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Dissertação apresentada para obtenção do gra
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de mestre do Programa de Pós-Graduação e
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Genética, do Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas da Universidade Estadual
Paulista – IBILCE/UNESP
Orientador: Prof. Dr. José Osmar Gaspar
São José do Rio Preto
2007
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1. Fitopatologia. 2. Fitovirologia. 3. Sobemovirus. 4. Genomas -
Seqüenciamento. I. Gaspar, José Osmar. II. Universidade Estadual
Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas III. Título.
CDU – 581.2
71 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: José Osmar Gaspar
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulsta,
Instituto de Biociências, Letras e Ciên cias Exatas
Ozato Junior, Tadaiti.
Sequenciamento do genoma do Southern bean mosaic virus, isolado
São Paulo, expressão da porção C-terminal da polimerase e produção
de anti-soro policlo nal / Tadaiti Ozato Junior. – São José do Rio
Preto: [s.n.], 2007.
4
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Fitovirologia, departamento de Zoologia-Botânica do
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São
José do Rio Preto (IBILCE), Universidade Estadual
Paulista (UNESP), com auxílio-bolsa CAPES.
5
Tadaiti Ozato Junior
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COMISSÃO JULGADORA
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE
Presidente e Orientador: ______________________________________________
Prof. Dr. José Osmar Gaspar
2º Examinador: ______________________________________________
Profª. Dra. Claudia Regina Bonini Domingos
3º examinador: ______________________________________________
Prof. Dr. Eliezer Rodrigues de Souto
São José do Rio Preto, 16 de fevereiro de 2007.
6
Dedico este trabalho:
Aos meus pais Tadaiti Ozato e Sonia Regina Ozato, a minha irmã
Thamy Ozato que são a minha vida e o motivo de eu estar aqui.
Aos meus amigos quase irmãos
Newton Kenji Nagoshi e Daniel Kiyoshi Nagoshi por me apoiarem
com suas amizades preciosas.
Ao meu orientador Prof. Dr. José Osmar Gaspar
Que me deu a oportunidade de pesquisar, me mostrando novos
rumos. Sempre me deixou livre para fazer as opções, mas com a
certeza de que confiava no meu trabalho e disposto a me corrigir
sempre que necessário. O senhor representa o que é ser Orientador.
Obrigado
Vocês são muito especiais e preciosos.
Vencemos juntos!
7
AGRADECIMENTOS
Agradeço em especial ao meu orientador Prof. Dr. José Osmar Gaspar pela
oportunidade, orientação, imensa paciência e exemplo de profissionalismo.
Aos membros participantes da banca examinadora: Profª. Dra. Claudia
Regina Bonini Domingos e ao Prof. Dr. Eliezer Rodrigues de Souto.
Ao Prof. Dr. Jorge A. M. Rezende pela ajuda na obtenção do anti-soro.
Aos professores da pós-graduação em Genética que me ajudaram muito e
colaboraram bastante para o meu crescimento acadêmico.
À coordenadora da pós em genética Maria Tercília Vilela de Azeredo
Oliveira e à vice-coordenadora Claudia Regina Bonini Domingos.
À direção do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE)
de São José do Rio Preto pelo fornecimento de recursos materiais.
Aos funcionários do IBILCE que de forma direta ou indireta me ajudaram
na realização deste trabalho.
Aos meus amigos de laboratório: Ana Cecília Bergamim Pereira (Aninha),
Lívia José Regatieri (Biston) e Ricardo Barros Mariuti (Tetchukine) que ajudaram
no afazeres do laboratório e me agüentaram nas horas mais difíceis da minha
pesquisa. Ao Luiz Gustavo Gardinassi (Bradock) que me ajudou muito no
seqüenciamento.
À Priscila Belintani que por meio dela pude conhecer muitas dessas
pessoas e graças a ela que me deu a oportunidade de iniciar na pesquisa. Minha
eterna orientadora.
Aos meus amigos sempre fiéis Lisandra (Lis), Júlio Borges (Prof. Dr.) e
Mário (Dr.) que sempre estiveram ao meu lado durante todo esse tempo e me
auxiliaram nas horas mais difíceis com a amizade e opiniões.
À CAPES pelo auxílio financeiro concedido para o desenvolvimento deste
trabalho.
E a Deus que torna tudo possível!
8
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO......................................................................................................
9
OBJETIVOS...........................................................................................................
21
MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................
22
RESULTADOS ......................................................................................................
32
DISCUSSÃO...........................................................................................................
56
CONCLUSÃO........................................................................................................
60
RESUMO................................................................................................................
61
ABSTRACT............................................................................................................
62
BIBLIOGRAFIA.................................................................................................... 63
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O feijão (Phaseolus vulgaris L.), leguminosa comum da família das
fabaceas (Leguminoseae) (CRONQUIST, 1981), constitui uma das culturas mais
importantes existentes, sendo consumida por todo o mundo, devido
principalmente ao seu valor nutritivo. A cultura do feijão no Brasil assume um
grande valor social, pois constitui a base da alimentação da população, sendo
fonte de proteína vegetal de baixo custo. A dupla arroz com feijão é o prato
principal na alimentação da maioria da população brasileira (CULTURA, 2000).
Dados da última safra (2004/2005) mostram que o Brasil produziu cerca de 2,9
milhões de toneladas de feijão, sendo a região sudeste a maior produtora
(CONAB, 2006).
A produtividade da cultura é grandemente afetada pela ocorrência de
doenças que diminuem sensivelmente a produção e, conseqüentemente, reduzem a
sua oferta, provocando um aumento nos preços de mercado (CULTURA, 2000).
Estas doenças têm exercido um papel relevante na baixa produtividade de
feijoeiros no Brasil e em outros países latino-americanos (JAYASINGHE, 1982;
COSTA & COSTA, 1983). As mais numerosas são ocasionadas por fungos
seguindo-se as de etiologia viral, várias com expressiva importância econômica
(GAMEZ, 1977).
No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro (COSTA et al.,
1972; BIANCHINI et al.,1997), citando-se aquela causada pelo Southern bean
mosaic virus (SBMV), do gênero Sobemovirus (HULL & FARGETTE, 2005).
Este vírus tem uma restrita gama de hospedeiras, confinada quase que
exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo algumas de interesse
econômico como o feijoeiro comum e a soja. Muito embora o SBMV não seja no
momento um problema fitossanitário, observações de campo no Estado do Paraná
têm indicado a sua presença em infecções mistas principalmente com o Bean
golden mosaic virus (Gênero Begomovirus, Família Geminiviridae), levando à
possibilidade de possíveis problemas futuros para a cultura do feijoeiro
(BIANCHINI, A. Comunicação pessoal).
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O nome Sobemovirus é originado das iniciais da espécie tipo do gênero
Southern bean mosaic virus e o gênero compreende 13 espécies definitivas, sendo
elas: Blueberry shoestring virus (BSSV), Cocksfoot mottle virus (CoMV),
Lucerne transient streak virus (LTSV), Rice yellow mottle virus (RYMV),
Ryegrass mottle virus (RGMoV), Sesbania mosaic virus (SeMV), Solanum
nodiflorum mottle virus (SNMoV), Southern bean mosaic virus (SBMV),
Southern cowpea mosaic virus (SCPMV), Sowbane mosaic virus (SoMV),
Subterranean clover mottle virus (SCMoV), Turnip rosette virus (TRoV) e Velvet
tobacco mottle virus (VTMoV) (HULL & FARGETTE, 2005). As espécies
SBMV e SCPMV eram a princípio consideras como isolados do SBMV
(respectivamente isolados feijão e caupí) (FAUQUET & MAYO, 1999). Há ainda
quatro possíveis espécies no gênero, cujas características são similares aos
sobemovírus, mas que necessitam de informações adicionais para serem incluídas.
São elas: Cocksfoot mild mosaic virus (CMMV), Cynosurus mottle virus
(CnMoV), Ginger chlorotic fleck virus (GCFV) e Rottboellia mottle virus
(RoMoV) (HULL & FARGETTE, 2005).
A maioria das espécies dos sobemovírus apresenta distribuição geográfica
limitada, mas algumas espécies são encontradas em várias partes do mundo
(HULL, 1988). Os sobemovírus infectam plantas tanto mono quanto
dicotiledôneas, mas a gama de hospedeiras de cada espécie é relativamente
restrita. Os sintomas induzidos são principalmente mosaico e mosqueado e, em
geral, causam infecção sistêmica invadindo quase que todos os diferentes tipos de
tecidos das plantas hospedeiras (HULL, 1988). São transmitidos mecanicamente,
por vetores e por sementes. Para a maioria das espécies (CoMV, RYMV,
SNMoV, SBMV, SCPMV, TRoV) a transmissão é feita por coleópteros enquanto
o BSSV é transmitido por afídeos, o VTMoV por mirídios e o SoMV por dípteros,
homópteros e hemípteros (HULL, 1988; TAMM & TRUVE, 2000b).
11
B. ORGANIZAÇÃO DO GENOMA
Os sobemovírus possuem partículas isométricas (28-30nm) contendo RNA
genômico de 4-4,5kb com polaridade positiva e proteína capsidial com massa
molecular de 29-30 kDa (SHEPHERD, 1971; SEHGAL, 1981). Uma pequena
proteína denominada de proteína ligada ao genoma viral (“viral genome linked-
protein”,VPg) é covalentemente ligada à extremidade 5' do RNA enquanto a
extremidade 3' é destituída de cauda poliadenilada (GHOSH et al., 1979). Existe
também, um RNA subgenômico de aproximadamente 1,0 Kb responsável pela
tradução da proteína capsidial (RUTGERS et al., 1980; GHOSH et al., 1981).
O genoma dos sobemovírus possui quatro cadeias abertas de leitura
(“Open reading frame”, ORF) (Figura 1). Todos os sobemovírus seqüenciados
contêm uma pequena ORF1 na extremidade 5’-terminal do genoma, que codifica
a possível proteína do movimento célula-a-célula, e uma ORF4 na extremidade
3’-terminal que codifica a proteína capsidial. Com base nas diferenças de
organização na parte central do genoma (que codifica uma poliproteína), os
sobemovírus podem ser divididos em dois grupos: aqueles semelhantes ao
SCPMV e aqueles semelhantes ao CoMV. A poliproteína do SCPMV é codificada
por uma longa e contínua ORF2, contendo também uma região codificadora
interna, ORF3. Organização semelhante do genoma já foi descrita para o isolado
Arkansas do SBMV (SBMV-Ark) (LEE & ANDERSON, 1998), isolado “Ivory
Coast” do RYMV (RYMV-CI) (YASSI et al., 1994) e LTSV (FEFFRIES et al.,
GenBank U31286).
Por outro lado, na organização genômica do CoMV falta a ORF2 contínua
e uma região codificadora similar à ORF3 do SCPMV. Em vez disso, CoMV
possui duas ORFs sobrepostas, ORF2a e ORF2b, e a poliproteína é expressa
através de um mecanismo de mudança de fase (“frameshift”) ribossomal -1
(MÄKINEN et al., 1995; RYABOV et al., 1996).
12
Figura 1: Organização genômica do Southern caupi mosaic virus (SCPMV) e Cocksfoo
A única exceção com relação a esta subdivisão dos sobemovírus é o
genoma do SBMV seqüenciado por Othman & Hull (1995). Neste, as ORFs 1, 2 e
4 não se sobrepõem como acontece com o SBMV-Ark e SCPMV (Figura 2).
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mottle vírus (CoMV); (•): VPg, proteína covalentemente ligada à extremidade 5’-terminal.
Figura 2: Organização do genômica do Southern bean mosaic virus descrito por Hull &
Fargette (2005), (•): VPg, proteína covalentemente ligada à extremidade 5’-terminal.
Diferentemente do SBMV, o isolado SBMV-Ark contém quatro ORFs que
se sobrepõem, tornando-o mais similar em organização genômica (mas não em
seqüência de aminoácidos de suas proteínas) ao SCPMV (LEE & ANDERSON,
1998). Foi proposto que essa diferença na organização genômica entre o SBMV e
SMBV-Ark resulta ou de mutações ou de erro no seqüenciamento do SBMV.
C. CITOPATOLOGIA
Os efeitos citopáticos mais evidentes causados por espécies de
sobemovírus são a distribuição das partículas virais no citoplasma e a formação de
grandes agregados cristalinos no citoplasma e vacúolos (FRANCKI et al., 1985).
As células infectadas mostram extensa vacuolização citoplasmática, sendo que
algumas espécies invadem células do floema e xilema (SBMV, RYMV) e
partículas virais podem também ser encontradas em membranas das pontuações
das paredes primárias (RYMV) (DE ZOETEN & GAARD, 1969; OPALKA et al.,
1998; WEINTRAUB & RAGETLI, 1970). Partículas virais são também
13
encontradas no núcleo celular de plantas infectadas por sobemovírus. Yassi et al.
(1994) verificaram que a parte N-terminal da proteína capsidial do RYMV contém
uma seqüência que é idêntica ao “motivo de localização nuclear do tipo bipartido”
(DINGWALL & LASKEY, 1991). Um motivo similar foi encontrado na região
N-terminal da capa proteica de vários outros sobemovírus (MÄKINEN et al.,
1995). Estes resultados podem explicar a presença de partículas virais dos
sobemovírus no núcleo celular durante o processo de infecção. Fora estas
observações, nenhum determinante molecular tem sido associado com a
localização tecido-específica ou subcelular das partículas dos sobemovírus. Nada
é conhecido sobre a localização subcelular das proteínas não estruturais deste
gênero (TAMM & TRUVE, 2000b).
D. PRODUTOS GÊNICOS E SUAS POSSÍVEIS FUNÇÕES
Os RNAs de vários sobemovírus já foram traduzidos in vitro em sistemas
de “lisado de reticulócitos de coelho” e de “extrato de germe de trigo”. Os RNA
do SBMV e SCPMV induziram a tradução de quatro proteínas nesses sistemas:
105 kDa, 75 kDa, 29 kDa e 14 kDa para o SBMV e 100 kDa, 70 kDa, 30 kDa e 20
kDa para o SCPMV (MANG et al., 1982; SALERNO-RIFE et al., 1980). Quatro
polipeptídeos foram também traduzidos a partir dos RNA do CoMV (MÄKINEN
et al., 1995), LTSV (MORRIS-KRSINICK & FORSTER, 1983), SNMoV
(KIBERSTIS & ZIMMERN, 1984) e TRoV (MORRIS-KRSINICK & HULL,
1981), apresentando somente ligeiras diferenças na massa molecular.
Estudos têm demonstrado que as proteínas de 100 e 70 kDa do SCPMV
são relacionadas e traduzidas a partir do RNA genômico enquanto a proteína de
20 kDa é presumivelmente codificada pela ORF1 (MANG et al., 1982; WU et al.,
1987). Já a poliproteína codificada pela ORF2 do SCPMV é processada por
clivagem proteolítica para dar o produto de tradução de 70 kDa (WU et al., 1987).
A proteína de 30 kDa (proteína capsidial) é traduzida a partir de um pequeno
RNA subgenômico (sgRNA) que já foi encontrado em tecidos infectados por
sobemovírus bem como em partículas virais (RUTGERS et al., 1980; WEBER &
SEHGAL, 1982; RYABOV et al., 1996; TAMM et al., 1999). Estudos com o
14
CoMV, utilizando a síntese de proteínas in vitro e imunoprecipitação com
anticorpos específicos, mostraram que as proteínas de 12 kDa, 71 kDa e 100 kDa
são sintetizadas a partir do RNA genômico do vírus. A proteína 12 kDa é
produzida a partir da ORF1, a proteína 71 kDa a partir da ORF2a e a 100 kDa é a
poliproteína produzida a partir das ORFs 2a e 2b. A proteína de 34 kDa (proteína
capsidial) é produzida a partir de um sgRNA. A seguir, os produtos gênicos
individuais, seus mecanismos de expressão e possíveis funções são mais
detalhados.
D.1. Proteína P1.
Todos os sobemovírus caracterizados codificam uma pequena proteína a
partir da ORF1, mas estas apresentam seqüências e massas moleculares diferentes
(11,7 a 24,3 kDa) e não são relacionadas com qualquer outra proteína conhecida.
Análises de mutantes incapazes de produzir P1 ou mutantes produtores de
proteínas truncadas indicaram que a P1 do RYMV ou SCPMV não é necessária
para a replicação viral, porém é necessária para o movimento célula-a-célula e
movimento sistêmico (BONNEAU et al., 1998; SIVAKUMARAN et al., 1998).
Proteína P1 recombinante do CoMV foi capaz de interagir com RNA de fita única
(ssRNA) numa maneira independente da seqüência (TAMM & TRUVE, 2000a).
Assim, levando-se em conta que nenhum outro produto gênico dos sobemovírus
estaria relacionado com o movimento célula-para-célula ou movimento sistêmico
do vírus, é proposto que a proteína P1 representa a proteína do movimento dos
sobemovírus. Foi também descrito que a proteína P1 do RYMV funciona como
supressora do mecanismo de silenciamento gênico (“posttranscrptional gene
silencing”, PTGS) (VOINNET et al., 1999).
D.2. Poliproteína
Os sobemovírus caracterizados codificam uma proteína com massa
molecular de cerca de 100 kDa. As estruturas genômicas do SBMV, SBMV-Ark,
SCPMV, RYMV e LTSV permitem a síntese desta proteína a partir de uma única
ORF contínua. Por outro lado, a metade C-terminal da poliproteína do CoMV e
15
RYMV é codificada por uma ORF2b separada e é traduzida como parte da
poliproteína pelo mecanismo de mudança de fase (“frameshift”) ribossomal -1
(MÄKINEN et al., 1995). A tradução da poliproteína dos sobemovírus não é
iniciada a partir de RNA subgenômico (nunca detectado em tecidos infectados),
mas sim a partir do próprio RNA genômico. Assim, as ORFs 1 e 2 são traduzidas
a partir de seus respectivos códons de iniciação AUG. Produtos de tamanho
esperado de ambas as ORFs foram observados após tradução dos RNAs
genômicos do SCPMV (SIVAKUMARAN et al., 1998) e do CoMV (TAMM et
al., 1999). Na poliproteína dos sobemovírus, pelo menos três domínios funcionais
podem ser encontrados: um para serino protease, um para VPg e um para RNA
polimerase dependente de RNA (RpRd) (GORBALENYA et al., 1988; LEE &
ANDERSON, 1998; MÄKINEN et al., 1995; OTHMAN & HULL, 1995;
RYABOV et al., 1996; WU et al., 1987; YASSI et al., 1994). Não é ainda
conhecido se estas são as únicas funções da poliproteína.
D.2.a. Serino Protease
A possível protease é similar às cisteína proteases encontradas nos
picornavírus (Família Picornaviridae) e é característica de todos os sobemovírus,
polerovírus (Família Luteoviridae), Pea enation mosaic virus (PEMV, Gênero
Enamovirus) e Mushroom bacilliform virus (MBV, Gênero Barnavirus). O
motivo serino protease está localizado no terço N-terminal da poliproteína
codificada pela ORF2 do SBMV, SBMV-Ark, SCPMV, RYMV e LTSV e é
codificada pela ORF2a no caso do CoMV (GORBALENYA et al., 1988). O
possível sítio catalítico H-D-S (Histidina, posição 181-Ácido Aspártico, posição
216-Serina, posição 284) encontrado no SCPMV é também conservado no SeMV
e outros sobemovírus (LOKESH et al., 2001). Mais recentemente, foi
demonstrado que a serino protease do SeMV possui atividade proteolítica atuando
em cis e trans, além de possuir possíveis hélices que estariam associadas à ligação
com membranas (SATHESHKUMAR et al., 2004). Com exceção do LTSV,
todos os produtos da ORF2 dos sobemovírus mostraram a presença de tais hélices
sugerindo que elas podem ter função de ligação às membranas. Em muitos vírus
16
de RNA de polaridade positiva, foi observado que a replicação e montagem das
partículas virais ocorrem em associação com membranas (CARETTE et al., 2002;
DEN BOON et al., 2001).
D.2.b. Proteína ligada ao genoma (“viral genome-linked protein”, VPg)
Uma proteína de 12 kDa foi descrita como covalentemente ligada à região
5’-terminal do genoma do SBMV (GHOSH et al., 1981) e uma de 10 kDa ligada
ao genoma do SCPMV (MANG et al., 1982). A posição da região codificadora da
VPg no genoma dos sobemovírus difere daquela que é característica de muitas
famílias de vírus de RNA, incluindo-se Picornaviridae e Comoviridae, isto é,
VPg-Protease-RpRd (KOONIN & DOLJA, 1983). No caso dos sobemovírus a
seqüência dentro da poliproteína é Protease-VPg-RpRd, similar ao também
encontrado no Potato leaf-roll virus (Gênero Polerovirus), PEMV e MBV
(REVILL et al., 1999; VAN DER WILK et al., 1989; WOBUS et al., 1998).
Em todas as espécies de vírus desse gênero, as proteínas VPg possuem
uma seqüência conservada de aminoácidos (WAD ou WGD; W= Triptofano, A=
Alanina, D, Ácido aspártico; G= Glicina) seguida de uma região rica em D ou E
(E= Ácido glutâmico) (MÄKINEN et al., 1995), sendo que este motivo é a única
seqüência conservada entre as proteínas VPg dos sobemovírus (VAN DER WILK
et al., 1997; 1998).
D.2.c. RNA polimerase dependente de RNA (RpRd)
A região C-terminal da poliproteína dos espécies virais desse gênero
codifica uma possível RpRd com base na presença do motivo GDD e de motivos
conservados que a este circundam e que são característicos das RNA polimerases
dependentes de RNA (KOONIN, 1991; KOONIN & DOLJA, 1983). As possíveis
RpRd dos sobemovírus mostram extensivas similaridades com RdRp de vários
outros vírus de RNA de polaridade positiva, tais como polerovírus, enamovírus e
barnavírus (TAMM & TUVE, 2000b).
Relativamente pouco é conhecido sobre os sinais de replicação necessários
para o início da síntese das fitas de polaridade positiva e negativa dos
17
sobemovírus. Seqüências similares foram encontradas na porção inicial da região
5’-terminal de vários sobemovírus, variando de ACAAAA, ACAAA e
CACAAAA (HACKER & SIVAKUMARAN, 1997; LEE & ANDERSON, 1998;
YASSI et al., 1994). Estes resultados indicam que RNA genômicos e
subgenômicos dos sobemovírus iniciam com seqüências muito similares e que
provavelmente são importantes para a replicação viral. Seqüências similares
foram também encontradas na região 5’-terminal do RNA genômico e
subgenômico do Red clover necrotic mosaic virus (Gênero Dianthovírus, Família
Tombusviridae) (XIONG & LONMEL, 1989; ZAVRIEV
18
D.4. Proteína capsidial
As proteínas da capa dos sobemovírus são codificadas pelas ORFs
localizadas nas ORFs 3’-terminais, seja a ORF4 no caso dos genomas do tipo
SCPMV ou ORF3 para o tipo CoMV (HULL & FARGETTE, 2005). No genoma
do SCPMV o sítio de ligação da proteína capsidial é localizado na região
codificadora da protease na ORF2 (WU et al., 1987). Nos sobemovírus, esta é a
região mais conservada dentro da ORF2. Entretanto, estes dados não demonstram
diretamente que a ligação da proteína capsidial nesta região serve para a
montagem das partículas do SCPMV (HACKER, 1995).
Estudos com diversos sobemovírus têm indicado que a proteína capsidial é
essencial tanto para o movimento célula-a-célula como para o movimento
sistêmico do vírus (BRUGIDOU et al., 1995; SIVAKUMARAN et al., 1998).
Além disso, evidência direta que a proteína capsidial determina a gama de
hospedeiras sistêmicas dos sobemovírus foi obtida pela caracterização de um
mutante de quebra de resistência do SBMV-Ark, o SBMV-S (LEE &
ANDERSON, 1998). O SBMV-S é capaz de infectar sistemicamente cultivares de
feijão onde o tipo selvagem SBMV-Ark infecta apenas localmente. Análises do
genoma indicaram 7 diferenças nas seqüências dos genomas mas apenas 4
mudanças na seqüência de aminoácidos deduzidos. Três dessas mudanças foram
identificadas na proteína capsidial podendo ter um efeito na interação RNA-
proteína capsidial, necessária para a correta montagem e desmontagem das
partículas e, desse modo, determinar o movimento a longa distância do vírus na
planta hospedeira.
III. O Southern bean mosaic virus no Brasil
O nome Southern bean mosaic virus deve-se ao fato de o vírus ter sido
primeiramente descrito infectando feijoeiros na região sul dos Estados Unidos da
América (ZAUMEYER & HARTER, 1942). Atualmente, sabe-se que o SBMV
apresenta-se amplamente disseminado, sendo encontrado também em outros
países como México, Nicarágua, Venezuela, Gana, Nigéria, Senegal, França,
19
Índia, Paquistão e Espanha (HULL & FARGETTE, 2005; TAMM & TRUVE,
2000b, VERHOEVEN et al., 2003 e SEGUNDO et al., 2004).
No Brasil, um isolado do SBMV foi detectado pela primeira vez no
Distrito Federal (SBMV-DF) (CUPERTINO et al., 1982) e, posteriormente, mas
ainda nos anos 80, foi também encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP)
(COSTA, A. S., Dados não publicados).
Os besouros crisomelídeos Diabrotica speciosa e Ceratoma arcuata são os
principais vetores do SBMV no Brasil (COSTA & BATISTA, 1979, SILVEIRA
JR. et al., 1983 e MEYER et al., 1992), sendo que C. arcuata foi identificado
como o vetor mais eficiente na transmissão desse vírus (SILVEIRA JR. et al.,
1983), porém as relações vírus/vetor ainda não são bem conhecidas (MEYER et
al., 1992). Também foi descrita a transmissão do SBMV pelas larvas de C.
arcuata, do sistema radicular de plantas infectadas para o de plantas sadias, em
uma taxa de 5,1% (MEYER et al., 1993). Esta taxa é pequena se comparada com
a taxa de transmissão pelo inseto adulto (58,3%) (SILVEIRA JR. et al., 1983), no
entanto, as larvas constituem população mais numerosa, o que torna a transmissão
substancialmente importante (MEYER et al., 1993). Isso evidencia a possibilidade
de transmissão do vírus através do solo, fato importante para a epidemiologia do
SBMV.
Em 2002, um isolado do SBMV foi encontrado no Estado do Paraná
(Gasparin, 2002). No entanto, devido à facilidade de transmissão do SBMV por
besouros crisomelídeos (SILVEIRA JR. et al., 1983, MEYER et al., 1992), pode-
se aventar que a distribuição geográfica do vírus pelo Brasil seja muito mais
ampla.
O isolado descrito no Estado de São Paulo (SBMV-SP) teve algumas de
suas propriedades determinadas. Através da análise de RNA de fita dupla
(dsRNA), evidenciou-se a existência de somente duas espécies de dsRNA de 4,2
kb e 1,0 kb que respectivamente corresponderiam ao RNA genômico e ao RNA
subgenômico, como as formas replicativas do vírus (MOREIRA & GASPAR,
2002). O genoma do SBMV-SP foi parcialmente seqüenciado nas ORF 1
(ESPINHA et al., 2004) e ORF 4 (ESPINHA et al., 2005), mostrando através das
20
relações filogenéticas e dos dados sobre identidade e similaridade que o isolado de
São Paulo está proximamente relacionado com o isolado americano de Arkansas
(SBMV-Ark) (LEE & ANDERSON, 1998).
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Os objetivos deste trabalho foram o seqüenciamento e a caracterização
molecular das ORF 2 e 3 do genoma do SBMV-SP, completando o
seqüenciamento de todo o genoma do isolado de São Paulo. Além disso, também
constituiu o objetivo deste projeto a expressão da porção C-terminal da RNA
Polimerase RNA Dependente para a obtenção de anti-soro policlonal para essa
proteína.
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O inóculo para transmissão do vírus para feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)
“Jalo” foi preparado através da maceração de plantas infectadas em tampão
fosfato de potássio 0,02M pH 7,4 contendo sulfito de sódio 0,02M. O
homogeneizado foi manualmente aplicado com um abrasivo (Cellite, Sigma) nas
folhas de feijoeiro.
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O SBMV-SP foi purificado seguindo-se o protocolo descrito por Moreira e
Gaspar (2002) em que foram utilizadas folhas de Phaseolus vulgaris, L. frescas e
que apresentaram sintomas do SBMV-SP. Folhas foram trituradas em
liquidificador tamponadas com tampão fosfato 0,1M pH 7,2 com 0,75% de sulfito
de sódio. O homogeneizado foi filtrado em gaze e o suco clarificado com
clorofórmio (0,5ml/g). A fase tamponada foi coletada e seu pH ajustado para 4,8
com ácido acético glacial para precipitação dos contaminantes e então submetida a
uma centrifugação de 12.000 xg por 5 min. O vírus foi precipitado da fase
tamponada com a adição de polietileno glicol 8000 (PEG) 10% e cloreto de sódio
1% sob agitação de 2 ho7646 deneizi72C. Nova centrifugação foi realizada a 16.000 xg
por 10 min., o sedimento foi ressuspendido em tampão KH
2
PO
4
0,01M, pH 7,2
sob agitação de 30 min. a izi72C. Após centrifugação realizada a 16.000 xg por 10
min. e o sobrenadante foi coletado e ultracentrifugado por 1h e 45 min. a 100.00
xg. O sedimento foi ressuspendido em 1ml de tampão KH
2
PO
4
0,01M, pH 7,2 e
centrifugado novamente por 2h e 30 min. a 150.000 xg em gradiente linear de
sacarose (10-50%) em tampão KH
2
PO
4
0,01M pH 7,2. A banda obtida após a
centrifugação foi coletada e diluída no mesmo tampão anterior e centrifugada por
3h a 35.000 rpm. O sedimento foi recuperado em 1ml de KH
2
PO
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0,01M, pH 7,2.
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O vírus purificado foi submetido à leitura em espectrofotômetro sob
comprimento de onda de 260 e 280nm (luz ultravioleta) para determinação da
concentração viral, utilizando o coeficiente de extinção do SBMV cujo valor é 6,0
em leitura a 260nm (SEHGAL, 1981).
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A extração do RNA das partículas virais foi realizada através da utilização
do “RNeasy Plant Mini kit” de acordo com instruções do fabricante (Qiagen).
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Os cDNAs foram sintetizados para a amplificação dos fragmentos da ORF
2 e foram produzidos a partir do RNA viral, utilizando um volume de cada
reação de 25μL que continha tampão (Tris-HCl 50mM pH 8,3; KCl 75mM); DTT
10mM; MgCl
2
3mM; 0,2mM de cada dNTP (dGTP, dATP, dCTP e dTTP); 1
unidade de inibidor de RNAse, oligonucleotídeos anti-senso descritos abaixo (3R
e 2R), 6μg de RNA viral e foi desnaturado à 95ºC por 5 minutos; 200 unidades de
transcriptase reversa “Superscript” (Invitrogen). A reação foi incubada por 2 horas
à 42ºC.
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Para amplificar por PCR os 5 fragmentos para seqüenciamento da ORF 2
foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos senso (F) e anti-senso (R):
1F 5'-GTGGTAGACGGCAAGATGGT-3' 1R
5'-TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3'
2F 5'-TACTCCAAGCAGGAAAGT-3' 2R 5'-AATAAGCTCAGCCATAAG-3'
3F 5'-TCGGATGGCACACTCATAGA-3' 3R 5'-TCAGGACTGTCACACCTCCA-3'
4F 5’-GTATCATCCAGGCCGCTCAC-3’ 4R
5’-TGGAATTGTTCCAAACATGG-3’
5F 5’-CTCAGACCATCGGTTTTGGT-3’ 5R
5’-GGCTGCTTCTCCTTCTTTGA-3’
* Oligonucleotídeos desenhados a partir da seqüência do SBMV-Ark depositada
no Genbank (nº acesso: NC004060).
24
Os tamanhos esperados dos fragmentos amplificados a partir dos oligonucletídeos
acima são:
1F/1R: 498 pares de base (pb)
2F/2R: 870 pb
3R/3F: 693 pb
4R/4F: 598 pb
5R/5F: 834 pb
Para amplificar por PCR o fragmento que corresponde a porção C-terminal
da polimerase, que foi utilizado para o processo de expressão, o seguinte par de
oligonucleotídeos foi utilizado:
• Exp-F: 5’-GGA TCC GCC CAG AAT AGG T-3’
• Exp-R: 5’-AAGCTTTC ACA CCT CCA GCC-3’
Este par de oligonucleotídeos apresenta sítios de restrição para as
endonucleases Bam HI (GGATCC) e Hind III (AAGCTT) e o produto de
amplificação utilizando esse par de oligonucleotídeos tem o tamanho esperado de
686 pb.
O volume de cada reação da PCR foi de 25μL consistindo de tampão
(Tris-HCl 20mM pH 8,4; KCl 50mM); 5mM de MgCl
2
; 0,2mM cada dCTP,
dGTP, dATP e DTTP; 10μg/mL de cada oligonucleotídeo (senso e anti-senso);
1μL da mistura da reação de cDNA e 2 unidades de Taq DNA-polimerase
(Invitrogen). O programa da PCR foi realizado em um termociclador MJ Research
que consiste em uma desnaturação inicial de 94ºC por 5 minutos e ciclos de 1
minuto de desnaturação à 94ºC, 1 minuto de anelamento à 50ºC e 1 minuto de
extensão à 72ºC. Após 35 ciclos e uma extensão final por 10 minutos à 72ºC. Os
fragmentos de DNA amplificados foram visualizados em gel de agarose 1%, sob
luz ultravioleta, em tampão TAE (Tris-HCl 0,04M; acetato de sódio 0,02M e
EDTA 0,001M pH 8,3) a uma voltagem de 80V e corado com brometo de etídio
(0,05μg/mL) (SAMBROOK et al., 1989).
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Após a purificação dos fragmentos amplificados foi realizada a reação de
ligação ao vetor pDrive (Qiagen). Para a reação de ligação foram utilizados o
produto do PCR, solução salina e vetor pDrive (Qiagen) conforme orientação do
fabricante.
Após a reação de ligação procedeu-se a transformação do recombinante
em Escherichia coli linhagem TOP 10 (Invitrogen), utilizando-se 50μL de células
competentes e 3μL de vetor ligado. Essa mistura permaneceu no gelo durante 1
hora e então, foi submetida ao choque de temperatura à 42ºC por 60 segundos. Em
seguida, foram adicionados 250μL de meio líquido SOC (meio SOB (peptona,
extrato de levedura, KCl e NaCl), 10mM de glicose e 10mM de Mg
2+
) e as
bactérias foram submetidas a regeneração (1 hora à 37ºC com agitação a 200
rpm). Posteriormente, as bactérias foram plaqueadas em meio sólido seletivo (LB
+ ampicilina 100μg/mL), contendo ainda 40μL de X-Gal 20mg/mL (5-bromo-4-
cloro-3-indolil-β-D-Galactopiranosidio), utilizado para a detecção colorimétrica
da atividade da enzima β-galactosidase. Após crescimento a 37°C por 16 horas, as
colônias brancas foram isoladas e multiplicadas em outra placa de meio sólido por
incubação durante aproximadamente 20 horas. Estas colônias foram testadas por
PCR para comprovar a existência do inserto. As colônias que apresentaram o
inserto foram inoculadas em tubos individuais de 5mL de meio líquido seletivo
(LB + ampicilina 100μg/mL) sob agitação constante à 37ºC para posterior
extração do DNA plasmidial.
A extração do DNA recombinante foi feita utilizando-se o “PureLink
Quick Plasmid Miniprep kit” (Invitrogen), seguindo instruções do fabricante. Em
linhas gerais, 5 ml de cultura líquida foram centrifugados por 1 minuto a 12.000
xg e o sobrenadante descartado. O precipitado foi ressuspendido em tampão de
suspensão e, em seguida foi acrescentado tampão de lise. O tubo foi manualmente
invertido 5 vezes e incubado à temperatura ambiente por 5 minutos. A esta
mistura foi adicionado tampão de precipitação e centrifugado a 12.000 xg por 10
minutos.
26
O sobrenadante resultante da centrifugação foi transferido para coluna de
afinidade e centrifugado novamente por 12.000 xg durante 1 minuto. O efluente
foi descartado e tampão de lavagem adicionado à coluna. Seguiu-se outra
centrifugação a 12.000 xg por 1 minuto e o efluente foi novamente descartado. A
coluna foi colocada em um novo tubo e o DNA foi eluído em tampão TE (10 mM
Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA) aquecido (65-70°C), com incubação da coluna
por 1 minuto a temperatura ambiente e centrifugação por 2 minutos a 12.000 xg.
Após a extração do DNA plasmidial dos clones selecionados, foi feita
digestão com enzima de restrição (EcoRI). A comprovação da formação do DNA
recombinante foi verificada através da liberação do fragmento esperado. A análise
dos produtos de digestão foi feita em gel de agarose 1%.
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O seqüenciamento de nucleotídeos foi realizado em ambas as direções
(senso e anti-senso) utilizando-se os oligonucleotídeos universais M13 e o "DNA
sequencing Kit Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (Perkin
Elmer) em um seqüenciador ABI Prism 377 (Applied Biosystems, Inc.), através
do método de terminação de cadeia por didesoxinucleoetídeos
("dideoxynucleotide chain termination method") (SANGER et al., 1977).
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A análise comparativa das seqüências foi feita através do algoritmo
BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e o alinhamento das seqüências consenso
pelo programa Multalin (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). As
seqüências de aminoácidos deduzidas foram determinadas pelo programa
Translate (http://www.expasy.org/tolls/dna.html). As relações filogenéticas foram
determinadas pelo método de máxima parcimônia, com auxílio do programa
PAUP v 4.0b10 (SWOFFORD, 1997) e com teste de confiança de topologia
(bootstrap) de pelo menos 1000 réplicas.
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A subclonagem dos fragmentos amplificados por PCR foi feita utilizando-
se o vetor pGEM
®
-T, de acordo com instruções do fabricante (Promega). Após a
extração do DNA plasmidial dos clones selecionados, foi feita digestão com
enzimas de restrição (Hind III e Bam HI). A comprovação da formação do DNA
recombinante foi verificada através da liberação do fragmento esperado. A análise
dos produtos de digestão foi feita em gel de agarose 1%.
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O vetor recombinante (pGEM + inserto) foi purificado e submetido à
dupla digestão com enzimas de restrição Bam HI e Hind III. O fragmento liberado
após a digestão foi extraído e purificado do gel utilizando MinElute Gel
Extraction Kit (Qiagen) conforme instruções do fabricante. Em seguida este
fragmento foi ligado em vetores de expressão pela enzima T4 ligase (Promega)
conforme instrução do fabricante e em seguida transformação em E. coli. O
primeiro sistema utilizado foi o pMALc-2x (New England Biolabs) em que foi
utilizada a linhagem de E.coli DH5α. O mesmo procedimento de foi utilizado
para o sistema pET 28a (Novagen) em que foi utilizada a linhagem bacteriana
BL21.
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Os vetores recombinantes foram seqüenciados, primeiramente o vetor
recombinante no sistema pMAL-c2x (New England Biolabs) e posteriormente o
ou outro vetor recombinante no sistema pET 28 a (Novagen). Ambos foram
seqüenciados pelo método Sanger utilizando o equipamento ABI Prism 377
(Applied Biosystems, Inc). Foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores 5´-
senso (malE primer) para o vetor PMALc-2x indicado pelo fabricante (New
England Biolabs) e o M13 para o vetor pET 28a. As seqüências foram obtidas e
alinhadas através do algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
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O pré-inóculo da colônia transformante selecionada consistiu de 7 mL de
meio LB líquido juntamente com 100µg/mL de ampicilina. Após incubação a
37°C sob agitação de 200 rpm por aproximadamente 16 horas, o pré-inóculo foi
adicionado a um novo meio de cultura (250 mL de meio LB, 100µg/mL de
ampicilina e 2mg/mL de Glicose) que foi incubado sob as mesmas condições.
Quando a cultura de células atingiu a densidade óptica de 0,6 em 550nm, a
indução de expressão foi feita com 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosida
(IPTG), a 37°C por 4 horas sob agitação de 200 rpm. As células foram separadas
do meio por centrifugação a 4.000 x g durante 20 minutos a 4ºC e posteriormente
congeladas a -20ºC.
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A lise celular foi realizada através da adição de 5mL de Tampão de Lise
(Fosfato de sódio 20mM, NaCl 200mM, EDTA 1mM, pH 7,2) seguida de
sonicação (8 vezes de 15 segundos). Após a sonicação, o lisado foi centrifugado
por 20 minutos a 4.000 x g a 4°C.
O sobrenadante do lisado foi aplicado em coluna de amilose (2,0 mL de
resina), previamente equilibrada com 8 volumes de Tampão de Coluna (Fosfato
de sódio 20mM e NaCl 200 mM, pH 7,2) e permaneceu sob agitação leve por
aproximadamente 4 horas a 4°C. Em seguida a coluna foi lavada com 12 volumes
de Tampão de Coluna e a proteína eluída com 5 volumes de Tampão de Coluna
acrescido de 100mM de maltose.
As amostras resultantes da eluição foram verificadas em SDS-PAGE 10% e as
frações contendo a proteína referente à porção C-terminal da polimerase do
SBMV-SP foram reunidas e concentradas utilizando-se concentradores Centricon-
30 (Millipore) por centrifugação.
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A lise celular foi realizada através da adição de 5mL de Tampão de Lise
(Fosfato de sódio 20mM pH 7,8, NaCl 500mM, 6M de guanidina e 20mM β-
mercaptoetanol) seguida de sonicação (8 vezes de 15 segundos). Após a
sonicação, o lisado foi centrifugado por 20 minutos a 4.000 x g a 4°C.
O sobrenadante do lisado foi aplicado em coluna de níquel (2,0 mL de
resina), previamente equilibrada com 8 volumes de Tampão de Ligação (Fosfato
de sódio 20mM pH 7,8, NaCl 500mM, 6M de guanidina 20mM, β-mercaptoetanol
e 8M de uréia) e permaneceu sob agitação leve por aproximadamente 4 horas a
4°C. Em seguida a coluna foi lavada com 10 volumes de Tampão de Lavagem 1
(Fosfato de sódio 20mM pH 6,0, NaCl 500mM, 6M de guanidina 20mM, β-
mercaptoetanol e 8M de uréia), em seguida uma nova lavagem foi feita com o
tampão de lavagem 2 (Fosfato de sódio 20mM pH 5,3, NaCl 500mM, 6M de
guanidina 20mM, β-mercaptoetanol e 8M de uréia)e a proteína eluída com 5
volumes de Tampão de Eluição (Fosfato de sódio 20mM pH 4,0, NaCl 500mM,
6M de guanidina 20mM, β-mercaptoetanol e 4M de uréia).
As amostras resultantes da eluição foram verificadas em SDS-PAGE 10%
e as frações contendo a proteína referente à porção C-terminal da polimerase do
SBMV-SP foram reunidas e concentradas utilizando-se concentradores Centricon-
30 (Millipore) por centrifugação.
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As amostras de proteínas obtidas das purificações foram analisadas em
SDS-PAGE conforme Laemmli (1970). O gel de empacotamento foi feito a uma
concentração de 5% e os de resolução de 10 ou 12%. Para a aplicação das
amostras no SDS-PAGE as proteínas foram desnaturadas por fervura a 100°C por
3 minutos em tampão de amostra (Tris. HCl 0,125 M, pH 6,8, contendo 4% de
dodecil sulfato de sódio - SDS, glicerol 20%, β-Mercaptoetanol 10% e azul de
bromofenol 0,001M), utilizando-se o aparelho Mini Protean II (BioRad). A
fixação das proteínas foi realizada utilizando uma mistura de metanol, água e
30
ácido acético (50:50:100) por 60 minutos. Para corar o gel foi utilizada a
coloração com Comassie 0,25% na mistura fixadora e em seguida o gel foi
descorado com uma mistura de metanol e água (1:1) por 6 horas.
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Foram inoculados coelhos da raça Nova Zelândia com o produto da
purificação (Maltose binding protein - MBP + C-terminal da polimerase). Cinco
injeções intramusculares foram aplicadas na região da coxa (100μg de proteína
cada aplicação), com intervalo de 7 dias entre elas. A primeira injeção continha
uma mistura da proteína purificada mais adjuvante completo de Freund (Sigma)
na proporção de 1:1. A aplicações seguintes foram feitas uma mistura da proteína
purificada mais adjuvante incompleto de Freund (Sigma) também na proporção de
1:1. Após 7 dias após a aplicação da última injeção foi coletado o sangue do
coelho e incubado a 4°C durante 12 horas e em seguida realizou-se uma
centrifugação a 3000 rpm por 20 minutos para separar o plasma sangüíneo das
hemácias. Feita a separação coletou-se a fração do plasma sangüíneo onde se
encontrava os anticorpos policlonais.
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A membrana de celulose foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente
em tampão PBS (fosfato de sódio 0,01 M pH 7,2, NaCl 0,15 M) contendo
soroalbumina bovina (BSA) 5% e Tween-20 0,3% (PBS-T). Em seguida a
membrana foi incubada por 1 hora com o anti-soro primário (anti - C-terminal da
polimerase) diluído 1: 2500 com tampão PBS-T contendo BSA 0,5%
(DIETZGEN & FRANCKI, 1987). Foram feitas três lavagens com PBS-T por 15
minutos cada. Em seguida a membrana foi incubada à temperatura ambiente com
anti-soro anti-IgG de coelho (Promega) conjugado com fosfatase alcalina diluído
1:7500 em PBS-T contendo 5% de BSA. Após a incubação com o anti-soro
secundário foram feitas 3 lavagens com PBS por 5 minutos cada. Após as
lavagens, a membrana foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente com
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mistura de 5-bromo-4-cloro.3-indolil fosfato/nitro-blue tetrazolio (BCIP/NBT -
substrato para fosfatase alcalina).
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Foi realizada uma eletroforese das proteínas conforme o item 3.15 para
fazer a transferência em membrana de nitrocelulose em um eletrotransferidor
(Mini Transblot Eletroforetic Cell – BioRad) operando a 100V por 1 hora em
tampão de transferência (Tris-Glicina- Tris 0,025 M e Glicina 0,192M) contendo
metanol 20%. A imunolocalização foi realizada conforme o item 3.18.
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O SBMV-SP, quando inoculado em P. vulgaris L. “Jalo”, induziu infecção
sistêmica com mosaico, mosqueado clorótico nas folhas inoculadas e distorção
foliar nas folhas mais jovens (Figura 1).
Figura 1: Comparação de folhas de feijoeiro sadia (esquerda) e infectada (direita);
Abaixo: Visualização da planta infectada.
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Levando-se em consideração o coeficiente de extinção de 6,0mg/ml/cm
estabelecido para vários sobemovírus, determinou-se que a concentração do
SBMV-SP purificado foi de 12,8 mg/100g de folha. Através da análise de SDS-
PAGE 10% foi possível visualizar uma banda de 29kDa correspondente à proteína
capsidial (figura 2).
Figura 2: SDS-PAGE 12% -(M) Marcador de massa molecular (kDa) BenchMark
(Invitrogen); 1: Proteína capsidial de ~ 29 KDa (seta).
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A análise do RNA viral em gel de agarose 1% evidenciou uma banda de
aproximadamente 4,2Kb referente ao RNA genômico e uma outra banda de
aproximadamente 1,0 Kb referente ao RNA subgenômico (Figura 3).
Figura 3: Análise do RNA viral extraído de partículas purificadas de SBMV-SP em gel
de agarose 1%. (M): Marcador de tamanho molecular 0,25-9.5 Kb RNA Ladder (Invitrogen); (1):
(A) RNA genômico com ~ 4,2kb (B) RNA subgenômico com ~ 1,0kb.
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Os produtos da reação de PCR foram analisados em gel nativo de agarose
1% evidenciando bandas de tamanhos esperados conforme a figura 4.
Figura 4. Gel nativo de agarose 1% (M): Marcador de tamanho molecular 100 bp DNA
Ladder (Invitrogen); 1-5: Produtos amplificados. (1): 498pb; (2): 870 pb; (3): 693; (4): 598pb; (5):
834pb.
M12345M
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A análise em gel de agarose 1% dos vetores recombinantes, após digestão
com enzima de restrição Eco RI, evidenciou a liberação dos fragmentos esperados
como mostra a figura 5.
Figura 5: Gel nativo de agarose 1%; (M): marcador de tamanho molecular de 100 bp
DNA Ladder (Invitrogen); 1-5: Vetores cortados e os fragmentos de interesse (1): 498pb; (2): 870
pb; (3): 693; (4): 598pb; (5): 834pb.
100pb
600pb
1500pb
M 1 2 3 4 5 M
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A figura 6 mostra a seqüência completa de nucleotídeos das ORF 2 e 3
depositada no GenBank (acesso: DQ875594) com suas respectivas seqüências de
aminoácidos deduzidas.
1 atgt
M Y H P G R S P S F L I T L A N V I C A
atcatccaggccgctcaccatcattcctgataacgttagcaaatgttatctgcgcg 60
61 gcaatcttgtacgacatccgtatgggggggtaccaaccaggatcactagttccaatagtg 120
A I L Y D I R M G G Y Q P G S L V P I V
121 gcctggatgaccccgttcgttacgctgctctggttgagcgcgtcattcgtgacatacctt 180
SP
A W M T P F V T L L W L S A S F V T Y L
SP
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Y R Y A R T R L L P E E K V A R V Y Y T
241 gcgcaatctgcgccttactttgacccggccctgggtgtcatgatgcaatttgcccctagc 300
SP
A Q S A P Y F D P A L G V M M Q F A P S
SP
301 catggcggcgccagcatagaagtgcaagttaacccttcgtggattagtctcttaggtggc 360
H G G A S I E V Q V N P S W I S L L G G
361 tctctcaagataaacggagatgacgcctctaatgagtctgctgtgttgggaagcttttat 420
S L K I N G D D A S N E S A V L G S F Y
421 tcttctgtgaaacctggtgatgaaccagctagtttggtagctattaagagtggtcctcag 480
S S V K P G D E P A S L V A I K S G P Q
481 accatcggttttggttgtagaactaagatcgacggtgatgactgcctcttcacagacaat 540
T I G F G C R T K I D G D D C L F T D N
541 cacgtttggaataattccatgcgccctaccgctttagcgaaagctggcaagcaggttgcg 600
H V W N N S M R P T A L A K A G K Q V A
601 attgaagattgggacacccctctctcttgtgaccataagatgcttgatttcgtagtggtg 660
I E D W D T P L S C D H K M L D F V V V
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721 tctgataaggacgctgtaacctgttatggtggatctagttctgatagcttgttgtcgggg 780
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781 acgggcgtttgtagtaaggttgatttctcttggaagttaacccactcatgccccacggca 840
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841 gctggctggagcggaactccaatttactctagcagaggtgtggtaggaatgcacgttggg 900
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V E T R S Y E F I E V E I K G R G K A K
Vpg
38
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L G K R E F A W I P E S G K Y W A D D D
Vpg
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D D S L P P P P K V V D G K M V W T S A
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Q E ⏐T V A E P L N Y Q R A A G S R P L P
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P F L N L Q A T T S K K E K Q P L Q E E
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ORF 3
ccccttagatttgttgggcagtcggcttgcaagtttagagagctgtgtagaaaagata 1380
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M P L R F V G Q S A C K F R E L C R K D
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L S E A P K Q S F T P C Y S K Q E S L I
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P P N P V T A F V E K P G P S T Q S T K
A S K S C Y C L R G E A W S F D A V Y E
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K S A R R R N R R K S T R K P V Q G V P
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1681 ctctcccgtctcgcctccaccaacaaagacctccttaagaggcacttagaattagttgct 1740
L S R L A S T N K D L L K
P L P S R L H Q Q R P P •
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P H A S R K V K E G R F R L I S S V S L
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RpRd
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W E H I P S K P G M G L S L Q R Q A K S
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L F D D L R V K H S R C P A A E A D I S
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L G G F G Q K L S I A A R N R F S C F M
2221 aactcagtcttccagctctcggatggcacactcatagaacagcaactgcctggtattatg 2280
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39
2281 aagtctggttcttactgcacttcctcaacaaactccagaatacgttgccttatggctgaa 2340
K S G S Y C T S S T N S R I R C L M A E
RpRd
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L I G S P W C I A M G D D S V E G W V D
RpRd
2401 ggtgcgaaagacaagtacatgagattaggccacacgtgcaaggattataaaccctgtgca 2460
G A K D K Y M R L G H T C K D Y K P C A
2461 acatccatttccggtcgcttatacgaggtagagttttgctctcacgttataagggaagat 2520
T S I S G R L Y E V E F C S H V I R E D
2521 cgatgttggttggcgtcgtggcccaaaactctgtataaatacttgtctgagggcaagtgg 2580
R C W L A S W P K T L Y K Y L S E G K W
2581 ttctttgaggatcttgagcgagagcttgggtcttctccccactggcccagaatcagacac 2640
F F E D L E R E L G S S P H W P R I R H
2641 tacgtagtcgggaatactccatcgcccgacaaaactagattagaaaattcaagtccgagc 2700
Y V V G N T P S P D K T R L E N S S P S
2701 tatggcgaagaggctgacaaaacaacagttagccaaggctatagcgaacactctggaagc 2760
Y G E E A D K T T V S Q G Y S E H S G S
2761 cccggccactcaatcgaggaggcccaggaaccggagacggcgccgttctgctgcaaggca 2820
P G H S I E E A Q E P E T A P F C C K A
2821 gcctcagtctatccaggctggggcatccatggcccctattgctcagggggctatggttcg 2880
A S V Y P G W G I H G P Y C S G G Y G S
2881 cttacgtga 2889
L T •
Figura 6: Seqüência de nucleotídeos e a aminoácidos deduzidos das ORFs 2 e 3 (nº de
acesso DQ875594); os aminoácidos em negrito indicam o início das regiões referentes aos
produtos SP (Serino Protease), Vpg (proteína ligada ao genoma viral) e RpRd (RNA polimerase
RNA-dependente); ⏐- indica o sítio de clivagem para a serino pr otease nos aminoácidos E e T (E:
glutamato e T: Treonina) ; marcados em cinza estão indicados os domínios e motivos da
poliproteína; os nucleotídeos (atg) sublinhados e em negrito referem-se ao códon de iniciação das
ORF 2 e ORF 3; em azul a seqüência deduzida de aminoácidos da ORF3; • indica o códon de
terminação; sublinhado em vermelho a seqüência heptanucleotídeo referente ao sinal de frameshift
-1 para a ORF 3.
40
4
4
.
.
7
7
.
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.
.
As tabelas 1 e 2 mostram dados de identidade para as seqüências de
aminoácidos deduzidos e nucleotídeos da ORF 2 e 3 do SBMV-SP com outros
sobemovírus, indicando os valores de identidade. A figura 7 mostra um
alinhamento entre as seqüências de aminoácidos de algumas espécies de
sobemovírus e isolados de SBMV, referentes à região do sítio de ligação da
proteína capsidial (Coat Protein Biding Site - CPBS), localizado internamente à
região da serino protease da ORF 2. A figura 8 mostra a organização genômica do
SBMV-SP, evidenciando a região da Vpg com sua seqüência de aminoácidos e
algumas regiões importantes, como os sítios de clivagem da poliproteína (E/T) e
algumas regiões conservadas na porção N-terminal da Vpg (20 primeiros
aminoácidos) e os aminoácidos WAD. O alinhamento mostrado na figura 9 é da
região N-terminal da Vpg (20 primeiros aminoácidos), comparando-se à mesma
região de outros sobemovírus.
ORF-2
SBMV SBMV-Ark SBMV-SP SeMV SCPMV RYMV LTSV CoMV
SBMV 76,6 71,9 61,3 49,3 45,6 38,6 40,5
SBMV-Ark
60,2 91,4 75,7 58,2 43,5 44,4 45,0
SBMV-SP
57,9 95,0 76,0 58,8 43,5 44,7 46,0
SeMV
49,9 77,0 77,7 58,9 43,3 43,7 45,6
SCPMV
36,5 52,7 53,1 55,5 42,9 43,3 50,5
RYMV
24,4 31,3 31,4 32,0 30,8 40,5 44,3
LTSV
27,7 37,4 36,9 36,9 35,4 30,6 40,3
CoMV
24,9 31,0 30,6 31,8 30,8 39,3 31,2
Tabela 1: Comparação (porcentagem de identidade) entre a seqüência de nucleotídeos
(acima da diagonal) e aminoácidos deduzidos (abaixo da diagonal) da ORF 2 de isolados do
Southern bean mosaic virus e espécies do gênero Sobemovirus. O número de acesso ao GenBank
para os vírus citados são: SeMV (NC002568), SBMV (L34672), SBMV-ARK (NC004060),
SBMV-SP (DQ875594) RYMV (NC001575), SCPMV (NC001625), CoMV (NC002618), LTSV
(NC001696).
41
ORF-3
SBMV-Ark SBMV-SP SeMV SCPMV RYMV LTSV
SBMV-Ark 97,0 76,1 54,4 45,1 38,5
SBMV-SP
97,7 76,1 54,8 45,4 39,1
SeMV
73,6 73,6 60,5 42,2 41,9
SCPMV
48,8 48,8 52,5 41,0 38,6
RYMV
23,5 22,0 18,8 19,1 41,1
LTSV
36,5 35,9 37,1 37,1 17,6
Tabela 2: Comparação (porcentagem de identidade) entre a seqüência de nucleotídeos
(acima da diagonal) e aminoácidos deduzidos (abaixo da diagonal) da ORF 3 de isolados do
Southern bean mosaic virus e espécies do gênero Sobemovirus. O número de acesso ao GenBank
para os vírus citados são: SeMV (NC002568), SBMV-ARK (NC004060), SBMV-SP
(DQ875594), RYMV (NC001575), SCPMV (NC001625), LTSV (NC001696).
Figura 7: Comparação entre as seqüências de aminoácidos da região do sítio de ligação
da proteína capsidial (Coat Protein Biding Site - CPBS) de isolados do SBMV e espécies do
gênero Sobemovirus. Os números à esquerda da seqüência referem-se à posição do primeiro
aminoácido e a direita a do último aminoácido deste sítio em relação à posição na seqüência de
aminoácidos da polipro teína d a ORF 2. Em destaque está o aminoácido serina (S) p resen te no sítio
catalítico da serino protease (SP).
42
Figura 8: Esquema da organização do genoma do SBMV-SP, evidenciando a região da
Vpg (em cinza) com sua respectiva seqüência completa de aminoácidos. E⏐T: indica o sítio de
clivagem para a serino protease (SP) na poliproteína, localizados entre as proteínas SP e Vpg e
entre Vpg e RpRd. As seqüências sublinhadas são regiões conservadas da Vpg para os
sobemovírus.
Figura 9: Comparação entre as seqüências de aminoácidos da região N-terminal das
Vpgs de isolados do SBMV e espécies do gênero Sobemovirus. Os números à esquerda da
seqüência referem-se à posição do primeiro aminoácido e a direita a do último aminoácido desta
seqüência em relação à posição na seqüência de aminoácidos da poliproteína da ORF 2.
43
4
4
.
.
8
8
.
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.
.
A análise filogenética pelo método de máxima parcimônia para as
seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da ORFs 2 (figuras 10 e 11),
as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da ORF 3 (figuras 12 e
13). A figura 14 refere-se a árvore para a seqüência de nucleotídeos dos genomas
de espécies e isolados de sobemovírus .
Figura 10. Análise filogenética com base na seqüência completa de nucleotídeos da
ORF-2 do SBMV-SP e outros sobemovírus, pelo método de máxima parcimônia com 1000
réplicas. As 8 espécies estão identificadas à direita da árvore e os valores de “bootstrap” (em
porcentagem) estão localizados à esquerda.
Figura 11. Análise filogenética com base na seqüência completa de aminoácidos
deduzidos da ORF-2 do SBMV-SP e outros sobemovírus, pelo método de máxima parcimônia
com 1000 réplicas. As 8 espécies estão identificadas à direita da árvore e os valores de “bootstrap”
(em porcentagem) estão localizados à esquerda.
44
Figura 12. Análise filogenética com base na seqüência completa de nucleotídeos da
ORF-3 do SBMV-SP e outros sobemovírus, pelo método de máxima parcimônia com 1000
réplicas. As 6 espécies estão identificados à direita da árvore e os valores de “bootstrap” (em
porcentagem) estão localizados à esquerda.
Figura 13. Análise filogenética com base na seqüência completa de aminoácidos
deduzidos da ORF-3 do SBMV-SP e outros sobemovírus, pelo método de máxima parcimônia
com 1000 réplicas. As 6 espécies estão identificados à direita da árvore e os valores de “bootstrap”
(em porcentagem) estão localizados à esquerda.
Figura 14. Análise filogenética com base na seqüência completa de nucleotídeos dos
genomas dos Sobemovirus, pelo método de máxima parcimônia com 1000 réplicas. As 8 espécies
estão identificados à direita da árvore e os valores de “bootstrap” (em porcentagem) estão
localizados à esquerda.
45
4
4
.
.
9
9
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-
S
S
P
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.
.
As seqüências das ORF 1, 2, 3 e 4 do SBMV-SP foram reagrupadas para
montagem do genoma completo do vírus (figura 15). As seqüências das ORFs 1 e
4 foram obtidas do GenBank (ORF1 nº de acesso: AY340587 e ORF4 nº de
acesso: AY340586). De acordo com Espinha et al. (2004) há sobreposição de 34
nucleotídeos entre as ORFs 1 e 2 e entre as ORFs 2 e 4 também há sobreposição
de 188 nucleotídeos (ESPINHA et al., 2005).
5´ ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5 15 25 35 45 55
CACAAAATAT AAGAAGGAAA GCTGGATTTC CTACCTTTGT GTTTCCATTG TCGAAGCATT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
65 75 85 95 105 115
GGTCAATACT TATCAATTGG TGCATTGTTC GC
ATGAGCTA CCGATTCTTA GTAGTCAAAG
∗ORF1
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
125 135 145 155 165 175
CCGTTGGTTT TCTTGGTTTC CATTCAGACG CTACTCGCAT TCTGTCAGAG ACTGAGATCG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
185 195 205 215 225 235
TAGACGTTCC TTCGTCCATT GATTTCGTCG GTGAAACCGA GTTACGCCTA GAAAACGCTT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
245 255 265 275 285 295
GGCCCCAAGG TGGTGAGAGA TACACTATCC TACCTAGGTT CAACGTTCAG ATTGACTTCA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
305 315 325 335 345 355
CGTACCATCC AGTGCGTGTC GAGATCATCT GTAGGGTTTG TGCTACTTCC CTTACTGTTG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
365 375 385 395 405 415
TCTTTAGCAA GTGGAACTTC CATTGCGAAA GGAAGGGCCA TTTTGTGCCA GTAGACCAGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
425 435 445 455 465 475
ACGGGAATCT GTTTAGGGTT GGAACGCTCC GGGAGACGGG AGAGAAATAC TTCTACTTCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
485 495 505 515 525 535
GTGAGAAATC TATCTGCAGA CA
ATGTATCA TCCAGGCCGC TCACCATCAT TCCTGATAAC
∗ORF2 •ORF1
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
545 555 565 575 585 595
GTTAGCAAAT GTTATCTGCG CGGCAATCTT GTACGACATC CGTATGGGGG GGTACCAACC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
605 615 625 635 645 655
AGGATCACTA GTTCCAATAG TGGCCTGGAT GACCCCGTTC GTTACGCTGC TCTGGTTGAG
46
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
665 675 685 695 705 715
CGCGTCATTC GTGACATACC TTTATAGGTA TGCTCGAACT CGACTGCTTC CAGAGGAGAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
725 735 745 755 765 775
AGTGGCCAGA GTTTATTATA CGGCGCAATC TGCGCCTTAC TTTGACCCGG CCCTGGGTGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
785 795 805 815 825 835
CATGATGCAA TTTGCCCCTA GCCATGGCGG CGCCAGCATA GAAGTGCAAG TTAACCCTTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
845 855 865 875 885 895
GTGGATTAGT CTCTTAGGTG GCTCTCTCAA GATAAACGGA GATGACGCCT CTAATGAGTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
905 915 925 935 945 955
TGCTGTGTTG GGAAGCTTTT ATTCTTCTGT GAAACCTGGT GATGAACCAG CTAGTTTGGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
965 975 985 995 1005 1015
AGCTATTAAG AGTGGTCCTC AGACCATCGG TTTTGGTTGT AGAACTAAGA TCGACGGTGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1025 1035 1045 1055 1065 1075
TGACTGCCTC TTCACAGACA ATCACGTTTG GAATAATTCC ATGCGCCCTA CCGCTTTAGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1085 1095 1105 1115 1125 1135
GAAAGCTGGC AAGCAGGTTG CGATTGAAGA TTGGGACACC CCTCTCTCTT GTGACCATAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1145 1155 1165 1175 1185 1195
GATGCTTGAT TTCGTAGTGG TGCGTGTGCC AAAACACGTG TGGTCCAAAC TAGGAGTGAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1205 1215 1225 1235 1245 1255
AGCGACTCAA CTGGTTTGTC CATCTGATAA GGACGCTGTA ACCTGTTATG GTGGATCTAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1265 1275 1285 1295 1305 1315
TTCTGATAGC TTGTTGTCGG GGACGGGCGT TTGTAGTAAG GTTGATTTCT CTTGGAAGTT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1325 1335 1345 1355 1365 1375
AACCCACTCA TGCCCCACGG CAGCTGGCTG GAGCGGAACT CCAATTTACT CTAGCAGAGG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1385 1395 1405 1415 1425 1435
TGTGGTAGGA ATGCACGTTG GGTTTGAAGA TATCGGAAAA CTCAACCGTG GCGTGAACGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1445 1455 1465 1475 1485 1495
TTTCTACGTG TCTAACTACT TGTTGAGGTC TCAAGAGACT CTACCTCCTG ATCTGTCCGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1505 1515 1525 1535 1545 1555
CATCGAAATA CCTTTCGAGG ACGTAGAAAC CCGGAGTTAT GAGTTCATTG AGGTCGAGAT
47
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1565 1575 1585 1595 1605 1615
TAAAGGAAGA GGTAAGGCTA AACTTGGTAA GCGTGAGTTC GCTTGGATTC CGGAATCAGG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1625 1635 1645 1655 1665 1675
AAAATACTGG GCCGATGATG ATGACGACTC TTTGCCCCCA CCGCCGAAGG TGGTAGACGG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1685 1695 1705 1715 1725 1735
CAAGATGGTG TGGACTTCAG CTCAGGAAAC CGTCGCAGAG CCTTTAAACT ACCAGAGGGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1745 1755 1765 1775 1785 1795
GGCAGGGTCA AGGCCCTTGC CGCCCTTTCT CAACTTGCAG GCTACAACTT CAAAGAAGGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1805 1815 1825 1835 1845 1855
GAAGCAGCCT CTACAAGAGG A
ATGCCCCTT AGATTTGTTG GGCAGTCGGC TTGCAAGTTT
∗ORF3
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1865 1875 1885 1895 1905 1915
AGAGAGCTGT GTAGAAAAGA TACTCCAGAT GAAGTCCTTA GAGCTACTAG AGTCTTCCCG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1925 1935 1945 1955 1965 1975
GAATTGTCAG ACTTCTCCTG GCCTGAGCGA GGCTCCAAAG CAGAGCTTCA CTCCCTGCTA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1985 1995 2005 2015 2025 2035
CTCCAAGCAG GAAAGTTTAA TCCCACCGCA ATCCCAAGGA ATCTTGAAGG AGCTTGTCAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2045 2055 2065 2075 2085 2095
AACCTCCTTG AGCGCTACCC CGCCTCCAAA TCCTGTTACT GCCTTCGTGG AGAAGCCTGG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2105 2115 2125 2135 2145 2155
TCCTTCGACG CAGTCTACGA AGAAGTCTGC AAGAAGGCGC AATCGGCGGA AATCAACGAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2165 2175 2185 2195 2205 2215
AAAGCCAGTC CAGGGAGTCC CCCTCTCCCG TCTCGCCTCC ACCAACAAAG ACCTCCT
TAA
•ORF3
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2225 2235 2245 2255 2265 2275
GAGGCACTTA GAATTAGTTG CTTTGTGTGT TACCGAGAGA TTGTTCTTAC TCAGTGAAGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2285 2295 2305 2315 2325 2335
TGAGGACCTG CACAATAAAT CCCCTGTGGA CCTAGTTCAG ATGGGGTTGT GCGACCCAGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2345 2355 2365 2375 2385 2395
TCGGCTGTTT GTCAAGCAGG AGCCCCATGC TTCCCGAAAG GTGAAGGAGG GTAGATTTCG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2405 2415 2425 2435 2445 2455
CTTGATTTCA TCCGTTTCGC TGGTGGATCA GCTTGTAGAG CGAATGCTTT TCGGGCCCCA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2465 2475 2485 2495 2505 2515
AAACCAGCTT GAGATCGCTG AGTGGGAACA TATTCCCTCA AAACCTGGTA TGGGCCTTTC
48
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2525 2535 2545 2555 2565 2575
GCTGCAACGA CAAGCCAAAA GCTTGTTCGA CGATTTGAGA GTCAAACATT CTCGTTGTCC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2585 2595 2605 2615 2625 2635
TGCGGCTGAA GCCGACATAT CGGGTTTTGA CTGGTCTGTT CAAGACTGGG AGTTGTGGGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2645 2655 2665 2675 2685 2695
TGATGTAGAG ATGAGAATAG TTTTAGGAGG TTTTGGACAG AAGTTGTCCA TAGCCGCTAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2705 2715 2725 2735 2745 2755
AAACAGGTTT TCGTGTTTCA TGAACTCAGT CTTCCAGCTC TCGGATGGCA CACTCATAGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2765 2775 2785 2795 2805 2815
ACAGCAACTG CCTGGTATTA TGAAGTCTGG TTCTTACTGC ACTTCCTCAA CAAACTCCAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2825 2835 2845 2855 2865 2875
AATACGTTGC CTTATGGCTG AACTTATTGG TTCCCCATGG TGTATCGCCA TGGGTGATGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2885 2895 2905 2915 2925 2935
TTCTGTTGAG GGTTGGGTTG ATGGTGCGAA AGACAAGTAC ATGAGATTAG GCCACACGTG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2945 2955 2965 2975 2985 2995
CAAGGATTAT AAACCCTGTG CAACATCCAT TTCCGGTCGC TTATACGAGG TAGAGTTTTG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3005 3015 3025 3035 3045 3055
CTCTCACGTT ATAAGGGAAG ATCGATGTTG GTTGGCGTCG TGGCCCAAAA CTCTGTATAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3065 3075 3085 3095 3105 3115
ATACTTGTCT GAGGGCAAGT GGTTCTTTGA GGATCTTGAG CGAGAGCTTG GGTCTTCTCC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3125 3135 3145 3155 3165 3175
CCACTGGCCC AGAATCAGAC ACTACGTAGT CGGGAATACT CCATCGCCCG ACAAAACTAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3185 3195 3205 3215 3225 3235
ATTAGAAAAT TCAAGTCCGA GCT
ATGGCGA AGAGGCTGAC AAAACAACAG TTAGCCAAGG
∗ORF4
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3245 3255 3265 3275 3285 3295
CTATAGCGAA CACTCTGGAA GCCCCGGCCA CTCAATCGAG GAGGCCCAGG AACCGGAGAC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3305 3315 3325 3335 3345 3355
GGCGCCGTTC TGCTGCAAGG CAGCCTCAGT CTATCCAGGC TGGGGCATCC ATGGCCCCTA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3365 3375 3385 3395 3405 3415
TTGCTCAGGG GGCTATGGTT CGCTTACG
TG AACCATCGCMC 16 >>BDC]8...|....| ..TGGGGCATCC ATGGCCCCTA
49
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3425 3435 3445 3455 3465 3475
CTGTCCTGAC GCACTCTGAG CTCTCAACAG AGCTTGCTGT GACGAATGCG ATAGTTGTCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3485 3495 3505 3515 3525 3535
CTTCTGAGCT TGTCATGCCC TTCACAATGG GCACTTGGCT TCGAGGCGTG GCGGCCAATT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3545 3555 3565 3575 3585 3595
GGTCGAAGTA CAGTCTGTTT TCAGTGAGGT ATACTTACCT CCCCTCTTGT CCTTCAACGA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3605 3615 3625 3635 3645 3655
CATCTGGGTC CATTCATATG GGTTTCCAAT ATGATATGGC TGACACTCTT CCCGTATCCG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3665 3675 3685 3695 3705 3715
TTAACCAGTT ATCCAACCTT AGAGGCTATG TGTCAGGGCA GGTCTGGTCT GGATCCTCTG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3725 3735 3745 3755 3765 3775
GATTGTGCTA TATAAATGGC ACGAGGTGTT CTGACACCGC CAACGCTATC ACGACCACTT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3785 3795 3805 3815 3825 3835
TGGACGTTGC AAAGCTTGGT AAGAAGTGGT ATCCTTTCAA GACCAGTACG GACTTCACTG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3845 3855 3865 3875 3885 3895
CCGCTGTTGG CGTAATAGTC AACATTGCTA CTCCCCTGGT CCCGGCTAGG CTAGTGATAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3905 3915 3925 3935 3945 3955
CCATGCTGGA TGGGTCGAGT TCTACGGCTG TGAGTACTGG ACGCCTATAC GTGTCGTACA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3965 3975 3985 3995 4005 4015
CTGTACAGCT AATTGAGCCG ACTGCCTTGG CCTTAAACAA C
TGAGGAGTT GTATAATAAT
•ORF4
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
4025 4035 4045 4055 4065 4075
ACCTGCACCC TTCTCTTTGG CAGGGAGGGT GTTTCGTTTT CACAATGCCA CGCGCTTGAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ... 3´
4085 4095 4105 4115 4125
GGAGAATGCA CGTTAATCAT CCCTCCGCTA GTGATGGAGC GTAATCCAAA AGT
Figura 15: Seqüência de nucleotídeos do Genoma do SBMV-SP. ∗ indica os códons de
iniciação (ATG) das ORFS 1, 2 , 3 e 4; (•) indica o códon de terminação (TGA para as ORFs 1, 2
e 4 e TAA para a ORF 3). Os nucleotídeos coloridos marcados em negrito e sublinhados indicam
os códons de iniciação e terminação das ORFs: em vermelho ORF 1, em preto ORF 2, em verde
ORF 3 e em azul ORF 4.
50
4
4
.
.
1
1
0
0
.
.
A
A
m
m
p
p
l
l
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l
l
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d
a
a
R
R
p
p
R
R
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d
.
.
O produto da reação de PCR foi analisado em gel nativo de agarose 1%
evidenciando bandas de tamanho esperado de aproximadame nte 686 pb (Figura
16).
M1
100pb
600pb
1500pb
686pb
Figura 16. Gel nativo de agarose 1% (M): Marcador de tamanho molecular 100 bp DNA
Ladder (Invitrogen); (1) Produto amplificado: 686pb (seta).
51
4
4
.
.
1
1
1
1
.
.
C
C
l
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n
a
a
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l
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d
a
a
R
R
p
p
R
R
d
d
.
.
A figura 17 mostra o corte com enzimas de restrição dos vetores
recombinantes (pGEM-T + inserto, pMALc-2x + inserto e pET 28 a + inserto),
indicando a liberação do fragmento tamanho esperadop de aproximadamente 686
pb, confirmando a presença do inserto. Através do seqüenciamento realizado dos
vetores recombinantes, confirmou-se a presença do fragmento da região 3´ do
gene da polimerase, possibilitando iniciar o processo de expressão da proteína.
A proteína foi expressa na forma solúvel em células de E. coli induzidas
com 1mM de IPTG por 4 horas. A análise da expressão proteica foi realizada
através de SDS-PAGE 10% e revelou a produção de uma proteína de massa
molecular aproximada de 67 kDa (Figura 18), conforme o esperado, uma vez que
a proteína de fusão (“Maltose Binding Protein" – MBP) do vetor tem
aproximadamente 43kDa e a porção C-Terminal da RpRd do SBMV-SP tem
massa molecular estimada em 24kDa. As amostras que foram eluídas da resina de
amilose confirmaram os resultados de expressão. A análise em SDS-PAGE 10%
evidenciou uma banda com massa molecular aproximada de 67kDa, o que
representa a proteína fusionada esperada (Figura 16).
No outro sistema de expressão em E. coli (pET 28 a) a cultura foi
submetida a uma indução com 1mM IPTG por 3 horas. A análise da expressão
também foi realizada através de um SDS PAGE 10%. A proteína também foi
obtida na forma solúvel, com um tamanho aproximado de 30kDa. As amostras
obtidas da eluição da resina de níquel (Invitrogen) foram aplicadas em SDS-
PAGE 10% e analisadas, A purificação da proteína confirma a expressão da
proteína recombinante conforme a figura 19.
52
686pb
M123
1500pb
600pb
100pb
Figura 17: Gel nativo de agarose 1% corte enzimático com Bam HI e Hind III dos
vetores recobinantes que contém o fragmento da polimerase. (M) Marcador de tamanho mo lecular
(100 pb DNA Ladder - Invitrogen). (1) DNA plasmidial (pGEM) recombinante digerido com Bam
HI e Hind III. (2) DNA plasmidial (pMAL) recomb inante digerido com Bam HI e Hind III. (3)
DNA plasmidial (pET 28a) recombinante digerido com Bam HI e Hind III. (Seta) indicando o
fragmento de interesse liberado de 686 pb.
53
M12 3
~ 67KDa
70KDa
*
*
50KDa
20KDa
Figura 18: SDS-PAGE 10% mostrando a expressão em E. coli e purificação parcial da
proteína referente a porção C-Terminal da RdRp fusionada a MBP em coluna de amilose. (M)
Marcador de massa molecular (kDa) BenchMark (Invitrogen). (1) Extrato de células antes da
indução da expressão. (2) Extrato de células após 4 horas de indução com 1mM de IPTG. (3)
Proteína referente a porção C-terminal da RpRd fusionada a MBP parcialmente purificada com
massa molecular estimada em ~67 kDa (seta); (∗) contaminantes.
54
M123
50KDa
30KDa
~30KDa
25KDa
20KDa
Figura 19: SDS-PAGE 10% mostrando a expressão em E. coli e purificação parcial da
proteína referente a porção C-Terminal da RdRp fusionada a cauda de histidina em resina de
níquel (Invitrogen). (M) Marcador de massa molecular (kDa) BenchMark (Invitrogen). (1) Extrato
de células antes da indução da expressão. (2) Extrato de cél ulas após 3 horas de i ndução com 1mM
de IPTG. (3) Proteína referente a porção C-terminal da RpRd fusionada a cauda histidina
purificada com massa molecular estimada em ~ 30 kDa (seta).
55
4
4
.
.
1
1
2
2
.
.
W
W
e
e
s
s
t
t
e
e
r
r
n
n
b
b
l
l
o
o
t
t
.
.
A especificidade foi confirmada ao reagir o anti-soro anti-C-terminal da
polimerase com a proteína recombinante (C-terminal da polimerase + cauda de
histidina) expressa no sistema pET 28 a. Uma banda de aproximadamente 30 kDa
mostra a reação.
M 1 2 3
50KDa
30KDa
25KDa
20KDa
Figura 20: (A) SDS PAGE 12%: (M) marcador de massa molecular (BenchMarkTM
Protein Ladder, Invitrogen); (1) proteína do movimento do Pepper ringspot virus; (2) BSA e
(3) Porção C-terminal da Polimerase do SBMV.
(B) Western blot: (M) marcador de massa molecular (Magic Mark XP, Invitrogen); (1)
Proteína do movimento do Pepper ringspot virus; (2) BSA e (3) Porção C-Terminal d
a
Polimerase do SBMV.
(A) (B)
56
5
5
.
.
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
Os resultados obtidos neste trabalho mostram que a ORF 2 do SBMV-SP
contém 2889 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com 962
aminoácidos deduzidos e massa molecular estimada de aproximadamente 105
kDa. Dentro desta ORF foi localizada a seqüência da ORF3 contendo 398
nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UAA, com 132 aminoácidos
deduzidos e massa molecular estimada de aproximadamente 15 kDa.
A análise feita a partir do seqüenciamento das ORFs 2 e 3 do genoma do
SBMV-SP, quando comparadas com outras espécies do mesmo gênero
(Sobemovirus) e isolados do SBMV, depositadas no GenBank, mostrou que a
ORF 2 possui maior identidade (91,4% na seqüência de nucleotídeos e 95,0% na
seqüência de aminoácidos deduzidos) com o isolado Arkanas do SBMV (Tabela
1). O resultado foi similar em relação à ORF3 com valores de identidade de
97,0% para a seqüência de nucleotídeos e 97,7% para a de aminoácidos deduzidos
(Tabela 2).
Os dados obtidos por Espinha et al. (2004) através do seqüenciamento da
ORF 1 do SBMV-SP mostram que as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos
deste vírus apresentam maior identidade (79%) com o isolado americano (SBMV-
Ark) e pouca identidade com as demais espécies de vírus do gênero Sobemovirus.
A extremidade 3´terminal da ORF1 do SBMV-SP se sobrepõe em 34 nucleotídeos
com a ORF 2 (ESPINHA et al., 2004), sendo que este dado foi também
confirmado no seqüenciamento da ORF 2 do SBMV-SP (Figura 15).
O seqüenciamento realizado para a ORF 4 do isolado São Paulo do SBMV
(ESPINHA et al., 2005) mostrou que há sobreposição de 129 nucleotídeos com a
ORF 2, resultado também obtido no presente trabalho. As seqüências de
nucleotídeos e aminoácidos da ORF 4 também apresentam maior identidade com
as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos do SBMV-Ark , 91% e 93%
respectivamente. Estes dados de identidade das ORFs 1 e 4 confirmam os dados
de identidade das ORFs 2 e 3 deste trabalho.
57
Os dados obtidos pela análise filogenética pelo método da máxima
parcimônia para as seqüências de aminoácidos das ORFs 2 e 3, corroboram os
dados de identidade. Para a ORF 3, os isolados SBMV-SP e SBMV-Ark foram
agrupados em um mesmo ramo em 100% das réplicas, valor próximo dos 96%
obtidos para a ORF 2. Deve-se notar, entretanto, que na análise filogenética das
seqüências de nucleotídeos dos genomas dos Sobemovirus, os isolados SBMV e o
SBMV-Ark foram agrupados num me smo ramo em 100% das réplicas, o mesmo
acontecendo quando da análise das ORF 2. Este fato pode ser explicado pelo fato
de que o SBMV e o SBMV-Ark são isolados encontrados nos Estados Unidos da
América do Norte e o SBMV-SP encontrado no Brasil, indicando haver alguma
diversidade genética entre eles mas que não redundam, entretanto, em mudanças
na seqüência de aminoácidos. A análise filogenética para a ORF3 não foi feita
visto que no seqüenciamento do SBMV inexiste esta ORF (OTHMAN & HULL,
1995). Mais recentemente, Hull & Fargette (2005) mostram a existência de uma
ORF 3 no genoma do SBMV, iniciando na posição 1826 e terminando na posição
2296. Entretanto, esta seqüência não codifica uma proteína, havendo vários
códons de terminação na seqüência. Já foi proposto que as diferenças na
organização genômica do SBMV e SBMV-Ark, resultam de mutações ou erro no
seqüenciamento do SBMV (LEE & ANDERSON, 1998).
Reunindo os resultados obtidos de seqüenciamento deste trabalho com os
dados de seqüenciamento obtidos por Espinha et al. (2004, 2005) das ORFs 1 e 4
do SBMV-SP, foi possível concluir que o genoma do Southern bean mosaic virus
encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP) possui 4133 nucleotídeos,
compreendendo três ORFs (1, 2 e 4) sobrepostas e uma (ORF3) inserida na ORF2,
apresentando organização genômica similar àquela descrita para o SBMV-Ark
(LEE & ANDERSON, 1998) e dentro do padrão de organização representado pelo
Southern cowpea mosaic virus (SCPMV). Um esquema da organização genômica
do SBMV-SP é mostrado a seguir.
58
Analisando a região referente a RpRd foi possível identificar uma
seqüência de heptanuleotídeos (TTTAAAC) com início na posição 1723 e término
na posição 1729 (figura 6). Esta seqüência possivelmente atua como uma região
sinalizadora para o mecanismo ribossomal de frameshift -1 para a tradução da
ORF 3, semelhante ao que ocorre com o CoMV para a ORF 2b (LEE &
ANDERSON, 1998; TAMM et al., 1999). Assim, a ORF3 seria traduzida por um
mecanismo de frameshift -1, o que produziria uma proteína de fusão de
aproximadamente 70 kDa. Tradução in vitro do RNA genômico do SCPMV
produziu uma proteína de aproximadamente 70 kDa, o que poderia ser a proteína
de fusão da ORF2-ORF3 (WU et al., 1987; TAMM et al., 1999). Entretanto,
ainda são necessários mais dados experimentais para comprovação de tal hipótese.
Através da análise das seqüências de aminoácidos, foi possível identificar
outras regiões conservadas, localizadas na ORF 2, citando-se o sítio de ligação da
capa proteica (Coat Protein Biding Site - CPBS) e a porção N-terminal da
seqüência da VPg. A CPBS, inserida na região da serino protease, mostrou ser
uma seqüência muito conservada entre os sobemovírus (Figura 9). Esta região é
importante para a formação do complexo ribonucleoproteico (RNPC) propiciando
estabilização dos vírions (HACKER, 1995). O aminoácido serina (S) em destaque
na Figura 7 está presente em todas as seqüências dos sobemovírus analisadas,
mostrando ser de grande importância, já que faz parte do sítio catalítico da serino
protease. Também foi possível identificar a posição da tríade catalítica H-D-S
(Histidina, posição 181-Ácido Aspártico, posição 216-Serina, posição 284)
presente nas serino proteases. Esta tríade catalítica também é encontrada no
SCPMV, SeMV e outros sobemovírus (LOKESH et al. 2001).
O alinhamento da porção N-terminal da VPg mostrou que esta região é
altamente conservada nas espécies SBMV-SP; SBMV-Ark; SeMV e SCPMV, o
que não se verifica para as espécies CoMV (MÄKINEN et al.,1995) e RYMV
(NGON et al., 1994). Os sítios de clivagem para a serino protease E/T (E-
Glutamato e T- Treonina) também foram identificados, estando localizados entre
as seqüências SP-Vpg e Vpg-RpRd (Figura 8), de maneira similar ao descrito para
espécies do gênero Luteovirus (VAN DER WILK et al., 1997). Uma outra
59
seqüência altamente conservada nas VPg dos sobemovírus, representada pelos
aminoácidos WAD/WGD seguidos por um domínio rico em D/E (MÄKINEN et
al., 1995), foi também identificada no SBMV-SP (Figura 8), onde a seqüência
WAD é seguida de um domínio rico em D. Motivos similares a este também estão
presentes nas VPg do Potato leafroll virus (PLRV) e Beet western yellows virus
(BWYV).
A expressão da porção C-terminal do polimerase do SBMV-SP em E. coli
no sistema pMAL c2-x produziu uma proteína de fusão de aproxima damente 67
kDa em forma nativa. Entretanto, mesmo após purificação em coluna de afinidade
de amilose, alguns contaminantes ainda estavam presentes na preparação (Figura
18). Mesmo assim, alíquotas foram utilizadas para imunização de coelhos visando
a produção de anti-soro específico. Utilizando-se a expressão em sistema pET
28a, houve a produção de uma proteína não fusionada, desnaturada, de
aproximadamente 30 kDa (Figura 19). O anti-soro obtido, quando testado em
Western Blot, mostrou-se específico para a porção C-terminal da polimerase, não
reagindo com outras proteínas utilizadas como controle (Figura 20).
Este anti-soro será de grande valia em estudos futuros, possibilitando
melhor entender o ciclo de multiplicação do Southern bean mosaic virus na célula
60
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C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
Ã
Ã
O
O
• O isolado do SBMV encontrado no Estado de São Paulo é idêntico ao
isolado do mesmo vírus descrito no Estado de Arkansas nos Estados
Unidos da América.
• O anti-soro produzido para a proteína de fusão (C-terminal da polimerase
+ MBP) reagiu eficientemente com a proteína recombinante purificada
expressa no sistema pET 28a (C-terminal da polimerase + cauda de
histidina), mostrando ser específico para essa proteína.
61
7
7
.
.
RESUMO
O presente trabalho consistiu no seqüenciament.4 6e 0 gB0 12 119.4-zação 6e olecular das Cadeias Abertas de Leitura (do genoma do isolado São Paulo do
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8
8
.
.
A
A
B
B
S
S
T
T
R
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A
A
C
C
T
T
The present work consisted of the sequencing and molecular
characterization of the Open Reading Frames (ORFs) 2 and 3 from the São Paulo
isolate genome of Southern bean mosaic virus (SBMV-SP), completing the
sequencing of all the genome of this isolate. The ORF 2 encodes a polyprotein
(serine protease - VPg - RNA dependent RNA polimarase) and the ORF 3 one
product with unknown function.
The sequencing of the ORF 2 reveals 2889 nucleotides, including the stop
codon (UGA), with 962 deduced amino acids e and estimated molecular weight of
approximately 105 kDa. Nested in the ORF 2 were found the ORF 3 with 398
nucleotides, including the stop codon (UAA), with 132 deduced amino acids and
estimated molecular weight of approximately 15 kDa.
The analysis made from the sequences of the ORFs 2 and 3 from the
SBMV-SP genome, when compared with other species of the same gender and
isolates of SBMV, deposited in the GenBank, showed that the ORF 2 presents
higher identity (91,4% in the nucleotide sequence and 95,0% in the deduced
amino acids sequence) with Arkansas isolate. Similar result was obtained in
relation to the ORF 3 with identity values of 97,0% for the nucleotides and
deduced amino acids sequences. Phylogeny data corroborate the identity data.
Conserved regions of the Sobemovirus gender had also been identified
such as Coat Protein Binding Site (CPBS), serine protease catalytic triad (H-D-S)
and heptanucleotide sequence (TTTAAAC).
The Expression in Escherichia coli of the C-terminal region of the RNA
dependent RNA polimerase produced a fusion protein of approximately 67 kDa in
pMAL c2-x system and a 30 kDa protein in pET 28a system. When the fusion
protein was injected in rabbits it had the production of specific anti-serum for the
recombinant protein.
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