das amostras foram realizadas (de 2 a 28

dias a partir do início dos sintomas; Tabela 4). Apesar disso, sabe-se que o TNF- é

produzido coordenadamente com o IFN- por linfócitos TH1 (ABBAS, LICHTMAN e

POBER, 2000; JANEWAY Jr. et al, 2002) e esta correlação foi encontrada no presente

trabalho (Figura 16B). Este achado, somado à presença de níveis elevados de TNF- e IFN-

 em alguns dos pacientes analisados e a não detecção de IL-4 e IL-5 - citocinas produzidas

em condições TH2 (Tabela 9) - sugerem que a polarização da resposta imune na SPCVH é

para um padrão TH1.

A resposta TH1 favorece o clearance viral mas poderia produzir fenômenos

imunopatológicos que agravam a SPCVH. TERAJIMA et al (1999) observaram a

coincidência do edema pulmonar com a queda rápida da viremia, o que poderia refletir

estes efeitos paradoxais da resposta TH1 na SPCVH. No presente trabalho, também

observamos efeitos deletérios da resposta TH1 porque, altos níveis de TNF- e de IFN-

correlacionaram-se com a hipotensão (Figuras 20B e 21B) e a hemocentração (Figuras 20A

e 19A). Altos níveis de TNF- estiveram também correlacionados com a hipóxia (Figura

22B). Tais resultados mostram que estas citocinas efetoras da resposta TH1 correlacionam-

se com a gravidade da SPCVH.

Ademais, os eventos precoces da infecção por hantavírus no ser humano são

pobremente conhecidos (NICHOL, 2001). Considerando que o período de incubação da

doença é longo (14 a 17 dias é o mais frequente; YOUNG et al, 2000) e que anticorpos

estão presentes já no período prodrômico da doença, tanto das subclasses IgG3 e IgG2

quanto IgG1, isotipos produzido em condições de ativação TH1 e TH2 (BOSTIK et al,

2000; KHAIBOULINA et al, 2005b) seria possível que na fase precoce da infecção

ocorresse uma resposta TH2. Com a evolução da doença, esta resposta seria substituída

pela TH1 e os sintomas da SPCVH tornar-se-iam evidentes. Respostas mistas, de padrão

100

TH1/TH2, tem sido sugeridas para a infecção com PUUV, com base nos isotipos de IgG

produzidos por modelo murino, após imunização com proteína N viral (NICACIO et al,

2001). Ainda, linfócitos do sangue periférico com marcação intra-celular para IL-4 (padrão

TH2) foram encontrados em pacientes com HFRS por vírus Hantaan (LIU et al, 2006).

Contudo, se ocorre uma troca da resposta imune na hantavirose, os mecanismos envolvidos

neste processo são desconhecidos e necessitam ser estudados.

O IFN- é produzido por certas células do sistema imune, classicamente, NK,

linfócitos T auxiliares CD4+ ativados e polarizados para TH1, linfócitos T citotóxicos

CD8+ ativados e células T  (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; JANEWAY Jr. et

al, 2002; KATZE, HE e GALE Jr., 2002). De modo geral, as infecções virais estimulam as

células NK a produzirem IFN-, que atua sobre os macrófagos induzindo a secreção de IL-

12, e esta por sua vez, estimula os linfócitos T CD4+ ativados e em proliferação a

diferenciarem-se em células TH1 (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; JANEWAY Jr.

et al, 2002; BERENSON, OTA e MURPHY, 2004). O IFN- é a citocina efetora mais

importante produzida nas respostas imunes padrão TH1 além de inibir a produção de

células TH2 (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; JANEWAY Jr. et al, 2002; KATZE,

HE e GALE Jr., 2002; BERENSON, OTA e MURPHY, 2004). Funcionalmente, o IFN-

produzido pelas células T CD8+ pode bloquear diretamente a replicação viral ou mesmo

levar à eliminação do vírus sem matar a célula infectada, além de aumentar a expressão de

moléculas do MHC de classe I, e também as de classe II em macrófagos, induzir a síntese

de IgG2a pelos linfócitos B e ativar macrófagos e células NK (JANEWAY Jr. et al, 2002;

GUIDOTTI e CHISARI, 2001). Em estudos imunohistoquímicos, células produtoras de

IFN- foram observadas nos pulmões (nas paredes alveolares), mas não no coração, de

101

casos fatais por SPCVH (MORI et al, 1999; SAGGIORO, 2004). Tais células foram

também encontradas no baço e fígado, principalmente nos sinusóides, sugerindo que as

células produtoras de IFN- (e também de outras citocinas) possam estar presentes em

vários locais (MORI et al, 1999). Os resultados obtidos no presente trabalho e discutidos

acima, corroboram os achados de MORI et al. (1999), suportando a idéia de que a produção

excessiva de citocinas em nível local e sistêmico, possa ter papel importante no edema

pulmonar e no choque cardiogênico da SPCVH. Contudo, é provável que doses moderadas

de IFN- aumentem a eficiência do clearance de hantavírus, como tem sido observado em

outras infecções virais (GUIDOTTI et al, 1994; KOHONEN-CORISH et al, 1990; LUCIN

et al, 1992; GUIDOTTI e CHISARI, 2001).

Além do IFN-, a resposta imune de padrão TH1 é também caracterizada pela

presença de IL-12 (BERENSON, OTA e MURPHY, 2004). No presente trabalho,

encontrou-se níveis elevados de IL-12 em alguns dos pacientes com SPCVH (Tabela 9),

embora não tenham sido diferentes daqueles encontrados nos controles (Figura 8A). À

semelhança do TNF- e IFN-, encontrou-se grande variação nos níveis da IL-12 entre os

pacientes com SPCVH (amplitude de 0 a 733,2 pg/mL; Tabela 9), que poderiam estar

relacionadas a diferentes fases da doença em que foram colhidas as amostras ou, poderia

refletir diferenças na intensidade da resposta imune individual. A IL-12 foi originalmente

identificada com base na sua capacidade para potencializar, em sinergia com IL-2, a

secreção de IFN- (GATELY et al, 1986; WONG et al, 1987; CHAN et al, 1991). Neste

trabalho, observamos este efeito da IL-12 pois encontramos correlação positiva desta

citocina com INF- (Figura 15 A).

102

Com base em nossos resultados com a IL-12 e naqueles observados por RAFTERY

et al, 2002, elaboramos um mecanismo de indução inicial de resposta imune adquirida na

SPCVH. Sabe-se que a IL-12 é forte indutora da polarização de células T CD4 naïve para

TH1 (BERENSON, OTA e MURPHY, 2004) e que macrófagos e DCs são os principais

produtores de IL-12, em resposta a estímulo microbiano (D’ANDREA et al, 1992;

MACATONIA et al, 1995). Entretanto, RAFTERY et al (2002) verificaram que hantavírus

infectando DCs humanas (in vitro) não induzem produção de IL-12 nestas células apesar de

induzirem a expressão de moléculas co-estimulatórias (marcadores de DCs maturas) como

CD40, CD80, CD86 e moléculas do MHC classe I e II. Deste modo, é possível que durante

a fase precoce de indução da resposta linfocitária ao hantavírus, a polarização para TH1

ocorra de forma independente de IL-12, como tem sido demonstrado em outras situações

(NOBLE et al, 2001). Esta polarização dar-se-ia pela produção de IFNs do tipo I (IFN- e

) pelas DCs infectadas por hantavírus, embora com menor eficiência que aquela obtida

pela ação de IL-12 (TRINCHIERI, 2003; ROGGE et al, 1998; NGUYEN et al, 2002;

ATHIE-MORALES et al, 2004; BERENSON, OTA e MURPHY, 2004). De fato,

RAFTERY et al (2002) demonstraram que hantavírus induzem a produção in vitro de TNF-

 e IFN- em DCs e que estas células são capazes de estimular eficientemente a

proliferação de linfócitos.

De acordo com a teoria de que resposta imune celular mais intensa seria deletéria

aos indivíduos infectados com hantavírus (NOLTE et al, 1995; ZAKI et al, 1995; ENNIS et

al, 1997; KILPATRICK et al, 2004; MORI et al, 1999; PRESCOTT et al, 2005; BORGES

et al, 2006), observamos que os níveis de IL-12, bem como de IL-2R – um marcador de

ativação linfocitária (RUBIN et al, 1985) – correlacionaram-se positivamente com a

103

hemoconcentração, nos pacientes com a SPCVH (Figuras 19C e D). Os teores plasmáticos

de IL-2R correlacionaram-se também com a hipóxia (Figura 22 A) e estavam muito

aumentados nos pacientes com SPCVH (Figura 10A). IL-2R de alta afinidade é composto

de 3 cadeias polipeptídicas (,  e ) e a sua expressão na membrana é dependente da

ativação de linfócitos T, após a apresentação do antígeno. A estimulação crônica ou intensa

das células T induz o desprendimento da cadeia IL-2R, chamada de receptor solúvel da

IL-2 (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000), por nós abreviado como IL-2R. Além de

marcador de estimulação antigênica forte, o IL-2R é detectável em situações de inflamação

sistêmica (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000; TAKALA et al, 1999). Também, altos

níveis de IL-2R foram encontrados em pacientes com choque séptico bacteriano (3.815

U/mL; TAKALA et al, 1999), com dengue hemorrágico (16.654 pg/mL; LIBRATY et al,

2002) e com NE por PUUV (3.641 U/mL), correlacionando-se, no último caso, com o grau

de trombocitopenia (TAKALA et al, 2000). No presente estudo, observamos que os níveis

de IL-2R foram maiores nos pacientes (sobreviventes e fatais) cuja coleta amostral foi

realizada após 7 dias do início dos sintomas (Figura 10B). Este resultado pode refletir o

tempo necessário à cinética de maturação da resposta imune adquirida, sugerindo ativação e

proliferação de maior número de linfócitos, produtores deste receptor. Ainda, níveis

elevados de IL-2R poderiam contribuir para a regulação da resposta imune, uma vez que

este receptor pode ligar-se à IL-2 livre, impedindo sua interação com as células-alvo.

Entretanto, este não parece ser um mecanismo imunossupressor eficiente (ABBAS,

LICHTMAN e POBER, 2000). De acordo com este pressuposto e à semelhança de outros

produtos linfocitários ativados (TNF- e IFN-), observamos que os níveis de IL-2R

104

correlacionaram-se positivamente com a hemoconcentração e com a hipóxia nos pacientes

com SPCVH (Figuras 19D e 22A).

Os resultados deste estudo reforçam a idéia de que a magnitude da resposta de

células T efetoras correlaciona-se à gravidade da doença, como sugerido por outros autores

(ENNIS et al, 1997; KILPATRICK et al, 2004). O nível de ativação imune pode refletir a

carga antigênica de vírus na dose inalada ou poderia estar associada a fatores genéticos do

hospedeiro (TERAJIMA et al, 1999; ENNIS et al, 1997).

Os níveis de IFN- avaliados nos quatro subgrupos SPCVH “cura e coleta <7 dias”,

“cura e coleta >7 dias”, “óbito e coleta <7 dias” e “óbito e coleta >7 dias” e no grupo

controle mostraram-se diferentes (Figura 9B). É interessante que, quando os subgrupos

foram comparados aos pares: “cura e coleta <7 dias” com “cura e coleta >7 dias”, e “óbito e

coleta <7 dias” com “óbito e coleta >7 dias”, os níveis de IFN- mostraram-se mais

elevados

nos grupos cuja coleta foi realizada em tempo <7 dias do início dos sintomas.

Esta mesma tendência foi virtualmente observada nos mesmos subgrupos para a

quantificação do TNF- (Figura 6B) embora sem diferença significante (possivelmente

pelo pequeno número de pacientes analisados, especialmente nos casos fatais).

Considerando que o TGF- é forte inibidor de respostas TH1 e antagonista de IFN-, faz

sentido a diferença nos teores de IFN- (e a tendência observada para o TNF-) observada

nos subgrupos com SPCVH se considerarmos que naqueles com coleta <7 dias os níveis de

TGF- mostraram-se menores

que nos subgrupos com coleta >7 dias (Figura 12B) (LIN et

al, 2005; LANGERMANS et al, 2001).

105

Nossos achados sugerem que na SPCVH a resposta sistêmica à infecção seja

caracterizada por fases pró-inflamatórias e anti-inflamatórias paralelas, dirigidas pela

expressão sequencial de citocinas.

O TGF- é uma citocina pleiotrópica com potentes propriedades imunoregulatórias

(LETTERIO, 1998). Esta citocina suprime o desenvolvimento ou a intensidade da auto-

imunidade em inúmeros modelos experimentais (CAUTAIN et al, 2001; GREWAL et al,

2002; LIU et al; 2003), controla a ativação de células T (LUCAS et al, 2000), e nas vias

aéreas, inibe a inflamação induzida por antígeno e a super reatividade alérgica (NAKAO et

al, 2000). Ademais, o TGF- tem uma função crítica e não redundante como antagonista do

desenvolvimento de células TH1, in vivo, sendo um potente inibidor da produção de IFN-

tanto nos linfócitos recém ativados quanto nos linfócitos maduros efetores (LIN et al, 2005;

LANGERMANS et al, 2001). Neste trabalho, observou-se que os níveis de TGF- séricos

no grupo SPCVH estavam significantemente reduzidos em relação ao grupo controle

(Figura 12A). Este achado sugere que, durante a infecção por hantavírus, ocorra uma

inibição da produção desta citocina por mecanismo desconhecido e isto explicaria a reação

imune intensa na SPCVH. Também, a correlação positiva entre níveis de TGF- e pressão

arterial média nos pacientes com SPCVH (Figura 21D), sugere um efeito benéfico da

citocina, regulando a resposta imune, a imunopatologia induzida por hantavírus e o

desenvolvimento da hipotensão e choque.

A produção de TGF- reduzida durante a infecção por hantavírus poderia ser

relacionada com os teores elevados de linfócitos ativados na circulação dos pacientes com

SPCVH (ENNIS et al, 1997). KILPATRICK et al, (2004), demonstraram que frequências

muito mais elevadas de células T CD8+ SNV-específicas estão presentes na SPCVH em

106

comparação a outras infecções virais como hepatite B, hepatite C (HCV), Aids, dengue e

vaccínia (MAINI et al, 1999; WILSON et al, 2000; LECHNER et al, 2000;

MONGKOLSAPAYA et al, 2003; TERAJIMA et al, 2003; KILPATRICK et al, 2004). O

TGF- inibe a diferenciação de linfócitos TH1 e TH2 por bloquear a expressão dos fatores

de transcrição envolvidos na diferenciação destas células, T-bet e GATA-3,

respectivamente (GORELIK et al, 2002; GORELIK et al, 2000, CHEN et al, 2003a;

SCHMIDT-WEBER e BLASER, 2004). Por outro lado, induz a expressão de FOXP3, um

fator de transcrição que promove a geração de células T regulatórias (Tregs) naturais

(CHEN et al, 2003b; FANTINI et al, 2004). As Tregs naturais e também as Tregs induzidas

(chamadas TH3 e Tr1), bem como as citocinas supressoras TGF-, IL-10 e IL-4 por elas

secretadas, têm papel crucial no controle das respostas imunes e da imunopatologia

(MILLS, 2004). Com a redução na produção do TGF- a geração das Tregs naturais

poderia estar prejudicada na SPCVH.

Um outro tipo de célula T regulatória, a chamada Tr1, é gerada na periferia,

especialmente na mucosa do trato respiratório, após contato com antígeno apresentado

pelas DCs em estado de ativação semi-maduro (JONULEIT et al, 2000; WEINER, 2001;

MILLS, 2004). DCs pulmonares, após o encontro com antígeno, produzem IL-10 e

induzem células Tr1 (AKBARI et al, 2001) que atuariam induzindo tolerância a antígenos

respiratórios (WEINER, 2001). Neste trabalho, encontramos os níveis séricos elevados de

IL-10 nos pacientes com SPCVH (Figura 11A). Células produtoras desta citocina também

foram observadas no coração de casos fatais por esta doença (SAGGIORO, 2004). Assim,

embora pareça haver uma deficiência da função regulatória mediada por TGF- na

SPCVH, ocorre regulação da resposta imune ao hantavírus mediada por IL-10. Apesar

107

disso, tal mecanismo parece não ser muito eficiente, uma vez que níveis de IL-10

correlacionaram-se com hemoconcentração e hipotensão nos pacientes com SPCVH

(Figuras 19B e 21C).

Além da produção de citocinas anti-inflamatórias pelas células T regulatórias

antígeno-específicas, ocorre também a produção destas citocinas pelas células do sistema

imune inato, participando como reguladoras na imunopatologia induzida pela infecção

(MILLS, 2004). Sabe-se que o TNF- e a IL-10 atuam antagonicamente na resposta

inflamatória funcionando como um sistema autócrino de feedback negativo e equilibrando a

produção de citocinas no sítio da infecção (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2000).

Contudo, neste estudo não observamos correlação entre níveis de IL-10 e TNF- nos

pacientes com a SPCVH, possivelmente devido ao pequeno número de amostras analisadas

para ambas as citocinas (9 amostras, Tabela 9). Entretanto, em análises imunohistoquímicas

do miocárdio de casos fatais da SPCVH, encontrou-se significante correlação entre células

produtoras de IL-10 e TNF- (SAGGIORO, 2004). Também, é sabido que a IL-10,

inibindo citocinas estimulatórias produzidas por DCs e macrófagos, inibe indiretamente a

produção de citocinas por linfócitos T ativados (de WAAL MALEFYT et al, 1991;

FIORENTINO et al, 1991b). Ainda, a IL-10 inibe indiretamente a produção do IFN- pelas

células NK ativadas por IL-2 e IL-12 (HSU et al, 1992; D’ANDREA et al, 1993). Contudo,

no presente trabalho, os níveis séricos de IL-10 nos pacientes com SPCVH se

correlacionaram positivamente com as citocinas produzidas por linfócitos ativados IFN- e

TNF- (Figuras 16C e 17). Este resultado inesperado poderia ser falso-positivo, ou seja,

uma conseqüência dos altos teores de IL-10 produzidos num estado de grave inflamação,

onde grandes concentrações de IFN- e TNF- são também produzidas. De fato, maiores

108

teores, tanto de IL-10 quanto de IFN- e TNF- foram produzidos nos primeiros 7 dias de

SPCVH (Figuras 11B; 9B e 6B). Portanto, nestes pacientes com SPCVH não foi possível

demonstrar o efeito inibitório indireto da IL-10 sobre a produção de IFN- e TNF-.

Embora a IL-10 seja produzida principalmente por monócitos/macrófagos ativados,

linfócitos T (TH1 e TH2) podem também produzi-la (AMAN et al, 1996; DAFTARIAN et

al, 1996). A produção de IL-10 por linfócitos T é amplificada por IL-12 e IFN- (AMAN

et al, 1996; DAFTARIAN et al, 1996). No presente trabalho, observamos que os níveis

séricos de IL-10 nos pacientes com SPCVH se correlacionaram positivamente com os de

IL-12 (Figura 15B), refletindo o efeito indutor desta citocina sobre a produção de IL-10.

Como as citocinas exercem efeitos estimulatórios e inibitórios sobre as células

imunológicas, a natureza da resposta imune global é determinada pelas concentrações das

diferentes citocinas no local da ativação imune. Sabe-se que as células T regulatórias têm

papel crucial suprimindo respostas imunes e mantendo o equilíbrio controlador da infecção,

prevenindo a imunoagressão e a auto-imunidade (MILLS, 2004; THOMPSON e POWRIE,

2004; TAYLOR et al, 2006). É muito provável que estas células regulatórias estejam

presentes nos tecidos e no sangue dos pacientes com SPCVH, o que necessita ser

investigado. A presença de células produtoras de IL-4 (citocina supressora, produzida por

alguns tipos de células T regulatórias) nos pulmões, rins, fígado e baço de casos fatais de

SPCVH (MORI et al, 1999), poderia ser uma evidência disto. Finalmente, é possível que

indivíduos com maior atividade de células Tregs durante a SPCVH possam desenvolver

formas mais brandas da doença. Sabe-se que ocorrem casos de infecção por hantavírus

associados a SPCVH mas produzindo doença leve, sem insuficiência respiratória e as

causas ou fatores envolvidos neste comportamento clínico não são conhecidas (ZAVASKY

109

et al, 1999; KITSUTANI et al, 1999). Nesses casos, assim como naqueles indivíduos com

sorologia positiva para hantavírus mas sem história de SPCVH, poderiam estar envolvidos

polimorfismos em genes de proteínas do sistema imune, como HLA e citocinas.

Altos níveis de anticorpos contra hantavírus têm sido encontrados na população

geral, inclusive em pessoas sem nenhuma história de SPCVH, em regiões do Paraguai

(40%), Província Salta na Argentina (17%) e na cidade de Jardinópolis, na região de

Ribeirão Preto-SP (14,3%) (PETERS 1998; FERRER et al, 1998; VINCENT et al, 2000;

WILLIAMS et al, 1997; CAMPOS, et al 2003). Uma vez que a magnitude de ativação da

resposta imune tem sido associada à gravidade da SPCVH, um possível fator genético

poderia atuar evitando esta resposta imunológica exacerbada (KILPATRICK, et al, 2004;

KHAIBOULLINA et al, 2005b; TERAJIMA et al, 2004). Genes do HLA e citocinas

poderiam estar associados neste processo. Os genes do HLA codificam proteínas essenciais

ao reconhecimento de antígenos pelos linfócitos T (JOHNSON, et al 1999b). Desta forma,

os alelos HLA de indivíduos infectados por hantavírus são provavelmente capazes de afetar

a magnitude de ativação dos linfócitos T, com respostas variáveis para diferentes haplótipos

(ENNIS et al, 1997). Este é o primeiro trabalho que analisa HLAs em pacientes com a

SPCVH, no Brasil. Observamos que a frequência do grupo alélico HLA-A*80 estava

aumentada nos indivíduos com SPCVH quando comparada à da população (Tabela 13) e

indicando que a doença ocorre 62,2 vezes em portadores do alelo. Portanto, os resultados

mostram que o HLA-A*80 é um fator de risco para a doença. Entretanto, faz-se necessário

confirmar esta observação em maior número de pacientes com SPCVH.

As frequências dos grupos alélicos HLA-B*38 e HLA-B*78 estavam aumentadas

nos indivíduos com SPCVH quando comparadas com as da população (Tabela 15). Estes

alelos contribuiriam em 11% e 4%, respectivamente, para o desenvolvimento da SPCVH

110

em indivíduos infectados com hantavírus. Embora o número de pacientes analisados seja

pequeno para estudos deste tipo, os alelos de HLA-B que parecem oferecer risco à SPCVH

na população da região de Ribeirão Preto, foram similares daqueles associados à gravidade

da SPCVH na população norte americana. Nos EUA, a gravidade da SPCVH mostrou-se

associada ao HLA-B*35, presente em 70% dos pacientes com a SPCVH grave (KOSTER

et al, 2001; KILPATRICK et al, 2004). Também, observou-se que pacientes com SPCVH

por SNV possuíam clones de linfócitos T CD8+ e CD4+ que reconheciam epítopos virais

restritos ao HLA B*35 e ao HLA Cw*7 (ENNIS et al; 1997). No presente trabalho, o HLA-

B*35 estava presente em 6 dos 21 pacientes do grupo SPCVH, sendo 2 casos fatais e 2

sobreviventes mas com SPCVH grave necessitando entubação e ventilação assistida (4/6

casos graves, 66,6%).

Estudo com 74 pacientes na Finlândia, demonstrou que o alelo HLA-B*27 está

associado a curso benigno e envolvimento renal leve da NE por PUUV, enquanto que o

haplótipo HLA B*8 e DRB1*03 estaria relacionado a quadros de choque (MUSTONEN et

al, 1996; MÄKELÄ et al, 2002). O mesmo haplótipo está associado à resposta imune

aumentada ou alterada a vários antígenos e à falência na resposta vacinal contra hepatite B

(OSOBA e FALK, 1978, ALPER et al, 1989). Porém, em nosso estudo, o haplótipo HLA

B*8 e DRB1*03 foi encontrado em apenas 2 pacientes com SPCVH (JBA e JPM; Tabela

12), um deles teve SPCVH grave necessitando entubação e ventilação assistida. Também,

o HLA-B*27 estava presente em apenas 2 dos pacientes estudados, sendo um deles um

caso fatal. As freqüências dos alelos HLA diferem consideravelmente entre grupos étnicos,

alguns alelos HLA estão restritos ou são encontrados em freqüências muito mais elevadas

em determinadas subpopulações étnicas (JOHNSON, et al 1999). Nossos resultados com o

HLA-B divergem daqueles encontrados em outras populações, como a norte-americana e a

111

européia. Entretanto, como o número de pacientes analisados no presente estudo é pequeno

(21 indivíduos), faz-se necessário estudar maior número de pacientes para definitivamente

concluir se na população brasileira os alelos HLA-B*35 e HLA-B*08 contribuem para a

gravidade da infecção por hantavírus.

Quanto ao HLA-Cw, neste trabalho observou-se que o HLA-Cw*03 é mais

frequentemente encontrado nos pacientes com SPCVH que na população (Tabela 16). Este

alelo contribuiria em 22% para a susceptibilidade à SPCVH na população brasileira. Ao

contrário do HLA-Cw04 que tem sido associado à persistência da infecção por HCV (THIO

et al, 2002), o HLA-Cw03 não tem sido associado à outras infecções. Sabe-se que o HLA-

Cw*03 é ligante de um dos receptores inibitórios da ativação e da lise de células NK p58

(chamado KIR2DL3) (MAENAKA et al, 1999). Se esta função estaria envolvida na

susceptibilidade à SPCVH é totalmente desconhecido e necessita estudos adicionais.

A frequência dos grupos alélicos de HLA-DRB1 nos pacientes com SPCVH não

foram diferentes das encontradas na população (Tabela 17), nem mesmo para o alelo HLA-

DRB1*03 que nos estudos com NE mostrou-se associado com gravidade da doença por

PUUV (MUSTONEN et al, 1996; MÄKELÄ et al, 2002).

Polimorfismos nos genes de citocinas têm impacto pouco conhecido na resposta

imune aos hantavirus e neste trabalho buscamos por evidências de que a gravidade da

SPCVH estaria relacionada ao excesso de citocinas produzidas e ao polimorfismo nestes

genes.

O gene para TNF- está localizado na região do MHC de Classe III (SPIES, et al,

1986). Em vista dos efeitos biológicos do TNF e da localização de seu gene codificador,

têm sido especulado que polimorfismos neste locus possam estar associados a doenças

112

auto-imunes e infecciosas (JACOB, 1992). Deste modo, SNP na posição –308 da região

promotora do TNF- estaria envolvido na regulação da secreção desta citocina (WILSON

et al, 1992; WILSON et al, 1997), apesar de existirem resultados contraditórios (STUBER

et al, 1996). A presença do alelo TNF2 têm sido associada a fenótipos de alta produção do

TNF- (WILSON et al, 1997). No presente trabalho, observou-se que o alelo TNF2 foi

mais frequente nos indivíduos que desenvolveram a SPCVH do nos que tiveram infecção

pregressa por hantavirus mas sem história clínica de doença (soropositivos) (Figura 25).

Este resultado sugere que o alelo TNF2 possa estar envolvido na progressão da SPCVH.

Também, uma vez que encontramos diferença na frequência do TNF-2 nos pacientes com

SPCVH em relação aos soropositivos, mas não em relação à população, nossos achados

poderiam sugerir que o alelo TNF-2 selecionaria o desenvolvimento de SPCVH nos

infectados. É prudente, contudo, salientar que este não seria o único fator determinante da

SPCVH, uma vez outros indivíduos não portadores do alelo TNF-2, também

desenvolveram a SPCVH (Tabela 12). Corrobora nossos resultados o trabalho de

KANERVA et al (1998) que sugeriram associação do alelo TNF2 com gravidade da NE por

PUUV. Entretanto, o alelo TNF2 está em desiquilíbrio de ligação (isto é, alelos que

segregam na população com uma freqüência significativamente maior no mesmo haplótipo

do que seria esperado ao acaso; JOHNSON, et al 1999b) com o haplótipo extendido HLA

B8, DR3 e DQ2 (WILSON et al, 1993). Deste modo, o estudo de MÄKELÄ et al (2002)

sugere que o alelo TNF-2 não é um fator de risco para NE grave independente e sim

relacionado ao haplótipo HLA B8, DR3 sendo este mais determinante de gravidade para

NE que o próprio alelo TNF-2 (MÄKELÄ et al, 2002). O haplotipo extendido HLA-A*01,

B*08, DRB1*03 e TNF-2 é um dos mais comuns (CORSO et al, 1999) e esteve presente

113

em apenas 2 dos 8 pacientes (25%) com SPCVH portadores do alelo TNF-2 (JBA e JPM;

Tabela 12), sugerindo que nesta doença o TNF-2 poderia ser um fator de risco

independente do haplótipo estendido HLA B8, DR3.

Não observamos correlação entre dados da genotipagem do TNF- e quantidades

desta citocina no soro (Figura 28). Portadores do TNF-1 exibiram teores mais alttos de

TNF- que os portadores de TNF-2. Portanto, o polimorfismo na posição –308 do gene do

TNF não influenciaria a produção de TNF em resposta à infecção por hantavírus. Estudos

adicionais com maior número de pacientes analisados são necessários para esclarecer esta

questão já que nossa casuística de pacientes com SPCVH e portadora de TNF-2 foi

pequena.

MÄKELÄ et al (2001) estudaram o polimorfismo nos genes do TNF-, da IL-1,

IL-1 e IL-1RA em pacientes infectados por PUUV, e encontraram que indivíduos não

portadores dos alelos 2 de IL-1RA e IL-1 podem ser mais susceptíveis à NE. Para o gene

da IL-10, três SPNs foram descritos na região promotora do gene, nas posições –1082, -819

e –592, e estes polimorfismos podem determinar baixa, média ou alta produção de IL-10

(TURNER et al, 1997; ESKDALE et al, 1998). SNPs foram descritos também nos genes de

IFN (intron 1, posição +874), IL-6 (promotor, posição –174) e TGF- (codons 10 e 25)

associados a graus diferentes de produção dessas citocinas (RUIZ-LINARES, 1994;

PRAVICA et al, 2000; PELLETIER et a, 2000; WARLÉ, 2003; FISHMAN et al, 1998;

AWAD et al, 1998). Até o momento, nenhum estudo avaliou o polimorfismo dos genes de

IFN, IL-6, IL-10 e TGF- na hantavirose. Os resultados originais do presente trabalho

sugerem que polimorfismo nos genes das citocinas IL-6, IFN-, IL-10 e TGF- não estão

associados à SPCVH (Tabela 20).

114

Este é também o primeiro trabalho que correlacionou resultados do polimorfismo das

citocinas TNF-, IFN-, IL-10, IL-6 e TGF- com os níveis dessas citocinas no sangue de

indivíduos com SPCVH. Entretanto, não observamos diferença na produção das citocinas

quando comparamos indivíduos com SPCVH portadores ou não dos alelos hipersecretores

de IFN-, IL-10, IL-6 e TGF- (Figuras 29 a 32). É possível de tal análise tenha sido

prejudicada pelo pequeno número de pacientes estudados em cada subgrupo. Contudo,

concluímos que o polimorfismo nos genes de IFN-, IL-10, IL-6 e TGF- não afeta a

produção destas citocinas em indivíduos infectados por hantavírus e não são fatores de risco

para a SPCVH.

O polimorfismo na 

integrina, determinante dos diferentes sistemas HPA também

foi por nós estudado. Uma vez que a entrada dos hantavírus patogênicos na célula é

mediada por integrinas da superfície celular, (GAVRILOVSKAYA, et al, 1998;

GAVRILOVSKAYA, et al, 1999), polimorfismos nas 

integrinas poderiam estar

associados à susceptibilidade ou resistência à SPCVH. Os polimorfismos HPA analisados

neste trabalho levam a troca de aminoácidos na cadeia polipeptídica 

da integrina nas

posições 33 (HPA-1), 143 (HPA-4) e 489 (HPA-6) (NEWMAN, 1994). Entretanto, estes

polimorfismos nos sistemas HPA-1, HPA-4 e HPA-6 não se mostraram associados à

SPCVH (Tabela 22) . Sabe-se que o sítio de interação na 



integrina com hantavírus é

um domínio plexina-semaforina-integrina (PSI) presente na região N-terminal da cadeia 

(resíduos 1 a 53) e pontualmente, o resíduo Asp-39 dentro do domínio PSI é essencial para

a infecção por hantavírus (RAYMOND et al, 2005). Os epítopos que determinam HPA-4 e

–6 não estão contidos neste domínio PSI. Ademais, embora o HPA-1 o esteja (aminoácido

115

na posição 33), este também não se mostrou associado à susceptibilidade para infecção por

hantavírus.

Em suma, este trabalho mostrou pela primeira vez que a IL-6 tem importante papel

na patogênese da SPCVH, estando inclusive associada à letalidade pela doença. Este estudo

mostrou também, de maneira original, o padrão de resposta imune que ocorre na SPCVH,

tanto inflamatório quanto anti-inflamatório. Observamos que a polarização da resposta

imune na SPCVH é para um padrão TH1 no momento da insuficiência respiratória e da

hipotensão. Os dados reforçam a idéia de que a magnitude da resposta imune correlaciona-

se com a gravidade da doença. A infecção provavelmente inibe a secreção de TGF- e este

poderia ser um dos mecanismos responsáveis pela resposta imune exacerbada que ocorre na

SPCVH. Ainda, existiria uma regulação da resposta imune mediada pela IL-10, que

aparentemente não é eficiente em controlar a resposta imune exacerbada na SPCVH.

Baseando-se nos resultados obtidos neste estudo, elaboramos um modelo esquemático

representativo da participação das citocinas na patogênese da SPCVH, conforme mostra a

Figura 33. Finalmente, este trabalho mostrou que os alelos HLA-A*80, HLA-B*38, HLA-

B*78, HLA-Cw*03 e TNF-2 podem representar fatores de risco à SPCVH.

116

Figura 33:

Modelo esquemático sobre a participação de citocinas na patogênese da

SPCVH, segundo os resultados do presente trabalho. O círculo preto representa os

resultados observados nos casos fatais de SPCVH e o círculo branco, aqueles obtidos nos

sobreviventes. Na intesecção (área cinza), estão os resultados comuns a ambos os grupos.

As citocinas nas caixas pretas são pró-inflamatórias, enquanto que aquelas nas caixas

brancas são anti-inflamatórias. As setas cinzas indicam efeitos inflamatórios deletérios, ao

passo que as brancas indicam efeitos anti-inflamatórios benéficos.

117

6. CONCLUSÕES

 Encontrou-se níveis séricos elevados de TNF-, IL-6, IL-10, IL-2R, NO e proteína C

reativa nos pacientes com a SPCVH.

 Os teores séricos de IL-6 correlacionam-se com a hipotensão e níveis elevados desta

citocina estão associados ao óbito na SPCVH.

 A presença de IFN-, IL-12 e TNF- no soro de pacientes sugere que a resposta imune

na SPCVH tenha predomínio de padrão TH1.

 Os mais elevados teores séricos de TNF- e IL-2R, correlacionam-se com hipóxia e

hipotensão em pacientes com SPCVH.

 Os mais elevados teores séricos de IFN-, IL-12, IL-2R, TNF- e IL-10 correlacionam-

se com hemoconcentração em pacientes com SPCVH.

 A produção de IL-10 em elevados teores séricos correlaciona-se com hemoconcentração

e hipotensão nos pacientes e, por isso, pareceu não apresentar um papel inibitório evidente

na resposta imune e na patogênese da SPCVH.

 Os elevados teores séricos observados para TNF- nos pacientes não se correlacionam

com hipotensão ou letalidade da doença, sugerindo que esta não seja a citocina mais atuante

no mecanismo patogenético da SPCVH.

 Apesar do efeito protetor do TGF- demonstrado pela sua correlação positiva com

pressão arterial, observou-se redução nos níveis séricos desta citocina em soro dos

pacientes, o que parece estar relacionado à resposta imune exacerbada na SPCVH.

 As freqüências dos alelos HLA-A*80, HLA-B*38, HLA-B*78 e HLA-Cw*03, que

estavam aumentadas nos indivíduos com SPCVH, podem ser fatores de risco para o

desenvolvimento de SPCVH.

 O TNF2 esteve presente em maior frequência nos pacientes com SPCVH sugerindo que

este alelo determinante de hipersecreção do TNF- possa estar envolvido na progressão da

doença.

118

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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