( PDF ) Avanço metodológico no biocontrole de Cianobactérias toxigênicas com ênfase a degradação de Microcistina-LR e Bioensaio na qualidade de água e piscicultura

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Centro de Ciências Agrárias

Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos

Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos

Avanço Metodológico no

Biocontrole de Cianobactérias

Toxigênicas com Ênfase a

Degradação de Microcistina-LR e

Bioensaio na Qualidade de Água e

Piscicultura

Elisabete Hiromi Hashimoto

Londrina – PR

2007

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Centro de Ciências Agrárias

Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos

Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos

Avanço Metodológico no Biocontrole de

Cianobactérias Toxigênicas com Ênfase a

Degradação de Microcistina-LR e Bioensaio na

Qualidade de Água e Piscicultura

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência de Alimentos da

Universidade Estadual de Londrina,

como requisito final à obtenção do título

de Doutor.

Doutoranda: Elisabete Hiromi Hashimoto

Orientadora: Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka

Co-orientador: Prof. Dr. Ken-ichi Harada, PhD

Londrina - PR

2007

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Comissão Examinadora

Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka

Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos.

Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR.

Prof. Dr. Eduardo Vicente

Centro de Química.

Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas-SP.

Profa. Dr. Dalva Trevisan Ferreira

Depto. de Química.

Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR.

Profa. Dra. Ana Paula F. R. L. Bracarense

Depto. de Medicina Veterinária Preventiva.

Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR.

Prof. Dr. Alexandre Rodrigo Coelho

Depto. de Engenharia e Tecnologia de Alimentos.

Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, S.J. Rio Preto-SP.

Suplentes

Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho

Depto. de Química.

Universidade Federal de São Carlos, São Carlos-SP

Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus

Depto. de Biologia Geral.

Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR.

Londrina - PR

2007

A adversidade desperta em nós capacidades que, em

circunstâncias favoráveis, teriam ficado adormecidas.

(Horácio)

Esta Tese de Doutorado não resultou de um ato solitário,

contando ao longo do seu desenvolvimento com colaboradores e

incentivadores que tornou possível, com a bênção de Deus a

conclusão desta importante etapa de minha vida.

Agradeço aos meus pais, pelo amor incondicional, cuja

certeza é essencial em minha vida.

Agradeço aos mestres sábios e experientes pela arte de

formar recursos humanos.

Agradeço aos amigos de sempre, que dão

brilho a minha vida com sorrisos simples,

palavras de apoio, choros de alegria e

risadas à toa.

Agradeço ao meu amor, que

preenche meu coração, estando

sempre presente.

Agradeço a Deus, sempre.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka, pelo incentivo, confiança, oportunidades,

compreensão das minhas dificuldades e orientação proporcionando amadurecimento

científico e profissional.

Ao Prof. Dr. Ken-Ichi Harada, da Universidade de Meijo do Japão, pelo incentivo,

confiança e exemplo profissional.

Aos professores do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da

Universidade Estadual de Londrina, pela contribuição na formação acadêmica.

À Chefia e Coordenação do curso de Pós-Gradução em Ciência de Alimentos, pela

colaboração.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela

concessão da bolsa de doutorado, pela oportunidade de estágio no exterior através da

bolsa sandwiche e apoio financeiro.

À Fundação Araucária, CNPq, JICA, FINEP, SIGEP e Fundo SETI pelo apoio

financeiro.

À comissão examinadora pela disponibilidade e contribuição.

À Companhia de Saneamento do Paraná – SANEPAR, por disponibilizar a estação

de tratamento de esgoto São Lorenço, Londrina-PR para coleta de amostras de água.

À Profa. Dra. Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira, da Escola Superior de

Agricultura Luis de Queiroz – ESALQ/Piracicaba, por disponibilizar os cultivos de

Microcystis aeruginosa.

À Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus, do Departamento de Biologia Animal e

Vegetal da UEL, pela colaboração e orientação nos ensaios de genotoxicidade.

À Profa. Dra. Ana Paula F. R. L. Bracarense, do Departamento de Medicina

Veterinária Preventiva da UEL, pelo incentivo, colaboração no ensaio imunoistoquímico.

Ao Mauro Caetano Filho e Heitor Frossard do Departamento de Biologia Animal

e Vegetal da UEL, por disponibilizar os animais, instalações na piscicultura. Ao Jurandir

Batista, Waldemar Ferreira da Silva, Valdenir da Silva pelo auxílio durante a execução do

experimento.

À Profa Dra. Sandra Cesário, Prof Dr Fernando Fernandes e Dra Emília Kuroda

do Depto de Engenharia Sanitária-CTU-UEL, pelas valiosas sugestões.

À Profa. Dra. Elisabete Y. Sataque Ono e Mário Augusto Ono, pelo incentivo e

sugestões.

À Profa Dra Cláudia B. R. Martinez pelas sugestões e ensinamentos na área de

fisiologia de peixes.

À Profa Dra Eiko Itano pelo incentivo e sugestões.

À Patrícia Sambatti e Sandra Rezende pela colaboração, auxílio e prontidão.

Aos amigos da Universidade de Meijo – Japão Yoshito Kawasaki, Hajime Kato,

Masahiko Tachi, Masateru Hasegawa Tsuyoshi Mayumi, e tantos outros pela recepção,

colaboração, abrigo e principalmente pela amizade.

A Dra Kiyomi Tsuji, Dra Emiko Ito, Dr Atsukabe pelo apoio, incentivo e valiosas

sugestões.

À Profa Dra Tatsuko Sakai por disponibilizar o Centro de Análises da Faculdade

de Farmácia, Universidade de Meijo para análise em LCMS.

À Anie Ieda Francabandiera, pela contribuição e colaboração no ensaio biológico

e amizade.

À Ana Paula M. E. S. Trad, pela contribuição com a análise histológica,

colaboração e amizade.

À Tatiana Perez Vanzela, pela colaboração nas análises de cometa e pela amizade.

À Letícia Schiavo pela amizade e colaboração nas coletas de amostras e

processamento das análises de cometa, micronúcleo e histológica.

Aos Doutores e amigos Alexandre Rodrigo Coelho e Simone Fujii, pelo auxílio,

dedicação, companheirismo e alegria durante todo o trabalho e, sobretudo amizade.

Aos amigos do grupo de pesquisa, Luciana Hayashi, Márcia Kamogae, Luciana

Bernd, Joice Sifuentes dos Santos, Cássia R.Takabayashi,Marcelo Silva, Ricardo Reche,

Cleiton Ramos, Tatiane de Oliveira, Elaine Moreno, Alexandre Morey pelo amizade e

suporte.

Aos amigos sempre presentes, mesmo na distância, Caroline M. Caliari, Alessandra

Braga Ribeiro, Cláudio Ueno, Camilla de Pádua, Edson Luiz Zangrando Figueira, Carlos

José Ono, Natalia Dincao, Suzana Hashimoto, Neusa Seibel, Flávio H. Itano.

Aos amigos e colegas Rafael Dias, Luis Rodrigo, Marly Katsuda, Vanessa Dias,

Rubia Casagrande, Valeria Garcia Pereira, Laisiane da Nóbrega, Lyssa Sakanaka, Elvis

Perboni, Ana Augusta, Luciane Yoshiara, Michele Rossi, Denis Marchi, Marcos Giovani

Celli Alexandre Sasaki, Daniel, Josimeire, Fernando Fracão, Marcos, Heberty, pela

alegria, companheirismo e momentos de descontração, tornando mais suaves os dias mais

difíceis;

À Marli, Berenice, Elza Youssef, Nelson, Alessandra, D. Marília, Célia, Alice,

Rubens, pela colaboração.

Aos meus pais Takashi Hashimoto e Kazue T. Hashimoto pela educação, incentivo e

amor.

Aos meus familiare, principalmente aos irmãos Marisa T. Hashimoto Yamada, Eni

Megumi Hashimoto, Jorge Minoru Hashimoto, Flávio Yuiti Hashimoto e a minha avó

Matsuko Hashimoto pelo apoio e amor.

Aos meus queridos primos Wayner Hashimoto, Érica Hashimoto, Eliane Hashimoto,

Kanji Takahashi, Helena Takahashi e tios Emília Kuriki, Mamoru Hashimoto, Michiko

Hashimoto pela amizade e incentivo nos momentos difíceis.

Aos amigos que tornaram a saudades do Brasil mais amena D. Kajihara, Yoko

Sakumoto, Ines Mari, Teruo e Masahiro Matsuda.

Aos meus avós (in memorian) Toshio Hashimoto, Masuko e Katsuji Takahashi pelo

exemplo de vida.

Ao Fernando Menegon Basso pelo amor, confiança, companherismo e amizade

sempre.

Aos peixes que literalmente deram a vida ao meu trabalho.

A todos que colaboraram afetiva e efetivamente para a realização deste trabalho.

LISTA DE ABREVITURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS.

% : Porcentagem

‰: Por mil

Adda: (2S,3S,8S,9S) 3-amino-9-metoxi-10-fenil-

2,6,8-trimetildeca-4,6- ácido dienóico.

AFB

: Aflatoxina B

AFBO:epóxido de AFB

-8,9B.

ABPx: Avidin biotin peroxidase

AFL: aflatoxicol

AFLAs: aflatoxinas.

Ala: alanina

ALT: alanina aminotranferase

API :atmospheric pressure ionization

arb:arbitrária

Arg: arginina

AST: aspartame aminotransferase

C: coagulação

CAT: catalase

CB9: crude B9 cell

CCBUSP: Centro de ciências biológicas da

Universidade de São Paulo

CCD: cromatografia em camada delgada

céls: células

CG: cromatografia gasosa

CIA: coluna de imunoafinidade

CID : collision induced dissociation

CLAE: Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência

D-βMeAsp: β-eritro-β-metil ácido aspártico.

DAB:dihydrate 3,3'-diaminobenzidine

tetrahydrochloride

D-Ala: D-alanina

DEN: dietilnitrosamina

D-Glu: γ-ácido glutâmico

DmAdda: ácido 3-amino-2,6,8-trimetil-10-

fenildeca-4E, 6E dienóico

7D-MCLR: 7 desmethyl-MCLR

EB9: B9 cell extract

EC: eletroforese capilar

ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay

EMC: extrato celular Microcystis aeruginosa

EROs: espécies reativas de oxigênio.

ESI: electrospray ionization

ex. : exemplo

F: floculação

FAB : Fast Atomic Bombardment

FDAA:1-Flúor-2,4-dinitrofenil-5-L-alaninamida

g : grama

GL: graus Gay Lussac

GSH: glutationa

GSH-Px: peróxido de glutationa

GSTm: glutationa S transferase microssomal

GSTs: glutationa S transferase solúvel

h : Hora(s)

i.e. : Isto é

IHQ: imunoistoquímica

IHC: immunohistochemsitry

ip : Intraperitonial

IFN-γ: interferon gama

IL-1, -6: interleucinas 1 e 6

Kg: Quilograma

km: Quilômetros

kV: Quilovolt

L : Litro

LCMS: Liquid chromatography-mass

spectrometry

LC/ITMS: Liquid chromatography/ion trap

mass spectrometry

Leu: Leucina

L-FDLA:1-Flúor-2,4-dinitrofenil-5-L-

leucinaminamida

LMP: Low melting point

LPS: lipopolissacarídeos

LR: leucina-arginina

LW: leucina-tirosina

m/z: massa/carga

m: Metros

MAb: Monoclonal antibody

MCLR: microcistina-LR

MCs : Microcistinas

Mdha: N-metildehidroalanina

mg : Miligrama

min : Minuto(s)

mL: Mililitro

MMPB: ácido 2 metil-3metoxi-4fenil-butírico.

MN: micronúcleo

MS : Mass spectrometry

MS/MS: método de espectrometria por massa

em tandem

n.d. : não detectável

NO: óxido nítrico

º C: Graus Celsius

ODS C

: octadecyl silanized silica

PBS: Phosphate Buffer Saline

PCR: Polimerase Chain Reaction

PDA: photo diode array

PMSF: fenilmetil sulfonil fluoreto

p-NPP: fosfato de p-nitrofenol

PP1: proteína fosfatase 1

PP2A: proteína fosfatase 2A

Px: peroxidase

RR: arginina-arginina

S: sedimentação.

seg :Segundo (s)

SIM: Selected íon monitoring

SOD: superóxido dismutase.

TNFα: fator de necrose tumoral alfa

TOF : Time-of-flight

UV :Ultravioleta

V: Volts

YR: tirosina-arginina

WB9: B9 washed cell

µg : Micrograma

µL: Microlitro

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1 - Etapas para desenvolvimento de biocontrole de cianobactérias....................8

Fluxograma 2 - Etapas de metodologia físico-química na análise de cianotoxinas .............16

Fluxograma 3 - Delineamento experimental geral da pesquisa............................................42

Fluxograma 4 - Delineamento experimental do bioensaio com Tilápias (Oreochormis

niloticus) expostas à extrato celular de Microcystis aeruginosa e Aflatoxina B

.................43

Fluxograma 5 - Cultivo de Microcystis aeruginosa, preparo do extrato celular, extração e

análise de microcistina..........................................................................................................44

Fluxograma 6 - Teste do Micronúcleo e Ensaio do Cometa para avaliação de efeitos

genotoxicológicos da interação Aflatoxina B

e extrato celular de Microcystis

aeruginosa.............................................................................................................................45

Fluxograma 7 - Ensaio imunoistoquímico para detecção de microcistina em tecido hepático

e muscular de Tilápia (Oreochromis niloticus).....................................................................46

Fluxograma 8 - Seleção de microrganismos antagônicos contra cianobactérias

toxigênica..............................................................................................................................47

Fluxograma 9 - Aplicação do método avançado de Marfey para elucidação do mecanismo

de biodegradação de MCLR pela cepa B9...................................................................48

LISTA DE FIGURAS

Revisão Bibliográfica:

Figura 1 - Estrutura química de microcistina..........................................................................3

Figura 2 - Estrutura química de 1-Flúor-2,4-dinitrofenil-5-L-leucinaminamida (FDLA),

ligação com L- aminoácido e representação da conformação...............................................14

Figura 3 - Estrutura química de Aflatoxina B1.....................................................................36

Figura 4 - Biotransformação de Aflatoxina B1 por reação de epoxidação ..........................37

Artigo 1:

Figure 1 - Chemical structure and mass spectra of 7D-MCLR analysed by LC/ITMS

…...61

Figure 2 - Comet class 0. 1. 2 and 3 in O. niloticus blood sample, exposed to AFB

and M.

aeruginosa cell extract. ........................................................................................................61

Figure 3 - Micronucleous in O. niloticus erythrocyte, exposed to AFB

and M. aeruginosa

cell extract.............................................................................................................................61

Figure 4 - Comet Score average in O. niloticus: ip AFB

, immersion or ip EMC, and

AFB

+EMC interaction. .......................................................................................................62

Figure 5 - Micronucleus frequency (‰) average in O. niloticus: ip AFB

, immersion or ip

EMC, and AFB

+EMC interaction. .....................................................................................63

Figure 6 - Immunohistochemistry of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Microcystis

aeruginosa CCBUSP262 exposed, MC marcation in liver (in Brow, A) and negative

immuno reaction (B)(100 X). ...............................................................................................64

Figure 7 - Immunohistochemistry of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Microcystis

aeruginosa CCBUSP262 exposed, negative immuno reaction in muscle ( 100 X). ………64

Artigo 2:

Figura 1 - Efeito antagônico de 7 isolados obtido de ETE contra M. aerugionosa NIES 298

(A); Isolado R2P5 inibindo M. aerugionosa NIES 298 (incolor) e respectivo controle

negativo (verde) após 96h de cultivo (B)..............................................................................78

Figura 2 - Cromatografia em Camada Delgada de extrato celular do isolado R2P5, fase

móvel isopropanol:água:amônia (80:15:5)...........................................................................79

Figura 3 - (a) Perfil cromatográfico do isolado EFA7 inoculado com MCLR em 0 e 72 h;

(b) perfil cromatográfico e espectro de absorção máxima de Adda a partir da cepa B9

(controle positivo) inoculado com MCLR após 24 h; (c) perfil cromatográfico e espectro de

absorção máxima dos picos A e B a partir do isolado R2P5 inoculado com MCLR em 0

h.............................................................................................................................................80

Artigo 3:

Figure 1- Microcystin-LR structure......................................................................................82

Figure 2 - MCLR Biodegradation process by B9 crude cell, B9 cell extract and B9 washed

cell, analyzed by HPLC and confirmed with LCMS at 238 nm UV detector…...…………93

Figure 3 - Selected ion chromatogram and mass spectra of MCLR degradation products:

tetrapeptide and tripeptides derivatized with L-FDLA.........................................................94

Figure 4 - Selected ion chromatogram and mass spectra of MCLR degradation product:

Adda and Glu-Mdha and Mdha-Ala derivatized with L-FDLA...........................................95

Figure 5 - Selected ion chromatogram and mass spectra of N-Methyl derivatized with L-

FDLA, from Mdha residue………........................................................................................96

Figure 6 - B9 strain biodegradation behavior of Adda-Glu-Mdha-Ala tetrapeptide from

MCLR.……..........................................................................................................................96

Figure 7 - Selected ion chromatogram and mass spectra of MCLR degradation product

tripeptide derivatized with L-FDLA…………..……...........................................................97

Figure 8 - B9 strain biodegradation behavior of Arg-βMeAsp-Leu tripeptide from

MCLR……………………………………………………………………………………...98

Figure 9 - MCLR biodegradation pathway using B9 washed cell………...........................99

LISTA DE TABELAS

Artigo 1:

Table 1 - Comet classification and damaged nuclei average in Oreochromis niloticus

erythrocyte exposed to AFB

10µg/Kg and M. aeruginosa BCCUSP 262 extract ………65

Table 2 - Immunohistochemistry reaction using avidin-biotin peroxidase and polymer

peroxidase system……….....................................................................................................66

Table 3 - Immunohistochemistry using M8H5-MAb and polymer peroxidase system in

liver and muscle of tilapia exposed to M. aeruginosa BCCUSP 262 extract………...........66

Artigo 2:

Tabela 1 - Identificação (provável) dos microrganismos isolados em amostras coletadas na

Estação de Tratamento de Esgoto São Lorenço, Londrina-PR............................................78

SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................................................i

ABSTRACT ..........................................................................................................................ii

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA………………………………………………………….2

2.1. Cianobactéria Toxigênica.............................................................................................2

2.2 Microcistina...................................................................................................................2

2.2.1 Mecanismo de ação de microcistina...........................................................................3

2.2.2 Propriedades da Microcistina ....................................................................................5

2.3 Métodos físico-químicos para remoção de cianobactéria e microcistina......................6

2.4 Controle biológico de cianobactéria.............................................................................7

2.5 Biodegradação de microcistina..................................................................................10

2.5.1 Mecanismo de biodegradação de microcistina.........................................................12

2.6 Metodologia Analítica para detecção de Microcistina...............................................14

2.6.1 Métodos físico-químicos para análise de microcistina............................................15

2.6.2. Ensaios biológicos para análise de microcistina.....................................................20

2.7 Ensaio imuno-histoquímico na detecção de microcistinas.........................................22

2.8 Ensaios de genotoxicidade para monitorar contaminantes na piscicultura................23

2.9 Risco de Microcystis spp. Toxigênica no Cenário da Piscicultura Brasileira...........25

2.10 Associação Aflatoxina e Microcistina.......................................................................33

2.10.1 Aflatoxina na piscicultura......................................................................................34

2.10.2 Estrutura química e atividade tóxica de aflatoxina................................................36

2.10.3 Efeito tóxico de Aflatoxinas em peixe ..................................................................37

2.11 Considerações finais................................................................................................39

3. OBJETIVOS ...................................................................................................................39

3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................40

3.2 Objetivos Específicos .................................................................................................40

4. MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................................40

4.1 Delineamento experimental…………………………………………………………40

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................49

Capítulo I: Biomonitoring assay in analysis of Co-occurring microcystin and Aflatoxin

in Aquaculture………………………………………………………………………….50

Capítulo II: Potencial Anti-Cianobactéria em Microbiota Pertecente ao Ecossistema de

Estação de Tratamento de Esgoto...................................................................................67

Capítulo III: Novel Microcystin-LR biodegradation products detected by Advanced

Marfey’s Derivatization Method………….……………………………………….…...81

5.1. PUBLICAÇÃO E TRABALHOS CIENTÍFICOS .................................................100

6. CONCLUSÃO...............................................................................................................102

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA............................................................................103

HASHIMOTO, E.H., Avanço Metodológico no Biocontrole de Cianobactérias

Toxigênicas com Ênfase a Degradação de Microcistina-LR e Bioensaio na Qualidade

de Água e Piscicultura. Tese (Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos)

da Universidade Estadual de Londrina. Londrina, 2007.

RESUMO

A freqüente ocorrência de floração de cianobactéria toxigênica e a ineficiência do tratamento de

água convencional para remoção de microcistina (MC) tornaram relevante o desenvolvimento de

alternativa para prevenir ou diminuir o risco de contaminação. Rações utilizadas na piscicultura são

compostas por grão susceptível à contaminação com aflatoxina B

(AFB

) e seu manejo inadequado

favorece a eutrofização da água. A interação de Microcystis aeruginosa e AFB

foi avaliada em

tilápia (Oreochromis niloticus). Os ensaios de genotoxicidade cometa e micronúcleo (MN) e a

imunoistoquímica (IHQ) para detecção de MC em peixe foram aplicados, visando métodos

adequados para o monitoramento destes contaminates. Amostras de água foram coletadas na

Estação de Tratamento de Esgoto (ETE São Lourenço, Londrina-PR) com objetivo de isolar

antagonistas contra cianobactéria. O mecanismo de biodegradação de MCLR pela cepa B9 foi

investigado através do método avançado de Marfey e ESI-LCMS (Electrospray Ionization – Liquid

Chromatography Mass Spectrometry) para detecção dos produtos da biodegradação. O ensaio com

tilápias (N=96) foi realizado através de exposição intraperitoneal (ip) de AFB

(10µg/Kg) e extrato

celular de M. aeruginosa cepa CCBUSP262 nas dose de 2x10

, 4x10

e 1x10

céls/Kg (0,602, 1,204

e 3,011 µg/Kg de 7D-MCLR) e exposição por imersão em 1x10

e 1x10

céls/mL e em doses

cumulativas de 1x10

, 2x10

e 5x10

céls/mL (30,1, 60,2, 150,5 e 301 µg/L de 7D-MCLR). Para

seleção de microrganismos com atividade anti-cianobactéria, as cepas Microcystis aeruginosa NIES

298, M. viridis NIES 102, Anabaena mendotae NIES 808, Phormidium tenue NIES 611 foram

inoculadas com cada isolado e após 0, 24, 48, 72 e 96 h a absorbância do extrato da biomassa foi

medida em 405 e 665 nm. Uma colônia de cada isolado foi adicionada em 10 µg/mL de MCLR e

após 0, 24, 48 e 72h foi analisado por CLAE. O método avançado de Marfey, utilizando

derivatização com L-FDLA (L-1-flúor-2,4-dinitrofenil-5-alaninamida) foi padronizado e aplicado

para análise dos produtos de biodegradação de MCLR (1mg/mL) pela cepa B9. A freqüência de

MN e escore de cometa mostraram efeito mutagênico e genotoxicidade sinérgica do extrato celular

de M. aeruginosa com AFB

(ip). A IIQ detectou MC em todos os fígado de peixe ip inoculados e

imersos a 1x10

cells/mL (301µg/L de 7D-MCLR). Embora MC não tenha sido detectada no

músculo (comestível) a resistência dos peixes às doses mostrou possibilidade de contaminação e

risco na cadeia alimentar. Entre os 35 isolados, apenas 7 microrganismos mostraram atividade

antagônica contra M. aeruginosa NIES 298 e nenhum foi capaz de degradar MCLR. Os resultados

indicaram potencial para isolamento de microrganismos antagonistas em pontos de ocorrência de

florações. Peptídeos e aminoácidos derivatizados com L-FDLA foram detectados por ESI-LCMS. A

biodegradação de MCLR pela cepa B9, inicia-se pela linearização de MCLR que é clivada

formando Adda-Glu-Mdha-Ala e Arg-βMeAsp-Leu. O tetrapeptídeo é preferencialmente degradado

em Adda e Glu-Mdha-Ala, sendo este degradado em Glu-Mdha e Mdha-Ala. A ligação βMeAsp-

Leu é clivada cujo principal produto é Arg-βMeAsp. Entre os resíduos de aminoácido Arg, Adda e

Mdha foram detectados como produtos finais da biodegradação. A identificação destes compostos é

uma ferramenta importante para entender a atividade enzimática hidrolítica da cepa B9 nos

processos de detoxificação de microcistina.

Palavras-chave: Microcistina, biocontrole, monitoramento, piscicultura

HASHIMOTO, E.H., Methodogical Advances in Biocontrol of Toxic Cyanobacteria

with emphasis in Microcystin-LR Biodegradation and Bioassay on Water Qualilty

and aquaculture. Tesis (Food Science Master and Doctorate Program) of State

University of Londrina. Londrina, 2007.

ABSTRACT

The frequently toxic cyanobacteria bloom and inadequate remotion of microcystin (MC) by

conventional water treatment, the development of alternative to prevent and reduce contamination

risk become a topic in concerning. Fish feed is composed by grains susceptible to aflatoxin B

(AFB

) contamination and inadequate feeding management enhances water eutrophication. The

interaction between Microcystis aeruginosa and AFB

was evaluated in tilapia (Oreochromis

niloticus). Comet and micronucleous (MN) assay to evaluate effect of genotoxicity and

immunohistochemistry (IHC) for MC detection in fish were applied to have in view suitable and

profitable monitoring method. Water were sampled from Sewage treatment of Londrina (ETE São

Lourenço, Londrina-PR) aiming to select antagonistis against cyanobacteria. The MCLR

biodegradation pathway by B9 strain was investigated using the advanced Marfey’s method and

ESI-LCMS (Electrospray Ionization- Liquid Chromatography Mass Spectrometry) for

biodegradation products detection. The bioassay with tilapia (N=96) was carried out with

intraperitoneal (ip) exposure of AFB

(10 µg/Kg ) and M. aeruginosa BCCUSP262 cellular extract

at 2x10

, 4x10

e 1x10

cells/Kg (0.602, 1.204 and 3.011 µg/Kg of 7D-MCLR) and immersion

exposure 1x10

e 1x10

cells/mL and cumulative doses at 1x10

, 2x10

e 5x10

cells/mL (30.1, 60.2,

150.5 and 301 µg/L of 7D-MCLR). To select microorganisms with anti-cyanobacteria activity the

strains Microcystis aeruginosa NIES 298, M. viridis NIES 102, Anabaena mendotae NIES 808,

Phormidium tenue NIES 611 were inoculated with each isolated and after 0, 24, 48, 72 and 96 h the

absorbance of biomass extract was mensured at 405 and 665 nm. One colony of each isolated was

added to 10 µg/mL of MCLR and after 0, 24, 48 e 72 h was analyzed by HPLC. The advanced

Marfey method with L-FDLA (L-1-fluor-2,4-dinitrophenyl-5-alaninamide) derivatization was

standardized and applied for detection of biodegradation products of MCLR (1 mg/mL) by B9

strain. The MN frequency and comet score showed synergic mutagenic and genotoxic effects of M.

aeruginosa cellular extract interaction with AFB

(ip). The IHC detected MC in all ip inoculated

fish liver and immersed at 1x10

cells/mL (301 µg/L de 7D-MCLR). Although MC has not been

detected in edible muscle, fish doses resistence showed the possibility of contamination and risk in

the food chain. Among 35 microorganisms isolated, only 7 microorganisms showed antagonic

activity against M. aeruginosa NIES 298 and none was able to degrade MCLR. The results

indicated the potencial of antagonist isolation at bloom ocorrence point. L-FDLA derivatization

detected aminoacid residues and peptides. The biodegradation of MCLR by B9 strain begins by

MCLR linearization that is degraded to Adda-Glu-Mdha-Ala and Arg-βMeAsp-Leu. The

tetrapeptide is mainly degraded in Adda and Glu-Mdha-Ala, which is cleaved as Glu-Mdha and

Mdha-Ala. The linkage between βMeAsp-Leu is cleaved, forming mainly dipeptide Arg-βMeAsp.

Among amino acid residues we detected Arg, Adda and Mdha, as MCLR biodegradation final

products. The identification of these compounds is an important tool to understand tha hydrolitic

enzimatic activity of B9 strain in the microcystin detoxification process.

Key words: microcystin, biocontrol, monitoring, aqualculture.

1. INTRODUÇÃO

As microcistinas (MCs) são hepatotoxinas produzidas por cianobatérias que

compõem as comunidades fitoplanctônicas de ocorrência comum em ambientes aquáticos

eutrofizados. A lixiviação de solo fertilizado pela agricultura, a contaminação ambiental

através de esgotos, as atividades industriais e piscicultura contribuem para elevação de

nutrientes nos corpos d’água.

O aumento da produção agrícola com vistas às exportações tem exigido maior rigor

nos mecanismos de controle e fiscalização da cadeia produtiva de alimentos. O controle de

qualidade deve prevenir ou diminuir o risco de contaminação, em especial de MCs

presentes na água para consumo humano ou destinada à irrigação e produção de alimentos.

Quimicamente as MCs são muito estáveis devido a pequena estrutura cíclica. Os

processos convencionais de tratamento de água mostraram-se ineficientes para remoção de

MCs. Muitos métodos físicos e químicos foram desenvolvidos para sanar este problema.

No entanto, o alto custo e problemas secundários de poluição representam o maior

obstáculo para a generalização destes métodos. Desta forma dentre os métodos mais

econômicos e menos agressivo ao meio ambiente, destaca-se o biocontrole.

Tendo em vista o aumento da demanda de produtos de pescado, a implementação de

práticas capazes de assegurar a qualidade desde a água, composição de rações formuladas,

aspectos sanitários do processamento à comercialização tornam-se fundamental. A

produção brasileira deve seguir a tendência da piscicultura no agronegócio globalizado com

implementação de processos de controle baseados em metodologias analíticas químicas e

biológicas. O fato implica na inserção dos testes de toxicidade capazes de estabelecer

limites visando avaliar o impacto de MCs sobre os organismos aquáticos e acumulação na

cadeia alimentar.

Considerando a limitação dos métodos convencionais para remoção de MCs aliado

ao alerta de contaminação na piscicultura, a seleção de antagonistas a cianobactérias

toxigênicas e a aplicação de bioensaio visando o monitoramento em peixes são

indispensáveis sob o ponto de vista de minimizar os riscos a saúde humana. Neste contexto,

o estudo do mecanismo de biodegradação é essencial para aprofundar o conhecimento da

complexa dinâmica de produção e detoxificação de microcistina no ecossistema.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Cianobactéria toxigênica

As cianobactérias ou cianofíceas são microrganismos aeróbios fotoautotróficos,

popularmente conhecidas como algas azuis. Os processos vitais desses microrganismos

requerem somente água, dióxido de carbono, substâncias inorgânicas e luz. A fotossíntese é

o principal modo de obtenção de energia para o metabolismo de cianofíceas. A origem das

cianobactérias foi estimada em cerca de 3,5 bilhões de anos, sendo provavelmente os

primeiros produtores primários de matéria orgânica no planeta. Entretanto, a organização

celular demonstra que estes organismos são procariontes e semelhantes bioquimicamente a

bactérias (CHARMICHAEL, 1992).

O fator preocupante referente a cianofíceas é freqüente ocorrência de florações

tóxicas. A produção de cianotoxina depende do estágio da floração, linhagens e espécies

envolvidas. A liberação da toxina ocorre durante a formação da floração, caracterizada por

intensa proliferação de cianobactérias em lagos e reservatórios de água doce enriquecidos

principalmente com nitrogênio e fósforo (YOO et al., 1995). Existem aproximadamente

150 gêneros e 2000 espécies de cianobactérias, das quais 40 gêneros são toxigênicos com

destaque para Microcystis aeruginosa, Microcystis viridis, Aphanizomenom flos aquae,

Anabaena spp., Oscillatoria spp., produtoras de microcistina (MC), uma classe de toxina

hepatotóxica (CHARMICHAEL et al., 2001).

Muitos estudos avaliaram o efeito de fatores ambientais na produção de MCs,

incluindo a disponibilidade de metais traços, nutrientes, luz, temperatura, pH, meio de

cultura, estabilidade na coluna d’água e atividade de zooplâncton predador. No entanto, há

muita controvérsia seja sobre os estudos laboratoriais ou de campo a respeito da dinâmica

de produção de MCs (WANG et al., 2007).

2.2 Microcistina

As MCs constituem heptapeptídeos monocíclicos, compostos de três D-aminoácidos

na porção invariável da molécula, além de dois L aminoácidos e dois aminoácidos raros. Os

D-aminoácidos consistem de alanina, β-eritro-β-metil ácido aspártico e γ-ácido glutâmico

(D-Ala, D-βMeAsp, D-Glu). Os dois aminoácidos raros correspondem a N-

metildehidroalanina (Mdha) e a (2S,3S,8S,9S) 3-amino-9-metoxi-10-fenil-2,6,8-

trimetildeca-4,6- ácido dienóico (Adda) (BOTES et al.,1982 ).

Os dois resíduos de L-aminoácidos variáveis e respectivas combinações incluem,

por exemplo, leucina e arginina para MCLR. Estas diferenças estruturais dependem

principalmente dos dois resíduos de aminoácidos variáveis e secundariamente, da presença

ou ausência de grupamentos metil em β-Me-Asp e/ou Mdha (CARMICHAEL, 1992).

Atualmente, já foram isolados mais de 80 análogos, sendo MCLR a mais tóxica e mais

freqüente (FALCONER & HUMPAGE, 2005; HOEGER et al., 2005).

Figura 1 - Estrutura química de Microcistina.

2.2.1 Mecanismo de ação de microcistina

A evidência de propriedades toxicológicas de MCs em diversas espécies animais se

deve a efeitos principalmente hepatotóxicos. Os mecanismos envolvidos decorrem da

inibição específica da atividade da proteína fosfatase 1 (PP1) e 2A (PP2A) de células

eucariontes, provocando subseqüente acúmulo de fosfoproteínas, perda da integridade do

citoesqueleto e apoptose em hepatócitos (FUJIKI et al., 1996; GOLDBERG et al., 1995;

MACKINTOSH et al., 1990; NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al., 1990; YOSHIZAWA et

al., 1990).

O aminoácido Mdha é capaz de se ligar covalentemente a um resíduo de cisteína da

subunidade catalítica da PP1 e PP2A (MACKINTOSH et al., 1995; ZHANG et al., 1993),

porém a inativação efetiva requer a introdução do grupamento Adda na cavidade

hidrofóbica do sítio catalítico das PPs (GOLDBERG et al., 1995, XING et al., 2006). O

aminoácido Adda, por estar presente intacto em todos os análogos de MCs, tem sido

apontado como o principal responsável pela atividade biológica de MCs (HARADA et

al.,1990; NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al.,1992).

Nishiwaki-Matsushima et al. (1992)

demonstraram inibição de proteína fosfatase 1 e

membranar e de frações citosólicas de hepatócitos por MCLR, YR (tirosina-arginina), e

RR (arginina-arginina), com o aumento na fosforilação de proteínas em intensidade

próxima ao ácido okadáico (NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al., 1992). Estas potentes

hepatotoxinas causam alteração estrutural na arquitetura hepática pelo rearranjo de

organelas e reorganização de microfilamentos. A intoxicação aguda por MC caracterizou-se

pelo aparecimento de pontos vermelho-escuro e hepatomegalia com acúmulo de sangue,

com aumento do volume hepático de duas vezes em relação ao fígado de rato normal

(HOOSER et al., 1990).

A letalidade de MC se atribui a choque hipovolêmico, devido ao seqüestro de

sangue pelo fígado (LeCLAIRE et al.,1995). Pesquisas intensivas foram realizadas para

explicar o mecanismo de ação destas hepatotoxinas, desencadeando seqüência de eventos

até o choque hemorrágico. A toxina é absorvida no íleo através de carreadores bile-ácidos,

que funcionam como transportadores das toxinas peptídicas através da membrana celular,

preferencialmente para os hepatócitos (CARMICHAEL, 1992; DABHOLKAR &

CARMICHAEL, 1987). A seguir, as MCs atuam sobre os microfilamentos de actina,

componentes de citoesqueleto celular, causando uma agregação densa de microfilamentos

próximos ao centro da célula. O fato pode ser interpretado como perda de suporte celular,

conduzindo à destruição de sinusóides endoteliais. A destruição de parênquima celular e

sinusóide hepático resultam em hemorragia intrahepática (após horas) e/ou insuficiência

hepática (após dias) (HOOSER et al., 1991).

Evidência da atividade promotora de tumor por MCLR foi apresentada em fígados

de ratos iniciados com dietilnitrosamina (DEN), através da mesma via promotora de tumor

do ácido okadaico (YOSHIZAWA et al., 1990). A inibição da atividade de proteínas

fosfatases (PP) resulta no acúmulo de proteínas fosforiladas que provavelmente

representam um papel significante na expressão de genes envolvidos no crescimento celular

(NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al., 1992). O envolvimento MCs na geração de espécies

reativas de oxigênio (EROs) resultando em danos oxidativos em hepatócitos, oxidação de

pirimidinas e purinas, emerge como elemento contribuinte na genotoxicidade e indução de

apoptose por MCLR (DING et al., 1998; 2001; ZEGURA et al., 2004).

A ingestão de água de valas e açudes contaminados com cianofíceas no Norte de

Xangai - China foi relacionada à incidência de câncer hepático primário com freqüência

oito vezes superior a população abastecida com água de qualidade adequada (YU, 1989,

NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al.,1992).

Baseado na toxicologia de MCLR e contaminação em reservatórios de água, a

Organização Mundial de Saúde estabeleceu o limite máximo de 1 µg/L de MCLR em água

destinada ao consumo humano. Este limite é adotado pela legislação vigente na grande

maioria dos países, inclusive no Brasil. A exposição humana decorre da exposição por

inalação, via dérmica, intravenosa (diálise) e, principalmente, via oral, através da ingestão

de água, alimentos irrigados com água contaminada, além do perigo de ingestão indireta

por peixes contaminados. Assim, a ingestão diária tolerável de MCLR foi estabelecida em

0,04 µg/Kg de peso corpóreo (WHO, 1998) .

2.2.2 Propriedades da Microcistina

Devido a sua estrutura peptídica cíclica, as microcistinas são muito estáveis à

fervura e resistentes a hidrólise química e oxidação em pH próximo a neutralidade. As MCs

podem persistir por meses ou anos em condições ambientais sem incidência de luz.

Hidrólises lentas de MCs foram observadas em temperaturas próximas a 40º C e em

condições de pH extremos, sendo necessário aproximadamente 10 semanas em pH 1 e mais

12 semanas em pH 9 para degradação de cerca de 90% da concentração total de MCs

(HARADA & TSUJI, 1998).

Degradação fotoquímica lenta de MCs foi observada sob exposição solar. A taxa

desta reação é aumentada pela presença de substâncias húmicas e de pigmentos

fotossintéticos hidrossolúveis, provavelmente ficobiliproteínas. Nessas condições, o tempo

para a degradação de 90% de MCs varia de 2 a 6 semanas, dependendo da concentração de

toxina e de pigmentos (TSUJI et al., 1995).

Chen et al. (2006) testaram a adsorção de MCs em 3 tipos de solos da China e

verificaram correlação negativa entre a adsorção de MCs e a concentração de argila no solo.

Portanto, solos compostos com menor teor de argila apresentam maior lixiviação de MCs.

Os riscos da persistência de MCLR e outros análogos no solo foram alertados, inclusive o

perigo de contaminação de aqüíferos.

2.3 Métodos físico-químicos para remoção de cianobactéria e microcistina

Os processos e seqüências de tratamento de água para abastecimento público devem

ser analisados em função da sua capacidade de remover as células viáveis (biomassa

fitoplanctônica) e de não promover a lise dessas células, assim como a capacidade de

remover a fração dissolvida da cianotoxina (SCHMIDT et al., 2002).

Florações de cianobactérias tóxicas na piscicultura são freqüentemente tratadas com

sulfato de cobre. Os algicidas em geral, são efetivos na lise celular, mas possuem o efeito

negativo de liberar a toxina intracelular. Muitos métodos químicos foram desenvolvidos

para sanar este problema (WETZEL, 2001). No entanto, o alto custo e problemas

secundários de poluição representam o maior obstáculo para a generalização destes

métodos (AHN et al., 2003).

A combinação seqüencial de coagulação (C), floculação (F), sedimentação (S) e

filtração são ineficientes para remoção de cianotoxinas (GRÜTZMACHER et al., 2002).

Estes processos apresentam elevada eficiência na remoção de células viavéis e

conseqüentemente de toxina intracelular. No entanto, a promoção da fragilidade e

conseqüente lise celular limitam a eficiência do processo (CHOW et al., 1998).

A pré-oxidação melhora a eficiência da filtração direta e também da flotação por ar

dissolvido. Por outro lado, o risco de liberação das cianotoxinas e compostos

potencialmente carcinogênicos como trialometanos originados em processos de cloração

devem ser alertados (GEHR et al., 1993).

Estudos intensivos visando a remoção de fitoplâncton abordam as mais variadas

tecnologias, como procedimentos de filtração lenta, ultrafiltração, nanofiltração, flotação

por ar dissolvido, radiação UV ou gama e oxidação utilizando ozônio (GIJSBERTSEN-

ABRAHAMSE et al., 2005; GRUTZMACHER et al., 2002; KAUR et al., 1994;

RODRIGUES et al., 2007; SAKAI et al., 2007; ZHANG et al., 2007). A adsorção em

carvão ativado e a pós-oxidação combinados com tratamento de água convencional têm

sido consideradas processos efetivos para remoção de cianotoxinas (FALCONER, 1999).

Não obstante, o perigo de contaminação não deve ser descartado nos casos de florações

tóxicas intensas.

Desta forma, o tratamento de água seja para consumo direto ou produção de

alimentos requer tecnologias eficientes, ecologicamente corretas e com custo-benefício

aplicável (HAIDER et al., 2003).

2.4 Controle biológico de cianobactéria

O biocontrole destaca-se dentre os métodos mais econômicos e menos agressivos ao

meio ambiente. Vírus, protozoários, fungos, actinomicetos e bactérias apresentam potencial

antagonista promissor à cianobactérias. A ação dos organismos antagonistas engloba desde

o parasitismo específico de contato celular ou captura até a produção não específica de

enzimas extracelulares ou antibióticos capazes de lisar cianobactérias (WRIGHT &

THOMPSON, 1985). O desenvolvimento destes organismos como controle biológico

envolve o isolamento a partir de amostras ambientais, caracterização da atividade anti-

cianobactéria, experimentos de campo em micro e macro-escala e o estudo final para

aplicação do controle biológico na estratégia de manejo no ambiente (Fluxograma 1).

Ambientes aquáticos com florações de cianobactéria apresentam alto potencial para

isolamento de antagonistas competitivos capazes de lisar células de cianofíceas

(IMAMURA et al., 2001). Em geral, técnicas de difusão em ágar e inibição da fotossíntese

com degradação de clorofila, através da leitura da absorbância a 405 nm são aplicadas para

seleção de microrganismos antagonistas (YAMAMOTO & SUZUKI, 1990). A produção de

substâncias ativas pode ser otimizada através da engenharia genética com microrganismos

que preencham requisitos como resistência a condições adversas e não patogenicidade. A

extrapolação da atividade microbiana para o ambiente aquático deve considerar

previamente a condições físico-químicas e efeito de diluição do corpo d’água. Na etapa

final, a produção em larga escala e comercialização requer uma avaliação rigorosa do

custo-benefício (SIGEE et al., 1999).

Safferman & Morris (1963) isolaram um vírus que infecta cianobactéria (cianófago

LPP) com ação direta no ciclo de florações de Lyngbya, Plectonema e Phormidium. Porém,

a complexidade da interação cianobactéria-fago devido ao alto grau de especificidade do

hospedeiro, aliada ao surgimento de hospedeiros mutantes resistentes limitam a aplicação

de vírus como biocontrole de cianobactérias (BARNET et al., 1981).

Fluxograma 1 - Etapas para desenvolvimento de biocontrole de cianobactérias (SIGEE, et

al., 1999, modificado).

As cianobactérias representam uma fonte de alimentos para protozoários ciliados

Nassula, flagelados Ochromonas e amebas Achantomoeba, Mayorella e Nuclearia

(CANTER et al., 1990; COLE & WYNNE, 1974; LAYBOURNE-PARRY et al., 1987;

WRIGHT et al., 1981; YAMAMOTO, 1981). No entanto, a eficiência da aplicação de

protozoários no biocontrole depende da especificidade de predação e ausência de

predadores contra estes protozoários na cadeia trófica (BRABRAND et al., 1983). Inamori

et al. (1998), sugerem a aplicação de Aeolosoma hemprichi e Philodina erythrophthalma no

controle de Microcystis viridis toxigênica em biofilme de reatores no tratamento de água.

Neste processo, os protozoários após digerirem a cianobactéria, excretariam a toxina que

por sua vez seria degradada por bactérias aderidas ao biofilme.

A atividade cianobacteriolítica por antibióticos fúngicos foi promovida por

cefalosporina C purificado a partir de Emericellopsis salmosynnemata e Acremonium

kiliense, cujo antibiótico β-lactama afetou diretamente a membrana celular de

cianobactérias (REDHEAD & WRIGHT, 1980).

A atividade antagônica à cianobactéria é comum em actinomicetos isolados de solos

ou ambientes aquáticos. Entre 83 espécies de actinomicetos isolados de sedimentos, 50%

apresentou atividade cianobacteriolítica, com destaque para Streptomyces phaeofaciens S9.

L-lisina, aminoácido secretado por S9, foi apontanda como um dos fatores capazes de

causar danos na parede celular de M. aeruginosa (YAMAMOTO et al., 1998).

Antagonismo por Streptomyces spp. foi relatado contra Nostoc, Phormidium, Lyngbya,

Plectonema, Anabaena, Oscillatoria e Microcystis (SAFFERMAN & MORRIS, 1962;

SIGEE et al., 1999; YAMAMOTO et al., 1998). Choi et al. (2005), apontaram que o

contato celular libera enzimas presentes no periplasma celular responsáveis pela atividade

lítica de S. neyagawaensis.

A atividade antagônica de Pseudomonas contra Anabaena, Phormidium e

Oscillatoria spp. foi atribuída a 1-metil-β-carbonila e a pigmentos fenazinas como 1-

hidroxifenazina e oxiclororafina (DAKHAMA et al., 1993; KODANI et al., 2002).

A lise de cianobactéria (Anabaena e Microcystis) por Bacillus sp. foi atribuído ao

antibiótico gramicidina e compostos voláteis, como álcool isoamílico (3-metil-1-butanol)

(REIM et al., 1974, WRIGHT et al., 1991; WRIGHT &THOMPSON, 1985). Surfactina,

um biosurfactante lipopeptídico cíclico produzido por Bacillus subtilis C1 apresentou

inibição seletiva de crescimento contra cianobactérias (Microcystis aeruginosa e Anabaena

affinis), sendo menos efetiva contra clorofíceas (Chlorella vulgaris e Scenedesmus sp.) e

diatomáceas (Navicula sp.), sugerindo um potencial para o biocontrole seletivo contra

cianobactérias sem afetar outras espécies e minizando o impacto no ecossistema (AHN et

al., 2003).

Sphingomonas M-17 isolada de amostras de florações de cianobactéria do lago

Biwa-Japão, apresentou potente atividade lítica contra M. aeruginosa e M. viridis

(IMAMURA et al., 2001). A atividade de M-17 foi atribuída a um pentapetído

denominado argimicina A e aos análagos B e C, que são produzidos em menor quantidade

(IMAMURA et al., 2000, YAMAGUCHI et al., 2003). A inibição da fotossíntese em

cianobactérias é o principal mecanismo de ação de argimicina A, tal inibição não foi

observada em fitoplâncton eucariótico, sugerindo atividade seletiva contra cianobactérias

(HIBAYASHI & IMAMURA, 2003). Inibição da reação de tranporte de elétrons na

fotossíntese, inibição das enzimas glicolato desidrogenase e nitrogenase de Oscillatoria

williamsii também foram relatadas como antagonismo por Flexibacter (SALLAL, 1994).

Embora vários microrganismos com atividade anti-cianobactéria sejam citados, não

foram encontradas informações sobre a aplicação de microrganismos in situ, provavelmente

devido a dificultade de prever os efeitos desses microrganismos em ecossistemas

complexos (CHOI et al., 2005).

2.5 Biodegradação de microcistina

Até o momento, poucos microrganismos com capacidade de remover efetivamente

MCs foram relatados (SAITO et al, 2003). As bactérias ácido-láticas e bifidobactérias

geralmente são selecionadas devido às propriedades benéficas à saúde. Linhagens de

Lactobacillus e Bifidobacterium capazes de remover MCs do meio através de propriedades

de adsorção são sugeridas como base para tecnologia de tratamento de água (MERILUOTO

et al., 2005).

Maruyama et al. (2003) relataram a degradação de MC por um grupo de bactérias

Cytophaga/Flavobacterium presentes em mucilagem de Microcystis. Uma protease alcalina

isolada de Pseudomonas aeruginosa foi capaz de degradar MCLR formando DmAdda

(ácido 3-amino-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4E, 6E dienóico). A aplicabilidade desta

protease foi sugerida, pois a atividade máxima desta enzima ocorre em pH alcalino similar

ao de ambientes eutrofizados (TAKENAKA & WATANABE, 1997). Recentemente,

Burkholderia sp. capaz de degradar MCLR e D-Leu-MCLR foi isolada na Lagoa dos Patos-

Rio Grande do Sul, com eliminação de aproximadamente 90% das MCs após 43 dias de

monitoramento por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e confirmado através

de kits de ELISA (ensaio imunoenzimático) (LEMES et al., 2007).

Jones et al. (1994) isolaram a linhagem MJ-PV na Austrália, inicialmente

identificada como Pseudomonas, MJ-PV foi posteriormente classificada Sphingomonas sp.

ACM3962 (BOURNE et al., 1996). O extrato celular de Sphingomonas ACM3962

degradou MCLR e RR in vitro. No entanto, ACM 3962 não foi capaz de degradar

nodularina, um pentapeptidío que difere de MCs apenas pela ausência dos 2 aminoácidos

variáveis e substituição de N-metil-deidro-alanina por N-metil-deidrobutirina (JONES et al.,

1994).

O isolamento de outras cepas fenotipicamente similares a ACM3962 e com

capacidade de degradar MCs foi relatado principalmente no Japão (ISHI et al., 2004;

HARADA et al., 2004; PARK et al., 2001; SAITOU et al., 2003), Austrália (HO et al.,

2007) e Argentina (AMÉ et al., 2006).

A cepa Y2, capaz de degradar MCLR, RR e YR apresentou taxa de degradação

máxima na temperatura de 30º C, degradando 13 e 5,4 mg/L/dia de MCRR e LR,

respectivamente (PARK et al., 2001). A degradação de MCRR e YR após a indução da

atividade com MCLR foi relatada por Saitou et al. (2003), cuja atividade máxima da cepa

MD ocorreu em pH neutro. A degradação induzida também foi comprovada pela cepa 7CY,

que foi capaz de degradar, MCLR, RR, LY, LW e LF isoladamente, mas a degradação de

nodularina-Har só foi possível em presença de MCRR (ISHI et al., 2004). A degradação de

nodularina através da cepa B9 é descrita por Imanishi et al. (2005), que relata também a

degradação de MCLR, RR, 3-desmetil-MCLR, di-hidro-MCLR e MCLR-cisteína

conjugada. A degradação de MCLA é relatada por Ho et al. (2007), que identificou

Sphingopyxis LH21 capaz de degradar MCLR. Desmetilação de MCRR é relatada como a

primeira etapa de degradação pela cepa CBA4, (AMÉ et al., 2006).

Estas cepas pertencentes à família Sphingomonadaceae, de colônias amarelas,

aeróbias e Gram negativas (MARUYAMA et al., 2006) mostraram ser capazes de degradar

análogos diferentes, embora a indisponibilidade de padrões de MCs seja fator limitante para

avaliar o espectro de biodegradação de cada cepa.

A principal enzima envolvida na degradação de MCs é codificada pelo gene mlrA.

Este gene isolado da cepa ACM3962 possui uma seqüência nucleotídica extremamente rara,

sendo detectado também em outras cepas através de PCR nested (Polimerase Chain

Reaction). Baseado na seqüência 16S rDNA. MD-1 e Y2 apresentaram similaridade a

Sphingomonas ACM3962 de 98% e 84%, respectivamente (SAITO et al., 2003). As

linhagens B9 (HARADA et al., 2004) e 7CY (ISHI et al., 2004) apresentaram uma alta

similaridade à linhagem Y2, que foi então denominada Sphingosinicella microcystinivorans

(MARUYAMA et al., 2006). Saito et al. (2003) verificaram que nem todas as espécies de

Sphingomas são capazes de degradar MC. Por outro lado, o gene mlrA, presentes em todas

as espécies com capacidade de degradar MC, apresentou-se conservado em pelo menos 3

espécies bacterianas, sugerindo que a capacidade de degradar MC tenha sido adquirida

através da transferência de genes em algum ponto de evolução de Sphingomonas (SAITO et

al., 2003).

Recentente, a aplicação das cepas ACM3962 e B9 foram relatadas. Em escala piloto

de reservatório de água em filtros de areia de filtração lenta, ACM3962 mostrou-se efetiva

na eliminação de mais de 80% de MCLR em reservatórios inoculados com 1x10

cels/mL

(BOURNE et al., 2006). A imobilização de 7,9 x 10

céls/mL da cepa B9 em resinas de

poliéster de biorreatores mostrou eliminação completa de MCLR após 1 dia de tratamento.

A adição continuada de MCRR (600 µg) eliminou 80% da toxina, cuja eficiência persistiu

durante 2 meses em plantas de tratamento de água (TSUJI et al., 2006).

2.5.1 Mecanismo de biodegradação de microcistina

A quebra da ligação peptídica em MCs requer proteases com estruturas específicas,

pois a toxina apresentou estabilidade contra várias proteases, tripsina, quimiotripsina,

elastase, trombina, papaína, colagenase, carboxipeptidase e pepsina. Sphingomonas

ACM3962 apresentou cluster de genes A, B, C e D que codificam enzimas responsáveis

pela quebra da ligação peptídica entre Adda-Arg (gene mlrA) abrindo a estrutura cíclica do

heptapeptídeo. MCLR linear é facilmente degradada pelas peptidases codificadas pelos

genes mlrB e mlrC. O gene mlrD possivelmente codifica a proteína transportadora que

carreia a MC para dentro da célula. MlrA, supostamente uma metaloprotease foi

considerada a enzima mais importante do mecanismo de metabolização de MC, pois a

estrutura cíclica promove estabilidade contra outras proteases e outros fatores químicos

(BOURNE et al., 1996; 2001).

Bourne et al. (1996), utilizando ACM3962, testaram uma série de inibidores

enzimáticos visando o acúmulo dos compostos intermediários da biodegradação de MCs e

posterior identificação por espectrometria de massas. A aplicação de EDTA resultou no

acúmulo de MCLR linear m/z (massa/carga) 1013,5 (H-Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu-βMeAsp-

Arg-OH). Na etapa seguinte, a aplicação de 1mMd e PMSF (fenilmetil sulfonil fluoreto)

resultou no acúmulo de tetrapeptídio m/z 615 (H-Adda-Glu-Mdha-Ala-OH). A porção

Adda (m/z 332) foi isolada intacta, purificada e caracterizada após biodegradação pela cepa

B9 inoculada com 40 mg de MCLR. A toxina linear, tetrapeptídeo e Adda apresentaram

menor atividade tóxica em camundongos e menor capacidade de inibir proteínas fosfatases

que MCLR, indicando a eficiência de detoxificação deste microrganismo (BOURNE et al.,

1996, HARADA et al., 2004, HO et al., 2007). No entanto, os demais produtos de

biodegradação, peptídeos e aminoácidos ainda não foram detectados (BOURNE et al., 2001,

HARADA et al., 2004).

A cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com detector UV (238 nm) têm

sido amplamente utilizada para avaliar a biodegradação de MCs. Devido ao principal

cromóforo dieno conjugado que permite a detecção de produtos de degradação de MCs que

contém Adda na estrutura.

Em 1984, Marfey propôs um método para determinação da configuração absoluta

de aminoácidos, separando aminoácidos enantiômeros após derivatização com um reagente

quiral, no caso 1-Flúor-2,4-dinitrofenil-5-L-alaninamida (FDAA). Os aminoácidos

derivatizados são separados por CLAE e detectados a 340 nm. Este método utilizado para

caracterização estrutural de compostos peptídicos devido à sensibilidade e capacidade de

identificar corretamente aminoácidos na configuração absoluta (FUJII et al., 1997). A

combinação do método de Marfey com a espectrometria de massas foi denominada Método

Avançado de Marfey. Após a derivatização com L-FDLA (1-Flúor-2,4-dinitrofenil-5-L-

leucinaminamida), os aminoácidos foram identificados baseados no tempo de retenção e

espectro de massas dos derivados. Neste método, a ordem de eluição de enantiômeros D e

L aminoácido foi elucidada pela comparação da hidrofobicidade entre o grupo α-carbonil e

a cadeia lateral do aminoácido na conformação tipo cis e trans, para D e L aminoácido,

respectivamente. Em geral, L-aminoácido é eluído da coluna cromatográfica antes do

correspondente enantiômero D-aminoácido (FUJII et al, 1997).

Desta forma, o método avançado de Marfey com ESI-LCMS para identificação de

aminoácidos e peptídeos representa uma alternativa promissora para o estudo do

mecanismo de biodegradação de MCs.

Figura 2 – Tipo de conformação de D e L aminoácidos derivatizados com L-FDLA.

2.6 Metodologia Analítica para detecção de Microcistina

A conscientização dos riscos da exposição de MCs à saúde humana culminou no

desenvolvimento de métodos para a análise dessa classe de toxinas. Para minimizar os

perigos de contaminação e intoxicação por MCs são necessários métodos sensíveis e

confiáveis, capazes de detectar um amplo espectro de toxinas em matrizes diversas e

capazes de monitorar MCs na faixa da concentração mínima permitida em água de 1 µg/L e

dose diária tolerável de 0,04 µg/Kg /dia, estabelecidas pela Organização Mundial de Saúde

(WHO- Word Health Organization, 1998 ).

Entre os métodos desenvolvidos para proceder à análise quantitativa e qualitativa de

MCs destaca-se a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) combinada com

detector ultra violeta –UV e foto-diodo (PDA- photo diode array) (LAWTON et al.,1994,

MERILUOTO, 1997). Preconizada para a separação com alta eficiência de uma extensa

variedade de compostos químicos e biológicos, a CLAE permite análise quantitativa com

eficiência e sensibilidade, embora a detecção por espectrometria de massas (MS - Mass

spectrometry) forneça uma identificação mais exata dos análogos (ZWEIGENBAUM et al.,

2000). Ainda assim, nenhuma metodologia isolada, entre as disponíveis, é suficiente para

analisar precisamente a toxicidade e exato perfil dos diferentes análogos de MCs

(HARADA et al., 1999).

2.6.1 Métodos físico-químicos para análise de microcistina

O fluxograma 2 apresenta as etapas da metodologia analítica de cianotoxinas.

Frascos de vidro são recomendados para coleta de amostras, devido ao risco de falsos-

negativo decorrente da adsorção de MCs em materiais plásticos (CODD & BELL, 1996).

Em amostras de floração ou cultivo, a centrifugação permite a concentração da biomassa,

além de reservar o sobrenadante para análise da toxina extracelular remanescente. De forma

geral, têm-se utilizado biomassa amostral de 1 mg a 26 g (peso seco). A determinação da

massa inicial é etapa primordial para quantificação exata da concentração de cianotoxinas

(DELL AVERSANO et al., 2004; MERILUOTO & ERIKSSSON, 1988; MOOLLAN et al.,

1996; SAITO et al., 2002).

A extração da toxina pode ser realizada através da agitação overnight da biomassa

em solvente, mas comumente realiza-se o rompimento celular por métodos físicos como

sonicação, agitação mecânica (vortex) e processos de congelamento/descongelamento. O

sonicador é amplamente empregado, no entanto o uso prolongado em pequenas amostras

pode elevar a temperatura do extrato, resultando em evaporação e/ou degradação, além

disso, pode ocorrer a desintegração de membranas de filtro de vidro utilizados na etapa de

concentração da biomassa, inteferindo na quantificação de MCs (SPOOF et al., 2003).

A escolha do solvente para extração deve considerar a polaridade dos diferentes

análogos de MCs. A recuperação da toxina é melhorada por re-extrações, em geral 3 vezes

com o mesmo solvente ou extração sequencial (combinações de solventes). Os principais

solventes utilizados consistem de soluções de metanol, água e combinação de metanol-água.

A solução aquosa de metanol 75% (v/v) é considerada a mais apropriada para extração de

MCs com polaridade variada (FASTNER et al., 1998). MCs hidrofílicas, como MCLR, RR

e YR, apresentam melhor recuperação na extração com ácido acético 5% aquoso (v/v),

seguida de metanol (90%, v/v) (LAWTON & EDWARDS, 2001). EDTA pirofosfato de

sódio é recomendado para extração de MCs em solos e sedimentos (CHEN et al., 2006).

Metcalf & Codd et al. (2000) propuseram o uso de microondas ou fervura para extração de

MCs, evitando-se o uso de solventes orgânicos, que interferem em métodos sensíveis como

o imunoensaio.

Fluxograma 2 - Etapas de metodologia físico-química na análise de cianotoxinas (Fonte:

SANGOLKAR et al., 2006)

Pré-limpeza e pré-concentração de MCs em minicolunas (cartridge) é requisito

indispensável em análises que exigem baixo limite de detecção, constituindo fator

fundamental na proteção de coluna cromatográfica utilizada em CLAE. Minicolunas de

pré-limpeza ODS (octadecyl silanized C

silica gel) amplamente empregadas, retêm MCs

através de interações hidrofóbicas (RAPALA & LAHTI, 2002). As colunas de

imunoafinidade (CIAs) representam uma alternativa a minicolunas de fase sólida C

para

remoção de interferentes de matriz e concentração de amostras com uso mínimo de

solventes orgânicos (KONDO et al., 2000). Apesar da recuperação ser comparável a

minicoluna C

, o alto custo da produção de anticorpos é a principal limitação das CIAs

(ARANDA-RODRIGUEZ et al., 2003).

Para evitar a degradação fotoquímica, hidrolítica ou oxidação o extrato deve ser

seco e conservado em frascos âmbar. O liofilizador, fluxo de gás nitrogênio ou argônio

Centrifugar/

Filtrar

Liofilizar a

biomassa

Pesar r o pelete

Amostra

BIOMASSA

Adicionar

solvente / sonicar

Centrifugar

Re-extração do

Pelete

Homogenizar a

biomassa

EXTRAÇÃO

Extração de fase

sólida

Evaporar o

eluato/ secar

Redissolver

Centrifugar/

coletar

sobrenadante

CONCENTRAÇÃO

Tempo de

retenção (tR)

Espectro UV/

Espectro de

Massa

Comparar tR e

espectro com

padrões

Analisar por

HPLC-PDA/ MS

Tandem MS

IDENTIFICAÇÃO

HPLC-UV

Curva de calibração

(plotar área do pico x

concentração do

padrão

Determinar a

concentração da

toxina

Padrão de toxina

QUANTIFICAÇÃO

acoplado a rotavapor a 40-60º C têm sido utilizados para remoção total do solvente

(LAWTON et al., 1994; SPOOF et al., 2003).

Entre as diversas fases estacionárias de CLAE aplicáveis na separação de MCs

destaca-se as colunas de fase reversa C

, além de colunas de amida C

e colunas de troca

iônica. A escolha apropriada da fase móvel permite uma boa resolução do analito, sendo

empregados principalmente metanol ou acetonitrila (LAWTON et al., 1994).

Medidas de absorbância de UV é a técnica mais comum na detecção de MCs após

separação por CLAE. A maioria das MCs possuem absorção máxima de UV em 238 nm

atribuído ao principal cromóforo, o dieno conjugado na porção Adda, comum em todos os

análogos. Com exceção dos análogos contendo triptofano, como MCLW que apresentam

absorção máxima no comprimento de onda de 222 nm (LAWTON et al., 1994). No entanto,

a co-eluição de interferentes de matriz com absorção em comprimento de onda próxima a

238 nm resultando em falsos-positivo devem ser considerados (MOOLLAN et al., 1996). A

comparação com o tempo de retenção, espectro UV e área do pico de padrões de toxinas é a

base para identificação e quantificação de MCs (RAPALA et al., 2002). Assim, o principal

obstáculo na análise de MCs é a falta de padrões de toxinas, entre os 80 análogos

identificados, apenas alguns possuem padrões comercialmente disponíveis. Na ausência de

padrões, muitos análogos são quantificados e a concentração expressa em MCLR-

equivalente (McELHINEY & LAWTON, 2005).

A cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LCMS) tem sido

empregada para análise qualitativa de MCs. Na espectrometria de massa, as moléculas são

ionizadas e um analisador de massas separa os íons formados de acordo com a razão

massa/carga (m/z), detector que quantifica os íons e transforma o sinal em corrente elétrica,

onde a magnitude do sinal elétrico em função da m/z é convertida por um processador de

dados representando um espectro de massa correspondente (GAVES & HAYSTEAD,

2002).

A exatidão de determinações de MCs tem sido relatadas em análises por

cromatografia líquida acoplada a diferentes métodos de espectrometria de massas, tais

como bombardeamento atômico rápido (Fast Atomic Bombardment – FAB), massa em

tandem (MS/MS) técnicas de ionização em pressão atmosférica (atmospheric pressure

ionization –API) e ionização por eletron-spray (electrospray ionization-ESI) (EDWARDS

et al., 1993; KONDO & HARADA, 1996; NAMIKOSHI et al.,1992; OTT &

CARMICHAEL, 2006; SIVONEN et al., 1992). Análogos de MCs apresentam diferentes

padrões de fragmentação ([M+H]

, [M+2H]

íons) dependendo do resíduo de aminoácido

presente (PÉREZ & AGA, 2005). Na indisponibilidade de padrões de MCs comerciais, a

toxina pode ser identificada por tentativa comparando-se espectros de massas descritos na

literatura.

A cromatografia líquida acoplada a MS com interface ESI é uma técnica simples,

sensível e apropriada para o monitoramento e identificação de uma ampla variedade de

MCs. Metodologia baseada em LC-MS-ESI tem sido desenvolvida possibilitando a

detecção simultânea de várias cianotoxinas como microcistinas, saxitoxinas, anatoxina e

nodularina em uma única corrida cromatográfica (DAHLMANN et al., 2003).

Espectrometria de massas em tandem (MS/MS) identifica compostos desconhecidos

com mais exatidão. MS/MS é usado para fragmentar um peptídio específico em peptídios

menores no qual a seqüência aminoacídica é deduzida (GAVES & HAYSTEAD, 2002)

Na ausência de informações sobre a massa do analito, o perfil de fragmentação fornecido

por MS/MS tem sido uma ferramenta para identificar análogos de MCs em matrizes

complexas (LAWTON et al., 1995). Fragmentos ionizados gerados pela dissociação

induzida por colisão (CID – collision induced dissociation) tem mostrado grande potencial

para confirmação da presença de MCs em amostras ambientais (ZHANG et al., 2004). Em

especial, o fragmento íon m/z 135 característico, derivado de Adda, fornece um diagnóstico

útil para identificar a presença de MCs mesmo em amostras ambientais com grande número

de interferentes (HARADA et al., 1999).

Fastner et al. (2001) identificaram MCs e outros oligopeptídeos em colônias de

Microcystis empregando ionização por MALDI com analisador de TOF (Matrix Assisted

Laser Desorption Ionization- Time of flight). No método de MALDI-TOF MS, a amostra

contendo a espécie de interesse é misturada com uma matriz (geralmente ácido α-ciano

hidroxicinâmico-CHCA, ácido sináptico-SA ou ácido 2,5-dihidroxidobenzóico-DBH)

formando uma mistura sólida. Um pulso de laser, com comprimento de onda próximo ao

UV, incide sobre essa mistura e a energia do laser é absorvida pela matriz, que evapora e o

analito se dispersa na fase gasosa altamente energética. A ionização ocorre através da

transferência de carga das moléculas da matriz para o composto que fica na forma de

[M+H]

. Os íons formados recebem uma alta energia cinética inicial que os impulsiona

para o analisador de massas Time-of-flight (TOF), onde são separados de acordo com o

tempo de vôo, considerando a distância na qual o íon se movimenta até atingir o detector. A

principal vantagem de MALDI-TOF é a possibilidade de analisar pequenas amostras sem

necessidade de pré-limpeza. A análise direta de colônias simples de Microcystis é uma

ferramenta para prevenir com antecedência floração de espécies toxigênicas

(SANGOLKAR et al., 2006).

Outras alternativas analíticas para análise de MCs inclui a cromatografia em camada

delgada (CCD), eletroforese capilar (EC), cromatografia gasosa (CG) entre outros. CCD

constitui técnica conveniente para detecção de MCs. Devido à facilidade e rapidez na

execução, análise de extratos brutos, baixo custo, detecção múltipla de compostos e

visualização direta do perfil cromatográfico baseado na cor, fluorescência e aspecto da

corrida (fator de retenção do analito - fr) é aplicável para triagem e apresenta boa

correlação com ELISA e ensaio de inibição de proteínas fosfatases (McELHINEY &

LAWTON, 2005). A EC separa a toxina por diferenças de tamanho e carga da molécula.

Apesar da baixa sensibilidade a EC pode ser melhorada acoplando-se detectores de

fluorescência ou ESI-MS (SIRÈN et al., 1999). A CG pode ser aplicada para separar

MMPB (ácido 2 metil-3metoxi-4fenil-butírico) formado pela oxidação de Adda através de

ozônio, permanganato ou periodato (HARADA et al., 1996, KAYA & SANO, 1999).

Apesar de consumir tempo e não apresentar especificidade, a análise de MMPB têm se

mostrado útil na detecção de MCs em amostras complexas como as de sedimentos (TSUJI

et al., 2001).

Atualmente, biosensores têm se destacado como ferramenta promissora no

monitoramento contínuo, in sittu e em tempo real. Biosensores são dispositivos que

transformam uma informação química em um sinal analítico, como a variação da

concentração de um componente específico de uma amostra. Estes sistemas contêm duas

unidades funcionais básicas: um receptor e um transdutor. A portabilidade e simplicidade

de análise são as principais vantagens dos bionsensores eletroquímicos. No entanto, a

necessidade de re-utilização através de várias etapas de lavagens é um dos maiores

obstáculos no desenvolvimento de biosensores como método rápido. Biosensores

imunoenzimáticos, com anticorpos anti-MCs acoplados apresentam mais sensíveis que os

biosensores enzimáticos com proteínas fosfatases com limite de detecção de 100 ng/L e 37

µg/L, respectivamente (CÀMPAS et al., 2007; ZHANG et al., 2007).

2.6.2 Ensaios biológicos para análise de microcistina

Até recentemente, o bioensaio com camundongo foi aplicado em muitos

laboratórios como método de triagem para determinar a presença de hepatotoxinas em

amostras de água. Porém, o ensaio apresenta baixa sensibilidade e especificidade. Além

disso, o uso de animais em testes de toxicidade tem sofrido implicações éticas com

oposições públicas (MOUNTFORT et al., 2005). O emprego de animais invertebrados tais

como Daphnia sp., Drosophila melanogaster e larvas de mosquitos foi investigado, no

entanto não foram validados para monitoramento de rotina. O bioensaio com camarões

(Artemia salina) tem se mostrado aplicável, no entanto não apresenta especificidade e sofre

interferências de matriz (McELHINEY & LAWTON, 2005).

O ensaio de inibição de proteínas fosfatases (PP) é baseado na capacidade de MCs

inibir PP. Este ensaio bioquímico fornece uma indicação da atividade da toxina, além de ser

rápido e a enzima ser comercialmente disponível. O método detecta MCs na faixa de

concentração limite (1 µg/L) permitida pela OMS, embora a inibição enzimática varie entre

os análogos de MCs (RAPALA et al., 2002; WHO, 1998). A reação pode ser quantificada

por substrados

P (fósforo) marcado ou substratos cromogênicos como fosfato de p-

nitrofenol (p-NPP) com boa correlação com HPLC (RIVASSEAU et al., 1999). O método

PP utlizando substratos fluorescentes como 4-metilumbeliferil fosfato e 6,8-difluor-4-

metilumbelirefil fosfato foi 2 vezes mais sensível que p-NPP (BOIAICHA et al., 2002).

O imunoensaio ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) é promissor para

triagem e detecção de MCs em rotina laboratorial de controle de qualidade e

monitoramento ambiental. ELISA utilizando anticorpos anti-MCs policlonais e

monoclonais (METCALF et al., 2000; NAGATA et al.,1995, ZECK et al., 2001) são

sensíveis o suficiente para monitorar MCs de acordo com os limites da OMS (WHO, 1998).

Atualmente, vários kits de ELISA são disponíveis comercialmente (Abraxis LLC,

Pensilvania Inc, USA; EnviroLogix Inc., Portland, ME, USA; Strategic Diagnostic Inc,

Newark, DE, USA e WAKO Chemicals, Osaka, JP). Apesar da praticidade, estes kits

apresentam baixa reatividade cruzada contra diferentes análogos de MCs. Na maioria dos

casos os anticorpos são produzidos a partir de imunização de animais com um análogo

específico, geralmente MCLR. Uma inovação recente é o uso de anticorpos anti-Adda, o

resíduo de β-aminoácido presente em todos os análogos (ZECK et al., 2001). Além da

possibilidade de resultados falsos-positivo em matrizes complexas, os kits de ELISA

podem superestimar a concentração de MCs, o uso de anticorpos anti-Adda não referencia

o grau de toxicidade, pois impossibilita a distinção entre os análogos de MCs.

O anticorpo monoclonal de melhor performance (M8H5) possui limite de detecção

de 0,025 µg/L, sendo capaz de detectar 5 variantes de MCs (MCLR, MCRR, MCYR, 3-

desmetil MCLR e 7-desmetil MCLR) e nodularina. M8H5 foi utilizado para

desenvolvimento de coluna de imunoafinidade (CIA) para pré-limpeza de amostras de

material biológico (tecido animal) e para concentração de amostras com quantidade traços

de toxina (KONDO et al., 2002, TSUTSUMI et al., 2000).

O tempo e alto custo inicial requerido na produção de anticorpos a partir de

hibridomas são as principais desvantagens dos métodos imunológicos. O uso da tecnologia

de anticorpos recombinantes tem sido proposto como uma alternativa a produção de

hibridomas. Esta inovação utiliza fragmentos de anticorpos selecionados a partir de

biblioteca de fagos. Os fagos são expostos na superfície de bacteriófagos filamentosos, e

em seguida são selecionados através da exposição ao antígeno. Os fragmentos selecionados

são expressos em Escherichia coli com um maior rendimento e custos consideravelmente

menores que anticorpos gerados por métodos tradicionais. Anticorpo de cadeia simples 3A8

clonado de biblioteca de anticorpos humano semi-sintético naïve (não imunizado)

apresentou aplicabilidade em CIA e em biosensores. Selecionados contra MCLR, 3A8 é o

fragmento de anticorpo mais sensível, possuindo limite de detecção de 0,8 µg/L para

ELISA, sendo capaz de detectar MCRR, MCLW, MCLF e nodularinas na faixa de nM

(McELHINEY et al., 2000, 2002).

Embora células produtoras e não produtoras de toxinas não apresentem diferenças

fenotípicas, o uso de técnica como PCR (polimerase chain reaction) vem sendo aplicada

para detecção de cluster de gene mcy que codificam microcistinas sintetases para análise da

ocorrência de espécies toxigênicas de M. aeruginosa (DITTIMAN et al., 1997).

2.7 Ensaio imunoistoquímico na detecção de microcistinas

Pela combinação de técnicas anatômicas, imunológicas e bioquímicas a

imunoistoquímica permite localizar toxinas em componentes tissulares definidos

(GIMENO et al.,1997). A metodologia baseia-se na reação antígeno-anticorpo, visualizada

por anticorpo marcado em tecidos fixados, processados por métodos histológicos

convencionais. Devido a especificidade a técnica se tornou crucial e largamente empregada

em laboratórios médicos e diagnósticos clínicos.

Inicialmente foram utilizados anticorpos marcados com substâncias fluorescentes

(COONS et al., 1941) com a expansão da imunoistoquímica, foi introduzido anticorpo

marcado como peroxidase (AVRAMEAS & URIEL 1966; NAKANE & PIERCE 1966) e

fosfatase alcalina (MASON & SAMMONS 1978). Sistema peroxidase aplicado

diretamente nos tecidos animais pode resultar em falsos-positivo, devido à presença de

peroxidases endógenas. O bloqueio prévio de peroxidase endógena com soluções de

peróxido de hidrogênio melhorou a performance desse sistema (MALORNY, et al., 1988).

Ouro coloidal foi introduzido e aplicado para análises em microscópio optico e eletrônico

(FAULK & TAYLOR, 1971).

Dados de experimentos in vivo sobre a biocumulação de MCs e transferência na

cadeia alimentar humana não têm sido relatadas, portanto técnicas capazes de localizar

MCs em tecidos animais representam uma ferramenta importante para marcar o percurso de

MCs e prever os riscos de contaminação na cadeia alimentar. Patogenia, hepatotoxicidade e

marcação de MCLR foram observadas em tecidos de camundongos (YOSHIDA et al., 1998,

ITO et al., 2000). A distribuição de MCLR foi observada em intestino, plasma, fígado,

pulmão, coração e em capilares do corpo todo em ratos oralmente administrados com 500

µg/Kg de MCLR (ITO et al., 2000).

Em peixes MCLR foi detectada em hepatócitos de trutas (O. mykiss) após 3 h da

administração gavage de 5,7 mg/Kg da toxina. A investigação através de anticorpo M8H5,

utilizando doses letais (2 mg/Kg ) de MCs em tilápias (O. niloticus) permitiu a detecção de

MC somente no fígado (FISHER & DIETRICH 2000; HITSFELD et al., 2000;

KAMOGAE et al., 2002).

2.8 Ensaios de genotoxicidade

Ensaios de toxicidade e citotoxicidade são empregados para avaliar a qualidade da

água em estudos de biomonitoramento de rios e na avaliação da genotoxicidade de

poluentes em ensaios de laboratório ou no campo (BICKHAM et al., 2000; HOUK, 1992).

O alimento é a principal rota de exposição a substâncias químicas tóxicas. Peixes e

crustáceos são freqüentemente apontados como vetores na transmissão de contaminantes

aos humanos. Por outro lado, os peixes reúnem características que os tornam excelentes

modelos experimentais para estudos de toxicologia aquática, pois alertam sobre o perigo

potencial de novas substâncias químicas ou para a possibilidade de poluição ambiental

(POWERS, 1989). Além disso, os peixes podem indicar o potencial de exposição das

populações humanas a substâncias genotóxicas presentes na água, sendo um excelente

modelo para estudos carcinogênicos e mutagênicos em amostras de água (AL-SABTI &

METCALFE, 1995).

Ensaio do cometa

O Teste do Cometa ou Ensaio de Eletroforese em Microgel é um teste sensível e

com grande potencial para a detecção de danos no DNA. Este ensaio avalia quebras

primárias na fita de DNA em células individuais e é relativamente rápido, simples e de

baixo custo (BELPAEME et al., 1998; LOVELL et al., 1999; SINGH et al., 1988).

No teste do Cometa, células são suspensas em agarose de baixo ponto de fusão

sobre uma lâmina de vidro para microscopia. As lâminas são colocadas em solução de lise

para permitir o relaxamento do DNA e em seguida é realizada a eletroforese. Durante a

eletroforese, os fragmentos de DNA danificados migram para além do core nuclear,

formando um cometa com cauda; os fragmentos danificados migram mais rapidamente do

que as moléculas de DNA intactas e as células que não foram expostas a um agente

genotóxico não formam cauda (PANDRANGI et al., 1995). Assim, quanto maior o dano,

maior a cauda do cometa.

O ensaio conduzido sob condições alcalinas (pH = 13) mede quebras de fita simples

e lesões em sítios álcali – lábeis (SINGH et al., 1988; LEE & STEINERT, 2003). O Teste

do Cometa mede danos genotóxicos, cujo efeito pode ser transitório, ou seja, reparáveis

(DEARFIELD et al., 2002; LOVELL et al., 1999). A sensibilidade aliada à aplicabilidade

em diversos tipos celulares e a necessidade de baixo número de células para a realização do

teste são as principais vantagens do ensaio (LEE & STEINERT, 2003; TICE, 1995).

Teste do micronúcleo

O teste do micronúcleo (MN) é um ensaio citogenético rápido e serve tanto para

detectar alterações cromossômicas estruturais como numéricas, i.e., efeitos mutagênicos

persistentes (HEDDLE et al., 1983). O teste do micronúcleo é comumente usado em vários

sistemas biológicos para o monitoramento de genotoxicidade ambiental (DEARFIELD et

al., 2002; MERSCH & BEAUVAIS, 1997).

Os micronúcleos são massas de cromatina citoplasmática com a aparência de

pequenos núcleos que surgem da condensação de fragmentos cromossômicos ou de

cromossomos acêntricos inteiros que não foram incluídos no núcleo principal, perdidos na

anáfase (AL-SABTI & METCALFE, 1995; HEDDLE et al., 1983). Os micronúcleos se

assemelham ao núcleo principal e podem ser observados facilmente em vários tipos

celulares após um ciclo de divisão celular (AYLLÓN & GARCIA-VAZQUEZ, 2000). O

MN representa um indicativo de danos citogenéticos de curta duração e promovem a

evidência de quebras cromatídicas ou cromossômicas e de disfunção nas fibras do fuso

causada por clastógenos e venenos do fuso, respectivamente (MINISSI et al, 1996).

O teste do micronúcleo em peixes é um teste promissor nas investigações de

mutagênese ambiental, a freqüência de micronúcleos parece estar fortemente relacionada

com a qualidade da água dos diferentes ambientes examinados (AL-SABTI & METCALFE,

1995; GRISOLIA & STARLING, 2001).

2.9. Risco de Microcystis spp. Toxigênica no Cenário da Piscicultura Brasileira

Hashimoto, E.H. Bittencourt-Oliveira, M.C, Hirooka, E.Y.

Risco de Microcystis spp. Toxigênica no Cenário da

Piscicultura Brasileira. Revista Biosaúde, 1/2 (5),69-81,

2003. (Atualizado)

Abstract

Aquaculture has been a growing affair in the recent Brazilian agribusiness, stimulated by adequate climate

condition and abundant supply of water reservoir. Nevertheless, an uncontrolled fish harvest activity can

result in deleterious impact in environment caused by increasing nutrient level in water due to feed input,

mainly of nitrogen and phosphorus, and consequent eutrophication and toxic cyanobacteria bloom. The fish

places in the top of aquatic food chain system, which exposes directly to toxic cyanobacteria. Experimental

studies reported the toxicity of microcystins (MCs) and others toxic components of Microcystis sp. cells, such

as fat acids and lipopolysaccharides (LPS). General acute toxicity and death caused by MCs were associated

with symptoms include damages in heart, kidney, gills, and spleen, as progressive and chronic hepatocyte

injury and necrosis. However, further systematic studies are required concerning tumor-promoting effect of

some cyanotoxins. This review compiles the information about toxicity of Microcystis sp. in fish and its

implication in the aquaculture system.

Key-words: Microcystis, aquaculture, fish and toxicity.

Introdução

O uso de recursos hídricos para a criação de peixe experimentou um crescimento

substancial nos últimos anos, cujo sistema de policultivo aliado ao incremento de ração

resultou na eutrofização nos tanques. O acúmulo de nutrientes no ambiente aquático,

principalmente de nitrogênio e fósforo resulta na queda da qualidade de água, constituindo

em causa mais comum de floração de cianofíceas toxigênicas, onde Microcystis spp.

destacam-se pela floração cosmopolita e produção de microcistina (MC). A intoxicação e

letalidade em peixe devido à floração de cianofíceas (exposição aguda) decorrem da

hepatotoxicidade desencadeada pela MC, e/ou diminuição dos teores de oxigênio

dissolvido, decorrente de crescimento microbiano.

Os peixes predominantemente cultivados no Brasil são tilápias e carpas pela

excelência na rusticidade, rápido ganho de peso e habilidade de aproveitar resíduos

agropecuários. Ocupando o topo da cadeia alimentar no ambiente aquático, o peixe,

principalmente de espécies fitoplanctófagas como tilápia e carpa, expõe-se diretamente às

cianotoxinas seja por contato ou ingestão.

As cianofíceas, além de causarem prejuízos econômicos na piscicultura, podem

afetar a qualidade da carne pela bioacumulação de cianotoxina, atingindo indiretamente a

saúde humana. Conseqüentemente, a produção de peixe requer rigoroso controle de

qualidade desde a água, composição de rações e aspecto sanitário no manejo,

processamento e comercialização. No contexto, a inserção dos testes de toxicidade capazes

de estabelecer limites permissíveis perante contaminantes químicos, assim como

caracterizar as injúrias teciduais, constituiria em ferramenta primordial na segurança e

qualidade da carne de peixe.

Considerando as atribuições crescentes na piscicultura, a revisão discerne sobre o

efeito de Microcystis spp. toxigênica em peixe e o impacto na piscicultura brasileira no

cenário de agronegócio globalizado.

Panorama sobre Piscicultura Brasileira

A piscicultura tem se desenvolvido rapidamente nos últimos anos, constituindo na

alternativa eficaz na obtenção de proteína nobre de baixo custo. A atividade consiste na

produção comercial em cativeiro, cujos aspectos inerentes dependem de rigoroso controle

de qualidade em todas as etapas de cultivo e produção (SEAB, 2003).

O fator climático brasileiro favorece a competitividade comercial de peixe,

permitindo produção com o custo quatro vezes inferior à Europa. Tradicionalmente, o país

exporta pescado para os EUA (70 %), Japão (20 %), Argentina (2 %), com perspectiva de

ampliação no Mercosul e Comunidade Econômica Européia (CEE). Uma análise

comparativa do crescimento da aqüicultura com outros setores produtores de proteína no

Brasil, revelou uma taxa anual média, entre 1990 e 2003, de 23,3 % para a aqüicultura,

frente às taxas de crescimento do setor de aves (10 %), bovinos (4 %), suínos (7,9 %) e soja

(8,6 %). A aqüicultura atualmente representa 5% da produção animal nacional (SEAP,

2007).

No Paraná, cerca de 20 mil produtores dedicam-se à atividade, o que representa

5,7% do total de propriedades rurais no estado, responsáveis pela produção de

aproximadamente 18 mil toneladas por ano. A piscicultura paranaense destaca-se entre os

três maiores produtores nacionais, sendo 62 % destinada ao pesque-pague, 26 % às

indústrias, 10 % ao consumo direto e 2 % comercializadas em feiras. Entre as principais

espécies produzidas, destaca-se a tilápia com participação de 64,9 % e carpas, 15,5 % na

produção estadual (AEN, 2007; ANDRADE et al., 2005; ARAGÃO, 2003; SEAB, 2003).

O requisito básico da água para o cultivo aquático depende da perfeita interação

entre oxigênio disponível, temperatura, matéria orgânica, nutrientes, espécie e densidade

mantida no sistema. A quantidade excedente de ração resulta em desequilíbrio ecológico,

alterando parâmetros físico-químicos do meio aquático. Salienta-se que 80 % do nitrogênio

de ração são excretados como amônia, cuja elevada concentração provoca desde atraso no

crescimento até intoxicação letal em peixe. Em síntese, por mais que se desenvolvam

rações balanceadas, estas podem comprometer o meio ambiente por lixiviação de nutrientes.

(TABOLT & HOLE, 1994).

A introdução excessiva de matéria orgânica acelera o crescimento de microalgas e

plantas superiores, perturbando o balanço de biota aquática. A conseqüente floração algal

diminui níveis de oxigênio e resulta na liberação de cianotoxinas e morte de peixes

(CARMICHAEL, 1992). Microcystis aeruginosa, espécie unicelular de distribuição

universal, é a principal produtora de MCs durante floração em meses favorecidos com

temperatura da água em torno de 22º C (REYNOLDS et al, 1981).

O CONAMA (Conselho Nacional do Meio Ambiente) determina que águas

destinadas à criação natural e/ou intensiva na aqüicultura devem preencher requisitos para

classe 2, perante limites de nutrientes e características físicas e químicas (CONAMA, 2002).

O limite máximo permitido de MCLR em água potável é de 1 µg/L (MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2000; WHO, 1998).

A análise físico-quimica de águas de piscicultura da região de Londrina-PR

(Julho/2001) mostrou alteração marcante nos níveis de alcalinidade, condutividade,

nitrogênio total, nitrito, nitrato e amônia, possivelmente devido ao incremento de rações. O

teor de nitrogênio total apresentou-se elevado (41,63 a 83,26 mg/L) principalmente em

tanques com alta densidade de peixe, indicando que a atividade propicia a eutrofização e

condições para a floração de cianofíceas (HASHIMOTO, 2002).

Eler et al. (2001) relacionaram a mortalidade de peixes em pesque-pague

(Descalvado-SP) a floração de Anabaena spiroides e Microcystis aeruginosa. O

monitoramento durante um ano de fitoplâncton em um pesqueiro de São Paulo-SP

identificou 112 táxons compostos principalmente por Cholorophyceae (52,7%) e

Cyanophyceae (17,9%) (MATSUZAKI et al., 2002).

Tamanaha et al. (2002), monitorando seis tanques de piscicultura (Agosto–

Outubro/2000) no Alto Vale do Itajaí-SC, onde predomina o cultivo de tilápia (80%), carpa

(15%) e bagre africano (5%), detectaram fitoplâncton composto de 51 espécies, com

floração predominante de Microcystis spp. atingindo densidade máxima de 5,12 x 10

céls/mL. Segundo os autores, o modelo de policultivo aplicado pela Empresa de Pesquisa

Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina - EPAGRI integrava a atividade de

suinocultura, visando diminuição do impacto ambiental, i.e. os dejetos constituíam fonte

alimentar direta (resíduos) e indireta (crescimento de fitoplâncton e zooplâncton) na

produção de pescado. Todavia, a piscicultura como alternativa para o aproveitamento de

dejetos e sobras afeta a qualidade sanitária de peixe (ZOCCARATO et al., 1995), além da

conseqüência indesejada de eutrofização (GOWEN, 1994).

Mais recentemente, em 2007, no Rio de Janeiro, noticiou-se a proibição da pesca e

venda de pescado no complexo lagunar da Barra da Tijuca. A presença de MC, produzida

por M. aeruginosa foi confirmada na água, em concentração 6 vezes acima da tolerável e

nas vísceras e carne de tilápia superando 0,06 µg/Kg (O GLOBO, 2007).

Efeito tóxico de microcistina em peixe

Estudos demonstram o acúmulo de MCs em tecidos, incluindo fígado e músculo de

organismos aquáticos (FISCHER & DIETRICH, 2000; LI et al., 2004; MAGALHÃES et

al., 2001, 2003; SOARES et al., 2004). Portanto, a saúde humana pode ser afetada pela

ingestão indireta de MCs, cujos riscos depende de toxicidade de florações na área de pesca.

Inicialmente, a letalidade de peixes devido a florações tóxicas foi correlacionada

com a hipóxia, causada pela alta demanda bioquímica de oxigênio no ambiente aquático.

Todavia, Rodger et al. (1994)

observaram dano hepático similar em truta tratada com

Microcystis spp. toxigênica in vitro, indicando que o efeito ocorreu principalmente pela

ação direta de MC e não pela redução de oxigênio dissolvido (PHILIPS et al., 1985;

RABERGH et al., 1991; SUGAYA et al., 1990).

Os peixes apresentaram maior sobrevivência e tolerância a altas doses de MCs, se

comparados a ratos e camundongos com LD

de 122 e 72 µg/Kg (massa corpórea),

respectivamente (MIURA et al., 1991). A cinética de absorção da toxina parece ser mais

lenta no hepatócito de peixe (ANDERSEN et al., 1993), devido à possibilidade de

adaptação ecológica dos animais que compartilham o mesmo habitat de florações de

cianofíceas. A dose letal (LD

) intraperitoneal (ip) de MCLR varia entre as espécies de

peixes, sendo considerada 550 µg/Kg (de massa corpórea) para carpa (RABERGH et al.,

1991), 2,6 mg/Kg para “goldfish” (SUGAYA et al., 1990), 1,6 mg/Kg para Salmão

(ANDERSEN et al., 1993) e 2 mg/Kg para tilápia do nilo (KAMOGAE et al., 2002).

Efeito agudo de MCs em peixe resulta principalmente em danos hepáticos

(PHILIPS et al., 1985; RABERGH et al., 1991; SUGAYA et al., 1990). Além de necrose

tecidual, a exposição crônica da toxina reduz a taxa de crescimento em trutas, devido ao

estresse comprometendo a absorção e eficiência na conversão de alimentos (BURY et

al.,1996).

As principais alterações histológicas por MC em peixe ocorrem no fígado, rim e

brânquias. O salmão (Salmo salar) submetido à dose cumulativa ip 1,66 mg/Kg de MCLR

apresentou alteração hepática após 36 dias da injeção ip, sendo observado necrose difusa e

megalocitose hepática (ANDERSEN et al., 1993).

Em carpa, as doses ip de 130-250 µg/Kg de MCLR causaram dano hepático com

dissociação de hepatócitos e degeneração hidrópica, enquanto que no rim ocorreram

dilatação da cápsula de Bowman e glomérulo. A administração ip de 550 µg/Kg causou

perda total da arquitetura de parênquima hepático com degeneração de túbulos renais

(RABERGH et al.,1991). A partir de 400 µg/Kg (ip), além de danos no hepatopâncreas e

rim, foi possível detectar MC procedendo marcação imunoistoquímica, após 1 hora da

aplicação da dose (FISCHER & DIETRICH, 2000).

Em truta administrada com 5,7 mg/Kg (massa corpórea) por gavage, o pico (517

ng/mL) máximo de MC-LR* (marcada) no plasma ocorreu após 3hrs, reduzindo ao nível de

6,0 ng/mL (limite de detecção) após 48hrs. No fígado, a detecção de MC-LR* ocorreu em 1

hora após a administração, com o pico máximo após 3hrs da administração (524 ng/g de

tecido) e permaneceu detectável mesmo após 72 horas (TENCALLA et al., 1997).

Os parâmetros bioquímicos de toxidez de MCs baseados na análise de enzimas

hepáticas e íons plasmáticos foram avaliados em carpas submetidas a diferentes vias de

administração (injeção ip, imersão e ingestão forçada – ‘gavage’ de extratos semi-

purificados de M. aeruginosa toxigênica). Nas doses ip de 2,5 a 50 mg/Kg ocorreu aumento

na atividade de aspartame e alanina aminotransferase (AST e ALT), indicando dano

hepático. O aumento na concentração de ácidos biliares e bilirrubinas foram

correlacionados com a excreção da toxina. O decréscimo de Na

e Cl

plasmático ocorreu

em todas as vias: gavage de 2,5- 250 µg/Kg (massa corpórea) e imersão em aquário com

1,7 µg/mL , resultado similar foi observado em carpas coletadas em lago contaminado com

MCs (CARBIS et al.,1996; 1997). A redução de Na

e Cl

plasmático indicaram excreção

desses íons em nível excedente a absorção, levando a alterações metabólicas e estresse

(CARBIS et al.,1996; 1997).

As lesões em brânquias por MCLR foram avaliadas em tilápia, truta e em carpa,

observando-se necrose e estrutura vacuolar, ponta lamelar dobrada e esfoliação do epitélio

lamelar (CARBIS et al., 1997). Lesões brânquiais podem ocorrer devido ao alto pH

resultante de atividade fotossintética e excesso de amônia procedente da decomposição de

cianofíceas, aumentando a absorção de MC e incrementando necrose hepática (RODGER et

al., 1994).

Em peixes de água doce, o sistema renal elimina a água, enquanto que o sódio e

cloro são mantidos pelas células clorídricas e células respiratórias do epitélio branquial na

lamela secundária. As células clorídricas inibem a saída de sais, enquanto as células

respiratórias realizam a troca de metabólitos por sódio e cloro na água (ex.: Na

/NH

e Cl

/HCO

). A depressão na atividade da bomba iônica afeta o movimento de

amônia e dióxido de carbono corporal, conduzindo a depressão respiratória pela redução da

afinidade de hemoglobina pelo oxigênio (efeito Bohr) (CARBIS et al., 1997). Os distúrbios

na homeostase iônica diminuem a capacidade de regulação da pressão osmótica, balanço de

água e equilíbrio ácido-base, influenciando a irritabilidade muscular, permeabilidade de

membrana, manutenção do potencial de membrana, transmissão de impulso nervoso e

produção de secreção contendo sódio ou cloro (ex: KCl, HCl, NaCl) (CARBIS et al., 1996;

1997).

A hiperfosforilação de proteína celular pela inibição de proteína fosfatase PP1 e

PP2A por MCs (MACKINTOSH et al., 1990) pode afetar as enzimas Na

ATPase e

ATPase Mg

dependente. A mortalidade em massa repentina foi inicialmente atribuída

a efeitos inibitórios nas bombas de íons das brânquias (GAETE et al., 1994).

Posteriormente, Bury et al. (1998)

constataram que na verdade, a inibição de bombas

iônicas seja devido a determinados ácidos graxos, que extraídos de M. aeruginosa inibem a

absorção de Ca

e atividade de paranitrofenolfosfatase-potássio-dependente em tilápia (O.

mossambicus). Pois, o mesmo efeito inibitório não foi demonstrado por MCLR in vitro

(BURY et al., 1996; 1998).

Em peixe saudável, a maior parte da toxina é absorvida pelo trato gastrointestinal,

sendo a absorção branquial ou dérmica desprezível (TENCALLA et al., 1997). No entanto,

o extrato lisado de M. aeruginosa contém uma variedade de substâncias tóxicas como

ficocianinas, capazes de causar reações inflamatórias na superfície epitelial ou mucosa.

Uma reação inflamatória moderada a severa pode aumentar a permeabilidade superficial,

inclusive perante MCs (JUBB et al.,1985).

Os lipopolissacarídeos (LPS) presentes na parede celular de bactérias Gram

negativas, incluindo cianofíceas, são tóxicos e altamente inflamatórios, estimulando a

liberação de fatores inflamatórios, como: fator de necrose tumoral alfa (TNFα), interferon

gama (IFN-γ) e interleucinas 1 e 6 (IL-1, -6) (BEST et al., 2002). LPS também estimulam a

produção de óxido nítrico (NO), agente de vasodilatação, hipotensão, ativando o sistema

renina-angiotensina (HEWETT et al., 1993). O aumento nos níveis de angiotensina II

circulante estimula a ingestão de água, conduzindo a maior exposição intestinal a

componentes presentes como microrganismos e toxinas e consequente absorção e danos em

outros órgãos (FUENTES et al., 1998).

A exposição de peixes ao extrato de cianofíceas promove desbalanço

osmorregulatório, com aumento na ingestão e incapacidade de remover o excesso de água.

O aumento da massa hepática resultante decorre da exposição e absorção da toxina no

intestino e efeito no fígado. Florações de cianofíceas não são axênicas e tipicamente contêm

bactérias heterotróficas (FUENTES et al., 1998), portanto os LPS de florações podem ser

originários da própria cianofícea, ou de bactérias associadas (BEST et al., 2002; 2003).

A biotransformação de MC ocorre através da bile, através da conjugação com

glutationa via glutationa S-transferase (GST) (BEATTIE et al., 2003). As preparações de

LPS de cianofíceas (Microcystis CYA43, bloom de Microcystis e Glotrichia) reduziram a

atividade de GST microssomal (GSTm) e solúvel (GSTs) em carpa. A tolerância de

tilápias a MCs correlacionada com a alta expressão de GSTs induzida (biostransformação

fase II) indicou que a fase II da biostranformação é mais importante que a fase I, pois

alterações em enzimas de fase I (CYP1A) não foram significativas após exposição a MCs

(WANG et al., 2006). A redução da atividade GST compromete severamente a capacidade

de detoxicação, aumentando a susceptibilidade a outras toxinas de cianofíceas, assim como

outros contaminantes presentes no corpo d’água (BEST et al., 2002).

Estudos têm demosntrado que extratos de cianobactérias e MC pura induzem o

estresse oxidativo e produtos de danos oxidativos como peróxidos de lipídio em muitos

organismos inclusive peixes (DING et al., 1998, 2001, LI et al., 2007). A exposição de 10

µg/L MCLR em carpas (C. Carpio L.) aumentou enzimas antioxidantes: superóxido

dismutase (SOD), catalase (CAT), peróxido de glutationa (GSH-Px). A elevação

enzimática indica a importância destas na eliminação de espécies de oxigênio reativo

(EROs) e regeneração de GSH, devido ao estresse oxidativo resultante de exposição à MC.

A continuidade de estresse induzido pela toxina (exposição crônica) pode resultar em danos

a hepatócitos como apoptose e necrose celular (LI et al., 2003).

Espécies que se alimentam de fitoplâncton são denominadas fitoplanctófagas. Estas

espécies apresentam uma rápida capacidade de depurar MCs, provavelmente devido a

freqüente exposição a cianobactérias tóxicas na história natural (XIE et al., 2004).

As cianofíceas são componentes regulares na dieta de peixes ciclídeos e ciprinídeos

(Cichlidae e Cyprinidae). Não obstante, tilápia (Oreochromis niloticus) e carpa

(Hypophthalmichthys molitrix) expostas a cianofíceas tóxicas demonstram redução na

ingestão na presença de células tóxicas (BEVERIDGE et al.,1993). A correlação

significativa (r= -0.98) indicou que maior proporção de células toxigênicas (toxina

intracelular) resultou em menor consumo de células por carpas e tilápias, sugerindo

capacidade de distinção entre linhagens tóxicas e não tóxicas (BEVERIDGE et al.,1993;

KESHAVANATH et al.,1994).

A carpa prata (H. molitrix) nativa do leste da Ásia consiste de herbívoros adaptados

a filtrar o alimento constituído de fitoplâncton. O aumento numérico de carpas prata no

Lago Donghu (China) eutrofizado com Microcystis spp., Anabaena spp. e Oscillatoria spp.

eliminou completamente as florações, indicando a sua aplicação para conter a

contaminação de cianotoxinas em águas eutrofizadas (XIE, 2001).

Moriaty & Moriaty (1973) afirmaram que o suco gástrico estomacal de O. niloticus

atinge pH<1 e facilita a digestão, podendo assimilar de 70-80% de carbono oriundo de

Microcystis spp. e Anabaena spp. Em contraste, baixa digestibilidade e eficiência de

conversão de M. aeruginosa no estômago de H. molitrix foram relatadas por Beveridge, et

al. (1993). Carpas e tilápias possuem um mecanismo de filtração envolvendo revestimento

mucóide produzido pelo filamento branquial. Este mecanismo interrupto retem as

cianofíceas através do revestido mucóide, sendo então eliminadas praticamente intactas

(BEVERIDGE et al., 1993). Desta forma, a aplicação de peixes fitoplanctófagos para o

controle de floração toxigênicas foi sugerida. No entanto mesmo que o as cianobacérias

sejam eliminadas praticamente intactas, contaminação secundária no ambiente pode ocorrer

através da ressuspensão das fezes de peixes contendo cianobactérias na água (KE et al.,

2007).

O monitoramento da Lagoa de Jacarepaguá-RJ (Agosto/1996 a Novembro de 1999)

mostrou contaminação de MC em praticamente todos os períodos, com nível máximo de

980 µg/L. MCs foram detectadas em 75% das tilápias (Tilapia rendalli) coletadas na lagoa,

com positividade no fígado (nd - 31,1 µg/g), vísceras (nd - 67,8 µg/g) e tecido muscular

(nd- 26,4 ng/g), porém sem mortalidade, indicando que os peixes embora resistentes não

evitaram a ingestão de cianofíceas tóxicas. Em novembro de 1996, a concentração de MCs

em tecido muscular atingiu 16,2 ng/g, representando ingestão de 0,081 µg/Kg de MC.

Considerando a ingestão de 300 g de peixe por indivíduo de 60 Kg, a concentração

detectada representa o dobro da dose diária tolerável por peso corpóreo para MCLR (0,04

µg/Kg) em humano (MAGALHÃES et al., 2001; WHO, 1998).

2.10 Associação Aflatoxina e Microcistina

Existem poucos relatos acerca de prováveis efeitos tóxicos desencadeados pela

associação entre micotoxina e microcistina. Atualmente, tem se mostrado possível a

ocorrência de sinergismo entre substâncias tóxicas quando da exposição de um iniciador a

um promotor tumoral.

Estudos com populações de Haimen e Fusui, regiões de alta incidência de câncer

hepático na China, demonstrou freqüente ocorrência de aductos de AFB

–albumina em soro

humano, sugerindo AFB

como um importante agente iniciador de hepatocarcinomas

(KAWAMURA et al., 1996; YU, 1995). Salienta-se que nestas regiões freqüente

contaminação da água de abastecimento por MCs também foi correlacionado com alta

incidência de câncer hepático primário, sugerindo o sinergismo tóxico dessas duas toxinas

(SEKIJIMA et al., 1999).

UENO et al. (1992) demonstraram que nivalenol e fumonisinas elevaram expressão

de glutationa S-transferase placental (GST-P) em ratos iniciados com aflatoxina B

(AFB

sugerindo que co-exposição de um iniciador potente com agentes promotores poderia

conduzir ao aumento de incidência de câncer hepático primário. Tal fato torna-se mais

preocupante à medida que a co-ocorrência de aflatoxina e outras micotoxinas, como

fumonisina, em cereais é rotineiramente verificada (HIROOKA et al., 1996; ONO et al.,

1999; 2002; ONO & HIROOKA, 2002; UENO, 1991).

O processo de carcinogênese envolve geralmente duas etapas distintas, a iniciação e

a promoção da neoplasia. A fase de iniciação é resultante de mutação, marcada por

alterações na seqüência de bases nitrogenadas do DNA celular, ao passo que a promoção

relaciona-se com a expressão fenotípica da mutação ocorrida na primeira fase. Mutações

provocadas por exposição à aflatoxina representam alterações genéticas permanentes nas

células afetadas, possibilitando a iniciação do processo de carcinogênese (FERREIRA et al,

2006).

MCLR, considerada agente promotor tumor, aumentou sinergicamente o

desenvolvimento de focos positivos de GST-P em ratos iniciados com AFB

, indicando

capacidade de induzir hepatocarcinogenicidade modulada por AFB

(SEKIJIMA et al.,

1999).

2.10.1 Aflatoxina na piscicultura

A expansão da piscicultura no Brasil tem sido acompanhada pela produção

industrial de ração, considerada o principal elemento de custo da atividade (CARNEIRO,

1999). O setor classifica-se como o sexto maior consumidor nacional de ração,

apresentando crescimento anual médio de 24,1% na demanda entre 1998 e 2001, em que

foram consumidas 80 mil e 152,8 mil toneladas, respectivamente (PADILHA, 2001).

A contaminação por micotoxinas atinge 25% do suprimento alimentar mundial,

constituindo-se no grupo de compostos tóxicos mais freqüentes em cereais e sementes

oleaginosas. Fungos micotoxigênicos crescem sob condições favoráveis nos mais variados

substratos durante a colheita, armazenamento e industrialização (BALDISSERA et al.,

1993; EPPLEY, 1968). Entre os fatores ambientais que determinam a contaminação

destacam-se o excesso de umidade no campo e no armazenamento, temperaturas extremas,

estiagem, práticas de colheita e infestação por insetos (COULOMB JR, 1993, ONO et al.,

2000).

As aflatoxinas (AFLAs) são micotoxinas provenientes do metabolismo secundário

de Aspergillus flavus e A. parasiticus, que contaminam as culturas desde o campo

(GOURAMA & BULLERMAN, 1995). As AFLAs são responsáveis por graves

intoxicações em doses elevadas, em adição ao efeito mutagênico e teratogênico em animais,

inclusive ao ser humano (WOGAN, 1992) .

Entre as AFLAs, a AFB

caracteriza-se por ser hepatocarcinógeno mais potente,

sendo que “International Agency For Research on Cancer” alocou AFB

no grupo de

carcinogênicos de Classe 1 – carcinógeno primário (IARC, 1993). AFB

, AFG

e AFG

derivam da AFB

e caracterizam-se pela menor toxicidade, porém acarretam sinergismo

tóxico (SMITH & MOSS, 1985).

A contaminação por aflatoxinas em rações e matérias-primas destinados ao

consumo animal tem sido relatada mundialmente (MADHUSUDHANAN, 2004; RAMOS

& HERNÁNDEZ, 1997; SCUDAMORE et al., 1997). Entre os produtos agrícolas com

maior risco de contaminação por aflatoxina distinguem-se os grãos, como amendoim, milho,

trigo e arroz, componentes da maioria das rações para animais, incluindo para peixes, assim

como da dieta humana.

A análise de AFLAs, por cromatografia em camada delgada, em 42 amostras de

rações utilizadas na piscicultura da região de Londrina-PR, detectou níveis de não

detectado até 15,60 ng/g. Entre as AFLAs, AFB

apresentou maior freqüência e

concentração (n.d. a 13,13 ng/g). Os níveis de AFLAs nas rações apresentaram-se dentro

dos limites estabelecidos pela legislação brasileira, conforme a Portaria n

. 183 de

21/3/1996 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1996), que

estabelece níveis de AFLAs (B

) em 20 ng/g. No entanto, considerando-se o

limite de 10 ng/g de ração, imposto pela maioria dos membros da comunidade importadora

da União Européia (FAO, 2001), 88,1% dos valores estiveram acima de 10 ng/g

(HASHIMOTO et al., 2003).

2.10.2. Estrutura química e atividade tóxica de aflatoxina

As aflatoxinas são difurocumarolactonas, pertencentes ao grupo de furocumarinas.

A AFB

apresenta atividade hepatocarcinogênica comprovada, cuja característica

heterocíclica confere degradação lenta pelo sistema microssomal hepático (EATON, 1994).

O problema se agrava, já que o sistema monoamino-oxidase, normalmente destinado a

biotransformação, executa reação indesejável de ativação metabólica de AFB

; o resultado

é a formação de aductos de DNA, conduzindo à mutagenicidade, carcinogenicidade e

efeitos teratogênicos (LOTLIKAR, 1989)

O mecanismo sobre genotoxicidade de AFB

tem sido parcialmente elucidado,

baseado no metabolismo hepático de sistema microssomal de citocromo P450 (CYP450). A

reação produz um intermediário altamente reativo constituído de epóxido de AFB

-8,9B

(AFBO), um composto altamente eletrofílico capaz de reagir covalentemente com sítios

nucleofílicos de macromoléculas, seja DNA, RNA ou proteínas, formando aductos (ABD-

ALLAH et al., 1999). O evento representa etapa inicial importante no processo de iniciação

da carcinogênese (NAKATSURU et al., 1989).

As espécies animais diferem significativamente quanto à sensibilidade perante

AFB

. Entre os mais diversos mecanismos, o grupo de enzimas citosólicas constituídas de

glutationa S transferases (GSTs) desempenham papel importante na modulação de ligação

AFB

-DNA e carcinogenicidade, através da inativação de epóxido-AFB

por conjugação

com glutationa (GSH) (EATON & GALLAGHER, 1994; LOTLIKAR, 1989).

Figura –3: Estrutura química de aflatoxina B

AFB

encontra-se entre os mais potentes agentes genotóxicos, capaz de induzir

formação de micronúcleo entre outras alterações genéticas. Aproximadamente 1% da dose

de aflatoxina administrada via ip em ratos forma ligação covalente com DNA, atingindo

seu pico após 2 h da inoculação. A formação de aductos parece ser dependente da dose bem

como do número de exposições (WOOGAN, 1992).

A AFB

induz aberrações cromossômicas, micronúcleo, troca de cromatídes irmãs e

quebras cromossômicas (WANG & GROOPMAN, 1999). Além da formação de aductos de

AFB

-DNA, espécies de oxigênio reativo (EROs) e danos oxidativos no DNA também

contribuem para a genotoxicidade de AFB

(SHEN et al., 1994; 1995). As EROs oxidam

ácidos graxos polinsaturados iniciando uma cadeia de reações levando a peroxidação de

ácidos graxos causando danos em mebrana fosfolipídica celular e desregulando funções

celulares (MADHUSUDHANAN et al., 2004).

Figura 4- Biotransformação de Aflatoxina B

por reação de epoxidação.

2.10.3 Efeito tóxico de Aflatoxinas em peixe

Micotoxicoses em peixes representam um problema de difícil diagnóstico, devido a

confusão de síndromes induzidas com infecções e desequilíbrios/deficiências nutricionais

(SMITH & MOSS, 1985). A hepatocarcinogenicidade da AFB

foi demonstrada em peixes

(HENDRICKS, 1982; SINNHUBER et al., 1977), embora a toxicidade aguda e o potencial

carcinogênico varie amplamente entre as espécies (PLAKAS et al., 1991). Nestes animais,

o principal metabólito da biotransformação da AFB

é o aflatoxicol (AFL), formado pela

redutase citosólica NADPH-dependente, o qual representa um mecanismo de detoxicação,

quando conjugado com ácido glucurônico e excretado, mas também de reserva de AFB

quando re-convertido a AFB

por oxidação microssomal (GALLAGHER & EATON, 1995).

A contaminação da ração com AFB

pode acarretar em perdas econômicas

consideráveis na produção de peixes. Estudos demonstraram que tilápias (Oreochromis

niloticus) alimentadas com dietas contendo AFB

apresentaram menor ganho de peso e

comprimento, pior conversão alimentar (TUAN et al, 2002). Em carpas (Labeo rohita) foi

demonstrada imunossupressão, favorecendo o aparecimento de doenças (SAHOO &

MUKHERJEE, 2001). Baixo peso e qualidade sanitária de peixe afetada são causas de

perdas econômicas significativas na piscicultura.

Halver (1969) relatou que a ingestão prolongada de 0,4 µg/g de AFB

causou

neoplasmas hepáticos, necrose de hepatócitos e mudanças degenerativas em tecidos

pancreáticos e renais de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss). Neste animal extremamente

sensível, a dose letal efetiva média (DL

) intraperitoneal de 0,81 mg/Kg de peso corpóreo

elegeu-o como modelo de estudo metabólico de AFB1 (BAILEY et al., 1984).

Em contraste, o bagre de canal (Ictalurus punctatus) requereu DL

intraperitoneal

de 11,5 mg/Kg de AFB

durante 10 dias (ASHLEY, 1970; JANTRAROTAI & LOVELL,

1990), sendo mais resistentes do que as tilápias (ABDELHAMID & KHALIL, 1994).

Plakas et al. (1991) procedendo a administração oral de AFB

-C

250 µg/Kg de peso

corpóreo em bagre de canal, detectaram a concentração máxima (40 µg/Kg) no músculo

após 4 horas. Alta concentração na bile foi observada após 24 horas, reduzindo bastante a

concentração no plasma e demais tecidos, demonstrando baixo potencial de acumulação de

AFB

e metabólitos em bagre de canal. No entanto, risco potencial deve ser advertido,

considerando que a bioacumulação varia entre espécies de peixes, freqüência e níveis de

exposição, taxa e extensão da absorção e metabolização.

A genotoxicidade induzida por AFB

foi demonstrada através do teste de

micronúcleo em eritrócito de ciprinídios (Cyprinus carpio, Tinca tinca e

Ctenopharyngodon idella). A truta arco-íris (O. Mykiss) inoculadas ip com AFB

(0,5

mg/Kg) apresentaram, após 4h, danos intensos no DNA de sangue total e rim com

reparação após 24h, enquanto no fígado os danos foram progressivos. Em constraste o

bagre de canal (I. punctatus) igualmente exposto à AFB

não apresentou aumento de danos

no DNA, quando comparados com controle (ABD-ALLAH et al., 1999).

2.11 Considerações finais

Diante da escassez de informação sobre efeito tóxico de cianofíceas na piscicultura

brasileira, assim como a falta de monitoramento nesta atividade em ascensão, investigações

abrangentes devem objetivar amplo controle de qualidade, envolvendo desde qualidade da

água a produto final, evitando a bioacumulação e risco à saúde humana.

Desta forma, a etapa inicial deste trabalho objetivou a aplicação de

imunoistoquímica para detecção de MCLR e ensaios genotóxicos para avaliar a interação

entre Microcystis aeruginosa e aflatoxina B

em tilápias, espécie amplamente cultivada no

Brasil.

Na etapa seguinte, considerando a necessidade de métodos alternativos para

controle de cianobactéria toxigênicas, foram isolados microrganismos da Estação de

Tratamento de Esgoto São Lourenço de Londrina-PR com intuito de selecionar

microrganismos antagonistas.

Na etapa avançada do experimento o método avançado de Marfey e ESI-LCMS

foram aplicados para investigação de aminoácidos e peptídeos, como produtos ainda não

identificados da biodegradação de MCLR utilizando a cepa B9, visando à qualidade de

água e o estudo dos mecanismos de biodegradação.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Propor o biocontrole de cianofíceas toxigênicas, utilizando microrganismo

antagonista diante da limitação dos métodos convencionais na remoção de microcistinas.

Paralelamente, avaliar a aplicabilidade de métodos biológicos visando monitoramento de

Microcystis aeruginosa toxigênica na piscicultura.

3.2 Objetivos Específicos

• Avaliar a aplicabilidade de ensaios de genotoxicidade micronúcleo e cometa, para o

monitoramento de Microcystis aeruginosa e aflatoxina B

e ensaio imunoistoquímico

para detectar microcistina em fígado e músculo de tilápias do nilo (Oreochromis

niloticus);

• Avaliar o potencial da Estação de tratamento de esgoto São Lorenço de Londrina-PR

para isolamento e seleção de microrganismos com atividade anti-cianobactéria e/ou

capacidade de degradar microcistina-LR;

• Detectar peptídeos e aminoácidos derivatizados com reagente de Marfey (L-FDLA),

visando elucidar o mecanismo de biodegradação de microcistina-LR pela cepa B9.

4 MATERIAL E MÉTODOS

A metodologia executada no transcurso da pesquisa foi esquematizada sob forma de

fluxograma no tópico Delineamento Experimental, conforme abaixo apresentado. O

procedimento técnico, redigido em detalhes, foi inserido em cada capítulo descrito no item

Resultados e Discussão, visando posterior publicação.

4.1 Delineamento experimental

Tendo como metas a aplicação de métodos biológicos para monitoramento e

controle de cianobactéria toxigênica na piscicultura e para o tratamento de água, o

delineamento experimental (Fluxograma 3) foi baseado no fluxograma iniciado no ano de

2001 com a dissertação de Mestrado e a partir da integração de grupos de pesquisas a nível

nacional e internacional. O Fluxograma 3 ilustra o delineamento geral do experimento

envolvendo o bioensaio com tilápias e interação de Microcystis aeruginosa e aflatoxina B

e controle de cianofíceas toxigênicas, através do isolamento e seleção de microrganismos

com atividade antagônica a cianobactéria e biodegradação de MCLR. Na etapa inicial, o

bioensaio com tilápias (Fluxograma 4) foi realizado na Estação de Piscicultura (EPUEL-

CCB-UEL) sob responsabilidade do Dr. Heitor Frossard e Mauro Caetano Filho, para este

bioensaio foi utilizado a cepa Microcystis aeruginosa CCBUSP262 (Fluxograma 5) cuja a

produção e o cultivo foi realizado no Laboratório de Cianobactérias CCB-ESALQ/USP

sob supervisão da Profa. Dra. Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira, a análise de MCs no

extrato celular de M. aeruginosa foi realizada através de Cromatografia líquida acoplado a

espectrometria de massas; A aplicação de métodos de genotoxicidade cometa e

micronúcleo para avaliar o efeito do extrato celular M. aeruginosa e aflatoxina B

(Fluxograma 6) foi realizada sob orientação da Profa. Dra. Ilce M. S. Cólus do Laboratório

de Mutagênese-CCB-UEL e para a análise do acúmulo de MCs em fígado e tecido

muscular dos peixes expostos ao extrato celular de M. aeruginosa, foi aplicado o ensaio

imunoistoquímico (Fluxograma 7), executado sob orientação da Profa. Dra. Ana Paula F. R.

L. Bracarense do Depto. de Medicina Veterinária Preventiva-CCA-UEL. Na etapa seguinte,

amostras de água de esgoto foram coletadas na Estação de esgoto São Lorenço, Londrina-

PR de acordo com a sugestão da Profa. Dra. Sandra Cesário do Depto de Engenharia

Sanitária – CTU-UEL, sendo coletadas 29 amostras de água no: afluente, reator 1 e 2, lagoa

de estabilização e efluente. A atividade anti-cianobactéria e a capacidade de degradar

MCLR de microrganismos isolados nestas amostras foram testadas na etapa avançada do

experimento (Fluxograma 8). A biodegradação de MCLR foi investigada utilizando a cepa

B9 e aplicando-se o método de derivatização com o reagente de Marfey (Fluxograma 9). A

análise de microcistina (Fluxograma 5), seleção de microrganismo antagonista (Fluxograma

8) e investigação do processo de biodegradação de MCLR (Fluxograma 9) foram realizadas

a partir de intercâmbio com o suporte do Programa de Doutorado no País com Estágio no

Exterior (PDEE) da CAPES. O trabalho foi realizado no Laboratory of Environmental

Science, Faculty of Pharmacy, University of Meijo – Nagoya, Japão, sob orientação do Prof.

Dr. Ken-ichi Harada.

Fluxograma 3 – Delineamento experimental geral da pesquisa.

Cianobactéria

toxigênica

Controle Monitoramento

Anti-

cianobactéria

Biodegradação

MCLR

Isolamento de

microrganismo

Seleção de

antagonista

Cepa B9

Elucidação do

processo de

biodegradação

Padronização

de Método

Bioensaio

com tilápia

Imunoistoquímica

imersão

Extrato celular de

Microcystis aeruginosa

Ensaio

genotoxicológicos

Aflatoxina

Injeção (i.p.)

Teste do

micronúcleo

Ensaio do

Cometa

Estação de

Tratamento de

Esgoto

Fluxograma 4 - Delineamento experimentao do bioensaio com Tilápias (Oreochromis niloticus) expostas à extrato celular de

Microcystis aeruginosa e Aflatoxina B

ip Controle

negativo

ip Aflatoxina

óleo mineral

Microcystis

aeruginosa

Imersão

Dose única

1x10

céls/mL

Dose única

1x10

céls/mL

Dose cumulativa

1x 0

céls/mL

(intervalo 2 meses)

2x 0

céls/mL

Dose cumulativa

1x 0

céls/mL

(intervalo 2 meses)

2x10

céls/mL

(intervalo 2 meses)

5x10

céls/mL

10 µg/Kg AFB1 +

4,0 x10

céls/Kg

10 µg/Kg AFB1 +

2,0 x 10

céls/Kg

Imunoistoquímica

M8H5anti-MC

(após 72h)

Micronúcleo e

cometa

(8, 24, 48 h)

Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)

10 µg/Kg AFB1 +

1,0 x 10

céls/Kg

Controle negativo

imersão em água

10 µg/Kg

ip AFB1 +

Microcystis

aeruginosa

ip Microcystis

aeruginosa

ip 2,0 x 10

céls/Kg

ip 4,0 x 10

céls/Kg

ip 1,0 x 10

céls/Kg

Fluxograma 5 – Cultivo de Microcystis aeruginosa, preparo do extrato celular, extração e análise de microcistina.

Microcystis aeruginosa

BCCUSP 262

Extração de microcistina

Análise de microcistinas

Liofilização do extrato

celular M. aeruginosa

100mL Ácido acético 5 %

3x (4000 xg 30 min)

Filtração GF/C

Minicoluna C18

•5mL água

•5mL metanol

•Extrato bruto

•Metanol 90%

•Metanol p.a.

Rotavapor 40 ºC

Estocagem 4ºC

LC/ITMS

Separação por Agilent 1100

CLAE-PDA 238 nm

Coluna TSK-gel Super-ODS

(2,0µm x 2,0 x 100 mm ,

TOSOH)

Fase móvel

A: ác. fórmico 1% em água

B: ác. fórmico 1% em metanol

Gradiente: 10%Æ90% (30 min),

fluxo 200 µL/min, 40ºC

ionização Eletrospray

MS/MS scan

Cultivo meio BG11

21-24

C, fotoperíodo

14:10, 2-3 meses

Contagem celular

Fuchs Rosental

8 ciclos de congelamento/

descongelamento/

sonicador 10 min

Extrato celular

Fluxograma 6- Teste do Micronúcleo e Ensaio do Cometa para avaliação de efeitos de genotoxicidade da interação Aflatoxina B

extrato celular de Microcystis aeruginosa.

Esfregaço sangüíneo em

lâmina de vidro

Fixação metanol, 10 min

Coloração com Giemsa 5%

em tampão fosfato

pH 6,8, 20 min

Leitura microscópio optico

Freqüência MN em 2000

eritrócitos/peixe

Lavagem H2O destilada

Secagem 24h

Teste do micronúcleo

Oreochromis niloticus

100μL sangue caudal

Neutralização

Tampão Tris, 0,4M 5min

Ensaio do cometa

Oreochromis niloticus

10μL sangue caudal

Diluição em salina 1:100

5 μL sangue diluído +

120μL ágar LMP

Acondicionamento em

lâminas cobertas com

NMP agarose 1,5%, 4ºC,

20min

Desnaturação 300mM

NaOH / 1mM EDTA,

pH 13,20min

Eletroforese

25V 300 mA, 20 min

Lise solução 10mMTris,

Triton X, DMSO, pH10,

Fixação Etanol p.a 5min.

Brometo de etídio

20 μg/mL

Microscópio de

fluorescência

Leitura e classificação de

cometas de 100

nucleóides/peixe

Fluxograma 7 – Ensaio imunoistoquímico para detecção de microcistina em tecido hepático e muscular de Tilápia (Oreochromis

niloticus).

Ensaio imunoistoquímico

Oreochromis niloticus

Fixação por 24h

formalina 10%

Inclusão na parafina

Secção 5µm

Diafanização xilol

Re-hidratação

Etanol absoluto,

Etanol 80%

Lâminas aderidas com

acetato de Poli L-lisina

fígado e tecido muscular

Bloqueio da Peroxidase

endógena

2O2 3% em metanol

Lavagem com H2O

Lavagem PBS pH 7,6

Incubação com

tripsina 0,1% , 37ºC,

10min

Aquecimento com Tampão

citrato pH 6,09 em

microondas , 2min

Esfriar por 20min em

Tampão citrato

Incubação com Soro fetal

bovino 37ºC, 30 min

Lavagem PBS pH 7,6

Anticorpo primário anti-

MC (M8H5) 1:100, 30min,

T ºC ambiente

Anticorpo secundário anti

Ig-G - Sistema polímero

peroxidase, 30 min, 4ºC

Substrato sistema

DAB- H

2O2, 10min

Lavagem PBS pH 7,6

Hematoxilina de Mayer

Fluxograma 8 – Seleção de microrganismos antagônicos contra cianobactérias

toxigênica.

Fluxograma 9 – Aplicação do método avançado de Marfey para elucidação do mecanismo de

biodegradação de MCLR pela cepa B9.

5 RESULTADOS E DISCUSSAO

Os resultados e discussão foram redigidos sob forma de capítulos para

publicação, listados abaixo:

Capítulo I:

• BIOMONITORING ASSAY IN ANALYSIS OF CO-OCCURRING

MICROCYSTIN AND AFLATOXIN IN AQUACULTURE

Capítulo II:

• POTENCIAL ANTI-CIANOBACTÉRIA EM MICROBIOTA

PERTENCENTE AO ECOSSISTEMA DA ESTAÇÃO DE

TRATAMENTO DE ESGOTO

Capítulo III:

• NOVEL MICROCYSTIN-LR BIODEGRADATION PRODUCTS

DETECTED BY ADVANCED MARFEY’S DERIVATIZATION

METHOD

BIOMONITORING ASSAY IN ANALYSIS OF CO-OCCURRING

MICROCYSTIN AND AFLATOXIN IN AQUACULTURE

Abstract

Aquaculture has been a recent growing affair in the Brazilian agribusiness, with successful goal

dependent on quality of water and feed supply. Aflatoxin B

(AFB

) in vegetable origin feed is a

topic of concern, where the overfeeding in fishpond can cause bloom of Microcystin aeruginosa

producing microcystin (MC). Exposure of Oreochromis niloticus (N = 96) to AFB

and crude-

extract of M. aeruginosa strain CCBUSP262 (MC analyzed by ESI-LCMS) was carried out, and

designed as

(EMC)

: intraperitoneal M. aeruginosa cell extract injected at 0.602

(EMC1)

, 1.204

(EMC2)

and 3.011

(EMC3)

µg/Kg of 7D-MCLR;

(AFB1+EMC)

: AFB

(ip10 µg/Kg)

and three ip M. aeruginosa

(AFB1+EMC1, AFB1+EMC2, AFB1+EMC3)

doses; (

i-EMC

): immersion in unique M. aeruginosa dose at 1x10

4 (i-

EMC1)

and 1x10

5 (i-EMC2)

cells/mL, and two months intervals cumulative doses at 1x10

, 2x10

4 (i-

EMC3)

and 1x10

, 2x10

and 5x10

4(i-EMC4)

cells/mL, corresponding: 30.1, 60.2, 150.5 and 301 µg/L

of 7D-MCLR. Blood sample was collected after 8, 24 and 48 h to analyze micronucleus (MN)

frequency and comet score. Immunohistochemistry in tissues was carried out with M8H5

monoclonal antibody by polymer peroxidase system. Comparing the ip EMC and ip

AFB

+EMC group, higher MN frequency at

(AFB1+EMC1, AFB1+EMC2, AFB1+EMC3)

than

(EMC1, EMC2, EMC3)

showed mutagenic response of this synergism. Slight genotoxic synergism was also observed in

comet score average comparing

(EMC1, EMC2, EMC3)

and

(AFB1+EMC1, AFB1+EMC2, AFB1+EMC3)

Immunohistochemistry detected MC in all fish liver treated with ip M. aeruginosa cell extract,

but immersed group showed positive only at 301 µg/L

(i-EMC3)

concentration, indicating lower

contamination of immersion route. Although MC was not detected in edible meat (muscle),

sensitive immunoassay combined with genotoxicity assay could be an attractive biomonitoring

tool.

Keywords: Microcystis aeruginosa, aflatoxin and biomonitoring.

INTRODUCTION

Microcystins (MCs) are hepatotoxic cyclic heptapeptides produced by

cyanobacteria of the genera Microcystis, Anabaena, Nostoc and Oscillatoria, which

cause bloom in eutrophied fresh water lakes and reservoirs (CARMICHAEL, 2002).

The MCLR is one of the most toxic in the group, where a single intraperitoneal dose

(ip) can cause hemorrhagic and coagulative necrosis in liver. MCLR inhibits activity of

protein phosphatase 1 (PP1) and 2A (PP2A) by covalent binding, and leads to

hyperfosforilation of cytoeskeletal proteins, rearrangement of intermediate actin

filaments, and microtubules with alteration of cell structure (HOOSER et al., 1991).

Aquaculture has been a recent growing affair in the Brazilian agribusiness,

stimulated by adequate climate and abundant supply of water reservoir. Inadequate

management in fish farming can cause deleterious environmental impact, regarding the

fish placed on top of aquatic food chain to toxic cyanobacteria (MAGALHÃES et al.,

2001). The hazard due to intake of such fish meat has been unknown. Monitoring of

aquaculture ponds in Northern Parana state-Brazil showed eutrophication and

Cyanophyceae bloom along October 2002 to October 2003. MC was detected in 95 %

of samples, but at low concentration (mean: 0.275 µg/L, range: not detected to 3.13

µg/L). However, the aquaculture samples collected at December/2002 and January/2003

showed >1 µg/L levels (KAMOGAE et al., 2006), i.e. higher than WHO Drinking

Water Guideline (1998).

Additional hazard can be incorporated from fish feed, as the aflatoxin B

(AFB

) has been a topic of concern in vegetable origin ingredients (GOURAMA &

BULLERMAN, 1995). Aflatoxin B

is classified as group 1 carcinogen by International

Agency for Research on Cancer and it is hepatotoxic, hepatocarcinogenic and

mutagenic in human and several animal species (IARC, 1993). The industries supply

aquaculture with a variety of feeds, where the main ingredient is mycotoxin susceptible

grain. The survey of 42 commercial fish feed in Northern Parana state detected aflatoxin

in levels ranging from non-detectable to 15.60 µg/Kg, and 61.90% were < 4 µg/Kg

(HASHIMOTO et al., 2003). The Brazilian guideline settled the limit in 20 µg/Kg for

feed (BRASIL, 1996).

The aquaculture activity is stimulated in tropical countries, whereas the same

condition favors fungal growth and mycotoxin production. The inadequate management

due to overfeeding exposes the fish simultaneously to carcinogen aflatoxin (EATON &

GROOPMAN, 1994) and tumor promoting MC (NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al.,

2002). The MC bioaccumulation was evaluated by immunohistochemistry, as well as

AFB

and MC synergism was monitored by micronucleus and comet assay in Nile

tilapia (Oreochromis niloticus).

MATERIAL AND METHODS

Toxins, reagents and M. aeruginosa cell extract

Aflatoxin (AFB

) purchased from Sigma-USA (approx. 98% purity) was

subdivided into 100 µg each vial. The injection solution was prepared with sterile

mineral oil to reach final concentration of 25 µg/mL. Aflatoxin B

(molar absortivity,

21,800) was previously dissolved in methanol and calibrated at 360 nm (UV-VIS Cintra

20, GMB, Melbourne, Australia).

MCLR and 7desmethyl-MCLR (7-D-MCLR) standards were isolated from

lyophilized cyanobacterial cells collected from Laguna Bay-Philippines and Lake Suwa-

Japan, respectively. The toxins were purified (> 95% purity) according with Harada et

al. (1996).

M. aeruginosa CCBUSP262 isolated from Lago das Garças- Sao Paulo, Brazil

was cultivated in BG11 medium at 21-24

C with 14:10 hours light:dark photoperiod

(irradiance 30-40 µmol/m

/s) for 2-3 months. The concentration (cells/mL) was

determinated in Fuchs-Rosental chamber (Nikon E200, Melville, NY, USA). Crude

extract was obtained disrupting the cells by 8 cycles of freeze-thawing and 10 min

sonication process. The MCs in lyophilized samples (1 g) was extracted with 5% acetic

acid (4000 x g/30 min), filtrated (GF/C) and cleaned up in ODS cartridge. The residue

was dried and stored at 4

C until analysis by LC/IT-MS

(liquid chromatography/ ion

trap mass spectrometer, Agilent 1100 HPLC system, Palo Alto, CA, USA). Five

microliters of sample was submitted to LC separation using TSK-gel Super-ODS

column (2 µm, 2.0 x 100 mm, TOSOH) at 40

C. The mobile phase was water

containing 0.1 % formic acid (A); methanol containing 0.1 % formic acid (B) under

gradient elution from 10 % B to 90 % B at 30 min. The flow rate was 200 µL/min, with

PDA detector at 238 nm. MS analysis was performed by Finnigan LCQ Deca XP plus

IT mass spectrometer equipped with an ESI interface (Thermo Fisher Scientific, San

Jose, CA, USA). Scan ranges were selected according to the molecular m/z of analytes

(HARADA et al., 1996).

Exposure protocol

Juvenile Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) of 40-60 g weight (N = 96) were

cultivated in Fish Hatchery Station at the State University of Londrina – Brazil. The fish

were acclimatized during 2 week in well-aerated water (dissolved oxygen > 4 mg/L),

pH 6.5 ± 1, temperature at 25 ± 1

C (500 L tanks). Daily feeding was carried out with

AFB

negative pellet feed, which was withdrawn 24 h before exposure. The fish were

exposed to M. aeruginosa CCBUSP262 cell extract by two routes: intraperitoneal (ip)

injection and immersion in tank containing cell-extract. The aflatoxin (AFB

) was ip

injected (single dose of 10 µg/Kg).

Intraperitoneal exposure was carried out in groups divided in 8 tanks with 6

fish each. Three groups were injected ip with a single dose of M. aeruginosa

CCBUSP262 cell extract at 2.0x10

5 (EMC1)

, 4.0x10

5 (EMC2)

and 1.0x10

cells/Kg

(EMC3)

AFB

and M. aeruginosa CCBUSP262 cell extract interaction test was carried out in 3

groups injected with ip AFB

(10 µg/Kg), and after 2 h, injected ip with M. aeruginosa

CCBUSP262 cell extract: AFB

(10 µg/Kg) + 2.0x10

cells/Kg

(AFB

+EMC1)

; AFB

(10

µg/Kg) + 4.0x10

cells/Kg

(AFB

+EMC2)

and AFB

(10 µg/Kg) + 1.0x10

cells/Kg

(AFB

+EMC3)

. The

(AFB

)

control was 6 fish with ip AFB

(10 µg/Kg), while negative

control was 6 fish ip injected with sterile mineral oil.

Immersion exposure in 3 tanks resulted in 4 experimental groups. Negative

control was carried out in tank A (18 fish), while the fish was immersed in tank B and C

with increasing concentration of M. aeruginosa CCBUSP262 cell extract during 72h

each exposure, replacing the water immediately after fish sampling. Fish in tank B (n =

18) were exposed at 1x10

cells/mL, and

6 fish sampled

at 72h

(i-EMC1)

; after 2 months,

remained 12 fish were exposed at 2x10

cells/mL/72h and 6 fish were sampled

(i-EMC3)

;

after 2 months, the last 6 fish were exposed at 5x10

cells/mL/72h

(i-EMC4)

. Fish in tank C

(n=6) were exposed once at 1x10

cells/mL/72h

(i-EMC2)

. The negative control in tank A

was sampled following the same protocol.

Genotoxicity tests (micronucleus and comet assay) were carried out in ip AFB

ip M .aeruginosa cell extract, ip AFB

+cell extract interaction assay and fish immersed

at 1x10

cells/mL, collecting the blood at 8, 24 and 48h after exposure. The

immunohistochemistry was carried out in liver and muscle, after 72 h of ip and

immersion in M .aeruginosa cell extract (

EMCs

) assay.

MC Immunohistochemistry

The M8H5 anti-MC monoclonal antibody (MAb) was used as primary

antibody (NAGATA et al., 1995). MC immunohistochemistry assay was performed

with paraffin-embedded tissues (5 µm) (liver and muscle of fish exposed to

CCBUSP262

(EMCs)

) adhered onto 5% poly-L-Lysine acetate-coated glass slides,

deparaffinized in xylene, and routinely hydrated in ethanol series. Endogenous

peroxidase was denatured with 3% H

in methanol (5 min), and washed with PBS

(pH 7.2). Tissue was incubated with 0.1% tripsine (10 min) and fetal bovine serum (30

min) at 37º C. M8H5 MAb diluted in PBS (1:10, 1:100 and 1:1000) was added, and

after incubation (30 min), unbounded antibodies were removed by washing sections in

PBS (pH 7.2). Then, the slides were incubated at 4º C with secondary antibody,

comparing two peroxidase systems: avidin-biotin peroxidase (ABPx) overnight, and

polymeric peroxidase (polymer-Px) system for 30 min (Dako Envision System,

Carpinteria, USA). After washing with PBS, the slides were incubated with dihydrate

3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB-substrate system, Sigma, St. Louis

USA) and H

solution for 3 min. The slides were washed with distilled water,

counterstained with Mayer hematoxylin, dehydrated in ethanol and cover slips applied

onto aqueous mounting medium for microscopy (Leica Microscopy, Wetzlar, Germany).

Genotoxicity tests

The micronucleus (MN) test was carried out in blood (two-smears each fish)

under ip AFB

, ip M. aeruginosa cell extract

(EMCs)

and ip AFB

+EMC interaction assay.

After 24 h, smear slide were fixed with absolute methanol and stained with Giemsa (in

phosphate buffer 1:20). The frequency of micronucleated erythrocytes was analyzed in

2000 cells per fish. Scoring criteria was oval shaped cell and nuclei with intact

membrane; non-refringent and clearly separated micronuclei of ≤ 1/3 the main nuclei

size (MATSUMOTO & CÓLLUS, 2000).

Comet assay was performed as described by Singh et al. (1988) and modified

by Speit & Hartmann (1999). A 10µL aliquot of blood sample (diluted 1:100 in saline),

was mixed with 120µL LMP agarose (0.5% in PBS), spread on slides (coated with

normal agarose) and then conditioned at 4

C for 10 min. In the following step, cells

were lysed for 60min at 4

C and slides were immersed in a solution of 10N NaOH and

200 mM EDTA, pH>13. The DNA was denaturated for 20min and the nuclei

electrophoresed at 300 mA and 25V (~1.5V/cm). The slides were neutralized in Tris

buffer and fixed in ethanol for 10min. Finally, the samples were stained with ethidium

bromide (200 µg/mL) and examined by fluorescence microscopy (EX 420-490, BA 520,

Melville, NY, USA). Analysis of the slides involved 100 nuclei per fish, utilizing the

visual classification from the nucleus of class 0 (no damage), class 1 (mild damage), 2

(moderate damage) and 3 (severe damage), according to DNA migration (SPEIT &

HARTMANN, 1999). The data are presented as the frequency of cells with and without

damage, score and distribution of classes. The score was calculated by multiplying the

number of nuclei found in a class times the class number.

Statistical analysis

The frequency of MN and comet data from M. aeruginosa cell extract

(EMCs)

AFB

-cell extract interaction

(AFB

+EMCs)

assays and negative control group were

compared by one way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey test for

multiple comparison of averages (p=0.05) by System for Statistical Analysis (Statistica

6.0, Statsoft, Tulsa, Oklahoma, USA).

RESULTS AND DISCUSSION

The cell extract was prepared with M. aeruginosa strain CCBUSP262 isolated

from Lago das Garças, Sao Paulo-Brazil, located in a region characterized by intensive

development of aquaculture. Both immersion and ip M. aeruginosa cell extract

concentrations were based on cell counting.

The higher immersion exposure simulated the alert level 2 (contamination with

risk for human health) of Alert Framework of Guidance in Drinking Water (WHO,

1998). Strain produced 1054.75 and 8.65 µg/g, respectively of 7D-MCLR and MCLW

per liophylized biomass. Main MC detected in cell extract was 7D-MCLR ([M+H]

, m/z

981) by LC/ITMS (Figure 1). The ip doses at 2x10

, 4x10

and 1x10

cells/Kg

corresponded respectively to 0.602, 1.204 and 3.011 µg/Kg of 7D-MCLR. Immersion

doses at 1x10

, 2x10

, 5x10

and 1x10

cells/mL corresponded to 30.1, 60.2, 150.5 and

301.0 µg/L of 7D-MCLR. Desmethylation of Mdha residue in MCLR (as 7-DMCLR)

decreased the toxicity to intermediate level in mice (HARADA et al., 1991).

This experiment used M. aeruginosa cell extract (Table 3), because

cyanobacterial cell components as lipopolysaccharide (LPS) can also be involved in

toxicity. LPS indirectly actives the rennin-angiotensin system, increasing MC uptake in

immersion assays. LPS also reduces the GST (glutathione S transferase) activity of

biotransformation pathways, including MC detoxication (BEST et al., 2003).

Liver and kidney are the main targets of MC in fish (FISCHER & DIETRICH,

2000). Regarding that fish erythropoieses take place in kidney, peripheral blood proved

to be adequate for biomonitoring purpose (PALHARES & GRISOLIA, 2002).

Therefore the genotoxicity effects (comet and micronucleus) were evaluated in tilapia’s

blood (Figures 2 - 5). Immunohistochemistry was carried out in liver and edible portion

of fish muscle (Tables 2 and 3, Figures 6 and 7). No fish death was observed during ip

or immersion assay, and the visual behavior was similar with control group throughout

the experiment, except by erratic swimming at EMC3, but without macroscopic

alterations.

Table 1 and Figure 4 detache the genotoxicity in all treatments (p<0.005). The

class 0 (non-damage) predominated in all group, while class 3 frequency was higher in

EMC ip group (1x10

cells/Kg, 3.011 µg/Kg of 7D-MCLR), increasing the comet score

independently on AFB

(10 µg/Kg) contamination. This AFB

dose was chosen based

on previous survey of fish farming feed monitoring, and fixed as a half concentration of

Brazilian guideline for feed (BRASIL, 1996). Comparing ip AFB

with non-ip AFB

data (EMC versus AFB

+EMC), the AFB

increased the genotoxicity in lower EMC

dose at 8 h (2x10

cells/Kg) (Figure 4, data

◆◆

p<0.005 ), and mutagenicity in all EMC

doses at 24h (2x10

to 1x10

cells/Kg) (Figure 5, data

◆

p<0.05).

Concerning AFB

, no difference was detected in MN frequency at 8h treatment,

but high MN frequency occurred in all treatments after 24 h, when compared with

negative control (p>0.05, Figure 4 and 5). Such a delay may be related with variable

response of O. niloticus to genotoxic agents (PALHARES & GRISOLIA, 2002), as well

as the maximum MN induction normally occurred one to five day post-exposure of

toxins (AL-SABTI & METCALFE, 1995). The MN is chromosome fragment or whole

chromosome lost during anaphase, and then MN frequency depends on kinetic of cell

cycle in a population (AL-SABTI & METCALFE, 1995).

In the other hand, the EMC dose-response was not significant (p > 0.05) in both

MN and comet data, but EMC addition increased AFB

mutagenicity (Figure 4, data

■

p<0.05). MC is a potent tumor promoter (NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al., 1992),

which can also act as tumor initiator (ITO et al., 1997), with increasing evidence of

genotoxicity. High MC dose was involved in clastogenic chromosome breakage

(REPAVICH et al., 1990).

Non-significant difference (Figure 4, data

▲

p>0.05) was found between comet

score of fish immersed at 1x10

cells/mL (alert level 2 of Alert Levels Framework,

WHO guideline, 1993) and two lowest dose of EMC or AFB

+EMC interaction.

Immersion concentration was as genotoxic as ip dose at 0.602 - 1.204 µg/Kg. However,

the spontaneous MN frequency (negative control) did not differ from MN frequency in

fish immersed at 1x10

cells/mL with 300 µg/L 7D-MCLR (p>0.05). Comparing the

comet score and MN frequency in all treatments (Figures 4 and 5), apparently the comet

assay was more sensitive than MN test regarding this dose-concentration range (Figures

4 and 5). Lankoff et al. (2004) reported negative correlation between apoptotic cell

frequency and level of DNA-damage. I.e., MCLR-induced DNA-damage in comet assay

may indicate earlier stage of apoptosis, which triggers cytotoxicity without genotoxicity.

Summarizing, reversible capacity of alkaline comet assay allows measuring of

DNA repair kinetic, while an impaired repair of DNA-damage may be detected by

micronucleus assay, i.e. mutagenicity (LANKOFF et al., 2004).

The effectiveness of avidine-biotine-peroxidade versus polymeric-peroxidase

system in immunohistochemistry was compared using anti-MC M8H5-MAb at 1:10 to

1:1000 dilutions (Table 2). Polymeric-peroxidase system showed higher performance

for marking of MC in fish liver using M8H5-MAb diluted at 1:10 and 1:100; therefore

1:100 was chosen for further immunohistochemical assay. This technology uses an

enzyme-labelled inert spine molecule of dextran, where approximately 70 enzymes and

10 antibodies can be attached, increasing signal response (Dako Envision System,

Carpinteria, USA). This staining with polymeric peroxidase system also reduces the 24

h analysis-time to 12 h.

Concerning the liver and muscle tissues, only the liver was

immunohistochemically MC-positive with polymeric-peroxidase system (Table 2),

suggesting the target specificity. Unique organotropy of MC in liver has been reported

in both intraperitoneal and oral administration in mice and rat, with immediate massive

intra-hepatic hemorrhage and cellular necrosis (TENCALLA & DIETRICH, 1997).

However, residual MC in muscle tissue was observed in fish collected in highly natural

contaminated lagoon in Jacarepaguá Lagoon, Rio de Janeiro-Brazil (MAGALHÃES et

al., 2003).

All ip EMC fish showed positive MC marking in liver (Figure 6A), but in

immersion test only higher dose was positive (1.0x10

cells/mL, 300µg/L of 7D-MCLR).

MC was not detected in muscle tissue (Figure 7), as well as in liver of animals

immersed in <1.0x10

cells/mL (Figure 6B, Table 3). Gill and skin epithelia of

freshwater fish have a barrier against MC transport, therefore ingestion is the main route

of MC uptake. Fish immersed several days in dense culture of toxigenic M. aeruginosa

remained unaffected, but i.p. injection of extract from same strain or purified MC

caused rapid severe liver damage and kidney degeneration, and death within hours

(CARBIS et al. 1996). MC was detected in liver of tilapia exposed at the concentration

equivalent to alert level 2 (WHO, 1993), indicating possibility of further contamination

of edible meat.

Immunohistochemical analysis performed with M8H5- MAb detected MCLR in

cytoplasm and some nuclei of fish hepatocyte. This finding suggested modulation of

nucleolar phosphatase affecting cellular growth and differentiation (YOSHIDA et al.,

1998). AFB

-iniatiated hepatocyte nuclei showed affinity for MCs, the combined effects

of these natural toxins in the development of tumor promotion can be expected

(SEKIJIMA et al., 1999).

Attending the request of sensitive method to detect contamination in situ, the

immunochemistry would be an ideal direct assay in fish, which combined with

genotoxicity tests could compose an efficient quality control tool intended for profitable

biomonitoring alternative in aquaculture.

Figure 1 - Chemical structure and mass spectra of 7D-MCLR analysed by LC/ITMS

Figure 2 – Comet classification: Class 0 - no damage 0, Class 1 – mild damage (≤ than to the

diameter of one nucleus) , Class 2 - modarate damage (> than the diameter of one nucleus and ≤

to the diameter of two nuclei) and Class 3 – severe damage (> than two times the diameter of

one nucleus) in O. niloticus blood sample, exposed to AFB

and M. aeruginosa cell extract.

Figure 3- Micronucleous in O. niloticus erythrocyte, exposed to AFB

and M.

aeruginosa cell extract.

OCH

H H

CH3

erythrocyte

Figure 4 - Comet Score average in O. niloticus: ip AFB

, immersion or ip EMC, and AFB

+EMC interaction.

Comet score: (0 x A)+(1xB)+(2xC)+(3xD)

* Score > than negative control (**p<0.005, ***p<0.0005)

■ Score > than AFB1 (10µg.Kg-1) (■ p<0.05, ■■ p<0.005)

▲ Score > than immersion group (▲ p<0.05, ▲▲ p<0.005, ▲▲▲ p<0.0005)

Score > than the correspondent MC dose, AFB1 (10µg.Kg-1) additional effect (p<0.005)

Figure 5 – Micronucleus frequency (‰) average in O. niloticus: ip AFB

, immersion or ip EMC, and AFB

+EMC interaction.

* MN frequency > than negative control (*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005%)

■ MN frequency > than AFB1 (10µg.Kg-1) (■ p<0.05, ■■ p<0.005, ■■■ p<0.0005%)

▲ MN frequency > than immersion group (▲ p<0.05, ▲▲ p<0.005, ▲▲▲ p<0.0005)



MN frequency > than the correspondent MC dose, AFB1 (10µg.Kg-1) additional effect ( p<0.05,   p<0.005)

A B

cytoplasm cytoplasm

hepatocyte hepatocyte nucleous

Figure 6- Immunohistochemistry of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Microcystis

aeruginosa CCBUSP262 exposed, MC marcation in liver (in Brow, A) and negative

immuno reaction (B)(100 X).

Figure 7- Immunohistochemistry of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Microcystis

aeruginosa CCBUSP262 exposed, negative immuno reaction in muscle (100 X).

nucleous

Table 1 – Comet classification and damaged nuclei average in Oreochromis niloticus

erythrocyte exposed to AFB

10µg.Kg

-1

and M. aeruginosa BCCUSP 262 extract

Comet Class

Time Treatments N 0 1 2 3

Damaged nuclei

(Class 1+2+3 Average± SD)

Negative control 6 567 28 5 0 5.5±5.2

AFB

10µg/Kg

(ip)

403 118 49 28

32.5±7.55****

MC Immersion 301µg/L

389 144 48 23

35.83±4.79****

MC 0.602µg/Kg

(ip)

449 109 32 10

25.16±6.76****

AFB

10 + MC 0.602µg/Kg

(ip)

390 110 67 27

34.0±4.09****

MC 1.204µg/Kg (ip)

422 80 60 38

29.66±8.80****

AFB

10 + MC 1.204µg/Kg (ip)

399 112 55 34

31.5±6.09****

MC 3.011µg/Kg (ip)

393 102 64 41

34.5±3.61****

AFB

10 + MC 3.011µg/Kg(ip)

349 116 75 50

40.16±7.256****

Negative control 6 574 17 8 0 4.16±3.76

AFB

10µg/Kg

(ip)

402 137 39 16

32.0±6.75****

MC Immersion 301µg/L

419 134 39 7

30.0±4.97****

MC 0.602µg/Kg

(ip)

428 116 37 19

28.66±6.47****

24h

AFB

10 + MC 0.602µg/Kg

(ip)

402 112 53 33

33.0±4.93****

MC 1.204µg/Kg (ip)

382 156 39 23

36.33±8.16****

AFB

10 + MC 1.204µg/Kg (ip)

382 136 36 39

35.16±6.43****

MC 3.011µg/Kg (ip)

349 126 73 42

40.16±6.21****

AFB

10 + MC 3.011µg/Kg(ip)

348 121 84 47

43.0±6.89****

Negative control 6 579 18 3 0 3.50±2.88

AFB

10µg/Kg

(ip)

405 138 37 19

32.3±5.54****

MC Immersion 301µg/L

413 136 30 21

31.16±5.1****

MC 0.602µg/Kg

(ip)

432 95 61 22

29.66±15.42****

48h

AFB

10 + MC 0.602µg/Kg

(ip)

406 116 54 23

32.16±4.791****

MC 1.204µg/Kg (ip)

425 102 44 29

29.16±7.41****

AFB

10 + MC 1.204µg/Kg (ip)

393 108 66 33

34.5±2.58****

MC 3.011µg/Kg (ip)

363 142 58 35

39.16±10.08****

AFB

10 + MC 3.011µg/Kg(ip)

349 102 98 49

41.6±6.83****

Statiscally different from negative control: level **** 0.005%

Table 2 – Immunohistochemistry reaction using avidin-biotin peroxidase and polymer

peroxidase system in tilapia liver ip exposed to Microcystis aeruginosa

CCBUSP262extract

Immunohistochemistry

(System)

Monoclonal antibody

(M8H5) dilution

Reactivity

1:1000 -

Avidin-Biotin 1:100 -

peroxidase 1:10 -

1:1000 -

Polymer peroxidase 1:100 +

1:10 +

Microcystin immunostaining: (+) positive, (-) negative

Table 3 - Immunohistochemistry using M8H5-MAb and polymer peroxidase system in

liver and muscle of tilapia exposed to Microcystis aeruginosa CCBUSP262extract

M. aeruginosa

7desmethyl-

MCLR

Reactivity

liver muscle

(ip)

Dose (cells/Kg) (µg/Kg)

EMC1

2.0 x 10

0.602 + -

EMC2

4.0 x 10

1.204 + -

EMC3

1.0 x 10

3.011 + -

immersion

Concentration (cells/mL) (µg/L)

i-EMC1

1.0 x 10

30 - -

i-EMC2

1.0 x 10

300 + -

i-EMC3

1.0 x 10

+ 2.0 x 10

30 + 60 - -

i-EMC4

1.0 x 10

+ 2.0 x 10

+ 5.0 x 10

30 + 60 + 150 - -

Microcystin immunostaining: (+) positive, (-) negative

POTENCIAL ANTI-CIANOBACTÉRIA EM MICROBIOTA PERTENCENTE

AO ECOSSISTEMA DA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO DE ESGOTO

Resumo

A intensa atividade agrícola e industrial, sem consciência logística e sustentável, causa impacto

negativo aos recursos hídricos devido à eutrofização e deterioração da água. A poluição aquática

se agrava pela ocorrência de floração de cianobactérias, com destaque a Microcystis aeruginosa,

produtora de hepatotoxina, pertencente ao grupo de microcistinas. Com o intuito de obter nova

alternativa no controle de cianobactérias e remoção de cianotoxinas, amostras de água da

Estação de esgoto (ETE São Lourenço de Londrina-PR) foram coletadas, para isolar

microrganismos antagonistas. Entre os 35 isolados obtidos do afluente, reatores 1 e 2, efluente e

lagoa de estabilização, nenhum apresentou capacidade de degradar microcistina-LR (MCLR).

Não obstante, 7 isolados apresentaram atividade anti-M. aeruginosa, com destaque a

Pseudomonas spp. (R2P5 e R2P8), sendo estes obtidos no reator 2. O isolamento de

antagonistas, em ambiente com freqüente floração (reator 2 e lagoa de estabilização), indicou o

potencial de ETE como ambiente altamente competitivo para obter antagonistas contra

cianobactérias; soma-se ainda, o potencial direcionado ao emprego da própria microbiota

presente no ecossistema, para o controle natural de floração toxigênica.

Palavras-chaves: Cianobactéria, microcistina e biocontrole

INTRODUÇÃO

As microcistinas (MCs) são hepatotoxinas produzidas principalmente por

Microcystis aeruginosa, Microcystis viridis, Aphanizomenom flos-aquae, Anabaena

spp., Oscillatoria spp., sendo estas cianobatérias pertencentes à comunidade

fitoplanctônica de ocorrência comum em ambientes aquáticos eutrofizados

(CHARMICHAEL, 2001).

Em 1996, a notificação pela comunidade científica internacional da intoxicação

por MCs em sessão de hemodiálise em Caruaru-PE, (JOCHIMSEN et al., 1998),

repercutiu diretamente sobre a necessidade de constante vigilância na qualidade da água

brasileira. A ocorrência de cianobactérias toxigênicas, em reservatório de água, tem sido

confirmada nos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Pará, Paraná,

Bahia, Pernambuco e Distrito Federal (FUNASA, 2003).

Os registros refletem estudo sobre o tema concentrado na região Centro-Sul do

Brasil, porém certamente a ocorrência de cianobactérias toxigênicas não se restringe a

esses Estados (FUNASA, 2003). Salienta-se ainda, a extensa atividade agrícola e

industrial em plena ascensão no país, em resposta ao competitivo agronegócio

globalizado. O desenvolvimento acelerado, sem consciência logística e sustentável, tem

sido motivo preocupante perante impacto negativo aos recursos hídricos, conduzindo à

eutrofização e deterioração da água. O Estado do Paraná ocupa somente 2,3 % do

território nacional e está estrategicamente posicionado no Mercosul, posicionando-se

em primeiro lugar na produção de grãos e de frango (ONO et al., 2000). No entanto, a

lixiviação de solo fertilizado pela agricultura, contaminação ambiental através de esgoto,

atividade industrial e piscicultura contribuem para elevação de nutrientes nos corpos

d’água, gerando impactos ambientais e deterioração da qualidade e disponibilidade de

água (CHARMICHAEL, 2002).

A aplicação de algicidas químicos para o controle de fitoplâncton na

piscicultura representa um problema sério ao ecossistema, já que provoca lise celular e

liberação de cianotoxinas (AHN et al., 2003). Soma-se ainda, o alerta da comunidade

científica perante uso indiscriminado de cloro nos sistemas de tratamento de água,

devido à liberação de carcinógenos potenciais, a exemplo de trialometanos no ambiente

(GEHR et al., 1993). Na tentativa de obter alternativas eficientes, microrganismos com

atividade antagônica, cuja ação engloba desde o parasitismo específico de contato

celular ou captura, até a produção inespecífica de enzimas extracelulares ou antibióticos

líticos, constituem alvo de constante investigação (WRIGHT & THOMPSON, 1985).

Entre os primeiros estudos, Jones et al. (1994) demonstraram a eficiência de

uma cepa inicialmente identificada como Pseudomonas MJ-PV na degradação de

MCLR, posteriormente classificada como Sphingomonas sp. Microrganismos similares,

apresentando colônias amarelas, aeróbios e Gram negativos têm sido isolados e com

capacidade de degradar MCs em produtos com toxicidade reduzida no fator de 20 a 160

vezes em relação a MCLR (BOURNE et al., 1996; ISHI et al., 2004; HARADA et al.,

2004; PARK et al., 2001; SAITOU et al., 2003; HO et al., 2007; AMÉ et al., 2006).

Considerando a ineficácia de métodos convencionais e impactos negativos de

agentes químicos ao meio ambiente, o biocontrole com microrganismos capazes de

controlar a proliferação de cianobactérias e/ou degradar MC demonstra perspectiva

promissora no controle de qualidade de água (AHN et al., 2003). O presente trabalho

teve como objetivo avaliar o potencial da Estação de tratamento de esgoto (ETE São

Lourenço, Londrina-PR) para isolamento e seleção de microrganismo antagônico contra

cianobactéria toxigênica.

MATERIAL E MÉTODOS

Padrão de Microcistina-LR e Adda

MCLR foi obtida de cultivo liofilizado de Microcystis aeruginosa TAC 95

(Tsukuba Algal Collection, Tsukuba, Japan). O β-aminoácido Adda [(2S,3S,8S,9S) 3-

amino-9-metoxi-10-fenil-2,6, 8-trimetildeca-4,6- ácido dienóico] foi isolado e

purificado a partir da biodegradação de MCLR com cepa B9. A pureza (mínimo 95%)

de MCLR e Adda foi analisada por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e

Espectrometria de massas (MS) no Laboratório de Ciências Ambientais - Centro de

Análises, na Faculdade de Farmácia da Universidade de Meijo, Nagoya – Japão.

Isolamento de microrganismos antagônicos

Entre setembro a dezembro/2005, amostras de água foram coletadas, na estação

da Estação de Tratamento de Esgoto de Londrina, Empresa de Saneamento e Esgoto do

Paraná (ETE- São Lourenço-SANEPAR, Londrina-PR). O isolamento de

microrganismos foi realizado em 29 amostras de água coletadas a cada 2 semanas em 5

pontos distintos: afluente - AF (7), Reator 1 - R1 (7), Reator 2 - R2 (7), Efluente - EF

(6), floração na lagoa de estabilização- B (2). Para o isolamento procedeu-se a técnica

de diluição seriada com água peptonada 1% (m/v) estéril até o fator de 10

. Três

diluições de cada amostra foram plaqueadas em 2 tipos de meio de cultura: meio A

contendo 2 % de peptona de gelatina, 0,14 % de cloreto de magnésio, 1 % de sulfato de

potássito e 1,36 % de ágar ou meio P, composto de meio A adicionado de irgasan

(0,0025 % - Meio seletivo para Pseudomonas – Acumedia Manufactures, Ltd). As

placas foram incubadas a 25º C por 24 a 48 h. As colônias com aspecto diferente de

cada diluição foram isoladas e mantidas em ágar nutriente, procedendo caracterização

preliminar por testes bioquímicos (VM, VP, nitrato , citrato, motilidade e indol).

A cepa B9, (99% geneticamente similar a Sphingosinicella microcystivorans)

(MARUYAMA et al., 2006) foi utilizada como controle positivo da biodegradação de

MCLR. Esta cepa foi isolada do Lago Tsukui, Kanagawa-Japão (TSUJI et al., 1997). A

cepa foi cultivada em caldo (peptona de caseína 0,2%, extrato de levedura 0,1% e

glicose 0,05%) sob agitação a 200 rpm a 27º C/48 h e mantida em ágar nutriente após

incubação a 25º C / 48-72 h.

Cianobactéria-teste

As cepas Microcystis aeruginosa NIES 298, M. viridis NIES 102, Anabaeba

mendotae NIES 808 e Phormidium tenue NIES 611 gentilmente cedidas pelo National

Institute of Environmental Studies (NIES) de Tsukuba-Japão, constituíram organismo-

teste para seleção de isolados anti-cianobactéria. Estas linhagens foram mantidas em

meio MA (pH 8,6 contendo 50 mg de Ca(NO

)

O, 100 mg de KNO

, 50 mg de

NaNO

, 40 mg de Na

, 50 mg de MgCl

O, 100 mgd e β-sodioglicerofosfato, 5

mg de Na

EDTA, 0,5 mg de FeCl

.6H

O, 5 mg de MnCl

.4H

O, 0,5 mg de ZnCl

, 5 mg

de CoCl

.6H

O, 0,8 mg de Na

MoO

O, 20 mg de H

, 50 0mg de bicina em 1L

de água purificada) a 25º C e luz constante no Laboratório de Ciências Ambientais da

Universidade de Meijo, Nagoya-Japão.

Seleção de microrganismos com atividade anti-cianobactéria

As cianobactérias NIES 102, 298, 611 e 808 foram cultivadas em meio MA

(300 mL) a 25 ºC / 7 dias sob luz constante e agitação a 80 rpm. Paralelamente, os

isolados da estação de esgoto foram cultivados em ágar nutriente (0,2 % de peptona de

caseína) a 25º C / 24 a 48 h. O cultivo de cada cianobactéria (70 mL) foi adicionado em

30 mL de meio MA, seguida de inoculação de 1 mL da cultura ou 1 colônia de cada

isolado. Após 0, 24, 48, 72 e 96 h, 10 mL da mistura foi filtrada (membrana GF/C,

Whatman®, Maidstone, England) e a membrana com biomassa foi acondicionada em

tubos de 15 mL (17x120 mm, DB Falcon, NJ, USA) contendo 5 mL de metanol p.a. Os

tubos foram incubados sob ausência de luz a 4º C / 24 h. A leitura da absorbância do

extrato metanólico foi realizada em microplacas tipo ELISA (96 poços, Nalgen Nunc

International, USA) e espectrofotômetro em 405 e 665 nm (Biocrhom Ltd, Cambridge,

UK). O controle negativo consistiu do cultivo de cianobactéria adicionado de 1 mL de

caldo nutriente. Realizou-se uma triagem com todos os isolados, com 3 repetições para

as cepas que apresentaram atividade antagônica.

Análise da biodegradação de microcistina por CLAE-PDA

Uma colônia de cada isolado foi introduzida em solução aquosa com 10 µg/mL

de MCLR e incubada a 27 ºC sob ausência de luz. Após 0, 24, 48 e 72 h, uma alíquota

de 50 µL do cultivo foi transferida em microtubo (Eppendorf, Hamburg, Germany).

Uma solução de ácido fórmico 0,2 % em metanol (50 µL) foi adicionada ao microtubo

para o bloqueio da reação de biodegradação. A mistura foi centrifugada (15.000 x g /10

min) e filtrada (membrana hidrofílica 0,2 µm PTFE, Millipore®, Bedford, MA, USA).

O controle negativo consistiu de isolado-teste sob as mesmas condições, sem a adição

de MCLR.

MCLR e produtos de biodegradação (MCLR linear, tetrapeptídeo e Adda) no

sobrenadante foram analisados por CLAE (Shimadzu, Kyoto, Japan) com detector PDA

(photodiode-array) a 238 nm. O sistema gradiente consistiu de duas bombas (LC-

10AVP), coluna TKS-gel-ODS (5 µm, 2,0 x 150 mm, TOSOH, Tokyo, Japan) a 40º C.

A fase móvel foi composta de (A) ácido fórmico 0,1% em água e (B) ácido fórmico

0,1% em metanol, sendo o gradiente inicial de 40 a 90% de B em 20 min. O fluxo foi de

200 µL/min.

Cromatografia em camada delgada de extrato celular de isolado anti-cianobactéria

A cepa com melhor performance anti-cianobactéria foi inoculada em 300 mL

de caldo nutriente estéril (peptona de caseína 2 %) por 27 ºC/ 48 h a 80 rpm (shaker

orbital). O cultivo foi centrifugado (3.000 x g por 15 min) e o sobrenadante descartado.

O pelete obtido foi lavado duas vezes, procedendo ressuspensão em tampão Tri-Cl (50

mM, pH 7,6) e centrifugação (3.000 x g / 15 min). O pelete lavado foi transferido para

Erlenmeyer contendo 100 mL de clorofórmio p.a. e, o extrato celular obtido

concentrado a 40 ºC (rotavapor). O extrato bruto foi dissolvido em 1 mL de clorofórmio

e submetido a cromatografia em camada delgada (20 x 20 cm Sílica gel 60F254 1mm,

Merck, Frankfurter, Germany) procedendo corrida com isopropanol:água:amônia

(80:15:5) como fase móvel (DAKHAMA et al., 1993).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Considerando a alta contagem microbiana em amostras de esgoto, os fatores de

diluição de 10

, 10

e 10

foram selecionados para a escolha dos isolados. Trinta e

cinco microrganismos foram selecionados e isolados, sendo 8 do afluente (AF), 8 do

reator 1 (R1), 9 do reator (2), 8 do efluente (EF) e 2 de floração na lagoa de

estabilização (Tabela 1).

O uso de meio de cultura específico para Pseudomonas, foi considerado devido

aos relatos da literatura da atividade antagônica Pseudomonas aeruginosa e da

similaridade bioquímica com Sphingomonas sp. capaz de degradar MCs (TAKENAKA

& WATANABE, 1997; JONES et al., 1994). Porém, a adição de irgasan (agente

bactericida) no meio seletivo (P) para Pseudomonas sp. não inibiu o crescimento de

outros microrganismos (Tabela 1).

A Tabela 1 mostra a identificação provável dos microrganismos isolados nos

diferentes pontos e data de coleta. De forma geral, em todos os pontos de coleta

observou-se uma predominância de Enterobacteriaceae, principalmente no afluente e

efluente, com presença de Pseudomonas sp. nos reatores 1, 2 e lagoa de estabilização,

principalmente no período de floração (5ª coleta). A co-ocorrência de Pseudomonas e a

floração de fitoplâncton em R2 e lagoa de estabilização, sugeriu a interação entre esses

organismos. A análise microscópica destas florações indicou a presença de

cloroflagelados (Euglena), clorofíceas, cianofíceas e protozoários ciliados (não

identificados). Considerando o fluxo do esgoto a partir do afluente (AF) Æ reator R1 e

R2 Æ lagoa de estabilização Æ efluente (EF), a presença de floração na lagoa de

estabilização indica a sobrecarga da ETE na primeira quinzena de novembro/2005. Por

outro lado, a atuação de organismos na cadeia trófica, principalmente protozoários e

zooplâncton, reduziu a carga de cianobactérias e Pseudomonas sp., não detectadas no

efluente (EF). Estas informações apontam a dinâmica do ecossistema microbiano no

processo de tratamento de água. Inamori et al. (1998), sugerem a aplicação de

protozoários como Aeolosoma hemprichi e Philodina erythrophthalma no controle de

Microcystis viridis toxigênica em biofilme de reatores no tratamento de água. Neste

processo, os protozoários após digerirem a cianobactéria, excretariam a toxina que por

sua vez seria degradada por bactérias aderidas a biofilme.

Apenas 7 microrganismos mostraram atividade somente contra M. aeruginosa

NIES 298, observados quando comparados com controle negativo (C-) (Figura 1A).

Após 96 h, M. aeruginosa NIES 298 (C-) apresentou crescimento (Figura 1B) com

aumento na absorbância (405 nm) o que não ocorreu com M. aeruginosa NIES 298

inoculadas com Pseudomonas sp. (BP5, R2P5 e R2P8), Serratia sp. (EFP3B e R2A8) e

Enterobacter sp. (EFP8 e AFP1) (Figura 1A).

Os isolados que apresentaram maior atividade antagônica foram R2P5 (Figura

1B) e R2P8 ambos isolados do Reator 2 da ETE. No entanto, esse resultado só foi

possível com M. aeruginosa NIES 298 em concentração inicial (0 h) entre DO 0,15 -

0,20 em concentração inicial superior a 0,25 (DO), os isolados não apresentaram efeito

antagônico.

Enfatizamos que esses dados foram obtidos após 3 repetições inoculando os 7

isolados com cultura de M. aeruginosa NIES 298 toxigênica. A aplicação de caldo

nutriente (1 mL com 0,2 % de peptona de caseína) apresentou lise celular de M.

aeruginosa NIES 298 (controle negativo), fato este justificado pela presença de L-

Lisina proveniente do meio de cultura. A adição de 50 µM de L-Lisina resultou em

perda da capacidade de flutuação, redução da concentração de clorofila a e morte

celular em cultivo de Microcystis sp (TAKAMURA et al., 2004). A análise do caldo

nutriente estéril por LCMS detectou tanto D como L-Lisina em sua composição (dados

não apresentados). Portanto, para confirmação da atividade cianobacteriolítica dos 7

isolados ativos, estes foram plaqueados e 1 colônia foi adicionada ao cultivo de

cianobactéria, utilizando como controle negativo 1 gota de água estéril.

Dakhama, et al. (1993) separaram por cromatografia em camada delgada 4

frações com pigmentos fluorescentes de extrato de Pseudomonas aeruginosa. As

frações apresentaram pigmentos fluorescente azul, azul-palha, amarelo e alaranjado,

posteriormente identificados como piocianina, ácido fenazina-1-carboxílico,

oxiclororafina e 1-hidroxifenazina, respectivamente. Oxiclorafina e 1-hidroxifenazina

apresentaram atividade cianobacteriolítica contra Anabaena sp., Phormidium bohneri e

Oscillatoria agardhii.

A cromatografia em camada delgada do extrato celular de R2P5 separou

compostos com Rf e fluorescência semelhantes aos pigmentos descritos por Dakhama et

al. (1993), inclusive de 1-hidroxifenazina (fator de retenção - Rf 0,72) no entanto o

efeito antagônico de cada fração não foi testado (Figura 2).

Em geral, a seleção de microrganismos com atividade anti-cianobactéria

envolve triagens com número extensivo de microrganismos. Yoshikawa et al. (2000)

selecionaram 37 microrganismos com atividade anti-cianobactéria a partir de 2594

bactérias isoladas no mar em Okinawa, Japão. Enquanto que o isolamento de 510

espécies no Lago Biwa, também no Japão, selecionou 17 microrganismos ativos

(IMAMURA et al., 2001). Comparando-se o isolamento de microrganismos a partir de

amostras de água com florações e diretamente de florações de cianobactéria, as

florações apresentaram maior freqüência de microrganismos antagônicos (IMAMURA

et al., 2001).

Entre os 35 microrganismos isolados na Estação de Tratamento de Água de

Londrina-PR, nenhum apresentou capacidade de degradar microcistina, mantendo a

concentração de MCLR constante mesmo após 72h. A Figura 3a exemplifica a

persistência de MCLR inoculada com a cepa EFA7 no tempo 0 e 72 h.

Por outro lado, a cepa B9 (controle positivo) reduziu significativamente o pico

MCLR após 24 h, além de apresentar 2 picos de produto de biodegradação (A e B,

Figura 3b). Posteriormente, o produto B foi identificado como Adda, cujo padrão

apresentou tempo de retenção similar ao produto B (R.T.= 10 min) e o produto A

provavelmente o tetrapeptideo Adda-Glu-Mdha-Ala.

Os produtos de degradação de MCLR inoculada com a cepa B9 foram

confirmados pela análise do espectro de absorção máxima dos picos detectados no

cromatograma em 238 nm, atribuído ao dieno conjugado presente em Adda (em azul,

Figura 3b). Perfil cromatográfico com 3 picos (MCLR, A e B) foi observado no tempo 0

h com as cepas R2P5 (Figura 3c) e R2P8. No entanto o espectro de absorção máxima

em 248-250 nm dos picos A e B nas cepas R2P5 e R2P8, descartou a hipótese de

formação de produtos de biodegradação por estes microrganismos (em azul e verde,

Figura 3c).

A caracterização bioquímica de R2P5 e R2P8 identificou estes microrganismos

como Pseudomonas sp. A análise por CCD detectou pigmentos fluorescentes,

provavelmente responsáveis pelos picos de absorção de 248-250 próximos a MCLR

(238 nm). Os pigmentos fluorescentes isolados por Dakhama, et al. (1993) a partir de

extrato celular de Pseudomonas aeruginosa apresentaram espectros de absorção

máxima em metanol de 238 nm para piocianina, 264-265 nm para 1-hidroxi-fenazina,

este último com capacidade de lisar cianobactéria.

Os resultados preliminares mostraram correlação positiva entre florações de

cianobactéria e presença de Pseudomonas sp. antagonista. Os dados indicam o potencial

do reator 2 (R2P5 e R2P8) e a lagoa de estabilização (BP5) para o isolamento de

microrganismos adaptados às condições tropicais e com potencial de controlar

cianofíceas toxigênicas.

Salienta-se que na ETE, o esgoto tratado sai do efluente e é gradativamente

diluído em córregos, cujo destino são corpos d’água utilizados para captação de água

para abastecimento público. Portanto, assumindo-se que a qualidade de água é um fator

limitante para o desenvolvimento social e econômico do país, verifica-se que várias

lacunas precisam ser preenchidas para que possamos garantir, de forma segura e

confiável, a qualidade de água em nossos mananciais e nos sistemas de abastecimento

público.

Tabela 1 - Identificação (provável) dos microrganismos isolados em amostras coletadas

na Estação de Tratamento de Esgoto São Lourenço, Londrina-PR.

Data da

coleta

Ponto de

coleta

Meio de

cultura

Isolado spp. (provável)

Afluente P AFP1

Enterobacter

19/09/05 Reator 1 A R1A1

Enterobacter

1ª coleta Reator 2 A R2A1

Proteus

Efluente A EFA1

Proteus

03/10/05 Afluente A AFA2

Yersinia

Reator 1 P R1P2

Enterobacter

2ª coleta Reator 2 A R2A2

Enterobacter

Efluente A EFA2

Citrobacter

Afluente P AFP3A

Enterobacter

Afluente P AFP3B

Enterobacter

17/10/05 Reator 1 A R1A3

Klebsiella

3ª coleta Reator 2 A R2A3

Proteus

Reator 2 P R2P3

Enterobacter

Efluente A EFA3A

Enterobacter

Efluente A EFA3B

Serratia

Efluente P EFP3

Enterobacter

Afluente A AFA4

Proteus

01/11/05 Reator 1 P R1P4

Klebsiella

4ª coleta Reator 2 A R2A4

Klebsiella

Efluente P EFP4

Enterobacter

Floração lagoa P BP4

Proteus

14/11/05 Afluente P AFP5

Enterobacter

5ª coleta Reator 1 P R1P5

Pseudomonas

Reator 2 P R2P5

Pseudomonas

Floração lagoa P BP5

Pseudomonas

29/11/05

As amostras foram acidentalmente descartadas

6ª coleta

Afluente P AFP7

Enterobacter

05/12/05 Reator 1 A R1A7

Yersinia

7ª coleta Reator 2 P R2P7A

Enterobacter

Efluente A EFA7

Shiguella

Afluente P AFP8

Enterobacter

Reator 1 A R1A8

Citrobacter

19/12/05 Reator 1 P R1P8

Pseudomonas

8ª coleta Reator 2 A R2A8

Serratia s

Reator 2 P R2P8

Pseudomonas

Efluente P EFP8

Enterobacter

A B

Figura 1 - Efeito antagônico de 7 isolados obtidos de ETE contra M. aerugionosa NIES

298 (A); Isolado R2P5 inibindo M. aerugionosa NIES 298 (incolor) e respectivo

controle negativo (verde) após 96h de cultivo (B).

Figura 2 - Cromatografia em Camada Delgada de extrato celular do isolado R2P5, fase

móvel isopropanol:água:amônia (80:15:5).

1-hidroxifenazina

Figura 3 – (a) Perfil cromatográfico do isolado EFA7 inoculado com MCLR em 0 e 72

h; (b) perfil cromatográfico e espectro de absorção máxima de Adda a partir da cepa B9

(controle positivo) inoculado com MCLR após 24 h; (c) perfil cromatográfico e

espectro de absorção máxima dos picos A e B a partir do isolado R2P5 inoculado com

MCLR em 0 h.

NOVEL MICROCYSTIN-LR BIODEGRADATION PRODUCTS DETECTED

BY ADVANCED MARFEY’S DERIVATIZATION METHOD

Abstract

The development of safe tool in cyanobacterial control has been a topic in concern due to

increased frequency of cyanobacterial toxic blooms. Biocontrol as an economical and

environment-friendly solution has pointed as the most promising option of detoxification

process in aquatic ecosystem. Taking into account the enzymatic hydrolysis activity of bacterial

strain B9 on structurally different cyanobacterial cyclic peptides, the mechanism of MCLR

degradation, which outcome peptides and amino acids were investigated by advanced Marfey’s

method. MCLR (1.0 mg/mL) degradation by strain B9 cell was carried out, and 120 µL was

sampled at 0, 6, 12, 24, 48, 72 and 96 h. The reaction was stopped adding 120 µL of methanol,

and the mixture was derivatized with 1% 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-leucinamide (L-

FDLA) in acetone prior to analysis by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry

(LC/ITMS). Novel L-FDLA derived amino acids and peptides were detected at respective m/z

values: [Arg-L-DLA+H]

m/z 468.9; [N-methyl-L-DLA+H]

m/z, 325.7, from Mdha; [Arg-

βMeAsp-L-DLA+H]

m/z 598; [Mdha-Ala-L-DLA+H]

m/z 467.0; [Glu-Mdha-L-DLA+H]

m/z

524.7; [Arg-βMeAsp-Leu-L-DLA+H]

m/z 711.0; [Glu-Mdha-Ala-L-DLA+H]

m/z 595.6;

[Adda-Glu-Mdha-L-DLA+H]

m/z 839.0, in addition to [Adda-L-DLA+H]

m/z 625.8 and

[Adda-Glu-Mdha-Ala-L-DLA+H]

m/z, 908.9. The detection of novel products fulfilling the

biodegradation metabolites would be essential to complete the elucidation of very unique

hydrolytic microcystin detoxification by B9 strain.

Key words: microcystin, biodegradation, B-9 strain, Advanced Marfey’s Method

INTRODUCTION

Microcystins (MCs) are a group of hepatotoxins and protein phosphatase

inhibitors, produced by cyanobacteria of the genera Microcystis, Anabaena, Nostoc and

Planktrotrix (CHARMICHAEL, 1992). These structures are cyclic heptapeptides

consisting of D-Ala-R

-D-MeAsp(iso)- R

-Adda-D-Glu(iso)-Mdha. Among the 80

variants fully identified, MCLR (R

: Leu, R

: Arg) is the most toxic(Figure 1) (BOTES

et al., 1984; HOEGER et al., 2005).

Following, the first isolation of a MC-degrading bacteria was an Sphingomonas

sp. strain (ACM-3962) by Jones et al. (1994); phenotypically similar bacteria capable to

degrade MC were reported (PARK et al., 2001, SAITOU et al., 2003, ISHI et al., 2004,

HARADA et al., 2004, RAPALA et al., 2005, AMÉ et al., 2006). In pilot-scale study,

the ACM-3962 effectively degraded MCLR in slow sand-filtration (BOURNE et al.,

2006), as well as a feasible bioreactor with B9 strain immobilized in polyester resin

removed MC of lake water (TSUJI et al., 2006).

Figure 1- Microcystin-LR

The molecular study of Sphingomonas strain ACM-3962 revealed three

hydrolytic enzymes involved in MCLR degradation. Microcistinase MlrA catalyzes the

initial ring opening of MCLR at Adda-Arg peptide bond to give linearized MCLR,

which is further degraded to a tetrapeptide by MlrB. The third enzyme MlrC hydrolyzes

tetrapeptide to smaller peptides and amino acids. The putative protein MlrD provided

the transport of MCLR and its degradation products across the bacterial cell wall

(BOURNE et al. 1996; 2001). Intact Adda was first isolated from MCLR by

degradation using strain B9, as a final product (HARADA et al., 2004).

OCH

COOH

O COOH O

3-Amino-2,6,8-trimethyl-9-methoxy-

10-phenyldeca-4(E), 6(E)-dienoic acid

(Adda)

D-Glu (iso)

N-Methyl-dehydro-Ala

(Mdha)

D-Ala

L-Leu

D—MeAsp (iso)

L- Arg

Further use of classic protease inhibitor as EDTA accumulated linear (Adda-

Glu-Mdha-Ala-Leu-βMeAsp-Arg) and (Adda-Glu-Mdha-Ala) tetrapeptide, which

allowed classification of these enzymes as MlrA and MlrC metallopeptidases, whereas

1,10-phenanthroline characterized MlrB as a possible serine peptidase (BOURNE et al.,

1996; 2001).

Liquid chromatography (LC) coupled with photodiode (PDA), and mass

spectrometry (MS) detection has been widely used in screening of MC-degrading

microorganism. The linear MC and tetrapeptide intermediates also contain Adda portion,

with a diene as the main chromophore and maximum absorption spectra at 238 nm

(LAWTON et al., 1994, MCELHINEY & LAWTON, 2005).

The restriction of chromatographic methods concerning complete identification

of degradation products is the lack of unusual amino acid and/or peptide standards. Fujii

et al. (1997) proposed advanced Marfey’s method as a nonempirical liquid

chromatography/mass spectrometry (LCMS) to determine the absolute configuration of

amino acid in a peptide without standard. Marfey (1984) using liquid chromatography at

340 nm, separated by D and L- amino acid enantiomers derivatized with 1-fluoro-2,4-

dinitrophenyl-5-alaninamide (FDAA), a chiral chromogenic reagent. The elution order

of a desired amino acid can be elucidated from the comparison of hydrophobicity of the

two more hydrophobic substituent at α-carbons and the side chain of the amino acid in

FDLA, which are arranged as cis or trans type conformation. The L-amino acid

derivative is usually eluted from the column before its correspondent D-amino acid

derivative (FUJII et al., 1997).

The strain B9, which is 99% similar with Sphingosinicella microcystinivorans

strain Y2 (GenBank accession no. AB084247) (MARUYAMA et al., 2006) showed

promising potential concerning degradation of MCLR, MCRR 3-desmethyl-MCLR,

dihydro-MCLR and nodularin (IMANISHI et al., 2005). In this study, the MCLR

degradation behavior of strain B9 was carefully investigated monitoring its products by

HPLC-PDA and LC/MS, as well as Marfey’s derivatization coupled with LC/ITMS

(liquid chromatography/ion trap mass spectrometry).

MATERIAL AND METHOD

Chemicals

The NaCl, Tris-Cl buffer (pH 7.6), HPLC grade methanol, acetonitrile and

formic acid were purchased from Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). The ultra-pure

(distillated) water used in mobile phases was purchased from Kanto Chemical (Tokyo,

Japan). As derivatization reagent, 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-leucinamide (L-

FDLA) was purchased from Kokusan Chemicals (Tokyo, Japan). Amino acids standard

(D-Ala, L-Arg, D-Glu, L-Leu, D-βMeAsp) were purchased from Sigma (St. Louis, MO,

USA), Wako (Osaka, Japan), Tokyo Kasei Kokyo (Tokyo, Japan), or Nacalai Tesque

(Kyoto, Japan). Purified Adda was produced by MCLR degradation using the cell

extract of B9 strain (HARADA, et al., 2004). MCLR was isolated and purified (>95%

on HPLC) from lyophilized cyanobacterial cells collected from Laguna de Bay,

Philippines.

MC-degrading bacterium

The bacterial strain B9 (isolated from Lake Tsukui, Kanagawa, Japan) was

inoculated in 100 mL of Sakurai medium (0.2 g peptone, 0.1 g yeast extract and 0.05 g

glucose), and incubated at 27

C / 3 days at 200 rpm. The cells were harvested (3,000 x

g/ 30 min, room-temperature), and the pellet was suspended in 50 mM Tris-Cl buffer

(pH 7.6), and again centrifuged (3,000 x g / 30 min). The degradation assay was carried

out with cell pellet as: (1) crude B9 cell, named CB9, was MCLR added directly into

freshly harvested pellet; (2) washed B9 cell, named WB9, was MCLR added into pellet

previously rinsed three times with 50 mM Tris-Cl buffer (3,000 x g /30 min), followed

by sequential rinsing with 0.9% NaCl at 7,500, 12,000 and 15,000 x g/5 min (three

repetitions each one); (3) B9 cell extract named EB9, MCLR added into crude B9 cell

pellet lyophilized and dissolved in water. The viability of CB9 and WB9 was checked

inoculating 10 µL of cell suspension in 10 mL of Sakurai medium at 27

C for 24-48h.

Negative biodegradation control was performed with CB9, WB9 and EB9 without

MCLR.

Advanced Marfey’s method

The advanced Marfey’s method was calibrated testing 50 mM of each pure D,

L and D-L amino acid (Ala, Arg, Glu, Leu, βMeAsp) and Adda (FUJII, et al., 1997).

The detection limit was established comparing 0.05, 0.1, 0.5, 5, 50 mM of amino acids

pool (D-Glu, D-Ala, D-βMeAsp, L-Arg, L-Leu and Adda) in 50 mM Tris-Cl buffer or

O. Each amino acid pool concentration was added with 20 µL of 1 M NaHCO

and

50 µL of 1% L-FDLA in acetone, followed by vortexing and incubating at 37

C / 60

min. The reaction was quenched adding 20 µL of 1 N HCl and dried-centrifuged. The

residue was dissolved in 300 µL of acetone, centrifuged to precipitate the NaHCO

(three repetitions, 15,000 x g, 2 min). The collected supernatant (900 µL) was dried, and

the residue was dissolved in acetonitrile (1 mL). Five microliter was screened by TLC

(thin layer chromatography, 20 x 20 cm Sílica gel 60F254 1mm, Merck, Frankfurter,

Germany) with chloroform:methanol (1:1) as the mobile phase, while 5µL was analyzed

by LC/ITMS (liquid chromatography / ion trap mass spectrometry). The performance of

Advanced Marfey’s method in the analysis of MCLR biodegradation products was

evaluated testing 100 µg/mL and 1 mg/mL of MCLR incubated with B9 cell extract

(EB9) at 27

C in the dark. The 120 µL of mixture was sampled after 0, 24, 48 and 72 h,

followed by addition of 120 µL of methanol to quench the degradation reaction and

stored at -20

C. Forty microliter was used for HPLC-PDA analysis at 238 nm, while the

remaining 200 µL was dried, dissolved in 50 µL of H

O, derivatized with L-FDLA and

analyzed by LC/ITMS as described.

MCLR-biodegradation assay

Biodegradation of 1 mg/mL of MCLR in H

O was carried out adding 200 µL

of bacterial strain B9 (crude, CB9; washed, WB9; extract cell, EB9), and incubated at

C in the dark. An aliquot of 120 µL was sampled after 0, 6, 12, 24, 36, 48 72 and 96

h, and filtrated by Ultrafree-MC membrane centrifuge filtration unit (hydrophilic PTFE,

0.20 µm, Millipore, Bedford, MA, USA). Biodegradation reaction was quenched adding

120 µL of methanol. Forty microliter was analyzed by HPLC-PDA (238 nm) for

biodegradation monitoring, followed by biodegradation products identification by

LC/ITMS (238 nm). The remained 200µL was dried and dissolved in 50 µL of H

O to

perform advanced Marfey’s derivatization with L-FDLA as previously described. The

derivatized residue was dissolved in acetone, centrifuged, and the dried supernatant

residue was dissolved in 100 µL of acetonitrile for LC/ITMS analysis (340 nm).

High-Performance Liquid Chromatography

MCLR degradation process was monitored by HPLC-PDA (238 nm). The

system consisted of a pair of LC 10A VP pumps, DGU 12A degasser, CTO 6A column

oven, SPD 10A VP photodiode array detector, and SCL 10A VP system controller

(Shimadzu, Kyoto, Japan). Five microliter of filtrated sample (hydrophilic PTFE, 0.20

µm, Millipore, Bedford, MA, USA) was loaded onto TSK-gel Super ODS column (2.0

µm, 2.0 X 100 mm, TOSOH, Tokyo Japan) at 40

C. The mobile phase was 0.1%

formic acid in water (A) and 0.1% formic acid in methanol (B). The gradient conditions

were initially 40 to 90% B at 20min, and the flow rate was 200 µL/min.

Liquid Chromatography/ Ion Trap Mass Spectrometry

Prior L-FDLA derivatization, MCLR cyclic, MCLR linear, tetrapeptide (Adda-

D-Glu-Mdha-D-Ala) and Adda were confirmed by LCMS (238 nm). The sample,

column, mobile phase and gradient conditions were the same of HPLC analysis. L-

FDLA derivatized sample was analyzed by LC/ITMS. The LC separation was

performed by Agilent 1100 HPLC system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).

Five microliter of the sample was filtrated through Ultrafree-MC membrane centrifuge-

filtration unit (hydrophilic PTFE, 0.20 µm, Millipore, Bedford, MA, USA) and loaded

onto TSK-gel Super ODS column (2.0 µm, 2.0 X 100mm, TOSOH, Tokyo Japan) at 40

C. The mobile phase was 0.1% formic acid in water (A) and 0.1% formic acid in

acetonitrile (B). The flow rate was 200µL/min with UV detection at 340 nm. The

gradient conditions were initially 10-90% B at 40min. The entire eluate was directed

into the mass spectrometer where it was diverted to waste for 2.5 min after injection to

avoid any introduction of salts into ion source. The MS analysis was accomplished by

Finningan LCQ Deca XP plus ITMS (Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA, USA)

equipped with electrospray ionization (ESI) interface. The ESI conditions in the positive

ion mode were as follows: capillary temperature, 300

C, sheat gas flow rate, 35

(arbitrary unit), ESI source voltage, 5000V, capillary voltage, 43V, tube lens offset,

15V. Various scan ranges were used according to the molecular weights of possible

amino acid and peptides from MCLR biodegradation.

RESULTS AND DISCUSSION

LCMS detected all pure amino acids in pool derivatized with L-FDLA,

including the lower concentration tested (0.05 mM, corresponding about 50 µg/mL of

MCLR), while the detection limit of TLC was 0.5 mM. Amino acids pool dissolved in

both water and Tris-Cl buffer showed no interference in the L-FDLA derivatization and

LCMS detection performance.

In a preliminary test prior to L-FDLA derivatization, the intermediate products

(linear, tetrapeptide and Adda) arisen from EB9 in 100 µg/mL of pure MCLR could be

monitored from 0 to 48 h at 238 nm. However, only Adda-L-DLA was detected by

LC/ITMS (340 nm), when the sample was derivatized with L-FDLA. Regarding that

MCLR is degraded in different products (tetrapeptide, tripeptides, dipeptides and amino

acids), probably the concentration of each product was below the threshold of LCMS

detection. In addition, L-FDLA derivatization is better performed with small peptide

and amino acid, i.e. it does not react with linear MCLR.

Therefore the test was performed with 1mg/mL of MCLR, and the degradation

process was monitored by HPLC-PDA and confirmed by LCMS analysis in both pre

and post-L-FDLA derivatization. Figure 2 shows MCLR biodegradation carried out

with CB9 (B9 crude cell), EB9 (B9 cell extract) and WB9 (B9 washed cell), analyzed

by LCMS at 238 nm. Intermediate products as linear MCLR, Adda-Glu-Mdha-Ala and

Adda were detected in all reaction, but at different degradation rate and profile. EB9 (12

h) degraded MCLR faster than CB9 and WB9 (18 h). The EB9 and CB9 showed similar

MCLR biodegradation profile, with a tetrapeptide peak at 24h, followed by its rapid

degradation, in contrast of slow tetrapeptide degradation observed in WB9.

Advanced Marfey’s derivatization was carried out in all MCLR biodegradation

test, as well as the corresponding negative control, i.e. B9 cell incubated in water

without MCLR. Due to unavailability of unusual small peptide standards,

biodegradation products were tentatively identified comparing ion chromatogram and

selected ion monitoring (SIM) of negative control (B9) versus B9 strain+MCLR (Figure

3, 4, 5 and 7). Only the data from WB9 was feasible for further study, as in CB9 and

EB9 negative control, the LCMS analyses showed ion chromatogram with various

peaks with closed m/z of investigated peptide and amino acid (data not shown). These

interferences probably were trace peptide from medium (casein hydrolyzed peptone and

yeast extract), which was remained around B9 cell and contaminated the microtube with

MCLR in water. I.e., Sphingomonas sp. usually produces a mucilaginous

exopolysacharide biopolymer, which can adsorb culture components even though after

once Tris-Cl buffer centrifugation.

MCLR as the sole carbon and nitrogen source has been used to select MCLR-

degrading Sphingomonas sp., but microcystinase could be expressed in absence of

MCLR, indicating induction by other oligopeptides (BOURNE et al., 1996). Therefore,

this oligopeptide enzimatic cleavage can accumulate low molecular weight peptides

similar with these ones investigated. Such interference was overcome by repetitive

washing. The cell viability checking demonstrated B9 washed cells (WB9) growth after

24 h. Then, WB9 was chosen for the follow experiment. In addition, other advantage of

WB9 was the slower behavior of MCLR degradation than CB9 and EB9, which

improved monitoring of biodegradation process. Probably the repetitive washing

process retarded the transportation of biodegradation products into the cell, mainly for

tetrapeptide (Figure 2). EDTA, an ion chelator, has been applied as protease inhibitor to

improve tetrapeptide detection (Bourne et al., 1996). In our experiment we did not use

protease inhibitor, but washing process could affect ion availability for metalloprotease

activity.

Figures 3, 4, 5 and 7 show ion chromatogram and mass spectra of MCLR

biodegradation products arisen from the tetrapetide Adda-Glu-Mdha-Ala (Figure 3-5)

and tripeptide Arg-βMeAsp-Leu (Figure 7), while Figure 6 and 8 show their

biodegradation behavior along 0 to 96h.

Concerning amino acid, all 7 residue of MCLR were investigated. Due to the

closed chemical structure between D-Glu and D- βMeAsp a very carefully condition

control of the liquid chromatography was required to standardize the retention time of

each analyte. In this way, the initial pressure of LC was standardized at 90 ± 1.0 Pa.

After derivatization with L-FDLA, [L-Leu-L-DLA+H]

m/z 425.8 and both D and L

[Ala-LDA+H]

m/z 383.7 were detected in B9 (negative control) and B9+MCLR

without quantitative difference (data not shown). Fujii et al. (1997) used MCLR

hydrolyzed with 6.0 N HCl and established advanced Marfey’s method for

determination of the absolute configuration of constituent amino acid in a peptide. The

authors distinguished D-Glu and βMeAsp residue with the same molecular weight and

similar hidrophobicity. However, in our data no difference between B9 (negative

control) and B9+MCLR in m/z 441.8 ion chromatogram was observed due to the closed

retention time. The [Adda-L-DLA+H]

m/z 625.8 was detected only in B9+MC (Figure

4). Though [L-Arg-L-DLA+H]

m/z 468.9 (Figure 7) was detected in both B9 (negative

control) and B9+MCLR, the addition of MCLR increased its concentration after 48h,

indicating as MCLR biodegradation product (Figure 6). Regarding the unstable

characteristic of Mdha residue, which is spontaneously converted to methylamine

(HARADA, et al., 1990), its concentration was monitored (Figure 5 and 6).

Methylamine [CH

NH-L-DLA+H]

m/z 325.7 was detected from 48 to 96 h.

Figure 6 summarizes the MCLR biodegradation behavior of the tetrapeptide

(Adda-Glu-Mdha-Ala) with peak at 36 to 48 h (Figure 6A), and further its cleavage in

Adda (Figure 6C) and tripeptide Glu-Mdha-Ala (Figure 6D) as the major degradation

route. This tripeptide (Figure 6D) was cleaved to dipetides Glu-Mdha (Figure 6E) and

Mdha-Ala (Figure 6F). The last dipetide [Mdha-Ala-L-DLA+H]

m/z 467.0 was the

major component with peak at 24 h, followed by decrease due to Mdha appearance

(Figure 6F), indicated by methylamine increase from 48 to 96h (Figure 6G).

Regarding that [Adda-Glu-Mdha-L-DLA+H]

m/z 839.0 was detected

at low

concentration (Figure 6 B), and its putative dipeptide [Adda-Glu-L-DLA+H]

was not

detected, the main tetrapeptide cleavage route would be at Adda-Glu peptide bond in B9

strain.

We first detected the tripeptide [Arg-βMeAsp-Leu-L-DLA+H]

m/z 711.1 as

one of direct biodegradation product from MCLR (Figure7A and 8A), and its dipeptide

[Arg-βMeAsp- L-DLA+H]

m/z 597.8 (Figure 7B and 8B), while the βMeAsp-Leu was

not detected. Therefore, the B9 strain hydrolyses the βMeAsp-Leu peptide bond,

followed by immediate intake of L-Leu as nitrogen and carbon source. Even though

negative control showed same [Arg-βMeAsp- L-DLA+H]

ion peak at m/z 597.8, its

intensity was lower (7.38E6) than B9+MCLR (4.34E8) (Figure 7B). This peak was not

detected in the previous ion chromatogram of negative control, and then the possibility

of equipment contamination should not be discarded.

Concerning the tripeptide Arg-βMeAsp-Leu, its putative βMeAsp-Leu was not

detected, therefore Arg-βMeAsp arisen was the major route, with its peak at 24 h,

followed by decrease due to [L-Arg L-DLA+H]

m/z 468.9 (Figure 7C) increase from

48h to 96h (Figure 8C).

Summarizing, biodegradation kinetics indicated that both tetrapeptide and

tripeptide were synchronically arisen with higher detection at 24 h. Afterward, the

succeeding enzymatic cleavage released free unusual and L- amino acid residues, which

can be used as N and C source.

The breakdown of cyclic MCLR decreased the toxicity in 160-fold (linear

MCLR) and 20-fold (tetrapeptide) and the protein phosphatase ininhition activity was

preserved by the interaction involving Adda side chain, glutamate and covalent bind

between Mdha and cysteine residue of protein phosphatase (BOURNE et al., 1996;

2001). Our data demonstrated the MCLR degradation until non-toxic amino acids

residue by B9 strain, where the initial pathway was similar with Sphingomonas ACM-

3962 (BOURNE et al., 1996; 2001).

Figure 9 summarizes the sequential cyclic MCLR breakdown started at Adda-

Arg peptide bond cleavage, with opening of the ring producing a linear MCLR (Adda-

Glu-Mdha-Ala-Leu-βMeAsp-Arg). Rupture at Ala-Leu linkage provides tetrapeptide

(Adda-Glu-Mdha-Ala) and tripetide (Arg-βMeAsp-Leu). The first mainly products of

tetrapeptide are Adda and Glu-Mdha-Ala tripeptide, which is cleaved to dipeptides

(Glu-Mdha and Mdha-Ala). The main biodegradation product from the tripeptide (Arg-

βMeAsp-Leu) was the Arg-βMeAsp dipeptide. Detection of methylamino-L-LDA and

L-Arg-L-DLA in the later stage settled up the MCLR degradation pathway.

The mlrA gene, which codifies the enzyme MlrA synthesis is conserved at least

three different bacterial species, and it has been detected in MC degraders but not to the

all Sphingomonas, suggesting that MC degradation gene was acquired during evolution

of Sphingomonas (SAITO et al., 2003).

The mlrA gene was confirmed in B9 strain, the identification of complete cluster

involved in MCLR degradation must be confirmed. B9 strain hydrolyzes toxic MCs as

well as non-toxic cyanobacteria peptide (KATO et al., 2006). The identification of

intermediated and final products of MCLR would be an important tool to understand a

very unique hydrolytic activity. In order to understand the MCLR degrading ability of

B9 strain, the isolation of the MC degrading enzymes is also in course, to complete this

study. The explanation of the B9 and other MC-degrading microorganism function and

role in the natural environment is required. Bacteria, as B9 strain may contribute to the

detoxification of the ecosystem, and the understanding of the mechanism for this

process would facilitate overcoming pollution problems.

Figure 2 - MCLR Biodegradation process by B9 crude cell, B9 cell extract and B9

washed cell, analyzed by HPLC and confirmed with LCMS at 238 nm UV detector.

CB9

EB9

WB9

Figure 3 - Selected ion chromatogram and mass spectra of MCLR degradation products:

tetrapeptide and tripeptides derivatized with L-FDLA.

Figure 4 - Selected ion chromatogram and mass spectra of MCLR degradation product:

Adda and Glu-Mdha and Mdha-Ala derivatized with L-FDLA.

Figure 5 - Selected ion chromatogram and mass spectra of N-Methyl derivatized with L-

FDLA, from Mdha residue.

Figure 6 - B9 strain biodegradation behavior of Adda-Glu-Mdha-Ala tetrapeptide from

MCLR.

Adda-Glu-Mdha-L-DLA

0,E+00

3,E+07

5,E+07

0 6 12 18 24 36 48 7 2 96

Time (h)

Area

Mdha-Ala-L-DLA

0,E+00

1,E+08

2,E+08

0 6 12 18 24 36 48 7 2 96

Time (h)

Area

Adda-Glu-Mdha-Ala-L-DLA

0,E +00

3,E +07

6,E +07

0 6 12 18 24 36 48 7 2 96

Time (h)

Are

CH3-NH-L-FDLA

0,E+00

2,E+08

4,E+08

0 6 12 18 24 36 48 72 96

Time (h)

Area

Glu-Mdha-A la-L-FD LA

0,E+00

1,E+09

3,E+09

0 6 12 18 24 36 48 72 96

Time (h)

Area

0,E+00

7,E+07

1,E+08

0 6 12 18 24 36 48 72 96

Time (h)

Glu-Mdha-L-FDLA

Adda-L-DLA

0,E +00

8,E +07

2,E +08

0 6 12 18 24 36 48 7 2 96

Time (h)

Area

E F

Figure 7 - Selected ion chromatogram and mass spectra of Arg-βMeAsp-Leu, Arg-

βMeAsp and Arg derivatized with L-FDLA.

Figure 8 - B9 strain biodegradation behavior of Arg-βMeAsp-Leu tripeptide from

MCLR.

Arg-BMeAsp-L-DLA

0,E+00

2,E+10

3,E+10

0 6 12 18 24 36 48 72 96

Time (h)

Area

Arg-L-DLA

0,E+00

5,E+08

9,E+08

0 6 12 18 24 36 48 72 96

Time (h)

Area

Arg-BMeAsp-Leu-L-FDLA

0,E+00

4,E+07

8,E+07

0 6 12 18 24 36 48 72 96

Time (h)

Area

A B

Figure 9 – MCLR biodegradation pathway using B9 washed cell.

OCH

COOH

O COOH O

OCH

O COOH

MlrA

MlrB

linear MCLR

Adda

βMeAsp-Arg

O COOH O

COOH

OCH

O COOH

O COOH O

COOH

Arg

COOH

N N

COOH O

COOH

Leu-βMeAsp-Arg

Mdha

Mdha-Ala

Glu-Mdha

Glu-Mdha-Ala

Adda-Glu-Mdha-Ala

COOH

MCLR

100

5.1. PUBLICAÇÃO E TRABALHOS CIENTÍFICOS

Os resultados obtidos no transcurso da pesquisa foram apresentandos em

eventos, visando publicação na forma de artigo científico, revisão, capítulo de livro listados

abaixo:

Publicação de revisão:

HASHIMOTO, E. H., BITTENCOURT-OLIVEIRA, M. C., HIROOKA, E. Y. Risco de

Microcystis spp toxigênica no cenário de piscicultura brasileira. Biosaúde. 1/2 (5), 69-81,

2003.

Capítulo de livro

HASHIMOTO, E.H.; COLUS, I.M.S; BITTENCOURT-OLIVEIRA, M.C; ITANO, E.;

BRACARENSE, APFL; UENO, Y., HARADAK-I; HIROOKA, E.Y. Biomonitoring assay

in analysis of Co-occurring Microcystin and Aflatoxin in Aquaculture. Proceeding of XII

International IUPAC Mycotoxins and Phycotoxins ed. Istambul- Turkey : IUPAC, 2007,

v.1. (enviado)

Apresentação oral:

HASHIMOTO, E.H., Biodegradação de microcistina-LR: elucidação de mecanismo e

caracterização de metabólitos intermediários. XXIV Congresso Brasileiro de

Microbiologia. 03-06 de outubro de 2007. Brasília-DF. Convite para participação em Mesa

redonda sobre Ficotoxinas.

HASHIMOTO, E.H.; COLUS, I.M.S; BITTENCOURT-OLIVEIRA, M.C; ITANO, E.;

BRACARENSE, APFL; UENO, Y., HARADA, K-I; HIROOKA, E.Y. Biomonitoring

assay in analysis of Co-occurring Microcystin and Aflatoxin in Aquaculture. In: XII

International IUPAC Mycotoxins and Phycotoxins ed. Istambul- Turkey : IUPAC, 2007.

HASHIMOTO, E.H., TRAD, A.P.M.S., KAMOGAE, M., BITTENCOURT-OLIVEIRA,

M.C., BRACARENSE, A.P.F.R.L., KAWAMURA, O., TSUTSUMI, T., NAGATA, S.,

HARADA, K-I., UENO, Y., HIROOKA, E.Y.,

Detecção de microcistina em tilápias

expostas a extrato de Microcystis aeruginosa. XI Reunião da Sociedade Brasileira de

Ficologia, Itajaí-SC, 2006.

HASHIMOTO, E.H., PÁUDA, C.G., BRACARENSE, A.P.F.R., BITTENCOURT-

OLIVEIRA, M.C., ONO, E.Y.S. HARADA, K-I, HIROOKA, E.Y.

. Interação Aflatoxinas-

Fumonisinas e Microcistinas. XI Encontro Nacional de Micotoxinas. Piracicaba-SP, 2004.

101

Apresentação de Poster:

HASHIMOTO, E, H., KATO, H. TSUJI, K, KAWASAKI, Y., HIROOKA, E.Y.,

HARADA, K.-I. Elucidation of a Biodegradation Mechanism of Microcystin-LR Using

Advanced Marfey’s Method. 7

ICTC International Conference on Toxic

Cyanobacteria. 5-10 August 2007. Angra dos Reis-RJ, Brasil..

HASHIMOTO, E.H., VANZELLA, T.P., SCHIAVO, L., SANTOS, A.P.M.,

FRANCABANDIERA, A.I., BRACARENSE, A.P.F.R., BITTENCOURT-OLIVEIRA,

M.C., CAETANO FILHO, M., FROSSARD, H., HARADA, K-I., UENO, Y., COLLUS, I.

M. S., HIROOKA, E.Y.

Genotoxicidade de Microcystis aeruginosa em Tilápia. XI

Reunião da Sociedade Brasileira de Ficologia, Itajaí-SC, 2006.

HASHIMOTO, E.H., VANZELLA, T.P., SCHIAVO, L., SANTOS, A.P.M.,

FRANCABANDIERA, A.I., BRACARENSE, A.P.F.R., BITTENCOURT-OLIVEIRA,

M.C., HARADA, K-I., UENO, Y., COLLUS, I. M. S., HIROOKA, E.Y.

Análise da

genotoxicidade oriunda da interação aflatoxina e Microcystis aeruginosa em tilápias

(Oreochromis niloticus). IX Congresso Brasileiro de Ecotoxicologia, 2006, São Pedro/SP.

HASHIMOTO, E. H., KAMOGAE, M., BRACARENSE, A. P. F. R. L., LONCAR, M.,

BITTENCOURT-OLIVEIRA, M. C., HIROOKA, E. Y. Marcação imuno-histoquímica de

microcistina em fígado de tilápia (Oreochromis niloticus) In: VI Congresso Londrinense

de Biologia Aplicada a Saúde, 2004, Londrina-PR. Revista Biosaúde. 2004.

HASHIMOTO, E. H., PADUA, C. G., KAMOGAE, M., YABE, M. J. S., IMANISHI, S.,

UENO, Y., HARADA, K- I., HIROOKA, E. Y. Monitoramento de microcistinas e

eutrofização em águas de pesqueiros na região de Londrina, Norte do Paraná In: XXII

Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2003, Florianópolis-SC.

102

6. CONCLUSÃO

O ensaio de cometa e micronúcleo e imunoistoquímica mostraram-se favoráveis e

aplicáveis para monitoramento de efeitos de genotoxicidade e detecção de AFB

Microcystis aeruginosa em tilápias (O. niloticus). A combinação desses ensaios biológicos

sem a necesidade de equipamentos sofisticados se mostrou adequada e vantajosa para

monitorar e minizar os riscos de contaminantes na cadeia alimentar.

O isolamento de microrganismos com atividade anti-cianobactéria apontou as

florações de cianobactéria na ETE - São Lourenço Londrina, como ambiente favorável para

seleção de antagonistas, devido à alta competitividade e carga microbiana deste meio. O

trabalho preliminar abriu perspectivas para seleção de um potente antagonista adaptado às

condições tropicais com requisitos adequados para aplicação em biocontrole.

A detecção de aminoácidos e peptídeos, como produtos de biodegradação de MCLR

pela cepa B9, representa uma ferramenta importante para o estudo de degradação de

cianotoxinas. Este estudo contribui para compreensão da complexa dinâmica de produção e

detoxificação de microcistina no ecossistema.

103

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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