( PDF ) Caracterização estrutural de polissacarídeos dos fungos liquenizados heterodermia obscurata e punctelia constantimontium

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MARIA IZABEL PEREIRA

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE POLISSACARÍDEOS DOS

FUNGOS LIQUENIZADOS

Heterodermia obscurata E Punctelia constantimontium

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Bioquímica e Biologia

Molecular, Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná, como

requisito parcial para a obtenção do título de

Mestre em Ciências (Bioquímica).

Orientador: Prof. Dr. Guilherme L. Sassaki

Co-orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini

Colaboradora: Dra. Elaine R. Carbonero

Curitiba

2007

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MARIA IZABEL PEREIRA

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE POLISSACARÍDEOS DOS

FUNGOS LIQUENIZADOS

Heterodermia obscurata E Punctelia constantimontium

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Bioquímica e Biologia

Molecular, Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná, como

requisito parcial para a obtenção do título de

Mestre em Ciências (Bioquímica).

Orientador: Prof. Dr. Guilherme L. Sassaki

Co-orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini

Colaboradora: Dra. Elaine R. Carbonero

CURITIBA

2007

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Em especial a Dra. Elaine R. Carbonero, que tanto me

ensinou e ajudou, permitindo que este trabalho se

realizasse.

iii

Aos meus pais, José Maria e Odete, e ao meu marido,

Junior, por serem o meu porto seguro. Amor, sempre...

“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um

novo começo, qualquer um pode começar agora e

fazer um novo fim.”

Francisco Xavier

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por todas as bençãos e por permitir a realização deste

trabalho.

Ao meu orientador Prof. Dr. Guilherme L. Sassaki e Co-orientador Prof. Dr.

Marcello Iacomini pelo apoio e incentivo à pesquisa científica.

Ao Prof. Philip A. J. Gorin, pelo exemplo de uma vida dedicada à pesquisa.

A Dra. Elaine R. Carbonero, por considerar um exemplo de pesquisadora, pela

pronta disponibilidade, pelos ensinamentos, ajuda, confiança, amizade e estímulo no

decorrer deste trabalho. “Se enxerguei mais longe foi porque me apoiei nos ombros de

gigantes.” Obrigada!

Aos meus pais José Maria e Odete, por serem sempre meu porto seguro e meu

exemplo de vida, aos meus irmãos, Ana Lúcia e Marcelo, e aos meus sobrinhos,

Raphael, Amanda e Beatriz, por estarem sempre perto, mesmo morando em cidades

diferentes, pela compreensão e carinho constantes, me trazendo alegrias e estímulo.

Ao meu marido Junior pelo carinho, amizade, paciência e compreensão da

minha ausência.

À Profa. Dra. Sionara Eliasaro (Departamento de Botânica – UFPR), pela coleta

e identificação dos fungos liquenizados estudados.

A “equipe de multirão de limpeza dos liquens”: Andrea, Dirce, Juliana,

Ricardo, Larissa, Elaine, sem vocês esta tarefa não seria tão divertida. (Eu ainda vou

pagar aquela pizza...)

Aos amigos de laboratório (247) Caroline Mellinger (pela força e palavra

sempre amiga), Maria Luiza, Lucimara, Andrea e “Cabelinho” (Posso usar sua

bancada?), pela acolhida, agradável convivência e amizade e por tornar os dias de

trabalho muito mais alegres.

Ao Ricardo, pela paciência, amizade e por estar sempre pronto a ajudar, a

Fernanda (Simas), Higor e Ana Helena, pela amizade formada.

Em especial a Dirce, Elaine e Andrea, que sempre estiveram dispostas a me

ajudar, pela paciência com as minhas dúvidas, pelo auxílio prestado em muitas etapas

deste trabalho, pelo apoio, mas acima de tudo, pela amizade. Nunca vou esquecer

vocês.

A amiga-irmã Juliana, que esteve ao meu lado desde o começo (“par de vasos”,

“as meninas”, “irmãs siamesas”), por ouvir minhas reclamações, pelo apoio, e em

especial pela amizade que se formou nesse período. Espero que consigamos mantê-la...

A Mariana e Dayane pela amizade, apoio, conversas, risadas...

Ao Rodrigo Faria e a Graciele, pelas inúmeras conversas e ajudas desde o início

deste trabalho.

Aos amigos de turma (Marco Aurélio, Amanda, Viviane, Caroline, Heide,

Vanessa, Francine, Luciana e Juliana) pelos momentos de estudos, “sofrimento”,

conversas e alegria.

Aos colegas do laboratório E-1 e laboratório “anexos” pelos momentos de

convivência e colaboração, Marco (por favor, deixa que eu faço café pra você), Juliana

Cassolato...

Aos coordenadores do Curso de Pós-Graduação, Profa. Dra. Leda Satie

Chubatsu e Prof. Dr. Miguel Daniel Noseda, pelo empenho e dedicação prestados e ao

crescimento e reconhecimento deste curso.

Aos professores Dr. Guilherme L. Sassaki e Dr. Miguel Daniel Noseda, pela

disponibilidade para a realização das análises de RMN.

À Rosane e a Andréia, pela disponibilidade para a realização de inúmeras

análises de GC-MS e HPSEC-MALLS.

À Dona Marilza pela presença alegre e prestativa.

A todos os professores, pós-graduandos e funcionários do Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular – UFPR, pela colaboração e amizade.

Ao CNPQ, pela bolsa de Mestrado concedida durante o desenvolvimento desta

dissertação.

A Fundação Araucária – PRONEX-Carboidratos pelo suporte financeiro.

A todos que, de algum modo, contribuíram com a realização deste trabalho.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS................................................................................................ ix

LISTA DE TABELAS ............................................................................................... xi

LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS, SIGLAS............................................xii

RESUMO .................................................................................................................. xiii

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................1

1.1 FUNGOS LIQUENIZADOS .................................................................................1

1.2 APLICAÇÃO DOS FUNGOS LIQUENIZADOS..................................................4

1.3 PRINCIPAIS CONSTIUINTES QUÍMICOS DOS FUNGOS LIQUENIZADOS..5

1.3.1 Substâncias Liquênicas .......................................................................................5

1.3.2 Carboidratos de Fungos Liquenizados.................................................................6

1.3.2.1 Homopolissacarídeos de fungos liquenizados...................................................7

1.3.2.2 Heteropolissacarídeos de fungos liquenizados..................................................8

1.4 IMPORTÂNCIA DA CARACTERIZAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS

LIQUÊNICOS......................................................................................................13

1.4.1 Quimiotaxonomia ..............................................................................................13

1.4.2 Polissacarídeos com Atividades Biológicas........................................................15

1.5 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS LIQUENIZADOS

ESTUDADOS ......................................................................................................16

1.5.1 Heterodermia obscurata .................................................................................... 16

1.5.2 Punctelia constantimontium ..............................................................................16

2 OBJETIVOS ..........................................................................................................18

2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................18

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................18

3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................19

3.1 MATERIAL DE ESTUDO ...................................................................................19

3.2 OBTENÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS............................................................20

3.2.1 Extrações ...........................................................................................................20

3.2.1.1 Extração com Acetona ...................................................................................20

viii

3.2.1.2 Extração Etanólica .........................................................................................21

3.2.1.3 Extração Aquosa .............................................................................................21

3.2.1.4 Extração alcalina.............................................................................................21

3.3 FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS ...............................................22

3.3.1 Separação dos Polissacarídeos por Congelamento e Degelo...............................22

3.3.2 Purificação dos Polissacarídeos com Solução de Fehling ...................................22

3.4 ANÁLISE ESTRUTURAL DOS POLISSACARÍDEOS......................................23

3.4.1 Composição Monossacarídica............................................................................23

3.4.1.1 Hidrólise Ácida Total......................................................................................23

3.4.1.2 Redução e Acetilação dos Produtos de Hidrólise.............................................23

3.4.2 Metilação dos Polissacarídeos ...........................................................................24

3.4.3 Dosagem de ácidos urônicos dos heteropolissacarídeos .....................................25

3.4.4 Carboxi-redução do heteropolissacarídeo de P. constantimontium .....................25

3.4.5 Hidrólise Ácida Parcial ......................................................................................25

3.5 MÉTODOS ANALÍTICOS...................................................................................26

3.5.1 Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS)..............26

3.5.2 Cromatografia de exclusão estérica acoplada à detecção por índice de refração e

espalhamento de luz (HPSEC-MALLS)............................................................26

3.5.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ...........................................................27

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................28

4.1 DESLIPIDIFICAÇÃO E EXTRAÇÃO ETANÓLICA .........................................28

4.2 EXTRAÇÕES AQUOSAS E ALCALINAS .........................................................30

4.3 FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS ...............................................31

4.4 POLISSACARÍDEOS DA FRAÇÃO PRECIPITADO CONGELAMENTO/

DEGELO .............................................................................................................31

4.5 POLISSACARÍDEOS DA FRAÇÃO PRECIPITADO DE FEHLING (PF)..........39

4.5.1 Polissacarídeo do Fungo Liquenizado Heterodermia obscurata .........................37

4.5.2 Polissacarídeo do Fungo Liquenizado Punctelia constantimontium....................48

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................59

REFERÊNCIAS ........................................................................................................61

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Corte transversal de Canomaculina pilosa (Stiz.) Elix & Hale em eletromicrografia

de varredura (cedida pela Profa. Dra. Sionara Eliasaro, Departamento de Botânica-

UFPR). Aumento de 1000 x. .....................................................................................3

FIGURA 2 – Principais estruturas observadas em galactomananas de fungos liquenizados ......12

FIGURA 3 – Foto do fungo liquenizado Punctelia constantimontium (A) vista face superior (B)

vista face inferior.....................................................................................................19

FIGURA 4 – Foto do fungo liquenizado Heterodermia obscurata ..............................................20

FIGURA 5 – Fluxograma de extração e purificação dos polissacarídeos dos fungos liquenizados

Heterodermia obscurata e Punctelia constantimontium.........................................29

FIGURA 6 – Espectros de RMN-

C das frações precipitado de congelamento e degelo (PW)

obtidas de Punctelia constantimontium (A) e Heterodermia obscurata (B)...........33

FIGURA 7 – Espectro de RMN-

C da fração PPG/D obtida de Heterodermia obscurata (A) e

Punctelia constantimontium (B). ............................................................................34

FIGURA 8 – Estrutura proposta para nigerana obtida por precipitado gelo/degelo H. obscurata e

P. constantimontium................................................................................................36

FIGURA 9 – Espectro de RMN-

C das frações do precipitado de Fehling, PFK2 (A) PFK10 (B)

PFW (C), obtidas de Heterodermia obscurata, em D

O a 70ºC. ...........................39

FIGURA 10 – Espectro 2D

C HMQC da fração precipitado de Fehling (PFK2;

glucomanana) obtida de Heterodermia obscurata (D

O, 70ºC)..............................40

FIGURA 11 – Região anomérica do espectro de HMQC acoplado da fração precipitado Fehling

(PFK2; glucomanana) obtida da Heterodermia obscurata (em D

O, 70ºC)...........41

FIGURA 12 – Espectro de DEPT da fração precipitado de Fehling (PFK2; glucomanana) obtida

de Heterodermia obscurata, em D

O a 70ºC. .......................................................42

FIGURA 13 – Espectros de RMN-

C das frações PFK2-HO (nativa) (A), PFK2-HP4 (B) e PFK2-

HP10 (C), em Me

SO-d

a 70ºC..............................................................................45

FIGURA 14 – Espectro de RMN-

C-DEPT para HP10-HO, em Me

SO-d

a 70ºC..................... 46

FIGURA 15 – Estrutura proposta para glucomanana obtida do líquen H. obscurata.....................47

FIGURA 16 – Espectro de RMN-

C das frações do precipitado de Fehling, PFK2 (A) PFK10 (B)

PFW (C), obtidas de Punctelia constantimontium, em D

O a 70ºC....................... 50

FIGURA 17 – Espectro 2D

C HMQC da fração precipitado de Fehling (PFK2;

galactoglucomanana) obtida de P. constantimontium (em D

O, 70ºC)...................51

FIGURA 18 – Região anomérica do espectro de HMQC acoplado da fração precipitado Fehling

(PFK2; galactoglucomanana) obtida da P. constantimontium (em D

O, 80ºC)......52

FIGURA 19 – Espectro de RMN-

C-DEPT da fração precipitado de Fehling (PFK2;

galactoglucomanana) obtida de Punctelia constantimontium em D

O a 70ºC........53

FIGURA 20 – Espectro de RMN-

C das Frações PFK2-PC (nativa) (A), PFK2-HP4 (B) e PFK2-

HP6 (C) do fungo liquenizado P. constantimontium, em Me

SO-d

a 70ºC...........56

FIGURA 21 – Espectro de RMN-

C-DEPT para HP4-PC, em Me

SO-d

a 70ºC. .......................57

FIGURA 22 – Estrutura proposta para galactoglucomanana obtida do líquen

P. constantimontium ..............................................................................................58

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Tipos de glucanas encontradas em fungos liquenizados ...........................................8

TABELA 2 – Tipos de heteropolissacarídeos encontrados em fungos liquenizados.....................13

TABELA 3 – Rendimento das frações obtidas das extrações dos fungos liquenizados H.

obscurata e P. constantimontium. .........................................................................28

TABELA 4 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado gelo/degelo

obtidos a partir de extrações aquosas, alcalinas a 2% e 10% do fungo liquenizado

H. obscurata. ..........................................................................................................32

TABELA 5 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado gelo/degelo

obtidos a partir de extrações aquosas, alcalinas a 2% e 10% do fungo liquenizado

Punctelia constantimontium ...................................................................................32

TABELA 6 – Deslocamentos químicos de

C obtidos da α-D-glucana isolada de H. obscurata e

P. constantimontium................................................................................................35

TABELA 7 – Análise por metilação da glucana isolada na fração precipitado gelo/degelo PPG/D-

HO e PPG/D-PC......................................................................................................36

TABELA 8 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado de Fehling do

fungo liquenizado H. obscurata. ............................................................................37

TABELA 9 – Análise por metilação da fração precipitado de Fehling (PFK2; glucomanana)

obtida de Heterodermia obscurata e de suas subfrações obtidas por hidrólise

parcial......................................................................................................................43

TABELA 10 – Composição monossacarídica da Fração PFK2-HO e suas subfrações após

hidrólises ácidas parciais do fungo liquenizado Heterodermia obscurata............43

TABELA 11 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado de Fehling do

fungo liquenizado Punctelia constantimontium. .....................................................49

TABELA 12 – Análise por metilação da fração precipitado de Fehling (PFK2) obtida de Punctelia

constantimontium e de suas subfrações obtidas por hidrólise parcial. ....................54

TABELA 13 – Composição monossacarídica da fração precipitado Fehling (PFK2-PC;

galactoglucomanana) após hidrólises ácidas parciais do fungo liquenizado

Punctelia constantimontium....................................................................................55

xii

LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS, SIGLAS

Carbono treze

BaCO

- Carbonato de bário

I - Iodeto de metila

CHCl

- Clorofórmio

CuSO

- Sulfato de cobre

O - Óxido de deutério

DEPT - Distiortionless enhancement by polarization transfer

f - Furanosídico

Gal

Galactose

GC-MS - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa

Glc

Glucose

HMQC - Heteronuclear multiple quantum correlation spectroscopy

HOAc - Ácido acético

HPSEC-MALLS

- Cromatografia de exclusão estérica acoplada à detecção por

índice de refração e espalhamento de luz (HPSEC-

MALLS)

Hz - Hertz

Índice de refração

J - Constante de acoplamento

kDa kilodaltons

KOH - Hidróxido de potássio

Espalhamento de luz

Molar

Man

Manose

SO - Dimetilsulfóxido

SO-d

- Dimetilsulfóxido deuterado

MeOH - Metanol

NaB

- Boroidreto de sódio deuterado

NaBH

- Boroidreto de sódio

NaN

- Azida de sódio

NaNO

- Nitrito de sódio

NaOAc - Acetato de sódio

p - Piranosídico

p/v

Peso/volume

Potencial hidrogeniônico

ppm

Partes por milhão

RMN - Ressonância Magnética Nuclear

rpm - Rotações por minuto

TFA - Ácido trifluoracético

v/v - Volume/volume

xiii

RESUMO

No presente trabalho foram estudadas as estruturas de polissacarídeos obtidos dos

fungos liquenizados Heterodermia obscurata e Punctelia constantimontium (algas do

gênero Trebouxia como fotobiontes). Estes, após deslipidificados, foram extraídos

com água e KOH a 2 e 10%, resultando em frações que foram submetidas aos

processos de purificação por congelamento/degelo e precipitação com solução de

Fehling. Os precipitados de congelamento/degelo (PPG/D) de ambos os fungos

liquenizados apresentaram α-D-glucana, e dados de metilação e RMN sugerem uma

estrutura contendo ligações glicosídicas alternadas (1→3) e (1→4), do tipo nigerana,

com relação molar de 1,07:1 para H. obscurata e 1,3:1 para P. constantimontium. O

precipitado de Fehling do fungo liquenizado H. obscurata apresentou manose e

glucose como componentes monossacarídicos e, por meio de análises de metilação e

RMN (

C, HMQC e HMQC-acoplado), esta estrutura consiste em uma glucomanana

altamente ramificada, com uma cadeia principal composta por unidades de α-D-Manp

ligadas-(1→6), sendo a maioria substituída em O-2, principalmente por unidades

terminais não redutoras de α-D-Glcp, α-D-Manp e, possivelmente, por cadeias laterais

constituídas por unidades de α-D-Manp 4-O-substituídas. A galactoglucomanana

isolada do precipitado de Fehling do fungo P. constantimontium contém manose,

galactose e glucose como componentes monossacarídicos neutros e 6% de ácidos

urônicos, os quais foram carboxirreduzidos e os resultados mostram que este ácido é

GlcAp. De acordo com os dados de metilação e RMN (

C, HMQC e HMQC-

acoplado), esta apresenta cadeia principal de unidades de α-D- Manp ligadas (1→6),

sendo parcialmente substituídas em O-2, e/ou O-2,4 por unidades de β-Galp, sendo

que as unidades de β-Galp encontram-se substituindo as unidades de α-Manp da

cadeia principal em O-4 e O-2, e não apenas em O-4, como geralmente observado em

liquens.

1 INTRODUÇÃO

1.1 FUNGOS LIQUENIZADOS

Fungos liquenizados são definidos como organismos simbióticos compostos por

um fungo, o micobionte, e um ou mais parceiros fotossintéticos, o fotobionte, que

pode ser uma alga verde ou uma cianobactéria (NASH III, 1996). Apesar dos fungos

liquenizados serem constituídos por dois ou mais organismos, seus nomes científicos

referem-se apenas ao fungo que participa da simbiose; a alga tem sua taxonomia

própria dentro dos grupos comuns de algas (PURVIS, 2000).

A natureza da simbiose liquênica é amplamente discutida. A maioria dos

pesquisadores refere-se a fungos liquenizados como um caso clássico de mutualismo,

onde todos os pares possuem vantagens na associação. Alternativamente, fungos

liquenizados são considerados como um exemplo de parasitismo controlado, uma vez

que os fungos parecem obter mais benefícios e o fotobionte crescer mais lentamente

no estado liquenizado do que no estado de vida livre (AHMADJIAN, 1993).

Os fungos, como organismos heterótrofos, desenvolveram várias estratégias

nutricionais para adquirir carbono fixado, sendo uma delas a liquenização, que

consiste da aquisição do carbono fixado de uma população de algas verdes e/ou

cianobactérias (HONEGGER, 1996). A transferência de metabólitos do fotobionte

para o micobionte depende do tipo de fotobionte que está envolvido na associação. Em

fungos liquenizados contendo cianobactérias, o carboidrato liberado e transferido para

o fungo é a glucose e nos organismos contendo algas verdes, o carboidrato liberado é

um poliol, podendo ser ribitol, eritritol ou sorbitol (ELIX, 1996). Além disso, as

cianobactérias produzem aminoácidos a partir de gás carbônico e nitrogênio, em

associação com a água e são capazes de fixar o nitrogênio atmosférico, contribuindo

para a fixação de nitrogênio no ecossistema. Dessa maneira, em cianoliquens o

micobionte ganha uma fonte de nitrogênio (AHMADJIAN, 1993; PURVIS, 2000).

Atualmente estima-se que o número de espécies de fungos liquenizados seja de

aproximadamente 17.000. A respeito do micobionte, cerca de 20% de todas as

espécies de fungos atualmente conhecidas são encontradas na natureza na forma

liquenizada, dentre os quais 98% são ascomicetos. Ao contrário, existem poucos

basidiomicetos e deuteromicetos (fungos imperfeitos) liquenizados (HONNEGER,

1991; NASH III, 1996).

Com relação aos fotobiontes, 40 gêneros de algas verdes e cianobactérias já

foram descritos como fotobiontes liquênicos, e estes responsabilizam-se totalmente

pela fotossíntese (HONNEGER, 1996). Os cianobiontes mais comuns são espécies dos

gêneros Nostoc, Scytonema, Stigonema, Gloeocapsa, e Calothrix, em ordem de sua

freqüência e os fotobiontes de algas verdes incluem Trebouxia, Trentepohlia,

Coccomyxa, e Dictyochloropsis. O fotobionte mais comum é Trebouxia, sendo que

este ocorre em mais da metade de todos os fungos liquenizados conhecidos

(AHMADJIAN, 1993). Pode ocorrer também a presença de dois fotobiontes

associados a um único fungo, sendo uma alga verde o bionte primário e uma

cianobactéria o organismo secundário, o último encontrando-se nos cefalódios, regiões

de crescimento do talo liquênico (MARCELLI, 2006a).

Nessa associação ocorre a formação de uma estrutura específica, denominado

talo liquênico (Figura 1), morfologicamente diferente da estrutura adquirida pela alga

ou fungo quando em vida livre. A constituição do talo liquênico compreende algas

microscópicas semelhantes às mesmas espécies de vida livre e filamentos fúngicos

(hifas), desenvolvendo-se simbioticamente. Um tecido resistente periférico,

denominado córtex, protege as células dos fotobiontes do ressecamento e luz

excessiva, enquanto outro mais interno, chamado medula, é frouxamente entrelaçado,

facilitando as trocas gasosas (AHMADJIAN, 1993).

FIGURA 1 - Corte transversal de Canomaculina pilosa (Stiz.) Elix & Hale em eletromicrografia de

varredura (cedida pela Profa. Dra. Sionara Eliasaro, Departamento de Botânica- UFPR).

Aumento de 1000 x.

A aparência do talo do fungo liquenizado é determinada primeiramente pelo

micobionte, entretanto sabe-se que a influência do fotobionte na morfogênese é

importante, uma vez que somente após a simbiose o talo característico é desenvolvido

(BÜDEL; SCHEIDEGGER, 1996). De maneira geral, existem três tipos de talo

liquênico, podendo ser crostoso, folioso ou fruticoso, e estes variam muito em

aparência, existindo desde formas muito simples até estruturas morfológicas e

anatomicamente complexas. A maior parte dos talos liquênicos pode ser medida em

centímetros (1 até 30 cm), entretanto, existem talos adultos de poucos milímetros, que

crescem em frestas de troncos ou de rochas, assim como enormes formas foliosas, com

mais de um metro de diâmetro, ou longas barbas-de-velho de até quatro metros de

comprimento (MARCELLI, 2006a).

Quanto à coloração dos fungos liquenizados, nos portadores de algas verdes, a

maioria dos talos liquênicos tem coloração entre o branco e o cinza, com um toque de

verde fornecido pela clorofila. Nos cianoliquens, as cores variam entre o preto,

marrom e cinza-chumbo. Por outro lado, alguns fungos liquênicos produzem

Córtex

superior

Camada

algal

Medula

Córtex

inferior

substâncias coloridas, para defesa contra o excesso de iluminação que pode degradar a

clorofila. Neste caso, o talo ou parte dele pode adquirir cores como amarelo, laranja e

vermelho (MARCELLI, 2006a).

Os fungos liquenizados possuem distribuição cosmopolita, podendo ser

encontrados desde os trópicos até as regiões polares, onde são freqüentemente a

vegetação predominante, no interior de rochas e cascas de árvores, em todos os

substratos, climas, altitudes e latitudes (GORIN et al., 1993). Os fungos liquenizados

conseguem sobreviver em condições de vida muito adversas devido à sua capacidade

de dessecamento rápido, oferecendo resistência a condições ambientais extremas de

temperatura e luz (RAVEN, 1996).

Esses organismos são os melhores bioindicadores de poluição de uma região,

devido à sua extrema sensibilidade a SO

, NO

e ozônio e habilidade em absorver e

acumular metais pesados (AHMADJIAN, 1993).

1.2 APLICAÇÃO DOS FUNGOS LIQUENIZADOS

Os fungos liquenizados são pouco usados na alimentação humana, devido ao

seu baixo conteúdo protéico, seu sabor geralmente amargo e sua escassa produção de

biomassa (LEGAZ et al., 2006). Entretanto, a espécie Cetraria islandica pode ser

convertida em um tipo de farinha usada no preparo de mingau, Gyrophora esculenta

usada no preparo do popular “iwatake” dos japoneses e Lecanora esculenta, o maná,

utilizado como alimento pelo homem e animais nas estepes semi-áridas (GORIN et al.,

1993).

Lethariella cashmeriana e L. sernanderi são utilizadas na medicina tradicional

tibetana e chinesa, no preparo de chás medicinais, possuindo a propriedade de baixar a

pressão arterial e reduzir inflamações. Os fungos liquenizados também têm sido

empregados para a fabricação de bebidas alcoólicas, substituindo o lúpulo da cerveja

por Lobaria pulmonaria (LEGAZ et al., 2006).

Devido as suas cores, que variam do branco ao negro, vermelho, laranja,

marron, amarelo e verde, muitos foram utilizados como corantes, entretanto, hoje

possuem pequena importância econômica (RAVEN, 1996; ELIX, 1996).

Nos últimos dez anos, diversos metabólitos procedentes desses organismos

estão sendo utilizados na fabricação de produtos cosméticos, como protetores solares.

(LEGAZ et al., 2006). Também é utilizado na indústria de perfumes, sendo as espécies

Evernia prunastri e Pseudevernia furfuraceae usadas para preparar um extrato o qual é

empregado como fixador de alguns perfumes (HONDA; VILEGAS, 1998).

Na medicina, as espécies Lobaria pulmonaria e Cetraria islandica têm sido

descritas como medicamentos para a tuberculose pulmonar. A Usnea barbata no

tratamento de doenças da pele e a Usnea longissima como expectorante. Além disso,

antibióticos contra as bactérias Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis, são também

encontrados nos liquens (GORIN et al., 1993).

Fungos liquenizados são usados como bioindicadores de poluição, devido à

capacidade de absorverem e acumularem metais pesados, ao fato de que muitas

espécies têm larga distribuição geográfica, e a constatação de que a morfologia não

varia de maneira marcante ao longo das estações (HONDA; VILEGAS, 1998).

Espécies contendo cianobactérias são de grande importância na fixação de nitrogênio

no solo (PURVIS, 2000).

1.3 PRINCIPAIS CONSTIUINTES QUÍMICOS DOS FUNGOS LIQUENIZADOS

Os principais constituintes químicos encontrados nos fungos liquenizados são

as substâncias liquênicas e os carboidratos (baixa e alta massa molar).

1.3.1 Substâncias Liquênicas

As substâncias liquênicas são produtos do metabolismo secundário do

micobionte, e são encontradas no córtex ou na medula, raramente em ambas as

camadas. A concentração pode variar de 0,1 a 10% em relação ao peso seco do talo

liquênico, embora em alguns casos a concentração possa ser superior (HONDA;

VILEGAS, 1998).

Os compostos provenientes do metabolismo secundário dos fungos liquenizados

são ácidos alifáticos, meta- e para-depsídeos, depsidonas, ésteres benzílicos,

dibenzofuranos, xantonas, antraquinonas, ácidos úsnicos, terpenos e derivados do

ácido pulvínico. Ainda que alguns desses compostos sejam também produzidos por

fungos de vida livre e por plantas superiores, a maior parte é considerada exclusiva de

fungos liquenizados (ELIX, 1996).

Até o momento, cerca de 700 dessas substâncias foram identificadas, sendo

esses organismos as entidades biológicas mais estudadas do ponto de vista da

produção de metabólitos secundários (MARCELLI, 2006a). Muitas delas vêm sendo

utilizadas com propósitos taxonômicos, devido a grande especificidade de ocorrência

nesses organismos (HONDA e VILEGAS, 1998).

1.3.2 Carboidratos de Fungos Liquenizados

Os carboidratos estão divididos em componentes de baixa e alta massa molar.

Entre os carboidratos de baixa massa molar encontram-se os monossacarídeos

redutores (pentoses, metilpentoses, hexoses e cetoses), polióis e os oligossacarídeos.

Componentes dos polióis incluem glicerol, eritritol, ribitol, arabinitol, manitol,

sorbitol, galactitol entre outros, e estão relacionados com a obtenção de energia

(GORIN et al., 1993).

Os carboidratos de alta massa molar são os polissacarídeos, sendo as α-

glucanas e β-glucanas (lineares ou com poucas substituições), galactomananas e

galactoglucomananas os mais freqüentes em fungos liquenizados (GORIN et al., 1993;

OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001).

Os primeiros estudos a respeito de polissacarídeos de fungos liquenizados

iniciaram em 1815 quando Berzelius extraiu de Cetraria islandica (“Iceland moss”)

uma glucana insolúvel em água fria, chamada liquenana [β-D-glucana (1→3) (1→4)]

na proporção de 3:7 (BERZELIUS

, citado por GORIN et al., 1993). Durante o

processo de purificação da liquenana foi observada a presença de uma outra glucana

solúvel em água. Utilizando-se de processos analíticos e quantitativos, o polissacarídeo

foi identificado como sendo uma α-D-glucana linear composta por ligações (1→3) e

(1→4) (3:2) sendo denominada isoliquenana (CHANDA et al., 1957).

A partir destes estudos com a Cetraria islandica, em que foram isolados os

polissacarídeos liquenana e isoliquenana, outros trabalhos foram realizados com o

objetivo de obtenção de polissacarídeos de diferentes espécies de fungos liquenizados.

Até 2001, aproximadamente 100 espécies de liquens foram investigadas quanto ao seu

conteúdo de polissacarídeos (OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001).

1.3.2.1 Homopolissacarídeos de fungos liquenizados

As glucanas são os principais homopolissacarídeos encontrados em fungos

liquenizados. A maioria apresenta uma estrutura linear com a presença de ligações

glicosídicas na sua configuração α ou β (IACOMINI et al., 2006), sendo estas

divididas segundo o tipo de ligação e a proporção molar. As principais glucanas

observadas em fungos liquenizados estão representadas na Tabela 1.

Outro homopolissacarídeo descrito é a xilana, e por ser encontrada em baixa

concentração, sugere-se que sua presença seja de responsabilidade do constituinte

fotobionte (CORRADI DA SILVA, 1992).

No basidiolíquen Dictyonema glabratum, o qual se encontra associado à alga

Scytonema sp. foi observado uma β-D-xilana linear ligada (1→4) e uma β-D-manana

contendo ligações do tipo (1→6) (CARBONERO et al., 2002a).

BERZELIUS, J.J. Versuche über die Mischung des Isländischen Mosses und Seine Anwendung als

Nahrungsmittel. J. Chem. Phys., v.7, p.317-353,1815.

TABELA 1 – Tipos de glucanas encontradas em fungos liquenizados

Tipos de glucanas Denominação Proporção

das ligações

Características estruturais

1:1

Linear; algumas possuem ligações (1→2)

Nigerana

1,2:1 Linear

3:1 Linear, distribuição irregular de ligações

3,8:1 Apresenta ramificação em O-2 (5%)

4:1 Linear

Isoliquenana

6:1

Possuem ligações (1→6)

2:3

Possuem ligações (1→6) (~ 6%)

α-D-Glucana (1→3), (1→4)

Acroscifana

2:5 Apresenta ramificação em O-3 (3%)

α-D-Glucana (1→4), (1→6)

Pululana 1:1 Linear

α-D-Glucana (1→3)

Pseudonigerana Linear

β-D-Glucana (1→3)

Laminarana Linear

β-D-Glucana (1→6)

Pustulana Podem apresentar grupamentos O-acetil

1:2 Linear

1:3 Linear

3:1 Linear

β-D-Glucana (1→3), (1→4)

Liquenana

3:7 Linear

β-D-Glucana (1→3), (1→6)

Apresentam cadeia principal formada por

unidades de β-D-Glcp (1→3), (1→6) ou

unidades de β-D-Glcp (1→3) ligadas;

Contém ramificação em O-6 (~ 20%)

1.3.2.2 Heteropolissacarídeos de fungos liquenizados

Os primeiros estudos a respeito de heteropolissacarídeos de fungos liquenizados

foram realizados em 1906, por ULANDER e TOLLENS

(citado por GORIN e

IACOMINI, 1984), quando detectaram manose, galactose e glucose no líquen Cetraria

islandica. Entretanto, os polissacarídeos de fungos liquenizados que contêm manose

foram somente descobertos em 1924 por KARRER & JOOS

(citado por GORIN e

IACOMINI, 1984), a partir de uma extração com água quente do líquen Cetraria

islandica após complexação com cobre via solução de Fehling. O precipitado obtido

ULANDER, A.; TOLLENS, B. Untersuchungen über die Kohlenhydrate der Flechten. Berichte der

deutschen chemischen Gesellschaft, v. 39, p. 401, 1906.

KARRER, J.; JOOS, B. Polysaccharide. XXX. Zur Kenntnis des Isolichenins. Hoppe Seyler’s Z.

Physiol. Chim., v. 141, p.311-315, 1924.

continha manose, galactose e glucose na proporção molar de 21:35:44, sugerindo uma

possível mistura entre uma galactomanana e liquenana ou galactoglucomanana.

A partir de 1984, os trabalhos de GORIN e IACOMINI (GORIN; IACOMINI,

1984, 1985; IACOMINI; SCHNEIDER; GORIN, 1985) representaram um grande

avanço no estudo dos heteropolissacarídeos de fungos liquenizados. Em 1984 estes

autores determinaram a estrutura das galactomananas obtidas por tratamento com

solução de Fehling dos extratos alcalinos da Cetraria islandica e Ramalina usnea. As

estruturas das galactomananas obtidas a partir destes liquens foram estruturalmente

diferentes. Análises químicas mostraram que ambas continham uma cadeia principal

de α-D-Manp ligados (1→6), entretanto, a molécula obtida de C. islandica mostrou-se

mais ramificada, com cadeias laterais de α-D-Galp e β-D-Galp ligadas em O-2 e O-4,

respectivamente, enquanto que a molécula obtida da R. usnea era menos ramificada,

com unidades de β-D-Galp ligados em O-4 às unidades de manose.

Estruturas similares foram obtidas a partir de Peltigera aphthosa, Parmelia

sulcata, Letharia vulpina, Stereocaulon paschale, Actinogyra muehlembergii e Usnea

sp., sendo a variação em relação ao grau e a seqüência que estas unidades eram ou não

substituídos nas posições O-2, O-4 e/ou O-2,4 por unidades de α-D-Manp e α-D-Galp,

β-D-Galp e β-D-Galf , respectivamente (GORIN e IACOMINI, 1985).

IACOMINI, SCHNEIDER e GORIN (1985) realizaram um estudo comparativo

entre galactomananas de três espécies do gênero Cladonia. Observou-se que C.

alpestris e C. confusa apresentavam galactomananas com cadeia principal α-D-Manp

ligado (1→6), sendo algumas 2-O-substituídas por unidades de α-D-Manp, 4-O-

substituídas por unidades de β-D-Galp, ou 2,4-di-O-substituídas por α-D-Manp e β-D-

Galp, respectivamente, sendo que C. amaurocraea apresenta uma galactomanana com

estrutura semelhante. A espécie C. alpestris mostrou uma galactomanana diferente,

contendo cadeia principal de α-D-Manp ligado (1→2) e substituída em O-6 por

unidades β-D-Galf .

No líquen Parmotrema cetratum foi obtida uma galactoglucomanana com

cadeia principal formada por unidades de α-D-Manp ligadas (1→6) e 2-O-substituídas

por unidades de α-D-Galp, 4-O-substituídas por unidades de β-D-Galp, ou 2,4-di-O-

substituídas por α-D-Galp e β-D-Galp, respectivamente (CORRADI DA SILVA;

GORIN; IACOMINI, 1993). CARBONERO et al., (2005a) estudaram várias espécies

dos gêneros Parmotrema e Rimelia, e todas apresentaram galactoglucomananas com

diferenças típicas de espécies, apresentando cadeia principal α-Manp-(1→6), sendo

não substituídas ou substituídas preferencialmente em O-2 e O-4 por terminais não

redutores de α-D-Galp e β-D-Galp, respectivamente. As galactoglucomananas de 13

espécies de Cladonia também foram estudadas, sendo as estruturas obtidas

constituídas por uma cadeia principal formada por unidades α-D-Manp-(1→6) ligadas

e o padrão de substituição da cadeia principal das mesmas apresentou variações de

acordo com a espécie (WORANOVICZ-BARREIRA, 1999d; WORANOVICZ-

BARREIRA et al., 1999c).

Galactomananas com cadeias laterais altamente complexas foram obtidas de

Lasallia pustulata, a qual apresenta uma cadeia principal formada por unidades de α-

Manp-(1→6), parcialmente substituídas por cadeias laterais, de diferentes tamanhos,

constituídas por unidades de α-Manp-(1→2) e Galf (PEREYRA et al., 2003).

Estruturas complexas (galactofuranomanana) também foi caracterizado no líquen

Umbilicaria mammulata (Trebouxia sp.), sendo esta formada por uma cadeia principal

de unidades de α-Manp-(1→6), sendo substituída em O-2, O-4 e O-2,4 por cadeias

laterais contendo unidades α-Manp e β-D-Galf (CARBONERO et al., 2006).

A partir de Leptogium azureum foi caracterizado uma galactomana, contendo

altos teores de manose, a qual contém uma cadeia principal α-D-Manp ligada (1→6),

altamente substituída em O-2 por terminais não redutores de α-D-Manp ou β-D-Galp.

As unidades de β-D-Galp substituem as unidades de α-D-Manp da cadeia principal em

O-2 e não em O-4, como geralmente observado (CARBONERO et al., 2003).

Estrutura similar, com alto nível de substituição e elevado teor de manose, foi

encontrado também para o cianolíquen Collema leptosporum (PRADO et al., 1999),

constituída de cadeia principal α-D-Manp (1→6) ligada, sendo substituída em O-2,4

por terminais não redutores de α-D-Manp e/ou β-D-Galp, respectivamente, sugerindo

que estas estruturas similares podem ser típicas de fungos liquenizados da família

Collemataceae.

Diferente da maioria das galactomananas já descritas, as quais contêm uma

cadeia principal formada por unidades de α-Manp-(1→6), no líquen Roccella

decipiens (CARBONERO et al., 2005b) foram isolados dois heteropolímeros contendo

cadeia principal formada por unidades α-Manp-(1→4), o qual encontra-se

parcialmente substituído em O-2 por cadeias laterais de unidades de β-Galf e α-Manp

2-O e 6-O- substituídas. Nestas estruturas, as unidades de galactose estão ligadas nas

extremidades das unidades de Manp das cadeias laterais, podendo estas estarem

presentes como β-Galf ou β-Galf 5-O-, 6-O- e 5,6-di-O- substituídas.

TEIXEIRA e colaboradores (1995) caracterizaram os heteropolissacarídeos de

23 espécies diferentes de fungos liquenizados os quais estão compreendidos em 13

gêneros. De acordo com os dados obtidos, os autores classificaram os liquens, de

acordo com o padrão observado para a região de C-1 dos espectros de RMN-

C, em 5

grupos diferentes, desta maneira, os autores sugerem que esses padrões possam ser

utilizados como uma possível base para quimiotaxonomia (TEIXEIRA; IACOMINI;

GORIN, 1995).

Estudos comparativos utilizando polissacarídeos também foram realizados com

os gêneros Cladina e Cladonia. Os autores verificaram a presença de

galactomanoglucanas semelhantes para a maioria das espécies de Cladonia (com

exceção da Cladonia furcata), com cadeia principal constituída de unidades de β-D-

Glcp (1→3) ligadas, sendo substituídas em O-2,6. As ramificações são constituídas

principalmente por β-D-Galf, β-D-Galp, β-D-Galf 6-O-substituídas, e unidades de α-D-

Manp 2-O, 4-O, 6-O e 2,3-di-O-substituídas. (WORANOVICZ-BARREIRA et al.,

1999b; WORANOVICZ-BARREIRA, 1999d). Estudos semelhantes foram realizados

para galactoglucomananas e galactomanoglucanas isoladas de três espécies do gênero

Cladina, dessa maneira, os autores sugerem que a química destes heteropolímeros

possam auxiliar na classificação de espécies dos gêneros Cladina e Cladonia

(CARBONERO et al., 2002b).

Em Tornabenia intricata foi isolado um heteropolissacarídeo contendo apenas

manose e glucose (glucomanana) formada por uma cadeia principal de α-Manp-

(1→6), parcialmente substituída em O-2 e O-4 por α-Manp, α-Manp 2-O- substituídas

e, com menores quantidades, α-Glcp (TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992).

Além dos heteropolímeros já descritos, no basidiolíquen Dictyonema glabratum

foi observado a presença de uma xilomanana com cadeia principal contendo unidades

de α-D-manopiranose ligadas (1→3), sendo 10% não substituída, 4-O- (10%) e 2,4-di-

O-substituída (10%) por unidades de β-D-xilopiranose (IACOMINI et al., 1987).

Recentemente foi observado um heteropolissacarídeo diferente, thamnolana, isolada

do Thamnolia subuliformis, sendo uma ramnogalactofuranana com cadeia principal

constituída por β-D-Galf-(1→3), com substituição em O-6, por diferentes tipos de

cadeias laterais (OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001).

Os heteropolissacarídeos descritos na literatura são mostrados, de maneira

geral, na Tabela 2. Nesta, pode ser observado os diferentes tipos de estruturas, sendo

as galactomananas e as galactoglucomananas as mais comumente encontradas. Estas

apresentam uma cadeia principal formada por unidades de α-Manp-(1→6),

substituídas, principalmente, em O-2, O-4 e/ou O-2,4 por unidades de α- ou β-Galp,

α-Manp, Glcp e, mais raramente, por β-Galf (Figura 2).

FIGURA 2 - Principais estruturas observadas em galactomananas de fungos liquenizados

-D-Manp

↓

-α-D-Manp-(1→6)-

-D-Manp

↓

-α-D-Manp-(1→6)-

↑

β-D-Galp (β-D-Galf)

-D-Galp

↓

-α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→6)-

↑

β-D-Galp

-D-Galp

↓

-α-D-Manp-(1→6)-

A B C

D E

TABELA 2 – Tipos de heteropolissacarídeos encontrados em fungos liquenizados

Heteropolissacarídeos

Composição

Monossacarídica

Cadeia principal Principais características estruturais

Galactomananas e/ou

Galactoglucomananas

Man:Gal:Glc

com proporções variáveis,

sendo Man e Gal sempre

em maior proporção

α-D-Manp (1→6)

Apresentam diferentes padrões de

substituição principalmente em O-2, O-4

e/ou O-2,4 por unidades de α- ou β-Galp

ou α-Manp ou Glcp, mais raramente por

β-Galf.

Glucomanana Man: Glc (93: 07)

α-D-Manp (1→6)

Substituída, principalmente, em O-2 por

cadeias lateriais de α-D-Manp e menor

proporção de α-D-Glcp

Galactofuranomananas

Man:Gal

com proporções variáveis

α-D-Manp (1→4)

Apresentam substituição principalmente

em O-2 e O-6 por unidades de α-Manp, e

diferentes padrões de substituição β-Galf.

Xilomanana

Gal:Rha:Glc:Xyl:Man:Fuc

(17:04:08:32:29:10)

α-D-Manp (1→3)

Não substituídas (10%) ou 4-O- (10%) e

2,4-di-O-substituídas (10%) por unidades

de β-D-Xylp

Galactomanoglucanas

Glc: Gal: Man

com proporções variáveis

β-D-Glcp (1→3)

Substituídas,principalmente, em O-2 e O-

6 sob diferentes modelos por unidades D-

Manp e D-Galp substituídas e ainda

unidades de D-Galf terminal não redutora

Arabinogalactomanogluc

ana

Ara:Gal:Man:Glc

12:34:40:14

β-D-Glcp (1→3)

Apresentam substituição em O-2 e O-6

por cadeias laterais altamente ramificadas

Ramnogalactofuranana

(Thamnolana)

Gal:Rha:Glc:Xyl:Man

40:31:13:10:06

β-D-Galf-(1→3)

Apresenta substituição em O-6 por

diferentes tipos de cadeias laterais

1.4 IMPORTÂNCIA DA CARACTERIZAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS

LIQUÊNICOS

1.4.1 Quimiotaxonomia

A identificação de fungos liquenizados em gêneros e espécies baseia-se

tradicionalmente na análise e descrição de caracteres morfológicos do talo liquênico e

apotécios (NASH, 1996). Porém, a presença de metabólitos vem sendo utilizada como

um recurso adicional para caracterizar fungos liquenizados. A análise química para

fins taxonômicos, a quimiotaxonomia, faz uso de reações de coloração no talo, de

procedimentos de microcristalização e cromatografia, análise por fluorescência e

espectrometria de massa de metabólitos secundários (HONDA, N. K., 2006). Também

foi sugerido para essa finalidade o uso de dados de RMN de polissacarídeos

(TAKAHASHI et al., 1981; GORIN et al., 1993; TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN,

1995). Dessa maneira, os avanços das técnicas de biologia molecular em conjunto com

a caracterização estrutural fina de macromoléculas, são uma importante ferramenta na

classificação taxonômica de fungos liquenizados, pois, na maioria das vezes, dados

relativos apenas à análise morfológica não elucidam a identificação de um dado

espécime (HONDA; VILEGAS, 1998).

O estudo de polissacarídeos, evidenciados por análises químicas e

espectroscópicas de RMN, auxiliam na taxonomia, uma vez que tanto as glucanas

quanto as galactomananas apresentam uma grande variedade de estruturas. Como as

estruturas destes polímeros mostram-se típicas, estas podem ser utilizadas como

ferramenta na identificação e na taxonomia de fungos liquenizados (GORIN et al.,

1993; TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1995; WORANOVICZ-BARREIRA et al.,

1999a,b,c; CARBONERO et al., 2001, 2002b; CARBONERO, 2005).

Os polissacarídeos obtidos dos diferentes fungos liquenizados apresentam um

padrão de distribuição. A pustulana é característica para a família Umbilicariaceae, a

liquenana é encontrado em Parmeliaceae, nigerana e pustulana são as glucanas

presentes em Cladoniaceae, enquanto que nigerana, laminarana e isoliquenana são

características em Ramalinaceae, sugerindo que as glucanas desempenham um

importante papel como marcadores taxonômicos para gênero e família. Da mesma

maneira, os heteropolissacarídeos também vêm sendo utilizados na classificação,

podendo, em alguns casos, diferenciar entre gêneros e até mesmo entre espécies

(OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001).

1.4.2 Polissacarídeos com Atividades Biológicas

Polissacarídeos de plantas e outras fontes naturais exercem atividade

antitumoral, imunomodulatória, anticoagulante, entre outras. Os estudos com as

atividades biológicas dos polissacarídeos de fungos liquenizados iniciaram-se no final

da década de 60 e vários trabalhos têm mostrado que polissacarídeos de fungos

liquenizados possuem atividades biológicas similares e com menor toxicidade, sendo

estes cada vez mais usados na medicina (OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001;

ASSEF et al., 2002).

Vários estudos foram realizados com os polissacarídeos de fungos liquenizados

isolados pelo grupo de Química de Carboidratos de Liquens da UFPR. Foi investigada

a atividade antitumoral de uma α-D-glucana com ligações (1→3) e (1→4) com relação

molar (3:1) (isoliquenana) do líquen Ramalina celastri, sendo demonstrado a atividade

citotóxica in vitro desta glucana nativa e modificada quimicamente por sulfatação,

resultando na morte celular de células tumorais (HeLa) (LEÃO et al., 1997).

Continuando os estudos com esta mesma glucana in vivo, usando o tumor Sarcoma

180 (S-180), os resultados mostram que esta pode inibir o crescimento do tumor, além

de possuir atividade imunoestimulante sobre macrófagos, induzindo um aumento no

número de células e na ação fagocitária (ASSEF et al., 2002; STUELP-CAMPELO et

al., 2002).

Uma glucana β-(1→6) ligada isolada do líquen Parmotrema mantiqueirense, e

uma galactoglucomanana, isolada do líquen Cladonia ibitipocae, foram sulfatadas e

mostraram atividades anticoagulante e antritrombótica, demonstrando que a

derivatização química de polissacarídeos, como a sulfatação, podem exibir tais

atividades (MARTINICHEN-HERRERO et al., 2005a, 2005b).

Dentre as 17.000 espécies de liquens, não mais que 100 foram estudados quanto

aos seus polissacarídeos (OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001). Como na

família Physciaceae apenas o líquen Tornabenia intricata foi estudado quanto ao seu

conteúdo em polissacarídeos, e a família Parmeliaceae necessita de mais estudos neste

aspecto, pois esta é muito extensa, e devido a muito dos polissacarídeos de liquens

serem únicos, possuindo atividade farmacológica e importância taxonômica, o

presente trabalho visa estudar os polissacarídeos dos liquens Heterodermia obscurata

(família Physciaceae) e Punctelia constantimontium (família Parmeliaceae) dando

continuidade aos trabalhos realizados pelo grupo de Química de Carboidratos de

Liquens da UFPR.

1.5 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS LIQUENIZADOS ESTUDADOS

Neste trabalho, foram estudadas 2 espécies de fungos liquenizados quanto aos

seus componentes polissacarídicos. Estes são Heterodermia obscurata e Punctelia

constantimontium.

1.5.1 Heterodermia obscurata

Este fungo liquenizado pertence à classe dos Ascomicetos, ordem Lecanorales,

subordem Lecanorineae, família Physciaceae (TEHLER, 1996), apresenta morfologia

do talo do tipo folioso e a alga verde Trebouxia como fotobionte. O gênero

Heterodermia consiste de aproximadamente 80 espécies, de distribuição tropical e

subtropical (COHEN; TOWERS, 1995), sendo cerca de 42 espécies de Heterodermia

citadas para o Brasil e 6 para o Paraná (MARCELLI, 2006b).

1.5.2 Punctelia constantimontium

Este fungo liquenizado pertence à classe dos Ascomicetos, ordem Lecanorales,

subordem Lecanorineae, família Parmeliaceae (TEHLER, 1996). É um gênero

facilmente reconhecido pela presença de pseudocifelas (pequenos poros) na superfície

superior, talo verde-acinzentado (atranorina no córtex), superfície inferior negra e

ausência de cílios (SPIELMANN, 2005).

São conhecidas atualmente cerca de 29 espécies de Punctelia, das quais 16 são

citadas para o Brasil e 7 para o Paraná (MARCELLI, 2006b), sendo a alga verde

Trebouxia sp. o fotobionte presente neste gênero.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho tem por objetivo geral a análise estrutural dos

polissacarídeos presentes nos fungos liquenizados Heterodermia obscurata e Punctelia

constantimontium.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Para o cumprimento do objetivo geral, têm-se como objetivos específicos:

a) Extrair e purificar os polissacarídeos dos fungos liquenizados Heterodermia

obscurata e Punctelia constantimontium;

b) Caracterizar estruturalmente os polissacarídeos obtidos, utilizando técnicas

químicas e analíticas de RMN e GC-MS.

FIGURA 4 – Foto do fungo liquenizado Heterodermia obscurata

3.2 OBTENÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS

3.2.1 Extrações

Os talos liquênicos (Punctelia constantimontium e Heterodermia obscurata)

limpos, secos e moídos foram pesados e submetidos, separadamente, a quatro

processos de extração, como descrito a seguir:

3.2.1.1 Extração com Acetona

Os talos liquênicos foram primeiramente submetidos a sucessivas extrações

com acetona a 50ºC sob refluxo, por períodos de 6 horas (2 x). Após cada extração, os

extratos acetônicos foram filtrados ainda quentes e evaporados até secura em

temperatura ambiente, para que os rendimentos pudessem ser calculados. Os materiais

residuais foram submetidos ao próximo processo extrativo.

3.2.1.2 Extração Etanólica

Os resíduos liquênicos da extração anterior foram submetidos à extração com

etanol, sob refluxo, por 6 horas a 60°C (1 x), sendo filtrado após extração. Os extratos

foram reunidos e evaporados até secura em temperatura ambiente, para calcular o

rendimento.

3.2.1.3 Extração Aquosa

Os materiais residuais, resultantes da extração etanólica, foram submetidos à

extração aquosa, sob refluxo a 100ºC, por 6 horas (3x para H. obscurata e 4x para P.

constantimontium). Após cada etapa, o extrato aquoso foi filtrado a quente,

concentrado em rotaevaporador até pequeno volume e precipitado com etanol (3:1,

v/v), com a finalidade de separar as moléculas de alta massa molar (precipitado) dos

componentes de baixa massa molar (sobrenadante). Os precipitados etanólicos obtidos

foram dialisados em água corrente por 48 horas e liofilizados.

3.2.1.4 Extração alcalina

Os resíduos das extrações aquosas foram extraídos com soluções aquosas de

KOH a 2% (5x para H. obscurata e 6x para P. constantimontium) e 10% (2x para

3.3 FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS

Os polissacarídeos obtidos pelos processos de extrações aquosas e alcalinas a 2

e 10% foram purificados através de diversas técnicas, como de congelamento e degelo

(GORIN; IACOMINI, 1984) e tratamento com solução de Fehling (JONES;

STOODLEY, 1965). A purificação foi acompanhada pelo perfil de eluição obtido por

meio de análises de HPSEC-MALLS.

3.3.1 Separação dos Polissacarídeos por Congelamento e Degelo

As frações obtidas através das extrações aquosas e alcalinas foram submetidas,

separadamente, ao processo de purificação por congelamento e degelo (GORIN;

IACOMINI, 1984). Cada fração foi solubilizada em água destilada e submetida ao

processo de congelamento e posterior degelo à temperatura ambiente, centrifugação

(8500 rpm, 20 min, 25°C), resultando em frações solúveis (sobrenadante) e insolúveis

em água fria (precipitado). Este processo de purificação foi repetido diversas vezes, até

que os sobrenadantes aquosos não apresentassem mais precipitado.

3.3.2 Purificação dos Polissacarídeos com Solução de Fehling

Os sobrenadantes do processo de congelamento e descongelamento foram

submetidos à purificação com solução de Fehling (JONES; STOODLEY, 1965). Esta

solução é preparada a partir de outras duas (A e B), sendo a solução A composta por

tartarato de potássio e KOH, enquanto que a B consiste de sulfato de cobre.

À fração sobrenadante, que foi dissolvida em volume de água suficiente para

solubilizá-la, adicionou-se igual volume da solução de Fehling: A+B (1:1) e após

vigorosa agitação manual, o material foi mantido sob refrigeração por 12 horas.

Os precipitados e os sobrenadantes foram separados por centrifugação (9000

rpm, 15 min, 25°C), neutralizados com ácido acético (HOAc) e dialisados contra água

corrente (~ 48 horas). Após a diálise, ambos foram tratados com resina catiônica

(Dowex 50x8, forma Na

) com o objetivo de retirar o cobre, e novamente dialisados.

Em seguida, os materiais foram concentrados sob pressão reduzida, congelados e

liofilizados, e seus rendimentos calculados.

3.4 ANÁLISE ESTRUTURAL DOS POLISSACARÍDEOS

3.4.1 Composição Monossacarídica

A composição monossacarídica dos polissacarídeos foi realizada em GC-MS

após hidrólise, redução e acetilação. Os monossacarídeos foram identificados pelos

seus respectivos valores de tr (tempo de retenção) e perfis de fragmentação.

3.4.1.1 Hidrólise Ácida Total

Amostras de polissacarídeos de aproximadamente 1 mg foram tratadas com 1,0

ml de TFA (ácido trifluoroacético) 2 M, durante 8 horas a 100°C ou TFA 1 M a

100°C, overnight (12-15h). Após este tempo, o ácido foi eliminado das amostras

hidrolisadas por evaporação à secura, sendo em seguida, submetidas à redução e

acetilação.

3.4.1.2 Redução e Acetilação dos Produtos de Hidrólise

Os produtos de hidrólise foram reduzidos com NaBH

(boroidreto de sódio) ou

NaB

(boroidreto de sódio deuterado) (WOLFROM; THOMPSON, 1963a) em

temperatura ambiente, pH 9-10, por 15 horas. Após este período, os materiais foram

neutralizados (pH 7,0) com resina catiônica (forma H

). A solução foi filtrada em

algodão e levada a secura em rotaevaporador. O ácido bórico formado foi eliminado na

forma de borato de trimetila, por meio de co-evaporação com metanol.

Os alditóis formados foram acetilados com anidrido acético e piridina (1:1, v/v),

overnight, à temperatura ambiente (WOLFROM; THOMPSON, 1963b). A reação foi

interrompida pela adição de gelo e os acetatos de alditóis formados foram extraídos

com clorofórmio. A piridina residual, ainda presente na fração clorofórmica, foi

removida por complexação com sulfato de cobre 5%. Após completa remoção da

piridina, o clorofórmio foi evaporado e os acetatos de alditol analisados por GC-MS

(Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa).

3.4.2 Metilação dos Polissacarídeos

As frações polissacarídicas que se mostraram puras foram metiladas pelo

método de CIUCANU e KEREK (1984) e/ou HAWORTH (1915).

No primeiro método, a amostra (2-5 mg) a ser analisada foi dissolvida (1%, p/v)

em dimetilsulfóxido (Me

SO), e após foi adicionado hidróxido de sódio (NaOH) seco

e triturado (4:1 NaOH:carboidrato). A solução foi mantida sob agitação e, então, foi

adicionado iodeto de metila (CH

I) na proporção recomendada

(CH

I/NaOH/carboidrato 1:200:50). Após 24 horas, a amostra foi neutralizada com

HOAc, dialisada exaustivamente contra água corrente, liofilizada e o processo foi

repetido novamente. Terminada a metilação por este método, foi realizada a extração

dos produtos per-O-metilados com CHCl

No segundo método, os polissacarídeos (10-20 mg) foram primeiramente

tratados com boroidreto de sódio (pH 9-10), dialisados contra água corrente e

liofilizados. Após foram solubilizados em 3 ml de uma solução de NaOH 40% (p/v),

mantidos sob agitação magnética constante e adicionados 0,5 ml de dimetilsulfato

(DMS), por 6 vezes. O material foi deixado sob agitação overnight, sendo o processo

repetido novamente.

Os polissacarídeos parcialmente O-metilados foram hidrolisados com H

50% (v/v; 0,5 ml) por 1 hora a 0°C, seguido por diluição até 5,5% (v/v; adição de 4,0

ml de água destilada), sendo então mantido a 100°C por um período de 12-18 horas,

seguido por neutralização com BaCO

(SAEMAN et al., 1954). Em seguida, estes

materiais foram derivatizados de acordo com o item 3.4.1.2 e analisados por GC-MS.

3.4.3 Dosagem de ácidos urônicos dos heteropolissacarídeos

A dosagem de ácido urônico foi realizada pelo método colorimétrico descrito

por FILISETTI-COZZI e CARPITA (1991). Em 400 µl de amostra foram adicionados

40 µl de uma solução de ácido sulfâmico-sulfamato de potássio 4 M (pH 1,6), e 2,4 ml

de solução de tetraborato de sódio 75 mM,

em H

concentrado. Após aquecimento

em banho com H

O fervente por 20 min, esta mistura foi resfriada e adicionados 80 µl

da solução de m-hidroxi-bifenil (Sigma) a 0,15% em NaOH 0,5% para a produção do

complexo colorido.

A coloração, estável até 1 hora após sua formação, foi lida em 525 nm. A

quantificação foi realizada com o auxílio de uma curva padrão de ácido glucurônico

(Sigma) dentro da sensibilidade do método (0,97 a 38,8 µg de ácido urônico).

3.4.4 Carboxi-redução do heteropolissacarídeo de P. constantimontium

O processo de carboxi-redução foi realizado segundo TAYLOR e CONRAD

(1972). O polissacarídeo (200 mg) foi dissolvido 3ml de tampão MES [ácido 2-(N-

morfolina)-etanosulfônico] (0,2 M) e a este se adicionou, pouco a pouco e sob

agitação, 385 mg de carbodiimida [ciclo-hexil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimida]. A

mistura de reação ficou sob agitação por duas horas. Decorrido este tempo, o pH foi

ajustado para 7,0 pela adição de tampão TRIS/HCl (2 M, pH 7,0; 1 ml). A amostra foi

então reduzida com NaBH

ou NaB

até uma concentração final de 2 M, durante 16

h, e depois foi neutralizada com ácido acético (HOAc). Finalmente, o material foi

dialisado em membrana com limite de exclusão de 8 kDa durante 48 horas,

concentrado e liofilizado. O processo de carboxi-redução foi novamente realizado,

sendo posteriormente analisado por espectroscopia de RMN e metilação.

3.4.5 Hidrólise Ácida Parcial

A glucomanana e a galactoglucomanana (~ 100mg) obtidas do fungo

liquenizado H. obscurata e P. constantimontium, respectivamente, foram submetidas a

hidrólises ácidas parciais com H

0,16 M, por 4, 6 e 10 h. Decorrido o tempo, as

soluções, separadamente, foram dialisadas em membranas com limite de exclusão de 2

kDa e então liofilizadas. Uma amostra (2mg) foi hidrolisada e seus monossacarídeos

analisados quanto aos seus derivados acetatos de alditol, por GC-MS. O restante foi

examinado por RMN-

C e metilação.

3.5 MÉTODOS ANALÍTICOS

3.5.1 Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS)

As análises cromatográficas em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa

foram realizadas utilizando um cromatógrafo a gás VARIAN, modelo 3.300, acoplado

a um espectrômetro de massa de marca FINNIGAN MAT, modelo ITD 800, e Varian

Saturn 2000R, ambos equipados com colunas capilares de sílica fundida (30m x 0,25

mm d.i.) revestidas DB-225 e DB23. As injeções nas colunas foram feitas partindo-se

de 50°C (mantida por 1 minuto), seguindo-se um aumento gradual de 40°C.min

-1

, até

215°C (acetatos de alditóis parcialmente O-metilados), ou 220°C (acetatos de alditóis),

sendo mantida constante até o final da análise. Hélio ultra puro foi utilizado como gás

de arraste, a um fluxo de 1,0 ml.min

-1

3.5.2 Cromatografia de exclusão estérica acoplada à detecção por índice de refração e

espalhamento de luz (HPSEC-MALLS)

As amostras foram solubilizadas em solução de nitrito de sódio (0,1 mol·l

-1

contendo azida de sódio (NaN3) 0,2 g·l-

, para uma concentração final de 1 mg·ml

-1

sendo filtradas através de membrana de acetato de celulose com tamanho de poro

equivalente a 0,22 µm. Em seguida, as amostras foram aplicadas em cromatógrafo de

exclusão estérica de alta pressão (HPSEC) Waters equipado com detector de índice de

refração diferencial, modelo Waters 2410, e com detector de espalhamento de luz em

multiângulos Wyatt technology, modelo DAWN DSP-F. Foram utilizadas, em série, 4

colunas de gel permeação Waters com limites de exclusão de 1 x 10

, 4 x 10

, 8 x 10

5 x 10

. O eluente utilizado foi uma solução de nitrito de sódio (NaNO2) 0,1 mol·l

-1

contendo azida de sódio (NaN3) 0,2 g·l

-1

, com fluxo de 0,6 ml min

-1

, monitorado por

bomba peristáltica Waters 515.

3.5.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

As amostras de polissacarídeos foram solubilizadas em água deuterada (D

ou dimetilsulfóxido deuterado (Me

SO-d

) e analisadas em tubos de quartzo de 20 cm

de comprimento por 5 mm de diâmetro interno. Os experimentos de

C e

H, mono e

bidimensionais foram realizados em um espectrômetro Bruker, modelo Advance DRX

400 MHz. A temperatura de cada análise foi estabelecida de acordo com a solubilidade

de cada amostra.

Os deslocamentos químicos das amostras solúveis em D

O foram expressos em

δ (ppm) relativos aos sinais de

C e

H da acetona em δ 30,20 e 2,22,

respectivamente, e aos sinais do Me

SO-d

em δ 39,70 (

C) e 2,40 (

H), para as

amostras solúveis no mesmo.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na presente pesquisa foram estudadas duas espécies de fungos liquenizados,

Punctelia constantimontium e Heterodermia obscurata, quanto aos seus componentes

polissacarídicos.

Conforme descrito anteriormente na seção Material e Métodos, para cada

espécie de fungo liquenizado realizou-se os processos de extração e purificação, sendo

adotadas as siglas HO para H. obscurata e PC para P. constantimontium (Figura 5). Os

fungos liquenizados estudados foram deslipidificados e submetidos aos procedimentos

de extrações e purificações dos carboidratos de alta massa molar.

4.1 DESLIPIDIFICAÇÃO E EXTRAÇÃO ETANÓLICA

O talo liquênico dos fungos liquenizados Punctelia constantimontium (53,0 g) e

Heterodermia obscurata (30,3 g), após triturados, foram submetidos a extrações com

acetona (2 x). Os extratos acetônicos apresentaram um rendimento de 12,2% para o

fungo liquenizado H. obscurata e de 11,4% para P. constantimontium, como mostra a

tabela 3. Esses extratos foram reservados para avaliações posteriores.

TABELA 3 - Rendimento das frações obtidas das extrações dos fungos liquenizados H. obscurata e

P. constantimontium.

Rendimento (em g%)

(1)

FRAÇÕES

H. obscurata P. constantimontium

Extrato acetônico

Extrato etanólico

Extrato aquoso

Extrato alcalino 2%

Extrato alcalino 10%

12,2

3,9

4,0

26,0

4,0

11,4

5,1

12,1

24,2

3,6

(1) Rendimento calculado com base no peso seco do fungo liquenizado (H. obscurata, 30,3g e P.

constantimontium,53,0 g).

FIGURA 5 – Fluxograma de extração e purificação dos polissacarídeos dos fungos liquenizados

Heterodermia obscurata e Punctelia constantimontium.

(1) Liquens: Heterodermia obscurata-HO (30,3g) e Punctelia constantimontium-PC (53,0g)

(2) Extração aquosa: 3 x para H. obscurata e 4 x para P. constantimontium

(3) Extração alcalina 2%: 5 x para H. obscurata e 6 x para P. constantimontium

Os materiais residuais foram posteriormente extraídos com etanol para obtenção

de carboidratos de baixa massa molar. Os rendimentos dessa extração foram de 3,9% e

5,1% para H. obscurata e P. constantimontium, respectivamente (Tabela 3).

Os extratos etanólicos obtidos foram acondicionados e reservados para

investigações posteriores.

4.2 EXTRAÇÕES AQUOSAS E ALCALINAS

O material deslipidificado foi submetido a sucessivas extrações aquosas e

alcalinas (solução aquosa de hidróxido de potássio a 2% e 10%) com a finalidade de

extrair os polissacarídeos. Primeiramente, foram realizadas extrações aquosas sob

refluxo em banho com água fervente (3 x para H. obscurata e 4 x para P.

constantimontium), sendo os polissacarídeos extraídos recuperados por precipitação

etanólica (3:1, v/v) e os precipitados etanólicos dialisados contra água corrente,

originando as frações W-HO e W-PC, para H. obscurata e P. constantimontium,

respectivamente (Figura 5).

Os materiais residuais (Resíduo III) obtidos após extrações aquosas foram

submetidos a extrações alcalinas com solução de KOH 2%, com adição de boroidreto

de sódio (NaBH

), sob refluxo em banho com água fervente, durante 6 horas (5 x para

H. obscurata e 6 x para P. constantimontium). O mesmo procedimento foi realizado

com solução aquosa de KOH a 10% durante 6 horas (2 x). Os extratos alcalinos a 2% e

10% (K2-HO, K2-PC, K10-HO e K10PC) obtidos foram, separadamente,

neutralizados com ácido acético glacial (HOAc), dialisados contra água corrente e

liofilizados.

Pode-se observar que em ambos os liquens, o maior rendimento obtido foi para

a extração alcalina a 2% (Tabela 3), sendo os rendimentos das extrações aquosas e

alcalinas (2% e 10%) de 4,0%, 26,0% e 4,0% para H. obscurata e 12,1%, 24,2% e

3,6% para P. constantimontium, respectivamente.

4.3 FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS

Os extratos obtidos, de ambos os fungos liquenizados, a partir das extrações

aquosas (W-HO e W-PC) e alcalinas a 2% (K2-HO, K2-PC) e 10% (K10-HO e K10-

PC) foram, separadamente, ressuspendidos em água, congelados e então

descongelados a temperatura ambiente (purificação por congelamento e degelo),

resultando em frações insolúveis (PW-HO, PW-PC, PK2-HO, PK2-PC, PK10-HO e

PK10PC) e solúveis em água fria (SW-HO, SW-PC, SK2-HO, SK2-PC, SK10-HO e

SK10PC) (Figura 5).

As frações sobrenadantes do processo de gelo/degelo foram submetidas ao

processo de purificação por precipitação com solução de Fehling (2 x), resultando na

formação de precipitados (PFW-HO, PFW-PC, PFK2-HO, PFK2-PC, PFK10-HO e

PFK10-PC) e sobrenadantes de Fehling (SFW-HO, SFW-PC, SFK2-HO, SFK2-PC,

SFK10-HO e SFK10PC) (Figura 5).

4.4 POLISSACARÍDEOS DA FRAÇÃO PRECIPITADO CONGELAMENTO/

DEGELO

As frações insolúveis em água fria, obtidas do processo de congelamento-

degelo (PW-HO, PW-PC, PK2-HO, PK2-PC, PK10-HO e PK10-PC) de ambos os

fungos liquenizados foram avaliadas quanto aos seus respectivos rendimentos e as suas

composições monossacarídicas. Estas apresentaram glucose como principal

componente monossacarídico (Tabelas 4 e 5), indicando a presença de glucanas

insolúveis em água fria nestas frações, porém provavelmente contaminadas com

polissacarídeos da fração solúvel em água fria.

TABELA 4 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado gelo/degelo obtidos

a partir de extrações aquosas, alcalinas a 2% e 10% do fungo liquenizado H. obscurata.

Monossacarídeos (mol%)

(2)

FRAÇÕES (g%)

(1)

Man Gal Glc

PW-HO 0,7 12,3 5,3 82,4

PK2-HO 5,3 15,3 8,4 76,3

PK10-HO 0,9 14,5 8,1 77,4

PPG/D-HO 0,6 1,4 1,2 97,4

(1) Rendimento em relação ao peso seco do fungo liquenizado (30,3g).

(2) Analisado em GC-MS após hidrólise ácida total, redução (NaBH

) e acetilação.

TABELA 5 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado gelo/degelo obtidos

a partir de extrações aquosas, alcalinas a 2% e 10% do fungo liquenizado P.

constantimontium.

Monossacarídeos (mol%)

(2)

FRAÇÕES

(g%)

(1)

Man Gal Glc

PW-PC 2,4 5,9 5,6 88,3

PK2-PC 3,5 17,6 14,5 67,8

PK10-PC 1,5 15,5 12,4 72,1

PPG/D-PC 1,9 1,6 1,3 97,1

(1) Rendimento em relação ao peso seco do fungo liquenizado (53,0 g).

(2) Analisado em GC-MS após hidrólise ácida total, redução (NaBH

) e acetilação.

Os espectros de RMN-

C das frações PW obtidas para ambos os fungos

liquenizados, H. obscurata e P. constantimontium (Figura 6 A e B, respectivamente),

foram similares e apresentaram 11 sinais caracteristícos de uma α-glucana, alternada,

com ligações (1→3) e (1→4). Esta similaridade também pode ser observada para as

frações precipitados de gelo/degelo obtidas a partir de extrações alcalinas (PK2 e

PK10), desta maneira estas frações foram reunidas, resultando nas frações PG/D-HO e

PG/D-PC, para H. obscurata e P. constantimontium, respectivamente.

FIGURA 6 – Espectros de RMN-

C das frações precipitado de congelamento e degelo (PW) obtidas

de Punctelia constantimontium (A) e Heterodermia obscurata (B).

Com a finalidade de eliminar possíveis contaminantes, as frações PG/D-HO e

PG/D-PC foram submetidas a mais um processo de purificação, que consistiu,

primeiramente, na solubilização das frações em KOH 2%, sob refluxo em banho com

água fervente por 2 horas, sendo estas neutralizadas e então tratadas com ácido acético

(HOAc) a 4%, sob refluxo a 80ºC por 30 minutos. Este processo resultou na formação

de frações insolúveis e solúveis em ácido acético, as quais foram neutralizadas e

dialisadas contra água corrente (~ 48 h). Após diálise, as frações solúveis em ácido

acético foram submetidas a um novo processo de congelamento e degelo, originando

frações solúveis (SPG/D-HO e SPG/D-PC) e insolúveis em água fria (PPG/D-HO e

PPG/D-PC) (Figura 5).

Como pode ser observado (Tabelas 4 e 5), este procedimento foi eficiente para a

obtenção de glucanas purificadas (PPG/D-HO e PPG/D-PC), pois o conteúdo de

glucose, após o tratamento, aumentou para ~ 97% para ambas frações, além de melhor

definição nos sinais observados no espectro de RMN-

C (Figura 7 A e B,

respectivamente ).

FIGURA 7 – Espectro de RMN-

C da fração PPG/D obtida de Heterodermia obscurata (A) e

Punctelia constantimontium (B).

Os espectros de RMN-

C foram comparados com os dados da literatura

(YOKOTA et al., 1979; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a; CARBONERO et

al., 2005c) e foi possível assinalar todos os carbonos (Tabela 6). O sinal na região de

carbono anomérico em δ 100,8 foi atribuído ao C-1 das unidades de α-Glcp 4-O-

substituídas enquanto que o sinal δ 99,8 corresponde ao C-1 das unidades de α-Glcp

3-O-substituídas, sendo confirmado pelos sinais em δ 79,5 e 82,8 referente ao C-4 e

C-3 das unidades de Glcp 4-O- e 3-O-substituídas, respectivamente. Os sinais em δ

72,4, 69,9 e 71,0 correspondem ao C-2, C-4 e C-5 das unidades 3-O-substituídas, e

com relação as unidades 4-O-substituídas, os sinais δ 71,1, 73,2 e 73,6 correspondem

ao C-2, C-3 e C-5, respectivamente. O sinal δ 60,9 refere-se ao C-6 não substituído das

unidades de Glcp 4-O-substituídas, e em δ 60,5 ao C-6 não substituído das unidades 3-

O-substituídas. A configuração α, bem como os sinais referentes às substituições em

O-3 e O-4 sugerem a presença de glucanas com ligações (1→3) e (1→4) nas frações

insolúveis em água fria obtidas a partir dos liquens estudados.

TABELA 6 – Deslocamentos químicos de

C obtidos da α-D-glucana isolada de H. obscurata e P.

constantimontium.

α-D-Glcp

3-O-substituído 4-O-substituído

C-1 99,8 100,8

C-2 72,4 71,1

C-3 82,8 73,2

C-4 69,9 79,5

C-5 71,0 73,6

C-6 60,5 60,9

Os resultados de metilação (PPG/D-HO e PPG/D-PC) obtidos concordaram

com as análises espectroscópicas, sendo possível observar a presença de unidades de

glucose 3-O- (2,4,6-Me

Glc) e 4-O- substituídas (2,3,6-Me

Glc) (Tabela 7). Embora

os espectros de RMN-

C destas frações sejam similares, através dos dados de

metilação pode ser observado que a relação molar entre as ligações do tipo (1→3) e

(1→4) foi diferente entre os liquens estudados, sendo de 1,3:1 para P.

constantimontium e de 1,07:1 para H. obscurata.

TABELA 7 - Análise por metilação da glucana isolada na fração precipitado gelo/degelo PPG/D-HO e

PPG/D-PC

Proporção relativa (%)

Acetatos de alditóis

parcialmente

O-metilados

(1)

PPG/D-HO

H. obscurata

PPG/D-PC

P.constantimontium

Tipo de Ligação

(2)

2,3,4,6-Me

Glc

0,9

1,6

Glcp-(1→

2,4,6-Me

Glc

51,4 56,5

→3)-Glcp-(1→

2,3,6-Me

Glc 47,7 41,9

→4)-Glcp-(1→

(1) Analisado em GC-MS após metilação, hidrólise ácida total, redução (NaB

) e acetilação.

(2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados.

De acordo com os dados obtidos, a fração insolúvel em água fria obtida a partir

dos liquens estudados, H. obscurata e P. constantimontium, consiste em uma α-D-

glucana contendo, alternadamente, ligações do tipo (1→3) e (1→4), numa relação

molar de 1,07:1 e 1,3:1, respectivamente, sendo denominadas de nigeranas (Figura 8).

FIGURA 8 – Estrutura proposta para nigerana obtida por precipitado gelo/degelo H. obscurata e P.

constantimontium

As nigeranas com relação molar de 1:1 são polissacarídeos amplamente

conhecidos em fungos liquenizados, como na Família Cladoniaceae (WORANOVICZ-

BARREIRA et al., 1999a; CARBONERO et al., 2002b) e Ramalinaceae (STUELP et

al., 1999; CORDEIRO et al., 2003). Na família Parmeliaceae, a maioria das nigeranas

descritas também apresentam relação molar de 1:1, como àquelas dos gêneros

Parmotrema e Rimelia (CARBONERO et al., 2005c) e em algumas espécies de

[→

→→

→3)-α

αα

α-D-Glcp-(1→

→→

→4)-α

αα

α-D-Glcp-(1→

→→

→3)-α

αα

α-D-Glcp-(1→

→→

→4)-α

αα

α-D-Glcp-(1→

→→

→]

Parmelia (OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001). Por outro lado, há exceções,

como no líquen Letharia vulpina (família Parmeliaceae), onde a relação molar

encontrada foi de 1,2:1

(IACOMINI et al., 1988).

Com relação à nigerana com relação molar de 1,3:1 encontrada em P.

constantimontium, estrutura similar foi encontrada apenas para o líquen da família

Parmeliaceae, Parmelia saxatilis (OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001).

4.5 POLISSACARÍDEOS DA FRAÇÃO PRECIPITADO DE FEHLING (PF)

4.5.1 Polissacarídeo do Fungo Liquenizado Heterodermia obscurata

Os precipitados de Fehling (PFW-HO, PFK2-HO e PFK10-HO) obtidos a partir

das extrações aquosas e alcalinas (KOH a 2% e 10%) de Heterodermia obscurata

mostraram-se similares, contendo manose e glucose como principais componentes

monossacarídicos (Tabela 8). Os espectros de RMN-

C dessas frações (PFK2-HO,

PFK10-HO e PFW-HO) também apresentaram-se similares (Figura 9 A, B e C,

respectivamente), indicando possuírem o mesmo heteropolissacarídeo. Devido ao

maior rendimento da fração PFK2-HO, as análises complementares foram realizadas

com esta fração, a qual apresentou perfil de eluição homogêneo quando analisada por

HPSEC-MALLS (Dado não mostrado).

TABELA 8 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado de Fehling do fungo

liquenizado H. obscurata.

Monossacarídeos (mol%)

(2)

Frações

Rendimento

(g%)

(1)

Man Gal Glc

PFW-HO

0,6 77,5 6,0 16,5

PFK2-HO

8,2 81,7

18,3

PFK10-HO

0,2 76,2 5,8 18,0

(1) Rendimento em relação ao peso seco do líquen (30,3g).

(2) Analisado em GC-MS após hidrólise ácida total, redução e acetilação.

Os espectros de RMN-

C (Figura 9) e HMQC (Figura 10) desta fração

apresentaram sinais na região anomérica que correspondem aos C-1/H-1 das unidades

de α-D-Manp ligadas-(1→4) e terminais não redutores de α-D-Manp (δ 102,0/5,09),

terminal não redutor de α-D-Glcp (δ 100,1/5,32) e de unidades de α-D-Manp da cadeia

principal 2,6-di-O-substituída (δ98,7;98,5;98,4/5,12) (TEIXEIRA; IACOMINI;

GORIN, 1992). Observa-se, na análise de HMQC (Figura 10), que os valores de H-1

das unidades de manose e glucose possuem sinais anoméricos em campo baixo,

caracterizando ligações do tipo α.

As configurações glicosídicas foram confirmadas pelos valores de constante de

acoplamento J

C-1,H-1

observadas no espectro de HMQC acoplado (Figura 11). As

unidades de Manp ligadas-(1→4) e terminais não redutores de D-Manp (δ 102,0), as

unidades terminais não redutoras de Glcp (δ 100,1), além das unidades de manose da

cadeia principal 2,6-di-O-substituídas (δ 98,7;98,5;98,4) apresentam configuração do

tipo α em virtude do valor J

C-1,H-1

= 174,3 Hz para o primeiro sinal e 173,8 Hz para os

demais sinais observados (PERLIN; CASU, 1969).

Outros sinais também puderam ser atribuídos e assinalados de acordo com

alguns já descritos e caracterizados por outros autores (TEIXEIRA; IACOMINI;

GORIN, 1992), como àqueles em δ 78,7, 78,5, 78,3 e 78,1 correspondentes ao C-2 das

unidades de α-Manp 2,6-di-O-substituídas, bem como o correspondente ao C-4 das

unidades de α-Manp 4-O-substituídas (δ 75,7) (Figura 9).

FIGURA 9 – Espectro de RMN-

C das frações do precipitado de Fehling, PFK2 (A) PFK10 (B) PFW

(C), obtidas de Heterodermia obscurata, em D

O a 70ºC.

FIGURA 10 – Espectro 2D

C HMQC da fração precipitado de Fehling (PFK2; glucomanana)

obtida de Heterodermia obscurata (D

O, 70ºC).

FIGURA 11 – Região anomérica do espectro de HMQC acoplado da fração precipitado Fehling

(PFK2; glucomanana) obtida da Heterodermia obscurata (em D

O, 70ºC).

O sinal de

C em δ 66,0 refere-se ao C-6 substituído das unidades de Manp

2,6-O-substituídas e os sinais δ 61,2 e 60,8 ao C-6 não substituído dos terminais não

redutores de Manp, Glcp e unidades de manose 4-O-substituídas. Esses resultados

foram confirmados por DEPT (Figura 12) através da inversão dos respectivos sinais.

FIGURA 12 – Espectro de DEPT da fração precipitado de Fehling (PFK2; glucomanana) obtida de

Heterodermia obscurata, em D

O a 70ºC.

A análise de metilação confirmou os resultados apresentados pelos espectros de

RMN, a qual, baseada nos acetatos de alditóis parcialmente O-metilados (Tabela 9),

indicou uma estrutura polissacarídica bastante ramificada, contendo unidades de Manp

(18,2%) e Glcp (19,8%) como terminais não redutores. Além disso, também foram

observados os derivados 3,4-Me

Man (42,4%) e 2,3,4-Me

Man (3,8%)

correspondentes as unidades da cadeia principal, a qual é constituída por unidades de

α-Manp (1→6) ligadas, sendo a maioria substituídas em O-2. Unidades de α-Manp-

(1→4) também foram observadas, devido à presença do derivado 2,3,6-Me

Man

(12,7%), possivelmente fazendo parte da cadeia lateral.

TABELA 9 - Análise por metilação da fração precipitado de Fehling (PFK2; glucomanana) obtida de

Heterodermia obscurata e de suas subfrações obtidas por hidrólise parcial.

(1) Analisado em GC-MS após metilação, hidrólise ácida total, redução (NaB

) e acetilação.

(2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados.

Com a finalidade de verificar a cadeia principal deste polissacarídeo, o mesmo

foi submetido à hidrólise ácida parcial, de acordo com a metodologia descrita na seção

Material e Métodos, item 3.4.5. Os materiais resistentes às hidrólises ácidas parciais,

após diálises em membrana com limite de exclusão de 2 kDa, foram denominadas

PFK2-HP4, PFK2-HP6 e PFK2-HP10 referentes aos tempos de hidrólise de 4, 6 e 10

horas, respectivamente. Estas frações foram analisadas quanto à sua composição

monossacarídica (Tabela 10), e pode ser observado um aumento significativo da

quantidade de manose, bem como redução no percentual de glucose.

TABELA 10 – Composição Monossacarídica da Fração PFK2-HO e suas subfrações após hidrólises

ácidas parciais do fungo liquenizado Heterodermia obscurata.

Monossacarídeos (mol%)

(1)

FRAÇÕES

Man Glc

PFK2-HO

81,7 18,3

PFK2-HP4

94,7 5,3

PFK2-HP6

95,2 4,8

PFK2-HP10

95,7 4,3

(1) Analisado em GC-MS após hidrólise ácida total, redução e acetilação.

Fração (mol %)

Acetatos de alditóis

parcialmente O-

metilados

(1)

PFK2 PFK2-HP4 PFK2-HP6

PFK2-

HP10

Tipo de ligação

(2)

2,3,4,6-Me

Man 18,2 21,0 24,2

26,7

Manp-(1→

2,3,4,6-Me

Glc 19,8 4,8 2,9

1,9

Glcp-(1→

3,4,6-Me

Man 1,9 2,3 2,2

2,7

→2)-Manp-(1→

2,3,6-Me

Man 12,7 2,6 2,1

1,2

→4)-Manp-(1→

2,3,4-Me

Man 3,8 28,6 29,3

43,5

→6)-Manp-(1→

2,3-Me

Man 1,2 0,9 1,3

1,0

→4,6)-Manp-(1→

3,4-Me

Man 42,4 39,8 37,8

22,9

→2,6)-Manp-(1→

Análises de metilação das frações PFK2-HP4, PFK2-HP6 e PFK2-HP10

(Tabela 9), mostraram um aumento do derivado 2,3,4-Me

Man, sugerindo uma cadeia

principal constituída de unidades de manose (1→6)- ligadas. Além disso, também foi

observado um decréscimo dos derivados 3,4-Me

Manp (o qual tornou-se o derivado

2,3,4-Me

Man da cadeia principal) e 2,3,4,6-Me

Glcp, indicando a remoção das

unidades terminais não redutoras de glucose, as quais possivelmente possam estar

substituindo as unidades de manose da cadeia principal em O-2.

Os espectros de RMN-

C destas frações, PFK2-HP4 e PFK2-HP10 (Figura 13

B e C, respectivamente), apresentaram sinais de C-1 correspondentes aos terminais

não redutores de α-D-Manp (δ 102,0), unidades de α-D-Manp da cadeia principal 6-O

(δ 99,7) e 2,6-di-O-substituída (δ 98,5) (TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992).

Também pode ser observado nestes espectros, a ausência dos sinais em δ 100,1

e 75,7 atribuído ao C-1 dos terminais não redutores de α-D-Glcp e ao C-4 das unidades

de Manp 4-O-substituídas, respectivamente, bem como a presença do sinal de C-1 (δ

99,7) das unidades de Manp (1→6) ligadas, referentes a cadeia principal, e a redução

da intensidade dos sinais de C-2 substituídos (δ 78,6 e 78,4) das unidades de α-D-

Manp a medida que aumenta o tempo de hidrólise. O sinal δ 94,2 corresponde aos

terminais redutores de manose.

Estes dados estão de acordo com aqueles obtidos por análises de metilação

(Tabela 9), onde foi possível observar a remoção das unidades de glucose e das

unidades de manose 4-O-substituídas, além do aumento do percentual do derivado

correspondente as unidades da cadeia principal (2,3,4-Me3Man).

FIGURA 13 – Espectros de RMN-

C das frações PFK2-HO (nativa) (A), PFK2-HP4 (B) e PFK2-

HP10 (C), em Me

SO-d

a 70ºC.

Os sinais de

C em δ 66,3, 66,0 e 65,6 referem-se ao C-6 substituído de α-D-

Manp da cadeia principal e o sinal δ 61,2 ao C-6 não substituído dos terminais não

redutores de Manp, Glcp e unidades de manose 4-O-substituídas. Esses dados foram

confirmados através da inversão dos respectivos sinais no experimento DEPT (Figura

14).

FIGURA 14– Espectro de RMN-

C-DEPT para HP10-HO, em Me

SO-d

a 70ºC.

A partir dos dados obtidos, as frações precipitados de Fehling (PFW-HO,

PFK2-HO e PFK10-HO) mostram resultados consistentes que sugerem uma

glucomanana altamente ramificada, com uma cadeia principal composta por unidades

de α-D-Manp ligadas-(1→6), sendo a maioria substituídas em O-2, principalmente,

por unidades terminais não redutoras de α-D-Glcp, α-D-Manp e, possivelmente, por

cadeias laterais constituídas por unidades de α-D-Manp 4-O-substituídas (Figura 15).

FIGURA 15 – Estrutura proposta para glucomanana obtida do líquen H. obscurata.

A B

α-D-Manp

↓

-α-D-Manp-(1→6)- α-D-Manp-(1→6)-

C α-D-Glcp

↓

-α-D-Manp-(1→6)-

Com relação aos heteropolissacarídeos presentes em fungos liquenizados, a

maioria destes consistem em galactomananas, galactoglucomananas e/ou

galactomanoglucanas, sendo estas compostas por significantes percentuais de

galactose, além de manose e glucose.

Relatos anteriores de estrutura similar (glucomanana) à encontrada no presente

estudo foi descrita apenas para o fungo liquenizado Tornabenia intricata (TEIXEIRA;

IACOMINI; GORIN, 1992) a qual pertence à mesma família (Physciaceae), porém

esta apresenta diferenças na sua estrutura. A glucomanana de T. intricata possui menor

percentual de glucose (T. intricata: 7% e H. obscurata: 18,3%), além de unidades de

Manp 2,4-di-O-substituídas (14%), as quais não foram observadas em H. obscurata.

Avaliando os resultados obtidos, observou-se que a glucomanana é um

polissacarídeo típico da família Physciaceae, desta forma, os dados obtidos reforçam a

utilização de polissacarídeos como uma ferramenta adicional para a quimiotaxônomia,

porém, estudos adicionais com fungos liquenizados desta mesma família deverão ser

realizados.

4.5.2 Polissacarídeo do Fungo Liquenizado Punctelia constantimontium

Os sobrenadantes de gelo/degelo obtidos a partir das extrações aquosas e

alcalinas (KOH a 2% e 10%) foram submetidos ao processo de purificação por

precipitação com solução de Fehling (Figura 5), originando as frações precipitados

(PFW-PC, PFK2-PC e PFK10-PC) e sobrenadantes de Fehling (SFW-PC, SFK2-PC e

SFK10-PC). Como podemos observar na Tabela 11, os precipitados de Fehling (PFW-

PC, PFK2-PC e PFK10-PC) mostraram-se similares, apresentando manose, galactose e

glucose como componentes monossacarídicos. A fração PFK2-PC apresentou além

dos monossacarídeos neutros, 6% ácidos urônicos, determinadas por método

colorimétrico (FILISETTI-COZZI; CARPITA, 1991).

Devido à presença desses grupamentos ácidos, a fração PFK2-PC foi submetida

ao processo de carboxi-redução pelo método de TAYLOR e CONRAD (1972),

resultando na fração CRPFK2-PC. Esta foi analisada em GC-MS (Tabela 11), e

conclui-se que o ácido urônico é o glucurônico, pois na fração PFK2-PC obteve-se

4,4% de glucose, e após este sofrer carboxirredução (CRPFK2-PC), a porcentagem de

glucose aumentou para 8,9%. Além dessa evidência no aumento nos teores de glucose,

foi observado os fragmentos com relação m/z 219 e 147 devido a presença de 2

núcleos de deutério em C-6, na fração que, após carboxiredução, foi reduzida com

NaB

Os espectros de RMN-

C da frações precipitados de Fehling das extrações

aquosas e alcalinas 2 e 10% (PFK2-PC, PFK10-PC e PFW-PC) mostraram-se

similares (Figura 16 A, B e C, respectivamente), indicando possuírem o mesmo

heteropolissacarídeo. Devido ao maior rendimento apresentado pela fração PFK2-PC

(Tabela 11), a qual apresentou-se homogênea quando analisada por HPSEC-MALLS

(dado não mostrado), esta foi submetida aos demais processos de caracterização

estrutural.

TABELA 11 – Composição monossacarídica e rendimento das frações precipitado de Fehling do

fungo liquenizado Punctelia constantimontium.

Monossacarídeos (mol%)

(2)

FRAÇÕES

Rendimento

(g%)

(1)

Man Gal Glc

Ácido urônico

(3)

( % )

PFW-PC 2,7 58,5 35,6 5,9 nd

PFK2-PC 8,7 48,5 47,1 4,4 6

CRPFK2-PC - 47,6 43,5 8,9 -

PFK10-PC 0,5 55,6 37,0 7,4 nd

(1) Rendimento em relação ao peso seco do líquen (53,0 g).

(2) Analisado em GC-MS após hidrólise ácida total, redução e acetilação.

(3) Determinado pelo método colorimétrico FILIZETTI-COZZI e CARPITA (1991)

(nd) não determinado

Os espectros de RMN-

C (Figura 16 A, B e C) e HMQC (Figura 17) da fração

PFK2 apresentou sinais na região anomérica que correspondem aos C-1/H-1 referentes

a terminais não redutores de β-D-Galp-(1→4)-α-D-Manp (δ 104,4/4,63), β-D-Galp-

(1→2)-α-D-Manp (δ 102,9/4,47), e de unidades de α-D-Manp da cadeia principal 6-O-

(δ 101,2/5,21), 2,6-di-O- (δ 100,3/5,00) e 2,4,6-tri-O-substituídas (δ 98,3/5,19)

(GORIN; IACOMINI, 1984, 1985; TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1995;

CARBONERO et al., 2005a) .

As configurações glicosídicas (α e β) foram determinadas pelos deslocamentos

H (HMQC: Figura 17) e constantes de acoplamento (J

C1,H1

) observadas no

espectro de HMQC acoplado (Figura 18). Os terminais não redutores de Galp

apresentam configuração do tipo β em virtude dos sinais de H-1 em campo alto em δ

4,63 (104,4) e δ 4,47 (102,9), os quais estão de acordo com os valores J

C-1,H-1

de 164,0

e 163,8 Hz, respectivamente. Os sinais de H-1 em campo baixo a δ 5,21 (101,2, J

C-1,H-1

= 173,3), 5,00 (100.3, J

C-1,H-1

= 172,0 Hz) e 5,19 (98,3;

C-1,H-1

= 174,5 Hz) indicam

que as unidades de Manp apresentam configuração glicosídica do tipo α, de acordo os

valores de J

C-1,H-1

obtidos (PERLIN; CASU, 1969).

FIGURA 16 – Espectro de RMN-

FIGURA 17 – Espectro 2D

C HMQC da fração precipitado de Fehling (PFK2;

galactoglucomanana) obtida de P. constantimontium (em D

O, 70ºC)

FIGURA 18 – Região anomérica do espectro de HMQC acoplado da fração precipitado Fehling

(PFK2; galactoglucomanana) obtida da P. constantimontium (em D

O, 80ºC).

Os sinais de

C em δ 66,2 e 65,8 correspondem ao C-6 substituídos das

unidades de α-Manp-(1→6) ligadas, enquanto que os sinais em δ 61,2 e 61,0 são

referentes, principalmente, aos grupos –CH

não substituídos das unidades terminais

não redutoras de Galp. Estes assinalamentos foram confirmados pela inversão dos

referidos sinais no experimento DEPT (Figura 19).

FIGURA 19 – Espectro de RMN-

C-DEPT da fração precipitado de Fehling (PFK2;

galactoglucomanana) obtida de Punctelia constantimontium em D

O a 70ºC.

A complexidade da estrutura, observada no espectro de RMN-

C (Figura 16)

foi confirmada pela análise de metilação, devido à presença de vários derivados

parcialmente O-metilados. Conforme pode ser observado (Tabela 12), esta fração

mostrou-se altamente ramificada, contendo consideráveis proporções de unidades

terminais não redutores de Galp, além de pequenas porcentagens de Manp e Glcp.

Também foram observados os derivados 2,3,4-Me

Man, 3,4-Me

Man e 3-MeMan,

correspondentes às unidades da cadeia principal a qual é constituída por unidades de α-

Manp-(1→6), substituídas em O-2 ou disubstituídas em O-2,4, além de unidades não

substituídas. Substituições em O-3, O-4 e O-6 foram observadas para as unidades de

Galp. As unidades de Glcp apresentaram-se como terminais não redutores e 3-O-

substituídas.

TABELA 12 - Análise por metilação da fração precipitado de Fehling (PFK2) obtida de Punctelia

constantimontium e de suas subfrações obtidas por hidrólise parcial.

Fração (mol %) Acetatos de alditóis

parcialmente O-

metilados

(1)

PFK2 PFK2-HP4 PFK2-HP6

PFK2-

HP10

Tipo de ligação

(2)

2,3,4,6-Me

Man 0,8 3,9 4,9 6,1

Manp-(1→

2,3,4,6-Me

Glc 0,8 0,8 0,8 0,3

Glcp-(1→

2,3,4,6-Me

Gal 28,9 16,4 10,4 4,1

Galp-(1→

2,4,6-Me

Glc 2,1 - - -

→3)-Glcp-(1→

2,4,6-Me

Gal 0,4 1,7 3,1 3,1

→3)-Galp-(1→

2,3,6-Me

Gal 4,2 1,1 1,4 3,4

→4)-Galp-(1→

2,3,4-Me

Man 26,1 52,6 56,7 65,5

→6)-Manp-(1→

2,3,4-Me

Gal 0,7 0,6 0,8 -

→6)-Galp-(1→

3,6-Me

Man 0,5 0,4 0,4 -

→2,4)-Manp-(1→

3,4-Me

Man 16,9 16,6 16,0 13,6

→2,6)-Manp-(1→

3-MeMan 18,5 5,9 5,5 3,9

→2,4,6)-Manp-(1→

(1) Analisado em GC-MS após metilação, hidrólise ácida total, redução (NaB

) e acetilação.

(2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados.

Com o objetivo de elucidar a estrutura deste polímero, esta fração foi submetida

a hidrólises ácidas parciais (H

0,16 M, 100ºC, por 4, 6 e 10 h), e após foram

dialisadas em membrana com limite de exclusão de 2 kDa, sendo denominadas PFK2-

HP4, PFK2-HP6 e PFK2-HP10, de acordo com o tempo de hidrólise de 4, 6 e 10

horas, respectivamente. Após hidrólise parcial, estas apresentaram, quando analisadas

por GC-MS, um aumento dos teores de manose e uma diminuição de galactose (Tabela

13).

TABELA 13 – Composição monossacarídica da fração precipitado Fehling (PFK2-PC;

galactoglucomanana) após hidrólises ácidas parciais do fungo liquenizado

Punctelia constantimontium.

Monossacarídeos (mol%)

(1)

FRAÇÕES

Man Gal Glc

PFK2-PC

48,5 47,1 4,4

PFK2-HP4

78,0 17,1 4,9

PFK2-HP6

80,7 15,3 4,0

PFK2-HP10

83,6 11,6 4,7

(1) Analisado em GC-MS após hidrólise ácida total, redução e acetilação.

Por meio das análises de metilação das frações PFK2-HP4, PFK2-HP6 e PFK2-

HP10 (Tabela 12) pode ser verificado que a hidrólise ácida parcial foi eficiente na

remoção das unidades de Galp devido à diminuição do derivado 2,3,4,6-Me

Galp.

Além disso, um aumento de 2,3,4-Me

Man juntamente com um decréscimo de 3-

MeMan reforça a idéia de que a cadeia principal seja constituída por unidades de α-D-

Man ligadas (1→6), podendo apresentar, principalmente, substituições em O-2 ou O-

2,4.

As análises espectroscópicas concordaram com os derivados parcialmente O-

metilados (Tabela 12). O espectro de RMN-

C das frações PFK2-HP4 e PFK2-HP6

(Figura 20 B e C, respectivamente) contém sinais na região anomérica correspondentes

aos C-1 dos terminais não redutores de β-D-Galp-(1→4)-α-D-Manp (δ 103,4) e β-D-

Galp-(1→2)-α-D-Manp (δ 101,2) e de unidades de α-D-Manp da cadeia principal 6-O-

(δ 99,5) e 2,6-di-O-substituída (δ 98,4). Além disso, apresenta sinais referente aos

terminais redutores de manose (δ 94,2 e 93,8).

FIGURA 20 – Espectro de RMN-

C das Frações PFK2-PC (nativa) (A) PFK2-HP4 (B) e PFK2-HP6

SO-d

a 70ºC.

Os sinais de

C em δ 66,0 referem-se ao C-6 substituído das unidades de

Manp-(1→6) ligadas, enquanto os sinais em δ 61,2 são atribuídos, principalmente, aos

grupos –CH

não substituídos das unidades terminais não redutoras de Galp. Estes

assinalamentos foram confirmados por DEPT (Figura 21) por meio da inversão dos

respectivos sinais no experimento.

FIGURA 21– Espectro de RMN-

C-DEPT para HP4-PC, em Me

SO-d

a 70ºC.

De acordo com os dados apresentados, a fração precipitado de Fehling (PFK2)

corresponde a uma galactoglucomanana, constituída por uma cadeia principal de

unidades de α-D-manopiranose ligadas (1→6), sendo parcialmente substituídas em O-

2, e/ou O-2,4 por unidades de β-Galp (Figura 22), sendo confirmadas pelos sinas em δ

104,4 e 102,9 e por suas constantes de acoplamento características de configuração do

tipo β, J

C-1,H-1

= 164,0 e 163,8 Hz, respectivamente.

FIGURA 22 – Estrutura proposta para galactoglucomanana obtida do líquen P. constantimontium

Comparando estes dados com àqueles obtidos de Rimelia spp. e Parmotrema

spp. (CARBONERO et al., 2005a), verificou-se que o heteropolissacarideo isolado

apresenta um maior grau de ramificação, possuindo maior teor de unidades de manose

2,6-di-O-substituídas. Além disso, em P. constantimontium foi observado que as

unidades de β-Galp encontram-se substituindo as unidades de α-Manp da cadeia

principal em O-4 e O-2, e não apenas em O-4, como geralmente observado. O mesmo

padrão de substituição foi descrito para o gênero Leptogium, com a diferença de que

neste líquen as unidades β-Galp substituem as unidades de α-Manp da cadeia principal

somente em O-2, e não em O-2 e O-2,4 como observado no líquen em estudo

(CARBONERO et al., 2003).

Este polissacarídeo também apresenta 6% de ácido glucurônico, concordando

com os dados obtidos por TEIXEIRA (1993), onde o autor relata que os liquens E.

prunastri, Parmotrema araucaria, Usnea meridionalis e Usnea sp., todos pertencentes

a mesma família do líquen P. constantimontium, Parmeliaceae, apresentavam uma

concentração de 8,4% de ácido glucurônico.

A B

β-D-Galp

↓

-α-D-Manp-(1→6)- α-D-Manp-(1→6)-

C β-D-Galp

↓

-α-D-Manp-(1→6)-

↑

β-D-Galp

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os resultados obtidos a partir das extrações aquosas e alcalinas a 2 e 10% dos

fungos liquenizados Heterodermia obscurata e Punctelia constantimontium sugerem

as seguintes estruturas:

a) Uma α-D-glucana contendo, alternadamente, ligações do tipo (1→3) e (1→4),

numa relação molar de 1,07:1 para H. obscurata e 1,3:1 para P.

constantimontium, sendo denominadas nigeranas.

b) Uma glucomanana altamente ramificada encontrada no líquen H. obscurata,

com cadeia principal composta por unidades de α-D-Manp ligadas-(1→6),

sendo a maioria substituída em O-2, por unidades terminais não redutoras de α-

D-Glcp, α-D-Manp e, possivelmente, por cadeias laterais constituídas por

unidades de α-D-Manp 4-O-substituídas. A maioria dos heteropolissacarídeos

presentes em fungos liquenizados consiste em galactomananas,

galactoglucomananas e/ou galactomanoglucanas, sendo que estrutura similar à

encontrada no presente estudo foi descrita apenas para o fungo liquenizado

Tornabenia intricata (TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992), a qual pertence

à mesma família (Physciaceae).

c) Uma galactoglucomanana (P. constantimontium), apresentando uma cadeia

principal de unidades de α-D-manopiranose ligadas (1→6), sendo parcialmente

substituídas em O-2, e/ou O-2,4 por unidades de β-Galp. Foi observado que as

unidades de β-Galp encontram-se substituindo as unidades de α-Manp da cadeia

principal em O-4 e O-2, e não apenas em O-4, como geralmente observado.

Este polissacarídeo apresenta ainda 6% de GlcAp, da mesma maneira que os

liquens E. prunastri, Parmotrema araucaria, Usnea meridionalis e Usnea sp.,

todos pertencentes a mesma família (Parmeliaceae), apresentam uma

concentração de 8,4% de ácido glucurônico.

De acordo com os dados obtidos, observa-se que as nigeranas aparentemente

representam uma estrutura comum nos gêneros Punctelia e Heterodermia (com

diferença nas suas relações molares). Com relação aos polissacarídeos isolados da

Fração Precipitado de Fehling dos dois liquens estudados, glucomanana e

galactoglucomanana, estes podem auxiliar a caracterizar os membros desses gêneros.

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