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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA ANIMAL
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
TESE
Caracterização genotípica e estudo filogenético de Cryptosporidium spp.
obtidos de diferentes hospedeiros
Franziska Huber
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA ANIMAL
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E ESTUDO FILOGENÉTICO
DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. OBTIDOS DE DIFERENTES
HOSPEDEIROS
FRANZISKA HUBER
Sob a Orientação da Professora
Teresa Cristina Bergamo do Bomfim
e Co-orientação dos Professores
Alexandre Ribeiro Bello
Rita de Cássia Alves Alcântara de Menezes
Tese submetida como requisito parcial
para obtenção do grau de Doutor em
Ciências, no Curso de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias, Área de
Concentração em Parasitologia
Veterinária
UFRRJ
Fevereiro, 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
FRANZISKA HUBER
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, no
Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de Concentração em Parasitologia
Veterinária
TESE APROVADA EM 27/02/2007
_________________________________________________________________
Teresa Cristina Bergamo do Bomfim (Orientadora, Ph.D. – UFRRJ)
________________________________________________________________
Regina Maura Bueno Franco (Drª – UNICAMP)
________________________________________________________________
Tânia Maria Pacheco Schubach (Drª – FIOCRUZ /RJ)
_______________________________________________________________
Rodolpho Mattos Albano ( Dr. UERJ)
______________________________________________________________
Adriana Rayol Pedrenho (Drª – UFRRJ)
UFRRJ
2007
I
DEDICATÓRIA
Dedico o presente trabalho aos meus pais -
Heidi e Albert e à vida, que constantemente
evolui e se revela maravilhosa e perfeita,
principalmente nos detalhes ínfimos.
II
AGRADECIMENTOS
Inicialmente agradeço de todo coração à orientadora, professora e amiga Teresa
Cristina Bergamo do Bomfim pelo amparo e constante empenho no trabalho. Sua dedicação e
ética profissional são sem dúvida os mais importantes exemplos que eu poderia ter recebido
neste curso.
Ao meu Co-orientador de fato, embora não tenha sido de direito, Sidnei Silva agradeço
pelo indispensável acompanhamento durante a realização das análises moleculares. Sem sua
amigável e agradabilíssima colaboração, a presente tese não teria metade de seu valor.
A Alexandre Ribeiro Bello agradeço por sua disponibilidade em abrir as portas de seu
laboratório e de seu conhecimento, possibilitando assim a realização do trabalho.
Ao professor Rodolpho Mattos Albano e à Denise, do Laboratório de Genoma (UERJ),
por contribuírem significativamente nos experimentos de seqënciamento.
A Yara, Teresa, Érika e todos do laboratório de Biologia Molecular do Departamento
de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da UERJ.
A Kátia R. S. Teixeira (EMBRAPA/Agrobiologia) pela orientação e acompanhamentos
durante as análises filogenéticas.
À Raquel Saucier Gomes pela presença e amizade constante.
Aos meus amigos e colegas do curso de Pós-graduação pela amizade, os momentos
divertidos e alegres que passamos juntos. Embora os caminhos da vida tendam a separar
muitos de nós, as lembranças e amizade real são inseparáveis.
São tantas as pessoas que colaboraram direta ou indiretamente neste trabalho, que fica
difícil relembrar a todos. Peço perdão aos que porventura não sejam aqui lembrados
diretamente e deixo meu abraço carinhoso a todos.
Agradeço especialmente a Deus, pela criação, seu bom humor e imaginação ao criar
com tanta leveza e beleza aquilo que Ele nós permite descobrir através do estudo e trabalho.
III
RESUMO
HUBER, Franziska. Caracterização genotípica e estudo filogenético de
Cryptosporidium spp. obtidos de diferentes hospedeiros. 2007. 59p Tese (Doutorado em
Ciências Veterinárias, Parasitologia Veterinária). Instituto de Veterinária, Departamento de
Parasitologia Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ,
2007.
O presente trabalho teve por objetivo caracterizar geneticamente as espécies de
Cryptosporidium oriundos de vários hospedeiros, realizar o seqüenciamento e análises
filogenéticas, incluindo o depósito das primeiras seqüências brasileiras de Cryptosporidium
spp. de origem animal no GenBank. Foram obtidas amostras fecais contendo oocistos de
Cryptosporidium de pintos, patos, codornas e porquinhos da índia comercializados num
mercado municipal da cidade do Rio de Janeiro, de bezerros de uma propriedade voltada à
produção leiteira localizada no mesmo município e de gatos e cães de um abrigo para animais
localizado no município de Nova Iguaçu. Para as análises foi utilizado Nested-PCR do DNA
extraído a partir de 200µl de solução fecal. Foi realizada RFLP dos produtos obtidos no
Nested-PCR, utilizando-se as enzimas SspI e VspI, para uma identificação preliminar das
espécies de Cryptosporidium presentes. As amostras de DNA foram seqüenciadas e análises
filogenéticas foram conduzidas. Foram diagnosticados e sequenciados C. baileyi infectando
dois patos (DQ855339 e DQ885340) e uma codorna (DQ885335) e C. melagridis infectando
um pinto (DQ885341). As seqüências dos Porquinhos da Índia receberam os números de
acesso DQ885337 e DQ885338, sendo que ambas as seqüências não puderam ser
identificadas como espécie conhecida de Cryptosporidium, devido à grande distância genética
entre elas e aquelas já depositadas no GenBank, sugerindo que se trate de um genóptipo ou
espécie nova. Parasitando os gatos foi diagnosticado C. felis (DQ885336) e em um cão C.
canis (DQ885334). Uma das amostras de C. parvum de bovinos foi seqüenciada, sendo
depositada no GenBank sob número de acesso DQ885333. Durante as análises dos sítios de
corte enzimático dos produtos da Nested-PCR do gen 18Sr DNA, a única espécie que
realmente possue padrão de corte característico é C. baileyi. As demais espécies de
Cryptosporidium deveriam ser submetidas à ação de outras enzimas, para um diagnóstico
acurado. Nas análises filogenéticas foi observada uma distância genética maior entre C. felis e
C. canis isolados no Brasil quando comparados às seqüências do GenBank. Com base nos
dados apresentados pelo agrupamento filogenético, uma possível nova espécie chama a
atenção à presença de espécies desconhecidas de Cryptosporidium, mesmo em animais
comuns de estimação, como é o caso do Porquinho da Índia. Estas são as primeiras seqüências
de C. baileyi, C. meleagridis, C. felis, C. canis e C. parvum do Brasil depositadas no
GenBank.
Palavras-chaves: Cryptosporidium, Filogenia, Caracterização genotípica, Brasil
IV
ABSTRACT
HUBER, Franziska. Genotypic characterization and phylogeny of Cryptosporidium
spp. from different hosts. 2007. 59p Thesis (PhD in Veterinary Sciences, Veterinary
Parasitology). Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Veterinária,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2007.
The objectives of the present study was the genetical characterizations of Cryptosporidium
spp. from different hosts, realize the sequencing an phylogenetic analysis, including the
deposit in GenBank of the first Cryptosporidium sequences of animal origin, from Brazil.
There were obtained fecal samples, containing Cryptosporidium oocysts from chiken, ducks,
quails and Guinea pigs from a public market localized in Rio de Janeiro city, from dairy calfs
maintained at a farm localized in the same city and from dogs and cats maintained at a shelter
localized in the city of Nova Iguaçu. For the analysis was utilized the Nested-PCR of the
extracted DNA from 200µl of fecal suspension. For primary identification of
Cryptosporidium species was realized RFLP with enzymes SspI and VspI. DNA samples were
sequenced and phylogenetic analysis were conducted. There were diagnosed and sequenced
C. baileyi infecting two ducks (DQ855339 and DQ885340) and one quail (DQ885335) and C.
melagridis infecting one chicken (DQ885341). The sequences obtained form
Cryptosporidium infecting Guinea pigs received accession numbers DQ885337 and
DQ885338, both sequences were not identified with known Cryptosporidium species due to
the great genetic distance between them and those already available at GenBank, suggesting
that it may be a new genotype or species. Parasitizing cats was diagnosed C. felis (DQ885336)
and in one dog C. canis (DQ885334). One sample of C. parvum of calf origin was sequenced
and received accession number DQ885333. During analysis of RFLP pattern of the nested-
PCR product from 18Sr DNA was stated that only C. baileyi has a characteristic digestion
pattern. Other Cryptosporidium species should be digested by several other enzymes, for a
accurate diagnosis. At phylogenetic analysis was found a greater genetic distance between C.
felis and C. canis from Brazil when compared to the reference sequences obtained from
GenBank. Based on the phylogenetic groupings, a possible new species of Cryptosporidium
from Guinea Pigs calls attention for the existence of new species even in common pet
animals. As is the case of the Guinea Pig. The sequences obtained in this study are the first
Brazilian sequences of C. baileyi, C. meleagridis, C. felis, C. canis and C. parvum deposited
in GenBank.
KEY-WORDS: CRYPTOSPORIDIUM, PHYLOGENY, GENOTYPIC
CHARACTERIZATION, BRAZIL
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Relação filogenética entre as espécies e genótipos de
Cryptosporidium, analisadas pelo Neighbor-Joining de seqüências parciais do
SSUrRNA gene. Os valores nos ramos são as percentagens do Bootstrap,
usando 1000 replicas. Os números após os nomes das espécies ou genótipos são
as identificações dos isolados usados na construção da árvore filogenética. Os
números entre parênteses representam a quantidade de isolados seqüenciados
(Xiao et al 2004).
Página
25
Figura 2: Produtos da RFLP-PCR de amostras fecais contendo oocistos de
Cryptosporidium sp. Colunas 1 a 5: produto da digestão SspI de C. baileyi de
patos. Coluna 6: produto de digestão de C. baileyi de codorna, Coluna 7:
produto de digestão de C. meleagridis isolado de pinto. Colunas 8 e 9: produto
não digerido de Cryptosporidium sp. de Porquinhos da índia. Os pesos
moleculares indicados são valores aproximados, admitindo uma variação de 3%
para mais ou para menos. M: Marcador de peso Molecular
31
Figura 3: Produtos da RFLP-PCR de amostras fecais de gatos e de um cão,
contendo oocistos de Cryptosporidium spp., provenientes de um abrigo.
Colunas 1, 2 e 3: produtos da digestão de C. felis isolados de gatos. Coluna 4:
produto da digestão de C. canis, isolado de cão. Os Pesos moleculares
apresentados são aproximados, podendo variar em 3% para mais ou para
menos. M: Marcador de peso molecular
33
Figura 4: Produtos da RFLP-PCR de amostras fecais contendo oocistos de
Cryptosporidium spp. de bezerros de uma fazenda de exploração leiteira.
Colunas 1, 2 e 3: produtos da digestão de C. parvum. Os Pesos moleculares
apresentados são aproximados, podendo variar em 3% para mais ou para
menos. M: Marcador de peso molecular
35
Figura 5: Resultado da digestão de Crytosporidium spp. com a enzima VspI.
Coluna 1: produto de digestão de C. meleagridis isolado de pinto. Colunas 2 e
3: produto de Cryptosporidium sp. de Porquinhos da Índia. Coluna 4: produto
da digestão de C. canis de cão. Colunas 5 e 6: produto de C. parvum de
bovinos. Os pesos moleculares indicados são valores aproximados, admitindo
uma variação de 3% para mais ou para menos. M: Marcador de peso molecular
36
Figura 6: Fluxograma de uso das enzimas de restrição SspI, VspI, DdeI, AseI e
NdeI para o diagnóstico de Cryptosporidium spp.
41
Figura 7: Alinhamento das seqüências de C. parvum (B83), C. canis (C224),
C. felis (Gato), Cyryptosporidium sp. de Porquinho da Índia (O92 e O93), C.
baileyi de codorna (Codorna), C. baileyi de patos (P21 e P22) e C. meleagridis
de pinto (Pinto). As cores marcam os sítios de restrição presentes nas
seqüências, para as enzimas DdeI (CTAAG), AseI (ATTAT), VspI (ATTAAT)
e SspI (AATATT). Lacunas são marcadas por ( - ) e Nucleotídeos idênticos por
( . ).
43
VI
Figura 8: Árvore flogenética de espécies brasileiras de Cryptosporidium e
espécies já descritas e depositadas no GenBank, elaborada pelo método do
Neighbor Joining, utilizando Kimura 2 Parâmetro. Note que os isolados de
Cavia porcelus agrupam-se com C. felis, porém mantendo-se distintas o
bastante para garantir estado de espécie distinta.
48
VII
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Alguns primers usados na caracterização dos genes SSu
rRNA, HSP70 e actina, das várias espécies de Cryptosporidium
Página
9
Quadro 2: Primers de micro e minisatélites para o estudo populacional
de C. parvum e C. hominis (TANRIVERDI &WIDMER, 2006).
21
Quadro 3: Comparação entre os sítios de restrição enzimática presentes
nas seqüências parciais do gene 18Sr DNA (Tamanho aproximado dos
fragmentos: 752pb) de C. parvum (B83), C. canis (C224), C. felis (Gato),
Cyryptosporidium sp. de Porquinho da Índia (O92 e O93), C. baileyi de
codorna (Codorna), C. baileyi de patos (P21 e P22) e C. meleagridis de
pinto (Pinto) e seqüências equivalentes já depositadas no GenBank.
Foram comparadas as enzimas SspI, VspI, DdeI, AseI e NdeI.
39
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Distância genética calculada pelo Kimura- 2 Parâmetro,
comparando a amostra brasileira de C. felis e seqüências previamente
depositadas no GenBank.
Página
46
Tabela 2: Distância genética calculada pelo Kimura- 2 Parâmetro,
comparando a amostra brasileira de C. canis e seqüências previamente
depositadas no GenBank.
46
Tabela 3: Distância genética calculada pelo Kimura- 2 Parâmetro,
comparando as amostras brasileiras de Cryptosporidium de Cavia
porcelus e seqüências previamente depositadas no GenBank.
47
IX
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO___________________________________________________________ 1
2 REVISÃO DE LITERATURA _______________________________________________ 3
2.1 Histórico do Gênero Cryptosporidium. _____________________________________ 3
2.2 Morfologia ___________________________________________________________ 3
2.3 Importância como Zoonose ______________________________________________ 4
2.4 Diagnóstico___________________________________________________________ 5
2.5 Diagnóstico Utilizando a Reação da Polimerase em Cadeia – PCR _______________ 6
2.5.1 Obtenção do DNA para a realização das análises - extração do DNA ____________ 6
2.5.2 Genes Utilizados Nas Análises __________________________________________ 8
2.5.3 Técnicas de PCR ____________________________________________________ 12
2.5.3.1 PCR simples e Nested PCR __________________________________________ 12
2.5.3.2 PCR da Transcriptase Reversa (Reverse Transcription PCR) ________________ 13
2.5.3.3 PCR de Tempo Real (Real time PCR) __________________________________ 14
2.5.4 Técnicas de identificação de genótipos e subgenótipos - Fingerprinting _________ 15
2.5.4.1 Técnica do Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição – RFLP
(Restriction Fragment Length Polimorfism) ___________________________________ 15
2.5.4.2 Amplificação Randomizada do DNA Polimórfico - RAPD__________________ 17
2.5.4.3 Polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados - AFLP __________ 18
2.5.4.4 Uso de Micro e minisatélites _________________________________________ 19
2.5.5.5 Polimorfismo da conformação de fitas únicas - SSCP______________________ 22
2.6 Estudo Filogênico_____________________________________________________ 23
3 MATERIAIS E MÉTODOS ________________________________________________ 26
3.1 Locais de Realização da Pesquisa ________________________________________ 26
3.2 Locais de Coleta das Amostras fecais e obtenção de oocistos para as análises ______ 26
3.2.1 Mercado Municipal __________________________________________________ 26
3.2.2 Abrigo para gatos. ___________________________________________________ 27
3.2.3 Fazenda de bovinos de leite. ___________________________________________ 27
3.3 Processamento das amostras fecais _______________________________________ 27
3.4 Extração do DNA total em amostras fecais _________________________________ 27
3.5 Realização do PCR primária e nested______________________________________ 28
3.6 Digestão dos Produtos do Nested PCR com Enzimas de Restrição_______________ 28
3.7 Seqüenciamento e Análise Filogenética____________________________________ 28
4 RESULTADOS _________________________________________________________ 30
4.1 Mercado Municipal ___________________________________________________ 30
4.2 Abrigo de gatos_______________________________________________________ 33
4.3 Bovinos leiteiros______________________________________________________ 35
4.4 Seqüências obtidas e identificação de sítios de corte enzimático ________________ 38
4.5 Filogenia____________________________________________________________ 46
5 DISCUSSÃO____________________________________________________________ 50
6 CONCLUSÕES _________________________________________________________ 52
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________________________________ 53
1
1 INTRODUÇÃO
O gênero Cryptosporidium tem sido classificado junto com outros coccídios entéricos
na ordem Eucoccidiorida com base nas similaridades de suas características morfológicas e de
seu ciclo de vida.
Baseado na proposta de classificação em 1988, por Levine, esse protozoário pertence
ao Filo Apicomplexa, caracterizado por apresentar complexo apical e todos os seus
representantes serem parasitas. Classe Sporozoasida por apresentar reprodução assexuada e
sexuada com a produção de oocisto; Subclasse Coccidiasina com ciclo de vida que envolve
merogonia, gametogonia e esporogonia. Ordem Eucoccidiida apresentando merogonia ou
esquizogonia; Subordem Eimeriina com o desenvolvimento independente de macrogamonte e
microgamontes. Família Cryptosporidiidae, apresentando oocisto com quatro esporozoítas,
esporocisto ausente e todos os estágios endógenos desenvolvendo-se isoladamente em
vacúolo parasitóforo na superfície das células parasitadas, sendo um protozoário intracelular/
extracitoplasmático que possui um ciclo biológico essencialmente monoxeno.
Após a primeira descrição do gênero Cryptosporidium, em 1907 por Tyzzer, diversas
espécies foram nomeadas em função dos hospedeiros nos quais foram encontradas e inclusive,
oocistos de Cryptosporidium foram confundidos, por alguns pesquisadores, com esporocistos
de Sarcocystis. Os critérios para designar espécies de representantes do filo Apicomplexa
incluem a especificidade por hospedeiro, morfologia dos oocistos e local de parasitismo,
contudo, para espécies pertencentes ao gênero Cryptosporidium, somente esses critérios não
são adequados para identificar e nomear novas espécies.
Os oocistos das diferentes espécies de Cryptosporidium são idênticos
morfologicamente e existem similaridades de morfometria em muitas delas. Essas
similaridades na estrutura têm causado confusão na nominação de várias espécies, não
sustentando uma classificação segura.
Através de estudos morfológicos e ultra-estruturais foram identificadas as
classificações errôneas e algumas espécies nomeadas no passado foram desconsideradas. Em
seguida foi sugerido o conceito equivocado da especificidade estrita de Cryptosporidium
quanto aos hospedeiros, o que resultou novamente na nomeação de diversas novas espécies. A
intensificação de estudos de infecção cruzada derrubou o conceito da especificidade restrita e
muitas das novas espécies de Cryptosporidium de localização intestinal, contendo oocistos
considerados de tamanho pequeno, foram consideradas sinonímias de C. parvum. Durante
alguns anos esta espécie foi decrita como sendo a única espécie parasita de mamíferos, ao
lado de C. wrairi e C. felis, que conseguiram manter o status de espécie devido a
características biológicas distintas (XIAO et al., 2004a).
Com o advento das técnicas de biologia molecular a taxonomia do gênero sofreu
novas mudanças, sendo que o número de espécies consideradas como válidas ainda é
largamente discutido entre os pesquisadores. O’Donoughue (1995) considerou seis espécies
válidas de Cryptosporidium, sendo elas C. parvum, C. muris, C. meleagridis, C. baileyi e C.
serpentis e C. nasorum. Mais tarde Fayer et al. (1997), acrescentaram a esta lista C. wrairi e
C. felis. Recentemente, foram descritas diversas outras espécies, baseando-se principalmente
em características moleculares, sendo C. saurophylum parasitando lagartos (KOUDELA;
MODRÝ, 1998); C. galli (RYAN et al., 1999) afetando aves; C. andersoni (LINDSAY et al.
2000) em bovinos; C. canis (FAYER et al., 2001) parasitando cães; C. molnari em peixes
marinhos (ALVAREZ-PELLITERO; SITJÀ-BOBADILLA, 2002); C. hominis (MORGAN-
RYAN et al., 2002) em humanos; C. suis (RYAN et al, 2003) em suínos e C. bovis (FAYER
et al, 2005) infectando também bovinos.
2
O desafio atual é definir até que ponto uma espécie deve ser considerada como tal ou
como variante de outra. Existe, a necessidade de um critério para a descrição e validação das
espécies do gênero Cryptosporidium. (XIAO et al., 2002).
Muitas tentativas têm sido feitas no sentido de caracterizar espécies, cepas e isolados
de Cryptosporidium utilizando uma variedade de técnicas da biologia molecular, além das
morfológicas, bioquímicas e imunológicas (O’DONUGHUE, 1995). Este tipo de abordagem
tem sido enfatizado por vários autores, com o objetivo de proporcionar soluções significativas
aos problemas relacionados à caracterizações genéticas do gênero Cryptosporidium. Porém, o
tipo de informação disponível para as diferentes espécies e genótipos do parasito é altamente
variável. Para algumas espécies, como C. nasorum e C. molnari, não existem dados referentes
ao seqüenciamento genético, enquanto que para a maioria, poucas características
morfológicas e biológicas são relatadas nos estudos (UPTON, 2002).
Nos últimos anos a espécie C. parvum foi submetida a intensos estudos moleculares e
filogenéticos com o propósito de elucidar se os diversos genótipos caracterizados não seriam
na realidade espécies distintas. Como resultado foram nomeados C. canis (FAYER et al.,
2001), que era o antigo genótipo canino de C. parvum; C. suis (RYAN et al., 2004) que é a
renominação do antigo C. parvum genótipo suíno. Cryptosporidium hominis (MORGAN-
RYAN et al., 2002) representa o genótipo humano de C. parvum, cujo hospedeiro é o homem
e C. bovis (FAYER et al., 2005) é o antigo subgenótipo bovino tipo B de C. parvum, que
infecta apenas ruminantes e é geneticamente relacionado ao genótipo de cervídeos.
O nome da espécie C. parvum ficou reservado a hospedeiros ruminantes e outros
mamíferos, incluindo o homem. Ainda se considera esta espécie como sendo na realidade um
grupo de espécies crípticas (de origem comum a C. parvum), denominadas de genótipos de C.
parvum, como forma de nomear protozoários de localização intestinal, de pequeno tamanho e
que apresentam a capacidade de infectar diversas espécies de mamíferos.
O presente trabalho teve por objetivo caracterizar geneticamente as espécies de
Cryptosporidium oriundos de vários hospedeiros, realizar o seqüenciamento e análises
filogenéticas, incluindo o depósito das primeiras seqüências brasileiras de Cryptosporidium
spp. de origem animal no GenBank.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico do Gênero Cryptosporidium.
A primeira descrição de um protozoário que infectava as células epiteliais do
estômago de camundongos foi feita por TYZZER em 1907, que nominou o parasito de C.
muris, em 1910. A família Cryptosporidiidae foi estabelecida em 1911 por LEGER e em
1912, TYZZER descreveu uma outra espécie do mesmo gênero, que parasitava as células
intestinais de camundongos, denominando-a C. parvum.
Em 1929, TYZZER descreveu Cryptosporidium sp. em cecos de frangos e o
indentificou como sendo C. parvum. A espécie foi mais tarde considerada como sendo
sinonímia de C. baileyi (CURRENT et al., 1986). A partir dessa data, diversos trabalhos
descreveram o parasitismo por Cryptosporidium sp. em várias espécies de mamíferos, aves,
répteis, anfíbios e peixes, porém na maioria das descrições iniciais tratava-se de esporocistos
de Sarcocystis sp. Em diversas outras circunstâncias, foram nomeadas novas espécies de
Cryptosporidium, com base unicamente no hospedeiro do qual o isolado foi obtido. Mais
tarde, estas espécies foram consideradas inválidas, quando foi verificada a baixa
especificidade do parasito ao hospedeiro. (XIAO et al., 2004a).
A patogenicidade do gênero foi relatada pela primeira vez por Slavin, em 1955, que
atribuiu a C. meleagridis a mortalidade de perus jovens de uma criação comercial e em 1971 o
primeiro caso de infecção de um bezerro foi descrito (PANCIERA et al., 1971).
Na década de 70, surgiu o interesse da comunidade médica, após os relatos da
criptosporidiose em pacientes imunocompetentes e imunodeprimidos (MEISEL et al, 1976;
NIME et al, 1976). Atualmente, a criptosporidiose é uma doença bem estudada e relatada,
principalmente como causa de diarréia severa em pessoas imunocomprometidas, como ocorre
em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV).
Apesar da reconhecida importância de Cryptosporidium como patógeno de
vertebrados, ainda há muitas dúvidas sobre quais são as espécies, e dentro destas, quais os
genótipos que representam maiores riscos para populações humanas e animais. É evidente a
necessidade de estudos sobre patogenicidade, transmissão cruzada e potencial zoonótico do
agente (O’DONOUGUE, 1995).
2.2 Morfologia
O gênero Cryptosporidium possui morfologia variável, de acordo com os estádios
evolutivos. Há, ainda, ligeiras diferenças morfométricas, principalmente em relação ao
tamanho dos oocistos, entre as diferentes espécies.
Todos os estádios evolutivos de Cryptosporidium sp. são microscópicos e
considerados muito pequenos, quando comparados a outros esporozoários entéricos
(O’DONOUGHUE, 1995).
A parede do oocisto possui uma camada interna e outra externa, como ocorre também
em outros coccídios. Em uma das extremidades, o oocisto possui uma região de fragilidade
que origina uma sutura e é através da abertura desta que os esporozoítas deixam o oocisto
durante o desencistamento (REDUKER et al., 1985).
Cada oocisto possui quatro esporozoítas e a ausência de esporocisto é uma
característica do gênero (O’DONOUGHUE, 1995).
4
Os estádios endógenos são estreitamente associados com a superfície luminal das
células epiteliais do hospedeiro. Em cortes histológicos, o protozoário se apresenta como
pequenos corpos basofílicos aparentemente aderidas à superfície das células, dando algumas
vezes à borda das microvilosidades uma aparência granulada. Os estádios evolutivos são
esféricos a elípticos, medindo de 2 a 6 µm de diâmetro. Pela microscopia eletrônica foi
evidenciado que os estádios evolutivos são intracelulares, extracitoplasmáticos e contidos por
um vacúolo parasitóforo (O’DONOUGHUE, 1995).
Os esporozoítas e merozoítas de Cryptosporidium são similares aos dos outros
coccidios, possuindo as organelas características do filo. Desta maneira, estão presentes as
roptrias, micronemas, grânulos densos, núcleo, ribossomos, microtúbulos e o anel apical.
Porém, outras organelas estão ausentes como os anéis polares, mitocôndria, microporos e
conóide (FAYER et al., 1997).
Esporozoítas e merozoítas nas células epiteliais são englobados pelas
microvilosidades, formando-se um vacúolo parasitóforo. Ocorre a formação da organela de
fixação ou alimentação por parte do parasito e da célula parasitada (FAYER et al., 1997).
Acredita-se que esta organela facilite a absorção de nutrientes da célula hospedeira
(O’DONOUGHUE, 1995).
Microgamontes são menos freqüentemente encontrados que outras formas evolutivas.
Microgamontes imaturos assemelham-se a esquizontes, porém eles contêm núcleos pequenos
e compactos. Os microgametas possuem forma alongada (1,4 x 0,5µm em C. parvum), com a
extremidade anterior achatada, sendo que há ausência de flagelos e mitocôndria (FAYER et
al., 1997)
Macrogamontes de C. parvum medem aproximadamente 4- 6µm e são esféricos a
ovóides. Para a fertilização, os microgametas aderem-se, por intermédio do capuz apical, à
célula que contém o macrogamonte, ocorrendo em seguida a inserção do núcleo com seus
microtúbulos associados no macrogamonte (FAYER et al., 1997).
O macrogamonte fertilizado, ou zigoto, pode formar um oocisto de parede espessa ou
fina. Aqueles zigotos que formarão oocistos de parede espessa possuem corpos de formação
de parede do tipo I e II, similarmente a outros coccidios. Os zigotos que formarão oocistos de
parede fina, não possuem estes corpos de formação de parede (FAYER et al., 1997).
2.3 Importância como Zoonose
Com o advento da imunodeficiência adquirida humana (AIDS) o estudo da
criptosporidiose ganhou destaque. A possibilidade da transmissão a partir do contato com
animais, água ou alimentos contaminados tem sido um campo vasto de estudos
epidemiológicos.
A contaminação da água pode ocorrer com oocistos eliminados através das fezes de
animais ou do homem. Os principais fatores que possibilitaram que C. parvum se tornasse o
mais importante contaminante de água potável nos Estados Unidos da América (EUA), é a
extrema resistência dos oocistos aos tratamentos convencionais de água (ROSE et al., 1997) e
o rápido ciclo biológico resultando em grande quantidade de oocistos eliminados pelas fezes
(O’DONOUGHUE, 1995).
Apesar do comprovado potencial zoonótico, oocistos isolados de casos humanos
individuais e de casos ocorridos durante surtos indicaram que na maioria dos isolados tratava-
se de C. hominis, evidenciando que a transmissão entre humanos, sem o envolvimento de
animais, é um fator de alta importância na epidemiologia da doença (SULAIMAN et al.,
1998).
5
Outras espécies de Cryptosporidium também podem infectar animais domésticos e o
homem, sendo que a possibilidade de transmissão zoonótica depende da espécie do
protozoário e da suscetibilidade do hospedeiro.
Em animais domésticos são encontrados C. felis, infectando principalmente gatos, C.
canis infectando os cães (Morgan et al. 2000; Fayer et al., 2001); C. parvum, C. andersoni e
C. bovis, infectando os ruminantes; C. galli, C . baileyi e C. meleagridis infectando aves
domésticas e silvestres (RYAN at al., 2003). Porém, a maioria destas espécies já foi
diagnosticada infectando outros hospedeiros, além dos mais comuns. Assim há diversos
relatos sobre o parasitismo de C. felis em humanos (PIENIAZEK et al., 1999; XIAO et al.,
2001; CAMA et al, 2003) e apesar desta espécie ter sido considerada de alta especificidade
para gatos, ela também já foi encontrada infectando bovinos (BORNAY-LLINARES et al.,
1999). Foi possível, experimentalmente, infectar gatos com C. parvum (FAYER, 1997;
DARABUS; OLARIU, 2003).
Cães podem ser infectados experimentalmente com C. parvum (DARABUS; OLARIU,
2003). Cryptosporidium canis também já foi diagnosticado em alguns casos humanos (XIAO
et al., 2001; CAMA et al., 2003), porém, na maioria dos estudos epidemiológicos, a infecção
natural dos cães ocorre por C. canis (ABE et al., 2002).
Atualmente, a atenção dos pesquisadores tem se voltado sobre a capacidade de C.
meleagridis infectar o homem, sendo que esta espécie é considerada a terceira espécie mais
diagnosticada neste hospedeiro (COUPE et al, 2005; XIAO et al., 2001; XIAO et al., 2004c).
Apesar destes relatos de infecção humana por espécies de Cryptosporidium
relacionadas ao parasitismo animal, as espécies mais freqüentemente encontradas são C.
hominis e C. parvum (COUPE et al, 2005; PENG et al, 1997; XIAO et al., 2001; XIAO et al.,
2004 a; XIAO et al., 2004 c).
Os estudos demostraram que diversas espécies podem parasitar o homem, sendo que
indivíduos com alguma disfunção imunológica são os mais suscetíveis, como ocorre com os
portadores do HIV e em crianças, nas quais o sistema imunológico ainda não está totalmente
desenvolvido (CAMA et al., 2003; XIAO et al., 2001; XIAO et al., 2004c).
2.4 Diagnóstico
Há diversos métodos de diagnóstico da criptosporidiose, desde métodos simples como
o exame parasitológico de fezes à fresco, até métodos sofisticados como a reação em cadeia
da polimerase (PCR). A metodologia a ser empregada depende das condições de infra-
estrutura do laboratório e da especificidade do diagnóstico desejado. Se a finalidade é apenas
determinar se há o parasitismo por Cryptosporidum sp., sem a identificação de espécie, então
métodos de exame parasitológico de fezes rotineiros e colorações especiais de esfregaços de
fezes podem ser o suficiente.
Para determinar qual é a espécie de Cryptosporidium envolvida, o uso da PCR torna-se
imprescindível. Já, se o objetivo é determinar se o hospedeiro alguma vez foi exposto ao
protozoário, então métodos sorológicos podem ser empregados. Os resultados destes irão
indicar o contato do hospedeiro com o protozoário, porém não permitem a diferenciação entre
uma infecção passada e já curada e uma infecção atual subclínica ou clínica.
A principal metodologia de diagnóstico utilizada na maioria dos laboratórios é a que
permite a identificação da presença de oocistos do protozoário nas fezes, sem a determinação
da espécie envolvida. Este fato deve-se a duas razões principais: a facilidade do procedimento
laboratorial e o relativo baixo custo, quando comparado a metodologias mais elaboradas.
Para o diagnóstico através de exames de fezes, amostras recém emitidas podem ser
coletadas e enviadas ao laboratório sem adição de conservantes ou preservantes ou o material
6
fecal pode ser preservado em formalina à 10% ou em solução aquosa de dicromato de
potássio a 2,5%. Oocistos mantidos em dicromato de potássio à 2,5 %, mantém a
infectividade durante vários meses e devem ser considerados como material de risco
biológico. Para inativar os oocistos é recomendada a adição de formalina a 10%, sendo que o
tempo de contato deve ser superior à 24 horas para neutralização dos oocistos (ARROWOOD,
1997).
A eliminação de oocistos, pelo hospedeiro, é intermitente em indivíduos sintomáticos
e assintomáticos. Desta maneira, várias amostras de fezes devem ser analisadas antes de ser
dado um diagnóstico preciso (CURRENT; GARCIA, 1991). Durante um surto de
cryptosporidiose humana transmitida pela água, nos Estados Unidos da América, a análise de
uma única amostra fecal foi capaz de identificar apenas 50% dos indivíduos infectados pelo
Cryptosporidium (FAYER et al., 1997).
A concentração das fezes possui importância relevante para aumentar as chances de
encontrar o protozoário. Podem ser utilizadas técnicas comuns de flutuação em solução
saturada de açúcar, sal ou sulfato de zinco (ARROWOOD, 1997).
Quando forem utilizadas técnicas de sedimentação, deve ser considerado o baixo peso
dos oocistos, que pode prejudicar a sedimentação em exames de rotina. Para a sedimentação
de oocistos de Cryptosporidium, devem ser aumentados a rotação da centrífuga e o tempo de
centrifugação. Uma rotação de 2000 – 2500 rpm por 10 minutos é necessária para garantir a
sedimentação adequada dos oocistos (ARROWOOD, 1997), o que equivale a
apoximadamente 402,48g.
Quando se utilizam técnicas de flutuação em solução de açúcar, os oocistos podem ser
observados ligeiramente róseos, na microscopia de campo claro, são claros e birefringentes
quando vistos em contraste de fase. Os oocistos encarquilham a partir de 15 minutos, quando
estão em solução saturada de açúcar, perdendo sua forma esférica, assim como também, a sua
coloração rósea (CURRENT; GARCIA, 1991).
A observação de estádios endógenos foi inicialmente realizada através da coloração de
cortes histológicos de tecidos infectados, raspados da mucosa intestinal ou do conteúdo
intestinal. Posteriormente, foi descoberto que os oocistos podiam ser evidenciados por
métodos não invasivos, utilizando técnicas ou métodos de coloração em material fecal.
Inicialmente utilizou-se o corante Giemsa, porém com este corante, não havia diferença entre
os oocistos e outras estruturas fecais fato que dificulta o diagnóstico.
Em 1981, a técnica de coloração de Ziehl-Neelsen possibilitou aos laboratórios
clínicos e de pesquisa um diagnóstico fácil e rápido da forma infectante, que são os oocistos
eliminados nas fezes. Com esta técnica, os oocistos apresentavam-se corado de vermelho ou
róseo, enquanto que outras estruturas fecais coraram-se de verde ou azul, de acordo com o
corante utilizado para contra corar. O método de Ziehl-Neelsen foi modificado e melhorado
durante os anos, e atualmente há vários protocolos de coloração, a frio e à quente, baseados no
método original (ARROWOOD, 1997).
2.5 Diagnóstico Utilizando a Reação da Polimerase em Cadeia – PCR
2.5.1 Obtenção do DNA para a realização das análises - extração do DNA
Um dos desafios primordiais dos pesquisadores foi a obtenção do DNA a partir de
oocistos de Cryptosporidium. As técnicas inicialmente utilizadas para a obtenção de DNA
genômico de bactérias não se aplicavam ao Cryptosporidium, por este possuir um oocisto com
uma parede extremamente resistente que não se rompe com facilidade. Portanto as técnicas de
extração de DNA deste protozoário incluem sempre um passo de rompimento dos oocistos,
seja por meios físicos, mecânicos, enzimáticos ou ainda a combinação destes.
7
Outros fatores que podem causar dificuldades no emprego da PCR para
Cryptosporidium são a distribuição desigual de oocistos nas fezes, fazendo com que a alíquota
utilizada no procedimento não contenha oocistos; falha na ruptura dos oocistos durante a
extração, evitando assim a liberação do DNA para a análise; a adsorção do DNA por
compostos presentes nas fezes e a presença de inibidores da PCR que também podem
dificultar o emprego da técnica (SCORZA et al., 2003).
Os inibidores, principalmente compostos orgânicos, presentes em amostras complexas,
tais como fezes e solos, podem diminuir a sensibilidade da PCR em até 1000 vezes (WARD;
WANG, 2001). Para evitar o impacto negativo de tais substâncias, são previamente utilizadas
técnicas de concentração e purificação dos oocistos, aumentando assim a sensibilidade da
PCR. São diversas as técnicas descritas na literatura, indicadas para amostras fecais, sendo
que, para amostras que não sofreram congelamento antes do processamento, podem ser
utilizadas técnicas comuns de flutuação em solução saturada de açúcar, sal ou sulfato de zinco
(ARROWOOD, 1997). Oocistos das amostras fecais podem ser concentrados pela técnica do
álcool-éter seguido por gradiente de sacarose (COUPE et al., 2005) ou Percoll ou outras
soluções hipertônicas (KUCZYNSKA; SHELTON, 1999).
O uso da formalina e do álcool polivinílico como conservantes ou preservantes pode
inviabilizar a extração do DNA, uma vez que podem causar a degradação do mesmo
(PIENIAZEK et al., 1999). Portanto, métodos como a concentração de oocistos pelo uso da
formalina-éter devem ser evitados, sendo que nesta técnica a formalina pode ser substituída
pela água destilada. Nichols et al (2006) relatam altas taxas de amplificação na PCR,
utilizando uma concentração prévia dos oocistos contidos nas amostras fecais utilizando para
esta metodologia a água e éter. Os autores relatam que fezes líquidas ou semi-sólidas
apresentam maiores taxas de recuperação de oocistos do que fezes sólidas, sendo que a perda
de oocistos no sobrenadante e no tampão gorduroso, varia entre 1 a 2 % dos oocistos nas
amostras fecais líquidas e semi-sólidas, chegando a mais de 3 % em amostras fecais sólidas.
Em amostras fecais congeladas, ocorre o rompimento dos oocistos e
conseqüentemente a liberação dos esporozoítas de Cryptosporidium, portanto nessas amostras
não podem ser realizadas as etapas de purificação ou concentração usando soluções saturadas,
uma vez que este procedimento causaria a perda e/ou degradação do material genético
presente. Tornam-se assim necessários métodos de extração de DNA aplicáveis à amostra de
fezes totais. Nestes casos pode ser usada a extração de DNA pelo fenol-clorofórmio, ou o uso
de suspensão de sílica (Glassmilk) (WARD; WANG, 2001).
A purificação do DNA usando suspensão de sílica é baseada na adsorção seletiva de
ácidos nucléicos às partículas de sílica, o que possibilita procedimentos de lavagem do
complexo sílica-DNA para a remoção de proteínas e inibidores indesejáveis. O protocolo
original foi proposto por Boom et al. (1990), sendo que a técnica pode ser aplicada tanto para
a purificação de DNA quanto de RNA.
Colunas de centrifugação (spin colums) usam uma resina com microporos que
permite que as moléculas grandes (como ácidos nucléicos) sejam eluídas primeiro, enquanto
moléculas menores (proteínas e inibidores) ficam retidas (WARD; WANG, 2001).
A extração com o uso do fenol-clorofórmio desnatura as proteínas que
subseqüentemente formam uma camada entre as fases de água e resíduos orgânicos, sendo
que o DNA fica retido na fase aquosa e a precipitação com álcool, geralmente empregada
como etapa final das diversas técnicas, auxilia na remoção de resíduos orgânicos e concentra
o DNA da solução aquosa (WARD; WANG, 2001).
Para a remoção de inibidores pode ser adicionado PVP no processo de extração
(COUPE et al., 2005) ou mais tarde, na própria reação da PCR (NICHOLS et al., 2006).
Para promover a lise dos oocistos, as duas alternativas descritas a seguir estão entre as
mais utilizadas, porém podem ser encontradas na literatura inúmeras combinações de técnicas,
8
inserção e/ou retirada de certos reagentes e alterações quantitativas no seu uso, de acordo com
o protocolo seguido por cada laboratório.
A lise dos oocistos pode ser promovida por meios físicos, através de ciclos de
congelamento e descongelamento usando-se nitrogênio líquido seguido de fervura do material
contendo oocistos. A extração do DNA ocorre posteriormente em soluções com proteinase K
e pelo fenol-clorofórmio (WARD; WANG, 2001; NICHOLS et al., 2006).
Os protocolos descritos variam consideravelmente quanto aos ciclos de congelamento-
descongelamento necessários. Higgins et al (2001) sugerem que dois ciclos são o suficiente
para promover o rompimento da maioria dos oocistos, enquanto que Nichols et al (2006)
descrevem 15 ciclos, adicionando o uso do vórtex a cada cinco ciclos, para aumentar a
eficácia do protocolo.
Uma alternativa é o uso de pérolas de vidro de 0,5 mm de diâmetro e uso do vórtex,
para promover a lise dos oocistos e a liberação do DNA. Esta lise mecânica é realizada na
presença de Tiocianato de Guanidina 10M, podendo ser usada a solução comercial (DNAzol
®) ou preparada no laboratório, que promove a diluição do DNA. O DNA fica retido na
solução de Tiocianato de Guanidina, podendo ser precipitada pelo álcool 80%
(McLAUCHLIN et al., 1999). Para inibir a formação de espuma durante o processo de
extração com o uso do Tiocianato de Guanidina, o álcool isoamílico pode ser acrescentado ao
processo (McLAUCHLIN et al., 1999).
2.5.2 Genes Utilizados Nas Análises
Considerando que a seqüência de DNA genômico codifica todas as informações
hereditárias responsáveis para o desenvolvimento da patogênese, virulência, especificidade e
resistência imunológica, um conhecimento do genoma de C. parvum poderá fornecer
informações necessárias para uma pesquisa específica e de eficiente custo-benefício sobre a
prevenção e tratamento da criptosporidiose (WIDMER et al., 2002).
Cryptosporidium parvum possui provavelmente oito cromossomos. Cada um com
tamanho aproximado de 1,03 a 1,54 Mb, tendo um tamanho total do genoma de ~10,4Mb.
Trata-se de um genoma Eucariota relativamente pequeno, tornando-o ideal para o
seqüenciamento. Adicionalmente a grande maioria dos genes caracterizados não possui
introns, o que aumenta a eficácia da caracterização de seqüências codificantes de genes de C.
parvum. O genoma completo de C. parvum contém aproximadamente ~5000 genes
(WIDMER et al., 2002).
Dentre esses genes, alguns são os alvos mais escolhidos para a realização da PCR, tais
como o gene codificante da subunidade menor do RNA ribossomal (SSU rDNA ou SSU
rRNA ou 18S rDNA ou 18Sr RNA), da proteína da parede do oocisto de Cryptosporidium
(COWP), o gene codificante da glicoproteina 60kDa (GP60), o gene codificante para a
proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP-70) e o gene codificante da Actina (XIAO;
RYAN, 2004; XIAO et al., 2004 c).
Para a genotipagem de Cryptosporidium, especialmente para o diagnóstico de
espécies, torna-se necessária a escolha de loci conservados, que possam ser utilizados como
marcadores filogenéticos, tais como a sub-unidade menor do DNA ribossomal (SSU rDNA) e
o locus da proteína do choque térmico 70-kDa (HSP-70). A determinação de subgenótipos,
envolvendo a pesquisa de variação dentro de uma determinada espécie ou genótipo requer o
uso de loci mais variáveis como o gene hiper-variável da glicoproteina 60-kDa (GP-60) e o
uso de microsatelites (FERGUSON et al., 2006).
O gene SSU rDNA de Cryptosporidium evolui lentamente, com variações nas
seqüências limitadas a diversas regiões do gene. Contrastando, os genes codificantes do
HSP70 e Actina são altamente polimórficos em todo o comprimento dos genes e a diferença
9
entre as espécies gástricas e intestinais, quando estes genes são utilizados, é tão grande quanto
a diferença entre os gêneros Plasmodium e Cryptosporidium. Assim os genes HSP-70 e
Actina podem ser muito úteis na diferenciação de espécies de Cryptosporidium muito
similares, devido à alta heterogeneidade das seqüências (XIAO et al., 2004 c).
O gene SSU rDNA é o mais amplamente caracterizado pelos pesquisadores, havendo
grande número de seqüências, de espécies conhecidas de Cryptosporidium, depositadas nos
bancos de dados públicos. O gene SSU rDNA possui uma região hipervariável localizada
entre os nucleotídeos 615-850 e três regiões polimórficas entre os nucleotídeos 179-271
(COUPE et al., 2005). O gene possui ainda cinco cópias por genoma haplóide (CHALMERS,
2005; FERGUSON et al, 2006).
Técnicas associando a PCR do SSU rDNA gene e o uso de enzimas de restrição
(RFLP), são capazes de identificar praticamente todas as espécies de Cryptosporidium.
Também há primers para a PCR primário e o Nested, que amplificam todas as espécies do
gênero, possibilitando o posterior seqüenciamento ou RFLP para a determinação das espécies
(XIAO; RYAN, 2004).
O gene COWP possui alto grau de polimorfismo, o que gerou uma mistura de cinco ou
seis conjuntos de primers para a detecção das variações inter-específicas, fazendo com que o
gene possa ser utilizado na diferenciação entre C. parvum, C. hominis e C. meleagridis
(AMAR et al., 2004). Em contraste ao 18S rDNA gene, o gene COWP possui apenas uma
cópia no genoma inteiro, o que resulta em uma menor sensibilidade dos métodos que utilizam
o gene COWP, em levantamentos epidemiológicos, quando comparado ao primeiro
(McLAUCHLIN et al., 1999).
Sua utilidade, como ferramenta para diagnóstico molecular só é interessante quando
há grande quantidade de material do qual se deseja extrair DNA, grande número de amostras
a serem testadas, e quando C. parvum e C. hominis são as espécies predominantes nas
amostras, como ocorre em amostras clínicas humanas (FERGUSON et al., 2006).
Kato et al. (2003) descreveram uma técnica de Nested PCR e um par de primers para
o gene COWP, que amplifica C. parvum, C. hominis, C. wrairi e C. meleagridis, sendo que as
espécies podem ser diferenciadas pela RFLP. Os autores descrevem que o limite de detecção
da técnica é de 100 oocistos por 1 ml de material fecal contendo ou ajustado para 50% de
líquido, o que torna o procedimento menos sensível que o uso do SSU rDNA gene, que
detecta um oocisto em 1 ml de material fecal.
O gene codificante das glicoproteinas presentes na superfície de esporozoítos gp 40 e
gp15 (Cpgp 40/15), por ser um locus altamente variável, pode ser de alta utilidade na sub-
genotipagem de diferentes isolados de Cryptosporidium, particularmente de C. hominis, onde
podem ser identificados quatro sub-genótipos (COHEN et al., 2006; CEVALLOS et al.,
2000; WINTER et al, 2000). Para aumentar a sensibilidade do diagnóstico utilizando o Cpgp
40/15, Cohen et al (2006), descreveram o uso de uma Nested PCR para este gene.
A Proteína adesiva relacionada à trombospondina (TRAP) é membro de uma classe de
proteínas presente nos apicomplexas. A proteína está associada com a superfície celular e o
complexo micronemal destes parasitos e acredita-se que esteja envolvida com o processo de
aderência à superfície da célula hospedeira. Conseqüentemente, mudanças nesta proteína
poderiam afetar a especificidade de aderência e, conseqüentemente, a especificidade quanto às
espécies hospedeiras do parasito (PENG et al, 1997). O gene codificante da TRAP – C1 é
utilizado na genotipagem das espécies de Cryptosporidium.
Muthsuamy et al (2006) realizaram a genotipagem de múltiplo locus de isolados de
Cryptosporidium de humanos. A sensibilidade dos diferentes métodos foi de 100% para os
exames de amplificação do gene codificante do SSU rRNA, 39,5% para o gene codificante do
COWP, 44% para o gene codificante da proteína TRAP e 97,5% para o Cpgp 40/15 gene.
10
O espaçador de transcição interna (ITS) de DNA nuclear ribossomal é um marcador
eficiente para a identificação genotípica ou subgenotípica, possuindo grande variação dentro
das espécies (GASSER et al., 2004). O seqüenciamento direto das regiões ITS é difícil ou
impossível devido à variabilidade das seqüências (polimorfismo) no mesmo isolado de
oocistos, e a PCR-RFLP não resolve acuradamente a variação apresentada. Apesar deste
impedimento, a variação das seqüências internas ao ITS indica que esta região espaçadora
ribosomal deve ser particularmente útil no estudo da estrutura genética de populações e para
caracterizar a variabilidade genética inter e intra isolados (GASSER et al., 2003).
Alguns pesquisadores envidaram esforços para o desenvolvimento de primers
específicos para C. parvum e outras espécies do gênero. O primer descrito por Laxer et al.
(1991) foi um dos primeiros publicados. Originalmente foi desenvolvido para ser específico
ao C. parvum e C. hominis, que na época ainda não era reconhecido como uma nova espécie,
porém ele também amplifica C. meleagridis e C. wrairi (GUYOT et al., 2002).
Akiyoshi et al (2002) desenvolveram primers específicos para o diagnóstico de C.
parvum e outro par de primers específicos para C. hominis. A aplicação destes primers é para
possibilitar a identificação de infecções mistas, mesmo quando uma das espécies estiver
presente em quantidade menor que a outra.
No quadro 1 estão relacionados alguns dos primers descritos na literatura e que são
mencionados em vários trabalhos científicos.
Um protocolo de multiplex PCR, amplificando fragmentos de 18S rDNA com uso de
vários primers específicos, desenvolvido por Patel et al (1999), permite a identificação C.
parvum, C. wrairi, C. baileyi e C. muris, de acordo com o tamanho final dos amplicons
obtidos, sendo que C. parvum e C. wrairi precisam ser diferenciados pelo uso de RFLP.
Atualmente os procedimentos da PCR visam a utilização de iniciadores específicos ao
gênero Cryptosporidium, sendo que se torna necessária a realização de procedimentos
complementares, tais como a digestão por enzimas ou o sequenciamento, para a identificação
das espécies e genótipos.
11
Quadro 1: Alguns primers usados na caracterização dos genes SSu rRNA, HSP70 e
actina, das várias espécies de Cryptosporidium.
Gene
Nome dos
primers
Sequencia (5’ a 3’ )
Tamanho
do
Amplicon
(bp)
Uso Referência
SSU
rRNA
SSU-F1
SSU-R1
AACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTC
TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG
~1,750 Amplifica o gene
rRNA completo da
maioria de
orcanismos
eucariotos
Xiao et al.,
1999
apud Xiao
et al, 2004
SSU
rRNA
SSU-F2
SSU-R2
SSU-F3
SSU-R3
TTCTAGAGCTAATACATGCG
CCCATTTCCTTCGAAACAGGA
GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
~1,325
~820
Ambos os primers
são específicos para
Cryptosporidium e
podem ser usados no
nested PCR
Xiao et al.,
2000
apud Xiao
et al, 2004
SSU
Nuclear
rDNA
18 SiF
18SiR
AGT GAC AAG AAA TAA CAA TAC AGG
CCT GCT TTA AGC ACT CTA ATT TTC
~300 Gasser et
al., 2004
HSP70 HSP-F1
HSP-R1
HSP-F2
HSP-R2
ATGTCTGAAGGTCCAGCTATTGGTATTGA
TTAGTCGACCTCTTCAACAGTTGG
TA/CTTCATG/CTGTTGGTGTATGGAGAAA
CAACAGTTGGACCATTAGATCC
~2,010
~1,950
Ambos os primers
amplificam a
maioria dos
parasitos
apicomplexas e são
usados no nested
PCR.
Sulaiman
et al., 2000
apud Xiao
et al, 2004
Actina Act-F1
Act-R1
Act-F2
Act-R2
ATGA/GGA/TGAAGAAGA/TAA/GC/TA/TCAAGC
AGAAG/ACAC/TTTTCTGTGT/GACAAT
CAAGCA/TTTG/AGTTGTTGAT/CAA
TTTCTGTGT/GACAATA/TG/CA/TTGG
~1,095
~1,066
Ambos os primers
amplificam a
maioria dos
parasitos
apicomplexas e são
usados no nested
PCR.
Sulaiman
et al, 2002
apud Xiao
et al, 2004
Cpgp
40/15
CCG TTA TAG TCT CCG CTG TA
AAA GCA GAG GAA CCG GCA T
Genotipagem
subgenótipos
Wu et al.,
2003
Cpgp
40/15
para
Nested
Nested
ATG CAA AAA TAC GTG GAC TGG G
TCG CAC GAA AGA TTT CCA TTG
TTA CTC TCC GTT ATA GTC TCC GCT G
CGA ATA AGG CTG CAA AGA TTG C
Genotipagem
subgenótipos
Cohen et
al., 2006
DNA J-
Like
Protein
Primer de
Laxer
CCG AGT TTG ATC CAA AAA GTT ACG AA
ATG AGT TAT TCC GTA TAC TCC TCG AT
452 Específico para C.
parvum, C. hominis
e C. meleagridis
Laxer et al.
1991
ITS-2 YA56F
YA54R
GGC GCT ACT TCA TAT AAT ATA ATG TTT TTT
GGC GCT AAT TTT AAC TTA AAT TGG TTA AGA AA
~230 Genotipagem de
subgenótipos
Gasser et
al., 2004
COWP
nested
COWP 1
COWP 2
COWP 3
COWP 4
GGA AGA GAT TGT GTT CG
GCA GGA GCT ACA TAT AG
GTG TTC AAT CAG ACA CAG
CTB TAT ATC CTG GTG GGC AGA
~422
~312
Kato et al.,
2003
COWP BCOWPF
BCOWPR
ACC GCT TCT CAA CAA CCA TCT TGT CCT C
CGC ACC TGT TTC CCA CTC AAT GTA A
~769 Pedraza-
Diaz, 2000
TRAP
C1
TRAPC1F2
TRAPC1-Rc
TAA GGG TGG TGA TAA TGG CTG TA
CCT TCT GAT AAA GTT GCA TTA TAC GAC C
Específico C.
parvum
Akiyoshi et
al., 2002
TRAP
C1
TRAPC1F1
TRAPC1-Rc
TAA AAG TGG TGA TAA CAF ATG CG
CCT TCT GAT AAA GTT GCA TTA TAC GAC C
Específico C.
hominis
Akiyoshi et
al., 2002
12
2.5.3 Técnicas de PCR
2.5.3.1 PCR simples e Nested PCR
Na década de 80 surgiu a técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR), descrita
por Saiki et al. (1988), cuja capacidade de amplificação seletiva de genomas complexos está
promovendo uma revolução na taxonomia e estudo dos seres vivos.
O princípio da técnica de PCR baseia-se na desnaturação de uma amostra de DNA de
fita dupla através do aquecimento, em seguida a temperatura é diminuída para permitir que
seqüências conhecidas de oligonucleotídeos, os iniciadores ou primers, realizem o anelamento
nas seqüências complementares em fitas opostas do DNA molde (template); posteriormente
ocorre a extensão ou síntese de DNA ao longo da fita molde, em ambas as direções, que é
catalisada pela enzima termoestável DNA polimerase, obtendo-se duas fitas duplas de DNA.
A síntese é usualmente repetida 20 a 40 vezes, utilizando-se um termociclador automatizado.
Durante cada ciclo, o DNA molde é multiplicado por um fator dois, de forma que ao final do
processo existem milhões de cópias do DNA molde disponível para análises subseqüentes
(GASSER, 2006).
Esta técnica é particularmente importante no estudo dos parasitos, uma vez que
freqüentemente é difícil obter material genético suficiente dos diferentes estádios evolutivos,
para viabilizar a aplicação de análises mais antigas tais como a eletroforese de isoenzimas e
immunoblotting, que requerem grandes quantidades de proteínas de boa qualidade (WIDMER
et al., 2002; GASSER, 2006).
Ao longo dos anos surgiram diversas evoluções da técnica original, bem como
diferentes métodos de tratamento para o processamento dos produtos obtido, afim de que
possa ser realizada uma descrição acurada da espécie sob estudo.
As espécies de protozoários pertencentes ao gênero Cryptosporidium também foram e
estão sendo intensamente estudadas por intermédio das ferramentas que a biologia molecular
oferece, sendo que podem ser processadas amostras fecais ou ambientais, com ou sem etapas
de purificação anteriores às análises moleculares (WIDMER, 2002).
Segundo Morgan & Thompson (1998), as qualidades ideais de um teste de PCR para
diagnóstico de Cryptosporidium seriam a aplicabilidade a amostras clínicas e ambientais;
capacidade de processamento de 10-20 amostras em menos de uma hora; uma sensibilidade
para detectar amostras com menos de 10 oocistos; resultados de interpretação rápida; ensaio
robusto e altamente reproduzível; capacidade de diferenciar genótipos infectantes a uma
grande variedade de hospedeiros incluindo humanos e ainda uma boa relação custo-benefício
com possibilidades de quantificação dos oocistos.
Para poder alcançar estas características, vários protocolos foram desenvolvidos,
incluindo-se o uso de diferentes métodos de extração do DNA molde bem como a análise de
diferentes genes, de acordo com o poder discriminatório desejado.
Como algumas vezes a detecção do DNA por meio da PCR simples era considerado
inviável, devido à baixa quantidade de DNA ou inibidores enzimáticos presentes na amostra,
foi desenvolvida a técnica da Nested PCR para aumentar a especificidade e sensibilidade dos
testes (MORGAN; THOMPSON, 1998). Esta técnica consiste em realizar uma amplificação
primária da PCR simples, usando um par de primers específicos. Após, uma quantidade
determinada do produto é utilizada como DNA molde numa nova PCR, utilizando-se
geralmente um segundo par de primers específicos.
O uso da Nested PCR torna-se especialmente importante quando se necessita detectar
poucos organismos específicos contidos numa microflora diversa, como ocorre na extração de
DNA a partir de material fecal (AMAR et al., 2004). Porém, seu uso também aumenta os
13
riscos de contaminação, podendo estes ser controlados pela observação de protocolos
preventivos padrões (MORGAN; THOMPSON, 1998).
Higgins et al (2001) descrevem que a PCR primária aplicada a amostras fecais
congeladas, resulta em positividade quando nas amostras examinadas estão presentes mais de
200 oocistos de Cryptosporidium. Se na amostra houver um número menor de oocistos, então
se torna necessária a realização da Nested-PCR.
A maioria das técnicas de biologia molecular, aplicada ao diagnóstico para
Cryptosporidium inclui uma etapa final de seqüenciamento, para a identificação da espécie
estudada. O seqüenciamento também é de fundamental importância, quando as demais
técnicas deixarem dúvidas quanto à identificação correta da espécie envolvida. Sugere-se o
seqüenciamento direto a partir dos produtos da PCR, em vez de clones, para evitar que
artefatos sejam introduzidos na seqüência (XIAO; RYAN, 2004).
São aceitas 15 espécies de Cryptosporidium e mais de 30 genótipos já foram descritos,
destas apenas algumas espécies apresentam potencial zoonótico como C. felis, C.canis, C.
meleagridis, C. muris, C. hominis e C. parvum. Sendo que C. felis e C. hominis também já
foram diagnosticados em bovinos, contribuindo para uma maior contaminação ambiental
(SMITH et al., 2005; XIAO et al., 2004 a).
Assim torna-se essencial a identificação correta das espécies, principalmente em
amostras ambientais, tais como solo e água, para possibilitar uma estimativa do risco de
infecção à população humana (FERGUSON et al., 2006).
Dificuldades podem surgir, quando são utilizadas amostras ambientais ou de fezes,
para o diagnóstico de Cryptosporidium devido à presença de inibidores, que impedem a
realização da reação da PCR.
Como forma de superar o efeito dos inibidores fecais foi sugerido o aumento da
quantidade da enzima Taq DNA polimerase para 5U, a adição de Poli-Vinil-Pirrolidona
(PVP) na reação da PCR e diminuição da quantidade do DNA molde (NICHOLS et al., 2006).
Quando necessário também pode ser realizada a diluição do DNA genômico, o que dilui
concomitantemente os inibidores, possibilitando a reação da PCR, apesar de refletir
negativamente na sensibilidade do teste (WILDE et al., 1990).
Para identificar falsos negativos, devido à presença destes compostos, podem ser
utilizados controles de amplificação interna, que co-amplificam com o alvo durante a reação
da PCR. Na presença de inibidores, nem o controle interno, nem o alvo irão amplificar, assim
uma amostra verdadeiramente negativa pode ser identificada se o controle interno foi
amplificado e o alvo não (RAMIREZ et al., 2006).
2.5.3.2 PCR da Transcriptase Reversa (Reverse Transcription PCR)
Uma crítica à PCR convencional é que esta não diferencia entre oocistos de
Cryptosporidium viáveis e inviáveis. Porém, esta informação é de grande importância para a
estimativa do risco real ao qual a população humana está exposta, bem como à avaliação da
eficácia dos sistemas de tratamento de água (HALLIER-SOULIER; GUILLOT, 2003;
FERGUSON et al., 2006).
Como resposta ao problema foi desenvolvido um teste de PCR usando a detecção de
mRNA pela PCR da Transcriptase Reversa (RT-PCR), baseado na informação de que
organismos vivos utilizam a transcrição para formar mRNAs, os quais sofrem rápida
degradação após a morte do organismo (MORGAN; THOMPSON, 1998).
Esta técnica pesquisa a quantidade de mRNA presente na amostra, podendo ser
utilizado o mRNA produzido por diversos gens.
14
Sob condições de estresse, o mRNA do heat shock protein 70 é um dos maiores
produtos de síntese, ocorrendo um aumento de 1000 a 10.000 vezes de sua quantidade,
assegurando uma quantidade suficiente para a detecção. Este fato é importante, pois o
resultado positivo na PCR indica a ocorrência de oocistos viáveis na amostra. Têm sido
sugeridos que a instabilidade e meia-vida curta do HSP-70 não permite a sua conservação em
oocistos inviáveis (MORGAN; THOMPSON, 1998).
Os fatores que podem aumentar a síntese de mRNA do HSP-70 são o aquecimento a
42º C por 30 minutos e o congelamento inicial a -80º C com posterior descongelamento e
incubação a 42º C (HALLIER-SOULIER; GUILLOT, 2003).
Outro estudo pesquisou o mRNA codificador da enzima amiloglucosidase como forma
de testar a viabilidade de oocistos de Cryptosporidium. Os autores argumentaram que uma
enzima com função metabólica seja um indicador melhor de viabilidade dos oocistos, do que
a pesquisa de mRNA sem função metabólica direta, tal como o HSP-70. A enzima é
responsável pela formação da amilopectina, fonte de energia dos esporozoítos, que está
presente em quantidades ínfimas em oocistos inviáveis (JENKINS et al., 2000).
A PCR da transcriptase reversa possui sua aplicação sempre quando há necessidade de
provar a presença de oocistos infectantes ou não. Desta forma ela pode ser utilizada em testes
de métodos de desinfecção química ou física (HALLIER-SOULIER; GUILLOT, 2003;
Jenkins et al., 2000), testes de drogas para o tratamento da criptosporidiose (CAI et al., 2005)
e o diagnóstico de oocistos viáveis em amostras ambientais ou biofertilizantes (GARCES et
al., 2006).
2.5.3.3 PCR de Tempo Real (Real time PCR)
A técnica da PCR de Tempo Real (Real time PCR) foi desenvolvida no início dos anos
90 e permite que a amplificação da PCR seja monitorada em tempo real. Todos os sistemas de
PCR de Tempo Real atualmente existentes utilizam químicos fluorescentes para detectar a
amplificação. A vantagem principal da PCR de Tempo Real sobre a PCR convencional é que
ela permite a análise dos produtos em um formato de “tubo fechado”, não sendo necessária a
manipulação após a amplificação. Assim a técnica pode ser utilizada para quantificação e
pode diferenciar amplicons de diversas seqüências pela análise da curva de fusão (melting
curve analysis) (GASSER, 2006).
De acordo com os gens amplificados e o tamanho final dos amplicons, a técnica da
PCR de Tempo Real pode ser utilizada para quantificar oocistos e identificar as espécies
presentes nas amostras (RAMIREZ et al., 2006). Também pode ser utilizada no diagnóstico
específico de oocistos viáveis presentes nas amostras (CAI et al., 2005), onde se torna
necessário a pesquisa de RNA, pela PCR da Transcriptase Reversa (RT-PCR).
Uma vantagem da PCR de Tempo Real é que ela pode diferenciar as espécies testadas,
sem o uso adicional de RFLP ou seqüenciamento (RAMIREZ, et al., 2006), o que diminui o
tempo necessário para o processamento das amostras.
A dificuldade no uso da PCR de Tempo Real é que produtos de amplificação
inespecífica não são diferenciados dos produtos de amplificação desejados. Este fato torna a
seleção cuidadosa dos primers essencial. Alternativamente o instrumento pode ser ajustado
para monitorar a intensidade da fluorescência em temperaturas elevadas, nestas condições
ocorre a desestabilização de produtos de PCR inespecíficos e de pequeno tamanho
(ZARLENGA; HIGGINS, 2001).
Fontaine et al. (2003) descreveram uma técnica de PCR de Tempo Real usando o gene
18S rDNA. O procedimento desenvolvido é específico para C. parvum, C. hominis e C.
meleagridis, não sendo capaz de diferenciar estas três espécies entre si. Outras espécies de
Cryptosporidium não são detectadas pela técnica. Os autores argumentaram que o diagnóstico
15
das três principais espécies que ocorrem em humanos é de fundamental importância,
principalmente em situações de surtos de criptosporidiose.
Amar et al. (2004) descrevem uma técnica de PCR de Tempo Real, associada a RFLP,
para o diagnóstico de Cryptosporidium, utilizando a amplificação do gene COWP e de
Nested-PCR. Na técnica proposta pelos autores a PCR primária é realizada em termociclador
convencional, enquanto a Nested-PCR é processada em uma cicladora de luz para de PCR de
Tempo Real com ‘hot start’. Neste procedimento não foi possível diferenciar as espécies de
Crptosporidium apenas baseando-se nos seus pontos de fusão. Assim houve a necessidade de
RFLP dos produtos, com as enzimas AluI e RsaI, o que possibilitou a distinção de C. hominis,
C. parvum, C. wrairi, C. canis e C. baileyi. As espécies C. felis e C. meleagridis possuem o
mesmo padrão de restrição. O mesmo ocorre com as espécies C. andersoni, C. muris e C.
serpentis, que não podem ser distinguidas entre si.
Já a técnica desenvolvida por Ramirez et al (2006), é capaz de diagnosticar as espécies
C. hominis, C. canis, C. felis e C. melagridis apenas usando a análise da curva de fusão. Os
pontos de fusão possuem diferença de pelo menos 1º C entre as espécies estudadas. Os autores
consideram que a alta especificidade do procedimento se deve ao pequeno tamanho do
fragmento amplificado, de 272pb, o que diminui a temperatura de fusão e aumenta a
sensibilidade do teste, quando comparado a outros protocolos que amplificam fragmentos
maiores (820 pb).
No teste de eficácia de medicamentos anti-criptosporidiais, a PCR de Tempo Real têm
se mostrado como ferramenta importante, por permitir uma PCR quantitativa (qPCR). Porém,
os testes que quantificam o DNA parasitário, podem levar as falsas conclusões, por não
distinguirem formas parasitárias viáveis das inviáveis, uma vez que o DNA se mantém estável
na amostra. Para superar esta limitação, Cai et al (2005) desenvolveram um procedimento de
PCR de Transcriptase Reversa de Tempo Real quantitativo (Real-Time Reverse
Transcription-PCR), para detecção da quantidade de 18S RNA presente na amostra. Devido
ao fato da rápida degradação do 18S RNA, em formas parasitárias inviáveis, a sua presença e
quantificação indicam a atividade celular de formas viáveis de Cryptosporidium.
2.5.4 Técnicas de identificação de genótipos e subgenótipos - Fingerprinting
As técnicas de “Fingerprinting” são utilizadas para a detecção de variação genética ou
a definição de marcadores genéticos de organismos vivos (GASSER, 2006).
Vários métodos, associados a PCR convencional, possibilitam o Fingerprint genético
de uma amostra (ou indivíduo) de parasitos. Estes métodos se baseiam na busca no genoma
por variações na seqüência e/ou organização sendo que os dados gerados para populações
podem ser usados para investigar a diversidade genética e relações genéticas. A vantagem de
algumas destas técnicas é que não são necessárias informações prévias de seqüências do
genoma do parasito a ser analisado. A desvantagem pode ser que quando os organismos são
analisados como “pool”, o fingerprint genético vai representar a população de organismos e
não um indivíduo. Assim marcadores individuais podem não representar todos os indivíduos
na população (GASSER, 2006).
2.5.4.1 Técnica do Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição – RFLP
(Restriction Fragment Length Polimorfism)
A técnica do Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição – RFLP
(Restriction Fragment Length Polimorfism) é atualmente um dos métodos mais empregados
para a determinação de espécies e genótipos de Cryptosporidium. A técnica se baseia na
16
reação de digestão dos produtos da PCR por enzimas específicas, denominadas enzimas de
restrição ou endonucleases. Estas enzimas clivam o DNA em fragmentos de determinados
tamanhos, cuja análise no gel de Agarose ou Poliacrilamida, resulta em diferentes padrões de
tamanhos de fragmentos, de acordo com a espécie de Cryptosporidium examinada,
possibilitando a identificação.
Apesar de ser uma técnica relativamente simples, sua aplicação é limitada por uma
falha na resolução e por não diferenciar subgenótipos contidos em uma mesma espécie ou de
genótipos de diferentes regiões geográficas (WIDMER et al., 2002).
A técnica também não é capaz de detectar infecções mistas, quando o genótipo
minoritário representa menos de 25% do total de oocistos presentes na amostra. Foi observado
que em infecções mistas experimentais conduzidas utilizando dois genótipos distintos, ocorre
primeiro um pico de eliminação de um dos genótipos, seguido pelo pico de eliminação do
segundo. Em outras instâncias, um dos genótipos tende a deslocar o outro, que não pode mais
ser detectado, sendo que a infecção acaba sendo relacionada apenas ao genótipo
predominante. Estes fatos ocorrem na infecção mista de C. parvum e C. hominis e naquelas
em que são usados sub-genótipos distintos de C. parvum (WIDMER et al., 2002).
Diversos grupos trabalham para estabelecer protocolos de RFLP que possam ser
utilizados no diagnóstico de Cryptosporidium em exames fecais ou amostras de água,
podendo ainda ser utilizados em grande quantidade de amostras.
Xiao et al. (2004) padronizaram um protocolo que diferencia quase todas as espécies
descritas de Cryptosporidium. A protocolo utiliza Nested PCR do gene SSU rRNA, e digestão
dos produtos com as enzimas SspI, VspI e Dde I. A enzima Dde I diferencia C. muris de C.
andersoni, enquanto as duas primeiras enzimas devem ser usadas em todas as amostras, para
confirmar o diagnóstico, principalmente referente às espécies C. parvum, C. hominis, C.
meleagridis, C. canis e C. serpentis, todas pertencentes ao antigo grupo reconhecido como C.
parvum.
Ainda utilizando o gene 18S rDNA, Coupe et al. (2005), padronizaram uma RFLP-
PCR, amplificando uma região polimórfica localizada na região entre os nucleotídeos 179-
271 do gene. Os seguintes iniciadores foram desenvolvidos pelos pesquisadores para a PCR
primário: SCL1 (5’-CTG GTT GAT CCT GCC AGT AG-3’) e CPB-DIAGR (5’-TAA GGT
GCT GAA GGA GTA AGG-3’) e para a Nested PCR: SCL2 (5’-CAG TTA TAG TTT ACT
TGA TAA TC-3’) e (5’-CAA TAC CCT ACC GTC TAA AG-3’). Após a amplificação o
produto da Nested-PCR deve ser digerido com a enzima TaqI, cujo resultado positivo
identifica C. hominis e C. parvum, ambas podendo ser diferenciadas entre si pela enzima Ase
I. Outras espécies de Cryptosporidium podem ser identificadas pelo uso seqüenciado ou
concomitante das enzimas MseI, BstUI, e SspI.
Um teste de RFLP dos produtos de PCR gerados pelo uso do primer proposto por
Laxer, demonstrou que com o procedimento diferencia as espécies C. parvum, C. meleagridis,
C. wrairi e C. hominis. Considerando que o primer não é genérico, sua utilidade em amostras
ambientais é restrita, devido ao estreito espectro de espécies que ele amplifica (GUYOT et al.,
2002).
Spano et al. (1997) descreveram uma técnica de RFLP, que diferencia C. wrairi de C.
parvum e C. hominis. Os pesquisadores utilizaram a PCR do gene COWP e digestão com a
enzima RsaI. A capacidade de diferenciar C. wrairi de C. parvum é importante, pois são
poucos os protocolos de RFLP-PCR que distinguem adequadamente estas duas espécies.
Pedraza-Díaz et al (2000), realizaram RFLP-PCR dos genes COWP e TRAP-1,
encontrando um padrão de restrição não compatível com C. parvum nem C. hominis. Para a
identificação da espécie, os autores tiveram que recorrer à amplificação de parte do gene 18S
rRNA e subseqüente seqüenciamento. Foi só então que os autores conseguiram diagnosticar
C. meleagridis infectando humanos imunocompetentes. O trabalho evidencia as limitações da
17
RFLP-PCR do gene COWP, para diagnóstico de espécies distintas de C. parvum e C. hominis,
com os primers utilizados e quando os padrões de restrição ainda não são conhecidos para
todas as espécies.
Por ser uma técnica relativamente fácil de ser realizada, Chalmers et al., (2005),
sugerem que RFLP-PCR do gene COWP seja utilizada para a avaliação de amostras clínicas
de origem humana, pois predominam nestas as espécies C. hominis e C. parvum.
A RFLP-PCR possui suas limitações, pois o tamanho dos fragmentos pode ser similar
entre as espécies de Cryptosporidium, de modo que um único teste pode não ser capaz de
diferenciar as espécies. Por isso recomenda-se a digestão com mais de uma enzima e
preferencialmente também a realização da genotipagem de múltiplos loci, para a confirmação
do diagnóstico. Como conseqüência este procedimento pode aumentar os custos do
diagnóstico.
Wu et al. (2003) descrevem a PCR-RFLP para o gene codificante de uma
glicoproteina nomeado de Cpgp40/15, de C. parvum. Os autores desenvolveram os primers e
realizaram a digestão dos produtos com as enzimas AluI e RsaI. A técnica identificou, além de
C. hominis e C. parvum, quatro sub-genótipos de C. hominis e três subgenótipos de C. parvum
(WU et al., 2003).
O protocolo foi aplicado com sucesso na genotipagem de isolados humanos de
Cryptosporidium, por Muthusamy et al. (2006), possibilitando a identificação de C. hominis,
C. parvum, C. felis e C. meleagridis, além dos subgenótipos de C. hominis. Cohen et al.
(2006), utilizaram Nested-PCR seguido de RFLP deste mesmo gene para a genotipagem de
oocistos de Cryptosporidium em águas na França. Os autores identificaram o genótipo Ib de
C. hominis como sendo o principal responsável pelo surto de criptosporidiose investigado.
Para a RFLP-PCR do gene 18S rDNA e COWP existem relatos na literatura
identificando todas as espécies válidas de Cryptosporidium, enquanto que os padrões de
restrição do HSP-70, Poly-T e TRAP-C1 são relatados para poucas espécies ou genótipos
(ABE et al., 2002).
Outro fator a ser considerado é que a aplicação de genotipagem de múltiplos loci para
a identificação das fontes de infecção e vias de transmissão é altamente dependente devido ao
fato dos genótipos se manterem estáveis ao longo do tempo. Num organismo clonal isto pode
ser o caso, enquanto que num organismo em cujo ciclo as trocas genéticas possuem
relevância, este genótipo não se manterá estável, uma vez que a recombinação irá deslocar o
linkage entre alelos em diferentes loci (TIBAYRENC, 1998).
Assim pode ser que a realização do seqüenciamento direto seja a ferramenta adequada
para a identificação acurada dos isolados de Cryptosporidium (ABE, et al., 2002).
2.5.4.2 Amplificação Randomizada do DNA Polimórfico - RAPD
A Amplificação Randomizada do DNA Polimórfico (Random Amplified Polimorfic
DNA - RAPD) ou Arbitrarily primed-polimerase chain reaction (AP-PCR) é um dos métodos
de fingerprinting. A técnica é baseada na amplificação de fragmentos de DNA, usando
normalmente primers isolados de seqüências arbitrárias, e a subseqüente separação dos
amplicons pela eletroforese em gel de agarose. Apesar deste método possuir as vantagens de
ser de fácil e rápida execução, o padrão de bandas do RAPD pode ser influenciado por vários
fatores, tais como a qualidade do DNA, a especificidade do primer, concentração do template,
co-migração de fragmentos não homólogos e/ou o uso de diferentes termocicladoras,
resultando numa falha na reprodutibilidade (GASSER, 2006).
Os estudos indexados na base de pesquisa Pubmed, que utilizam RAPD para a
investigação de Cryptosporidium spp. são relativamente poucos, totalizando quatorze, sendo
18
que o último trabalho original publicado, data do ano de 2002. Neste estudo a técnica foi
utilizada para a identificação de um fragmento genético espécie-específico para C. parvum,
possibilitando posteriormente o desenvolvimento de RAPD específico para esta espécie
(TIAN et al., 2002).
Outra dificuldade é que, devido à baixa reprodutibilidade da técnica, os pesquisadores
precisam realizar testes com vários primers, antes de efetuarem a escolha daqueles que serão
usados nos estudo. Assim, Tian et al., (2001) testaram 200 primers para escolher os 26
utilizados enquanto que Shianna et al (1998) testaram 28 primers já descritos para
Cryptosporidium, dos quais apenas quatro amplificaram as amostras analisadas, os outros ou
falharam na amplificação, ou amplificaram amostras sem DNA específico ou não
apresentaram reprodutibilidade em testes seriados.
A variação na formação de bandas pode tornar necessário alguns cuidados para
garantir a reprodutibilidade dos resultados. Afim de não definir indevidamente novos
genótipos, Morgan et. al (1999) realizaram análises de oocistos de Cryptosporidium de
répteis, em triplicatas, considerando apenas as bandas que apareceram em todos os ensaios.
Além do RAPD os pesquisadores utilizaram também da PCR do 18S rDNA gene e
seqüenciamento.
Shianna et al (1998) utilizaram o RAPD para caracterizar 20 isolados de
Cryptosporidium. Para a confirmação de que os oocistos que possuíam eram realmente de C.
parvum, os autores realizaram uma primeira PCR usando o Primer proposto por Laxer, o qual
até então era conhecido por ser espécie-específico. Os autores conseguiram, através de RAPD,
identificar quatro genótipos distintos de Cryptosporidium, sendo um de origem humana e três
de bovinos.
Como a validade das análises usando RAPD depende principalmente da pureza do
DNA, métodos de purificação das amostras tornam-se essenciais para a reprodutibilidade da
técnica. Assim podem ser usados procedimentos de purificação de oocistos e posterior
esterilização pelo hipoclorito de sódio (DENG ; CLIVER 1998). Outra técnica de purificação
descrita é a separação imunomagnética dos oocistos, seguido ou não do excistamento in vitro,
possibilitando a obtenção de DNA de boa qualidade para a realização do RAPD (DEN ;
CLIVER, 1998; DENG et al., 2000).
2.5.4.3 Polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados - AFLP
O método do Polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (Amplified
fragment length polimorfism - AFLP) tem sido aplicado na investigação de plantas e animais,
no diagnostico de doenças, na ciência forense e na análise de parentesco. O método baseia-se
na digestão do DNA genômico por um conjunto de duas enzimas de restrição. Em seguida é
realizada a adição de adaptadores específicos que se ligam às terminações 3’ e 5’ do
fragmento de restrição. Com o uso de primers que anelam à seqüência dos adaptadores, é
realizada a amplificação do fragmento e, finalmente a análise do fragmento de restrição
através da eletroforese (GASSER, 2006).
As vantagens do processo são que ele dispensa a existência de informações prévias
sobre a seqüência, podendo ser aplicado ao DNA de qualquer origem, é realizado sob
condições altamente restringentes e pode alcançar altos níveis de discriminação. A limitação é
que a técnica é relativamente demorada para ser realizada, quando comparada a outras
técnicas de fingerprinting. A existência de alto nível de variação e o número limitado de
marcadores “homólogos” detectados pelo AFLP pode ser tornar um fator limitante (GASSER,
2006).
Um protocolo de AFLP, que diferencia C. hominis (na época do estudo ainda
considerado como genótipo I de C. parvum) e C. parvum, foi descrito por Blears et al. (2000).
19
Para encontrar a combinação ideal de primers, os autores testaram 112 combinações de
primers, encontrando nove pares adequados para a análise. A técnica aparentemente não é
muito utilizada na pesquisa de Cryptosporidium, pois não foram encontrados outros trabalhos
além do citado.
2.5.4.4 Uso de Micro e minisatélites
Outra técnica é o uso de satélites no DNA para a análise da estrutura genética e a
população de parasitos (GASSER, 2006). São consideradas satélites seqüências repetitivas no
genoma e microsatélites, quando as seqüências repetitivas são extremamente curtas de até três
bases, minisatélites e macrosatélites, quando as seqüências repetidas são mais longas (FENG
et al., 2000).
Microsatélites e macrosatélites têm sido descritos como abundantes no genoma de
todos os Eucariotos. Estas seqüências consistem em repetições que tendem a curtas
seqüências que são aleatoriamente dispersas pelo genoma. Geralmente não são transcritas e
mantêm polimorfismo devido ao acúmulo de mutações. A variação no número de repetições
permite aos alelos presentes num locus serem classificados pelo tamanho, em géis de
eletroforese. Os satélites são caracterizados pela hiper-variabilidade alelica. O comprimento
da repetição tem sido usado no estudo da estrutura genética de populações bem como na
análise de linkage e mapeamento genético (GASSER, 2006).
Regiões não codificantes do genoma são mais sujeitas a mutações que seqüências de
regiões codificantes para proteínas, devendo ter preferência sobre estas, por permitirem a
identificação de subgenótipos. Em contraste com RAPD e AFLP, os fingerprints de
microsatelites não são afetados por DNA exógeno, tornando a técnica mais adequada para a
análise de amostras ambientais (FENG et al., 2000).
Até o ano de 2002, a espécie de Cryptosporidium que infectava homem e ruminantes
de localização intestinal, era nomeado como C. parvum. Até esta data, a pesquisa de micro e
minisatélites visavam definir o genótipo I, ou humano, atualmente denominado de C. hominis
e o genótipo II ou bovino de C. parvum (WIDMER et al., 2004). A mesma técnica permitiu a
posterior separação destes em duas espécies distintas, C. parvum e C. hominis (MORGAN-
RYAN et al., 2002). O uso de micro e minisatélites também têm demonstrado importância no
estudo populacional de Cryptosporidium.
Mallon et al (2003a) sugerem em seus estudos que C. hominis apresenta uma estrutura
clonal, enquanto que C. parvum possui estrutura não clonal. Uma possível explicação para a
estrutura clonal de C. hominis é que as infecções sejam adquiridas a partir de um ou de
poucos oocistos, com expansão rápida e disseminação em populações locais, ficando assim
pouca possibilidade de ocorrer recombinação genética com outros genótipos. Isso possibilita a
formação de populações específicas em C. hominis, enquanto que em C. parvum, não foi
observada a formação de populações específicas em um determinado espaço geográfico ou
temporal (MALLON et al., 2003 b).
A maior diversidade genética, devido à ocorrência de recombinação genética na
espécie C. parvum, foi evidenciada por Feng et al (2002). Os pesquisadores utilizaram cinco
microsatélites para caracterizar dois subgenótipos iniciais de C. parvum e o subgenótipo
resultante de recombinação genética ocorrida durante a infecção mista em camundongos
GKO.
Mais recentemente a técnica foi utilizada para a identificação de genótipos distintos de
C. parvum e sua aplicação na definição de subgenótipos específicos isolados de bovinos de
várias propriedades. Tanriverdi et al (2006) utilizaram 16 marcadores de mini e
microsatélites, sendo que foram encontrados genótipos específicos confinados a certas
propriedades. Em contraste ao descrito por Mallon et al (2003b), os autores sugerem que
20
populações genéticas distintas podem emergir dentro de um grupo em relativamente pouco
tempo. Isso pode explicar a freqüente detecção de genótipos específicos ao hospedeiro, com
status taxonômico desconhecido, como ocorre em águas superficiais e a existência de
genótipos geograficamente restritos de C. hominis no homem.
O uso de micro e minisatelites evidenciaram que C. hominis e C. parvum possuem um
mesmo ancestral, tendo evoluído em espécies distintas recentemente, sugeriu-se ainda que a
evolução diferencial dos micro e minisatelites de diferentes isolados podem estar ligadas à
adaptação a diferentes hospedeiros (TANRIVERDI; WIDMER, 2006).
A técnica pode evidenciar a correlação entre as regiões geográficas de origem dos
isolados e os respectivos genótipos existentes e ainda evidencia alterações ocorridas quando
um determinado isolado de Cryptosporidium é passado de uma espécie hospedeira para outra,
como exemplo, de bovinos para camundongos (FENG et al., 2000; TANRIVERDI et al.,
2006).
No quadro 2 estão relacionados os micro e minisatélites pesquisados por Tanriverdi;
Widmer (2006) e os respectivos primers.
21
Quadro 2: Primers de micro e minisatélites para o estudo populacional de C. parvum e C.
hominis (TANRIVERDI; WIDMER, 2006).
Locus Primers Forward e Reverse Tamanho
do amplicon
OBS:
MAS TAGGCTCGGGTTCAGA
GACTGTCACAAAAGTTAATCC
139–248
MAS TAGGTTCGGGTTCAGA
GACTGTCACACAAGTTAATCC
139-248 Específico C.
hominis
MSB CTTTTGATCGCTTCTTTTCCA
GGGAGGCATAGGGATGA
246-234
MSC AAATGGGTGTGGAGAAAAG
TTAGATAAAGATTGGTCTTGTC
147–238
MSE CTTTAGGTACAACTGAACAGA
AGCTTATTCCTGATTTGGAC
149-272
MSF TCGGCCTCCTCTACAG
AGAAGAAAGCCAAGAAGGGT
124-200
MSF TCGGTCTCCTCGACAG
AGAAGAAGGCCAAGAAGGGT
124-200 Específico C.
hominis
MSG TGGAATGATAATTGGACC
GGAGTTTCTGAGACAC
179-334
MSG TGGGATGATAATTGGACC
GGAGTTTCTGAGACAC
179-334 Específico C.
hominis
MSI TCCTTGGATAAACCTGG
AGTGACGCATCTCAAAC
168-240
MSK ATAGTTGACAGGATGAC
AGAAGAAAGCCAAGAAGGGT
124-232
MSK ATAGTTTACAGGATGAC
AGAACAAAGCCAAGAAGGGT
124-232 Específico C.
hominis
MS5 CTTTCTCATCAACTTGCATG
AGCGAGTGGAGGAGCT
192-324
1887 ATGATTGAGAGGTAAGTTC
GTTATTTGATTTTATACGA
150-194
1887 ATGATTGAGAGGTAAGTTC
GTCATTTGATTTTATACGA
150-194 Específico C.
hominis
Cp492 TCATCTACCAGCACTAC
ACCAATAGTGTATCTTACATC
227-251
MS9 ACCTGGAGTGTGATTTGG
GTTCTTGTTCAAAGTCA
110-248
TP14 GTTCACAGCCAACAGT
CATTTTGATTTTGGGAGT
179-223
5B12 AGGAGGAGGAGAAAAATAG
AATTCCCCATATTACTCTATTTGT
134-155
22
2.5.5.5 Polimorfismo da conformação de fitas únicas - SSCP
Existe uma ampla gama de técnicas que possibilitam a detecção de mutações, das
quais o Polimorfismo da conformação de fitas únicas (Single-Strand Conformation
Polimorfism – SSCP) é particularmente prática e de versátil aplicação. O princípio da SSCP é
que a mobilidade eletroforética de uma molécula de DNA de fita simples em um gel de
poliacrilamida não desnaturante, depende da sua estrutura e tamanho. Moléculas de fita única
assumem estruturas com conformações secundárias ou terciárias, quando em soluções,
causadas pelo pareamento das bases entre nucleotídeos dentro de cada fita. Estas
conformações são altamente dependentes da seqüência primária e do comprimento da
molécula, sua localização e número de regiões onde ocorre o pareamento das bases. Assim,
moléculas que possuem seqüências distintas, por exemplo, devido a uma única base, podem
ser separados num gel de poliacrilamida não-desnaturante, devido às diferenças na mobilidade
das distintas conformações geradas. O método SSCP pode ser usado para evidenciar mutações
pontuais de amplicons pequenos (200-300bp), porém a técnica pode ser usada também com
amplicons de até 530pb (GASSER, 2006).
A técnica inicialmente descrita utilizava iniciadores de oligonucleotídeos
radiomarcados para a etapa de amplificação pela PCR, sendo que os amplicons eram
submetidos a eletroforese num anel de seqüenciamento convencional (Conventional
sequencing ring) (GASSER et al., 2003). Apesar do método ser altamente eficiente, o uso de
marcadores radioativos representa um risco potencial para a saúde dos pesquisadores, assim o
mesmo grupo de pesquisa desenvolveu um método de SSCP ‘frio’, sem marcadores
radioativos, para Cryptosporidium (GASSER et al., 2004).
A técnica proposta utiliza a SSCP para o gene SSU rDNA, com um amplicon esperado
de ~300pb e a região ITS-2, com um amplicon esperado de ~230pb, sendo que o SSU rDNA
identifica Cryptosporidium até ao nível de espécie, enquanto a mesma técnica utilizando a
região ITS-2 discrimina sub-genótipos. Os pesquisadores identificaram 10 sub-genótipos para
C. hominis e 13 sub-genótipos para C. parvum (GASSER et al., 2003).
O SSCP com os primers descritos por Gasser (2003), mostrou ter boa repetibilidade,
podendo ser utilizado no rastreamento das fontes de infecção exatas (CHALMERS et al.,
2005). Mas também pode ser utilizada preferencialmente quando grandes quantidades de
amostras precisam ser analisadas, isso devido ao seu alto poder discriminatório e os custos
relativamente baixos. A técnica possui a capacidade de identificar sub-genótipos, podendo ser
usada para o fingerprint (FERGUSON et al., 2006). Porém ainda são necessários maiores
estudos para padronização do SSCP para todas as espécies de Cryptosporidium.
Um gene codificante de uma glicoproteina, nomeado de Cpgp40/15 de C. parvum,
possui variações suficientes para identificar ao menos cinco genótipos da espécie. Wu et al
(2003) desenvolveram um primer para o gene de Cpgy40/15 e uma técnica que combina
RFLP e SSCP, nesta técnica o DNA é primeiramente amplificada na PCR convencional, o
produto é submetido à digestão enzimática e posteriormente os fragmentos de DNA são
desnaturados em solução própria, e aplicados no gel de Acrilamida. A técnica identificou
quatro sub-genótipos de C. hominis e três sub-genótipos de C. parvum, mostrando-se
adequada para o estudo de sub-populações (WU et al., 2003).
23
2.6 Estudo Filogênico
Atualmente o gênero Cryptosporidium possui 15 espécies consideradas como válidas,
sendo elas: C. andersoni; C. baileyi; C. bovis; C. canis; C. felis; C. galli; C. hominis; C.
meleagridis; C. molnari; C. muris; C. parvum; C. saurophilum ; C. serpentis; C. suis; C.
wrairi.
Algumas espécies apresentam como local de parasitismo o estômago, sendo estas: C.
serpentis, C. muris, C. galli e C. andersoni e as demais são de localização parasitária
intestinal. Cryptosporidium baileyi também é capaz de infectar o trato respiratório de aves.
Análises filogenéticas de Cryptosporidium spp. usando os loci do SSU rRNA, HSP-70
e actina, suportam a estrutura genética geral do gênero, com as espécies gástricas e as
intestinais formando grupos monofiléticos distintos. Dentro de cada grupo as espécies que
parasitam répteis formam os ramos basais e a maioria das espécies encontradas em mamíferos
formam os ramos mais distantes (XIAO et al., 2004a).
A colocação de C. baileyi ainda é incerta, nas análises utilizando o SSU rRNA e
actina, esta espécie se agrupa com os parasitos intestinais, já nas árvores construídas com o
HSP-70, ela se agrupa com as espécies gástricas (XIAO et al., 2004 a).
De maneira geral as espécies gástricas de Cryptosporidium apresentam oocistos
maiores que as espécies intestinais, existindo como única exceção C. baileyi, que também
apresenta oocistos relativamente grandes. Possivelmente esta espécie tenha sido originalmente
pertencente ao grupo gástrico, sofrendo adaptação intestinal recentemente, o que justificaria
sua colocação ora num grupo, ora no outro, de acordo com os genes analisados.
A formação dos dois grupos principais, de espécies de Cryptosporidium gástricos e
intestinais, parece ter ocorrido antes do surgimento de peixes e répteis, uma vez que em
ambos os grupos de hospedeiros ocorrem os dois tipos de localização do protozoário (XIAO
et al., 2004 a).
Hospedeiros geneticamente relacionados muitas vezes albergam espécies semelhantes
de Cryptosporidium, sugerindo a co-evolução entre hospedeiro e parasito (XIAO et al., 2004
c). Duas espécies consideradas como exceções para a hipótese da co-evolução no gênero
Cryptosporidium são C. parvum e C. meleagridis a primeira está geneticamente relacionado à
espécie encontrada em camundongos, o Mouse Genotype, e forma um grupo monofilético
com C. hominis e os genótipos de primatas e coelhos. Por outro lado, roedores, primatas e
lagomorfos possuem um mesmo ancestral, que é diferente do ancestral dos ruminantes. Assim
é possível que C. parvum tenha sido originalmente um parasito de roedores e que se
estabeleceu apenas recentemente em ruminantes. Esta expansão de hospedeiros para a espécie
C. parvum, pode justificar sua habilidade em parasitar diferentes hospedeiros mamíferos,
incluindo os roedores (XIAO et al, 2004).
Cryptosporidium meleagridis é outra espécie que aparentemente está expandindo seus
hospedeiros. Diferentemente de C. baileyi e Cryptosporidium spp. de patos e gansos, que
sempre assumem posições basais no grupo intestinal nas análises filogenéticas, C. meleagridis
sempre é colocado no clado contendo a maioria das espécies de Cryptosporidium que
parasitam mamíferos (FAYER et al., 2005; XIAO et al., 2004a; XIAO et al., 2000). A espécie
é geneticamente relacionada a C. parvum, C. hominis, C. wrairi e aos genótipos de macaco,
coelho e camundongo. Assim C. meleagridis pode ter sido originalmente uma espécie
parasitária de mamíferos que se estabeleceu em aves. Esta hipótese é fortalecida pelo
diagnóstico da espécie em uma ampla variedade de mamíferos, incluindo o homem, roedores,
suínos gnotobióticos e bezerros (XIAO et al, 2004).
A formação das espécies do gênero Cryptosporidium aparentemente é o resultado da
adaptação do parasito a diferentes hospedeiros, porém diferentes espécies de Cryptosporidium
24
podem parasitar um mesmo hospedeiro, como ocorrem em C. parvum, C. hominis, C.
meleagridis e C. muris, sugerindo que outros fatores podem levar à especiação
(TANRIVERDI; WIDMER, 2006).
Cryptosporidium wrairi, C. meleagridis, C. hominis e C. parvum, juntamente com os
genótipos de camundongos, furão e primatas, formam um clado único, evidenciando que se
trata de espécies relacionadas (XIAO et al, 2000) e que podem ter surgido num mesmo
ancestral.
Os bovinos possuem também seu próprio genótipo de Cryptosporidium, o antigo
genótipo B, atualmente nomeado como espécie distinta, C. bovis (FAYER et al., 2005) e que
se localiza num ramo distinto daquele que agrupa C. parvum, C. melagridis e C. wrairi.
A figura 1 mostra a árvore filogenética publicada na revisão por XIAO et al. (2004),
contendo as principais espécies e genótipos descritos de Cryptosporidim, utilizando a análise
do gene SSU rRNA.
25
Figura 1: Relação filogenética entre as espécies e genótipos de Cryptosporidium, analisadas
pelo Neighbor-Joining de seqüências parciais do SSUrRNA gene. Os valores nos ramos são
as percentagens do Bootstrap, usando 1000 replicas. Os números após os nomes das espécies
ou genótipos são as identificações dos isolados usados na construção da árvore filogenética.
Os números entre parênteses representam a quantidade de isolados seqüenciados (Xiao et al
2004).
26
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Locais de Realização da Pesquisa
O diagnóstico inicial de Cryptosporidium em amostras fecais dos diferentes hospedeiros
utilizados no trabalho foi realizado no Laboratório de Protozoologia da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro. A manutenção de animais vivos foi realizada no biotério pertencente
ao laboratório.
Os procedimentos de extração de DNA genômico, realização da PCR e RFLP foram
realizados no laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
O seqüenciamento foi realizado no Laboratório do Projeto GENOMA do Centro
Biomédico, localizado na Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
As seqüências consenso e análises filogenéticas foram realizadas no Laboratório de
Genética e Bioquímica da Embrapa Agrobiologia, localizado em Seropédica, Estado do Rio
de Janeiro.
3.2 Locais de Coleta das Amostras fecais e obtenção de oocistos para as análises
3.2.1 Mercado Municipal
Localizado no Município do Rio de Janeiro, sua estrutura física apresenta as laterais
fechadas, abrigando cerca de 50 lojas, com grande diversidade de produtos. Neste mercado
existem duas lojas de comercialização de animais vivos, como pintos, codornas, patos, e
pequenos mamíferos (coelhos, cobaias e hamsters).
As lojas onde foram adquiridos os animais para esse estudo, localizavam-se no centro
do mercado, ao lado de lojas destinadas à comercialização de carnes e verduras para consumo
alimentar.
Os animais oferecidos para venda ficavam alojados em gaiolas com telas de arame,
dispostas em prateleiras, com fundo removível para a limpeza. As espécies animais eram
mantidas separadas, sendo duas gaiolas do topo utilizadas para canários e pombos,
respectivamente. Nas três gaiolas logo abaixo eram alojados os pintos, patos e codornas e as
duas gaiolas do fundo eram ocupadas por Galinhas de Angola e Porquinhos da Índia.
Devido ao empilhamento, muitas vezes observavam-se fezes de uma espécie de animal
caídas em outras gaiolas, por não haver um isolamento adequado entre as mesmas. Além
disso não havia uma separação que impedisse o contato direto do público que comumente
transita nesse mercado, com os animais.
Para verificar a ocorrência de Cryptosporidium spp. nos animais comercializados,
foram realizadas inicialmente coletas das fezes presentes nas gaiolas de exposição no próprio
estabelecimento. As amostras fecais foram processadas conforme descrito abaixo.
Após 24 horas da primeira coleta, nos casos em que foram encontrados oocistos,
retornou-se ao estabelecimento para a aquisição de animais possivelmente infectados,
oriundos das gaiolas nas quais foram detectados oocistos. Após a aquisição, os animais foram
acondicionados em gaiolas individuais, recebendo ração e água à vontade. Amostras fecais
diárias foram coletadas e processadas conforme descrito. Para verificar a ocorrência de
Cryptosporidium sp. nos animais comercializados, foram realizadas inicialmente coletas das
fezes presentes nas gaiolas de exposição no próprio estabelecimento.
27
3.2.2 Abrigo para gatos
Foram coletadas 30 amostras fecais de gatos mantidos em um abrigo particular de
animais no Município de Nova Iguaçu no Estado do Rio de Janeiro. Os gatos eram recolhidos
da rua pela proprietária do abrigo, sendo ao total 80 gatos, alojados em dois gatis distintos, de
piso de alvenaria e cercados com tela, recebendo água e ração específica à vontade.
As amostras fecais foram coletadas diretamente do chão, sendo recolhidas em sacos
plásticos e identificadas. Apenas foram coletadas fezes recentemente eliminadas, para
minimizar o risco da coleta repetida de amostras fecais de um mesmo animal.
Também foram coletadas amostras fecais de quatro cães filhotes que ficavam soltos
na área livre do abrigo, sendo estes animais filhotes de uma cadela sem raça definida que fazia
a guarda do terreno.
3.2.3 Fazenda de bovinos de leite
Amostras fecais de 56 bezerros foram coletadas diretamente da ampola retal de
animais pertencentes a uma fazenda de gado de leite, localizada no Município do Rio de
Janeiro. No manejo da fazenda, os bezerros são separados da mãe logo após o parto,
recebendo colostro na mamadeira. Os animais examinados possuíram entre 1 a 14 dias de
idade, sendo alimentados com substituto de leite (PURINA).
3.3 Processamento das amostras fecais
As amostras fecais, aos serem recebidas no Laboratório de Protozoologia da UFRRJ,
foram identificadas individualmente com um número seqüenciado de registro. Os dados
referentes a cada amostra foram anotadas em um livro no qual foram registrados o número da
amostra, a data da coleta, idade e sexo do animal (quando isto era possível), a origem da
amostra e os resultados do exame parasitológico de fezes.
Após receber o número de registro as fezes foram homogeneizadas com água destilada
e, logo após, filtradas em tamis de plástico descartável contendo uma gaze sobre o mesmo
para reter ao máximo os resíduos grosseiros. Após esta filtragem, o material fecal foi
colocado em dois tubos de ensaio cônico e centrifugado a 402,48g por 10 minutos.
Posteriormente, foi desprezado o sobrenadante e um dos tubos foi gradado sob refrigeração,
enquanto ao sedimento do segundo tubo foi adicionada solução saturada de açúcar com
densidade específica de 1.30 g/ml, após homogeneização o material foi centrifugado a
402,48g por 5 minutos. O tubo foi completado com solução de açúcar e coberto com uma
lamínula, ficando em repouso por 3 minutos. A lamínula foi montada sobre uma lâmina de
vidro e examinada em microscópio óptico com contraste de fase. Nos casos em que foi
diagnosticada a presença de Cryptosporidium, do sedimento contido no primeiro tubo, era
realizada a extração de DNA e as análises subseqüentes.
3.4 Extração do DNA total em amostras fecais
A extração de DNA foi feita a partir de 200 µl de suspensão de fezes semipurificados
por centrífugo-sedimentação, sendo que foi utilizado um protocolo baseado nos propostos por
McLauchlin et. al. (1999), Zhu et al (1998) e Boom et al (1990), com modificações.
Resumidamente: a 200 µl de sedimento fecal, num tubo eppendorf de 1.5 ml, foram
adicionados 500µl de DNAzol ® (Invitrogen), 0,5% (concentração final) de solução de
polivinilpirrolidona (PVP, Sigma) e aproximadamente 0.2g de pérolas de vidro com 425-
600µm de diâmetro (Sigma). Os microtubos foram agitados três vezes em vórtex, e após,
28
incubados a 96º C por 60 minutos. Foram posteriormente centrifugados, sendo o sobrenadante
aspirado e depositado em outro tubo eppendorf, precipitado com 1000µl de etanol absoluto e
centrifugado. O sobrenadante foi desprezado e o pellet lavado com 500µl etanol 95% por
duas vezes. O sobrenadante da última lavagem foi desprezado e o pellet foi resuspenso com
500µl de DNAzol, centrifugado e o sobrenadante transferido para novo tubo. O DNA foi
precipitado com etanol absoluto e a lavagem foi repetida, sendo o pellet resultante resuspenso
em 100 µl de tampão Tris-EDTA (TE). Os microtubos contendo o DNA foram mantidos a –
20º C até serem utilizados.
3.5 Realização do PCR primária e nested
Para a PCR primário (tamanho esperado do amplicon: 1.325pb) foram utilizados os
primers: 18 SF: 5`- TTCTAGAGCTAATACATGCG-3` (Forward) e 18 SR: 5`-
CCCATTTCC TTCGAAACAGGA-3` (Reverse). Para o nested PCR (tamanho esperado do
amplicon: 819 a 825pb, dependendo da espécie) foram utilizados os primers 18 SNF: 5`-
GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3` (Forward) e 18 SNR 5`- AAGG
AGTAAGGAACAACCTCCA-3` (Reverse)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada num volume final de 50µl, onde
se usou na reação primária 4mM de MgCl
2
, 0,2µM de cada primer (18 SF e 18SR), tampão da
Taq 1x, 200 µM de cada desoxirribonucleotideo, 2,5U de Taq DNA Polimerase (Cenbiot ® ),
2 µl de DNA da amostra e água milliQ até completar o volume de 50 µl.
As condições para a realização do Nested PCR foram idênticas às do primário, exceto
pelo uso do outro par de primers e de 3 mM de MgCl
2
.
As concentrações de MgCl2 foram determinadas através de teste prévio das seguintes
concentrações: 6mM, 4mM, 3mM e 2mM, encontrando-se os valores ideais de 4mM na PCR
primária e 3mM na PCR secundária, quando utilizada a Taq DNA Polimerase da Ceenbiot ®.
Os ciclos, para ambos os procedimentos foram: 30 ciclos de 94º C/1 min, 65º C/1min,
72º C/1 min. Ao final do programa foi realizada uma etapa adicional de extensão de 72º C/ 10
min.
3.6 Digestão dos Produtos do Nested PCR com Enzimas de Restrição
Para a identificação das espécies de Cryptosporidium foi realizada a digestão dos
produtos do nested PCR com a enzima SspI (invitrogen), segundo as recomendações do
fabricante, exceto que foram utilizadas 4U de enzima para cada reação. Para um diagnóstico
acurado de C. meleagridis, foi realizado também a digestão com a enzima VspI (Invitrogen),
usando igualmente 4 U da enzima para cada reação.
Após a realização da digestão foi feito uma eletroforese em gel de agarose a 3% para a
visualização, análise e fotografia dos produtos. O marcador de peso molecular utilizado foi o
1Kb plus DNA ladder, Invitrogen ®.
3.7 Seqüenciamento e Análise Filogenética
Os produtos da nested PCR foram submetidos à purificação utilizando Polietilenoglycol
(PEG) a 22% (SAMBROOK; RUSSEL, 2001) e posteriormente seqüenciados utilizando-se o
kit de seqüenciamento DYEnamic ET Dye Terminator Kit, compatível para a plataforma
MEGA BACE, segundo o protocolo fornecido pelo fabricante.
As seqüências obtidas foram submetidas a uma busca no BLAST para determinar suas
identidades e encontrar homologias e similaridades às seqüências depositadas de cada grupo
de Cryptosporidium no GenBank. As seqüências foram alinhadas utilizando-se CLUSTAL W
29
(HIGGINS et al., 1994) e ajustes manuais. As análises filogenéticas foram conduzidas
utilizando-se o software MEGA versão 3.1 (Kumar et al., 2004). Como teste filogenético foi
realizado bootstrap com 1000 réplicas, das quais foi construída uma árvore consenso pelo
método Neighbor joining, utilizando-se o logaritmo Kimura 2 Parâmetro.
Também foi realizada a análise filogenética pelo método da Maximum parcimony, com 1000
bootstrap. Para a construção de árvore filogenética pelo método da Máximum Likelyhood, foi
utilizado o programa computacional dnaML do conjunto de programas PHYLIP
(FELSENSTEIN, 1993), igualmente com teste filogenético de 1000 Bootstrap.
As seqüências obtidas no presente trabalho foram depositadas no GenBank, utilizando-
se o programa computacional SeqIn, disponibilizado pelo GenBank.
Nas análises filogenéticas comparativas entre as seqüências consenso obtidas no
presente estudo, foram utilizadas as seguintes seqüências depositadas no GenBank: C.
meleagridis: AF112574, AF329187, AF404821; C. parvum ferret: AF112572; C. parvum
mouse genotype AF112571; C. suis: AF 115377 e AF 108861; C. wrairi: AY115378; C.
parvum DQ067566, AF164102, AF093490; C. hominis: DQ286403, AF093489, AF108865,
AJ849464; C. parvum rabbit genotype: AY112573; C. saurophylum: AF112573; C. felis:
AF159113, AF108862, AF112575; Cryptosporidium sp. isolate N: AF262332; C. canis:
AY120909, AJ493209, AF112576, AB210854; Cryptosporidium sp. Deer genotype:
AY120910; C. bovis: AY120911, AY731305; C. baileyi: AF093495, AY954884; AF262324;
C. serpentis: AF093502; C. galli: AY168847; C. muris: AF093498; C. andersoni: AB089285
e Eimeria tenella: AF026388 como grupo externo.
30
4 RESULTADOS
4.1 Mercado Municipal
Durante a avaliação inicial foi realizado o exame de amostras fecais coletivas,
coletadas das gaiolas contendo pintos, patos, codornas, galinhas da Angola, canários e
porquinhos da índia. Oocistos de Cryptosporidium foram encontradas nas fezes de pintos,
patos, codornas e dos Porquinhos da Índia, sendo que foram adquiridos posteriormente, quatro
patos, três pintos, três codornas e dois Porquinhos da Índia.
Das três codornas adquiridas, duas já estavam eliminando oocistos de
Cryptosporidium sp. nas fezes, mantendo a eliminação durante três dias consecutivos. Após
10 dias, sem a presença de oocistos nas fezes, estes começaram a serem encontrados
novamente, sendo que foram eliminados apenas poucos oocistos durante dois dias.
Posteriormente não houve novos episódios de eliminação até o 21º dia, quando o
acompanhamento coproparasitológico das codornas foi encerrado.
A terceira codorna começou a eliminar oocistos no segundo dia de observação,
mantendo o período patente até o 14º dia, totalizando um período patente de 12 dias, com um
pico de eliminação no sexto dia após o início do período patente.
Um pato começou a eliminar oocistos de Cryptosporidium sp. no 3º dia de observação,
tendo um aumento lento e gradativo das quantidades de oocistos nas fezes, sendo que o pico
de eliminação foi observado no 14º e 15º dias, posteriormente houve uma redução gradual dos
oocistos eliminados até o 29º dia de observação. O período patente totalizou 26 dias. Após
cinco dias, houve um retorno de eliminação de oocistos, durante um único dia, com a
presença de poucos oocistos nas fezes. Posteriormente o pato não voltou a eliminar oocistos
nas fezes. Após 35 dias, o acompanhamento coproparasitológico do pato foi encerrado. Dos
outros quatro patos não foi realizado o acompanhamento do período patente.
Os três pintos começaram a eliminar oocistos nas fezes no terceiro dia de observação e
mantiveram o período patente por 16 dias. Ocorreram dois picos de eliminação mais intensa
de oocistos, sendo o primeiro no dia 3, após o início da eliminação, e o segundo nos dias 9 e
10, após o início da eliminação.
Os dos dois Porquinhos da Índia chegaram ao laboratório, sem a eliminação de
oocistos de Cryptosporidium sp. nas fezes. Após oito dias, o primeiro animal começou a
apresentar oocistos nas fezes, mantendo um período patente de 23 dias. O segundo animal
começou a eliminar oocistos após 25 dias de acompanhamento, apresentando período patente
de 12 dias. Em ambos os casos eram poucos os oocistos eliminados, sendo que por este
motivo não foi evidenciado um pico de maior eliminação de oocistos.
Para a realização da RFLP-PCR foram selecionadas uma amostra de cada pato, uma
amostra de codorna, uma de pinto e uma de cada Porquinho da Índia.
A digestão com a enzima SspI mostrou padrão compatível com C. baileyi, infectando
os patos e a codorna, ou seja, apresentando duas bandas de peso aproximado de 253pb e 578
pb. No pinto o padrão de corte foi compatível com C. meleagridis, apresentando fragmentos
de 117pb, 264pb e 442pb. Usando a enzima VspI os fragmentos obtidos (468pb, 186pb e
168pb) foram compatíveis com a espécie descrita.
A amostra oriunda dos Porquinhos da Índia não sofreu digestão pela SspI e a digestão
pela VspI obteve fragmentos de aproximadamente 689pb e 110pb.
Os padrões de corte foram comparados com aqueles estabelecidos por Xiao et al (2004
b).
31
O resultado da RFLP pode ser visualizado na Figura 2, para a enzima SspI e na Figura 5
para a enzima VspI.
32
Figura 2: Produtos da RFLP-PCR de amostras fecais contendo oocistos de
Cryptosporidium sp. Colunas 1 a 5: produto da digestão SspI de C. baileyi de
patos. Coluna 6: produto de digestão de C. baileyi de codorna, Coluna 7: produto
de digestão de C. meleagridis isolado de pinto. Colunas 8 e 9: produto não digerido
de Cryptosporidium sp. de Porquinhos da índia. Os pesos moleculares indicados
são valores aproximados, admitindo uma variação de 3% para mais ou para menos.
M: Marcador de peso Molecular
578
253
858
442
264
117
M1 2 3 456 7
89
33
4.2 Abrigo de gatos
Das 30 amostras fecais de gatos, nove amostras continham oocistos de Cryptosporidium
sp. (30,00%). Todas as amostras continham ovos ou oocistos de ao menos uma espécie de
parasito. Foram encontrados ovos de Toxocara sp. em 26 amostras (86,66%), Ancylostoma sp.
em 14 amostras (46,66%), Platynossomum em seis amostras (20,00%), Dipylidium caninum
em quatro (13,33%), Cystoisospora em quatro (13,33%), Sarcocystis sp. em uma amostra
(3,33%) Giardia sp. em 18 (60,00%) amostras.
Parasitismo simples ocorreu em apenas três amostras (10,00%), parasitismo duplo em
10 amostras (33,33%), triplo em 12 amostras (40,00%), parasitismo por quatro diferentes
espécies de parasitos em dois casos (6,66%) e infecção por cinco diferentes espécies em três
amostras (10,00%).
Das quatro amostras fecais de cães apenas uma (25,00%) continha oocistos de
Cryptosporidium sp. e todas continham cistos de Giardia sp., ovos de Toxocara sp e de
Ancylostoma sp., sendo que ovos de Trichuris sp. foram encontrados em uma amostra.
Das nove amostras de gatos, contendo oocistos de Cryptosporidium sp., seis
apresentavam mais de quatro oocistos observados na técnica de centrífugo-flutuação. Estas
seis amostras e a amostra de cão foram submetidas às técnicas de Biologia Molecular para a
determinação das espécies de Cryptosporidium envolvidas no parasitismo.
O padrão de digestão da amostra proveniente do cão mostrou-se compatível com C.
canis (fragmentos de peso aproximado: 447pb, 275pb e 110pb) enquanto que o padrão de
digestão de três amostras de gatos foi compatível com C. felis (fragmentos de peso
aproximado: 447pb e 418pb), conforme descrito por Xiao et al. (2004 b).
As outras três amostras dos gatos não amplificaram, mesmo após diversas tentativas e
modificações no protocolo.
A fotografia do gel de agarose pode ser vista na Figura 3.
34
Figura 3: Produtos da RFLP-PCR de amostras fecais de gatos e de um cão, contendo oocistos
de Cryptosporidium spp., provenientes de um abrigo. Colunas 1, 2 e 3: produtos da digestão
de C. felis isolados de gatos. Coluna 4: produto da digestão de C. canis, isolado de cão. Os
Pesos moleculares apresentados são aproximados, podendo variar em 3% para mais ou para
menos. M: Marcador de peso molecular
447 pb
418 pb 437 pb
268 pb
110 pb
M 1 2 3 4
35
4.3 Bovinos leiteiros
Das 56 amostras de fezes de bovinos, 10 continham oocistos de Cryptosporidium,
destas três amostras foram selecionadas para serem submetidas ao PCR, devido à alta
quantidade de oocistos de Cryptosporidium sp. presente e a ausência de outros parasitos.
A técnica da RFLP do produto da amplificação do gene 18S rDNA usando a enzima
SspI mostrou um padrão de corte compatível com o descrito para C. parvum tendo
fragmentos com peso aproximado de 461pb, 260pb e 110pb. Foi realizada uma segunda
digestão com a enzima VspI, que também mostrou padrão de corte compatível com esta
espécie, apresentando fragmentos de peso aproximado de 689pb e 112pb.
Na figura 4 poder ser visualizado o resultado da digestão enzimática utilizando a
enzima SspI e na figura 5 para a enzima VspI.
36
Figura 4: Produtos da RFLP-PCR de amostras fecais contendo oocistos de
Cryptosporidium spp., de bezerros de uma fazenda de exploração leiteira. Colunas 1, 2 e 3:
produtos da digestão de C. parvum. Os Pesos moleculares apresentados são aproximados,
podendo variar em 3% para mais ou para menos. M: Marcador de peso molecular
459 pb
263 pb
120 pb
M 1 2 3
37
Figura 5: Resultado da digestão de Crytosporidium spp. com a enzima VspI. Coluna 1:
produto de digestão de C. meleagridis isolado de pinto. Colunas 2 e 3: produto de
Cryptosporidium sp. de Porquinhos da Índia. Coluna 4: produto da digestão de C. canis de
cão. Colunas 5 e 6: produto de C. parvum de bovinos. Os pesos moleculares indicados são
valores aproximados, admitindo uma variação de 3% para mais ou para menos. M: Marcador
de peso molecular
M1 2 345 6
689pb
468pb
110pb
730pb
38
4.4 Seqüências obtidas e identificação de sítios de corte enzimático
As amostras seqüenciadas resultantes deste trabalho, foram depositadas no GenBank,
recebendo os números de acesso descritos abaixo, seguidos pelo tamanho do fragmento.
As duas amostras seqüenciadas de C. baileyi oriundas de patos, receberam os números de
acesso: DQ885339 com tamanho de 694pb e DQ885340 com 684pb.
A amostra de C. baileyi da codorna recebeu o número de acesso DQ885335, possuindo
tamanho de 657pb e a seqüência de C. meleagridis encontrada parasitando o pinto foi
depositado sob número DQ885341, medindo 672pb.
As seqüências dos Porquinhos da Índia receberam os números de acesso DQ885337
possuindo 673pb e DQ885338 com 676pb, sendo que ambas as seqüências não puderam ser
identificadas como espécie conhecida de Cryptosporidium, pois na busca pelo BLAST elas
alinharam principalmente com seqüências de Cryptosporidium sp. obtidas de amostras
ambientais, sem hospedeiros identificados. Assim sendo, a seqüência com o número de acesso
AF262332 foi a única, que em toda sua extenção alinha-se com a seqüência do presente
estudo. Trata-se de uma amostra ambiental (isolado N) de Cryptosporidium sp. isolado das
águas de um lago após um evento de tempestade. A similaridade entre as duas seqüências é de
93%. As demais seqüências identificadas na busca do BLAST, alinham, formando dois
fragmentos e uma grande lacuna intermediária, o que torna a busca pela similaridade
impossível.
Devido à grande distância genética entre as seqüências de Cryptosporodium sp. de
Porquinho da índia, do presente estudo, e seqüências de espécies conhecidas de
Cryptosporidium depositadas no GenBank sugerimos que se trate de um genóptipo ou espécie
nova.
Apenas duas amostras de gatos continham DNA suficiente para permitir o
seqüenciamento, sendo que uma das seqüências resultantes foi de baixa qualidade, não
possibilitando o estabelecimento de uma seqüência consenso confiável. A seqüência
depositada recebeu o número DQ885336 e possue tamanho de 702pb. A amostra de C. canis
foi seqüenciada e recebeu o número de depósito DQ885334, possuindo tamanho de 571pb.
Uma das amostras de C. parvum de bovinos foi seqüenciada, sendo depositada no
GenBank sob número de acesso DQ885333, possuindo 689pb.
Estas são as primeiras seqüências de C. baileyi, C. meleagridis, C. felis, C. canis e C.
parvum do Brasil depositadas no GenBank.
Para uma melhor avaliação da eficácia da RFLP na identificação das espécies de
Cryptosporidium, foi realizado o alinhamento das seqüências obtidas no presente trabalho e
de uma seqüência ‘tipo’ já depositada no GenBank. Os sítios de restrição foram pesquisados
para as enzimas SspI, VspI, DdeI, AseI, e NdeI (Quadro 3).
Apenas C. felis; C. suis e C. baileyi podem ser seguramente diagnosticados com a
digestão pela enzima SspI, possuindo estas espécies padrão de corte que as diferencia das
demais. Na distinção entre C. suis e C. felis, pode ainda ser utilizado a enzima NdeI.
Para a identificação das outras espécies de Cryptosporidium combinações de enzimas
precisam ser empregadas, assim C. parvum, C. hominis e C. meleagridis podem ser
distinguidas entre si pelo uso da enzima VspI. Embora Xiao et al. (2004) relatem que estas
duas enzimas sejam suficientes para o diagnóstico das espécies de Cryptosporidium, foi
constatado que o uso da enzima NdeI pode ser necessário na diferenciação clara entre C.
parvum e C. canis, enquanto o uso de DdeI diferencia C. parvum de C. bovis.
A enzima AseI distingue Cryptosporidium Mouse Genotype das demais espécies. Já
Cryptosporidium Ferret genotype e C. melagridis não conseguem ser diferenciadas com as
enzimas testadas.
39
Conforme foi notado, as seqüências de Cryptosporidium sp. dos Porquinhos da Índia
são as únicas que não possuem sítio de restrição para a enzima SspI, porém possuem sítios
para as demais enzimas.
No Quadro 3 podem ser visualizados os sítios aproximados de restrição para as diversas
enzimas, na Figura 6 está exposto um fluxograma, evidenciando o emprego seqüenciado de
enzimas de restrição no diagnóstico das principais espécies de Cryptosporidium e na Figura 7
pode ser visto o alinhamento das seqüências obtidas no presente estudo.
40
Quadro 3: Comparação entre os sítios de restrição enzimática presentes nas seqüências
parciais do gene 18Sr DNA (Tamanho aproximado dos fragmentos: 752pb) de C. parvum
(B83), C. canis (C224), C. felis (Gato), Cyryptosporidium sp. de Porquinho da Índia (O92 e
O93), C. baileyi de codorna (Codorna), C. baileyi de patos (P21 e P22) e C. meleagridis de
pinto (Pinto) e seqüências equivalentes já depositadas no GenBank. Foram comparadas as
enzimas SspI, VspI, DdeI, AseI e NdeI. O término das seqüências ( - ), indica que a seqüência
é mais curta, terminando antes das outras seqüências comparadas.
41
Região aproximada
(pb)
23 29 173 414 420 427 437 448 429 438 486 543 573 608 625 720
B83
DdeI SspI SspI SspI NdeI SspI DdeI VspI VspI
C. parvum
AF164102
DdeI SspI SspI SspI NdeI SspI DdeI VspI VspI
C. hominis
DQ286403
VspI DdeI SspI SspI SspI NdeI SspI DdeI VspI VspI
Pinto
DdeI SspI SspI SspI VspI NdeI SspI DdeI VspI
-
C. meleagridis
AF112574
DdeI SspI SspI SspI VspI NdeI SspI DdeI VspI VspI
Mouse AF112571
DdeI SspI SspI SspI VspI AseI NdeI SspI DdeI VspI VspI
C. ferret AF112572
DdeI SspI SspI SspI VspI NdeI SspI DdeI VspI VspI
C. suis AF1125377
DdeI SspI SspI SspI NdeI DdeI VspI VspI
C. RABBIT
AY120901
DdeI SspI SspI NdeI SspI DdeI VspI VspI
C. wrairi
DdeI SspI SspI SspI NdeI SspI DdeI VspI VspI
C.bovis AY731305
AseI DdeI SspI SspI VspI VspI
C224
DdeI SspI SspI SspI VspI
C. canis AB210854
DdeI SspI SspI SspI DdeI VspI VspI
Gato
DdeI SspI SspI SspI AseI DdeI VspI
-
C.felis AF112575
DdeI SspI SspI AseI DdeI VspI VspI
O92
DdeI AseI DdeI VspI
-
O93
DdeI AseI DdeI VspI
-
C. sp. N AF262332
DdeI SspI
-
- -
Codorna
DdeI SspI VspI
-
P21
DdeI SspI VspI VspI
P22
DdeI SspI VspI VspI
C. baileyi
AF262324
DdeI SspI VspI VspI
C. muris
DdeI SspI DdeI AseI AseI VspI
C. galli
DdeI AseI AseI VspI
C. serpentis
DdeI SspI AseI SspI AseI VspI
C.andersoni
DdeI SspI AseI AseI VspI
42
Figura 6: Fluxograma de uso das enzimas de restrição SspI, VspI, DdeI, AseI e NdeI
para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. de répteis, aves e mamíferos.
43
Cryptosporidium spp.
Ssp
I
C. baileyi
C. felis
C. suis
C. muris
C. galli
C. serpentis
C. andersoni
C. parvum
C. hominis
C. meleagridis
C. Mouse
genotype
C. Ferret genotype
C. Rabbit genotype
C. wrairi
C. bovis
C. canis
A
se
I
C. felis
C. suis
NdeI
C. felis
C. suis
VspI
C. hominis
C. Rabbit Genotype
C. wrairi
C. bovis
C. canis
C. parvum
C. meleagridis
C. Ferret
Genotype
C. Mouse
C. galli
C. serpentis
C. andersoni
C. muris
DdeI
C. andersoni
C. muris
AseI
C. Mouse Genotype
C. Ferret Genotype
C. meleagridis
DdeI
C. bovis
C. Rabbit Genotype
C. wrairi
C. canis
C. parvum
NdeI
C. canis
C. wrairi
C. parvum
C. Rabbit Genotype
44
Figura 7: Alinhamento das seqüências de C. parvum (B83), C. canis (C224), C. felis
(Gato), Cyryptosporidium sp. de Porquinho da Índia (O92 e O93), C. baileyi de codorna
(Codorna), C. baileyi de patos (P21 e P22) e C. meleagridis de pinto (Pinto). As cores
marcam os sítios de restrição presentes nas seqüências, para as enzimas DdeI (CTAAG), AseI
(ATTAT), VspI (ATTAAT) e SspI (AATATT). Lacunas são marcadas por ( - ) e Nucleotídeos
idênticos por ( . ).
45
#B83 --------CT TTACGGATCA CA-------T TAAATGTGAC ATATCATTCA AGTTTCTGAC CTATCAGCTT TAGA-CGGTA [ 80]
#C224 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- [ 80]
#Gato --TAATAA.. .......... ..ACAATTTA .TT.G..... .......-.. .......... .......... ....A..... [ 80]
#O92 -----TAA.. .......... ..-----TT. .T........ .......... .......... .......... ....-..... [ 80]
#O93 -----TAA.. .......... ..-----TT. .T........ .......... .......... .......... ....-..... [ 80]
#Codorna CATAATTA.. .......... ..-------- .TT....... .......... .......... .......... ....-..... [ 80]
#P21 -----TTA.. .......... .G-------- .TT..C.... ....T..... .......... ......-... ....-..... [ 80]
#P22 -----TTA.. .......... ..-------- .TT....... .......... .......... ......-... ....-..... [ 80]
#Pinto -------A.. .......... ..-------A .TT....... .......... .......... .......... ....-..... [ 80]
#B83 GGGTATTGGC CTACCG-TGG CAATGACGGG TAACGGGGAA TTAGGGTTCG ATTCCGGAGA GGGAGCCTGA GAAACGGCTA [160]
#C224 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -......... [160]
#Gato ......G... ......G... .T........ .......... .......... .......... .......... .......... [160]
#O92 .......... ......-... .T........ .......... .......... .......... .......... .......... [160]
#O93 .......... ......-... .T........ .......... .......... .......... .......... .......... [160]
#Codorna .......... ......-... .T........ .......... .......... .......... .......... .......... [160]
#P21 .......... ......-... .T........ .......... .......... .......... .......... .......... [160]
#P22 .......... ......-... .T........ .......... .......... .......... .......... .......... [160]
#Pinto .......... ......-... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160]
#B83 CCACATCTAA GGAAG-GCAG CAGGCGCGCA AATTACCCAA TCCTAATACA GGGAGGTAGT GACAAGAAAT AACAATACAG [240]
#C224 .......... .....T.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240]
#Gato .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240]
#O92 .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240]
#O93 .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240]
#Codorna .......... .....-.... .......... .......... ....G.C... .......... .......... .......... [240]
#P21 .......... .....-.... .......... .......... ....G.C... .......... .......... .......... [240]
#P22 .......... .....-.... .......... .......... ....G.C... .......... .......... .......... [240]
#Pinto .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240]
#B83 GACTTTT--T GGTTTTGTAA TTGGAATGAG TTAAGTATAA ACCCCTTTAC AAGTATCAAT TGGAGGGCAA GTCTGGTGCC [320]
#C224 ......AA-C A......... .......... ..G....... .......... .......... .......... .......... [320]
#Gato ......A--C .....G.... .G........ .......... .......... .......... G......... .......... [320]
#O92 ...C...AT. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320]
#O93 ...C...AT. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320]
#Codorna .G.C.AA--C ...C...... .......... .......... .......... .....G.... .......... .......... [320]
#P21 .G.C.AA--C ...C...... .......... .......... .......... .....G.... .......... .......... [320]
#P22 .G.C.AA--C ...C...... .......... .......... .......... .....G.... .......... .......... [320]
#Pinto .......--. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320]
#B83 AGCAGCCGCG GTAATTCCAG CTCCAATAGC GTATATTAAA GTTGTTGCAG TTAAAAAGCT CGTAGTTGGA TTTCTGTTAA [400]
#C224 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400]
#Gato .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..CTGT.A.T [400]
#O92 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400]
#O93 .......... .......... ....C..... .......... .......... .......... .......... .......... [400]
#Codorna .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400]
#P21 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400]
#P22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400]
#Pinto .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400]
#B83 TAATT-TATA TAAAATATTT TGAT--GAAT ATTTATATAA TATTAACATA ATTCATATTA ---------- ---CTATATA [480]
#C224 .....-.... ..T....... AACA-----. .......... .......... .......... ---------- ------CTAT [480]
#Gato ACC..A.... ...T..T... .TT.AAAT.. TA....G... G......... .........T TTTAAGACTG AATT.T..GT [480]
#O92 ..G..TC... ..T.....CC ATT--GAT.. TA....G--. C......... .C.......T ---------- ACTT.CGGGT [480]
#O93 ..G..TC... ..T.....CC ATT--GAT.. TA....G--. C......... .C...?...T ---------- ACTT.CGGGT [480]
#Codorna ..C..A.... C..T.CCACG GT.------- -......... C......... .....C.... ---------- -----C.TAT [480]
#P21 ..C..A.... C..T.CCACG GT.------- -......... C......... .....C.... ---------- -----C.TAT [480]
#P22 ..C..A.... C..T.CCACG GT.------- -......... C......... .....C.... ---------- -----C.TAT [480]
#Pinto .....-.... ..T....... GAT.-AAT.. T.A....--. .......... .......... ---------- ---...A..T [480]
#B83 TTTTAGTATA TGAAATTTTA CTTTGAGAAA ATTAGAGTGC TTAAAGCAGG CATATGCCTT GAATACTCCA GCATGGAATA [560]
#C224 ..A....... .....C.... .......... .......... .......... .T.T...... .......AG. .......... [560]
#Gato ...G.TA... .......... .......... .......... .......... .T.T...... .......... .......... [560]
#O92 ...-----.. ...G...... .......... .......... .......... ...T-..... .......A.. .......-.. [560]
#O93 ...-----.. ...G...... .......... .......... .......... ...T-..... .......A.. .......... [560]
#Codorna ..AA.....G .....C.... .......... .......... .......... .TAT...... .......... .......... [560]
#P21 ..AA.....G .....C.... .......... .......... .......... .TAT...... .......... .......... [560]
#P22 ..AA.....G .....C.... .......... .......... .......... .TAT...... .......... .......... [560]
#Pinto .A........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560]
#B83 ATATTAAAGA TTTTTA---T CTTTCTTATT GGTTCTAAGA TAAGAATAAT GATTAATAGG GACAGTTGGG GGCATTTGTA [640]
#C224 .......... ......---. .......... .......G.. ..GA...... .......... .......T.. ...G..-... [640]
#Gato ...A....AG A....TATC. T...T..... .......... ...A...... .......... .......... .......... [640]
#O92 ...A....AG A....TATC. T...T..TA. .......... ...A...... .......... .......... ......GTA- [640]
#O93 ...A....AG A....TATC. T...T..TA. .......... ...A...... .......... .......... .......... [640]
#Codorna .......... ......---. .......... .......G.. ...A...... .......... .......... .......... [640]
#P21 .......... ......---. .......... .......G.. ...A...... .......... .......... .......... [640]
#P22 .......... ......---. .........G .......G.. ...A...... .......... .......... .......... [640]
#Pinto .......... ......---. .......... .......... ...A...... .......... .......... .......... [640]
#B83 -TTAACAGTC AGAGGTGA-A TTCTTAGATT TGTTAAAGAC AA-CTAATGC GAAAGCATT- GCCAAGGATG TTTTCATTAA [720]
#C224 T.......AT ........A- -......... .......... ..-....... .........T .......... ...CT.A.C. [720]
#Gato T......... ........T. .......... .......... ..-....... .........- .......... ---------- [720]
#O92 -......... ........A. .......... .......... ..-....... .........- ....G.ATGT .--------- [720]
#O93 T......... ........A. .......... .......... ..-....... .........- ....G.ATGT .--------- [720]
#Codorna T......... ........A. .......... .......... ..-...C... .......--- ---------- ---------- [720]
#P21 T......... ........A. .......... .......... ..-...C... .........- .......... .......... [720]
#P22 T......... ........A. .......... .......... ..A...C... .........- .......... .......... [720]
#Pinto T......... ........A. .......... .......... ..-....... .........- TG.CCA.GAT G..------- [720]
#B83 TCAAGACGAA GT-------- ---------- -- [752]
#C224 GA.C..A.TT AGGGATCGAG ACGATCAGAT AC [752]
#Gato ---------- ---------- ---------- -- [752]
#O92 ---------- ---------- ---------- -- [752]
#O93 ---------- ---------- ---------- -- [752]
#Codorna ---------- ---------- ---------- -- [752]
#P21 ......ACG. AGTTAGGGAT C--------- -- [752]
#P22 ...GA..... ---------- ---------- -- [752]
#Pinto ---------- ---------- ---------- -- [752]
46
4.5 Filogenia
As espécies C. parvum, C, baileyi e C. meleagridis mostraram 99% de similaridade
quando comparadas às seqüências já existentes no GenBank. A espécie C. felis e C. canis do
presente estudo, possuem similaridade de 98% e 97%, respectivamente, quando comparadas
às seqüências do GenBank.
Não foi possível identificar as seqüências de Cryptosporidium obtidas dos Porquinhos
da Índia, sugerindo tratar-se de uma seqüência que ainda não foi depositada no GenBank,
sendo provavelmente um genótipo ou espécie nova.
Nas tabelas 1 e 2 podem ser observadas as distâncias genéticas entre diversas
seqüências de C. felis e de C. canis já depositadas no GenBank e as seqüências obtidas no
presente estudo. É interessante notar que a distância genética dos isolados brasileiros é maior
que aquela existente entre os isolados previamente descritos.
Na tabela 3 podem ser observadas as distâncias genéticas entre as seqüências de
Cryptosporidium obtidas dos Porquinhos da Índia e seqüências de espécies conhecidas de
Cryptosporidium e uma não identificada (Xiao et al, 2000).
Na análise filogenética, os isolados brasileiros agruparam-se às espécies correlatas já
descritas. Os isolados de Cryptosporidium obtidos de Cavia porcelus se localizaram entre as
espécies intestinais, estando geneticamente relacionadas a C. felis, porém mantendo-se
distintas o bastante para caracterizarem uma espécie distinta. Na figura 7 pode ser visualizada
a árvore filogenética elaborada pelo método do Neighbor Joining. Os dados foram
confirmados também pela análise da Maximum parcimony e Maximum Likelyhood, cujas
árvores finais são condizentes com a apresentada.
47
Tabela 1: Distância genética calculada pelo Kimura- 2 Parâmetro, comparando a
amostra brasileira de C. felis e seqüências previamente depositadas no GenBank.
C. felis amostra
brasileira
C._felis_
AF112575
C._felis_
AF159113
C._felis_
AF108862
C. felis amostra
brasileira
C. felis
AF112575
0.005
C._felis
AF159113
0.007 0.002
C._felis_
AF108862
0.005 0.000 0.002
E._tenella_
AF026388
0.282 0.274 0.274 0.274
Tabela 2: Distância genética calculada pelo Kimura- 2 Parâmetro, comparando a
amostra brasileira de C. canis e seqüências previamente depositadas no GenBank.
C. canis
amostra
brasileira
C. canis
AF112576
C. canis
AB210854
C. canis
AY120909
C. canis
AJ493209
C. canis
amostra
brasileira
C. canis
AF112576
0.008
C. canis
AB210854
0.008 0.000
C. canis
AY120909
0.010 0.002 0.002
C. canis
AJ493209
0.008 0.000 0.000 0.002
E. tenella
AF026388
0.270 0.264 0.264 0.262 0.264
48
Tabela 3: Distância genética calculada pelo Kimura- 2 Parâmetro, comparando as amostras brasileiras de Cryptosporidium de Cavia
porcelus e seqüências previamente depositadas no GenBank.
O92 O93 C. felis
AF112575
C.sp. N
AF262332
C.wrairi
AY115378
RABBIT
GENOT
AY120901
C. parvum
AF164102
MOUSE
GENOT
AF112571
FERRET
AF112572
C. canis
AB210854
C. baileyi
AF262324
DEER
GENOT
AY120910
C. muris
AF093498
O92
O93 0.003
C. felis
AF112575
0.037 0.040
C.sp. N
AF262332
0.045 0.048 0.050
C.wrairi
AY115378
0.048 0.050 0.037 0.037
RABBIT
GENOT
AY120901
0.048 0.050 0.039 0.034 0.013
C. parvum
AF164102
0.050 0.053 0.039 0.040 0.003 0.010
MOUSE
GENOT
AF112571
0.053 0.056 0.039 0.042 0.008 0.010 0.005
FERRET
AF112572
0.053 0.056 0.039 0.042 0.008 0.010 0.005 0.005
C. canis
AB210854
0.064 0.067 0.042 0.048 0.031 0.039 0.034 0.039 0.039
C. baileyi
AF262324
0.076 0.078 0.059 0.059 0.056 0.056 0.056 0.062 0.062 0.053
DEER
GENOT
AY120910
0.076 0.078 0.059 0.059 0.053 0.048 0.053 0.053 0.053 0.050 0.045
C. muris
AF093498
0.113 0.116 0.102 0.113 0.096 0.104 0.099 0.099 0.104 0.099 0.078 0.107
E. tenella
AF026388
0.263 0.267 0.266 0.255 0.282 0.282 0.286 0.285 0.289 0.286 0.285 0.292 0.262
Figura 8: Árvore filogenética de espécies brasileiras de Cryptosporidium e espécies já
descritas e depositadas no GenBank. Os números mostram os valores do Bootstrap para
Neighbor Joining, Maximum parsimony entre parênteses e Maximum Likelihood em itálico.
50
5 DISCUSSÃO
No presente estudo foi diagnosticado quatro espécies de Cryptosporidium com
comprovado potencial zoonótico, sendo elas: C. parvum, C. meleagridis, C. felis e C. canis.
Nos cães e gatos do abrigo de animais, a ocorrência de infecções concomitantes com
helmintos e outros protozoários, mostraram a precária sanitária dos animais nesse ambiente.
Como Cryptosporidium é um importante parasito oportunista de várias espécies de animais e
de humanos, este intenso parasitismo pode ter colaborado para a debilidade dos hospedeiros,
favorecendo a infecção por C. felis e C. canis, nos gatos e no cão, respectivamente,
justificando a alta ocorrência encontrada nesse estudo.
Huber et al (2002) encontraram uma ocorrência de Cryptosporidium sp. de 25% em 20
gatos mantidos aglomerados. Porém a maioria dos relatos se refere a uma ocorrência até
12,1% da infecção em gatos.
O que chamou atenção foi que, apesar do ambiente altamente contaminado por fezes e
conseqüentemente por oocistos de C. felis, o cão que estava infectado apresentou a espécie C.
canis, indicando certa preferência ao hospedeiro, apesar do ambiente propício para a
dispersão de C. felis.
Abe et al (2002), estudando 140 amostras de fezes de cães recolhidos das ruas também
diagnosticaram apenas C. canis nestes animais, evidenciando uma certa especificidade pelo
hospedeiro, ao menos na infecção natural de cães.
Até o momento não há relato de infecção natural por outra espécie de Cryptosporidium
em gatos, que não seja C. felis, porém estudos conduzidos em gatos domésticos realizando a
genotipagem, ainda são raros.
Segundo Scorza et al. (2003) a distribuição desigual de oocistos nas fezes, fazendo
com que a alíquota utilizada no procedimento não contenha oocistos suficientes; falha na
ruptura dos oocistos durante extração, evitando assim a liberação do DNA para a análise; a
absorção do DNA por compostos presentes nas fezes e a presença de inibidores da PCR,
podem dificultar o uso da PCR em materiais fecais. Estes fatores podem ter sido responsáveis
pela não amplificação do material de três das amostras fecais de gatos que apresentavam-se
positivas para Cryptosporidium no exame de centrífugo-flutuação.
É notável, e ao mesmo tempo preocupante, a facilidade com a qual foram encontradas
pelo menos duas espécies distintas de Cryptosporidium nos animais comercializados no
Mercado Municipal. Considerando que C. meleagridis também infecta humanos, causando
infecção tanto em adultos quanto em crianças, fica evidente o risco de contrair a doença aos
quais os freqüentadores, comerciantes e fregueses do Mercado, e em especial, da loja de
animais, estão expostos, existindo também a possibilidade da contaminação dos alimentos
comercializados nas vizinhanças do local.
É comum serem vistas crianças, acariciando animais por entre a tela, principalmente
nos patos e pintinhos. Outras vezes, pedem aos pais para que comprem um dos animais para
poderem ser levados para casa, como animais de estimação. Devido ao baixo custo de
aquisição, muitas das vezes o desejo das crianças é realizado. Desta forma possíveis
portadores de criptosporidiose são levados para o domicílio. O estreito contato de crianças
com seus animais de estimação pode aumentar ainda mais os riscos da transmissão zoonótica.
Durante as análises dos sítios de corte enzimático dos produtos da Nested-PCR do gen
18Sr DNA, utilizando-se as enzimas SspI e VspI, a única espécie que realmente possui padrão
de corte característico é C. baileyi. As demais espécies de Cryptosporidium deveriam ser
submetidas à ação de outras enzimas, conforme mostrado na Figura 06, para um diagnóstico
específico. Porém, as espécies C. wrairi, C. parvum e Cryptosporidium Rabbit genotype, bem
51
como C. meleagridis e Cryptosporidium Ferret genotype, não podem ser especificados pelos
métodos propostos, devendo ser analisadas mediante uso de outros gens, como o COWP ou o
sequenciamento. No presente trabalho a RFLP foi realizada utilizando-se as enzimas SspI e
VspI, sendo que o diagnóstico específico foi confirmado mediante a realização do
sequenciamento do produto obtido na Nested-PCR.
Com base nos dados apresentados pelo agrupamento filogenético, uma possível nova
espécie chama a atenção à presença de espécies desconhecidas de Cryptosporidium, mesmo
em animais comuns de estimação, como é o caso do Porquinho da Índia.
As espécies do gênero Cryptosporidium podem sofrer recombinações genéticas,
principalmente quando ocorrem infecções mistas de genótipos ou mesmo de espécies distintas
(FENG et al., 2002), sendo que a formação das espécies do gênero Cryptosporidium
aparentemente é o resultado da adaptação do parasito a diferentes hospedeiros. Diferentes
espécies de Cryptosporidium podem parasitar um mesmo hospedeiro, como ocorrem em C.
parvum, C. hominis, C. meleagridis e C. muris, sugerindo que outros fatores podem levar à
especiação (TANRIVERDI; WIDMER, 2006).
Também foi sugerido que populações genéticas distintas podem emergir dentro de um
grupo de hospedeiros em relativamente pouco tempo, devido à rápida reprodução do gênero e
a possibilidade de estabelecer uma população clonal. Segundo Tanriverdi et al. (2006), isso
pode explicar a freqüente detecção de genótipos específicos a hospedeiros cujo status
taxonômico é desconhecido, como ocorre em estudos que isolam oocistos em águas
superficiais. O mesmo fato pode explicar a existência de genótipos geograficamente restritos
de C. hominis no homem. Este fato poderia explicar a distância genética maior observada
entre C. felis e C. canis isolados no Brasil quando comparados às seqüências do GenBank.
Também seria possível que a espécie de Cryptosporidium dos Porquinhos da Índia tenha se
formado desta forma.
Existe a possibilidade de surgimento de uma nova espécie a partir de recombinações
genéticas, quando há a infecção do hospedeiro por mais de uma espécie. No caso dos
Porquinhos da Índia acompanhados, as seqüências obtidas não alinharam, utilizando o
BLAST, com seqüências de espécies conhecidas, mas com uma seqüência de
Cryptosporidium sp. ‘isolado N’ encontrado na água, cuja provável origem seria de roedores
silvestres (XIAO et al, 2000).
Maiores estudos são extremamente necessários para a descrição do ciclo biológico,
infectividade e obtenção de mais seqüências, se possível maiores que as obtidas no presente
trabalho e de outros locus genéticos.
O estudo da criptosporidiose em ruminantes é bem avançado, sendo que ruminantes
domésticos jovens, principalmente neonatos, são capazes de eliminar uma grande quantidade
de oocistos de Cryptosporidium, podendo atingir um número de 10
6
a 10
7
por grama de fezes
(FAYER, 1997). Como isto representa uma intensa contaminação ambiental, se tornam de
fundamental importância às práticas de manejo para o controle da infecção (MOHAMMED et
al., 1999).
Apesar da presença da pesquisa veterinária brasileira nos levantamentos
epidemiológicos da criptosporidiose animal, ela se mostra ausente na aplicação das
tecnologias moleculares no seu diagnóstico, assim maiores estudos são necessários com
relação às espécies de Cryptosporidium que ocorrem no Brasil, incluindo o depósito de
seqüências no GenBank, para fornecer aos pesquisadores bases de dados eficientes na
realização de estudos filogenéticos.
52
6 CONCLUSÕES
Através do uso da Nested-PCR e do seqüenciamento de fragmento do gene 18Sr DNA,
foi possível identificar as seguintes espécies de Cryptosporidium nos respectivos hospedeiros:
C. parvum em bovinos, C. meleagridis em pintos, C. baileyi em codornas e patos, C. felis em
gatos, C. canis em um cão e Cryptosporidium sp. em Porquinhos da Índia.
A análise das distancias genéticas entre as seqüências de Cryptosporidium oriundas de
porquinhos da Índia e de espécies conhecidas, permitiu o reconhecimento de um novo
genótipo, nesse hospedeiro.
A realização da RFLP com as enzimas utilizadas foi suficiente para a indicação das
espécies de Cryptosporidium encontradas, porém para o diagnóstico específico, o
sequenciamento torna-se essencial.
Animais comercializados em mercados municipais podem ser considerados potenciais
fontes de contaminação ambiental para diversas espécies de Cryptosporidium, evidenciando-
se assim o risco de infecção a partir da aquisição de animais provenientes desses mercados,
bem como da contaminação acidental de alimentos que são comercializados no entorno das
lojas de animais.
53
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