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Estudo da influência da variabilidade em genes de apolipoproteínas
sobre níveis lipídicos e parâmetros de massa e gordura corporal na
população de Porto Alegre.
Marilu Fiegenbaum
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Curso de Pós-Graduação em
Genética e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Rio Grande do
Sul para obtenção do grau de Mestre
em Genética e Biologia Molecular.
Orientadora: Dra. Mara Helena Hutz
Porto Alegre, 2001.
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AGRADECIMENTOS
À Dra. Mara H. Hutz pela orientação durante estes anos e também pela amizade.
À Dra. Sídia Maria Callegari-Jaques, por sempre estar disponível para ajudar em
problemas estatísticos e também pela apresentação à “análise fatorial”.
À Fabiana de Andrade, Silvana de Almeida e Marcel Arsand pela coleta da
amostra na Faculdade de Farmácia.
À Vanessa Mattevi e André F. Vargas pela coleta da amostra no HCPA.
À todo pessoal dos laboratórios de eletroforese e de DNA pela amizade e bom
humor durante o trabalho.
Ao André por todo apoio no laboratório.
À Silvana, pela indicação deste local para trabalhar.
Aos amigos Bia, Bina, Fabi, Sil e Vanessa pelas diárias “hora do café”, pela ajuda
em todos os sentidos e também pela amizade.
Aos demais amigos feitos neste Departamento.
Aos meus pais, pelo amor, carinho, todo suporte durante a minha formação e
confiança depositada em mim.
À minha irmã, pelo amor e por todos os momentos que passamos juntas.
Ao meu namorado, por sempre estar ao meu lado e ser visitante constante deste
Departamento.
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À minha segunda família, Sandra e Miguel, por terem me adotado como uma
filha e não uma nora.
Ao CNPq pela concessão da bolsa.
As pesquisas realizadas no Laboratório de DNA e Eletroforese do Departamento
de Genética da UFRGS são financiadas pelo CNPq, FINEP, PRONEX, FAPERGS e
FIPE-HCPA.
3
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 06
1.1. Metabolismo de Lipídeos ........................................................................... 06
Considerações iniciais ...................................................................................... 06
Como ocorre o metabolismo de lipídeos? ..................................................... 07
1.2. Níveis lipídicos e seus fatores determinantes ............................................ 09
1.3. A distribuição das apolipoproteínas no genoma humano...................... 11
1.4. O papel das apos C-I, C-II, C-III e A-IV no metabolismo lipídico ............ 12
Apolipoproteína C-I ............................................................................................ 12
Apolipoproteína C-II ........................................................................................... 13
Apolipoproteína C-III .......................................................................................... 15
Apolipoproteína A-IV ......................................................................................... 16
1.5. Influência da variabilidade dos genes das apos C-I, C-II, C-III e A-IV, nos
níveis de lipídeos plasmáticos ................................................................................ 18
Apolipoproteína C-I ............................................................................................ 19
Apolipoproteína C-II ........................................................................................... 20
Apolipoproteína C-III .......................................................................................... 20
Apolipoproteína A-IV ......................................................................................... 23
2. J
USTIFICATIVA E OBJETIVOS ............................................................................................ 25
3. M
ATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 27
3.1. Amostra .......................................................................................................... 27
3.2. Dosagens bioquímicas e medidas antropométricas ............................... 28
3.3. Análise dos polimorfismos............................................................................ 28
3.4. Análise estatística ......................................................................................... 30
3.4.1. Freqüências gênicas e haplotípicas, comparação de freqüências e
desequilíbrio de ligação ........................................................................ 30
3.4.2. Fatores determinantes e ajuste das variáveis lipídicas e
antropométricas ..................................................................................... 31
3.4.3. Análise de variância e delineamento fatorial .................................... 32
4. R
ESULTADOS ................................................................................................................. 33
4.1. Análise descritiva da amostra ..................................................................... 33
4.2. Freqüência dos RFLPs.................................................................................... 34
4
4.2.1. Freqüências na amostra total................................................................ 34
4.2.2. Desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos ............................... 35
4.2.3. Freqüências de acordo com os níveis de colesterol total (CT) e de
triglicerídeos (TG)..................................................................................... 36
4.2.4. Freqüências de acordo com as variáveis antropométricas ............. 39
4.3. Influência dos polimorfismos sobre os níveis lipídicos ...............................42
Apolipoproteína C-I ............................................................................................ 42
Apolipoproteína C-II ........................................................................................... 50
Apolipoproteína C-III .......................................................................................... 51
Apolipoproteína A-IV ......................................................................................... 55
4.4. Influência da variabilidade da apo A-IV sobre variáveis
antropométricas ........................................................................................... 57
5. D
ISCUSSÃO .................................................................................................................... 62
5.1. Efeito da variabilidade em genes de apolipoproteínas sobre variáveis
lipídicas ............................................................................................................................ 62
5.1.1. Efeito sobre os níveis de triglicerídeos .................................................... 62
5.1.2. Efeito sobre os níveis de HDL colesterol ................................................. 64
5.1.3. Efeito sobre os níveis de colesterol total e LDL colesterol .................... 65
5.2. Efeito da variabilidade da apo A-IV sobre variáveis antropométricas ..... 67
5.3. Importância de interações gene-ambiente ................................................ 69
6. R
ESUMO E CONCLUSÕES .................................................................................................. 71
7. S
UMMARY AND CONCLUSIONS ......................................................................................... 75
8. B
IBLIOGRAFIA ................................................................................................................. 79
A
NEXOS ............................................................................................................................ 92
Anexo 1 ...................................................................................................................... 93
Anexo 2 ...................................................................................................................... 94
Anexo 3 ...................................................................................................................... 95
5
LISTA DE ABREVIATURAS
Apo: apolipoproteína
ANOVA: análise de variância
CETP: proteína transferidora de ésteres de colesterol
CO: contraceptivos orais
CT: colesterol total
DAC: doença arterial coronariana
H: horas
HDL: lipoproteína de alta densidade
HDL-C: HDL colesterol
HTG: hipertrigliceridemia
IDL: lipoproteína de densidade intermediária
IMC: índice de massa corporal
IRE: elemento de resposta à insulina
LCAT: enzima lecitina-colesterol aciltransferase
LDL: lipoproteína de baixa densidade
LDL-C: LDL colesterol
LDL-R: receptor de LDL
LPL: enzima lipoproteína lipase
LRP: proteína relacionada ao receptor de LDL
LTR: lipoproteína rica em triglicerídeos
NCEP: National Cholesterol Education Program
OMS: Organização Mundial da Saúde
PCR: reação em cadeia da polimerase
PYY: peptídeo gama-gama
RFLP: polimorfismo de tamanhos de fragmento de restrição
SNC: sistema nervoso central
SR-BI: receptor de HDL (scavenger receptor class B type I)
TG ou Tri: triglicerídeos
TRC: transporte reverso de colesterol
U: unidades
VLDL: lipoproteína de muito baixa densidade
WHR: relação cintura/quadril
6
Capítulo 1 – Introdução
1. I
NTRODUÇÃO
1.1. M
ETABOLISMO DE LIPÍDEOS
Considerações iniciais
Os lipídeos podem ser obtidos de duas maneiras: a partir da dieta
ou sintetizados de novo. O principal local de síntese é o fígado, mas outros locais,
como o intestino também produzem quantidades apreciáveis. Este aporte
lipídico endógeno e exógeno pode ser transportado para os seus sítios de
estocagem (fígado e tecido adiposo) ou ser usado como fonte imediata de
energia (STRYER, 1987; WEISS, 1993).
Como os lipídeos são moléculas apolares e insolúveis em água
precisam ser transportados ativamente pela corrente sangüínea até os tecidos
alvo, o que é realizado na forma de lipoproteínas, que são classificadas segundo
a sua densidade e constituição. A estrutura e a composição destas lipoproteínas
são enzimaticamente reguladas e, de forma geral, são formadas por uma parte
central de lipídeos hidrófobos circundada por uma capa de lipídeos polares e
proteínas, denominadas apolipoproteínas (apos). Várias apolipoproteínas já
foram caracterizadas e cada lipoproteína contém uma ou mais destas proteínas,
que tem como função proporcionar estabilidade estrutural, solubilizar os lipídeos
altamente hidrófobos, servir como ligantes para receptores celulares ou agir
como co-fatores para enzimas envolvidas no metabolismo de lipoproteínas
(STRYER, 1987; WEISS, 1993; WITZTUM, 1996).
6
Capítulo 1 – Introdução
Como ocorre o metabolismo de lipídeos?
Durante a última década, grandes avanços foram feitos em relação
ao conhecimento dos papéis das apolipoproteínas, receptores, enzimas e
proteínas de transporte na modulação do metabolismo lipídico. Por esta razão,
para melhor compreensão, esta rota metabólica pode ser dividida em dois
grandes subgrupos: o metabolismo de lipoproteínas ricas em triglicerídeos
(origem endógena e exógena) e o transporte reverso do colesterol.
O Metabolismo de Lipoproteínas Ricas em Triglicerídeos
Em sociedades industrializadas, o consumo diário de colesterol e
fosfolipídeos é de 0,2 a 0,5 g e 2 a 3 g, respectivamente. Estes valores são bem
menores quando comparados com a quantidade de triglicerídeos que é
ingerida, que é de 60 a 150 g/dia, o que torna o metabolismo deste lipídeo o
mais abundante no homem (MONTGOMERY e cols., 1996).
Após a ingestão de gordura, os triglicerídeos e o colesterol livre são
absorvidos nas células intestinais como ácidos graxos e colesterol livre. Dentro das
células da mucosa intestinal, os ácidos graxos são reesterificados e, juntamente
com o colesterol, incorporados no cerne de uma partícula nascente de
quilomícron, que assume um diâmetro variável de 80 a 500 nm. Sua densidade é
muito baixa (<0,94g/cm
3
) porque são ricos em triglicerídeos e têm um teor
protéico menor do que 2%. As apolipoproteínas ligadas aos quilomícrons são a
apo A-I, apo A-II, apo A-IV e apo B-48. Os quilomícrons entram no plasma, onde
são incorporados também as apos C-II, C-III e E. A apo C-II capacita a enzima
lipoproteína lipase (LPL) a hidrolisar os triglicerídeos em partículas menores,
liberando os ácidos graxos para absorção nos tecidos periféricos. A lipoproteína
lipase se liga a células endoteliais e as apos Cs são perdidas neste processo,
resultando em partículas conhecidas como quilomícrons remanescentes, que são
menores e contêm muitas cópias de apo E. Elas possuem uma meia-vida curta
(cerca de alguns minutos) e são removidas rapidamente, pois são reconhecidas,
ligadas e absorvidas pelo receptor de LDL (LDL-R) e proteína relacionada ao
receptor de LDL (LRP) nos hepatócitos (STRYER, 1987; WEISS, 1993; MONTGOMERY
e cols., 1996; WITZTUM, 1996).
7
Capítulo 1 – Introdução
Os triacilgliceróis sintetizados endogenamente, diferentemente
daqueles obtidos da dieta, são transportados pelas lipoproteínas de muito baixa
densidade (VLDL), produzidas primariamente no fígado. As apolipoproteínas
presentes na superfície das partículas de VLDL são a apo B-100, apo E, apo C-I,
apo C-II e apo C-III, sendo a primeira principal e indispensável à secreção de
VLDL. Quando as VLDL circulam, seu conteúdo de triglicerídeos é hidrolisado pela
enzima lipoproteína lipase (LPL), que está ligada ao endotélio dos capilares e da
mesma forma que nos quilomícrons, é ativada pela apo C-II ligada a partícula de
VLDL. Os ácidos graxos liberados podem entrar nos adipócitos, onde são
reesterificados e armazenados como triglicerídeos, ou nos músculos, onde são
oxidados para produção de energia. A partícula residual de VLDL, rica em
ésteres de colesterol, agora é considerada uma lipoproteína de densidade
intermediária (IDL) e possui dois destinos: metade delas é captada pelo fígado,
onde é removida pelo receptor de LDL, enquanto que a outra metade é
convertida em lipoproteína de baixa densidade (LDL), a principal carreadora de
colesterol no sangue. A LDL contém uma parte central com cerca de 1500
moléculas de colesterol esterificado circundada por uma capa de fosfolipídeos,
colesterol não esterificado e uma única cópia de apo B-100. Em condições
normais, a meia-vida de IDL é curta (minutos a algumas horas) e os níveis de IDL
são muito baixos. Por outro lado, a meia-vida de LDL é muito mais longa (cerca
de dois dias) e é por isso que a LDL representa dois terços do conteúdo de
colesterol do plasma (STRYER, 1987; WEISS, 1993; MONTGOMERY e cols., 1996;
WITZTUM, 1996).
As partículas de LDL estão envolvidas no transporte de colesterol
para as células periféricas, as quais podem utilizá-lo para necessidades
fisiológicas (obtenção de energia) ou estocá-lo. Quando estes tecidos
necessitam de mais colesterol eles aumentam o número de receptores de LDL na
sua superfície e removem mais LDL do plasma via receptor de LDL, sendo que o
inverso também ocorre quando a necessidade de colesterol diminui. Nos seres
humanos, aproximadamente 75% das partículas de LDL são removidas do plasma
via receptor de LDL e, quase dois terços desta quantidade são removidos pelo
fígado (WEISS, 1993; WITZTUM, 1996).
8
Capítulo 1 – Introdução
O Transporte Reverso do Colesterol (TRC)
O TRC consiste basicamente na remoção do excesso de colesterol
e triglicerídeos circulante via tecido hepático para reutilização ou excreção pela
bile. Este excesso de colesterol é proveniente de duas fontes: 1) componentes de
superfície, como colesterol não-esterificado, fosfolipídeos e várias
apolipoproteínas resultado da hidrólise de lipoproteínas ricas em triglicerídeos e 2)
colesterol sintetizado nos tecidos extra-hepáticos.
Nesta rota, este excesso é transferido às lipoproteínas de alta
densidade (HDL), que são sintetizadas por macrófagos e pelos tecidos hepático e
intestinal. A HDL é formada por discos de fosfolipídeos que contém
apolipoproteínas A-I, A-II e A-IV, C-I e C-III. Estes discos contatam e absorvem o
colesterol das membranas celulares que é colocado na partícula de HDL por
uma reação de esterificação catalisada pela enzima lecitina-colesterol
aciltransferase (LCAT). Esta esterificação torna o colesterol apolar fazendo com
que ele se mova para o cerne da HDL, o que torna a superfície da partícula
disponível para aceitar mais colesterol livre. A remoção do colesterol da HDL pelo
fígado é mediada por um receptor denominado SR-BI (scavenger receptor class
B type I) que internaliza somente ésteres de colesterol e libera a lipoproteína para
captação de mais lipídeos (WEISS, 1993; WITZTUM, 1996, KRIEGER, 1999).
Além disso, a proteína transferidora de ésteres de colesterol (CETP)
que circula, em maior proporção, ligada à HDL media a transferência de ésteres
de colesterol das partículas de HDL para VLDLs e LDLs em troca de triglicerídeos
(HILL e cols., 1998; BARTER, 2000). Este mecanismo permite que também ocorra a
recaptação hepática via outros receptores, como LDL-R que reconhecem VLDLs
e LDLs.
1.2. N
ÍVEIS LIPÍDICOS E SEUS FATORES DETERMINANTES
A relação entre níveis lipídicos e o risco de doença cardiovascular
já está bem estabelecido. Até alguns anos, um mau perfil lipídico era definido
quase exclusivamente pelos níveis de LDL, mas hoje em dia sabe-se que baixos
9
Capítulo 1 – Introdução
níveis de HDL e níveis elevados de triglicerídeos, principalmente de lipoproteínas
remanescentes, também são fatores importantes para o cálculo de risco para
doença cardiovascular (revisões em BALLANTYNE, 1998; KWITEROVICH, 1998;
BREWER, 1999).
O NCEP (National Cholesterol Education Program), principal órgão
que define as diretrizes do que seria um perfil lipídico considerado bom, atualiza
periodicamente seus dados visando auxiliar profissionais dá área em proceder
tratamentos adequados (NCEP, 2001). A tabela 1.1 apresenta os valores
recomendados:
Tabela 1.1: Valores recomendados pelo NCEP – ATP III.
Nível (mg/dl) Classificação
LDL
< 100 ótimo
100 –129 próximo ao ótimo
130 –159 levemente elevado
160 –189 elevado
≥ 190 muito elevado
colesterol total
< 200 desejável
200 –239 levemente elevado
≥ 240 elevado
HDL
< 40 baixo
≥ 60 elevado
triglicerídeos
< 150 normal
150 –199 levemente elevado
200 – 499 elevado
≥ 500 muito elevado
Os níveis lipídicos, assim como as demais características
multifatoriais, são determinadas por vários fatores. Estudos familiares e
populacionais determinaram que aproximadamente 50% da variância
observada podem ser atribuídos a variabilidade genética entre indivíduos, e que
fatores ambientais tais como dieta, exercício físico, consumo de álcool e
tabagismo são responsáveis pelos outros 50% (TALMUD e WATERWORTH, 2000).
No metabolismo de lipídeos (descrito resumidamente no item
anterior), pode-se observar que várias proteínas (tanto estruturais como com
atividade catalítica) estão envolvidas para o correto balanço metabólico. Desta
10
Capítulo 1 – Introdução
forma, a variabilidade dos genes codificadores para proteínas que atuam em
diferentes pontos desta rota metabólica é de especial interesse para explicar a
variância encontrada nos níveis lipídicos.
Esta dissertação será focada em polimorfismos dos genes das
apolipoproteínas C-III e A-IV do agrupamento gênico A-I/C-III/A-IV e das apos C-I
e C-II pertencentes ao agrupamento E/C-I/C-II, sobre os quais serão detalhados a
organização gênica, funções específicas no metabolismo e outras funções
desempenhadas, além de como a variabilidade nestes genes está associada a
alterações nos níveis de lipídeos e lipoproteínas.
1.3. A
DISTRIBUIÇÃO DAS APOLIPOPROTEÍNAS NO GENOMA HUMANO
Os genes das apolipoproteínas apresentam, com exceção das apos
D e B, uma organização estrutural comum composta de quatro éxons e três
íntrons. Os íntrons possuem localizações similares: o primeiro íntron termina na
região 5’ não traduzida do mensageiro; o segundo íntron termina na região que
codifica o peptídeo sinal e o terceiro íntron termina na região codificadora da
proteína madura (LI e cols., 1988; HOUPPERMANS, 1994). O gene da apo A-IV
difere do das demais apolipoproteínas pois o primeiro íntron foi perdido, mas os
demais íntrons foram conservados e sua estrutura global permanece inalterada
(HOUPPERMANS, 1994).
Os genes das apolipoproteínas são derivados de um gene ancestral
localizado no cromossomo 19 que codificava as apos E, A-I, C-III, A-II, C-II e C-I.
No homem moderno, a apolipoproteína A-II é codificada por um gene isolado
mapeado no cromossomo 1. As apos A-I, C-III e A-IV no cromossomo 11 e as apos
E, C-I e C-II no cromossomo 19 formam dois agrupamentos gênicos distintos.
O agrupamento gênico A-I/C-III/A-IV tem cerca de 20 Kb. O gene
da apo A-IV é resultante de uma duplicação do gene da apo A-I e por
transposição o gene da apo C-III foi introduzido entre os genes das
apolipoproteínas A-I e A-IV. Além disso, o sentido da transcrição (oposto aos
11
Capítulo 1 – Introdução
genes das apos A-I e A-IV) mostra que o gene da apo C-III não localizava-se
nesta posição no gene precursor (LI e cols., 1988; HOUPPERMANS, 1994).
Já o agrupamento gênico E/C-I/C-II tem cerca de 48 Kb e além de
codificar essas três apos inclui na sua seqüência o pseudo-gene apo C-I e o gene
apo C-IV descoberto mais recentemente (LI e cols., 1988; JONG e cols., 1999).
1.4. O
PAPEL DAS APOS C-I, C-II, C-III E A-IV NO METABOLISMO LIPÍDICO
A compreensão da função das apolipoproteínas de baixo peso
molecular presentes em quilomícrons, VLDLs e HDLs denominadas, em conjunto,
de apolipoproteínas Cs, tem progredido rapidamente com os avanços da
biologia molecular (estudos com expressão in vitro e modelos animais,
principalmente). Estas apolipoproteínas foram classificadas primeiramente como
sendo uma única proteína, e adquiriram a denominação atual (apos C-I, C-II e C-
III) após o reconhecimento das suas propriedades distintas que serão
apresentadas a seguir.
Apolipoproteína C-I
A apo C-I é uma proteína de 6,6 KDa sintetizada principalmente no
fígado, mas que também é encontrada em níveis moderados na pele, baço e
pulmão. No metabolismo lipidíco, esta proteína é constituinte de lipoproteínas
ricas em triglicerídeos (quilomícrons e VLDLs) e HDLs (revisão em JONG e cols.,
1999).
Assim como outras apolipoproteínas, a apo C-I parece inibir a
remoção de lipoproteínas ricas em triglicerídeos (LRTs) via receptor de apo E,
além de também ser capaz de inibir a ligação mediada por apo E de partículas
de β-VLDL a proteína relacionada ao receptor de LDL (LRP). O mecanismo pelo
qual isso ocorre pode ser similar ao da apo C-III, ou seja, por deslocamento de
12
Capítulo 1 – Introdução
moléculas de apo E da lipoproteína ou por alteração da conformação da apo E
pela apo C-I como foi sugerido por WEISGRABER e cols. (1990).
A apo C-I parece também ter ação sobre enzimas envolvidas no
metabolismo lipídico. Apesar da apo A-I ser a principal ativadora da LCAT, a apo
C-I também se mostra efetiva (revisão em JONG e cols., 1999). Além disso,
GAUTIER e cols. (2000) mostraram que, em altas concentrações de HDL, a
transferência de ésteres de colesterol para outras lipoproteínas mediada pela
CETP é inibida, e que esta inibição é causada pela partícula de HDL e mais
especificamente pela apo C-I presente nesta lipoproteína.
Estudos com ratos knockout para apo C-I e transgênicos para apo
A-I revelaram uma depuração retardada de partículas de VLDL (JONG e cols.,
1996a). Já em estudos com animais transgênicos para apo C-I os resultados
obtidos também foram de hiperlipidemia associada a anormalidades cutâneas
(JONG e cols., 1998) e inibição da ligação de lipoproteínas à receptores
(SHACHTER e cols., 1996, JONG e cols., 1996b, JONG e cols., 1996c), mas
independente de resistência à insulina, outra causa de hiperlipidemia bastante
comum (KOOPMANS e cols., 2001). Sendo assim, tanto animais knockout como
transgênicos apresentam a depuração de VLDL retardada e o que se pode
pensar é que a apo C-I influencia a depuração de lipoproteínas de maneira
dose-dependente, mas de forma descontínua (JONG e cols., 1998).
Em outro estudo recente desenvolvido por BJÖRKEGREN e cols.
(2000), com o objetivo de verificar a composição de LRTs pós-prandiais em
pacientes normolipidêmicos com doença coronariana, foi verificado que além
destes pacientes apresentarem uma hipertrigliceridemia pós-prandial exagerada
quando comparados a um grupo controle, eles também apresentavam um
acúmulo de VLDLs grandes enriquecidas de apo C-I e que as VLDLs
remanescentes continuavam ricas em apo C-I e colesterol, o que pode ser
relevante para o desenvolvimento de aterosclerose.
Apolipoproteína C-II
Apo C-II humana é uma proteína de 8,8 KDa composta de 79
aminoácidos e ao contrário das outras apolipoproteínas abordadas na presente
investigação, tem sua função bem estabelecida. A apolipoproteína C-II tem um
13
Capítulo 1 – Introdução
importante papel no metabolismo lipídico, pois é responsável pela ativação da
enzima lipoproteína lipase (LPL), além de promover a remoção de VLDLs e
quilomícrons remanescentes pelo fígado (JONG e cols., 1999).
Estudos com fragmentos desta proteína mostram que a porção
carboxi-terminal contém estruturas responsáveis pela interação com a LPL e com
a sua ativação. Já a parte amino-terminal forma hélices anfipáticas que
ancoram a proteína à lipoproteína. O mecanismo detalhado de ativação da LPL
pela apo C-II ainda não está totalmente estabelecido. A apo C-II é um
constituinte normal das lipoproteínas, apesar da LPL poder se ligar a partículas
lipídicas na sua ausência. Por isso se assume que esta interação ocorre após a
ligação da LPL à partícula da lipoproteína e que a apo C-II atua mudando a
orientação da LPL em relação às moléculas lipídicas de uma forma favorável. A
dependência da ativação da lipase em relação a apo C-II varia de acordo com
a natureza do substrato lipídico. Interessantemente existem casos onde a LPL tem
atividade normal mesmo na ausência de apo C-II e por isso se torna difícil
entender porque pacientes com deficiência de apo C-II tem níveis tão altos de
triglicerídeos. Após alguns estudos cinéticos se concluiu que o maior efeito da
apo C-II é aumentar a afinidade da enzima pelas partículas lipídicas
(OLIVECRONA e BEISIEGEL, 1997).
Outros dados que mostram a relevância desta proteína são os casos
de deficiência de apo C-II, onde se observa uma severa hipertrigliceridemia,
principalmente com elevação de quilomícrons. Heterozigotos para deficiência
da apo C-II geralmente possuem níveis lipídicos normais, o que mostra que a apo
C-II está normalmente em excesso. Apesar de sua ausência causar
hipertrigliceridemia, a super-expressão de seu gene em ratos transgênicos
também causa esta alteração por uma depuração retardada de VLDLs, o que
pode ser explicado pela inibição da LPL por excesso de apo C-II na lipoproteína.
Estes dados sugerem que a apo C-II deve desempenhar um complexo papel no
metabolismo de triglicerídeos (OLIVECRONA e BEISIEGEL, 1997; JONG e cols.,
1999).
14
Capítulo 1 – Introdução
Apolipoproteína C-III
A apolipoproteína C-III (apo C-III) é um proteína com 79
aminoácidos (cerca de 8,8 KDa) que circula no plasma associada a lipoproteínas
ricas em triglicerídeos e HDL e tem como principal local de síntese o fígado. Sua
função no metabolismo lipídico ainda não está clara e o que se sabe
atualmente é resultado de estudos in vitro e em modelos animais (knockout ou
com super-expressão do gene).
WANG e cols. (1985) estudaram a função da apolipoproteína na
modulação da atividade da LPL e mostraram que somente a apo C-III possui
atividade inibitória sobre esta enzima; atuando como um inibidor não
competitivo. Este efeito também foi observado por outros pesquisadores (revisão
em JONG e cols., 1999).
Esta apolipoproteína também parece diminuir a remoção de
lipoproteínas ricas em triglicerídeos (LRTs) via receptor de apo E. FREDENRICH e
cols. (1997), estudando a relação apo C-III/apo E em pacientes
normotrigliceridêmicos e hipertrigliceridêmicos, verificaram que pacientes com
hiperlipoproteinemia tipo IV (aumento de triglicerídeos em VLDLs) apresentavam
um aumento de apo C-III em relação a apo E em lipoproteínas de tamanho
intermediário (remanescentes), o que poderia explicar o aumento de
triglicerídeos neste grupo de pacientes, já que estas lipoproteínas tem seu
reconhecimento pelos receptores celulares para apo E diminuído e sua
depuração reduzida. MARCOUX e cols. (2001) replicaram estes resultados
mostrando um aumento de apo C-III em LTRs e LTRs remanescentes também em
pacientes hipertrigliceridêmicos. Outra investigação conduzida por BREYER e cols.
(1999) mostrou que o deslocamento da apo E pela apo C-III de partículas de
VLDL é tamanho dependente: o deslocamento é maior quando estas partículas
são menores. Além do aumento direto nos níveis de triglicerídeos esta troca de
apos nas lipoproteínas leva a um prolongamento no intervalo de circulação das
LTRS devido a presença de mais apo C-III, o que aumenta a probabilidade de
ocorrer o contato com as paredes arteriais e o desenvolvimento de placas
ateromatosas (SPRECHER, 1998).
Outras evidências da ação desta proteína sobre o metabolismo de
LTRs são observadas: o catabolismo de lipoproteínas ricas em triglicerídeos é
15
Capítulo 1 – Introdução
acelerado em pessoas com deficiência de apo C-III e em cobaias knockout
para este gene, onde também ocorre uma acentuada queda nos níveis de
triglicerídeos (MAEDA e cols., 1994; PATSCH e GOTTO, 1996; FREDENRICH, 1998).
Por outro lado, a expressão aumentada de apo C-III humana em ratos
transgênicos está associada a severa hipertrigliceridemia, e o mecanismo pelo
qual isso ocorre provavelmente se deve a junção do efeito inibitório sobre a LPL e
a substituição de apo E por apo C-III, o que diminui o catabolismo das
lipoproteínas ricas em triglicerídeos (AALTO-SETÄLÄ e cols., 1992; DE SILVA e cols.,
1994; EBARA e cols., 1997).
Apolipoproteína A-IV
A apolipoproteína A-IV é uma glicoproteína plasmática com peso
molecular de 46 KDa sintetizada primariamente nos enterócitos do intestino
delgado durante a absorção de gordura. Ela é o maior componente pós-
prandial de quilomícrons e HDL (GREEN e cols., 1980; LEFEVRE e ROHEIM, 1984).
Apesar de sua função específica no metabolismo lipídico não estar
completamente esclarecida, estudos mostram que partículas de apo A-IV
participam do metabolismo destas lipoproteínas. Foi demonstrado que a apo A-
IV atua como um cofator para a lecitina-colesterol aciltransferase, uma enzima
chave na esterificação do colesterol. A ação da lecitina-colesterol
aciltransferase modifica in vitro a distribuição da apo A-IV de uma maneira em
que paralelamente há formação e retirada de colesteril ésteres (STEINMETZ e
UTERMANN, 1985; BISGAIER e cols. 1987). A apo A-IV também parece promover o
efluxo de colesterol das células e desta maneira participa do transporte reverso
do colesterol (STEINMETZ e cols., 1990; WEINBERG e JORDAN, 1990), além de
modular a ativação de lipoproteína lipase (GOLDBERG e cols., 1990). Em estudos
com ratos transgênicos para esta proteína observou-se uma diminuição no
desenvolvimento de lesões ateromatosas e níveis significativamente elevados de
HDL (COHEN e cols., 1997) enquanto que construções knockout para este gene
tem níveis diminuídos de HDL (WEINSTOCK e cols., 1997).
O comportamento bioquímico e biofísico da apo A-IV, entretanto, é
distinto das outras apolipoproteínas. Apesar de conter grande parte de sua
estrutura como α-hélices anfifílicas, a apo A-IV é a mais hidrofílica das
16
Capítulo 1 – Introdução
apolipoproteínas humanas, o que torna sua ligação a superfície lipídica bastante
lábil. Além disso, a apo A-IV facilmente forma dímeros com grande afinidade
tanto in vitro como in vivo. Devido as suas características, a apo A-IV circula
primariamente não associada às lipoproteínas (WEINBERG e JORDAN, 1990).
Apesar dos estudos realizados mostrarem a participação desta
proteína no metabolismo lipídico, as funções desempenhadas pela apo A-IV são,
de uma forma geral, compartilhadas com a apo A-I, que está em maior
concentração na circulação. Além disso, o seu comportamento biofísico (circular
dissociada da fração lipídica) e ter sua expressão e síntese aumentadas durante
a ingestão de gordura sugerem que esta proteína tenha outras funções. Nos
últimos anos, vários estudos têm mostrado que a apo A-IV pode ser um sinalizador
de saciedade em curto período e um potencial controlador de apetite e ganho
de peso a longo prazo (revisões em KALOGERIS e cols., 1997; LIU e cols., 1999 e
TSO e cols., 1999). O mecanismo pelo qual isso ocorre provavelmente se dá por
controle ao nível de sistema nervoso central (SNC). Como a síntese de apo A-IV
no SNC é improvável, uma hipótese proposta é a de que a proteína atravesse a
barreira cérebro-espinhal para influenciar o comportamento alimentar.
Outra descoberta relativamente recente é a ação da apo A-IV
como um modulador da atividade gástrica superior. A infusão de apo A-IV inibe
a secreção ácida e o esvaziamento gástrico. A apo A-IV, então, deve agir como
uma enterogastrona, ou seja, um mediador humoral da inibição da secreção
gástrica por gordura intestinal. Não se sabe se há uma ligação entre o efeito
sobre a secreção gástrica e a de controle de apetite (KALOGERIS e cols., 1997),
mas estudos realizados visando estabelecer o efeito do peptídeo tirosina-tirosina
(PYY), um hormônio gastrointestinal que também possui atividade de
enterogastrona, sobre a síntese de apo A-IV mostram que este estimula a síntese
desta proteína (KALOGERIS e cols., 1998; SONOYAMA e cols., 2000).
Como a função da apo A-IV em modular o apetite pode ser um
efeito secundário decorrente de alterações nas concentrações de outras
proteínas importantes para o controle do apetite, estudos com o objetivo de
verificar estas relações estão sendo desenvolvidos, mas os resultados ainda são
inconclusivos. Recentemente, KALOGERIS e cols. (2001) verificaram que ocorre
uma rápida adaptação (aumento) dos níveis de apo A-IV induzida por gordura
que é independente dos níveis de leptina. Por outro lado, MORTON e cols. (1998)
17
Capítulo 1 – Introdução
mostraram que a administração intravenosa de leptina diminui em duas vezes o
nível de transcrição da apo A-IV.
Um outro estudo realizado por QIN e cols. (1998) mostrou que a apo
A-IV pode ser um potente antioxidante de lipoproteínas, o que leva a se pensar
em uma outra função para essa proteína. Apesar de existirem vários
antioxidantes naturais, a apo A-IV pode ser importante devido aos seguintes
aspectos: 1) é um produto endógeno que tem sua síntese aumentada com
consumo de gordura; 2) tem estrutura anfipática, circula tanto associada como
dissociada de lipoproteínas e pode agir como antioxidante tanto em meio
aquoso como hidrofóbico (em meio aos lipídeos). Estes resultados parecem
explicar a proteção contra o desenvolvimento de aterosclerose em ratos
transgênicos para apo A-IV, uma vez que estariam “protegidos” da oxidação
lipoproteica. Outra investigação que mostra esta função da apo A-IV como
antioxidante foi recentemente descrita por OSTOS e cols. (2001), onde duas
construções knockout para apo E foram desenvolvidas, sendo que em uma
também havia expressão da apo A-IV. Os resultados mostraram, que em ambas
as linhagens, o perfil lipídico era péssimo, mas aquela onde a apo A-IV era
expressa estava protegida de dano oxidativo.
1.5. I
NFLUÊNCIA DA VARIABILIDADE DOS GENES DAS APOS C-I, C-II, C-III E A-IV, NOS
NÍVEIS DE LIPÍDEOS PLASMÁTICOS
Vários polimorfismos nos agrupamentos gênicos A-I/C-III/A-IV e E/C-
I/C-II já foram descritos. A figura 1.1 resume os polimorfismos de comprimento de
fragmentos de restrição (RFLPs) que serão analisados na presente investigação:
18
Capítulo 1 – Introdução
Agrupamento gênico AI/C-III/A-IV – cromossomo 11
3’
5 ’
A
po A-
I
5’ 5’ 3’
A
po
C
-III
A
po A-IV
3’ 3’
IRE
X
baI
SacI
HinfI PvuII
T-455C
FokI
C-482T
MspI
Ag
ru
p
amento
g
ênico E/C-I/C-II
–
cromossomo 19
5’
A
po
E
5’ 5’
A
po
C
-II
A
po
C
-I
3’
3’
AvaII
HpaI
Figura 1.1: Esquema simplificado dos agrupamentos gênicos A-I/C-III/A-IV e
E/C-I/C-II e a localização dos RFLPs.
Apolipoproteína C-I
O gene para apolipoproteína C-I apresenta um sítio polimórfico
para a endonuclease de restrição HpaI localizado na região promotora (posição
–317) que é resultado de uma inserção de 4 pares de base (CGTT). A freqüência
do alelo H*1 (ausência da inserção) varia de 0,67 (Países Baixos) a 0,87 (Coréia)
(NILLESEN e cols., 1990; HONG e cols., 1997; SEIXAS e cols., 1999; XU e cols., 1999;
WATERWORTH e cols., 2000, DE ANDRADE e cols., 2001b; HUBACEK e cols., 2001).
XU e cols. (1999) estudaram este marcador em dois grupos étnicos e
verificaram um perfil distinto de desequilíbrio de ligação entre os alelos deste loco
com os alelos da apo E entre caucasóides e negróides norte-americanos além
de encontrarem uma associação significante entre a presença do alelo H*2 e
níveis diminuídos de triglicerídeos (-19%) e aumentados de HDL (+18%) no grupo
negróide com genótipo ε*3/ε*3 para apo E. Outro enfoque dado por esses
pesquisadores em experimentos de expressão gênica in vitro mostrou que a
19
Capítulo 1 – Introdução
seqüência com a inserção (H*2) apresentava um aumento de cerca de 50% na
expressão do gene.
Em outro estudo, WATERWORTH e cols. (2000) investigaram a
influência deste RFLP sobre níveis de lipoproteínas remanescentes. Neste trabalho
verificou-se uma associação entre o alelo H*2 e aumento tanto de lipoproteínas
remanescentes ricas em triglicerídeos como em colesterol. O polimorfismo para
HpaI foi também estudado em coreanos e tchecos, onde não foram observadas
associações com o perfil lipídico (HONG e cols., 1997, HUBACEK e cols., 2001,
respectivamente).
Apolipoproteína C-II
Embora várias mutações raras que abolem totalmente a função
desta apolipoproteína terem sido descritas (revisão em JONG e cols., 1999),
poucos polimorfismos nesta proteína são conhecidos. Em 1987, KORNELUK e
colaboradores verificaram a presença de um polimorfismo para endonuclease
de restrição AvaII por southern blot. A alteração responsável pela eliminação do
sítio de restrição para esta enzima foi elucidada por GEISEL e cols. (1996) como
sendo a substituição de T para C na posição 3548 do gene. Em 1997, HONG e
colaboradores verificaram a presença do mesmo sítio polimórfico para AvaII em
um fragmento de PCR descrito por ZYSOW e cols. (1992). Este sítio é bastante
polimórfico na população caucasóide onde foi descrito (KORNELUK e cols, 1987)
e também em coreanos (HONG e cols., 1997) com uma freqüência de 45% e
46%, respectivamente. Em tribos indígenas brasileiras, por outro lado, a freqüência
deste mesmo alelo variou de 0 a 3% (DE ANDRADE e cols., 2001b).
Um único trabalho foi realizado com o objetivo de verificar a
influência deste RFLP sobre os níveis lipídicos. Nesta investigação a análise de
associação realizada mostrou que os níveis de triglicerídeos e colesterol em
portadores do alelo A*2 eram menores (HONG e cols., 1997).
Apolipoproteína C-III
A variabilidade da apo C-III vem sendo amplamente investigada
em diversas populações. Um dos RFLPs mais estudados é o para a endonuclease
20
Capítulo 1 – Introdução
de restrição SacI (SstI). Este polimorfismo é decorrente da substituição C3238G na
região 3’ não traduzida do gene (3’UTR). Apesar de não ser funcional, a presença
do sítio de restrição (alelo S*2) parece estar associada a alterações nos níveis
lipídicos em diversas populações, mas não em todas (tabela 1.2).
Tabela 1.2: Alguns estudos sobre a associação do polimorfismo SacI com
níveis lipídicos.
População Associação encontrada Referência
FRANÇA
↑ VLDL, ↑ LDL, ↑ VLDL-C/VLDL-tri,
↑ S*2 em HTG
OPPERT e cols. (1992)
FRANÇA ↑ Tri, apo C-III
DALLONGEVILLE e cols.
(2000)
F
RANÇA ↑ S*2 em diabéticos HTG MARÇAIS e cols. (2000)
E
SPANHA
↓ LDL-C após dieta rica em
gordura
LÓPEZ-MIRANDA e cols.
(1997)
I
TÁLIA → MARASCO e cols. (1993)
F
INLÂNDIA ↑ colesterol, ↑ LDL-C PORKKA e cols. (1994)
I
RLANDA
↑ apo C-III
↑ Tri, ↑ colesterol,↑ LDL-C
DALLINGA-THIE e cols.
(1996)
R
EPÚBLICA TCHECA → HUBACEK e cols. (2001)
E
UROPA* → KEE e cols. (1999)
A
LEMANHA ↑ colesterol, ↑ Tri WICK e cols. (1995)
J
APÃO ↑ S*2 em HTG ZENG e cols. (1995)
C
HINA
↑ Tri, ↑ colesterol
↑ S*2 em HTG
KO e cols. (1997)
B
RASIL ↑ S*2 em indivíduos com DAC BYDLOWSKI e cols. (1996)
DAC: doença arterial coronariana, HTG: hipertrigliceridemia, Tri: triglicerídeos, *
indivíduos selecionados de vários países europeus, ↑: aumento, ↓: diminuição, →:
não achou associação.
Como o mecanismo pelo qual a presença do alelo S*2 altera os
níveis de colesterol e triglicerídeos ainda é desconhecido, acredita-se que este
21
Capítulo 1 – Introdução
polimorfismo possa estar em desequilíbrio de ligação com outros sítios
polimórficos em elementos regulatórios que seriam responsáveis pelas desordens
lipídicas apresentadas por pacientes portadores do alelo variante. Uma região
polimórfica candidata é o IRE (insulin response element) situada a 5’ do gene
para apo C-III. O IRE é um importante ponto de controle para a transcrição da
apo C-III: a insulina se liga a este sítio inibindo a transcrição do gene.
Duas variantes descritas neste elemento, C-482T (MspI) e T-455C
(FokI), parecem abolir o efeito inibitório da insulina sobre a transcrição deste
gene, o que leva a expressão contínua de apo C-III, com conseqüente
hipertrigliceridemia (LI e cols., 1995). Estudos de associação com níveis lipídicos e
de lipoproteínas incluindo os três RFLPs mostram que existe desequilíbrio de
ligação forte entre os três sítios (HEGELE e cols., 1997; GROENENDIJK e cols. 1999;
WATERWORTH e cols., 2000), mas se verificou que, em alguns casos, a associação
encontrada para cada sítio é independente dos outros (SHOULDERS e cols., 1996;
SURGUCHOV e cols., 1996; WATERWORTH e cols., 2000) e em outros casos, a
associação é resultado do desequilíbrio de ligação (DALLONGEVILLE e cols.,
2000).
Outra abordagem realizada com objetivo de avaliar a influência
destes polimorfismos é a construção de haplótipos com os três RFLPs (-482, -455 e
SacI). Em dois trabalhos (SURGUCHOV e cols., 1996; HOFFER e cols., 1998) que
abordaram os três polimorfismos simultaneamente foram observadas diferenças
estatisticamente significantes entre pacientes normotrigliceridêmicos (maior
prevalência do haplótipo -482T/-455T/S*1) e hipertrigliceridêmicos (maior
prevalência do haplótipo –482T/-455C/S*2), mas a retirada do polimorfismo para
SacI da análise fez com que as freqüências se igualassem nos dois grupos.
DAMMERMAN e cols. (1993) investigaram os polimorfismos MspI e SacI e
verificaram que pacientes portadores do haplótipo -482T/S*2 tinham um risco
aumentado de desenvolver hipertrigliceridemia.
Quanto aos níveis de expressão, ESTERBAUER e cols. (1999)
realizaram um estudo no qual compararam construções com os alelos comuns (-
482C, -455T e S*1) com construções contendo pelo menos uma das variantes e
verificaram que a presença de qualquer uma delas aumenta a expressão de
apo C-III, sendo que a construção com a variante S*2 foi a mais expressa.
22
Capítulo 1 – Introdução
Apolipoproteína A-IV
A alteração genética responsável pelo polimorfismo PvuII foi
elucidada por seqüenciamento de DNA e consiste em uma substituição de G
(alelo A-IV*1 ou 360Gln, presença do sítio) para T (alelo A-IV*2 ou 360His, ausência
do sítio) na terceira base do códon 360 resultando na mudança de glutamina
para histidina na proteína madura. Estudos físico-químicos sugerem que a
substituição deste aminoácido aumenta o conteúdo de α-hélice da proteína
nativa aumentando sua ação sobre a ativação da LCAT (ZAIOU e cols., 1994;
PATSCH e GOTTO, 1996).
A associação entre este polimorfismo e os níveis de lipídeos e
lipoproteínas é bastante controverso. Alguns estudos mostraram que esta
variação genética não exerce nenhum efeito importante nas concentrações de
lipídeos e de lipoproteínas (DE KNIJFF e cols., 1988; ZAIOU e cols., 1994; MENZEL e
cols., 1995; CARREJO e cols., 1995; MALLE e cols., 1996). Entretanto em outras
investigações, uma associação significante deste polimorfismo foi observada.
BOERWINKLE e SING (1986) descreveram um aumento do colesterol total e de
LDL-colesterol em indivíduos com o alelo A-IV*2 enquanto que outros
pesquisadores verificaram níveis aumentados de HDL-colesterol em indivíduos
com o mesmo alelo (MENZEL, 1988, 1990; LEHTINEN e cols., 1998). EICHNER e cols.
(1989) relataram que mulheres homozigotas A-IV 1-1 tem níveis de triglicerídeos
maiores que mulheres heterozigotas (A-IV 1-2).
Com o objetivo de avaliar a influência deste RFLP sobre o perfil
lipídico em resposta a alterações alimentares, dois trabalhos observaram que
portadores do alelo A-IV*2 (360His) tinham níveis significantemente inferiores de
HDL após algum tempo com dieta restrita (HEILBRONN e cols., 2000) e dieta pobre
em gordura (JANSEN e cols., 1997). Já WEINBERG e cols. (2000) mostraram que
portadores do alelo 360His têm a absorção de colesterol diminuída após dieta
rica em gordura polinsaturada, mas este efeito só foi evidenciado em indivíduos
homozigotos para outro polimorfismo no mesmo gene (347Thr).
Além disso, outras investigações mostraram que o polimorfismo
Gln360His também pode influenciar o status lipêmico pós-prandial. OSTOS e cols.
(2000) e HOCKEY e cols. (2001) verificaram um aumento nas concentrações de
lipoproteínas ricas em triglicerídeos em portadores do alelo 360His nestas
23
Capítulo 1 – Introdução
condições, enquanto que FISHER e cols. (1999) verificaram que obesos portadores
do mesmo alelo demonstravam uma lipemia pós-prandial diminuída.
Dadas as funções desempenhadas por esta proteína, trabalhos
com o objetivo de verificar se a variabilidade neste gene pode estar associada a
sobrepeso ou obesidade também vem sendo desenvolvidos. Uma investigação
conduzida por FISHER e cols. (1999) mostrou que portadores do alelo A-IV*2
(360His) tinham o índice de massa corporal (IMC) significantemente inferiores a
homozigotos 360Gln, resultado este também encontrado por LEFEVRE e cols.
(2000).
Outro polimorfismo encontrado no gene da apolipoproteína A-IV é
decorrente da substituição A Æ T na primeira base do codon 347 e resulta na
troca do aminoácido treonina (Thr) por serina (Ser) na proteína madura.
Investigações sobre este RFLP também são inconclusivas. Alguns trabalhos
relataram ausência de associação do polimorfismo com níveis lipídicos (ZAIOU e
cols., 1994; CARREJO e cols., 1995) enquanto outros encontraram o alelo 347Ser
associado a um melhor perfil lipídico, como diminuição de LDL (VON
ECKARDSTEIN e cols., 1992) e hidrólise rápida de quilomícrons por maiores
concentrações de apo A-IV (OSTOS e cols., 1998) ou a um pior perfil lipídico com
aumento de colesterol total e triglicerídeos (FISHER e cols., 1999). Além disso, este
RFLP também vem sendo investigado quanto a sua influência sobre o índice de
massa corporal. FISHER e cols. (1999) e LEFEVRE e cols. (2000) verificaram que
portadores do alelo 347Ser têm IMC significantemente maiores do que
homozigotos 347Thr.
Além destes dois polimorfismos, a apolipoproteína A-IV apresenta
um sítio polimórfico para a endonuclease de restrição XbaI localizado no
segundo íntron do gene. Este polimorfismo ainda é pouco estudado, mas como
os demais citados acima apresenta resultados controversos sobre seus efeitos
sobre os níveis de lipídeos. ZAIOU e cols. (1994) e KEE e cols. (1999), estudaram
este polimorfismo e não encontraram efeitos significativos sobre os níveis de
lipoproteínas, apolipoproteínas ou doenças relacionadas, enquanto que PAUL-
HAYASE e cols. (1992) encontraram níveis aumentados de apolipoproteína A-IV
em portadores do alelo X*2 (presença do sítio de restrição).
24
Capítulo 2 – Justificativa e Objetivos
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
As complicações da aterosclerose são responsáveis por cerca da
metade das mortes nos países ocidentais. Dados do SUS sobre a mortalidade no
Brasil mostram que o Rio Grande do Sul apresenta um índice de mortalidade
devido a problemas circulatórios, aterosclerose e doenças cardíacas maior que
a média nacional (DATASUS, 1998), o que deve refletir tanto o estilo de vida
como a constituição genética da população formadora do estado do Rio
Grande do Sul.
De acordo com o que foi descrito na introdução deste trabalho,
polimorfismos nos genes das apos pertencentes aos agrupamentos gênicos A-
I/C-III/A-IV e E/C-I/C-II podem estar associados a níveis aumentados de lipídeos,
lipoproteínas e de variáveis antropométricas, bem como às doenças
relacionadas. No entanto, os estudos realizados ainda são inconclusivos, o que se
deve, provavelmente, às diferentes abordagens dadas por cada autor assim
como à heterogeneidade genética destas características em diferentes
populações. É importante ressaltar que pouco se sabe sobre a variabilidade
desses genes em populações brasileiras bem como qual a influência dessa
variabilidade sobre esses parâmetros.
Desta forma, o presente trabalho tem como objetivos específicos:
I. Estudar oito RFLPs (figura 1.1, introdução) nos genes das apolipoproteínas
pertencentes aos agrupamentos gênicos A-I/C-III/A-IV e E/C-I/C-II em uma
amostra de indivíduos caucasóides de Porto Alegre.
25
Capítulo 2 – Justificativa e Objetivos
II. Realizar um estudo de associação entre cada RFLP e dos haplótipos derivados
e os níveis de lipídeos e lipoproteínas, para verificar a contribuição destes
polimorfismos para o perfil lipídico da população em questão.
III. Determinar se a variabilidade da apo A-IV está correlacionada com o IMC e a
relação cintura/quadril nesta amostra.
26
Capítulo 3– Material e Métodos
3. M
ATERIAL E MÉTODOS
3.1. A
MOSTRA
Participaram da amostra deste trabalho 391 indivíduos caucasóides
da região de Porto Alegre (RS – Brasil). A coleta da amostra foi realizada junto ao
laboratório de bioquímica da Faculdade de Farmácia da UFRGS bem como no
Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Na Faculdade de Farmácia (n=309),
cada indivíduo, após assinatura de um termo de consentimento informado
(anexo 1), foi entrevistado quanto a história familiar ou presença de doença
coronariana, hipertensão arterial ou diabetes, tabagismo, sedentarismo (avaliado
como prática de esporte fora do ambiente de trabalho, conforme HAN e cols.,
1998) e consumo de álcool (anexo 2). Juntamente com a entrevista os indivíduos
foram pesados e medidos (altura, cintura e quadril) e tiveram seus lipídeos séricos
(colesterol total, triglicerídeos e HDL), bem como glicose quantificados. No
delineamento da amostra foram excluídos indivíduos que usavam medicamentos
que podem alterar níveis lipídicos (tais como, hipolipemiantes, β-bloqueadores,
corticosteróides, revisão em MANTEL-TEEUWISSE e cols., 2001) ou apresentavam
doenças que também afetam estes parâmetros (insuficiência renal, diabetes,
alcoolismo, hipotiroidismo).
No HCPA as amostras (n=82) foram obtidas junto ao laboratório de
Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica do hospital após dosagens lipídicas.
Neste caso, os pacientes não foram entrevistados, mas uma análise detalhada
de cada prontuário foi realizada, visando excluir amostras de pacientes não
apropriadas para o estudo com os mesmos critérios descritos anteriormente. O
projeto foi previamente aprovado pelo GPPG do HCPA (anexo 3).
27
Capítulo 3– Material e Métodos
3.2. DOSAGENS BIOQUÍMICAS E MEDIDAS ANTROPOMÉTRICAS
Os níveis de colesterol total, HDL colesterol e triglicerídeos foram
dosados nos próprios locais de coleta por métodos enzimáticos após 12 horas de
jejum. Na Faculdade de Farmácia foram utilizados “kits” Labtest em um aparelho
automatizado Selectra, enquanto que no HCPA, as dosagens foram realizadas no
aparelho MegaMerck com “kits” Merck. A fração LDL colesterol foi calculada
segundo a fórmula descrita por FRIEDEWALD e cols. (1972), que é válida somente
para casos onde os níveis de triglicerídeos são inferiores a 400 mg/dl.
O índice de massa corporal (IMC) foi obtido dividindo-se o peso em
quilogramas pela altura em metros elevada ao quadrado (kg/m
2
). A medida da
cintura foi realizada na menor circunferência entre a 12º costela e a crista ilíaca.
O quadril foi medido como a máxima circunferência dos glúteos. A proporção
cintura/quadril foi obtida através da divisão da medida da cintura pela medida
do quadril.
3.3. A
NÁLISE DOS POLIMORFISMOS
O DNA de cada amostra foi extraído de sangue total através das
técnicas descritas por MILLER e cols. (1988) ou LAHIRI e NURNBERGER (1991).
A identificação dos RFLPs foi realizada pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) seguida de digestão com as endonucleases de restrição
apropriadas para cada caso. O fragmento de interesse para cada sítio foi
amplificado conforme os protocolos descritos na tabela 3.1.
Após a digestão com as respectivas endonucleases de restrição, os
produtos de clivagem foram submetidos a eletroforese em géis de poliacrilamida
ou agarose e os fragmentos foram visualizados sob luz UV após exposição dos
géis a solução de brometo de etídio. As condições de clivagem (tempo de
incubação, temperatura e quantidade de enzima) estão especificadas na
tabela 3.2.
28
Capítulo 3– Material e Métodos
Tabela 3.1: Descrição dos primers e condições de amplificação para cada RFLP investigado.
RFLPs Primers Reação de amplificação
Condições de
amplificação
Referência
SacI
apo C-III
P1 5`-AGG ACA AGT TCT CTG AGT
TCT-3`
P2 5`- GCA GCT TCT TGT CCA GCT
T-3`
1,5mM MgCl
2
, 10mM Tris, 50mM KCl,
30 pmol de P1 e P2,
200µM dNTPs, 0,5U Taq polimerase,
~ 100ng DNA
95°C – 5’
95°C – 5’’
63°C – 1’ 30 x
72°C – 30’’
72°C – 5’
OPPERT e cols. (1992)
FokI e MspI
apo C-III
P1 5`-GTG AGA GCT CAG CCC
CTG TAA-3’
P2 5`-TTT CAC ACT GGA AAT TTC
AGG-3’
1,5mM MgCl
2
, 10mM Tris, 50mM KCl,
10 pmol de P1 e P2,
200µM dNTPs,1,5U Taq polimerase,
~ 100ng DNA
94°C – 5’
94°C – 1’
60°C – 1’ 40 x
72°C – 1’
72°C – 5’
HEGELE e cols. (1997)
XbaI
apo A-IV
P1 5`-TAG GAT CCA CAT ATG TAA
AC-3`
P2 5`-GTC TTT CTG AAA CG ATT
AG –3`
1,5mM MgCl
2
, 10mM Tris, 50mM KCl,
20 pmol de P1 e P2,
200µM dNTPs, 0,5U Taq polimerase,
~ 100ng DNA
94°C – 5’
94°C – 1’
37°C – 1’ 30 x
72°C – 2’
72°C – 5’
ZAIOU e cols. (1994)
HinfI e PvuII
apo A-IV
P1 5`-GCC CTG GTG CAG CAG
ATG GAA CAG CTC AGG-3`
P2 5`-CAT CTG CAC CTG CTC
CTG CTG CTG CTC CAG -3`
1,5mM MgCl
2
, 10mM Tris, 50mM KCl,
20 pmol de P1 e P2,
200µM dNTPs, 1,0U Taq polimerase,
~ 100ng DNA
95°C – 5’
95°C – 1’
65°C – 1’ 35 x
70°C – 2’
72°C – 5’
HIXSON e POWERS
(1991)
HpaI
apo C-I
P1 5`-TTT GAG TCG GCT CTT GAG
ACA GGA A -3`
P2 5`-GGT CCC GGG CAC TTC
CCT TAG CCC CA -3`
1,5mM MgCl
2
, 10mM Tris, 50mM KCl,
10 pmol de P1 e P2,
250µM dNTPs, 1,0U Taq polimerase,
~ 100ng DNA
94°C – 5’
95°C – 50’’
58°C – 50’’ 30 x
72°C – 1’30’’
72°C – 5’
NILLESEN e cols.
(1990)
AvaII
apo C-II
P1 5’- CCG AGT CAC ACA GCG
CAG GAT CTC AGT C-3’
P2 5’-AAG AAT TCA GGA CTA GCT
AGA GAG TTG GGA GGA GG-3’
2,0mM MgCl
2
, 10mM Tris, 50mM KCl,
10 pmol de P1 e P2,
250µM dNTPs, 2U Taq polimerase,
~ 100ng DNA
95°C – 5’
95°C – 15’’
60°C – 15’’ 30 x
72°C – 2’30’’
72°C – 5’
ZYSOW e cols. (1992)
29
Capítulo 3– Material e Métodos
Tabela 3.2: Condições de clivagem.
Gene Enzima
Quantidade
de enzima (U)
Temperatura
(ºC)
Tempo de
incubação (h)
Apo C-I HpaI 15 37 3
Apo C-II AvaII 2 37 2
Apo C-III FokI 3 37 2
Apo C-III MspI 15 37 3
Apo C-III SacI 8 37 4
Apo A-IV HinfI 5 37 3
Apo A-IV PvuII 10 37 4
Apo A-IV XbaI 10 37 4
3.4. A
NÁLISE ESTATÍSTICA
3.4.1. Freqüências gênicas e haplotípicas, comparação de freqüências e
desequilíbrio de ligação
As freqüências alélicas dos polimorfismos investigados foram
calculadas pelo método de contagem gênica e os haplótipos derivados foram
estimados por máxima verossimilhança para cada indivíduo (LONG e cols., 1995;
LONG, 1999; PETERSON e cols., 1999). A freqüências genotípicas e haplotípicas
foram comparadas pelo teste de χ
2
(GraphPad INSTAT versão 3.05) ou teste exato
de Fisher em tabelas 2xk, onde K ≥ 2 (PEPI versão 4.0, ABRAMSON e GAHLINGER,
2001). Nos casos onde alguma freqüência tinha valor 0 (zero) foi utilizado o teste
de χ
2
de ROFF e BENTZEN (1989), apropriado para estas condições. O
desequilíbrio de ligação entre os RFLPs foi calculado pelo programa ARLEQUIN
versão 2.000 (SCHNEIDER e cols., 2000) e o D’ foi estimado manualmente como
descrito em LEWONTIN (1988). Os alelos serão denominadas como 1 (mais
freqüente) e 2 (menos freqüente), conforme a alteração de bases (C3238G) ou
aminoácidos (Gln360His).
30
Capítulo 3– Material e Métodos
3.4.2. Fatores determinantes e ajuste das variáveis lipídicas e
antropométricas
Níveis lipídicos
Os efeitos de variáveis como sexo, idade, IMC e hábitos de vida
sobre os níveis lipídicos nesta amostra foram previamente investigados por DE
ANDRADE e cols. (2001a). Nesta investigação verificou-se uma alta correlação do
IMC com todos os níveis lipídicos. Idade e sexo, embora não significantes para
todas as variáveis resposta, foram utilizados para o ajuste por serem variáveis
reconhecidamente importantes para determinação de níveis lipídicos. Quanto
aos hábitos de vida, observou-se que o consumo de álcool, tabagismo e
sedentarismo não afetavam os níveis lipídicos. O efeito do climatério, uso de
anticoncepcionais e reposição hormonal também foi testado em mulheres, mas
nenhum efeito sobre os parâmetros de interesse foi observado.
Desta forma, conhecendo-se os fatores que determinam os níveis, o
ajuste das variáveis foi realizado por regressão linear múltipla com o pacote
estatístico SPSS versão 8.0. Com exceção de HDL, as demais variáveis lipídicas
foram transformadas em logaritmo natural (ln) para obtenção de uma
distribuição normal dos dados. Após a regressão múltipla para os efeitos do sexo,
idade e IMC, cada variável resposta foi corrigida (ajustada) somando-se o
resíduo resultante da regressão à média dessa variável.
O número total de observações para as variáveis difere de 391(n
total) em alguns casos, pois os níveis de LDL colesterol não foram calculados para
indivíduos com triglicerídeos acima de 400 mg/dl e, com a finalidade de diminuir
a variância da variável triglicerídeos, indivíduos fora da faixa média ± 2(desvios
padrão) foram excluídos.
Variáveis antropométricas
O índice de massa corporal (IMC) e a relação cintura quadril (WHR)
apresentaram uma distribuição normal e por este motivo não foram
transformados para análise. Os efeitos do sexo, idade e hábitos de vida sobre
estes parâmetros foram testados por teste t ou correlação linear, e somente
variáveis que se associaram significantemente ao IMC e ao WHR foram mantidas
no ajuste. No modelo de regressão linear múltipla para ajuste do IMC foram
31
Capítulo 3– Material e Métodos
colocados sexo e idade como variáveis de correção. Já os valores de WHR
(disponíveis somente para os indivíduos coletados na Faculdade de Farmácia,
n=309) foram ajustados para os efeitos do uso de anticoncepcionais, consumo
de álcool e idade em mulheres e para os efeitos do consumo de álcool e idade
em homens. O ajuste foi realizado da mesma forma que nos níveis lipídicos, ou
seja, somando-se o resíduo resultante da regressão à média da variável. Isto foi
feito separadamente para homens e mulheres e como as médias diferiram
significantemente entre os sexos, a análise do efeito dos genótipos descrita a
seguir também foi realizada para cada sexo em separado.
3.4.3. Análise de variância e delineamento fatorial
Para analisar a influência dos RFLPs sobre os níveis lipídicos e
variáveis antropométricas, as médias dos genótipos foram comparadas por
análise de variância (ANOVA), realizada com o pacote estatístico SPSS 8.0.
Quando o teste de Levene para homogeneidade de variâncias foi significativo
(p<0.05), o teste não paramétrico correspondente (Kruskal-Wallis) foi utilizado. Nos
casos em que o número de observações em um determinado genótipo era
pequeno, os indivíduos foram separados em dois grupos (homozigotos versus
portadores do outro alelo).
Com a finalidade de verificar a interação do genótipo com outros
fatores, tais como sexo e tabagismo, por exemplo, uma subseqüente análise de
variância com delineamento fatorial foi realizada. Neste caso, quando o sexo
entrava como uma variável de interação as variáveis resposta não foram
ajustadas por este fator. Nesse tipo de análise o resultado fornecido mostra os
efeitos do genótipo, da outra variável que se quer testar, além da interação
destes dois fatores.
32
Capítulo 4 – Resultados
4. RESULTADOS
4.1. A
NÁLISE DESCRITIVA DA AMOSTRA
A tabela 4.1 mostra as características gerais da amostra coletada.
Podemos observar que a freqüência de tabagismo e consumo de álcool é
significantemente superior no sexo masculino, enquanto que o sedentarismo é
mais freqüente em mulheres. A idade média da amostra é de 43.2 anos (faixa de
variação 15-89 anos) e homens e mulheres não diferem quanto a este parâmetro
(p = 0.330).
Quanto aos níveis lipídicos, o que pode ser ressaltado é que o perfil
lipídico de uma forma geral na população investigada não está dentro dos
valores considerados “ótimos” pela NCEP, discutidos na introdução deste
trabalho. A média dos valores de colesterol cai no limite superior do considerado
desejável (< 200 mg/dl) e os níveis de LDL colesterol estão acima deste (< 100
mg/dl), com a média de 128.1 mg/dl. Além disso, podemos observar que
homens têm níveis significantemente menores de HDL colesterol quando
comparados com mulheres (p < 0.001). Os níveis de triglicerídeos também estão
aumentados nos homens, embora esse incremento não seja significante (p=
0.06).
Nas variáveis antropométricas, o que deve ser ressaltado é a alta
média do IMC nesta amostra (26.0 kg/m
2
). De acordo com a Organização
Mundial de Saúde (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997), as medidas de IMC são
classificadas como: IMC <25 kg/m
2
como normal, IMC ≥ 25 kg/m
2
como
sobrepeso e ≥ 30 kg/m
2
como obesidade. Nesta amostra cerca de 17% das
pessoas enquadram-se dentro desta última categoria.
33
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.1: Análise descritiva da amostra.
Total mulheres homens P*
n 391 210 171
Dados gerais
Idade
b
, anos 43.2 (16.4) 42.5 (17.4) 44.1 (15.0) 0.33
Tabagismo, % 35.4 30.5 42.7 0.02
Consumo de álcool, % 45.3 34.1 59.6 < 0.001
Sedentarismo, % 62.2 69.8 53.0 0.001
Climatério, % - 29.7 -
Uso CO
a
, % - 30.2 -
Níveis lipídicos
b
CT, mg/dl 200.0 (49.2) 201.3 (53.3) 198.4 (43.4) 0.54
LDL-C, mg/dl 128.1 (41.8) 128.1 (44.5) 128.0 (40.0) 0.98
HDL-C, mg/dl 44.8 (12.2) 47.7 (12.5) 41.1 (10.7) < 0.001
TG, mg/dl 134.2 (86.5) 126.7 (77.3) 143.9 (96.6) 0.06
Medidas
antropométricas
b
IMC, kg/m
2
26.0 (4.8) 25.9 (5.1) 26.2 (4.2) 0.48
WHR 0.87 (0.08) 0.84 (0.07) 0.91 (0.06) < 0.001
a
CO: contraceptivos orais,
b
valores apresentados como média (desvio
padrão), * p para a comparação entre homens e mulheres.
4.2. F
REQÜÊNCIA DOS RFLPS
4.2.1. Freqüências na amostra total
As freqüências gênicas e genotípicas para cada RFLP investigado
estão apresentadas na tabela 4.2. A soma do número observado difere do n
total da amostra (n = 391) porque a amplificação do fragmento de interesse não
foi possível em alguns casos. Todos os marcadores utilizados foram polimórficos na
população estudada.
34
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.2: Freqüências genotípicas e alélicas para os RFLPs investigados.
Genótipos
Polimorfismo 11 12 22 Alelo 2 (%)
Apo C-I - HpaI n 250 127 11
% 64.4 32.7 2.8 19.2
Apo C-II - AvaII n 125 189 70
% 32.6 49.2 18.2 42.8
Apo C-III - SacI n 305 80 6
% 78.0 20.5 1.5 11.8
Apo C-III - FokI n 130 174 74
% 34.8 46.5 18.7 42.6
Apo C-III - MspI n 171 173 40
% 44.5 45.1 10.4 32.9
Apo A-IV - XbaI n 260 117 12
% 66.8 30.1 3.1 18.1
Apo A-IV - HinfI n 263 109 11
% 68.7 28.5 2.9 17.1
Apo A-IV - PvuII n 339 44 0
% 88.5 11.5 0.0 5.7
4.2.2. Desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos
A tabela 4.3 apresenta o resultado dos cálculos para o desequilíbrio
de ligação existente entre os RFLPs localizados no agrupamento gênico A-I/C-
III/A-IV. Com exceção dos pares SacI-XbaI, SacI/HinfI e SacI/PvuII, todos os
demais polimorfismos estão em desequilíbrio de ligação (D’ entre 47.2 e 98.6%, p
< 0.01). Já os dois polimorfismos investigados no agrupamento gênico E/C-I/C-II
não estão em desequilíbrio de ligação (D’= 0.162, p = 0.206).
35
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.3: Desequilíbrio de ligação, medidos pelo D’, entre os RFLPs investigados
no agrupamento gênico A-I/C-III/A-IV.
SacI FokI MspI XbaI HinfI PvuII
SacI - 0.954* 0.908* 0.112 0.097 0.107
FokI - 0.938* 0.686* 0.874* -0.697*
MspI - 0.638* 0.614* -0.472*
XbaI - 0.986* -0.984*
HinfI - -0.984*
PvuII -
* D’ estatisticamente significante (p<0.01)
4.2.3. Freqüências genotípicas e haplotípicas de acordo com níveis de
colesterol total (CT) e de triglicerídeos (TG)
As freqüências genotípicas e haplotípicas foram comparadas
agrupando-se os indivíduos conforme as diretrizes do NECP, descritas na
introdução. Assim, fez-se a comparação entre as freqüências da categoria
triglicerídeos < 150 mg/dl com aquela de triglicerídeos ≥ 200 mg/dl. Isto foi
repetido para os níveis de colesterol total, onde foram comparados aqueles com
CT < 200 mg/dl e os de CT ≥ 240 mg/dl. As tabelas 4.4 e 4.5 resumem os resultados
encontrados para as freqüências genotípicas e haplotípicas, respectivamente.
Pode-se observar que nenhuma diferença estatisticamente significante foi
encontrada para os níveis de triglicerídeos, embora para o polimorfismo HpaI
(apo C-I) verifica-se uma tendência de associação (p = 0.075). A freqüência de
portadores do genótipo H*1/H*1 foi maior entre os indivíduos com níveis de
triglicerídeos menores que 150 mg/dl.
Para os níveis de colesterol total, observa-se que as freqüências
haplotípicas para os sítios HpaI-AvaII das apolipoproteínas C-I e C-II diferem entre
os dois grupos. O haplótipo H*2-A*1 representa 15% dos haplótipos do grupo com
CT < 200 mg/dl enquanto que está representado em somente 10.8% dos
haplótipos do grupo com CT ≥ 240 mg/dl. Por outro lado, o haplótipo H*1-A*2 é
mais prevalente (44.6 x 39.4%) em indivíduos que se enquadram no grupo com
níveis mais elevados de colesterol.
36
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.4: Freqüências genotípicas de acordo com os níveis de
triglicerídeos (TG) e colesterol total (CT).
TG CT
TG < 150 TG ≥ 200 p CT < 200 CT ≥ 240 p
n (%) n (%) n (%) n (%)
SacI
S*1/S*1 223 (79.4) 52 (78.8) 168 (76.7) 56 (81.2)
S*1/S*2 53 (18.9) 13 (19.7) 1.000* 47 (21.5) 11 (15.9) 0.538*
S*2/S*2 5 (1.8) 1 (1.5) 4 (1.8) 2 (2.9)
FokI (T-455C)
TT 92 (34.2) 22 (34.9) 70 (33.5) 30 (46.9)
TC 124 (46.1) 32 (50.8) 0.592 99 (47.4) 25 (39.1) 0.146
CC 53 (19.7) 9 (14.3) 40 (19.1) 9 (14.1)
MspI (C-482T)
CC 129 (46.6) 28 (43.8) 93 (43.0) 33 (50.0)
CT 119 (43.0) 32 (50.0) 0.489* 95 (44.0) 31 (47.0) 0.057*
TT 29 (10.5) 4 (6.3) 28 (13.0) 2 (3.0)
HinfI (Thr347Ser)
Thr/Thr 187 (68.2) 44 (66.7) 151 (70.6) 48 (69.6)
Thr/Ser 81 (29.6) 19 (28.8) 0.534* 59 (27.6) 20 (29.0) 0.951*
Ser/Ser 6 (2.2) 3 (4.5) 4 (1.9) 1 (1.4)
XbaI
X*1/X*1 184 (65.7) 43 (66.2) 148 (67.6) 46 (67.6)
X*1/X*2 88 (31.4) 20 (30.8) 1.000* 66 (30.1) 21 (30.9) 1.000*
X*2/X*2 8 (2.9) 2 (3.1) 5 (2.3) 1 (1.5)
PvuII (Gln360His)
Gln/Gln 241 (88.0) 30 (90.9) 0.425* 191 (89.7) 63 (91.3) 0.819*
Gln/His 33 (12.0) 6 (9.1) 22 (10.3) 6 (8.7)
HpaI
H*1/H*1 188 (67.1) 34 (53.1) 141 (64.7) 47 (70.1)
H*1/H*2 85 (30.4) 28 (43.8) 0.075* 70 (32.1) 20 (29.9) 0.284<p<0.342**
H*2/H*2 7 (2.5) 2 (3.1) 7 (3.2) 0 (0.0)
AvaII
A*1/A*1 88 (31.8) 19 (29.7) 72 (33.2) 19 (28.8)
A*1/A*2 140 (50.5) 30 (46.9) 0.562 108 (49.8) 30 (45.5) 0.285
A*2/A*2 49 (17.7) 15 (23.4) 37 (17.1) 17 (25.8)
* Teste exato de Fisher, ** χ
2
de Roff e Bentzen (1989).
37
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.5: Freqüências haplotípicas de acordo com os níveis de triglicerídeos (TG) e colesterol total (CT).
TG CT
TG < 150 TG ≥ 200 p CT < 200 CT ≥ 240 p
2n (%) 2n (%) 2n (%) 2n (%)
apo A-IV (XbaI-HinfI-PvuII)
X*1-Thr-Gln 412 (75.5) 99 (76.2) 331(77.7) 105 (77.2)
X*1-Ser-Gln 0 (0.0) 1 (0.8) 0 (0.0) 0 (0.0)
X*1-Thr-His 33 (6.4) 6 (4.6) 0.294 < p < 0.351** 22 (5.2) 6 (4.4) 1.000*
X*2-Thr-Gln 8 (1.5) 1 (0.8) 6 (1.4) 2 (1.5)
X*2-Ser-Gln 93 (17.0) 23 (17.7) 67 (15.7) 21 (15.4)
apo C-III (SacI-FokI-MspI)
S*1-T-C 303 (56.3) 74 (58.7) 234 (56.0) 81 (63.3)
S*1-C-T 110 (20.5) 25 (19.8) 89 (21.3) 21 (16.4)
S*1-C-C 60 (11.1) 11 (8.7) 36 (8.6) 11 (8.6)
S*1-T-T 3 (0.6) 2 (1.6) 0.662 < p < 0.720** 4 (1.0) 3 (2.3) 0.290 < p < 0.349**
S*2-C-T 59 (11.0) 13 (10.3) 53 (12.7) 10 (7.8)
S*2-T-C 2 (0.4) 0 (0.0) 1 (0.2) 1 (0.8)
S*2-C-C 1 (0.2) 1 (0.8) 1 (0.2) 1 (0.8)
apo C-I/C-II (HpaI-AvaII)
H*1-A*1 237 (42.9) 41 (32.5) 183 (42.4) 52 (40.0)
H*1-A*2 222 (40.2) 54 (42.9) 170 (39.4) 58 (44.6)
H*2-A*1 76 (13.8) 24 (19.1) 0.086 65 (15.0) 14 (10.8) 0.032*
H*2-A*2 17 (3.1) 7 (5.5) 4 (3.2) 6 (4.6)
* Teste exato de Fisher, ** χ
2
de Roff e Bentzen (1989).
38
Capítulo 4 – Resultados
A comparação de freqüências também foi realizada para os dois
sexos em separado, usando-se os mesmos critérios descritos anteriormente. As
freqüências gênicas para os RFLPs das apos C-II, C-III e A-IV não diferiram para
os diferentes níveis lipídicos em nenhum dos sexos. Para o polimorfismo da apo
C-I, entretando, verifica-se que a freqüência dos genótipos onde o alelo H*2
está presente é maior em homens com triglicerídeos ≥ 200 mg/dl (p= 0.014), o
que não é observado em mulheres (figura 4.1). As prevalências dos haplótipos
não diferiram para os diferentes níveis lipídicos para ambos os sexos.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Freqüência (%)
H*1/H*1 H*1/H*2 H*2/H*2
p
= 0.726
p
= 0.014
TG < 150 TG ≥ 200 TG < 150 TG ≥ 200
MULHERES HOMENS
Figura 4.1: Comparação de freqüências para o polimorfismo HpaI da apo C-I de
acordo com as categorias de triglicerídeos para os dois sexos em separado.
4.2.4. Freqüências dos marcadores de apo A-IV de acordo com as
variáveis antropométricas
A tabela 4.6 apresenta os resultados de freqüências genotípicas de
acordo com as categorias de IMC e os pontos de corte para relação
cintura/quadril (WHR). Podemos observar que, embora as freqüências dos
genótipos com os alelos X*2, 347Ser e 360His aumentem com o IMC, estas
diferenças não são estatisticamente significantes.
39
Capítulo 4 – Resultados
O WHR foi analisado separadamente para cada sexo, pois os
pontos de corte diferem para homens e mulheres (LEAN e cols., 1995; WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 1997). Os valores utilizados para este parâmetro são
bastante controversos e segundo a Organização Mundial de Saúde, podem
diferir de população para população. Por este motivo, os valores utilizados aqui
foram retirados de uma investigação onde foram compilados resultados de
várias pesquisas (LEAN e cols., 1995). Segundo este estudo os pontos de corte
para a relação cintura/quadril são de 0.80 para mulheres e 0.95 para homens.
Embora IMC e WHR sejam altamente correlacionados, não se observa a mesma
tendência de aumento de freqüência observada no IMC em nenhum dos sexos
(tabela 4.6).
40
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.6: Freqüências genotípicas para os polimorfismos da apo A-IV conforme as classificações de índice de
massa corporal (IMC) e os pontos de corte para relação cintura/quadril.
IMC (kg/m
2
) WHR
MULHERES HOMENS
IMC < 25 25 ≤ IMC < 30 IMC ≥ 30 < 0.80 ≥ 0.80 < 0.95 ≥ 0.95
n (%) n (%) n (%)
XbaI
X*1/X*1 129 (72.1) 88 (62.0) 43 (63.2) 41 (70.7) 79 (73.1) 60 (58.3) 24 (63.2)
X*1/X*2 46 (25.7) 48 (33.8) 23 (33.8) 14 (24.1) 28 (25.9) 37 (35.9) 13 (34.2)
X*2/X*2 4 (2.2) 6 (4.2) 2 (2.9) 3 (5.2) 1 (0.9) 6 (5.8) 1 (2.6)
P 0.314 < p < 0.372 ** 0.261* 0.808*
Thr347Ser
Thr/Thr 130 (73.4) 91 (65.0) 42 (63.6) 40 (70.2) 78 (72.9) 61 (60.4) 24 (63.2)
Thr/Ser 43 (24.3) 44 (31.4) 22 (33.3) 14 (24.6) 29 (27.1) 34 (33.7) 12 (31.6)
Ser/Ser 4 (2.3) 5 (3.6) 2 (3.0) 3 (5.3) 0 6 (5.9) 2 (5.3)
P 0.437< p < 0.498 ** 0.057 < p < 0.074** 0.949*
Gln360His
Gln/Gln 160 (90.4) 125 (89.4) 54 (81.8) 50 (86.2) 93 (86.9) 88 (87.1) 35 (92.1)
Gln/His 17 (9.6) 15 (10.6) 12 (18.2) 8 (13.8) 14 (13.1) 13 (12.9) 3 (7.9)
P 0.165 1.000* 0.556*
* teste exato de Fisher, ** χ
2
de Roff e Bentzen (1989).
41
Capítulo 4 – Resultados
As categorias de IMC também foram analisadas em relação às
freqüências dos haplótipos para a apo A-IV. Como na análise uni-loco foram
observadas tendências de aumento de freqüência dos genótipos com os alelos
X*2, 347Ser e 360His, os haplótipos foram divididos em dois grupos: haplótipo X*1-
347Thr-360Gln e portadores dos outros haplótipos. Quando as prevalências são
comparadas observa-se um claro aumento de haplótipos contendo X*2, 347Ser
ou 360His com o aumento do IMC (20% quando IMC < 25 e 30% quando IMC ≥
30). A figura 4.2 apresenta os resultados graficamente.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Categorias de IMC
Freqüência (%)
Figura 4.2: Freqüências haplotípicas de acordo com as categorias de IMC.
Comparação entre as freqüências: χ
2
= 6.757, p = 0.034.
X*1
347Thr
360Gln
outros
haplótipos
IMC < 25 25
≤
IMC < 30 IMC ≥ 30
4.3. I
NFLUÊNCIA DOS POLIMORFISMOS SOBRE OS NÍVEIS LIPÍDICOS
Apolipoproteína C-I
O polimorfismo HpaI criado pela inserção de 4 pares de bases na
região promotora do gene da apo C-I está em forte desequilíbrio de ligação
com as isoformas da apo E (D’ = 79.57%, p < 0.00001). A variabilidade da apo E já
42
Capítulo 4 – Resultados
foi investigada em nosso laboratório (DE ANDRADE e cols., 2000) e como os dados
para este polimorfismo estavam disponíveis, a influência do sítio HpaI foi
analisada de duas maneiras: uma com todos os indivíduos e a outra somente
com indivíduos portadores do genótipo ε*3/ε*3 para apo E. O alelo H*1 está
ligado ao alelo ε*3, enquanto o alelo H*2 está ligado aos alelos ε*2 e ε*4. O efeito
do polimorfismo da apo E já foi estudado em um grande número de populações
e de uma maneira geral, o alelo ε*4 está associado a um pior perfil lipídico,
enquanto o alelo ε*2 está associado com diminuição dos níveis lipídicos (revisão
em MAHLEY e RALL, 2000).
Na tabela 4.7 podemos observar que a presença da inserção, alelo
H*2, não está associada significantemente com alterações nos níveis lipídicos
quando se analisa a amostra como um todo. Contudo, quando apenas os
indivíduos com genótipo ε*3/ε*3 são considerados, observamos que portadores
do alelo H*2 têm níveis significantemente menores de colesterol total (-8.3%) e de
LDL colesterol (-13%).
Tabela 4.7: Influência do polimorfismo HpaI sobre o perfil lipídico na
amostra total e em portadores ε*3/ε*3.
HpaI
H*1/H*1 H*2 +
p
TODOS
n 236 130
CT
a
198.9 (48.2) 195.3 (45.1) 0.53
HDL-C 45.2 (10.6) 45.6 (12.3) 0.73
LDL-C
a
129.8 (41.6) 123.3 (39.3) 0.08
TG
a
119.4 (61.9) 132.4 (82.4) 0.71
apo E ε*3/ε*3
n 208 18
CT
a
201.6 (49.2) 184.8 (34.6) 0.01
HDL-C 45.7 (10.8) 46.2 (12.4) 0.84
LDL-C
a
132.0 (42.5) 114.9 (34.4) 0.006
TG
a
120.2 (63.6) 117.7 (52.3) 0.44
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão)
a
médias
dos níveis não ajustados, variáveis analisadas na forma de ln. H*2 +: heterozigotos
H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
43
Capítulo 4 – Resultados
Com a finalidade de se verificar a interação sexo*genótipo, uma
análise fatorial foi realizada para as variáveis não ajustadas por sexo. Quando a
amostra total é analisada observamos interações significantes com sexo para
colesterol total, LDL colesterol e triglicerídeos (tabela 4.8). As figuras 4.3, 4.4 e 4.5
mostram os resultados graficamente. Neste tipo de análise torna-se claro o efeito
do genótipo sobre os níveis lipídicos em cada sexo. Em mulheres, observa-se que
tanto os níveis de colesterol total (figura 4.4) como de LDL colesterol (figura 4.3)
estão diminuídos em portadoras do alelo H*2, enquanto que os níveis de
triglicerídeos parecem não ser afetados por este polimorfismo (figura 4.5). Já em
homens, o efeito mais pronunciado ocorre sobre os níveis de triglicerídeos, onde
portadores do alelo H*2 tem níveis cerca de 38% superiores aos homozigotos
H*1/H*1 (figura 4.5).
Tabela 4.8: Análise fatorial para os efeitos do sexo e do polimorfismo HpaI
sobre os níveis de LDL colesterol, colesterol total e triglicerídeos na amostra total.
HpaI Nível lipídico N Efeito p
SEXO LDL
-C
a
feminino H*1/H*1 132.9 (44.5) 135 sexo 0.694
H*2 + 119.9 (43.8) 81 HpaI 0.139
masculino H*1/H*1 126.4 (39.7) 110 Sexo*HpaI 0.036
H*2 + 129.6 (31.7) 52
CT
a
feminino H*1/H*1 205.5 (52.5) 137 sexo 0.845
H*2 + 193.9 (54.1) 81 HpaI 0.756
masculino H*1/H*1 193.8 (45.8) 113 Sexo*HpaI 0.012
H*2 + 205.0 (33.7) 57
TG
a
feminino H*1/H*1 126.3 (73.5) 136 sexo 0.025
H*2 + 125.7 (81.6) 81 HpaI 0.147
masculino H*1/H*1 127.5 (79.6) 112 Sexo*HpaI 0.019
H*2 + 175.7 (118.5) 56
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão)
a
médias
dos níveis não ajustados, variáveis analisadas na forma de ln. H*2 +: heterozigotos
H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
44
Capítulo 4 – Resultados
HpaI
H*2 +H*1/H*1
Médias de LDL colesterol (mg/dl)
134
132
130
128
126
124
122
120
118
SEXO
Feminino
Masculino
Figura 4.3: Efeito da interação sexo*genótipo (HpaI) sobre os níveis de LDL
colesterol. H*2 +: heterozigotos H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
HpaI
H*2 +H*1/H*1
Médias de colesterol total (mg/dl)
208
206
204
202
200
198
196
194
192
SEXO
Feminino
Masculino
Figura 4.4: Efeito da interação sexo*genótipo (HpaI) sobre os níveis de colesterol
total. H*2 +: heterozigotos H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
45
Capítulo 4 – Resultados
HpaI
H*2 +H*1/H*1
Médias de triglicerídeos (mg/dl)
180
170
160
150
140
130
120
SEXO
Feminino
Masculino
Figura 4.5: Efeito da interação sexo*genótipo (HpaI) sobre os níveis de
triglicerídeos. H*2 +: heterozigotos H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
Outro tipo de interação observado é a modulação do efeito do
polimorfismo HpaI sobre os níveis de HDL colesterol pelo tabagismo (tabela 4.9).
Mulheres fumantes portadoras do H*2 tem níveis de HDL cerca de 20% maiores
que homozigotas H*1/H*1, enquanto que em mulheres não fumantes os níveis
não se alteram (p interação fumo*genótipo = 0.019). Em homens a interação
fumo*genótipo não foi observada (p = 0.657).
Esta interação também é observada quando são considerados
somente indivíduos com genótipo ε*3/ε*3 para apo E. Embora o número de
fumantes portadores do alelo H*2 seja muito pequeno (n=3), estes apresentam
níveis de HDL colesterol cerca de 50% maiores (63.7 mg/dl x 42.3 mg/dl) quando
comparados com homozigotos H*1/H*1 também fumantes (p interação
fumo*genótipo = 0.001). Em não fumantes os níveis de HDL colesterol não diferem
entre H*1/H*1 e portadores do alelo H*2. Neste caso, não foi possível investigar se
o efeito é diferente entre os sexos, uma vez que o tamanho amostral é muito
pequeno.
46
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.9: Análise fatorial para os efeitos do tabagismo (em homens e
mulheres) e do polimorfismo HpaI sobre os níveis de HDL colesterol na amostra
total.
HpaI Nível lipídico N Efeito p
MULHERES HDL
-C
TABAGISMO
não H*1/H*1 48.7 (11.6) 93 fumo 0.608
H*2 + 48.2 (12.9) 59 HpaI 0.037
sim H*1/H*1 43.0 (9.9) 39 fumo*HpaI 0.019
H*2 + 51.8 (17.2) 21
HOMENS
TABAGISMO
não H*1/H*1 41.9 (9.7) 62 fumo 0.835
H*2 + 40.9 (10.7) 29 HpaI 0.944
sim H*1/H*1 40.7 (12.1) 38 fumo*HpaI 0.657
H*2 + 41.4 (8.6) 22
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão). H*2 +:
heterozigotos H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
HpaI
H*2 +H*1/H*1
Médias de HDL colesterol (mg/dl)
54
52
50
48
46
44
42
Tabagismo
Não
Sim
Figura 4.6: Efeito da interação fumo*genótipo (HpaI) sobre os níveis de HDL
colesterol na amostra total. H*2 +: heterozigotos H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
47
Capítulo 4 – Resultados
A tabela 4.10 apresenta o resultado da análise fatorial para
interação sexo*genótipo somente com indivíduos apo ε*3/ε*3. Em mulheres os
níveis de LDL colesterol são 27% menores em portadoras do alelo H*2 enquanto
que ocorre uma pequena elevação de 6% em homens com o mesmo genótipo
(figura 4.7). Há uma interação sexo*genótipo altamente significante (p = 0.005),
onde se verifica que o efeito do genótipo ocorre no sexo feminino. Este mesmo
tipo de interação é observado sobre os níveis de colesterol total, onde mulheres
portadoras de H*2 têm níveis 19% menores, enquanto que em homens os níveis
praticamente não se alteram (figura 4.8). Sobre os níveis de triglicerídeos não foi
verificada interação sexo*genótipo significante (p = 0.492) como foi observada
na amostra total. Provavelmente o efeito do sítio HpaI sobre os níveis de
triglicerídeos não sejam independentes da variabilidade da apo E.
Tabela 4.10: Análise fatorial para os efeitos do sexo e do polimorfismo HpaI sobre
os níveis de LDL, colesterol total e triglicerídeos em indivíduos com genótipo
ε*3/ε*3 para apo E.
HpaI Nível lipídico N Efeito p
SEXO LDL-C
a
feminino H*1/H*1 135.0 (45.8) 121 sexo 0.038
H*2 + 98.3 (25.3) 10 HpaI 0.016
masculino H*1/H*1 127.7 (39.8) 95 Sexo*HpaI 0.005
H*2 + 135.6 (34.2) 8
CT
a
feminino H*1/H*1 207.8 (54.3) 123 sexo 0.116
H*2 + 169.0 (28.7) 10 HpaI 0.021
masculino H*1/H*1 196.0 (44.9) 98 Sexo*HpaI 0.009
H*2 + 204.5 (32.4) 8
TG
a
feminino H*1/H*1 126.1 (75.8) 122 sexo 0.401
H*2 + 112.4 (48.0) 10 HpaI 0.330
masculino H*1/H*1 129.5 (80.5) 97 Sexo*HpaI 0.492
H*2 + 124.2 (59.8) 8
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão)
a
médias
dos níveis não ajustados, variáveis analisadas na forma de ln. H*2 +: heterozigotos
H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
48
Capítulo 4 – Resultados
HpaI
H*2 +H*1/H*1
Média de LDL (mg/dl)
140
130
120
110
100
90
SEXO
Feminino
Masculino
Figura 4.7: Efeito da interação sexo*genótipo (HpaI) sobre os níveis de LDL
colesterol em indivíduos com genótipo ε*3/ε*3 para apo E. H*2 +: heterozigotos
H*1/H*2 e homozigotos H*2/H*2.
HpaI
H*2 +H*1/H*1
Média do colesterol total (mg/dl)
210
200
190
180
170
160
SEXO
Feminino
Masculino
Figura 4.8: Efeito da interação sexo*genótipo (HpaI) sobre os níveis de colesterol
total em indivíduos com genótipo ε*3/ε*3 para apo E. H*2 +: heterozigotos H*1/H*2
e homozigotos H*2/H*2.
49
Capítulo 4 – Resultados
Apolipoproteína C-II
Este RFLP, apesar de não estar em desequilíbrio de ligação com a
apo E (p = 0.253), foi analisado da mesma forma que o polimorfismo HpaI, de
forma a controlar o efeito da variabilidade em outro loco sobre os níveis lipídicos.
Na amostra total, observa-se uma tendência para a redução dos níveis de
triglicerídeos em portadores do alelo A*2, embora não significante (p = 0.07). Já
quando se analisa somente indivíduos homozigotos ε*3/ε*3, está associação se
torna evidente (p = 0.04), apesar do número amostral menor (tabela 4.11).
Portadores do alelo A*2 tem níveis de triglicerídeos 9% menores. Uma análise
fatorial também foi realizada para este RFLP, mas nenhuma interação
sexo*genótipo, tabagismo*genótipo ou sedentarismo*genótipo foi observada.
Tabela 4.11: Influência do polimorfismo AvaII sobre o perfil lipídico.
AvaII
A*1/A*1 A*2 +
p
TODOS
n 121 248
CT
a
194.4 (45.2) 199.8 (48.6) 0.44
HDL-C 45.3 (11.5) 45.3 (11.2) 0.98
LDL-C
a
123.7 (39.5) 129.9 (41.8) 0.19
Tg
a
127.3 (58.0) 123.2 (76.1) 0.07
b
apo E ε*3/ε*3
n 68 160
CT
a
201.2 (45.6) 200.5 (50.4) 0.58
HDL-C 46.1 (11.2) 45.5 (10.8) 0.72
LDL-C
a
129.7 (39.8) 131.5 (43.7) 0.98
Tg
a
126.9 (51.1) 117.3 (67.0) 0.04
b
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão)
a
médias
dos níveis não ajustados, variáveis analisadas na forma de ln,
b
teste não
paramétrico de Kruskal-Wallis. A*2 +: heterozigotos A*1/A*2 e homozigotos
A*2/A*2.
50
Capítulo 4 – Resultados
Apolipoproteína C-III
A comparação entre as médias das variáveis lipídicas para os três
RFLPs investigados está apresentada na tabela 4.12. A presença do alelo S*2 foi
associada a uma diminuição nos níveis de LDL-C, embora este resultado
provavelmente seja espúrio, uma vez que este alelo está associado a aumento
dos níveis lipídicos em diversas populações, como foi descrito na introdução. Esta
associação não faz sentido quando consideramos o metabolismo de lipídeos e o
conhecimento atual sobre este polimorfismo e provavelmente deve ser resultado
do grande número de testes realizados com a amostra.
Já os dois polimorfismos investigados na região 5´do gene para
apo C-III, localizados no elemento insulino responsivo (IRE), parecem não afetar
os níveis de lipídeos. No entanto, quando testamos as interações com sexo e
tabagismo, observamos algumas interações interessantes (tabelas 4.13 e 4.14).
Tabela 4.12: Influência dos polimorfismos da apo C-III sobre o perfil lipídico.
n CT
a
HDL-C LDL-C
a
TG
a
SacI
S*1/S*1 287 200.0 (47.0) 45.2 (11.1) 130.2 (40.4) 123.6 (70.4)
S*2 + 82 191.2 (49.0) 45.8 (11.8) 119.9 (42.7) 128.0 (71.8)
p 0.25 0.64 0.04 0.25
FokI (T-455C)
TT 123 202.8 (52.6) 46.1 (12.7) 130.9 (44.4) 125.7 (71.4)
TC 163 196.0 (43.0) 44.4 (9.4) 126.9 (38.4) 125.5 (69.1)
CC 68 192.0 (46.7) 45.0 (12.1) 123.9 (40.3) 119.9 (74.1)
p 0.51 0.66 0.67 0.51
MspI (C-482T)
CC 162 199.9 (49.7) 45.8 (11.8) 129.5 (42.2) 122.2 (69.2)
CT 161 198.6 (45.6) 44.7 (11.0) 129.0 (40.3) 126.8 (74.2)
TT 39 184.1 (41.4) 45.3 (10.2) 115.2 (37.3) 117.7 (58.8)
p 0.18 0.69 0.11 0.77
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão)
a
médias
dos níveis não ajustados, variáveis analisadas na forma de ln. S*2 +: heterozigotos
S*1/S*2 e homozigotos S*2/S*2.
51
Capítulo 4 – Resultados
Na análise fatorial se observa que o sexo parece influenciar o efeito
do polimorfismo T-455C sobre os níveis de triglicerídeos, ainda que estes efeitos
sejam marginalmente significantes (tabela 4.13 e figura 4.9). Mulheres
homozigotas CC tem níveis de triglicerídeos 20% menores que homozigotas TT,
enquanto que o efeito deste RFLP se dá de maneira inversa em homens, onde
portadores do genótipo CC têm níveis 10% superiores aos TT (p para interação
sexo*genótipo = 0.056). Outra tendência é vista quando comparamos os níveis
de HDL colesterol em fumantes e não fumantes (tabela 4.13 e figura 4.10). Neste
caso, o mesmo genótipo que aumenta os níveis de HDL em não fumantes (-455
TT), parece ter o efeito contrário em fumantes, onde diminui os níveis em 12% (p
de interação fumo*genótipo = 0.05).
Este mesmo tipo de interação é observado em relação ao
polimorfismo C-482T (tabela 4.14 e figura 4.11), onde os níveis de HDL colesterol
em indivíduos –482CC é maior do que os de indivíduos –482TT em não fumantes e
menor em fumantes (p interação fumo*genótipo = 0.015).
52
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.13: Análise fatorial para os efeitos do sexo, tabagismo e do polimorfismo
FokI sobre os níveis de triglicerídeos e HDL colesterol.
Variável
FokI
T-455C
Nível lipídico N Efeito p
SEXO TG
a
feminino TT 127.5 (75.1) 78
TC 136.9 (85.5) 92 sexo 0.040
CC 102.6 (53.5) 37 FokI 0.563
masculino TT 143.6 (101.8) 50 Sexo*FokI 0.056
TC 136.0 (82.4) 81
CC 157.5 (115.3) 33
TABAGISMO HDL-C
Não TT 47.2 (13.2) 83
TC 44.5 (9.9) 108 fumo 0.348
CC 44.3 (10.6) 45 FokI 0.652
Sim TT 41.3 (12.4) 41 Fumo*FokI 0.050
TC 43.7 (10.2) 51
CC 47.1 (15.1) 21
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão)
a
médias
dos níveis não ajustados, variáveis analisadas na forma de ln.
Tabela 4.14: Análise fatorial para os efeitos do tabagismo e do polimorfismo MspI
sobre os níveis de HDL colesterol.
Variável
MspI
C-482T
Nível lipídico N Efeito p
TABAGISMO HDL-C
Não CC 47.0 (12.3) 106
CT 44.3 (10.4) 114 fumo 0.974
TT 43.8 (9.9) 21 MspI 0.578
Sim CC 43.7 (12.3) 55 Fumo*MspI 0.015
CT 44.8 (13.5) 49
TT 49.1 (10.0) 14
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão).
53
Capítulo 4 – Resultados
FokI
CCTCTT
Médias de triglicerídeos (mg/dl)
170
160
150
140
130
120
110
100
90
SEXO
Feminino
Masculino
Figura 4.9: Efeito da interação sexo*genótipo (FokI) sobre os níveis de
triglicerídeos.
Tabagismo
SimNão
Médias de HDL-C (mg/dl)
48
47
46
45
44
43
42
41
40
FokI
TT
TC
CC
Figura 4.10: Efeito da interação fumo*genótipo (FokI) sobre os níveis de HDL
colesterol.
54
Capítulo 4 – Resultados
Tabagismo
SimNão
Médias de HDL-C (mg/dl)
50
48
46
44
42
40
MspI
CC
CT
TT
Figura 4.11: Efeito da interação fumo*genótipo (MspI) sobre os níveis de HDL
colesterol.
Apolipoproteína A-IV
O resultado da análise do efeito da variabilidade da apo A-IV sobre
os níveis lipídicos está apresentado na tabela 4.15. Pode-se observar que os três
polimorfismos parecem não influenciar de maneira significante os níveis lipídicos
quando a análise é realizada sem testar as interações. Quando testamos
interações com sedentarismo, verifica-se que o efeito do polimorfismo PvuII é
diferente em sedentários de não sedentários. Ocorre um aumento de 13.5% nos
níveis de LDL colesterol em indivíduos sedentários portadores do alelo 360His,
enquanto que em não sedentários portadores do mesmo alelo os níveis são
cerca de 7% menores (p interação genótipo*sedentarismo = 0.038). A tabela 4.16
e a figura 4.13 mostram estes resultados. As interações sexo*genótipo e
tabagismo*genótipo foram testadas para os três RFLPs mas nenhuma interação
foi constatada.
55
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.15: Influência dos polimorfismos da apo A-IV sobre o perfil lipídico.
n CT
a
HDL-C LDL-C
a
TG
a
XbaI
X*1/X*1 243 195.9 (47.0) 45.4 (11.4) 125.5 (41.2) 123.4 (67.2)
X*2 + 124 201.6 (48.5) 45.2 (11.0) 132.3 (40.9) 125.4 (75.6)
p 0.30 0.90 0.14 0.26
HinfI (Thr347Ser)
Thr/Thr 247 196.3 (48.5) 45.5 (11.5) 125.6 (42.0) 123.9 (67.1)
Ser + 115 202.3 (46.5) 44.7 (10.9) 133.3 (39.6) 127.3 (79.0)
p 0.20 0.53 0.07 0.26
PvuII (Gln360His)
Gln/Gln 322 198.4 (48.1) 45.3 (44.3) 127.6 (41.4) 127.3 (73.8)
Gln/His 40 200.3 (47.7) 44.3 (9.7) 134.0 (40.7) 114.0 (52.9)
p 0.49 0.59 0.17 0.15
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão),
a
médias
dos níveis não ajustados, variáveis analisadas na forma de ln. X*2 +: heterozigotos
X*1/X*2 e homozigotos X*2/X*2. Ser +: heterozigotos Thr/Ser e homozigotos Ser/Ser.
Tabela 4.16: Análise fatorial para os efeitos do sedentarismo e do
polimorfismo PvuII sobre os níveis de LDL colesterol.
Variável
PvuII
Gln360His
Nível
lipídico
N Efeito p
SEDENTARISMO LDL-C
a
Não Gln/Gln 128.0 (42.9) 99 sedentarismo 0.342
Gln/His 120.0 (32.8) 18 PvuII 0.369
Sim Gln/Gln 120.8 (36.2) 176 sedentarismo*PvuII 0.038
Gln/His 137.1 (31.9) 22
Níveis lipídicos apresentados como média em mg/dl (desvio padrão).
a
médias
dos níveis não ajustados, variável analisada na forma de ln.
56
Capítulo 4 – Resultados
PvuII (Gln360His)
Gln/HisGln/Gln
Médias de LDL colesterol (mg/dl)
140
130
120
110
SEDENTARISMO
Não
Sim
Figura 4.12: Efeito da interação sedentarismo*genótipo (PvuII) sobre os níveis de
LDL colesterol.
4.4. INFLUÊNCIA DA VARIABILIDADE DA APO A-IV SOBRE VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS
A figura 4.13 apresenta os resultados da análise de associação entre
os três RFLPs investigados no gene da apo A-IV e o índice de massa corporal
(IMC). Indivíduos portadores dos alelos 347Ser e X*2 tem IMC cerca de 1kg/m
2
maior que indivíduos homozigotos 347Thr/Thr e X*1/X*1 (p = 0.02). Esta diferença
também é observada quando se compara indivíduos portadores do alelo 360His
com homozigotos 360Gln/Gln, mas esse incremento não atinge nível significante
devido ao menor número de indivíduos portadores do alelo 360His (n = 40).
57
Capítulo 4 – Resultados
24,4
24,8
25,2
25,6
26
26,4
26,8
RFLPs da apo A-IV
BMI (kg/m2)
P = 0.11
P = 0.02
P = 0.02
Gln/His
Ser +
X*2 +
Gln/Gln
Thr/Thr
X*1/X*1
Gln360His
Thr347Ser XbaI
Figura 4.13: Comparação das médias de IMC para os três polimorfismos da apo
A-IV investigados. X*2 +: heterozigotos X*1/X*2 e homozigotos X*2/X*2. Ser +:
heterozigotos Thr/Ser e homozigotos Ser/Ser.
As médias de IMC também foram comparadas entre os haplótipos,
Esta análise foi realizada da seguinte maneira: homozigotos para o haplótipo X*1-
347Thr-360Gln (mais freqüente) versus haplótipos com 347Ser ou haplótipos com
360His. As presenças de serina na posição 347 e histidina na posição 360 são
mutuamente exclusivas, ou seja, haplótipos com a configuração 347Ser-360His
não ocorrem. Como o sítio para XbaI está em forte desequilíbrio de ligação
positivo com o polimorfismo Thr347Ser, haplótipos onde X*2 e 347Ser estavam
presentes foram analisados juntos.
A média de IMC em homozigotos para o haplótipo X*1-347Thr-
360Gln é de 24.9 kg/m
2
, enquanto que em haplótipos X*2-347Ser-360Gln o IMC
médio é 26.2 kg/m
2
(p = 0.004). Da mesma forma, haplótipos onde o alelo 360His
está presente o IMC é significantemente maior quando comparado com
homozigotos para o haplótipo mais comum (p = 0.019). A figura 4.14 apresenta
estes resultados graficamente. O que se observa é que ambos polimorfismos
(Thr347Ser e Gln360His) tem influência sobre o índice de massa corporal em nossa
população, e que este efeito é independente do desequilíbrio de ligação
existente entre os dois sítios.
58
Capítulo 4 – Resultados
24
24.4
24.8
25.2
25.6
26
26.4
26.8
IMC (kg/m2)
P
AxC
= 0.019
n
Haplótipos
P
AxB
= 0.004
X*1/X*1
347Thr/Thr
360Gln/Gln
216
portadores do
haplótipo
X*2 347Ser 360Gln
107
portadores do
haplótipo
X*1 347Thr 360His
34
A B C
Haplótipos da apo A-IV
Figura 4.14: Influência dos haplótipos da apo A-IV sobre o IMC.
Assim como os níveis lipídicos, as variáveis antropométricas são
influenciadas por efeitos ambientais (tabagismo e sedentarismo, por exemplo) e
pelo sexo. Desta maneira, análises fatoriais para interação dos genótipos com
estes fatores também foram realizadas para o IMC e o WHR. Uma interação do
polimorfismo HinfI com tabagismo foi observada. Em não fumantes o IMC não é
afetado pelo polimorfismo HinfI, enquanto que fumantes portadores do alelo
347Ser tem IMC maiores que homozigotos 347Thr/Thr (p interação
tabagismo*genótipo = 0.015). Estes resultados também foram observados para o
sítio XbaI, que como já foi explicado, está em forte desequilíbrio de ligação com
o polimorfismo para HinfI. A tabela 4.17 e a figura 4.15 mostram estes resultados.
59
Capítulo 4 – Resultados
Tabela 4.17: Análise fatorial para os efeitos do tabagismo e do polimorfismo
HinfI sobre o IMC.
Variável
HinfI
Thr347Ser
IMC
N Efeito p
TABAGISMO
Não Thr/Thr 25.5 (3.7) 157 fumo 0.769
Ser + 25.8 (3.6) 68 HinfI 0.004
Sim Thr/Thr 24.3 (3.7) 79 Fumo*HinfI 0.015
Ser + 26.8 (4.2) 35
IMC apresentado como média em kg/m
2
(desvio padrão).
Ser +: heterozigotos
Thr/Ser e homozigotos Ser/Ser.
HinfI (Thr347Ser)
Ser +Thr/Thr
IMC médio (Kg/m2)
27.0
26.5
26.0
25.5
25.0
24.5
24.0
Tabagismo
não
sim
Figura 4.15: Efeito da interação tabagismo*genótipo (HinfI) sobre o índice de
massa corporal.
Os resultados da análise de associação dos RFLPs da apo A-IV com
a relação cintura/quadril (WHR) estão apresentados na tabela 4.18, onde pode-
se observar que nenhum destes polimorfismos influência este parâmetro na
60
Capítulo 4 – Resultados
população investigada. Interações com tabagismo e sedentarismo também não
foram observadas.
Tabela 4.18: Influência dos polimorfismos da apo A-IV sobre o WHR.
Mulheres Homens
n WHR n WHR
XbaI
X*1/X*1 118 0.84 (0.07) 84 0.92 (0.05)
X*2 + 45 0.83 (0.06) 57 0.91 (0.05)
p 0.45 0.73
HinfI (Thr347Ser)
Thr/Thr 116 0.84 (0.07) 85 0.92 (0.05)
Ser + 45 0.83 (0.06) 54 0.91 (0.05)
p 0.42 0.66
PvuII (Gln360His)
Gln/Gln 140 0.84 (0.07) 123 0.92 (0.05)
Gln/His 22 0.83 (0.06) 16 0.91 (0.05)
p 0.72 0.60
WHR apresentado como média (desvio padrão). X*2 +: heterozigotos X*1/X*2 e
homozigotos X*2/X*2. Ser +: heterozigotos Thr/Ser e homozigotos Ser/Ser.
61
Capítulo 5 – Discussão
5. D
ISCUSSÃO
5.1. E
FEITO DA VARIABILIDADE EM GENES DE APOLIPOPROTEÍNAS SOBRE VARIÁVEIS LIPÍDICAS
5.1.1. Efeito sobre os níveis de triglicerídeos
Neste estudo foram observadas associações entre a variabilidade
das apolipoproteínas Cs e os níveis de triglicerídeos. Apesar de cada uma destas
proteínas ter suas funções específicas no metabolismo de lipídeos elas
compartilham algumas características, como diminuir a recaptação hepática de
lipoproteínas por receptores e estarem amplamente distribuídas em lipoproteínas
ricas em triglicerídeos (JONG e cols., 1999).
Para o polimorfismo HpaI localizado na região promotora da apo C-
I verificou-se que a freqüência de portadores do alelo H*2 é maior em homens
com triglicerídeos ≥ 200 mg/dl. Na análise fatorial com a amostra total, também
se observou que portadores do mesmo alelo têm níveis de triglicerídeos cerca de
38% maiores que homozigotos H*1/H*1. Estes resultados, no entanto, parecem ser
efeito do desequilíbrio de ligação entre este marcador com a variabilidade
presente na apo E. A presença do alelo ε*4 tem sido associada ao aumento de
colesterol, LDL colesterol e triglicerídeos em várias populações. A presença do
alelo ε*2, por outro lado, geralmente está associada a uma diminuição dos níveis
de colesterol, mas o seu efeito sobre os níveis de triglicerídeos é controverso,
estando ligado a níveis diminuídos ou aumentados em diferentes populações
(revisão em DALLONGEVILLE e cols., 1992).
62
Capítulo 5 – Discussão
Por outro lado, controlar o efeito da variabilidade de outros genes
pode revelar associações, como ocorre com o polimorfismo AvaII da apo C-II. No
presente estudo verificou-se, só se verifica que portadores do alelo A*2 têm níveis
diminuídos de triglicerídeos apenas quando os homozigotos ε*3/ε*3 são
analisados. Provavelmente o efeito sobre os níveis de triglicerídeos desta variante
(A*2) seja pequeno e pode não ser constatado quando um fator de confusão é
mantido. De acordo com DE ANDRADE e cols. (2000) a variabilidade da apo E
nesta mesma população influencia significantemente os níveis de triglicerídeos, o
que torna claro a importância do “controle” para esta variável.
O desequilíbrio de ligação e a variabilidade de outros genes podem
ser fatores de confusão nos resultados de estudos, levando a falsos positivos
como a associação com triglicerídeos para o polimorfismo HpaI da apo C-I e a
falsos negativos como no caso da investigação da variabilidade na apo C-II. Este
tipo de situação tem se tornado mais freqüente e chamado atenção de vários
pesquisadores nos últimos anos. Estimativas atuais sugerem que no código
genético humano ocorra uma alteração a cada 1000 pares de bases,
totalizando cerca de 3.000.000 de seqüências variantes em nosso genoma. Por
isso uma associação positiva não estabelece causalidade. Muitas vezes a
variante investigada pode ser somente um marcador que está em desequilíbrio
de ligação com a mutação causal (revisão em WINKELMAN e HAGER, 2000). Este
provavelmente seja o caso da nossa associação para apo C-I com triglicerídeos,
uma vez que esta não é mantida quando só homozigotos para a variante que
não altera níveis lipídicos da apo E (ε*3/ε*3) são analisados. WATERWORTH e cols.
(2000) também verificaram que o alelo H*2 está associado a um aumento dos
níveis de triglicerídeos e de lipoproteínas remanescentes, mas com efeito
dependente da variabilidade da apo E.
A influência da variabilidade da apo C-III sobre os níveis de
triglicerídeos vem sendo investigada em diversas populações. A variante C3238G
(SacI), descoberta em 1983, é a mais amplamente estudada e está em
desequilíbrio de ligação com as duas variantes no elemento de resposta a
insulina localizado a 5’ do gene. Embora o alelo S*2 (3238G) tenha sido associado
a níveis aumentados de triglicerídeos em vários estudos (revisões em
GROENENDIJK e cols., 2001; SHACHTER, 2001), trabalhos como o de KEE e cols.
(1999) que envolveu amostras de vários países não constatou esta associação.
63
Capítulo 5 – Discussão
Em nossa investigação esta variante também não foi associada a alterações dos
níveis de triglicerídeos, assim como nenhuma interação com fatores ambientais
ou sexo foi constatada.
Quando as variantes no elemento de resposta a insulina foram
descobertas por DAMMERMAN e colaboradores em 1993 pensou-se ter
encontrado a resposta para as associações encontradas para o polimorfismo
SacI, que como já foi mencionado na introdução desta dissertação é não
funcional. No entanto, os estudos com as duas variantes T-455C e C-482T são
bastante controversos. Vários estudos que encontraram associação com o alelo
S*2 não as verificaram com as variantes no IRE, sendo que o contrário também
ocorreu. A perda da regulação da transcrição do gene por insulina pela
presença das variantes no IRE apresentada por LI e cols. (1995) foi recentemente
contestada por DALLINGA-THIE e cols. (2001). Esses autores mostraram que a
expressão do gene da apo C-III é controlada por insulina, mas esse controle é
independente das variantes no IRE.
Em nossa investigação, o efeito da variante T-455C sobre os níveis
de triglicerídeos parece ser sexo dependente. Em mulheres os níveis de
triglicerídeos diminuem em homozigotas para a variante –455CC, enquanto que
em homens o efeito observado é o de aumento destes níveis em homozigotos –
455CC. Em um recente estudo sobre o polimorfismo T-482C (HUBACEK e cols.,
2001) os resultados são comparáveis aos encontrados por nós, só que para a
outra variante. Neste trabalho, mulheres –482TT tinham níveis aumentados de
insulina, enquanto que homens –482TT tinham níveis aumentados de triglicerídeos
e níveis de insulina marginalmente diminuídos, mostrando também um contexto
sexo dependente.
5.1.2. Efeito sobre os níveis de HDL colesterol
O efeito dos polimorfismos HpaI (apo C-I) e T-455C e C-482T (apo C-
III) sobre os níveis de HDL colesterol mostraram que o tabagismo é uma variável
de interação importante para determinação dos níveis dessa lipoproteína.
O efeito do fumo e de outros fatores sobre enzimas envolvidas no
metabolismo lipídico vem sendo alvo de estudo de alguns pesquisadores. De
64
Capítulo 5 – Discussão
acordo com KARK e cols. (2000) mulheres fumantes têm a atividade da enzima
CETP significantemente reduzida (-15%) quando comparadas com não fumantes.
No presente estudo, mulheres fumantes portadoras do alelo H*2 da apo C-I tem
níveis significantemente maiores de HDL, provavelmente devido a uma
combinação de fatores, tais como inibição da CETP pelo fumo e pela apo C-I e
ativação da LCAT pela apo C-I. No entanto, o efeito da variabilidade da apo C-I,
isoladamente, não é suficiente para modificar os níveis séricos de HDL colesterol.
A interação com um terceiro fator (tabagismo, no caso) parece ser necessária
para que o fenótipo se manifeste.
Quando a amostra de homens foi testada, entretanto, esta
interação tabagismo*genótipo não foi observada. A provável explicação para
esta diferença é que o efeito do tabagismo sobre a atividade da CETP parece
não ocorrer da mesma forma que em mulheres. Segundo ITO e cols. (1995) e
KARK e cols. (2000) o hábito de fumar não tem efeito sobre a atividade desta
enzima em homens, enquanto que DULLAART e cols. (1994) encontraram que a
CETP é 18% mais ativa em homens fumantes.
Em nossa investigação também foram encontradas interações
significantes com tabagismo para os dois RFLPs do elemento de resposta a
insulina do gene da apo C-III. Os efeitos de ambos os polimorfismos parecem
ocorrer de forma inversa em fumantes e não fumantes. Portadores dos genótipos
–455TT e –482CC tem níveis maiores de HDL colesterol em não fumantes enquanto
que entre os fumantes, estes compõem o grupo com os menores níveis de HDL
colesterol. Esta interação provavelmente resulta de um complexo conjunto de
modulações do fumo sobre o metabolismo lipídico. Segundo revisão em PORKKA
e EHNHOLM (1996), o ato de fumar aumenta a produção de catecolaminas e
conforme COPPACK e cols. (1994) a enzima lipoproteína lipase, modulada pela
apo C-III, tem sua atividade regulada por catecolaminas e insulina.
5.1.3. Efeito sobre os níveis de colesterol total e LDL colesterol
Neste estudo foi observado que mulheres portadoras do alelo H*2
do RFLP HpaI têm níveis significantemente menores de LDL colesterol e colesterol
total quando comparadas com homozigotas H*1/H*1. Este efeito foi observado
65
Capítulo 5 – Discussão
na amostra total e também em homozigotas ε*3/ε*3 para apo E, onde a
diferença nos níveis foi ainda maior. Homens, por outro lado, não tem estes níveis
alterados pela presença do alelo H*2, mostrando mais uma vez um contexto sexo
dependente.
Biologicamente esta associação pode ser explicada pelo mesmo
mecanismo que explica a modulação dos níveis de HDL colesterol discutido no
item anterior, ou seja, inibição da enzima CETP que catalisa a transferência de
ésteres de colesterol da HDL para LDL. Como a recaptação de lipoproteínas
mediadas por apo B não é afetada por apo C-I, a retirada de partículas de LDL
colesterol será normal (CLAVEY e cols., 1995) e esta via não será comprometida.
Além disso, segundo MALMENDIER e cols. (1986) cerca de 80% da proteína apo
C-I circula associada a HDL in vivo, ou seja, o seu efeito provavelmente seja mais
pronunciado na rota do transporte reverso do colesterol.
Outro polimorfismo que afeta os níveis de LDL e que revela
interações gene-ambiente significantes é o Gln360His localizado no terceiro éxon
da apo A-IV. A presença do alelo 360His está associada ao aumento nos níveis
de LDL-C em sedentários, enquanto que em não sedentários os níveis dessa
lipoporteína foram mais reduzidos. Estes resultados são comparáveis aos
encontrados por CAMPOS e cols. (1997). Esses investigadores concluíram que
hábitos de vida associados a um ambiente mais urbano, levam a um aumento
dos níveis de LDL colesterol e diminuição dos níveis de HDL colesterol em
portadores do alelo 360His. Em indivíduos residentes na zona rural, o efeito deste
RFLP não foi observado. Esta interação sedentarismo*genótipo, no entanto, pode
estar somente refletindo uma associação deste polimorfismo com o IMC, ponto
a ser discutido a seguir. A presença de sedentarismo está associada aumento de
peso e consequentemente aumento do IMC. Para se ter certeza desta interação
somente pessoas com IMC normal deveriam compor a amostra.
66
Capítulo 5 – Discussão
5.2. EFEITO DA VARIABILIDADE DA APO A-IV SOBRE VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS
Sobrepeso e obesidade são condições que aumentam os risco de
morbidade e mortalidade para diversas doenças, como hipertensão,
dislipidemias, diabetes tipo 2, doenças cardíacas e também alguns tipos de
câncer. O que era uma doença que afetava uma parcela menor da população
a anos atrás vem se tornando uma pandemia. De acordo com a OMS cerca de
55% de adultos acima dos 20 anos são obesos ou tem sobrepeso. A nossa
compreensão de como e porque a obesidade se desenvolve é incompleta, mas
certamente envolve a integração de fatores sociais, comportamentais,
fisiológicos e genéticos.
Como foi discutido na introdução deste trabalho, a apo A-IV
parece desenvolver funções também no controle do apetite. Em uma recente
revisão, TSO e cols. (2001) colocaram os principais pontos da ação desta proteína
como fator de saciedade e discutiram que sua ação pode ser mediada via
sistema nervoso central. Embora sua síntese no SNC não seja um ponto aceito, LIU
e cols. (2001) mostraram que esta proteína pode ser sintetizada no hipotálamo de
ratos. De uma maneira ou de outra, a apo A-IV parece agir sobre a regulação do
apetite e a longo prazo, sobre o peso.
Nesta investigação foram estudados três polimorfismos no gene da
apo A-IV. Dois deles resultam em alterações de aminoácidos (Thr347Ser e
Gln360His) e o terceiro se localiza no segundo íntron do gene. Os nossos
resultados mostraram que as variantes 347Ser e X*2 estão significantemente
associadas com aumento do IMC na população investigada. A variante X*2
provavelmente é somente um marcador do efeito da variante 347Ser sobre o
IMC, uma vez que as duas estão em desequilíbrio de ligação quase completo.
O efeito da variante Gln360His sobre o IMC só é observado quando
os haplótipos são analisados. Uma vez que o desequilíbrio de ligação existente
entre os polimorfismos Gln360His e Thr347Ser é negativo, a influência da variante
360His é constatada quando se compara haplótipos onde o alelo 360His está
presente com aqueles onde os alelos 347Ser ou X*2 não estão presentes. O
haplótipo com 360His tem IMC médio cerca de 1.8 kg/m
2
maior que homozigotos
para o haplótipo mais comum (X*2-347Thr-360His). A freqüência dos haplótipos
67
Capítulo 5 – Discussão
onde os alelos 347Ser ou 360His estavam presentes também foram maiores
naqueles com IMC ≥ 30 kg/m
2
.
O efeito do polimorfismo Thr347Ser sobre o IMC parece sofrer
influências do tabagismo. Apesar do tabagismo influenciar positivamente o peso,
fumantes tem taxas de mortalidade maiores por outros motivos. O efeito do ato
de fumar é difícil de ser quantificado por razões como as diferentes taxas de
inalação dos compostos e diferentes tipos de cigarros fumados (WILLETT e cols.,
1999). Apesar dos pontos negativos ao se analisar o efeito da interação do
tabagismo com polimorfismos sobre o IMC, o nosso trabalho mostrou que o efeito
da variante Thr347Ser é muito mais forte em fumantes e modificado pelo ato de
fumar. Homozigotos 347Thr/Thr fumantes tem IMC menor que indivíduos com o
mesmo genótipo mas não fumantes. Já portadores do alelo 347Ser e fumantes
tem IMC maior que homozigotos Thr/Thr também fumantes e portadores 347Ser
não fumantes. Segundo SUN e cols. (2000) o tabagismo não afeta os níveis da
proteína apo A-IV e a interação constatada deve ser um efeito indireto
decorrente da modulação de outros pontos do metabolismo.
Investigações realizadas por FISHER e cols. (1999) e LEFEVRE e cols.
(2000) estudaram as variantes Thr347Ser e Gln360His em populações caucasóides
com o objetivo de verificar sua influência sobre variáveis antropométricas. Os
resultados de ambos os trabalhos quanto ao polimorfismo Thr347Ser são
semelhantes aos observados no presente estudo. Portadores do alelo 347Ser têm
IMC maiores. Já os resultados para o outro polimorfismo, Gln360His, foram na
direção oposta aos nossos. O alelo 360His foi associado a uma diminuição no IMC
nas investigações destes dois pesquisadores.
A compreensão de como estas duas variantes podem modular a
função da apo A-IV e ter influência sobre o índice de massa corporal ainda não
é conhecida. As duas mutações ocorrem no domínio carboxi-terminal da apo A-
IV. Estudos funcionais da variante 360His mostraram que a proteína tem sua
estrutura de α-hélice aumentada e que isto a torna mais hidrofóbica (WEINBERG
e cols., 1990). No entanto, propriedades funcionais desta parte carboxi-terminal
da proteína não são conhecidas e a hipótese de que estas variantes também
estejam servindo de marcadores para outras alterações no gene da própria apo
A-IV ou de outros genes adjacentes não está descartada.
68
Capítulo 5 – Discussão
5.3. IMPORTÂNCIA DE INTERAÇÕES GENE-AMBIENTE
Os primeiros trabalhos de associação entre marcadores genéticos e
características poligênicas abrangiam somente dados como sexo, idade, grupo
étnico e quantificação adequada da característica de interesse. Depois de
muitos anos de resultados discrepantes, as investigações têm se voltado para
coleta de dados sobre hábitos de vida e mais recentemente, em como estes
fatores podem interagir com determinados genótipos.
O método onde indivíduos são genotipados para um determinado
loco e então o fenótipo é comparado entre os diferentes genótipos é uma
estratégia robusta, mas que pode ser confundida por interações gene-ambiente.
Estas interações podem obscurecer tanto fatores ambientais (evidentes somente
em pessoas suscetíveis) como fatores genéticos (evidenciados somente em
indivíduos com uma história prévia de exposição). Portanto, estudar e
compreender as interações gene-ambiente é de especial interesse para se
conhecer melhor influências genéticas e ambientais. Conforme STALENHOEF e
cols. (1997) o poder de uma determinada amostra em detectar uma associação
depende crucialmente das proporções relativas dos subgrupos de indivíduos
(fumantes, obesos, homens, por exemplo), uma vez que o efeito do genótipo
pode ser diferente nestes grupos. Isso pode explicar as aparentes inconsistências
encontradas em diferentes estudos (OTTMAN, 1996; WANG e MAHANEY, 2001).
Outra questão relevante é a interpretação de certas interações
gene-ambiente por profissionais da área de saúde, que deve ser responsável e
acurada. Muitas vezes os resultados dos efeitos de determinadas interações são
apresentadas ao público como uma tentativa de se evidenciar que “genótipos
não suscetíveis” não precisam se prevenir contra certos fatores ambientais, tais
como álcool, fumo, dietas ricas em gordura. Um exemplo que ilustra uma
situação destas é um estudo que mostra que portadores do alelo ε*4 da apo E
não tem seu perfil lipídico melhorado com exercício físico, enquanto que
portadores de ε*3 e ε*2 são beneficiados com a atividade física (HAGBERG e
cols., 2000). Isto poderia sugerir que em portadores de ε*4 ser ou não sedentário
não faria diferença. No entanto, a probabilidade de que um indivíduo não tenha
ao menos um alelo de suscetibilidade para nenhuma doença influenciada por
estes fatores é mínima.
69
Capítulo 5 – Discussão
De uma forma geral, os resultados do presente estudo revelaram
que os efeitos destes polimorfismos sobre o perfil lipídico e variáveis
antropométricas são altamente influenciadas por fatores ambientais e que estas
interações são fatores importantes para determinação destes parâmetros na
população investigada. Não podemos dizer se um determinado “perfil genético”
é de suscetibilidade para altos níveis de triglicerídeos ou colesterol, sem o
conhecimento do estilo de vida dos indivíduos. Muitas das interações aqui
encontradas ainda não foram descritas na literatura e assim como em outros
casos, precisam ser replicadas por outros pesquisadores em amostras
independentes para que se conheça o seu verdadeiro significado, bem como
para trazer soluções práticas para prevenção de doenças.
70
Capítulo 6 – Resumo e Conclusões
6. R
ESUMO E CONCLUSÕES
Apolipoproteínas constituem a parte proteica das lipoproteínas e de
uma maneira geral desempenham papéis como proporcionar estabilidade
estrutural, solubilizar lipídeos altamente hidrofóbicos, servir como ligantes a
receptores ou agir como co-fatores para enzimas envolvidas no metabolismo.
Diversos estudos têm mostrado que a variabilidade dos genes que codificam
estas proteínas podem influenciar os níveis lipídicos em diversas populações. A
variabilidade da apo A-IV também foi associada com variáveis antropométricas.
Nesta investigação foram analisados 8 RFLPs nos genes das apolipoproteínas C-I
(HpaI), C-II (AvaII), C-III (SacI, FokI e MspI) e A-IV (XbaI, HinfI e PvuII). A amostra foi
composta por 391 indivíduos caucasóides de Porto Alegre (RS) e dados sobre
hábitos de vida, dosagens lipídicas e medidas antropométricas foram obtidas
para cada indivíduo. Os fragmentos de interesse de cada gene foram
amplificados por PCR e os genótipos foram identificados por eletroforese em géis
de agarose ou poliacrilamida corados com brometo de etídio.
Os objetivos específicos deste trabalho foram: (1) estudar oito RFLPs
nos genes das apolipoproteínas pertencentes aos agrupamentos gênicos A-I/C-
III/A-IV e E/C-I/C-II em uma amostra de indivíduos caucasóides de Porto Alegre.
(2) realizar um estudo de associação entre cada RFLP e dos haplótipos derivados
e os níveis de lipídeos e lipoproteínas, para verificar a contribuição destes
polimorfismos para o perfil lipídico da população em questão. (3) determinar se a
variabilidade da apo A-IV está correlacionada com o índice de massa corporal
(IMC) e a relação cintura/quadril nesta amostra.
71
Capítulo 6 – Resumo e Conclusões
Os principais resultados e conclusões deste trabalho foram:
(1) Para apo C-I verifica-se que o alelo H*2 está associado a níveis aumentados
de triglicerídeos em homens. Isto é observado tanto nas freqüências, onde
genótipos com o alelo H*2 é mais prevalente no grupo com triglicerídeos ≥
200mg/dl (p = 0.014), como na comparação de médias entre os genótipos,
quando portadores do alelo H*2 têm níveis de triglicerídeos cerca de 38%
maiores. No entanto, esta associação não foi independente da variabilidade
da apo E.
(2) O efeito da variante A*2 da apo C-II sobre os níveis de triglicerídeos só foi
observado quando apenas indivíduos homozigotos para a variante neutra
(ε*3/ε*3) da apo E foram analisados. A redução dos níveis de triglicerídeos
devido ao alelo A*2 parece não ter um efeito muito forte (diminuição de 9%,
p=0.04)e por isso não foi constatado quando uma variável de confusão
como a variabilidade em outro gene é mantida.
(3) O efeito do polimorfismo T-455C localizado no elemento de resposta à insulina
do gene da apo C-III sobre os níveis de triglicerídeos é gênero dependente.
Mulheres homozigotas CC têm níveis de TG 20% menores que os das
homozigotas TT, enquanto que o efeito em homens é inverso. Portadores do
genótipo CC têm níveis de triglicerídeos 10% maiores do que os dos
homozigotos TT. Este resultado, no entanto é marginalmente significante (p
interação sexo*genótipo = 0.056).
(4) A influência dos polimorfismos HpaI da apo C-I e T-455C e C-482T da apo C-III
sobres os níves de HDL colesterol são contexto dependentes, onde o
tabagismo é uma variável de interação importante para a determinação dos
níveis desta lipoproteína.
(5) Na amostra total o efeito da interação fumo*genótipo para o RFLP HpaI
também foi gênero específica, só ocorrendo em mulheres. Em mulheres
fumantes e portadoras do alelo H*2 os níveis de HDL-C são significativamente
maiores, enquanto que em não fumantes os níveís não são alterados (p
interação fumo*genótipo = 0.019). Em homens este efeito não foi observado.
72
Capítulo 6 – Resumo e Conclusões
Estas diferenças podem ser explicadas pelas ações diferenciais do fumo em
enzimas envolvidas no metabolismo lipídico de acordo com os sexos. A
provável rota envolvida nesta modulação sexo-específica é a do transporte
reverso do colesterol e a enzima; provavelmente a ação ocorre sobre a
proteína transferidora de ésteres de colesterol.
(6) Os efeitos dos polimorfismos T-455C e C-482T sobre os níveis de HDL-C
também parecem ser influenciados pelo fumo. Nestes casos os efeitos são
inversos em não fumantes e fumantes. Os genótipos que têm os maiores níveis
desta lipoproteína entre os não fumantes (-455TT e –482CC) formam o grupo
com menores níveis de HDL-C entre os fumantes. Heterozigotos para as duas
variantes do elemento de resposta à insulina não apresentaram alterações
nesses níveis. Este efeito foi marginalmente significante para o polimorfismo T-
455C (p interação fumo*genótipo = 0.05) e mais pronunciado para o C-482T
(p interação fumo*genótipo = 0.015). Esta interação também provavelmente
resulta de um complexo conjunto de modulações do fumo sobre o
metabolismo lipídico.
(7) Os níveis de LDL colesterol e colesterol total foram modulados pelos
polimorfismos HpaI da apo C-I e Gln360His da apo A-IV de maneira contexto
dependente nos dois casos. Para o RFLP na região promotora da apo C-I o
efeito sobre os níveis de LDL-C parecem ser gênero dependentes. Como a
associação foi encontrada tanto na amostra total como em indivíduos com
genótipo ε*3/ε*3 para apo E, onde o efeito parece ser ainda maior, estes
resultados sugerem um efeito independente desta variante. A observação de
uma interação sexo*genótipo significante (p=0.036 para amostra total e p =
0.005 para indivíduos ε*3/ε*3) pode ser explicada pelo mesmo mecanismo
que modula os níveis de HDL colesterol também de maneira sexo
dependente. O transporte reverso do colesterol provavelmente seria a via
afetada, uma vez que a maior parte (80%) desta proteína circula in vivo
associada à partícula de HDL colesterol.
(8) O efeito do polimorfismo Gln360His sobre os níveis de LDL colesterol é
influenciado pelo sedentarismo. Ocorre uma aumento de 13.5% nos níveis
73
Capítulo 6 – Resumo e Conclusões
desta lipoproteína em indivíduos sedentários portadores do alelo 360His,
enquanto que em não sedentários portadores do mesmo alelo os níveis são
cerca de 7% menores (p interação sedentarismo*genótipo = 0.038). Esta
interação, no entanto, é questionável uma vez que esta mesma variante está
envolvida na determinação de parâmetros de massa corporal (medido pelo
IMC), também correlacionado ao sedentarismo.
(9) A variante Thr347Ser da apo A-IV está associada ao índice de massa
corporal. Na comparação das médias, observou-se que portadores do alelo
347Ser têm, em média, o IMC aumentado em 1 kg/m
2
(p = 0.02). Este efeito
também sofre ação de fatores ambientais e parece ocorrer de forma mais
pronunciada em fumantes. Homozigotos 347Thr/Thr fumantes têm IMC menor
que indivíduos com o mesmo genótipo não fumantes. Já portadores do alelo
347Ser fumantes têm IMC maior que homozigotos Thr/Thr também fumantes e
portadores de 347Ser não fumantes (p interação fumo*genótipo = 0.015).
(10) O efeito da variante Gln360His sobre o IMC só é observado ao nível
haplotípico. Encontrou-se que haplótipos onde o alelo 360His estava presente
tinham o IMC 1.8 kg/m
2
maior do que homozigotos para o haplótipo mais
comum (p = 0.019). O efeito do polimorfismo Thr347Ser também foi mais
pronunciado (p = 0.004) na análise haplotípica, uma vez que a
“interferência” do efeito da outra variante (Gln360His) foi retirado.
(11) Os haplótipos onde os alelos 347Ser ou 360His estavam presentes foram
mais freqüentes naqueles com IMC acima de 30 Kg/m
2
(p = 0.034).
(12) De uma forma geral o presente trabalho mostrou que a grande parte dos
resultados discrepantes dos estudos de associação publicados podem ser
explicados pela não consideração das complexas interações gene-gene,
gene-ambiente e gene-gênero, ainda pouco conhecidas.
74
Capítulo 7 – Summary and Conclusions
7. S
UMMARY AND CONCLUSIONS
Apolipoproteins constitute the protein fraction of lipoproteins. In
general, these proteins provide structural stability, solubilize hydrophobic lipids,
function as receptor ligands, and act as cofactors to metabolic enzymes.
Investigations providing evidences about the influence of the genetic variability of
these proteins on lipid levels in different populations have been published. The
apo A-IV genetic variability is also associated with anthopomentric variables. In
the present investigation, we have analysed 8 RFLPs in the apolipoproteins C-I
(HpaI), C-II (AvaII), C-III (SacI, FokI, and MspI), and A-IV genes (XbaI, HinfII, and
PvuII). The sample was composed by 391 unrelated Caucasian individuals from
Porto Alegre (RS). Data about lifestyle, lipid levels and anthropometric measures
were obtained for each individual. The specific sequences of each gene were
amplified by PCR and genotypes were identified after electrophoresis of the
digested DNA fragments on agarose or polyacrylamide gels stained with ethidium
bromide and visualized under UV light.
The specific objectives of this study were: (1) To investigate eight
RFLPs in apolipoproteins of A-I/C-III/A-IV and E/C-I/C-II gene clusters in a
Caucasian sample. (2) To perform an association study for each polymorphism
and for the derived haplotypes with lipid levels. (3) To determine if the apo A-IV
gene variability is associated with body mass index (BMI) or waist-to-hip ratio
(WHR) in this population.
The main results and conclusions of the present study were:
(1) For the HpaI polymorphism, male carriers of H*2 allele had elevated
triglycerides levels. This association was observed in the frequencies, where
75
Capítulo 7 – Summary and Conclusions
genotypes with allele H*2 were more common in the group with triglycerides
above 200 mg/dl (p = 0.014) and when means were compared. Men
bearing allele H*2 had triglycerides levels near 38% higher than those of
homozygotes H*1/H*1. This effect, however, was dependent of the apo E
polymorphism.
(2) The effect of the A*2 allele of apo C-II AvaII polymorphism on triglycerides
levels was observed only in homozygotes ε*3/ε*3 for apo E. The lowering
effect on triglyceride levels of this variant is weak, therefore it is not verified in
the total sample, when a confounding variable is kept in the analysis.
(3) The T-455C polymorphism located within the insulin response element of apo
C-III gene shows a gender specific association with triglyceride levels.
Women bearing the CC genotype had triglyceride levels 20% lower than TT
homozygotes. TT male homozygotes had the highest levels of this lipid. The
interaction gender*genotype, however, is marginally significant (p = 0.056).
(4) All polymorphisms associated with HDL cholesterol levels show a significant
interaction with smoking status. For the HpaI polymorphism the effect on HDL-
C levels was also gender specific. Smoker women bearing the H*2 allele had
HDL cholesterol levels significant higher than H*1/H*1 homozygotes. In female
no smokers the HDL-C levels were unchanged (p smoking*genotype
interaction = 0.019). In men this effect was not observed. The most probable
metabolic pathway involved in this sex specific modulation of HDL-C levels
by smoking status and HpaI polymorphism is the reverse cholesterol transport
pathway and the enzyme modulated by this lifestyle and genetic factors is
the cholesterol esther transfer protein (CETP).
(5) The effects of the T-455C and C-482T polymorphisms on HDL-C levels are also
influenced by smoking. In this case, the effects in current smokers are in the
opposite direction when compared with non smokers. Genotypes with the
highest levels of this lipoprotein among the group of non smoking individuals
(-455TT and –482CC) are in the group with the lower levels among current
smokers. Heterozygotes for the two insulin responsive element variants had
76
Capítulo 7 – Summary and Conclusions
their HDL-C unchanged. This effect was weaker for the T-455C polymorphisn
(p smoking*genotype interaction = 0.05) and statistically significant for C-482T
polymorphism (p smoking*genotype interaction = 0.015). This interaction
probably also results from a complex modulation of lipid metabolism and
smoking.
(6) LDL cholesterol levels and total cholesterol were influenced by the HpaI (apo
C-I) and Gln360His (apo A-IV) polymorphisms. The effects were context
dependent for both polymorphisms.
(7) For the apo C-I promoter HpaI polymorphism, the effect on LDL-C were
gender dependent. The association with the H*2 allele was found in the total
sample as well as in apo E ε*3/ε*3 subjects, with a greater effect among the
latter. These results suggest a independent effect of this variant. The
significant gender*genotype interaction found (p = 0.036 for the total sample
and p = 0.005 for ε*3/ε*3 carriers) could be explained by the same
mechanism that affect the HDL-C levels, also in a gender specific manner.
Most apo C-I is associated in vivo to HDL-C (80%) and therefore, the reverse
cholesterol transport is the most probable pathway involved.
(8) The effect of Gln360His polymorphism on LDL cholesterol levels was
modulated by physical activity. Levels of this lipoprotein are 13.5% higher in
physically inactive individuals carriers of the 360His allele, while in physically
active carriers of the same allele LDL-C levels were about 7% lower. This
interaction, in fact, could reflect just the association verified with this same
polymorphism with obesity, since physical activity and obesity are correlated
variables.
(9) The apo A-IV Thr347Ser polymorphism was associated with the body mass
index. When means were compared, 347Ser carriers have the average BMI 1
Kg/m
2
higher than Thr/Thr homozygotes (p = 0.02). This effect was also
affected by environmental factors and seems be more marked in smokers.
347Thr homozygote smokers had a BMI lower than non-smokers with the
77
Capítulo 7 – Summary and Conclusions
same genotype. 347Ser carriers had a BMI higher than Thr/Thr smokers and
347Ser carriers non-smokers (p smoking*genotype interaction = 0.015).
(10) The effect of the Gln360His polymorphism on BMI was observed at the
haplotypic level. We found that haplotypes with the 360His allele have a BMI
1.8 kg/m
2
higher than homozygotes for the common haplotype (p = 0.019).
The effect of the 347Ser variant was also stronger (p = 0.004) when
haplotypes were analysed, since the effect of another polymorphism
(Gln360His) was removed.
(11) Haplotypes with the 347Ser or 360His allele were more frequent among
individuals with a BMI above 30 kg/m
2
(p = 0.034).
(12) The present investigation showed that most of the contradictory results
reported in the literature could be explained if the gene-gene, gene-gender
and environment-gene interactions reported herein would have been taken
into account. How these interactions modulate the phenotypic expression of
these genes is not yet well-known.
78
Capítulo 8 – Bibliografia
8. B
IBLIOGRAFIA
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México: McGraw Hill, 1996.
90
Capítulo 8 – Bibliografia
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of the apolipoprotein C-II gene detected by polymerase chain reaction. Hum.
Genet., 89: 361.
91
Anexos
A
NEXOS
92
Anexos
ANEXO 1
TERMO DE CONSENTIMENTO PARA A PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO SOBRE FATORES
GENÉTICOS QUE AFETAM OS NÍVEIS DE COLESTEROL E TRIGLICERÍDEOS NA
POPULAÇÃO DE PORTO ALEGRE
Através deste documento, consinto em ser entrevistado e em doar uma
quantidade de 5 (cinco) ml de sangue, a ser obtida juntamente com a retirada
de sangue para os exames dos quais necessito, no Laboratório de Análises
Clínicas da Faculdade de Farmácia da UFRGS.
Estou ciente de que os objetivos deste estudo são conhecer um pouco
mais sobre algumas das causas do aumento dos níveis de colesterol e
triglicerídeos. Além disso, sei que os benefícios virão somente a longo prazo,
quando será possível prever o risco genético de um indivíduo ter problemas
cardiovasculares.
Os resultados do presente estudo estarão a minha disposição tão logo
forem obtidos.
Tenho a garantia de que meus dados serão mantidos em sigilo, e que meu
nome daqui para frente não será revelado.
Porto Alegre, / / . __________________________________
Assinatura do Paciente
Pesquisadora Responsável:
Dra. Mara Helena Hutz
Departamento de Genética da UFRGS
Telefone: 316 - 6720
93
Anexos
ANEXO 2
FICHA DO PACIENTE
IDENTIFICAÇÃO:_______________________________________________________
PRONTUÁRIO:_________________________________________________________
GRUPO ÉTNICO: C N
IDADE________________ PROFISSÂO________________________________
SEXO : MASCULINO
FEMININO CLIMATÉRIO? SIM NÃO
INGERE HORMÔNIO? SIM NÃO
DADOS:
1 – Jejum? Sim Não
2 – Gravidez? Sim Não
3 - Diabete? Sim Não
4 - Complicações cardiovasculares? Sim Não
5 - História familiar de complicações cardiovasculares? Sim Não
Pai Mãe Irmão Outros__________________________
6 - Hipertensão arterial prévia? Sim Não
7 - Sedentarismo? Sim Não
8 - Tabagismo? Sim Maços/dia_____________anos_______
Não
9 - Consumo de álcool: Não
< 1 copo/semana 1- 5 copos/semana >5 copos
Tipo de bebida ingerida em maior quantidade:___________________________
10- Ingere algum medicamento? Sim ___________________________________
Não
11 - Peso___________ Altura__________ Cintura___________ Quadril____________
EXAMES LABORATORIAIS:
CT _________mg/dl HDL _________mg/dl TRIG __________mg/dl
GLICEMIA ________mg/dl LDL ________mg/dl VLDL ________mg/dl
CT/HDL_________ LDL/HDL_____________
94
Anexos
ANEXO 3
95
Livros Grátis
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