( PDF ) Anticorpo monoclonal anti-AFB1: coluna de imunoafinidade e espectrofluorimetria para controle de qualidade de alimentos

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Centro de Ciências Agrárias

Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos

Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos

ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-AFB

COLUNA DE IMUNOAFINIDADE E

ESPECTROFLUORIMETRIA PARA CONTROLE

DE QUALIDADE DE ALIMENTOS

LUCIANA HAYASHI

Londrina - PR

2007

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Centro de Ciências Agrárias

Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos

Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos

ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-AFB

COLUNA DE IMUNOAFINIDADE E

ESPECTROFLUORIMETRIA PARA CONTROLE

DE QUALIDADE DE ALIMENTOS

Dissertação apresentada ao Programa de

Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos

da Universidade Estadual de Londrina, como

requisito parcial à obtenção do título de Mestre

em Ciência de Alimentos.

Luciana Hayashi

Orientadora: Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka

Londrina - PR

2007

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BANCA EXAMINADORA

____________________________________________

Profa. Dra. Myrna Sabino

____________________________________________

Profa. Dra. Eiko Nakagawa Itano

____________________________________________

Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka

Londrina, 22 de junho de 2007.

Dedicatória

A Deus, por estar sempre presente em minha vida, me proporcionando

saúde, força, ânimo e coragem para a realização deste trabalho;

Aos meus queridos pais, Nelson e Misako, por acreditarem em mim e

me incentivarem, com muito amor e carinho, a nunca desistir dos

meus sonhos, estando presentes em todos os momentos,

não fisicamente, mas em meu coração.

Aos meus irmãos, Daniela, Marcos e Rafael, por estarem sempre ao

meu lado, me confortando, ouvindo minhas reclamações

e me ajudando a alcançar meus objetivos.

Ao Rogerio, por todo amor, compreensão e apoio dedicados a mim

nesta longa caminhada, sendo fundamental em minha vida

e na concretização desta etapa.

AGRADECIMENTOS

À Professora Dra. Elisa Yoko Hirooka, pela orientação, paciência, incentivo, valiosos

ensinamentos, por me fazer acreditar que este trabalho seria possível, meus sinceros

agradecimentos.

À Universidade Estadual de Londrina e aos professores do Depto.Ciência de Alimentos,

pelos preciosos ensinamentos e colaboração durante o desenvolvimento do mestrado;

À Chefia e Coordenadoria do Curso de Pós-graduação, pela atenção e colaboração;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela

concessão da bolsa de mestrado e apoio financeiro;

Ao CNPq, pelo apoio financeiro com os projetos proc. n. 506334/2004-0 e n. 473711/03-6, e

SETI-UFG-Fundo Paraná com o projeto CV. 33/04-Prot. n.88;

Ao Dr. Osamu Kawamura de Kagawa University, Japão, pelo fornecimento de

hibridoma AF4, pela orientação e valiosas informações sobre produção de reagentes

imunológicos, sem os quais este trabalho não seria possível;

À Profa. Dra. Eiko Nakagawa Itano, pela valiosa orientação, auxílio no

desenvolvimento técnico, utilização do laboratório de imunologia e empréstimo de materiais para

confecção de coluna de imunoafinidade;

Aos membros titulares da banca examinadora, Dra. Myrna Sabino e Dra. Eiko N. Itano,

pelas valiosas sugestões que contribuíram para o aprimoramento da dissertação;

À Profa. Dra. Elisabete Yurie Sataque Ono, pela orientação, apoio e esclarecimentos de

dúvidas no decorrer do trabalho;

À Profa. Dra. Tereza Cristina Rocha Moreira de Oliveira, pela colaboração e

empréstimo de material para cultivo de células;

À Doutora e amiga Simone Fujii, pelos preciosos ensinamentos, apoio, colaboração,

prontidão em esclarecer dúvidas, ajuda em momentos imprescindíveis e, sobretudo, pela amizade

verdadeira que construímos nestes anos de convivência;

Aos amigos Letícia Schiavo, Joice Sifuentes dos Santos, Cleiton Ramos e Tatiane de

Oliveira, pelo auxílio prestado no cultivo de células, produção de anticorpos e demais

experimentos, colaboração, alegria e amizade;

À amiga Aniê Ieda Francabandiera, por toda ajuda prestada, pelo companheirismo,

colaboração, apoio, incentivo, esclarecimentos de dúvidas de experimentos, e principalmente

pelo carinho e amizade de sempre;

Às amigas “Florzeras”, Michele Rosset, Luciane Yuri Yoshiara, Suellen Jensen, Maike

Taís Maziero, Renata Dinnies Santos, Roselane Langer, Tatiana dos Santos, pelo precioso apoio,

colaboração, dicas, companheirismo e, sobretudo, amizade;

Aos amigos Elisabete Hashimoto, Cláudio Ueno, Adriana da Silva, Caroline Calliari,

Ricardo Reche Ribeiro, pela colaboração, ajuda, apoio, dicas, alegria e amizade;

À Patrícia Sambatti e Marli, pela preciosa ajuda no laboratório, com reagentes, pedidos

e favores, carinho e amizade;

A todos os funcionários e técnicos do Depto. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Nelson,

Rubens, Célia, Irene, Alessandra, Sandra Rezende, Berenice e Elza Youssef, por me prestarem

ajuda quando necessário;

Aos pós-graduandos e funcionários do Depto. Ciências Patológicas, em especial ao

Alexandre Sasaki, Juliana, Fernanda, Nilson e Mari, pela ajuda e colaboração;

Aos amigos e colegas, Luciana Bernd, Elaine Moreno, Alexandre Morey, Luiz Morioka,

Rafael Dias, Ana Augusta Xavier, Luciana Lobato, Alexandre Azevedo, Norma Pimentel, Magali

Maganhini, Mery Rendón, Denis Marchi, Miriam, Eduardo Toledo, pelo companheirismo e

momentos de alegria, que suavizaram os dias árduos de trabalho;

Aos meus grandes e queridos amigos, Gisele Carvalho, Douglas Gallo, Roberta

Uherara, Jhonatan Liberato, Andréa Sera, Fernanda Komatsu, Kelcilene Nakamura, Alberto

Duran, Vera Tatakihara, Alessandra Okino, Camila Brito, Aluísio Kreling, Saulo Godoy, Jorge

Sassaki, Thaís Matheus, Aline Matheus, Sílvia Schmith, Eduardo Neri, que tanto me deram força,

apoio, carinho e amizade, dentro e fora da universidade, e que moram em meu coração;

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho;

Aos meus familiares, em especial à minha prima Renata Nishimura, minha tia Nobue

Taniguti e ao meu futuro cunhado Renato Banja, pelo apoio e incentivo constante, carinho, amor

e amizade;

Ao meu querido namorado Rogerio Hashimoto, pelo apoio, paciência, compreensão,

força, carinho, amizade, amor e felicidade proporcionados a mim, servindo de estímulo para a

concretização do mestrado;

À Daniela, Marcos e Rafael Hayashi, meus queridos irmãos, pelo apoio, carinho,

compreensão, alegria e amizade dedicados a mim;

Aos meus amados e queridos Pais, Nelson Yukio e Misako Taniguti Hayashi, por todo

incentivo, apoio, amor, dedicação e esforços realizados para minha formação profissional;

A Deus, sobretudo, por ter me concedido o direito à vida, e a oportunidade de conviver

com pessoas maravilhosas, fazendo minha vida valer a pena.

"É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar;

é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final.

Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder.

Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver ..."

Martin Luther King

SUMÁRIO

RESUMO ....................................................................................................................................i

ABSTRACT ...............................................................................................................................ii

LISTA DE SIGLAS ..................................................................................................................iii

LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................................iv

LISTA DE TABELAS ...............................................................................................................v

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .........................................................................................3

2.1 A

FLATOXINA..................................................................................................................3

2.2 M

ETODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETECÇÃO DE AFLATOXINA......................................10

2.3 COLUNA DE IMUNOAFINIDADE PARA DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINA........................15

2.4 ANTICORPO PARA TÉCNICAS IMUNOQUÍMICAS .............................................................18

3 OBJETIVOS.....................................................................................................................22

3.1 OBJETIVO GERAL .........................................................................................................22

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..............................................................................................22

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................23

4.1 MATERIAL....................................................................................................................23

4.2 PRODUÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL IgG ANTI-AFB

..........................................24

4.2.1 Linhagem de célula de hibridoma ........................................................................24

4.2.2 Recepção e cultivo de hibridoma..........................................................................24

4.2.3 Contagem e análise de viabilidade celular ...........................................................25

4.2.4 Manutenção e recuperação de hibridoma .............................................................25

4.2.5 Produção de AcM IgG a partir de cultivo de hibridoma em meio sintético.........26

4.2.6 Purificação parcial de anticorpo monoclonal IgG anti-AFB

...............................27

4.3 D

ESENVOLVIMENTO DA COLUNA DE IMUNOAFINIDADE (CIA) PARA DETECÇÃO DE AFB

EMPREGANDO

ACM ANTI-AFB

.............................................................................................28

4.3.1 Preparo da CIA Affi-Gel 10: acoplamento aquoso ..............................................28

4.3.2 Manutenção de CIA Affi-Gel 10..........................................................................29

4.3.3 Avaliação da eficiência de acoplamento de AcM à CIA Affi-Gel 10..................29

4.3.4 Determinação da capacidade de retenção de AFB

em CIA Affi-Gel 10.............29

4.4 TESTE DE RECUPERAÇÃO DE AFB

EM CIA AFFI-GEL 10 ............................................30

4.4.1 Contaminação de milho com AFB

......................................................................30

4.4.2 Extração de AFB

de milho contaminado ............................................................30

4.4.3 Limpeza de extrato bruto pela CIA ......................................................................31

4.4.4 Determinação de AFB

por espectrofluorimetria.................................................31

4.4.5 Regeneração de CIA.............................................................................................31

4.5 COMPARAÇÃO ENTRE ESPECTROFLUORIMETRIA E CCD PARA ANÁLISE DE AFB

........32

4.5.1 Contaminação de milho com AFB

......................................................................32

4.5.2 Extração de AFB

de milho contaminado ............................................................32

4.5.3 Limpeza de extrato bruto pela CIA ......................................................................32

4.5.4 Quantificação de AFB

por espectrofluorimetria.................................................33

4.5.5 Determinação de AFB

por cromatografia em camada delgada (CCD)...............33

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................................34

CAPÍTULO I............................................................................................................................35

CAPÍTULO II...........................................................................................................................46

CAPÍTULO III .........................................................................................................................64

6 CONCLUSÃO..................................................................................................................75

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................76

HAYASHI, Luciana. Anticorpo monoclonal anti-AFB

: coluna de imunoafinidade e

espectrofluorimetria para controle de qualidade de alimentos. 2007. Dissertação

(Mestrado em Ciência de Alimentos) – Universidade Estadual de Londrina.

RESUMO

A freqüente ocorrência de aflatoxina em produtos agrícolas causa impacto negativo no

agronegócio brasileiro. A aflatoxina tem sido classificada em grupo 1 por International

Association in Research on Cancer. A produção de imunorreagentes aliada ao

desenvolvimento de métodos imunoquímicos possibilitariam o controle de qualidade acessível

e de baixo custo, visando prevenção de contaminação e fornecimento de alimentos seguros ao

consumidor. Considerando a necessidade em minimizar a dependência de importação de kits

imunoquímicos para análise avançada de resíduos tóxicos na rotina laboratorial, introduziu-se

a tecnologia de produção de anticorpo monoclonal (AcM) empregando hibridoma linhagem

AF4, secretor de IgG específico para aflatoxina B

(AFB

). O cultivo celular em meio

sintético resultou em 632,63 mg de IgG purificada (82,18 µg/mL), superando a expectativa da

obtenção de AcM descrito na literatura (50,00 µg/mL), sendo este atingido devido ao uso de

L-glutamina e cultivo até morte celular. O AcM anti-AFB

semi-purificado e liofilizado foi

utilizado na confecção da coluna de imunoafinidade (CIA) empregando suporte gel ativado

Affi-Gel 10. A CIA Affi-Gel 10 de 0,5 mL apresentou capacidade de retenção de 25,32 ng de

AFB

, sendo a toxina eluída com 15 mL de metanol. Para quantificação empregou-se a

espectrofluorimetria, padronizando o comprimento de onda para 360nm de excitação e 420

nm de emissão, baseado na maior sensibilidade e estabilidade entre leituras consecutivas de

AFB

pura. A CIA Affi-Gel 10 desenvolvida não foi totalmente eficaz na limpeza de milho

artificialmente contaminado com AFB

. O capeamento da coluna ainda deve prosseguir com

ensaios de melhoria, para atingir a eficácia equivalente à da CIA comercial Aflatest-P

(VICAM) (recuperação de AFB

de 72,40 a 79,77 %). Outrossim, considerando a

especificidade comprovada de AcM anti-AFB

produzido por meio do teste de capacidade de

retenção, deve-se prosseguir estudo inserindo novas condições de capeamento de coluna e

ensaios de padronização. Quanto à reutilização de CIA comercial Aflatest-P, após

regeneração de coluna, os resultados mostraram-se variáveis, com 34,15 a 82,88 % de

recuperação de AFB

. O fato indicou que as colunas comerciais podem inferir erro de análise

se reutilizadas, contra-indicando o reuso. Em suma, a produção de AcM IgG anti-AFB

foi

atingida com sucesso, sendo aconselhável proceder ultrafiltração na etapa de concentração e

manutenção a 4º C para conservar a integridade e atividade biológica do anticorpo. Assim, a

disponibilidade de AcM específico, limpeza de extrato alimentar em única etapa

cromatográfica, uso reduzido de solventes tóxicos e possibilidade de reutilização, justificam o

desenvolvimento de CIA, visando minimizar o custo referente à aquisição e aplicação no

controle de qualidade.

Palavras-chave: aflatoxina B

; anticorpo monoclonal; coluna de imunoafinidade;

espectrofluorimetria.

HAYASHI, Luciana. Monoclonal antibody against AFB

: immunoaffinity column and

spectrofluorimetry in food quality control. 2007. Master Degree (Dissertation on Food

Science) – Universidade Estadual de Londrina.

ABSTRACT

The frequent occurrence of aflatoxin in foodstuffs causes a potential negative impact on

Brazilian agribusiness. Aflatoxin has been classified in group 1 by International Association

in Research on Cancer. The production of immunoreagents associated with immunochemical

assay developments could allow accessible and low cost quality control aiming prevention of

contamination and safe food supply to consumers. Considering the need in minimizing the

dependence on immunochemical kits imports, which are essential to carry out advanced toxic

residues analysis routinely in laboratories, the technology of monoclonal antibody (mAb)

using hybridoma cell line AF4 that produces IgG against aflatoxin B

(AFB

) was introduced.

Cell culture in synthetic medium raised 632.63 mg of purified IgG (82.18 µg/mL),

overcoming the expectation described in literature, i.e. 50.00 µg/mL of mAb, due to the use of

L-glutamine and cell culture until death. Semi-purified and lyophilized mAb against AFB

was used to prepare the immunoaffinity column (IAC) using activated Affi-Gel 10

immunoaffinity support. IAC Affi-Gel 10 coupled with 0.5 mL of IgG-gel showed an AFB

retention capacity of 25.32 ng, with further toxin elution from IAC with 15 mL of methanol.

Spectrofluorimetry was used to quantify the AFB

, where the excitation and emission

wavelengths were standardized to 360 and 420 nm, respectively, which were selected based

on the best sensibility and stability through consecutive readings of pure AFB

. The IAC Affi-

Gel 10 developed was not totally efficient concerning the cleaning-up of artificially

contaminated corn with AFB

. The end-capping procedure must be continued to reach the

effectiveness which is equivalent to the commercial IAC Aflatest-P (VICAM) (recovery of

72.40 to 79.77 %). Nevertheless, taking into account the specific activity of mAb against

AFB

, checked by the AFB

retention capacity test, the following study should insert new

conditions concerning column end-capping and standardizing assays. The reusability of IAC

Aflatest-P was evaluated after column regeneration, but the data were variable, reaching 34.15

to 82.88 % for AFB

recovery. Such data showed that the reuse of commercial IAC may lead

to analysis error. In short, the production of mAb against AFB

was successfully reached. It is

also recommended a further procedure using ultrafiltration at the concentration step and

antibody maintenance at 4º C to keep its integrity and biological activity. Therefore, the

availability of specific mAb, cleaning-up of food matrices extract in a single chromatographic

step and also toxic solvents reduced usage and their possible reusability justify the IAC

development bearing in mind the reduction in quality control costs.

Key-words: aflatoxin B

; monoclonal antibody; immunoaffinity column; spectrofluorimetry.

iii

LISTA DE SIGLAS

Acs

AcM

AcMs

AFs

AFB

AFG

AFM

Ag-Ac

ANVISA

AOAC

BSA

CCD

CIA

CIAs

CLAE

CNBr

DMEM

DMSO

GC-MS

HAT

HEPES

HPAC

HPLC

HPTLC

H-SFM

IAPAR

IC-ELISA

IgG

KLH

LC-MS

MFC

MSPD

OVA

PBS

RPMI

SFB

SFE

SPE

WHO

2D-CCD

Anticorpo

Anticorpos

Anticorpo Monoclonal

Anticorpos Monoclonais

Aflatoxinas

Aflatoxina B

Aflatoxina G

Aflatoxina M

Antígeno-Anticorpo

Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Association of Official Analytical Chemists

Albumina de soro bovino

Cromatografia em Camada Delgada

Cromatografia Gasosa

Coluna de Imunoafinidade

Colunas de Imunoafinidade

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Brometo cianogênico

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

Dimetil-sulfóxido

Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massa

Meio Dulbecco’s modified Eagle’s, contendo 100 µM de hipoxantina, 0,4

µM de aminopterina e 16 µM de timidina

(N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])

Cromatografia por Afinidade de Alta Resolução

High Performance Liquid Chromatography

Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficiência

Meio Hybridoma-SFM (serum free medium)

Instituto Agronômico do Paraná

Indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay

Imunoglobulina G

Keyhole limpet hemocyanin

Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa

Coluna multifuncional

Matrix solid-phase dispersion

Ovoalbumina

Tampão fosfato de sódio

Meio RPMI 1640

Soro fetal bovino

Supercritical-fluid extraction

Solid-phase extraction

Radiação ultravioleta

Organização Mundial de Saúde

Cromatografia em Camada Delgada de duas dimensões

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura de aflatoxinas.............................................................................................8

Figura 2 – Estrutura de aflatoxina M

(AFM

) e aflatoxina M

(AFM

) ...................................8

Figura 3 – Mecanismo de ação de AFB

: início do processo de mutagênese no DNA..............9

Figura 4 – Estrutura de aflatoxina Q

e P

..................................................................................9

Figura 5 – Procedimento de limpeza de amostra em coluna de imunoafinidade .....................18

Figura 6 – Produção de anticorpo monoclonal.........................................................................21

Figura 7 – Estrutura de AFB

-oxime........................................................................................21

Figura 8 – Ligação de AFB

-oxime à proteína.........................................................................21

Figura 9 – Reação de acoplamento de suporte Affi-Gel com ligante contendo grupamento

amina livre................................................................................................................................28

Figura 10 – Estrutura de aflatoxicol I.......................................................................................41

Figura 11 – Recepção, reativação, adaptação, manutenção e cultivo de hibridoma AF4, com

produção de anticorpo monoclonal anti-AFB

.........................................................................44

Figura 12 – Vista microscópica de células de hibridoma AF4 em meio Hybridoma-SFM .....44

Figura 13 – Viabilidade de hibridoma AF4 por microscopia utilizando corante vital Azul de

Trypan.......................................................................................................................................45

Figura 14 – Purificação parcial de anticorpo monoclonal anti-AFB

por precipitação com

(NH

)

................................................................................................................................55

Figura 15 – Desenvolvimento de coluna de imunoafinidade utilizando anticorpo monoclonal

anti-AFB

e suporte Affi-Gel 10 ..............................................................................................56

Figura 16 – CIA 1 anti-AFB

confeccionada com 3 mL de Affi-Gel 10 .................................61

Figura 17 – CIA anti-AFB

confeccionada com 0,5 mL de Affi-Gel 10 .................................61

Figura 18 – Comportamento da fluorescência de AFB

com a variação de comprimento de

onda de excitação e emissão.....................................................................................................62

Figura 19 – Variação da fluorescência de AFB

em função do tempo, utilizando 360 e 420 nm

..................................................................................................................................................63

Figura 20 – CIA anti-AFB

confeccionada com 0,5 mL de Affi-Gel 10 .................................69

Figura 21 – CIA comercial Aflatest-P (VICAM).....................................................................69

Figura 22 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo

prolongado (30 min) e limpeza de amostra em CIA Aflatest-P e CIA Affi-Gel 10.................70

Figura 23 – Teste de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo reduzido (1

min) e limpeza de amostra em CIA Aflatest-P e CIA Affi-Gel 10 ..........................................71

Figura 24 – Variação da taxa de recuperação de AFB

em função da intensidade de

fluorescência.............................................................................................................................73

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Reatividade cruzada de AcM produzido por hibridoma AF4 em IC-ELISA .........41

Tabela 2 – Viabilidade celular de hibridoma AF4 em diferentes condições de cultivo celular e

tempo de manutenção a -185º C...............................................................................................42

Tabela 3 – Proteína (IgG) produzida em cultivo de hibridoma AF4........................................57

Tabela 4 – Comparação entre os processos de purificação de anticorpo monoclonal dos

sobrenadantes 5 e 6...................................................................................................................57

Tabela 5 – Teste preliminar de capacidade de retenção de AFB

pela CIA Affi-Gel 10.........58

Tabela 6 – Determinação de proteína (IgG) acoplada à CIA Affi-Gel 10 ...............................58

Tabela 7 – Capacidade de retenção de AFB

pela CIA Affi-Gel 10 considerando diferentes

comprimentos de onda de excitação e emissão na análise espectrofluorimétrica....................59

Tabela 8 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo

prolongado (30 min) e limpeza de amostra em CIA Affi-Gel 10.............................................59

Tabela 9 – Teste de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo reduzido (1 min)

e limpeza de amostra em CIA Affi-Gel 10...............................................................................60

Tabela 10 – Teste de recuperação de AFB

em milho com limpeza de amostra em CIA Affi-

Gel 10 capeada com glicina-etil-éster ou leite desnatado.........................................................60

Tabela 11 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo

prolongado (30 min) e limpeza de amostra em CIA comercial Aflatest-P ..............................72

Tabela 12 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo

prolongado (30 min) e limpeza de amostra em CIA Affi-Gel 10.............................................72

Tabela 13 – Teste de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo reduzido (1

min) e limpeza de amostra em CIA comercial Aflatest-P........................................................72

Tabela 14 – Teste de recuperação de AFB

em milho, reutilizando CIA comercial Aflatest-P

para limpeza de amostra ...........................................................................................................73

Tabela 15 – Teste de recuperação de AFB

em milho, com extração em tempo reduzido (1

min) e limpeza de amostra em CIA Affi-Gel 10 ......................................................................74

Tabela 16 – Teste de recuperação de AFB

em milho, com limpeza de amostra em CIA Affi-

Gel 10 capeada com glicina-etil-éster ou leite desnatado.........................................................74

1 INTRODUÇÃO

A agricultura do Brasil é uma das bases mais potentes de economia do país,

que garante o fornecimento contínuo de insumos baseados em cereais, oleaginosas, hortaliças,

frutas e derivados oriundos de processamento.

A contaminação fúngica e a produção de metabólitos tóxicos constituem

fatores inevitáveis e de difícil controle, que repercutem na qualidade de matéria-prima e saúde

do consumidor. Considerando que a contaminação seja condicionada a fatores ambientais e

características inerentes do substrato, a conduta tomada tem sido o controle de fitopatógenos

baseado em fungicidas químicos e técnicas alternativas, com ênfase ao emprego de

microrganismos inócuos à saúde humana, aprofundando-se para inserção de genes de

interesse (modificação genética de matéria-prima) e mecanismos naturais de defesa da planta

(compostos biativos). O fato fundamenta-se na maior inocuidade dos determinantes

intrínsecos de vegetais, perante agressividade ao ecossistema e à saúde humana.

A relevância de fungos toxigênicos na cadeia alimentar é direcionada a

espécies que contaminam produtos agrícolas nas etapas de pós-colheita, a exemplo de

Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, produtores de aflatoxinas (AFs). As propriedades

toxicológicas desta micotoxina resumem-se em efeitos carcinogênicos, mutagênicos,

teratogênicos e imunossupressivos, incluindo toxicidade aguda e crônica.

As técnicas convencionais para proceder à análise de micotoxina incluem

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia em camada delgada (CCD),

cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), cromatografia líquida-

espectrometria de massa (LC-MS), cromatografia por afinidade e imunoensaio. A CLAE

constitui a técnica recomendada para determinação quantitativa de micotoxinas-ficotoxinas.

Porém o alto custo de equipamento e manutenção, necessidade de técnica especializada e

extrema limpeza de extrato, restringem a disseminação na rotina laboratorial. A exigência de

extrato límpido para análise em CLAE estimulou o desenvolvimento de técnicas de limpeza,

envolvendo colunas em fase sólida para remoção de interferentes. Atualmente, destaca-se a

coluna de imunoafinidade preparada com anticorpos anti-micotoxinas, cuja introdução de

metodologia biológica à química conferiu rapidez, especificidade e alta recuperação na etapa

de limpeza.

Conseqüentemente, a cromatografia por imunoafinidade tem sido

amplamente difundida na análise quantitativa de micotoxinas e associada à CLAE e ELISA,

permitindo a combinação entre eficiência e especificidade da metodologia biológica à

sensibilidade e alta resolução da CLAE.

Por outro lado, em conseqüência às dificuldades inerentes aos métodos

convencionais de análise, o ensaio imunoquímico, a exemplo de ELISA, apontou entre as

técnicas alternativas atrativas e promissoras para detecção direta de micotoxinas em

alimentos. A vantagem consiste em pouca ou nenhuma necessidade de limpeza de amostra,

simplicidade, baixo custo após padronização e reprodutibilidade, oferecendo análise rápida de

triagem, resultados quantitativos com alto grau de sensibilidade e possibilidade de automação.

Entretanto, a análise por ELISA restringe-se a determinados alimentos, devido a interações

inespecíficas entre anticorpo e interferentes alimentares, resultando em superestimação em

caso de ELISA competitivo indireto para análise da AFB

. A precisão na reatividade desta

técnica depende de anticorpo específico, sendo a alta especificidade essencial para evitar

resultados falso-positivos.

A produção de anticorpo monoclonal anti-micotoxina tem despertado

interesse na análise de alimentos, com ênfase a anticorpo anti-AFB

, estando a qualidade

deste reagente imunológico relacionada ao desenvolvimento de imunoensaios sensíveis para a

micotoxicologia.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Aflatoxina

Aflatoxinas são metabólitos secundários tóxicos produzidos por Aspergillus

flavus, Aspergillus parasiticus (STROKA et al., 2000b; GARDEN & STRACHAN, 2001;

STROKA & ANKLAM, 2002; BLESA et al., 2003; AMMIDA et al., 2004; LEE et al., 2004;

VENTURA et al., 2004; EDINBORO & KARNES, 2005; LIU et al., 2006;

SALEEMULLAH et al., 2006) e Aspergillus nomius (CHIAVARO et al., 2001), capazes de

crescer em uma variedade de produtos agrícolas. Ocorrem amplamente em produtos vegetais,

especialmente milho, trigo, farinha de trigo, cevada, nozes, amêndoa, pistache, arroz, feijão,

coco, semente de algodão, pimenta-malagueta, gengibre, pimenta, pimentão-doce, frutas,

incluindo respectivos derivados, a exemplo de frutas secas, cerveja, ração, assim como

produtos de origem animal devido à ingestão de ração contaminada, citando-se ovo, produtos

lácteos e cárneos (JAIMEZ et al., 2000; STROKA et al., 2000b; CHIAVARO et al., 2001;

YONG & COUSIN, 2001; PAPP et al., 2002; BLESA et al., 2003; VENTURA et al., 2004;

LIU et al., 2006). Aspergillus flavus é o principal fungo causador de contaminação por

aflatoxina no estágio de pré-colheita (LIU et al., 2006).

O termo aflatoxina é derivado de Aspergillus flavus, cuja primeira sílaba ‘a’

vem do gênero Aspergillus, a segunda, ‘fla’, da espécie flavus, e o termo ‘toxina’ do adjetivo

‘tóxico’ (PAPP et al., 2002; SALEEMULLAH et al., 2006).

Dentre os 18 análogos identificados, os mais tóxicos têm sido aflatoxina B

(AFB

), aflatoxina B

(AFB

), aflatoxina G

(AFG

)

e aflatoxina G

(AFG

) (Figura 1), sendo

naturalmente prevalentes e rotineiramente monitorados (OTTA et al., 2000; CHIAVARO et

al., 2001; GARDEN & STRACHAN, 2001; PAPP et al., 2002; AMMIDA et al., 2004). AFB

é uma micotoxina de baixa massa molecular (312,3 Da) (PESAVENTO et al., 1997). AFB

AFB

são assim designadas por apresentarem fluorescência azul intensa sob luz ultravioleta,

enquanto que AFG

e AFG

mostram fluorescência amarelo-esverdeada (SALEEMULLAH et

al., 2006). Sendo derivado químico de difuranocumarina (Figura 1) (PAPP et al., 2002), os

análogos da série G diferem quimicamente dos da série B pela presença de um anel 3-lactona

ao invés de um anel ciclopentanona. Além disso, uma dupla ligação entre os carbonos 8 e 9 é

encontrada na forma de vinil éter no anel furano terminal em AFB

e AFG

, mas não em

AFB

e AFG

. Contudo, esta pequena diferença estrutural é associada à mudança bastante

significativa na atividade biológica, já que AFB

e AFG

são mais carcinogênicas e tóxicas

que AFB

e AFG

(JAIMEZ et al., 2000; CHIAVARO et al., 2001). Do ponto de vista

químico, a estrutura altamente conjugada e rígida da aflatoxina é responsável pela

fluorescência natural. Pequenas variações estruturais que distinguem as aflatoxinas influem

drasticamente na propriedade fluorescente, i.e. derivados G

e B

são muito mais

fluorescentes que seus homólogos insaturados B

e G

(JAIMEZ et al., 2000).

A aflatoxina exibe toxicidade aguda e crônica, incluindo efeito

carcinogênico, mutagênico, teratogênico e imunossupressivo (JAIMEZ et al., 2000;

CHIAVARO et al., 2001; PAPP et al., 2002; BLESA et al., 2003; AMMIDA et al., 2004;

EDINBORO & KARNES, 2005), sendo o fígado o principal órgão alvo (VENTURA et al.,

2004). AFB

, reconhecidamente mais tóxica, tem sido detectada como análogo predominante

em alimento (OTTA, et al., 2000; PAPP et al., 2002). A aflatoxina M

(AFM

) (Figura 2),

também conhecida como ‘toxina do leite’, constitui principal derivado metabólico de

aflatoxina em inúmeras espécies de animais, sendo produzida por hidroxilação de AFB

pelo

citocromo P450 do sistema microssomal hepático. AFM

é muito menos carcinogênica e

mutagênica que AFB

, mas possui toxicidade aguda similar ao das demais aflatoxinas.

Geralmente pode ser encontrada em leite e produtos lácteos, como leite em pó, soro,

manteiga, queijo, iogurte e sorvete, juntamente com aflatoxina M

(AFM

), que é o análogo

metabólico derivado de AFB

(CHIAVARO et al., 2001).

A determinação de aflatoxina é dificultada pela presença em baixa

concentração em matrizes alimentares complexas, apesar de ser, provavelmente, a micotoxina

mais comum perante consumo humano (VENTURA et al., 2004).

A ingestão prolongada dessas toxinas em baixa concentração também pode

ser altamente perigosa. Estes compostos podem entrar na cadeia alimentar principalmente

pela ingestão, mas também por inalação sob circunstâncias particulares, i.e. em locais de

trabalho onde produtos contaminados são manuseados. Estudos focando a detecção de

micotoxinas em fluídos biológicos tem esclarecido o mecanismo prejudicial à saúde. Após

ingestão, AFB

é biotransformada para gerar um metabólito reativo 8,9-epóxido de AFB

AFB

-epóxido (anteriormente denominado AFB

-2,3 epóxido) originado por meio de

epoxidação da dupla ligação do éter vinílico, presente na estrutura bi-furanóide da molécula

de AFB

, capaz de ligar ao DNA assim como à soroalbumina, formando aflatoxina-N

guanina e aflatoxina-N

-lisina respectivamente (Figura 3). A ligação covalente ao DNA é

considerada etapa crítica na hepatocarcinogênese da aflatoxina, sendo a detecção destes

metabólitos atingida pelo desenvolvimento de ensaio imunoenzimático (ELISA) (PAPP et al.,

2002).

Apesar de alguns autores sugerirem que a hepatocarcinogênese em humanos

não está diretamente associada à aflatoxina, a alta incidência de câncer hepático na África do

Sul, Sudeste Asiático, Coréia, Taiwan e China pode estar ligada à combinação de alta

exposição à aflatoxina na dieta com infecção pelo vírus da hepatite B (LEE et al., 2004).

Devido à biotransformação, o consumo de rações contaminadas é

responsável pela contaminação indireta por meio de alimentos de origem animal como carne,

leite e outros produtos lácteos. AFM

acumula-se no leite bovino em animal que ingeriu AFB

(JAIMEZ et al., 2000), sendo relativamente estável à pasteurização e estocagem, bem como

subseqüente processamento (BADEA et al., 2004).

A biossíntese de aflatoxina é induzida por açúcares, associada com a

ativação transcricional dos genes responsáveis e do gene regulador, aflR. A regulação da

biossíntese de aflatoxina tem sido analisada manipulando este gene. Uma super expressão

constitutiva do caminho transcricional do gene regulador aflR permitiu maior acúmulo de

transcrição de genes e aumentou a produção de aflatoxina (PAPP et al., 2002).

A ampla ocorrência de Aspergillus spp. e o alto conteúdo de carboidrato

indicam vulnerabilidade de produtos agrícolas à contaminação fúngica, não implicando,

porém, na presença de toxinas. As espécies fúngicas podem produzir aflatoxina sob condições

de estresse, que incluem alta temperatura durante o dia (25 a 30º C), baixa temperatura

durante a noite (10º C), alta umidade de armazenamento (70 a 90 %) e deficiência de

nutrientes no solo (JAIMEZ et al., 2000; PAPP et al., 2002; TARÍN et al., 2004, ABBAS, et

al., 2006).

A aflatoxicose causada pela ingestão de aflatoxina provoca dano hepático

agudo, cirrose hepática, indução de tumores, prejuízo no sistema nervoso central, desordens

de pele e defeitos hormonais, assim como a síndrome da má absorção e baixa resistência

óssea. A toxidez em animal pode ser determinada pela taxa de formação de intermediários

reativos, ligação com macromoléculas (DNA, RNA), grau de detoxificação e outras reações

competitivas (SALEEMULLAH et al., 2006).

Apesar da suscetibilidade humana à aflatoxina não ser totalmente elucidada,

estudos epidemiológicos em regiões da África e Ásia com alta incidência de hepatoma

revelaram uma associação entre incidência de câncer e aflatoxina na dieta. Severa hepatite

humana devido à aflatoxicose foi registrada na Índia em 1974, com morte de 108 de 397

pacientes que consumiram milho contaminado com 250 a 15000 ng/g de aflatoxina. A doença

conhecida como ‘Cirrose da Infância Indiana’ tem sido em parte devido ao envenenamento

por aflatoxina, assim como a ‘Síndrome de Reye’, com encefalopatia e degeneração

gordurosa de víscera em criança. Na região endêmica da Tailândia, a AFB

, AFG

e AFB

têm sido detectadas em fígado humano, sendo a presença de metabólito P

e Q

(Figura 4)

relacionada ao câncer (JAIMEZ et al., 2000).

Salienta-se o maior e mais severo surto de aflatoxicose aguda documentada

em todo o mundo ocorrida na área rural do Kenia em abril de 2004; o suto envolveu 317 casos

e 125 mortes, decorrente da ingestão de milho contaminado (LEWIS et al., 2005).

International Agency for Research on Cancer (IARC) classifica AFB

Grupo 1, i.e. como carcinógeno humano, e aflatoxinas G

, B

e G

no Grupo 2B, i.e.

prováveis carcinógenos a humano. Por ordem de toxicidade, AFB

> AFG

> AFB

> AFG

(IARC, 1993).

Limites legais a nível mundial dependem de considerações econômicas e

variam de um país para outro, mas aproximadamente 119 países têm estabelecido limites

legais para aflatoxina em alimentos e rações animais (FAO, 2004). Valores variam

amplamente e tendem a ser mais altos em países subtropicais produtores de insumos agrícolas

e mais baixos em nações consumidoras com clima temperado (CHIAVARO et al., 2001).

A Comissão Européia estabelece o nível máximo aceitável de aflatoxina em

cereais, amendoim e frutas secas para consumo humano em 4 ng/g para aflatoxina total

(expresso pela soma das concentrações de AFB

, AFB

, AFG

e AFG

), 2 ng/g para AFB

, e

0,05 ng/g para AFM

em leite. Novos limites estão sendo estabelecidos para AFB

alimento para bebês (provavelmente 0,1 ng/g) e alimento de origem animal (em discussão 1

ng/g) (GARDEN & STRACHAN, 2001; STROKA & ANKLAM, 2002; AMMIDA et al.,

2004). Os limites para alimentos processados encontram-se em 15 ng/g para aflatoxinas totais

e 8 ng/g para AFB

(GARDEN & STRACHAN, 2001).

O Comitê Científico Europeu para Alimento (European Scientific

Committee for Food) tem advertido que o nível de micotoxina em alimentos deve ser reduzido

ao nível mais baixo tecnicamente detectável. Com esse objetivo, uma nova Comissão de

Regulação No. 466/2001 impôs, em 8 de março de 2001, limite de 2 ng/g de AFB

e 4 ng/g

aflatoxina total em nozes, frutas secas e cereais para consumo humano direto (CHAN et al.,

2004; LEE et al., 2004; KOLOSOVA et al., 2006).

A Organização Mundial de Saúde (WHO) prescreve o limite de AFB

para

vários produtos alimentícios em 5 ng/g e o nível de aflatoxina total não pode exceder 10 ng/g

(PAPP et al., 2002).

No Brasil, o limite máximo de aflatoxina total permitido pelas legislações

específicas é de 20 ng/g em milho, amendoim e derivados para consumo humano, enquanto

que para AFM

em leite fluído e leite em pó o limite máximo é de 5 ng/g. (ANVISA, 2002b).

Esta legislação brasileira foi definida em consenso com MERCOSUL, com limite máximo de

aflatoxinas permitido em 20 ng/g (ANVISA, 2002a).

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, MAPA do Brasil,

adota o limite de 50 ng/g de aflatoxina total para alimento destinado ao consumo animal

(ingestão direta ou matéria crua de rações) (MAPA, 2002).

O O

OMe

AFB1

OMe

O O

AFB2

OMe

O O

AFG1

OMe

AFG2

O O

Figura 1 – Estrutura de aflatoxinas: aflatoxina B

(AFB

), aflatoxina B

(AFB

), aflatoxina G

(AFG

) e aflatoxina G

(AFG

O O

OMe

Figura 2 – Estrutura de aflatoxina M

(AFM

) e aflatoxina M

(AFM

AFB

AFG

AFM

Epoxidação (O

)

AFB

-8,9-epóxido

Adição à base

guanina do

DNA

Aflatoxina-N

-guanina

P450

AFB

Figura 3 – Mecanismo de ação de AFB

: início do processo de mutagênese no DNA.

(Fonte: IVISO; MYKOTOXINE)

O O

OCH

Figura 4 – Estrutura de aflatoxina Q

e P

2.2 Metodologia analítica para detecção de aflatoxina

A presença inevitável de fungo, associada ao difícil controle de toxinas

naturais pertencentes à categoria de micotoxina, gera dificuldades a órgãos governamentais,

resultando em incessáveis discussões internacionais. As medidas efetivas para minimizar a

exposição humana e animal, e as condições adequadas de produção e processamento

dependem de rigoroso e eficiente programa de monitoramento em produtos agrícolas e

animais (CHU, 1984; SCOTT & TRUCKSESS, 1997; ONO et al., 2000; WHITAKER,

2003). O desenvolvimento de métodos analíticos com alta sensibilidade, especificidade,

viabilidade, rapidez, reprodutibilidade e facilidade de uso, além de exatidão e precisão, são

essenciais na micotoxicologia para avaliar exposição humana e animal, e controle de

qualidade de matérias primas agropecuárias e produtos derivados (CHU, 1984; SCOTT &

TRUCKSESS, 1997; ONO et al., 2000; CHIAVARO et al., 2001; PETTERSSON &

ABERG, 2003; van der GAAG et al., 2003; WHITAKER, 2003).

No entanto, a diversidade na estrutura química inerente de micotoxinas

dificulta a análise, exigindo desenvolvimento metodológico específico para cada grupo

molecular, com nível de separação e diferenciação capaz de detectar análogos estruturalmente

relacionados. Aliada a isto, a distribuição heterogênea de micotoxinas nos produtos agrícolas

exige análise de um número significativo de amostras, visando minimizar a variabilidade

estatística (DAVIS et al., 1980).

O monitoramento perante presença de aflatoxina é crucial à segurança do

consumidor (OTTA, et al., 2000). O desenvolvimento de método único para detectar todas as

micotoxinas é impossível, devido à diversidade estrutural. Uma alternativa seria detectar os

fungos micotoxigênicos no estágio inicial de crescimento, visando aplicar medidas de

controle na fase anterior à produção de micotoxinas (YONG & COUSIN, 2001).

A contaminação por aflatoxina tem sido detectada em ampla variedade de

alimentos e rações, sendo importante a disponibilidade e desenvolvimento de método simples

e quantitativo para análise desta micotoxina. A etapa inicia-se empregando amostras

‘aflatoxina-livre’ (aflatoxina abaixo do limite de detecção) contaminadas com concentrações

conhecidas de aflatoxina, seguida de extração, limpeza, separação e determinação quantitativa

(PAPP et al., 2002). Yong e Cousin (2001) inocularam esporos de Aspergillus parasiticus em

amostras de milho e amendoim, incubaram em condições controladas (temperatura e

umidade) e monitoraram a aflatoxina sintetizada após o aparecimento de fungos nas amostras

pelo método ELISA.

Inúmeros métodos para determinação de aflatoxina têm sido desenvolvidos,

citando-se métodos baseados em cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) com absorção-UV, fluorescência, espectrometria de massa

ou detecção amperométrica, cromatografia líquida (LC) e ensaios imunoenzimáticos (ELISA)

(GARDEN & STRACHAN, 2001; STROKA & ANKLAM, 2002; AMMIDA et al., 2004).

A análise cromatográfica é amplamente aceita como método oficial de

determinação de aflatoxina (KOLOSOVA et al., 2006), cujo propósito é confirmar

positividade de amostras que demonstram conter micotoxinas em testes de triagem, além de

proporcionar aumento de exatidão na quantificação de toxina presente (CAST, 2003). Os

métodos mais difundidos para determinação quantitativa de aflatoxina em diferentes amostras

são CCD e CLAE (LEE et al., 2004; KOLOSOVA et al., 2006).

Apesar de ser um método de referência, a CCD é freqüentemente utilizada

como ensaio de triagem de micotoxina (CAST, 2003). Esta metodologia é relativamente

econômica e requer pouco equipamento para determinação de aflatoxina, mas fornece

variação entre as análises, já que a quantificação se faz por estimação visual (LEE et al.,

2004; KOLOSOVA et al., 2006). É uma poderosa ferramenta para determinar presença de

uma ou mais micotoxinas em uma amostra, permitindo quantificação crítica e utilização de

densitômetro. A quantificação densitométrica conduzida em CCD é mais exata quando os

compostos analisados são coloridos ou fluorescentes, não necessitando revelação para

visualização dos spots (CAST, 2003). Stroka e Anklam (2000) descreveram o

desenvolvimento de um densitômetro simples, pequeno, de baixo consumo de energia, para

quantificação de aflatoxina em CCD. Freqüentemente, a técnica de CCD pode ser utilizada

com pouca ou nenhuma etapa de limpeza prévia à aplicação do spot na placa cromatográfica

(CAST, 2003). Stroka et al. (2000b) reportaram o uso de CIA comercial para limpeza de

amostra antes da aplicação em placa de CCD, com quantificação e identificação de aflatoxina

por densitometria. Em alguns casos, a CCD de duas dimensões (2D-CCD) pode ser utilizada

para determinação de micotoxinas em amostras extremamente sujas (CAST, 2003). O uso de

2D-CCD e CCD de alta eficiência (HPTLC) têm sido reportado para determinação de

aflatoxina (PAPP et al., 2002).

A CLAE é o método mais amplamente utilizado para análise de micotoxina,

cuja detecção revela razoavelmente baixos níveis de contaminação e alta sensibilidade,

implicando em método quantitativo de boa qualidade (CAST, 2003). A aflatoxina pode ser

separada e detectada utilizando tanto CLAE normal como o de fase reversa. Este método

cromatográfico possibilita utilização de uma variedade de estratégias para detecção, i.e.

reação pós-coluna com iodo ou bromo acoplado com detecção de fluorescência, absorção UV,

espectrometria de massa, detecção amperométrica, com diferentes processos de limpeza como

extração em fase sólida (SPE), supercritical-fluid extraction (SFE), matrix solid-phase

dispersion (MSPD) e cromatografia por afinidade (PAPP et al., 2002; EDINBORO &

KARNES, 2005; KOLOSOVA et al., 2006). CLAE utilizando detecção de fluorescência tem

se tornado o método mais aceito para determinação de aflatoxina devido ao alto grau de

separação e menor tempo de análise. Métodos de fase reversa utilizando detecção de

fluorescência e UV também têm sido desenvolvidos. A sensibilidade da metodologia pode ser

aumentada pela reação de derivatização (OTTA et al., 2000).

A cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massa (LC-

MS) tem sido relatada como alternativa sensível e específica para métodos

espectrofotométricos, sem necessidade de manipulação de pós-colunas (EDINBORO &

KARNES, 2005).

Dentre as desvantagens dos métodos cromatográficos estão a dependência

de laboratórios com equipamentos especializados, operadores treinados, uso de solventes

tóxicos e demora na obtenção de resultados (GARDEN & STRACHAN, 2001; AMMIDA et

al., 2004; KOLOSOVA et al., 2006), a exemplo de análise em CLAE que necessita de

extensivo processo de limpeza e derivatização de amostra para melhorar a sensibilidade de

detecção (LEE et al., 2004).

Além disso, a análise cromatográfica de aflatoxina é precedida por uma

seqüência de operações amplas e complexas, que incluem amostragem, preparo de amostra,

extração, purificação e concentração de extrato obtido antes da separação, quantificação e

etapas de confirmação. Os resultados de quantificação e etapas de identificação são

determinados pela efetividade obtida nas operações gerais (JAIMEZ et al., 2000).

Novos métodos para detecção de aflatoxina têm sido propostos, como

aplicação de biosensores de ressonância plásmica de superfície (surface plasmon ressonance

biossensors), monitoramento de injeção de fluxo (flow injection monitoring), sensores de fibra

óptica (fibre optic sensors), eletrocinética capilar (capillary electrokinetics) e transdução

eletroquímica (electrochemical transduction). Imunossensores geralmente referem-se ao

sistema que acopla material imunoativo ao transdutor para gerar sinal elétrico proporcional à

quantidade de analito presente, empregando antígenos ou anticorpos imobilizados na

superfície sensora do transdutor. Imunossensores pequenos, semi-automáticos e portáteis

estão sendo desenvolvidos com o objetivo de separar com rapidez (GARDEN &

STRACHAN, 2001; AMMIDA et al., 2004; KOLOSOVA et al., 2006). A principal limitação

do uso de biosensores é a regeneração de superfície do receptor (KOLOSOVA et al., 2006).

Em termos de análise de aflatoxina sem utilização de clorofórmio,

procedimentos altamente bem-sucedidos têm sido publicados, utilizando, na maioria dos

casos, amostras de leite e fluídos biológicos. Por outro lado, foi reportado um método oficial

de aflatoxina (AOAC) em alimentos usando coluna multifuncional (MFC), que permite

passagem de aflatoxina e retém substâncias interferentes (JAIMEZ et al., 2000; AKIYAMA

et al., 2001). Akiyama et al. (2001) desenvolveram método de limpeza rápido e sensível com

coluna multifuncional comercial, utilizando LC acoplada à detecção por fluorescência para

análise de aflatoxina em cereais, nozes e milho.

Mesmo utilizando métodos de extração, o extrato obtido ainda contém, além

de aflatoxina, várias impurezas (lipídeos, pigmentos), necessitando de etapas de limpeza

adicionais (PAPP et al., 2002).

A aflatoxina é solúvel em alguns solventes polares e completamente

insolúvel em solventes apolares (JAIMEZ et al., 2000). Os solventes mais comumente

utilizados para extração são misturas de clorofórmio-água, metanol-água ou acetonitrila-água,

cuja combinação humidifica o substrato, resultando em aumento da penetração de solvente

orgânico na amostra e melhora da extração de aflatoxina (JAIMEZ et al., 2000; PAPP et al.,

2002; BLESA et al., 2003). Para limpeza e purificação de extrato bruto, o uso de colunas de

imunoafinidade ou mini-colunas de extração em fase sólida (SPE) tem sido relatado para

substituir procedimentos de partição líquido-líquido e o tradicional uso de coluna

cromatográfica. A técnica de extração mais utilizada é a SPE, sendo a sílica gel, C

fase-

ligada e silicato de magnésio (comercializado como florisil) as fases estacionárias mais

comuns. (PAPP et al., 2002; BLESA et al., 2003). Outros tipos de colunas de SPE são coluna

multifuncional Mycosep, que ao contrário das outras permite passagem de micotoxina e retém

substâncias interferentes, e coluna de imunoafinidade (JAIMEZ et al., 2000).

Embora as técnicas analíticas convencionais (CLAE, CCD, CG) sejam

oficialmente aceitas e validadas, a exigência de extrema limpeza de amostra, demanda

considerável de reagentes com alto grau de pureza destinados a derivatização e análise

cromatográfica, instabilidade de derivatizados fluorescentes, e alto custo de instrumentação e

manutenção sob supervisão de técnicos especializados, restringem o uso em rotina

laboratorial (CHU, 1984; CHU et al., 1988; PESTKA et al., 1995; BARNA-VETRÓ et al.,

1996; SYDENHAM et al., 1996).

Em vista a estas dificuldades, o ensaio imunoquímico constituiu técnica

analítica alternativa promissora na análise de micotoxinas em alimentos, a exemplo o ensaio

imunoenzimático ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). O ELISA possue vantagens

sobre outros procedimentos pela simplicidade, alta sensibilidade de reações imunológicas

capaz de detectar concentrações traço de um composto (pg), pouca ou nenhuma necessidade

de limpeza ou concentração de analito, baixo custo após padronização, facilidade de operação,

uso de reagentes seguros, rapidez, adaptabilidade, seletividade, além do potencial de aplicação

diagnóstica de rotina (GAZZAZ et al., 1992; HEFLE, 1995; PESTKA et al., 1995;

VALENTA, 1998; CHIAVARO et al., 2001; AMMIDA et al., 2004; LEE et al., 2004;

XIULAN et al., 2005; KOLOSOVA et al., 2006). A desvantagem desta técnica limita-se a

determinados tipos de alimentos em vista ao efeito de matriz alimentar, que resulta em

interferência nas reações imunológicas, i.e. interações inespecíficas de anticorpo a

componentes alimentares (proteínas, ácidos graxos), ou bloqueio estérico da ligação entre

anticorpo e analito, que superestimariam a concentração de micotoxina na aplicação de

ELISA competitivo indireto, ou seja, reação falso-positiva (PESTKA et al., 1994, 1995;

HEFLE, 1995; BARNA-VETRÓ et al., 1996). A interferência de matriz pode ser minimizada

por meio de diluição de amostra previamente à realização do ensaio, ou pela inclusão de

processo simples de limpeza (PESTKA et al., 1994; BARNA-VETRÓ et al., 1996; ONO et

al., 2000; SASAKI, 2000; FUJII, 2002). Deve-se considerar também o efeito de precursores

de micotoxinas ou produtos oriundos do metabolismo fúngico, capazes de interferir na reação

imunológica (SASAKI, 2000).

Métodos fluorimétricos simples associados à etapa de limpeza em CIA têm

sido desenvolvidos com o objetivo de aumentar a velocidade de execução a um menor custo.

Tais métodos são baseados em simples medida fluorimétrica de extrato purificado contendo

aflatoxina. A validação intra-laboratorial desta metodologia tem demonstrado precisão de

parâmetros comparável ao fornecido pelo método de CLAE. No entanto, matrizes complexas

podem gerar falso-positivos devido a reações cruzadas e interferência de matriz alimentar

(STROKA & ANKLAM, 2002). Aghamohammadi et al. (2007) reportaram o uso de

espectrometria de fluorescência sincronizada (Synchronous Fluorescence Spectrometry),

técnica convencional de fluorescência com simples modificação, e espectrofluorimetria

normal em combinação com métodos de calibração multivariada e técnicas de derivatização,

para determinar AFB

em amostras de pistache.

2.3 Coluna de imunoafinidade para detecção de aflatoxina

A técnica de cromatografia por afinidade pode ser considerada como

inovação na área de metodologia analítica, essencialmente baseada em procedimentos

químicos, por introduzir componente biológico (anticorpo) como reagente principal na análise

(OSTROVE, 1990; SCOTT & TRUCKSESS, 1997; HOLTZAPPLE et al., 2001; CONG et

al., 2002; KONDO et al., 2002; SHELVER et al., 2002; JURADO & JARRET, 2003;

TAVČAR-KALCHER et al., 2007).

A incorporação de procedimentos biológicos, i.e. coluna de imunoafinidade

(CIA), à metodologia química analítica consistiu em alternativa promissora às técnicas

convencionais de limpeza na análise de micotoxinas, conferindo rapidez e especificidade na

etapa do preparo de amostra (HOLTZAPPLE et al., 2001; WATANABE et al., 2001; ZHAO

et al., 2003), além de fornecer extratos com alta pureza que podem ser quantificados por

modernos e sensíveis métodos de detecção (BRADBURN & COKER, 1995).

A coluna de imunoafinidade (CIA), preparada com anticorpo anti-

micotoxina, destaca-se por proporcionar simplicidade, alta especificidade e recuperação,

melhorando limites de detecção e possibilitando análise de variedade de compostos em

distintas matrizes complexas. Uma vantagem incontestável também está na utilização de

tampão, dispensando emprego de grandes volumes de solventes tóxicos durante o preparo,

além da possibilidade de automação da técnica e disponibilidade comercial (OSTROVE,

1990; SCOTT & TRUCKSESS, 1997; OTTA et al., 2000).

A técnica de imunoafinidade possibilita análise de matrizes alimentares

utilizando etapa única de extração, sem empregar solventes hidrocarbono-halogenados

(OTTA et al., 2000). Os procedimentos de limpeza de amostra por imunoafinidade melhoram

não apenas o desempenho, devido à provisão de extratos extremamente limpos (ausência de

substâncias interferentes), mas também facilitam a determinação de aflatoxina, desde que a

automação seja aplicável (STROKA & ANKLAM, 2002).

As colunas compõem-se de suporte de fase sólida ativada, a exemplo de

Sepharose

-CNBr, onde se imobilizam os anticorpos específicos contra determinada

micotoxina (SCOTT & TRUCKSESS, 1997; HOLTZAPPLE et al., 2001; WATANABE et

al., 2001; CONG et al., 2002; KONDO et al., 2002; SHELVER et al., 2002; JURADO &

JARRET, 2003; ZHAO et al., 2003). O processo de limpeza consiste na ligação seletiva de

micotoxina presente no extrato aos anticorpos da coluna, seguido de eluição com solvente

apropriado (Figura 5). A imobilização dos anticorpos à matriz da coluna e a afinidade do

analito ao anticorpo específico durante a limpeza, lavagem e condições de eluição da amostra

são fatores determinantes da eficiência e aplicabilidade da CIA (SHELVER et al., 2002).

O uso de colunas de imunoafinidade tem sido relatado para extração de

aflatoxina de matrizes biológicas e não biológicas, a exemplo de coluna de imunoafinidade

utilizando anticorpo monoclonal (AcM) covalentemente ligado a esferas de agarose para

fornecer extração seletiva de componentes interferentes de matriz (EDINBORO & KARNES,

2005).

A aplicabilidade de cromatografia por afinidade vem sendo amplamente

difundida na análise de micotoxinas inerentes de matrizes complexas, a exemplo de

ocratoxina A em café (ENTWISLE et al., 2001; SIBANDA et al., 2002), vinho (LEITNER et

al., 2002; STANDER E STEYN, 2002), e cerveja (VISCONTI et al., 2000); aflatoxina em

ração (SHARMA E MÁRQUEZ, 2001), produtos lácteos (DRAGACCI et al., 2001),

alimentos infantis (STROKA et al., 2001), amendoim e páprica (STROKA et al., 2000a,

2000b); fumonisina em milho e produtos derivados (CHENG et al., 2002); tricoteceno em

pipoca e milho (OLIVEIRA et al., 2001; PASCALE et al., 2003), trigo, cevada e malte

(TACKE & CASPER, 1996; PASCALE et al., 2003), arroz, aveia e sorgo (PASCALE et al.,

2003); zearalenona em cereais e rações (FAZEKAS & TAR, 2001) e microcistina em água

(KONDO et al., 2002, 2000; AGUETE et al., 2003).

A coluna de imunoafinidade Aflatest, acoplada à fluorimetria ou

cromatografia líquida com derivatização pós-coluna, tem sido adotada como método oficial

de primeira escolha (Official First Action Method) pela AOAC para determinação de

aflatoxina total (≥ 10 ng/g) em milho, amendoim cru e pasta de amendoim (BRADBURN &

COKER, 1995).

Recentemente, a incorporação on line de coluna de imunoafinidade de alta

resolução à coluna de CLAE resultou em método caracterizado por rapidez e simplicidade no

preparo de amostra, redução de solventes orgânicos, além de alta eficiência na separação

(HOLTZAPPLE et al., 2001; JURADO & JARRET, 2003). A técnica denominada de

cromatografia por afinidade de alta resolução (HPAC), combina especificidade inerente de

cromatografia por afinidade à eficiência e sensibilidade da CLAE para separação de

compostos distintos (HOLTZAPPLE et al., 2001; JURADO & JARRET, 2003).

Embora exista a disponibilidade comercial de CIA para análise de

micotoxina em diferentes matrizes, o alto custo tem exigido novas opções de suporte e

possibilidade do preparo de coluna a partir da produção de anticorpo monoclonal e policlonal

específico, bem como o uso de suportes adequados (SCOTT & TRUCKSESS, 1997;

ENTWISLE et al., 2001; KOBAYASHI et al., 2003; NAKANO & NAGATA, 2003).

A desvantagem referente ao alto custo de CIA comercial tende a ser

minimizada aplicando processo de regeneração adequado à coluna, capaz de permitir

reutilização sem perda significativa na atividade, reduzindo o custo de análise (NAKAJIMA

et al., 1990; SCOTT & TRUCKSESS,1997; FAZEKAS & TAR, 2001; WATANABE et al.,

2001; KONDO et al., 2002).

Coluna de

imunoafinidade

contendo AcM

específico

imobilizado.

Extrato de amostra

contendo

micotoxina é

eluído através da

coluna.

AcM retém a

micotoxina na

coluna. Os

interferentes são

eliminados.

Passagem de

eluente rompe a

ligação antígeno-

anticorpo e libera a

micotoxina.

Figura 5 – Procedimento de limpeza de amostra em coluna de imunoafinidade.

(Fonte: R-BIOPHARM RHÔNE Ltd., USA)

2.4 Anticorpo para técnicas imunoquímicas

Inicialmente, as técnicas imunoquímicas foram padronizadas empregando-

se anticorpos policlonais usualmente produzidos em coelhos ou carneiros (THIMURALA et

al., 2000). Entretanto, a produção de grande quantidade de anticorpos policlonais apresenta

limitações, requerendo fornecimento contínuo de antígeno purificado para as inoculações,

manutenção de biotérios, variabilidade individual do animal na qualidade de anti-soro ou no

mesmo animal devido ao intervalo de sangria (WYATT, 1992). A produção de anticorpo

monoclonal superou o problema, obtendo-se reagente uniforme, de alta qualidade, passível de

ser empregado na rotina laboratorial (KOBAYASHI et al., 2003; NAKANO & NAGATA,

2003).

A qualidade de anticorpo (alta afinidade e especificidade, baixa reatividade

cruzada) é essencial para o desenvolvimento de imunoensaios sensíveis na micotoxicologia, já

que estes se baseiam na interação específica entre antígeno-anticorpo (GAZZAZ et al., 1992;

HEFLE, 1995; BARNA-VETRÓ et al., 1996; KOBAYASHI et al., 2003; NAKANO &

NAGATA, 2003). A obtenção de anticorpo de alta qualidade depende de imunógenos

purificados, protocolo de imunização e critério para seleção de anticorpo monoclonal

específico (NEWSOME, 1986; HEFLE, 1995; BARNA-VETRÓ et al., 1996). Os anticorpos

monoclonais caracterizam-se pela uniformidade, alta especificidade e afinidade constante a

um único epítopo, sendo homogêneos na estrutura e especificidade, características estas

essenciais na identificação de antígenos em matrizes complexas (GAZZAZ et al., 1992;

DIETRICH et al., 1995; HEFLE, 1995).

A produção de anticorpo monoclonal envolvendo etapas de imunização de

animais, fusão de células sensibilizadas (produtoras de anticorpos) com células de mieloma,

cultivo e clonagem de hibridomas, tornou-se instrumento essencial na medicina e indústria,

conferindo a Milstein e Köhler, o Prêmio Nobel de Medicina em 1984 (MORO &

RODRIGUEZ, 2001).

A tecnologia de hibridoma permitiu o fornecimento ilimitado de AcM com

especificidade definida, obtido pela imunização de camundongo com antígeno específico,

seguido de fusão de célula esplênica secretora de anticorpo com célula de mieloma (Figura 6)

(HARLOW & LANE, 1988a). No passado, AcM era produzido apenas em líquido ascítico,

cujo método é limitado para produção em rato ou camundongo. A implementação de

tecnologia in vitro foi estimulada por razões éticas e pelo fato de que AcM humano não pode

ser produzido em animais (HEILMANN et al., 2005). No entanto, a produção de IgG anti-

AFB

pelo cultivo de hibridoma procede-se em meio sintético de composição definida (in

vitro), a exemplo de RPMI 1640 e DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), meios

mais comumente utilizados, ou na cavidade peritoneal de camundongo (HARLOW & LANE,

1988b; EVEN et al., 2006).

Micotoxinas e ficotoxinas mostram-se incapazes de estimular o sistema

imune para produzir anticorpo devido à estrutura relativamente pequena (haptenos). Não

obstante, as moléculas tornam-se imunogênicas procedendo à conjugação com proteínas

carreadoras de alta massa molecular, empregando sistema de ativação adequado que garanta

manutenção de grupos determinantes de identidade do hapteno (CHU, 1984; NEWSOME,

1986; KAWAMURA et al., 1988; GAZZAZ et al., 1992; HEFLE, 1995; XIAO et al., 1995;

KIM et al., 2003). Conseqüentemente, o preparo de antígeno para imunização (hapteno)

requer suporte peptídico pouco imunogênico para obtenção de anticorpo monoclonal e

policlonal específicos (DANILOVA, 1994; TUOMOLA et al., 2000; MOGHADDAM et al.,

2001; MORAN et al., 2002; KIM et al., 2003).

A seleção de proteína carreadora e método de conjugação para síntese de

imunógeno representa etapa crítica na produção de anticorpos específicos (DANILOVA,

1994; TUOMOLA et al., 2000; MORAN et al., 2002). Entre os carreadores e adjuvantes

citam-se albumina de soro bovino (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH) e ovoalbumina

(OVA) (KAWAMURA et al., 1989; KIM et al., 2003). A AFB

precisa ser primeiramente

convertida em Afla B

-O-carboximetil-oxime (Afla B

-oxime) devido ao fato de não dispor

de grupo reativo para reações de acoplamento (Figura 7), introduzindo-se um grupo

carboxílico livre, por meio de derivatização, para reagir covalentemente com a molécula de

proteína (Figura 8) (CHU & UENO, 1977).

Um cuidado especial deve ser considerado no emprego de reagentes

imunológicos (material biológico), cujo componente fundamental, a imunoglobulina,

apresenta baixa estabilidade com possível perda de reatividade. Em relação ao método

químico convencional, a manutenção adequada dos reagentes torna-se fator decisivo na

confiabilidade da reação, devendo-se evitar ao máximo a desnaturação protéica

(DAUPHINAIS, 1986; NEWSOME, 1986; HEFLE, 1995).

A produção de anticorpos anti-AFB

tem permitido o desenvolvimento de

uma variedade de métodos baseados em Acs, i.e. imunoensaio acoplado à detecção

colorimétrica (GARDEN & STRACHAN, 2001; XIULAN et al., 2005) ou eletroquímica

(AMMIDA et al., 2004), e ensaios imunoenzimáticos (ELISA) (PAL & DHAR, 2004; LEE et

al., 2004; SAPSFORD et al., 2006).

Figura 6 – Produção de AcM: imunização de camundongo, fusão

celular, obtenção de hibridomas e cultivo em meio sintético de

composição definida e na cavidade peritoneal de camundongo.

(Fonte: BERG et al., 2002)

CH3

N CH2COOH

CH3

N NH

proteína

CH2CO

Figura 7 – Estrutura de AFB

-oxime. Figura 8 – Ligação de AFB

-oxime à proteína.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Produzir anticorpo monoclonal anti-aflatoxina B

(AFB

) empregando

hibridoma AF4, fornecido pelo intercâmbio com grupo japonês, para atender controle de

qualidade de alimentos.

3.2 Objetivos Específicos

♦ Cultivar e manter hibridoma linhagem AF4, secretor de AcM IgG específico para

AFB

;

♦ Produzir IgG anti-AFB

procedendo ao cultivo de hibridoma AF4 em meio sintético;

♦ Desenvolver CIA empregando IgG anti-AFB

e suporte gel ativado;

♦ Aplicar método rápido e simples de detecção de aflatoxina utilizando

espectrofluorimetria.

4 MATERIAL E MÉTODOS

As metodologias que apresentaram melhores resultados no decorrer dos

experimentos foram descritas a seguir.

4.1 Material

AcM anti-AFB

(122% de reatividade cruzada com aflatoxicol); AFB

padrão, PBS (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA); DMSO (Trade TCI, Japan);

microplaca de 24 orifícios, criotubo (Corning, USA); filtro de microfibra de vidro (GF/C 2,5

cm i.d), filtro qualitativo nº 1 (Whatman International Ltd., Maistone, England); CIA Aflatest-

P (VICAM Inc., Watertown, USA); meio RPMI 1640, soro fetal bovino, Hybridoma-SFM

(serum free medium), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, L-glutamina,

sulfato de amônio (Gibco Co., USA); frascos para cultivo de células de 25, 75 e 150 cm

(Nunc, Denmark); corante vital Azul de Trypan (Acros Organics, New Jersey, USA);

Activated Immunoaffinity Supports Affi-Gel 10 (Bio-Rad, 153-6046, USA); freezer (-20º C)

(CFC FREE, Sanyo, USA); recipiente de nitrogênio líquido (-185º C) (Cryo Diffusion,

France); incubadora sob 5 % CO

(Forma Scientific, USA); BOD (TE-391, Tecnal, Brasil);

espectrofotômetro UV-VIS Cintra 20 (GMB, Brasil); espectrofluorímetro (Varian, Cary-

Eclipse, Australia); sistema Stirred Cell 8400, membrana de exclusão molecular de 100 Kda

(YM 100, celulose) (Millipore Co., Bedford, MA, USA); banho ultrasônico (Ultrasonic

cleaner Unique); água ultra-pura (Ultra Purê Water System Milli-Q plus, Millipore Corp.,

Bedford, MA, USA); centrífuga refrigerada (Centrifuge 5804 R, Eppendorf, 3805 03551,

Germany); moinho A10 (Janke & Kunkel IKA



Labortechnik, Germany).

4.2 Produção de anticorpo monoclonal IgG anti-AFB

4.2.1 Linhagem de célula de hibridoma

A célula de hibridoma linhagem AF4 secretora de AcM específico para

AFB

(isotipo IgG

lambda), derivada de mieloma linhagem SP2/0-AG14 e célula esplênica

de camundongo BALB/c, foi produzida por Kawamura et al. (1988) em Faculty of

Pharmaceutical Sciences, Science University of Tokyo e mantida em Department of

Biochemistry and Food Science, Faculty of Agriculture, Kagawa University, Japão.

Camundongo BALB/c foi imunizado com conjugado AFB

-BSA e as

células esplênicas obtidas foram fundidas com células de mieloma (linhagem SP2/0-AG14).

Os hibridomas foram selecionados em meio HAT (meio Dulbecco´s modified Eagle´s,

contendo 100 µM de hipoxantina, 0,4 µM de aminopterina e 16 µM de timidina) e triados por

ELISA não-competitivo indireto quanto à presença de AcM anti-AFB

. Os clones positivos

foram clonados por método de diluição limitante e expandidos em meio de cultura, com

posterior preservação em nitrogênio (N

) líquido (-185º C).

O hibridoma AF4, secretor de AcM IgG

anti-AFB

, foi selecionado com

base no melhor perfil quanto à especificidade pela AFB

e menor reatividade contra as demais

aflatoxinas, e encaminhado ao Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos (Centro

de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Londrina, UEL – PR).

4.2.2 Recepção e cultivo de hibridoma

Um cultivo celular de células de hibridoma AF4 foi gentilmente fornecido

por Dr. Osamu Kawamura (Faculty of Agriculture, Kagawa University, Japão) para

continuidade de estudo no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Ciência e

Tecnologia de Alimentos, CCA, UEL – PR.

Imediatamente após a recepção, as células híbridas foram encaminhadas ao

Laboratório de Imunologia (Departamento de Ciências Patológicas, Centro de Ciências

Biológicas, UEL – PR) para prosseguir com a reativação e cultivo. Os hibridomas foram

reativados em meio RPMI 1640 (RPMI) suplementado com 20 % de soro fetal bovino (SFB)

em microplacas de 24 orifícios, a 37º C, em incubadora de CO

(5 % CO

) com

monitoramento diário de crescimento celular por microscopia. Após a reativação, as células

foram expandidas em frascos de cultivo de 25 e 75 cm

utilizando meio RPMI com 10 % de

SFB (HARLOW & LANE, 1988b; KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University).

4.2.3 Contagem e análise de viabilidade celular

A contagem e viabilidade de hibridoma foram avaliadas microscopicamente

utilizando corante vital Azul de Trypan. Uma alíquota de 100 µL da suspensão celular foi

combinada a 100 µL da solução de corante (0,25 % em meio RPMI, p/v) e as células viáveis

(aptas a excluir corante, i.e. refringentes, com citoplasma homogêneo e membrana íntegra)

foram contadas em câmara de contagem Neubauer em microscópio óptico.

Células viáveis/mL = Total de células viáveis x 2 x 10

Número de quadrantes

4.2.4 Manutenção e recuperação de hibridoma

As células viáveis de hibridoma reativadas e expandidas em meio RPMI

com 10% de SFB foram preservadas em nitrogênio líquido (-185º C) utilizando SFB contendo

agente crioprotetor dimetilsulfóxido (DMSO) na proporção de 9:1 (v/v) (HARLOW &

LANE, 1988b; KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University). As células foram

centrifugadas (200 x g – 5 min), ressupendidas e incubadas em meio fresco (RPMI com 10 %

SFB) por 24 horas, para atingir a fase log de crescimento. Em seguida, as células foram

centrifugadas (200 x g – 5 min) e ressuspendidas em solução de SFB:DMSO (9:1) resfriada a

4º C. Alíquotas de 0,5 mL desta suspensão contendo 2,5 x 10

a 2,5 x 10

células viáveis

foram adicionadas em criotubos e mantidas a -70º C por 16 horas, sendo posteriormente

transferidas para um recipiente contendo N

líquido (-185º C).

Previamente ao uso, os hibridomas estocados a -185º C em nitrogênio

líquido foram recuperados por descongelamento rápido do criotubo em banho de água a 37º

C, lavados com 15 mL de meio RPMI a 37º C e centrifugados (200 x g – 5 min). Descartado o

sobrenadante, as células foram avaliadas microscopicamente com corante vital Azul de

Trypan e a viabilidade celular pós-congelamento foi calculada e expressa como porcentagem:

Viabilidade (%) = células viáveis pós-congelamento x 100

células viáveis pré-congelamento

Em seguida as células foram ressuspendidas em meio RPMI com 10 % SFB,

e cultivadas em microplaca de 24 orifícios a 37º C em incubadora de CO

(5 %).

Posteriormente, procedeu-se a expansão celular para frascos de cultivo de 25 e 75 cm

4.2.5 Produção de AcM IgG a partir de cultivo de hibridoma em meio sintético

Os hibridomas foram cultivados inicialmente em meio RPMI suplementado

com 10 % SFB (37º C, 5 % de CO

), seguido de adaptação gradual ao meio Hybridoma-SFM

(H-SFM) suplementado com 2 mM de glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de

estreptomicina, por adição de 25, 50, 75 e 100 % deste meio ao RPMI (BRUCE et al., 2002;

KAWAMURA, informação pessoal, Kagawa University). Após adaptação, as células foram

cultivadas em frascos de 150 cm

com inóculo inicial de 2,5 a 5 x 10

células/mL até

atingirem saturação celular (aproximadamente 5 x 10

a 1 x 10

células/mL) e então

removidas por centrifugação (200 x g, 5 min). Em seguida, as células foram ressuspendidas

em meio fresco e incubadas a 37º C com 5 % CO

. O volume celular foi ajustado com o meio

para obter a concentração celular desejada.

A produção de anticorpos monoclonais foi realizada em cultivo estático, em

meio com concentração celular de 1 x 10

células/mL. As células foram incubadas por

aproximadamente 15 dias, sem reposição de meio, até morte celular. O sobrenadante de

cultivo contendo os anticorpos monoclonais IgG anti-AFB

foi armazenado a 4º C, após

centrifugação (2400 x g, 10 min, 4º C) para remover células e material celular.

4.2.5.1 Determinação de proteína (IgG)

A concentração de proteínas (IgG) foi determinada por absorção a 280 nm

em espectrofotômetro, adotando coeficiente de absorção (E

280

) de 1,35 para IgG (HARLOW

& LANE, 1988e):

Concentração IgG (mg/mL) = absorvância a 280 nm

coeficiente de absorção

4.2.6 Purificação parcial de anticorpo monoclonal IgG anti-AFB

Anticorpo monoclonal IgG anti-AFB

produzido pelo cultivo de hibridoma

AF4 foi previamente submetido à concentração por ultrafiltração (sistema Stirred Cell 8400,

Millipore Co.) utilizando membranas de exclusão molecular de 100 Kda.

4.2.6.1 Precipitação de IgG com sulfato de amônio - (NH

)

A solução concentrada de anticorpos foi adicionada de sulfato de amônio

sob agitação lenta até concentração final de 40 % de saturação (243 g/L de sobrenadante) para

precipitação e purificação parcial de IgG.

O precipitado protéico obtido foi mantido a 4º C por 16 horas sob agitação,

centrifugado (8000 x g, 30 min, 4º C) e ressuspendido em PBS (tampão fosfato de sódio)

(1/10 do volume original da amostra concentrada). Em seguida, a amostra ressuspendida foi

dialisada (cut-off de 12000-16000 MM) empregando-se PBS (4 x 1 L) a 4º C por 16 horas,

sob agitação. Após a diálise em PBS, a solução de anticorpos purificada foi submetida à outra

diálise em água ultra-pura (4 x 1 L) para remoção de sais. A partir deste concentrado protéico

determinou-se a concentração de IgG conforme item 4.1.5.1. A solução de anticorpos foi

congelada (-20º C), liofilizada (-50º C) e mantida a -20º C.

4.3 Desenvolvimento da coluna de imunoafinidade (CIA) para detecção de AFB

empregando AcM anti-AFB

A coluna de imunoafinidade para análise de AFB

foi desenvolvida com

suporte ativado de imunoafinidade (Activated Immunoaffinity Supports) Affi-Gel 10 (Bio-

Rad) e anticorpo monoclonal produzido e parcialmente purificado em nosso laboratório,

seguindo as instruções do fabricante de Affi-Gel 10.

Affi-Gel 10 é um suporte de afinidade comumente utilizado, pois se acopla

espontaneamente ao anticorpo contendo grupamento amina livre, em solução aquosa, sem

utilizar materiais perigosos como CNBr (Figura 9) (PFEIFFER et al., 1987). Consiste de

suporte de gel de agarose (agarose gel bead support) com braço espaçador contendo 10

átomos neutros, i.e. éster N-hidroxisuccinamida derivatizado ao suporte gel (BIO-RAD,

2000).

Figura 9 – Reação de acoplamento de suporte Affi-Gel com ligante contendo

grupamento amina livre (Fonte: Bio-Rad, USA, 2000).

4.3.1 Preparo da CIA Affi-Gel 10: acoplamento aquoso

Três mL de Affi-Gel 10 acondicionados em tampão acetato de sódio 10

mM, pH 4,5 foram adicionados de 1,5 a 4,5 mL de anticorpo monoclonal semi-purificado e

liofilizado ressuspendido em tampão de ligação (NaHCO

0,1 M, pH 8,5) (25 mg/mL) por mL

de suporte gel, e incubados por 4 h a 4º C. Em seguida, a mistura foi centrifugada e o

sobrenadante removido para determinar a eficiência de acoplamento dos anticorpos

monoclonais. O gel foi lavado com PBS e adicionado de 0,2 mL de glicina-etil-éster 1,0 M

(pH 8,0) por 1 hora para bloquear as regiões não acopladas com os anticorpos. O gel foi

transferido para uma coluna e lavado com PBS até que a leitura a 280 nm não detectasse

presença de reagentes.

4.3.2 Manutenção de CIA Affi-Gel 10

A coluna foi mantida a 4º C em PBS contendo 0,02 % de azida sódica

(NaN

). Previamente ao uso, metanol grau HPLC foi passado através da coluna para remover

qualquer impureza solúvel neste solvente. Em seguida, a coluna foi reequilibrada

imediatamente com PBS.

4.3.3 Avaliação da eficiência de acoplamento de AcM à CIA Affi-Gel 10

A eficiência de acoplamento de AcM ao suporte Affi-Gel 10 foi

determinada por quantificação de anticorpos eluídos na etapa de lavagem da coluna por

absorção a 280 nm após o período de imobilização entre ligante e gel (suporte). O pH da

solução de proteínas remanescentes foi acidificado com solução de HCl 10 mM para evitar

interferência de leitura de N-hidroxisuccinamida, que absorve a 280 nm em pH neutro ou

básico.

4.3.4 Determinação da capacidade de retenção de AFB

em CIA Affi-Gel 10

A capacidade de retenção de AFB

em CIA Affi-Gel 10 desenvolvida foi

determinada conforme Watanabe et al. (2001) modificado. Volume de 5 mL de AFB

(10

ng/mL) em água:metanol (21:4, v/v) foi continuamente adicionado à CIA sob fluxo de 1-2

gotas/seg. Duas frações (2,5 mL) foram coletadas e analisadas por espectrofluorimetria. A

coluna foi lavada com 20 mL de água ultra-pura (1-2 gotas/seg). A AFB

ligada à CIA foi

eluída com duas frações (7,5 mL) de metanol (1-2 gotas/seg) e quantificada por

espectrofluorimetria.

4.4 Teste de recuperação de AFB

em CIA Affi-Gel 10

A coluna de imunoafinidade confeccionada com o suporte Affi-gel 10 foi

avaliada quanto à eficiência na limpeza e determinação de AFB

em milho, em comparação à

CIA Aflatest-P (VICAM).

4.4.1 Contaminação de milho com AFB

Os grãos de milho utilizados (híbrido AG7000) foram colhidos na estação

experimental do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR, Londrina-PR), safra 2005.

Cinqüenta gramas de milho (48 mesh) foram artificialmente contaminados com solução

padrão de AFB

(Sigma) (500 ng/mL em metanol) para as concentrações de 5, 15 e 30 ng

AFB

/g alimento. As amostras foram mantidas em repouso por 24 horas a 25º C, submetidas à

extração e limpeza em CIA (CIA Affi-Gel 10 e CIA Aflatest-P) para posterior quantificação

por espectrofluorimetria.

4.4.2 Extração de AFB

de milho contaminado

A extração procedeu-se conforme recomendação do manual da CIA

comercial (Aflatest-P). A amostra de milho contaminada (50 g com granulometria de 48

mesh) foi adicionada de 5 g de NaCl e 100 mL de solução de metanol:água (80:20, v/v) e

agitada por 1 minuto (175 rpm). O extrato foi filtrado em papel plissado (filtro qualitativo nº

1) e coletado em recipiente limpo.

4.4.3 Limpeza de extrato bruto pela CIA

O extrato bruto (10 mL) foi adicionado de 40 mL de água ultra-pura

(diluição 1:4), filtrado (filtro de microfibra de vidro GF/C) e 10 mL do extrato diluído foram

submetidos à limpeza pela CIA Affi-Gel 10 previamente preparada no item 4.3.1 e pela CIA

Aflatest-P a um fluxo contínuo de 1-2 gotas por segundo. Em seguida, a coluna foi lavada

com 20 mL de água ultra-pura sob o mesmo fluxo (1-2 gotas/seg). A AFB

foi eluída da CIA

Aflatest-P com 1,0 mL de metanol grau HPLC (1-2 gotas/seg) e da CIA desenvolvida com 2

frações de 7,5 mL.

4.4.4 Determinação de AFB

por espectrofluorimetria

O eluato coletado da CIA foi submetido à secagem sob fluxo de N

gasoso e

o resíduo foi ressuspendido em 200 µL de metanol. Uma alíquota de 100 µL de amostra foi

adicionada de 100 µL de revelador (solução aquosa de bromo 0,003 %, v/v) e quantificada

por espectrofluorimetria a 360 nm de excitação e 420 nm de emissão, após 60 segundos.

4.4.5 Regeneração de CIA

Após o uso, as CIAs (Affi-Gel 10 e Aflatest-P) foram regeneradas conforme

Nakajima et al. (1990) e avaliadas quanto à reutilização. As colunas foram lavadas com 5 mL

de tampão TRIS-HCl (0,1 M, pH 8,5) contendo NaCl 0,5 M, seguido de 5 mL de tampão

acetato de sódio (0,1 M, pH 4,5 contendo NaCl 0,5 M) e 5 mL de PBS. Após lavagem, as

colunas foram estocadas a 4º C por 72 horas e reutilizadas sucessivamente para amostras de

milho artificialmente contaminadas. A reutilização de CIA foi avaliada por

espectrofluorimetria e expressa como porcentagem de recuperação de AFB

após cada reuso.

4.5 Comparação entre espectrofluorimetria e CCD para análise de AFB

4.5.1 Contaminação de milho com AFB

A contaminação de milho procedeu-se conforme item 4.4.1. As amostras

foram mantidas em repouso por 24 horas a 25º C, submetidas à extração e limpeza em CIA

Aflatest-P para posterior quantificação por cromatografia em camada delgada (CCD) e

espectrofluorimetria. Os grãos de milho (híbrido AG7000) foram colhidos na estação

experimental do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR, Londrina-PR), safra 2005.

4.5.2 Extração de AFB

de milho contaminado

A extração procedeu-se conforme item 4.4.2.

4.5.3 Limpeza de extrato bruto pela CIA

O extrato bruto (10 mL) foi adicionado de 40 mL de água ultra-pura

(diluição 1:4), filtrado (filtro de microfibra de vidro GF/C) e 10 mL do extrato diluído foram

submetidos à limpeza pela CIA Aflatest-P a um fluxo contínuo de 1-2 gotas por segundo. Em

seguida, a coluna foi lavada com 20 mL de água ultra-pura sob o mesmo fluxo (1-2

gotas/seg). A AFB

foi eluída 1,0 mL de metanol grau HPLC (1-2 gotas/seg).

4.5.4 Quantificação de AFB

por espectrofluorimetria

O eluato coletado da CIA foi submetido à secagem sob fluxo de N

gasoso e

o resíduo foi ressuspendido em 200 µL de metanol. Uma alíquota de 100 µL de amostra foi

adicionada de 100 µL de revelador (solução aquosa de bromo 0,003 %, v/v) e quantificada

por espectrofluorimetria a 360 nm de excitação e 420 nm de emissão, após 60 segundos.

Outra alíquota de 100 µL foi novamente seca sob fluxo de N

gasoso e ressuspendida em 100

µL de clorofórmio.

4.5.5 Determinação de AFB

por cromatografia em camada delgada (CCD)

Cem µL da amostra ressuspendida em clorofórmio foram aplicados em

placa cromatográfica de sílica gel juntamente com 4 pontos de solução padrão de AFB

a 1

µg/mL (1,5; 2,5; 7,5 e 15 µL), a 2 cm da base. O cromatograma foi desenvolvido em cuba

saturada contendo como fase móvel tolueno:acetato de etila:clorofórmio:ácido fórmico

(70:50:50:20, v/v/v/v) (GIMENO, 1979). A placa foi removida após desenvolvimento de 10

cm de corrida, deixando-a secar. O cromatograma foi observado em lâmpada de UV longa

para verificar presença de AFB

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados foram compilados em capítulos listados abaixo:

 ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-AFLATOXINA B

PARA CONTROLE DE

QUALIDADE EM ALIMENTO (CAPÍTULO I)

 ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-AFLATOXINA B

: SCALE-UP,

PURIFICAÇÃO-PARCIAL E DESENVOLVIMENTO DA COLUNA DE

IMUNOAFINIDADE (CAPÍTULO II)

 COLUNA DE IMUNOAFINIDADE PARA ESPECTROFLUORIMETRIA:

DETECÇÃO DE AFB

EM MILHO

PELA CIA COMERCIAL VERSUS CIA AFFI-

GEL 10-AcM ANTI-AFB

DESENVOLVIDA (CAPÍTULO III)

CAPÍTULO I

ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-AFLATOXINA B

PARA CONTROLE DE

QUALIDADE EM ALIMENTO

MATERIAL E MÉTODOS

Produção de anticorpo monoclonal IgG anti-AFB

A produção de anticorpo monoclonal (AcM) IgG anti-AFB

foi conduzida

pelo cultivo de hibridoma AF4, gentilmente fornecido por Dr. Osamu Kawamura, Kagawa

University, Japão (item 4.2).

Recepção e cultivo de hibridoma

O hibridoma AF4 foi recepcionado e reativado em meio RPMI 1640

(RPMI) suplementado com 20 % de soro fetal bovino (SFB) (item 4.2.2).

Contagem e análise de viabilidade celular

A contagem e viabilidade de hibridomas foram avaliadas

microscopicamente utilizando corante vital Azul de Trypan (item 4.2.3).

Manutenção e recuperação de hibridoma

As células viáveis de hibridoma reativadas e expandidas em meio RPMI

com 10% de SFB foram preservadas em nitrogênio líquido (-185º C) utilizando SFB contendo

agente crioprotetor dimetilsulfóxido (DMSO) na proporção de 9:1 (v/v) (item 4.2.4).

Produção de AcM IgG a partir de cultivo de hibridoma em meio sintético

O AcM IgG anti-AFB

foi produzido cultivando o hibridoma AF4 em meio

RPMI e posteriormente em meio Hybridoma-SFM (H-SFM) (item 4.2.5).

Determinação de proteína (IgG)

A concentração de proteínas (IgG) foi determinada por absorção a 280 nm

(item 4.2.5.1).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O hibridoma linhagem AF4, secretor de AcM específico para AFB

(isotipo

IgG

lambda), derivado de mieloma linhagem SP2/0-AG14 e célula esplênica de camundongo

BALB/c, foi produzido em Faculty of Pharmaceutical Sciences, Science University of Tokyo

e mantido em Department of Biochemistry and Food Science, Faculty of Agriculture, Kagawa

University, Japão (KAWAMURA et al., 1988).

O AcM produzido pelo hibridoma AF4 reagiu tão bem com AFB

quanto

com AFL II (isômero natural [1R]-aflatoxicol) (Figura 10), demonstrando reatividade cruzada

de 122 % (KAWAMURA et al., 1988) (Tabela 1).

Um cultivo de hibridoma AF4, correspondente a 5 x 10

células, foi cedido

para pesquisa colaborativa na Universidade Estadual de Londrina – PR. A Figura 11

esquematiza o fluxograma desde a recepção do hibridoma AF4 até a produção de AcM anti-

AFB

, como produto final de cultivo em meio sintético H-SFM.

As células híbridas recebidas no Laboratório de Imunologia (Depto.

Ciências Patológicas, CCB-UEL) foram imediatamente reativadas em meio RPMI

suplementado com 20 % de SFB a 37º C (5 % de CO

). Após reativação, as células foram

expandidas em frascos de 25 e 75 cm

(RPMI com 10% SFB) e encaminhadas ao Depto.

Ciência e Tecnologia de Alimentos (DCTA), CCA-UEL. As células foram imediatamente

acondicionadas em meio RPMI, aumentando SFB para 20% para adaptação, e incubadas a 37º

C (5% de CO

) (Figura 11, Exp. 1). As células não se adaptaram à nova condição de cultivo,

ocorrendo morte celular gradativa no decorrer de 3 dias (alteração morfológica, membrana

celular granulada). Após centrifugação, procedeu-se cultivo aumentando a quantidade de SFB

para 40%, mas mesmo assim não reduziu a mortalidade. Considerando a debilidade celular,

enriqueceu-se o meio de cultura com 2 mM de L-glutamina. Obteve-se êxito na adaptação

celular, recuperando a característica morfológica, i.e. célula refringente com membrana lisa,

confirmando que a suplementação com SFB e L-glutamina foi essencial na recuperação

celular. A L-glutamina é um importante substrato para célula de hibridoma. Parte deste

aminoácido é deaminada, liberando amônia e glutamato, e depois é transformada em outros

aminoácidos com o propósito de biossíntese. A glucose também é fundamental para o

crescimento de hibridoma, constituindo uma das principais fontes de carbono e energia, sendo

utilizada também para síntese de biomassa (LEGAZPI et al., 2005).

O soro fetal bovino tem sido utilizado como estimulante para o crescimento

de hibridoma na rotina, por fornecer fatores hormonais e proteínas carreadoras de hormônios,

minerais, lipídeos e outros compostos essenciais (LIDDELL & CRYER, 1991; HARLOW &

LANE, 1988b; LEGAZPI et al., 2005). Além disso, o baixo conteúdo de IgG no soro

miniminiza interferência durante ensaios e purificação de AcM (HARLOW & LANE, 1988b).

A L-glutamina destaca-se como estimulante da produção de anticorpo monoclonal in vitro

(BRUCE et al., 2002; LEGAZPI et al., 2005; HEILMANN et al., 2005). Legazpi et al. (2005)

aumentaram a concentração final de IgG

anti-lactoferrina bovina no fator de 2 vezes,

adicionando 1,4 mM de glutamina ao meio livre de SFB. A alta especificidade do hibridoma

AF4 perante produção de AcM anti-AFB

(Tabela 1), por outro lado, traduziu-se em células

sensíveis a quaisquer variações no cultivo, i.e. lenta recuperação, sendo a suplementação do

meio o fator fundamental para adaptação e expansão.

O hibridoma AF4 requereu um mês de adaptação para atingir expansão

adequada e produção de AcM anti-AFB

, sendo conservado posteriormente em N

líquido (-

185º C), com agente crioprotetor SFB:DMSO (9:1). A criopreservação mantém a

característica biológica do hibridoma, conservando a capacidade de produção de anticorpo

monoclonal durante anos, garantindo eficiente recuperação (HARLOW & LANE, 1988b). A

alta contagem de células viáveis (5,0 x 10

a 5,0 x 10

células/mL) em fase logarítmica

(Figura 12) também tem sido essencial para congelamento adequado e maior recuperação pós-

estocagem (HARLOW & LANE, 1988b). A concentração de hibridoma viável congelado foi

de 8,95 x 10

e 9,80 x 10

células/criotubo (Figura 11, Exp.1). Embora o DMSO seja

crioprotetor, a interação com a membrana pode causar toxidez e dano celular (WEWETZER

& DILMAGHANI, 2001). O contato com DMSO a 4º C deve ser minimizado na fase de pré-

congelamento, sendo este relevante na sobrevivência celular (WEWETZER &

DILMAGHANI, 2001).

O hibridoma adaptou-se gradualmente no meio H-SFM suplementado com 2

mM de L-glutamina (adição seqüencial de 25, 50, 75 % e 100 % de meio H-SFM, Figura 11,

Exp 1). A substituição de RPMI por H-SFM eliminou os problemas com o uso de SFB, i.e.

alto custo, heterogeneidade entre lotes, alto teor protéico que interfere na purificação de AcM,

e contaminação por prions, vírus e micoplasmas, veiculados por meio do soro (LIDDELL &

CRYER, 1991; BRUCE et al., 2002; LEGAZPI et al., 2005; EVEN et al., 2006). Chang et al.

(1980) reportaram o primeiro uso bem sucedido de meio livre de soro para cultivo de

hibridoma. Neste estudo, 5 linhagens de hibridoma foram cultivadas em meio livre de soro

por mais de 3 meses, e continuaram secretando AcM ao nível alcançado na presença de SFB.

Stoll et al. (1996) adaptaram célula de hibridoma secretora de IgA em 2 meios livres de soro

comercialmente disponíveis. Kreutz et al. (1997) adaptaram uma linhagem de hibridoma

secretora de IgG em meio livre de soro em 3 etapas de substituição gradual de meio.

No decorrer de tempo ocorreu contaminação fúngica, sendo os frascos

contaminados descartados (Figura 11, Exp.1), já que se mantinha um estoque de células a -

185º C. Na existência de estoque, a melhor opção consiste em autoclavar os cultivos

contaminados e reiniciá-lo com células estocadas (HARLOW & LANE, 1988b). Na falta de

estoque, os métodos potenciais para recuperar as culturas contaminadas seriam uso de

antimicrobiano, se a contaminação fosse detectada no início, e inoculação da linhagem em

camundongo como única alternativa de recuperação para contaminação avançada (HARLOW

& LANE, 1988b).

Um criotubo mantido a -185º C (8,95 x 10

células) foi descongelado após 2

meses e a viabilidade (Figura 12) pós-congelamento avaliada (14,64%) (Tabela 2). As células,

acondicionadas em frasco com 10 mL de meio (RPMI com 20 % SFB e 2 mM de L-

glutamina) e incubadas por 24 horas (37º C, 5 % CO

), apresentaram-se todas mortas (Figura

11, Exp. 2). Para testar se as condições de cultivo estavam inadequadas para reativação,

descongelou-se outro criotubo (9,80 x 10

células, 9,88 % de viabilidade pós-congelamento)

(Tabela 2) e ressuspendeu-se em 4,5 mL de meio RPMI com 20 % SFB e 2 mM de L-

glutamina, para transferir em microplaca de 24 orifícios sob mesmas condições de incubação.

A redução no volume visou condicionar uma área menor capaz de permitir proximidade

celular, estimulando a multiplicação. Nas tentativas seguintes, um criotubo de hibridoma

descongelado foi ressuspendido em 4 mL de meio RPMI com 20 % SFB e teor de L-

glutamina aumentado para 4 mM; em outro criotubo, aumentou-se o teor de SFB para 40 % e

manteve-se L-glutamina em 4 mM, submetendo-se ao cultivo em microplaca. Em todos os

ensaios não se constatou adaptação celular, i.e. morte celular após 24 horas de cultivo.

Rastreando os fatores envolvidos na reativação celular do Exp. 2, i.e. meio,

fatores suplementares e condições utilizadas, constatou-se o uso de água destilada e não ultra-

pura no preparo de meio. Todavia, o insucesso repetiu-se com o meio RPMI preparado com

água ultra-pura (4 mL de RPMI com 40 % SFB e 4 mM de L-glutamina). Um criotubo (8,95 x

células) também foi encaminhado ao Laboratório de Imunologia (CCB), cujo insucesso na

reativação confirmou falha na qualidade de água desde o início do preparo de estoque celular

(Figura 11, Exp. 3).

Em vista disso, prosseguiu-se a produção de AcM anti-AFB

a partir de

estoque inicial de hibridoma mantido a -185º C no Laboratório de Imunologia-CCB, ou seja,

células recém-enviadas do Japão adaptadas à condição de nosso cultivo e estocadas (Figura

11, Exp. 4). O descongelamento e adaptação de células em meio RPMI (água ultra-pura) com

20 % SFB e 2 mM de L-glutamina foram realizados no Laboratório de Imunologia, seguido

de encaminhamento ao Laboratório do DCTA, onde se prosseguiu o cultivo em RPMI,

aumentando SFB para 30 % e L-glutamina para 4 mM, para garantir a adaptação. As células

híbridas adaptaram-se gradualmente ao meio, permitindo redução de SFB para 20, 15 até 10

% de SFB, seguida de adaptação gradual ao meio H-SFM (25 a 100 %) com 2 mM de L-

glutamina, para produção de AcM. Neste ponto realizou-se um teste de viabilidade, mantendo

um criotubo (6,44 x 10

células) a -185º C por 12 dias. As células apresentaram-se viáveis

(39,75 %) (Tabela 2), mantendo esta característica após 24 horas de incubação a 37º C sob 5

% de CO

Estes dados apontaram que as dificuldades ocorridas no Exp. 1 a 3 foram

devidas à utilização de água destilada no cultivo celular, ao invés de água ultra-pura. Salienta-

se a necessidade de aporte constante de água ultra-pura para o cultivo de hibridoma,

principalmente para a estocagem de células sob N

líquido, devido à injúria celular por

congelamento. No contexto, pode-se comparar a viabilidade celular em nossa condição

(40%), em relação à viabilidade do mesmo hibridoma em Kagawa University (80%).

Confirmada a viabilidade, um lote de cultivo (H-SFM, 2 mM L-glutamina)

foi estocado em criotubos (6,86 x 10

células, -185º C), antes de prosseguir com a produção

de anticorpo (Figura 11, Exp. 5). No decorrer do experimento, frascos contaminados com

bactéria foram descartados. Justifica-se o fato, já que meios para o cultivo celular, inclusive o

meio H-SFM, não contêm antibiótico. Portanto adicionou-se 100 U/mL de penicilina e 100

µg/mL de estreptomicina ao meio H-SFM, sendo estes antibióticos comuns no cultivo de

células (HARLOW & LANE, 1988b).

O scale-up da produção de AcM IgG anti-AFB

foi conduzido em meio H-

SFM suplementado (2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 µg/mL estreptomicina),

inoculado com 2,5 a 5,0 x 10

células/mL, sob cultivo estático por 15 dias sem substituição de

meio, até morte celular (Figura 13). O Scale-up resultou no total de 7700 mL do sobrenadante

de cultivo contendo 632,63 mg de proteína (82,18 µg/mL). Embora o cultivo de hibridoma em

meio sintético forneça baixa concentração de IgG (50 µg/mL) (HARLOW & LANE, 1988b),

o uso de L-glutamina, aliado à técnica de cultivo até morte celular permitiram aumento na

produção de proteína (82,18 µg/mL, Figura 11, Exp 5).

O anticorpo foi precipitado com sulfato de amônio (40 % de saturação), já

que consiste de técnica de concentração e purificação parcial simples e de baixo custo

(HARLOW & LANE, 1988c). Após diálise em água ultra-pura procedeu-se liofilização e

ressuspendeu-se em volume menor (aproximadamente 5 a 7 mL, 27 mg/mL), para

confeccionar a coluna de imunoafinidade anti-AFB

. A atividade de AcM específico para

AFB

, obtida por scale-up, foi confirmada pelo teste de capacidade de retenção de AFB

(5,0

mL de solução 10 ng/mL - Sigma, > 99 % pureza) em coluna de imunoafinidade (CIA)

confeccionada. O AcM reteve 25,27 ng de AFB

, sendo este eluído com 15 mL de metanol.

Em suma, o cultivo de hibridoma AF4 visando obter anti-AFB

mostrou-se

laborioso, com etapas e detalhes críticos durante cultivo, mas com possibilidade de produção

ilimitada de AcM específico destinado ao desenvolvimento de CIA, devendo-se prosseguir

com otimização técnica. O fato abre perspectiva positiva para reduzir importação de kits

imunoquímicos para análise de AFB

, destinados ao controle de qualidade de alimentos.

Tabela 1 – Reatividade cruzada de anticoporpo monoclonal produzido por hibridoma AF4

analisada por IC-ELISA (KAWAMURA et al., 1988).

Aflatoxina % reatividade cruzada

100,0

2,3

3,4

2,4

AFL I

14,1

AFL II

122,0

4,5

10,8

>1,3

AFL I, isômero natural [1S]-aflatoxicol

AFL II, isômero natural [1R]-aflatoxicol

AFLATOXICOL I

Figura 10 – Estrutura de aflatoxicol I,

isômero natural [1S]-aflatoxicol.

Aflatoxicol I

Tabela 2 – Viabilidade celular de hibridoma AF4 em diferentes condições de meio de cultivo

celular e tempo de manutenção a -185º C.

AD – água destilada

AP – água ultra-pura

n.d. – não determinado

Condições Contagem (cels viáveis/mL)

Meio de cultivo

Tempo a -185º C

(dias)

inicial final

viabilidade

celular (%)

RPMI (AD) + 10 % SFB 60 8,95 x 10

1,31 x 10

14,64

RPMI (AD) + 10 % SFB 62

9,8 x 10

9,68 x 10

9,88

RPMI (AD) + 10 % SFB 67 9,8 x 10

9,0 x 10

9,18

RPMI (AD) + 10 % SFB 73

9,8 x 10

1,68 x 10

17,14

RPMI (AD) + 10 % SFB 82 9,8 x 10

9,7 x 10

9,89

RPMI (AD) + 10 % SFB 89

8,95 x 10

n.d. n.d.

RPMI (AP) + 10 % SFB 100

n.d n.d.

≈ 40-50

H-SFM (AP) + 2 mM Gln 12

6,44 x 10

2,56 x 10

39,75

1 mês

DCTA

2 meses

Imuno - CCB

12 dias

. 1

75 % (RPMI + 10 % SFB + 2 mM Gln)

25 % (H-SFM + 2 mM Gln)

50 % (RPMI + 10 % SFB + 2 mM Gln)

50 % (H-SFM + 2 mM Gln)

25 % (RPMI + 10 % SFB + 2 mM Gln)

75 % (H-SFM + 2 mM Gln)

100 % H-SFM + 2 mM Gln

. 5

Exp. 3

. 4

Exp. 2

HIBRIDOMA AF4

Lab. Imunologia

CCB

AF4 estocada

Descongelamento - Recuperação

RPMI + 20 % SFB

Lab. DCTA - Adaptação

RPMI + 30 % SFB + 4 mM Gln

RPMI + 20 % SFB + 4 mM Gln

RPMI + 15 % SFB + 4 mM Gln

RPMI + 10 % SFB + 4 mM Gln

75 % (RPMI + 10 % SFB + 2 mM Gln)

25 % (H-SFM + 2 mM Gln)

50 % (RPMI + 10 % SFB + 2 mM Gln)

50 % (H-SFM + 2 mM Gln)

25 % (RPMI + 10 % SFB + 2 mM Gln)

75 % (H-SFM + 2 mM Gln)

100 % H-SFM + 2 mM Gln

Contaminação

bacteriana

Penicilina

Estreptomicina

Teste de viabilidade (-185º C)

Criotubo C: 6,44 x 10

cels

Descongelamento

Criotubo C – 4 mL

RPMI + 40 % SFB + 2 mM Gln

Viabilidade: 39,75 %

AF4 estocada

Criotubos D:

86 x 10

cels

Lab. DCTA

RPMI + 10 % SFB

Descarte

Criotubo B – 4 mL

RPMI + 40 % SFB + 4 mM Gln

Viabilidade: 17

14 %

Criotubo A – 10 mL

RPMI + 20 % SFB + 2 mM Gln

Viabilidade: 14

64 %

Criotubo B – 4,5 mL

RPMI + 20 % SFB + 2 mM Gln

Viabilidade: 9

88 %

Criotubo B – 4 mL

RPMI + 20 % SFB + 4 mM Gln

Viabilidade: 9

18 %

Criotubo B – 4 mL

RPMI + 40 % SFB + 4 mM Gln

Viabilidade: 14

64 %

Água ultra-pura

Morte Celula

Figura 11 – Recepção, reativação, adaptação, manutenção e cultivo de hibridoma AF4, com produção de anticorpo monoclonal (AcM) anti-AFB

. Experimento 1, 2, 3, 4 e 5

(Exp. 1, Exp. 2, Exp. 3, Exp. 4, Exp. 5 respectivamente). L-glutamina (Gln). Meio RPMI 1640 (RPMI) e Hybridoma SFM (H-SFM). Soro fetal bovino (SFB). Hibridoma AF4

(AF4). Lab. DCTA (Laboratório do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos). Imuno-CCB (Laboratório de Imunologia do Centro de Ciências Biológicas).

Descongelamento

Criotubo A

Confirmação

Morte Celula

Expansão

AcM

Descarte

Água ultra-pura

Água destilada

7,7 L

(82,18 µg/mL)

Contaminação fúngica

Adaptação

RPMI + 20 % SFB

RPMI + 40 % SFB

RPMI + 20 % SFB + 2 mM Gln

RPMI + 10 % SFB + 2 mM Gln

(-185º C)

Criotubos A: 8,95 x 10

cels

Criotubos B: 9,80 x 10

cels

Cels viáveis

Figura 12 – Vista microscópica de células de hibridoma AF4 em

meio Hybridoma-SFM (aumento de 10 vezes). (A) Contagem inicial

(2,5 a 5,0 x 10

células/mL); (B) Saturação celular, após 3-4 dias de

cultivo (5 x 10

a 1 x 10

células/mL); (C) Morte celular, após 15

dias de cultivo sem substituição do meio.

(A)

(B)

(C)

Figura 13 – Viabilidade de hibridoma AF4 por microscopia utilizando

corante vital Azul de Trypan. (A) Célula viável caracteriza-se por

exclusão do corante (refringência), citoplasma homogêneo e membrana

íntegra com aspecto liso; (B) Célula morta cora-se com Azul de Trypan.

(A)

(B)

CAPÍTULO II

ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-AFLATOXINA B

: SCALE-UP,

PURIFICAÇÃO-PARCIAL E DESENVOLVIMENTO DA COLUNA DE

IMUNOAFINIDADE

MATERIAL E MÉTODOS

Purificação parcial de anticorpo monoclonal IgG anti-AFB

A purificação parcial de anticorpo monoclonal (AcM) anti-AFB

foi

realizada pela precipitação de proteínas com sulfato de amônio (40 % de saturação) (item

4.2.6.1).

Desenvolvimento da coluna de imunoafinidade (CIA) para detecção de AFB

empregando AcM anti-AFB

A coluna de imunoafinidade para análise de AFB

foi desenvolvida com

suporte ativado de imunoafinidade (Activated Immunoaffinity Supports) Affi-Gel 10 (Bio-

Rad) e anticorpo monoclonal produzido e parcialmente purificado em nosso laboratório,

seguindo as instruções do fabricante de Affi-Gel 10 (item 4.3.1).

Manutenção de CIA Affi-Gel 10

A coluna foi mantida a 4º C em PBS (tampão fosfato de sódio) contendo

0,02 % de azida sódica (NaN

) (item 4.3.2).

Avaliação da eficiência de acoplamento de anticorpos à CIA Affi-Gel 10

A eficiência de acoplamento de anticorpos monoclonais ao suporte Affi-Gel

10 foi determinada por quantificação de anticorpos eluídos na etapa de lavagem da coluna por

absorção a 280 nm após o período de imobilização entre ligante e gel (suporte) (item 4.3.3).

Determinação da capacidade de retenção de AFB

em CIA Affi-Gel 10

A capacidade de CIA desenvolvida em reter AFB

foi determinada por

comparação entre concentração de AFB

adicionada e eluída da coluna (item 4.3.4).

Teste de recuperação de AFB

em CIA Affi-Gel 10

A coluna de imunoafinidade confeccionada com o suporte Affi-Gel 10 foi

avaliada quanto à eficiência na limpeza e determinação de AFB

em milho (item 4.4).

Cinqüenta gramas de milho (48 mesh) foram artificialmente contaminados

com solução padrão de AFB

(Sigma) (10 ng/mL em metanol) para as concentrações de 5, 15

e 30 ng AFB

/g alimento. As amostras foram mantidas em repouso por 24 horas a 25º C,

submetidas à extração e limpeza em CIA Affi-Gel 10 para posterior quantificação por

espectrofluorimetria (itens 4.4.1, 4.4.2, 4.4.3 e 4.4.4).

Regeneração de CIA Affi-Gel 10

Após o uso, a CIA Affi-Gel 10 foi regenerada conforme Nakajima et al.

(1990) e avaliada quanto à reutilização (item 4.4.5).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Scale-up e purificação parcial de anticorpo monoclonal

O scale-up da produção de AcM IgG anti-AFB

foi conduzido com

hibridoma AF4 em meio Hybridoma-SFM suplementado (2 mM L-glutamina, 100 U/mL

penicilina e 100 µg/mL estreptomicina), inoculado com 2,5 a 5,0 x 10

células/mL, sob

cultivo estático por 15 dias, sem substituição de meio, i.e. até morte celular. O processo

resultou no total de 7700 mL de sobrenadante com 632,63 mg de proteína (82,18 µg/mL)

(Tabela 3). O fato mostrou que embora o cultivo de hibridoma em meio sintético forneça

baixa concentração de IgG, em torno de 50,00 µg/mL (HARLOW & LANE, 1988b), o uso de

L-glutamina aliado ao cultivo até morte celular justificou o aumento de teor protéico para

82,18 µg/mL.

O AcM foi precipitado com sulfato de amônio (40 % de saturação), já que

constitui técnica de concentração e purificação parcial simples e de baixo custo (HARLOW &

LANE, 1988c). A Figura 14 esquematiza o fluxograma dos processos de purificação testados.

O AcM do sobrenadante de cultivo 1 e 2 (Figura 14) foi precipitado com sulfato de amônio,

dialisado em PBS e, após leitura a 280 nm, acondicionado em tubos e armazenado a -20º C. O

congelamento de anticorpo monoclonal dialisado em PBS após precipitação com sulfato de

amônio (45 % de saturação) até o uso também tem sido seguido por Pfeiffer et al. (1987). A

leitura a 280 nm constitui método rápido de quantificação protéica em solução sem destruição

do analito, sendo que a absorção ocorre devido à presença de tirosina e triptofano (NELSON

& COX, 2000; HARLOW & LANE, 1988e). Após 4 meses, as soluções foram descongeladas,

dialisadas em água ultra-pura para eliminar sais e lidas a 280 nm. Houve aumento no teor

protéico no fator de 1,6 a 1,8 (Tabela 3), indicando que o processo de congelamento e

descongelamento causou desnaturação e agregação de anticorpo, com possível perda de

atividade por efeito estérico no sítio de ligação Ag-Ac, ou pela formação de material

insolúvel. Este pode ser removido por filtração ou centrifugação (HARLOW & LANE,

1988c), mas ambos os fatos provavelmente contribuíram para expor maior número de

resíduos de tirosina e triptofano, aumentando a leitura de absorvância. A solução foi

congelada (-20º C) e liofilizada (-50º C) para aumentar a concentração de Ac destinado ao

desenvolvimento de CIA (25 a 30 mg/mL de gel), e armazenada a -20º C (Ac utilizado na

confecção de CIA 7, 8 e 9). Os sobrenadantes de cultivo 3 e 4 (Figura 14) submetidos ao

mesmo processo de purificação parcial dos sobrenadantes 1 e 2 (até a primeira diálise em

PBS) foram quantificados a 280 nm, aliquotados e armazenados a -20º C.

Tendo em vista a desnaturação de AcM, eliminou-se a etapa de

congelamento, submetendo o sobrenadante de cultivo diretamente às diálises (sobrenadante 5

e 6). O sobrenadante de cultivo 5 (Figura 14) foi precipitado com sulfato de amônio (40 % de

saturação), dialisado em PBS e em água ultra-pura, obtendo 101,97 mg de proteína (280 nm).

Após aliquotar o AcM semi-puro, procedeu-se o congelamento (-20º C), liofilização (-50º C)

e armazenamento a -20º C, até a confecção de CIA 2 a 6.

Com a finalidade de reduzir o custo de scale-up, no experimento seguinte

inseriu-se a etapa de concentração por ultrafiltração para reduzir a quantidade de sulfato de

amônio adicionado (KONDO et al., 2000). A ultrafiltração de sobrenadante 6 (2,9 L) (Figura

14) reduziu o volume para 440 mL e aumentou a concentração de proteína no fator de 5,79,

para prosseguir com etapa de purificação com sulfato de amônio. Após diálise em PBS e água

ultra-pura, os anticorpos foram quantificados a 280 nm, congelados (-20º C), liofilizados (-50º

C) e armazenados a -20º C até a confecção de CIA 1.

A Tabela 4 compara os processos de purificação de AcM dos sobrenadantes

5 e 6. Os resultados indicaram que a ultrafiltração (sobrenadante 6) reduziu a recuperação de

Acs para 74,20 % no final da purificação, em comparação ao método sem-ultrafiltração

(sobrenadante 5, 80,40 % de recuperação). A vantagem consistiu na economia de sulfato de

amônio, reduzindo o reagente de 704,7 para 106,92 g (redução de 84,83 %).

A etapa sobre purificação de anticorpo atingiu sucesso parcial, devido à

persistência de problemas relacionados ao congelamento e descongelamento, desnaturando

AcM produzido, devendo-se adotar cuidados para melhorar a eficiência de AcM, sem

prejudicar a purificação. A desvantagem da precipitação com sulfato de amônio consistiu na

precipitação de outras proteínas de alta massa molecular, além de AcM alvo (HARLOW &

LANE, 1988c). Uma solução seria inclusão da etapa de precipitação empregando menor

concentração de sulfato de amônio (< 40 % saturação), para remover agregados protéicos

indesejáveis, antes de prosseguir com a coleta de AcM desejado. Considerando a

sensibilidade deste AcM ao congelamento e descongelamento, o AcM em uso deveria ser

armazenado a 4º C, evitando-se ao máximo mudanças bruscas (ambiente climatizado,

transporte, constância na condição de manutenção). Harlow e Lane (1988c) garantiram a

estabilidade de 6 meses para AcM mantido sem congelamento, assim como recomendaram

armazenamento de AcM purificado em alta concentração (≥ 1 mg/mL) e pH neutro,

concentrado sob ultrafiltração.

Desenvolvimento da coluna de imunoafinidade anti-AFB

empregando Affi-Gel 10

O AcM purificado e liofilizado foi utilizado para o desenvolvimento de 9

colunas de imunoafinidade, denominadas de CIA 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9. A Figura 15

esquematiza o fluxograma referente a ensaios experimentais envolvendo CIA desenvolvida

com AcM anti-AFB

(CIA Affi-Gel 10) e respectivos testes da capacidade de retenção e

recuperação de AFB

(CIA 1 a 9).

A CIA 1 (Figura 16), desenvolvida com AcM liofilizado obtido de

sobrenadante 6 (139,74 mg/5,0 mL), utilizou tampão bicarbonato de sódio como tampão de

ligação e 3 mL de suporte gel ativado (Affi-Gel 10). A quantidade de AcM acoplado ao gel

não foi determinada. O gel acoplado com IgG foi acondicionado em seringa de 5 mL e

mantido a 4º C com 0,02 % de azida sódica. Para testar a capacidade de retenção de AFB

introduziu-se 5 mL de AFB

(10 ng/mL, Sigma) para saturar os sítios de ligação micotoxina-

AcM anti-AFB

e a AFB

foi eluída em 3 frações seqüenciais de 1 mL de metanol

(quantificação por espectrofluorimetria, 350-440 nm de excitação e emissão,

respectivamente). A Tabela 5 apresenta a AFB

retida em CIA; todas as frações eluídas com

metanol continham AFB

, sendo que a fração 3 reteve maior quantidade (30,59 ng). Fixando o

total de AFB

introduzida na CIA 1 em 50 ng, a coluna desenvolvida apresentou capacidade

de retenção de 42,20 ng (soma de AFB

das 3 frações eluídas). A espectrofluorimetria de

solução pós-coluna de AFB

em metanol água, i.e. solução anterior à eluição com metanol,

detectou 8,05 ng de AFB

, indicando saturação da coluna. Assim sendo, esta coluna seria

indicada para uso em concentração de AFB

< 42 ng, devendo eluir a toxina com 3,0 mL de

metanol. A coluna Aflatest-P (VICAM) emprega 1 mL de metanol para eluir até 150 ng/g de

aflatoxina, indicando diferença qualitativa e quantitativa no Ac acoplado à coluna.

Considerando a capacidade de retenção de AFB

(42,20 ng) e a quantidade

de gel utilizado em ensaios no Japão (0,2 a 0,3 mL de gel) (KAWAMURA, informação

pessoal, Kagawa University) confeccionou-se as CIAs subseqüentes, reduzindo a quantidade

de gel acoplado com AcM para 0,5 mL (Figura 17).

As CIAs 2, 3, 4, 5 e 6 foram desenvolvidas misturando AcM liofilizado

obtido de sobrenadante 6 (47,77 mg) e 5 (101,97 mg), utilizando tampão de ligação

bicarbonato de sódio (5,5 mL) e o gel acoplado (3 mL) mantido a 4º C com 0,02 % de azida

sódica. A solução de AcM foi quantificada a 280 nm quanto ao teor de proteína (IgG) pré e

pós-acoplamento com o suporte Affi-Gel 10 (Tabela 6), para determinar a quantidade de AcM

acoplado. A quantidade inicial de proteína (pré-liofilização, 149,74 mg) diferenciou da

quantidade pós-liofilização ressuspendida em tampão de ligação (125,03 mg), na fase anterior

ao acoplamento com Affi-Gel 10. A diferença pode ser devido à perda de material durante a

liofilização. Por outro lado, a diálise com água ultra-pura removeu os sais e diminuiu danos à

molécula protéica, impedindo desnaturação, se comparado ao efeito observado na Tabela 3.

Salienta-se também que este concentrado protéico sofreu apenas uma etapa de congelamento,

evitando provável dano seqüencial, como ocorrido com o processo conduzido com

sobrenadante 1 e 2 (Figura 14). Após acoplamento, o AcM não acoplado foi separado do gel

(centrifugação) e a quantidade de proteína no sobrenadante determinada a 280 nm (Tabela 6).

O gel foi lavado com PBS para remover o AcM não-ligado, sendo o teor de proteína na

solução de lavagem também quantificado a 280 nm (Tabela 6). Os resultados mostraram-se

incoerentes, já que a quantidade de proteína na solução pré-acoplamento (pós-liofilização)

apresentou-se inferior (125,03 mg) ao valor pós-acoplamento somado à quantidade na solução

de lavagem (189,53 mg), indicando interferência de Affi-Gel residual na absorção a 280 nm.

Esta interferência do gel não foi eliminada mesmo com a centrifugação (2400 x g, 5 min),

com redução mínima no teor de proteína pós-acoplamento e solução de lavagem (145,29 mg),

impedindo o cálculo da quantidade de AcM acoplado ao suporte Affi-Gel (Tabela 6).

A CIA 2 foi confeccionada em seringa de 1 mL, introduzindo 0,5 mL de

suporte Affi-Gel 10 acoplado com AcM, e analisou-se a capacidade de retenção de AFB

Cinco mL de solução de AFB

(10 ng/mL, Sigma, > 99 % pureza) foram introduzidos na CIA

2 e a toxina eluída seqüencialmente com 5 mL e 10 mL de metanol (KAWAMURA,

informação pessoal, Kagawa University), e quantificada por espectrofluorimetria testando

diferentes comprimentos de excitação e emissão (Figura 18, Tabela 7). A Tabela 7 mostra a

variação da capacidade de retenção de AFB

(18,87 a 25,32 ng), dependente do comprimento

de onda. Esta variação ocorreu devido à diferença no espectro da fluorescência de AFB

com

a mudança do comprimento de onda de excitação e emissão (Figura 18). A escolha de 360 nm

para excitação e 420 nm para emissão baseou-se na maior leitura obtida durante análise de

mesma solução, aliada a sensibilidade e estabilidade entre leituras consecutivas (Figura 18).

Tarín et al. (2004) também utilizaram 360 nm para excitação e 420 nm para emissão para

análise de aflatoxina em detector de fluorescência acoplado a CLAE. Assim, a capacidade de

retenção de AFB

pela CIA 2 foi definida em 25,32 ng.

Um teste em paralelo foi realizado com a curva padrão de AFB

para

analisar a estabilidade da fluorescência de AFB

durante 57 min, utilizando 360 e 420 nm

como comprimento de excitação e emissão, respectivamente (Figura 19). O gráfico mostra

que não houve variação considerável na fluorescência detectada no decorrer de 57 min,

mantendo o coeficiente de determinação (R

) quase inalterado (0,9980 a 0,9997). Isto

significa que os dados estão bem ajustados à equação da reta.

As CIAs 3, 4, 5 e 6 foram confeccionadas em seringa de 1 mL (0,5 mL de

suporte Affi-Gel acoplado com AcM) para realizar teste de recuperação de AFB

em milho

em 3 níveis de contaminação artificial: 5, 15 e 30 ng/g. A AFB

foi eluída da CIA com 2

frações de 10 mL de metanol e quantificada por espectrofluorimetria e CCD. A Tabela 8

mostra que a CIA desenvolvida não foi eficiente na limpeza de amostra, obtendo-se elevada

fluorescência com AFB

recuperada atingindo 1146,20 %, indicando interferência direta de

matriz alimentar. A corrida por CCD também mostrou inúmeras bandas interferentes,

impedindo a análise de AFB

. Os compostos interferentes podem ser oriundos de extração

prolongada (30 min), ausentes numa extração rápida (1 min) (VICAM, Manual de Instruções

de Aflatest).

As CIAs 7, 8 e 9 originaram de sobrenadante 1 (74,05 mg de AcM

liofilizado) adicionado de 3 mL de suporte Affi-Gel 10, mudando tampão de ligação para

HEPES pH 8,0 (7,5 mL, Sigma Chemical Co., H-3375, St. Louis, MO). O gel acoplado foi

mantido a 4º C até o preparo de CIA 7, 8 e 9 (0,5 mL de gel em seringa de 1 mL), sendo as

etapas de acoplamento monitoradas quanto ao teor protéico por Método de Lowry (LOWRY,

1951). A Tabela 6 mostra incoerência nos dados obtidos, já que a quantidade de proteína

determinada (661,88 mg) foi muito superior à quantidade existente (74,05 mg), descartando o

Método de Lowry para esta finalidade. Uma nova tentativa de quantificar os AcMs acoplados

foi realizada acidificando o pH da solução de Acs, já que a presença dos resíduos de N-

hidroxisuccinamida (componente do suporte Affi-Gel 10) interfere na detecção de proteína,

devido à absorção a 280 nm em pH neutro ou básico (BIO-RAD, 2000). Mesmo assim, os

resultados obtidos não foram satisfatórios (Tabela 6), pois se eliminou a interferência de N-

hidroxisuccinamida na leitura a 280 nm, mas não os Acs interferentes (presentes no SFB) e

desnaturados, que aumentaram a leitura protéica. Uma alternativa para obter a quantidade de

AcM acoplado ao gel seria utilizar a metodologia de Bradford para determinação de proteínas

(BRADFORD, 1976).

A CIA 7 foi preparada para teste de recuperação de AFB

em milho

contaminado artificialmente com 30 ng/g de padrão de AFB

. A aflatoxina foi eluída com 2

frações de 7,5 mL de metanol e quantificada por espectrofluorimetria (360-420 nm). A Tabela

9 indicou que a CIA desenvolvida não foi eficiente na limpeza de interferentes naturais da

matriz alimentar, i.e. capturou componentes fluorescentes, aumentando a fluorescência e,

conseqüentemente, a recuperação de AFB

para mais de 100 %. A extração de AFB

com

tempo reduzido (1 min) não diminuiu a interferência de compostos fluorescentes presentes na

amostra. Isto pode ser decorrente de ligações inespecíficas de componentes de matriz

alimentar com sítios ativos da CIA não acoplados com AcM. O fabricante de suporte Affi-Gel

10 recomenda bloquear os ésteres ativos restantes com glicina-etil-éster 1M, pH 8,0, para

minimizar a interferência, procedendo ao capeamento de CIA (BIO-RAD, 2000).

As CIAs 8 e 9 foram utilizadas para teste de capeamento de CIA

desenvolvida, empregando glicina-etil-éster 1M, pH 8,0 (BIO-RAD, 2000) e leite desnatado

5% (p/v) em PBS, recomendado como solução bloqueadora em ensaios imunoenzimáticos

(HARLOW & LANE, 1988d). A reação de capeamento com glicina-etil-éster foi conduzida

por 1 hora a 25º C, enquanto a reação com leite desnatado foi incubada por 4 horas a 25º C.

Em seguida, as CIAs foram lavadas com água ultra-pura para retirar o reagente não-ligante à

CIA e imediatamente acondicionadas em PBS. O teste de recuperação de AFB

foi realizado

com milho contaminado artificialmente com 5 ng/g, e a toxina eluída com 2 frações de 7,5

mL de metanol e quantificada por espectrofluorimetria (360-420 nm). Durante a eluição de

aflatoxina da CIA, percebeu-se que parte do reagente não ligado à CIA, não foi retirado

completamente com a lavagem de água ultra-pura, pois apareceu como fase contaminante na

primeira fração eluída, i.e. fase esbranquiçada acima do metanol. Isto ocorreu devido ao não

acondicionamento da coluna com o solvente de eluição (metanol) previamente ao uso, como

recomendado pelo manual do fabricante. Na análise espectrofluorimétrica da amostra, a

fluorescência detectada sofreu interferência tanto dos resíduos de reagente quanto de

compostos presentes no milho, sugerindo alta porcentagem de recuperação (658,60 a 1012,40

%) (Tabela 10). O fato indicou que a reação de capeamento não foi eficaz para permitir

limpeza completa de amostra e detecção de AFB

. Outro fator importante a ser considerado é

o emprego de AcM anti-AFB

bastante debilitado pelo processo de purificação e concentração

envolvendo etapas de congelamento e descongelamento.

Em suma, embora a CIA Affi-Gel 10 confeccionada tenha apresentado

ineficiência na limpeza de amostra e recuperação de AFB

, o AcM anti-AFB

produzido

mostrou-se ativo no teste de capacidade de retenção desta micotoxina, devendo-se prosseguir

com estudo inserindo novas condições de capeamento de coluna e ensaios de padronização.

Assim, a disponibilidade de AcM específico, limpeza de extrato alimentar em única etapa

cromatográfica, uso reduzido de solventes tóxicos e possibilidade de reutilização, justificam o

desenvolvimento de CIA, visando minimizar o custo referente à aquisição e aplicação no

controle de qualidade.

Figura 14 – Purificação parcial de anticorpo monoclonal (AcM) anti-AFB

por precipitação com (NH

)

(40 % saturação) visando desenvolvimento de coluna de

imunoafinidade (CIA). Meio RPMI 1640 (RPMI) e Hybridoma-SFM (H-SFM). Tampão fosfato de sódio (PBS). Soro fetal bovino (SFB).

Congela (-20º C) – Descongela

Diálise água ultra-pura

Absorção 280 n

122,04 mg proteína

45,0 mL

2,71 mg/mL

Congelamento (-20º C)

Liofilização (-50º C)

Armazenamento (-20º C)

89,19 mg proteína

32,0 mL

2,79 mg/mL

Precipitação (NH

)

40 % saturação

Diálise PBS

Absorção 280 nm

74,05 mg proteína

37,5 mL

1,97 mg/mL

49,66 mg proteína

24,5 mL

2,03 mg/mL

101,97 mg proteína

37,0 mL

2,76 mg/mL

187,51 mg proteína

72,0 mL

2,60 mg/mL

Concentração por

ultrafiltração

440 mL

Precipitação (NH

)

40 % saturação

Diálise PBS

Diálise água ultra-pura

Absor

ão 280 n

Congelamento (-20º C)

Liofilização (-50º C)

Armazenamento (-20º C)

CIA 7 a 9

(0,5 mL)

Precipitação (NH

)

40 % saturação

Diálise PBS

Absorção 280 nm

Armazenamento (-20º C)

113,24 mg proteína

42,0 mL

2,70 mg/mL

106,20 mg proteína

40,0 mL

2,66 mg/mL

CIA 2 a 6

( 0,5 mL)

CIA 1

(3 mL)

Produção de AcM

(Hibridoma AF4)

Padronização, otimização

Sobrenadante 1 (4º C)

(RPMI + SFB)

1075 mL

Sobrenadante 2 (4º C)

(H-SFM)

630 mL

Sobrenadante 3 (4º C)

(RPMI + SFB)

1000 mL

Sobrenadante 4 (4º C)

(RPMI + SFB)

1000 mL

Sobrenadante 5 (4º C)

(H-SFM)

1095 mL

Sobrenadante 6 (4º C)

(H-SFM)

2900 mL

Figura 15 – Desenvolvimento de coluna de imunoafinidade (CIA) utilizando anticorpo monoclonal (AcM) anti-AFB

e suporte Affi-Gel 10, e testes de capacidade de retenção e

recuperação de AFB

em CIA desenvolvida.

CIA 7 (0,5 mL)

Teste Recuperação

AFB

Milho + 30 ng AFB

Espectrofluorimetria

CIA 8 e 9 (0,5 mL)

Capeamento

Milho + 5 ng

AFB

Teste Recuperação

AFB

Eluição CH

2 frações de 7,5 mL

Eluição CH

2 frações de 7,5 mL

AcM liofilizado (-20º C)

74,05 mg/7,5 mL

Tampão HEPES

Armazenamento (4º C)

0,02 % NaN

Affi-Gel 10 (3 mL)

acoplado com AcM

Método de

Lowry

AcM acoplado

Absorção a

280 nm

Espectrofluorimetria

Leite

desnatado

Glicina-etil

éster

Precipitação (NH

)

Diálise e liofiliza

ão

AcM liofilizado (-20º C)

149,74 mg/5,5 mL

Tampão NaHCO

Affi-Gel 10 (3 mL)

acoplado com AcM

Absorção a

280 nm

AcM acoplado

Armazenamento (4º C)

0,02 % NaN

Espectrofluorimetria

CIA 2 (0,5 mL)

Teste Capacidade

Retenção de AFB

Padrão AFB

10 ng/mL – 5 mL

Eluição CH

Fração 1: 5 mL

Fração 2: 10 mL

CIA 3 a 6 (0,5 mL)

Teste Recuperação

AFB

Milho

5, 15 e 30 ng AFB

Eluição CH

2 frações de 10 mL

AcM liofilizado (-20º C)

139,74 mg/5,0 mL

Tampão NaHCO

CIA 1 (3 mL)

AcM acoplado

n.d.

Armazenamento (4º C)

0,02 % NaN

Teste Capacidade

Retenção de AFB

Padrão AFB

10 ng/mL – 5 mL

Eluição CH

3 frações de 1 mL

Espectrofluorimetria

Capacidade de CIA

Precipitação (NH

)

Congela/descongela

Diálise e liofilização

Determinação

Capacidade de CIA

Escolha melhor

excitação e emissão

Espectrofluorimetria CCD

AcM anti-AFB

(

Hibridoma AF4

)

Precipitação (NH

)

Diálise e liofilização

Tabela 3 – Proteína (IgG) produzida por hibridoma AF4 em diferentes meios de cultivo, quantificada por absorção a 280 nm.

Pós-diálise em PBS Pós-diálise em água ultra-pura

Sobrenadante Meio cultivo Volume [ ] Proteína Proteína

Volume [ ] Proteína Proteína

Fator Proteína considerada

(mL) (mg/mL) (mg) (mL) (mg/mL) (mg) (b/a) (mg)

1 RPMI + SFB 37,5 1,97 74,05 15,0 2,71 122,04 1,65 74,05

2 H-SFM 24,5 2,03 49,66 16,0 2,79 89,19 1,80 49,66

3 RPMI + SFB 42,0 2,70 113,24 n.d. n.d. n.d. --- 113,24

4 RPMI + SFB 40,0 2,66 106,20 n.d. n.d. n.d. --- 106,20

5 H-SFM n.d. n.d. n.d. 37,0 2,76 101,98 --- 101,98

6 (UF) H-SFM n.d. n.d. n.d. 72,0 2,60 187,50 --- 187,50

Total

632,63

UF – Ultrafiltração

RPMI – meio RPMI 1640

H-SFM – meio Hybridoma-SFM

SFB – soro fetal bovino

PBS – tampão fosfato de sódio

n.d. – não determinado

Tabela 4 – Comparação entre os processos de semi-purificação de anticorpo monoclonal dos sobrenadantes 5 e 6.

Sobrenadante 5 Sobrenadante 6

Tratamento Volume Proteína Proteína Recuperação (NH

)

Volume Proteína Proteína Recuperação (NH

)

(mL) [ ] mg/mL Total (mg) (%) (g) (mL) [ ] mg/mL Total (mg) (%) (g)

Pré-Ultrafiltração

1095 0,116 127,02 100,00 266,09 2900 0,087 252,30 100,00 704,70

Pós-Ultrafiltração

n.d. n.d. n.d. n.d. --- 440 0,504 221,76 87,90 106,92

Pós-(NH

)

37 2,76 102,12 80,40 --- 72 2,600 187,20 74,20

---

n.d. – não determinado

Tabela 5 – Teste preliminar de capacidade de retenção de AFB

pela coluna de imunoafinidade desenvolvida com

anticorpo monoclonal anti-AFB

e suporte Affi-Gel 10 (CIA Affi-Gel 10), com quantificação de AFB

por

espectrofluorimetria (350-440 nm).

AFB

Fração* (ng/mL) (ng)

1,21 2,43

4,59 9,18

15,29 30,59

4,02 8,05

Total

50,25

*Fração de metanol contendo AFB

eluída da CIA Affi-Gel 10: 1, 2 e 3 (1mL)

RP – Quantidade restante de padrão introduzida em CIA

Tabela 6 – Determinação de proteína (IgG) acoplada à coluna de imunoafinidade desenvolvida com anticorpo

monoclonal anti-AFB

e suporte Affi-Gel 10 (CIA Affi-Gel 10).

Proteína (mg)

Método pré-liofilização pós-liofilização pós-acoplamento solução lavagem acoplada

(mg) (mg) (mg) (mg) (mg)

A 280 nm

149,74 125,03 139,23 50,30 n.d.

A 280 nm (2400 x g)

149,74 125,03 98,94 46,35 n.d.

Método de Lowry

74,05 661,88 n.d. n.d. n.d.

A 280 nm (acidificado)

74,05 417,23 262,13 n.d. n.d.

A 280 – Absorção a 280 nm

A 280 (2400 x g) – Absorção a 280 nm após centrifugação a 2400 x g

A 280 (acidificado) – Absorção a 280 nm após acidificação do pH para 5,5

n.d. – não determinado

Tabela 7 – Capacidade de retenção de AFB

pela coluna de imunoafinidade desenvolvida com

anticorpo monoclonal anti-AFB

e suporte Affi-Gel 10 (CIA Affi-Gel 10), considerando

diferentes comprimentos de onda de excitação e emissão na análise espectrofluorimétrica.

AFB

(ng)

CIA

Affi-Gel 10

350-440

(nm)

350-450

(nm)

360-420

(nm)

365-425

(nm)

365-435

(nm)

365-440

(nm)

15,94 15,31 18,98 17,27 14,54 14,53

5,13 5,48 6,34 6,35 4,48 4,34

Capacidade

21,07 20,79 25,32 23,62 19,02 18,87

F1 – primeira fração de metanol eluída da CIA Affi-Gel 10

F2 – segunda fração de metanol eluída da CIA Affi-Gel 10

Tabela 8 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho utilizando 3 níveis de

contaminação artificial (5, 15 e 30 ng/g), com extração em tempo prolongado (30 min),

limpeza de amostra em coluna de imunoafinidade confeccionada com suporte Affi-Gel 10 e

anticorpo monoclonal anti-AFB

, e quantificação por espectrofluorimetria (360-420 nm).

AFB

adicionada Fração* AFB

recuperada Recuperação (%)

(ng/g) (ng/g) (soma frações)

5 1 44,26 1146,2

5 2 13,05

15 1 31,15 291,67

15 2 12,6

30 1 27,14 136,23

30 2 13,73

*Fração de metanol contendo AFB1 eluída da coluna: 10 mL cada

Tabela 9 – Teste de recuperação de AFB

em milho contaminado artificialmente com 30 ng/g,

com extração em tempo reduzido (1 min), limpeza de amostra em CIA confeccionada com

suporte Affi-Gel 10 e anticorpo monoclonal anti-AFB

, e quantificação por

espectrofluorimetria (360-420 nm).

AFB

adicionada Fração* AFB

recuperada Recuperação (%)

(ng/g) (ng/g) (soma frações)

30 1 41,06 188,67

30 2 15,54

*Fração de metanol contendo AFB

eluída da coluna: 7,5 mL cada

Tabela 10 – Teste de recuperação de AFB

em milho contaminado artificialmente com 5 ng/g,

com limpeza de amostra em coluna de imunoafinidade confeccionada com suporte Affi-Gel

10 e anticorpo monoclonal anti-AFB

, capeada com glicina-etil-éster ou leite desnatado, e

quantificação por espectrofluorimetria (360-420 nm).

AFB

adicionada Fração

Agente de capeamento

AFB

recuperada Recuperação (%)

(ng/g) (ng/g) (soma frações)

5 1 glicina-etil-éster 30,68 1012,4

5 2 19,94

5 1 leite desnatado 26,17 658,6

5 2 6,76

Fração de metanol contendo AFB

eluída da coluna: 7,5 mL cada

Reagente utilizado no capeamento de CIA Affi-Gel 10: glicina-etil-éster 1,0 M, pH 8,0; leite desnatado 5 %

Figura 16 – CIA 1 anti-AFB

confeccionada com 3 mL de Affi-Gel 10.

Figura 17 – CIA anti-AFB

confeccionada com 0,5 mL de Affi-Gel 10.

= 0,9980

= 0,9997

= 0,9995

= 0,9988

= 0,9996

-0,5

0,5

1,5

2,5

3,5

0 5 10 15 20 25 30

AFB

(ng/mL)

Fluorescência

350-440 nm

350-450 nm

360-420 nm

365-425 nm

365-435 nm

365-440 nm

Figura 18 – Comportamento da fluorescência de AFB

com a variação de comprimento de onda de excitação e emissão.

= 0,9973

= 0,9991

= 0,9983

= 0,9944

= 0,9971

= 0,9974

= 0,9972

= 0,9990

-0,5

0,5

1,5

2,5

0 5 10 15 20 25 30

AFB

(ng/mL)

Fluorescência

Tempo 0

1,5 min

3 min

8 min

11 min

15 min

36 min

57 min

Figura 19 – Variação da fluorescência de AFB

em função do tempo, utilizando 360 e 420 nm como comprimento de onda de excitação e emissão,

respectivamente.

CAPÍTULO III

COLUNA DE IMUNOAFINIDADE PARA ESPECTROFLUORIMETRIA:

DETECÇÃO DE AFB

EM MILHO

PELA CIA COMERCIAL VERSUS CIA AFFI-

GEL 10-AcM ANTI-AFB

DESENVOLVIDA

MATERIAL E MÉTODOS

Teste de recuperação de AFB

em CIA Affi-Gel 10 e CIA Aflatest-P

A coluna de imunoafinidade (CIA) confeccionada com o suporte Affi-Gel

10 (CIA Affi-Gel 10) foi avaliada quanto à eficiência na limpeza e determinação de AFB

milho, em comparação à CIA comercial Aflatest-P (VICAM) (item 4.4).

Cinqüenta gramas de milho (48 mesh) foram artificialmente contaminados

com solução padrão de AFB

(Sigma) (10 ng/mL em metanol) para as concentrações de 5, 15

e 30 ng AFB

/g alimento. As amostras foram mantidas em repouso por 24 horas a 25º C,

extraídas e submetidas à limpeza em CIA Affi-Gel 10 e CIA Aflatest-P para posterior

quantificação por espectrofluorimetria (itens 4.4.1, 4.4.2, 4.4.3 e 4.4.4).

Regeneração de CIA Affi-Gel 10

Após o uso, a CIA Affi-Gel 10 foi regenerada conforme Nakajima et al.

(1990) e avaliada quanto à reutilização (item 4.4.5).

Comparação entre espectrofluorimetria e CCD para análise de AFB

A contaminação de milho procedeu-se conforme item 4.4.1. As amostras

foram mantidas em repouso por 24 horas a 25º C, submetidas à extração e limpeza em CIA

comercial Aflatest-P para posterior quantificação por cromatografia em camada delgada

(CCD) e espectrofluorimetria (itens 4.5.2, 4.5.3, 4.5.4 e 4.5.5).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O desempenho de CIA Affi-Gel 10 (Figura 20) foi comparado à CIA

comercial Aflatest-P (Figura 21) quanto à eficiência no processo de limpeza e recuperação de

AFB

em milho. A escolha de matriz alimentar milho baseou-se na persistente ocorrência de

aflatoxina em milho em regiões do Brasil, como Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul,

Goiás, Rio de Janeiro, São Paulo e Paraíba (BALDISSERA et al., 1992; SOARES &

FURLANI, 1992; POZZI et al., 1995; CARDOSO & BRAGA, 1997; BADIALE-FURLONG

et al., 1998; MENEGAZZO, 1998; ONO et al., 1998b; PICH et al., 1998; CORREA et al.,

2000; RIBEIRO et al., 2000 apud SALAY & MERCADANTE, 2002, p.89).

A Figura 22 esquematiza o teste preliminar de recuperação de AFB

milho utilizando 3 níveis de contaminação artificial (5, 15 e 30 ng/g), com limpeza de amostra

em CIA Aflatest-P e CIA Affi-Gel 10, e análise por CCD e espectrofluorimetria. A pureza do

padrão de AFB

, i.e. banda única com fluorescência azul, foi confirmada em CCD. O extrato

bruto de milho, seco e resssuspendido em clorofórmio para análise em CCD formou grumos

insolúveis, provavelmente devido à alteração na polaridade do solvente ao longo de 30 min,

resultando em compostos interferentes adicionais menos polares. A partição deste extrato

bruto com hexano (3 vezes) removeu parcialmente os interferentes lipídicos (JAIMEZ et al.,

2000). Em seguida, adicionou-se a água e procedeu-se a partição com clorofórmio. O

processo permitiu obter resíduo capaz de ressuspender em clorofórmio e proceder CCD,

embora não eliminasse os interferentes, dificultando a análise de aflatoxina.

O mesmo extrato bruto foi submetido à limpeza em CIA e quantificado por

espectrofluorimetria (360-420 nm, definido CAPÍTULO II). A AFB

foi eluída de CIA

Aflatest-P com 1 mL de metanol, enquanto que se empregou 2 frações de 10 mL para CIA

Affi-Gel 10. A Tabela 11 mostra uma baixa recuperação de AFB

(29,60 a 62,03 %, Aflatest-

P), enquanto a Tabela 12 apresenta uma superestimação de resultados, ultrapassando 100 %

de recuperação (136,23 a 1146,20 %, Affi-Gel 10), indicando problemas na extração de

aflatoxina; soma-se ainda a ineficácia de CIA Affi-Gel 10 na eliminação de interferentes. A

extração por 30 min aumentou compostos interferentes, afetando a interação de antígeno-

anticorpo na CIA por efeito estérico.

Na etapa seguinte reduziu-se o tempo de extração para 1 min e procedeu-se

teste de recuperação com 5 e 30 ng/g de AFB

em CIA Aflatest-P e 30 ng/g em CIA Affi-Gel

10 (Figura 23). Após limpeza em CIA, a AFB

foi eluída com 1 mL de metanol (Aflatest-P) e

2 frações de 7,5 mL (Affi-Gel 10). A Tabela 13 mostra o aumento na recuperação para 72,40

e 79,77 % para CIA Aflatest-P, perante contaminação de 5 e 30 ng/g, respectivamente.

Yazdanpanah et al. (2001) obtiveram recuperação de AFB

de 60,9, 80,3 e 74,4 %

respectivamente para 0,25, 2 e 40 ng/g em milho empregando Aflatest (VICAM) e análise por

CLAE (365-435 nm). Os autores atingiram esta recuperação em milho contaminado com 40

ng/g de AFB

após modificar a metodologia do fabricante (anteriormente com 65-68 % de

recuperação). O mesmo extrato apresentou performance similar para Aflatest (VICAM) e

AFLAPREP (Rhone-Diagnostics Technologies Ltd., UK) com 69,2-74,4 % de recuperação. A

recuperação de 69,00 % de AFB

foi atingida em milho contaminado (0 a 50 ng/g), analisado

por CLAE com reação fotoquímica pós-coluna (360-440 nm) (VICAM, Manual de Instruções

de Aflatest). Aflatest (VICAM) seguida de fluorimetria (350-450 nm) atingiu a recuperação

de 79,27 a 122,92 % de aflatoxina total em milho (DIÁRIO OFICIAL, 2000).

Segundo o fabricante, a coluna Aflatest-P deve ser usada uma única vez, não

se recomendando a reutilização. Mesmo assim, uma avaliação perante reutilização foi

realizada com milho contaminado com 5 e 30 ng/g AFB

, sendo a coluna para uso-2 e uso-3

aleatoriamente escolhida entre as colunas já utilizadas, simulando uma análise de rotina

(Tabela 14). No segundo uso, a recuperação de AFB

decaiu consideravelmente, passando de

72,40 para 34,15 % na contaminação de 5 ng/g e de 79,77 para 50,24 % na contaminação de

30 ng/g, indicando que não convém reutilizar a CIA Aflatest-P (Tabela 14). Para confirmação,

uma CIA Aflatest-P usada e uma nova foram testadas para limpeza de amostra contaminada

com 30 ng/g. Todavia, obteve-se resultado contraditório, já que a recuperação na coluna usada

(82,88 %) apresentou-se maior que na coluna nova (37,54 %), diferindo ainda dos resultados

anteriores (Tabela 14). A performance do terceiro uso da CIA Aflatest-P também se

apresentou baixa (36,08 % de recuperação). Estes dados sugeriram variabilidade na

performance de CIAs comerciais de um mesmo lote, i.e. além de diferença na capacidade de

recuperação na reutilização, até colunas novas podem inferir erros de análise, devendo-se

analisar reprodutibilidade de CIA em duplicata.

A Figura 24 mostra o teste da estabilidade de fluorescência, i.e. variação na

leitura de uma mesma amostra (AFB

recuperada) conduzida durante 57 min. A recuperação

de AFB

calculada na contaminação de 5 ng/g variou de 3,40 a 3,88 ng/g, enquanto que na de

30 ng/g variou de 20,36 a 24,19 ng/g. Não houve uma variação linear na leitura, indicando

flutuação associada à instabilidade das condições de análise (ex, rede elétrica), e não devido à

perda de amostra por evaporação (200 µL).

A Tabela 15 mostra o teste de recuperação de AFB

em CIA Affi-Gel 10

(milho com 30 ng/g AFB

). O resultado (188,67 % de recuperação) indicou ineficácia de CIA

Affi-Gel 10 na eliminação de compostos interferentes fluorescentes, devendo-se proceder ao

capeamento para bloquear ésteres ativos do gel, não acoplados com AcM, para impedir a

ligação inespecífica do gel com interferentes de matriz alimentar (BIO-RAD, 2000; FUJII,

2007).

A Tabela 16 mostra resultado preliminar de dois testes de capeamento de

CIA utilizando glicina-etil-éster 1,0 M, pH 8,0 (BIO-RAD, 2000) e 5 % de leite desnatado em

PBS (p/v), recomendado como solução bloqueadora em ensaios imunoenzimáticos

(HARLOW & LANE, 1988d). A reação de capeamento com glicina-etil-éster foi conduzida

por 1 hora a 25º C, enquanto a reação com leite desnatado por 4 horas a 25º C. Em seguida, as

CIAs foram lavadas com água ultra-pura para retirar o reagente não-ligante à CIA e

imediatamente acondicionadas em PBS.

O teste de recuperação de AFB

foi realizado com milho contaminado

artificialmente com 5 ng/g e a CIA eluída com 2 frações de 7,5 mL de metanol e aflatoxina

quantificada por espectrofluorimetria (360-420 nm). Após a eluição de CIA, o eluato dividiu-

se em duas fases, sendo a primeira esbranquiçada (contaminante) e a segunda transparente

(metanol), sugerindo que parte do reagente não ligado à CIA não foi completamente removido

com água ultra-pura. Isto ocorreu devido ao não acondicionamento da coluna com metanol

após a fase de capeamento, i.e. entre lavagem com água e manutenção em PBS, como

recomendado pelo manual do fabricante (BIO-RAD, 2000).

Consequentemente, a fluorescência detectada consistiu da soma de

interferentes oriundos de reagente residual e componentes do milho, obtendo falsa

recuperação entre 658,60 a 1012,40 % (Tabela 16). O fato indicou que cuidados adicionais

seriam necessários durante a fase de capeamento, para permitir limpeza completa de amostra.

Salienta-se também, que o AcM anti-AFB

usado no preparo de CIA (CIA 7, 8 e 9) tinha sido

bastante debilitado pelo processo de purificação e concentração envolvendo etapas de

congelamento e descongelamento.

Os resultados mostraram a importância dos cuidados, desde a fase de

extração na análise de aflatoxina até a formação de técnicos com base analítico-científica

perante interpretação de resultados, para emitir laudos confiáveis. A CIA comercial também

requer cuidados especiais de conservação e armazenamento para que seja eficaz na detecção

de aflatoxina, evitando resultados falso-positivos. A complementação com análise

microbiológica é essencial para confirmar presença de fungos produtores de aflatoxina na

amostra analisada, assim como o histórico da amostra referente à procedência, condições de

armazenamento e processamento envolvendo tratamento térmico.

Em suma, embora a CIA Affi-Gel 10 confeccionada para análise de AFB

ainda seja ineficiente em comparação à CIA comercial Aflatest-P, o AcM anti-AFB

produzido apresentou-se específico contra AFB

, devendo-se prosseguir com estudo inserindo

novas condições de capeamento de coluna e ensaios de padronização. A disponibilidade de

AcM específico, limpeza de extrato alimentar em única etapa cromatográfica, uso reduzido de

solventes tóxicos e possibilidade de reutilização, justificam o desenvolvimento de CIA,

visando minimizar o custo de aquisição e aplicação no controle de qualidade.

Figura 20 – CIA anti-AFB

confeccionada com 0,5 mL de Affi-Gel 10.

Figura 21 – CIA comercial Aflatest-P (VICAM).

Figura 22 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho utilizando 3 níveis de contaminação artificial (5, 15 e 30 ng/g) e extração em tempo prolongado (30 min),

com limpeza prévia de amostra em CIA Aflatest-P e CIA confeccionada com Affi-Gel 10 e anticorpo monoclonal anti-AFB

, e quantificação por espectrofluorimetria e

cromatografia em camada delgada (CCD).

Milho

Teste de Recuperação

de AFB

0 ng/g

Extração (30 min)

Diluição (1:4)

CIA Aflatest-P

Eluição com 1 mL

Espectrofluorimetria

5, 15 e 30 ng/g

CIA Aflatest-P

Eluição com 1 mL

Espectrofluorimetria

Regeneração CIA

Extração (30 min)

Diluição (1:4)

CCD CCD

CIA Affi-Gel 10

Eluição 2 frações

10 mL CH

Espectrofluorimetria

Regeneração CIA

Extrato bruto

Partição com

hexano e

clorofórmio

CCD

Extrato bruto

Partição com

hexano e

clorofórmio

CCD

Figura 23 – Teste de recuperação de AFB

em milho utilizando 2 níveis de contaminação artificial (5 e 30 ng/g) e extração em tempo reduzido (1 min), com limpeza prévia

de amostra em CIA Aflatest-P e CIA confeccionada com Affi-Gel 10 e anticorpo monoclonal anti-AFB

, e quantificação por espectrofluorimetria e cromatografia em

camada delgada (CCD).

Milho

Teste de Recuperação

de AFB

0 ng/g

Extração (1 min)

Extrato bruto

Diluição (1:4)

CIA Aflatest-P

Eluição com 1

mL CH

CCD Espectrofluorimetria

5 e 30 ng/g

Extração (1 min)

Extrato bruto

Diluição (1:4)

CIA Aflatest-P

Eluição com 1

mL CH

Espectrofluorimetria

CCD

Regeneração de CIA

2º uso – 5 e 30 ng/g

Regeneração de CIA

3º uso – 30 ng/g

Regeneração de CIA

CIA Affi-Gel 10

Recuperação 30 ng/g

Eluição com 2 frações

de 7,5 mL CH

Capeamento de CIA

Leite desnatado

Glicina-

etil-éste

Recuperação 5 ng/g

Eluição com 2

frações de 7,5 mL

Regeneração de CIA

Espectrofluorimetria

Regeneração

CIA

Tabela 11 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho utilizando 3 níveis de

contaminação artificial (5, 15 e 30 ng/g), com extração em tempo prolongado (30 min),

limpeza de amostra em CIA comercial Aflatest-P, e quantificação por espectrofluorimetria

(360-420 nm).

AFB

adicionada AFB

recuperada Recuperação

(ng/g) (ng/g) (%)

0 0,19 ---

5 1,48 29,6

15 5,41 36,07

30 18,61 62,03

Tabela 12 – Teste preliminar de recuperação de AFB

em milho utilizando 3 níveis de

contaminação artificial (5, 15 e 30 ng/g), com extração em tempo prolongado (30 min),

limpeza de amostra em CIA confeccionada com suporte Affi-Gel 10 e anticorpo monoclonal

anti-AFB

, e quantificação por espectrofluorimetria (360-420 nm).

AFB

adicionada Fração* AFB

recuperada Recuperação (%)

(ng/g) (ng/g) (soma frações)

5 1 44,26 1146,2

5 2 13,05

15 1 31,15 291,67

15 2 12,6

30 1 27,14 136,23

30 2 13,73

*Fração de metanol contendo AFB

eluída da coluna: 10 mL cada

Tabela 13 – Teste de recuperação de AFB

em milho utilizando 2 níveis de contaminação

artificial (5 e 30 ng/g), com extração em tempo reduzido (1 min), limpeza de amostra em CIA

comercial Aflatest-P e quantificação por espectrofluorimetria (360-420 nm).

AFB

adicionada AFB

recuperada Recuperação

(ng/g) (ng/g) (%)

0 0,37 ---

5 3,62 72,40

30 23,93 79,77

Tabela 14 – Teste de recuperação de AFB

em milho com 2 níveis de contaminação artificial

(5 e 30 ng/g), reutilizando CIA comercial Aflatest-P para limpeza de amostra, com

quantificação por espectrofluorimetria (360-420 nm).

Uso* AFB

adicionada AFB

recuperada Recuperação

(ng/g) (ng/g) (%)

1 5 3,62 72,40

30 23,93 79,77

30 11,26 37,54

2 5 1,71 34,15

30 15,07 50,24

30 24,86 82,88

3 30 10,82 36,08

*Uso de CIA Aflatest-P: 1 (primeiro uso), 2 (segundo uso) e 3 (terceiro uso)

1,5

5 ng/g

30 ng/g

AFB

recuperada (ng/g)

Tempo de leitura (min)

Nível de

contaminação

5 ng/g

30 ng/g

Figura 24 – Variação da taxa de recuperação de AFB

de milho contaminado artificialmente em 2

níveis (5 e 30 ng/g) utilizando CIA comercial Aflatest-P para limpeza de amostra, calculada a partir da

intensidade de fluorescência detectada no decorrer de 57 min, em 360 nm de excitação e 420 nm de

emissão.

Tabela 15 – Teste de recuperação de AFB

em milho contaminado artificialmente com 30

ng/g, com extração em tempo reduzido (1 min), limpeza de amostra em CIA confeccionada

com suporte Affi-Gel 10 e anticorpo monoclonal anti-AFB

, e quantificação por

espectrofluorimetria (360-420 nm).

AFB

adicionada Fração* AFB

recuperada Recuperação (%)

(ng/g) (ng/g) (soma frações)

30 1 41,06 188,67

30 2 15,54

*Fração de metanol contendo AFB

eluída da coluna: 7,5 mL cada

Tabela 16 – Teste de recuperação de AFB

em milho contaminado artificialmente com 5 ng/g,

com limpeza de amostra em CIA confeccionada com suporte Affi-Gel 10 e anticorpo

monoclonal anti-AFB

, capeada com glicina-etil-éster ou leite desnatado, e quantificação por

espectrofluorimetria (360-420 nm).

AFB

adicionada Fração

Agente de capeamento

AFB

recuperada Recuperação (%)

(ng/g) (ng/g) (soma frações)

5 1 glicina-etil-éster 30,68 1012,4

5 2 19,94

5 1 leite desnatado 26,17 658,6

5 2 6,76

Fração de metanol contendo AFB

eluída da coluna: 7,5 mL cada

Reagente utilizado no capeamento de CIA Affi-Gel 10: glicina-etil-éster 1,0 M, pH 8,0; leite desnatado 5 %

6 CONCLUSÃO

O scale-up com êxito na produção de AcM IgG anti-AFB

requer cuidados

especiais, sendo aconselhável proceder ultrafiltração para concentração do anticorpo e

subseqüente manutenção a 4º C para conservar a integridade e atividade biológica. O AcM

concentrado, utilizado no desenvolvimento da coluna de imunoafinidade para detecção de

AFB

, ainda apresentou baixo desempenho na limpeza de interferentes. Todavia, a

especificidade de AcM foi comprovada pelo teste de capacidade de retenção de AFB

devendo-se prosseguir com estudo inserindo novas condições de capeamento da coluna e

ensaios de padronização. Outrossim, mesmo a análise de AFB

empregando coluna comercial

deve ser conduzida em duplicata para garantir resultados confiáveis. A disponibilidade de

AcM específico, limpeza de extrato alimentar em etapa cromatográfica única, uso reduzido de

solventes tóxicos e possibilidade de reutilização justificam o desenvolvimento de CIA

nacional, contribuindo para minimizar o custo referente à aquisição e aplicação em laboratório

de controle de qualidade.

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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