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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
DISSERTAÇÃO
Avaliação in vitro dos efeitos de Isaria farinosa, I.
fumosorosea, Paecilomyces lilacinus e Lecanicillium
lecanii sobre Boophilus microplus.
Isabele da Costa Angelo
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AVALIAÇÃO in vitro DOS EFEITOS DE Isaria farinosa, I.
fumosorosea, Paecilomyces lilacinus E Lecanicillium lecanii SOBRE
Boophilus microplus
ISABELE DA COSTA ANGELO
Sob a Orientação da Professora
Vânia Rita Elias Pinheiro Bittencourt
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Curso de Pós-
Graduação em
C
iências Veterinárias, Área de
Concentração em Parasitologia
Animal.
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2007
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595.42
A584a
T
Angelo, Isabele da Costa, 1981-
Avaliação in vitro
dos efeitos de Isaria farinosa, I.
fumosorosea, Paecilomyces lilacinus
e Lecanicillium
lecanii sobre Boophilus microplus / Isabele da Costa
Angelo. – 2007.
49 f. : il.
Orientadora: Vânia Rita Elias
Pinheiro Bittencourt.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, Instituto de
Veterinária.
Bibliografia: f. 42-49.
1. Boophilus microplus –
Controle biológico – Teses. 2.
Fungos entomopatogênicos - Teses.
I. Bittencourt, Vânia Rita Elias,
1959. II. Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro. Instituto
de Veterinária. III. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ISABELE DA COSTA ANGELO
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências,
no Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de Concentração em Parasitologia
Veterinária.
TESE APROVADA EM 26 / 02 / 2007.
___________________________________
Dedico este trabalho aos meus pais
Josemar e Maria de Fátima,, aos
meus avós Florival e Valentina,, aos
meus irmãos Leonardo , Josemar Jr.
e Dafni e ao meu pequeno Gabriel.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por ter guiado meus passos nesta longa caminhada. A
professora e orientadora Vânia Rita Elias Bittencourt por ter me deixado fazer parte de seu
grupo de pesquisa, compartilhado seus conhecimentos, confiado no meu trabalho e por muitas
vezes ter dito palavras de conforto nos momentos de desespero; à minha grande família por
todo o amor concedido; a grande amiga Ana Paula Rodrigues de Moraes, que me acompanha
pessoalmente e profissionalmente desde o início da graduação, compartilhando minhas
alegrias e tristezas; ao querido Wagner Gitahy Leira, que por muitos fins de semana me
ajudou no laboratório, e que durante muitos anos me incentivou, me fazendo acreditar em um
futuro promissor, confiando sempre no meu potencial; ao grande amigo Marcos Pinheiro
Franque, que esteve sempre disposto a me ajudar, me estimulando em todos os dias de nossos
estudos; aos amigos Éverton Kort Kamp Fernandes e Thiago Campanharo Bahiense pelos
momentos de descontração no laboratório, pela amizade conquistada em pouco tempo e pelos
ensinamentos teóricos e práticos compartilhados; ao sempre presente Wendell Marcelo de
Souza Perinotto, que acompanhou meus experimentos e que certamente contribuiu para o
desenvolvimento deste trabalho; a mais nova amiga Andréia Loureiro Musso Terra, que
recentemente chegou ao laboratório, mas que já é muito especial; ao querido professor Carlos
Luiz Massard, que sempre esteve presente, contribuindo direta ou indiretamente para a
realização deste trabalho; a Dra Áurea Maria Lage de Moraes e Dra Gisela Lara da Costa
pela colaboração na identificação dos isolados dos fungos e pela atenção disponibilizada; a
todos os funcionários da Estação Experimental W. O. Neitz que contribuíram para a
manutenção dos animais nos estábulos; a CAPES pelo auxílio financeiro que foi primordial
para a execução deste trabalho e aos colegas e professores do Curso de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias.
BIOGRAFIA
Isabele da Costa Angelo, filha de Josemar Angelo e Maria de Fátima da Costa Angelo,
nasceu em 12 de junho de 1981, na cidade do Rio de Janeiro – RJ.
Cursou o ensino fundamental no Colégio Peri, sendo o último ano na Escola
Municipal Dr. Jair Tavares de Oliveira, ambos no município do Rio de Janeiro, tendo
concluído em dezembro de 1994. Em 1995, ingressou no ensino médio no Colégio Técnico da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - CTUR, em Seropédica, concluindo o curso
técnico em Agropecuária em dezembro de 1997.
Em setembro de 1999 ingressou na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, no
curso de Medicina Veterinária, tendo concluído em outubro de 2004. Durante esses anos foi
estagiária na Clínica Veterinária Andresa, em Campo Grande, RJ; no Departamento de
Reprodução Animal da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e no Laboratório de
Controle Microbiano da mesma instituição. Foi, pelo período de um ano, bolsista de Iniciação
Científica PIBIC-CNPq, apresentando trabalhos em congressos e simpósios, e publicou dois
trabalhos científicos em periódico indexado.
Em março de 2005 iniciou o curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área
de concentração em Parasitologia Animal, ao nível de Mestrado, na Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro.
RESUMO
ANGELO, Isabele da Costa. Avaliação in vitro dos efeitos de Isaria farinosa, I.
fumosorosea, Paecilomyces lilacinus e Lecanicillium lecanii sobre Boophilus microplus.
2007. 37p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Parasitologia Veterinária).
Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2007.
Boophilus microplus é um ectoparasito que causa grandes perdas na pecuária mundial. A
utilização exclusiva de produtos químicos no controle de carrapatos, associada ao manejo
inadequado tem conduzido o desenvolvimento de populações de carrapatos resistentes, e a
contaminação dos produtos de origem animal e do ambiente pelos seus resíduos. O uso de
fungos entomopatogênicos no controle de artrópodes tem se tornado uma abordagem cada vez
mais atrativa. Inúmeros trabalhos comprovam experimentalmente a patogenicidade dos
fungos sobre diversas espécies de carrapatos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o
efeito in vitro de Isaria farinosa, I. fumosorosea, Paecilomyces lilacinus e Lecanicillium
lecanii sobre fêmeas ingurgitadas, ovos e larvas de B. microplus. Os fungos foram repicados
em meio de cultura extrato de malte, e mantidos em câmara climatizada sob temperatura de
25ºC ± 1 e umidade relativa de 80% por quinze dias. Suspensões conidiais foram preparadas a
partir do crescimento do fungo, cujos conídios foram adicionados a solução de água destilada
e Tween 0,1%. As concentrações 10
5
,
10
6
,
10
7
e 10
8
conídios mL
-1
formaram os grupos
tratamento, juntamente com o grupo controle, constituído por água destilada estéril e Tween
0,1%. O tratamento constituiu-se de um mililitro da concentração conidial testada, e cada
grupo foi formado por 10 repetições. Os parâmetros de avaliação observados para demonstrar
o efeito dos fungos sobre o carrapato foram as alterações biológicas de fêmeas ingurgitadas,
viabilidade de ovos tratados e percentual de mortalidade de larvas, acompanhado a cada cinco
dias até o 20º dia após infecção. Os resultados mostraram que L. lecanii causou alterações nos
parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas, diminuindo o período de postura, o índice
nutricional, o índice de produção de ovos, e aumentando o período de incubação. Isaria
farinosa mostrou redução no período da postura e no índice nutricional de fêmeas
ingurgitadas. P. lilacinus foi o único fungo capaz de reduzir o período de eclosão das larvas
provenientes da infecção de fêmeas ingurgitadas. I. fumosorosea reduziu o índice nutricional
e foi o único isolado que causou alteração significativa no período de eclosão de larvas
provenientes da infecção de ovos. Diferentes concentrações dos entomomopatógenos
reduziram o potencial reprodutivo das fêmeas ingurgitadas dos grupos tratados. Os isolados
de I. fumosorosea e L. lecanii apresentaram maior potencial de controle para fêmeas
ingurgitadas de B. microplus. Todos os isolados testados mostraram patogenicidade para
larvas não alimentadas de B. microplus após infecção in vitro.
Palavras-chave: Boophilus microplus, Controle biológico, Entomopatógenos.
ABSTRACT
ANGELO, Isabele da Costa. In vitro evaluation of the effects of Isaria farinosa, I.
fumosorosea, Paecilomyces lilacinus and Lecanicillium lecanii toward Boophilus
microplus. 2007. 37p. Dissertation (Master Science in Veterinary Parasitology, Veterinary
Science). Veterinary Institute, Departament of Animal Parasitology, Federal Rural University
of Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2007.
Boophilus microplus is an ectoparasite which causes great economic losses around the world.
The exclusive use of acaricides and the inadequate management have conducted the
development of resistance in ticks’ populations, environmental and food contamination by
acaricides and their residues. The use of entomopathogenic fungi to arthropods control has
shown interesting responses. Several studies have proved the pathogenicity of fungi toward
various ticks’ species. The aim of the present study was to evaluate the effect of Isaria
farinosa, I. fumosorosea, Paecilomyces lilacinus and Lecanicillium lecanii toward engorged
females, eggs and larvae of B. microplus tick. The isolates were cultured on malt extract
medium at 25 ± 1ºC and 80% of relative humidity for 15 days. Conidial suspensions were
prepared in Tween 80 water solution (0.1% v/v). There were 4 treatment groups according to
the following conidial concentrations: 10
5
, 10
6
, 10
7
and 10
8
conidia mL
−1
. The control group
was made up of water and Tween 80 only (0.1% v/v). Treatment was based on immersion of
the specimen in 1 mL of the conidial suspension. Each treatment group was made up of 10
repetitions. Changes in biology of engorged females, eggs’ viability and larvae mortality,
were observed every 5 days up to the 20
th
day after treatment. The results have shown that L.
lecanii changed biological parameters in engorged females through the reduction in posture
period, nutritional rate, eggs’ production rate, and increase of incubation period. Isaria
farinosa has shown reduction in posture period and in nutritional rate. Paecilomyces lilacinus
was the unique isolate able to reduce the eclosion period of larvae from infected females.
Isaria fumosorosea has reduced the nutritional rate and was the unique isolate that changed
significantly in eclosion period when eggs were infected. Conidial concentrations reduced
reproduction capacity of engorged females. The isolates of I. fumosorosea and L. lecanii have
presented major potential to control B. microplus engorged females. All tested isolates have
shown pathogenicity toward unfed larvae of B. microplus after in vitro infection.
Key-words: Boophilus microplus, Biological control, Entomopathogens
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Características macromorfológicas das colônias dos entomopatógenos. A:
Colônia de Lecanicillium lecanii; B: Reverso da colônia de L. lecanii; C: Colônia de
Isaria farinosa; D: Reverso da colônia de I. farinosa; E: Colônia de I. fumosorosea;
F: Reverso da colônia de I. fumosorosea; G: Colônia de Paecilomyces lilacinus; H:
Reverso da colônia de P. lilacinus.................................................................................
Figura 2. Isolados dos entomopatógenos observados sob microscopia óptica. Barras
= 10 µm. A e B: Fiálides solitárias de Lecanicillium lecanii; C: Fiálide solitária e
conídios em cadeia de Isaria farinosa em aumento de 400×; D: Fiálides com porção
basal dilatada - I. farinosa; E: Fiálide com porção basal globosa - I. fumosorosea; F:
Conidióforo de I. fumosorosea; G: Fiálide solítária de Paecilomyces lilacinus em
aumento de 400×; H : Fiálide com porção basal dilatada, apresentando um
“pescoço”na extremidade - P. lilacinus em aumento de
1000×..............................................................................................................................
Figura 3. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
5
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium
lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea
e CG 36 de
Paecilomyces lilacinus....................................................................................................
Figura 4. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
6
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium
lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea
e CG 36 de
Paecilomyces lilacinus....................................................................................................
Figura 5. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
7
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium
lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36 de
Paecilomyces lilacinus...................................................................................................
Figura 6. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
8
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium
lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea
e CG 36 de
Paecilomyces lilacinus....................................................................................................
Figura 7. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de Boophilus microplus a partir do
tratamento de ovos com a concentração 10
5
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG
36 de Paecilomyces lilacinus sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
Figura 8. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de Boophilus microplus a partir do
tratamento de ovos com a concentração 10
6
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG
36 de Paecilomyces lilacinus sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
17
18
22
22
23
23
31
31
Figura 9. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de Boophilus microplus a partir do
tratamento de ovos com a concentração 10
7
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG
36 de Paecilomyces lilacinus sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
Figura 10. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de Boophilus microplus a partir
do tratamento de ovos com a concentração 10
8
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG
36 de Paecilomyces lilacinus sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
Figura 11. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus tratadas
com a concentração 10
5
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium lecanii,
CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36 de Paecilomyces
lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-tratamento............................................
Figura 12. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus tratadas
com a concentração 10
6
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium lecanii,
CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36 de Paecilomyces
lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-tratamento............................................
Figura 13. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus
tratadas
com a concentração 10
7
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii,
CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36 de
Paecilomyces
lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-tratamento.............................................
Figura 14. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus
tratadas
com a concentração 10
8
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii,
CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36 de
Paecilomyces
lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-tratamento.............................................
Figura 15. Fêmeas de Boophilus microplus pertencentes ao grupo controle, 10 dias
após tratamento..............................................................................................................
Figura 16. Fêmeas de Boophilus microplus pertencentes ao grupo tratado com a
concentração 10
8
conídios ml
-1
de Lecanicillium lecanii, 10 dias após o
tratamento.......................................................................................................................
Figura 17. Fêmeas de Boophilus microplus pertencentes ao grupo tratado com a
concentração 10
8
conídios ml
-1
de Isaria farinosa, 10 dias após o tratamento..............
32
32
35
36
36
37
40
40
40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Isolados de fungos entomopatogênicos, suas respectivas espécies, seus
hospedeiros ou substratos, sua origem e ano de recebimento da cultura no
Cenargen........................................................................................................................
Tabela 2. Concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces
utilizadas para o tratamento de fêmeas ingurgitadas, ovos e larvas não alimentadas
de Boophilus microplus.................................................................................................
Tabela 3. Características macromorfológicas dos entomopatógenos Paecilomyces,
Isaria e Lecanicillium utilizados nos bioensaios...........................................................
Tabela 4. Valores médios, em gramas, do peso de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium,
Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
Tabela 5. Valores médios, em dias, do período de pré-postura de fêmeas
ingurgitadas de Boophilus microplus tratadas com diferentes concentrações de
conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ±
1 ºC e umidade relativa = 90%......................................................................................
Tabela 6. Valores médios, em dias, do período de postura de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus submetidas ao tratamento com diferentes concentrações de
conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ±
1 ºC e umidade relativa = 90%......................................................................................
Tabela 7. Valores médios do período de incubação da postura de fêmeas
ingurgitadas de Boophilus microplus tratadas com diferentes concentrações de
conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ±
1 ºC e umidade relativa = 90%.......................................................................................
Tabela 8. Valores médios do período de eclosão de larvas provenientes do
tratamento de fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus com diferentes
concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob
temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%......................................................
Tabela 9. Valores médios do índice nutricional de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium,
Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%.................................................................................................................................
Tabela 10. Valores médios do índice de produção de ovos de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de
Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e
umidade relativa = 90%.................................................................................................
10
12
15
19
20
21
24
25
26
27
Tabela 11. Percentual de controle de fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus
tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e
Paecilomyces, mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
Tabela 12. Valores médios do percentual de eclosão de larvas oriundas do
tratamento de fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus em relação aos diferentes
tratamentos e mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%.................................................................................................................................
Tabela 13. Percentual de eclosão de larvas de Boophilus microplus após tratamento
de ovos com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e
Paecilomyces mantidos sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
Tabela 14. Percentual de eclosão de larvas de Boophilus microplus após tratamento
de ovos com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e
Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa =
90%................................................................................................................................
Tabela 15. Percentual de mortalidade das larvas não alimentadas de Boophilus
microplus no 10º dia após o tratamento com as diferentes concentrações de conídios
dos fungos entomopatogênicos Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob
temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%......................................................
Tabela 16. Percentual de mortalidade das larvas não alimentadas de Boophilus
microplus no 15º dia após o tratamento com as diferentes concentrações de conídios
dos fungos entomopatogênicos Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob
temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%......................................................
Tabela 17. Percentual de mortalidade das larvas não alimentadas de Boophilus
microplus no 20º dia após o tratamento com as diferentes concentrações de conídios
dos fungos entomopatogênicos Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob
temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%......................................................
Tabela 18. Valores das concentrações letais (CL
50
e CL
90
) dos isolados de
Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces obtidos através da avaliação do percentual de
mortalidade de larvas não alimentadas de Boophilus microplus nos diferentes dias de
observação......................................................................................................................
27
28
29
33
34
34
35
38
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O carrapato Boophilus microplus ..................................................................
2.2 Métodos de Controle Realizados para B. microplus......................................
2.3 Controle Microbiano – Uma Alternativa para o Controle de Carrapatos......
2.4 Verticillium lecanii – Classificação Atual e sua Utilização no Controle de
Artrópodes .....................................................................................................
2.5 Paecilomyces sp - Classificação Atual e sua Utilização no Controle de
Artrópodes ......................................................................................................
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização do Experimento ..........................................................................
3.2 Obtenção e Manutenção dos Isolados Fúngicos ..............................................
3.3 Avaliação Morfológica dos Isolados ................................................................
3.4 Preparo das Suspensões Fúngicas .....................................................................
3.5 Viabilidade dos Conídios ..................................................................................
3.6 Delineamento Experimental .............................................................................
3.7 Obtenção de Boophilus microplus ....................................................................
3.8 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de Boophilus microplus ..........................
3.9 Bioensaio com Ovos de Boophilus microplus...................................................
3.10 Bioensaio com Larvas não Alimentadas de Boophilus microplus.....................
3.11 Reisolamento dos Entomopatógenos após Bioensaio........................................
3.12 Análise Estatística e Próbites ............................................................................
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação Morfológica dos Isolados .................................................................
4.2 Viabilidade dos Conídios ..................................................................................
4.3 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de Boophilus microplus...........................
4.3.1 Peso médio das fêmeas ingurgitadas .............................................................
4.3.2 Período de pré-postura ...................................................................................
4.3.3 Período de postura .........................................................................................
4.3.4 Período de incubação .....................................................................................
4.3.5 Período de eclosão das larvas ........................................................................
4.3.6 Índice nutricional ...........................................................................................
4.3.7 Índice de produção de ovos ...........................................................................
4.3.8 Percentual de eclosão......................................................................................
4.3.9 Percentual de controle ...................................................................................
4.4 Bioensaio com Ovos de Boophilus microplus...................................................
4.5 Bioensaio com Larvas não Alimentadas de Boophilus microplus....................
4.6 Reisolamento dos Entomopatógenos após Bioensaio ......................................
5 CONCLUSÕES
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1
3
3
4
4
7
8
10
10
10
10
11
11
11
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14
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42
1
1. INTRODUÇÃO
Boophilus microplus é conhecido como o carrapato dos bovinos, porém em altas
infestações nas pastagens, podem parasitar outros mamíferos como eqüinos, caprinos, ovinos,
caninos, o homem (GONZALES, 1975), além de búfalo, gato, coelhos, canguru, porco e onça
(PEREIRA, 1980). É um parasito hematófago e encontra-se amplamente distribuído nas
regiões de clima tropical e subtropical. As condições de temperatura e umidade existentes em
nosso país favorecem a distribuição de B. microplus em todo o território nacional.
O efeito do parasitismo sobre bovinos pode determinar a diminuição da produção de
leite, do ganho de peso e dos índices de fertilidade, aumento da taxa de mortalidade,
principalmente em bezerros, desvalorização do couro e aumento nos custos de produção,
gerando grandes prejuízos na pecuária mundial. No Brasil, esses gastos chegam a dois bilhões
de dólares por ano.
Na natureza, predadores, parasitóides e patógenos são conhecidos por influenciar o
tamanho da população de carrapatos. No Brasil, predadores naturais como a anum, perdiz,
aranhas, ratos, formigas, camundongos, gavião pomba, galinha, e galinha d’angola, já foram
observados se alimentando de carrapatos. Entretanto, os inimigos naturais não são eficientes
para o biocontrole do carrapato pois não possuem especificidade alimentar, e a população de
carrapatos é muito ampla, havendo então, pouco potencial para o controle natural do
carrapato. Além disso, a fecundidade dos predadores naturais parece estar muito abaixo do
nível necessário para responder ao explosivo aumento no número de carrapatos em certas
épocas do ano, uma vez que cada fêmea ingurgitada pode produzir cerca de 3000 ovos.
Os carrapatos são controlados principalmente por acaricidas químicos, através de
banhos de imersão ou pulverização dos bovinos. No entanto, a utilização inadequada desses
produtos propiciou a proliferação da resistência nas populações de carrapatos, além da
contaminação dos produtos de origem animal, e do meio ambiente.
O controle biológico está se tornando uma abordagem cada vez mais atrativa para o
manejo do carrapato devido ao aumento dos custos com o controle químico, aumento da
resistência de carrapatos aos pesticidas e ao aumento da preocupação com segurança
ambiental e a saúde humana. O biocontrole tem sido usado amplamente para pragas da
agricultura, e até a presente data, poucos esforços estão sendo realizados para introduzir
agentes biocontroladores no controle de carrapatos.
Patógenos como a bactéria Cedecea lapagei, encontrada principalmente no inverno,
são capazes de causar mortalidade em fêmeas ingurgitadas de carrapatos devido à destruição
do seu epitélio vaginal (Brum, 1989). As bactérias entomopatogênicas penetram em seus
hospedeiros pela via oral, e esse modo de penetração constitui uma desvantagem na sua
utilização para o controle microbiano de carrapatos quando comparadas com outros
patógenos, como os fungos.
Os fungos entomopatogênicos são conhecidos pela sua especificidade a organismos-
alvo sob condições a campo, especialmente durante epizootias, e essa especificidade
evidentemente reduz os riscos de organismos não-alvo serem afetados.
Numerosos fungos patogênicos são conhecidos por estarem associados com
carrapatos, entre eles Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus (= Isaria
fumosorosea), P. farinosus (= I. farinosa) e Verticillium lecanii (= Lecanicillium lecanii).
Esses fungos têm sido isolados de todos os estágios do ciclo evolutivo de carrapatos,
incluindo ovos.
Inúmeros trabalhos comprovam experimentalmente a patogenicidade de fungos como
Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae usados no controle microbiano de diferentes
2
estágios evolutivos de carrapatos. Ambos são os entomopatógenos mais empregados no
controle microbiano, talvez devido a sua ampla distribuição geográfica, à variedade de
hospedeiros e às ocorrências em condições naturais, enzoóticas ou epizoóticas.
Samish e Rehacek (1999) discutiram o potencial do controle biológico de carrapatos e
concluíram que pesticidas biológicos baseados em fungos entomopatogênicos são uma
alternativa promissora. Porém, há a necessidade de obtenção e caracterização de mais
espécies de fungos patogênicos para ácaros e carrapatos, concomitantemente com o
desenvolvimento de micoacaricidas.
Poucos dados experimentais existem sobre o impacto de inimigos naturais do
carrapato sob condições a campo, e tais estudos são essenciais para o desenvolvimento de um
programa eficiente de biocontrole de carrapatos.
Uma recente mudança na nomenclatura dos gêneros Verticillium e Paecilomyces foi
proposta por alguns autores, baseados em estudos moleculares. O gênero Lecanicillium W.
Gams & Zare (GAMS; ZARE, 2001) foi criado para acomodar anamorfos de Verticillium
fungicolas e entomógenos de Clavicipitaceae anteriormente classificados como Verticillium
seção Prostrata. Lecanicillium foi separado de Verticillium baseado em dados moleculares,
morfológicos e ecológicos (ZARE et al., 2000; ZARE; GAMS, 2001).
Luangsa-Ard et al. (2005) analisaram as relações filogenéticas de 37 espécies de
Paecilomyces seção Isarioidea. Nesse estudo, os autores reconheceram um grupo
monofilético de espécies que foi então designado como a clade Isaria, na qual se encontram
as espécies P. farinosus, P. fumosoroseus, entre outras. As espécies de Paecilomyces
remanescentes formalmente localizadas na seção Isarioidea (incluindo P. lilacinus),
necessitam ser mais bem estudadas e, portanto, permanecem no gênero Paecilomyces.
Os gêneros Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces são muito utilizados para o controle
de pragas na agricultura, e as espécies L. lecanii, I. farinosa, I. fumosorosea e P. lilacinus
foram escolhidas para a execução do bioensaio com carrapatos, uma vez que não há trabalhos
citados na literatura.
O presente trabalho integra a linha de pesquisa Controle Microbiano de Artrópodes de
Importância desenvolvido na UFRRJ, e teve como objetivo avaliar os efeitos in vitro dos
entomopatógenos P. lilacinus, I. farinosa, I. fumosorosea e L. lecanii sobre ovos, larvas e
fêmeas ingurgitadas de B. microplus, sugerindo novas espécies fúngicas como
entomopatógenos no controle microbiano do carrapato B. microplus.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O Carrapato Boophilus microplus
Boophilus microplus é um carrapato pertencente à família Ixodidae, superfamília
Ixodoidea, subordem Acari, ordem Ixodida, classe Arachnida e ao filo Arthropoda. É
originário do continente asiático e foi introduzido na maioria dos países tropicais e
subtropicais pela importação do gado bovino (WHARTON, 1974). Encontra-se amplamente
distribuído nos rebanhos bovinos da América Central, América do Sul, Este e Sul da África,
Austrália, Oriente e sul da Flórida, na faixa compreendida entre os paralelos 32º Norte (sul
dos EUA) e 32º Sul (próximo à cidade de Rio Grande, RS) (GONZÁLES, 2002).
É parasita de um único hospedeiro (homoxeno) e apresenta o ciclo evolutivo dividido
em duas fases: fase de vida livre e fase de vida parasitária. A fase de vida livre ocorre no solo,
e se inicia quando a fêmea ingurgitada se desprende do hospedeiro, cai ao solo, começando
então, o período de pré-postura, que dura em média de dois a três dias. Posteriormente, há a
fase de ovopostura, que pode variar de 17 a mais de 90 dias, seguida pela fase de eclosão das
larvas, que varia de cinco a dez dias, podendo durar mais de 100 dias. Um período de quatro a
20 dias é necessário para que as larvas tornem-se infestantes. Em condições ótimas de
temperatura e umidade, o ciclo de vida livre pode durar 28 dias (GONZÁLES, 1974).
Segundo Gonzáles (1975), a fase de vida livre sofre variações em decorrência das alterações
da temperatura e umidade, porém a fase de vida parasitária é praticamente constante em todas
as regiões.
A fase de vida parasitária inicia-se com a fixação da larva infestante no hospedeiro,
seguida pela sua alimentação, troca de cutícula, fase adulta, acasalamento, ingurgitamento e
queda das fêmeas. Esse período dura, em média, de 18 a 26 dias no Brasil-Central
(FURLONG, 1993).
Recentes estudos moleculares e morfológicos realizados com os gêneros
Rhipicephalus Koch, 1844 e Boophilus Curtice, 1891 sugerem uma mudança na nomenclatura
de B. microplus fundamentada na filogenia de ambos os gêneros. De acordo com Murrel e
Barker (2003), as cinco espécies de Boophilus tornam-se membros de Rhipicephalus
(Boophilus), ou seja, Boophilus é mantido como um subgênero de Rhipicephalus, o que torna
R. (B.) microplus sinonímia de B. microplus.
O impacto econômico das principais ectoparasitoses no Brasil foi estimado por Grisi et
al. (2002) em 2,650 bilhões de dólares/ano, sendo o carrapato B. microplus responsável por 2
bilhões de dólares. Os prejuízos econômicos são decorrentes da ação espoliativa sobre o
hospedeiro, da predisposição ao aparecimento de miíases, da desvalorização do couro, do
retardo no desenvolvimento dos animais, diminuição da produção, excessivos gastos com
mão-de-obra e carrapaticidas e pela transmissão de patógenos causadores de doenças como
anaplasmose e babesiose (HORN; ARTECHE, 1985).
A babesiose é uma doença de alta morbidade em bovinos e é descrita como a principal
parasitose de eqüinos devido aos danos diretos e indiretos causados à sanidade animal, como
mortalidade, impedimento para comercialização e impossibilidade de exportação
(FRIEDHOFF, 1990), além da diminuição do desempenho dos animais nas atividades
esportivas e funcionais nos trabalhos de campo (IBANÉZ et al., 1979). Guimarães et al.
(1998) sugeriram que B. microplus desempenhasse o papel de vetor de Babesia equi em
eqüinos, e Heuchert et al. (1999), mostraram altas prevalências de B. equi em eqüinos criados
em associação com bovinos.
4
2.2. Métodos de Controle Realizados para Boophilus microplus
O controle da fase parasitária de B. microplus é feito basicamente por aplicação de
carrapaticidas no rebanho. Contudo, os freqüentes tratamentos com produtos químicos e o
manejo inadequado tem conduzido o desenvolvimento de populações de carrapatos
resistentes. Segundo Wharton (1967), as cepas resistentes aos acaricidas se desenvolvem por
seleção e recombinações de genes resistentes em populações de carrapatos expostas a pressão
de seleção por carrapaticidas.
Uma redução na população de carrapatos no rebanho pode ser alcançada melhorando a
eficácia no seu controle através da seleção e aplicação correta do carrapaticida, e utilizando o
sistema estratégico de controle associado a outras práticas de manejo (FURLONG et al.,
2004).
Outras medidas relacionadas com o controle da fase parasitária são pesquisas sobre
resistência do hospedeiro e desenvolvimento de vacinas. As vacinas contra B. microplus são
baseadas no antígeno recombinante Bm86 e Willadsen et al., (1995) afirmam que são capazes
de reduzir o número de fêmeas ingurgitadas, seu peso e sua capacidade reprodutiva,
significando que o efeito positivo da vacina é caracterizado com a redução da infestação de
larvas em uma geração subseqüente.
Na tentativa de controlar a fase não parasitária, Thompsom et al. (1978) e Sutherst et
al. (1982) estudaram a ação de forrageiras sobre larvas de carrapatos, e demonstraram a
existência de repelência e/ou letalidade em algumas espécies de gramíneas e leguminosas,
respectivamente. As espécies de gramíneas forrageiras estudadas por Barros e Evans (1989)
apresentaram elevado poder letal devido à retenção mecânica de larvas nas pilosidades e/ou
secreções.
De acordo com Penna, (1990), outros métodos para controlar a população de
carrapatos seriam a rotação de pastagens, o controle biológico, a criação de raças de animais
resistentes aos carrapatos, introdução de machos estéreis na população e atividades como a
queimada. Todavia, nem todos esses métodos são eficientes ou mesmo indicados.
A utilização exclusiva dos carrapaticidas é cada dia menos viável em termos práticos e
econômicos, tornando-se necessária a adição de métodos alternativos a serem empregados em
sistemas de controle integrado (BARROS; EVANS, 1989).
2.3. Controle Microbiano – uma Alternativa para o Controle de Carrapatos
A primeira classificação de um entomopatógeno foi feita por Réaumur em 1726, que
identificou um fungo atacando um lepidóptero como sendo do gênero Cordyceps. Porém há
referências antigas de chineses e egípcios relatando doenças apresentadas pelo bicho-da-seda
(2700 anos a.c.) e pelas abelhas (2200 anos a.c.), respectivamente. Em 1835, Agostino Bassi,
considerado o pai da patologia de insetos, foi o primeiro pesquisador a provar a natureza
infecciosa de um agente microbiano para um animal quando comprovou que o fungo
Beauveria bassiana era o causador de uma doença no bicho-da-seda, chamada “muscardine
branca”. Desde então, muitos trabalhos foram desenvolvidos e muitos conceitos básicos da
patologia de insetos foram bem definidos.
No Brasil, o estudo da patologia de insetos e o desenvolvimento do controle
microbiano iniciaram-se há cerca de 80 anos, com algumas referências de patógenos atacando
insetos. Dentre eles, podemos citar: Hambleton (1937), que relatou a ocorrência de Botrytis sp
(B. bassiana) e Verticillium sp. sobre a broca-do-algodoeiro e Viègas (1939), que mencionou
aspectos interessantes relacionados a V. lecanii infectando Coccus viridis e Empusa dysderci
infectando Dysdercus sp. Contudo, somente depois de 1964, com a ocorrência epizoótica de
5
Metarhizium anisopliae sobre as cigarrinhas da cana-de-açúcar, que os fungos receberam
maior atenção dos pesquisadores (ALVES, 1998).
Atualmente, é crescente o número de trabalhos publicados por pesquisadores na área
de controle microbiano de carrapatos envolvendo fungos, vírus, bactérias, protozoários e
nematóides (SAMISH; REHACED, 1999). Esses autores revisaram mais de 100 espécies de
patógenos e aproximadamente 150 predadores associados com carrapatos, o que representa
um amplo arsenal para seleção de espécies com potencial uso como agentes de biocontrole.
Alves (1998) cita inúmeras vantagens da utilização de patógenos como fungos, vírus e
bactérias quando comparados aos produtos químicos de amplo espectro:
especificidade/seletividade dos entomopatógenos, evitando desequilíbrios biológicos de
importância no ecossistema; controle mais duradouro quando a doença estabelecida pelo
patógeno assume um caráter enzoótico; controle associado com produtos químicos seletivos
visando à ação sinérgica e consequentemente um controle mais rápido e eficaz da praga; além
de causarem a mortalidade direta, os patógenos podem afetar as gerações seguintes dos
artrópodes tratados, diminuindo a oviposição, viabilidade dos ovos e aumentando a
sensibilidade a outros agentes biológicos; os patógenos não poluem o ambiente, não são
tóxicos para o homem e outros animais, desde que selecionados e manuseados corretamente.
Os fungos foram os primeiros patógenos a serem utilizados no controle microbiano. A
maioria dos gêneros de fungos entomopatogênicos ocorre no Brasil, e em condições naturais,
tanto enzoótica quanto epizoótica, sua ocorrência é um fator importante na redução das
populações de pragas. A grande variabilidade genética desses entomopatógenos pode ser
considerada uma de suas principais vantagens no controle microbiano de artrópodes, pois o
uso da ferramenta da biologia molecular permite selecionar isolados altamente virulentos,
específicos ou não, para o controle de um grande número de pragas (ALVES, 1998).
O mecanismo de penetração de fungos entomopatogênicos foi descrito por Madelin et
al. (1967), que relataram a penetração via tegumento através de processos químicos como
digestão enzimática e processo físico por pressão mecânica. Essa via de penetração foi
comprovada por Bittencourt et al. (1995), uma vez que não evidenciaram, através de técnicas
histológicas, a infecção do fungo Metarhizium anisopliae nas cavidades naturais do carrapato
B. microplus.
Em 1999, Bittencourt et al. descreveram pela primeira vez o mecanismo de infecção
do isolado 959 de M. anisopliae em fêmeas ingurgitadas de B. microplus, no qual foi
observada a fixação dos conídios na cutícula do carrapato, germinação do conídio, formação
do tubo germinativo a partir de conídios germinados, e início da dilatação da extremidade
deste tubo, formando o apressório. Chandler et al. (2000) descreveram que após a fixação e
penetração dos conídios, o fungo se multiplica na hemocele e tecidos moles do hospedeiro, e a
morte do mesmo ocorre em um período de três a 10 dias em função da perda de água,
privação de nutrientes, danos mecânicos e ação de toxinas. Sob condições favoráveis, o fungo
esporula extensivamente sobre o cadáver do hospedeiro para facilitar novas infecções na
população de hospedeiros e assim continuar o ciclo da doença.
Cerca de 750 espécies de fungos agrupados em 56 gêneros são conhecidos por serem
patógenos ou parasitos de artrópodes (HAWKSWORTH et al., 1995). A maioria dos fungos
patogênicos de artrópodes estudados mundialmente pertence a quatro gêneros: Beauveria,
Metarhizium, Verticillium (= Lecanicillium), e Paecilomyces. As espécies M. anisopliae, B.
bassiana, B. brongniartii, V. lecanii (= L. lecanii), P. farinosus (= I. farinosa) e P.
fumosoroseus (= I. fumosorosea) são patogênicas tanto para insetos quanto para ácaros e
carrapatos (CHANDLER et al., 2000).
Beauveria bassiana já foi encontrada promovendo infecções naturais em Hyalomma
anatolicum e Ixodes ricinus (SAMSINAKOVA, 1957). Outras espécies de fungos
6
entomopatogênicos foram encontradas causando infecções em carrapatos das famílias
Ixodidae e Argasidae, em países de clima temperado (LIPA, 1971).
Beauveria, Metarhizium, e Paecilomyces mostram adaptações ao solo, possuindo uma
ampla variedade de hospedeiros na classe Insecta, ocupando amplamente nichos tróficos
similares. V. lecanii está comumente associado com a superfície do solo e habitats aerados.
Todos esses fungos têm distribuição mundial e podem ser cultivados facilmente em grandes
quantidades
Os micopesticidas têm demonstrado ser eficientes contra uma variedade de pragas,
particularmente quando o uso de pesticidas químicos é inapropriado devido ao
desenvolvimento de resistência ou em função dos danos causados ao ambiente (CHANDLER
et al., 2000). Como exemplo, pode-se incluir o uso de L. lecanii contra pulgões e moscas
brancas (QUINLAN, 1988), Metarhizium spp. contra baratas, gafanhotos e cupins
(HARMON, 1994; BATEMAN, 1997; MILNER et al., 1998) e B. brongniartii utilizada para
o controle do besouro Melolontha melolontha (KELLER, 1992).
Gindin et al. (2001) afirmam que uma cepa de um fungo que é altamente patogênica
para uma espécie de carrapato, frequentemente é patogênica para outras espécies, uma vez
que cepas de M. anisopliae foram altamente virulentas para a maioria dos estágios de
desenvolvimento de três diferentes gêneros de carrapatos ixodídeos sob condições de
laboratório.
Bittencourt et al. (1996) evidenciaram elevada capacidade carrapaticida dos isolados
986 e 747 de B. bassiana quando verificaram sua patogenicidade in vitro sobre ovos e larvas
não alimentadas de B. microplus, observando uma elevada redução do percentual de eclosão e
uma maior mortalidade das larvas nos grupos tratados.
Infecção artificial de M. anisopliae sobre ovos, larvas e fêmeas ingurgitadas de B.
microplus promoveu alterações significativas nos parâmetros biológicos de fêmeas
ingurgitadas, alteração na viabilidade dos ovos tratados e elevada mortalidade das larvas a
infecção causada pelo fungo (BITTENCOURT, 1992).
A mortalidade de ninfas alimentadas e não alimentadas e de adultos de Amblyomma
cajennense foi demonstrada por Reis et al. (2001) ao utilizarem diferentes isolados de B.
bassiana e M. anisopliae em testes in vitro, sugerindo que os isolados testados são capazes de
controlar os estágios avaliados de A. cajennense.
Alves et al. (1998) afirmam que pode haver sinergismo entre produtos químicos e
biológicos, resultando no aumento da eficácia do tratamento de alguns artrópodes resistentes
ou menos susceptíveis aos produtos químicos. Esse efeito sinérgico foi comprovado pela
compatibilidade entre os fungos B. bassiana e M. anisopliae e o piretróide sintético quando
associados para o tratamento de larvas de B. microplus deltametrina-resistente (BAHIENSE,
2003). Outros trabalhos mostram o sinergismo entre várias classes de acaricidas e fungos
entompatogênicos, (CLARK et al., 1982; KAAYA et al., 1996; KAAYA; HASSAN, 2000;
LECUONA et al., 2001), tornando possível a utilização de ambos os métodos para o controle
do carrapato.
Recentes avanços na tecnologia de formulação de entomopatógenos têm mostrado que
é possível o uso de micopesticidas em ambientes onde a umidade era considerada um fator
limitante (MILNER, 1997). Kaaya e Hassan (2000) demonstraram a eficiência da formulação
oleosa de M. anisopliae e B. bassiana sobre B. decoloratus, Rhipicephalus appendiculatus, e
Amblyomma variegatum. Esses mesmos autores afirmam que o impacto desses fungos sobre
as populações de B. decoloratus é grande, quando a mortalidade dos carrapatos e a redução na
viabilidade dos ovos são consideradas, fato esse que garante que fungos entomopatogênicos
podem ser utilizados como substitutos ou de forma integrada no controle dessa espécie de
carrapato, atenuando assim, o problema da resistência.
7
A necessidade de métodos não-químicos para controlar pestes como ácaros e
carrapatos tende a aumentar no futuro, devido à preocupação acerca da segurança e
sustentabilidade dos pesticidas químicos de pesticidas químicos (CHANDLER et al., 2000).
Muitos estudos sobre fungos entomopatogênicos e desenvolvimento de produtos
formulados a base desses fungos são realizados para controle de pragas da agricultura. Gindin
et al. (2001) afirmam que a concentração necessária para causar alta mortalidade de
carrapatos é similar a que é usada comercialmente contra insetos, aumentando assim, a
possibilidade de desenvolvimento de um carrapaticida a base de fungos entomopatogênicos.
Porém, os agentes de controle biológico que afetam os ixodídeos e sua ação patogênica ainda
são pouco estudados.
Maiores informações sobre as doenças que afetam os carrapatos, sua susceptibilidade
aos entomopatógenos e o funcionamento do seu sistema imune são necessárias para a
aplicação eficaz do controle biológico (MONTEIRO et al., 2003).
2.4. Verticillium lecanii – Classificação Atual e sua Utilização no Controle de Artrópodes
O gênero anamorfo Verticillium é extremamente heterogêneo, compreendendo
membros de Phyllachorales e Hypocreales, particularmente Clavicipitaceae. Verticillium
seção Prostrata W. Gams (1971) compreende fungos saprofíticos e parasitos, que podem
atacar insetos e outros artrópodes, nematóides e invertebrados, além de vários fungos (ZARE
et al., 2001).
Em função das inúmeras diferenças biológicas entre espécies associadas a plantas e
patogênicas para insetos e nematóides, bem como das evidências moleculares, bioquímicas e
fisiológicas, uma subdivisão de Verticillium tem sido proposta por diversos autores
(JACKSON; HEALE, 1985; KOUVELIS et al., 1999; ZARE et al., 1999; ZARE et al., 2000).
Zare et al. (2000) usando análise filogenética de seqüências do ITS, sugeriram no
mínimo quatro clades distintas, sendo os taxon entomógenos e fungícolas considerados na
clade B. A nitidez dessas clades foi confirmada por Sung et al. (2001), baseadas em análises
de seqüências de DNAr nuclear LSU e SSU de um extenso arranjo de taxon. A maior parte
das espécies formalmente classificadas como Verticillium seção Prostrata foram transferidas
para o gênero Lecanicillium e quatro delas, distantes da clade de Lecanicillium, foram
classificadas como um novo gênero: Simplicillium (ZARE; GAMS, 2001).
Zare e Gams (2001) descreveram uma chave para identificação das espécies de
Lecanicillium e Verticillium, baseada nas características morfológicas dos conídios e das
fiálides das espécies estudadas.
Fundamentado em análises moleculares, o isolado CG 420 de V. lecanii utilizado no
experimento, foi agrupado no gênero Lecanicillium, logo sua atual classificação é L. lecanii
(GAMS; ZARE, 2001).
Lecanicillium lecanii é um patógeno que ocorre freqüentemente sobre pulgões e
cochonilhas nas regiões tropicais e neotropicais. Já foi relatado sobre insetos das ordens
Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, sobre ácaros eriofídeos, adultos de Encarsia formosa,
parasitóide de moscas brancas (EKBON, 1979) e sobre o carrapato Ixodes ricinus
(KALSBEEK et al., 1995).
Balazy et al., (1987) isolaram 24 espécies de fungos infectando ácaros mesostigmatas
coletados do solo, de ninhos de pássaros e formigueiros. Entre essas espécies, somente B.
bassiana, P. farinosus (= Isaria farinosa) e V. lecanii (= L. lecanii) têm sido estudadas como
agentes de biocontrole. Samsinakova et al. (1974) observaram infecções naturais de 17
espécies de fungos sobre os carrapatos I. ricinus, Dermacentor marginatus e D. reticulatis.
Dentre elas, foram identificadas Aspergillus parasiticus, B. bassiana, V. lecanii (= L. lecanii)
8
e P. fumosoroseus (= I. fumosorosea), responsáveis por causar mortalidade de 57% de fêmeas
ingurgitadas de I. ricinus.
Testes de patogenicidade in vitro realizados com V. lecanii (= L. lecanii), P.
fumosoroseus (I. fumosorosea), B. bassiana e M. anisopliae sobre diferentes estágios do ciclo
de R. sanguineus, Hyalomma excavatum e B. annulatus mostraram que todos os fungos
testados foram capazes de causar alta mortalidade, redução da fecundidade das fêmeas
ingurgitadas tratadas e redução da viabilidade dos ovos dos carrapatos (GINDIN et al., 2001).
2.5. Paecilomyces sp - Classificação Atual e sua Utilização no Controle de Artrópodes
O gênero Paecilomyces foi identificado por Bainier (1907), que descreveu sua estreita
relação com Penicillium, diferindo na ausência de colônias com coloração verde e pelas
fiálides cilíndricas curtas. Anteriormente, espécies similares foram agrupadas no gênero
Spicaria Hartin (1846). Hughes (1951) e Brown e Smith (1957) (apud SAMSON, 1974)
sugeriram que o nome Spicaria fosse esquecido, e transferiram várias espécies para
Paecilomyces. Esses últimos autores reconheceram a ocorrência de estruturas conidiogênicas
similares na espécie tipo Paecilomyces variotii e em algumas espécies descritas em Isaria e
Spicaria, e as transferiram para Paecilomyces. Uma dessas espécies é I. farinosa, que foi
considerada por Clements e Shear (1931), Mains (1955) e Morris (1963) como o lectótipo do
gênero Isaria (apud SAMSON, 1974). Essa escolha poderia indicar que, devido à prioridade,
Isaria deveria ser usada para todas as espécies de Paecilomyces.
Samson (1974) reconheceu espécies mesofílicas anteriormente localizadas em Isaria
ou Spicaria e a maior parte das espécies associadas a insetos como uma distinta seção
Isarioidea dentro do gênero. As espécies descritas nesta seção apresentam fiálides com
“pescoços” distintos, conídios catenulados e conidióforos verticilados.
Hodge et al. (2005) discutiram a nomenclatura e a história do gênero Isaria, e Gams et
al. (2005) propuseram conservar o nome Isaria. Recentes estudos com análise de seqüências
de β-tubulina parcial de 34 cepas de Paecilomyces e seqüências de DNAr ITS1-5.8S-ITS2 de
37 cepas mostraram que a seção Isarioidea não é monofilética e que não há um grupo
monofilético para todas as espécies associadas a invertebrados. No entanto, uma clade foi
criada, a qual inclui espécies de entomopatógenos previamente considerados como
pertencentes ao gênero Isaria (Luangsa-Ard et al., 2005).
As espécies P. amoeneroseus, P. cateniannulatus, P. cateniobliquus, P. cicadae, P.
coleopterorus, P. farinosus, P. ghanensis, P. fumosoroseus, P. javanicus e P. tenuipes,
analisadas por Luangsa-Ard (2005), foram reclassificadas como Isaria e suas nomenclaturas
foram modificadas. As espécies foram renomeadas como I. amoenerosea, I. cateniannulata, I.
cateniobliqua, I. cicadae, I. coleopterora, I. farinosa, I. ghanensis, I. fumosorosea, I. javanica
e I. tenuipes, respectivamente.
Paecilomyces suffultus, P. marquandii, P. cinnamomeus, P. viridis, P. niphetodes, P.
sulphurellus, P. puntonii, P. inflatus, P. carneus, P. penicillatus e P. lilacinus são espécies
remanescentes de Paecilomyces formalmente colocadas na seção Isarioidea e que necessitam
de maiores estudos para determinar sua verdadeira relação entre essas espécies e entre os
outros anamorfos de Clavicipitacea. Portanto, permanecem no gênero Paecilomyces
(Luangsa-Ard et al., 2005).
O antigo gênero Paecilomyces reunia diversas espécies entomopatogênicas, sendo as
mais freqüentes P. farinosus (= I. farinosa), P. tenuips, P. amoeneroseus, P. cicadidae e P.
fumosoroseus (I. fumosorosea) observadas sobre lepidópteros, coleópteros, homópteros e
ortópteros (ALVES, 1998). Este gênero causa o chamado “muscardine amarelo” em insetos e
podem provocar epizootia em populações de lagartas do gênero Brassolis no Sudeste do
Brasil, e algumas espécies podem atacar nematóides de plantas (ALVES, 1998).
9
Paecilomyces lilacinus tem sido isolado freqüentemente de diferentes hospedeiros ou
substratos oriundos de várias localidades (FARIA; TIGANO, 1996; SOSA-GOMEZ, 2002),
apresenta distribuição cosmopolita e maior freqüência em solos agricultáveis (DUNN et al.,
1982). É um fungo habitante do solo, capaz de parasitar ovos de nematóides, juvenis e
fêmeas, e reduzir a população de nematóides parasitos de plantas (CABANILLAS et al.,
1989).
Caracteriza-se por penetrar nos ovos de nematóides, destruindo o embrião, podendo
exercer forte pressão na capacidade reprodutiva das fêmeas que são colonizadas e
posteriormente mortas (DUNN et al., 1982). Sua capacidade em controlar nematóides foi
observada em diferentes culturas agrícolas (JATALA et al., 1979; SCHENCK et al., 2004;
SANTIAGO et al., 2006).
Isaria fumosorosea tem sido isolada de uma ampla variedade de hospedeiros (em mais
de 25 famílias) e demonstrou ser patogênica para a mosca branca do tomate Bemisia tabaci
(OSBORNE et al., 1990). É resistente a vários pesticidas comumente usados no controle de
pragas em casas-de-vegetação, característica favorável para sua utilização no Manejo
Integrado de Pragas. Atualmente, já existe no mercado micopesticidas para o controle da
mosca branca utilizando o fungo I. fumosorosea (LACEY et al., 2001).
Isaria farinosa é cosmopolita, encontrada nas áreas tropicais parasitando vários
insetos das ordens: Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera e Homoptera (SAMSON,
1974; DOMSCH et al., 1980; ALVES, 1998). Devido à diversidade de hospedeiros, é
considerada um agente promissor no controle biológico de inseto-pragas, sendo sua
patogenicidade in vitro comprovada contra o besouro Scolytus scolytus (DOBERSKI, 1981),
larvas de Cephalgia abietis (PRENEROVÁ, 1994), a mosca Bemisia argentifolii (WRAIGHT
et al., 1998), a formiga cortadeira Atta sexdens sexdens (LOUREIRO; MONTEIRO, 2005) e
diferentes estágios de Haematobia irritans (Diptera: Muscidae) (STEENBERG et al., 2001;
ANGEL-SAHAGÚN et al., 2005). Porém, poucos estudos demonstram o potencial
patogênico de Isaria sp. sobre carrapatos (POLAR et al., 2005; GINDIN et al., 2001; GINDIN
et al., 2002).
10
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Localização do Experimento
A manutenção dos isolados e os bioensaios in vitro para avaliar o efeito dos fungos P.
lilacinus, I. fumosorosea, I. farinosa e L. lecanii sobre ovos, larvas e fêmeas ingurgitadas de
B. microplus foram realizados no Laboratório de Controle Microbiano localizado na Estação
Experimental para Pesquisas Parasitológicas Wilhemn Otto Neitz (EEPPWON) do
Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), localizado em Seropédica
1
- RJ, no período entre setembro
e novembro de 2005.
3.2. Obtenção e Manutenção dos Isolados Fúngicos
Foram utilizados os isolados de P. lilacinus, I. farinosa, I. fumosorosea e L. lecanii,
cedidos pelo CENARGEN / EMBRAPA ao Laboratório de Controle Microbiano. A origem
dos isolados fúngicos e seus hospedeiros / substrato estão relatados na tabela 1.
Tabela 1. Isolados de fungos entomopatogênicos, suas respectivas espécies, seus hospedeiros
ou substratos, sua origem e ano de recebimento da cultura no Cenargen.
Isolados fúngicos agrupados por hospedeiro
Isolado* Espécie Hospedeiro / substrato Origem Ano
CG 36
Paecilomyces lilacinus
(Homoptera: Cercopidae) Brasília – DF, Brasil 1992
CG 198 Isaria farinosa (Diptera: Culicidae) Califórnia, EUA 1985
CG 202 I. fumosorosea (Diptera: Muscidae) Brittany, França 1990
CG 420 Lecanicillium lecanii solo Aracaju – SE, Brasil 1992
* CG = Centro Nacional de Recursos Genéticos - CENARGEN / EMBRAPA, Brasil.
Esses isolados foram cultivados em placas de Petri contendo meio de cultura BDA
(batata - dextrose - ágar), e incubadas em câmara climatizada sob temperatura de 25 ± 1 ºC e
umidade relativa ≥80% por 15 dias. Decorrido esse período, as placas foram armazenadas em
um refrigerador sob temperatura de 5ºC.
3.3. Avaliação Morfológica dos Isolados
Os isolados fúngicos foram repicados em meio de cultura extrato de malte e mantidos
em câmara climatizada sob condições ideais de temperatura e umidade descritas acima,
segundo Samson (1974). Após 14 dias, foi realizada descrição das características
macroscópicas da colônia de cada isolado: mensuração do diâmetro da colônia, aspecto e
coloração das massas conidiais e reverso.
A avaliação das características microscópicas foi realizada através da utilização da
técnica de microcultivo entre lâmina e lamínula (RIVALIER; SEYDEL, 1932) utilizando
1
Entre os paralelos 22º49’ e 22º45’ de latitude sul, e os meridianos 43º38’ e 43º42’ de longitude oeste de
Greenwich, com altitude de 33 metros e clima do tipo subtropical.
11
meio de cultura extrato de malte. As placas com as culturas foram mantidas sob as mesmas
condições de temperatura e umidade durante 14 dias. Decorrido esse período, foram
confeccionadas lâminas temporárias coradas com Lactofenol de Amman com azul de algodão
(HAWKSWORTH, 1977).
3.4. Preparo das Suspensões Fúngicas
As suspensões fúngicas foram preparadas a partir do cultivo dos isolados dos fungos
em placas de Petri contendo meio de cultura extrato de malte. A superfície das colônias foi
raspada com auxílio de um cabo e lâmina de bisturi para retirada dos conídios, que foram
adicionados a 30ml de água destilada estéril e espalhante adesivo Tween 80 a 0,1% (LUZ et
al., 1998). A suspensão conidial foi homogeneizada e filtrada em gaze estéril. Uma amostra
da suspensão foi colocada em Câmara de Neubauer e examinada sob microscópio óptico para
a quantificação dos conídios.
As concentrações 10
7
, 10
6
e 10
5
conídios ml
-1
de cada isolado foram preparadas através
de diluição seriada. Dessa forma, 2 ml da concentração 10
8
conídios ml
-1
era adicionado a 18
ml de água destilada estéril + Tween 80 a 0,1% e homogeneizados, resultando na
concentração 10
7
conídios ml
-1
. A mesma metodologia foi usada para o preparo das demais
concentrações.
3.5. Viabilidade dos Conídios
Após o preparo das suspensões conidiais, uma alíquota de 10µL da suspensão 10
8
conídios ml
-1
de cada isolado do entomopatógeno foi transferida para placas de Petri contendo
BDA e antibiótico (500 mg de Cloranfenicol : 1 L meio de cultura). As placas foram
incubadas a 25 ± 1 ºC e umidade relativa ≥ 80%. Após 24 horas, foi efetuada a leitura, através
da visualização direta ao microscópio. Procedeu-se o cálculo de germinação, obtido através da
divisão do número de conídios germinados pelo total de conídios contados. Esse resultado foi
multiplicado por 100 (ALVES, 1998).
3.6. Delineamento Experimental
O tratamento para as diferentes fases do desenvolvimento de B. microplus foi formado
pelo grupo controle e por quatro diferentes concentrações (10
5
, 10
6
,
10
7
e 10
8
conídios ml
-1
). O
grupo controle foi tratado com uma solução de água destilada estéril e Tween 80 a 0,1%.
Cada tratamento foi constituído por dez repetições. As suspensões fúngicas utilizadas
no tratamento variaram sua concentração de acordo com o isolado do entomopatógeno
utilizado e com a fase do desenvolvimento de B. microplus testada. A tabela 2 mostra as
concentrações 10
8
conídios ml
-1
dos isolados de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces
utilizados para o tratamento. As demais concentrações utilizadas no bioensaio foram
preparadas a partir dessa concentração, como explicado no item anterior.
12
Tabela 2. Concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces utilizadas para
o tratamento de fêmeas ingurgitadas, ovos e larvas não alimentadas de Boophilus microplus.
Fêmeas ingurgitadas Ovos Larvas não alimentadas
P. lilacinus
2,75 x 10
8
con. ml
-1
2,70 x 10
8
con. ml
-1
2,80 x 10
8
con. ml
-1
I. farinosa 2,14 x 10
8
con. ml
-1
2,80 x 10
8
con. ml
-1
2,07 x 10
8
con. ml
-1
I. fumosorosea 2,07 x 10
8
con. ml
-1
3,62 x 10
8
con. ml
-1
1,04 x 10
8
con. ml
-1
L. lecanii 2,22 x 10
8
con. ml
-1
1,75 x 10
8
con. ml
-1
2,50 x 10
8
con. ml
-1
3.7. Obtenção de Boophilus microplus
Para obtenção do carrapato B. microplus, dois bezerros, alojados em baias na Estação
Experimental, foram infestados artificialmente com larvas provenientes de 300mg de ovos
durante três dias consecutivos. Decorridos vinte e um dias, as fêmeas ingurgitadas foram
coletadas do piso das baias e levadas ao Laboratório de Controle Microbiano para assepsia da
cutícula, sendo então, submetidas à imersão com solução de hipoclorito de sódio a 1% durante
três minutos, e posteriormente, secas em papel toalha. Uma amostra dessas fêmeas
ingurgitadas foi submetida ao tratamento proposto, enquanto que a outra, foi mantida em
placas de Petri em câmara climatizada sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa ≥90%
para obtenção de ovos e larvas.
3.8. Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de Boophilus microplus
As fêmeas ingurgitadas da amostra destinada ao tratamento foram pesadas
individualmente e divididas em dez classes. O número de classes foi calculado através da
fórmula de Yule (SAMPAIO, 2002), em função do número de observações (n), permitindo,
com isso, o cálculo do intervalo de classe (IC), obtido pelas fórmulas seguintes:
Número ideal de classes
IC = Amplitude dos valores obtidos na amostra
Número ideal de classes
A amplitude observada na amostra é a diferença entre os valores máximo e mínimo
observados.
O intervalo de classe utilizado foi de 8 mg sendo o valor mínimo para o peso das
fêmeas 200 mg e o valor máximo para a mesma variável 280 mg. Uma fêmea de cada classe
foi escolhida aleatoriamente para formar um grupo tratamento. Após formação dos grupos,
procedeu-se a pesagem individual das fêmeas, seguida pela sua identificação e seu respectivo
tratamento.
As fêmeas ingurgitadas foram colocadas individualmente em tubos de ensaio, e
tratadas com um ml da concentração fúngica, ficando submersas por três minutos. As fêmeas
do grupo controle foram submersas por três minutos em um ml de água destilada estéril +
Tween 80 0,1%. Após o tratamento, as fêmeas ingurgitadas, devidamente identificadas, foram
4
5,2 n=
13
fixadas em decúbito dorsal, em placas de Petri, com auxílio de fita dupla face, e mantidas em
câmara climatizada sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa ≥90%. Diariamente, a
postura de cada fêmea foi coletada, pesada e armazenada em pequenos frascos de vidro,
vedados com uma rolha de algodão hidrófilo, identificados e mantidos em câmara climatizada
para a avaliação diária do percentual de eclosão das larvas.
Para avaliação dos efeitos dos fungos sobre fêmeas ingurgitadas, foram observados os
seguintes parâmetros biológicos:
Peso inicial da fêmea, valor obtido da pesagem individual das fêmeas ingurgitadas,
em balança analítica, antes do tratamento.
Período de pré-postura, número de dias compreendido entre a data da coleta da
fêmea até o início da postura.
Peso da postura, obtido do somatório das pesagens parciais diárias da postura. A
separação e pesagem diária dos ovos ocorreram do primeiro dia da postura até a observação
da última postura.
Período de postura, número de dias compreendido entre a data do início e o fim da
postura.
Período de incubação, número de dias compreendido entre a data do início da postura
e o início da eclosão das larvas.
Período de eclosão, número de dias compreendido entre as datas do início e fim da
eclosão.
Percentual de eclosão das larvas, obtido por avaliação visual da quantidade de larvas
eclodidas em relação à massa total de ovos.
Peso da quenógina, obtido da pesagem individual das fêmeas três dias após a
observação da última postura.
Cálculo do Índice de Produção de ovos (IPO), realizado segundo Bennett (1974), e
obtido através da equação:
IPO = peso da massa de ovos (g) × 100
peso inicial da fêmea ingurgitada (g)
Cálculo do Índice Nutricional (IN), realizado segundo Bennett (1974), e obtido pela
equação:
IN = peso da massa de ovos (g) × 100
peso da teleógina (g) – peso da quenógina (g)
Cálculo do Percentual de controle, realizado segundo Drummond et al. (1971) e
obtido pela equação:
Percentual de controle = média RE (controle) – média RE (tratado) × 100,
média RE (controle)
onde o cálculo de reprodução estimada (RE) foi realizado segundo Drummond et al. (1971) e
obtido pela equação:
RE = peso da massa de ovos (g) × % eclosão larvas × 20000
peso da teleógina (g)
14
3.9. Bioensaio com Ovos de Boophilus microplus
As fêmeas ingurgitadas destinadas à produção de ovos tiveram sua postura separada
no 10º dia. Os ovos foram separados em alíquotas de 50 mg e acondicionados em tubos de
ensaio vedados com uma rolha de algodão hidrófilo. Cada tubo de ensaio recebeu um ml de
cada concentração conidial testada e o grupo controle positivo recebeu um ml de água
destilada estéril + Tween 80 0,1%. Os ovos ficaram submersos na suspensão por três minutos.
Decorrido esse período, os tubos de ensaio foram invertidos, para que o excesso da suspensão
fosse absorvido pelo algodão, e mantidos em câmara climatizada.
Como parâmetro de avaliação, foi observado diariamente o período de eclosão, o
período de incubação e o percentual de eclosão das larvas.
3.10. Bioensaio com Larvas não Alimentadas de Boophilus microplus
Tubos de ensaio contendo alíquotas de 50 mg de ovos de B. microplus foram mantidos
em câmara climatizada em condições ideais de temperatura e umidade, já descritas, até a
completa eclosão das larvas. Os tubos de ensaio que não apresentaram eclosão próxima de
100% foram excluídos do tratamento. A metodologia utilizada para o tratamento foi
semelhante à descrita no item anterior.
O parâmetro de avaliação utilizado foi o percentual de mortalidade das larvas,
observado a cada cinco dias após a realização do tratamento, até o 20º dia.
3.11. Reisolamento dos Entomopatógenos após Bioensaio
Uma amostra das quenóginas, dos ovos e das larvas dos grupos controle e tratamento
foi colocada em câmara úmida para propiciar o crescimento fúngico sobre suas cutículas.
Após sete dias, as amostras foram transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura
extrato de malte acrescido de cloranfenicol (0,05%), mantidas em câmara climatizada durante
15 dias. Decorrido esse período, as colônias foram avaliadas quanto às características macro e
micromorfológicas.
3.12. Análise Estatística e Próbites
Para análise dos dados paramétricos (períodos de pré-postura, postura, incubação e
eclosão) foi realizada a análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Student-
Newman-Keuls (SNK) para comparação entre as médias. Para avaliação do percentual de
eclosão e mortalidade das larvas, do índice nutricional e do índice de produção de ovos foram
realizadas análises não paramétricas de Kruskal Wallis seguida pelo teste t de Student para
comparação entre as ordenações médias (SAMPAIO, 2002).
O cálculo das concentrações letais, CL
50
e CL
90
, foi realizado pelo método de análise
de próbites segundo Finney (1971).
15
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Avaliação Morfológica dos Isolados
Após o período de incubação, foi realizada a descrição macromorfológica das colônias
dos quatro isolados fúngicos. Foram consideradas as seguintes características: mensuração da
colônia, aspecto e coloração das massas conidiais e reverso.
Segundo Samson (1974), as espécies classificadas na seção Isarioidea do gênero
Paecilomyces, na qual se encontram a maioria das espécies entomopatogênicas, apresentam
colônias com coloração viva, brilhante, podendo ser branca, amarela, verde clara, rosa ou
violeta.
Paecilomyces lilacinus apresenta colônias com crescimento rápido em meio de cultura
extrato de malte, atingindo um diâmetro de cinco a sete centímetros com 14 dias a 25º C.
Apresenta um crescimento flocoso do micélio aéreo. Inicialmente, a colônia é branca, mas
quando esporula torna-se lilás vináceo. O reverso algumas vezes é incolor, mas usualmente
com sombreado vinho, se aproximando de uma coloração avermelhada a púrpura (SAMSON,
1974).
Segundo Samson (1974), as colônias de I. farinosa crescem moderadamente rápido em
meio de cultura extrato de malte, atingindo um diâmetro de quatro centímetros com 14 dias a
25ºC. Apresentam numerosos conidióforos em isolados pulverulentos recentes, e algumas
vezes sinemas amarelos evidentes em cepas antigas com micélio aéreo flocoso. Inicialmente
são de coloração branca, permanecendo assim, ou se tornando amarelo brilhante ou creme. O
reverso pode variar entre creme a amarelo, e em isolados recentes, frequentemente é amarelo
brilhante.
O crescimento das colônias de I. fumosorosea é moderadamente rápido em meio de
cultura extrato de malte, atingindo um diâmetro de cerca de quatro centímetros com 14 dias a
25ºC. Apresentam um elevado crescimento flocoso, pulverulento quando isolado
recentemente. Inicialmente branca, permanecendo assim ou tornando-se ligeiramente rosa,
especialmente quando esporula abundantemente. O reverso apresenta-se incolor ou amarelo
(SAMSON, 1974).
Todas as características macromorfológicas dos isolados de P. lilacinus, I. farinosa e I.
fumosorosea foram compatíveis com as descrições realizadas por Samson (1974) (Tab.3 e
Fig.1), e as características do isolado de L. lecanii foram compatíveis com as descritas por
Zare e Gams (2001).
Tabela 3. Características macromorfológicas dos entomopatógenos Paecilomyces, Isaria e
Lecanicillium utilizados nos bioensaios.
Características macromorfológicas
Isolado Espécie
Diâmetro
da colônia
Coloração da colônia Reverso
CG 420 L. lecanii 3,4 cm Branca amarelada. Creme
CG 198 I. farinosa 4,0 cm Amarela apresentando borda branca. Creme
CG 202 I. fumosorosea 6,5 cm Branca apresentando borda rósea. Amarelo
CG 36
P. lilacinus
6,4 cm Branca apresentando borda lilás. Incolor
16
Segundo a chave descrita por Samson (1974), os isolados de P. lilacinus apresentam
as seguintes características micromorfológicas: conidióforos pigmentados, parede áspera e
clamidosporos ausentes. I. farinosa apresenta conídios elipsóides a fusiformes enquanto I.
fumosorosea apresenta conídios fusiformes a cilíndricos, medindo 3,0 – 4,0 × 1,0 – 2,0 µm.
As características dos isolados utilizados nos bioensaios foram compatíveis com as descritas
por Samson (1974) (Fig.2).
De acordo com a chave para identificação das espécies de Lecanicillium descrita por
Zare e Gams (2001), L. lecanii apresenta fiálides curtas, conídios curtos-elipsóides a
subclilíndricos, medindo 2,5 – 3,5 × 1,0 – 1,5 µm. Tais características foram observadas no
isolado CG420 de L. lecanii utilizado no bioensaio (Fig.2).
Portanto, sendo as características macro e micromorfológicas dos isolados testados
compatíveis com as descritas na literatura, pode-se afirmar que não houve contaminação das
colônias de L. lecanii, I. farinosa, I. fumosorosea e P. lilacinus utilizadas no presente trabalho
e que qualquer alteração nos parâmetros de avaliação das fases de desenvolvimento de B.
microplus se deu pela ação do fungo.
17
Figura 1.
Características macro
morfológicas das colônias dos entomopatógenos.
A: Colônia de Lecanicillium lecanii; B: Reverso da colônia de L. lecanii; C:
Colônia de Isaria farinosa; D: Reverso da colônia de I. farinosa; E: colônia de I.
fumosorosea; F: Reverso da colônia de I. fumosorosea; G: Colônia de
Paecilomyces lilacinus; H: Reverso da colônia de P. lilacinus.
18
Figura 2.
Isolado dos entomopatógenos observados sob microscopia óptica.
Barras = 10µm. A e B: Fiálides solitárias de Lecanicillium lecanii; C: Fiálide
solitária e conídios em cadeia de Isaria farinosa em aumento de 400 ×; D:
Fiálides com porção basal dilatada – I. farinosa; E: Fiálide com porção basal
globosa – I. fumosorosea; F: Conidióforo de I. fumosorosea G: Fiálide de
Paecilomyces lilacinus em aumento de 400 ×; H: Fiálide com porção basal
dilatada, apresentando um “pescoço” na extremidade – P. lilacinus em aumento
de 1000 ×.
19
4.2. Viabilidade dos Conídios
Os conídios das suspensões de I. farinosa, I. fumosorosea, P. lilacinus e L. lecanii
apresentaram 100% de germinação após 24 horas de incubação sob temperatura de 25 ± 1 ºC
e umidade relativa ≥ 80%.
Garantindo a qualidade dos conídios nas suspensões utilizadas para tratamento,
podemos afirmar que tanto os resultados positivos quanto os negativos encontrados no
presente trabalho são decorrentes exclusivamente da ação do fungo sobre o estágio de
desenvolvimento do carrapato testado, uma vez que todos os conídios estavam viáveis.
4.3. Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de Boophilus microplus
4.3.1. Peso médio das fêmeas ingurgitadas
O peso médio, em gramas, das fêmeas ingurgitadas utilizadas no bioensaio está
demonstrado na tabela 4. Segundo Bennett (1974), fêmeas ingurgitadas de B. microplus com
pequeno tamanho são menos eficientes na produção de ovos do que fêmeas apresentando
média de peso entre 160 e 300mg. Logo, as fêmeas utilizadas tanto no grupo controle quanto
nos grupos tratados com suspensão conidial dos entomopatógenos apresentaram médias de
peso que validam a cepa de B. microplus utilizada nesse estudo.
Tabela 4. Valores médios, em gramas, do peso de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e
Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p=0,05).
4.3.2. Período de pré-postura
O período de pré-postura foi um dos parâmetros avaliados para identificar o efeito dos
isolados dos entomopatógenos sobre a fase não parasitária de B. microplus. Os isolados dos
fungos entomopatogênicos P. lilacinus, I. farinosa, I. fumosorosea e L. lecanii não
demonstraram redução significativa nesse parâmetro quando comparados ao grupo controle,
independente da concentração de conídios utilizada (Tab.5).
Glória et al. (1993) ao compararem a biologia da fase não parasitária de duas estirpes
de B. microplus sob diferentes temperaturas, verificaram que o período de pré-postura dessas
fêmeas durou em média 2,91 dias, quando submetidas à temperatura de 27 ± 1ºC e umidade
relativa de 80 ± 10%. Portanto, a cepa de B. microplus utilizada como controle no presente
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 0,2392 ± 0,02 a 0,2392 ± 0,02 a 0,2392 ± 0,02 a 0,2392 ± 0,02 a
10
5
con. ml
-1
0,2376 ± 0,02 a 0,2382 ± 0,02 a 0,2387 ± 0,02 a 0,2381 ± 0,02 a
10
6
con. ml
-1
0,2377 ± 0,02 a 0,2381 ± 0,02 a 0,2397 ± 0,02 a 0,2406 ± 0,02 a
10
7
con. ml
-1
0,2388 ± 0,02 a 0,2390 ± 0,02 a 0,2380 ± 0,03 a 0,2378 ± 0,02 a
10
8
con. ml
-1
0,2400 ± 0,02 a 0,2381 ± 0,03 a 0,2365 ± 0,03 a 0,2406 ± 0,02 a
20
estudo apresentou período de pré-postura condizente com o descrito na literatura, validando a
cepa de B. microplus utilizada no presente estudo.
Tabela 5. Valores médios, em dias, do período de pré-postura de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium,
Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle
3,2 ± 0,48 a 3,2 ± 0,48 a 3,2 ± 0,48 a 3,2 ± 0,48 a
10
5
con. ml
-1
3,2 ± 0,44 a 3,2 ± 0,42 a 3,5 ± 0,53 a 3,1 ± 0,32 a
10
6
con. ml
-1
3,0 ± 0,00 a 3,4 ± 0,52 a 3,6 ± 0,52 a 3,0 ± 0,00 a
10
7
con. ml
-1
3,1 ± 0,32 a 3,6 ± 0,52 a 3,9 ± 0,57 a 3,0 ± 0,00 a
10
8
con. ml
-1
3,2 ± 0,42 a 3,2 ± 0,42 a 4,0 ± 0,50 a 3,0 ± 0,00 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p=0,05).
Bittencourt et al. (1994) ao avaliarem os efeitos do fungo M. anisopliae sobre as
características biológicas de fêmeas ingurgitadas de B. microplus mostraram que houve
aumento significativo no período de pré-postura à medida que se aumentava a concentração
dos conídios, provando que o isolado do entomopatógeno utilizado interfere na biologia de
fêmeas ingurgitadas de B. microplus.
Outro estudo realizado por Bittencourt et al. (1997) não demonstrou variação
significativa no número de dias do período de pré-postura de fêmeas ingurgitadas de B.
microplus quando comparou o grupo controle com cinco concentrações conidiais de B.
bassiana. Mesmo não interferindo no período de pré-postura, os isolados 747 e 986 de B.
bassiana foram considerados eficazes no controle biológico do carrapato B. microplus, uma
vez que apresentaram efeito patogênico sobre outros parâmetros biológicos de fêmeas
ingurgitadas estudados.
Embora as espécies de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces utilizadas no presente
trabalho não tenham demonstrado interferência no período de pré-postura de fêmeas
ingurgitadas tratadas por imersão em suspensões conidiais, ainda podem ser consideradas
agentes microbianos promissores no controle de B. microplus.
4.3.3. Período de postura
Lecanicillium lecanii e I. farinosa demonstraram seu potencial patogênico para as
fêmeas ingurgitadas de B. microplus causando diminuição significativa do período de postura.
As concentrações 10
7
conídios ml
-1
e 10
8
conídios ml
-1
de L. lecanii foram responsáveis por tal
redução, e somente a maior concentração de I. farinosa mostrou-se eficaz (Tab.6). Os isolados
de I. fumosorosea e P. lilacinus não reduziram significativamente esse parâmetro quando
comparados com o grupo controle.
As fêmeas ingurgitadas do grupo controle apresentaram período de postura de 12,1 ±
1,27 dias, semelhante ao demonstrado por Glória et al (1993) quando submeteram fêmeas da
mesma espécie às mesmas condições de temperatura e umidade relativa.
21
O trabalho de Bittencourt et al. (1994) mostrou redução significativa desse período
quando trataram fêmeas de B. microplus com M. anisopliae, sugerindo o potencial do fungo
de controlar a população de carrapatos, uma vez que o período de postura foi diminuído.
Tabela 6. Valores médios, em dias, do período de postura de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus submetidas ao tratamento com diferentes concentrações de conídios de
Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade
relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 12,1 ± 1,27 a 12,1 ± 1,27 a 12,1 ± 1,27 a 12,1 ± 1,27 a
10
5
con. ml
-1
9,4 ± 3,71 a 12,8 ± 2,15 a 11,9 ± 1,73 a 12,7 ± 1,49 a
10
6
con. ml
-1
10,6 ± 2,22 a 10,9 ± 3,14 a 11,5 ± 1,31 a 12,2 ± 1,75 a
10
7
con. ml
-1
6,4 ± 1,96 b 11,4 ± 3,78 a 11,9 ± 0,74 a 11,9 ± 3,38 a
10
8
con. ml
-1
5,8 ± 1,93 b 8,2 ± 1,99 b 12,0 ± 1,58 a 11,4 ± 2,01 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p=0,05).
Os ritmos de postura diária das fêmeas ingurgitadas de B. microplus tratadas com
diferentes concentrações de conídios dos fungos entomopatogênicos estão demonstrados nas
figuras 3, 4, 5 e 6.
Na concentração 10
5
conídios ml
-1
não houve diferença significativa do pico de postura
dos isolados testados quando comparados ao grupo controle. Nas concentrações 10
6
e 10
7
conídios ml
-1
o isolado de I. fumosorosea se destacou dos demais isolados apresentando pico
de postura abaixo do grupo controle, embora essa diferença não tenha sido significativa.
Notou-se que o isolado de I. farinosa na concentração 10
7
conídios ml
-1
foi o único
que apresentou pico de postura acima do grupo controle, porém não diferiu
significativamente. Além disso, o pico de postura de fêmeas ingurgitadas precedeu o dia do
pico de postura de fêmeas do grupo controle, mostrando que o entomopatógeno foi capaz de
intervir na biologia de fêmeas desafiadas à infecção fúngica.
Ao tratar as fêmeas de B. microplus com L. lecani e I. farinosa na concentração 10
8
conídios ml
-1
observou-se diferenças significativas nos picos de postura, que se mostraram
abaixo do pico do grupo controle, em razão da menor postura realizada por essas fêmeas
tratadas com a maior concentração dos entomopatógenos em questão.
22
Ritmo de Postura Diária
Concentração 10
5
conídios mL-1
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Nº de Dias
Peso médio de Postura
(mg)
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 3. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com a concentração 10
5
conídios ml
-1
dos isolados
CG 420 de Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202
de I. fumosorosea e CG 36 de Paecilomyces lilacinus.
Ritmo de Postura Diária
Concentração 10
6
conídios mL-1
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Nº de Dias
Peso médio de Postura
(mg)
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 4. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com a concentração 10
6
conídios ml
-1
dos isolados
CG 420 de Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202
de I. fumosorosea e CG 36 de Paecilomyces lilacinus.
23
Ritmo de Postura Diária
Concentração 10
7
conídios mL-1
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Nº de Dias
Peso médio de
Postura (mg)
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 5. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com a concentração 10
7
conídios ml
-1
dos isolados
CG 420 de Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202
de I. fumosorosea e CG 36 de Paecilomyces lilacinus.
Ritmo de Postura Diária
Concentração 10
8
conídios mL-1
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Nº de Dias
Peso médio de
Postura (mg)
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 6. Ritmo de postura diária de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com a concentração 10
8
conídios ml
-1
dos isolados
CG 420 de Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202
de I. fumosorosea e CG 36 de Paecilomyces lilacinus.
4.3.4. Período de incubação
Com relação ao período de incubação, foi observado aumento significativo no número
de dias apenas com a maior concentração do isolado CG 420 de L. lecanii, sugerindo que esse
isolado pode atuar no controle da fase não parasitária de B. microplus, uma vez que a
concentração 10
8
conídios ml
-1
aumentou o período necessário para a eclosão das larvas,
prolongando o ciclo biológico do carrapato. Esse aumento do período de uma das fases do
ciclo biológico do carrapato pode ser útil quando o manejo integrado de pragas é utilizado
como forma de controle, pois ganha-se tempo para a utilização simultânea de outras práticas
24
de controle do carrapato. Os demais isolados aumentaram o período de incubação, porém essa
diferença não foi considerada significativa (Tab.7).
Tabela 7. Valores médios do período de incubação da postura de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium,
Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 25,5 ± 0,52 a 25,5 ± 0,52 a 25,5 ± 0,52 a 25,5 ± 0,52 a
10
5
con. ml
-1
25,4 ± 0,73 a 26,0 ± 0,82 a 26,2 ± 0,92 a 25,5 ± 0,57 a
10
6
con. ml
-1
26 ± 0,94 ab 26,1 ± 0,74 a 26,0 ± 9,24 a 26,0 ± 0,94 a
10
7
con. ml
-1
25,4 ± 1,07 a 26,2 ± 1,03 a 26,8 ± 1,99 a 26,1 ± 0,74 a
10
8
con. ml
-1
26,6 ± 1,17 b 25,7 ± 0,82 a 26,2 ± 1,09 a 26,2 ± 0,79 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p=0,05).
Boycev e Rizvanov (1960) e Gorskova (1966) também observaram aumento no
número de dias do período de incubação quando expuseram fêmeas de Ixodes ricinus ao
fungo Botrytis cinerea. Bittencourt et al. (1997), ao estudarem dois isolados de uma espécie
de Beauveria sobre o carrapato B. microplus, mostraram resultados diferentes entre si quando
o período de incubação foi comparado. O isolado 986 de B. bassiana promoveu aumento
significativo no número de dias à medida que a concentração de conídios aumentava, porém o
isolado 747 não causou aumento significativo. Logo, tanto a espécie do artrópode-alvo quanto
à espécie e o isolado do entomopatógeno utilizado, devem ser considerados quando se deseja
avaliar o potencial do fungo no controle de tal artrópode.
Glória et al. (1993), ao estudarem a biologia comparativa da fase não parasitária de B.
microplus, observaram um período de incubação variando entre 24 a 27 dias, em temperatura
de 27 ± 1ºC, semelhante ao observado no estudo para o grupo controle. Logo, as cepas de
carrapatos utilizadas no bioensaio apresentaram parâmetros biológicos compatíveis com os
parâmetros de outras cepas de B. microplus já descritos na literatura sob mesmas condições de
temperatura e umidade.
4.3.5. Período de eclosão das larvas
O período de eclosão das larvas foi reduzido significativamente com a concentração
10
8
conídios ml
-1
do isolado de P. lilacinus. Os outros isolados testados não foram capazes de
causar diferenças significativas no período de eclosão quando comparados ao grupo controle.
Os resultados obtidos estão demonstrados na tabela 8.
Bittencourt et al. (1994), ao estudarem dois isolados de B. bassiana, observaram
aumento no período de eclosão de larvas de B. microplus quando o tratamento foi realizado
sobre fêmeas ingurgitadas, embora o isolado Bm tenha apresentado melhores resultados que o
isolado Mãe. O aumento desse período foi diretamente proporcional ao aumento da
concentração de conídios. No presente trabalho, os resultados encontrados discordam dos
apresentados pelos autores supracitados, pois o período de eclosão das larvas foi reduzido
25
com a utilização dos entomopatógenos, porém tal redução foi considerada significativa apenas
com a maior concentração do isolado de P. lilacinus.
Tabela 8. Valores médios do período de eclosão de larvas provenientes do tratamento de
fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus com diferentes concentrações de conídios de
Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade
relativa = 90%*.
L .lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle
8,5 ± 1,65 a 8,5 ± 1,65 a 8,5 ± 1,65 a 8,5 ± 1,65 a
10
5
con. ml
-1
8,0 ± 1,41 a 8,1 ± 1,03 a 7,2 ± 2,25 a 7,3 ± 1,16 ab
10
6
con. ml
-1
7,8 ± 0,92 a 7,8 ± 1,14 a 6,4 ± 3,98 a 7,7 ± 0,95 ab
10
7
con. ml
-1
8,2 ± 1,23 a 7,6 ± 1,51 a 7,3 ± 2,31 a 7,3 ± 1,06 ab
10
8
con. ml
-1
7,3 ± 1,64 a 7,9 ± 0,74 a 8,1 ± 2,98 a 7,0 ± 1,15 b
*Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste de
Student-Newman-Keuls (p=0,05).
4.3.6. Índice nutricional
Os resultados dos valores médios do índice nutricional de fêmeas ingurgitadas dos
grupos controle e tratados podem ser observados na tabela 9.
Observou-se que as concentrações 10
7
conídios ml
-1
e 10
8
conídios ml
-1
do isolado de
I. fumosorosea demonstraram redução significativa do índice nutricional, cujos valores
obtidos foram 59,02% no grupo tratado com a maior concentração e 69,65% no grupo
controle. O isolado de L. lecanii também demonstrou redução nesse parâmetro quando as
fêmeas ingurgitadas foram tratadas com as duas maiores concentrações.
Quanto ao isolado de I. farinosa, foi observado redução do índice nutricional somente
com a concentração 10
8
conídios ml
-1
.
A redução significativa deste índice demonstra que as fêmeas infectadas
experimentalmente com determinadas concentrações de entomopatógenos apresentaram
menor proporção entre seu peso inicial e a produção de ovos, indicando que esses fungos
interferem na capacidade reprodutiva de fêmeas de B. microplus.
O isolado CG 36 de P. lilacinus não foi capaz de causar diminuição significativa do
índice nutricional quando comparado com o grupo controle.
Bittencourt et al. (1997) testaram dois isolados de B. bassiana sobre fêmeas de B.
microplus e observaram uma tendência à diminuição do índice nutricional quando se
aumentava a concentração de conídios na suspensão. Essa proporção foi observada apenas
quando se utilizou as duas maiores concentrações dos isolados de L. lecanii e I. fumosorosea,
sugerindo uma menor patogenicidade dos fungos avaliados no presente trabalho.
26
Tabela 9. Valores médios do índice nutricional de fêmeas ingurgitadas de Boophilus
microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e
Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 69,65 a 69,65 a 69,65 a 69,65 a
10
5
con. ml
-1
56,01 a 73,96 a 71,63 a 76,14 a
10
6
con. ml
-1
65,68 a 66,07 a 60,30 ab 71,91 a
10
7
con. ml
-1
51,60 b 69,54 a 68,38 b 64,91 a
10
8
con. ml
-1
44,83 b 55,48 b 59,02 b 70,45 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
4.3.7. Índice de produção de ovos
As fêmeas ingurgitadas utilizadas para formação do grupo controle apresentaram
valores do índice de produção de ovos semelhantes aos encontrados por Davey et al. (1980).
Esses autores, ao avaliaram a biologia da oviposição de B. microplus em condições de
laboratório, observaram que o índice de produção de ovos foi de 57,95%. Isso significa que as
fêmeas utilizadas no presente estudo apresentaram parâmetros semelhantes aos já descritos na
literatura.
Todos os isolados demonstraram redução significativa no índice de produção de ovos
em relação ao grupo controle (Tab.10). O índice de produção de ovos traduz a relação entre o
somatório de nutrientes ingeridos pela fêmea durante a fase parasitária e a energia
desprendida para a produção da massa de ovos. As fêmeas ingurgitadas do grupo controle e
do grupo tratado com fungos não apresentaram diferença significativa quanto ao peso inicial,
como demonstrado na tabela 4, logo a quantidade e qualidade (pois as fêmeas foram obtidas
do mesmo hospedeiro) de sangue ingerido eram iguais nos dois grupos. Porém, as fêmeas
submetidas ao tratamento com os isolados fúngicos não foram capazes de fazer a adequada
conversão de nutrientes em ovos, pois o índice de produção de ovos dessas fêmeas foi
significativamente reduzido quando comparado com o de fêmeas do grupo controle.
As quatro diferentes concentrações de conídios de L. lecanii reduziram
significativamente esse índice, o que significa que uma menor quantidade de conídios desses
entomopatógenos poderá ser usada para causar impacto no tamanho da população de
carrapatos, uma vez que a postura dessas fêmeas será reduzida, interferindo assim, na geração
subseqüente.
Estudos realizados por Gindin et al. (2001) mostraram redução na fecundidade de
fêmeas ingurgitadas de B. annulatus tratadas com suspensão conidial de I. fumosorosea e L.
lecanii quando comparados com o grupo controle. Esses mesmos autores, ao avaliarem a
eficácia de outras duas cepas de I. fumosorosea e a mesma cepa de L. lecanii sobre B.
annulatus, R. sanguineus e Hyalomma excavatum observaram a redução da massa de ovos das
fêmeas ingurgitadas tratadas com a concentração 1 × 10
7
conídios ml
-1
. Esses dados são
similares aos observados neste trabalho, comprovando a eficiência de I. fumosorosea e L.
lecanii na redução do índice de produção de ovos de fêmeas de outra espécie de carrapato.
27
Tabela 10. Valores médios do índice de produção de ovos de fêmeas ingurgitadas de
Boophilus microplus tratadas com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium,
Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 58,21 a 58,21 a 58,21 a 58,21 a
10
5
con. ml
-1
47,58 b 61,01 a 57,47 ab 61,80 a
10
6
con. ml
-1
57,03 b 54,32 bc 43,54 c 54,83 b
10
7
con. ml
-1
41,25 c 56,17 ab 52,84 bc 49,52 b
10
8
con. ml
-1
35,02 c 45,04 c 48,95 bc 59,05 ab
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
4.3.8. Percentual de eclosão
Não foi observada a redução significativa do percentual de eclosão de larvas oriundas
de fêmeas ingurgitadas tratadas com as diferentes concentrações conidiais dos isolados de I.
farinosa, P. lilacinus e L. lecanii.
O isolado de P. lilacinus, quando utilizado na maior concentração de conídios, foi
capaz de interferir no período de eclosão das larvas quando fêmeas de B. microplus foram
tratadas, como demonstrado na Tab.8, porém não foi capaz de interferir na eclosão dessas
larvas, haja visto que nenhuma diferença significativa foi encontrada no percentual de eclosão
entre os grupos tratados e o controle.
O isolado CG 202 de I. fumosorosea foi o único capaz de reduzir o percentual de
eclosão, porém essa redução somente foi obtida quando se utilizou as concentrações 10
6
conídios ml
-1
e 10
7
conídios ml
-1
como tratamento de fêmeas ingurgitadas. A maior
concentração utilizada não foi capaz de alterar o parâmetro avaliado (Tab.11).
Tabela 11. Valores médios do percentual de eclosão de larvas oriundas do tratamento de
fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus em relação aos diferentes tratamentos, mantidas
sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 97,8 a 97,8 a 97,8 a 97,8 a
10
5
con. ml
-1
90,4 a 88,3 a 67,0 ab 96,1 a
10
6
con. ml
-1
97,4 a 89,5 a 51,2 b 91,8 a
10
7
con. ml
-1
97,6 a 98,9 a 58,5 b 96,6 a
10
8
con. ml
-1
92,9 a 95,4 a 83,6 ab 83,1 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
A redução do percentual de eclosão foi observada por Kaaya et al. (1996), quando
testaram o potencial de B. bassiana e M. anisopliae sobre os carrapatos Rhipicephalus
28
appendiculatus e Amblyomma variegatum em testes a campo. Os resultados mostraram
percentual de eclosão de 0% em A. variegatum e variação de 0 a 6% em R. appendiculatus,
demonstrando o potencial destes patógenos no controle de carrapatos.
Beauveria bassiana foi utilizada por Boycev e Rizvanov (1960) em infecção artificial
de fêmeas de I. ricinus, e foi capaz de reduzir significativamente o percentual de eclosão de
larvas oriundas da postura das fêmeas tratadas. Foi observado somente 6,5% de eclosão das
larvas. Resultados diferentes foram encontrados por Fernandes et al. (1997), que ao utilizaram
o mesmo fungo sobre fêmeas de B. microplus encontraram valores que variaram de 18,18% a
83,33%. Essa diferença de resultados pode ser atribuída à espécie de carrapato utilizada nos
bioensaios, aos isolados do fungo testados, e à ausência de informação quanto à concentração
da suspensão utilizada na infecção de I. ricinus.
4.3.9. Percentual de controle
O percentual de controle foi calculado e os seguintes resultados foram obtidos: as
concentrações 10
8
conídios ml
-1
dos quatro entomopatógenos mostraram maior eficiência no
controle in vitro de fêmeas de B. microplus. O percentual de controle variou entre 2,51% e
41,02% para L. lecanii, 2,61% e 25,15% para I. farinosa, 28,57% e 59,19% para I.
fumosorosea (Tab.12).
O isolado CG 36 de P. lilacinus não apresentou resultados promissores no percentual
de controle, mostrando variações entre -4,28% a 13,5%.
O fungo I. fumosorosea apresentou os melhores resultados, que variaram entre 28,57%
e 59,19%, porém, ao contrário do que se podia esperar, o melhor percentual de controle não
foi obtido na maior concentração de conídios utilizada.
Tabela 12. Percentual de controle de fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus tratadas
com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces e mantidas
sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
10
5
con. ml
-1
24,22 % 5,21 % 33,05% -4,28 %
10
6
con. ml
-1
2,51 % 15,17 % 59,19 % 10,77 %
10
7
con. ml
-1
29,16 % 2,61 % 46,16 % 7,21 %
10
8
con. ml
-1
41,02 % 25,15 % 28,57 % 13,50 %
Estudos realizados por Fernandes et al. (1997) mostraram o elevado percentual de
controle promovido por dois isolados de B. bassiana quando testados in vitro sobre fêmeas
ingurgitadas de B. microplus. O percentual de controle foi maior à medida que se aumentava a
concentração de conídios na suspensão, variando entre 10,45% e 86,78% para o isolado 986, e
entre 4,4% e 83,39% para o isolado 747.
Os resultados de percentual de controle de B. microplus demonstrados no presente
trabalho estão aquém dos obtidos por Fernandes et al. (1997) quando utilizou o fungo B.
bassiana, considerado promissor no controle de diversas espécies de artrópodes em geral.
Mesmo tendo sua eficácia contra carrapatos comprovada por diversos autores, a virulência do
fungo contra o artrópode-alvo pode variar consideravelmente em função do isolado utilizado,
uma vez que, Fernandes (2003) ao estudar a variabilidade genética de 50 isolados de B.
29
bassiana de diferentes regiões geográficas, observou variação de 3% a 100% no percentual
médio de mortalidade de larvas não alimentadas de B. microplus infectadas artificialmente.
Considerando as espécies dos fungos avaliadas no presente trabalho, poucos estudos
demonstram seu efeito sobre carrapatos. Dessa forma, outros isolados fúngicos de L. lecanii,
I. farinosa, I. fumosorosea e P. lilacinus deveriam ser estudados para avaliação do seu
potencial no controle de B. microplus.
4.4. Bioensaio com Ovos de Boophilus microplus
O isolado CG 420 de L. lecanii se mostrou eficaz para reduzir significativamente o
percentual de eclosão das larvas quando ovos de B. microplus foram submetidos ao
tratamento com as concentrações 10
6
e 10
7
conídios ml
-1
. As concentrações 10
5
e 10
8
conídios
ml
-1
não foram capazes de causar redução significativa desse parâmetro (Tab.13).
O fungo entomopatogênico I. farinosa reduziu o parâmetro estudado quando utilizou-
se todas as concentrações, porém essa redução foi considerada significativa somente quando
as duas maiores concentrações conidiais foram utilizadas. Resultados diferentes foram obtidos
quando avaliou-se o percentual de eclosão de larvas, oriundas do tratamento de fêmeas
ingurgitadas (Tab.8). Portanto, o isolado CG 198 de I. farinosa somente é eficaz na redução
do percentual de eclosão de larvas de B. microplus quando a infecção ocorre sobre a fase de
ovo.
O isolado CG 36 de P. lilacinus não foi capaz de causar redução significativa do
percentual de eclosão das larvas quando ovos de B. microplus foram expostos às diferentes
concentrações conidiais. Da mesma forma, nenhuma concentração utilizada foi capaz de
reduzir o percentual de eclosão de larvas quando fêmeas de B. microplus foram submetidas ao
tratamento, como demonstrado anteriormente (Tab.11).
Em relação ao isolado de I. fumosorosea, todas as concentrações foram capazes de
reduzir significativamente o percentual de eclosão das larvas, exceto a concentração 10
6
conídios ml
-1
. A concentração 10
7
conídios ml
-1
mostrou-se eficaz na redução do percentual
de eclosão tanto no bioensaio com fêmeas ingurgitadas quanto no bioensaio com ovos,
mostrando uma possível utilização do fungo entomopatogênico I. fumosorosea no controle da
fase não parasitária de B. microplus.
Tabela 13. Percentual de eclosão de larvas de Boophilus microplus após tratamento de ovos
com diferentes concentrações de conídios de Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidos
sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 98,8 ab 98,8 a 98,8 a 98,8 a
10
5
con. ml
-1
97,4 ac 97,7 a 64,8 bc 98,3 a
10
6
con. ml
-1
97,3 c 97,9 a 79,0 ab 98,9 a
10
7
con. ml
-1
96,0 c 92,5 b 63,0 c 98,2 a
10
8
con. ml
-1
98,9 b 88,3 b 25,5 d 98,4 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
Gindin et al. (2001) demonstraram a virulência de nove isolados de fungos
entomopatogênicos sobre fêmeas ingurgitadas, ovos e larvas de B. annulatus, entre os quais se
30
encontravam dois isolados de I. fumosorosea e um isolado de L. lecanii. O percentual de
mortalidade foi observado no sétimo dia após tratamento e os isolados de I. fumosorosea e um
isolado de L. lecanii apresentaram menor virulência para fêmeas ingurgitadas quando
comparados com os demais isolados testados. Os isolados de I. fumosorosea colonizaram a
superfície dos ovos tratados e a eclodibilidade foi retardada, porém, o percentual de eclosão
das larvas não diferiu estatisticamente do grupo controle quando observado 15 dias após o
tratamento. Já o isolado de L. lecanii não provocou alteração na eclodibilidade das larvas tão
pouco colonizou a superfície dos ovos.
Os resultados obtidos no presente trabalho diferiram dos observados por Gindin et al.
(2001). A concentração utilizada por esses autores foi menor que a utilizada no presente
trabalho, fato esse que poderia justificar a ausência de patogenicidade do isolado sobre ovos
do carrapato B. annulatus, sendo esses valores 1× 10
7
conídios ml
-1
e
3,62 × 10
7
conídios ml
-1
,
respectivamente. Outro fator a ser considerado é a diferença entre as espécies de carrapatos
estudadas e entre as metodologias empregadas. Gindin et al. (2001) adotaram como
metodologia o contato dos ovos com papel filtro impregnado com 0,5 ml da suspensão 1× 10
7
conídios ml
-1
enquanto que na metodologia aqui apresentada, os ovos ficaram submersos na
suspensão por três minutos, aumentando o contato dos conídios com a superficie dos ovos.
Bittencourt et al. (1996) avaliaram o efeito patogênico dos isolados 986 e 747 de B.
bassiana sobre ovos e larvas de B. microplus, que se mostraram patogênicos para ambos os
estágios de desenvolvimento do carrapato. Foi observada a redução do percentual de eclosão
das larvas, que variou entre 20% e 86,6% de acordo com o isolado e concentração conidial
utilizados, enquanto que o percentual de eclosão do grupo controle foi de 93,3%.
Paião et al. (2001) estudando a ação de M. anisopliae e B. bassiana sobre ovos de B.
microplus obtiveram os melhores resultados com os tratamentos contendo as maiores
concentrações de conídios.
O ritmo de eclosão acumulada comparando os quatro entomopatógenos é demonstrado
nas figuras 7, 8, 9 e 10. Percebe-se nitidamente que as quatro concentrações do isolado de I.
fumosorosea se destacam do grupo controle, mostrando sua capacidade de reduzir o
percentual de eclosão das larvas. Porém, diferenças estatísticas significativas somente foram
encontradas quando as concentrações 10
7
conídios ml
-1
e 10
8
conídios ml
-1
foram utilizadas.
Ainda observando as figuras 11, 12, 13 e 14, constatamos que I. fumosorosea também
se destaca dos demais fungos utilizados no bioensaio, porém deve-se considerar que a
quantidade de conídios disponíveis na suspensão preparada com esse isolado fúngico foi
maior que a quantidade de conídios contida nos demais tratamentos. Portanto, não podemos
afirmar que o isolado CG 202 é mais patogênico para ovos de B. microplus que os outros
isolados testados.
31
Ritmo de Eclosão Acumulada
Concentração 10
5
con. mL
-1
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nº de dias
% de eclosão diário
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 7. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de
Boophilus microplus a partir do tratamento de ovos com a
concentração 10
5
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de
I. fumosorosea e CG 36 de Paecilomyces lilacinus sob
temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa = 90%.
Ritmo de Eclosão Acumulada
Concentração 10
6
con. mL
-1
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nº de dias
% eclosão diário
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 8. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de Boophilus
microplus a partir do tratamento de ovos com a concentração
10
6
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium lecanii,
CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36
de Paecilomyces lilacinus sob temperatura de 27 ± 1 ºC e
umidade relativa = 90%.
32
Ritmo de Eclosão Acumulada
Concentração 10
7
con. mL
-1
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nº de dias
% de eclosão diário
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 9. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de Boophilus
microplus a partir do tratamento de ovos com a concentração 10
7
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium lecanii, CG
198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36 de
Paecilomyces lilacinus sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade
relativa = 90%.
Ritmo de Eclosão Acumulada
Concentração 10
8
con. mL
-1
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nº de dias
% eclosão diário
Controle CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 10. Ritmo de eclosão acumulada de larvas de Boophilus
microplus a partir do tratamento de ovos com a concentração 10
8
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de Lecanicillium lecanii, CG
198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG 36 de
Paecilomyces lilacinus sob temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade
relativa = 90%.
33
4.5. Bioensaio com Larvas não Alimentadas de Boophilus microplus
Os dados do percentual de mortalidade das larvas analisados nos dia 5, 10, 15 e 20
após tratamento estão demonstrados nas tabelas 14, 15, 16 e 17, respectivamente.
Os resultados mostraram que L. lecanii foi o único isolado que causou mortalidade das
larvas no 5º dia após o tratamento. Esse percentual variou de 1,3% para o grupo tratado com a
menor concentração, e 13,0% para o grupo tratado com a maior concentração, enquanto que
no grupo controle, não houve mortalidade das larvas (Tab.14).
Tabela 14. Percentual de mortalidade das larvas não alimentadas de Boophilus microplus no
5º dia após o tratamento com as diferentes concentrações de conídios dos fungos
entomopatogênicos Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1
ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a
10
5
con. ml
-1
1,3 ab
0,0 a 0,0 a 0,0 a
10
6
con. ml
-1
11,0 cd
0,0 a 0,0 a 0,0 a
10
7
con. ml
-1
6,5 bc
0,0 a 0,0 a 0,0 a
10
8
con. ml
-1
13,0 d
0,0 a 0,0 a 0,0 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
Os isolados de Isaria somente causaram mortalidade nas larvas de B. microplus no 10º
dia após o tratamento, e esse percentual foi inferior ao causado pelo isolado de L. lecanii. A
variação encontrada no percentual de mortalidade das larvas foi de 6 a 56% para I. farinosa e
5,5% para I. fumosorosea, enquanto que a menor concentração de conídios do isolado de L.
lecanii causou mortalidade de 18,5% das larvas e a maior concentração demonstrou
percentual de mortalidade de 82,2% das larvas tratadas (Tab.15).
Dois isolados de I. fumosorosea tiveram sua ação avaliada sobre larvas não
alimentadas de R. sanguineus (Samish et al., 2001). Os resultados obtidos por esses autores
mostraram que os isolados causaram percentual de mortalidade das larvas inferior a 10%, sete
dias após o tratamento. Esses dados foram similares aos encontrados neste trabalho, em que o
isolado de I. fumosorosea causou apenas 5,5% de mortalidade no 10º dia após o tratamento.
Os dois isolados estudados por Samish et al. (2001) não demonstraram efeito patogênico
sobre larvas alimentadas de R. sanguineus 10 dias após inoculação, ratificando que na maioria
das vezes, estágios imaturos não alimentados são mais susceptíveis à infecção causada pelo
fungo que o seu estágio alimentado correspondente (GINDIN et al., 2002).
Esses mesmos isolados estudados por Samish et al. (2001) provocaram cerca de 15%
de mortalidade de ninfas alimentadas e não alimentadas, sete dias após a inoculação. Por ter
sido pouco patogênico para os estágios imaturos de R. sanguineus, os autores não testaram a
patogenicidade dos isolados de I. fumosorosea sobre adultos dessa espécie de carrapato.
34
Tabela 15. Percentual de mortalidade das larvas não alimentadas de Boophilus microplus no
10º dia após o tratamento com as diferentes concentrações de conídios dos fungos
entomopatogênicos Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1
ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a
10
5
con. ml
-1
18,5 b 0,0 a 0,0 a 0,0 a
10
6
con. ml
-1
43,5 c 6,0 b 0,0 a 0,0 a
10
7
con. ml
-1
73,0 d 13,0 c 0,0 a 0,0 a
10
8
con. ml
-1
82,2 d 56,0 d 5,5 b 0,0 a
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
O isolado de P. lilacinus demonstrou seu efeito sobre larvas somente no 15º dia após
tratamento, causando mortalidade de apenas 13,0% das larvas tratadas com a maior
concentração de conídios. O percentual de mortalidade das larvas variou de acordo com a
concentração utilizada e o fungo testado: 32% e 94,4% quando o tratamento foi realizado com
L. lecanii; 2,0 e 89,5% quando se testou o isolado de I. farinosa e 1,0 e 17,0% quando I.
fumosorosea foi testada (Tab.16).
Tabela 16. Percentual de mortalidade das larvas não alimentadas de Boophilus microplus no
15º dia após o tratamento com as diferentes concentrações de conídios dos fungos
entomopatogênicos Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1
ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a
10
5
con. ml
-1
32,0 b 2,0 a 1,0 a 0,5 ab
10
6
con. ml
-1
78,0 c 16,5 b 1,5 a 1,0 ab
10
7
con. ml
-1
85,0 d 46,0 c 5,5 b 5,5 b
10
8
con. ml
-1
94,4 d 89,5 d 17,0 c 13,0 c
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
Somente o isolado de L. lecanii foi capaz de causar o máximo percentual de
mortalidade das larvas, quando utilizada a maior concentração no 20º dia após o tratamento.
Resultados similares foram obtidos com o isolado de I. fumosorosea, que causou 98,5% de
mortalidade. Em todos os isolados, o percentual de mortalidade foi maior à medida que se
aumentava a concentração de conídios (Tab.17).
35
Tabela 17. Percentual de mortalidade das larvas não alimentadas de Boophilus microplus no
20º dia após o tratamento com as diferentes concentrações de conídios dos fungos
entomopatogênicos Lecanicillium, Isaria e Paecilomyces mantidas sob temperatura de 27 ± 1
ºC e umidade relativa = 90%*.
L. lecanii I. farinosa I. fumosorosea P. lilacinus
Controle 1,0 a 1,0 a 1,0 a 1,0 a
10
5
con. ml
-1
42,0 b 10,0 b 6,0 b 3,0 ab
10
6
con. ml
-1
94,5 c 26,0 c 4,5 b 5,5 b
10
7
con. ml
-1
98,5 d 66,0 d 24,0 c 31,5 c
10
8
con. ml
-1
100,0 d 98,5 e 56,0 d 67,5 d
* Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si pelo teste t de
Student (p=0,05).
Comparando o isolado CG 420 de L. lecanii com os demais isolados estudados, nota-
se que em todas as concentrações testadas, e independente dos diferentes dias de observação,
este isolado causou o maior percentual de mortalidade das larvas (Fig.11, 12, 13 e 14).
Portanto, o isolado CG 420 de L. lecanii foi mais patogênico para larvas não alimentadas de
B. microplus do que os isolados CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e CG
36 de Paecilomyces lilacinus.
Percentual de Mortalidade de Larvas
Concentração 10
5
con. mL
-1
0
20
40
60
80
100
5º dia 10º dia 15º dia 20º dia
Nº dias pós-tratamento
% mortalidade
CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 11. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
5
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e
CG 36 de Paecilomyces lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-
tratamento.
36
Percentual de Mortalidade de Larvas
Concentração 10
6
con. mL
-1
0
20
40
60
80
100
5º dia 10º dia 15º dia 20º dia
Nº dias pós-tratamento
% mortalidade
CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 12. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
6
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e
CG 36 de Paecilomyces lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-
tratamento.
Percentual de Mortalidade de Larvas
Concentração 10
7
con. mL
0
20
40
60
80
100
5º dia 10º dia 15º dia 20º dia
Nº dias pós-tratamento
% mortalidade
CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 13. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
7
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e
CG 36 de Paecilomyces lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-
tratamento.
37
Percentual de Mortalidade de Larvas
Concentração 10
8
con. mL
-1
0
20
40
60
80
100
5º dia 10º dia 15º dia 20º dia
Nº dias pós-tratamento
% mortalidade
CG 420 CG 198 CG 202 CG 36
Figura 14. Percentual de mortalidade das larvas de Boophilus microplus
tratadas com a concentração 10
8
conídios ml
-1
dos isolados CG 420 de
Lecanicillium lecanii, CG 198 de Isaria farinosa, CG 202 de I. fumosorosea e
CG 36 de Paecilomyces lilacinus, demonstrado em diferentes dias pós-
tratamento.
Bittencourt et al. (1996) avaliaram o efeito patogênico dos isolados 986 e 747 de B.
bassiana sobre larvas de B. microplus. A observação do percentual de mortalidade das larvas
foi realizada 10 dias após o tratamento. Os dois isolados causaram considerável mortalidade
das larvas, que variou entre 18,8% e 88%, enquanto que o percentual de mortalidade do grupo
controle variou entre 13% e 16,5%. Os valores obtidos com o fungo L. lecanii no presente
trabalho são similares aos observados pelos autores supracitados, que consideraram os dois
isolados de B. bassiana como sendo patogênicos para o carrapato. Sendo assim, podemos
considerar o isolado CG 420 de L. lecanii patogênico para larvas B. microplus.
Polar et al. (2005) ao avaliarem o efeito de M. anisopliae, Simplicillium lamellicola e
I. farinosa sobre fêmeas ingurgitadas, ovos e larvas de B. microplus observaram que os
melhores resultados foram obtidos com o fungo M. anisopliae. Como parâmetros de
avaliação, foram observados o tempo médio de sobrevivência das fêmeas e das larvas e o
tempo médio de eclodibilidade das larvas oriundas do tratamento de ovos. Esses autores
verificaram que o isolado de I. farinosa não se mostrou patogênico para nenhuma das fases
testadas do desenvolvimento de B. microplus 21 dias após o tratamento.
O presente trabalho mostra o efeito patogênico de I. farinosa sobre larvas no 10º dia
após o tratamento, enquanto que no 20º dia após o tratamento, a mortalidade observada
chegou próximo de 100%. Essa diferença pode ser atribuída ao isolado fúngico utilizado,
como também às distintas metodologias empregadas para a avaliação do fungo sobre os
diferentes estágios do carrapato. Polar et al. (2005) utilizaram concentração de conídios
menor quando comparada com a utilizada no presente trabalho, além de menor tempo de
exposição das fêmeas, ovos e larvas.
Os isolados de I. fumosorosea e L. lecanii estudados por Gindin et al. (2001) não
mostraram diferenças significativas sobre o percentual de mortalidade de larvas não
alimentadas de B. annulatus quando comparados com o grupo controle. As observações foram
realizadas nos dias três e seis após inoculação. Embora a metodologia empregada para o
tratamento das larvas tenha sido distinta, esses resultados corroboram os obtidos nesse
bioensaio com o isolado de I. fumosorosea, uma vez que a mortalidade das larvas só foi
38
observada 10 dias após o tratamento. Porém, os dados observados com o isolado de L. lecanii
diferem dos encontrados neste bioensaio, uma vez que a concentração 10
8
conídios ml
-1
foi
capaz de provocar 13% de mortalidade das larvas no 5º dia após o tratamento.
As concentrações letais (CL
50
e CL
90
) das suspensões de conídios dos diferentes
entomopatógenos, nos diferentes dias após tratamento, estão demonstradas na tabela 18.
Pode-se observar que o isolado CG 420 de L. lecanii foi capaz de causar mortalidade de 50%
e 90% das larvas de B. microplus utilizando uma menor concentração de conídios, quando
comparado com os demais isolados.
Tabela 18. Valores das concentrações letais (CL
50
e CL
90
) dos isolados de Lecanicillium,
Isaria e Paecilomyces obtidos através da avaliação do percentual de mortalidade de larvas não
alimentadas de Boophilus microplus nos diferentes dias de observação.
Dias após tratamento
Fungos
5 10 15 20
CL
50
1,16 × 10
14
1,96 × 10
7
2,47 × 10
6
1,16 × 10
4
L. lecanii
CL
90
7,4 × 10
19
2,15 × 10
9
1,81 × 10
8
1,35 × 10
7
CL
50
-
8,98 × 10
8
9,22 × 10
7
3,11 × 10
7
I. farinosa
CL
90
-
2,57 × 10
10
1,41 × 10
9
4,87 × 10
8
CL
50
-
9,05 × 10
14
7,45 × 10
10
8,55 × 10
8
I. fumosorosea
CL
90
-
2,83 × 10
19
1,97 × 10
13
5,52 × 10
10
CL
50
- -
2,63 × 10
11
3,54 × 10
8
P. lilacinus
CL
90
- -
1,39 × 10
14
8,14 × 10
9
Os valores da CL
50
dos isolados CG 420 de L. lecanii e CG 198 de I. farinosa obtidos
no 15º dia após tratamento foram menores do que os encontrados por Reis et al. (2001)
quando estudaram o efeito in vitro de três isolados de M. anisopliae sobre ninfas não-
alimentadas de Amblyomma cajennense. Todos os isolados utilizados no presente trabalho
apresentaram valores de CL
90
menores do que os encontrados por Reis et al. (2001). Esses
resultados podem ser explicados pela diferença de patogenicidade entre as espécies dos
entomopatógenos utilizados e/ou pela espécie e estágio dos carrapatos e demonstram que os
isolados CG 420 de L. lecanii e CG 198 de I. farinosa apresentam potencial para o controle
microbiano in vitro de larvas de B. microplus, uma vez que as concentrações conidiais 2,47 ×
10
6
conídios ml
-1
e 1,81 × 10
8
conídios ml
-1
, 9,22 × 10
7
conídios ml
-1
e 1,41 × 10
9
conídios ml
-1
relativos às CL
50
e CL
90
, respectivamente (Tab.18), são facilmente preparadas em laboratório.
Bittencourt et al. (1996) avaliaram o efeito do contato de dois isolados de B. bassiana
sobre larvas de B. microplus, no décimo dia após o tratamento, e observaram que o percentual
de mortalidade das larvas variou entre 13,0% e 88,0%, proporcionando uma CL
50
e CL
90
de
6,83 × 10
6
conídios ml
-1
e 5,95 × 10
8
conídios ml
-1
, respectivamente para o isolado 986 de B.
bassiana, e 1,01 × 10
7
conídios ml
-1
e 1,15 × 10
9
conídios ml
-1
, respectivamente, para o
isolado 747. Os valores das concentrações conidiais letais encontrados para o isolado CG 420
de L. lecanii (Tab.18) são similares aos descritos por Bittencourt et al. (1996), que
consideraram o entomopatógeno B. bassiana patogênico para larvas de B. microplus.
39
Portanto, o isolado CG 420 de L. lecanii pode ser considerado patogênico para larvas de B.
microplus sob condições ideais.
4.6. Reisolamento dos Entomopatógenos após Bioensaio
Amostras de quenóginas, ovos e larvas dos grupos tratados com as diferentes
concentrações conidiais dos entomopatógenos I. farinosa, I. fumosorosea, P. lilacinus e L.
lecanii incubadas em câmara úmida apresentaram desenvolvimento de colônias fúngicas. Tais
colônias foram avaliadas quanto as suas características macro e micromorfológicas e
identificadas como sendo as mesmas espécies de fungos utilizadas no bioensaio com fêmeas
ingurgitadas, ovos e larvas não alimentadas de B. microplus, comprovando que os
entomopatógenos utilizados nos bioensaios foram responsáveis pela infecção nos carrapatos.
As amostras de quenóginas, ovos e larvas do grupo controle que foram mantidas em
câmara úmida, sob as mesmas condições das amostras dos grupos tratados, não apresentaram
desenvolvimento de colônias fúngicas.
Gindin et al. (2001) após realizar tratamento de fêmeas ingurgitadas de B. annulatus
com suspensões de nove fungos entomopatogênicos observaram a colonização das superfícies
dorsal e ventral dos cadáveres por M. anisopliae e M. flavoviridae (= M. anisopliae var.
acridum). Em contrapartida, os autores relatam que os isolados de B. bassiana e I.
fumosorosea normalmente não emergem da cutícula do carrapato e sim através das aberturas
naturais, e que o isolado de L. lecanii testado não colonizou a superfície das fêmeas mortas, já
que não apresentaram sinais típicos da infecção fúngica.
No presente estudo, foi observado a colonização fúngica da cutícula de fêmeas
ingurgitadas no 10º dia após o tratamento. As figuras 15, 16 e 17 ilustram fêmeas de B.
microplus do grupo controle, e dos grupos tratados com a concentração 10
8
conídios ml
-1
dos
isolados de L. lecanii e I. farinosa, respectivamente.
40
Figura 15. Fêmeas de Boophilus microplus
pertencentes ao grupo controle, 10 dias após
tratamento.
Figura 16. Fêmeas de Boophilus microplus
pertencentes ao grupo tratado com a concentração
10
8
conídios ml
-1
de Lecanicillium lecanii, 10 dias
após o tratamento.
Figura 17. Fêmeas de Boophilus microplus
pertencentes ao grupo tratado com a concentração
10
8
conídios ml
-1
de Isaria farinosa, 10 dias após o
tratamento.
41
5. CONCLUSÕES
Os isolados CG 420 de L. lecanii, CG 198 de I. farinosa, CG 36 de P. lilacinus e CG
202 de I. fumosorosea interferem na biologia de fêmeas ingurgitadas de B. microplus
mediante bioensaio in vitro.
O isolado CG 202 de I. fumosorosea promove o maior percentual de controle de
fêmeas ingurgitadas de B. microplus, em laboratório, seguido pelos isolados CG 420 de L.
lecanii, CG 198 de I. farinosa e CG 36 de P. lilacinus.
Os isolados CG 420 de L. lecanii, CG 198 de I. farinosa e CG 202 de I. fumosorosea
são patogênicos para ovos de B. microplus sob condições de laboratório.
O isolado CG 36 de P. lilacinus não é patogênico para ovos de B. microplus mediante
tratamento in vitro.
Os isolados CG 420 de L. lecanii, CG 198 de I. farinosa, CG 36 de P. lilacinus e CG
202 de I. fumosorosea causam mortalidade em larvas não alimentadas de B. microplus sob
condições ideais de temperatura e umidade.
42
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