( PDF ) Estudos genéticos sobre a virulência de Escherichia coli enteroagregativa atípica

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ANDRESA ZAMBONI

ESTUDOS GENÉTICOS SOBRE A VIRULÊNCIA DE

Escherichia coli ENTEROAGREGATIVA ATÍPICA

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina para obtenção do Título de

Doutor em Ciências

São Paulo

2006

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ANDRESA ZAMBONI

ESTUDOS GENÉTICOS SOBRE A VIRULÊNCIA DE

Escherichia coli ENTEROAGREGATIVA ATÍPICA

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina para obtenção do Título de

Doutor em Ciências pelo Programa de

Pós-Graduação em Microbiologia e

Imunologia.

Orientadora:

Profª Dra. Isabel Cristina Affonso Scaletsky

São Paulo

2006

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Zamboni, Andresa

Estudos genéticos sobre a virulência de Escherichia coli

enteroagregativa atípica. / Andresa Zamboni. -- São Paulo, 2006.

22, 118f.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e

Imunologia.

Título em Inglês: Genetic studies on the virulence of atypical

enteroaggregative Escherichia coli.

1. Escherichia coli enteroagregativa. 2. Fatores de virulência.

3. Diarréia.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E

PARASITOLOGIA

Chefe do Departamento: Prof. Dr. Sérgio Schenkmam

Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. José Daniel Lopes

ANDRESA ZAMBONI

ESTUDOS GENÉTICOS SOBRE A VIRULÊNCIA DE Escherichia coli

ENTEROAGREGATIVA ATÍPICA

Presidente da Banca:

Prof. Dr. ______________________________________________________________

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr.

_____________________________________________________________________

Prof. Dr.

_____________________________________________________________________

Prof. Dr.

_____________________________________________________________________

Prof. Dr.

_____________________________________________________________________

Prof. Dr.

_____________________________________________________________________

Aos meus pais Higino e Rosana, que me ensinaram a viver com dignidade, respeito e valorizar

meus ideais. Por me ensinarem a enfrentar as dificuldades e superar os desafios. Por todo

carinho, apoio e crença em meus sonhos. Por inúmeras vezes, abdicarem de seus sonhos, para que

eu pudesse realizar os meus,.....

Dedico

Ao meu irmão Alexandre, por todo apoio, amor, e confiança. Por todos os momentos em que

juntos, compartilhamos nossos medos, angústias e muitas alegrias. Por você estar sempre ao meu

lado, por ser um grande amigo e por ter a certeza que estaremos sempre juntos........

Dedico

Aos meus queridos avós Natalino e Maria Eda (in memoriam), pelo exemplo de força,

honestidade, perseverança, determinação. Muito obrigada por terem compartilhado comigo os

anos mais importantes de minha vida.....não há um único dia em que eu não pense em vocês.

Saudades......

Ao meu grande e eterno amor Ricardo Corrêa Marcondes, por todo apoio, paciência, constante

dedicação e incentivo. Pelo enorme carinho e amor desprendidos a mim. Pelo papel fundamental

em que exerceu durante a conclusão deste trabalho, por acreditar em meus sonhos,

por estar ao

meu lado em todos os momentos......

Dedico com muito amor esta tese

A Profa. Dra. Isabel Cristina Affonso Scaletsky, excelente pesquisadora e orientadora.

Por ter me recebido em seu laboratório, pelos conhecimentos científicos transmitidos e

por todas as oportunidades ao longo destes anos. Pela paciência, por ter acreditado em

minha capacidade e sempre exigir o melhor e que desta forma contribuiu para o meu

crescimento profissional e pessoal.

Muito obrigada

À Fundação de Amparo à Pesquisa

do Estado de São Paulo (FAPESP)

pelo apoio financeiro para

realização deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

À Sandra Hilde Fabbricotti, pela amizade, alegria, grande incentivo e por todo apoio

científico e pessoal, durante os anos da realização deste trabalho.

À grande amiga Katia Regina Aranda, por sua amizade, companheirismo, confiança e

grande apoio em todos os momentos, durante esses muitos anos de convivência. Por ter

vivenciado comigo momentos tão importantes de minha vida.

À Profa. Dra. Marilis do Valle Marques, pelo importante auxílio, conhecimentos

transmitidos, por seu apoio e paciência.

À Profa. Maria Cecília Campos, por ter acreditado em mim e ser a grande responsável

pelo ínicio de minha vida científica.

À Profa. Maria Juditte Bittencourt Fernandes, minha “mestra”, por ter me incentivado e

conduzido pelo caminho da ciência, foi por seus ensinamentos e amor à pesquisa, que

segui por este caminho.

À Profa. Dra. Márcia Regina Machado dos Santos, pelo auxílio no sequenciamento.

À grande amiga Michelle V. Dulguer , pela valiosa amizade, compreensão, constante

apoio científico e pessoal, e por todos os momentos que compartilhamos juntas durante

esse caminho.

À amiga Bianca Bragato, pelo constante apoio, incentivo e alegria contagiante, por ter

transformado nosso local de trabalho em um ambiente de amizade e companheirismo.

Aos amigos André L. Bachi e Rodrigo Hernandes, por todo apoio científico e pessoal, e

pela grande amizade.

Aos amigos, Suzely C. Montanino, Elaine C. Delpra, Beatriz C. Manoel, Lúcia M. Lopes, Joel

Mendes, Sérgio Suzart, por todo apoio e por terem compartilhado comigo várias

emoções, durante a realização deste trabalho e pela valiosa amizade.

A Magda e Paola, pela amizade, sugestões e grande eficiência na secretaria da Disciplina

de Microbiologia.

A Sueli, Edvan e Flávio, pela convivência, dedicação e colaboração constante durante

todos esses anos.

A Beatriz Schnabel, Ana Carolina Padovan e Aparecido, por terem colaborado por várias

vezes na realização de experimentos.

Aos professores e funcionários da Disciplina de Microbiologia da Universidade Federal de

São Paulo.

Ao meu tio Sidney Ferrari e a toda minha amada família, por terem compartilhado com

paciência e otimismo todos os momentos importantes, durante a realização deste

trabalho.

A todas as pessoas que de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.

Muito Obrigada

Assim eu vejo a vida

(Cora Coralina)

”

A vida tem duas faces:

Positiva e negativa

O passado foi duro

mas deixou o seu legado

Saber viver é a grande

sabedoria

Que eu possa dignificar

Minha condição de mulher,

Aceitar suas limitações

E me fazer pedra de segurança

dos valores que vão

desmoronando.

Nasci em tempos rudes

Aceitei contradições

lutas e pedras

como lições de vida

e delas me sirvo

Aprendi a viver.”

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO

1.1. Histopatologia de EAEC 4

1.2. Fatores de virulência envolvidos na patogênese de EAEC 5

1.2.1. Adesinas e outros fatores de virulência codificados por genes plasmidiais

1.2.2. Toxinas 8

1.2.3. Fatores de virulência codificados por genes cromossômicos 10

1. 3. Potencial papel pró-inflamatório dos fatores de virulência de EAEC 12

1.4. Regulação gênica em EAEC 13

1.5. EAEC atípica 13

2. OBJETIVO

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Amostras bacterianas 17

3.2. Condições de cultivo das amostras bacterianas 18

3.3. Determinação do sorogrupo das amostras bacterianas 18

3.4. Reação da polimerazação em cadeia (PCR) 19

3.5. Extração de DNA plasmidial 20

3.5.1. Extração em pequena escala (“mini-prep”) 20

3.5.2. Extração em larga escala (“maxi-prep”) 20

3.6. Extração de DNA genômico 21

3.7. Determinação da concentração de DNA 21

3.8. Eletroforese de DNA em gel de agarose 22

3.9. Eluição dos fragmentos de DNA de gel de agarose 22

3.10. Reações de digestão de DNA 22

3.11. Reações de ligação de DNA 22

3.12. Transformação bacteriana 23

3.12.1.Transformação através de eletroporação 23

3.12.2. Transformação através de choque térmico 24

3.13. Conjugação bacteriana 24

3.14. Cura plasmidial 25

3.14.1. Cura plasmidial com alaranjado de acridina 25

3.14.2. Cura plasmidial com novobiocina 25

3.15. Transferência de DNA de células bacterianas para filtros de papel

Whatman-“Colony-blotting”

3.16. Transferência de DNA de gel de agarose para membrana de nylon –

“Southern- blotting”

3.17. Marcação radioativa do fragmento sonda 27

3.18. Hibridização de DNA com sondas radioativas 27

3.18.1. Hibridização dos filtros de papel Whatman 27

3.18.2. Hibridização das membranas 28

3.19. Seqüenciamento e análise das seqüências de DNA 28

3.20. Determinação da resistência a drogas antimicrobianas 29

3.21. Testes de hemaglutinação 29

3.22. Teste de adesão a células HEp-2 30

3.22.1. Cultivo das células HEp-2 30

3.22.2. Realização do teste de adesão 31

3.23. Curva de crescimento 31

3.24. Microscopia eletrônica de transmissão 31

3.25. Eletroforese de proteínas em SDS-PAGE 32

3.25.1. Extração de proteínas por lise 32

3.25.2. Extração de proteínas por aquecimento 32

3.25.3. Extração de proteínas de membrana externa 33

3.25.4. Eletroforese em SDS-PAGE 33

3.25.5. Seqüenciamento da região N-terminal 34

3.26. Métodos estatísticos 34

4. RESULTADOS

4.1. Características das amostras de EAEC atípicas 38

4.2. Análise do perfil plasmidial das amostras de EAEC atípicas 38

4.3. Estudos realizados com as amostras MA691-2 e RN153-1 39

4.3.1. Padrão de resistência a drogas antimicrobianas 39

4.3.2. Pesquisa de hemaglutininas 39

4.4. Identificação dos genes envolvidos no padrão AA da amostra MA691-2 39

4.5. Identificação dos genes envolvidos no padrão AA da amostra RN153-1 40

4.5.1. Construção de biblioteca genômica em vetor cosmídeo 40

4.5.2. Análise dos clones cosmídeos quanto a adesão a células HEp-2 41

4.6. Análise do clone cosmídeo pVIII-F-1 41

4.7. Mutagênese do clone pVIII-F-1 com o transposon mini-Tn10 42

4.8. Análise dos mutantes obtidos através da mutagênese com o mini-Tn10 42

4.9. Seleção do fragmento BamHI de 3 Kb contendo o mini-Tn10 44

4.10. Seqüenciamento do clone pAZ2 44

4.11. Análise da seqüência de 1.244 pb e da proteína deduzida 45

4.12. Análise da seqüência de 899 pb e da proteína deduzida 46

4.13. Prevalência da seqüência genética homóloga a proteína ygjV nas

amostras de EAEC atípicas

4.14. Ensaios preliminares para caracterização fenotípica da adesina AA da

amostra RN153-1

5. DISCUSSÃO

6. CONCLUSÃO

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8. ANEXOS

103

ARTIGO ORIGINADO A PARTIR DESTE TRABALHO

RESUMO

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente, associado à

doença diarréica, que apresenta como característica o padrão de adesão agregativo

(AA) a superfície de células HEp-2. O fenótipo AA está associado à presença de um

plasmídeo de 65 MDa, conhecido como plasmídeo pAA, detectado através de uma

sonda genética denominada de CVD432 ou simplesmente AA. Algumas amostras de

EAEC, entretanto, apresentam o padrão AA, mas não são portadoras do plasmídeo. No

plasmídeo pAA estão presentes vários genes relacionados com as propriedades de

virulência, dentre os quais aqueles que codificam as adesinas fimbrias AAF

(“Aggregative Adherence Factor” - AAF/I, AAF/II e AAF/III), o regulador de transcrição

AggR, a proteína antiagregação (Aap) e as toxinas Pet e EAST1. Outros fatores de

virulência de EAEC são codificados por genes cromossômicos, entre eles, a

enterotoxina ShET1, o sideróforo Yersiniabactin (irp2), uma ORF críptica (Shf), e uma

α-hemolisina.

A maioria dos estudos sobre mecanismos de virulência de EAEC compreende

amostras que apresentam o padrão AA e que reagem com a sonda AA, ou seja, as

amostras de EAEC típicas. Pouco se conhece sobre a presença de potenciais fatores

de virulência em amostras de EAEC sonda-negativas, descritas por nós como EAEC

atípicas.

Neste estudo analisamos 28 amostras de EAEC atípicas isoladas de crianças com

diarréia (N = 18) e sem diarréia (N = 10) provenientes de várias cidades brasileiras

quanto à presença de seqüências genéticas associadas aos fatores de virulência

codificados no plasmídeo pAA e no cromossomo.

A maioria das amostras era portadora de dois ou mais genes de virulência, sendo

a média dois; porém, duas amostras controles foram negativas para todos os

marcadores de virulência pesquisados. Os genes astA, pet, shf, shET/1/pic, irp2 e hly

foram encontrados mais freqüentemente em amostras isoladas de casos do que de

controles. Quatro amostras apresentaram o gene aggR e em uma delas foi encontrado

também as seqüências genéticas aafA e aap. A combinação dos genes astA e shf, foi

encontrada em 16 (57%) amostras e 7 (25%) amostras eram portadoras das

sequências genéticas astA, shf e irp2.

Entre as amostras estudadas, os marcadores genéticos codificados por genes

plasmidiais, astA, relacionada a produção de EAST1, e shf associada a uma ORF

críptica, foram os mais freqüentes (61%) e apresentaram uma freqüência

significantemente maior nos casos do que nos controles estudados (P = 0,003 e P =

0,020, respectivamente).

A maioria das amostras de EAEC atípicas estudadas reagiu com um dos 175

antissoros utilizados, sendo que alguns desses, como os sorogrupos O42, O126 e

O162 foram os mais freqüentes e encontrados apenas nas amostras isoladas de casos.

A análise do perfil plasmidial de 12 amostras isoladas de crianças com diarréia

mostrou a presença de mais de um plasmídeo de alto peso molecular na maioria das

amostras estudadas. Duas amostras, uma contendo apenas um plasmídeo e uma outra

sem nenhum plasmídeo foram então selecionadas para caracterização dos genes

envolvidos no padrão AA.

A amostra RN691-2 portadora de um único plasmídeo e apresentando resistência

antimicrobiana múltipla, foi submetida a experimentos de transformação, conjugação e

cura, não sendo possível à obtenção de um transformante, transconjugante ou mesmo

a amostra isogênica sem o plasmídeo.

Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) envolvidos no padrão AA da amostra

RN153-1, sem nenhum plasmídeo, foi construída uma biblioteca genômica e

identificado um clone-cosmídeo, designado pVIII-F-1, que apresentou o padrão AA em

células HEp-2 de maneira semelhante à amostra selvagem. Para localizar o gene

necessário para a adesão, o clone cosmídeo foi submetido a mutagênese com o

transposon mini-Tn10 (Cm

), sendo identificado o mutante pVIII-F-1::Tn10, que havia

perdido a capacidade de aderir. Tanto o clone-cosmídeo quanto o mutante foram

mapeados em seus sítios de restrição e um fragmento de 3 kb BamHI contendo 1 kb do

mini-Tn10 ainda mantendo funcional a resistência a Cm foi novamente ligado,

originando o sub-clone pAZ2.

A análise da seqüência de nucleotídeos do clone pAZ2 tem em seu total 2.197 pb,

sendo 953 pb referentes ao gene de cat e 1.244 pb referentes às seqüências obtidas,

constatando-se homologia de 97% com uma permease (proteína de membrana interna)

de Escherichia coli K12, uma proteína hipotética denominada ygjV, presente na

amostra protótipo de E. coli uropatogênica CFT073, em outras E. coli e bactérias

enteropatogênicas. O peptídeo deduzido dessa região revelou uma identidade de 91%

com o COG0477 (família das permeases facilitadoras) e 98% de identidade com

altronato hidrolase de Shigella flexneri

Ensaios de microscopia eletrônica de transmissão da amostra RN153-1 após

coloração negativa mostraram a presença de estruturas fimbriais, embora, nenhuma

proteína tenha sido observada com evidência nos extratos totais e nos aquecidos da

referida amostra.

Concluindo, os resultados obtidos em nosso trabalho mostraram que a maioria

(71%), das amostras de EAEC atípica, apresenta pelo menos dois dos fatores de

virulência envolvidos na patogênese das EAEC típicas. Entre eles, EAST1 e Shf foram

os mais prevalentes (61%), sendo encontrados significantemente associados com

diarréia.

Na caracterização preliminar dos genes envolvidos no fenótipo AA da amostra

RN153-1, foi identificado um mutante não aderente a células HEp-2, apresentando

inserção de mini-Tn10. A análise da seqüência do DNA flanqueado pela inserção do

mini-Tn10 levou a identificação de uma região a qual apresentou homologia com uma

permease, que parece estar envolvida no processo de transporte de íons e outros

eletrólitos na célula bacteriana. A identificação dos determinantes genéticos da adesina

AA da amostra RN153-1, entretanto, merece ainda maiores investigações.

ABSTRACT

Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) is emerging as a significant diarrheal

pathogen. EAEC is defined by its characteristic “stacked brick” aggregative adherence

(AA) pattern of adherence to HEp-2 cells. Most EAEC strains harbor a 60 to 65-MDa

virulence plasmid (pAA). A 1-Kb fragment of pAA, referred to as the AA probe or

CVD432, has been widely used for epidemiological studies. The pAA also encodes AA

fimbrae (AAF) I, II, and III; the transcriptional activator AggR; enteroaggregative heat-

stable enterotoxin 1 (EAST1); a 104-KDa cytotoxin designated Pet; the cryptic secreted

protein Shf; and a novel antiaggregation protein (dispersin) encoded by the aap gene. In

addition to the pAA plasmid, some EAEC strains express putative virulence factors that

are encoded on the chromosome, including a 116-KDa secreted mucinase (Pic),

yersiniabactin (Irp2), and the E. coli α-hemolysin (α-Hly). Shigella enterotoxin 1 (ShET1)

is encoded by the antisense strand of the pic gene.

Few studies have evaluated the prevalence of EAEC markers in probe-negative

strains, reported by us as atypical EAEC. By using atypical EAEC strains isolated in a

case-control study, we assessed the prevalence of putative virulence factors, such as

AAF/I, AAF/II, AAF/III, AggR, Aap, EAST-1, Pet, Shf, ShET1/Pic, Irp2, and α-Hly, in an

attempt to identify their roles as enteric virulence factors.

The majority of strains carried two or more of the genes, with two being the modal

value; but two strains isolated from a control did not test positive for any of the factors.

The AAF, aggR, and aap genes were present in only a minority of strains. The astA,

pet, shf, ShET1/pic, irp2 and hly genes were found more frequently in the patients than

in the controls. The combination astA and shf was found in 16 strains (57%), followed

by 7 strains (25%) possessing the combination astA, shf, and irp2.

The common virulence markers found in strains included the Pet, EAST1, Shf,

Irp2, ShET1/Pic, and Hly virulence markers. EAST1 and Shf were the most frequently

detected markers (61%) in strains and were found to be significantly associated with

diarrhea (P = 0,003 and P = 0,020, respectively).

The majority (75%) of the EAEC isolates reacted with one of the antisera used. It

was interesting that the strains belonging to serogroups O42, O126 and O162 were

detected only in children with diarrhea.

Plasmid analysis of 12 strains isolated from diarrhea showed that the majority of

strains contained large plasmids. Two strains, one carrying only one plasmid (MA691-2)

and another one any plasmid (RN153-1), were chosen for genetic studies on the

identification of genes responsible for the AA phenotype.

Plasmid from MA691-2 strain was transferred to E. coli K12 and no transformant or

transconjugant harboring the plasmid or isogenic derivative strain lacking the plasmid

was identified.

A genomic cosmid library of EAEC RN153-1 was generated in E. coli K12, and the

resulting clones were screened for aggregative adherence to HEp-2 cells. One cosmid

clone, pVIII-F-1, exhibited the same adherence as the wild-type, albeit to a lesser

extent. Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pVIII-F-1

responsible for the aggregative phenotype. Plasmid pBSL181 carrying mini-Tn10::Cm

was electroporated into E. coli DH5α (pVIII-F-1), and isolates were selected on L agar

with cloranfenicol and ampicillin. One isolate resistant to ampicillin and cloranfenicol

(pVIII-F-1::Tn10) was chosen for further analysis. Subsequent mapping of both cosmid

and mutant using restriction enzymes generated a 3 kb BamHI fragment containing 1

Kb of Tn10 (including the cloranfenicol resistance gene). This fragment was subcloned

and the resultant plasmid designated pAZ2 was sequenced.

The DNA sequence of 2,197 bp of pAZ2 contained 953 pb of cloranfenicol gene

and 1,244 pb whose sequence was 97% homologous to a permease of E. coli K12, a

hypothetical protein called ygjV presented in prototype uropathogenic E. coli strain

CFT073 and others pathogenic E. coli and enteric pathogens. The predicted protein

product of this region showed 91% identity to the COGO477 and 98% to the altronato

hidrolase of the Shigella flexneri.

Electron microscopy assays showed the presence of fibrillar structures on the

surface of strain RN153-1, but no predominant protein was seen in crude fimbrial

preparations of this strain obtained through whole-cell lysates or heat extracts.

In conclusion, the majority (71%) of atypical EAEC strains carried at least two

virulence factors mediating typical EAEC pathogenesis. EAST1 and Shf were the most

frequently (61%) detected and were found to be significantly associated with diarrhea (P

= 0.003 and P = 0.020, respectively).

In a preliminary characterization of genes involved in the AA phenotype of RN153-

1 strain, we identified one mutant markedly deficient in HEp-2 cell adherence.

Sequence analysis of the gene disrupted in this mutant revealed a region exhibit up to

97% amino acid similarity to a permease which seems to be involved in the process of

transport of ions and other electrolytes in the bacterial cells. Nevertheless, the genes

required for the AA phenotype remains unidentified.

INTRODUÇÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

1. INTRODUÇÃO

Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, pertencente à família

Enterobacteriaceae, anaeróbio facultativo mais predominante da flora do intestino

grosso de seres humanos e de alguns animais, estabelecendo uma relação comensal

com o hospedeiro. Nos seres humanos, as amostras comensais de E. coli usualmente

não causam doença no trato intestinal ou em sítios extra-intestinais. Entretanto, no

hospedeiro debilitado ou no imunodeprimido, ou, ainda, quando as barreiras

gastrointestinais são violadas, essas amostras podem causar infecções. Estas

infecções podem ser tanto intestinais, como a diarréia, ou extraintestinais no caso das

infecções do trato urinário, meningite ou septicemia (Nataro & Kaper, 1998; Levine et

al., 1984). Algumas cepas da espécie, contudo, podem causar diarréia em indivíduos

saudáveis, se apresentarem um conjunto específico de fatores de virulência, ausentes

nas amostras comensais de E. coli (Kaper et al., 2004).

As amostras de E. coli que causam infecções intestinais, atualmente designadas

de E. coli diarreiogênicas, são divididas em seis categorias: E. coli enteropatogênica

(EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli

enterohemorrágica (EHEC) ou E. coli produtora da toxina Shiga (STEC), E. coli

enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC). Esta classificação

tem por base as propriedades de virulência, tipos de interações com as linhagens

celulares e as manifestações clínicas que causam (Nataro & Kaper, 1998). Além do

mais, os vários patótipos de E. coli tendem a formar grupos clonais que são

caracterizados pelos seus antígenos O (lipopolissacarídeo, LPS) e H (flagelo) que

definem os sorogrupos (somente o antígeno O) ou sorotipos (antígenos O e H) (Nataro

& Kaper, 1998; Whittam, 1993).

E. coli enteroagregativa (EAEC) foi descrita em 1985, reconhecida por sua

capacidade de aderir a monocamadas de células HEp-2 em cultura em um padrão de

adesão agregativa (AA). No padrão AA, as bactérias apresentam-se aderidas umas às

outras, à superfície das células epiteliais, bem como à superfície da lamínula na

ausência de células, numa configuração semelhante a “tijolos empilhados”, formando

agregados heterogêneos ou distribuindo-se em forma de cordões (Figura 1).

INTRODUÇÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 1. Padrão de adesão agregativa (AA) apresentado pela EAEC MA691-2 a

células HEp-2 em ensaio de 3 horas.

O padrão AA, distinto dos padrões de adesão apresentados pela EPEC e DAEC,

foi inicialmente associado significantemente à diarréia entre crianças da cidade de

Santiago, no Chile em 1987 (Nataro et al., 1987). Estudos realizados com duas

amostras protótipos, EAEC 17-2 e EAEC 042 mostraram que o fenótipo AA está

associado à presença de plasmídeos entre 55 MDa e 65 MDa, denominados pAA

(Nataro et al., 1985; Vial et al., 1988). Posteriormente, Baudry et al. (1990),

demonstraram, um fragmento Sau3A de 1 kb, críptico, do plasmídeo pAA presente na

amostra 17-2 que foi utilizado no desenvolvimento de uma sonda genética EAEC

específica e variavelmente sensível, para distinguir EAEC das demais E. coli. Muitos

estudos epidemiológicos têm utilizado esta sonda, denominada de CVD432 ou

simplesmente AA, como também a presença do fenótipo AA através do teste de

adesão, na detecção de amostras de EAEC (Huppertz et al., 1997; Germani et al.,

1998; Scaletsky et al., 2002a; Okeke et al., 2003).

Desde a sua descoberta, um número crescente de estudos relacionaram a EAEC

como causa de diarréia nos mais variados cenários (Chan et al., 1994; Wilson et al.,

2001; Kawano et al., 2004). Atualmente, estes estudos incluem a diarréia endêmica em

crianças tanto em países industrializados quanto em desenvolvimento (Okeke &

Nataro, 2001; Huang & DuPont, 2004; Huang et al., 2004), a diarréia persistente entre

INTRODUÇÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

indivíduos com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) (Gassama-Sow et al.,

2004) e a diarréia dos viajantes (Gascón et al., 1998; Adachi et al., 2001). Vários surtos

epidêmicos de diarréia por EAEC também foram descritos (Levine et al.,1988; Haider et

al., 1991 Scaletsky et al., 2002b). Estudos prospectivos sugerem que em populações

bem nutridas de países industrializados, a EAEC poderia ser uma causa de diarréia

endêmica esporádica. Recentemente, um amplo estudo prospectivo de vigilância no

Reino Unido apontou a EAEC como o principal patógeno em todas as faixas de idade

(Wilson et al., 2001).

A implicação de EAEC em surtos epidêmicos de diarréia confirmou o fato de que

pelo menos algumas amostras que apresentam o fenótipo AA sejam verdadeiros

patógenos humanos, mesmo que nem todos os estudos tenham encontrado a EAEC

associada significantemente à diarréia (Germani et al., 1996; Scaletsky et al., 2002b;

Batista et al., 2004). Estudos mais recentes têm procurado identificar os genes

pertinentes à virulência das amostras de EAEC, para melhor identificar as

verdadeiramente patogênicas.

A manifestação clínica da infecção por EAEC compreende uma diarréia aquosa,

com a presença ocasional de sangue e muco (Baron, S., 2000). Vários estudos

mostraram que pacientes infectados com amostras de EAEC apresentam inflamação

intestinal, observando-se a presença de lactoferrina fecal e citocinas inflamatórias,

notadamente a interleucina IL-8 (Steiner et al., 1998; Greenberg et al., 2002).

Em um estudo realizado com voluntários, Nataro et al. (1995) descreveram que de

quatro amostras sonda-positivas, apenas uma, a protótipo 042, provocou diarréia em

voluntários, confirmando que nem todas as amostras de EAEC são igualmente

patogênicas. Estudos realizados com esta amostra propuseram três características

principais para a patogênese de EAEC (Figura 2): (1) aderência abundante à mucosa

intestinal, (2) produção de enterotoxinas e citotoxinas e (3) indução de inflamação da

mucosa intestinal (Harrington et al., 2006).

INTRODUÇÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 2. Fatores de virulência envolvidos na patogênese de EAEC. Fonte: Harrigton

et al. (2006)

1.1. Histopatologia de EAEC

Em modelos animais e pacientes infectados, EAEC parece ser capaz de colonizar

as regiões do íleo e cólon do trato intestinal sem danos aparentes à mucosa do

intestino delgado. A EAEC adere aos tecidos intestinais de forma agregativa em

associação com uma espessa camada de muco (Tzipori et al., 1992; Hicks et al.,

1996). A aderência é seguida por toxicidade da mucosa, que inclui dilatação da cripta,

vesiculação das microvilosidades e extrusão da célula epitelial (Hicks et al., 1996;

Nataro et al., 1996). Tipicamente, EAEC induz, um aumento da secreção de muco na

mucosa intestinal, sendo que as bactérias ficam emaranhadas nesta espessa camada

de biofilme. A formação desse biofilme, possivelmente, está envolvida com a

capacidade de colonização da bactéria, causando má-absorção de nutrientes e a

doença persistente (Nataro & Kaper, 1998; Steiner et al., 1998).

Estudos utilizando biópsias do cólon de crianças mostraram que algumas

amostras de EAEC induzem encurtamento das vilosidades intestinais, necrose

hemorrágica do topo das vilosidades e uma resposta inflamatória branda, com edema e

infiltração mononuclear. A extrusão de enterócitos foi também evidenciada (Knutton et

INTRODUÇÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

al., 1992; Hicks et al., 1996). A amostra protótipo 042 também provocou efeitos

citotóxicos em células T84 (originárias de carcinoma intestinal humano) polarizadas in

vitro, induzindo vesiculação das microvilosidades, exfoliação de células da

monocamada, aumento de vacuolização e separação nuclear do citoplasma

circundante (Nataro et al., 1996) (Figura 3). Esta histopatologia ainda não foi observada

em infecções em seres humanos. Ainda não foi descrito infiltrado de leucócitos

polimorfonucleares na infecção humana por EAEC (Vial et al., 1988).

FIGURA 3. Fotomicrografia eletrônica de transmissão mostrando a interação da EAEC

042 com monocamadas de células T84. Fonte: Nataro et al., 1998.

1.2. Fatores de virulência envolvidos na patogênese de EAEC

1.2.1. Adesinas e outros fatores de virulência codificados por genes plasmidiais

Os fatores de aderência melhor estudados em EAEC são as adesinas fimbriais

AAFs (“aggregative adherence fimbria), codificadas nos plasmídeos pAA. Até o

momento, foram descritas três diferentes AAFs: AAF/I, AAF/II e AAF/III. Estas adesinas

são capazes de mediar o fenótipo AA nas amostras 17-2, 042 e 55989,

respectivamente (Nataro et al., 1992; Czeczulin et al., 1997; Bernier et al., 2002).

AAF/I é uma estrutura fimbrial de 2 a 3 nm de diâmetro, organizada em feixes

flexíveis. Esta adesina foi inicialmente identificada na amostra 17-2 e promove a

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Escherichia coli

enteroagregativa

aderência AA a células HEp-2 e a capacidade de aglutinar eritrócitos humanos. Os

genes que codificam para AAF/I estão localizados no pAA em duas regiões separadas

por um fragmento de DNA de 9 kb (Nataro et al., 1993).

A região 1 contém os genes necessários para a síntese, aggA (pilina), e

montagem, aggC (usher) e aggD (chaperonina), da fímbria, e um gene sem função

determinada, aggB. Mediante a construção de uma proteína de fusão entre “maltose-

binding protein” e AggA, inferiu-se que o produto de AggA está relacionado à

subunidade estrutural de AAF/I, correspondendo a uma proteína de 14 kDa (Savarino

et al., 1994). Os genes relacionados à biogênese de AAF/I presentes na região 1

apresentam o arranjo típico de um operon da família Dr (Nataro & Kaper, 1998).

O seqüenciamento da região 2 evidenciou uma ORF (“open reading frame”)

relacionada à expressão de AAF/I, denominada AggR (Nataro et al., 1994). AggR

apresenta homologia com reguladores positivos da expressão de fímbrias de E. coli,

que são membros da família AraC de proteínas que ligam DNA (Nataro et al., 1994).

AAF/II, inicialmente descrita na amostra protótipo 042, mede aproximadamente 5

nm de diâmetro e é geneticamente distinta de AAFI (Nataro et al.,1985; Vial et al.,1988;

Nataro et al., 1995). Os genes que codificam AAF/II estão localizados em duas regiões

separadas. Na região 2, está o gene que codifica para o “usher”, aafC e, na região 1,

separada por um fragmento de 15 kb, estão os genes estruturais aafA, a chaperonina

aafD, e o ativador de transcrição aggR (Elias et al., 1999). A proteína codificada por

aafA possui 17 kDa e apresenta homologia com AggA (25% de identidade e 47% de

similaridade), a proteína estrutural de AAF/I. Na posição “dowstream” a aafC, foi

revelado um “cluster” com três ORFs, transcritas na mesma direção e com 93% de

identidade a um “cluster” de genes localizados no plasmídeo de Shigella flexneri

(Nakata et al., 1992). O primeiro gene deste “cluster” é uma ORF denominada shf. Este

gene codifica para uma proteína de função não conhecida, que apresenta uma

identidade de 25% com o aminoácido IcaB de Staphylococcus epidermidis, que está

relacionado com a adesão intercelular (Heilmann et al., 1996).

As AAFs também possuem um gene, aafB, que codifica para uma provável

proteína com função de invasina, portanto mediando a invasão do epitélio celular

(Bernier e LeBouguénec, 2002). Alguns pesquisadores sustentam a hipótese de que

EAEC seria um patógeno invasor, contudo, a amostra prototótipo 042

comprovadamente não se mostrou invasora nos estudos in vitro (revisado por

Harrington et al., 2006).

INTRODUÇÃO

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enteroagregativa

As seqüências de aminoácidos, deduzidas a partir das seqüências de

nucleotídeos dos genes envolvidos com a biogênese de AAF/I e AAF/II, apresentam

similaridade com as proteínas relacionadas à biogênese das adesinas pertencentes à

família Dr (Nataro et al., 1998). A família Dr de adesinas é composta de adesinas

fimbriais e afimbriais, expressas por E. coli relacionadas com infecções do trato

intestinal e urinário, que apresentam como receptor comum o antígeno eritrocitário do

grupo sanguíneo Dra, presente na molécula “decay-accelerating factor” (DAF) (Nowicki,

et al., 1990). DAF é uma glicoprotéina de membrana citoplasmática, ancorada via

glicosil fosfatidilinositol, que está amplamente distribuída nas células hematopoiéticas,

tecidos endoteliais e epiteliais e atua na regulação da cascata do sistema

complemento, pela via alternativa, protegendo esses tecidos dos danos celulares

desencadeados pela ativação de C

(Nowick et al., 1990; Garcia et al., 1996).

Apesar das AAFs não reconhecerem o receptor Dr e apresentarem uma

organização genética distinta, Dal’Agnol (2002) mostrou que essas adesinas podem ter

suas seqüências de aminoácidos alinhadas com as da família Dr, sugerindo que as

mesmas sejam incluídas nesta família.

AAF/III foi identificada na amostra 55989, proveniente de diarréia persistente, em

um paciente adulto portador de aids. Essa fímbria é caracterizada por estruturas longas

e flexíveis, com aproximadamente 3 a 5 nm de diâmetro, distintas de AAF/I e AAF/II

(Bernier et al., 2002). O sequenciamento dos genes envolvidos na biogênese de AAF/III

revelou similaridade com os operons agg e aaf (AAF/I e AAF/II, respectivamente). A

região 1 compreende os genes agg3D (chaperonina), agg3C (usher), agg3B (membro

da família de invasinas) e agg3A (subunidade estrutural). Na região 2, encontra-se o

gene já descrito aggR (ativador da transcrição) e na região 3 foi encontrado um gene

muito similar a astA, que codifica a toxina EAST1 (“enteroggregative heat-stable

enterotoxin”).

A expressão dos genes AAF requer AggR, um ativador de transcrição da família

AraC (Nataro et al., 1994). Esta proteína regula os genes envolvidos na biogênese das

adesinas AAF/I e AAF/II. Estudos genéticos do plasmídeo pAA revelaram uma pequena

ORF localizada “upstream” ao gene aggR na maioria das amostras de EAEC. Esse

gene codifica uma proteína secretada de 10 kDa, que foi reconhecida pelo soro de

voluntários após inoculação oral da amostra protótipo 042. Amostras desprovidas

(“knocked-out”) deste gene apresentaram um único fenótipo hiperagregativo, e a

microscopia eletrônica dessas amostras revelou um colapso das fímbrias AAFs na

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enteroagregativa

superfície da bactéria. O produto desse gene foi denominado Aap (“antiaggregation

protein”), e esta foi chamada de dispersina (Sheikh et al., 2002). A dispersina é

secretada na superfície de amostras de EAEC e liga-se não covalentemente ao

lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa. Dados mais recentes sugeriram que o

mecanismo de ação da dispersina seria mediado predominantemente por sua

capacidade de neutralizar a forte carga negativa do LPS, permitindo, assim, que as

AAFs que carregam uma forte carga positiva fiquem livres para se espalhem na

superfície, ligando-se a sítios distantes (revisado por Harrington et al., 2006).

Nishi et al. (2003) demonstraram que a secreção da dispersina requer cinco

“clusters” de genes, localizados no plasmídeo pAA, porém não ligados ao gene aap.

Esse “cluster” de genes inclui genes homólogos a permeases (ATPase e ABC),

sugerindo a presença de um complexo transportador ABC. O segundo gene desse

complexo, aatA, codifica uma estrutura homóloga a TolC, canal de membrana externa,

facilitando assim a entrada do substrato na célula (Nataro, 2005).

O regulon AggR não é restrito ao plasmídeo pAA. Dudley e Nataro (revisado por

Harrington et al., 2006) observaram que, além de regular genes do plasmídeo pAA,

AggR também regula um operon cromossômico inserido numa ilha de patogenicidade

no locus pheU.

Adesinas não fimbriais foram também observadas em amostras de EAEC

pertencentes a diferentes sorogrupos. Monteiro-Neto et al. (2003) identificaram uma

OMP de 58 kDa com propriedades hemaglutinantes, em amostras de EAEC

pertencentes ao sorotipo O111:H12. Demonstrou-se, também, a presença de uma

OMP de 18kDa, em amostras de EAEC pertencentes aos sorotipos O44:H18 e

O126:H27, envolvida na formação de uma película em meio líquido (Chart et al., 1995).

Esta OMP de 18 kDa é antigenicamente similar à subunidade protéica de uma fímbria

apresentada por amostras de Salmonella enteridis. Spencer et al. (1998) demonstraram

que a expressão dessa OMP também ocorria em amostras de EAEC de outros

sorotipos, mas somente naquelas que hibridizavam com a sonda AA.

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1.2.2. Toxinas

Diversos tipos de toxinas foram detectadas em sobrenadantes de cultura de

algumas amostras de EAEC. Eslava et al., (1993) identificaram no sobrenadante de

cultura de amostras de EAEC isoladas de dois surtos de diarréia em hospitais no

México, duas proteínas de 108 e 116 kDa, pertencentes à família de proteínas

autotransportadoras serina-proteases (SPATE) (“Serine Protease Autotransporters of

Enterobacteriacea”) (Henderson et al., 1998). Esse grupo de proteínas se caracteriza

por possuir um domínio C-terminal conservado, que forma um poro na membrana

externa bacteriana, por onde a proteína madura é transportada.

A proteína de 108 kDa foi designada de Pet (“Plasmid encoded toxin”) (Eslava et

al., 1993). A amostra protótipo 042 que expressa Pet provocou efeitos citotóxicos em

células T84 polarizadas in vitro, induzindo dilatação das criptas e seu arredondamento,

vacuolização subnuclear e ruptura celular com extrusão nuclear, enquanto que o

mutante isogênico em pet promoveu anormalidades em uma escala significantemente

menor (Henderson et al., 1999). Estudos sugerem que os efeitos tóxicos de Pet sejam

devido a rearranjos do citoesqueleto seguidos da clivagem mediada por Pet de uma

proteína do citoesequeleto, a espectrina (Villaseca et al., 2000; Canizalez-Roaman &

Navarro-Garcia, 2003). Embora Pet tenha um papel na patogênese de EAEC,

encontra-se presente numa minoria de amostras (Czeczulin et al., 1999); Pet apresenta

alta homologia às proteases EspP de EHEC e EspC de EPEC (Stein et al., 1996;

Eslava et al., 1998).

Ao estudar o sobrenadante da cultura da amostra protótipo 17-2 em câmaras de

Ussing, Savarino et al. (1991) observaram a presença de atividade enterotoxigênica

relacionada com alteração do transporte de íons. A substância secretada correspondia

a uma proteína de baixo peso molecular, codificada pelo plasmídeo pAA e parcialmente

termo-estável, que foi denominada EAST1 (“Enteroaggregative heat-stable toxin 1”).

EAST1 apresenta homologia significante com o domínio enterotóxico da toxina Sta de

ETEC e com a guanilina, um peptídeo endógeno ativador natural da guanilato ciclase

(Savarino et al., 1993). Com base nessa homologia e devido à elevação dos níveis de

cGMP, inferiu-se que EAST1 atua ativando a guanilato ciclase da mesma forma que a

toxina STa e a guanilina. O papel de EAST1 na patogênese da diarréia é questionável,

uma vez que voluntários inoculados com amostras que expressavam EAST1 não

desenvolveram diarréia (Nataro et al., 1995). A seqüência astA, envolvida na expressão

INTRODUÇÃO

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enteroagregativa

de EAST1, mostra-se presente em somente uma minoria de amostras de EAEC e tem

sido encontrada em outras categorias de E. coli diarreiogênica e também em E. coli

não patogênica (Savarino et al.,1996; Zhou et al., 2002).

Além de EAST1, foi descrito que as EAEC podem secretar uma toxina termo-lábil

de 120 kDa antigenicamente relacionada à α−hemolisina de E. coli. Essa toxina induzia

uma elevação de cálcio intracelular e estimula a fosforilação de proteínas, na presença

de cálcio (Baldwin et al., 1992); o seu papel, no entanto, como fator de virulência, não

foi ainda definido.

1.2.3. Fatores de virulência codificados por genes cromossômicos

A terceira enterotoxina que poderia contribuir para a diarréia por EAEC, é a ShET-

1 codificada cromossomicamente. Os genes setBA, que codificam ShET1 estão

localizados na fita antisenso a pic, que codifica uma proteína secretada de 116 kDa,

descrita por Navarro-Garcia et al. (1998). A toxina ShET-1 é codificada no cromossomo

por duas ORFs, set1A e set1B, que codificam para as subunidades A e B,

respectivamente. As duas organizam-se em uma estequiometria similar ao da toxina

colérica, ou seja, uma subunidade A juntamente com cinco subunidades B. ShET1

promove acúmulo de fluído no modelo de alça intestinal ligada de coelho e aumento na

diferença de potencial e na corrente de curto circuito quando testado em câmaras de

“Ussing”. (Fasano et al., 1995).

Pic (“protein involved in intestinal colonization”) é uma proteína extracelular de

109,8 kDa codificada por genes cromossômicos da amostra protótipo 042 e por S.

flexneri. Pic é sintetizada como uma molécula precursora de 146,5 kDa, que é

processada durante sua secreção, liberando uma proteína madura de 109,8 kDa no

sobrenadante da cultura bacteriana. A seqüência de aminoácidos desta proteína

também revelou alta homologia com a família de proteínas SPATEs (Henderson et al.,

1998). Pic apresenta atividade mucinolítica in vitro, resistência ao soro, e

hemaglutinação, mas seu papel na patogênese de EAEC ainda não foi comprovado

(Henderson et al., 1999).

O locus pic/setBA não é exclusivo de EAEC, sendo também encontrado em S.

flexneri 2a (Fasano et al., 1995) e em E. coli uropatogênica CFT073 (Heimer et al.,

2004), com seqüências nucleotídicas com identidade de 99% e 96%, respectivamente,

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quando comparadas com a EAEC 042. Estudos propõem que a prevalência deste locus

possa estar associada a um possível papel na patogenicidade de EAEC (Harrington et

al., 2006). Em EAEC, a prevalência de pic/setA varia entre 4,6% e 57% das amostras

(Czeczulin et al., 1999; Okeke et al., 2000; Vila et al., 2000; Piva et al., 2003; Sarantuya

et al., 2004), sendo associada à diarréia entre crianças da cidade de Brasília (Piva et

al., 2003) e viajantes adultos da Espanha (Vila et al., 2000).

Resultados obtidos através do seqüenciamento do genoma da amostra protótipo

042 revelaram que o locus pic/setBA está inserido numa ilha de patogenicidade de 117

kb, por sua vez, inserida no locus pheU do RNAt. As seqüências que flanqueiam o

locus pic/setBA, incluem elementos de seqüências de inserção (IS), IS911 e IS629

(Harrington et al., 2006). Uma ORF semelhante a uma IS, perD, e um gene fágico

críptico L0015 estão localizados “downstream” a pic (Henderson et al., 1999). Al-Hasani

et al. (2001) determinaram que o locus pic/setBA da amostra de S. flexneri YSH6000T

está localizado numa ilha de patogenicidade (PAI) denominada she e inserido

adjacente ao gene pheV do RNAt. Os elementos IS que flanqueiam pic/setBA em

EAEC diferem daqueles encontrados dentro da PAI she, o que leva a crer, que a

aquisição do gene pic/setAB tenha sido diferente para as duas espécies bacterianas.

Também inserido na ilha pheU encontram-se dois grupos de genes, ScI e ScII, de

cerca de 20 kb cada um, sendo que o último deles está sob controle do ativador de

transcrição AggR. ScII compreende 16 ORFS, designadas de aaiA-P (significando, ilha

de patogenicidade ativada por AggR) (revisado por Harrington et al., 2006). Estudos

moleculares revelaram um promotor dependente de AggR localizado upstream a aaiA e

sugeriram que as 16 ORF seriam transcritas como um operon. Exceto para aaiP, que

codifica putativamente uma chaperonina ClpB, nenhuma outra ORF codifica alguma

outra proteína de função conhecida. A contribuição dos genes aai na patogênese de

EAEC ainda é desconhecida, porém esses genes parecem não ter um papel na

aderência da bactéria a superfícies abióticas ou as células epiteliais intestinais, como

ocorre com os genes regulados por AggR descritos anteriormente (revisado por

Harrington et al., 2006).

Duas outras ilhas de patogenicidade também foram reveladas no genoma da

amostra 042. Uma delas, inserida no gene glyU, codifica um homólogo do sistema de

secreção do tipo III ETT-2 da EHEC O157:H7. A outra contém genes para um

regulador de transcrição e proteínas efetoras e está inserida em selC. Além dessas

duas ilhas, uma outra, a ilha de patogenicidade de Yersinia contendo o gene do

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sideróforo Yersiniabactin está presente na maioria das amostras de EAEC (Schubert et

al., 1998).

1.3. Potencial papel pró-inflamatório dos fatores de virulência de EAEC

As infecções causadas por EAEC são acompanhadas de inflamação da mucosa

intestinal mesmo na ausência de diarréia. Steiner et al. (2000) mostraram que os

sobrenadantes dos cultivos destas bactérias possuem atividade pró-inflamatória

mediada pela liberação de IL-8, que é induzida pela proteína flagelina de E. coli. A

liberação de IL-8 atrairia neutrófilos para o sítio da infecção, causando em outras

infecções intestinais secreção de fluido e ruptura da barreira epitelial (Madara et al.,

1993; Sansonetti et al., 1999). Ainda, segundo Steiner et al. (2000) a atividade pró-

inflamatória da flagelina também está presente em cepas de EPEC e EHEC, levando a

crer que o flagelo possa desempenhar outros papéis, além da motilidade, na

patogênese destas bactérias.

Steiner et al. (1998) também sugeriram um papel para os fatores codificados no

plasmídeo na liberação de IL-8. Jiang et al. (2002) observaram que os níveis de IL-8

eram mais altos em pacientes infectados com amostras EAEC contendo os genes

aggR e aafA, em comparação a pacientes infectados por amostras de EAEC negativas

para esses fatores. Huang et al. (2004) demonstraram que amostras de EAEC

albergando os fatores aggR, aggA e aap eram capazes de causar uma liberação de IL-

8 maior que 100 pg/mL em células epiteliais intestinais não polarizadas (HCT-8), do

que amostras de EAEC negativas para estes fatores. Em um estudo com células T84

polarizadas in vitro infectadas com a amostra 042, ocorreu liberação de IL-8 das células

até mesmo quando estas células eram infectadas com a amostra 042 mutada em FliC,

subunidade principal da flagelina. Observou-se que a liberação de IL-8 das células T84

polarizadas requeria o ativador AggR e a fímbria AAF, sendo que a liberação de IL-8 foi

significantemente menor, quando as células eram infectadas com mutantes na

subunidade fimbrial menor, AafB (Harrington et al., 2005).

A proteína AafB foi recentemente descrita como um homólogo de uma classe de

proteínas com potencial função de invasina em E. coli uropatogênica e DAEC (Bernier

& Le Bouguénec, 2002; Plancon et al., 2003; Cota et al. 2004). Plancon et al. (2003)

INTRODUÇÃO

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sugeriram que o fenótipo invasão estaria correlacionado a ligação da integrina β1 na

superfície celular.

1.4. Regulação gênica em EAEC

Para compreender o papel principal do gene aggR na regulação dos genes de

virulência de EAEC, é necessário entender como a proteína é regulada por si mesma.

Recentes estudos demonstraram que a proteína liga-se a sítios específicos ao lado do

promotor no sítio 35. Um segundo sítio de ligação foi sugerido por “footprinting” do

DNA, embora nenhum papel para este sítio possa ser demonstrado em estudos de

expressão gênica (Harrington et al., 2006). Em virtude da autoativação desse gene, foi

questionado como a expressão de aggR seria iniciada e terminada. Verificou-se que o

“regulon” AggR é expresso preferencialmente na fase logarítmica do crescimento

bacteriano em meios de cultura. Harrington et al. (2006) demonstraram que FIS, um

regulador fase-dependente, contribui para a ativação de AggR e que o nível basal de

AggR é controlado por ações repressivas de uma proteína H-NS associada a

nucleóide. Dessa forma, o promotor aggR estaria sujeito a um esquema de regulação

que asseguraria sua abundante e rápida expressão logo após entrar no trato

gastrointestinal.

1.5. EAEC atípica

O teste de adesão a células HEp-2 continua sendo o diagnóstico diferencial para

a categoria de EAEC (Nataro & Kaper, 1998). Em um grande número de amostras de

EAEC, o padrão AA está associado à presença de plasmídeos pAA, esses apresentam

homologia, indicando que são conservados entre diferentes amostras de EAEC (Vial et

al., 1988; Baudry et al., 1990).

Uma sonda de DNA derivada de um fragmento críptico do plasmídeo pAA vem

sendo amplamente utilizada na detecção de amostras de EAEC, a qual inicialmente

mostrou ser 89% sensível e 99% específica (Baudry et al., 1990). Estudos mais

recentes confirmaram a alta especificidade dessa sonda, porém mostraram que a

sensibilidade variava entre 15% e 90% para amostras de EAEC de diferentes regiões

INTRODUÇÃO

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(Figura 4). Esses dados têm conseqüências importantes nas conclusões obtidas de

estudos epidemiológicos que utilizam apenas a sonda AA na detecção de EAEC.

FIGURA 4. Proporção de amostras de EAEC isoladas de estudos reportados em

Bangladesh (Faruque et al., 1992), Alemanha (Schmidt et al., 1995), São Paulo

(Gomes et al., 1998), Nigéria (Okeke et al., 2000), Alemanha (Durrer et al., 2000),

Londrina (Gioppo et al., 2000) e Iran (Bouzari et al., 2001), que hibridizaram com a

sonda AA (Okeke & Nataro, 2001).

Estudos genéticos sobre virulência e estudos epidemiológicos têm sugerido que

as EAEC sonda-positivas sejam as verdadeiramente patogênicas, sendo denominadas

por alguns pesquisadores de EAEC típicas (Sarantuya et al., 2004; Kaper et al., 2004).

Embora a enteropatogenicidade de amostras de EAEC sonda-positivas tenha sido

relatada em vários estudos epidemiológicos e em voluntários humanos, a

patogenicidade de pelo menos algumas amostras sonda-negativas é suportada pela

evidência de estudos epidemiológicos que demonstraram associação entre amostras

positivas e negativas, ou somente entre amostras sonda-negativas e a diarréia (Fang et

al., 1995; Okeke et al., 2000). Além disso, surtos epidêmicos de EAEC por amostras

sonda-negativas aconteceram na Europa oriental e Japão (Cobeljic et al., 1996; Ito et

al., 1997).

Em um estudo multicêntrico sobre diarréia infantil realizado em várias cidades

brasileiras foram isoladas 109 amostras de E. coli que apresentavam o padrão AA.

INTRODUÇÃO

Escherichia coli

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Destas 109 amostras, 81 hibridizaram com a sonda AA. As 28 amostras que não

hibridizaram com a sonda AA, como também eram desprovidas de seqüências

genéticas específicas para as demais categorias patogênicas de E. coli (EPEC, ETEC,

EIEC e EHEC), foram classificadas como EAEC atípicas. Embora a diferença numérica

entre as amostras isoladas de casos e controles não tivesse sido significantemente

diferente, decidimos avaliar se dentro dessa população haveria possíveis

enteropatógenos.

OBJETIVO

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2. OBJETIVO

Para compreender melhor o potencial enteropatogênico das amostras de EAEC

atípica, este trabalho teve como objetivos:

- Verificar a presença dos fatores de virulência envolvidos na patogênese de EAEC,

codificados por genes plasmidiais e cromossômicos.

- Caracterizar novas adesinas envolvidas no fenótipo AA, mediante a identificação,

clonagem, seqüenciamento e mutagênese dos genes envolvidos nessa adesão.

MATERIAIS E MÉTODOS

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Amostras bacterianas

As amostras estudadas foram isoladas durante um estudo epidemiológico sobre

diarréia em crianças menores de 2 anos de idade de baixo nível sócio-econômico, que

foram atendidas no pronto socorro dos hospitais públicos, nas cidades de São Paulo,

Joinville, Natal, Goiana e São Luiz entre agosto de 1997 a julho de 1999 (Scaletsky et

al., 2002a). Este estudo epidemiológico compreendeu, originalmente, a análise de

amostras de fezes de 338 crianças com diarréia aguda ou persistente (casos) e 322

crianças sem diarréia (controles), que compareceram aos hospitais por outros motivos

que não a diarréia.

No referido estudo, em cada amostra de fezes foi pesquisada, por meio de

métodos convencionais, a presença dos seguintes enteropatógenos: Shigella spp.,

Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Campylobacter spp., Cryptosporidium spp. e

rotavírus (Scaletsky et al., 2002a). Outrossim, de cada amostra de fezes semeada em

ágar MacConkey foram selecionadas cinco colônias fermentadoras e uma outra não

fermentadora de lactose, típicas de E. coli. Em seguida, foram realizados testes

bioquímicos para confirmação da espécie, e as amostras foram armazenadas a -70

em caldo LB (item 8.1.1) acrescido de 15% de glicerol (Merck). Todas as amostras de

E. coli foram submetidas a teste de adesão a células HEp-2, para caracterizar o padrão

de adesão e hibridização de colônias com sondas genéticas específicas para a

identificação das categorias de E. coli diarreiogênicas, isto é, relacionadas à produção

de enterotoxinas de ETEC (sondas LT e ST), capacidade invasora de EIEC (sonda

Inv), produção de toxinas de Shiga de STEC (sondas Stx1 e Stx2), produção de

intimina e fímbria BFP de EPEC (sondas eae e bfpA), presença do plasmídeo de

adesão de EAEC (sonda AA) e presença da seqüência daaC e adesina AIDA-I de

DAEC (sondas daaC e AIDA-I).

Entre as 660 amostras de fezes analisadas, 109 (67 casos e 42 controles)

apresentaram amostras de E. coli com o padrão de adesão agregativa (AA), sendo que

81 dessas amostras hibridizaram com a sonda AA. Entre as 28 amostras que não

reagiram com a sonda AA, 5 amostras reagiram com a sonda daaC. Por serem

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

desprovidos de seqüências genéticas das outras sondas, esses 28 isolados foram

classificados como EAEC atípicas. O número de isolados, em cada amostra de fezes,

variou de um a cinco, mas para o presente estudo, somente um isolado de E. coli de

cada uma dessas 28 amostras de fezes foi selecionado e considerado como uma

amostra bacteriana.

As amostras de EAEC protótipos de expressão das adesinas fimbriais AAFs, 17-2

(AAF/I) (Nataro et al., 1995), 042 (AAF/II) (Czeczulin et al., 1997) e 55989 (AAF/III)

(Bernier et al., 2002), e a EAEC 236 que expressa a proteína de membrana externa de

58 KDa (Monteiro-Neto et al.,2003) foram empregadas em alguns experimentos.

As características e origem das amostras de E. coli K12 e selvagens, bem como

os vetores plasmidiais utilizados neste estudo, encontram-se na Tabela 1.

3.2. Condições de cultivo das amostras bacterianas

Todas as amostras foram cultivadas a 37°C em caldo ou ágar LB (item 8.1.1) ou

ágar MacConkey. Os seguintes antibióticos foram adicionados, quando indicado:

ampicilina, 100 µg/mL; tetraciclina 20 µg/mL; canamicina, 30 µg/mL; cloranfenicol, 25

µg/mL; estreptomicina 10 µg/mL; sulfonamida 300 µg/mL; ácido nalidíxico, 50 µg/mL.

As soluções estoque de antibióticos foram preparadas em solvente apropriado,

esterilizadas por filtração e mantidas a –20°C (Sambrook et al., 1989).

As culturas em meio líquido foram incubadas por 16 a 18 horas em condições

estáticas ou, quando citado, sob agitação constante de 200 rpm.

Os estoques bacterianos foram mantidos em caldo LB (item 8.1.1), acrescidos de

15% de glicerol, e do antibiótico apropriado, e congelados a –70°C.

3.3. Determinação do sorogrupo das amostras bacterianas

A identificação do antígeno somático (O) foi realizada utilizando-se soros O1 a

O175, adquiridos comercialmente (Universidade de Santiago de Compostela, Santiago

de Compostela, Espanha).

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

As amostras foram semeadas em 5 mL de TSB (Difco) e incubadas a 37°C por 18

horas. Após esse período, as amostras foram diluídas em solução salina com azida

sódica (item 8.2.1) até atingir a concentração de 1,8x10

bactéria/mL. O crescimento

bacteriano foi submetido à fervura durante 1 hora e, após o resfriamento das

suspensões, foram adicionados 2 mL de solução formalizada a 0,5% contendo violeta

genciana (item 8.2.2)

O antígeno, assim preparado, foi submetido a soroaglutinação em placas de 96

orifícios com os soros polivalentes (P1 a P24), diluídos 1:1. Após a incubação a 37°C

por 24 h, a reação foi lida, em comparação ao controle positivo, em microscópio

invertido. As suspensões antigênicas que aglutinaram com determinado soro

polivalente foram submetidas a novos ensaios com os soros monovalentes respectivos,

nas condições descritas.

3.4. Reação da polimerização em cadeia (PCR)

Os “primers” utilizados para a pesquisa dos determinantes genéticos das

amostras estudadas estão relacionados na Tabela 2.

As reações de PCR foram todas realizadas em banho de gelo, utilizando-se tubos

de polipropileno de 0,2 mL (Eppendorf, Hamburg, Alemanha), onde foram colocados

o DNA molde, obtido através de fervura de duas colônias bacterianas em 50 µL de

água destilada esterilizada durante 5 minutos e os reagentes (Invitrogen, Life

Tecnologies Inc, Gaithenesburg MD, EUA) nas seguintes concentrações: 1x tampão

PCR, 1,5 mM MgCl

(50 mM), 2mM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP,

dGTP, dTTP), 50 pmoles de cada “primer”, 1,5 U de Taq DNA Polimerase e 10 µL do

DNA bacteriano, sendo o volume completado com 50 µL de água destilada estéril.

A seguir, os tubos foram colocados em um aparelho termociclador (modelo

System 2400, Perkin Elmer Corporation, Norwalk, EUA) e a reação submetida a ciclos

específicos de amplificação para cada par de “primers” (Tabela 2). Após a amplificação,

os produtos foram analisados através de eltroforese em gel de agarose 1%,

comparando-se ao padrão de peso molecular “1Kb DNA ladder”.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.5. Extração de DNA plasmidial

3.5.1. Extração em pequena escala (“mini-prep”)

A extração do DNA plasmidial foi realizada pelo método de Birnboim & Doly

(1979).

As amostras bacterianas foram cultivadas em 3 mL de caldo LB (item 8.1.1),

contendo o antibiótico apropriado, por 16 a 18 horas sob agitação constante. Em

seguida, 1 mL das culturas foram transferidos para tubos de polipropileno e

centrifugados por 2 minutos em microcentrífuga Eppendorf



a 12.000 rpm. Após

centrifugação, os sobrenadantes foram desprezados, e as células foram ressuspensas

em 100 µL de solução I (item 8.3.3). A seguir, foram adicionados 200 µL de solução II

(item 8.3.4) e, após cuidadosa homogeneização, a suspensão foi incubada em banho

de gelo por 5 minutos. Após a adição de 150 µL de solução III (item 8.3.5), a

suspensão foi novamente incubada em banho de gelo por 10 minutos. Após a

incubação, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 12.000 rpm, o sobrenadante

foi coletado e o DNA precipitado em 2 volumes de etanol gelado. Os tubos foram

homogeneizados lentamente e mantidos a –20°C por 1 hora. Após nova centrifugação,

os tubos foram secos à temperatura ambiente e o DNA ressuspenso em 50 µL de

tampão TE (item 8.3.8) contendo RNAse A (Sigma-Aldrich, EUA) em concentração final

de 20 µg/mL e incubados a 37°C por 30 minutos.

3.5.2. Extração em larga escala (“maxi-prep”)

O kit “Qiagen Plasmid Midi Kit” (Qiagen Inc., Califórnia, EUA) foi empregado para

extração de DNA em larga escala, segundo as recomendações do fabricante.

As amostras foram cultivadas em 500 mL de caldo LB (item 8.1.1), contendo o

antibiótico apropriado. Em seguida, as culturas foram centrifugadas a 6.000 rpm por 15

minutos a 4°C em centrífuga Sorvall RC2B (Sorvall, Newtown, EUA). Os sedimentos

assim obtidos foram submetidos à extração de DNA, utilizando a coluna “Qiagen – tip

500”. Os sedimentos foram ressuspensos em 200 µL de tampão TE (item 8.3.8).

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.6. Extração de DNA genômico

A extração do DNA genômico foi realizada de acordo com Marmur et al. (1961).

A amostra bacteriana foi cultivada em 250 mL de caldo LB (item 8.1.1) e incubada

com agitação a 37°C por 16-18 horas. A seguir, a cu ltura foi centrifugada a 5.000 rpm

por 20 minutos e o sedimento ressuspenso em 20 mL de solução para suspensão

celular (item 8.4.1). Após incubação a 37°C por 5 minutos, foram adicionados 30 mL de

solução de lise (item 8.4.2), sendo a solução homogeneizada e incubada a uma

temperatura de 60°C por 2 horas. Para a extração da s proteínas foram adicionados 12

mL de uma solução de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (item 8.3.7) e mantido a

uma agitação vigorosa por 20 minutos. Após centrifugação a 10.000 rpm por 10

minutos, a fase aquosa foi coletada e repetiu-se a extração com a mistura de solventes

até não se observar mais a fase protéica. O DNA foi então precipitado com 0,6 volumes

de álcool isopropílico e 20 mL de etanol 80% gelado, ressuspenso em 20 mL de SSC

0.1X (item 8.7.3) acrescido de 1mg/mL de RNAse A (Sigma-Aldrich, EUA). Após

incubação a 37°C por 30 minutos, o DNA foi novament e precipitado por adição de 0,1

volume de acetato de sódio 3M pH 6,0 e 2 volumes de etanol 95%. O DNA foi coletado

com auxílio de um bastão de vidro e dissolvido em 3mL de tampão TE (item 8.3.8).

3.7. Determinação da concentração de DNA

Após extração, avaliaram-se a concentração e a pureza do DNA, segundo técnica

descrita por Sambrook et al. (1989).

As soluções foram diluídas em 1:60 em água e as densidades ópticas foram

determinadas em espectrofotômetro SmartSpec

3000 (Bio-Rad, Califórnia, EUA) nos

comprimentos de onda de 260 e 280 nm. As leituras em 260 nm foram empregadas no

cálculo da concentração de DNA em ng/µL ou µg/mL. A relação entre as leituras de

260 e 280 nm indicava a pureza da extração, quando os valores encontravam-se entre

1,8 e 2,0.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.8. Eletroforese de DNA em gel de agarose

Os géis de agarose foram preparados dissolvendo-se a agarose (Invitrogen, Life

Tecnologies Inc, Gaithenesburg MD, EUA) por aquecimento em tampão Tris-EDTA-

Borato 0,5X (TBE) (item 8.5.1), na concentração final de 0,7%, exceto quando indicado.

As amostras de DNA analisadas foram misturadas a 5 µL de tampão de amostra

para DNA 6X (item 8.5.2), obtendo-se um volume final de 20 µL em água, que foi

aplicado nas canaletas do gel. Como marcadores de peso molecular foram utilizados

DNA do bacteriófago λ digerido com HindIII (λ/HindIII) (Invitrogen) e “1 Kb DNA ladder”.

A corrida eletroforética foi realizada sob voltagem máxima e constante de 100

Volts em tampão TBE 0,5X. Após a corrida, o gel foi corado em solução de brometo de

etídio (5mg/mL) (item 8.5.3) por 10 a 15 minutos e observados em transluminador de

luz ultravioleta (Fotodyne), para análise visual.

3.9. Eluição dos fragmentos de DNA de gel de agarose

Após separação e visualização dos fragmentos de DNA de interesse, estes foram

eluídos do gel, empregando-se o kit “GeneClean II Kit” (Bio 101, Califórnia, EUA),

segundo recomendações do fabricante.

3.10. Reações de digestão de DNA

As reações de digestão de DNA foram realizadas em um volume final de 20 µL,

empregando-se as enzimas de restrição e seus respectivos tampões, segundo

recomendações do fabricante (Invitrogen).

3.11. Reações de ligação de DNA

As ligações entre DNA do inserto e vetor plasmidial foram efetuadas com a

utilização da enzima T4 DNA-ligase e o respectivo tampão de ligação (Invitrogen),

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

segundo recomendações do fabricante, seguindo a proporção molar 3:1 (inserto:vetor)

em volume final de 20 µL. As reações foram incubadas por 18 horas a 16 °C.

3.12. Transformação bacteriana

As células bacterianas competentes foram transformadas através de choque

térmico com DNA recombinante resultante das clonagens e através de eletroporação

com DNA plasmidial de alto peso molecular das amostras selvagens.

Após a transformação, foram adicionados 800 µL de meio SOC (item 8.6.2) à

reação, seguindo-se uma incubação por 1 hora sob agitação a 250 rpm. Em seguida,

os cultivos foram plaqueados em diferentes volumes de 50 a 200 µL em ágar LB (item

8.1.1) contendo o antibiótico apropriado para seleção.

3.12.1. Transformação através de eletroporação

As células bacterianas competentes foram transformadas através de

eletroporação, segundo metodologia descrita por Ausubel et al. (1989).

As células competentes de E. coli foram preparadas em água resfriada a 4°C e

mantidas congeladas a –70 °C em alíquotas de 200 µL de solução de glicerol a 10%.

Para a transformação, as células competentes foram descongeladas em banho de gelo

e 1 µL de DNA plasmidial foi adicionado à alíquota de células competentes. Essa

mistura foi transferida para cubetas apropriadas (0,2 cm Bio-Rad, Califórnia, EUA),

previamente resfriadas, e, em seguida, foram eletroporadas através do eletroporador

“Gene Pulser” (Bio-Rad), a 2,5 kV, 25 µF e controle de pulso de 200Ω. Após a

eletroporação, foram adicionados 800 µL de meio SOC contendo 1 mM de IPTG (para

induzir a expressão da transposase), e a mistura foi incubada a 37°C sob agitação

durante 1 hora. A seguir, foram plaqueados cerca de 100 µL e 200 µL do cultivo, em

ágar LB (item 8.1.1) contendo o antibiótico apropriado para seleção.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.12.2. Transformação através de choque térmico

As células competentes foram preparadas em tampão FB (item 8.6.1). Uma

colônia de E. coli foi semeada em 5 mL de meio LB e incubada sob agitação durante 18

horas a 37°C. Após o crescimento bacteriano, cerca de 3 mL foram semeados em 125

mL de meio LB. A mistura foi incubada sob agitação a 37°C até a DO

550

atingir valores

entre 0,5 e 0,6. A cultura foi incubada durante 10 minutos no gelo e em seguida

centrifugada por 15 minutos a 3.000 rpm a 4°C. Após ressuspensão em 20 mL de

tampão FB, as células competentes foram alíquotadas em 250 µL em tubos de

polipropileno e mantidas a –70°C até o momento do u so.

3.13. Conjugação bacteriana

A amostra bacteriana (doadora) e a receptora E. coli C600 foram cultivadas

individualmente em 3 mL de caldo LB (item 8.1.1) a 37°C por 18 horas. Após o

crescimento, ambas amostras, foram diluídas 1:100 no mesmo meio e crescidas sob

agitação a 37°C, até atingirem a concentração de 3x 10

células/mL. Foram adicionados

1 mL da amostra doadora e 1 mL da amostra receptora em um erlenmeyer de 25 mL

contendo 1 mL de caldo LB. A mistura foi incubada a 37°C por 24 horas e plaqueada

para a seleção dos transconjugantes.

Os transconjugantes foram selecionados em placas de ágar nutriente contendo

ácido nalidíxico 100 µg/mL e as drogas correspondentes às marcas de resistência da

amostra doadora.

A amostra foi diluída 1:100 e 1:10.000 em meio LB. Uma alíquota de 100 µL foi

semeada em placas contendo o antibiótioco apropriado, dependendo do perfil de

resistência da amostra doadora. Como controle, as amostras doadora e receptora

foram semeadas separadamente no mesmo meio que o da seleção. As placas foram

incubadas por 24 horas a 37°C. As colônias obtidas nas placas seletoras foram

purificadas em placas contendo as mesmas drogas utilizadas para a seleção.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.14. Cura plasmidial

3.14.1. Cura plasmidial com alaranjado de acridina

A amostra bacteriana foi cultivada caldo LB (item 8.1.1) por 16 horas a 37°C. Após

o crescimento, a cultura foi diluída até atingir a concentração de 10

bactérias/mL em

caldo LB e incubada por 3 horas com agitação. A cultura em fase logarítimica foi diluída

para uma concentração final de 10

células/mL (escala 5 de MacFarland). Alíquotas de

3mL da suspensão em salina foram distribuídas em tubos aos quais foi adicionado

alaranjado de acridina (10 µg/mL) para as concentrações finais de 25, 50, 75, 100 e

125 µg/mL. Os tubos foram cobertos com papel alumínio e incubados a 37°C por 18

horas. O crescimento bacteriano ocorrido no tubo de maior concentração de alarajado

de acridina, foi semeado em placas contendo ágar MacConkey, de modo a se obter

colônias isoladas. As colônias assim obtidas foram mantidas congeladas em caldo LB e

glicerol para análises posteriores.

3.14.2. Cura plasmidial com novobiocina

O procedimento foi o mesmo utilizado no item 3.14.1, com a substituição do

alaranjado de acridina por novobiocina na concentração de 500 µg/mL.

3.15. Transferência de DNA de células bacterianas para filtros de papel

Whatman– “Colony- blotting”

As amostras de E. coli foram inicialmente semeadas em placas de ágar

MacConkey pela técnica de semeadura de placa-mestre e incubadas a 37ºC, entre 16

a 18 horas. Em cada placa foram incluídos controle positivo (E. coli K12 albergando o

plasmídeo recombinante contendo com fragmento sonda utilizado no experimento) e

controle negativo (E. coli K12 DH5α).

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

Em seguida, um papel de filtro Whatman nº 541 (Whatman, Nova Jersey, EUA),

do mesmo diâmetro da placa, foi pressionado sobre as colônias a fim de transferi-las

para os filtros, que foram incubados por 1 hora a 37ºC.

Os filtros assim obtidos foram tratados segundo metodologia descrita por Grustein

(1975), com algumas modificações. Inicialmente, os filtros secos à temperatura

ambiente foram tratados com solução desnaturante (item 8.7.1), expostos a vapores de

água fervente por 3 minutos e novamente tratados com solução neutralizante (item

8.7.2) por 5 minutos e mantidos à temperatura ambiente até ficarem completamente

secos.

3.16. Transferência de DNA de gel de agarose para membrana de nylon –

“Southern- blotting”

Os DNAs genômico e plasmidial foram transferidos do gel de agarose para

membranas de nylon por capilaridade. Após a corrida eletroforética e visualização do

DNA em luz ultravioleta, os géis foram fotografados com câmera Polaroid, com filme

667 (Polaroid Corporation, Cambridge, MA). O DNA no gel foi tratado com solução

desnaturante (item 8.7.1) durante 45 minutos, à temperatura ambiente, sob agitação

lenta. Em seguida, o gel foi lavado várias vezes em água destilada e tratado com

solução de neutralização (item 8.7.2), nas mesmas condições utilizadas para a

desnaturação.

A transferência por capilaridade foi realizada por 16 horas, no mínimo, segundo

metodologia descrita por Sambrook et al. (1989), utilizando uma solução de SSC 6X

(item 8.7.3) e membranas de nylon positivamente carregadas (Hybond-N, Amersham

Biosciences, EUA). Após esse período, o sistema foi desmontado, e a membrana foi

lavada em solução de SSC 2X (item 8.7.3) por 20 minutos sob agitação leve e seca à

temperatura ambiente.

As membranas tiveram as regiões referentes às canaletas do gel marcadas com

lápis e foram submetidas à imobilização por luz ultravioleta no aparelho para “cross

linking UV” (UV Spectrolinker

XL1000, Spectroline, New York, USA), utilizando o

parâmetro automático para imobilização de DNA em membranas de nylon.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.17. Marcação radioativa de fragmento sonda

Os fragmentos sonda foram marcados com [α-

P]dCTP (Amersham Biosciences,

EUA), com atividade específica de 3.000 Ci/mmol, pelo método de “random-primer

extension” utilizando-se o kit “Ready To Go–DNA Labelling Beads” (dCTP) (Amersham

Biosciences, EUA), segundo as recomendações do fabricante.

Os fragmentos de DNA em concentração de 25 ng em volume de 45 µL de água

destilada foram desnaturados a 100ºC por 5 minutos e, em seguida, mantidos em gelo.

Essa solução foi transferida para os microtubos do kit, que continham a mistura de

marcação, e os tubos agitados delicadamente. Em seguida, 5 µL de [α-

P]dCTP foram

adicionados à mistura, e os tubos foram incubados a 37ºC por 10 minutos. Após esse

período, a reação foi interrompida pela adição de 5 mL de EDTA pH 8,0 (0,2 M). A

purificação dos nucleotídeos marcados não incorporados foi realizada em microcolunas

de Sepharose G50 “ProbeQuant G50 microcolumns” (Pharmacia-Biotech, New Jersey,

EUA), segundo as recomendações do fabricante. O fragmento sonda, assim obtido foi

mantido a –20ºC até o momento de sua utilização.

3.18. Hibridização de DNA com sondas radioativas

3.18.1. Hibridização dos filtros de papel Whatman

Os filtros contendo as colônias, obtidos conforme descrição no item 3.15 para

detecção dos genes pet e hly (Tabela 3) em amostras de EAEC, foram colocados em

sacos plásticos contendo solução de hibridização (item 8.7.4) durante 1 hora a 65ºC,

sob agitação lenta. Foram utilizados em média 5 mL da solução de hibridização por

filtro. Em seguida, foram adicionados à solução de hibridização aproximadamente 10

cpm/mL de sonda radioativa (item 3.17), previamente desnaturada a 100ºC por 5

minutos. Os sacos plásticos foram selados e incubados sob agitação lenta, por 18

horas a 65ºC. Após esse período, a solução de hibridização contendo a sonda

radioativa foi retirada e os filtros transferidos para recipientes plásticos para lavagens

posteriores.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

Os filtros foram lavados 2 vezes durante 30 minutos a 65ºC, sob agitação lenta,

em SSC 0,1X (item 8.7.3), acrescido de 0,1% de SDS. A seguir, os filtros foram secos a

temperatura ambiente e autoradiografados através da exposição a filmes de raios X

Kodak “X-Omat-R” (Eastman Kodak Co Nova Jersey, EUA) em cassetes apropriados

(Eastman Kodak Co.), contendo tela intensificadora, por no mínimo 24 horas a -70°C. O

filme foi revelado em revelador Kodak automático de filmes de raios X em câmara

escura.

3.18.2. Hibridização das membranas

As membranas de nylon contendo o DNA plasmidial e cromossômico foram

colocadas em garrafas de vidro, que continham solução de hibridização “Rapid-hyb

buffer” (Amersham Biosciences, EUA Pharmacia Biotech Inc, EUA) além de 100 µg/mL

de DNA desnaturado de esperma de salmão (Gibco-BRL). Foi empregado o volume de

1 mL de solução de hibridização/cm

de membrana. Em seguida, foram adicionadas às

membranas, aproximadamente 10

cpm/mL da sonda marcada, previamente

desnaturada a 100 °C por 5 minutos. As garrafas for am incubadas sob agitação lenta,

por 1 hora a 65°C em forno de hibridização, e, em s eguida, foi adicionada a sonda

radioativa. Após nova incubação de 2 horas a 65°C, as membranas foram lavadas,

secas e expostas a filmes de raios-X conforme descrito no item anterior.

3.19. Seqüenciamento e análise das seqüências de DNA

O sequenciamento automático foi realizado pelo Centro de Estudos do Genoma

Humano-USP, utilizando o sistema MegaBACE

1000 (Amersham Biosciences, EUA ).

O DNA plasmidial, preparado segundo metodologia descrita no item 3.5.2, foi digerido

com a enzima de restrição XhoI, para quantificação através do padrão de peso

molecular DNA Mass Ladder (Invitrogen). Os “primers” utilizados para as reações foram

sintetizados pela Promega (SC, Brasil) em escala de 25 nmoles.

Os programas SeqMan e MegAlign (DNASTAR) foram utilizados para alinhar

continuamente as seqüências encontradas, formando “contigs”. Mediante o

alinhamento múltiplo entre as seqüências foi possível localizar os sítios comuns e,

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

assim, a junção dos fragmentos de forma a se obter um fragmento único. Essas

seqüências foram analisadas através do programa BLAST do “National Center for

Biotechnology Information”. (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast;) (Altschul et al., 1990).

3.20. Determinação da resistência a drogas antimicrobianas

Foi utilizada a técnica descrita por Bauer & Kirby (1966), utilizando-se discos de

antibiótico de procedência Sensifar (Brasil). As drogas testadas e as concentrações dos

discos foram as seguintes: ampicilina (100 µg/mL), canamicina (30 µg/mL), cefalotina

(30 µg/mL), ciprofloxacina (5 µg/mL), cloranfenicol (25 µg/mL), estreptomicina (10

µg/mL), gentamicina (10 µg/mL), tetraciclina (20 µg/mL), sulfonamida (300 µg/mL) e

ácido nalidíxico (50 µg/mL).

As amostras bacterianas foram cultivadas em 2 mL de caldo LB (item 8.1.1) e,

após o crescimento correspondente à concentração de 1,5x10

bactérias/mL, foram

semeadas com “swab” estéril em placas de ágar Muller Hinton (Difco). Em seguida, os

discos contendo as drogas antimicrobianas foram colocados sobre a superfície do ágar

e as placas incubadas a 37°C por 18 horas.

A leitura foi realizada comparando o halo de inibição com os dados da tabela do

fabricante.

3.21. Testes de hemaglutinação

Os testes de hemaglutinação foram realizados segundo a metodologia descrita

por Evans et al. (1979). Foram utilizadas hemácias humanas do grupo A e de boi,

coelho e carneiro. As hemácias foram lavadas 3 vezes com solução tampão salina

fosfatada (PBS) (item 8.8.1) e uma suspensão de 3% de hemácias foi testada na

presença e na ausência de 1 % de D-manose (item 8.8.5).

As amostras foram cultivadas em caldo de TSB (Difco) e incubadas por 18 horas a

C. Após o crescimento, as amostras foram semeadas em placas contendo meio

Blood Agar Base (BAB) (Difco) e incubadas a 37

C até se observar o crescimento. Os

testes foram realizados em placa de vidro quadriculada à temperatura ambiente. A

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

suspensão de hemácias (20 µL) foi misturada com uma quantidade de crescimento

bacteriano, com auxílio de um palito de madeira e placa de vidro foi agitada

manualmente para a observação da aglutinação (formação de grumos).

3.22. Teste de adesão a células HEp-2

O teste de adesão a células HEp-2 foi realizado segundo a metodologia descrita

por Scaletsky et al. (1984), utilizando um único período de incubação. Para o teste as

amostras foram cultivadas em 3 mL de caldo LB (item 8.1.1), a 37°C em cultura

estática por 18 horas.

3.22.1. Cultivo das células HEp-2

O cultivo das células HEp-2 foi realizado em garrafas de plástico apropriado

(Nalge Nunc, NY, EUA) contendo 10 mL de meio mínimo essencial de Eagle,

modificado com sais de Earle (MEM) acrescido de soro fetal bovino 10% (MEM-SFB

10%) (item 8.8.2) e mantidas em estufa 37°C, sob at mosfera de 5% de CO

por 3 a 4

dias. Após esse período, o meio de cultivo foi removido e a monocamada celular lavada

com 4,5 mL de tripsina a 0,25% (item 8.8.3). Essa solução foi desprezada,

adicionando-se em seguida, 5 mL de MEM-SFB 10%, sendo feitas pipetagens

repetidas, para se obter uma suspensão celular homogênea.

O número de células viáveis foi determinado através do método de exclusão do

corante azul Tripan a 0,5% (item 8.8.4) (Schrek, 1936). A suspensão obtida foi ajustada

para uma concentração de 150.000 células/mL, através de diluição em MEM-SFB 10%

e volumes de 1 mL foram transferidos para placas de 24 orifícios (Corning,Costar,

EUA), contendo lamínulas de plástico 13 mm (Nalge Nunc, NY). A placa foi incubada a

37°C sob atmosfera de 5% de CO

por 48 horas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.22.2. Realização do teste de adesão

As monocamadas celulares confluentes foram submetidas a duas lavagens com

PBS (item 8.8.1) e acrescidas de 1 mL de MEM-SFB 2% contendo 1% de D-manose

(item 8.8.5). Uma alíquota de 40 µL da cultura bacteriana foi inoculada sobre a

monocamada celular e incubada em estufa a 37°C por 3 horas. Após esse período, o

meio de cultura foi removido e as células foram lavadas 6 vezes com PBS, fixadas com

1 mL de metanol por 15 minutos e coradas com solução May-Grünwald (item 8.8.7) por

10 minutos e, a seguir, com uma solução de Giemsa (item 8.8.8) por 20 minutos. As

lamínulas foram, então, lavadas com água corrente, secas, montadas sobre uma

lâmina de vidro e observadas ao microscópio óptico comum.

3.23. Curva de crescimento

As amostras foram cultivadas em 2 mL de caldo LB (item 8.1.1) com os

antibióticos apropriados por 16 horas a 37°C, sob a gitação. A seguir, as culturas foram

diluídas na razão 1:50 em 20 mL de caldo LB e incubadas por 30 minutos. Após esse

período, a densidade óptica (DO) foi medida em 600 nm em espectrofotômetro

SmartSpec

3000 (Bio-Rad, Califórnia, USA), sendo este considerado o tempo de

crescimento zero. Esse procedimento foi repetido até completar 220 minutos, sendo

realizadas leituras a cada 20 minutos.

3.24. Microscopia eletrônica de transmissão

Os ensaios para microscopia eletrônica foram realizados segundo Knutton (1995).

As preparações foram realizadas e examinadas pela Dra. Cecília M. Abe no

microscópio de transmissão eletrônica JEOL JEM 1200 EX II no Departmento de

Bioquímica da Universidade de Birmingham, Reino Unido, operando a 80 kV.

As amostras bacterianas foram cultivadas em placas contendo ágar LB (item

8.1.1) por 16 a 18 horas a 37°C. As bactérias foram coletadas da placa com PBS 0,1 M

(pH 7.2) (item 8.8.1), e 1 mL do crescimento foi transferido para microtubos de

polipropileno e que foram centrifugados em microcentrífuga por 3 minutos a 14.000

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

rpm. O sedimento foi novamente centrifugado e ressuspenso em 50 µL de água

destilada. A seguir, 10 µL da suspensão foi transferida para outro microtubo contendo

uma solução de 10 µL de bacitracina (50 µg/mL) juntamente com 10 µL de molibdato

de amônia a 2% . Após suave homogenização, 10 µL da mistura foram aplicados em

grades revestidas de carbono. Após 5 minutos de contato, o excesso de líquido foi

removido com o auxílio de papel de filtro e as grades secas à temperatura ambiente.

3.25. Eletroforese de proteínas em SDS-PAGE

3.25.1. Extração de proteínas por lise

As amostras foram cultivadas em diferentes meios de cultura: ágar LB (item

8.1.1), ágar MacConkey, BAB e ágar Brucella com o antibiótico apropriado a 37°C

durante 18 horas e ressuspensas em solução salina estéril (PBS pH 7.4) necessário

para obtenção de turvação correspondente à concentração 4x10

bactérias/mL. A

suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante descartado e o

sedimento ressuspenso em 200 µL de tampão de amostra e aquecido a 100°C por 10

minutos e submetida a técnica de SDS- PAGE.

3.25.2. Extração de proteínas por aquecimento

As amostras foram cultivadas em ágar LB (item 8.1.1) e ágar MacConkey com o

antibiótico apropriado a 37°C durante 18 horas e di luídas em PBS pH 7,4 (item 8.8.1)

para obtenção de turvação correspondente a concentração 4x10

bactérias/mL.

Alíquotas de 1 mL dessa suspensão foram centrifugadas a 2.500 rpm (250 g/s) por 10

minutos, e o sedimento foi ressuspenso em 160 µL de PBS pH 7,4. Após incubação, a

60°C por 30 minutos, o sobrenadante foi transferido para microtubos, adicionando-se,

então, 40 µL de tampão de amostra (item 8.9.2). A mistura foi aquecida a 100°C por 10

minutos e analisada em gel de SDS- PAGE.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.25.3. Extração de proteínas de membrana externa

A extração de proteínas de membrana externa foi realizada segundo metodologia

descrita por Achtman et al., 1983.

As amostras bacterianas foram semeadas em 100 mL de caldo TSB a 37°C

durante 16 a 18 horas, e centrifugadas em centrífuga Sorval RC 2B a 3.000 rpm

durante 20 minutos a 4°C. As culturas foram ressusp ensas em 10 mL de Tris 10 mM

pH 8,0, e as células lisadas por ultra-som em sonicador (Sonifier 450, Branson

Ultrasonics Corp., Danbry) durante 80 segundos em ciclos de 50%. Após a

centrifugação para remover as células que não foram rompidas, o sobrenadante foi

coletado e centrifugado em ultracentrífuga (Beckman, rotor Ti50) por 60 minutos a

20.000 rpm (2.000 g/s) a 4°C. A cultura foi então r essupensa em 150 mL de água

destilada e tratada com 8 volumes de uma solução contendo 1,67% de N-

lauroilsarcosina (Sigma-Aldrich, EUA) e 11,1 mM de Tris pH 7,6. Após 20 minutos à

temperatura ambiente, a mistura foi novamente centrifugada em ultracentrífuga por

20.000 rpm a 20°C durante 90 minutos. O sedimento f oi ressuspenso em 150 mL de

PBS, e cerca de 10 mL dessa suspensão foram misturados a 10 mL de tampão de

amostra 1x. A mistura foi aquecida em banho-maria a 100°C por 5 minutos e analisada

em gel de SDS-PAGE.

3.25.4. Eletroforese em SDS-PAGE

A eletroforese de proteínas foi realizada, como descrita por Laemmli et al.

(1970), utilizando-se um gel de resolução 12% (item 8.9.4) e de empacotamento 5%

(item 8.9.3). A eletroforese foi conduzida em tampão Tris-glicina (item 8.9.5) sob uma

corrente de 25 mA durante aproximadamente 5 horas. Após a corrida eletroforética, o

gel foi corado com uma solução de azul de Comassie R-250 (item 8.9.6) por 2 horas e

descorado em solução descorante (item 8.9.7) por aproximadamente 12 horas até a

visualização completa das bandas protéicas. O padrão de peso utilizado foi “Bench

Mark Protein Ladder – Pre-stained” (Invitrogen, EUA).

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

3.25.5. Sequenciamento da região N-terminal

Após a separação eletroforética em SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas

para membranas de “polyvinylidene difluoride” (PVDF-Millipore) e visualizadas através

de coloração com azul de Comassie R-250 (item 8.9.6). A seguir, a banda de interesse

foi cortada da membrana e enviada para o serviço de seqüenciamento da Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto da USP. As seqüências N-terminais da proteína foram

alinhadas com seqüências previamente conhecidas, presentes no GenBank, utilizando-

se o programa BLAST.

3.26. Métodos estatísticos

As diferenças entre a prevalência das diferentes categorias de E. coli nas

amostras provenientes de casos de diarréia e controles foram analisadas pelo uso do

teste de Qui-quadrado χ² para cálculo do valor de p. O programa Epi-info 6.02 (Dean et

al., 1991) foi utilizado para realizar os cálculos. Um valor de p < que 0.001 foi

considerado significante.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

TABELA 1. Características de amostras de Escherichia coli e vetores plasmidiais

utilizados neste estudo.

Amostra ou

plasmídeo

Características relevantes

Referência

DH5α

[supE44∆lacU169 (∅80 lacZ∆M15) hsdR17

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1] (Nal)

Sambrook et al., 1989

HB101

mcrB mrr hsdS20[r

] recA13 leuB6 ara-14

proA2 lacY1 galK2 xyl-5 mtl-1 rpsL20 supE44;

Escherichia coli híbrida B/K-12 (Sm)

Boyer & Roulland-

Dussoix, 1969

C600

thi1 thr1 leuB6 lacy1 tonA21 supA21 supE44

hsdR (Nal)

Sambrook et al., 1989

ORN103

thr1 leu-6 thi1 lacYI xyl-7, ara13 gal-6 tonA2

minA minB U169 recA13 ∆fim (Km)

Orndorff et al., 1985

pACYC184

Plasmídeo vetor de baixo número de cópias; 4,2

Kb (Cm, Tc)

Chang &Cohen, 1978

pHC79 Plasmídeo vetor cosmídeo; 6,5 Kb (Ap) Hohn, B., 1979

Ap, resistência a ampicilina; Cm, resistência a cloranfenicol; Km, resistência a canamicina; Sm, resistência à

estreptomicina; Tc, resistência à tetraciclina; Nal, resistência a ácido nalidíxico.

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

TABELA 2. “Primers” utilizados na pesquisa de determinantes genéticos de virulência

através de reações de PCR.

Determinante

de Virulência

Propriedade

codificada

Seqüência dos “primers” 5’----3’

Gene

Amplificado

Fragmento

amplificado

(bp)

Referência

bibliográfica

AAF/I

Subunidade de

AAF/I

TTAGTCTTCTATCTAGGG

AAATTAATTCCGGCATGG

aggA

450

Czeczulin et al.,

1999

AAF/II

Subunidade de

AAF/II

ACATGCATGCAAAAAATCAGAATGTTTGTT

CGGGATCCATTTGTCACAAGCTCAGC

aafA

550

Czeczulin et al.,

1997

AAF/III

Subunidade de

AAF/III

GTATCATTGCGAGTCTGGTATTCAG

GGGCTGTTATAGAGTAACTTCCAG

agg3A

462

Bernier et al.,

2002

EAST1 Enterotoxina EAST1

CCATCAACACAGTATATCCGA

GGTCGCGAGTGACGGCTTTGT

astA

111

Yamamoto &

Echeverria, 1996

AggR

Ativador de

transcrição

das AAFs

CTAATTGTACAATCGATGTA

ATGAAGTAATTCTTGAAT

aggR

308

Czeczulin et al.,

1999

Shf Proteína secretada

ACTTTCTCCCGAGACATTC

CTTTAGCGGGAGCATTCAT

shf

613

Czeczulin et al.,

1999

ShET1/pic

Enterototoxina de

Shigella/mucinase

TCACGCTACCATCAAAGA

TATCCCCCTTTGGTGGTA

shET1/pic

1.100

Okeke et al.,

2000

Irp2 Yersiniabactin

AAGGATTCGCTGTTACCGGAC

TCGTCGGGCAGCGTTTCTTCT

irp2

264

Schubert et al.,

2000

Ap58

Proteína de

membrana externa

de 58 KDa

GGATGGCGCGGGTTTCAGAGG

CCGCCGGGCATTTGTCAGA

ap58

591

Monteiro-

Neto et

al., 2003

F1A

Maior subunidade

estrutual da fímbria

do tipo 1

CAATCGTTGTTCTGTCGGCTCTCGGTC

GAAGGTCGCATCCGCATTAGCA

fimA

527 Suzart, 2000

MATERIAIS E MÉTODOS

Escherichia coli

enteroagregativa

TABELA 3. Características das sondas genéticas utilizadas na pesquisa de

determinantes genéticos de virulência associados com EAEC.

Sonda

genética

Fator de

virulência

Plasmídeo

recombinante

Enzimas de

restrição

Tamanho do

fragmento (Kb)

Referência

bibliográfica

pet

104 KDa

Citotoxina

pCEFN1

BamHI/KpnI

3,9 Eslava et al., 1998

hly

α-hemolisina

pSF4000

AvaI

7,0 Welch et al., 1983

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

4. RESULTADOS

4.1. Características das amostras de EAEC atípicas

Foram estudadas 28 amostras de EAEC atípicas, sendo 18 provenientes de casos

e 10 de controles, sendo que 21 (75%) pertenceram a 16 sorogrupos distintos (Tabela

4). A maioria das amostras era portadora de dois ou mais genes de virulência, sendo a

média dois; porém, duas amostras controles foram negativas para todos os marcadores

de virulência pesquisados. Os genes astA, pet, shf, shET/1/pic, irp2 e hly foram

encontrados mais freqüentemente em amostras isoladas de casos do que em

controles. Quatro amostras apresentaram o gene aggR e em uma delas foi encontrado

também a seqüência genética aafA e aap. A combinação dos genes astA e shf, foi

encontrada em 16 (57%) amostras e 7 (25%) amostras eram portadoras das

seqüências genéticas astA, shf e irp2.

A distribuição dos fatores de virulência entre amostras isoladas de casos e

controles está apresentada na tabela 5. Os marcadores de virulência EAST1 e Shf

foram os mais freqüentes, tendo sido ambos encontrados em 61% das amostras, e

apresentaram uma freqüência significantemente maior nos casos do que nos controles

estudados (P = 0,003 e P = 0,020, respectivamente).

4.2. Análise do perfil plasmidial das amostras de EAEC atípicas

Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) envolvido no padrão AA, foram

selecionadas 12 amostras de EAEC atípicas todas provenientes de crianças com

diarréia; essas amostras foram negativas para a sonda daaC, e não apresentavam a

seqüência genética pesquisada para o regulador de transcrição AggR. As amostras

foram submetidas à eletroforese em gel de agarose para escolha da amostra de menor

número ou ausência de plasmídeos.

A Figura 5 mostra a análise do perfil plasmidial das 12 amostras de EAEC

atípicas. Oito amostras apresentaram diferentes plasmídeos de tamanho variados,

duas apresentaram dois plasmídeos de alto peso molecular, uma amostra apresentou

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

apenas um plasmídeo de alto peso molecular, e apenas uma não possuía nenhum

plasmídeo. Duas dessas amostras foram selecionadas para estudos posteriores: a

amostra MA691-2 apresentando um único plasmídeo de alto peso molecular e a

amostra RN153-1 sem nenhum plasmídeo.

4.3. Estudos realizados com as amostras MA691-2 e RN153-1

4.3.1. Padrão de resistência a drogas antimicrobianas

As amostras MA691-2 e RN153-1 foram analisadas quanto à resistência às

seguintes drogas: ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfonamida,

gentamicina, ciprofloxacina, oflaxacina, ácido nalidíxico e canamicina. A amostra

RN153-1 apresentou resistência apenas à tetraciclina e canamicina, enquanto que a

amostra MA691-2 apresentou-se resistente à ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol,

canamicina, estreptomicina e sulfonamida.

4.3.2. Pesquisa de hemaglutininas

A pesquisa de hemaglutininas foi realizada através de hemaglutinação manose-

resistente (MRHA) com quatro tipos diferentes de hemácias, entre elas, hemácias de

coelho, boi, carneiro e de origem humana do tipo A. Ambas as amostras MA691-2 e

RN153-1 aglutinaram hemácias de carneiro e de boi. Somente a amostra RN153-1

aglutinou hemácias humanas e nenhuma das duas amostras aglutinou hemácias de

coelho na presença de manose.

4. 4. Identificação do(s) gene(s) envolvido no padrão AA da amostra MA691-2

Inicialmente, a amostra MA691-2 foi utilizada como doadora nos experimentos

de conjugação com a receptora E. coli C600, com seleção para as marcas de

resistência presente na doadora mais ácido nalidíxico. Nenhum transconjugante foi

obtido em qualquer uma das placas seletoras.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

A seguir, o DNA plasmídial foi extraído da amostra MA691-2 e transferido por

transformação para a E. coli DH5α, com seleção para as marcas de resistência

presentes na referida amostra. Não foi obtido nenhum transformante utilizando tanto a

transformação mediante choque térmico quanto a transformação através de

eletroporação.

Por último, foram feitas tentativas de curar o plasmídeo da amostra MA691-2,

utilizando os tratamentos com alaranjado de acridina e novobiocina. A amostra MA691-

2 foi cultivada na presença de diferentes concentrações de alaranjado de acridina,

sendo que a maior concentração de alaranjado de acridina onde ainda ocorreu

crescimento bacteriano foi de 100 µg/mL. Após semeadura em placa, foram analisadas

700 colônias quanto à resistência a ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, canamicina,

estreptomicina e sulfonamida e nenhuma delas apresentou qualquer sensibilidade para

qualquer uma dessas drogas. Cinco dessas colônias foram analisadas através de

eletroforese em gel de agarose, e todas apresentavam o plasmídeo de alto peso

molecular, indicando que todos os genes de resistência estavam presentes nesse

plasmídeo. Este mesmo procedimento foi realizado utilizando o tratamento com

novobiocina na concentração de 500 µg/mL em substituição ao alaranjado de acridina

e também foram observadas somente colônias resistentes a todas as drogas testadas.

4. 5. Identificação do(s) gene(s) envolvido no padrão AA da amostra RN153-1

4.5.1. Construção de biblioteca genômica em vetor cosmídeo

O vetor cosmídeo pHC79 foi empregado na construção de uma biblioteca

genômica da amostra RN153-1. Esse vetor pode ser empregado na clonagem de

fragmentos de DNA entre 15 e 30 kb para obtenção de bibliotecas genômicas e

plasmidiais (Datta et al., 1984).

O DNA genômico da amostra RN153-1 foi extraído e parcialmente digerido com a

enzima Sau3A. Foram testados diferentes tempos de digestão e diferentes

concentrações da enzima, a fim de gerar fragmentos entre 9 e 23 kb. Ao final,

escolheu-se a reação de digestão de 1 hora e 45 minutos com a enzima diluída na

razão 1:10 que apresentou maior número de fragmentos entre a faixa de 9 e 23 kb

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

(Figura 6). Esses fragmentos foram ligados ao vetor cosmídeo pHC79 linearizado com

BamHI. Após a reação de ligação, o DNA foi empregado no encapsulamento in vitro do

bacteriófago λ, utilizando o kit “Gigapack III Gold” (Stratagene, EUA) segundo as

recomendações do fabricante e transfectado em E. coli DH5α.

Para a transfecção, as células competentes obtidas através de choque térmico

foram descongeladas em banho de gelo e 3 µL do DNA ligado foram adicionados a 200

mL de células competentes. Os transductantes obtidos foram selecionados em placas

de ágar LB contendo 100 µg de ampicilina.

Foram selecionadas 960 colônias que apresentavam resistência à ampicilina,

designadas clones cosmídeos, que foram cultivadas em placas de 96 orifícios contendo

caldo LB acrescido de ampicilina e glicerol e mantidas a -70ºC. A Figura 7 ilustra o

perfil plasmidial de 7 clones cosmídeo após digestão com a enzima de restrição

BamHI.

4.5.2. Análise dos clones cosmídeos quanto à adesão a células HEp-2

Dos 960 clones obtidos, foram testados 880 quanto à adesão a células HEp-2.

Um clone recombinante, designado pVIII-F-1, apresentou o padrão AA em células HEp-

2 de maneira semelhante a amostra selvagem RN153-1 (Figura 8).

4.6. Análise do clone cosmídeo pVIII-F-1

O clone cosmídeo pVIII-F-1 foi analisado quanto a presença das seqüências

genéticas astA e shf apresentadas pela amostra selvagem RN153-1. Também foi

pesquisado o gene ap58 que codifica uma proteína de membrana externa de 58 kDa

envolvida na adesão AA de amostras de EAEC do sorotipo O111:H12 (Monteiro-Neto

et al., 2003). Como mostra a Figura 9, o clone pVIII-F-1 não apresentou nenhum

produto de PCR para os três genes pesquisados.

Um outro estudo realizado com o clone pVIII-F-1 foi verificar qual o papel da

fímbria tipo 1 na adesão AA apresentada pelo mesmo. Para tanto, a amostra de E. coli

OR103 (∆fim) foi transformada por eletroporação com o plasmídeo pVIII-F-1. As 31

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

colônias obtidas que apresentavam resistência à ampicilina foram testadas quanto à

adesão a células HEp-2, sendo verificado que todas apresentavam a capacidade de

aderir (dados não mostrados).

Com o objetivo de delimitar a região do clone pVIII-F-1 responsável pelo

fenótipo AA, o DNA plasmidial foi extraído e mapeado através de digestão com

diversas enzimas de restrição, entre elas, EcoRI, HindIII, SalI, PstI, ClaI, BamHI,

EcoRV, XbaI, ScaI, SphI, HincII, SmaI, BglII e PuvI (Figura 10). A fim de subclonar

fragmentos de DNA do cosmídeo foi realizado um “Southern blotting”, utilizando o vetor

pHC79 como sonda genética.

O tamanho do inserto foi então calculado em 21,5 kb através do corte com a

enzima EcoRI, sendo observados 3 fragmentos de tamanhos aproximados entre 11, 9

e 1,5 kb (Figura 11). Após eletroforese em gel de agarose 0,7% os três fragmentos

foram cortados do gel, eluídos e subclonados em vetor pACYC184 linearizado com a

enzima EcoRI (Figura 12).

Os três subclones obtidos foram testados quanto à capacidade de aderir a

células HEp-2. Os três subclones não apresentaram nenhuma adesão.

4.7. Mutagênese do clone pVIII-F-1 com o transposon mini-Tn10

O mini-transposon Tn10 que alberga um cassete de cloranfenicol (cat) foi

utilizado na construção de um banco de mutantes do cosmídeo pVIII-F-1 na tentativa

de identificar os genes envolvidos no fenótipo AA.

O clone pVIII-F-1 foi mutagenizado através de transformação por eletroporação

com o plasmídeo pBSL181, que alberga o transposon mini-Tn10. Foram obtidas 250

colônias que apresentavam resistência à ampicilina e ao cloranfenicol.

4.8. Análise dos mutantes obtidos através da mutagênese com o mini-Tn10

Todos os clones do banco de mutantes foram testados individualmente quanto à

adesão a células HEp-2, sendo identificados 8 mutantes não aderentes.

O DNA plasmidial desses 8 mutantes foi extraído e submetido à digestão com a

enzima EcoRI. A análise da eletroforese em gel de agarose dos fragmentos de DNA

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

obtidos mostrou dois perfis de digestão distintos, indicando serem apenas dois

mutantes diferentes (Figura 13). Os mutantes 20I e 15II foram selecionados para

experimentos posteriores.

Para confirmar se os dois mutantes possuíam apenas uma cópia do mini-Tn10, o

DNA plasmidial foi extraído e submetido à “Southern blotting” após digestão com as

diferentes enzimas de restrição BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, ScaI e BglII, utilizando

como sonda o gene de resistência a cloranfenicol. A análise do “Southern blotting”

mostrou a presença de apenas uma banda radioativa, indicando a presença de uma

única cópia do transposon inserido no DNA plasmidial (Figura 14). No mutante 20II, o

mini-Tn10 estava inserido em fragmentos de DNA de aproximadamente 1 kb até 9 kb.

No mutante 15II, o mini-Tn10 inseriu-se em fragmentos de 3 a 9 kb, sendo escolhido

para experimentos de clonagem. Este mutante foi denominado pVIII-F-1::Tn10. A

Figura 15 ilustra a adesão deste mutante a células HEp-2.

Em seguida, foi realizada uma comparação da velocidade de crescimento do

mutante pVIII-F-1::Tn10 em relação ao cosmídeo pVIII-F-1. A curva de crescimento

mostrou um crescimento semelhante para ambas as amostras, com crescimento

ligeiramente maior do mutante em relação ao cosmídeo após 140 minutos de

incubação (Figura 16). Esses dados indicam que a perda do fenótipo AA apresentada

pelo mutante estaria relacionada possivelmente à interrupção de um gene envolvido na

biogênese da adesina e não por uma eventual redução de seu crescimento.

A seguir, foi feita uma estimativa do sítio de inserção do mini-Tn10 no clone

cosmídeo pVIII-F-1. Para tanto, o DNA plasmidial do mutante pVIII-F-1 foi comparado

ao DNA do cosmídeo após digestão com diferentes enzimas de restrição, entre elas,

BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, ScaI e BglII (Figura 17). Foram encontrados fragmentos de

DNA de tamanhos variados contendo o mini-Tn10: BamHI de 3 kb, EcoRI de 5 kb,

HindIII de 5,0 kb, Pst de 6,5 kb, ScaI de 6,5 kb e BglII de 7,0 kb (Figura 18). Foi

selecionado o fragmento BamHI de 3 kb para experimentos de subclonagem e

sequenciamento.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

4.9. Seleção do fragmento BamHI de 3 kb contendo o mini-Tn10

O mutante pVIII-F-1::Tn10 foi submetido à digestão com BamHI e novamente

ligado. A mistura de ligação foi transformada em E. coli DH5α e as colônias

selecionadas em ágar LB contendo ampicilina e cloranfenicol. As colônias resistentes à

ampicilina e cloranfenicol foram analisadas em gel de agarose, sendo possível

identificar uma delas contendo apenas o fragmento BamHI de 3 kb (Figura 19). Esta

colônia denominada de clone pAZ2 foi escolhida para o seqüenciamento.

4.10. Seqüenciamento do clone pAZ2

O inserto de aproximadamente 3 kb foi submetido à reação de seqüenciamento,

utilizando um conjunto de “primers”, “forward” (Fcat) e “reverse” (Rcat), desenhados a

partir da seqüência do gene de resistência a cloranfenicol, gene cat e um conjunto de

“primers” do plasmídeo pHC79, “forward” (Fhc) e “reverse” (Rhc), desenhados a partir

do sítio de BamHI (Tabela 6).

Com os “primers” desenhados a partir do gene cat, foi obtida uma seqüência de

1.244pb. O “primer” Rcat não apresentou uma seqüência satisfatória, com diversos

intervalos entre os nucleotídeos, dificultando a análise da seqüência. Por sua vez, o

“primer” Fcat resultou em uma seqüência de aproximadamente 725 pb, onde 100 pb

correspondem a seqüências de inserção (IS) do transposon mini-Tn10 e os 625 pb

restantes ao cromossomo da E. coli. A partir da análise dessa seqüência, utilizando

“cromossomo wallking”, foi desenhado um novo “primer” denominado Fmcat (Tabela 6,

Figura 20). Através do programa DNAstar (Seqman), verificou-se que, com o primer

Fmcat foi possível seqüênciar 519 pb, que formaram um “contig” com a seqüência de

625 pb totalizando, assim, 1.244pb nucleotídeos sequenciados, localizados no sentido

“upstream” ao gene cat, permitindo assim localizar no clone pAZ2 o local de inserção

do mini-Tn10.

Com os “primers” desenhados a partir do plasmídeo pHC79, foi obtida uma

seqüência de 899 pb. O “primer” Rhc resultou em uma sequência de 442 pb

correspondente apenas ao vetor pHC79, onde não foi localizado o sítio de clonagem

BamHI. Já o “primer” Fhc resultou em uma seqüência de 457 pb, que apresentava o

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

sítio de clonagem BamHI no nucleotídeo 106 e a seguir a seqüência do clone cosmídeo

pAZ2.

O clone pAZ2 apresenta 2.624 pb seqüenciados, sendo 953 pb referentes ao

gene cat e 1.701 pb referentes a 1.244 pb,seqüenciados com os “primers” Fcat e

FMcat (Anexo 8.10.1) e 457 pb, seqüenciados com o “primer” Fhc (Anexo 8.10.2).

4.11. Análise da seqüência de 1.244 pb e da proteína deduzida

A análise dos 1.244 pb obtidos a partir do seqüenciamento do clone pAZ2 com os

“primers” Fcat e Fmcat, foi realizada utilizando-se o programa BLAST.

O BLASTN identificou o gene cat nos 100 primeiros nucleotídeos, sendo possível,

assim, localizar o sítio de inserção deste gene e a partir do nucleotídeo 102, foi

identificada homologia de 97% com uma ORF presente em E. coli K12 MG1655, E. coli

uropatogênica CFT073, Shigella flexneri 2a, outras E. coli e bactérias

enteropatogênicas. Esta ORF, denominada ygjV codifica para uma proteína de

membrana interna, uma permease com função hipotética.

De acordo com o contexto genômico analisado a partir da E. coli K12 MG1655,

nas posições 3237.000 a 3241.000, a pesquisa no banco de dados através do BLASP

identificou “dowstream” a ygjV uma outra ORF transcrita na mesma direção, com

homologia de 97% de identidade, com um sistema de transporte, que contém os genes

altronato hidrolase (uxaA) e uronato isomerase (uxaC). A Figura 21 representa o mapa

linear do fragmento de 1.244 pb do clone pAZ2, demonstrando a localização genética

da proteína ygjV, das ORFs uxaA e uxaC bem como, o sítio de inserção do gene cat.

A análise da proteína foi realizada através do BLASTX. O peptídeo deduzido a

partir da região de 1.244 bp, identificou do nucleotídeo 656 ao 108 uma proteína de 183

aminoácidos, com identidade de 91% com o COG (Clusters de Grupos Ortólogos de

Proteínas)0477 pertencente à família das permeases facilitadoras e do nucleotídeo

1244 ao 741, 98% de identidade com altronato hidrolase de Shigella flexneri,

apresentando apenas 503 aminoácidos da proteína de 495 aminoácidos (Figura 22).

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

4.12. Análise da seqüência de 899 pb e da proteína deduzida

A análise dos 899 pb obtidos a partir do seqüenciamento do clone pAZ2 com os

“primers” Fhc e Rhc, foi realizada através do programa BLAST.

A partir da análise no BLASTN da seqüência de 442pb, obtida com o “primer” Rhc,

observou-se homologia somente com o vetor pHC79, não sendo possível a

identificação do sítio de clonagem, BamHI, sugerindo assim que o “primer” pode ter

anelado em região diferente da esperada, sequenciando apenas o vetor de clonagem.

Já com o “primer” Fhc, foi revelado na seqüência de 457 pb, que os 100 primeiros

nucleotídeos possuem homologia com o vetor pHC79 e a partir do nucleotídeo 106, foi

identificada homologia de 94% com uma ORF, denominada ygjU, uma proteína de

transporte.

Ainda de acordo com o contexto genômico encontrado em E. coli K12MG1655

(Figura 21), essa ORF está localizada “upstream” a ygjV e em direção oposta. A partir

destes dados, pode ser sugerido, que o gene cat esteja inserido ao final das ORFs

ygJV e ygJU, sem interrupção das mesmas.

A análise da seqüência nucleotídica, através do BLASTX identificou do

nucleotídeo 108 ao 426 uma proteína de 414 aminoácidos. Essa proteína apresentou

identidade de 90% do aminoácido108 ao 326 e 69% do aminoácido 304 ao 426 com o

COG3633, pertencente à família dos transportadores de sódio (Figura 23).

4.13. Prevalência da sequência genética homóloga a proteína ygjV nas amostras

de EAEC atípicas

A pesquisa da proteína ygjV nas outras 27 amostras de EAEC atípicas foi

realizada através de PCR utilizando os “primers” Fmcat e RygjV (Tabela 6). O “primer”

RygjV foi desenhado a partir da seqüência da proteína. Seqüências homólogas à

proteína ygjV, presente na amostra RN153-1, foram detectadas em 17 (63%) das 27

amostras analisadas, sendo 12 (70%) isoladas de casos e 5 (50%) de controles. Todas

as 4 amostras positivas para o ativador de transcrição aggR, dentre essas, a portadora

da seqüência aafA, amplificaram a seqüência pesquisada para o gene ygjV .

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

4.14. Ensaios preliminares para caracterização fenotípica da adesina AA da

amostra RN153-1

Iniciou-se uma série de ensaios preliminares para caracterizar a adesina AA na

amostra RN153-1. Primeiramente, procurou-se verificar a presença de estruturas de

superfície através de microscopia eletrônica de transmissão após coloração negativa.

As observações de microscopia eletrônica realizadas com a amostra selvagem RN153-

1 cultivada em caldo LB sem aeração revelaram a presença de estruturas fimbriais,

com morfologia semelhante à fímbria tipo 1 (Figura 24A e 24B). Por outro lado, a

análise do clone pVIII-F-1 revelou a existência de poucas fímbrias semelhantes às

observadas anteriormente (Figura 24C e 24D).

Com o intuito de verificar a presença da fímbria do tipo 1 foi realizada uma

reação de PCR utilizando um conjunto de “primers” que reconhece o gene fimA, que

codifica a maior subunidade estrutural da fímbria do tipo 1. Ambas as amostras RN153-

1 e pVIII-F-1 amplificaram o gene fimA (dados não mostrados).

Em seguida, pesquisou-se o perfil eletroforético de proteínas das amostras

RN153-1, pVIII-F-1 e pVIII-F1::Tn10 após cultivo das mesmas em diferentes meios de

cultura e aquecimento a 60

C. A eletroforese em gel de SDS-PAGE revelou apenas

uma proteína de aproximadamente 25 KDa predominante somente nos extratos

proteícos aquecidos do mutante pVIII-F-1::Tn10 cultivado em ágar LB (Figura 25).

Como não foi possível visualizar uma proteína bacteriana com potencial de

adesina, pesquisou-se então a presença de proteínas de membrana externa,

envolvidas na adesão AA. Esse estudo foi feito comparando-se o perfil eletroforético de

proteínas de membrana externa da amostra RN153-1 ao de uma amostra de mesmo

sorogrupo, mas não aderente. A amostra selecionada, E. coli 213-1 de sorogupo O126

pertencia à bacterioteca da Prof. Dra. Isabel Scaletsky.

A análise dos componentes da preparação de membrana externa das duas

amostras revelou uma proteína de aproximadamente 85 kDa presente na amostra

RN153-1 e ausente na amostra 213-1 (Figura 26).

A proteína de 85 kDa foi purificada a partir de preparações de membrana

externa da amostra RN153-1 cultivada em ágar LB. Foram obtidos cerca de 200 mg de

proteína, sendo que esta fração foi concentrada, separada por SDS-PAGE e transferida

para uma membrana de PVDF. A banda equivalente ao peso de 85 KDa foi localizada

e submetida à determinação da seqüência de aminoácidos da região N-terminal.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

A comparação da seqüência dos 19 aminoácidos realizada através do programa

BLASTP indicou que ela apresentava uma identidade de 71% com a proteína flagelina

de E. coli (Figura 27).

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

TABELA 4. Distribuição dos fatores de virulência plasmidial e cromossômico em 28

amostras de EAEC atípica, isoladas de crianças com e sem diarréia através de PCR

ou sonda genética.

Genes plasmidiais

Genes cromossômicos

Amostras de

EAEC

Sorogrupo

sorotipo

aggA

aafA

agg3A

aggR aap astA pet shf

shET1/pic

irp2 hly

Casos

RN731-5

O3 - - - - - - + -

- + +

SC385-5 O42 - - - - - + - +

- - -

HSP53-1 O42 - - - + - - - -

- - -

SC319-3 O49:NM - - - - - + - +

+ + -

RN779-4 O54 - - - - - + - +

+ - -

SC289-3

O86:NM - - - - - + - +

- - -

SC323-4 O89NM - - - - - + - +

- + -

MA701-1 O98 - - - - - + - +

- - -

RN453-1 O117 - - - + - + + +

- + -

RN741-5 O126:NM - - - - - + - +

- + -

RN153-1 O126 - - - - - + - +

- - -

RN771-5 O162:NM - - - - - + - +

- - -

RN749-9 O162 - - - - - + + +

- + -

HD137-10

1011010

ONT - - - - - + + +

+ + -

RN767-7

ONT - - - - - - + -

+ - +

RN751-9 ONT - - - - - + + +

+ + -

SC373-4 ONT - + - + + + + +

- - -

MA691-2 ONT - - - - - + - -

- - -

Controles

SC358-1 O6:NM - - - - - - + -

- - +

SC378-3

O28 - - - + - + - +

- - -

SC730-1 O49 - - - - - - + -

- - -

RN406-5 O52 - - - - - - - -

+ - -

MA558-7 O66:NM - - - - - - - +

- + -

RN772-3 O89 - - - - - + - +

- - -

RN502-1

O141 - - - - - - - -

- - -

RN582-3 O174:NM - - - - - - + -

- - -

SC796-1 ONT - - - - - - - -

- + -

SC798-4 ONT - - - - - - - -

- - -

daaC positiva

NM, não movel NT, não tipavel.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

TABELA 5. Distribuição dos fatores de virulência entre as amostras de EAEC atípica,

isoladas de casos e controles.

Nº (%) de isolados de EAEC atípica

Fator de

Virulência

Casos

(n = 18)

Controles

(n = 10)

Total

(n = 28)

AAF/I 0 0 0

AAF/II 1 (5) 0 1 (3.6)

AAF/III 0 0 0

AggR 3 (17) 1 (10) 4 (14)

Aap 1 (5) 0 1 (3.6)

EAST1 15 (83) 2 (20)

17 (61)

Pet 7 (39) 3 (30) 10 (36)

Shf 14 (78) 3 (30)

17 (61)

ShET1/Pic 5 (28) 1 (10) 6 (21)

Irp2 8 (44) 2 (20) 10 (36)

Hly 2 (11) 1 (10) 3 (11)

Significância de P = 0.003, foi determinado por χ

, teste.

Significância de P = 0.020, foi determinado por χ

, teste.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

TABELA 6. Seqüências nucleotídicas dos “primers” utilizados no seqüenciamento do

clone pAZ2.

“Primers” Seqüência (5’----3’)

Fhc (Forward pHC79) AAGTGCCACCTGACGTCTAAGAA

Rhc (Reverse pHC79) CCACCATACCCACGCCGAAACAAG

Fcat (Forward do gene cloranfenicol) TAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAAC

Rcat (Reverse do gene cloranfenicol) CGAAGTGATCTTCCGTCACA

FMcat (Forward da seqüência de 725pb) TACCAATCAGAAAGGCGA

RygjV(Reverse do gene ygjV) GCGGGCTGCCATATGGTGCTGTT

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 5. Perfil plasmidial de 12 amostras de EAEC atípica, isoladas de crianças com

diarréia. Canaletas: A, SC385-5; B, SC319-3; C, RN153-1; D, SC323-4; E, RN779-4; F,

MA701-1; G, RN741-5; H, RN771-5; I, RN749-9; J, HD137-10; K, RN751-9; L, MA691-

2. As setas indicam as amostras RN153-1 e MA691-2.

A B C D E F G H I J K L

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 6. Gel de agarose 0,7% do DNA genômico da amostra RN153-1 digerido com

a enzima de restrição Sau3A diluída na razão 1:10 utilizando diferentes tempos de

digestão. Canaletas: A, Padrão de peso molecular λ/HindIII; B, 1 h; C, 1:30 h; D, 1:45 h.

A B C D

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 7. Gel de agarose 0,7% do DNA plasmidial de sete clones cosmídeo, obtidos

na construção da genoteca com a amostra RN153-1, após digestão com a enzima de

restrição BamHI. Canaletas: A, Padrão de peso molecular λ/HindIII; B a H, sete

diferentes clones cosmídeo.

A B C D E F G H

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 8. Padrões de adesão às células HEp-2 em ensaio de 3 h apresentados pela

EAEC RN153-1 (A) e pelo clone cosmídeo pVIII-F-1 (B).

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

ap58 astA shf

FIGURA 9. Gel de agarose 1%. PCR para amplificação dos genes shf, astA e ap58.

Canaletas: A, padrão de peso molecular “100 pb DNA ladder”; B, EAEC 236 (controle

positivo para ap58); F e J, EAEC 17-2 (controle positivo para astA e shf); C, G, K,

RN153-1; D, H e L, clone pVIII-F-1; E, I, M, E. coli DH5α.

A B C D E F G H I J K L M

613 pb

591 pb

111 pb

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 10. Gel de agarose a 0,7% do DNA plasmidial do clone cosmídeo pVIII-F-1,

após digestão com diferentes enzimas de restrição. Canaletas: A, Padrão de peso

molecular λ/HindIII; B, clone pVIII-F-1 não digerido; C, EcoRI; D, HindIII; E, SalI; F,

PstI; G, ClaI; H, BamHI; I, EcoRV; J, XbaI; K, ScaI; L, SphI; M, HincII; N, SmaI; O, BglII;

P, PvuI. As setas indicam os fragmentos EcoRI de 11, 9 e 1,5 kb.

A B C D E F G H I J K L M N O P

11 kb

9 kb

1,5 kb

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 11. (A) Gel de agarose 0,7% do DNA plasmidial do clone pVIII-F-1 após

digestão com diferentes enzimas de restrição. Canaletas: A, Padrão de peso molecular

λ/HindIII; B, EcoRI; C, EcoRV; D, ScaI; E, BglII; F, pVIII-F-1 não digerido; G, vetor

pHC79 digerido com BamHI. (B) “Southern blotting” do gel com a sonda pHC79

marcada com [α-

P]dCTP. A seta indica a localização do vetor nos fragmentos de

DNA.

A B C D E F G

pHC79

A’ B’ C’ D’ E’ F’ G’

pHC79

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 12. Gel de agarose 0,7% do DNA plasmidial dos subclones do cosmídeo

pVIII-F-1, após digestão com a enzima de restrição EcoRI, em vetor pACYC184.

Canaletas: A, pVIII-F-1; B, pACYC184; C, fragmento de 1,5 kb; D, fragmento de 11 kb;

E, fragmento de 9 kb.

A B C D E

11 kb

9 kb

pACYC184

1,5 kb

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 13. Gel de agarose 0,7% do DNA plasmidial de 8 mutantes, obtidos através

da mutagênese do clone cosmídeo pVIII-F-1, com o transposon mini-Tn10, após

digestão com a enzima de restrição EcoRI. Canaletas: A, 20I; B, 15II; C, 24II; D, 68II; E,

9III; F, 17III; G, 32III; H, 34III.

A B C D E F G H

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 14. (A) Gel de agarose 0.7% do DNA plasmidial dos mutantes 20I e 15II após

com digestão com diferentes enzimas de restrição. Canaletas: A, padrão de peso

molecular λ/HindIII; B, 20I/BamHI; C, 15II/BamHI; D, 20I/EcoRI; E, 15II/EcoRI; F,

20I/HindIII; G, 15II/HindIII; H, 20I/PstI; I, 15II/PstI; J, 20I/ScaI; K, 15II/ScaI; L, 20I/BglII;

M, 15II/BglII; N, pBSL181. (B) “Southern blotting” do gel com a sonda pBSL181

marcada com [α-

P]dCTP.

A B C D E F G H I J K L M N

B’ C’ D’ E’ F’ G’ H’ I’ J’ K’ L’ M’ N’

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 15. Padrões de adesão a células HEp-2 apresentados pelo clone cosmídeo

pVIII-F-1(A) e mutante pVIII-F-1::Tn10 (B).

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

Curva de Crescimento

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Tempo

DO600

Clone

Mutante

FIGURA 16. Gráfico da curva de crescimento do clone-cosmídeo pVIII-F-1 e do

mutante pVIII-F-1::Tn10.

(minutos)

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 17. Gel de agarose 0.7% do DNA plasmidial do cosmídeo pVIII-F-1 e mutante

pVIII-F-1::Tn10 após digestão com diferentes enzimas de restrição. Canaletas: A,

padrão de peso molecular λ/HindIII; B e C; BamHI; D e E, EcoRI; F e G, HindIII; H e I,

PstI; J e K, ScaI; L e M, BglII.

A B C D E F G H I J K L M

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 18. (A) Gel de agarose 0.7% do DNA plasmidial do mutante pVIII-F-1::Tn1

após digestão com diferentes enzimas de restrição. Canaletas: A e A’, padrão de peso

molecular λ/HindIII; B e B’, EcoRI; C e C’, BamHI; D e D’, HindIII; E e E’, PstI; F e F’,

ScaI; G e G’, BglII; H e H’, ClaI; I e I’, EcoRV; J e J’, pBSL181. (B) “Southern blotting”

do gel com a sonda pBSL181 marcada com [α-

P]dCTP.

A B C D E F G H I J

3 kb

A’ B’ C’ D’ E’ F’ G’ H’ I’ J’

3 kb

5 kb

6,5 kb

7 kb

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 19. Gel de agarose 0,7% do DNA plasmidial do mutante pVIII-F-1::Tn10 e do

clone pAZ2 após digestão com a enzima de restrição BamHI. Canaletas: A, padrão de

peso molecular λ/HindIII; B, pVIII-F-1::Tn10; C, pAZ2.

A B C

pHC79

3 kb

pAZ2

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 20. Representação esquemática da localização dos “primers” construídos

para o seqüenciamento do clone pAZ2.

Seqüência – 725 pb

IS – 100 pb

cat - 953 pb

Fragmento de 3 Kb

B B

625 pb

FMcat

B B

Fcat

CAT

953 pb

Rcat

IS IS

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 21. (A) Mapa linear das seqüências obtidas através do sequenciamento do

clone pAZ2, as setas sólidas representam as ORFs encontradas no sequenciamento e

as setas pontilhadas representam as ORFs de acordo com o contexto genômico de E.

coli K12 MG1655. (B) Representação do “locus” gênico da ORF ygjV no genoma da E.

coli K12 MG1655, demonstrando o local de inserção do gene cat e proteína transcrita.

Região Genômica e Produtos Transcritos

Contexto Genômico

Fcat

Rcat

CAT

Fcat

FMcat

ygjV

uxaA

ygjU

cat

457 pb

725 pb

519 pb

1244 pb

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 22. (A) BLASTX da seqüência de 1.244 pb, obtida a partir do seqüênciamento

do clone pAZ2. (B) Representação da seqüência de aminoácidos deduzida.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 23. (A) BLASTX da seqüência de 457 pb, obtida a partir do sequenciamento

do clone pAZ2 com o “primer” Rhc. (B) Seqüência de aminoácidos do peptídeo

deduzido.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 24. Microscopia eletrônica de transmissão após coloração negativa. (A, B)

Amostra RN153-1 apresentando estruturas fimbriais, com morfologia semelhante a

fímbria tipo 1; (C, D) Clone cosmídeo pVIII-F-1 apresentando poucas fímbrias

semelhantes as encontradas na amostra RN153-1.

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 25. Gel de SDS-PAGE a 12% de proteínas extraídas por lise (A a F) e por

aquecimento (A’ a F’). Canaletas: A, A’, EAEC 042; B, B’, RN153-1; C, C’, EAEC 17-2;

D, D’, clone pVIII-F-1; E, E’, mutante pVIII-F-1::Tn10; F, F’, E. coli DH5α; G, padrão de

peso molecular.

A B C D E F G A’ B’ C’ D’ E’ F’

~ 25 kDa

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 26. Gel de SDS-PAGE das proteínas de membrana externa (OMP) das

amostras RN153-1 e 213-1 (não aderente), diluídas em PBS. Canaletas: A, RN153-1

(diluição 1:1); B, 213-1 (diluição 1:1); C, RN153-1 (diluição 1:2); D, 213-1 (diluição 1:2);

E, padrão de peso molecular ; F, RN153-1 (diluição 1:3); G, 213-1 (diluição 1:3).

A B C D E F G

85 kDa

RESULTADOS

Escherichia coli

enteroagregativa

FIGURA 27. BLASTP da região N-terminal seqüenciada a partir da proteína de

aproximadamente 85 kDa, obtida através da extração de OMPs da amostra RN153-1.

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

5. DISCUSSÃO

A EAEC está emergindo como um importante patógeno bacteriano envolvido em

casos de diarréia em nosso meio e está associada a vários surtos recentes de infecção

intestinal (Germani et al., 1998; Okeke et al., 2000; Scaletsky et al., 2002; Okeke et

al.,2003; Sarantuya et al., 2004). Amostras de EAEC são detectadas pelo padrão AA a

células HEp-2 e pela sonda genética AA. A maioria dos estudos sobre mecanismos de

virulência de EAEC compreende amostras que apresentam o padrão de adesão

agregativo e reagem com a sonda AA, sendo consideradas como amostras de EAEC

típicas. Pouco se conhece, entretanto, sobre a presença de potenciais fatores de

virulência em amostras de EAEC sonda-negativas, descritas no presente trabalho

como EAEC atípicas.

O presente estudo foi realizado com o objetivo de contribuir para o esclarecimento

das características de virulência que possam influenciar no papel enteropatogênico das

EAEC atípicas. Para tanto, uma coleção de 28 amostras de EAEC atípica, provenientes

de fezes de crianças com ou sem diarréia aguda, caracterizadas pelo padrão de

adesão AA a células HEp-2, foi analisada com relação aos marcadores genotípicos

envolvidos na patogênese das EAEC típicas.

Os estudos iniciais envolveram a pesquisa de 11 seqüências genéticas

associadas a fatores de virulência codificados por genes plasmidiais, como as adesinas

fimbriais AAF/I, AAF/II e AAF/III, as toxinas Pet e EAST1, o regulador de transcrição

AggR e as proteínas Aap e Shf, e por genes cromossômicos, tais como ShET1/pic, Irp2

e Hly nas 28 amostras de EAEC atípicas.

A pesquisa dos diferentes marcadores genéticos de virulência realizada através

de ensaios de PCR e hibridização de colônias mostrou que, com exceção de uma

amostra, todas as demais transportavam pelo menos uma das 11 sequências genéticas

pesquisadas.

Entre as amostras estudadas, os marcadores genéticos codificados por genes

plasmidiais, astA, relacionada a produção de EAST1, e shf associada a uma ORF

críptica, foram encontrados significantemente associados à diarréia (P =0.003 e P=

0.020, respectivamente).

No presente estudo, 61% das amostras transportavam o gene astA. Elias et al.

(2002), observaram freqüência semelhante desse gene entre amostras de EAEC

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

atípica, sendo, entretanto, EAST1 detectada mais frequentemente em amostras

isoladas de controles do que de pacientes. Okeke et al. (2000) e Rich et al. (1999)

detectaram EAST1 em 23 e 45% de amostras de EAEC, respectivamente, porém não

foi encontrada nenhuma correlação entre a presença de EAST1 e diarréia. O gene astA

está presente não apenas em EAEC, mas também em amostras de E. coli

enteropatogênica, enterotoxigênica, enteroinvasoras e produtoras de toxina de Shiga

(Vial et al., 1988; De Sousa et al., 2001; Yatsuyanagi et al., 2003). Entretanto, o

verdadeiro papel de EAST1 na patogênese da infecção causada por E. coli ainda não

foi esclarecido.

O gene shf também foi detectado em 61% das amostras EAEC estudadas. Este

gene codifica uma ORF críptica que apresenta uma identidade de 25% com a proteína

IcaB de Staphylococcus epidermidis, que está implicada na adesão intercelular

(Heilmann et al., 1996). Seu papel na patogenese de EAEC, no entanto, ainda não foi

esclarecido. Alguns trabalhos têm demonstrado a presença deste gene em pequeno

número de amostras de EAEC atípica (Czeczulin et al., 1997; Elias et al., 2002).

A presença da seqüência aggR, regulador de transcrição das fímbrias AAF/I e

AAF/II, foi encontrada em 4 amostras, sendo três isoladas de casos e uma de controle.

Uma destas amostras era portadora da seqüência aafA, relacionada à adesina AAF/II.

Jiang et al. (2002) associaram a presença de aggR, quando relacionado a outros

fatores de virulência, a presença de sintomas entéricos, particularmente causando

inflamação intestinal. Recentemente, Dudley et al. demonstraram que o regulon AggR

não é restrito ao plasmídeo pAA. Além de regular genes deste plasmídeo, também

regula um operon cromossômico inserido numa ilha de patogenicidade no locus pheU

(citado por Harrington et al., 2006).

A presença dos marcadores genéticos Pet, EAST1, Shf, ShET1/Pic e Irp2

observada no presente estudo parece ser uma característica comum à categoria de

EAEC, presente tanto em amostras de EAEC típicas como atípicas. Elias et al. (2002)

estudando amostras de EAEC isoladas de casos e controles, também observaram a

ocorrência desses mesmos marcadores em amostras de EAEC atípica. Bouzari et al.

(2001) também verificaram que em amostras de casos de diarréia, EAEC atípicas

compartilhavam fatores de virulência com as amostras de EAEC típicas, porém

apresentavam para os genes astA e aafA, uma diferença estatística; sendo mais

freqüentemente encontrados em amostras típicas do que em atípicas.

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

A maioria das amostras EAEC estudadas reagiu com um dos 175 antissoros

utilizados, enquanto que outros pesquisadores têm mostrado um grande número de

amostras de EAEC apresentando o antígeno O não tipável (Itoh et al., 1997; Vial et al.,

1988). A diversidade de sorotipos encontrada no presente estudo e a aparente falta de

uma correlação entre um sorotipo particular e a presença de um fator de virulência

também particular, sugere que vários clones de EAEC atípica seriam responsáveis pela

diarréia nas diferentes cidades brasileiras. Também é interessante ressaltar que alguns

sorogrupos como O42 e O126 foram mais freqüentes e detectados apenas em

amostras provenientes de crianças com diarréia. A presença desses sorogrupos em

outras amostras de EAEC de diversas origens sugere a possibilidade dos mesmos

servirem como marcadores para discriminar amostras verdadeiramente patogênicas

(Qadri et al., 1994; Kawano et al., 1998; Shazberg et al., 2003).

A adesão aos tecidos do hospedeiro é uma etapa complexa e essencial para o

estabelecimento das doenças infecciosas bacterianas de mucosas (Finlay & Falkow,

1997). Em muitos casos, ela é mediada por duas ou mais adesinas que podem atuar

simultaneamente ou em estágios distintos de um processo de interação com a célula

eucariótica (Knutton et al., 1998; Henderson, et al., 1999). No que concerne às EAEC,

as pesquisas realizadas por Nataro et al. (1992) e por Czeczulin et al. (1997)

resultaram na caracterização molecular das fimbrias AAF/I e AAF/II, respectivamente,

em amostras distintas, e em estudos recentes foi caracterizada a AAF/III (Bernier et al.,

2002). Essas fímbrias estão associadas ao padrão AA, muito embora as pesquisas dos

genes estruturais das mesmas, em amostras de EAEC em diferentes países, tenham

demonstrado que muitas amostras não as possuíam (Czeczulim et al., 1997; Elias et

al., 1999).

A etapa seguinte no presente estudo foi a tentativa de caracterizar a adesina

responsável pelo fenótipo AA das amostras de EAEC atípicas. Esse estudo teve início

com a escolha da amostra para caracterização de uma possível nova adesina AA. Para

tanto, 12 amostras provenientes de crianças com diarréia foram submetidas à análise

eletroforética e os perfis plasmidiais obtidos mostraram presença de diversos

plasmídeos com pesos moleculares variáveis em 10 das amostras estudadas. Duas

amostras, a amostra MA691-2 apresentando um único plasmídeo de alto peso

molecular e uma outra amostra, a RN153-1, sem nenhum plasmídeo, foram

selecionadas para os estudos genéticos.

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

As amostras MA691-2 e RN153-1 foram analisadas quanto à resistência às

diferentes drogas, sendo encontrada uma resistência múltipla na amostra MA691-2.

Estas duas amostras também foram submetidas a ensaios de hemaglutinação

utilizados na identificação e caracterização de diferentes tipos de adesinas bacterianas.

As duas amostras analisadas apresentaram atividade hemaglutinante manose-

resistente (MRHA) semelhante, aglutinando em pelo menos dois eritrócitos dos 4 tipos

de eritrócitos testados (humano do grupo A, coelho, bovino e carneiro). A presença de

atividade MRHA nas duas amostras é um achado interessante, pois sugere a

ocorrência de uma adesina diferente da fimbria tipo 1 possivelmente associada ao

fenótipo AA. De fato, uma das amostras a RN153-1 também era portadora de

estruturas de superfície semelhantes à fímbria tipo 1, conforme visualizado em MET e

apresentou o gene fimA, que codifica uma subunidade da fímbria tipo 1.

Como os genes que codificam as adesinas fimbriais AAFs estão associadas à

presença de um plasmídeo de alto peso molecular, pensou-se que os genes envolvidos

no fenótipo AA da amostra MA691-2 também poderiam estar presentes em tal

plasmídeo. Para tanto, foram realizados experimentos de transformação e conjugação

na tentativa de transferir este plasmídeo de alto peso molecular para uma amostra de

E. coli K12 não aderente. Os experimentos de conjugação realizados mostraram que

esse plasmídeo não é conjugativo e tampouco passível de ser transferido,

possivelmente pelo seu alto peso molecular. Também tratamentos com alaranjado de

acridina e novobiocina não resultaram em perda do referido plasmídeo. A última

tentativa de identificar os genes envolvidos no padrão AA da amostra MA691-2 seria a

construção de um banco de mutantes utilizando um transposon. Como a amostra

MA691-2, porém, apresentou resistência a drogas comum a maioria dos plasmídeos

que alberga os transposons, não foi possível realizar quaisquer experimento de

mutagênese.

Como a maioria das adesinas conhecidas é codificada por genes plasmidiais,

resolvemos investigar os determinantes genéticos de adesão da amostra RN153-1,

posto que, esta amostra não apresentava nenhum plasmídeo, caracterizando assim um

dado novo. Uma biblioteca genômica foi construída a partir desta amostra e o clone

denominado de pVIII-F-1 foi selecionado por apresentar um padrão de adesão muito

semelhante ao da amostra selvagem. Mediante a análise com a enzima de restrição

EcoRI, estimou-se o tamanho do inserto em 21,5 kb. Na subclonagem dos fragmentos

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

gerados por esta enzima de restrição, nenhum dos subclones obtidos foi capaz de

reproduzir o fenótipo AA. Isto provavelmente se deva ao fato de que os sítios para esta

enzima possam estar localizados dentro do gene e, interferindo, conseqüentemente, na

transcrição do mesmo.

A mutagênese empregando o transposon mini-Tn10 foi utilizada, para selecionar

mutantes não aderentes. A análise de um banco de mutantes em teste de adesão

levou à identificação de um mutante denominado de pVIII-F-1::Tn10 que perdeu a

capacidade de aderir a células HEp-2. O DNA flanqueado pela inserção do transposon

foi clonado, e o clone obtido, pAZ2, sequenciado.

O clone pAZ2 apresenta 2.624 pb seqüenciados a partir de “primers” desenhados

do vetor de clonagem pHC79 e do gene de cloranfenicol. A análise da seqüência de

nucleotídeos do fragmento de 3 kb do clone pAZ2 revelou a presença de três regiões

de 953 pb, 1.244 pb e 457 pb. A região de 953 pb correspondia ao gene de

resistência a cloranfenicol (cat), originado do transposon mini-Tn10 e duas regiões,

uma de 1.244 pb e a outra de 457pb, correspondentes às seqüências do clone pAZ2,

as quais, foram analisadas através do programa BLAST.

A análise da região de 1.244 pb a partir do BLASTn revelou a presença do gene

cat nos 100 primeiros nucleotídeos; a partir do nucleotídeo 102, foi identificada uma

homologia de 97% com uma ORF presente em E. coli K12 MG1655 (GenBank n°

U00096), E. coli uropatogênica CFT073 (GenBank n° AE014075), Shigella flexneri 2a

(GenBank n°AE005674), outras E. coli e bactérias enteropatogênicas. Esta ORF,

denominada ygjV, codifica para uma proteína de membrana interna, uma permease

com função hipotética. De acordo com o contexto genômico analisado a partir da E. coli

K12 MG1655, nas posições 3237.000 a 3241.000, a pesquisa no banco de dados

através do BLASP identificou “dowstream” à ygjV uma outra ORF transcrita na mesma

direção, com homologia de 97% de identidade, com um sistema de transporte, que

contém os genes altronato hidrolase (uxaA) e uronato isomerase (uxaC) (Portalier et

al., 1981; Ritzenthaler et al., 1981). A análise do peptídeo deduzido a partir desta

região, apresentou identidade de 91% com o COG 0477 pertencente à família das

permeases facilitadoras e 98% de identidade com altronato hidrolase de Shigella

flexner.

A análise da região de 457 pb revelou que os 100 primeiros nucleotídeos

possuem homologia com o vetor pHC79 e a partir do nucleotídeo 106, foi identificada

homologia de 94% com uma ORF, denominada ygjU, uma proteína de transporte e que

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

de acordo com o contexto genômico encontrado em E. coli K12MG1655 (GenBank

n°U00096) essa ORF está localizada “upstream” a ygjV, e em direção oposta. O gene

ygjU localizado “upstream” à ORF ygjV codifica uma serina transportadora e é

responsável pelo transporte de íons sódio para dentro da célula bacteriana. A análise

da seqüência nucleotídica, através do BLASTX identificou do nucleotídeo 108 ao 426

uma proteína de 414 aminoácidos. Essa proteína apresentou identidade de 90% e

69% com o COG3633, pertencente à família dos transportadores de sódio.

O fato da ORF ygjV ter sido encontrada em nosso trabalho, assim como, em

diversas bactérias enteropatogênicas, é concordante a outros estudos realizados a

partir da seqüência completa do genoma da E. coli uropatogênica CFT073 (Welch et

al., 2002), tendo em vista, que várias E. coli patogênicas e não patogênicas envolvem

um complexo processo de definição genética, a partir de transferência horizontal de

diversos genes cromossômicos e plasmidiais. O DNA de cada patótipo de E. coli pode

ter sido constituído freqüentemente de perda ou ganho de genes acessórios, sugerindo

uma cuidadosa reconsideração para definição de fenótipos e mapas genéticos de

enterobactérias e bactérias extraintestinais como já assinalado por Welch et al., 2002.

Um estudo desenvolvido por Rodionov et al. 2004 sugere, ainda, que muitas

permeases que participam da captação de carboidratos, podem estar sob o controle de

KgdR, um regulon da família das gama-proteobactérias, restrito para o controle de

genes envolvidos no catabolismo e que está presente em enterobactérias de diversas

espécies. Rodinov et al. 2004, demonstraram, ainda, que o sítio de ligação do regulon

KdgR está localizado, entre os genes uxaA e ygjV, imediatamente após um operon uxa.

Em nosso trabalho, de acordo com o genoma de E. coli K12, o gene ygjV está

localizado “dowstream” a um “cluster” de genes relacionados a transporte de

catabólitos, denominado uxaAC, sugerindo assim que este regulon pode estar presente

no genoma da amostra RN153-1.

Analisando-se a região de 1.244 pb, o transposon mini-Tn10, foi inserido entre os

genes ygjU e ygjV, porém não houve comprometimento da tradução dessas ORFs,

uma vez que sua inserção foi ao final de ambas. A inserção do mini-Tn10 pode estar

interrompendo a sinalização dos genes responsáveis pelo transporte de catabólitos,

que sejam, indispensáveis para a transcrição de proteínas capazes de conferir um

potencial de virulência à amostra. Estes dados indicam que a adesão agregativa da

amostra em estudo pode estar sendo mediada por outros fatores ainda não descritos.

Nossos achados, porém, sugerem que a permease YgjV pode estar relacionada ao

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

processo de patogênese da E. coli enteroagregativa, uma vez que esta perdeu sua

capacidade de aderência, quando o transposon foi inserido ao final da ORF ygjV.

De acordo com Cundell et al. (1995), para muitas bactérias patogênicas, proteínas

exportadas são determinantes de virulência que participam de processos de aderência

em células eucarióticas, sendo importantes para a sobrevivência bacteriana, não

somente por manter a função celular normal, mas também servindo de determinante de

virulência, seja mediando a aderência e colonização na superfície celular, seja

protegendo a bactéria da resposta imune do hospedeiro.

Utilizando uma estratégia genética baseada na fusão de genes bacterianos à

fosfatase alcalina, foram obtidas bactérias defectivas em proteínas de exportação e foi

demonstrado em Streptococcus pneumoniae que a mutação do locus plpA e ami

(Pearce et al., 1994; Alloing et al., 1989), que codificam para permeases, revela uma

diminuição de 50% a 60% na aderência e uma diminuição do receptor GalNAcβ1-4Gal

em células epiteliais. O locus ami é similar a operons que codificam proteínas de

transporte em bactérias gram-negativas (Alloing et al., 1990). Diferentes dados

apontam para o fato de que os membros da família das permeases ligam e transportam

pequenos peptídeos através da membrana bacteriana presumidamente para utilização

no metabolismo (Alloing et al., 1994; Sicard et al., 1994). No estudo desenvolvido por

Cundell et al (1995), é sugerido ainda que a classe das permeases tanto em

organismos gram-negativos quanto em gram-positivos, modula diretamente a

sinalização celular de vários processos bacterianos e também a quimiotaxia em

Salmonella typhimurium e E. coli. (Manson et al. 1986; Abouhamad et al., 1991).

As permeases relacionadas por Cundell et al. (1995), medeiam distintas

propriedades de aderência dos pneumococos diretamente pela ligação e transporte das

moléculas de sinalização celular que alteram a regulação da expressão dos ligantes.

Este estudo não elimina a possibilidade de que essas permeases sejam moléculas

estruturais que se ligam diretamente em células eucarióticas. Já em 1994, Tane et al.

mostraram que oligopeptídeos-ligantes de proteína (OppA), homólogos em E. coli,

ligam peptídeos indiscriminadamente, podendo ligar-se em receptores glicoprotéicos na

superfície da célula eucariótica.

Estudos recentes revelam ainda que uma permease, descrita em Neisseria

meningitidis é requerida na colonização do tecido nasofaríngeo, na doença

meningocócica. N. meningitidis deficientes na captação de nutrientes por uma

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

mutagênese no gene lactato permease, tem a sua capacidade de colonizar o tecido

diminuída, quando comparada à amostra selvagem (Exley et al., 2005).

Todas essas pesquisas atribuem diversas funções às permeases, entre elas, o

fato de estarem relacionadas a fatores de aderência, colonização, transporte de

catabólitos e outros processos bacterianos.

Para verificar a prevalência da proteína YgjV nas outras amostras de EAEC

atípicas deste trabalho, foi realizado uma reação de PCR, na qual foram detectadas

seqüências homólogas a proteína ygjV em 17 (63%) das 27 amostras analisadas,

sendo 12 (78%) provenientes de casos e 5 (50%) de controles. Não foram encontradas

diferenças estatísticas entre as amostras pesquisadas. Todas as 4 amostras positivas

para a seqüência aggR, foram positivas para a seqüência da proteína ygjV.

Como última etapa de nosso estudo, realizamos alguns ensaios preliminares

para a caracterização fenotípica da adesina responsável pelo padrão AA da amostra

RN153-1. Os primeiros foram ensaios de microscopia eletrônica de transmissão após

coloração negativa, onde se pesquisou a presença de estruturas de superfície com

aspecto semelhante aos das adesinas fimbriais AAFs. Na amostra RN153-1 visualizou-

se a presença de estruturas fimbriais, entretanto sem a formação de agregados típicos

das AAFs.

Em seguida, pesquisou-se a presença de uma proteína bacteriana com potencial

de adesina nos extratos protéicos das amostras RN153-1, pVIII-F-1 e pVIII-F1::Tn10

após seu cultivo em diferentes meios de cultura e aquecimento a 60

C. Não se observou

nenhuma proteína diferente presente na amostra selvagem e no clone cosmídeo, mas

ausente no mutante.

Por último, realizamos uma comparação dos perfis eletroforéticos de OMPS da

EAEC RN153-1 e da amostra 231-1 (não aderente), onde verificamos uma proteína de

85 KDa presente apenas na amostra aderente. Entretanto, a análise da seqüência N-

terminal de 19 aminoácidos revelou uma identidade de 71% com a proteína flagelina de

E. coli. Embora o flagelo participe da adesão de EPEC em células epiteliais (Girón et

al., 2002), os achados obtidos até o momento ainda não nos permitem sugerir a

possível estrutura da adesina envolvida na adesão da amostra RN153-1. Outros

estudos serão necessários para definir o fenótipo da referida adesina.

Aparentemente, houve uma relação entre os resultados nos ensaios de

microscopia eletrônica com os de proteínas. A amostra RN153-1 apresentou o gene

fimA, que codifica uma subunidade da fímbria do tipo 1 (o que explicaria as

DISCUSSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

observações de microscopia eletrônica) e não apresentou nenhuma proteína evidente

nos extratos aquecidos.

Moreira et al. (2003) mostraram que a fímbria tipo 1 (TIF) exerce papel na

adesão agregativa da amostra protótipo 042, utilizando um soro anti-TIF e ensaios de

adesão com incubação de 3 e 6 horas. Experimentos de clonagem do plasmídeo pVIII-

F1 em uma amostra de E. coli apresentando deleção no gene fim, e ensaios de adesão

realizados com a presença e ausência de manose, mostraram o não envolvimento da

fímbria tipo 1 com as propriedades de adesão da amostra RN153-1.

Concluindo, os resultados obtidos em nosso trabalho mostraram que a maioria

(71%), das amostras de EAEC atípica, apresenta pelo menos dois dos fatores de

virulência envolvidos na patogênese das EAEC típicas. Entre eles, EAST1 e Shf foram

os mais prevalentes (61%), sendo encontrados significantemente associados com

diarréia.

Na caracterização preliminar dos genes envolvidos no fenótipo AA da amostra

RN153-1, foi identificado um mutante não aderente a células HEp-2, apresentando

inserção de mini-Tn10. A análise da seqüência do DNA flanqueado pela inserção do

mini-Tn10 levou a identificação de uma região a qual apresentou homologia com uma

permease, que parece estar envolvida no processo de transporte de íons e outros

eletrólitos na célula bacteriana. A identificação dos determinantes genéticos da adesina

AA da amostra RN153-1, entretanto, merece ainda maiores investigações. Estudos

com um outro mutante se encontram em andamento na tentativa de obtermos deleção

de genes relacionados estritamente a aderência bacteriana.

CONCLUSÃO

Escherichia coli

enteroagregativa

6. CONCLUSÃO

A maioria (71%) das amostras de EAEC atípica analisadas apresenta pelo menos

dois dos fatores de virulência envolvidos na patogênese das EAEC típicas. Entre eles,

a toxina EAST1 e a ORF críptica Shf foram os mais prevalentes (61%) e encontrados

significantemente associados com diarréia (P = 0,003 e P = 0,020, respectivamente).

- A caracterização preliminar dos genes envolvidos no fenótipo AA da amostra RN153-

1 identificou um mutante não aderente à células HEp-2, apresentando inserção de

transposon mini-Tn10. A análise da seqüência do DNA flanqueado pela inserção do

mini-Tn10 levou a identificação de uma região a qual apresentou homologia com uma

permease, que parece estar envolvida no processo de transporte de íons e outros

eletrólitos na célula bacteriana.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Escherichia coli

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ANEXOS

103

Escherichia coli

enteroagregativa

8. ANEXOS

8.1. Meios de cultura, reagentes e soluções

Os meios de cultura, sais e açúcares utilizados, quando não especificados,

foram de procedência Difco (Difco Laboratories, Michigan, EUA), Merck (Merck

Chemicals, New Jersey, EUA) e Synth (Labsysnth S. A., Diadema, SP). Os demais

reagentes utilizados foram provenientes da Sigma (Sigma-Aldrich Chemical, Missouri,

EUA), Invitrogen (Life Tecnologies Inc, Gaithenesburg MD, EUA), Amershan

(Amershan Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), tendo sido preparados conforme

especificações dos fabricantes.

Os meios de cultura, obtidos sob a forma desidratada foram preparados com

água destilada e purificada pelo sistema Mili-Q (Milipore Inc., Massachusetts, EUA) e

autoclavados a 121°C por 15 minutos. Foram utilizad os os meios ágar MacConkey,

ágar Nutriente, Blood Agar base (BAB), ágar Brucella e o caldo de soja tripticase (TSB

– “Triptic Soy Broth” – Difco Laboratories, Michigan, EUA).

8.1.1. Caldo Lúria Bertani (LB)

Triptona 10 g

Extrato de levedura 5 g

Cloreto de Sódio 10 g

Água bidestilada q.s.p. 1000 mL

Todos os elementos foram adicionados a agua destilada e o meio esterelizado

em autoclave a 121°C por 15 minutos. Para a prepara ção de LB ágar foi adicionado à

solução acima 2% de bacto ágar (Difco).

ANEXOS

104

Escherichia coli

enteroagregativa

8.2. Soluções utilizadas na determinação do antígeno somático (O) das amostras

8.2.1. Solução salina com azida sódica

NaCl 8,5 g

Na 1 g

Água destilada q.s.p. 1000 mL

A solução salina foi autoclavada a 121°C por 15 min utos.

8.2.2. Solução formalizada contendo violeta genciana

Formaldeído 35% 10 mL

NaCl 17 g

Violeta genciana 0,1 g

Água destilada q.s.p. 2000 mL

Adicionar os reagentes e após homogeinização estocar a temperatura ambiente.

ANEXOS

105

Escherichia coli

enteroagregativa

8.3. Soluções utilizadas para a extração de DNA plasmidial

8.3.1. Solução Tris-HCl 1M pH 8,0

O Trizma base foi dissolvido em água bidestilada e seu pH ajustado com HCL 10

N. A solução foi autoclavada a 121 °C por 15 minuto s.

8.3.2. Solução Na

EDTA 0,5 M pH 8,0

O Na

EDTA foi dissolvido em água bidestilada quente e pH ajustado com NaOH

5N para 8,0 e autoclavado a 121°C por 15 minutos.

8.3.3. Solução I (Solução de ressuspensão)

Glicose 50 mM

Tris-HCl pH 8.0 25 mM

EDTA pH 8.0 10 mM

A solução foi preparada no momento do uso e mantida no gelo.

8.3.4. Solução II (Solução lítica desnaturante)

NaOH 0.2 N

SDS 1 %

A solução foi preparada no momento do uso.

8.3.5. Solução III (Acetato de sódio 3M pH 4,8)

Acetato de sódio 3 M pH 4,8

O acetato de sódio foi dissolvido em água bidestilada, o pH ajustado com acido

acético glacial e a solução foi autoclavada a 121°C por 15 minutos. A solução foi

mantida a temperatura ambiente.

ANEXOS

106

Escherichia coli

enteroagregativa

8.3.6. Solução IV (Acetato de sódio 100 mM pH 7,0)

Acetato de sódio 100 mM

Tris 50 mM

A solução foi autoclavada a 121°C por 15 minutos.

8.3.7. Solução de Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico

Fenol 25 mL

Clorofórmio 24 mL

Álcool isoamílico 1 mL

Após preparo, a solução foi armazenada a 4°C.

8.3.8. Solução tampão Tris-EDTA (TE) - pH 8,0 (10X)

Trizma base 100 mM

EDTA 10 mM

Inicialmente o Na

EDTA é dissolvido à quente com uma parte de água destilada,

adicionando-se em seguida Trizma base e ajustando o pH com HCl. Completar o

volume da solução, autoclavar a 121ºC por 15 minutos.

ANEXOS

107

Escherichia coli

enteroagregativa

8.4. Soluções utilizadas para extração de DNA genômico

8.4.1. Solução para suspensão celular

Tris pH 8.0 100 mM

EDTA pH 8.0 1 mM

Sacarose 35 mM

Solução preparada no momento do uso.

8.4.2. Solução de lise

Tris pH 8.0 100 mM

NaCl 300 mM

EDTA pH 8.0 0.5 M

SDS 2 %

2-mercaptoetanol 2 %

Proteinase K 100 µg/mL

Perclorato de sódio 0,5 mM

Solução preparada no momento do uso e mantida em gelo.

ANEXOS

108

Escherichia coli

enteroagregativa

8.5. Soluções para eletroforese em gel de agarose

8.5.1. Solução tampão Tris-Borato-EDTA (TEB) - pH 8,2 (10X)

Trizma base 890 mM

EDTA 25 mM

89 mM

Após a dissolução à quente do Na

EDTA, são acrescentados Tris e H

e o

volume da solução é completado com água destilada. No momento de uso, esse

tampão é diluído 0,5 x em água destilada.

8.5.2. Tampão de amostra para DNA (6X)

Ficoll 400 2,5g

Azul de bromofenol 0,025g

Xileno cianol 0,025g

O Ficoll é dissolvido à quente em 10 mL de água bidestilada e em seguida são

acrescentadas as demais soluções, completando-se o volume desejado.

8.5.3. Solução de brometo de etídio (5 mg/mL)

O brometo de etídio foi preparado a 5 mg/mL em tampão Tris 0,05 M, pH 8,5 e

mantido em frasco escuro à temperatura ambiente.

ANEXOS

109

Escherichia coli

enteroagregativa

8.6. Soluções e meios de cultura utilizados para preparação de células

competentes

8.6.1. Tampão FB

KCl 100 mM

CaCl

50 mM

Acetato de potássio 10 mM

Glicerol 10 %

Misturar todos os reagentes e esterilizar o meio em autoclave a 121°C durante

15 minutos. Esterilizar o glicerol separadamente e adicionar a solução.

8.6.2. Meio SOC

Triptona 2,0 g

Extrato de levedura 0,5 g

NaCl 0,05 g

Água bidestilada q.s.p. 100 mL

Adicionar 1 mL de uma solução de KCl 250 mM, ajustar o pH para 7.0 com

NaOH 5 N. Depois de esterilizado, adicionar 0,5 mL de uma solução estéril de MgCl

M e mais 2 mL de glicose 1 M também estéril.

ANEXOS

110

Escherichia coli

enteroagregativa

8.7. Soluções utilizadas nos testes de hibridização de DNA bacteriano com

sondas genéticas

8.7.1. Solução desnaturante

NaOH 0,5 N

NaCl 1,5 M

Esta solução foi preparada em água destilada a partir das soluções estoque de

NaOH a 10 N e de NaCl à 5 M.

8.7.2. Solução neutralizante

Tampão Tris - pH 7,0 1 M

NaCl 2 M

Esta solução foi preparada em água destilada a partir das soluções estoque de

tampão Tris 2M, pH 7,0 e NaCl 5M.

8.7.3. Solução salina citrato “SSC“ - pH 7,0 (20X)

NaCl 3 M

Citrato de sódio 0,3 M

A solução foi preparada em água destilada e o pH ajustado com HCl. A seguir a

solução foi autoclavada a 121ºC durante 15 minutos.

8.7.4. Solução de esperma de salmão

Foi preparada uma solução de DNA de esperma de salmão em tampão Tris -

EDTA na concentração de 10 mg/mL. Esta solução foi submetida a 5 passagens

sucessivas por uma agulha de 38 mm X 7mm para homogeneização. Após o preparo,

esta solução foi mantida a -20ºC.

ANEXOS

111

Escherichia coli

enteroagregativa

8.7.5. Solução de Lavagem 0,1%

SSC 0,1%

SDS 0,1%

Água destilada q.s.p. 500 mL

8.7.6. Solução de Lavagem 0,05%

SSC 0,05%

SDS 0,05%

Água destilada q.s.p. 500 mL

8.7.7. Solução Denhardts (50x)

Ficoll 400 1g

Polivinil pirrolidona 1g

BSA 1g

Água destilada q.s.p. 100mL

ANEXOS

112

Escherichia coli

enteroagregativa

8.8. Soluções e meios de cultura utilizados para os testes de adesão em células

HEp-2.

8.8.1. Solução Tampão Salina Fosfato (PBS)

NaCl 136,9 mM

KCl 2,7 mM

HPO

8,1 mM

1,5 mM

Os sais foram dissolvidos em água destilada e a solução foi autoclavada a

121°C durante 15 minutos. Para a solução salina fosfato com pH7,2, acertar o pH com

ácido clorídrico.

8.8.2. Meio mínimo essencial de Eagle (modificado) com sais de Earle (MEM)

O meio foi dissolvido em água bidestilada, conforme recomendações do

fabricante. O pH foi ajustado para 7,2 com uma solução de bicarbonato de sódio a

7,5%; o meio foi acrescido com 10% e 2% de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, o

meio foi filtrado em membranas de acetado de celulose com poros de 0,22 µm

(Sistema de filtração Milipore Corporation, EUA) e armazenado a 4°C.

8.8.3. Solução Associada de Tripsina e Versene

Primeiro era preparada uma solução salina:

NaCl 0,8%

KCl 0,2%

6,4 g

0,2 g

Água bidestilada q.s.p. 100 mL

Foi dissolvido 2 gramas de tripsina (Difco) em 50 mL da solução salina durante 2

horas sob agitação em banho de gelo e, então, acrescentada no restante da solução

salina. A solução de Versene foi preparada dissolvendo-se 0,2 g de Titriplex (Merck)

ANEXOS

113

Escherichia coli

enteroagregativa

em 10 mL da solução salina e 1,5 mL de solução de vermelho de fenol a 1%. A solução

foi esterilizada por filtração em membranas com poros de 0,22 µm de diâmetro

(Milipore Corporation, EUA) e conservada a -20

8.8.4. Solução de Azul de Tripan a 0,5%

O azul de tripan foi diluído em solução tampão salina fosfato (PBS) a 0,5%. Esta

solução foi utilizada na diluição 1:2 (v/v) com a suspensão de células HEp-2 para efeito

de contagem de células viáveis.

8.8.5. Solução estoque de D-manose

A solução de D-manose foi preparada em água bidestilada na concentração final

de 10% e autoclavada em vapor fluente por 1 hora. A solução foi armazenada a 4°C

até o momento do uso.

8.8.6. Solução tampão de SØrensen

Solução A:

0,64 g

Água bidestilada q.s.p. 70 mL

Solução B:

HPO

2,36 g

Água bidestilada q.s.p. 250 mL

Para a solução final foi adicionado 69,6 mL da solução A em 230,4 mL da

solução B. Essa solução foi armazenada a 4°C até o momento do uso.

8.8.7. Solução corante de May-Grünwald (eosina-azul de metileno)

A solução comercial foi diluída 1:2 (v/v) em tampão SØrensen.

8.8.8. Solução corante de Giemsa (eosina-azul de metileno)

A solução comercial foi utilizada na diluição 1:3 em tampão SØrensen.

ANEXOS

114

Escherichia coli

enteroagregativa

8.9. Soluções utilizadas na eletroforese de proteína em SDS-PAGE

8.9.1. Solução de Acrilamida bis – Acrilamida

Acrilamida 30 g

N,N, - metilenobisacrilamida 0,8g

Água destilada q.s.p. 100 mL

A solução foi filtrada em papel de filtro e armazenada em frasco escuro a 4°C.

8.9.2. Solução de Ressuspensão das Amostras

Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 2,5 mL

SDS 400 mg

Glicerol 2,0 mL

Azul de bromofenol 1%

Betamercaptoetanol 5%

Água destilada q.s.p. 20 mL

Manter essa solução a 4°C.

8.9.3. Gel de Empacotamento

Acrilamida/bis 1,70 mL

Tris-HCl 1 M pH 6,8 1,25 mL

Persulfato de amônia 10% 0,10 mL

TEMED 0,01 mL

SDS 10% 0,10 mL

Água bidestilada 6,80 mL

8.9.4. Gel de Resolução 10%

Acrilamida/bis 8,30 mL

Tris-HCl 1 M pH 8,8 6,30 mL

Persulfato de amônia 10% 0,25 mL

TEMED 0,01 mL

SDS 10% 0,25 mL

Água bidestilada 9,90 mL

ANEXOS

115

Escherichia coli

enteroagregativa

8.9.5. Tampão de Eletroforese (4 x)

Trizma base 6 g

Glicina 28,5 g

SDS 2 g

Água bidestilada q.s.p. 500 mL

8.9.6. Solução de Coomassie Blue

Metanol 10%

Coomassie Brilhant Blue 0,05%

Ácido acético 10%

Água bidestilada 40%

8.9.7. Solução descorante

Ácido acético 10%

Metanol 40%

Água destilada q.s.p. 100 mL

ANEXOS

116

Escherichia coli

enteroagregativa

8.10. Seqüências obtidas a partir do seqüenciamento do clone pAZ2

8.10.1. Alinhamento da seqüência de 1244 pb obtida a partir dos primers Fcat e

FMcat com a E. coli K12 MG1655

Query 102 TGTTTAACCCCTTTCGTCTACGGCGGAAGGGGTTTTCTCAACTTTAAACGGATCAATTCC 161

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2213 TGTTTAACCCCTTTCGTCTACGGCGGAAGGGGTTTTCTCAACTTTAAACGGATCAATTCC 2272

Query 162 CCTTTTCTGCATCCGCCAGAAACGAATGATATTCAGGCCATTCATAAGCAGAAAACTACC 221

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2273 CCTTTTCTGCATCCGCCAGAAACGAATGATATTCAGGCCATTCATAAGCAGAAAACTACC 2332

Query 222 CTCAATCATCGTGCCGCCTATCGACCCCGCCCAGAAGTTGTGAATCACCCAGCAACACGT 281

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2333 CTCAATCATCGTGCCGCCTATCGACCCCGCCCAGAAGTTGTGAATCACCCAGCAACACGT 2392

Query 282 TGAAAACCACATTACGCAGCGCATGGTCAGCCCTTTACAGCGGAATAGCGCCCAGGTACT 341

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

Sbjct 2393 TGAAAACCACATTACGCAGCGCATGGTCAGCCCTTTACAGCAGAATAGCGCCCAGGTACT 2452

Query 342 GACAATCGTGCCGATAACCGGCAATAGTTCGACAGGATGATGGAACTTCGCGAGGCCAAT 401

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2453 GACAATCGTGCCGATAACCGGCAATAGTTCGACAGGATGATGGAACTTCGCGAGGCCAAT 2512

Query 402 TCCGCCAGTCAGCACAATAAAAATCGCCATTACCCATAAGCTGCGCGTGCGTAAGGTAAT 461

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

ANEXOS

117

Escherichia coli

enteroagregativa

Sbjct 2513 TCCGCCAGTCAGCACAATAAAAATCGCCATTACCCATAAGCTGCGCGTGCGTAAGGTAAT 2572

Query 462 CAATGTACGAATGGCATTAAGGATGGCACTGGCACCAGCGGGATAGGTGCCCAGAAGNNN 521

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2573 CAATGTACGAATGGCATTAAGGATGGCACTGGCACCAGCGGGATAGGTGCCCAGAAGAAA 2632

Query 522 NNNNTGTACGCCAATAACGGCGCTATAGACCGAAAGCTGCTTTTTGAAGCGACGTTCGTC 581

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2633 AAAATGTACGCCAATAACGGCGCTATAGACCGAAAGCTGCTTTTTGAAGCGACGTTCGTC 2692

Query 582 ACGATTGAACACATGTTGTGATACCAATCAGAAAGGCGATGACACCAGC-CCTTGGGCCA 640

||||||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||| | || |||||||

Sbjct 2693 ACGATTGAAAA-ATGTTGTGATACCAATCAGAAAGGCGATGACACCCACGCCCTGGGCCA 2751

Query 641 ACCAAATACGCGG-CATGACTCAATCCTTAGCAG-TATGGAAAAGCAAACGGCGCTTCAC 698

|||| ||||||| ||||| | |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2752 GCCAA-TACGCGGTCATGA-TAAATCCTTAGCAGGTATGGAAAAGCAAACGGCGCTTCAC 2809

Query 699 ATTATGAAACGCCGTTTTT-ATTAAACACTCATTTCGACTTTATAGCGTTACGCCGCTTT 757

||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2810 ATTATGAAACGCCGTTTTTTATTAACAACTCATTTCGACTTTATAGCGTTACGCCGCTTT 2869

Query 758 TGAAGATCGCCAGTTCGCGGAAGTCGTTACGCTCGTTACAGGTTTGCTTACCGTTGGCAA 817

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2870 TGAAGATCGCCAGTTCGCGGAAGTCGTTACGCTCGTTACAGGTTTGCTTACCGTTGGCAA 2929

Query 818 ACTCAACGATGGTGTCGATAAATTCTTCCAGCAACTGCGGCATCGCTTTACCGTGGATCA 877

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2930 ACTCAACGATGGTGTCGATAAATTCTTCCAGCAACTGCGGCATCGCTTTACCGTGGATCA 2989

Query 878 ACTGACCCGCGTCAAAGTCGATCCAGTGTTTTTTCTTCGCCGCCAGTTCACTGTTGGTGG 937

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 2990 ACTGACCCGCGTCAAAGTCGATCCAGTGTTTTTTCTTCGCCGCCAGTTCACTGTTGGTGG 3049

Query 938 CGATTTTCACCGTCGGCNCAAATCCACCATACGGCGTGCCACGACCAGTACTGAACAGCA 997

||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 3050 CGATTTTCACCGTCGGCACAAATCCACCATACGGCGTGCCACGACCAGTACTGAACAGCA 3109

Query 998 CCATATGGCAGCCCGCACCCGCCAGGGCGCTGGTCGCTACGGCATCGTTACCCGGCGCAC 1057

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Sbjct 3110 CCATATGGCAGCCCGCACCCGCCAGGGCGCTGGTCGCTACGGCATCGTTACCCGGCGCAC 3169

Query 1058 TTAAAAGATTCAGCCCTGGCGTTTTCAGACGCTCGCCGTAACGCAGCACGTCAACCACGA 1117

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Sbjct 3170 TTAACAAGTTCAGCCCTGGCGTTTTCAGACGCTCGCCGTAACGCAGCACGTCAACCACGA 3229

Query 1118 CGCCGGAACCCGCTTTCTGGGTACAGCCAAGTGATTTGTCTTCCAGCGTGGTGATACCGC 1177

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Sbjct 3230 CGCTGGAACCCGCTTTCTGGGTACAGCCAAGTGATTTGTCTTCCAGCGTGGTGATACCGC 3289

Query 1178 CCGCTTTGTTCCCCGGCGATGGGTTTTCATAAATCTGCTGATCATGGGCAATAAAGTACT 1237

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Sbjct 3290 CCGCTTTGTTCCCCGGCGATGGGTTTTCATAGATCGGCTGATCATGGGCAATAAAGTACT 3349

Query 1238 GTTTGAA 1244

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Sbjct 3350 GTTTGAA 3356

ANEXOS

118

Escherichia coli

enteroagregativa

8.10.2. Alinhamento da seqüência de 457 pb obtida a partir do primer Rhc com a

E. coli K12 MG1655

Query 106 GGATCTCAAAACCCGCGGCGGAAGCTGTTGGTCTGTTAGGTACTTTGTTCGTCGGCGCAC 165

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Sbjct 1067 GGATCTCAAAACCCGCGGCGGAAGCTGTTGGTCTGTTAGGTACTTTGTTCGTCGGCGCAC 1126

Query 166 TGAAAGCCGTTGCCCCCATCCTGGTGTTGATGCTGGTGATGGCATCTATTGCTAACCACC 225

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Sbjct 1127 TGAAAGCCGTTGCCCCCATCCTGGTGTTGATGCTGGTGATGGCATCTATTGCTAACCACC 1186

Query 226 AGCACGGGCAGAAAACCAATATCCGCCCTATTTTGTTCCTCTATCTACTGGGCACCTTCT 285

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Sbjct 1187 AGCACGGGCAGAAAACCAATATCCGCCCTATTTTGTTCCTCTATCTACTGGGCACCTTCT 1246

Query 286 CTGCTGCTCTGGCCGCAGATAGTCTTCAGCTTTGCCTTCCCTTCTACCCTGCATTTATCC 345

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Sbjct 1247 CTGCTGCTCTGGCCGCAG-TAGTCTTCAGCTTTGCCTTCCCTTCTACCCTGCATTTATCC 1305

Query 346 AGTAGTGCGGGTGATATTTCGCCGCCGTCAGGCATTGTC--AATGATGCGCGGGCTGGTA 403

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Sbjct 1306 AGTAGCGCGGGTGATATTTCGCCGCCGTCAGGCATTGTCGAAGTGATGCGCGGGCTGGTA 1365

Query 404 ATGA-CATGGTTTTCCACCCCATC-ACGCGCTGCTGAAAGGTAACT-CATCGGGATT 457

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Sbjct 1366 ATGAGCATGGTTTCCAACCCCATCGACGCGCTGCTGAAAGGTAACTACATCGGGATT 1422

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