( PDF ) Avaliação morfológica e molecular de lesões colônicas em modelo de colite experimental induzida por Dextran Sulfato de Sódio

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AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE

NEOPLASIAS COLÔNICAS EM MODELO DE

COLITE EXPERIMENTAL INDUZIDA POR

DEXTRAN SULFATO DE SÓDIO

RENATA DE ALMEIDA COUDRY

Tese de Doutorado apresentada à Fundação

Antônio Prudente para a obtenção do Grau de

Doutor em Ciências

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Prof. Dr. Fernando Augusto Soares

São Paulo

2005

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do Centro de Tratamento e Pesquisa

Hospital do Câncer A.C. Camargo

Coudry, Renata de Almeida

Avaliação morfológica e molecular de lesões colônicas em

modelo de colite experimental induzida por Dextran Sulfato de Sódio

/ Renata de Almeida Coudry -- São Paulo, 2005.

100p.

Tese(doutorado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração:

Oncologia.

Orientador: Fernando Augusto Soares

Descritores: 1. RETOCOLITE ULCERATIVA. 2. NEOPLASIAS

COLORECTAL. 3. DEXTRAN SULFATO. 4. CAMUNDONGOS/genética.

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AGRADECIMENTOS

Eu gostaria primeiramente de agradecer aos grandes amores da minha vida,

meu marido Daniel e meu filho Lucas, por estarem ao meu lado todo o

tempo nesta fase de dedicação total aos meus estudos. Grandes mudanças

foram feitas neste período, um novo país, um novo lar. Posso dizer que

valeu a pena pois nos deixou mais unidos e, além do meu conhecimento

científico adquirido, ganhamos experiência de vida. Por isso, muito obrigada

por todo o esforço que fizeram para se adaptarem a esta grande, se assim

podemos chamar, aventura. Obrigada Daniel também por toda sua ajuda na

tese, sempre me dando idéias de como deixá-la melhor.

Ao meu orientador, o Prof. Dr. Fernando Soares, que tem total

responsabilidade por todas estas mudanças. Embora minha especialização

fosse em Gineco-Patologia, ele me fez fazer minha tese de mestrado em

cólon. Por este específico motivo apareceu a chance de ir para os EUA e

fazer minha tese de doutorado na mesma área. O Fernando é alguém por

quem tenho grande admiração pois, além de ser um grande profissional,

tanto como morfologista quanto como investigador, é uma pessoa de grande

visão. Ele está sempre à frente das novidades e da modernidade na

Patologia.

Aos meus colegas de trabalho no Hospital do Câncer também vai meu

grande agradecimento por todo apoio que me deram no meu novo

empreendimento.

Agradeço à Sra. Ana Maria Kunari, coordenadora da pós-graduação, por

toda ajuda e por sempre ser tão solícita e eficiente em resolver nossas

dificuldades e à Sra. Suely Francisco e todos os funcionários da biblioteca

da Fundação Antônio Prudente pelo suporte bibliográfico.

No Fox Chase Cancer Center (Filadéfia, EUA), lugar onde desenvolvi minha

pesquisa, gostaria de agradecer ao Dr. Harry Cooper, um grande

Patologista, que me recebeu em seu laboratório de braços abertos e me

proporcionou adquirir experiência em Patologia Gastrointestinal,

principalmente em tumores do cólon, sendo um grande especialista nesta

área e um entusiasta em desvendar os processos que regem o

desenvolvimento deste câncer. À Dra. Margie Clapper, em cujo laboratório

fiz grande parte dos meus experimentos. Seu intenso conhecimento na área

de colite e quimio-prevenção foi de grande ajuda para desenvolver meu

trabalho. À futura Dra. Monique Gary por toda sua ajuda com o cuidado dos

animais usados neste trabalho e também por sua amizade. À Dra. Cinthia

Spitlle e a Sra. Rita Michelli pela imensa ajuda nas técnicas moleculares

que foram utilizadas na tese. À Dra. Wen-Chi Chang pelo trabalho em

conjunto com os animais geneticamente alterados usados na tese. Um

agradecimento muito especial para a Dra. Sibele Meireles que, além de

amiga, é uma grande companheira de trabalho. Obrigada por ler minha tese,

pelos seus comentários sempre pertinentes e excelentes idéias. Ao Sr.

Gerard Caprio por seus dons de professor, os quais abriram-me as portas

para o mundo da bancada. À Sra. Mauren Climaldi por toda sua assistência

e por ser esta pessoa tão bondosa.

Gostaria de agradecer minha mãe Laura e meu pai Jorge por me darem a

chance de prosseguir com meu sonho de ser médica e de estarem sempre

presentes quando preciso. Aos meus irmãos, minhas cunhadas, sobrinhos e

aos meus tios e primos pela atenção e carinho.

Agradeço com grande carinho a Sra. Elivânia Aparecida de Sousa, uma

amiga presente em vários momentos de nossas vidas e que sempre tanto

me ajudou.

Um agradecimento profundo para Cida Coudry e todos os demais membros

da família Coudry, por todo apoio e torcida em todos os nossos projetos de

vida e principalmente neste último que tem sido difícil para nós, pois tivemos

que nos privar da companhia de todos vocês.

Agadeço imensamente aos membros da Fundação AHEPA (The American

Hellenic Educational Progressive Association) que me proporcionaram uma

bolsa para desenvolver meus estudos.

Obrigada Jesus e Nossa Senhora da Aparecida pela proteção constante.

RESUMO

Coudry R. Avaliação morfológica e molecular de lesões colônicas em

modelo de colite experimental induzida por Dextran Sulfato de Sódio

(DSS). São Paulo; 2005. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio Prudente].

A retocolite ulcerativa (RU) é uma doença inflamatória crônica que

caracteristicamente afeta o reto e o intestino grosso e cuja etiologia ainda é

desconhecida. Os pacientes portadores de RU apresentam um alto risco

para o desenvolvimento de câncer colorretal (CCR). O desenvolvimento e a

progressão do câncer associado à RU envolvem vários eventos genéticos

que parecem ser diferentes dos observados nos cânceres esporádicos.

Alterações nos genes Apc e K-ras são menos freqüentes em tumores

associados à RU. O gene TP53 está freqüentemente alterado nos tumores

esporádicos, mas quando relacionados aos tumores incidindo em pacientes

com RU este tende a ser um evento precoce ao invés de tardio como ocorre

naqueles tumores. O gene ß-catenina não se mostra alterado nos tumores

esporádicos ou relacionados à RU, mas a translocação de ß-catenina para o

núcleo das células neoplásicas é um evento comum nos dois tipos de

tumores. O modelo utilizando camundongos para desenvolver colite, através

do uso de DSS desenvolve displasia e câncer muito similares aos

observados em humanos. O estudo da carcinogênese do cólon nestes

camundongos pode ser de grande valia para o melhor entendimento das

alterações que ocorrem em humanos e pode proporcionar o descobrimento

de novos marcadores ou mesmo regimes quimiopreventivos para o câncer

relacionado à RU. O objetivo deste estudo é elucidar os eventos moleculares

das neoplasias relacionadas à RU no modelo experimental animal de colite

induzida por DSS, traçando um paralelo com os estudos moleculares

realizados em humanos. Para isto, foram utilizadas duas abordagens. A

primeira, relacionada com a pesquisa de alterações moleculares nas

neoplasias originadas no modelo de colite pelo uso de DSS e Azoximetano

(AOM) em camundongos sadios, onde foram avaliados os genes Trp53, k-

ras, Apc e ß-catenina. A segunda, relacionada com o uso de DSS em

camundongos alterados geneticamente para o gene Trp53, considerado o

evento inicial nos tumores associados à RU. Neste objetivo além da

pesquisa da mutação do gene k-ras também foram avaliados os aspectos

histológicos das lesões colônicas oriundas neste modelo. Nos camundongos

sadios em uso de DSS/AOM, foram observadas mutações no gene ß-

catenina (códons 32 e 34) e a translocação desta proteína para o núcleo das

células tumorais. Não foram observadas mutações no gene K-ras, Trp53 e a

pesquisa de LOH do gene Apc não foi informativa. Nos camundongos

geneticamente alterados para o gene Trp53 a pesquisa de mutação no gene

k-ras foi negativa. Estes camundongos demonstraram a presença de

displasia e câncer, também muito similares aos humanos, sendo que os

animais homozigotos (p53-/-) apresentaram uma maior incidência de lesões

quando comparados aos animais heterozigotos (p53+/-) e controles p53

(+/+). Além de displasia e câncer os camundongos p53-/- e p53+/-

apresentaram lesões benignas denominadas colite cística profunda e lesões

hiperplásicas, ambas associadas à RU em humanos. O acúmulo de dados

decorrentes de estudos usando o modelo animal de colite induzido

quimicamente deve fornecer informações valiosas para o melhor

entendimento da carcinogênese do cólon em pacientes portadores da RU.

SUMMARY

Coudry R. [Morphological and molecular evaluation of colonic lesions in

a mouse model of experimental colitis induced by Dextran Sulfate

Sodium (DSS)]. São Paulo; 2005. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio

Prudente].

Ulcerative Colitis (UC) is a diffuse inflammatory disease of the colorectum,

which etiology is unknown. UC patients are at increased risk of developing

colorectal cancer (CRC). Development and progression of UC-associated to

CRC involves multiple genetic alterations that appear to be different from

those of sporadic cancer. Alterations of APC gene and k-ras gene are less

frequent than in sporadic colorectal neoplasia. Although, alterations of TP53

gene is a frequently observed in both UC associated tumors and sporadic

tumors, this alteration is an early event in UC related tumors but it is occurs

late in sporadic tumors. Dextran Sulfate Sodium (DSS) mouse colitis model

develop dysplasia and cancer similar to UC in human. Studies of colon

carcinogenesis in this model can be very useful to elucidate mechanisms and

provide development of markers or chemoprevention approaches in the

human situation. The aim of this study is to establish the molecular events in

a DSS mouse colitis model associated neoplasia in parallel with the

molecular alterations seen in humans. Two different approaches had been

used to achieve this goal. First, investigate molecular events in neoplastic

lesions developed in a mouse model of colitis using DSS in combination with

Azoxymethane (AOM) in healthy animals. In this approach, it was investigate

genes, such as Trp53, k-ras, ß-catenin and Apc. Second, evaluate genetic

events in mice deficient in the Trp53 gene, considered an early event in RU-

associated tumors. Besides k-ras evaluation, it was also evaluated the

histological aspects of the colonic lesions in this model. ß-catenin mutation

(codons 32 and 34) and translocation ß-catenin were observed in healthy

animals using DSS/AOM. No mutation of k-ras and Apc were observed and

Apc LOH was not informative. DSS induced colitis in p53 deficient mice

developed dysplasia and cancer. p53-/- (homozygous) showed a higher

incidence of tumors when compared with p53+/- (heterozygous) and p53+/+

(wild-type) animals. No mutation of k-ras gene was observed. Besides

dysplasia and cancer, p53-/- and p53+/- animals developed colite cystica

profunda and hyperplastic lesions, both observed in patients with UC.

The further accumulation of data originated in studies with mouse models of

colitis related-neoplasia chemically-induced should provide information for

better understand UC- related colorectal neoplasia in humans.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema simplificado da via de sinalização Wnt. 70

Figura 2 Carcinogênese colorretal nos tumores esporádicos e

associados à RU. 71

Figura 3 Esquema de indução de colite nos animais SW e p53. 72

Figura 4 Representação do procedimento de LCM. 73

Figura 5 Estudo imunohistoquímico: proteínas p53 e ß-catenina em

modelo de colite induzida por DSS/AOM. 74

Figura 6 Seqüências representando mutação do gene ß-catenina

em modelo de colite induzida por DSS/AOM. 75

Figura 7 Processo inflamatório envolvendo a mucosa intestinal dos

camundongos deficientes para o geneTrp53 tratados com

DSS. 76

Figura 8 Classificação de displasia em camundongos deficientes para

o gene Trp53 com o uso de DSS. 77

Figura 9 Câncer em camundongos deficientes para gene Trp53

tratados com DSS. 78

Figura 10 Câncer mucinoso nos animais deficientes para o gene

Trp53 tratados com DSS. 79

Figura 11 Colite cística profunda em camundongos deficientes para o

gene Trp53 tratados com DSS. 80

Figura 12 Hiperplasia da mucosa intestinal dos animais deficientes para

o gene Trp53 tratados com DSS. 81

Figura 13 Pseudoinvasão em animais deficientes para o gene Trp53

e controles tratados com DSS. 81

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Incidência do câncer colorretal (CCR) por categoria de risco. 67

Tabela 2 Fatores associados com o risco do CCR em pacientes

portadores da RU. 67

Tabela 3 Sequência dos iniciadores de amplificação para k-ras,

ß-catenina e Trp53. 68

Tabela 4 Mutação do gene ß-catenina em lesões colônicas em modelo

de colite induzida por DSS/AOM. 68

Tabela 5 Alterações nos exons 6 e7 do gene Trp53 em animal SW. 69

Tabela 6 Distribuição dos tumores colônicos em animais p53, tratados

com DSS. 69

Tabela 7 Lesões não neoplásicas em animais p53, tratados com DSS. 69

LISTA DE ABREVIATURAS

BAX

do inglês "BCL2-associated X protein"

GADD45

do inglês "Growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha"

GSK3ß

do inglês "Phosphorylation Syntase Kinase 3ß"

IGF2R

do inglês "Insulina Growth Factor Recptor 2"

IL-2

do inglês "Interleucin 2"

IL-10

do inglês "Interleucin 10"

K-ras

do inglês "Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene, homolog"

Mdm2

do inglês "Transformed 3T3 cell double minute 2, p53 binding

protein"

MLH1

do inglês "MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2"

MSH2

do inglês "MutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1"

Tcf

do inglês "T-cell Trancription Factor"

TGFßRII

do inglês "Trasforming Growth Factor ß-Receptor type II"

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Retocolite Ulcerativa 1

1.1.1 Patogênese molecular do câncer colorretal esporádico 5

1.1.1.1 Via de sinalização Wnt 6

1.1.1.2 Gene K-ras 8

1.1.1.3 Gene TP53 8

1.1.1.4 Instabilidade cromossômica 12

1.1.1.5 Instabilidade de microssatélites 12

1.1.2 Patologia molecular do câncer colorretal associado à RU 13

1.1.2.1 Via de sinalização Wnt 14

1.1.2.2 Gene TP53 15

1.1.2.3 Gene K-ras 16

1.1.2.4 MSI 16

1.1.2.5 CIN 17

1.1.2.6 O papel dos RONS na carcinogênese colorretal associado à RU 18

1.1.3 Tipos de lesões precursoras do carcinoma colorretal associado à

RU 19

1.1.3.1

Macroscopia 19

1.1.3.2

Microscopia 21

1.1.3.3

Diferenças moleculares: DALMS vs displasias planas 23

1.1.4 Carcinomas na RU 24

1.1.5

Lesões colônicas não neoplásicas em pacientes com RU 25

1.1.5.1 Hiperplasia 25

1.1.5.2 Colite cística profunda 25

1.1.6 Modelos animais para o estudo da inflamação colônica

relacionados ao CCR 26

1.1.6.1

Dextan Sulfato de Sódio (DSS) em animais sadios 27

1.1.6.2 DSS em animais modificados geneticamente 29

1.1.6.3 Animais com tendências para o desenvolvimento de inflamação 31

2 JUSTIFICATIVA 33

3 OBJETIVOS 36

3.1 Objetivos gerais 36

3.2 Objetivos específicos 36

4 MATERIAL E MÉTODO 37

4.1 Animais e indução de colite 37

4.1.1 Experimento com animais Swiss Webster (SW) 37

4.1.2 Experimento com animais alterados para o gene Trp53 38

4.2 Avaliação histopatológica das lesões colônicas 39

4.3 Captura de células usando microdissecção a laser (LCM) e

isolamento do DNA 41

4.4 Estudo imunohistoquímico das proteínas p53 e ß-catenina 43

4.5 Avaliação de mutação no gene k-ras 44

4.6 Avaliação de mutação no gene ß-catenina 46

4.7 Avaliação de mutação no gene Trp53 47

4.8 Avaliação de LOH no gene APC 47

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 50

RESULTADOS 51

6.1 Modelo de colite utilizando os animais SWs 51

6.1.1 Expressão das proteínas p53 e ß-catenina 51

6.1.2 Mutação dos genes K-ras (exon 1), ß-catenina (exon 3) e Trp53

(exons 5-8) 51

6.1.3 LOH do gene Apc 53

6.1.4 Comparação dos achados moleculares entre as displasias planas e

DALMs 53

6.2

Modelo de colite utilizando animais alterados geneticamente para o

gene p53 54

6.2.1 Achados histopatológicos 54

7 DISCUSSÃO 57

8 CONCLUSÃO 66

9 TABELAS E FIGURAS 67

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 82

1 INTRODUÇÃO

1.1 RETOCOLITE ULCERATIVA

A retocolite ulcerativa (RU) é uma doença inflamatória crônica que

caracteristicamente afeta o reto e o intestino grosso e cuja etiologia ainda é

desconhecida. Pacientes portadores de RU apresentam um alto risco para o

desenvolvimento de câncer gastrointestinal, particularmente do

adenocarcinoma colorretal. O primeiro caso de câncer colorretal ocorrendo

em um paciente com diagnóstico de RU foi descrito em 1925 por CROHN e

ROSENBERG. De fato a RU se apresenta entre as três condições com

maior risco de desenvolvimento de câncer colorretal, estando junto com a

Adenomatose Poliposa Familiar (FAP) e o Câncer Colorretal Hereditário

Sem-Polipose (HNPCC), sendo estas as duas mais importantes formas de

câncer colônico heriditário (LYNCH e DE LA CHAPELLE 2003). A Tabela 1

relaciona os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer colorretal.

O câncer em pacientes com colite tende a se desenvolver 10 anos

mais cedo do que na população em geral (GRANQVIST 1981;

PAPATHEODORIDIS et al. 1996). O risco do desenvolvimento do câncer em

paciente com RU está principalmente relacionado com a duração e a

extensão da doença. A maioria das neoplasias malignas se desenvolve oito

anos após a presença da colite. A incidência acumulada é abaixo de 1% nos

primeiros 8 a 10 anos, mas após isso se observa um aumento anual de 0.5%

a 1% (GYDE et al. 1982; LENNARD-JONES 1985). Comparado com casos

controles, aproximadamente 5 a 10% dos pacientes com RU desenvolvem

câncer colorretal depois de 20 anos e 15 a 20% após 30 anos do diagnóstico

inicial (EKBOM et al. 1990b; HARPAZ e TALBOT 1996). Após 40 anos da

presença da doença, 25-40% dos pacientes que não tiveram uma colectomia

profilática vão desenvolver câncer colorretal (EKBOM et al. 1990a). Quanto

maior a superfície envolvida pela colite maior o risco no desenvolvimento do

câncer. Assim sendo, estudos utilizando enema opaco e/ou colonoscopia

mostraram que o risco do desenvolvimento de um adenocarcinoma é 20 a

30 vezes maior em indivíduos apresentando pancolite com mais de 10 anos

de duração da doença que o risco observado nos casos controles (EKBOM

et al. 1990b; LANGHOLZ et al. 1992).

Um estudo recente demonstrou que a severidade da inflamação no

decorrer do curso da doença também é um fator de risco para o

desenvolvimento do câncer colorretal (RUTTER et al. 2004). Apesar desta

nunca antes ter sido mostrada como um fator de risco, esta evidência pode

ser sustentada por alguns fatores. Primeiro pelo fato da duração da doença

ser um importante fator de risco nos pacientes com RU. Segundo, os

estudos mostram que estes pacientes, quando em uso de antiinflamatórios,

demonstram uma diminuição no risco do desenvolvimento do carcinoma

colorretal (PINCZOWSKI et al. 1994; MOODY et al. 1996; EADEN et al.

2000). Terceiro, o risco do câncer colorretal é muito maior em pacientes com

RU portadores da Colangite Esclerosante Primária (EKBOM et al. 1990b;

BRENTNALL et al. 1996). A Colangite Esclerosante Primária é uma

condição idiopática caracterizada pela inflamação crônica dos ductos biliares

que predispõe não somente ao câncer colorretal assim como ao câncer dos

ductos biliares. Este fator de risco pode não ter sido óbvio até o momento

devido a indicação de colectomia precoce que ocorre na maioria dos

pacientes que apresentam uma inflamação mais severa, pois estes não

respondem adequadamente ao tratamento. Por este motivo não estão mais

em risco de desenvolverem câncer colorretal.

Embora alguns autores tenham descrito que a variabilidade genética

possa ser responsável pelo risco do desenvolvimento do câncer colorretal

em pacientes com colite (RHODES 1996; ASKLING et al. 2001b), um novo

estudo mostrou que parentes de primeiro grau de pacientes portadores da

RU não demonstram um risco aumentado ( ASKLING et al. 2001a).

Início precoce da doença também foi descrito como um fator de risco

por alguns autores mas contestado por outros, desta forma não

apresentando evidências suficientes para uma mudança na conduta de

rastreamento destes pacientes (GREENSTEIN et al. 1979; PRIOR et al.

1982; LENNARD-JONES 1985; EKBOM et al. 1990b; EADEN et al. 2001).

O critério usado para se iniciar o rastreamento do câncer colorretal e

a freqüência do acompanhamento dos pacientes portadores da RU pode

variar em diferentes centros. Segundo um consenso apresentado no

workshop intitulado “Colon Cancer in IBD: Science and Surveillance” no

estado da Florida (EUA) em 2000, este rastreamento deve se iniciar após 8

a 10 anos do início dos sintomas e o intervalo de seguimento deve ser de 1

a 2 anos (ITZKOWITZ e PRESENT 2005). Apesar dos dados mostrarem que

o rastreamento e o acompanhamento realizado até o momento são aspectos

que protegem contra o desenvolvimento do carcinoma colorretal estes

exames não são suficientes para a detecção de todos os cânceres que

desenvolvem em pacientes com RU (CONNELL et al. 1994; SHANAHAN

1995). Por este motivo um melhor entendimento das bases moleculares do

câncer colorretal associado à RU pode ser de grande valia para o

desenvolvimento de um programa de rastreamento e acompanhamento mais

efetivo. Um sumário dos fatores que aumentam e diminuem o risco de

desenvolvimento do câncer colorretal em pacientes portadores da RU está

relacionado na Tabela 2.

É de conhecimento dos clínicos e investigadores que o câncer

colorretal associado à RU se inicia ao longo de uma via com múltiplos

passos e cuja lesão precursora é denominada displasia (HARPAZ e

TALBOT 1996). A displasia é caracterizada por alterações neoplásicas

restritas ao epitélio colônico e confinada pela membrana basal que circunda

as glândulas na qual a lesão se manifesta. A observação de que a displasia

é freqüentemente observada adjacente ao carcinoma é um fator que

sustenta a evolução da displasia para o carcinoma colorretal em pacientes

com RU (WEBB et al. 1991; CONNELL et al. 1994). Além de ser

considerada uma lesão precursora, a displasia também é vista como um

marcador do câncer colorretal. Algumas publicações mostraram que esta

lesão também pode ser observada simultaneamente em outras áreas do

cólon em um paciente com câncer colorretal e, assim sendo, ela funcionaria

como um sinal da presença deste (RANSOHOFF et al. 1985; CONNELL et al.

1994). Para melhor entender as bases moleculares que levam à formação

do câncer nos pacientes com RU, tentou-se traçar uma idéia paralela ao que

ocorre nos carcinomas esporádicos, neoplasia colônica que ocorre na

população em geral, e investigar as mesmas etapas de progressão. O

câncer colorretal esporádico é provavelmente a neoplasia mais bem

conhecida no homem. Histologicamente, ele progride de maneira seqüencial

tendo sido originalmente chamada por FEARON e VOLGESTEIN (1990)

como a seqüência adenoma-carcinoma.

A patogênese molecular da RU relacionada com o câncer colorretal

parece ser um processo complexo, mas é muito importante que se

aprofunde nos conhecimentos da carcinogênese do cólon nesta doença para

que melhores sistemas de detecção sejam incrementados e que se

produzam regimentos quimioterápicos mais eficientes.

1.1.1 Patogênese Molecular do câncer colorretal esporádico

Acredita-se que o desenvolvimento do câncer colorretal siga vários

passos, sendo estes representados por mutações ou alterações

epigenéticas (metilação) que resultam na ativação de um oncogene ou

inativação de um gene supressor de tumor e/ou devido a uma instabilidade

genômica. Esta última é identificada no câncer colorretal como instabilidade

cromossômica (CIN), referindo-se à perda ou ganho de regiões nos

cromossomos e como instabilidade de microssatélites (MSI), que ocorre em

conseqüência da inativação de genes relacionados ao sistema de reparo do

DNA (GRADY 2004). Cada evento altera o comportamento de resposta

fisiológica da célula e provoca uma vantagem na proliferação destas. Com o

acúmulo destes eventos, ocorrem alterações progressivas da proliferação

normal para um comportamento neoplásico maligno, caracterizado pelo

crescimento autônomo e sem restrição, invasão do tecido adjacente e

metástase. Como já demonstrado por vários autores, observa-se uma

correlação entre as alterações genéticas e os achados histopatológicos,

sendo que o câncer colorretal esporádico segue a seqüência adenoma-

carcinoma (MUTO et al. 1975; FEARON e VOGELSTEIN 1990; BODMER

1997).

1.1.1.1 Via de sinalização Wnt

Os genes pertencentes à via de sinalização Wnt que se encontram

mais freqüentemente alterados no câncer colorretal esporádico são: o gene

da polipose adenomatosa colônica (APC) e o gene ß-catenina.

A mutação mais precoce do adenocarcinoma do cólon ocorre no gene

supressor de tumor APC. Como se trata de um gene supressor de tumor, de

acordo com a hipótese dos dois hits de Knudson, a mutação no primeiro

alelo deve ser seguida pela inativação do outro alelo decorrente de uma

nova mutação ou devido à perda do material cromossomal, denominado

perda de heterozigose (LOH) (KNUDSON 1971). Este gene tem um papel

importante na proliferação e diferenciação celular, está localizado no braço

longo do cromossomo 5 e é encontrado mutado em 60 a 80% dos cânceres

colorretais esporádicos (BODMER et al. 1987; POWELL et al. 1992). A

mutação germinativa do gene APC é observada na FAP, uma doença

autossômica dominante caracterizada por centenas ou milhares de pólipos

adenomatosos no cólon (GRODEN et al. 1991).

O produto do gene APC é uma proteína de 312 kD que consiste de

2843 amino-ácidos, multifuncional e que contem vários domínios que

permitem sua interação com outras moléculas (POLAKIS 1997). Uma grande

proporção das mutações ocorre entre os códons 1286 e 1513 que

compreendem apenas 10% da seqüência codificadora do gene APC e é

denominado agrupamento de mutações somáticas (mutation cluster region -

MCR). As mutações que ocorrem em células somáticas são quase

totalmente mutações truncadas que resultam em perda da função do

domínio que segue a MCR. Uma das funções que está relacionada a um dos

domínios perdidos devido à mutação é a regulação da degradação da

proteína ß-catenina. Nas células epiteliais normais do cólon, esta se

encontra predominantemente ligada a E-caderina como parte do complexo

de adesão entre as células, que está localizado na porção lateral da

membrana epitelial. Os níveis citoplasmáticos da ß-catenina são regulados

pela ligação desta com um complexo de outras proteínas, como por exemplo,

APC, GSK-3ß e Axina. Após a ligação a este complexo, a proteína é

fosforilada e subseqüentemente degradada pelo proteossoma. Quando o

gene APC se encontra inativado, desencadeado por um efeito da sinalização

da proteína Wnt ou devido a uma mutação, a proteína ß-catenina se

transloca da porção lateral da membrana da célula para o núcleo, onde se

liga com a proteína Tcf para desencadear a transcrição de vários genes

implicados na proliferação celular (KORINEK et al. 1997).

O gene ß-catenina se encontra mutado em apenas 10 a 15% dos

cânceres colorretais esporádicos (MORIN et al. 1997; SPARKS et al. 1998).

Um esquema representando a associação entre proteínas da via de

sinalização Wnt é demonstrada na Figura 1.

1.1.1.2. Gene K-ras

Cerca de 50% dos tumores colorretais mostram mutação do

oncogene K-ras. A família de proteínas Ras está envolvida na transdução de

sinais e faz parte de um grande número de moléculas que coordenam a

sinalização de eventos celulares que culmina com a proliferação celular. A

maioria das mutações que ocorrem no gene k-ras são mutações com ganho

de função e estão limitadas aos códons 12 e 13 (BOS 1988). É difícil de

concluir precisamente qual o efeito da mutação de k-ras já que esta parece

ser multifatorial. Já foi observada em vários estudos a presença da mutação

de k-ras no epitélio normal da mucosa do cólon. A presença destas

mutações em lesões displásicas só são vistas quando a mutação do gene

APC está associada (WHETSELL et al. 1992; CHAUBERT et al. 1994;

MINAMOTO et al. 1995). Isto implica que k-ras apenas oferece uma

vantagem seletiva para as células que contêm mutação do gene APC.

1.1.1.3 Gene TP53

A perda da função do gene TP53 ocorre de forma tardia na seqüência

adenoma-carcinoma e mais provavelmente é observada antes da evolução

para metástase. A mutação do gene parece demarcar a transição de

adenoma, que é uma lesão benigna, para um tumor maligno, sendo

observada em 70% dos carcinomas colorretais esporádicos (DONEHOWER

e BRADLEY 1993).

Este gene está localizado no braço curto do cromossomo 17 e

apresenta um grande número de funções com um papel fundamental nas

vias de apoptose (EL-DEIRY et al. 1994). Por exemplo, quando ocorre um

dano no DNA, a proteína p53 se torna estável e ativa genes como: p21 e

GADD45 que causam a parada do ciclo celular em G1 permitindo o reparo

do DNA antes que a célula se dirija para fase S. Se o dano for irreparável,

p53 media a ativação de genes que resultam na morte da célula. A cada dia

novos trabalhos mostram que a ativação do gene TP53 não é apenas

decorrente do dano no DNA, mas a outros eventos também são

responsáveis por promover a ativação deste. Entre eles podemos citar:

genotoxicidade, hipoxia, hiperoxia, citoquinas, fatores de crescimento,

estresse oxidativo, alterações metabólicas, contato entre as células, ativação

de oncogenes e vários outros fatores (PRIVES e HALL 1999). A proteína

Mdm2 controla os níveis de p53 na célula causando sua degradação através

do sistema de ubiquitina-proteossoma (HAUPT et al. 1997). Vousden e

colaboradores relataram que a mutação do gene TP53 ou a inativação de

Mdm2, previnem a interação das duas proteínas resultando na estabilidade

de p53 (KUBBUTAT et al. 1997).

Apesar do entendimento dos fatores implicados em sua ativação e

repressão estarem se tornando mais conhecidos, o mecanismo pelo qual

TP53 funciona como um gene supressor de tumor ainda continua em plena

discussão. Novos estudos demonstraram uma nova visão de qual possa ser

o papel de TP53 na formação de tumores. Especificamente, estes novos

dados levam a conclusão de que o papel de TP53 na oncogênese estaria

mais associado a sua função em regular superexpressão de oncogenes do

que seu simples papel na via de regulação de resposta ao dano no DNA

(PRIVES e HALL 1999). A via responsável pela regulação de oncogenes

como, por exemplo, c-myc e ras está relacionada com a estabilização de p53

pela proteína ARF um produto do gene p14

ARF

que se liga a proteína Mdm2

e impede a degradação de p53 (POMERANTZ et al. 1998; ZHANG et al.

(1998). A perda da função de p53 ou ARF promoveria uma grande vantagem

na proliferação celular, pois resultaria na perda de inibidores da atividade

dos oncogenes.

O gene TP53, apesar de ser considerado um gene supressor de

tumor, não parece seguir o modelo de outros genes desta mesma categoria

onde, para a inativação do mesmo, é necessária a presença de mutação em

um alelo seguida pela perda do segundo alelo (KNUDSON 1971). Para

corroborar este fato, DONEHOWER et al. (1992) descreveram a presença

de tumores em camundongos heterozigotos para o gene Trp53

(VENKATACHALAM et al. 1998). Este achado demonstra que o nível da

proteína na célula pode ser um fator importante para o desenvolvimento de

uma neoplasia. ZHAO et al (2000) mostraram que diferentes níveis da

proteína p53 eram seguidos por diferentes sinais de stress e sugeriram que

estes níveis seriam responsáveis por diferentes ações em resposta a

ativação de determinados genes (ZHAO et al. 2000). Outro evento que

sugere a diferença deste gene em relação aos demais genes supressores de

tumor é que estes são inativados por mutações nonsense ou frameshift que

levam à ausência da síntese de proteína (ou a produção de um produto

truncado). Enquanto que, mais de 80% das alterações que ocorrem em

TP53 são decorrentes de uma mutação missense que leva à síntese de uma

proteína completa (full-lenght) (SOUSSI e BEROUD 2001). Porém a proteína

perde a função de se ligar ao DNA e se acumula no núcleo das células

tumorais. SOUSSI e LOZANO (2005) acreditam que este acúmulo possa ter

como conseqüência o papel de um dominante negativo ou um ganho de

função da proteína p53 mutante (SOUSSI e LOZANO 2005). Desta maneira,

apesar de TP53 na sua forma selvagem ser realmente um gene supressor

de tumor, em sua forma mutada se classificaria como um oncogene.

A detecção do acúmulo intracelular da proteína p53 através da

técnica de imunohistoquímica em cânceres colorretais como resultado de

uma mutação missense é amplamente aceita, sendo que 80 a 90% destes

casos apresentam positividade para a proteína p53 (HARRIS e HOLLSTEIN

1993; HANSKI et al. 1996). Este acúmulo pode não ser evidenciado em

aproximadamente 10% dos casos e pode ser decorrente da deleção do gene

em ambos alelos ou quando ocorre uma mutação que não tem efeito na

meia vida da proteína p53 ( HARRIS e HOLLSTEIN 1993).

1.1.1.4 Instabilidade Cromossômica

Além das mutações em oncogenes e genes supressores de tumor,

reconhecida por deleções ou inserções nas pequenas seqüências que

aparecem repetidas vezes no genoma e que são chamadas microssatélites.

Embora MLH1 e MSH2 sejam os genes mais afetados pela perda de função

no câncer colorretal, outros genes também participam do reparo do DNA e

podem dar origem a erros de replicação através do genoma. Estes erros

afetam preferencialmente genes como: TGFßRII, IGF2R e BAX, os quais

contêm microssatélies em sua região codificadora. Assim, a MSI cria um

estado favorável para o acúmulo de mutações em genes vulneráveis que

controlam atividades biológicas críticas das células e estas alterações

podem levar ao desenvolvimento do câncer.

MSI é a marca registrada do HNPCC, pois é encontrada na maioria

dos tumores de pacientes portadores desta síndrome. HNPCC é uma

doença hereditária autossômica dominante, decorrente da mutação

germinativa em genes de reparo do DNA (LYNCH e DE LA CHAPELLE

1999).

1.1.2 Patologia Molecular do câncer colorretal associado à RU

Semelhante ao câncer colorretal esporádico os carcinomas

decorrentes da RU são conseqüência de uma série de eventos genéticos

que se correlacionam com aspectos morfológicos. Acredita-se que a

seqüência se inicie em um epitélio inflamado, progrida para estágios

precursores chamados de displasia (baixo e alto grau) e culmine com o

carcinoma (HARPAZ e TALBOT 1996). No intuito de se desenhar um perfil

molecular similar ao já bem estudado câncer colorretal esporádico, os

investigadores deram ênfase na avaliação de genes, como por exemplo:

TP53, APC, ß-catenina e K-ras. Os achados em estudos buscando

mutações nos genes citados acima mostram que apesar de tumores

relacionados com a RU apresentarem mutação nos mesmos genes, estas se

apresentam em proporções e estágios da carcinogênese que diferem

daquelas observadas nos tumores esporádicos (BENHATTAR e SARAGA

1995).

1.1.2.1 Via de sinalização Wnt

O gene APC que está freqüentemente mutado nos tumores

esporádicos e é considerado um evento inicial na tumorigênese destes,

mostra um padrão totalmente diferente na carcinogênese dos tumores

relacionados à RU. A perda da função do gene APC é muito menos

freqüente nos tumores asssociados à RU e parece corresponder a um

evento tardio. Foi demonstrado nos carcinomas associados à RU que a

freqüência de mutação truncada neste gene é em torno de 30% enquanto

que nos cânceres esporádicos varia de 60 a 80% (REDSTON et al. 1995;

TARMIN et al. 1995). A presença de mutação na mucosa inflamada ou

indefinida para displasia não é observada e apenas 14% das displasias

apresentam este tipo de mutação (TARMIN et al. 1995; AUST et al. 2002).

Existem poucos estudos relacionando alterações de ß-catenina na

carcinogênese de tumores associados à RU. Foi observada uma incidência

de 30% de LOH ocorrendo na região onde se localiza o gene ß-catenina nos

carcinomas relacionados à RU e a mesma incidência desta alteração foi

descrita nos carcinomas esporádicos (AUST et al. 2002). Entretanto, a

mutação deste gene não foi encontrada em um estudo onde poucos casos

de tumores que se desenvolvem em pacientes portadores da RU foram

avaliados (SOUZA et al. 1997). AUST et al. (2001) e colaboradores

mostraram que a translocação da proteína ß-catenina para o núcleo ou

citoplasma das células ocorre em 80% dos carcinomas relacionados à RU.

Todavia, a mutação do gene ß-catenina, no exon 3, não foi observada

nestes tumores.

1.1.2.2 Gene TP53

A freqüência da mutação do gene TP53 nos tumores colônicos

observados na RU varia de 75 a 85%, e são similares aos índices

encontrados nos cânceres esporádicos (BURMER et al. 1990; BRENTNALL

et al. 1994; HARPAZ et al. 1994). Ao contrário do que ocorre nos cânceres

colorretais esporádicos, mutação no gene TP53 foi relatada ocorrendo nas

lesões regenerativas e displásicas, assim como em carcinomas, mas sem

correlação com superexpressão da proteína avaliada por imunohistoquímica

(YOSHIDA et al. 2004). Acredita-se que quando a mutação do gene TP53 é

um evento inicial, como é o caso em RU, ela possa contribuir para uma

vantagem no processo de proliferação celular, enquanto que sua ocorrência

em estágios mais tardios, como no câncer esporádico do cólon, ela

contribuiria com a conversão de uma neoplasia benigna em um carcinoma

(BRENTNALL et al. 1994). A maioria das mutações estão localizadas no

exon 8, mas são também observadas nos exons 5 a 7 (HOLZMANN et al.

1998).

1.1.2.3 Gene K-ras

O gene k-ras, freqüentemente alterado no carcinoma colorretal

esporádico, apresenta uma atuação bastante contraditória na carcinogênese

relacionada à RU. Embora vários estudos tenham mostrado que a

freqüência de mutação neste gene é baixa e pode variar de 0-15%

(BURMER et al. 1990; MELTZER et al. 1990; CHAUBERT et al. 1994, KERN

et al. 1994) observaram uma freqüência de 50% que é comparada à

observada em tumores esporádicos. Um estudo mais recente mostrou que

apenas 3% das mutações do gene K-ras ocorrem em lesões displásicas e

regenerativas e que 40% destas ocorrem no câncer associado a RU

(HOLZMANN et al. 1998). Similarmente ao que ocorre com o gene TP53 em

tumores relacionados à RU e tumores esporádicos, este evento ocorre em

fases diferentes da carcinogênese. O gene K-ras, que tem um papel no

aumento do grau de atipia e tamanho dos adenomas durante a

tumorigênese dos cânceres esporádicos, na RU parece ocorrer na evolução

de uma lesão displásica para o carcinoma.

1.1.2.4 MSI

Tendo em vista que os tumores esporádicos que apresentam

mutação no gene APC não demonstram grandes semelhanças aos tumores

associados à RU, se desenvolveu um interesse em se comparar estes

últimos com tumores procedentes da via de carcinogênese relacionada com

os genes de reparo. Além disso, alguns investigadores relataram a

associação de certos polimorfismos em genes como MSH2 e MLH1, com

esclarecida. A maioria dos estudos realizados até o momento demonstrou

que a instabilidade genômica observada nos tumores relacionados à colite é

a mesma que a observada nos tumores esporádicos (KERN et al. 1994;

AUST et al. 2000; HABERMANN et al. 2003).

1.1.2.6 O papel dos RONS na carcinogênese colorretal associado à RU

Em adição as alterações responsáveis pela carcinogênese colorretal

associada à RU, acima mencionados, vários genes associados à inflamação

também parecem colaborar com o desenvolvimento dos tumores. Estudos

demonstraram que os produtos dos genes ciclooxigenase-2 (COX-2), óxido

nítrico (NO) e sintase do óxido nítrico-2 (NOS-2) estão elevados na mucosa

inflamada de pacientes com RU e persistem elevados nas neoplasias

colônicas (HUSSAIN et al. 2000). A colite, que é desencadeada por um

mecanismo ainda não esclarecido, gera espécies reativas de oxigênio e

nitrogênio (RONS) através das células inflamatórias. Os RONS têm o

potencial de afetar um grande número de processos metabólicos, pois seus

alvos incluem o DNA, RNA, proteínas e lipídios (HUSSAIN et al. 2000;

MARNETT 2000). Foi demonstrado que peroxidase de hidrogênio (H

)

inativa o sistema de reparo do DNA, provavelmente através de sua interação

com o complexo de proteínas responsáveis por esta tarefa (CHANG et al.

2002). Este achado pode explicar o fenótipo de MSI observado na mucosa

inflamada dos pacientes com RU (HOFSETH et al. 2003).

A Figura 2 ilustra o processo simplificado de carcinogênese que rege

a formação dos cânceres esporádicos e dos cânceres associados à RU.

1.1.3 Tipos de lesões precursoras do carcinoma colorretal associado

à RU

Até o início dos anos 70, proctocolectomia profilática era a única

opção de um paciente portador de RU de longa duração para evitar a morte

por um câncer colorretal (EDWARDS e TRUELOVE 1964). Entretanto, com

o reconhecimento de que lesões precursoras definidas como displasias,

estão associadas com o desenvolvimento do câncer colorretal em pacientes

portadores de RU, abriu-se um horizonte para um novo mecanismo de

prevenção (MORSON e PANG 1967). Em 1966 no St. Mark’s Hospital em

Londres foi estabelecido o rastreamento endoscópico para a avaliação das

lesões displásicas no cólon e reto de pacientes portadores da RU

(LENNARD-JONES et al. 1974). Nos dias de hoje, o rastreamento

endoscópico se inicia após 8 a 10 anos de duração da colite e o seguimento

ocorre anualmente ou bi-anualmente com a realização de 2 a 4 biópsias em

intervalos de 10cm de comprimento em busca de alterações displásicas, que

serão descritas a seguir (CONNELL et al. 1994; BERNSTEIN 1999).

1.3.1.1 Macroscopia

As lesões displásicas mostram vários aspectos macroscópicos

incluindo: 1) uma mucosa plana quase completamente sem alterações e que

difere da mucosa normal apenas pela discreta perda nas dobras desta

mucosa; 2) uma aparência aveludada devido à transformação viliforme da

mucosa e também uma variação entre placa e nódulos; e 3) um aspecto

polipóide, lembrando um adenoma.

As lesões descritas no item dois (2) são denominadas DALM

(displasia associada à lesão ou massa) e podem facilmente estar

disfarçadas pelo envolvimento inflamatório da mucosa tornando sua

identificação na colonoscopia muito complexa (BLACKSTONE et al. 1981).

As lesões planas são diagnosticadas microscopicamente quando

ocorre a casualidade de serem representadas na amostragem realizada

durante a colonoscopia (BUTT et al. 1983). Por este motivo sua detecção

depende criticamente de uma representação adequada realizada pelos

colonoscopistas. RUBIN et al. (1992) calcularam que se 33 biópsias fossem

realizadas durante a colonoscopia, ocorreria uma detecção das displasias

em 90% dos casos. Ao passo que se 64 biópsias fossem colhidas, a

detecção chegaria a 95%. A cromoendoscopia com uso de endoscópios

mais potentes (magnifyng endoscopes) aumenta em 3 vezes a detecção de

lesões planas, mas ainda não tem sido amplamente usada provavelmente

pela falta de conhecimento da técnica ou porque esta se mostra associada a

tempo extra e por isso baixa remuneração (PFAU e SIVAK 2001;

KIESSLICH et al. 2003). Devido à alta freqüência dos adenomas

esporádicos, não é impossível que estes também possam estar associados

à pacientes portadores da RU. Estudos recentes têm demonstrado que além

das DALMs e displasias planas, estes pacientes mostram lesões displásicas

com aspecto polipóide, não associadas à áreas de inflamação, incidindo em

pacientes mais velhos (> 40 anos de idade) com aspectos semelhantes aos

dos adenomas esporádicos e por esta razão sendo denominadas lesões

adenoma-like (ENGELSGJERD et al. 1999; RUBIN et al. 1999). A

diferenciação histológica entre DALM e lesões adenoma-like não é possível,

por isso a decisão recai totalmente sobre o endoscopista (SCHNEIDER e

STOLTE 1993). Esta não é uma decisão fácil, pois a conduta tomada frente

às duas lesões é totalmente diferente. Com o diagnóstico de uma DALM vai

ser indicada uma colectomia, já frente a uma lesão adenoma-like a

ressecção desta e o acompanhamento endoscópico é a conduta

estabelecida (MEDLICOTT et al. 1997; TORRES et al. 1998).

1.1.3.2 Microscopia

O reconhecimento histológico das displasias pode ser complicado,

principalmente em biópsias mostrando colite em atividade. Algumas vezes o

diagnóstico diferencial entre displasia e alterações regenerativas pode ser de

grande dificuldade ou mesmo impossível. Por esta razão o “Inflammatory

Bowel Disease Dysplasia Morphology Study Group”, baseado na publicação

de RIDDELL et al. (1983), estabeleceu uma classificação para avaliar

displasias em biópsias de pacientes portadores da RU, que inclui: a)

negativo para displasia, b) positivo para displasia, tratando-se de displasias

de alto e baixo grau e c) alterações indefinidas para o diagnóstico de

displasia. Embora seja recomendada uma subclassificação para a categoria

indefinida para displasia (provavelmente negativo para displasia,

provavelmente positivo e desconhecido), os patologistas tomam esta como

opcional e na maioria das vezes não a utilizam. As anormalidades celulares

(nucleares e citoplasmáticas) e arquiteturais que definem displasia na RU

são similares às alterações observadas em um tecido colônico neoplásico

em geral. Entre as alterações celulares estão: aumento no raio núcleo-

citoplasma, hipercromatismo e pleomorfismo nuclear, nucléolos

proeminentes, figuras de mitose anormais, perda da polaridade nuclear,

basofilia citoplasmática e redução ou ausência das células caliciformes. As

alterações arquiteturais geralmente são resultantes de um arranjo glandular

similar aos adenomas. Em contraste com as criptas observadas em um

epitélio normal ou mesmo regenerativo, que exibe um gradiente de

maturação da base para a superfície, as criptas com alterações displásicas

permanecem imaturas ao longo de todo eixo.

As lesões consideradas positivas para displasia, o que indica que esta

pode estar associada ou progredir para um adenocarcinoma, são

subdivididas em baixo e alto grau, principalmente devido à implicação destas

em relação à conduta (BERNSTEIN et al. 1994). Displasia de baixo grau é

caracterizada por aspectos similares aos observados em adenomas e é

geralmente encontrada em lesões planas. As criptas envolvidas são

revestidas por um epitélio alto com diferenciação incompleta mostrando

núcleos alongados, pseudoestratificados e levemente hipercromáticos.

Alguma mucina pode ser produzida pelas células neoplásicas, mas a

quantidade se mostra sempre reduzida. Células caliciformes distróficas

podem estar presentes. A superfície de uma displasia de baixo grau pode

ser vilosa ou plana. A arquitetura das criptas tende a estar preservada.

A displasia de alto grau inclui casos anteriormente classificados como

displasia moderada e difere das displasias de baixo-grau por apresentarem

um maior grau de atipia citológica. Nas displasias de alto grau os núcleos

perdem sua polaridade e tendem a apresentar nucléolos proeminentes. A

estratificação nuclear não se mostra apenas restrita à porção basal, mas se

estende além da porção média das criptas. Displasias de baixo e alto grau

podem coexistir na mesma lesão e o diagnóstico definitivo é baseado no

maior grau de alteração. Claro que é necessário bom senso, pois a presença

de apenas uma ou duas criptas com alterações de alto grau não são

suficientes para um aumento no grau da displasia.

O diagnóstico de lesão indefinida para neoplasia é feito quando as

alterações citológicas parecem exceder o que se espera observar em uma

mucosa com colite em atividade, mas ao mesmo tempo estas são

insuficientes para o diagnóstico de displasia, especialmente em biópsias

escassas.

1.1.3.3 Diferenças moleculares: DALMS vs displasias planas

A questão é se displasia plana e DALM são apenas aspectos

morfológicos diferentes de uma mesma lesão ou na verdade são duas

lesões totalmente distintas. Apesar de algumas similaridades moleculares

entre estas lesões, como por exemplo, alterações genéticas nos

cromossomos 9p e 5q, diferenças no envolvimento dos genes VHL e TP53

são observadas. Deleções de marcadores próximos ao gene VHL são vistas

em 50% das DALMs, mas pouco freqüente nas displasias planas (12%).

Neste mesmo trabalho foi demonstrado que estas alterações também são

observadas em áreas não acometidas microscopicamente e adjacentes às

lesões displásicas (FOGT et al. 1998). A LOH do gene TP53 foi observada

com maior freqüência nas lesões planas (6 de 14 casos informativos) que

nas DALMs (2 de 12 casos informativos). Este achado pode ser indício de

que DALMs seguem uma via de carcinogênese na qual a deleção do alelo

selvagem não é um evento precoce. Foi demonstrado um aumento na

expressão da proteína p53 semelhante nas duas lesões (RUBIO e

RODENSJO 1995).

1.1.4 Carcinomas na RU

A maioria dos carcinomas se origina nas áreas mostrando

inflamação. O diagnóstico macroscópico de neoplasias malignas pequenas

pode ser difícil, pois são caracterizadas apenas por uma pequena área

nodular ou uma placa. Microscopicamente o diagnóstico de carcinoma

também pode ser um desafio, devido à tendência destes cânceres em

apresentar na sua porção superficial apenas alterações displásicas (FOGT

et al. 1998). Alguns carcinomas na RU apresentam infiltração da lâmina

própria sem a extensão deste através da muscularis mucosae como é visto

nos tumores gástricos. Adenocarcinomas em pacientes portadores da RU

mostram uma grande variedade de tipos histológicos, mas os tumores

mucinosos e pouco diferenciados são mais freqüentes neste pacientes que

nos pacientes com carcinomas esporádicos. Um estudo demonstrou que

54% dos tumores apresentavam aspectos colóides e 27% mostravam

células em anel de sinete (HARPAZ e TALBOT 1996).

1.1.5 Lesões colônicas não neoplásicas em pacientes com RU

1.1.5.1 Hiperplasia

Criptas com padrão serrilhado ou aspectos similares a pólipos

hiperplasicos são observados em pacientes portadores da RU. Uma grande

variedade de alterações é observada nestas lesões, desde de alterações

indefinidas para displasia como até mesmo alterações displásicas, e esta

quando presente se mostra confinada à porção basal da cripta.

1.1.5.2 Colite cística profunda

Trata-se de uma lesão benigna observada em pacientes portadores

de RU. O primeiro caso de um paciente apresentando a lesão foi descrito em

1766 e consistia da presença de cistos localizados na submucosa do cólon

em um paciente portador de diarréia crônica. GOODALL e SICLAIR (1957)

descreveram a ocorrência de cistos em pacientes portadores de RU e

chamaram a atenção dos médicos para esta lesão benigna antes pouco

conhecid. Em uma série com 19 pacientes apresentando colite cística

profunda, EPSTEIN et al. (1966) descreveram os aspectos histológicos

envolvendo lesão cística localizada e difusa. As glândulas se estendem da

mucosa até a submucosa e se tornam dilatadas ao atingir esta última. O

epitélio revestindo os cistos é semelhante ao epitélio da mucosa normal do

cólon, mas células colunares altas ou mesmo cuboidais são evidenciadas

também. Alguns cistos não mostram nenhum epitélio revestindo-os e são

como lagos de mucina permeando a submucosa. Atipia ou anaplasia não foi

observada em nenhuma glândula ou cisto localizado na sbmucosa. O

principal aspecto relacionado à colite cística profunda é seu diagnóstico

diferencial com adenocarcinoma mucinoso, principalmente quando uma

biópsia pequena é examinada. SILVER e STOLAR (1969) descreveram

alguns aspectos que são necessários para esta diferenciação, como por

exemplo, lagos de mucina contendo pequenos aglomerados de células

malignas, irregularidade no formato das glândulas e mais de uma camada de

células revestindo as glândulas e cistos, que são características observadas

no adenocarcinoma mucinoso.

1.1.6 Modelos animais para o estudo da inflamação colônica

relacionados ao CCR

Os modelos animais de inflamação têm servido a investigadores

para melhor entender o papel da inflamação no câncer colorretal em um

modelo in vivo que pode recapitular muitos dos aspectos que ocorrem nos

seres humanos. Três principais abordagens têm sido utilizadas: a) a indução

de inflamação em animais sadios com agentes que irritam o cólon e a

monitoração para o desenvolvimento de neoplasia; b) a indução de

inflamação em animais alterados geneticamente sendo que a maioria destes

apresentam tendência no desenvolvimento de tumores colônicos; e c) o

estudo de animais que mostram uma predisposição genética para

inflamação e seu seguimento para a avaliação de tumores no cólon.

1.1.6.1 Dextan Sulfato de Sódio (DSS) em animais sadios

DSS é um polissacarídio sulfatado produzido sinteticamente e que

tem o potencial de desenvolver colite em modelos animais quando

administrados através da dieta ou misturados à água ingerida (MARCUS e

WATT 1969; WATT e MARCUS 1971; OHKUSA 1985). OKAYASU et al.

(1990) escreveram a presença de displasia e carcinoma em cobaias após o

uso de DSS por um longo período (YAMADA et al. 1992). Este trabalho tinha

o objetivo de verificar se a duração da colite num modelo animal mostrava o

mesmo risco de desenvolvimento de neoplasia que a RU produz no humano.

Colites aguda e crônica foram induzidas em camundongos BALB/C e CBA/J

com o uso de DSS (5-10%) misturado à água para reproduzir os períodos de

atividade e remissão característicos da RU (OKAYASU et al. 1990). Para isto,

4-5 ciclos de DSS foram dados aos animais, onde cada ciclo correspondia à

ingestão de DSS adicionado à água durante sete dias, seguidos de água por

10 dias. Os autores demonstraram que aspectos clínicos e histopatológicos

relacionados à colite induzida eram muito similares aos observados em

humanos, como por exemplo: diarréia, sangue oculto nas fezes, perda de

peso, melena, inflamação da mucosa intestinal com formação de abscessos

nas criptas e erosão do epitélio superficial.

COOPER et al. (1993 e 2000), usando camundongos Swiss Webster,

estudaram as alterações histológicas precoces de indução de colite e

também avaliaram as lesões displásicas e carcinomas presentes neste

modelo. Este modelo mostrou que a incidência de displasia e/ou câncer

variou de 10% a 37%. Esta incidência varia de acordo com a duração da

colite, que é um aspecto análogo ao reportado em humanos (7,5 a 38%)

(COLLINS et al. 1987; LOFBERG et al. 1990). É importante ressaltar que os

camundongos que recebem DSS também reproduzem o achado de lesões

planas e DALMS observados em humanos e além disso as displasias planas

foram associadas à severidade da colite (COOPER et al. 2000).

Estudos demonstram que o dano causado por estresse oxidativo é o

responsável pela indução de inflamação e tumor no modelo experimental de

colite pelo uso de DSS (BLACKBURN et al. 1997). O uso de agentes

antioxidantes diminui o índice de inflamação e o número de

adenocarcinomas em camundongos tratados com DSS. Além disso,

observa-se uma diminuição na expressão de iNOS e nitrotirosina nos

macrófagos da mucosa colônica e dos tumores destes animais (SERIL et al.

2002).

Acredita-se que o carcinoma colorretal esporádico em humanos é

causado pela exposição crônica a pequenas quantidades de agentes

mutagênicos e/ou carcinogênicos e promotores (SUGIMURA et al. 2000).

Azoximetano (AOM) é um carcinógeno específico do cólon de roedores cujo

mecanismo de ação consiste na formação de adutos no DNA das células.

Esta substância quando administrada por via intraperitoneal em várias doses,

produz tumores na porção distal do cólon de linhagens de roedores que são

mais suscetíveis. Estes tumores exibem aspectos histológicos semelhantes

aos tumores esporádicos observados em humanos (SHAMSUDDIN e

TRUMP 1981; DELKER et al. 1999). Desta forma, no intuito de se

desenvolver um modelo animal mais eficiente de colite associada a

carcinogênese colorretal, uma única injeção intraperitoneal de AOM foi

administrada em camundongos machos Crj: CD-1 seguida por ciclos de DSS

(TANAKA et al. 2003). Neste estudo todos os animais desenvolveram

tumores intestinais 20 semanas após o início do experimento e estes

mostraram translocação patológica de ß-catenina para o núcleo e um

aumento na expressão de COX-2 e iNOS, mas não foi observada

positividade nuclear para a proteína p53.

1.1.6.2 DSS em animais modificados geneticamente

O animal sem o gene (knockout) MSH2 é uma mistura de

camundongos C57BL/6 e 129/Ola que desenvolvem, além de linfomas, uma

alta freqüência de tumores intestinais (REITMAIR et al. 1996). Após o uso de

DSS esta incidência aumenta ainda mais, sendo que 28 de 30 animais

apresentam displasia ou câncer seguido deste tratamento (KOHONEN-

CORISH et al. 2002).

O primeiro modelo animal de tumorigênese do trato gastrintestinal foi

gerado através de uma mutação nonsense induzida por ethylnitrosourea no

gene Apc, que leva a morte dos animais homozigotos, mas em heterozigotos

observa-se uma grande quantidade de tumores principalmente no intestino

delgado (MOSER et al. 1990). Estes camundongos, conhecidos como Apc

Min/+

, foram também estudados por nosso grupo no contexto de colite

induzida por DSS (COOPER et al. 2001). A presença de neoplasia invasiva

não é observada nos camundongos Apc

Min/+

que não são tratados com DSS.

Ao passo que, em animais recebendo dois ciclos de DSS foi observada a

incidência de 22% de cânceres e quando três ciclos eram administrados um

aumento para 40% ocorria nestes animais. Além disso, os camundongos

apresentando inflamação mais intensa tiveram um maior índice de lesões.

Até o momento apenas um estudo foi relatado usando camundongos

sem o gene p53 em associação com DSS (FUJII et al. 2004). Os estudos

demonstraram que estes animais apresentam uma aparência normal, mas

desenvolvem uma variedade de neoplasias e tendem a morrer ao redor dos

seis meses de idade (DONEHOWER et al. 1992). Os camundongos

heterozigotos também apresentam uma alta taxa de tumores. Os tumores

mais incidentes são linfomas e sarcomas, sendo que o primeiro ocorre em

mais de 70% dos camundongos homozigotos (p53-/-). A neoplasia colônica

foi reportada ocorrer espontaneamente em 2% dos camundongos

heterozigotos (p53+/-), mas não é uma característica dos camundongos

homozigotos (HARVEY et al. 1993a; PURDIE et al. 1994). Quando colite é

induzida por DSS em camundongos p53 geneticamente alterados, animais

p53-/- apresentam uma incidência de neoplasia colônica de 100%, animais

p53-/+ de 46.2% e os animais wild-type (C57BL/6 x CBA - p53+/+) uma

incidência de 13.3% (FUJII et al. 2004). A maioria das neoplasias

observadas neste modelo são lesões planas tanto nos camundongos

homozigotos quanto nos heterozigotos. Também foi observada neste modelo

a presença de translocação da proteína ß-catenina para o núcleo pela

técnica de immuno-histoquímica e a ausência de mutação no gene K-ras no

códon 12, por seqüenciamento direto.

1.1.6.3 Animais com tendência para o desenvolvimento de inflamação

Os camundongos sem o gene IL-2, cujo produto é uma citoquina

reguladora essencial para o sistema imune, apresentam perda completa na

atividade desta proteína e cerca de 50% dos animais morrem em 9 semanas

com esplenomegalia, linfoadenopatias e anemia hemolítica severa (HIBI et al.

2002) . Apesar da limitação na sobrevida, a presença de displasia, mas não

a de câncer, é observada no intestino destes animais (SOHN et al. 2001).

Camundongos sem os genes IL-2 e ß

-Microglobulin desenvolvem pancolite

similar aos camundongos deficientes apenas para o gene IL-2, mas estes

animais apresentam doença menos severa e mostram uma sobrevida maior

(>6 mêses) com uma incidência de tumor em torno de 32%. Estudos

moleculares mostraram que todos os tumores apresentam mutação no gene

Apc, 50% mostram mutação em Trp53 e a grande maioria tem MSI.

Os camundongos sem o gene IL-10 demonstram uma incidência de

100% de colite aos três meses de idade com mortalidade de 30%. Kulleberg

e colegas demonstraram que a inflamação no cólon de camundongos IL-10

nulo é dependente da presença de Helicobacter hepaticus, uma bactéria

comum em animais alterados geneticamente, já que com a eliminação desta

pelo uso de antibióticos os animais não produziam mais colite (KULLBERG

et al. 1998). Outras alterações no cólon destes camundongos são

caracterizadas por hiperplasia e lesões degenerativas do epitélio e aos seis

meses de idade apresentam o desenvolvimento de tumores colônicos. Os

adenocarcinomas presentes neste modelo não apresentam alterações nos

genes Apc, Trp53, K-ras e Msh2, desta forma o mecanismo molecular

destes tumores continua desconhecido.

2 JUSTIFICATIVA

O uso de camundongos como modelo animal para o estudo do

carcinoma do cólon tem se tornado uma ferramenta de grande valia, pois em

muitos casos os aspectos histológicos, distribuição de lesões e progressão

natural da doença são muito similares aos observados em humanos. A RU

relacionada ao câncer colorretal também tem sido estudada nestes modelos.

É sabido que a displasia nesta doença é considerada, até o momento, o

único marcador do desenvolvimento do carcinoma colorretal em humanos.

Apesar de vários estudos terem sido realizados em um modelo animal que

recapitula os aspectos morfológicos da carcinogênese do câncer colorretal

originado em pacientes portadores da RU, pouco tem sido esclarecido

quanto a seus aspectos moleculares. O objetivo deste trabalho é elucidar os

eventos moleculares da RU relacionada à displasia no modelo experimental

animal de colite induzida por DSS, traçando um paralelo com os estudos

moleculares em displasia e câncer que foram realizados em humanos.

Estudos com esta finalidade são muito importantes para o uso destes

modelos na descoberta de novos marcadores que ajudem na elaboração de

sistemas de detecção mais eficientes e regimes quimiopreventivos eficazes.

Este trabalho consta de dois objetivos específicos, sendo que o

primeiro está associado à pesquisa de alterações moleculares nas lesões

displásicas relacionadas ao modelo de indução de colite pelo uso de

DSS/AOM em um animal sadio. O segundo trata da avaliação das lesões

colônicas e alterações moleculares ocorrendo num modelo de indução de

colite pelo uso de DSS em um animal alterado geneticamente.

O modelo de indução de colite e displasias pelo uso de DSS/AOM em

animais SWs sadios já vem sendo utilizado por este grupo para a

avaliação da resposta a quimiopreventivos. Apesar das alterações clínicas

e morfológicas deste modelo já serem bem conhecidas, o entendimento

das alterações moleculares é escasso e precisa ser discutido. Além disso,

durante nossos estudos de avaliação de agentes quimiopreventivos neste

modelo, foi observada uma resposta seletiva no efeito quimiopreventivo

das drogas entre lesões displásicas planas e DALMs. O uso do

antiinflamatório Celecoxib mostrou uma diminuição na multiplicidade das

displasias em torno de 50%, mas apenas em relação às DALMs (COUDRY

et al. 2004). Entretanto, o agente 5-ASA (5-ácido aminosalicílico) inibe a

formação de colite associada à displasia em 44%, às custas das lesões

planas (GARY et al. 2004). Esta observação deixa a dúvida se estas duas

lesões são apenas variação morfológica da mesma lesão ou duas lesões

completamente diferentes que por isso respondem diferentemente a

agentes preventivos.

Na tentativa de simular os mesmos passos da carcinogênese que

estão associados à RU, onde o gene TP53 é um evento inicial, a colite foi

induzida pelo uso de DSS em camundongos alterados geneticamente para o

gene Trp53. Até o momento apenas um estudo foi publicado mostrando a

indução de tumores colônicos em animais p53 deficientes com o uso de DSS

(FUJII et al. 2004). O background dos animais usados neste trabalho

constava de camundongos C57BL/6 x CBA. Porém, nosso estudo foi

conduzido em camundongos C57BL/6. Sabe-se que linhagens diferentes de

animais apresentam diferente suscetibilidade para a formação de tumores

(NAMBIAR et al. 2003). Por este motivo foi realizada a caracterização das

lesões colônicas no modelo usado.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

Este trabalho tem o objetivo de avaliar alguns dos possíveis eventos

moleculares incidentes nas lesões colônicas relacionadas ao modelo de

indução de colite pelo DSS e avaliar fenotipicamente as lesões colônicas em

animais alterados geneticamente para o gene Trp53.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

A Objetivo específico 1: DSS/AOM em animais Swiss Webster

1 Avaliar o status de mutação nos genes Trp53, K-ras e ß-catenina,

LOH do gene APC e expressão das proteínas p53 e ß-catenina,

2 Comparar as alterações genéticas observadas no objetivo anterior

entre as lesões planas e DALMs.

B Objetivo específico 2: DSS em animais deficientes em p53

1 Caracterização de lesões colônicas,

2 Avaliar o status de mutação no gene K-ras.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS E INDUÇÃO DE COLITE

4.1.1 Experimento com animais Swiss Webster (SW)

O protocolo de uso dos animais foi aprovado pelo “Institutional Animal

Care and Use Comitte” (IACUC) no Fox Chase Cancer Center (FCCC),

Filadélfia, EUA. Fêmeas SW foram adquiridas da companhia Taconic Farms

(Albany, NY) com seis semanas de idade e mantidas no biotério do FCCC

em condições de umidade e luminosidades controladas para adaptação ao

meio ambiente antes do início do experimento. Os camundongos receberam

ração Purina e água ad libitum. Após uma semana (animais com sete

semanas de idade), os camundongos foram pesados e foi administrada uma

única injeção intraperitoneal de AOM dissolvido em solução salina na dose

de 7,4 mg/kg. Após uma semana, foi iniciado o primeiro ciclo de DSS, que

correspondia a sete dias de ingestão de água contendo DSS 4% seguidos

por 14 dias de recuperação com ingestão de água pura, como descrito

previamente (COOPER et al. 2000). A substância DSS denominada de alto

peso molecular (30-40.000) foi adquirida da companhia ICN Biomedicals Inc;

Costa Mesa, CA. Mais dois ciclos se seguiram e os camundongos foram

sacrificados no final do terceiro ciclo com 18 semanas de vida. Animais em

sofrimento, em qualquer parte do estudo, receberam eutanásia através de

asfixia por CO

. Um esquema mostrando as etapas deste processo está

apresentado na Figura 3.

4.1.2 Experimento com animais alterados para o gene Trp53

Os camundongos alterados geneticamente para o gene Trp53: p53 -/-

(homozigotos), p53 -/+ (heterozigotos) e p53+/+ (animais controles) foram

adquiridos das colônias (C57BL/6) pertencentes à companhia Taconic Farms.

Estes receberam os mesmos cuidados relatados acima dedicados aos

camundongos SWs. A colite foi induzida nos camundongos com 10 semanas

de vida usando quatro ciclos de tratamento com DSS nos animais p53 +/+ e

três ciclos nos animais p53 -/- e p53 -/+, em. Os ciclos consistiram de quatro

dias de ingestão de água contendo DSS 4% seguidos por 21 dias de água

pura. Após o término dos ciclos de DSS, os camundongos alterados

geneticamente para o gene Trp53 e os camundongos controles, foram

mantidos com água pura por um período adicional de 120 dias. Os

camundongos foram sacrificados com um total de 265 dias para os animais

p53-/- e p53+/- e 290 dias para os animais p53+/+. Este protocolo foi obtido

após estudos pilotos avaliando a toxicidade e a promoção de tumores pelo

regime usado. Nestes estudos preliminares foi verificado que os animais p53

+/+ só produzem tumores quando expostos a mais de três ciclos de DSS e

animais p53-/- e p53+/- não resistem ao uso de mais de três ciclos de DSS.

Como controle do tratamento foram usados animais p53 -/-, p53 -/+ e p53

+/+ sem o uso de DSS. Animais em sofrimento receberam eutanásia através

de asfixia por CO

. Um esquema mostrando as etapas deste processo está

apresentado na Figura 3.

4.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES

COLÔNICAS

Após o sacrifício dos animais o abdômen dos camundongos foi aberto

e o cólon, retirado. O cólon foi aberto em sua porção longitudinal e lavado

em solução salina à 4

C. A seguir foi colocado em um papel histológico

cortado em fitas estreitas e examinado para avaliação de lesões

macroscópicas. Todas as lesões foram contadas e registradas em uma ficha

de sacrifício designada para cada animal. Lesão maior que 4mm foi dividida

ao meio, sendo que uma parte foi congelada em nitrogênio líquido, para criar

um banco de lesões, e a outra parte foi fixada em etanol 70%, para

avaliação histológica. O intestino restante depositado no papel histológico foi

enrolado com o auxílio de um canudo e fixado em etanol 70%. Após 12

horas de fixação o cólon foi dividido em três porções: proximal, médio e

distal. Foi cortado em fatias em intervalos de 2mm e encaminhado para o

processamento histológico. Uma lâmina corada em Hematoxilina e Eosina

(H&E) foi destinada ao exame histopatológico.

A avaliação histológica das displasias foi baseada na classificação

desenvolvida pelo “Inflammatory Bowel Disease-Dysplasia Morphology

Study Group” (RIDDELL et al. 1983). As lesões foram classificadas como:

negativa, indefinida e positiva para neoplasias. As lesões classificadas como

positivas para displasia foram designadas planas ou polipóides. Aquelas

lesões que não se encaixavam como planas ou polipóides, provavelmente

devido a um artefato na inclusão do fragmento, foram chamadas de

indeterminadas. Em adição, as displasias foram classificadas como baixo

grau e alto grau. Displasia de baixo grau foi caracterizada pela presença de

células com núcleos alongados, discretamente hipercromáticos e com

discreta estratificação nuclear, mas que ainda mantinham a polaridade em

relação à membrana basal. Displasia de alto grau foi caracterizada por uma

atipia nuclear e arquitetural muito mais pronunciadas: 1) complexa

irregularidade das glândulas e mostrando um padrão cribriforme; 2) intensa

hipercromasia nuclear com perda da polaridade; e 3) presença de nucléolos

evidentes e numerosas figuras de mitose.

Os adenocarcinomas também designados planos ou polipóides foram

classificados segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) na

publicação dos tumores do sistema digestivo (HAMILTON et al. 2000).

Adenocarcinomas foram chamados de mucinosos quando estes eram

compostos de mucina extracelular em mais que 50 % de sua totalidade.

Pseudoinvasão e presença de glândulas em meio à parede intestinal

sem uma conotação maligna foram diagnosticadas quando os seguintes

aspectos, característicos de neoplasia maligna, não estavam presentes: 1)

desmoplasia que não estava associada a um processo inflamatório; 2)

presença de glândulas com aspecto irregular e angulado; 3) células

glandulares diferentes das células da mucosa superficial com atipia

excedendo uma displasia de baixo-grau e 4) ausência de membrana basal

envolvendo as glândulas (BOIVIN et al. 2003).

Lesões hiperplásicas foram caracterizadas por uma expansão da

porção proliferativa das criptas e maturação das células na porção superficial

com aspecto serrilhado.

A avaliação histopatológica descrita nos parágrafos acima é relativa

apenas aos animais p53. O tecido adquirido para o estudo das alterações

moleculares nos animais SWs foi oriundo de um trabalho anterior cuja

finalidade era a avaliação de agentes quimiopreventivos neste modelo

(COUDRY et al. 2004). Neste estudo as lesões displásicas foram

classificadas em planas e DALMs, pois o desenvolvimento espontâneo de

adenomas, que pode ser observado nos animais deficientes para o gene p53,

não é observado em camundongos SWs. As lesões displásicas não foram

sub-classificadas em baixo e alto grau, pois em animais SWs após o uso de

DSS as lesões displásicas apresentam aspectos de lesões de alto-grau.

Foram selecionadas 28 lesões DALMs e 12 lesões planas para avaliação

molecular.

4.3 CAPTURA DE CÉLULAS USANDO MICRODISSECÇÃO A

LASER (LCM) E ISOLAMENTO DO DNA

O procedimento de LCM foi realizado no intuito de coletar uma

população homogênea de células epiteliais displásicas. Desta maneira evita-

se a presença de células contaminantes que podem mascarar a detecção de

alterações presentes apenas nas células displásicas. Para a realização da

LCM, os tecidos colônicos embebidos em parafina, correspondentes a cada

lesão, foram cortados numa espessura de 5µm e colocados numa lâmina

comum (não carregada). As lâminas foram colocadas em uma caixa

apropriada e mantidas a -80

C até o momento do início do procedimento.

Antes do procedimento de LCM, as lâminas seguiram um processo de

desparafinização e em seguida foram hidratadas com banhos consecutivos

de 30 segundos em um gradiente decrescente de etanol (100%, 95%, 75%)

e água. Foram coradas com Staining Solution (Arcturus Bioscience;

Mountain View, CA) por 30 segundos e depois desidratadas com banhos

seqüenciais em etanol 75% (30 seg), 95% (30 seg) e 100% (2 min) e Xileno

por 5 minutos. As lâminas secaram ao ar livre por 5 minutos e a LCM foi

realizada imediatamente. Foram coletadas cerca de 2.000 células usando

um sistema automático de captura, o AutoPix Automated System (Arcturus,

Mountain View, CA). A Figura 4 representa o procedimeno de LCM.

O DNA foi extraído e isolado das células capturadas com o uso do

produto PicoPure DNA kit (Arcturus Bioscience, CA) de acordo com o

protocolo do fornecedor. Blocos com fragmentos de pele de todos os

camundongos SW/AOM/DSS e pertencentes a 6 camundongos (2 para cada

animal p53-/-, p53 +/- e p53 +/+) foram cortados com 5µm de espessura e

DNA foi isolado, seguindo o mesmo protocolo descrito acima, com exceção

da microdissecção a laser, para servirem de controle na análise de

mutações.

4.4 ESTUDO IMUNOHISTOQUÍMICO DAS PROTEÍNAS P53 E ß-

CATENINA

Para a realização da técnica imunohistoquímica foram realizados

cortes de 5µm de espessura em blocos de animais SWs contendo lesões

displásicas e mucosa normal. Foram usados anticorpos contra as proteínas

p53 e ß-catenina e a detecção foi através do complexo avidina-biotina-

peroxidase, como descrito previamente (COOPER et al. 2000). O anticorpo

usado contra ß-catenina (Sigma, St Louis, MO) foi um anticorpo policlonal de

coelho contra o peptídeo amino-ácido 768-781. O anticorpo contra p53

(produto CM5, Novocastra Laboratorie, UK) é também policlonal de coelho e

que reage com a proteína selvagem e mutada. O anticorpo contra ß-catenina

foi diluído em 1:4000 e 1:8000, e contra p53 em 1: 500 e 1:1000. Foi usada

uma câmara úmida para heat epitope retrieval após imersão em tampão de

citrato. Foi usado um sitema automático (Techmate 1000) para realização da

técnica imunohistoquímica utilisando um protocolo padrão sugerido pelo

fabricante. Ocorreu a substituição do anticorpo secundário proveniente da

companhia Vector Labs pelo anticorpo secundário da Techmate. Um

carcinoma escamoso de pele de camundongo, o qual é conhecido por

expressar a forma mutada de p53, foi usado como controle positivo do

anticorpo p53, gentilmente cedido pelo Dr. Andres J.P. Klein-Szanto (FCCC)

(MITSUNAGA et al. 1995). Para a proteína p53, a extensão da positividade

foi estabelecida em uma escala de 0 a 4; 0, representa menos de 5% das

células positivas para a proteína; 1, mais que 5% e até 25%; 2, mais de 25%

e até 50%; 3, mais de 50% e até 75%; e 4, quando a positividade foi

presente em mais de 75% das células. A intensidade da expressão foi

medida de 0 a 3+, onde 0 representa a não expressão da proteína, 1+

pequena quantidade, 2+ moderada quantidade e 3+ grande quantidade. A

medida final foi obtida multiplicando-se as duas variáveis (extensão e

intensidade), com as medidas variando de 0 a 12. Quando o total variou de 0

a 4 este foi considerado como pouco expressivo, de 5 a 8 como uma

expressão intermediária e de 9 a 12 como uma expressão intensa.

Para o controle de expressão da proteína ß-catenina foram usadas

mucosas colônicas normais e adenomas, ambos coletados do camundongo

com mutação do gene Apc em células germinativas (Min). A expressão da

membrana mesmo que fraca foi considerada como normal e a positividade

da proteína no citoplasma e no núcleo foram consideradas anormais.

Quando a positividade foi presente no núcleo ou citoplasma, a extensão

desta foi medida de 1-3, sendo 1 menos de 5% das células positivas, 2 de 5

a 25% das células positivas e 3 mais que 25% das células positivas.

4.5 AVALIAÇÃO DE MUTAÇÃO NO GENE K-RAS

Uma região contendo 167 pares de bases (pb) do gene k-ras de

camundongo (exon 1) que contém os condons 12 e 13 foi amplificada pela

técnica de PCR. Os iniciadores específicos estão descritos na Tabela 3 e

foram gerados baseados na seqüência genômica obtida no Genbank

(número de acesso S39586). O iniciador antisenso, para cada par, foi

biotinilado na posição 5’ com o objetivo de viabilizar o isolamento da fita

simples de DNA a ser utilizada como molde na reação de seqüenciamento.

Cada reação de PCR continha 50-500 ng de DNA genômico, 10 pmols de

iniciadores senso e antisenso e 25 µl de Jumpstart Readymix RedTaq

Polymerase (Sigma) em um volume total de 50 µl. Os ciclos foram realizados

em uma máquina de PCR Eppendorf Mastercycler Gradient (Brinkman

Instruments, Westbury, NY) da seguinte maneira: 95ºC por 5 min, 35 ciclos

de 95ºC por 30 s, 51ºC por 30 s, 72ºC por 45 s, e finalmente 5 min à 72ºC.

A amplificação da região específica foi verificada pela vizualização do

amplicon em um gel de agarose à 2% contendo brometo de etídeo. A

purificação da fita simples de DNA a ser utilizada como molde na reação de

sequenciamento foi realizada em uma placa de 96-wells (Millipore, Bedford,

MA). Vinte µl do produto biotinilado foram purificados utilizando esferas de

agarose marcadas com estreptoavidina (Amersham Pharmacia Biotech,

Piscataway, NJ) e processados utilizando o kit PSQ 96 Sample Preparation

Kit (Pyrosequencing AB, Westborough, MA). A reação de síntese por

sequenciamento da fita complementar foi realizada automaticamente pelo

instrumento PSQ 96MA (Biotage) em temperatura ambiente usando

reagentes PyroGold (Biotage). O sinal emitido durante a incorporação de

cada nucleotídeo foi detectado por uma câmera CCD e convertido em picos

para formar um pirograma.

Para servir como controle da reação, tecido não tumoral (pele) dos

camundongos AOM/DSS e p53 foi usado.

4.6 AVALIAÇÃO DE MUTAÇÃO NO GENE ß-CATENINA

O exon 3 do gene ß-catenina de camundungo (Ctnnb1) foi amplificado

pela técnica de PCR. Os iniciadores específicos estão descrito na Tabela 3

e foram gerados baseados na seqüência genômica obtida no Genbank

(número de acesso mCG22702). Cada reação de PCR continha 50-500 ng

de DNA genômico, 10 pmols de iniciadores senso e antisenso e 25 µl de

Jumpstart Readymix RedTaq Polymerase (Sigma) em um volume total de 50

µl. Os ciclos foram realizados em uma Eppendorf Mastercycler Gradient

(Brinkman Instruments, Westbury, NY) da seguinte maneira: Um ciclo de 94º

por 4 minutos e 35 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 60ºC por 30 segundos e

72ºC por 30 segundos. A amplificação da região específica foi verificada

pela vizualização do amplicon (408 pb) em um gel de agarose a 2%

contendo brometo de etídeo. O produto de amplificação da PCR foi

purificado usando Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen, Inc, Chatsworth,

CA) e foi seqüenciado usando BigDye Terminator Cycle Sequencing

Chemistry (Applied Biosystems, Foster City, CA), as instruções foram

seguidas de acordo com o protocolo do fabricante. A reação correu num

sequenciador de DNA automático (Prism 377; Applied Biosytems). O

alinhamento da seqüência adquirida foi realizado com base em uma

seqúência referência utilizando SeqWeb ver. 2.0. Para servir como controle

da reação, tecido não tumoral (pele) dos camundongos AOM/DSS e p53 foi

usado.

4.7 AVALIAÇÃO DE MUTAÇÃO NO GENE TRP53

Os exons 5, 6, 7 e 8 do gene Trp53 de camundongo foram

amplificados pela técnica de PCR usando iniciadores específicos

desenhados na região intrônica (Tabela 3). Estes iniciadores (senso e

antisenso) para cada exon foram gerados baseados na seqüência genômica

obtida no Genbank (número de acesso AF367373). A rea ção de PCR

seguiram os mesmo procedimento descrito para o gene ß-catenina. A

amplificação das regiões específicas foi verificada pela visualização dos

amplicons que continham 366pb (exons 5-6) e 576 pb (exons 7-8) em um gel

de agarose a 2% contendo brometo de etídeo. As demais etapas

(purificação, seqüenciamento e alinhamento da seqüência) também foram

similares as descritas para o gene ß-catenina.

Para servir como controle da reação tecido não tumoral dos camundongos

AOM/DSS foi usado.

4.8 AVALIAÇÃO DE LOH NO GENE APC

O camundongo SW é uma linhagem não isogênica (outbred), por isso

pode apresentar uma combinação de alelos muito variada, sendo, desta

forma, muito semelhante à realização de estudos genéticos realizados em

humanos, onde cada indivíduo possui um padrão (imprint) característico

destes marcadores para cada alelo. Por este motivo, a LOH do gene Apc de

camundongo foi determinada através da amplificação de seqüências

repetitivas (dinucletotídeas) pela técnica de PCR. As seqüências foram

obtidas através do Mouse Genome Database do Jackson Laboratory em Bar

Harbor (Maine, EUA) e de estudos previamente descritos realizando LOH no

gene Apc (BLAKE et al. 2001; JANSSEN et al. 2002). Como o banco de

informações de microssatélites do Mouse Genome Database do Jackson

Laboratory em Bar Harbor (Maine, EUA) ou qualquer outra fonte de dados

para estes marcadores não apresenta dados com avaliação das seqüências

repetitivas nos camundongos SW, a opção foi usar marcadores que se

mostram polimórficos para a maioria das linhagens dos camundongos.

Foram usados também marcadores que tiveram seu polimorfismo avaliado

em linhagem SWR, um camundongo albino muito similar ao camundongo

SW. Os seguintes marcadores foram usados para o locus de Apc

(cromossomo 18; 15cM): D18Mit64 (2cM), D18Mit111 (11cM), D18Mit132

(11cM), D18Mit17 (20cM), D18Mit58 (24cM), D18Mit34 (12cM), D18Mit147

(16cM) e D18Mit60 (16cM). Cada reação de PCR continha um volume total

de 25µl. Os ciclos foram realizados em uma Eppendorf Mastercycler

Gradient (Brinkman Instruments, Westbury, NY) da seguinte maneira: 94ºC

por 4 minutos, para uma desnaturação inicial, e 35 ciclos de 94ºC por 30s,

quando o marcador apresenta apenas uma banda quando testado no tecido

controle significa que ambos alelos apresentam a mesma seqüência para

este marcador e este é considerado não informativo.

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Foi usado o teste de Wilcoxon para comparar a diferença entre os

grupos como, por exemplo, número de lesões e tipos de lesões. O teste de

Fisher foi usado para avaliar a incidência de tumores e a comparação entre

o status de mutação. Todos os testes foram realizados usando o software

SAS (SAS Institute, Cary, NC).

6 RESULTADOS

Os resultados dos experimentos utilizando o modelo de colite em

animais SWs e p53 vão ser descritos separadamente.

6.1 MODELO DE COLITE UTILIZANDO OS ANIMAIS SWS

6.1.1 Expressão das proteínas p53 e ß-catenina

Foram avaliadas 28 lesões DALMs e 12 lesões planas. Todas as

lesões foram negativas para a detecção da proteína p53 pelo estudo

imunohistoquímico. O tecido controle mostrou positividade nuclear nas

células escamosas neoplásicas.

A translocação da proteína ß-catenina para o núcleo das células foi

observada em 85% das lesões planas e 87% das DALMs. A mucosa normal

demonstrou a expressão desta na membrana celular. A Figura 5 ilustra

estes resultados.

6.1.2 Mutação dos genes K-ras (exon 1), ß-catenina (exon 3) e Trp53

(exons 5-8)

Foram examinadas 28 lesões DALMs, 12 lesões planas e 10 tecidos

não tumorais controle (pele), para a pesquisa de mutação em k-ras, ß-

catenina e Trp53.

Não foram observadas evidências de mutação do gene k-ras em

nenhuma das lesões displásicas ou no tecido controle.

O seqüenciamento do exon 3 do gene ß-catenina demonstrou a

presença de mutações em 85% (29/34) das lesões displásicas, nos códons

32, 33, 34, 37, 41 e 47. No códon 32, as mutações encontradas foram de

GAT (Ácido Aspártico) para AAT (Aspargina) ou para GGT (Glicina). No

códon 33, foi encontrada mutação de TCT (Serina) para TTT (Fenilalanina).

No códon 34, foi observada mutação de GGA (Glicina) para GAA (Glutamina)

ou para AGA (Arginina). No códon 37, foi encontrada mutação de TCT

(Serina) para TTT (Fenilalanina). No códon 41, foi encontrada mutação de

ACC (Treonina) para ATC (Ileína). No códon 47, foi encontrada mutação de

AGT (Serina) para AGG (Arginina). O seqüenciamento não foi considerado

ótimo para 6 lesões, sendo 1 displasia plana e 5 DALMs. O seqüenciamento

foi repetido nas lesões que apresentaram mutação para confirmar o achado.

Nenhum dos tecidos controles examinados apresentou mutação no gene ß-

catenina. (Tabela 4; Figura 6).

O seqüenciamento do gene Trp53 (exons 5-8) demonstrou a

substituição de bases nas posições 320 (exon 6), 348 (exon 6) e 843 (exon 7)

em todos os tecidos examinados. As substituição na posição 320 de C>T

provocou a mudança do amino-acido prol>leucina e a substituição na

posição 843 de A>G a mudança de Ile>Met. A substituição na posição 348

de T>C não provocou mudança no amino-ácido. Estas substituições foram

observadas nos tumores, mas também no tecido controle (pele) denotando

tratar-se apenas de uma variação genética que ocorre nesta linhagem em

relação a sequência referência usada que pertencente à espécie Mus

musculus (Tabela 5).

6.1.3 LOH do gene Apc

Todos os marcadores utilizados para pesquisa de LOH no gene Apc

testados no tecido não-tumoral dos animais SW não demonstrou nenhum

polimorfismo. Assim sendo, nenhum deles foi informativo para esta pesquisa.

Para testar se a ausência de polimorfismo nos marcadores era decorrente

da téquinica empregada ou se realmente estes marcadores não eram

polimórficos para os animais SW, foi realizada a pesquisa do polimorfismo

dos marcadores em tecidos oriundos de camundongo C57BL/6. Foram

avaliados tecidos de 4 animais (C57BL/6) para todos os oito marcadores e

todos resultaram polimórficos. Confirmando assim, que estes marcadors não

são polimórficos para os animais SWs.

6.1.4 Comparação dos achados moleculares entre as displasias planas

e DALMs

Não foram observadas diferenças entre o status de mutação dos

genes avaliados (k-ras, p53 e ß-catenina) ou entre a expressão das

proteínas p53 e ß-catenina entre as lesões planas e DALMs.

6.2 MODELO DE COLITE UTILIZANDO ANIMAIS ALTERADOS

GENETICAMENTE PARA O GENE P53

6.2.1 Achados histopatológicos

Foram observadas, em graus diferentes, alterações típicas de colite

como, por exemplo, infiltrado inflamatório crônico na mucosa e distorção das

criptas em 80% dos animais p53 -/-, 65% dos animais p53+/- e 85% dos

animais p53+/+ tratados com DSS (Figura 7). Nestes animais com colite,

independentemente da severidade do envolvimento inflamatório, áreas

completamente normais da mucosa também eram observadas. Isso indica

que a lesão inflamatória ocorre em um padrão descontínuo.

A incidência de displasia e/ou câncer nos animais tratados com DSS

foi de 93% nos animais p53 -/-, 21% nos animais p53 +/- e 40% nos animais

p53 +/+. Nenhum tumor colônico foi observado nos animais que não

receberam DSS. Em adição à alta incidência de tumores colônicos nos

camundongos p53 -/-, estes também exibiram uma predominância de lesões

planas quando comparadas às lesões polipóides (73,3% vs 13,3%,

respectivamente). A distribuição das lesões observadas nos camundongos

p53 -/- tratados com DSS foi de 33,3% de cânceres planos, 13.3% de

cânceres polipóides, 40% de displasias planas e 13.3% de lesões indefinidas.

Não foram observadas displasias polipóides nestes animais, sendo que

83,3% e 16,7% das displasias planas observadas foram sub-classificadas

como de baixo grau e alto grau, respectivamente. Em contraste, os

camundongos p53 +/- tratados com DSS mostraram um predomínio de

lesões polipóides em relação às lesões planas (75% e 15%,

respectivamente). A distribuição das lesões colônicas em animais p53 +/-, foi

de 15% de cânceres planos, 5% de cânceres polipóides, 5% de cânceres

indeterminados, 70% de displasias polipóides e 5% de lesões indefinidas.

Todas as displasias foram classificadas como polipóide, sendo que 21,4% e

78,6% delas foram sub-classificadas como baixo-grau e alto grau,

respectivamente. Os animais p53 +/+ tratados com DSS apresentaram 40%

de lesões colônicas e todas classificadas como displasia polipóide, sendo

que 100% foram sub-classificadas como de baixo grau. Quanto aos

adenocarcinomas, 14% e 90% deles foram classificados como mucinosos,

nos animais p53-/- e nos animais p53+/- tratados com DSS, respectivamente.

A Tabela 6 sumariza a incidência de lesões neoplásicas em animais

p53 tratados com DSS. Imagens ilustrando estas lesões estão apresentadas

nas Figuras 8, 9 e 10.

Um achado interessante neste estudo foi à presença de lesões

compostas por glândulas dilatadas e preenchidas por muco, localizadas na

submucosa e camada muscular da parede intestinal, semelhante à colite

cística profunda observada em humanos (Figura 11). Algumas glândulas

eram revestidas por um epitélio similar ao epitélio da mucosa intestinal,

entretanto outras apresentavam um epitélio de revestimento de aspecto

colunar e que se transformava num aspecto cuboidal nas áreas mais

dilatadas. Foi observada a presença de lagos de mucina que, mesmo após a

realização de cortes seriados, continuavam desprovidos de um epitélio de

revestimento. Estes lagos de mucina foram observados nas camadas

submucosa, muscular e serosa da parede intestinal. Não foi observada

nenhuma evidência de atipia tanto na mucosa superficial acima da lesão

quanto no epitélio que revestia estes cistos. Estas alterações foram

observadas em 7% dos animais p53 -/-, sendo que todas as lesões não

eram revestidas por epitélio. Já 3.4% dos animais p53 +/- mostraram este

tipo de lesões, 1.1% delas mostrando glândulas na parede intestinal e 2.2%

sem epitélio de revestimento presente. Não foram observadas as mesmas

lesões nos animais p53 +/+ tratados com DSS ou nos animais não tratados

com DSS.

A hiperplasia focal da mucosa, com diferenciação serrilhada da

porção superficial da lesão, também foi observada nos animais p53 -/- e p53

+/- tratados com DSS mostrando uma incidência de 28.6% e 2.2%,

respectivamente (Figura 12). Este achado não foi observado nos animais

p53 +/+ tratados com DSS ou em animais que não receberam DSS.

A pseudoinvasão foi dectada em 0% dos animais p53 -/-, 3,4% dos

animais p53 +/- e 20% dos animais p53 +/+ (Figura 13). Este achado é

comum nos camundongos, provavelmente pela fina camada de muscularis

mucosae que estes apresentam (BOIVIN et al. 2003). A importância de

descrever esta alteração é no intuito de diferenciá-la de uma neoplasia

invasiva.

A Tabela 7 sumariza os achados de lesões não tumorais em animais

p53 tratados com DSS.

7 DISCUSSÃO

Estudos prévios demonstraram que o modelo de colite induzida pelo

DSS produz aspectos clínicos e histopatológicos muito similares aos

observados em pacientes portadores de RU. Foi também descrito o risco do

desenvolvimento de tumores colônicos em cobaias, ratos e camundongos

decorrentes do uso de DSS, outro aspecto que denota a progressão da

doença numa mesma direção daquela observada em humanos. No sentido

de aprofundar os conhecimentos na carcinogênese intestinal que ocorre

neste modelo, foram avaliados eventos moleculares nas neoplasias

intestinais, traçando um paralelo com estudos moleculares em pacientes

portadores de colite associados à displasia e câncer. Este trabalho avaliou o

status de mutação ou LOH e expressão da proteína para os genes: Tpr53,

Apc, K-ras e ß-catenina. Foram utilizados dois tipos de abordagem para o

estudo dos eventos moleculares no modelo de indução de colite e neoplasia

pelo uso de DSS. Uma delas é associada à pesquisa de alterações

moleculares nas lesões displásicas relacionadas ao modelo de indução de

colite pelo uso de DSS/AOM no camundongo SW, que é um animal sadio.

Na segunda abordagem avaliaram-se lesões displásicas e câncer e a

mutação no genes K-ras que ocorrem num modelo de indução de colite pelo

uso de DSS em camundongos alterados geneticamente para o gene Trp53.

O estudo do modelo DSS/AOM em SWs, demonstrou que quase a totalidade

das lesões displásicas avaliadas (em torno de 85%) apresentaram

translocação da proteína ß-catenina para o núcleo, mas não foi detectada a

presença da proteína p53 no núcleo das células displásicas. Nestes tumores,

apesar da presença de mutação no gene TP53, a positividade nuclear da

proteína não é observada (YOSHIDA et al. 2004). TANAKA et al. (2003)

também demonstraram os mesmos achados observados neste estudo,

quanto à expressão de ß-catenina e p53, em modelo de colite induzida por

AOM/DSS, mas usando uma outra linhagem de camundongos (Crj: CD-1)

(TANAKA et al. 2003). Nenhum outro estudo avaliou simultaneamente o

status de mutação do gene k-ras, Trp53 e ß-catenina e a LOH do gene Apc

no modelo de indução de colite pelo uso de DSS/AOM. Neste estudo,

mutações nos genes k-ras e Trp53 não foram observadas e a pesquisa de

LOH para o gene Apc não foi informativa. Entretanto, mutação no gene ß-

catenina foi observada em 85% das lesões avaliadas. Este achado explica a

translocação anormal da proteína ß-catenina para o núcleo das células nas

lesões displásicas estudadas. A proteína ß-catenina está envolvida no

sitema de adesão entre as células e é considerada uma molécula

fundamental na via de sinalização Wnt (MILLER e MOON 1996; KORINEK et

al. 1997). Devido a uma inativação do complexo de moléculas APC, GSK-3ß

e Axina 1, a proteína ß-catenina se transloca da porção lateral da membrana

da célula para o núcleo, onde se liga com a proteína Tcf para desencadear a

transcrição de vários genes implicados na proliferação e diferenciação das

células. A translocação patológica da proteína ß-catenina é quase sempre

decorrente da mutação ou LOH do gene APC nos tumores esporádicos. Esta

também pode ser causada pela mutação no gene ß-catenina, apesar desta

ser um evento raro tanto nos tumores esporádicos e ausente nos tumores

associados à RU (AUST et al. 2002). Entretanto, quando presente, a

mutação de ß-catenina nos tumores esporádicos ocorre nos códons 33, 41 e

45, os quais representam motivos onde ocorre a fosforilação por GSK-3ß

(Sparks et al. 1998). Em nosso modelo animal (DSS/AOM), as displasias

avaliadas demonstraram a presença da mutação no gene ß-catenina nos

códons 32, 33, 34, 37, 41 e 47. Entretanto, nos tumores de camundongos

(ICR) com o uso de apenas AOM para indução da carcinogênese, a mutação

do gene ß-catenina foi observada nos códons 33, 34, 37 e 41, mas não foi

demonstrada mutação nos códons 32 ou 47 (TAKAHASHI e WAKABAYASHI

2004). Em adição, os autores demonstraram alteração da proteína ß-

catenina em todas as lesões examinadas. A presença de mutação no gene

ß-catenina também foi estudada em ratos após o uso de diferentes agentes

carcinogênicos. A mutação em tumores colônicos induzidos por AOM

também se encontra distribuída em vários códons como observada em

camundongos tratados com AOM (TAKAHASHI et al. 1998). Porém, com o

uso de 1,2 dimetilhidrazina (DMH) a localização da mutação era dependente

da dose de carcinógeno usada. Nos ratos que recebiam DMH por 2 a 5

semanas, a mutação do gene ß-catenina foi detectada nos códons 32, 33 e

34 (BLUM et al. 2001). Entretanto, quando estes eram tratados com DHM

por 20 semanas, as mutações passaram a ser observadas quase que

exclusivamente no códon 41 (KOESTERS et al. 2001). A mutação de ß-

catenina, em nosso estudo, afeta os códons 33, 37 e 41 que codificam

resíduos de serina ou treonina, os quais são muito importantes na

fosforilação da proteína ß-catenina por GSK-3ß (ABERLE et al. 1997).

Acredita-se que mutações que ocorrem nos códons adjacentes aos citados

acima, tais como nos códons 32, 34 e 47, também devem afetar a

fosforilação da proteína ß-catenina e causar um acúmulo desta no

citoplasma e sua liberação para agir como um fator de

transcrição(TAKAHASHI e WAKABAYASHI 2004).

Neste estudo, não foi observada mutação no gene Trp53, uma

característica dos tumores colorretais que se desenvolvem em pacientes

com RU (YOSHIDA et al. 2004). Isto pode ser devido ao fato que o modelo

animal de colite induzido por DSS/AOM produz uma instabilidade na

proteína ß-catenina, através da mutação deste gene, que parece ser

suficiente para iniciar o desenvolvimento dos tumores. Esta hipótese pode

ser corroborada pelo fato de que alteração na expressão da proteína ß-

catenina, devido à mutações no gene APC ou mesmo no gene ß-catenina, é

um achado prevalente em tumores colorretais esporádicos ou mesmo em

outros tipos de tumores (ILYAS et al. 1997; POLAKIS 1997), demonstrando

assim, o potencial oncogênico desta proteína. Todavia, AUST et al. (2001)

demonstraram que alterações nos genes APC ou ß-catenina não parecem

ser um evento importante nos carcinomas relacionados à RU. Em contraste,

os autores observaram que a translocação da proteína ß-catenina para o

núcleo ou citoplasma das células ocorre em 80% destes carcinomas. Uma

possível explicação para a ocorrência desta alteração nos tumores de

pacientes portadores de RU seria a presença de mutação no gene TP53.

CAGATAY e OZTURK (2002) demonstraram que o acúmulo de ß-catenina

no núcleo de células de carcinomas hepáticos pode ser decorrente da

inativação do gene TP53. Estes achados demonstram que não importa a via

de iniciação dos tumores, todos parecem seguir o mesmo padrão em relação

à estabilidade da proteína ß-catenina.

O oncogene K-ras que está relacionado a várias vias de sinalização e

se encontra mutado na maioria das neoplasias esporádicas (40-50%), mas

pouco freqüente nos tumores associados à RU (8-25%) (BOS et al. 1987;

BELL et al. 1991). Um estudo analisando a mutação no gene k-ras (exon 1)

em camundongos tratados com AOM, demonstrou que esta alteração está

presente em um pequeno número de tumores colônicos (GUDA et al. 2004).

Em contraste, ratos recebendo AOM ou apenas DSS, demonstram uma alta

incidência de mutação no gene k-ras, em torno de 60 e 66%,

respectivamente (JACOBY et al. 1991; ENDO et al. 2001). Neste estudo,

não foi observada mutação do gene k-ras, no modelo de colite induzido por

DSS/AOM, correspondendo com achados observados em tumores

associados à RU.

A lesão precursora do câncer colorretal associado à RU é chamada

de displasia, e é considerada, até o momento, o principal marcador de

câncer neste pacientes. A displasia no modelo de indução de colite por

DSS/AOM, como em pacientes com RU, é observada na forma plana ou

polipóide (DALM). Foi demonstrado que as displasias planas e as DALMs

mostram aspectos moleculares diferentes sendo que as lesões planas estão

menos associadas com LOH do gene VHL e com um aumento da expressão

da proteína p53 (FOGT et al. 1998; WONG et al. 2000). Este estudo não

demonstrou nehuma diferença molecular entre os dois tipos de displasia.

Estes achados não excluem a possibilidade de origens diferentes entre elas.

Alterações que representam diferenças entre displasias planas e DALMs no

modelo de colite induzido por DSS/AOM podem estar relacionadas a outros

genes que ainda não foram investigados.

Os achados observados no modelo de colite induzida por DSS em

animais deficientes em p53 demonstraram similaridades, diferenças e

adições a um estudo publicado recentemente usando o mesmo modelo

animal (FUJII et al. 2004). FUJII et al. (2004) relataram uma incidência de

tumores em animais p53-/- tratados com DSS muito similar à observada no

presente estudo (100% vs 93%, respectivamente). Entretanto, este estudo

observou uma inversão na incidência de tumores em animais p53+/- e

p53+/+ quando comparada com o estudo dos autores citados acima.

Observamos uma incidência de apenas 21% nos animais p53+/-, em

contraste com a incidência de 46%. Porém, a incidência de tumores em

animais p53+/+ foi maior no presente estudo que no estudo dos demais

autores (40% vs 13,3%). Entretanto, apesar de uma menor incidência no

total de tumores observado neste estudo, a incidência de neoplasias

infiltrando a submucosa foi muito mais elevado que os índices de FUJII et al.

(2004) (33% vs 0.3%, respectivamente). A variação no número de tumores

entre os dois estudos pode ser explicado pelo background dos

camundongos usados, pois já foi demonstrado que algumas linhagens de

camundongos são mais sensíveis que outras na formação de tumores

(NAMBIAR et al. 2003). Este estudo utilizou animais deficientes em p53 e

controles com um background de camundongos C57BL/6 enquanto FUJII et

al. (2004) usaram um background misto de camundongos C57BL/6 x CBA.

O modelo de colite induzida por DSS em animais geneticamente

alterados para o gene Trp53, além de demonstrar displasias e cânceres

muito semelhantes com os observados em pacientes com RU, também

demonstrou lesões benignas que são observadas nestes pacientes. Em

nosso estudo, foram observadas lesões císticas e lagos de mucina

localizados na submucosa da parede intestinal de camundongos deficientes

em p53, que são muito semelhantes à lesão designada como colite cística

profunda (GOODALL e SICLAIR 1957). Há apenas um relato na literatura,

de 1969, descrevendo a presença de colite cística profunda em

camundongos (BRYNJOLFSSON e LOMBARD 1969). Os autores

demonstraram a presença de cistos de mucina associada ao prolapso retal

observado em poucos animais, mas não descreve o uso de nenhuma

substância para a indução de colite ou mesmo se estes animais

apresentavam inflamação no cólon distante da área do prolapso. As imagens

apresentadas no estudo são muito similares a carcinoma, pois apresentam

um moderado grau de atipia e consta de várias glândulas, algumas delas

apresentando um aspecto cribriforme. Até o momento, cerca de 30 casos no

total foram descritos na literatura como presentes em humanos em

associação com a RU. Apesar das lesões descritas em humanos ou nestas

observadas no presente estudo não demonstrarem nenhum grau de atipia

nas células que revestem as glândulas ou mesmo na mucosa superficial

acima da lesão, ainda assim existe a dúvida se é uma lesão benigna ou um

carcinoma sem a presença de atipia. Para colaborar com a hipótese de

malignidade, Ridell e colaboradores descreveram que muitos dos

adenocarcinomas em pacientes com RU mostram áreas de invasão bem

definida, mas o epitélio superficial apresenta pouca atipia, às vezes

compatível com uma displasia de baixo-grau (RIDDELL et al. 1983).

Alem da colite cística profunda, também observamos a presença de

lesão hiperplásica na mucosa intestinal dos animais p53-/- e p53+/- tratados

com DSS, mas não dos animais p53+/+. Estas lesões se encontravam

distantes das displasias e cânceres e demonstravam um espessamento da

mucosa intestinal de quase duas vezes mais a espessura usual e um

aspecto serrilhado na porção superficial (RIDDELL et al. 1983). A incidência

de hiperplasia foi maior nos animais p53 -/- (28.6%) que nos animais p53 +/-

(2.2%). HARVEY et al. (1993b) demonstraram que fibroblastos de

camundongos p53 -/- passavam por várias passagens por um longo período

de tempo (por mais de 50 passagens) e nunca entravam em fase de

envelhecimento ou não-proliferação, diferente dos fibroblastos de animais

p53 +/- e p53 +/+. E teorizaram que a perda de p53 pode ser insuficiente

para induzir a imortalização destas células, mas ocorre uma falha na indução

destas ao processo de envelhecimento, sugerindo que a deficiência de p53

predispõe as células a adquirir alterações, as quais induzem a imortalização.

Estes achados podem explicar a presença da hiperplasia nos camundongos

deficientes em p53, onde a perda da função de p53 levaria ao não

envelhecimento das células e persistência destas ao longo da mucosa,

acarretando a aparência hiperplásica.

O modelo de DSS nos animais alterados geneticamente para o gene

Tp53, também não demonstrou mutação do gene k-ras em nenhuma das

lesões avaliadas, colaborando com os achados observados no modelo de

indução de colite pelo uso de DSS/AOM em camundongos sadios. Estas

observações suportam a hipótese de que mutação do gene k-ras não é um

evento observado em camundongos com colite induzida por DSS.

Novos estudos no intuito de desvendar as alterações moleculares no modelo

de colite induzida por DSS continuam sendo realizados por nosso grupo.

Acreditamos que um melhor entendimento das bases moleculares na

carcinogênese colorretal em modelos animais de colite, possa ajudar na

descoberta de marcadores para as neoplasias associadas à RU e no

desenvolvimento de regimentos quimiopreventivos mais eficientes.

8 CONCLUSÃO

► O modelo animal de colite induzida por DSS/AOM mostra

similaridades com respeito às displasias colorretais associadas à RU

em humanos quando se tratando da translocação da proteína β-

catenina.

► A mutação do gene β-catenina apesar de não ser um achado

frequente na carcinogênese dos tumores colorretais associados à RU,

esta tem um papel importante na carcinogênese dos tumores

colônicos de camundongos com colite induzida por DSS/AOM.

► Parece evidente que a falta de regulação da proteína β-catenina é um

evento primordial para o desenvolvimento dos tumores colorretais

esporádicos, relacionados à RU e também dos tumores colônicos em

camundongos com uso de DSS e AOM.

► O modelo animal de colite induzida por DSS em camundongos

deficientes para o gene p53 mostra similaridades com respeito às

características morfológicas das displasias e dos carcinomas

colorretais quando comparadas com aos mesmos tumores em

pacientes portadores de RU.

► O gene k-ras não tem um papel importante na carcinogênese dos

tumores associados a colite em camundongos com o uso de DSS.

9 TABELAS E FIGURAS

Tabela 1 - Incidência do câncer colorretal (CCR) por categoria de risco.

Risco médio (esporádico; sem fator de risco identificável) 75%

História de CCR na família 15 a 20%

CCR hereditário sem polipose (HNPCC) 3 a 8%

Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) 1%

Retocolite Ulcerativa 1%

Tabela 2 - Fatores associados com o risco do CCR em pacientes portadores

da RU.

FATORES QUE AUMENTAM O RISCO FATORES DE PROTEÇÃO PARA O CCR

• Duração da doença

• Extensão do envolvimento colônico

• História familiar de CCR

• Colangite Esclerosante Primária

• Início precoce da doença (jovens ou

crianças)

• Severidade da inflamação

• Colectomia profilática

• Programas de ratreamento e

seguimento

• Uso de anti-inflamatórios

Tabela 3 - Sequência dos iniciadores de amplificação para k-ras, ß-catenina

e Trp53.

SEQUÊNCIA

Gene Senso 5’ Antisenso 5” Exon

K-ras TTATTATTTTTATTGTA GCACGCAGACTGTAGAG 1

ß-catenina GCCTTTCTAACAGTATT GCCCTTCCTTCAACCCA 3

Trp 53 TACTCTCCTCCCCTCAAT CGGGAGATGGGAGGCTGC 5

Trp 53 GGGGTTAGGACTGGCAGC CTAAGACGCACAAACCAA 6

Trp 53 CTGTAGTGAGGTAGGGAG GGAACAGAAACAGGCAGA 7

Trp 53 CTTACTGCCTTGTGCTGG GAGGTGACTTTGGGGTGA 8

Tabela 4 - Mutação do gene ß-catenina em lesões colônicas em modelo de

colite induzida por DSS/AOM.

Mutação do gene ß-catenina no exon 3

Códon Alteração

Substituição

(amino-ácido)

GAT → AAT Asp → Asn

GAT → GGT Asp → Gly

TCT → TTT Ser → Phe

GGA → GAA Gly → Glu

TCT → TTT Ser → Phe

ACC → ATC Thr → Ile

AGT → AGG Ser → Arg

Tabela 5 - Alterações nos exons 6 e7 do gene Trp53 em animal SW.

Exon Posição

Substituição (amino-

ácido)

códon

6 320 (C>T)

CCG>CTG

(Pro > Leu)

6 348 (T>C)

AGT>AGC

(Ser > Ser)

7 843 (A>G)

ATA>ATG

(Ile> Met)

121

Tabela 6 - Distribuição dos tumores colônicos em animais p53, tratados com

DSS.

Tipos de lesões p53

-/-

p53

+/-

p53

+/+

Câncer plano 33.3% (5/15) 15% (3/20) 0%

Câncer polipóide 13.3% (2/15) 5% (1/20) 0%

Câncer Indeterminado 0% 5% (1/20) 0%

Displasia plana 40% (6/15) 0% 0%

Displasia polipóide 0% 70% (14/20) 100% (4/4)

Lesões indefinidas 13.3% (2/15) 5% (1/20) 0%

Tabela 7 - Lesões não neoplásicas em animais p53, tratados com DSS.

p53 -/- p53 +/- p53

+/+

% Animal com lesões mucinosas 7% (1/14) 3.4% (3/89) 0%

i) com glândulas 0% 1.1% (1/89) 0%

ii) sem glândulas 7% (1/14) 2.2% (2/89) 0%

% Animais com pseudoinvasão 0% 3.4% (3/89) 20% (2/10)

% Animais com hiperplasia 28.6% (4/14) 2.2% (2/89) 0%

Legenda: As glicoproteínas Wnts são capazes de realizarem uma sinalização de forma

parácrina e autócrina. Fisiologicamente, estas proteínas formam um complexo com a

proteína transmembrana, denominada Frizzled, e liberam a molécula ß-catenina do

chamado complexo de destruição, o qual, na ausência de Wnts, promove a degradação

desta via ubiquitinação-proteossoma. Subseqüentemente, ß-catenina livre se dirige para o

núcleo da célula e se associa com fatores que se ligam ao DNA para promover a transcrição

de certos genes fundamentais na proliferação celular. Quando ocorre uma mutação no gene

APC ou em qualquer gene membro do complexo de degradação da ß-catenina, esta

desencadeia a formação de uma proteína constitutivamente ativa.

Fonte: Adaptado deCLAPPER et al. (2004).

Figura 1 - Esquema simplificado da via de sinalização Wnt.

Legenda: As mesmas vias de sinalização parecem estar alteradas na carcinogêse dos

tumores colorretais esporádicos e daqueles associados à RU. Entretanto, o momento de

ocorrência e a freqüência com que estas vias se manifestam parece ser o principal fator que

diferencia estes dois tipos de tumores.

Fonte: Adaptado de ITZKOWITZ e YIO (2004).

Figura 2 - Carcinogênese colorretal nos tumores esporádicos e associados

à RU.

Figura 3 - Esquema de indução de colite nos animais SW e p53.

Legenda: LCM de uma lesão polipóide representada na foto superior. A foto abaixo à

esquerda mostra a área antes de ser microdissecada. A foto abaixo em região central

representa células displásicas dissecadas e aderidas ao filme da cápsula de dissecção. A

foto abaixo à direita mostra o tecido após a dissecção com o espaço vazio na área

dissecada.

Figura 4 - Representação do procedimento de LCM.

Legenda: A) Ausência de positividade para o anticorpo contra p53 em uma lesão displásica

do cólon. B) Positividade nuclear em carcinoma escamoso de pele de camundongo,

servindo como controle da reação. C) Localização de ß-catenina na membrana celular em

mucosa colônica preservada. D) Positividade nuclear e citoplasmática de ß-catenina em

displasia plana. E) Positividade nuclear e citoplasmática de ß-catenina em DALM. F)

Presença de aspecto heterogêneo da positividade de ß-catenina nas células displásicas.l

Figura 5 - Estudo imunohistoquímico: proteínas p53 e ß-catenina em modelo

de colite induzida por DSS/AOM.

Codons 32 e 34 Codon 32

Legenda: A seqüência demonstrada no quadro superior representa códons 32 e 34

avaliadas em tecido controle e que não apresenta mutação. Os quadros abaixo

demonstram mutações nos códons 32 e 34 (à esquerda) e mutação no códon 32 (à direita)

identificado pelas setas.

Figura 6 - Seqüências representando mutação do gene ß-catenina em

modelo de colite induzida por DSS/AOM.

Legenda: A) Presença de um infiltrado inflamatório crônico e distorção das criptas na

mucosa intestinal. B) Processo inflamatório crônico da mucosa intestinal com a presença de

criptite. C) Presença de ulceração aftosa, compatível com atividade da doença.

Figura 7 - Processo inflamatório envolvendo a mucosa intestinal dos

camundongos deficientes para o geneTrp53 tratados com DSS.

Legenda: A) Lesão diagnosticada como indefinida, pois apesar de alterações como

hipercromasia nuclear a superfície da lesão ainda mantém um aspecto normal. B) Presença

de displasia plana e C) Lesão displásica polipóide. No quadro, observa o aspecto cribriforme

das glândulas.

Figura 8 - Classificação de displasia em camundongos deficientes para o

gene Trp53 com o uso de DSS.

Legenda: A) Câncer com aspecto polipóide. No quadro, observa-se o aspecto infiltrativo da

lesão através da submucosa. B) Câncer com aspecto plano.

Figura 9 - Câncer em camundongos deficientes para gene Trp53 tratados

com DSS.

Legenda: A) Câncer mucinoso em pequeno aumento. B) Note a presença de um

brotamento de células oriundo de uma glândula maior. C) Presença de intensa desmoplasia

ao redor de glândulas com formato irregular.

Figura 10 - Câncer mucinoso nos animais deficientes para o gene Trp53

tratados com DSS.

Legenda: A) Presença de glândulas dilatas e lagos de mucina permeando a submucosa. B)

Esta foto é um detalhe da foto anterior onde se observa um epitélio similar ao observado na

mucosa normal com várias células caliciformes e apresentando núcleos arredondados e

sem atipia. C) e D) Presença de lagos de mucina desprovidos de epitélio de revestimento na

submucosa e serosa da parede intestinal, respectivamente.

Figura 11 - Colite cística profunda em camundongos deficientes para o gene

Trp53 tratados com DSS.

Legenda: Mucosa mostrando espessamento. No detalhe observa-se na porção superficial

um aspecto serrilhado um achado típico dos pólipos hiperplásticos que ocorrem em

humanos.

Figura 12 - Hiperplasia da mucosa intestinal dos animais deficientes para o

gene Trp53 tratados com DSS.

Legenda: Presença de pequenas glândulas na parede intestinal. No detalhe observa-se um

infiltrado inflamatório crônico ao redor das glândulas e não se observa desmoplasia.

Figura 13 - Pseudoinvasão em animais deficientes para o gene Trp53 e

controles tratados com DSS.

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