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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Avaliação da composição química da parede celular de plantas de tabaco
(Nicotiana tabacum) que superexpressam o gene ugdh de soja, que codifica a
enzima UDP-glicose desidrogenase (EC 1.1.1.22)
Juliano Bragatto
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração: Fisiologia e
Bioquímica de Plantas
Piracicaba
2007
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Juliano Bragatto
Licenciado em Química
Avaliação da composição química da parede celular de plantas de tabaco (Nicotiana
tabacum) que superexpressam o gene ugdh de soja, que codifica a enzima UDP-glicose
desidrogenase (EC 1.1.1.22)
Orientador:
Prof Dr. CARLOS ALBERTO LABATE
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre
em Ciências. Área de concentração: Fisiologia e Bioquímica
de Plantas
Piracicaba
2007
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Bragatto, Juliano
Avaliação da composição química da parede celular de plantas de tabaco (Nicotiana
tabacum) que superexpressam o gene ugdh de soja, que codifica a enzima UDP-glicose
desidrogenase (EC 1.1.1.22) / Juliano Bragatto. - - Piracicaba, 2007.
73 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2007.
Bibliografia.
1. Desidrogenase 2. Enzimas 3. Fibras vegetais 4. Fumo 5. Parede celular vegetal
6. Plantas transgênicas 7. Xilema I. Título
CDD 633.71
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Dedico este trabalho aos meus pais, Luiz Antonio e Maria Rosa, pelo
incondicional apoio e incentivo, em especial a minha esposa Simone, pelo amor e
compreensão em todos os momentos desta jornada.
4
AGRADECIMENTOS
Ao estimado professor Dr. Carlos Alberto Labate, pelos valiosos ensinamentos, pela
oportunidade, confiança e acima de tudo pela importante amizade construída ao longo desses
anos.
A Dra. Mônica T. V. Labate, pelo incondicional apoio na realização deste trabalho e ao Dr. David
H. Moon, pelo apoio e pela amizade.
Aos excelentes estagiários Luiz Otávio Pagotto e Karina de Lima, pela grande ajuda em todos os
trabalhos realizados.
Aos amigos do Laboratório Max Feffer de Genética de Plantas, José Matheus Bonatto, Maria
Juliana Calderan Rodrigues, Edenilson Rabelo, Thiago Falda Leite, Lilia Barbosa, Gisele
Lacerda, Dra. Daniela D. Nascimento, Dra. Inêz Faraldo, Dr. Guillermo Salvatierra, Gunta
Gutmanis, Alexandra A. Magro, pela harmoniosa convivência.
Ao grande amigo Dr. Esteban González, pelos importantes ensinamentos na minha vida
acadêmica.
Aos amigos do laboratório e do “happy hour” Dra. Mayra C. C. Gallo, Danielle Gregório,
Fernanda Salvato, Dr. Alexander de Andrade, Raphael T. Carneiro, Dra. Ana Letícia Bertolo,
Eduardo Leal, Felipe Boaretto, Gabriela Conti, Lívia Franceschini, Paulo André “Pity”, Cristiano
Barbosa, Maurício Caldas, agradeço pelos valiosos momentos de alegria.
Aos meus queridos sobrinhos Luiz Felipe “Tal”, Luiz Fernando “Dico”, Luiz Eduardo “Dudu”,
Gabriela “Bi” e Juliana pelo carinho e por se fazerem sempre presentes nos momentos de alegria.
Aos meus estimados irmãos, Marcelo, Luiz Antonio, Adriana, Andréia, minha cunhada Eliana, e
ao meu cunhado Severino Bezerra.
Aos Funcionários do Departamento de Genética, Dr. Luiz Humberto Gomes, Nivaldo Laerte
Pivetta, Carmo José Bueno de Campos, Rudinei de Jesus Graciani, Antonio Marques Silveira,
Benedito Edson Soares, Reginaldo Martiniano da Silva.
Aos colegas do laboratório de Anatomia da Madeira ESALQ-USP, Maria Aparecida R. C.
Bermudez e Carlos Sette, em especial ao professor Dr. Mario Tomazello.
A secretária do departamento de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Maria Solizete Granziol
Silva, pelo excepcional atendimento.
Aos professores do curso de Fisiologia e Bioquímica de Plantas da ESALQ-USP, pelos
ensinamentos e abertura de novos horizontes.
Ao CNPq pelo financiamento da minha bolsa de estudos e Companhia Suzano de Papel e
Celulose, em especial ao Shinitiro Oda.
A todos que, direta ou indiretamente contribuiram para a realização deste trabalho.
5
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................................7
ABSTRACT ....................................................................................................................................8
LISTA DE FIGURAS .....................................................................................................................9
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................................11
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .............................................................................12
1 INTRODUÇÃO ..........................................................................................................................14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................................17
2.1 Parede celular ..........................................................................................................................17
2.2 Componentes químicos da parede celular ...............................................................................20
2.2.1 Celulose ................................................................................................................................20
2.2.2 Hemiceluloses .......................................................................................................................20
2.2.3 Pectinas .................................................................................................................................22
2.2.4 Lignina ..................................................................................................................................23
2.3 Biossíntese da parede celular ...................................................................................................24
2.4 Enzima UDP-glicose desidrogenase (EC 1.1.1.22)..................................................................28
2.5 Composição química da madeira: influência nas características da polpa ou papel ...............29
2.6 Características das fibras: influência nas propriedades da polpa ou papel...............................31
2.7 Cromatografia dos carboidratos................................................................................................34
2.8 Características das plantas de tabaco .......................................................................................36
3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................38
3.1 Caracterização das plantas transgênicas e controles ................................................................38
3.2 Preparo das sementeiras e condições de cultivo ......................................................................38
3.3 Esquema dos experimentos .....................................................................................................38
3.4 Análise das plantas cultivadas em casa de vegetação ..............................................................40
3.4.1 Condições de cultivo ............................................................................................................40
3.4.2 Coleta do caule......................................................................................................................40
3.4.3 Coleta seletiva dos diferentes tecidos do caule ....................................................................40
3.4.4 Preparo das amostras e remoção dos extrativos ...................................................................41
3.4.5 Hidrólise dos carboidratos da parede celular.........................................................................41
3.5 Análise das plantas cultivadas em câmara de crescimento.......................................................42
6
3.5.1 Condições de cultivo ............................................................................................................42
3.5.2 Coleta das folhas e caules .....................................................................................................43
3.5.3 Determinação do conteúdo de carboidratos do tecido foliar ................................................43
3.5.3.1 Quantificação de hemiceluloses ........................................................................................43
3.5.3.2 Quantificação de celulose ..................................................................................................44
3.5.4 Determinação do conteúdo de hemiceluloses e celulose nas amostras de caule ..................44
3.6 Parâmetros do HPAE-PAD para as análise dos carboidratos .................................................45
3.6.1 Parâmetros utilizados para a quantificação dos monossacarídeos ........................................45
3.6.2 Parâmetros utilizados para a quantificação dos ácidos urônicos ..........................................45
3.7 Análise das fibras .....................................................................................................................46
3.7.1 Coleta do tecido xilemático das plantas de tabaco para obtenção das dimensões das
fibras...............................................................................................................................................46
3.7.2 Preparo das lâminas do macerado de fibras ..........................................................................47
3.8 Análise anatômica do caule de tabaco .....................................................................................48
3.8.1 Coloração dos cortes transversais e longitudinais do caule de tabaco ..................................48
3.9 Delineamento experimental e análise estatística .....................................................................49
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................50
4.1 Avaliação fenotípica das plantas transgênicas .........................................................................50
4.2 Composição química do caule .................................................................................................51
4.3 Composição química do tecido xilemático ..............................................................................52
4.4 Composição química do tecido medular .................................................................................53
4.5 Mensurações das fibras ...................................................................... .................................... 54
4.6 Análise química dos componentes da parede celular primária do tecido foliar.......................56
4.7 Análise das diferentes partes do caule .....................................................................................57
4.8 Análise histológica do caule ............................ .......................................................................58
5 CONCLUSÕES ..........................................................................................................................61
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................62
7
RESUMO
Avaliação da composição química da parede celular de plantas de tabaco (Nicotiana
tabacum) que superexpressam o gene ugdh, que codifica a enzima UDP-glicose
desidrogenase (EC 1.1.1.22)
Os elementos celulares que constituem o tecido xilemático de várias espécies vegetais são
amplamente utilizados em diversos setores industriais, com inúmeras aplicações, como por
exemplo, a geração de energia e produção de celulose e papel. A parede celular das células
vegetais é formada basicamente por celulose, hemiceluloses e lignina. A formação dos polímeros
de celulose e hemicelulose dependem exclusivamente do suprimento de precursores chamados de
nucleotídeos-açúcares, tais como UDP-glicose, UDP-glucuronato, UDP-xilose, UDP-arabinose,
UDP-manose e UDP-galactose. A biossíntese da parede celular é altamente regulada do ponto de
vista metabólico, e envolve a participação de várias enzimas que catalisam uma série de reações.
Estratégias para alterar o fluxo metabólico destes precursores, podem originar modificações na
deposição dos polissacarídeos na parede celular. Em particular, para o setor de celulose e papel
tal estratégia pode resultar em fibras com determinadas características, melhorando a qualidade
da polpa celulósica ou do papel produzido. O UDP-glucuronato é um dos principais precursores
de polissacarídeos hemicelulósicos da parede celular, sendo formado a partir de UDP-glucose
pela ação da enzima UDP-glicose desidrogenase (EC. 1.1.1.22). Esta enzima é chave na
regulação da biossíntese das pentoses e hexoses da parede celular de plantas superiores. Com o
objetivo de modular a síntese dos polissacarídeos hemicelulósicos na parede celular, o presente
trabalho analisou o impacto da superexpressão do gene ugdh em plantas transgênicas de tabaco.
Foram realizadas análises da composição química da parede celular primária e secundária de
folhas e caules, bem como avaliações morfológicas das fibras do tecido xilemático, e também
cortes histológicos da região basal do caule. Da parede secundária do tecido xilemático
determinou-se o conteúdo de lignina klason e solúvel, bem como a concentração dos carboidratos
via HPAE-PAD. No tecido xilemático, todas as plantas transgênicas apresentaram aumento do
conteúdo de xilose, embora não significativo. Juntamente, ocorreu um aumento de arabinose
significativo em três linhagens transgênicas. Paralelamente, todas as plantas transgênicas tiveram
redução do conteúdo de lignina klason, embora significativo em apenas uma linhagem. A relação
hexoses/pentoses reduziu em todas as linhagens transgênicas, sendo significativa em três
linhagens. As análises histológicas do caule mostraram que os transformantes apresentaram um
aumento do tecido xilemático em relação às plantas controles. As análises morfológicas das
fibras mostraram que todas as plantas transgênicas apresentaram reduções significativas no
comprimento, em relação às plantas controles. No tecido foliar, o conteúdo de polissacarídeos da
parede celular primária apresentou uma redução significativa em todas as plantas transgênicas.
Palavra-chave: Tabaco; Fibra; Tecido xilemático; Parede celular vegetal; UDP-glicose
desidrogenase; HPAE-PAD
8
ABSTRACT
Evaluation of the chemical composition of the cell wall of transgenic tobacco plants
(Nicotiana tabacum) that superexpress the gene ugdh, that codes for the enzyme UDP-
glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.22)
The cellular elements that constitute the xylematic tissue of various plant species are
widely used in diverse industrial sectors, with numerous applications, for example, the generation
of energy and production of cellulose and paper. Plant cell walls are basically formed by
cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of cellulose and hemicellulose polymers
depend exclusively on the supply of the precursors called nucleotide sugars, such as UDP-
glucose, UDP-glucuronate, UPD-xylose, UDP-arabinose, UDP-mannose and UDP-galactose. The
biosynthesis of the cell wall is highly regulated from the metabolic point of view and involves the
participation of various enzymes that catalyse a series of reactions. Strategies to alter the
metabolic flux of these precursors could give rise to modifications in the deposition of
polysaccharides in the cell wall. In particular, for the cellulose and paper sector these strategies
could result in fibers with determined characteristics, improving the quality of the cellulose pulp
or the paper produced. UDP-glucuronate is one of the principal precursors of the hemicellulose
polysaccharides of the cell wall, which is formed from UDP-glucose by the action of UDP-
glucose dehydrogenase (EC1.1.1.22). This is a key enzyme in the regulation of the biosynthesis
of the pentoses and hexoses in the cell walls of higher plants. With the objective of modulating
the synthesis of the hemicellulose polysaccharides in the cell wall, the present study analysed the
impact of the superexpression of the ugdh gene in transgenic tobacco plants. Chemical analyses
were performed to determine the chemical composition of the primary and secondary cell walls
of leaves and stems, as well as morphological evaluations of the fibers of the xylematic tissue and
histological cuts through the base of the stem. The Klason and soluble lignin content as well as
the carbohydrate concentrations (using HPAE-PAD) were determined in the secondary cell walls
of the xylematic tissue. All of the transgenic plants showed an increase in xylose content, albeit
not significant. A significant increase in arabinose content was observed in three transgenic lines.
In parallel all the transgenic plants presented a reduction in Klason lignin, but only significant in
one line. The ratio hexose/pentose was reduced in all transgenic lines, being significant in three.
Histological analyses on the stem showed that the transformants presented an increase in the
xylematic tissue when compared to the controls. The morphological analyses of the fibers
showed that all the transgenic plants presented significant reductions in length when compared to
the controls. In the leaf tissue, the polysaccharide content of the primary cell wall showed a
significant reduction in all of the transgenic plants.
Keywords: Tobacco; Fiber; Xylematic tissue; Plant cell wall; UDP-glucose dehydrogenase;
HPAE-PAD
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema da célula vegetal, com parede celular primária e secundária ........................18
Figura 2 - Esquema das estruturas de celulose (a) e xiloglucanas (b) ...........................................21
Figura 3 - Representação esquemática da formação dos monossacarídeos ...................................27
Figura 4 - Reação realizada pela enzima UDP-glicose desidrogenase ........................................28
Figura 5 - Ilustração dos elementos celulares presentes em espécies lenhosas.............................32
Figura 6 - Estruturas e elementos anatômicos do caule de tabaco ................................................37
Figura 7 - Fluxograma dos experimentos......................................................................................39
Figura 8 - Detalhe da amostragem da coleta do caule de tabaco ..................................................44
Figura 9 - Ilustração da coleta do material para análise dos carboidratos em diferentes tecidos e
mensurações das fibras ................................................................................................47
Figura 10 - Plantas transgênicas e controles ..................................................................................50
Figura 11 - Principais componentes da parede celular da região da medula do caule de tabaco...54
Figura 12 - Principais carboidratos encontrados na parede celular do tecido foliar de plantas de
tabaco ...........................................................................................................................57
Figura 13 - Conteúdo de carboidratos presentes em diferentes secções (ápice, meio e base), de
plantas transgênicas e controles ...................................................................................58
10
Figura 14 - Cortes transversais do caule de plantas de tabaco com 60 dias de idade ....................59
Figura 15 - Cortes transversais do caule de plantas de tabaco com 90 dias de idade ....................59
Figura 16 - Cortes transversais do caule de plantas de tabaco com 120 dias de idade ..................60
Figura 17 - Cortes longitudinais do caule de plantas de tabaco com 120 dias de idade ...............60
11
LISTA DE TABELAS
Tabela1 - Composição química da parede celular do caule total das plantas transgênicas e
controles .......................................................................................................................52
Tabela 2 - Composição química da parede celular do tecido xilemático das plantas transgênicas e
controles .......................................................................................................................53
Tabela 3 - Características das fibras do tecido xilemático de plantas de tabaco e parâmetros da
qualidade das fibras .....................................................................................................56
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AHexs – ácidos hexênuronicos
A
215
A
280
(nm) – Absorbância em 215 ou 280 nanômetros de comprimento de onda
água milliQ - água ultrapura filtrada em filtro Millipore (0,45µm)
o
C - grau Celsius
CG – Controle Gateway, planta de tabaco transformada com vetor Gateway desprovido do
cDNA do gene de interesse ugdh
cm – centímetro
etanol 95 GL – álcool grau Gay-Lussac 95
EC – código de classificação das enzimas
g – grama
g – força gravitacional
GalA – ácido galacturônico ou galacturonato
HPAE-PAD – High Performance Anion Exchange- Pulsed Amperometric Detection
H
2
SO
4
– ácido sulfúrico
HNO
3
– ácido nítrico
L – litro
M- molar
Mesh – diâmetro do orifício da peneira (µm)
mg – miligrama
mm – milimetros
mM – milimolar
mL – mililitro
ms – milisegundo
mV – milivolts
N
2
- Nitrogênio líquido
NaCl – Cloreto de Sódio
NaOAc – Acetato de Sódio
NaOH – Hidróxido de Sódio
psi – libra por polegada quadrada, unidade de pressão
13
rpm – rotações por minuto
TFA – ácido trifluoroacético
UDP – uridina difosfato
UDP-Glic – UDP-glicose
UDP-Ara – UDP- arabinose
UDP-Gal – UDP-galactose
UDP-GalA – UDP-galacturonato ou UDP-ácido galacturônico
UDP-Man – UDP-manose
UDP-GlcA – UDP-ácido glucurônico
UDP-GlcUA – UDP-glucuronato
UDP-Xil – UDP-xilose
UGDH – proteína UDP-glicose desidrogenase
ugdh – gene codificador da enzima UDP-glicose desidrogenase
µg – micrograma
µL – microlitro
v/v – volume por volume
WT – espécie selvagem (não transformante)
14
1 INTRODUÇÃO
As plantas superiores fixam o carbono através do processo fotossintético, considerado por
muitos o processo biológico mais importante. Este processo biológico transforma a luz solar em
energia química, sendo os carboidratos a forma mais importante. Os diferentes tipos de
carboidratos sintetizados podem ser usados como precursores de vários componentes celulares
(aminoácidos, lipídios e ácidos nucléicos) e também como componentes estruturais da parede
celular. A biossíntese dos componentes da parede celular, tais como celulose, hemiceluloses,
pectinas e lignina dependem do fornecimento dos açúcares que são produzidos durante o
processo fotossintético (TAIZ; ZEIGER, 2004). Desta maneira, os produtos fotossintéticos são
utilizados principalmente na produção de biomoléculas de celulose, à qual pode ser utilizada para
diferentes fins comerciais (ENGLEHARDT, 1995).
A celulose e as hemiceluloses são formadas por unidades básicas, chamadas de
monossacarídeos (arabinose, ramnose, galactose, glicose, xilose e manose). A biossíntese desses
monômeros e a incorporação dos mesmos na parede celular envolvem a atividade de várias
enzimas e substratos de nucleotídeo-açúcares, tais como: UDP-glicose, UDP-glucuronato, UDP-
galactose, UDP-xilose e UDP-arabinose (REITER; VANZIN, 2001). Nas dicotiledôneas, a maior
parte dos polissacarídeos hemicelulósicos são formados a partir dos substratos UDP-D-xilose e
UDP-D-glucuronato, e em menor proporção a partir de UDP-glicose e UDP-manose
(DALESSANDRO; NORTHCOTE, 1977a).
Na parede celular primária grande parte da xilose encontra-se na forma de xiloglucanas,
que estão associadas às microfibrilas de celulose por pontes de hidrogênio. Esta interação está
envolvida com as propriedades mecânicas específicas da parede celular (AWANO et al., 2001;
BINDSCHEDLER et al., 2005). Já na parede celular secundária, a xilose aparece na forma de
cadeias poliméricas, chamadas de xilanas, que fazem ligações cruzadas com as microfibrilas de
celulose e com a lignina. As xilanas estão presentes nas plantas dicotiledôneas e constituem cerca
de 5% da parede primária e 20% da parede secundária. (HATFIELD et al., 1999; AWANO et al.,
2001; BINDSCHEDLER et al., 2005).
No caso de dicotiledôneas de fibra curta, como por exemplo, o eucalipto, as cadeias de
xilanas sofrem substituições em algumas ramificações com grupos de 4-O-metilglucurônico e
ácido glucurônico (EBRINGEROVA; HEINZE, 2000; O’NEILL; YORK, 2003).
15
As características dos polissacarídeos hemicelulósicos, presentes na madeira utilizada na
indústria de celulose e papel, têm influência direta no processo de polpação, mesmo sendo a
celulose o componente da polpa que confere resistência às fibras. Polpas com altos teores de
celulose e baixos teores de hemiceluloses apresentam menor resistência no processo de refino. Já
em altas concentrações, as hemiceluloses protegem a celulose de reações de despolimerização,
aumentando o rendimento no processo de polpação (WAGBERG; ANNERGREN, 1997).
Modificações das características das plantas com importância econômica, em particular as
que são utilizadas para a produção de papel e celulose, implicam praticamente em técnicas de
alteração da composição química da parede celular. Para melhorar as propriedades químicas das
fibras, são necessários conhecimentos dos processos moleculares que formam a parede celular
(REITER, 2002). A estrutura formada pela matriz de polissacarídeos estabelece as propriedades
anatômicas da fibra, tais como: comprimento, largura e espessura da parede celular, e estas
propriedades controlam diretamente a qualidade do papel e da polpa. Portanto, acredita-se que,
mudanças no metabolismo envolvido no processo de formação da parede celular altere a
deposição dos polissacarídeos resultando em fibras com melhores características para a produção
de celulose e papel.
Uma das possíveis estratégias para alterar o conteúdo de polissacarídeos nas fibras
vegetais está baseada na modulação da via biossintética dos nucleotídeos-açúcares, uma vez que,
a manipulação destes componentes pode resultar em efeitos quantitativos e qualitativos na matriz
de polissacarídeos (BOLWELL, 2000). Portanto, com o objetivo de alterar a composição dos
polissacarídeos da parede celular das plantas superiores, de forma a alterar o fluxo metabólico da
síntese de hemiceluloses, promoveu-se a modulação da expressão do gene ugdh, responsável pela
codificação da enzima UDP-glicose desidrogenase (EC 1.1.1.22), que converte UDP-glicose em
UDP-glucuronato (UDP-ácido glucurônico). O UDP-glucuronato é o principal precursor da
biossíntese de polissacarídeos pécticos e hemicelulósicos. Desta forma acredita-se que a
superexpressão do gene ugdh, no sentido de se aumentar o conteúdo de UDP-glucuronato,
aumente também o conteúdo de polissacarídeos hemicelulósicos, em especial a xilose. Na planta,
modificações no conteúdo de xilose podem melhorar as características da fibra resultando em um
incremento de grande interesse em aplicações industriais.
Neste trabalho plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) foram utilizadas, por serem
consideradas plantas modelo pelas característica que apresentam tais como: boa adaptação na
16
cultura de tecidos, alta susceptibilidade à infecção por Agrobacterium tumefaciens, fácil
manipulação molecular, ciclo curto e também por possuir tecido xilemático bem definido com
células de parede secundária (BOUDET, 1998, 2003; BOERJAN et al., 2003).
O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o impacto da superexpressão do gene ugdh, na
composição dos polissacarídeos e outros componentes da parede celular, bem como
características anatômicas do caule e dos elementos fibrilares, comparando as plantas
transgênicas às controles.
Com base nos resultados obtidos com as plantas transgênicas de tabaco, a mesma
estratégia pode ser aplicada para espécies economicamente importantes, como é o caso do
eucalipto.
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Parede celular
A parede celular é uma das principais estruturas da célula vegetal, constituída por
agrupamentos de macromoléculas heterogêneas. Sua composição é muito diversificada. A além
dos polissacarídeos, existem também pequenas quantidades de proteínas e substâncias fenólicas.
As proporções destes componentes químicos na parede celular sofrem significativas alterações
durante a vida da planta. A parede celular é uma estrutura muito complexa que possue diversas
funções. Proporciona às células rigidez mecânica, mantêm a sua morfologia, controla a expansão
celular e transporte intercelular, protege a célula contra uma grande quantidade de organismos
potencialmente patogênicos e predadores, e também participa na comunicação intercelular. Como
muitas destas funções são exigidas ao mesmo tempo em vários estádios de desenvolvimento do
vegetal, a parede celular possui simultaneamente, grande flexibilidade com um máximo de
resistência, devido a um sofisticado controle metabólico, com regiões de extrema complexidade,
com altos conteúdos de polissacarídeos, proteínas e compostos fenólicos. Assim, a determinação
da composição exata destas substâncias na parede celular, fornece importantes informações para
o esclarecimento das funções específicas que determinado tipo de célula possui (NORTHCOTE,
1972; BRETT; WALDRON, 1990; CARPITA; GIBEAUT, 1993; GIBEAUT; CARPITA, 1994;
DHUGGA, 2001; RAVEN et al., 2001).
Morfologicamente, a parede celular é dividida em três regiões distintas, a lamela média,
parede primária e parede secundária (Figura 1). A lamela média é a região de intersecção entre
duas células. Esta camada intercelular é rica em substâncias pécticas mergulhadas em um meio
aquoso (CARPITA; MAcCANN, 2000; RAVEN et al., 2001).
A parede primária de grande parte dos vegetais é composta por três estruturas
independentes, as microfibrilas de celulose (~30%), os polissacarídeos não-celulósicos, que
incluem hemiceluloses (~30%) e pectinas (~30%) e as proteínas estruturais (~10%). A parede
primária é produzida por células em expansão podendo assim, se alongar com crescimento difuso
ou orientado (HAYASHI, 1989; MCCANN; ROBERTS, 1991; CARPITA; GIBEAUT, 1993;
RAVEN et al., 2001). Estas estruturas estão localizadas em duas interfases, a microfibrilar e a
matricial. A microfibrilar distingue-se da matricial pelo alto grau de cristalinidade visível ao
microscópio eletrônico e por possuir composição química homogênea, sendo constituída
basicamente de microfibrilas de celulose, normalmente arranjadas em padrão helicoidal,
18
ordenadas em estruturas longas e finas, unidas por pontes de hidrogênio (ROLAND et al., 1992).
Juntamente ao longo das microfibrilas de celulose estão os polissacarídeos não-celulósicos ou
hemicelulósicos, localizados em zonas amorfas sem orientação regular. A fase matricial consiste
de polissacarídeos, compostos pécticos, glicoproteínas e substâncias fenólicas, de composição
variada nas diferentes camadas da parede, tipos de células e diferentes fases do ciclo celular
(CARPITA; GIBEAUT, 1993; TAIZ; ZEIGER, 2004).
Quando o crescimento celular é finalizado, inicia-se o processo de diferenciação celular,
com início da formação da parede secundária. A transição da parede celular primária para a
formação da parede secundária é marcada pela redução da síntese de pectina e um grande
aumento na síntese de celulose, hemiceluloses e lignina (RAVEN et al., 2001).
LAMELA
MÉDIA
ÂNGULO
FIBRILAR
LÚMEM
PAREDE
SECUNDÁRIA
PAREDE
PRIMÁRIA
S1
S2
S3
Figura 1 - Esquema da célula vegetal com detalhes dos diferentes camadas da parede celular secundária (S1, S2 e
S3), a parede primária e a lamela média entre as paredes primárias de células adjacentes
(KRETSCHMANN, 2003)
19
A lignificação é a fase final da diferenciação celular, onde a lignina depositada estabelece
ligações covalentes e não covalentes com a matriz de carboidratos, formando o chamado
complexo lignina-carboidratos (SARKANEN, 1998; LAWOKO, 2005). O processo de
diferenciação destas células resulta em uma intensa lignificação e na morte celular programada.
A lignificação da parede celular tem início na região da parede celular primária e se estende em
dois sentidos, para o exterior em direção à lamela média, ou para o interior da célula, onde se
desenvolve a parede secundária (TAIZ; ZEIGER, 2004). Células com parede celular secundária
são muito rígidas, como é o caso das fibras e elementos vasculares, e são extremamente
importantes para a sustentação do vegetal, atuando no suporte e condução de água e outros
fluídos na planta (HOPKINS, 1995).
A parede celular secundária contem tipicamente três camadas distintas, S
1
, S
2
e S
3
, as
quais são diferenciadas, em espessura, composição e orientação das microfibrilas de celulose. A
camada exterior S
1
é a mais fina (0,1-0,35 µm) e representa apenas 5-10 % da espessura total da
parede celular. Nesta camada as microfibrilas de celulose formam um ângulo de 60-80
o
em
relação ao eixo da célula. A camada intermediária S
2
é a mais espessa (1-10 µm) e representa 75-
85 % da espessura total da parede celular, e a orientação das microfibrilas forma um ângulo de 5-
30
o
em relação ao eixo da célula. As características relacionadas à espessura e à orientação das
microfibrilas influenciam diretamente as propriedades físicas e mecânicas da célula. Assim, a
camada S
2
é a mais importante na parede celular. Já a camada S
3
é relativamente fina (0,5-1 µm),
e forma um ângulo de 60-90º em relação ao eixo da célula (FENGEL; WAGENER, 1984;
EMONS; MULDER, 2000; PLOMION et al., 2001; MELLEROWICZ, et al., 2001).
Numa célula com parede celular secundária, a camada que compreende a lamela média e a
parede celular primária é rica em substâncias pécticas quando comparada ao restante do material.
A camada S
3
e parte interior da S
2
têm um conteúdo de celulose mais elevado, enquanto a
camada S
1
e a parte exterior da camada S
2
são relativamente ricas em hemiceluloses
(SELVENDRAN, 1983; TAIZ; ZEIGER, 2004).
A celulose e as hemiceluloses são os componentes da parede celular com maior
importância econômica para o setor de papel e celulose. Portanto, conhecer o mecanismo de
regulação da biossíntese da celulose e hemiceluloses é um pré-requisito para alterarmos as
características das fibras e isto pode ser alcançado através de técnicas de biologia molecular
(REITER, 2002).
20
Os avanços tecnológicos são enormes no sentido de elucidar os mecanismos de formação
da parede celular, que envolvem um grande número de genes, relacionados à biogênese,
organização e também a mudanças estruturais. Em plantas de Arabidopsis aproximadamente 15%
do seu genoma está relacionado ao processo de formação e modificação da parede celular, o que
nos dá uma idéia da complexidade da estrutura e formação da parede celular das plantas em geral
(CARPITA et al., 2001).
2.2 Componentes químicos da parede celular
2.2.1 Celulose
A celulose encontrada na parede celular das plantas é a biomolécula mais abundante na
natureza. Todos os anos as plantas produzem aproximadamente 180 bilhões de toneladas de
celulose. Esta biomolécula tem enorme valor comercial para diversos setores industriais, em
particular pode-se destacar o setor de produção de celulose e papel (FRY, 1988; ENGLEHARDT,
1995).
A celulose é produzida na forma de microfibrilas de celulose, (semi)-cristalina em cadeias
lineares de β 1,4 D Glicose ligadas por pontes de hidrogênio (Figura 2) (DELMER, 1999). Cada
microfibrila de celulose consiste de aproximadamente 36 cadeias lineares de glicose, cuja
organização determina as propriedades mecânicas da célula e promovem o suporte e resistência à
parede celular (FRY, 1988; EMONS; MULDER, 2000; EMONS et al., 2002). Em geral, a parede
primária contém de 10 a 40% de celulose e a secundária aproximadamente 40 a 60% (McNEIL et
al., 1984; BACIC et al., 1988).
2.2.2 Hemiceluloses
As hemiceluloses são formadas por diversos grupos de polissacarídeos interligados às
microfibrilas de celulose. Na parede primária das plantas dicotiledôneas, as hemiceluloses mais
abundantes são as xiloglucanas, representando aproximadamente 20% (FRY, 1988).
As xiloglucanas são polissacarídeos cuja cadeia principal é constituída por unidades de
(1,4)-β-D-Glicose (Glic) (Figura 2). Mas, grande parte dos resíduos de glicose encontram-se
ramificados no carbono-6 por resíduos de α-D-Xil, encontrando alguns destes resíduos de xilose
substituídos no carbono-2 por resíduos de β-D-Gal ou com α-L-Fuc(1,2)-β-D-Gal. As
xiloglucanas também apresentam função regulatória, pois seus oligossacarídeos, os quais são
21
denominados de oligossacarinas, regulam o crescimento celular. As xiloglucanas são sintetizadas
no complexo de Golgi e então, transportadas para a parede celular (MACNEIL et al., 1984;
HAYASHI, 1989; FOSKET, 1994).
As xiloglucanas estão associadas às microfibrilas de celulose por pontes de hidrogênio, e
promovem a união das microfibrilas de celulose adjacentes. Esta interação parece estar
relacionada às propriedades mecânicas da parede celular (FRY, 1988; HAYASHI et al., 1987;
HAYASHI, 1989; HAYASHI; MACLACHLAN, 1994; WHITNEY et al., 1995, 1999).
As xilanas são cadeias lineares de monossacarídeos com unidades de xilose. Fazem
ligações cruzadas com as microfibrilas de celulose e lignina, representando cerca 5% dos
componentes da parede primária e 20% da parede secundária. (HATFIELD et al., 1999;
AWANO et al., 2001).
Nas cadeias de xilanas ocorrem substituições em algumas ramificações com grupos de 4-
O-metilglucurônico, ácido glucurônico, acetil e arabinose (FRY, 1988; GRUPPEN et al., 1992;
EBRINGEROVA; HEINZE, 2000; O’NEILL; YORK, 2003). A natureza dos grupos substituídos
nas cadeias de xilanas depende do material vegetal. Por exemplo, altos níveis de grupos de
arabinose são encontrados em madeira de coníferas ou “softwood”. Já na madeira de folhosas ou
“hardwood” encontra-se principalmente grupos de ácidos glucurônicos (COUGHLAN;
HAZLEWOOD, 1993).
a
b
β-D-Glic
α-D-Xil
α-L-Fuc
β-D-Gal
Figura 2 - Esquema da estrutura da celulose (a) e xiloglucanas (b)
22
As glucuronoxilanas são os polímeros hemicelulósicos mais abundantes, representando
cerca de 15 a 30% do total desses polissacarídeos na parede celular secundária de árvores de
madeira dura. Há também pequenas quantidades de cadeias de glucomananas, contendo ligações
resíduais de β-1,4-manose e β-1,4-glicose (TIMELL, 1964; SJÖSTROM, 1981; STEPHEN,
1982). Já as galactoglucomananas estão presentes em grande quantidade na parede celular
primária das solanáceas (STEPHEN, 1982).
2.2.3 Pectinas
As pectinas são os principais componentes da lamela média. Sua principal característica é
a de funcionar como um agente cimentante, fazendo a união entre as células. Esta propriedade
está relacionada à determinação de importantes características da parede primária, como por
exemplo, sua porosidade (MOORE et al., 1986).
As pectinas da região da lamela média encontram-se associadas por pontes de Ca
2+
e são
facilmente solubilizadas por extração com agentes quelantes (JARVIS et al., 1981; JARVIS,
1982). Na parede primária, a matriz péctica funciona como um envoltório para as ligações
cruzadas entre celulose e as cadeias de xiloglucanas (CARPITA; GIBEAUT, 1993).
As pectinas originadas da lamela média e da parede celular primária têm características
estruturais diferentes. As da lamela média são menos ramificadas e possuem cadeias laterais mais
curtas do que as da parede celular primária (SELVENDRAN, 1985).
Substâncias pécticas em geral, podem ser polissacarídeos ricos em ácido galacturônico
(GalA), e quando estes polímeros de GalA estão metil-esterificados, são chamados de
polissacarídeos de pectinas. Já quando se encontram desesterificados, são chamados de ácidos
pécticos. Nas paredes celulares também são encontrados os chamados polissacarídeos neutros
(arabinanas, galactanas e arabinogalactanas) que apesar de não possuírem uma cadeia de ácido
galacturônico se encontram geralmente associados a pectinas (TAIZ; ZEIGER, 2004).
Os polissacarídeos pécticos podem ser classificados com base em sua estrutura. As
homogalacturonanas possuem resíduos do ácido galacturônico (GalA) com ligações α (1-4) e
ramnogalacturonanas do tipo I (RG-I), um polissacarídeo com estrutura básica longa e uma
variedade de cadeias laterais. Já as ramnogalacturonanas do tipo II (RG-II), são polissacarídeos
altamente ramificados que contém ao menos dez açúcares diferentes em um padrão complexo de
ligações (TAIZ; ZEIGER, 2004). Assim, acredita-se que a complexidade dos polissacarídeos
23
pécticos da parede celular das plantas esteja fortemente ligada às funções fundamentais para a
organização e o padrão celular (O’NEILL et al., 1990).
2.2.4 Lignina
A lignina é o segundo biopolímero mais abundante, superado apenas pela celulose. É um
componente fundamental da madeira, representando cerca de 15 a 35% de seu peso seco. A
lignina é um complexo polimérico com caráter fenólico que é resistente à hidrólise. Sua rigidez e
hidrofobia são importantes para o suporte mecânico. Característica que provavelmente permitiu a
melhor adaptação das plantas. A complexidade deste polímero na célula, lhe confere alta
eficiência na condução de água da base até o topo do vegetal e também na defesa ao ataque de
patógenos. A distribuição do conteúdo de lignina é diferente para cada região da célula. A maior
concentração da lignina está localizada na região da lamela média. Já no interior da parede
celular secundária a concentração é menor (FRY, 1988; TERASHIMA et al., 1993; RAVEN et
al., 2001).
A lignina é biossintetizada nas plantas vasculares em um complexo processo de reações,
iniciado pelo metabolismo do ácido shiquímico, seguido da via do aminoácido aromático L-
fenilalanina. A fenilalanina amônialiase (PAL), é uma enzima que regula o metabolismo fenólico
nas células vegetais, convertendo o aminoácido L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico, que
posteriormente é hidroxilado para ácido ρ-coumárico. Esse último, pela ações de enzimas
específicas produz os três principais componentes da lignina, o ρ-coumarílico, coniferílico e
sinapílico. Portanto por definição, lignina é um complexo de biopolímeros com estrutura de
natureza aromática, com alto peso molecular, composto por várias combinações de três tipos de
ligninas, a lignina ρ-hidroxi-fenila, lignina guaiacila e siringila, tendo como precursores os três
álcoois do tipo fenilpropanóides (ρ-coumarílico, coniferílico e sinapílico), respectivamente. A
deposição dos monômeros da lignina na parede celular vai depender da espécie vegetal, tipo de
célula e estádio do desenvolvimento do tecido. No complexo polimérico da lignina ocorre uma
variedade de ligações, incluindo ester, éter e carbono-carbono. A ligação éter é dominante,
representando aproximadamente 2/3 das ligações. O restante das ligações são do tipo carbono-
carbono e éster. Como resultado destas ligações, ocorre a formação de uma complexa rede
tridimensional hidrofóbica, com importantes ligações covalentes e não covalentes com a celulose
e as hemiceluloses, em particular com as cadeias de xilanas (BOLWELL, 1993; SJÖSTRÖM,
24
1993; WHETTEN et al., 1998; BOUDET, 1998, 2003; ANTEROLA; LEWIS, 2002; BOERJAN
et al., 2003).
2.3 Biossíntese da parede celular
A fotossíntese pode ser considerada como o processo biológico mais importante para os
vegetais superiores. Através desde mecanismo as células fotossintetizantes captam a luz solar e a
convertem em diferentes formas de energia química, sendo os carboidratos as formas mais
importantes. Os diferentes tipos de carboidratos sintetizados podem ser usados como precursores
de vários componentes celulares (aminoácidos, lipídios e ácidos nucléicos) e também como
componentes estruturais da parede celular. A biossíntese dos componentes da parede celular, tais
como celulose, hemiceluloses, pectina e lignina dependem do fornecimento dos açúcares que
foram fixados pelo processo fotossintético (TAIZ; ZEIGER, 2004).
A parede celular é constituída de vários polissacarídeos formando uma rede estrutural
complexa. Para organizar essa rede de polissacarídeos, a célula necessita de um amplo
mecanismo biossintético. Assim, estima-se que aproximadamente 2000 genes estão envolvidos
no processo de biossíntese e manutenção da parede celular (CARPITA et al., 2001; PERRIN et
al., 2001).
O processo central da biossíntese de polissacarídeos é realizado pela ação das
glicosiltransferases (GTs). Essas enzimas formam ligações glicosídicas com misturas de
açúcares, mais precisamente com os nucleotídeos-açúcares da região citoplasmática. Este
processo conhecido como via de interconversão dos nucleotídeos-açúcares (Figura 3), envolve
inúmeras reações enzimáticas (REITER; VANZIN, 2001).
A biossíntese dos polímeros da parede celular ocorre em diferentes regiões da célula. Por
exemplo, a celulose é sintetizada na superfície da membrana plasmática pelas proteínas de
celulose sintase (CesA), que formam um complexo protéico em forma de rosetas na superfície da
membrana plasmática (BROWN, 1996; DELMER, 1999; KIMURA et al., 1999), Já as
hemiceluloses e os polissacarídeos pécticos são sintetizados no complexo de Golgi (GIBEAUT;
CARPITA, 1994; SCHEIBLE; PAULY, 2004). Nesse caso, os nucleotídeos-açúcares devem ser
transportados para dentro do lume do complexo de Golgi para que os polissacarídeos sejam
sintetizados (KEEGSTRA; RAIKHEL, 2001). No interior do complexo de Golgi as GTs
transferem um resíduo de açúcar para a cadeia dos polissacarídeos em construção, formando o
25
complexo polimérico, que é então transportado via vesículas secretoras do complexo de Golgi,
para a superfície da parede celular (DOBLIN et al., 2003; SCHEIBLE; PAULY, 2004).
Os nucleotídeos-açúcares são monossacarídeos que têm moléculas de nucleotídeos ligadas
a carboidratos e esta conjugação de moléculas gera energia para a célula. Os dois principais
nucleotídeo-açúcares são ADP-Glicose (ADP-Gli) e UDP-Glicose (UDP-Gli), que são os
formadores dos dissacarídeos e polissacarídeos, tais como a sacarose, amido e celulose. O UDP-
Gli é o UDP-açúcar mais importante para a formação da parede celular, sendo precursor primário
dos polímeros de celulose, hemiceluloses e pectinas (GIBEAUT, 2000; SEIFERT, 2004). Os
açúcares precursores dos polímeros da parede celular são, UDP-arabinose (UDP-Ara), UDP-
xilose (UDP-Xil), ácido UDP-galacturônico (UDP-GalA), UDP-apiose, que são sintetizados a
partir de um precursor comum, o ácido UDP-glucurônico (UDP-GlcA), considerado como um
intermediário biossintético essencial de muitos precursores da matriz de polissacarídeos (SEITZ
et al., 2000; REITER; VANZIN, 2001). O UDP-GlcA, pode ser irreversivelmente formado a
partir de UDP-Gli pela enzima UDP-D- glicose desidrogenase (UGD, EC 1.1.1.22) ou através de
uma via alternativa conhecida como via de oxigenação do inositol (SEITZ et al., 2000). Existem
evidências de que as duas vias metabólicas coexistem, variando a importância de cada rota
durante o desenvolvimento da planta (ROBERTS; LOEWUS, 1973; VERMA; DOUGALL,
1979; RUBERY, 1972; DALESSANDRO; NORTHCOTE, 1977
a, 1977 b; WITT, 1992).
A biossíntese de UDP-xilose é mediada pela enzima UDP-glucuronato descarboxilase
(EC 4.1.1.35), que catalisa a conversão de UDP-D-glucuronato a UDP-D-xilose, em uma reação
irreversível (DALESSANDRO; NORTHCOTE, 1977a; BAR-PELET et al., 2001). Até o
momento têm sido propostas duas vias através das quais sintetiza-se o UDP-glucuronato a partir
de glicose-6-fosfato; a via de oxidação dos nucleotídeos-açúcares e a via de oxidação do mio-
inositol (SEITZ et al., 2000).
A primeira via enzimática, denominada via de oxidação dos nucleotídeo-açúcares (SNOP,
Sugar Nucleotide Oxidation Pathway) consiste da conversão, por meio da ação da enzima
fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2), de D-glicose-6-fosfato a D-glicose-1-fosfato. Logo formada, a
glicose 1-fosfato é convertida em UDP-glicose pela enzima UDP-glicose pirofosforliase (EC
2.7.7.9). Finalmente, a enzima UDP-glicose desidrogenase (EC 1.1.1.22) e uma uridiltransferase
são as responsáveis pela conversão do açúcar UDP-glicose a UDP-glucuronato (LOEWUS;
LOEWUS, 1983; LOEWUS; MURTHY, 2000). A UDP-glicose desidrogenase é uma enzima
26
dependente de NAD
+
. Tanto a uridiltransferase, que constitui a UDP-glicose, quanto a
desidrogenase, sofrem retroinibição, o que significa que são fortemente inibidas pelos produtos
da reação. Além disso, estas enzimas sofrem inibição por certos produtos derivados do ácido
UDP-glucurônico, como a UDP-xilose. O requerimento de NAD+ e as restrições cinéticas
impostas pelos produtos inibidores são aspectos muito importantes nesta via de síntese de ácido
UDP-glucurônico (NELSETUEN; KIRKWOOD, 1971; FEINGOLD, 1982; KLECZKOWSKI,
1994; KÄRKÖNEN, 2005).
A outra via de síntese do UDP-glucuronato é conhecida como via de oxidação do mio-
inositol (MIOP, Myo Inositol Oxidation Pathway). Esta via metabólica não requer diretamente a
síntese de UDP-glicose, nem a redução acoplada ao NAD
+
, para produzir UDP-glucuronato. A
conversão do mio-inositol livre, em UDP-glucuronato é catalisada por três enzimas: MI
oxigenase (E.C.1.13.99.1), glucuronoquinase (E.C.2.7.1.43) e glucuronato 1-fosfato uridiltrans-
ferase (E.C.2.7.7.44). O UDP-glucuronato é o principal metabólito da biossíntese dos
nucleotídeos-açúcares (UDP-D-xilose, UDP-D-apiose, UDP-D-arabinose e UDP-D-
galacturonato), sendo assim considerado o intermediário central na síntese de polissacarídeos da
parede celular. A importância deste metabólito para a biossíntese da parede vegetal é tão crucial
que em folhas de Arabidopsis, por exemplo, foi demonstrado que aproximadamente 50% da
massa da parede celular é produzida através dos derivados de UDP-glucuronato (ZABLACKIS et
al., 1995; SEITZ et al., 2000; REITER; VANZIN, 2001).
Apesar de ainda não existir uma elucidação completa de como os fluxos metabólicos dos
diversos nucleotídeos-açúcares afetam a biossíntese de polissacarídeos da parede celular, é
necessária a caracterização genética das enzimas envolvidas na via de interconversão dos
nucleotídeos-açúcares. Essas informações são importantes para o entendimento da regulação das
complexas rotas metabólicas, de forma a permitir assim, modificações do conteúdo de
polissacarídeos da parede celular. As técnicas de biologia molecular podem auxiliar assim, na
modulação da expressão de alguns genes envolvidos no processo de síntese da parede celular
(REITER; VANZIN, 2001; HARPER; BAR-PELED, 2002).
27
PAREDE CELULAR
Xilanos
2.4.2.24
UDP-Xilose PAREDE CELULAR
4.1.1.35
2.7.7.44 2.7.1.43
UDP-glucuronato Glucuronato 1-P Glucuronato
2.4.1.17 3.2.1.31
1.1.1.22
1.13.99.1
UDP-glicose
2.4.1.12 2.7.7.9
Mio-inositol
Celulose Glicose 1-P
5.4.2.2 3.1.3.25
5.5.1.4
Glicose 6-P Inositol 1-P
Figura 3 - Representação esquemática da formação de xilanos, celulose e glucuronato a partir do açúcar Glicose 6-P
na via de oxidação de açúcares nucleotídeo (SNOP) e através da via de oxidação do mio-inositol (MIOP).
5.5.1.4, mio-inositol 1-fosfato sintase (MIPS); 3.1.3.25, mio-inositol monofosfatase (IMP); 1.13.99.1,
mio-inositol oxigenase (MIOX); 3.2.1.31, β-glucuronidase; 2.7.1.43, glucuronoquinase; 2.4.1.17,
glucuronosil-transferase; 2.7.7.44, glucuronato 1-P uridiltransferase; 5.4.2.2, fosfoglucomutase; 2.7.7.9,
UDP-glicose pirofosforilase; 1.1.1.22, UDP-glicose desidrogenase; 4.1.1.35, UDP-glucuronato
descarboxilase; 2.4.2.24, 1-4 β-D-xilano sintase; 2.4.1.12, celulose sintase
UDP-Arabinose
28
2.4 Enzima UDP-D-glicose desidrogenase (EC 1.1.1.22)
A enzima UDP-glicose desidrogenase (UGDH) é extremamente importante para a
formação de hemiceluloses e pectinas; componentes essenciais da parede celular das plantas
superiores (JOHANSSON et al., 2002). Como primeiro passo para formação dos açúcares
constituintes da parede celular, a reação de conversão de UDP-açúcar é catalisada pela UGDH,
que converte o substrato UDP-glicose (UDP-Glic) a UDP-D-glucuronato (UDP-GlcUA) (Figura
4). O UDP-GlcUA é o precursor direto da síntese de pectinas e importantes hemiceluloses, tais
como xilose e conseqüentemente arabinose (REITER; VANZIN, 2001).
O gene ugdh foi clonado e estudado em diferentes espécies vegetais, tais como soja
(TENHAKEN; THULKE, 1996), Arabidopsis (SEITZ et al., 2000) e álamo (JOHANSSON et al.,
2002) e recentemente de Eucalyptus grandis (LABATE et al., 2007 submetido). Segundo esses
autores, os genes udpgdh são altamente conservados entre as espécies vegetais quando se refere à
composição de aminoácidos e também apresentam homologia com as seqüências de mamíferos.
Nas plantas, a proteína UGDH é encontrada na região citoplasmática da célula, tem peso
molecular ao redor de 52-53 kDa e pode sofrer retroinibição por UDP-xilose (DAVIES;
DICKINSON, 1972; DALESSANDRO; NORTHCOTE, 1977; HINTERBERG et al., 2002;
TURNER; BOTHA, 2002). Nos vegetais, foi verificado que o nível de expressão da enzima
UGDH está associado ao estádio de desenvolvimento do tecido vascular, indicando uma
importante função na síntese da parede secundária (BINDSCHEDLER et al., 2005). A alta
atividade da enzima UGDH foi observada em plantas jovens, mais especificamente em tecido em
crescimento de plântulas de Arabidopsis (SEITZ et al., 2000). Já em álamo, alta atividade
enzimática foi observada na região cambial (DALESSANDRO; NORTHCOTE, 1977).
Figura 4 - Reação realizada pela enzima UDP-glicose desidrogenase (EC 1.1.1.22), que oxida UDP-glicose
UDP-glucuronato, e é dependente de NAD (GAINEY et al., 1975)
29
2.5 Composição química da madeira: influência nas características da polpa celulósica.
A composição química dos vegetais utilizados em diversos setores industriais pode definir
as características do produto final. A determinação dos componentes químicos é de extrema
importância, pois a partir destas informações pode-se definir o comportamento do material
fibroso como, por exemplo, madeira de eucalipto utilizada no processo de polpação para a
produção de papel.
Nas indústrias de celulose e papel, os parâmetros químicos como, teores de extrativos,
conteúdo de lignina, celulose e hemiceluloses, são considerados os mais relevantes e
normalmente são relacionados aos aspectos de rendimento e consumo de produtos químicos
durante o processo de deslignificação (CARVALHO et al., 1998; WALLIS et al., 1996).
Materiais com elevado conteúdo de lignina e extrativos não são desejáveis, pois
estabelecem correlação negativa com o rendimento no processo de polpação. Já, altas frações de
carboidratos são correlacionadas positivamente com o rendimento da polpa (WALLIS et al.,
1996).
A produção da polpa celulósica a partir da madeira envolve uma série de processos, cujo
objetivo principal é o isolamento das fibras, preservando-se componentes como a celulose e as
hemiceluloses (SMOOK, 1990; SANJUAN, 1997). Os componentes não celulósicos, como
lignina e extrativos devem ser removidos, pois estes interferem no processo de fabricação do
papel, assim como comprometem a qualidade do produto final.
No Brasil, o processo de produção de polpa química mais utilizado é o processo kraft, que
envolve o cozimento da madeira com uma solução contendo hidróxido e sulfeto de sódio, a altas
temperaturas, em torno de 160
o
C. Durante este processo é possível remover-se grande parte da
lignina presente na madeira. Entretanto, a polpa resultante ainda apresenta uma coloração escura,
tornando-se necessária a realização de branqueamento a fim de atingir-se níveis de alvura
aceitáveis para as diversas aplicações da celulose (CLARKE et al., 1997; IPT, 1998; GRIMA-
PETTERNATI ; GOFFNER, 1999).
Atualmente muitas empresas do setor e celulose e papel utilizam no processo de
branqueamento da polpa celulósica o peróxido de hidrogênio(H
2
O
2
). Este reagente químico gera
menos compostos tóxicos, mas ainda se utiliza no processo convencional de branqueamento,
reagentes químicos à base de cloro (cloro, dióxido de cloro, hipoclorito de sódio). Esse processo
30
apresenta grandes inconvenientes, como o excessivo consumo de energia e a formação de
compostos organoclorados, especialmente dioxinas e furanos com elevado grau de toxicidade
(mutagênicos e bioacumulativos). Além disso, o grande volume de água utilizado nos processos
de branqueamento e o descarte dessas águas residuárias, com alto teor de organoclorados
constituem um dos mais sérios problemas ambientais do setor de celulose e papel (RAPPE et al.,
1987; ONYSKO, 1993; CLARKE et al., 1997; IPT, 1998).
A determinação do teor de lignina em materiais lignocelulósicos pode ser dividida em
dois tipos, a lignina klason (lignina residual), que se encontra polimerizada na parede celular e é
representada em maior quantidade em materiais lenhosos, e a lignina solúvel, que tem estruturas
químicas menos resistentes à degradação e à solubilização. Acredita-se que a lignina solúvel seja
mais fácil de se remover durante o cozimento alcalino Kraft (GOMIDE et al., 2005).
Gomide e colaboradores (2005) verificaram que clones de eucalipto que apresentam maior
conteúdo de lignina solúvel, também apresentam maior conteúdo de estruturas do tipo siringil em
relação as do tipo guaiacil. As estruturas de lignina do tipo siringil, por não possuírem o carbono
reativo C5 disponível para a reação na etapa de polimerização da biossíntese de lignina,
apresentam estruturas menos condensadas e conseqüentemente, são mais facilmente
deslignificadas nos processos de cozimento kraft.
Além da lignina, o conteúdo de hemiceluloses influência no processo de polpação, mesmo
sendo a celulose o componente da polpa que confere resistência às fibras, polpas com altos teores
de celulose e baixos teores de hemiceluloses são menos resistentes ao processo de refino. Isso
pode ser explicado, pelo fato das hemiceluloses protegerem a celulose contra o processo de
despolimerização (WAGBERG; ANNERGREN, 1997).
As hemiceluloses são muito hidrofílicas e estão relacionadas à habilidade da fibra em
absorver água, o que aumenta a flexibilidade das mesmas assim como a área de contato,
proporcionando ligações interfibrilares mais fortes. Tais fatores favorecem a formação de fibras
mais coesas, que consomem menos energia no processo de refino (WAGBERG; ANNERGREN,
1997; LAINE; HYNYNEN, 1997; BARZYC et al., 1997).
O conteúdo das hemiceluloses encontrado na pasta celulósica é determinado
principalmente pelo álcali ativo do processo de cozimento da madeira. Assim, quando se utiliza
uma alta concentração alcalina, menor é a retenção das hemiceluloses e conseqüentemente tais
31
condições alteram as propriedades físico-químicas da polpa (índice kappa, viscosidade, alvura e
rendimento).
A principal hemicelulose encontrada na madeira de eucalipto (fibra curta) é a xilana, que
é caracterizada por uma estrutura central formada por resíduos 1,4 β-xilose e por algumas
ramificações com grupos de 4-O-metilglucurônico e ácido glucurônico (FRY, 1989; HAYASHI,
1989).
No processo de polpação, as condições de alta temperatura e alcalinidade, favorecem a
formação dos ácidos hexenurônicos (AHexs), pelas modificações dos ácidos 4-O-
metilglucurônico e ácido glucurônico presentes nas xilanas. A formação destes compostos tem
um grande impacto no processo de produção de polpa kraft branqueada. Estes ácidos formam
ligações covalentes com a lignina, consumindo reagentes químicos eletrofílicos de
branqueamento (cloro, dióxido de cloro, ozônio e perácidos). Os AHexs são responsáveis por
uma fração significativa do índice Kappa (lignina da polpa kraft), principalmente para as de fibra
curta (JIANG et al., 2000; COSTA et al., 2001). Por outro lado, os AHexs contêm grupos
funcionais de enol-éter e carboxila relativamente estáveis sob condições alcalinas. Tais estruturas
protegem as xilanas contra a reação de despolimerização terminal, preservando assim o
rendimento da polpa durante o tratamento alcalino a altas temperaturas (COSTA et al., 2001).
2.6 Características das fibras: influência nas propriedades da polpa celulósica.
As espécies vegetais apresentam elevada diversidade de células, com diferentes formas e
dimensões (traqueídeos, células do parênquima, elementos de vaso e fibras do xilema e do
floema) (Figura 5).
As fibras são células peculiares das angiospermas e nas espécies lenhosas representam
cerca de 20-80% do seu lenho. Normalmente, desempenham a função de sustentação (BURGER;
RICHTER, 1991). Especificamente para o eucalipto, a porcentagem total de fibras (fibras
libriformes + fibrotraquídes) é de 65%, a de vaso 17%, e a de tecido parenquimatoso é de 18%
(FOELKEL; BARRICHELO, 1975a; BARRICHELO; BRITO, 1976). Por definição, as fibras
são células alongadas e afiladas, que fornecem suporte mecânico às plantas vasculares.
Geralmente ocorrem em feixes, sendo sua maior característica a espessa parede celular
secundária, constituída basicamente de microfibrilas de celulose e uma matriz de lignina e
hemiceluloses.
32
As fibras são praticamente classificadas de acordo com o local onde são originadas;
fibras foliares, fibras de sementes e fibras do xilema (madeira) (RAVEN et al., 2001).
Várias são as fontes vegetais utilizadas comercialmente para o fornecimento de fibras,
entre elas podemos destacar, o eucalipto (Eucalyptus ssp), algodão (Gossypium hirsutum),
cânhamo (Cannabis sativa), linho (Linum usitatissimum), etc. Estas fibras vegetais naturais têm
um amplo mercado de aplicações, como por exemplo, o setor de celulose e papel que utiliza
principalmente fibras do xilema de árvores de eucalipto.
No estádio jovem das árvores de eucalipto, o câmbio vascular produz uma madeira
chamada de juvenil. A madeira juvenil tem algumas características não desejáveis para produção
da celulose e papel. Este tipo de madeira contém alto conteúdo de lignina e baixo teor de
celulose, além de produzir fibras com menor comprimento. Estas características vão sendo
modificadas com a idade. Portando, o aumento do comprimento das fibras em função da idade é
o resultado do aumento do comprimento das células que as originam, denominadas de iniciais
fusiformes. A estabilização do comprimento das fibras, para inúmeras espécies de eucalipto,
somente irá ocorrer quando as células do câmbio atingirem comprimento máximo, iniciando a
formação da madeira adulta (TOMAZELLO FILHO, 1987).
vaso
fibra
B
A
CD
Figura 5 - Ilustração dos elementos celulares e tecido xilemático presente em espécies lenhosas, adaptado dos site
http://unisanta.br/imagens/anatomia/xilema/macerado.html e http//biologia.edu.ar/botanica/images. (A)
corte transversal de um tronco de uma espécie lenhosa, (B) tecido xilemático, (C) bloco didático
orientado do tecido xilemático, (D) elementos celulares constituintes do xilema das angiosopermas, a-
elementos de vaso, b-fibras, c-células do parênquima
a
33
As características das fibras como, comprimento e largura, controlam diretamente as
propriedades do papel produzido. Em particular, o comprimento da fibra está associado à
resistência ao rasgo e às dobras (DINWOODIE, 1965: CARVALHO, 1998).
O papel produzido a partir de fibras de eucalipto (fibra curta), pode ter qualidade inferior
em relação à resistência ao rasgo. Essa característica indesejável pode ser reparada com a
incorporação de fibras de algumas coníferas (fibra longa) às polpas de folhosas (BAMBER,
1985). As fibras mais curtas têm menor tendência para flocular no processo de fabricação do
papel, o que resulta em uma melhora na formação da folha e lisura superficial, favorecendo a
produção de papel com uma distribuição mais homogênea dos poros. Essa característica beneficia
a absorção de tinta, e conseqüentemente resulta em uma melhor qualidade de impressão
Outra característica muito importante para as propriedades do papel é a largura da fibra.
As fibras mais largas produzem um papel com menor resistência ao ar, maior volume específico
aparente e maior resistência ao rasgo. A espessura da parede também é uma característica
anatômica importante da fibra e geralmente está relacionada à rigidez. As fibras com maior
espessura de parede podem sofrer maior desfibrilamento durante o processo de refino, o que
aumenta o potencial de ligações interfibrilares e conseqüentemente a resistência à tração do papel
(CARVALHO et al., 1998).
Pela determinação das características das fibras tais como, comprimento, largura,
diâmetro do lúmem e espessura da parede celular, pode-se avaliar alguns fatores da qualidade das
fibras para a fabricação de papel. Fatores como índice de Runkel, fração parede, coeficiente de
flexibilidade, são os mais usados na avaliação das fibras.
O índice de Runkel, proposto pelo próprio Runkel (1952), relaciona duas características
importantes da fibra, o diâmetro do lúmem e a espessura da parede celular. Esse índice considera
que, fibras de madeira com índice baixo, favorecem a produção de polpas de boa qualidade e com
boa capacidade de integração.
A fração parede mede a relação, expressa em porcentagem, entre a espessura da parede
celular e a metade da largura da fibra. Em geral se a fração parede é alta, ou seja, acima de 40%,
isso indica que as fibras são extremamente rígidas, e apresentam pouca flexibilidade com
diminuto potencial de ligação. Esse tipo de fibra tende a dar origem a um papel com volume
específico aparente alto. Devido a esta característica, quando as fibras são comprimidas durante a
formação do papel, o grau de colapso é menor do que as fibras com frações parede baixas
34
(GONÇALEZ et al., 1986). Na seleção de madeira destinada à produção de papel, foram
qualificadas, segundo Paula (1999) a madeira com índice de fração parede menor, como sendo a
de melhor qualidade para a produção de papel.
O coeficiente de flexibilidade é normalmente expresso em porcentagem pela relação entre
o diâmetro do lúmem e a largura da fibra. A flexibilidade da fibra influencia o número de
ligações interfibrilares. Na prática, este parâmetro indica o grau de achatamento (colapso) que as
fibras sofrem durante o processo de fabricação do papel. (FOLKEL; BARRICHELO, 1975b). O
coeficiente de flexibilidade possibilita avaliar a capacidade de flexão da fibra e o potencial de
ligações interfibrilares, sendo correlacionado diretamente à resistência à tração e ao
arrebentamento (GONÇALVEZ et al., 1986).
As medidas das dimensões das fibras devem ser realizadas em amostras retiradas da
madeira ou do material lenhoso, e não da polpa branqueada, devido a três fatores. Primeiramente,
quando a madeira é reduzida a cavacos, cortam-se muitas fibras, e isso pode interferir nas
medições. Em segundo lugar, as condições de polpação e branqueamento alteram as dimensões
das fibras. Durante esses processos, a lignina e as hemiceluloses são solubilizadas da parede
celular, o que tornam as fibras mais finas. E finalmente, durante o processo de polpação as fibras
sofrem tratamentos mecânicos em misturadores, e desintegradores que deformam as mesmas e
induzem curvaturas que podem distorcer as mensurações (TREPANIER, 1998; LEVLIN;
SÖDERHJEM, 1999; BRAATEN; MOLTEBERG, 2004).
2.7 Cromatografia dos Carboidratos
O conhecimento da composição química de determinados materiais lignocelulósicos, em
particular o conteúdo de carboidratos presentes na madeira e também na polpa celulósica
utilizada na indústria de celulose e papel é muito importante. Assim, a análise de carboidratos,
tornou-se uma importante ferramenta para a determinação da qualidade da madeira. Portanto, a
partir da composição dos carboidratos pode-se destinar a madeira para diferentes processos de
fabricação do papel.
As técnicas cromatográficas destinadas à análise de carboidratos receberam inúmeras
modificações nos últimos 40 anos. As primeiras separações cromatográficas utilizavam
cromatografia de papel com detecção fotométrica, mas tal técnica era pouco sensível. No inicio
da década de 70, surgiu a cromatografia a gás, que ofereceu rápidas separações e boa
35
reprodutibilidade na determinação de monossacarídeos (BORCHARDT; PIPER, 1970). Com a
obtenção de ótimos resultados, em meados da década de 70, a cromatografia gasosa já substituía
a cromatografia de papel em muitos laboratórios da indústria de celulose e papel. Entretanto, essa
técnica também possuía suas limitações. A técnica era muito demorada e utilizava grande
quantidade de reagentes para derivatizar os carboidratos, convertendo os monossacarídeos em
derivados voláteis.
Com o objetivo de eliminar o processo de derivatização dos carboidratos, novos métodos
surgiram, e a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC- High-Performance
Liquid Chromatography) se desenvolveu rapidamente. Devido a altos investimentos nesta área,
uma nova vertente da cromatografia líquida de alta eficiência surgiu em meados da década de 80.
Como resultado dos avanços tecnológicos, o desenvolvimento da cromatografia de troca aniônica
HPAE (High Performance Ânion Exchange) permitiu a obtenção de melhores resultados nas
análises de monossacarídeos. E em seguida, o acoplamento ao detector amperométrico pulsante
PAD (Pulsed Amperometric Detection), possibilitou a quantificação direta dos carboidratos de
baixa concentração, e com um mínimo de preparação e purificação da amostra (ROCKLIN;
POHL, 1983).
O princípio da cromatografia de troca aniônica se baseia na natureza ácida fraca dos
carboidratos, e na capacidade de separação altamente seletiva em condições de pH elevado. Nas
análises de monossacarídeos, utilizam-se colunas com fase estacionária de forte troca aniônica.
Tais colunas são muito eficientes, pois os carboidratos são separados segundo suas constantes de
dissociação (pKa). Assim, quanto menor o valor do pka maior é a acidez e ionização deste
monossacarídeo que permanece mais tempo no interior da coluna. A detecção destes carboidratos
é efetuada por medição da corrente elétrica gerada pela oxidação do carboidrato na superfície do
eletrodo de ouro (DIONEX CORPORATION, 1993).
Na cromatografia de troca aniônica são utilizados como eluentes soluções fortemente
alcalinas, normalmente de hidróxido de sódio (NaOH). Tais eluentes ativam a ionização dos
grupos carboxilos dos carboidratos, promovendo a perda de carga positiva (H
+
). Assim os
carboidratos ficam carregados negativamente, o que possibilita a interação dos carboidratos com
o enchimento da coluna que se encontra carregada positivamente (LEE, 1990).
36
2.8 Características das plantas de tabaco
As plantas de tabaco são consideradas plantas modelo em estudos de biologia e fisiologia
vegetal por possuírem algumas características importantes como, boa adaptação à cultura de
tecido e alta susceptibilidade à infecção por Agrobacterium tumefaciens. Além de ser uma planta
de ciclo curto, o que possibilita avançar rapidamente nas gerações seguintes, o tabaco também
tem a capacidade de produzir tecido xilemático bem definido, o que justifica o fato de ser
amplamente utilizado em pesquisas relacionados à parede celular (BOUDET, 1998, 2003;
BOERJAN et al., 2003).
As plantas de tabaco são excelentes modelos de estudo em experimentos de engenharia
genética, substituindo muito bem espécies como o eucalipto, que embora já tenha sido
transformado por González et al. (2002) não tem ainda uma rotina de transformação genética bem
estabelecida e rápida (TEULIÉRES et al., 1994).
O tabaco é uma dicotiledônea da família das Solanáceas, que apresenta como
particularidade a presença de floema em feixes na região perimedular. O xilema compreende um
segmento em torno de toda a medula (Figura 6). No caule de tabaco adulto que apresenta
estruturas mais desenvolvidas, parte do parênquima se transforma em colênquima. O tecido
xilemático é muito similar ao xilema de espécies lenhosas e apresenta elementos característicos
de plantas vasculares, em particular as fibras e os vasos. Em espécies arbóreas, o tecido
xilemático produz células com parede secundária com várias camadas chamadas de S
1
, S
2
e S
3
,
como ilustrado na Figura 1. Já a parede celular das plantas de tabaco contém somente duas
camadas distinguíveis; a parede primária com a lamela média e a parede secundária. O tecido
medular de caules de tabaco é constituído basicamente de células de parênquima (HEPWORTH;
VINCENT, 1998).
Em plantas herbáceas como é o caso do tabaco, os vasos e as fibras são os principais
elementos lignificados do tecido xilemático, mas a composição de lignina é diferente nesses tipos
de células. Geralmente os vasos são ricos em monômeros de lignina do tipo guaiacil e as fibras
ricas no tipo siringil (FERGUS; GORING, 1970). Esta mesma distribuição dos monômeros de
lignina pode ser encontrada em caules de Arabidopsis, onde os vasos contêm preferencialmente
unidades guaiacil e as fibras são ricas em unidades siringil (CHAPPLE et al., 1992).
37
Figura 6 - Estruturas e elementos do caule de plantas de tabaco em vários aumentos (a), (b), (c), (d) e (e).
Lâmina do macerado de fibras (f), com diversos tipos celulares isolados.
M- região da medula; X- tecido xilemático; PC- parênquima cortical; EN- endoderme; P- pêlos
peridérmicos; CC- camada cambial; RFE- região do floema externo; F-fibra; R-raios; FI-floema
interno; ; V-vaso; C-células parenquimáticas
M
X
PC
EN
P
CC
RFE
R
V
V
R
F
V
C
FI
FI
a
c
d
F
e
b
f
38
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Caracterização das plantas transgênicas e controles
Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum), variedade Petit Havana SR1, foram
obtidas a partir de plantas selvagens (WT) via transformação genética por Agrobacterium
tumafaciens com a linhagem (EHA105)(HOOD et al., 1986) recombinante, contento o gene ugdh
da UDP-glicose desidrogenase (EC. 1.1.1.22) de soja previamente clonado no vetor binário
Gateway pK7WG2D (KARIMI et al., 2002). As linhagens homozigotas para o transgene de
interesse foram selecionadas pela capacidade de enraizamento e crescimento em meio contendo
canamicina (50mg/L) e sucessivas autofecundações e análise genética das progênies da geração
F2. As plantas homozigotas selecionadas da geração F2 foram transferidas para vasos contento
substrato organo-mineral (Plantmax) e vermiculita (tamanho médio) na proporção de (v:v). Essas
linhagens foram previamente submetidas às análises moleculares via Southern (SOUTHERN,
1975) e Northern blot (SAMBROOK, 1989).
Cinco linhagens transgênicas (2M, 42, 51, 55 e 79) e dois controles, (WT e CG), sendo a
linhagem transgênica gateway (CG) obtida pela transformação da linhagem selvagem (WT) com
vetor gateway “vazio” (desprovido do transgene de interesse), foram utilizados nas análises
químicas da parede celular.
3.2 Preparo das sementeiras e condições de cultivo
As sementes das linhagens homozigotas de tabaco transgênicas e das linhagens controles
(WT e CG) foram semeadas em vasos contento substrato organo-mineral (Plantmax) e
vermiculita na proporção de (v:v). As sementeiras foram mantidas por 10 dias em câmaras de
crescimento (CONVIRON E15) sob um regime fotoperiódico de 16 horas de luz e 8 horas de
escuro, fluxo luminoso de 250 µmol m
-2
s
-1
e temperatura de 25
o
C. Após este período, as plântulas
foram transplantadas para vasos individuais, permanecendo na câmara de crescimento por mais 5
dias antes de serem transferidas para a casa de vegetação onde permaneceram até o momento da
coleta do material vegetal para as análises.
3.3 Esquema dos experimentos
Em todas as análises, foram utilizadas 5 plantas por genótipo, sendo dois genótipos
controles (CG e WT), e cinco genótipos transgênicos (2M, 42, 51, 55 e 79), totalizando 35
39
plantas por experimento. Os experimentos foram conduzidos em dois ambientes, casa de
vegetação e câmara de crescimento (Figura 7).
Plantas com 90 dias de idade após a germinação, mantidas em casa de vegetação foram
utilizadas para a determinação dos componentes químicos da parede celular do caule total e dos
diferentes tecidos, xilema e medula separadamente, e também para cortes anatômicos transversais
da região basal do caule. As plantas com 120 dias de idade foram utilizadas para as
determinações das propriedades morfológicas das fibras do tecido xilemático e para os cortes
anatômicos da região basal do caule.
Já as plantas coletadas com 60 dias de idade após a germinação foram cultivadas em
câmaras de crescimento e utilizadas nas análises químicas dos componentes da parede celular do
PLANTAS CASA DE VEGETAÇÃO
PLANTAS COM
90 DIAS
Composição química do xilema
Composição química da medula
Composição química do caule
total
Cortes transversais da região
basal do caule
PLANTAS COM
120 DIAS
Mensurações das fibras do
xilema
Cortes transversais da região
basal do caule
PLANTAS CÂMARA DE CRESCIMENTO
PLANTAS COM
60 DIAS
Quantificação de hemiceluloses
FOLHA CAULE
Quantificação de celulose
Quantificação de celulose
Cortes transversais da região
basal
Quantificação de hemiceluloses
Figura 7 - Fluxograma das análises com plantas cultivadas em casa de vegetação e câmara de crescimento
40
caule e da folha. As secções basais do caule dessas plantas foram utilizadas para cortes
anatômicos.
3.4 Análise das plantas cultivadas em casa de vegetação
3.4.1 Condições de cultivo
Na casa de vegetação as plantas de tabaco foram cultivadas em vasos plásticos de 3L,
distribuídas aleatoriamente entre os canteiros, com regas diárias de água e fertirrigadas com
solução nutritiva (plantmax), três vezes por semana. A casa de vegetação é provida de
luminosidade suplementar, controle de luz através de um “timer” luminoso, num regime
fotoperiódico de 16 horas de luz e 8 horas de escuro.
3.4.2 Coleta do caule
O caule das plantas de tabaco (aproximadamente 25 cm), com 90 dias de idade, foi
cortado próximo à base. O parênquima cortical (casca) foi removido manualmente, restando
praticamente o tecido xilemático e o tecido medular, que foram rapidamente congelados em N
2
líquido (nitrogênio líquido) e liofilizado (câmara de -50
o
C). O material liofilizado foi então
moído em moinho tipo micro-wiley, seguido pelo processo de remoção dos extrativos, para
posteriormente ser utilizado nas análises químicas dos componentes da parede celular. Os
carboidratos (arabinose, galactose, glicose, xilose e manose) foram determinados via HPAE-PAD
(High Performance Ânion Exchange – Pulsed Amperometric Detection). Os outros componentes,
como as ligninas klason e solúvel, foram determinadas por análise gravimétrica e por
espectrofotometria, respectivamente.
3.4.3 Coleta seletiva dos diferentes tecidos do caule
Na coleta seletiva, o caule das plantas de tabaco (aproximadamente 25cm) com 90 dias de
idade, foram utilizados. A casca foi removida e o tecido xilemático foi separado manualmente do
tecido medular, que foram congelados separadamente em N
2
líquido, liofilizados e moídos em
moinho tipo micro-wiley. Após a remoção dos extrativos, as amostras foram utilizadas nas
análises químicas para a quantificação dos componentes da parede celular em cada tecido
separadamente. No tecido xilemático foram quantificados os carboidratos e os ácidos urônicos
41
(ácido galacturônico e ácido glucurônico), também via HPAE-PAD, além das ligninas. No caso
do tecido medular, foram determinados somente os carboidratos e os ácidos urônicos.
3.4.4 Preparo das amostras e remoção dos extrativos
Após a moagem individualizada de cada tecido vegetal (caule total, tecido xilemático e
tecido medular), a serragem final foi peneirada com auxílio de peneiras de 40 e 60 mesh com
agitador para análise granulométrica eletromagnético, de acordo com a Norma ABCP M1
(ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA TÉCNICA DE CELULOSE E PAPEL, 1974). A serragem retida
na peneira de 60 mesh foi transferida para uma plataforma de extração Soxhlet para a remoção
dos extrativos. Os extrativos solúveis em solventes orgânicos, incluem vários compostos, como
os ácidos resinosos, graxos, ésteres, ceras, substâncias insaponificáveis e materiais pigmentados
de natureza diversa. A metodologia para a remoção dos extrativos foi adaptada das normas
TAPPI T 264 om-88 (TAPPI, 1999). Assim, a remoção dos extrativos foi realizada em duas
etapas. A primeira, com uma mistura de toluol/etanol (v:v) durante 4 horas, seguida de etanol
95% (GL) por mais 4 horas.
Após a remoção dos extrativos, determinou-se o teor de umidade do material vegetal, pois
todos os dados referentes à composição química do material vegetal são relativos ao peso seco.
Para isso a porcentagem de umidade da amostra foi determinada com auxílio de uma estufa
104
o
C.
3.4.5 Hidrólise dos carboidratos da parede celular
O ácido sulfúrico (H
2
SO
4
) em altas concentrações é um eficiente desidratante. Carboniza
os carboidratos pelo simples processo de retirada de moléculas de água do interior de sua
estrutura química. Mas em concentrações mais diluídas, o ácido ataca somente as ligações dos
polímeros de carboidratos. Assim, quando a parede celular das plantas de tabaco ou de qualquer
material vegetal é tratada com ácidos, como por exemplo, o H
2
SO
4
ou ácido nítrico (HNO
3
), as
cadeias de polissacarídeos da parede celular sofrem hidrólise e liberam seus monômeros
constituintes. Conseqüentemente essa reação de hidrólise também produz um resíduo insolúvel
que é determinado como lignina residual ou lignina klason. Uma pequena parcela da lignina é
solubilizada, e pode ser determinada por espectrofotometria a 215 e 280 nm, segundo a
metodologia TAPPI T 259 um-75 (TAPPI, 1991b).
42
Nesse trabalho, utilizou-se a metodologia que emprega H
2
SO
4
72%, para a hidrólise ácida
dos carboidratos de acordo com as metodologias descritas por Effland (1977), juntamente com os
descritas nas normas TAPPI T249 cm 85 (TAPPI, 1991a).
Durante o processo de hidrólise da parede celular, os polímeros de açúcar têm suas
ligações quebradas o que resulta na liberação de seus monômeros constituintes. Esse processo de
hidrólise acontece em duas etapas. Primeiro, utiliza-se ácido sulfúrico 72% à baixa temperatura
ou temperatura ambiente, para a conversão dos polissacarídeos em oligossacarídeos. A segunda
etapa, se faz com a diluição do ácido e elevação da temperatura para 120
o
C, que finaliza a
conversão dos oligossacarídeos a monossacarídeos.
Para a realização das hidrólises das amostras do caule total, tecido xilemático e tecido
medular livre de extrativos, pesou-se aproximadamente 50 mg (peso-seco) em tubo tipo Falcon™
(15 mL), ao qual adicionou 500 µL de H
2
SO
4
72% padronizado (24 N, densidade de
1,6338g/cm
3
à temperatura de 10
o
C) de acordo com as normas TAPPI T222 om-88 (TAPPI,
1996).
Logo após a adição do H
2
SO
4
72%, as amostras foram mantidas por 1 hora a 30
o
C, sob
agitação com bastão de vidro em intervalos de 15 minutos. Após este período adicionou-se à
amostra 14 mL de água milliQ, diminuindo-se a concentração do ácido sulfúrico para
aproximadamente 4%. As amostras foram submetidas a um processo de autoclavagem (120
o
C,
15 psi) por 1 hora, seguido de um resfriamento em banho de gelo, para completa paralisação do
processo de hidrólise. O resíduo proveniente do processo de autoclavagem foi filtrado em uma
membrana 47 mm (GF-92 Scleiclie & Schiil), acoplada a copo de filtragem com placa porosa,
com auxílio de kitassato associado a uma bomba de vácuo. O filtrado final é denominado de
hidrolisado secundário, onde se encontra a fração solúvel da lignina, que foi determinada por
espectrofotometria, juntamente aos carboidratos e ácidos urônicos que foram determinados no
HPAE-PAD. Já a fração residual retida na membrana, corresponde à fração que contêm a parcela
insolúvel da lignina, a lignina klason.
3.5 Análise das plantas cultivadas em câmara de crescimento
3.5.1Condições de cultivo
Na câmara de crescimento as plantas foram cultivadas em vasos plásticos de 500 mL e
distribuidas totalmente ao acaso no interior da câmara, com regas diárias de água e fertirrigadas
43
com solução nutritiva (plantmax) três vezes por semana. As condições de cultivo utilizadas foram
as mesmas descritas no ítem 3.2.
3.5.2 Coleta das folhas e caules
Devido à grande quantidade de amido armazenado nos tecidos vegetais, que pode
interferir nas análises da composição química da parede celular, as plantas foram mantidas no
escuro por 24 horas antes da coleta. Amostras de caule e tecido foliar foram coletadas para as
análises químicas dos componentes da parede primária. O caule foi divido em três partes,
denominadas de ápice, meio e base. Na parte basal do caule também foram retiradas secções
tranversais para análise anatômica.
3.5.3 Determinação do conteúdo de carboidratos em tecido foliar
3.5.3.1 Quantificação das hemiceluloses
Para a determinação do conteúdo das hemiceluloses da parede primária das folhas de
tabaco via HPAE-PAD, 500mg de tecido foliar foram coletados e macerados em cadinhos de
porcelana sob N
2
líquido com auxílio de um pistilo. A amostra foi transferida para tubos tipo
Falcon™ (15 mL) e a lavagem foi feita pela adição de 10 mL de etanol 80% (v/v). Os tubos
foram então, mantidos por 40 minutos a 60
o
C. Após homogeneização, as amostras foram
centrifugadas por 10 minutos a 2348 g. Esse processo de lavagem foi repetido por mais duas
vezes. Após as lavagens, o material foi liofilizado por 48 horas até completa secagem do resíduo
de parede celular.
Pesou-se 1 mg do resíduo de parede celular, transferindo para tubos eppendorf (2 mL), ao
quais adicionou-se 1,5 mL de TFA 2 mol/L (ácido trifluoroacético). Após homogeneização, os
tubos foram mantidos em autoclave a (120
o
C, 15 psi) por 90 minutos. Em seguida, as amostras
foram resfriadas em banho de gelo, e centrifugadas por 10 minutos a 5435 g. Uma alíquota (1
mL) do sobrenadante foi submetida à secagem a vácuo a 30
o
C por 12 horas com auxílio do
concentrator 5301 eppendorf para completa remoção do TFA. O pellet foi reservado para a
quantificação da celulose. O precipitado resultante da secagem do sobrenadante no liofilizador,
foi ressuspendido em 1 mL de água milliQ e utilizado para a quantificação das hemiceluloses da
parede celular primária do tecido foliar. As amostras contendo o total de hemiceluloses foram
diluídas antes de serem injetadas no HPAE-PAD.
44
3.5.3.2 Quantificação de celulose
Na hidrólise do material vegetal contento basicamente células de parede primária, o
ataque químico com TFA não é completo, pois libera somente os monômeros provenientes das
cadeias de hemiceluloses. O resíduo remanescente é composto de microfibrilas de celulose
(SELVENDRAN; RYDEN, 1990). Assim, o pellet remanescente (ítem 3.5.3.1) da centrifugação
após o tratamento com TFA, foi utilizado nas determinações do conteúdo de celulose da parede
celular primária de tecido foliar, conforme descrito abaixo.
Após secagem a vácuo à temperatura de 30
o
C por 10 horas, com auxílio do concentrator
5301 eppendorf para completa remoção do TFA, o pellet foi lavado com água milliQ, cinco
vezes até total remoção dos resíduos de hemiceluloses provenientes do procedimento anterior
descrito acima. Após essa lavagem, o pellet foi submetido à secagem final nas mesmas condições
descrita acima. Em seguida o pellet foi também submetido ao processo de hidrólise ácida,
utilizando-se ácido sulfúrico 72% com o descrito por effland (1977) em detalhes no ítem 3.4.5. A
determinação do conteúdo de glicose nessas amostras refere-se então ao conteúdo de celulose das
mesmas.
3.5.4 Determinação do conteúdo de hemiceluloses e celulose nas amostras de caule
Para a determinação do conteúdo das hemiceluloses e celulose do tecido caulinar,
coletaram-se amostras de (± 15 cm) do caule, que foi dividido em três partes de 5cm,
denominadas de ápice, meio e base (Figura 8).
ÁPICE
MEIO
BASE
a
b
Figura 8 - Detalhes da amostragem do caule das plantas de tabaco, cultivadas em câmara
de crescimento. (a) planta de tabaco antes da coleta, (b) planta de tabaco sem
as folhas para coleta do caule
45
As amostras do ápice, meio e base do caule foram congeladas e posteriormente maceradas
em cadinhos de porcelana e pistilo com N
2
líquido. Em seguida, procedeu-se a lavagem do
material com etanol 80% a 60
o
C por 40 minutos, seguida de centrifugação a 2350 g por 10
minutos. Este procedimento foi repetido por mais três vezes. O resíduo da parede celular
resultante foi seco por liofilização, e utilizado nas determinações do conteúdo das hemiceluloses
e celulose, realizadas de acordo com a mesma metodologia descrita acima para o tecido foliar.
3.6 Parâmetros do HPAE-PAD para análise dos carboidratos
3.6.1 Parâmetros utilizados para a quantificação dos monossacarídeos
O hidrolisado secundário e o sobrenadante resultante da centrifugação das amostras de
caule e folhas das plantas de tabaco após o tratamento com TFA, foram utilizados para a
quantificação do conteúdo de monossacarídeos via HPAE-PAD, de acordo com a metodologia de
Fardim e Duran (1999).
As curvas de concentração para cada monossacarídeo foram construída com os referidos
padrões: L-Arabinose, D-Galactose, D-Glicose, D-Xilose e D-Manose, todos da Sigma
®
,
utilizando-se a L-fucose como padrão interno. Essas determinações foram realizadas com o
auxílio do equipamento ICS 2500, HPLC Dionex® equipado com DS50 gradiente; detector
amperiométrico ED50 com eletrôdo de ouro e um amostrador automático AS50. O eluente de
arraste utilizado foi H
2
O milliQ e o eluente de limpeza foi de 200mM de NaOH, com fluxo de
0,25 mL.min
-1
, pressão no sistema de aproximadamente 2500 psi. O eluente de pós-coluna
utilizado foi 300 mM de NaOH com pressão de gás nitrogênio externo de 20 psi. As amostras
foram injetadas com volume de 25 µL determinado pelo loop. A coluna utilizada foi a de troca
aniônica Dionex® CarboPac PA10 (2 x 250 mm) com coluna-guarda CarboPac PA10 (2 x
50mm), e o detector amperométrico associado ao eletrôdo de ouro foi ajustado com os seguintes
potenciais: +100mV (0 a 200ms), +100mV de integração (200 a 400ms), -2000mV (410 a
420ms), +600mV (430ms) e -100mV (440 a 500ms).
3.6.2 Parâmetros utilizados para quantificação dos ácidos urônicos
O mesmo hidrolisado secundário e o sobrenadante resultante da centrifugação das
amostras de caule e folhas das plantas de tabaco após o tratamento com TFA, foram utilizados
para a quantificação do conteúdo de ácidos urônicos via HPAE-PAD. Para a quantificação dos
46
ácidos urônicos, construíu-se uma curva de concentração para cada ácido urônico com os
referidos padrões: ácido D-Glucurônico (Sigma
®
) e ácido D-Galacturônico (Fluka
®
). O mesmo
equipamento descrito acima foi utilizado para essas determinações. Entretanto, para as separações
dos ácidos urônicos o eluente de arraste foi uma mistura de 100mM de NaOH com 150mM de
NaOAc, e o eluente de limpeza foi 200mM de NaOH com fluxo de 0,25 mL.min
-1
, e uma pressão
de aproximadamente 2500 psi. Nesse caso não se utilizou eluente de pós-coluna. As amostras
foram injetadas com volumes de 25 µL determinado pelo loop e a coluna utilizada foi a de troca
aniônica Dionex® CarboPac PA100 (2 x 250mm) com coluna-guarda CarboPac PA100 (2 x
50mm).
3.7 Análise das Fibras
3.7.1 Coleta do tecido xilemático das plantas de tabaco para obtenção das dimensões das
fibras
As plantas cultivadas por 120 dias, em casa de vegetação (figura 9) foram utilizadas para
a obtenção das dimensões das fibras, tais como comprimento, largura, diâmetro do lúmem, assim
como para a determinação da espessura da parede.
Para o preparo das amostras, adotou-se o método de Flanklin (1937). Essa metodologia
utiliza agentes químicos que removem a lamela média (região de união entre as células), mas
mantêm a integridade das fibras, separando as fibras e os vasos. A lamela média é composta
basicamente de lignina e pectinas, que funcionam como agente cimentante entre as células. As
amostras de três plantas por genótipo foram coletadas de forma totalmente casualizadas,
totalizando 21 plantas. Amostras de aproximadamente 2mm x 2mm x 30 mm de largura,
espessura e comprimento, respectivamente, foram coletadas da parte basal do tecido xilemático e
transferidas para tubos de ensaio contento água destilada. Após a remoção da água, adicionou-se
uma solução de ácido acético glacial e peróxido de hidrogênio (30 volumes) na proporção de 1:1
(v/v). As amostras foram mantidas a 60
o
C por 48 horas. Em seguida, removeu-se a solução
utilizada na maceração, e o material fibroso foi lavado três vezes com água destilada. O material
resultante (fibras isoladas) foi utilizado para o preparo das lâminas e determinações das
dimensões das fibras das plantas transgênicas relativas às amostras das plantas controles.
47
3.7.2 Preparo das lâminas do macerado de fibras
As lâminas para análise de microscopia foram preparados a partir do material contento as
fibras isoladas, previamente coradas com uma solução de safranina. Os resultados das
mensurações das fibras foram obtidos com o auxílio de um microscópio óptico Zeiss Axioskop
acoplado a uma ocular micrométrica. As imagens das fibras foram capturadas por uma câmera
fotográfica digital Media Cybernetics modelo PLA662 acoplada a um microcomputador. As
medidas do comprimento das fibras foram obtidas com um aumento de 25 vezes. Já as medidas
de largura e espessura da parede, assim como o diâmetro do lúmem, foram obtidos com um
aumento de 200 vezes. O comprimento das fibras representa o valor médio de um total de 225
fibras por genótipo. No caso das medidas de largura e espessura da parede, como também o
a
b
c
d
e
f
Figura 9 - Ilustração da coleta do material para a análise dos carboidratos em diferentes tecidos e mensurações das
fibras: (a) plantas de tabaco cultivadas em casa de vegetação, (b) corte transversal do caule de tabaco com
dupla coloração, verde para células lignificadas e vermelho para células ricas em celulose, (c) tecido
xilemático, (d) fibras da região xilemática isoladas, (e) cromatograma de carboidratos da região do xilema
do caule de tabaco, (f) cromatograma de carboidratos da região da medula do caule de tabaco
48
diâmentro do lúmem, os valores médios obtidos representam 135 fibras por genótipo. Todas as
medidas foram obtidas com o auxílio do software Image tool versão 3.0
®
.
Os valores de comprimento, largura da fibra, diâmetro do lúmem e espessura da parede
obtidos, foram utilizados para o calculo de alguns índices relacionados à qualidade das fibras
importantes para o processo de fabricação do papel. Por exemplo, o índice de Runkel foi
determinado pela razão entre duas vezes o valor da espessura da parede pelo diâmetro do lúmem.
Já a fração parede das fibras das plantas de tabaco, foi determinada usando-se a fórmula
(2EP/L.100), onde (EP) representa a espessura da parede da fibra e (L) o diâmetro da fibra
(PAULA; ALVEZ, 1997). E o coeficiente de flexibilidade das fibras, foi determinado pela
fórmula (100.d/L), onde (d) é o diâmetro do lúmem e (L), o diâmetro da fibra.
3.8 Análise Anatômica do caule de tabaco
Plantas de tabaco com 60 dias de idade, provenientes de câmaras de crescimento assim
como as plantas com 90 e 120 dias de idade, cultivadas em casa de vegetação foram utilizadas
para a obtenção dos cortes transversais de caule para as análises de microscopia. Os caules das
plantas com 60 e 90 dias de idade foram cortados manualmente na orientação transversal na
região basal, com o auxílio de lâminas de aço inox (gillette). Já no caso dos caules de plantas com
120 dias, os cortes transversais e longitudinais, também na região basal, foram realizados com o
auxílio de um micrótomo de deslize Leica SM200R, com espessuras entre 60 e 80 µm.
3.8.1 Coloração dos cortes transversais e longitudinais do caule de tabaco
Todos os cortes transversais e longitudinais das amostras de caule de plantas de tabaco,
obtidas manualmente ou feitas com o auxílio do micrótomo, foram armazenados em água milliQ
e posteriormente clarificados com uma solução de hipoclorito de sódio 20%, antes de serem
coradas. O método de coloração utilizado foi o de contraste específico, com vermelho congo
(congo red) e o verde iodo (iodine green) de acordo como descrito por Dop e Gautié (1928).
Primeiro, as secções foram coradas com verde iodo 1% por 2 minutos. Este corante reage com a
lignina presente no material, colorindo de verde escuro as células lignificadas. Em seguida, as
secções foram lavadas com água milliQ por duas vezes, até completa remoção do excesso do
verde iodo para poderem ser submetidas à coloração com o vermelho congo 1% por 30 segundos,
que reage com a celulose presente no material, colorindo de vermelho as células ricas em
49
celulose. Após a coloração as secções foram novamente lavadas com água milliQ por duas vezes,
até remoção do excesso de corante. As secções duplamente coradas foram posicionadas em
lâminas para visualização em microscópico óptico provido de ocular micrométrica acoplado a
uma câmera fotográfica digital para registro das imagens.
3.9 Delineamento experimental e análise estatística
Todos os experimentos foram conduzidos de forma inteiramente casualizadas para os 7
genótipos (tratamentos) ou seja, 5 linhagens transgênicas (2M, 42, 51, 55 e 79) e duas linhagens
controles (WT e CG).
Todas as análises de composição química da parede celular foram realizadas em triplicata
por parcela utilizando-se 5 plantas (parcela) de cada genótipo num total de 35 plantas analisadas.
Já as amostras de caule utilizadas, tanto para os cortes histológicos, quanto para as determinações
das medidas das fibras do xilema, foram coletadas 3 plantas (parcela) de cada genótipo, num total
de 21 plantas analisadas.
As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa SAS (2000) e o nível de
significância estatística estabelecido como p<0,05. O teste de Dunnett de comparação de médias
foi o teste utilizado para as comparações do efeito da superexpressão do gene ugdh de soja na
composição química da parede celular das plantas transgênicas relativo ao planta controle. A
planta transgênica gateway (CG) foi utilizada como planta controle nas análises estatísticas, uma
vez que não mostrou diferenças estatisticamente significativas com relação à planta selvagem
(WT).
50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação fenotípica das plantas transgênicas
Todas as plantas transgênicas de tabaco que superexpressam o gene ugdh de soja
desenvolveram-se normalmente, tanto em câmara de crescimento como em casa de vegetação, e
não mostraram diferenças fenotípicas aparentes (Figura 10). Os parâmetros fenotípicos
considerados foram diâmetro do caule, área foliar e altura. A exceção foi a planta 66 que
apresentou um desenvolvimento muito restrito, com internódios curtos, caule inteiramente oco
com pontos de oxidação na região da medula, foi desconsiderada nas análises químicas e
histológicas, por não apresentar características desejáveis no desenvolvimento da parede
secundária. Esse fenótipo pode ser decorrência do local de inserção do transgene de interesse, no
genoma dessa planta.
Alguns trabalhos indicam que alterações na composição química da parede celular podem
ocorrer sem que haja um comprometimento do desenvolvimento ou viabilidade das plantas
transformadas. Reiter e colaboradores (1997) obtiveram plantas mutantes de Arabidopsis que
apresentaram alterações da composição de polissacarídeos da parede celular, embora não tenham
mostrado modificações fenotípicas ou fisiológicas no seu desenvolvimento em relação às plantas
de Arabidopsis selvagem utilizadas como controle.
Figura 10 - Fenótipos das plantas transgênicas (2M, 42, 51, 55, 66 e 79) e controles (WT e CG)
*A planta 66 foi desconsiderada nas análises de composição químicas da parede celular , assim como
nas análises histológicas
WT 2M 42 51 55 66* 79 CG
51
4.2 Composição química do caule
Os dados da Tabela 1 resumem os resultados obtidos da análise realizada com amostras de
caule total (tecido xilemático e medula) e mostram que as plantas de tabaco transgênicas
cultivadas em casa de vegetação apresentam um aumento do conteúdo de xilose, embora,
estatisticamente significativa somente para a planta 2M em relação à planta controle (CG). Com
relação ao conteúdo de glicose, houve uma redução para todas as linhagens, mas estatisticamente
significativa só para a planta 55. Essas diferenças podem ser explicadas pelo fato do gene ugdh
estar envolvido na regulação do fluxo metabólico dos carboidratos classificados como pentoses e
hexoses, importantes na constituição da parede celular.
O conteúdo de lignina klason aumentou para todas as plantas transgênicas, sendo
estatisticamente significativo somente para as linhagens 2M e 79. O aumento deste componente
na composição química do caule também foi observado em plantas transgênicas de alfafa
(Medicago sativa) que superexpressam o gene ugdh (SAMAC et al., 2004). Paralelamente, os
cortes histológicos do caule das plantas transgênicas de tabaco, mostram uma extensão do tecido
xilemático, correspondendo a uma grande proporção do caule total (Figuras 14, 15, 16 e 17). O
alargamento do tecido xilemático, rico em lignina em relação à medula, que praticamente não
contêm lignina, corrobora o fato do aumento do conteúdo das ligninas klason e solúvel observado
nas análises do caule total. O aumento da proporção do tecido xilemático poderia explicar
também o aumento do conteúdo de xilose nas amostras de caule total das plantas transgênicas em
relação às plantas controles.
52
CG 2M 42 51 55 79
LIGNINA KLASON 174,180 183,100 * 171,880 177,240 176,580 183,360 *
LIGNINA SOLÚVEL 20,800 21,380 22,160 22,180 21,520 21,700
ARABINOSE 6,042 5,922 6,330 5,476 5,586 5,756
GALACTOSE 14,293 13,856 14,249 14,376 14,303 13,293
GLICOSE 413,132 421,071 413,913 407,333 404,326 * 405,150
XILOSE 179,751 189,082 * 179,705 175,669 184,756 182,386
MANOSE 12,803 12,990 13,043 13,638 13,659 13,071
4.3 Composição química do tecido xilemático
Do ponto de vista tecnológico, a composição química da parede celular do tecido
xilemático é a que pode fornecer informações com respeito à qualidade do material vegetal para a
produção de celulose e papel, pois é nesta região que se encontram as fibras responsáveis pela
qualidade da celulose e papel produzidos no processo de fabricação. A Tabela 2 mostra os dados
da composição química do tecido xilemático. Observa-se que houve um pequeno acréscimo,
embora não significativo no conteúdo de xilose para todas as plantas transgênicas. Kärkönen et
al. (2005) mostrou que em plantas de milho mutantes com baixa atividade da enzima UGDH
ocorreu o inverso, ou seja, o conteúdo de xilose diminuiu.
O conteúdo de lignina klason reduziu em todas as plantas transgênicas, embora seja
estatisticamente significativo somente para a planta 2M. Estas alterações já foram mostradas em
outros trabalhos, que postularam, que há uma relação inversa do conteúdo de lignina e xilose em
várias espécies vegetais, como o tabaco (CHABANNES et al., 2001), abeto (LAWOKO et al.,
2005) e álamo (DAVISON et al., 2006).
O conteúdo de arabinose do tecido xilemático é significativamente maior em três
linhagens transgênicas (42, 55 e 79). Esse aumento de arabinose parece ser reflexo do
Tabela 1 - Composição química da parede celular das amostras de caule total das linhagens de tabaco
transgênicas (2M, 42, 51, 55 e 79) relativas ao controle (CG). Valores são médias expressas em
mg/g de matéria seca
* Diferenças estatisticamente significativas ao nível de 5 % pelo teste de Dunnett
53
deslocamento da rota metabólica para o acúmulo de xilose, uma vez que este monossacarídeo é o
precursor para a síntese de arabinose.
A razão entre o conteúdo de hexoses e pentoses reduziu para todas as linhagens
transgênicas em relação ao controle (CG), sendo significativo para as plantas (42, 51 e 79). Estes
valores confirmam que a superexpressão do gene ugdh alterou o fluxo de açúcares para a síntese
das pentoses (xilose e arabinose) e ácidos urônicos (ácido galacturônico e ácido glucurônico), em
relação à síntese de hexoses (galactose, glicose e manose).
CG 2M 42 51 55 79
LIGNINA KLASON 179,678 169,997 * 174,711 176,144 176,133 175,656
LIGNINA SOLÚVEL 36,811 37,267 37,411 36,311 36,466 36,989
ARABINOSE 1,727 1,832 2,019 * 2,042 * 2,026 * 1,962 *
GALACTOSE 5,639 5,432 5,276 6,624 * 5,723 5,275
GLICOSE 409,757 405,548 399,865 400,340 405,509 404,050
XILOSE 172,242 173,548 176,434 175,902 173,130 176,849
MANOSE 21,110 20,333 19,181 * 19,940 19,414 20,652
ÁCIDO
GALACTURÔNICO
6,586 5,661 5,360 * 6,069 5,859 5,903
ÁCIDO GLUCURÔNICO 0,769 0,708 0,762 0,815 0,770 0,876
HEXOSES/ PENTOSES 2,408 2,374 2,299 * 2,310 * 2,370 2,317 *
4.4 Composição química do tecido medular
A região da medula é um tecido caulinar formado basicamente de células de parênquima,
constituído de hemiceluloses, celulose e pectinas.
Tabela 2 - Composição química da parede celular das amostras de tecido xilemático dos caules das linhagens de
tabaco transgênicas (2M, 42, 51, 55 e 79) relativas ao controle (CG). Valores são médias expressas
em mg/g de matéria seca
* Diferenças estatisticamente significativas ao nível de 5 % pelo teste de Dunnett
54
A figura 11 mostra o conteúdo dos principais constituintes da parede celular do tecido
medular das plantas transgênicas em relação ao controle (CG). O conteúdo de pectina que resulta
da somatória do conteúdo de ácido galacturônico, galactose e arabinose, aumentou em todas as
plantas transgênicas em relação ao controle (CG). Embora não seja estatisticamente significativo,
mostra uma tendência de aumento como efeito da superexpressão do gene ugdh.
4.5 Mensurações das fibras
As características anatômicas das fibras de madeira de espécies arbóreas estão
relacionadas às propriedades da polpa celulósica e conseqüentemente à qualidade do papel
produzido (GOMIDE et al., 2005).
ARABINOSE
0
5
10
15
20
25
CG 2M 42 51 55 79
Plantas
Conc. mg/g peso seco
GALACTOS
E
0
20
40
60
CG 2M 42 51 55 79
Plantas
Conc. mg/g peso seco
GL I C OS
E
380
400
420
440
460
480
CG 2M 42 51 55 79
Plantas
Conc. mg/g peso
seco
XILOS
E
0
10
20
30
40
CG 2M 42 51 55 79
Pl antas
Conc. mg/g peso
seco
URÔNICOS TOTAIS
148
150
152
154
156
158
160
162
CG 2M 42 51 55 79
Plantas
Conc. mg/g peso seco
PEC TIN
A
190
195
200
205
210
215
CG 2M 42 51 55 79
Pl antas
Conc. mg/g peso
seco
A
C
B
D
E
F
*
*
*
*
Figura 11 - Composição química dos principais componentes da parede celular da região da medula das
amostras do caule das plantas de tabaco transgênicas (2M, 42, 51, 55 e 79) relativa ao controle
(CG): (A) arabinose, (B) galactose, (C) glicose, (D) xilose, (E) pectina, (F) ácidos urônicos totais,
valores expressos em mg/g peso seco
* Diferenças estatisticamente significativamente ao nivel de 5 % de probabilidade pelo teste de
Dunnett
55
As fibras de espécies arbóreas, como por exemplo, as encontradas no tecido xilemático de
eucalipto têm valores médios de comprimento e espessura de parede muito próximos aos
encontrados para as plantas de tabaco analisadas.
As plantas transgênicas apresentaram uma redução significativa do comprimento da fibra
de aproximadamente 10% para todos os genótipos (Tabela 3). Essa diminuição é muito
interessante, uma vez que no processo de fabricação do papel, fibras mais curtas melhoram a
textura do papel. Enquanto as fibras mais longas favorecem a resistência ao rasgo. As fibras mais
curtas produzem um papel com distribuição mais homogênea dos poros, o que facilita a absorção
de tinta, e conseqüentemente melhora a qualidade de impressão.
Todas os genótipos transgênicos apresentaram um aumento da largura das fibras (Tabela
3), embora esse aumento não seja estatisticamente significativo. A largura da fibra é uma
característica anatômica tão importante quanto o comprimento, uma vez que fibras mais largas
conferem ao papel menor resistência ao ar, maior volume específico aparente, resultando em uma
maior resistência ao rasgo.
O índice de Runkel mostra a interação entre duas características importantes das fibras, o
diâmetro do lúmem e espessura da parede celular. Quanto ao valor desse índice, observamos que
todas as plantas transgênicas apresentaram um valor baixo desse índice, mas estatisticamente
significativo somente para a planta 2M. Esse índice determina a qualidade da polpa. Assim, fibras
de madeira com índice de Runkel baixo produzem polpa celulósica considerada de boa qualidade
para a produção de papel (RUNKEL, 1952).
Outro parâmetro analisado foi a fração parede, que também reduziu para todas as
linhagens transgênicas em relação ao controle, embora apenas estatisticamente significativo nas
plantas 2M e 79. Esse índice reflete o grau de flexibilidade das fibras. Quanto menor, maior a
flexibilidade da mesma e melhor a qualidade do papel. Paralelamente a esse parâmetro, avaliou-
se também o coeficiente de flexibilidade das fibras, e pela Tabela 3, observamos que houve um
aumento desse coeficiente para todos as plantas transgênicas, em relação ao controle, embora
também significativo somente para o caso das plantas 2M e 79. O aumento deste parâmetro é
muito vantajoso para melhorar a qualidade da polpa celulósica. Fibras altamente flexíveis
melhoram a interação inter-fibrilar. Na prática, este parâmetro indica o grau de achatamento
(colapso) que as fibras sofrem durante o processo de polpação (FOLKEL; BARRICHELO,
56
1975b). O coeficiente de flexibilidade também está diretamente relacionado à resistência à tração
e ao arrebentamento (GONÇALVEZ et al., 1986).
Comprimento
(µm)
Largura da
fibra (µm)
Diâmetro
do lúmem
(µm)
Espessura
da parede
(µm)
Índice
de
Runkel
Fração
parede
(%)
Coeficiente de
flexibilidade
(%)
CG 953 30,71 20,76 4,97 0,48 32,41
67,58
2M 871 * 31,77 22,58 4,59 * 0,40* 28,98 *
71,01 *
42 860 * 31,78 21,94 4,92 0,44 30,97
69,05
51 855 * 31,48 21,52 4,98 0,46 31,64
68,36
55 868 * 32,52 22,65 4,88 0,43 30,04
69,65
79 855 * 32,6 22,85 4,87 0,42 29,89 *
70,11 *
4.6 Análise química dos componentes da parede celular primária de tecido foliar
Os resultados da Figura 12 (A e B) mostram uma queda do conteúdo significativo de
celulose para todas as plantas transgênicas em relação à planta controle. Paralelamente, algumas
plantas mostraram reduções significativas no conteúdo de monossacarídeos hemicelulósicos. Em
vista disso, a superexpressão do gene ugdh nas plantas de tabaco transgênicas pode ter interferido
no “pool” de UDP-glucuronato, precursor primário para a síntese de ácido glucurônico. Em todas
as linhagens transgênicas observou-se que o conteúdo de ácido glucurônico reduziu
significativamente. A redução deste metabólito pode ter alterado assim o conteúdo de celuloses e
hemiceluloses nas plantas transgênicas. A importância do ácido glucurônico para a biossíntese e
construção da parede celular é tão crucial que em folhas de Arabidopsis, aproximadamente 50%
da massa da parede celular primária é produzida através dos derivados de UDP-glucuronato
(SEITZ et al., 2000).
* Diferenças estatisticamente significativamente ao nível de 5 % de probabilidade pelo teste de Dunnett
Tabela 3 - Características das fibras da região do tecido xilemático dos caules das linhagens de tabaco transgênicas
(2M, 42, 51, 55 e 79) e controle (CG) e parâmetros para análise da qualidade da fibra.
57
4.7 Análise das diferentes partes do caule de tabaco
A Figura 13 (A, B, C e D) resume os dados do conteúdo de carboidratos em diferentes
regiões do caule das plantas transgênicas relativas ao controle. Pode-se observar que há um
gradiente crescente no conteúdo de xilose e celulose, na direção do ápice para a base. Esse
gradiente de concentração se deve ao fato de que na base do caule, há maior quantidade de
células fibrilares ricas em celulose e xilose quando comparadas às células parenquimatosas
localizadas preferencialmente no meio e no ápice do caule. Já o conteúdo de ácido galacturônico
e pectinas apresentaram redução do ápice para a base. Isso ocorre devido à formação do tecido
xilemático, sendo mais pronunciado na base do caule das plantas de tabaco. O conteúdo de
pectinas e ácido galacturônico aumentou ligeiramente nas linhagens transgênicas em relação à
planta controle.
*
CONTEÚDO DE CARBOIDRATOS MINORITÁRIOS
EM TECIDO FOLIAR DE TABACO
0
5
10
15
20
25
30
CG 2M 42 51 55 79
Plantas
Conc. mg/g peso seco
ARABINOS E
XILOS E
MANOS E
ÁC GLUCURÔNICO
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CO NTEÚDO DE CARBO IDRATO S MAIO RITÁRIOS
EM TEC IDO FO LIAR DE TAB AC O
0
50
100
150
200
CG 2M 42 51 55 79
Plantas
Conc. mg/g peso seco
GALACTOSE
CELULOSE
ÁC GALACTURÔNICO
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
A
B
Figura 12 - Conteúdo de carboidratos da parede celular primária de tecido foliar das plantas transgênicas (2M, 42,
51, 55 e 79) e controle (CG).Valores expressos em mg/g de peso seco
* Diferenças estatisticamente ao nivel de 5 % de probabilidade pelo teste de Dunnett
58
4.8 Análise histológica do caule
Pelo contraste específico dos cortes transversais e longitudinais dos caules das plantas de
tabaco transgênicas e controle, que colore de vermelho células ricas em celulose (medula e
parênquima cortical), e de verde as células ricas em lignina (tecido xilemático). Na figura 14
pode-se observar que a formação do anel xilemático e o processo de lignificação estão adiantados
nas linhagens transgênicas em relação ao controle. As Figuras 15, 16 e 17 mostram que as plantas
transgênicas apresentaram um aumento significativo do tecido xilemático em relação ao controle.
Estas alterações do tecido xilemático podem ser decorrência de modificações hormonais.
Sabe-se que os hormônios controlam diretamente o processo de xilogênese. Em alguns casos alta
concentração de citocinina pode inibir a produção de xilema (FOSKET; ROBERTS, 1964;
ROBERTS et al., 1988).
Conte údo de Xilos e em difrentes partes do caule de tabaco
0
50
100
150
200
250
300
350
ápice meio base
Partes do caule
Conc. mg/g peso seco
2M
42
51
55
79
CG
Conte údo de Celulose em difere nte s
p
artes do caule de tabaco
0
100
200
300
400
500
600
ápice meio base
Partes da caule
Conc. mg/g peso seco
2M
42
55
51
79
CG
Conteúdo de Ácido Galacturônico e m diferente s parte s do caule de tabaco
0
20
40
60
80
100
ápice meio base
Partes do caule
Conc. m g/g peso seco
2M
42
51
55
79
CG
Conte údo de Pe ctina e m dife rente s parte s do caule de tabaco
0
100
200
300
400
ápice meio base
Partes do caule
Conc. mg/g peso seco
2M
42
51
55
79
CG
B
A
DC
Figura 13 - Conteúdo de carboidratos em diferentes secções (ápice, meio, base), do caule de plantas transgênicas
(2M, 42, 51, 55, 79) e controle (CG); (A)-conteúdo de xilose, (B)-conteúdo de celulose, (C)-conteúdo
de àcido galacturônico, (D)- conteúdo de pectina.Valores são médias expressas em mg/g peso seco
59
a
b
c
d e
f
a
b
d
e
c
f
Figura 15 - Cortes transversais do caule das plantas de tabaco transgênicas e controle duplamente coradas com
verde iodo (lignina) e vermelho congo (celulose), plantas com 90 dias de idade cultivadas em casa de
vegetação: (a) planta CG, (b) planta 2M, (c) planta 42, (d) planta 51, (e) planta 55, ( f) planta 79,
barra =2mm
Figura 14 - Cortes transversais do caule das plantas de tabaco transgênicas e controle duplamente coradas com
verde iodo (lignina) e vermelho congo (celulose), plantas com 60 dias de idade cultivadas em câmara
de crescimento: (a) planta CG, (b) planta 2M, (c) planta 42, (d) planta 51, (e) planta 55, ( f) planta 79,
barra =200µm
60
a
b
c
d
e
f
a
b
c
d
e
f
Figura 16 - Cortes transversais do caule das plantas de tabaco transgênicas e controle duplamente coradas com
verde iodo (lignina) e vermelho congo (celulose), plantas com 120 dias de idade cultivadas em casa
de vegetação: (a) planta CG, (b) planta 2M, (c) planta 42, (d) planta 51, (e) planta 55, ( f) planta 79,
barra =2mm
Figura 17 - Cortes longitudinais do caule das plantas de tabaco transgênicas e controles duplamente coradas com
verde iodo (lignina) e vermelho congo (celulose), plantas com 120 dias de idade cultivadas em casa de
vegetação: (a) planta CG, (b) planta 2M, (c) planta 42, (d) planta 51, (e) planta 55, ( f) planta 79,
barra=1mm
61
5 CONCLUSÕES
- A análise da composição química do tecido xilemático mostrou que as plantas transgênicas
apresentaram um acréscimo no conteúdo de xilose e uma redução no conteúdo de lignina klason.
- A relação entre hexoses/pentoses na parede celular foi menor nas plantas transgênicas,
demonstrando alterações na síntese de polissacarídeos da parede celular.
- Em todas as linhagens transgênicas houve uma redução significativa do comprimento da fibra
do tecido xilemático.
- Na fase inicial de desenvolvimento do caule, as plantas transgênicas apresentaram uma
formação do anel xilemático mais adiantada em relação ao controle.
- As plantas transgênicas adultas apresentaram maior proporção do tecido xilemático em relação
ao tecido medular quando comparadas à planta controle.
62
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