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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DOUTORADO EM IMUNOLOGIA
MARCONDES QUEIROZ OLIVEIRA
BIOCOMPATIBILIDADE DA MEMBRANA FIBROSA
DA CASCA DE OVO DA GALLINEA GALLI GALLUS DOMESTICA:
ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATO
Salvador
2006
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2
MARCONDES QUEIROZ OLIVEIRA
BIOCOMPATIBILIDADE DA MEMBRANA FIBROSA
DA CASCA DE OVO DA GALLINEA GALLI GALLUS DOMESTICA:
ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATO
Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em
Imunologia, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade
Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do
grau de Doutor em Imunologia.
Orientador: Prof. Dr. Moysés Sadigursky
Salvador
2006
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3
TERMO DE APROVAÇÃO
MARCONDES QUEIROZ OLIVEIRA
BIOCOMPATIBILIDADE DA MEMBRANA FIBROSA
DA CASCA DE OVO DA GALLINEA GALLI GALLUS DOMESTICA:
ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATO
Tese aprovada como requisito parcial para a obtenção do grau de
Doutor em Imunologia, Universidade Federal da Bahia, pela seguinte banca
examinadora:
Professor Doutor MOYSÉS SADIGURSKY - Orientador
Universidade Federal da Bahia
Professora Doutora IVANA LÚCIA OLIVEIRA NASCIMENTO - Examinadora
Universidade Federal da Bahia
Professor Doutor EDMAR JOSÉ BORGES DE SANTANA - Examinador
Universidade Federal da Bahia
Professora Doutora FABIANA PAIM ROSA - Examinadora
Universidade Federal da Bahia
Professor Doutor ARYON ALMEIDA BARBOSA JUNIOR - Examinador
Fundação de Pesquisas Oswaldo Cruz
Salvador, 27 de maio de 2006.
4
AGRADECIMENTOS
Ao orientador, Professor Doutor Moysés Sadigursky, professor da Disciplina de Imunologia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal da Bahia e do Curso de Pós-Graduação em
Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA).
Ao Professor Doutor Emílio de Castro e Silva e à Professora Doutora Josmara Fregonesi, do
Laboratório de Neurociências do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia
(UFBA).
À Professora Doutora Ivana Lúcia de Oliveira Nascimento, ao Professor Doutor Roberto Meyer
Nascimento e à Professora Doutora Songeli Menezes Freire, do Programa de Pós-Graduação em
Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA).
À Professora Doutora Silvia Sardi, do Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências da Saúde da
Universidade Federal da Bahia (UFBA).
Ao Professor Doutor Lisandro Diego Giraldez Alvarez, do Laboratório de Biologia Celular do
Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA).
Ao Professor Doutor Ramon dos Santos El-Brachã, do Laboratório de Biologia Celular do Instituto
de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA).
À Professora Doutora Cláudia Elena Carneiro e ao Professor Doutor Francisco de Assis Ribeiro
dos Santos, do Laboratório de Micromorfologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual
de Feira de Santana (UEFS).
Ao Professor Doutor Aryon de Almeida Barbosa Jr., pesquisador da Fundação Osvaldo Cruz, Bahia
(FIOCRUZ).
À Professora Ana Verena Madeira, chefe geral dos laboratórios básicos da União Metropolitana de
Educação e Cultura (UNIME).
À bioquímica e doutoranda Maria das Graças Silva Vieira, do Laboratório de Imunohistologia do
Hospital Universitário Professor Edgar Santos da Universidade Federal da Bahia (UFBA), Colega de
Doutorado.
À bioquímica e mestranda Paula Moreira, do Laboratório de Imunologia do Hospital Santa Isabel.
À bióloga e mestranda Gisele P. Rocha, do Laboratório de Pesquisa em Microorganismos (LAPEM) -
Projeto Instituto do Milênio do Semi-Árido, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Estadual
de Feira de Santana (UEFS).
À doutoranda Ana Paula Cardoso Peixoto.
Aos técnicos Vanilson Silva de Souza e José de Souza, do Laboratório de Neurociências do Instituto
de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA).
A técnica Juçara Maria Souza Andrade, do Laboratório de Patologia e Imunohistologia do Hospital
Universitário Prof. Edgar Santos, Universidade Federal da Bahia (UFBA).
A técnica Marleide Maria dos Santos, do Laboratório de Histologia e Patologia da União
Metropolitana de Educação e Cultura (UNIME).
A Dilcea Reis Santana Santos Oliveira, secretária do Programa de Pós-Graduação em Imunologia do
Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia (UFBA).
À bibliotecária Maria da Graça Gomes Almeida, da Biblioteca Central da Universidade Federal da
Bahia (UFBA).
A minha irmã, Zélia de Queiroz Oliveira.
5
RESUMO
A biocompatibilidade de uma membrana é o principal requisito para o seu uso na técnica da
regeneração tecidual guiada (RTG) ou regeneração óssea guiada (ROG). Neste trabalho, foi
avaliada a resposta do tecido conjuntivo e muscular do Rattus norvegicus albinus à membrana
fibrosa originada da casca de ovo (MFCO) da Gallinea galli gallus domestica. A membrana foi
removida manualmente em condições estéreis, lavada com solução salina pH 7,4 e processada em
quatro tipos distintos: a membrana do tipo “a”, depois de secada, foi inserida em pacotes
esterilizados; a do tipo “b” foi inserida em pacotes estéreis e esterilizada em autoclave; a do tipo
“c” foi imersa em solução de glutaraldeído a 0,5% por quinze dias e depois novamente lavada,
secada, inserida em pacotes estéreis e esterilizada em autoclave; a do tipo “d” recebeu o mesmo
tratamento da membrana do tipo “c”, sem autoclavagem. A avaliação foi realizada em histologia,
em inunoistoquímica para interferon gama (IFN-γ) e por ensaio imunoenzimático para
interleucina 10 (IL-10). A atividade experimental desenvolveu-se em cento e vinte e cinco ratos
divididos nos grupos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 avaliados em vinte e quatro horas, uma, duas, três, oito, dez e
doze semanas. O grupo 1 foi o controle, e os animais não foram manipulados. No grupo 2, a
membrana do tipo “a” foi implantada na região dorsocefálica dos animais. Os animais do grupo 3
receberam na região dorsocefálica a implantação da membrana tipo “b” e a região dorsocaudal foi
somente manipulada, sem implantação da membrana. Os animais do grupo 3 serviram ainda para
os experimentos no tecido muscular onde se implantou a membrana do tipo “b” no músculo da
perna traseira direita, servindo a esquerda como sham. Os animais dos grupos 4 e 5 receberam
implantação das membranas dos tipos “c” e “d” na região dorsocefálica e dorsocaudal,
respectivamente. O grupo 6, composto de cinco animais que tiveram implantadas na região
dorsocefálica e dorsocaudal, respectivamente, as membranas dos tipos “c” e “d”, servindo para
obtenção de líquido da ferida. Os resultados histológicos da membrana do tipo “a” revelaram, em
três semanas, uma graduação de Sewell classificada como de leve a moderada e tecido conjuntivo
com muitos fibroblastos, mas livre de linfócitos ou plasmócitos. Ao final de doze semanas, a
membrana do tipo “b” revelou uma graduação de Sewell classificada como leve, com a presença
de poucos fibroblastos, intensa rede de matriz extracelular fibrosa, ausência de infiltrado
inflamatório linfocitário, mas povoada de macrófagos. As membranas dos tipos “c” e “d”
apresentaram, em oito semanas, uma graduação de Sewell leve, com ausência de linfócitos,
plasmócitos, macrófagos e presença de matriz extracelular fibrosa. O resultado imunoistoquímico
para marcação do IFN-γ nas células no conjuntivo adjacente à membrana do tipo “c” revelou grau
ausente (zero a 0,96%). No grupo 6, em uma semana, foi positivada a presença de IL-10 no
líquido da ferida. Concluiu-se que as membranas dos tipos “a”, ”b” “c” e “d” são biocompatíveis,
mas as dos tipos “c” e “d” apresentaram completa biocompatibilidade, podendo ser usadas para as
técnicas da RTG ou ROG. A presença de IL-10 no grupo experimental de uma semana indicou ter
sido produzida pelos macrófagos, mas os valores não se revelaram estatisticamente significantes
entre as membranas “c” e “d”, usando-se o teste ANOVA, p=0,15. A média do diâmetro da reação
inflamatória dos grupos experimentais em que foram utilizadas as membranas dos tipos “c” e “d”,
em oito semanas, mostrou resultados não significantes estatisticamente com valor de p=0,17
através do teste “t”.
Palavras-chave: Biocompatibilidade; Tecido conjuntivo; Histologia; Fluido de tecido;
Imunoistoquímica; IFN-γ; IL-10; Membrana fibrosa da casca de ovo.
6
ABSTRACT
Biocompatibility of a membrane is the main requisite for its use in guided tissue regeneration
technique (RTG) or guided bone regeneration (ROG). On this research, the response of muscle
and connective tissues of Rattus norvegicus albinos to the fibrous membrane extracted from the
shell’s egg of Gallinea galli galus domestica, has been evaluated. The membrane has been
removed manually in sterile conditions, washed in a saline solution pH 7.4 and processed into
four different types. Type “a”, after drying, has been packed into sterilized sachets, type “b” has
been inserted into sterilized packages and sterilized by the autoclave, type “c” has been immersed
in a glutaraldehyde solution on 0,5% for fifteen days and then washed, dried and inserted into
sterelized sachets and sterelized by the autoclave. Type “d” has received the same procedures as
the type “c”, except for the sterilization by the autoclave. The evaluation has been produced from
histology, immunohistochemical for interferon gamma (IFN-γ) and from enzyme-linked
immunosorbent assay for Interleukin 10 (IL-10). The experiment has been done in a 125 rats,
divided into group 1, 2 , 3 , 4 ,5 and 6, evaluated for 24 hours, during 1, 2, 3, 8, 10 and 12 weeks.
Group 1 has been set to be the non-manipulated rats. In group 2 there has been implantation of
membrane type “a” into their cephalic dorsal area. The rats of group 3 have received on their
cephalic dorsal area the membrane “b” and the cephalic tail area has been manipulated, but with
no membrane implants. The animals of group 3 have also been used for the experiments on
muscle tissue, which has been implanted the membrane type “b” into their right back-leg, having
the left one as a sham. The membranes “c” and “d” have been implanted into the dorsal cephalic
and tail area of groups 4 and 5, respectively. In group 6, composed of five rats, there has been
implanted into dorsal cephalic and tail area, respectively, the membranes “c” and “d”. They have
been used to obtain wound fluid. Histological results of membrane type “a” have shown in three
weeks a Sewell gradation classified from light to moderate and there have been many fibroblasts,
lymphocyte and plasma cell free. By the end of the twelfth week membrane “b” has shown a
Sewell gradation classified as light, with the presence of a few fibroblasts, an intense network of
extracell fibrous matrix, absence of infiltrated inflammatory lymphocyte, but populated by
macrophages. The membranes “c” and “d”, within eight weeks, have shown a light Sewell
gradation, with absence of lymphocyte, plasma cell, macrophage and presence of an extracell
fibrous matrix. The immunohistochemical results for the IFN-γ set in connective cells adjoining
the membrane type “c” has shown an absent grade (0 to 0,96%). In group 6, there has been found
the presence of IL-10 in the wound fluid. It has been concluded that the membranes type “a”, “b”,
“c” and “d” are biocompatible, but the membranes type “c” and “d” have shown a complete
biocompatibility, that can be used for the RTG or ROG technique. The presence of IL-10 in the
experimental group of one week might have been produced by the macrophages, but the values
have not shown to be statistically significant between the membranes type “c” and “d”, using the
ANOVA test p=0,15. The average diameter of inflammatory reaction in the experimental groups
which have used the membranes type “c” and “d”, within eight weeks, have not shown
statistically significant results under “t” test, p= 0,17.
Keywords: Biocompatibility; Connective tissue; Histology; Tissue fluid; Immunohistochemical;
IFN-γ; IL-10; Eggshell’s fibrous membrane.
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABS Sigla comercial de membrana fabricada de ácido polilactídeo
C Controle
DFDB Osso seco desmineralizado
DPDA Difenil fosforil azide
E Experimental
EGF Fator de crescimento epidérmico
E-M Experimental muscular
E-S Experimental conjuntivo
FGF-b Fator de crescimento fibroblasto básico
GM-CSF Fator estimulante de colônia macrófago-granulócito
Guidor AB Marca comercial de uma membrana reabsorvível
H-E Hematoxilina-eosina
HA Hidroxiapatita
ICBM Matriz de colágeno de osso bovino insolúvel
IFNγ Interferon gama
IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina
IL-1 Interleucina 1
IL-4 Interleucina 4
MEC Matriz extracelular
MFCO Membrana fibrosa da casca de ovo
PDGF Fator de crescimento derivado de plaqueta
PTFE Politetrafluoretileno
PTFEd Politetrafluoretileno denso
8
PTFEe Politetrafluoretileno expandido
PTFEn Politetrafluoretileno de alta densidade
PVA Esponja de álcool polivinil
rhBMP2 Proteína morfogenética humana
RTG Regeneração tecidual guiada
Sh Sham
Sh-M Sham muscular
Sh-S Sham conjuntivo
TCD4 Linfócito T helper ou auxiliar
TCD8 Linfócito T citotóxico
TGF-β Fator de crescimento transformador beta
TGF-α Fator de crescimento transformador alfa
Th1 Linfócito T helper 1
Th2 Linfócito T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
9
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
11
2 REVISÃO DA LITERATURA
13
2.1 TIPOS DE MEMBRANAS, COMPOSIÇÃO E ORIGEM 13
2.2 BIOCOMPATIBILIDADE E METODOLOGIAS DE AFERIÇÃO 27
2.3
RESPOSTA HISTOLÓGICA DOS TECIDOS
ATRAVÉS DE CÉLULAS IMUNES E NÃO IMUNES
28
2.4
RESPOSTA IMUNE ATRAVÉS DE CITOCINAS
E FATORES DE CRESCIMENTO
50
3 OBJETIVOS
60
3.1 OBJETIVO GERAL 60
3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO 60
3.3 JUSTIFICATIVA 60
4 MATERIAL E MÉTODO
61
4.1 PREPARO DA MEMBRANA 61
4.2 ANIMAIS 64
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 64
4.4
ETAPAS EXPERIMENTAIS - PROCEDIMENTOS
CIRÚRGICOS
65
4.5 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS 67
4.5.1
Estudo da membrana em microscopia de luz
e microscopia eletrônica de varredura
67
4.5.2 Estudo da resposta histológica à membrana em microscopia de luz
71
4.5.3 Avaliação do colágeno total pela coloração Picrossírius
73
4.5.4 Ensaio imunoenzimático (ELISA de captura)
74
4.5.5 Cultura primária para fibroblastos e ensaio MTT (estudo piloto)
77
4.5.6 Estudo imunoistoquímico
78
4.5.6.1 Procedimento para imunoistoquímica
79
4.5.6.2 Controle da imunorreação
81
4.5.6.3 Critérios de avaliação
82
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
82
10
5 RESULTADOS
83
5.1 RESULTADO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO 84
5.2
RESULTADO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
PELO ENSAIO MTT
84
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.3.5
5.3.6
RESULTADOS HISTOLÓGICOS
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Índice de Sewell
84
84
89
90
105
111
113
5.4
RESULTADO DO ESTUDO HISTOLÓGICO
PARA AVALIAÇÃO DO COLÁGENO
118
5.5
RESULTADO IMUNOHISTOQUÍMICO
PARA AVALIAÇÃO DO INTERFERON GAMA (IFNΓ)
120
6 DISCUSSÃO
160
7 CONCLUSÃO
182
TABELAS
123
GRÁFICOS
156
REFERÊNCIAS
184
ANEXOS
191
11
1 INTRODUÇÃO
Produtos naturais, como o colágeno de origem humana ou bovina, o sacchachitin,
derivado de fruta, o chitosan, derivado de crustáceo, a membrana da casca de ovo, derivada de
ave, o alginato, a lâmina de osso autógeno e o osso bovino desmineralizado, têm sido usados
na clínica odontológica e na pesquisa experimental como membranas tanto para a técnica da
regeneração tecidual guiada (RTG) quanto para a regeneração óssea guiada (ROG), quando a
ação é dirigida exclusivamente para a formação de tecido ósseo. Produtos sintéticos, como o
politetrafluoretileno (PTFE) do tipo expandido ou não expandido, reabsorvível ou não, a
polilactina biodegradável, o poliortoester, o titânio, a celulose e o ácido polilático, também
têm sido usados na prática clínica e em experimentos.
A técnica da RTG baseia-se no princípio de guiar a proliferação de componentes
celulares do ligamento periodontal e do osso na reparação, depois de procedimentos
cirúrgicos, usando-se uma barreira. O propósito da barreira ou membrana é impedir que,
durante parte do processo de reparação, o tecido epitelial e conjuntivo da gengiva entre em
contato com a superfície da raiz do dente, possibilitando às células do ligamento periodontal e
do osso reposição sem interferência das células do tecido gengival (KARRING et al., 1993;
DAHLIN, 1996;).
Na atualidade, a RTG e a ROG têm sido usadas em procedimentos diversos na
área de cirurgia odontológica: na cirurgia implantológica, com o propósito de aumentar
previamente o volume do osso alveolar; na cobertura de implantes por exposição no ato
cirúrgico; no aumento da regeneração óssea do implante imediato à extração do dente; na
recuperação e no aumento do osso em extração dentária para fins de implante; nos
tratamentos cirúrgicos de fendas palatinas e na pesquisa científica experimental de
biocompatibilidade dos biomateriais (LUNDGREN et al., 1995; NYMAN et al., 1995;
12
BUSER; DAHLIN; SCHENK, 1996; MEINIG et al., 1996; PIATTELLI et al., 1996; GORDH
et al., 1998; VERSCHUEREN et al., 2005).
As barreiras biológicas, como as de colágeno, as sintéticas, como o ácido
polilático e outras, têm sido estudadas e credenciadas como biomaterias que apresentam
baixos índices de alergenicidade, que podem apresentar diferentes graus de
biocompatibilidade, impermeabilidade e outras propriedades resultantes de diferentes tipos de
procedimentos dispensados (LAMBERTI, 1994; REGO et al., 1996; MAEDA; KASUGA;
HENCH, 2006).
A investigação da biocompatibilidade, qualquer que seja o material utilizado, se
caracteriza por uma resposta tecidual, com ausência ou um mínimo de infiltrado
linfoplasmocitário, ausência de polimorfonucleares e mínima presença de células gigantes, em
avaliações que duram de duas a doze semanas. O escore estabelecido para a aceitação de
biocompatibilidade se aproxima da resposta dos tecidos em condições de cura fisiológica, ou
seja, ao final do primeiro mês, deverá ser observada a presença de fibroblastos do fenótipo
sintetizante, colágeno abundante e nenhuma ou poucas células do processo inflamatório
crônico. É necessário, portanto, que o produto biocompatível seja incapaz de liberar
moléculas imunogênicas e que exerça pouca influência sobre as células dos tecidos
adjacentes.
Na técnica da regeneração tecidual guiada, os eventos celulares ocorrem sobre a
membrana na área gengival e sob a membrana no ligamento periodontal, tornando duplamente
importante as interações biológicas aí desenvolvidas. Assim, considerando a possibilidade do
uso da membrana fibrosa da casca de ovo como um biomaterial, é importante desenvolver
novos processamentos para o produto e conhecer a sua biocompatibilidade através da resposta
dos tecidos, seus tipos celulares e citocinas envolvidas.
13
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 TIPOS DE MEMBRANAS, COMPOSIÇÃO E ORIGEM
A estrutura microscópica da casca de ovo compõe-se de várias camadas, dentre as
quais duas fibrosas que se apresentam imbricadas e separadas macroscopicamente somente no
pólo mais côncavo, com a externa ligada à estrutura mineralizada e a interna em contato com
a clara do ovo. Vistas ao microscópio eletrônico, as duas camadas fibrosas apresentam redes
de fibras protéicas semelhantes em sua construção, unidas umas às outras com aspecto de rede
ou galho, apresentando uma manta central eletricamente densa, rodeada por outra de menor
densidade. As camadas fibrosas compõem-se de 95% de proteína semelhante à queratina e 5%
de glicosaminoglicano. Sua insolubilidade justifica-se pela alta concentração do aminoácido
cisteína. A camada interna é mais lisa em decorrência da infiltração de albumina na sua
superfície (PARSONS, 1982).
Um esquema representativo da casca de ovo distribuiu-a nas seguintes camadas de
fora para dentro: cutícula, camada calcária paliçada, poros entre as camadas paliçadas,
membrana externa e membrana interna; e atribuiu-se o percentual de 95% ao material
inorgânico presente em sua composição e 5% ao material orgânico distribuído pela membrana
e pela porção calcária. A composição das camadas foi estudada por imunoistoquímica, tendo-
se identificado a presença de queratan sulfato e colágeno I e V nas camadas fibrosas.
Surpreendentemente, foi identificado o colágeno X, comum na cartilagem hipertrófica
(CARRINO et al., 1996).
Estudando-se a composição da casca de ovo, concluiu-se que: participam da
formação de sua camada fibrosa o colágeno I, IV e X; a porção calcária é composta de 95%
de carbonato de cálcio e 3,5% de glicoproteínas e glicosaminoglicanas. A análise da
distribuição da lisozima na estrutura calcária e na membrana revelou que sua presença na
14
membrana origina-se do fluido uterino produzido pelas células epiteliais do oviduto. A
natureza fibrosa da membrana foi examinada em microscopia eletrônica (HINCKE et al.,
2000).
Dupoirieux, Pourquier e Souyris (1995) transformaram a casca de ovo em
partículas e testaram a sua resposta no tecido muscular e no osso mandibular de ratos da
linhagem Wistar. Para o experimento I, introduziram 50mg de pó da casca de ovo no músculo
da coxa direita; para o experimento II, foram criados defeitos de 5,0mm nos dois lados do
ramo da mandíbula (lado direito experimental), onde foram introduzidos ±200mg de pó da
casca de ovo. Os animais foram sacrificados oito semanas depois do ato cirúrgico, as peças
processadas e coradas por hematoxilina-eosina. Os resultados do experimento I mostraram
que, histologicamente, as partículas da casca de ovo estavam envolvidas por uma fina camada
fibrosa, com pouca ou nenhuma reação inflamatória dentro do músculo, registrando-se
ocasional presença de células gigantes e desprovidas de formação de osso. No experimento II,
o lado experimental mostrou partículas da casca de ovo rodeadas por finas camadas de tecido
conjuntivo, livre de formação ou indução de osso ou cartilagem; no grupo controle, os
orifícios foram preenchidos por tecido conjuntivo fibroso. Os autores concluíram que o pó da
casca de ovo é de excelente biocompatibilidade, com ausência de risco de transmissão viral e
de salmonelose, uma vez que pode ser autoclavado. É um produto natural, não tóxico, de
baixo custo e encontrado em grande quantidade, mas tem uso limitado para pequenos defeitos,
como os decorrentes de extração de dentes e defeitos periodontais.
A biocompatibilidade e o funcionamento da membrana fibrosa da casca de ovo
(MFCO) na técnica da regeneração tecidual guiada foram testados em 40 Rattus norvegicus
albinus, divididos em dois grupos de 20 animais cada. No grupo 1, usou-se o tecido
conjuntivo subcutâneo e o tecido muscular para o teste da biocompatibilidade, e os mesmos
animais foram tomados como experimentais e como controle. No grupo 2, a tíbia dos animais
15
sofreu defeitos de 2,0mm x 4,0mm, seguindo o longo eixo do osso. A biocompatibilidade foi
testada a partir do escore de Stanford e, ao final de três semanas, os resultados revelaram
quantidade mínima ou ausência de linfócitos e plasmócitos, além de ausência de macrófagos e
células gigantes. Comparados os grupos controle e experimental, os dados da resposta da
regeneração do osso na área do defeito não se revelaram estatisticamente significativos. Ao
longo do tempo estudado, a membrana manteve-se íntegra, o que evidenciou a sua não
degradabilidade (OLIVEIRA, 2001).
Tendo em conta a biocompatibilidade e os bons resultados da membrana de casca
de ovo na cobertura de feridas de queimaduras, e que a sua preparação industrial permitiu
controlar facilmente sua forma, tamanho e espessura, além de torná-la solúvel, concluiu-se
que a insolubilidade da membrana in natura em água se deve às pontes de sulfeto em sua
estrutura molecular. Como em trabalho anterior havia-se preparado a proteína fibrosa da casca
de ovo com solventes não tóxicos (SEP-membrana), analisou-se a composição dessa
membrana em microscopia eletrônica de varredura em comparação com a da membrana in
natura, e sua biocompatibilidade em cultura de células pela técnica MTT comparada à do
colágeno I. A análise da composição dos aminoácidos mostrou Asp, Thr, Ser, Gla, Gly, Ala,
Cys, Val, Met, Ile, Leu, His, Trp, Arg, Lys, His, Phe, Tyr e Leu. A membrana SEP apresentou
menor quantidade de cisteína (Cys) e outros aminoácidos e, em cultura de células, foi
semelhante à membrana de colágeno, havendo respondido melhor nas primeiras sete horas. A
adesão e a forma das células na membrana foram consideradas como pontos positivos: células
achatadas e fusiformes e a formação de projeções finas (filopodia) sugeriram boa adesividade.
Concluiu-se que a membrana é biocompatível e que a perda do aminoácido cisteína permitiu a
sua solubilidade, tendo, assim, grande potencial de aplicação na prática clínica (YI et al.,
2004).
16
Em exposição escrita sobre a técnica da regeneração tecidual guiada e os materiais
nela utilizados, Lamberti (1994) relacionou entre eles o osso autógeno e o colágeno. Em
relação ao colágeno, destacou a sua compatibilidade e a facilidade de ser atacado pelas
colagenases produzidas por macrófagos, fibroblastos e células epiteliais.
A avaliação da biocompatibilidade, da taxa de absorção e do potencial de uma
membrana de colágeno tipo I para a regeneração tecidual guiada foi realizada sob a ação de
uma nova técnica de alteração da cadeia química do colágeno, o difenil fosforil azida
(DPDA), que o torna mais biocompatível. Foram utilizados 48 ratos Wistar com peso entre
300g e 350g, distribuídos por quatro grupos, e na calvária de cada um deles foram criados
defeitos ósseos de 6mm. O grupo 1 foi o controle; nos três grupos experimentais, usou-se a
membrana com DPDA em diversas concentrações: no grupo 2, DPDA a 0,02%; no grupo 3,
DPDA a 0,1%, e no grupo 4, DPDA a 0,5%. Os animais foram sacrificados aos 10, 20 e 30
dias. O grupo controle, aos dez dias, apresentou infiltrado hemorrágico com perda de coesão
entre a mucosa, o periósteo e o osso; aos 20 dias, o infiltrado tinha diminuído, e o tecido
conjuntivo fibroso preenchia a ferida; aos 30 dias, o tecido conjuntivo estava arranjado com
fibras de densidade regular e formação de osso similar à constatada aos dez dias. Os grupos
experimentais, aos dez dias, apresentaram uma membrana pobremente colonizada por células
vermelhas e polimorfonucleares; aos 20 dias, os grupos 3 e 4 mostraram pequeno infiltrado
celular, enquanto no grupo 2 (com 0,02% de DPDA) estava presente uma membrana
fragmentada e invadida por células mononucleares e células gigantes de corpo estranho; aos
trinta dias, não se evidenciou a membrana no grupo 2, a reabsorção da membrana estava em
curso no grupo 3, e estava se iniciando no grupo 4. Nos defeitos curados dos grupos 2, 3 e 4, a
formação do osso se efetivou do centro para a periferia, com o aparecimento de ilhas de osso
de vários tamanhos tendendo a fechar o defeito e coalescer. Nos grupos 3 e 4, a presença de
osteoblastos na periferia indicou a incompleta regeneração (BRUNEL et al., 1996).
17
Corsi (1998) estudou, do ponto de vista clínico e histológico, a resposta da derme
de ratos Wistar depois da aplicação de ciclosporina. Os estudos clínicos envolveram desde a
dosagem da droga e sua concentração no sangue até a formação de tumores. O estudo
histológico avaliou os colágenos tipos I e III, identificados nas áreas de aplicação da droga,
através da medição em microscopia das áreas coloridas obtidas com a técnica de coloração
tecidual Picrossírius examinadas em microscopia de luz e de luz polarizada.
Para testar o efeito da proteína morfogenética humana 2 (rhBMP2) incorporada a
uma membrana de colágeno de origem humana tipo I na formação de osso e cemento, foram
utilizados ratos Wistar adultos pesando 280g a 300g que sofreram defeitos de 4,00mm na
mandíbula, nas regiões de primeiro e segundo molares, desnudando-se as raízes, sob intensa
irrigação. As áreas receberam membranas de 4,0mm x 2,0mm x 2,0mm com 10µl de solução
com 50µg (micrograma/ml) de rhBMP2, e os resultados foram comparados com os de estudos
prévios. Os animais foram sacrificados aos dez dias do ato operatório, e as peças processadas
para coloração em hematoxilina-eosina e para imunoistoquímica. Os cortes do grupo
experimental revelaram osso normal dentro do defeito e nova formação óssea com
osteoblastos adjacentes estendendo-se das margens das feridas em todos os sentidos ântero-
posteriores; a membrana estava parcialmente degradada, com infiltrado inflamatório no seu
interior e grande quantidade de crescimento ósseo; espículas de cimento foram observadas na
periferia da superfície da raiz dos dentes com promoção de osso e cimento estendendo-se para
além das áreas do defeito (KING; KING; HUGHES, 1998).
Estudando-se a resposta tecidual de uma membrana de colágeno biodegradável
para a técnica da regeneração óssea guiada (ROG), buscou-se apurar os eventos celulares pelo
uso da histologia e da imunoistologia, investigando-se a fosfatase alcalina, a osteoporina e a
osteocalcina. A pesquisa foi desenvolvida em vinte ratos que tiveram os molares extraídos e,
depois de quatro meses, foram reoperados nessa mesma área através de defeitos de 1,0mm x
18
2,5mm cobertos com uma membrana de 4,0mm x 5,0mm com poros voltados para o lado do
defeito. A avaliação foi realizada em uma, duas, três e quatro semanas. Os resultados da
primeira semana foram similares entre o grupo controle e o experimental, com formação de
osso trabecular, espículas e algumas células positivas para fosfatase alcalina; não foram
observadas células inflamatórias, e havia poucos macrófagos no perímetro da membrana. Na
segunda semana, observou-se produção abundante de osso trabecular, que não alcançou,
porém, o rebordo alveolar; abundantes células positivas para fosfatase alcalina (FA) foram
identificadas nos poros da camada da membrana, assim como células positivas para
osteocalcina e osteoporina. Na terceira semana, o novo osso alcançou o rebordo alveolar com
grande número de células positivas para FA; constatou-se ainda uma pequena separação entre
o novo osso e o osso remanescente, e as fibras colágenas da membrana se tornaram
integrantes do novo osso. Na quarta semana, foi difícil separar o osso da membrana do osso
da cavidade, e este atingiu a altura do rebordo alveolar, apresentando-se células positivas para
FA em pequeno número. Em três e quatro semanas, evidenciou-se pequena inflamação que
pode ter estimulado a formação de osteoclastos, através da interleucina-1 e fator de necrose
tumoral. Os resultados permitiram concluir que a membrana de colágeno biodegradável é uma
excelente escolha para a ROG (TAGUCHI et al., 2005).
Investigando-se se a regeneração tecidual guiada poderia ser útil em defeitos de
osteotomia mais amplos, como nas fraturas Le Fort I, tendo em vista a pobre vascularização
nas fibroses e que poros são importantes na membrana, foram produzidas fraturas maxilares
em dez coelhos nos dois lados, servindo um como experimental e outro como controle. As
fraturas do lado experimental foram cobertas com membrana de colágeno porosa e
reabsorvível, depois da prévia fixação dos ossos. Quatro semanas depois, procedeu-se à
avaliação histológica com espécimes corados por hematoxilina-eosina, em análise
histomorfométrica de três regiões: do incisivo central, do lúmen da artéria alveolar superior e
19
da sutura premaxila-maxilar. Foram obtidas imagens através de câmeras digitais, e sobre essas
foram traçados planos milimetrados. Os resultados mostraram grandes quantidades de tecido
fibroso e invaginação epitelial nas áreas não cobertas com a membrana. Do lado experimental,
houve grande produção óssea, pouco tecido fibroso e ausência de invaginação epitelial, mas a
formação óssea não foi completa. Concluiu-se que o uso da membrana foi efetivo para
impedir a migração do tecido fibroso para o interior do espaço ósseo resultante do
procedimento (VERSCHUEREN et al., 2005).
Uma vez que a membrana de colágeno não mineralizado é de difícil manuseio,
testou-se uma membrana com três camadas, uma com hidroxiapatita nanocarbonatada, outra
de colágeno e uma terceira de co-polímero de lactóide-glicólide e éster ácido, embora os co-
polímeros sejam degradados com liberação ácida, o que causa forte reação inflamatória. A
biocompatibilidade foi testada em cultura de células osteoblásticas com 8000/poço (MC3T3-
EI) nos tempos de um, três e sete dias. Os resultados permitiram entender que a nanonização
do componente mineral auxiliou na absorção da membrana, concluindo-se que o material é
promissor para uso na regeneração tecidual guiada, mas que o fato de possuir um lado poroso
e outro não poroso resultou em diferentes taxas de biodegradação (LIAO et al., 2005).
Para um estudo de Carvalho, Garcia Júnior e Ferraz (1999) sobre a eficácia de
uma membrana fabricada de osso bovino desmineralizado, foram criados defeitos na tíbia da
perna direita de cães, servindo a esquerda como controle. Os animais foram sacrificados 45 e
90 dias depois do ato cirúrgico. O grupo experimental revelou preenchimento de osso com
trabéculas nas laterais e profundidades da cavidade; ao final do experimento, as cavidades
foram completamente preenchidas por trabéculas ósseas, havendo maior densidade na
periferia e trabéculas mais finas no centro.
O chitosan foi experimentado como cobertura de feridas no tecido conjuntivo, e o
processo de cura evoluiu em inflamação, formação de tecido e remodelação da matriz.
20
Estabeleceu-se um índice mitótico e um índice de tecido de granulação. Em três dias, houve
um aumento significativo de neutrófilos no grupo experimental em comparação com o grupo
controle. Considerando que o fragmento do complemento C5a foi farto no exsudato
inflamatório, quimiotático para neutrófilo, além de ter sido indicado em outros trabalhos, o
chitosan foi considerado indutor de complemento. Tendo havido aumento do C5a com o uso
de chitosan, entendeu-se que esta substância ativa a efusão de líquidos. Os macrófagos se
evidenciaram em maior quantidade no grupo experimental do que no grupo controle. Como,
no tempo de nove dias, houve troca da composição da matriz colágena, considerou-se que o
chitosan permitiu aceleração da inflamação e da cura da ferida, associando um maior afluxo
de oxigênio e outros produtos à região da ferida (UENO et al., 1999).
O chitin, um polímero natural derivado de crustáceo (N-acetilglicosamina),
insetos e outros animais, quando processado, libera glicosaminoglicano, componente normal
da matriz extracelular. Para pesquisar a sua influência na cura de feridas ósseas em câmara de
Teflon com a técnica da regeneração tecidual guiada, foram utilizadas bolas de Teflon que
passaram a cúpulas redondas de 4,0mm a 5,0mm através de orifícios com espessura de
0,5mm. As cúpulas foram autoclavadas, algumas receberam seis balas de chitin e foram
colocadas em um lado da mandíbula de ratos, presas por fios em furos previamente
executados; o outro lado foi o controle. Os animais foram sacrificados em 7, 15, 30, 60 e 120
dias. Para a avaliação histológica, os cortes foram feitos com equipamento que dispensa
desmineralização e corados com azul de toluidina. Os resultados revelaram maior formação
óssea do lado controle do que do lado experimental no tempo de 120 dias. Entre o chitin e o
osso formado, foram observados linfócitos, plasmócitos e macrófagos. Os achados não
apontaram na direção da impossibilidade do uso do chitin, mas de mudanças na configuração
ou estrutura desse material (KOSTOPOULOS et al., 2001).
21
Um produto derivado de resina de mamona em forma de floculado, considerado
biocompatível em trabalhos anteriores, foi inserido em espaços alveolares dentários de ratos.
Os resultados confirmaram a biocompatibilidade, mas, comparando-se aos do grupo controle,
houve perda na produção de osso na região apical, variando entre 8% e 22%. É provável que o
formato do floculado testado tenha sido o causador do evento, uma vez que a literatura tem
destacado que características físicas como forma, quantidade, rugosidade superficial,
existência e tamanho de poros podem alterar o resultado de uma resposta inflamatória
(CALIXTO et al., 2001).
Pela técnica da regeneração tecidual guiada, foram testados in vivo os fatores de
crescimento e o acúmulo de citocinas com o emprego de uma membrana bioabsorvível de
alginato, para determinar a concentração de cada solução usada em sua fabricação. A
biocompatibilidade foi confirmada, mas houve ausência de inflamação nos tecidos dos
animais do grupo experimental. No grupo controle, depois de uma semana, o coágulo foi
observado dentro do defeito ósseo; em quatro semanas, o defeito criado na tíbia foi
preenchido por tecido fibroso e, em oito semanas, houve invasão de músculo e tecido
conjuntivo no osso. No grupo experimental, em uma semana, foi identificada a presença de
coágulo dentro do defeito ósseo sem nenhuma produção de novo osso; em quatro semanas,
nenhuma célula inflamatória foi encontrada, mas ligeira presença de tecido conjuntivo no
defeito e formação completa de osso no grupo com alginato na concentração de 1%; em oito
semanas, houve restauração da cortical óssea com imperfeição da regeneração. Embora a
biocompatibilidade tenha sido confirmada, as feridas dos grupos experimentais, quando
comparadas com as do grupo controle, demoraram a completar a cura e sofreram imperfeição
natural na regeneração (UEYAMA et al., 2002).
Aplicando-se a técnica da regeneração tecidual guiada, foram utilizadas como
membrana, sobre o periósteo da mandíbula de ratos, cápsulas de Teflon (PTFE) presas através
22
de orifícios, mas sem criação de defeitos ósseos. Os animais foram sacrificados em 7 e 15
dias, um, dois e quatro meses. As peças foram obtidas de cortes sem desmineralização,
coradas com azul de toluidina e quantificadas por medidas planimétricas mediante
aparelhagem associada a computador. Aos sete dias, os resultados histológicos mostraram
maior quantidade de osso no grupo teste e, tanto no grupo teste quanto no grupo controle,
foram observadas numerosas células inflamatórias no conjuntivo adjacente externo à cápsula,
com tecido de granulação frouxo altamente vascularizado abaixo da camada de osteoblastos
internamente à cápsula. Aos 15 dias, foi identificado, no grupo teste, tecido ósseo com
espessura similar ao do ramo da mandíbula, enquanto no grupo controle houve uma produção
óssea fina e nenhum vestígio de inflamação. Em um mês, o grupo teste apresentou osso
trabecular compacto, espaços medulares, células hematopoiéticas, mas o novo osso se
encontrava coberto por tecido de granulação; o grupo controle apresentou osso compacto e
menor quantidade de osso trabecular. Aos dois meses, a quantidade de osso encontrado foi
similar nos dois grupos. Aos quatro meses, houve similaridade nos dois grupos na qualidade e
quantidade do osso, predominando o osso maduro, e em alguns espécimes houve contato do
osso com o teto da cápsula (KOSTOPOULOS; KARRING; URAGUCHI, 1994).
Uma avaliação da resposta biológica da implantação de três tipos de membranas
(politetrafluoretileno, celulose e nitrato de celulose) em tecido subcutâneo do animal Rattus
norvegicus albinus foi realizada por Sonohara e Greghi (1994). Os animais foram sacrificados
após 30 dias do ato cirúrgico, e as peças processadas e coradas com hematoxilina-eosina. A
resposta do tecido foi avaliada a partir dos parâmetros: grau de infiltrado inflamatório, grau de
fibrosamento da cápsula e grau de alteração vascular nos tecidos que envolviam. Aos três
itens foram atribuídos escores, como a seguir: 0 = ausente; 1 = discreto; 2 = moderado; e 3 =
intenso. Os resultados mostraram que, aos 30 dias, a membrana à base de nitrato de celulose
possuía cápsula fibrosa bem organizada com predominância de fibroblastos e presença
23
discreta de células gigantes multinucleadas. A membrana à base de celulose ofereceu resposta
histológica ao redor da cápsula semelhante à anterior, mas com presença intensa de células
gigantes multinucleadas. O tecido em volta da membrana de Teflon ou politetrafluoretileno
(PTFE) mostrou formação de cápsula fibrosa intensa em qualidade e presença de células
gigantes em grau moderado.
Membranas de politetrafluoretileno (PTFE) e de celulose Gengiflex foram
implantadas no tecido conjuntivo subcutâneo de ratos Wistar pesando entre 150g e 200g. As
membranas foram cortadas em forma de disco com 2,0mm, e os animais foram sacrificados
aos 7, 14, 21 e 30 dias após o ato cirúrgico, sendo as peças processadas e coradas com
hematoxilina-eosina. Os resultados histológicos revelaram, aos sete dias, em áreas de contato
com a membrana Gengiflex, grande quantidade de células degeneradas, tecido conjuntivo
com moderado número de fibroblastos e fibras colágenas dispostas paralelamente; nesse
mesmo período, a área com a membrana de PTFE revelou tecido conjuntivo rico em
fibroblastos com discreto número de linfócitos e plasmócitos. Aos 14 dias, as áreas do tecido
com a membrana Gengiflex apresentaram tecido vascularizado, rico em células, com
moderado número de macrófagos, linfócitos e fibroblastos, além de regiões de necrose; nas
áreas adjacentes à membrana de PTFE, havia tecido conjuntivo bem diferenciado com
discreto número de linfócitos, macrófagos e áreas de tecido degenerado. Aos 21 dias, o tecido
contendo a membrana de celulose mostrou tecido conjuntivo pouco organizado e discreto
número de linfócitos e macrófagos, enquanto a membrana de PTFE evidenciou tecido
conjuntivo organizado com cápsula espessa de fibras colágenas, número discreto de linfócitos,
macrófagos e células gigantes. Aos 30 dias, em todos os espécimes com a membrana de
PTFE, o tecido apresentou cápsula de tecido conjuntivo fibroso, com raros linfócitos,
macrófagos e algumas células gigantes; no tecido em contato com a membrana Gengiflex,
havia células degeneradas, grande quantidade de fibroblastos, vasos sangüíneos e elevado
24
número de linfócitos e macrófagos. Concluiu-se que, no tecido em volta da membrana de
PTFE, a inflamação foi discreta, diminuindo com o tempo, enquanto a membrana de celulose
causou inflamação acentuada e crescente com o decorrer do tempo (MACEDO; JARDINI;
OKAMOTO, 1995).
Pesquisas em que foram comparadas a ação da membrana de politetrafluoretileno
não reabsorvível (nPTFE), da de poligalactina reabsorvível e da de casca de ovo, aplicadas na
calvária de Rattus através de defeitos de 6mm, obtiveram resultados pouco promissores para a
última delas. Somente com a membrana de nPTFE os defeitos se curaram e produziram
formação parcial de novo osso em sete dos dez exemplares, e formação completa em três. As
informações de aceitação histológica foram positivas, mas foram usadas apenas as
observações de neutrófilos. A membrana da casca de ovo compunha-se de colágeno I, V e X,
e a pepsina e ácido acético a 0,5N foram utilizados no seu processamento (DUPOIRIEUX et
al., 2001).
Pela técnica da regeneração tecidual guiada, foram experimentados como barreira
pedaços de borracha do tipo usado em consultório dentário, esterilizados em autoclave, raios
gama e produto químico. Para o teste de biocompatibilidade, empregou-se cultura de células,
avaliando-se a sua proliferação pela técnica que usa o 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl
etrazolium bromide (MTT) e pela análise em microscopia de fase. A borracha esterilizada em
raios gama e autoclave revelou-se atóxica (biocompatível), enquanto a borracha tratada com
produto químico mostrou-se tóxica; em conseqüência desses resultados, sugeriu-se a
utilização da primeira em estudos clínicos (APINHASMITH et al., 2003).
Membranas fabricadas a partir de ácido poliglicólico e de ácido poliláctico com
poros, já testada a sua cinética e o seu efeito biológico em cultura de fibroblastos e
biodegradabilidade em tecido subcutâneo de rato, foram embebidas em tetraciclina,
fluorbiprofeno e fator de crescimento derivado e plaqueta (PDGF). Às membranas
25
biodegradáveis foram adicionados tetraciclinas, PDGF e flúor biprofeno, e com elas foram
cobertos defeitos ósseos de 5,0mm criados na calvária de ratos Sprague-Dawley. Após duas
semanas, os defeitos estavam completamente curados, com tecido osteóide abaixo da
membrana com PDGF e flúor biprofeno em nova formação extensiva. Os resultados sugerem
que as membranas a que se adicionam drogas e fatores de crescimento são mais efetivas para
a regeneração óssea guiada do que as membranas sem essas drogas (CHUNG et al., 1997).
Levando-se em conta que compostos contendo carbonato de cálcio apresentam
teores mais altos de hidroxicarbonato apatita nos fluidos corporais estimulados, e que as
membranas para a técnica da regeneração óssea guiada (ROG), além de serem
biocompatíveis, devem estimular a formação de osso, testou-se uma membrana de ácido
poliláctico associado a polisiloxane e carbonato de cálcio (hidroxicarbonato de apatita).
Foram avaliadas as propriedades físicas, a presença de poros e a liberação de íons. A
biocompatibilidade foi testada através de cultura de células semelhantes a osteoblastos
(MC3T3E1) em um, três e cinco dias, usando-se por poço 6x10
4
, através de contagem celular
por hemocitômero. A membrana testada permitiu melhores índices de proliferação celular do
que as membranas com polisiloxane apenas. Os poros serviram para a conexão dos seus lados
opostos e para junção das células à superfície. Como a membrana foi capaz de estimular a
proliferação celular, concluiu-se que tem grande potencial para uso na ROG (MAEDA;
KASUGA; HENCH, 2006).
Uma membrana composta de β tricálcio fosfato e L-lactídio co-glicóide co-ε
coprolactone foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura, por espectroscopia e em
tecido de animal. Para o exame histológico, foram usados cinco cães machos beagles, dos
quais foram removidos os primeiros, segundos e terceiros molares de ambos os lados da
mandíbula. Três semanas depois, nessa mesma área, foram criados em cada animal defeitos
de 10,0mm x 10,0mm x 10,0mm
3
. Do lado experimental, os defeitos foram cobertos pela
26
membrana esterilizada por óxido de etileno. Doze semanas depois, os animais foram
sacrificados, e o exame histológico realizado em microscopia de luz em cortes corados por
hematoxilina-eosina revelou, do lado experimental, um preenchimento ósseo de 9,0mm contra
0,5mm de osso do lado controle. Os achados permitem concluir que a membrana pode ser
usada para a regeneração de tecido ósseo (KIKUCHI et al., 2004).
Tendo em vista o uso da tetraciclina na descontaminação de feridas para
regeneração de tecido periodontal perdido e não tendo conhecimento de estudos sobre o uso
desse antibiótico em conjunto com membranas de osso cortical bovino desmineralizado,
implantou-se, no tecido conjuntivo subcutâneo de 60 ratos Wistar, uma membrana com
tetraciclina (MT) e, em outros 60, uma membrana sem tetraciclina (M). A avaliação foi feita
em 1, 3, 7, 15, 30 e 60 dias em cortes corados por hematoxilina-eosina, para observação da
intensidade do infiltrado inflamatório ao redor da área implantada, usando-se a microscopia
de luz. A análise semiquantitativa levou em conta os seguintes escores: 0 = ausente; 1 =
pequena; 2 = intensa; e 3 = severa. Os resultados mostraram que a angiogênese foi maior no
tempo de sete dias, a presença de células gigantes foi mais alta no décimo quinto dia, e a
fibrose aumentou ao longo do tempo. A avaliação histológica do primeiro dia foi semelhante
para os dois tipos de membrana, apresentando neutrófilos e linfócitos em grau moderado. No
terceiro dia, o processo foi mais intenso do que no primeiro, mostrando linfócitos e
neutrófilos. No sétimo dia, foi intensa a presença de células gigantes, linfócitos e neutrófilos,
constatando-se a mais alta taxa de angiogênese. No período de quinze dias, houve reabsorção
de 25% da MT e de 10% da M, além de redução do número de neutrófilos e aumento do de
macrófagos. No trigésimo dia, a MT havia sido reabsorvida, e se apresentaram poucos
fragmentos da M. Em sessenta dias, a área da MT manifestou conjuntivo normal
(GRANJEIRO et al., 2006).
27
2.2 BIOCOMPATIBILIDADE E METODOLOGIAS DE AFERIÇÃO
A biocompatibilidade é a qualidade de estar em harmonia com a vida, com
ausência de efeitos tóxicos ou lesivos na função biológica (DORLAND, 1994).
Em documento da Federação Dentária Internacional, foram recomendadas práticas
padronizadas para avaliação biológica de materiais dentários (STANFORD, 1980). Para a
avaliação histológica da biocompatibilidade os critérios devem ser: interpretação da presença
e intensidade da inflamação nos tecidos adjacentes ao material no tempo estabelecido de duas
a doze semanas, devendo-se observar a organização do tecido, a presença de leucócitos,
linfócitos, plasmócitos, macrófagos e células de corpo estranho, considerando-se quatro
reações: nenhuma, mínima, moderada e severa. Os resultados devem ser interpretados como
aceitáveis e não aceitáveis: a resposta severa deve ser considerada inaceitável em qualquer
dos tempos; a moderada é aceitável se passa a mínima ou a nenhuma com o decorrer do
tempo; e a aceitável, se mínima ou nenhuma em duas a doze semanas.
Um novo método para identificação do crescimento celular passível de
determinação rápida por leitura óptica foi descrito por Mosmann (1983). O método utiliza o 3-
(4-5 dimethylthiazol-2-yl)-2-5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT), um produto amarelo
pálido que, quando processado pela célula na mitocôndria, provoca o rompimento do seu anel,
gerando o MTT formazan, um produto azul escuro que ocorre somente em células vivas.
Quando se dissolve o formazan da célula, torna-se possível a leitura da adsordância óptica,
sendo esta diretamente proporcional ao número de células. Esse método permite a medição da
atividade de células vivas, indicando-se o seu uso nas aferições de citotoxicidade.
Para observar a sua biocompatibilidade em comparação com a do dracon, que é
um material sintético, submeteu-se o pericárdio bovino a diversos tipos de tratamento,
inclusive ao uso do glutaraldeído a 0,5%. A seguir, ele foi implantado em tecido conjuntivo
subcutâneo de ratos Wistar, e a resposta foi observada em tecido e em cultura de células aos
28
30, 60 e 90 dias. Concluiu-se que o uso do glutaraldeído oferece vantagens como agente de
conservação e esterilização, além de não possuir características antigênicas e imunogênicas
(PINTO et al., 1993).
Foram estudados dois tipos de membrana, uma delas formada por uma associação
entre chitosan e alcoolpolivinílico. Para testar sua biocompatibilidade, foi utilizada cultura de
fibroblastos analisados através da técnica com o 3-(4-5 dimethylthiazol-2-yl)-2-5 diphenyl
tetrazolium bromide (MTT) e da avaliação morfológica celular por microscopia eletrônica de
varredura (MEV). Os melhores resultados da proliferação celular com o uso do MTT foram
conseguidos com a membrana com a associação chitosan-alcoolpolivinílico; na MEV, as
células aderiram à superfície da membrana e se mostraram achatadas, com poliploidia e
superfície citoplasmática franzida ou rugosa, diferentemente da membrana alcoolpolivinílica,
que exibiu células redondas ou arredondadas (CHUANG et al., 1999).
A biocompatibilidade de três tipos de fios foi avaliada através de um método que
requereu a contagem de cada tipo celular imune ou não, estabelecendo-se graus e pesos, para,
finalmente, determinar um escore que firma a qualidade da reação tecidual (método
desenvolvido por Sewell) (MOLEA et al., 2000).
2.3 RESPOSTA HISTOLÓGICA DOS TECIDOS
ATRAVÉS DE CÉLULAS IMUNES E NÃO IMUNES
Na cura normal de feridas, Deuel e Kawahara (1991) constatam três estágios: a
migração direta e seqüencial de neutrófilos, monócitos e fibroblastos (de zero a sete dias); a
ativação de macrófagos e fibroblastos, nova matriz extracelular e proliferação de fibroblastos
(entre 14 e 21 dias); e a remodelação (de duas semanas a um ano); e destacaram que as
29
plaquetas são importantes no fornecimento de fatores quimiotáticos para leucócitos e
macrófagos.
Para Contran, Kumar e Collins (2000) o processo de reparo por tecido conjuntivo
(fibrose) e formação de cicatriz se desenvolve em quatro fases: formação de novos vasos
sangüíneos; migração e proliferação de fibroblastos; deposição de matriz extracelular (MEC)
e subseqüente produção de proteoglicanos; e maturação e organização do tecido fibroso,
conhecido como remodelação, deposição de colágeno e fibronectina. O conjunto celular, a
matriz extracelular e os vasos neoformados apresentam um componente avermelhado e
granuloso que sangra facilmente, chamado de tecido de granulação, que ocorre já nos
primeiros três ou quatro dias.
Em artigo de revisão, refere-se que os estágios das feridas cirúrgicas ou
traumáticas são bem definidos: coagulação; inflamação; proliferação celular; reparação da
matriz, reepitelização e remodelação do tecido cicatricial. Na fase de coagulação, as plaquetas
liberam fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento semelhante à
insulina (IGF-1) e fatores de crescimento epidérmico (EGF), transformador beta (TGF-β) e de
fibroblasto (FGF), que são quimiotáticos para leucócitos e monócitos, além de serem
estimulantes para fibroblastos, células endoteliais e epiteliais. O FGF também é sintetizado
por macrófagos e fibroblastos, o de tecido conjuntivo (TCGF) por fibroblastos, o PDGF por
macrófagos, plaquetas, fibroblastos e queratinócitos. O TGF é também sintetizado por
macrófagos, plaquetas e fibroblastos. Na fase inflamatória (que dura de algumas horas até 14
dias), além de vasodilatação e aumento de permeabilidade, ocorre a ativação do complemento
e a saída natural de neutrófilos e macrófagos. Os macrófagos sintetizam a interleucina-10 (IL-
10), citocina que inibe a ação de macrófagos, a produção de fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α), da interleucina-1 (IL-1) e interleucina-6 (IL-6) e a ativação de neutrófilos. Na fase
proliferativa, ocorre a formação de novos vasos, diminuição do número de células
30
inflamatórias com os fibroblastos em proliferação, que, juntamente com as células endoteliais,
assumem o papel de produzir citocinas e fatores de crescimento. Os queratinócitos produzem
IL-1, TGF-α e -β, assim como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). No início do
processo da ferida, a matriz extracelular é preenchida provisoriamente por fibrina e
fibronectina. Na fase proliferativa, os fibroblastos sintetizam novo colágeno, elastina,
fibronectina, proteoglicano, ocorrendo o cross-linking do colágeno. Na fase de remodelação, o
número de fibroblastos e outras células declina ao longo do tempo, mas a produção da matriz
extracelular continua, para estabelecer o equilíbrio (SCHULTZ et al., 2003).
Em tese de doutorado, Lopes (1998) explica que o processo de cicatrização de
feridas se inicia através da inflamação. A primeira fase, conhecida como de enchimento,
inflamatória ou de substrato, é inicialmente caracterizada por um aumento da permeabilidade
vascular da região, acompanhada da deposição de fibrina e um fluxo de polimorfonucleares
neutrófilos e monócitos. Os neutrófilos e macrófagos ingerem bactérias, mas os restos
celulares e corpos estranhos são fagocitados pelos macrófagos.
De acordo com Welch, Odland e Clark (1990), ao descrever a formação do tecido
de cicatrização (a segunda fase do processo, fase proliferativa), os fibroblastos do fenótipo
migrante se diferenciam em miofibroblastos, e os estimuladores de proliferação o fator de
crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e o fator de crescimento transformador beta (TGF-
β). No início do quarto dia de sua experiência, os fibroblastos moveram-se rapidamente para
dentro da ferida, começando a produzir fibronectina e colágeno, com produção máxima em
sete dias.
Em pesquisa sobre a cicatrização de feridas, Linsenmayer (1991) descreve a
terceira fase ou fase de maturação, que se inicia na segunda ou terceira semana depois que a
lesão se instala e persististe por meses. Ela se caracteriza pelo alinhamento das fibras
colágenas, por ligações cruzadas e por uma continuada e aumentada taxa de síntese e
31
degradação de colágeno. O colágeno surge de cadeias polipeptídicas individuais, produzidas
nos ribossomos e retículo endoplasmático do fibroblasto. As cadeias individuais se ligam com
mais duas, formando a fita tríplice. O aminoácido hidroxiprolina origina-se de resíduos de
prolina e lisina, aos quais é incorporada a hidroxila (OH), formando-se a hidroxiprolina por
ação da enzima prolina-hidroxilase. A hidroxila da hidroxiprolina confere a sustentação à fita
tripla através de ligações de hidrogênio entre as três cadeias alfa.
Clark (1993) esclarece que, na cura de feridas, não se constata, em três dias,
invasão de fibroblastos, e a área é preenchida com fibrina, fibronectina e vitronectina. No
quarto dia, os fibroblastos se movem rapidamente, preenchendo-a completamente no sétimo
dia; em feridas recentes, os fibroblastos assumem características proliferativas, estacionárias e
migratórias (fenótipos) e, quando ocupam o espaço da ferida, inicia-se imediatamente a
produção de colágeno; entre o sétimo e o décimo quarto dia, ocorre a contração do tecido
conjuntivo (os fibroblastos se ligam aos elementos da matriz extracelular provocando a
contração). No processo inicial da ferida, as plaquetas entregam fator de crescimento derivado
de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformador beta (TGF-β), que são mitógenos e
quimiotáticos para fibroblastos. O PDGF e o TGF-β são ainda indutores da síntese de
colágeno pelos fibroblastos. O fator de crescimento de fibroblasto (FGF) produzido por
macrófago é angiogênico. O PDGF, dentre as várias funções, é mitogênico para fibroblasto e
indutor do aparecimento do fenótipo miofibroblasto. Embora desde as seis horas do início do
processo se detecte a sua presença, seu pico de produção pelos macrófagos é o sétimo dia,
quando podem ser observadas áreas de feixes finos de colágeno e áreas de degeneração de
eritrócitos.
A reação normal dos tecidos aos fios de sutura ocorre, segundo Greco Júnior
(1999), em três estágios: o primeiro, nos primeiros quatro dias, se caracteriza pela presença de
linfócitos e monócitos com inflamação exsudativa inespecífica; no segundo estágio, entre o
32
quarto e o sétimo dia, aparecem macrófagos e fibroblastos; após o sétimo dia, ocorre a
inflamação crônica com linfócitos, plasmócitos e tecidos fibróticos. Por outro lado, o processo
de cicatrização da ferida se processa em três estágios: inflamatório ou exsudativo,
proliferativo e regenerativo. O primeiro estágio ocorre em 72 horas, com a ativação do
mecanismo de coagulação do sangue e liberação de mediadores, como o fator de crescimento
derivado de plaqueta. No segundo estágio, do quarto ao décimo quarto dia, há formação de
muito tecido vascularizado, macrófagos, fibroblastos, miofibroblastos, linfócitos, plasmócitos
angioblastos; os fibroblastos se desenvolvem usando aminoácidos da lise do coágulo
sangüíneo. No terceiro estágio, o da cicatrização, há produção de fibras colágenas, interrupção
da atividade mitótica do fibroblasto e ocorre a maturação da camada epidérmica.
Em artigo de revisão sobre o estudo da ferida dérmica e a produção de colágeno,
Lindblad (1998) destaca a participação das células epiteliais das vênulas e arteríolas na
produção de colágeno IV para o restabelecimento da membrana basal. A origem do colágeno
não se restringiria unicamente aos fibroblastos, contando também com a participação dos
macrófagos e neutrófilos. Antes do uso dos anticorpos na marcação celular, era difícil, em
muitos casos, diferenciar as células dentro das feridas apenas pelo aspecto morfológico, daí a
importância dos marcadores, que permitem diferenciar as células morfologicamente
semelhantes. Na cura da ferida, a produção de colágeno representa duas composições, uma
para substituir o tecido perdido e a outra para formação da cicatriz. O colágeno do tecido
normal se posiciona paralelamente à superfície do corpo, predominando na pele o I e o III,
embora também se identifique o VI. As células epiteliais produzem colágeno V e III, além do
IV. No tecido conjuntivo, o fator de crescimento transformador beta (TGF-β) estimula os
fibroblastos na produção de colágeno, enquanto o fator de crescimento derivado de plaqueta
(PDGF) é mitogênico para essas células.
33
Quanto aos macrófagos, esclarece Kessel (2001), são células de vida longa,
secretoras, numerosas no tecido conjuntivo frouxo e se distribuem por todo o corpo. Elas
podem ser do tipo fixo (não migratório) e livre (migratório) e têm a capacidade de fagocitar
bactérias, células mortas e restos celulares que são digeridos por enzimas lisossômicas. No
tecido conjuntivo frouxo, os macrófagos apresentam núcleos que tendem a ser menores,
esféricos e mais heterocromáticos em comparação com o núcleo do fibroblasto. Os
macrófagos são estimulados por fatores de infecção, regular inflamação ou resposta
imunológica. O fator inibitório de migração de macrófago (MIF) foi estudado em feridas na
pele de ratos, tendo sido observado o seu aumento (SHIMITZJ et al., 1999).
Os estudos experimentais de Bartee e Carr (1995) permitiram constatar a
estabilidade de uma membrana de politetrafluoretileno de alta densidade (PTFEn) não porosa
e dobrável. No lado direito da mandíbula de ratos, foram criados defeitos de 4,0mm com
brocas em motor de baixa rotação e com bastante irrigação, funcionando o lado esquerdo
como controle. Administrou-se tetraciclina aos animais, e a eutanásia ocorreu na segunda,
sexta e décima semanas. No grupo controle, não houve cura dos defeitos em dez semanas,
preenchendo-se os defeitos com tecido mole. No grupo experimental, alguns dos defeitos
apresentaram cura tão significativa, que a concavidade da mandíbula foi restabelecida. No
tempo de duas semanas, os defeitos cobertos com membrana tiveram nova formação de osso
nas margens com conjuntivo muito vascularizado nas bordas; em seis semanas, completou-se
a cura da ferida nas beiradas, enquanto, no centro, observou-se a presença de espículas ósseas
e, sobre os defeitos, em alguns dos espécimes, tecido conjuntivo fino vascularizado; em dez
semanas, todos os defeitos foram curados completamente, menos em um caso. A membrana
não tinha porosidade, o que parece não ter sido elemento importante, além de não ter
interferido no fechamento do defeito; ao contrário, ela pode ter servido para prevenir a entrada
de microorganismos.
34
Kharmandayan, Goldenberg e Villa (1995), apurando a resposta da pele de ratos
Wistar a três tipos de fios de sutura nos tempos de sete e quatorze dias, observaram em
macroscopia a hiperemia e a presença ou não de secreção. Tendo procedido à análise
histológica comparativa da quantidade de colágeno, de fibroblastos e da disposição das fibras
colágenas, os autores identificaram à luz da microscopia de luz, após sete dias, novas fibras
colágenas, confirmando-se que a proliferação de vasos e fibroblastos é fruto da fase
proliferativa (cinco a sete dias). O número de fibroblastos não aumentou significativamente a
quantidade de fibras colágenas na sutura com náilon, mas o mesmo não foi observado em
relação a outros fios.
Uma membrana de colágeno foi desenvolvida na Universidade de São Carlos, São
Paulo, e seu comportamento foi testado em periodonto de cães, utilizando-se doze pré-
molares, sete para o grupo teste e cinco para o grupo controle, em tempos de 20 e 45 dias. O
grupo teste se caracterizou pela ocorrência de deiscências ósseas nos dentes respectivos, e a
membrana ultrapassou o defeito em 3,0mm. O resultado do grupo controle em 20 dias
evidenciou uma resposta inflamatória mononuclear difusa, variando de discreta a moderada.
No grupo teste, o infiltrado inflamatório concentrou-se junto à membrana. Concluiu-se que a
membrana desempenhou bem o seu papel, com algum grau de reabsorção, mas exibindo a sua
biocompatibilidade (REGO et al., 1996).
Combinando-se a técnica da regeneração tecidual guiada (RTG) com a
microcirurgia, foram introduzidos, em um retalho de tecido muscular do dorso de ratos
Wistar, cilindros desmineralizados (DBM) de 1,0cm, provenientes de tíbia e fêmur, cobertos
com uma membrana de silicone. A análise histológica e a quantificação radiomorfométrica
foram realizadas nos períodos de 10, 21 e 35 dias. Do ponto de vista histológico, a existência
de novo osso medular e células cartilaginosas foi avaliada como fator positivo ou negativo da
evidência de osteoindução. Aos 10 dias, houve formação de microcalficação em metade das
35
amostras, enquanto a outra metade acusou a presença de cartilagem e infiltrado ao redor dos
cilindros de DBM. Aos 21 dias, quando a inflamação começou a cessar, foi detectado
microscopicamente novo tecido ósseo em completo desenvolvimento medular com presença
de cartilagem em parte dele. No 35º dia, histologicamente, os cilindros foram quase
completamente ossificados, com presença de células cartilaginosas e poucas células
inflamatórias ao seu redor (VILJANEN; GAO; LINDHOLM, 1997).
Considerando que seria difícil encontrar material que fosse completamente
biocompatível, desde que o organismo reconhece os implantes como material estranho,
promovendo o isolamento por encapsulamento, procedeu-se a um experimento, com o animal
Rattus, com o propósito de avaliar a biocompatibilidade de polímeros anidridos com
modificações (para torná-los mais resistentes às forças de tração). Foram obtidos os seguintes
resultados: fase aguda (0 a 7 dias) caracterizada pela presença de neutrófilos, linfócitos,
macrófagos e exsudato; fase subaguda (7 a 14 dias), por macrófagos e fibroblastos; e fase
crônica (28 a 69 dias) com encapsulamento, apresentando poucos macrófagos e células
gigantes (IBIM et al., 1998).
Lundgren, Lundgren e Tylor (1998) testaram barreiras não perfuradas e barreiras
perfuradas para promover o aumento de osso, sendo seis com perfurações, uma sem
perfuração com completa oclusividade, e outra completamente aberta. Na área central das
calvárias de ratos Sprague-Dawley de 250g a 300g, foram feitas raspagens grosseiras com
broca diamantada (escoriações), num espaço de 3,6mm, e quatro furos com um molde, para
implantação de um aparelho de polioximetileno, com 10,0mm de diâmetro externo, 3,6mm de
diâmetro central e 2,0mm de altura. Os animais foram divididos em oito grupos, inclusive um
grupo controle (grupo 1). Os grupos 2
a 7 foram os portadores de membranas com perfurações
variadas, e no grupo 8 a câmara permaneceu aberta (sem membrana, com a área escoriada
para cura espontânea). As membranas foram fabricadas com poliéster, com perfurações de 10,
36
25, 50, 75, 100 e 300µm para os grupos 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente. Uma vez colocado o
aparelho, nenhum esforço foi feito para manter o coágulo sangüíneo. Os animais foram
sacrificados, as peças descalcificadas e cortadas com aparelho especial. Procedeu-se à análise
histológica, fotográfica e morfométrica em microscópio conectado a computador. Não foi
evitada a sutura sagital da calvária, que possui um tecido conjuntivo diferenciado. Houve
dificuldade para determinar os limites dos tecidos analisados, que foram grosseiramente
estimados, com as bordas dos aparelhos em íntimo contato com o osso. No grupo controle, o
total da área aumentada de tecido foi de 6%, 15% e 18% em 4, 8, e 12 semanas,
respectivamente; do tecido formado, 98% foi do tipo trabecular, e os 2% restantes, de tecido
conjuntivo da sutura. No grupo 2, com membranas de perfurações de 10µm, o aumento de
tecido correspondeu a 37%, 60%, e 72%, respectivamente em 4, 8 e 12 semanas, mas a
quantidade de osso correspondeu a 24%, 35%, e 33%, respectivamente (nesse grupo foi difícil
estabelecer a precisão). Nos grupos 3 e 4, o total da área de tecido aumentado foi 81% em 8
semanas, 84% em 12 semanas, com 31% e 41% de tecido mineralizado, respectivamente. Nos
grupos 5 e 7, os resultados foram similares aos dos grupos 3 e 4. No grupo 8, em doze
semanas a área de tecido formado correspondeu a 92%, e a de osso formado, a 32%.
Partindo-se da premissa de que uma barreira deve ser porosa, foi fabricada uma
membrana de polilactídeo, a ela tendo sido adicionado fator de crescimento derivado de
plaqueta (PDGF). A membrana foi testada quanto à cinética, à concentração, à
biodegradabilidade e à toxicidade em cultura celular de fibroblastos, usando-se técnicas
especiais, após o que defeitos de 5,0mm criados na calvária de ratos Sprague-Dawley foram
cobertos com a membrana do lado experimental, ficando sem cobertura o lado controle. Nos
defeitos sem a membrana, houve invasão de tecido conjuntivo sem evidência de nova
formação óssea. No grupo com membrana e PDGF-BB, registrou-se, em uma semana,
proeminente formação óssea, com ausência de macrófagos e células gigantes multinucleadas;
37
em duas semanas, além de completo preenchimento do defeito, houve uma completa
neoformação óssea, o que promoveu uma total união do novo osso com o osso mais maduro.
Concluiu-se que a membrana de polilactídeo com PDGF pode funcionar como barreira física
e entregadora de drogas estimuladoras da neoformação óssea (PARK et al., 1998).
Enxertos ósseos retirados de tíbia e fêmur foram aplicados a defeitos criados na
calvária de ratos Lewis isogênicos e cobertos com membrana com 6,0mm de comprimento,
que excedeu em 2,0mm a 3,0mm as suas bordas. Foram analisados três grupos de sete animais
cada; no grupo 1, o defeito foi preenchido com enxerto que ficou com o lado medular voltado
para o leito da ferida e foi coberto com a membrana de politetrafluoretileno expandido
(PTFE-e) durante 12 semanas; para o lado controle, procedeu-se do mesmo modo, porém sem
a membrana. Ao grupo 2 foram aplicados os mesmos procedimentos por 20 semanas,
utilizando-se o lado esquerdo como controle, sem a membrana. No grupo 3, o enxerto foi
colocado, mas a membrana foi retirada após doze semanas, acompanhando-se a cura por 20
semanas; já do lado esquerdo, o enxerto foi colocado, mas a membrana foi mantida durante 20
semanas. A análise imunoistoquímica e a análise da incorporação do enxerto revelaram os
seguintes resultados: no grupo 1, onde a cobertura da membrana foi retirada após 12 semanas,
o enxerto foi total ou parcialmente incorporado; no período de 20 semanas, o grupo 2 revelou
completa incorporação do enxerto, enquanto no grupo controle, no mesmo período, somente
quatro espécimes manifestaram incorporação parcial do enxerto; uma completa incorporação
do enxerto ocorreu com o grupo experimental 3 (GORDH et al., 1998).
Bohning, Davenport e Jeansonne (1999) avaliaram a inflamação e a cura de
defeitos ósseos de 5,0mm criados com peça de mão de alta velocidade sob irrigação na região
occipital da calvária de ratos Sprague-Dawley. Os defeitos foram cobertos com membranas
reabsorvíveis Guidor AB, e os animais foram sacrificados na terceira, quinta e sétima
semanas. As peças foram preparadas para coloração em hematoxilina-eosina, e a avaliação
38
histológica não demonstrou diferença significativa entre o grupo controle e o experimental na
inflamação e cura da ferida. Na terceira semana, foi percebida nova formação óssea em todos
os espécimes, revelando-se presença moderada de tecido conjuntivo denso e inflamação de
ligeira para moderada no centro do defeito. Na quinta e sétima semanas, o comportamento foi
similar com consistente crescimento ósseo da periferia para o centro do defeito. Na periferia
do defeito, verificou-se, na quinta semana, o preenchimento de tecido conjuntivo com ligeira
inflamação; na sétima semana, a inflamação não estava mais presente. Nenhuma diferença
estatisticamente significativa foi constatada entre o grupo controle e o experimental.
Levando-se em conta a capacidade de o pentosan polifosfato ser capaz de evitar a
fibrose ajudando no crescimento ósseo, testou-se a efetividade de partículas de casca de ovo,
reduzindo-as de 100µm a 200µm para servirem de promotoras dos fatores de crescimento, em
combinação com a técnica da regeneração tecidual guiada. Para o ato cirúrgico, utilizou-se a
região parietal de ratos Wistar, onde foram criados defeitos de 6mm, no lado direito tomados
como teste e no esquerdo, como controle, deixando-os vazios, mas com membranas colocadas
por dentro e por fora, ultrapassando as margens em 1mm e 2mm, respectivamente. Foram três
os grupos experimentais: o grupo I, com defeito de 6mm e membrana interna e externa
colocadas no interior com 100µl de carboximetil celulose a 2%; o grupo II com o mesmo
procedimento, injetando-se 1mg de pentosan polisulfato misturado com carboximetil celulose;
e o grupo III, a que foi aplicado pó de casca de ovo com pentosan polisulfato e carboximetil
celulose. Os animais foram sacrificados aos 42 dias, a que se seguiram exames radiográficos e
histológicos, avaliando-se a presença de polimorfonucleares e células gigantes. A regeneração
óssea foi classificada de acordo com os seguintes escores: 0 = nenhuma ou mínima cura óssea
com a interposição de tecido fibroso; 1= cura óssea parcial com ocasional crescimento de
tecido fibroso; 2 = completa cura óssea fechando o defeito. Os resultados histológicos foram
decepcionantes: registraram-se os piores para o grupo III, em que, de um total de 14
39
espécimes, 12 obtiveram escore zero na formação do osso; os melhores desempenhos foram
observados nos grupos I e II, com escore parcial para a maioria dos espécimes
(DUPOIRIEUX et al. 1999).
Membranas reabsorvíveis fabricadas à base de ácido lático em forma de tubo com
molde de 1,3mm de diâmetro foram testadas, obedecendo-se aos princípios da técnica da
regeneração tecidual guiada, em estrutura nervosa (nervo ciático) de seis ratos Wistar, que
tiveram o nervo ciático bilateralmente exposto e seccionado em 10,0mm com equipamento de
microcirurgia. Do lado direito, o conduto foi suturado entre os dois cotos, formando uma
ponte; o fragmento do nervo do lado direito foi usado como enxerto para o lado esquerdo. A
observação foi feita em um, três e seis meses, em microscopia ótica e eletrônica. Os
resultados não foram funcionalmente significativos para os dois lados. Em um mês, o tecido
continha células de Schwann e axônio, com perda de tecido conjuntivo; em três meses, ao
redor do tubo, havia pequena reação de corpo estranho, sinais de fragmentação das paredes do
tubo, e o nervo dentro do lúmen continha axônios mielinizados e não mielinizados; em seis
meses, o conduto tinha sofrido degradação, apresentando tecido nervoso bem organizado com
axônios mielinizados e não mielinizados. No lado esquerdo (controle), após seis meses, houve
regeneração de axônios mielinizados e não mielinizados, além de células de Schwann e tecido
conjuntivo com sinais de fibrose. Concluiu-se que o conduto pode ser um substituto de
enxerto na regeneração de nervo (GIARDINO et al., 1999).
O efeito osteocondutivo do chitosan, um polissacarídeo reabsorvível e
biocompatível, foi testado, assim como o efeito das propriedades físicas e reações do tecido
conjuntivo ao chitosan associado à hidroxiapatita (HA). Constituiu-se uma pasta nas
proporções de 0,2g; 3,0g; 4,0g e 5,0g de HA para 11,0g de chitosan, que foi transformada em
membranas de 1,5mm de espessura, 3,0mm de comprimento e 7,0mm de largura. Pedaços
dessas membranas foram hidratadas e postas em tecido conjuntivo subcutâneo da calvária de
40
ratos Sprague-Dawley, que foram sacrificados em uma, duas, três, quatro e oito semanas. As
peças foram processadas e coradas com hematoxilina-eosina, e o exame histológico revelou
inicial encapsulamento por tecido de granulação que tinha maturado dentro do tecido
conjuntivo fibroso. Áreas ocasionais de osteogênese foram observadas com formação
periosteal de osso, estendendo-se dentro do tecido conjuntivo que rodeia a membrana.
Constatou-se degradação parcial da membrana, principalmente nos espécimes de maior
concentração de HA, e, nas áreas de degradação, partículas foram fagocitadas pelos
macrófagos e células gigantes multinucleadas. Nos animais do grupo controle, comprovou-se
ocasional osteogênese periosteal. Concluiu-se que a membrana foi bem tolerada
biologicamente com encapsulação fibrosa e que o aumento da HA parece aumentar a
degradação da membrana (ITO et al., 1999).
O chitosan e os chitooligômeros têm a capacidade de estimular várias células
enquanto são fosforilados e incorporados aos componentes da matriz extracelular (MEC),
como o condroitino sulfato. O processo de cura favorece esses materiais na ativação e
produção de citocinas pelos macrófagos e fibroblastos, ativação da angiogênese, ação
antiinflamatória, formação de tecido de granulação e formação da cicatriz (MUZZARELLI et
al., 1999).
Com o objetivo de conhecer a influência do coágulo sangüíneo no auxílio da cura
de defeito ósseo, foram estudados defeitos de 0,8mm, na calvária de ratos Wistar isogênicos
adultos, por meio de câmaras oclusivas de titânio. As câmaras tinham forma de
paralelepípedo, medindo 5,0mm x 4,0mm x 3,0mm (comprimento, largura e altura,
respectivamente) com um lado aberto. Os animais foram divididos em três grupos: no grupo I,
foram feitas perfurações na calvária e sobre elas foram colocadas as câmaras; no grupo II, as
câmaras foram colocadas sobre os ossos dos animais sem perfurações e sem sangue
periférico; no grupo III, sobre as perfurações foram colocadas as câmaras e sangue periférico.
41
Os animais foram sacrificados em 4, 8 e 16 semanas, e as peças processadas por aparelho
especial para realização da histomorfometria. Os resultados evidenciaram que, em quatro
semanas, os grupos com perfuração e sangue periférico (I e III) apresentaram formação de
novo osso em maior quantidade, mas não foi estatisticamente significativa se comparados
entre si, embora, na comparação do grupo III com o controle, o aumento ósseo tenha sido
significativo. Em todos os grupos, inclusive no controle, foram observados três tipos de
tecidos: uma camada de tecido ósseo lamelar, uma zona de tecido altamente vascular não
mineralizada e uma camada de novo tecido ósseo do tipo trabecular com bordos internos
compostos por células cubóides. Depois de oito semanas, foi evidente o aumento da
quantidade de osso nos grupos I e III, sendo neste último em maior quantidade, com resultado
considerado significativo. O osso predominante na oitava semana foi do tipo trabecular,
embora presente o osso lamelar e uma camada de tecido conjuntivo altamente vascularizado.
Na décima sexta semana, os resultados no grupo III foram significativamente mais efetivos do
que nos demais grupos, com predominância de osso lamelar (ROMPEN et al., 1999).
Uma pesquisa de Slotte e Lundgren (1999), com a finalidade de testar o aumento
vertical de osso através do efeito quantitativo e qualitativo do osso bovino mineralizado como
adjunto para a técnica da regeneração tecidual guiada, destacou a importância do espaço na
obtenção do volume de osso e apontou para o uso de material sintético como uma alternativa
para conseguir este espaço. Foi utilizado um aparelho de silicone em forma de abóbada
medindo 10,0mm de comprimento por 2,0mm de altura e espaço interno de 3,6mm, com o
teto do aparelho preparado para receber barreiras de diversas porosidades, embora a barreira
empregada no trabalho tenha sido do tipo impermeável. O aparelho foi fixado na calvária de
ratos Sprague-Dawley sobre uma área óssea com quatro orifícios de 0,5mm cada, abertos com
um molde fixado por parafusos. No grupo teste, o aparelho foi preenchido com partículas de
osso bovino descalcificado (Bio-Oss) e fechado, assim como no grupo controle, sem o uso,
42
porém, dessas partículas. Os animais foram sacrificados depois de oito semanas, as peças
descalcificadas, coradas por Ehrlich HTX-eosina e analisadas em microscópio acoplado a
computador, medindo-se em milímetros: a altura e o total da área, a área mineralizada e a não
mineralizada, a área remanescente do Bio-Oss e o número de novos vasos sangüíneos.
Constatou-se a formação de osso sem inflamação e sem células gigantes em todos os
espécimes. No grupo controle, a formação óssea foi mais uniforme e mais próxima do osso
remanescente, enquanto, no grupo teste, o osso foi mais heterogêneo e substancialmente
aumentado; no grupo teste, o novo osso estava mais afastado do osso remanescente e, no
controle, estava mais próximo. Os resultados confirmaram as propriedades necessárias ao
osso substituto (ser biocompatível com os tecidos, ser condutivo para a produção de matriz,
contribuir para a estabilidade da membrana, ser reabsorvível com o tempo), mas os autores do
experimento sugeriram que a interpretação dos resultados deveria ser absorvida com cautela.
Um estudo de Dupoirieux, Neves e Pourquier (2000) versou sobre o efeito
potencial de preenchimento de espaço em combinação com a técnica da RTG, usando o pó da
casca de ovo como preenchimento e o periósteo como proteção do espaço. Em ratos Wistar
pesando entre 250g e 300g foram realizadas incisões na calvária, no músculo e no periósteo,
disjuncionados para a criação de defeitos ósseos esféricos de 6,0mm. O lado parietal esquerdo
foi usado como o controle e deixado vazio (grupo I). O lado parietal direito foi o
experimental, dividido em dois grupos (II e III): no grupo II, foi colocada uma membrana
interna e outra externa de politetrafluoretileno expandido (PTFEe) e, entre elas, um fragmento
de 1,0cm x 1,0cm de periósteo proveniente da calvária dos animais; no grupo III, foi colocado
pó de casca de ovo de 400µm a 600µm entre as membranas. Os animais foram sacrificados
aos 15, 30 e 90 dias para radiografia da calvária e processos laboratoriais e de coloração. Foi
avaliada a ocorrência de inflamação caracterizada pela presença de infiltrado
polimorfonuclear ou células gigantes. A avaliação da regeneração do osso foi feita por
43
método semiquantitativo com escores de 0 a 2, como segue: 0 = nenhum ou mínimo osso com
tecido fibroso; 1 = cura limitada do osso com ocasional tecido fibroso; 2 = completa cura do
osso ligando o defeito. Aos 15 dias, nenhuma ou limitada quantidade de osso foram
identificadas nos grupos I e II, subentendendo-se que, no grupo II, o espaço entre as duas
membranas foi preenchido por tecido conjuntivo frouxo altamente vascularizado. Aos 30 dias,
pouco osso se formou entre as membranas nos grupos II e III, mas, no grupo I, houve três
espécimes com parcial formação de osso. Aos 90 dias, foi possível observar, no grupo
controle, três espécimes com completa formação de osso; no grupo II, somente em um
espécime o defeito apresentou preenchimento parcial de osso, e o grupo III obteve o grau zero
(pouco ou nenhum osso), adquirindo tecido fibroso rodeando as partículas e presença de
poucas células gigantes. Nenhuma reação inflamatória foi observada nos grupos. Os autores
revelaram sua surpresa diante da não formação de osso no grupo do periósteo, considerando
que o periósteo da tíbia é mais osteogênico do que o da calvária, e concordaram com muitos
autores que atribuíram à membrana a função de formar um espaço para o coágulo,
favorecendo o ambiente para as células osteogênicas.
Para revelar o tecido conjuntivo fibroso neoformado nos tecidos próximos aos
implantes, Gehrke, Walboomers e Jansen (2000) utilizaram o método de coloração de van
Gieson, método que discrimina o tecido conjuntivo novo do velho. A escala de graduação
histológica como resposta da zona de reação para o tecido mole ao redor do implante foi a
seguinte: 4 = cápsula de tecido fibroso, maduro, não denso lembrando tecido conjuntivo ou
tecido gorduroso dentro da região não lesada; 3 = cápsula de tecido fibroso porém imaturo,
mostrando pouco fibroblasto e pouco colágeno; 2 = cápsula de tecido conjuntivo granuloso e
denso, contendo fibroblastos e muitas células inflamatórias; 1 = cápsula que consiste de
massas de células inflamatórias com pouco ou nenhum sinal de organização do tecido
conjuntivo; 0 = não pode ser avaliado por causa de infecção ou outros fatores não
44
necessariamente relacionados com o material. Os autores estudaram o efeito do fator de
crescimento transformador beta (TFG β) e concluíram que macrófagos ativados
desempenham papel crítico na cura de feridas. Essas células aceleram a transição da fase de
inflamação para a de granulação, e nessa fase os macrófagos recrutam fibroblastos.
Foram criados defeitos nos ossos alveolares de cães e fechados com
politetrafluoretileno (PTFE), e os animais foram sacrificados quatro semanas depois do
processo cirúrgico. Utilizou-se um procedimento para identificar proteínas morfogenética 2 e
4 e anticorpo policlonal para colágeno I e III, sialoproteína, biglican e decorin e outros
componentes da matriz extracelular. Os resultados revelaram a presença de colágeno I como o
mais abundante dentro do defeito ósseo em cura e do colágeno tipo III no tecido conjuntivo
fora do defeito criado; a coloração para proteína morfogenética foi fraca e para a sialoproteína
foi forte na área de regeneração óssea e cemento. Concluiu-se que o quadro de
imunolocalização das macromoléculas na matriz sugere uma heterogeneidade da população
celular, que, preenchendo a ferida na regeneração tecidual guiada (RTG), estabelece um
ambiente para a regeneração periodontal (IVANOVSKI et al., 2000).
Kibe, Takenaba e Kishimoto (2000) estudaram a presença de fator de crescimento
de fibroblasto básico (FGF-b) na cura de feridas de pele no animal Rattus e concluíram que os
macrófagos desempenham papel importante na produção do FGF-b, nas fases inflamatória,
proliferativa e no estágio de remodelação.
Testando uma membrana não absorvível que substituísse a membrana absorvível e
examinando os fatores que influenciariam no tamanho crítico para a técnica da regeneração
tecidual guiada, Lim, Lee e Yeo (2000) criaram defeitos de 8,0mm na calvária de ratos e
implantaram no seu interior diversos materiais, entre eles o osso seco desmineralizado
(DFDB). Sobre os defeitos foram colocadas membranas dos tipos absorvíveis e não
absorvíveis. Os melhores resultados foram obtidos com os defeitos preenchidos com osso
45
desmineralizado e seco coberto por membrana não reabsorvível. Na análise histoquímica, os
macrófagos recrutados foram envolvidos parcialmente na diminuição do osso regenerado.
Comprovou-se, assim, a importância da barreira física sobre o defeito, suprimindo a
infiltração do colágeno.
Em comentário ao artigo de Dupoirieux, Neves e Pourquier (2000) acima citado,
Linde (2000) ocupou-se da importância dos poros da membrana sobre a ancoragem do
coágulo no processo de regeneração do osso e na existência do espaço para estabilização do
coágulo e da membrana, discutindo o papel das plaquetas e das moléculas de adesão. Abordou
também a biodegradabilidade das membranas, o papel das membranas de colágeno como
entregadoras de drogas e a relação entre osteointegração e membrana, que, diferentemente do
ligamento periodontal, exige, naquela, a anquilose óssea sobre o implante.
Com vistas a um modelo para a regeneração tecidual guiada em maxila,
investigou-se o efeito da membrana no novo osso formado, bem como o novo osso após a
remoção da membrana. O estudo foi realizado em ratos da linhagem Wistar, que tiveram os
primeiros e segundos molares superiores removidos e cicatrizados os tecidos. Após um mês,
procedeu-se a um corte do terceiro molar até o incisivo, levantou-se o retalho e criou-se um
defeito ósseo 0,5mm de profundidade por 2,5mm de comprimento e 1,0mm de largura; uma
membrana de 4,0mm x 5,0mm foi colocada no defeito ósseo do lado direito, o que não
ocorreu do lado esquerdo, tomado como controle. Após quatro semanas, alguns animais do
grupo com membrana tiveram as mesmas retiradas e foram sacrificados em uma, quatro e oito
semanas depois da retirada, enquanto os demais foram sacrificados em uma, duas, quatro, oito
e doze semanas. Os resultados cirúrgicos revelaram cura completa um mês após a extração
dos dentes. No grupo controle, após o segundo ato cirúrgico, havia, em quatro semanas, novo
osso trabecular com menores espaços e osso esponjoso no fundo do defeito; em oito semanas,
os defeitos foram completamente fechados com formação de novo osso lamelar, semelhante
46
ao observado nos animais com a membrana. No grupo em que a membrana foi removida
quatro semanas depois da criação dos defeitos, havia osso maduro com espessas trabéculas e
formação de osso do lado da membrana. No lado do experimento, a comparação entre o lado
com membrana e aquele onde a membrana foi retirada mostrou que o osso trabecular foi
maior no lado com membrana. Ao final de oito semanas, observou-se que a espessura do osso
formado era maior no lado em que se retirou a membrana, enquanto aquele em que ela foi
mantida apresentou reabsorção óssea. Concluiu-se que a aplicação da membrana é vantajosa
até quatro semanas da sua colocação, mas sua permanência por longo tempo induz ao
aumento dos espaços medulares do novo osso formado e, ainda, que a retirada da membrana
de politetrafluoretileno (PTFE) no tempo adequado promove a corticalização e a maturação
do novo osso formado (OHNISHI et al., 2000).
Membranas do tipo biodegradável feitas de polilactídeo com poros, às quais foi
adicionada tetraciclina, em razão de seu fator antimicrobiano e sua ação anticolagenolítica,
foram aplicadas na calvária de ratos. As membranas mantiveram-se íntegras por quatro
semanas e permitiram a formação de osso e de células, de modo que os defeitos foram
curados em duas semanas (PARK et al., 2000).
A biocompatibilidade de esferas de alginato e a liberação de fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF), relacionadas à angiogênese, foram testadas em tecido conjuntivo
de Rattus, partindo-se do pressuposto de que esse fator de crescimento, além de provocar a
proliferação de vasos, é também quimiotático para macrófagos. Analisada a formação de
vasos nas áreas das microesferas de alginato a uma distância de zero a 600µm, o tecido em
volta do produto não apresentou inflamação, evidenciando que essas esferas foram
biocompatíveis e que foram competentes na entrega do VEGF, permitindo a formação de
novos vasos em níveis significativamente maiores do que no grupo controle (ELÇIN; DIXIT;
GITNICK, 2001).
47
Reportando-se às três fases da cura de feridas: a inflamatória, que compreende a
aguda (característica de neutrófilos) seguida da crônica (característica de linfócitos e
macrófagos); a proliferativa (que consta de fibroblastos, vasos, linfócitos e ocorre em quatro
dias); a de remodelação, Hung e outros (2001) analisaram a resposta de ferimentos de 1,5cm x
1,5cm, criados no dorso de Rattus, a uma membrana fabricada de sacchachitin (produto
natural), procederam ao estudo histológico e ao imunoensaio, além de testar a sua
citotoxicidade através da proliferação celular pela técnica que usa o 3-(4-5 dimethylthiazol-2-
yl)-2-5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT). As fotomicrografias com 400x de aumento
mostraram a presença de linfócitos e neutrófilos nas primeiras 24 horas, o que permitiu
concluir que o material empregado acelera a inflamação, auxiliando na cura, como mostraram
as medições clínicas das feridas.
A biocompatibilidade de fios de sutura inseridos em tecido conjuntivo subcutâneo
de Rattus foi testada em quatro grupos de cinco animais, que foram sacrificados nos tempos
de 48 horas, 7, 14 e 21 dias. Foram analisadas a inflamação, a taxa fibroblástica, a
proliferação angioblástica e a presença e intensidade de tecido fibroso, sendo-lhes atribuídos
os seguintes escores: 0 = ausente, 1 = pequena, 2 = moderada, 3 = severa, aplicando-se o teste
estatístico de Friedman. Os resultados revelaram resposta agressiva do tecido para o fio de
sutura fabricado de politetrafluoretileno, com persistência de neutrófilos até o final do
experimento. A resposta fibroblástica e angioblástica foi similar entre os materiais estudados.
O tecido adjacente ao politetrafluoretileno mostrou pouca organização e perda de fibras
colágenas. Também foi observada a resposta tecidual relativa ao infiltrado inflamatório
mononuclear, infiltrado inflamatório polimorfonuclear, proliferação fibroblástica e fibrose,
não tendo sido possível especificar se no infiltrado mononuclear havia linfócitos e macrófagos
ou somente uma dessas células. Concluiu-se que um bom material deve mostrar um breve
exsudato inflamatório, para não interferir na proliferação celular e organização do tecido
48
conjuntivo, e que é indesejável a presença de neutrófilos além dos primeiros dias da
inflamação (NARY FILHO et al., 2002).
A biocompatibilidade de implantes de titânio em tecido subcutâneo de Rattus foi
avaliada através da resposta inflamatória local. A análise inflamatória foi feita nos tempos de
um, dois, três e quatro semanas, usando-se microscopia de luz, em cortes corados por
hematoxilina-eosina e por imunoistoquímica. As secções coradas foram analisadas quanto à
espessura da cápsula e celularidade. Em cada espécime, foi medida a densidade celular de
granulócitos, macrófagos, linfócitos, células gigantes de corpo estranho e fibroblastos. O
número de cada tipo de célula foi identificado e processado por dois pesquisadores, e foi
expresso em gráficos. A comparação entre o número de células feita para cada espécime foi
expressa em unidades arbitrárias (ua) de zero a 5, como segue: 0 = células não observadas; 1
= baixo número de células; 2 = algumas células; 3 = muitas células; 5 = número relativamente
alto de células. A espessura da cápsula foi medida dez vezes em cada espécime em todo o
tecido de granulação próximo ao implante. Imagens foram digitalizadas por lente 2,5 (1 pixel-
6,81µm) no microscópio de luz e analisadas usando-se software específico com dois
operadores medindo a cápsula. O colágeno identificado em imunoistoquímica foi medido
conforme os mesmos parâmetros (LEHLE et al., 2004).
Próteses vasculares de diâmetros diversos foram implantadas na aorta de Rattus
para verificar a microporosidade de estruturas de poliuretano em comparação com outros
materiais como o politetrafluoretileno. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina, e
foi verificada a quantidade de colágeno e sua presença com microscopia eletrônica de
varredura. O estudo objetivou examinar a formação de endotélio vascular na área de
implantação do produto e concluiu-se que as próteses de poliuretano com poros de 30µm
aceleraram a formação de células semelhantes às endoteliais (ZHANG et al., 2004).
49
Partindo-se do conhecido princípio de que fibras porosas com menor diâmetro
permitem resposta tecidual sem encapsulação, diferentemente dos materiais com outro tipo de
arquitetura, avaliou-se a densidade celular e seu crescimento dentro do tecido fibroso formado
nas adjacências do material, usando-se cilindros de Teflon revestidos com quatro tipos de
materiais e com fibras de 5,8µm e poros com 64,9µm de diâmetro e 0,2mm de espessura. Os
materiais foram o hexafluorpropileno neutro, o N,N dimetilaminoetil- positivamente
carregado e o ácido metacril- negativamente carregado; o Teflon não coberto serviu para o
controle. Quatro desses cilindros foram implantados na pele de 16 ratos Sprague-Dawley.
Para diminuir o trauma antes da incisão, a pele foi inflada com ar de uma seringa de 10cc.
Depois de cinco semanas, os animais foram sacrificados, e o tecido removido para preparação
em parafina e coloração com hematoxilina-eosina. Realizou-se a análise quantitativa para
identificar a presença de cápsula fibrosa e a densidade de núcleos dentro da rede de fibras. A
densidade celular foi medida através de áreas de 46µm x 46µm x 5µm, comportando o
número obtido de células dividido pela área, usando-se oito imagens de cada região e
contando-se os núcleos das células em cada foto obtida. A densidade foi medida em número
de núcleos por unidade de volume. O número de vasos foi contado nas fotos em cada
representante dos espécimes (oito). A área da fibra foi subtraída para se obter a área do tecido,
e a densidade dos núcleos celulares representou o número de núcleos por unidade de volume.
Os resultados revelaram semelhança qualitativa entre as membranas e nenhuma das amostras
formou cápsula de tecido fibroso, apresentando densidade nuclear normal em todos os grupos
(1,73 núcleos por 5000µm
3
). Não houve diferença estatisticamente significativa entre o
número de vasos nas amostras, mas as áreas do ácido metacrilato tenderam a apresentar mais
vasos. Não houve estímulo para a proliferação de fibroblastos. Concluiu-se que os diâmetros
estabelecidos para os poros e fibras permitiram resposta tecidual sem encapsulação e que a
50
carga negativa apresentada às amostras influenciou no crescimento vascular (SANDERS et
al., 2005).
2.4 RESPOSTA IMUNE ATRAVÉS DE CITOCINAS
E FATORES DE CRESCIMENTO
Estudando os fluidos de lesões, Chen, Rogers e Lyndon (1992) esclarecem que,
para a manutenção das reações vasculares, estão presentes nos tecidos vários mediadores da
inflamação advindos de plaquetas, linfócitos, neutrófilos, macrófagos e de outras células.
Em artigo de revisão, Feliciani, Gupta e Sauder (1996) listaram as células
produtoras de várias citocinas. A interleucina-10 (IL-10), que é uma inibidora da proliferação
de células T, inclusive as células Th1 e Th2, é produzida por queratinócitos e outras células e
também por macrófagos e células B, tendo recebido anteriormente o nome de citocina
inibidora de síntese (CSIF). Os queratinócitos produzem também fator de crescimento
derivado de plaqueta (PDGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). As citocinas
expressadas pelos queratinócitos agem rapidamente, uma vez que eles estão nas zonas
próximas às da ferida.
A cura de uma ferida se processa em três estágios: ao inflamatório segue-se o
proliferativo, que envolve a proliferação de fibroblastos, os queratinócitos e sua migração, as
células endoteliais, a formação de tecido de granulação, a reepitelização; e, finalmente, ocorre
a remodelação. Os macrófagos chegam no primeiro dia do processo e permanecem além da
fase inflamatória. Eles expressam interleucina-12 (IL-12), interleucina-1beta (IL-1 β), fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α), que são estimulantes para proliferação e quimiotaxia de
fibroblastos e queratinócitos. Pesquisando-se o processo de cura, foram feitas feridas de
6,0mm no dorso de camundongos, examinado-as nos tempos de 7, 15 e 24 horas, três e cinco
51
dias com excisão de pele e panniculus carnosus, servindo o tecido para extração de ácido
ribonucléico (RNA), para imunoistoquímica com fluorescência direta e para IL-1 α e β.
Registrou-se a presença de TNF-α e de IL-1 α e β no tecido dos camundongos poucas horas
depois da ferida operatória, e os macrófagos e neutrófilos foram as células mais importantes
como fonte dessas citocinas. Doze horas após a lesão, foram detectados altos níveis de ácido
ribonucléico mensageiro (mRNA) para IL-1 α, supondo-se que os neutrófilos tenham sido as
células produtoras, a considerar a morfologia do núcleo. No tempo de cinco dias, foi
detectado mRNA para IL-1 β em áreas de poucos neutrófilos, originando-se essa citocina
certamente de macrófagos; quando, porém, os mesmos procedimentos foram aplicados em
animais usando-se corticóides, os níveis daquelas citocinas foram baixos ou menores. Assim,
mRNA para IL-1α, β e TNF-α foi expresso poucas horas depois da lesão na pele, e o
neutrófilo foi a principal célula responsável por sua expressão, destacando-se que essa seria
uma nova função para os neutrófilos nos estágios iniciais das lesões. Somente nos estágios
mais avançados (reparação) é que os macrófagos foram predominantes na produção de IL-1 β
(HUBNER et al., 1996).
Em inflamação crônica da gengiva (periodontite) manifestou-se a presença de
imunoglobulina G, macrófagos e outras células. As células identificadas por citometria de
fluxo foram compostas de TCD4+ num percentual de 20% a 30% . Para a análise das
citocinas, o ácido ribonucléico (RNA) foi extraído e feito PCR-RT, usando-se primers para
interferon gama (IFN-γ), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5),
interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) e outras. A resposta mais forte foi produzida
pelas células Th2, o que contribuiu para a indução de uma resposta alta de célula B no local
da doença. Por outro lado, a perda de IL-4 pode ser responsável pelo acúmulo de macrófagos
(YAMAMOTO et al., 1997).
52
Em artigo de revisão, Schaffer e Barbul (1998) ressaltaram que os mecanismos da
defesa inata ou inespecífica envolvem polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos, basófilos),
fagócitos mononucleares (macrófagos), células assassinas naturais ou NK (do inglês natural
killer) e produtos da ativação do complemento. A defesa imune específica inclui a formação
de anticorpo pelas células B, destruição de microorganismos pelas células TCD8 e ativação de
linfócitos TCD4 pelos macrófagos. A resposta imune que se segue a uma lesão é
primeiramente inata, incluindo a barreira da pele e mucosa e a via do complemento ativado
espontaneamente no plasma. Os elementos celulares incluem os macrófagos, neutrófilos,
células NK e células endoteliais. Os mediadores químicos e histaminas produzidos incluem
fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), fator
ativador de plaquetas (PAF), cininas (bradicininas, serotonina) e superóxido de hidrogênio.
Danos nos tecidos por material estranho podem desencadear proteínas do complemento como
C5a, C3a, que são ativadores da permeabilidade capilar. Os macrófagos e as células
dendríticas são as de primeira linha na defesa e produzem, dentre outros, TNF-α, IL-1, IL-6,
interleucina-8 (IL-8), interleucina-12 (IL-12) e interferon gama (IFN-γ). Na resposta celular,
os macrófagos são apresentadores de antígenos às células T, ingerem antígenos e expressam
MHC de classe II. Os linfócitos desempenham papel modulador na cura da ferida, embora a
ordem completa dos eventos ainda não esteja completamente apreendida. Histologicamente,
um número significativo de linfócitos T aparece em feridas de Rattus no quinto dia, com pico
no sétimo. Os autores discutem diversos experimentos, nos quais a adição de hormônios e
outros produtos estimuladores do timo resultaram no aumento da deposição de colágeno em
feridas, sugerindo que os linfócitos podem modificar passos importantes na cura de feridas.
Também em artigo de revisão, Kurzer, Erika e Kurzer (1999) referiram-se ao
importante papel dos linfócitos na cura das feridas, produzindo interferon gama (IFN-γ), fator
de crescimento transformador beta (TGF-β), citocinas participantes da estimulação e
53
regulação dos fibroblastos e células endoteliais, e destacaram que alterações na presença de
colágeno têm sido creditadas à diminuição do número de linfócitos.
Rosenberg e Gallin (1999) classificaram a inflamação em aguda e crônica. A
aguda se caracteriza como uma resposta que dura de minutos a dias, relativamente uniforme,
com aumento de fluidos nos tecidos, proteínas plasmáticas e neutrófilos; da resposta
inflamatória participam ainda linfócitos, plaquetas, células endoteliais e outras células.
Considerando-se que os neutrófilos são células fagocitárias profissionais de bactérias,
entende-se a sua participação no processo de reparação tecidual, e a participação das enzimas
elastases e gelatinases nos processos que incluem a destruição de microorganismos. Os
elementos ou corpos estranhos de qualquer natureza seriam os agentes causais da inflamação
aguda. Por outro lado, a inflamação crônica se caracteriza como uma resposta de duração
longa, dela participando macrófagos, linfócitos, fibroblastos e células endoteliais vasculares.
As células TDC8+ e macrófagos são produtoras de interleucina-10 (IL-10), peptídio que inibe
a produção de citocinas inflamatórias e inibe a apresentação de antígenos. Importantes são os
fibroblastos e as células endoteliais, que se dividem criando nova matriz tecidual para
restaurar a função. A formação de novos vasos se relaciona com fatores de crescimento, como
fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento queratinócito (KGF), fator de
crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Os
autores listaram como fatores da inflamação as bactérias, os vírus, os parasitas, os corpos
estranhos exógenos e os endógenos; e como células produtoras de interferon gama (IFN-γ), os
linfócitos TCD4 (Th1), TCD8 e células assassinas naturais (NK).
O processo de diferenciação da célula T auxiliar ou T helper (Th) é regulado por
citocinas. A depender das citocinas que secreta, apresenta-se sob dois tipos. O linfócito Th1
secreta interleucina-2 (IL-2), interferon gama e linfotoxina beta que medeiam funções críticas
pró-inflamatórias para o desenvolvimento celular na resposta imune. As células Th2 secretam
54
interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5) e interleucina-10 (IL-10), que aumentam a
imunidade humoral. Estudos em camundongos com deficiência de citocina celular T receptor
(TCCR) sugeriram sua participação na menor produção de IFN-γ, aumentando nesses animais
a susceptibilidade à infecção. Concluiu-se que há uma nova citocina receptora crítica para a
geração de células, a Th1, envolvida na regulação da resposta imune adaptativa (CHEN et al.,
2000).
Em artigo de revisão, Hunt, Hopf e Hussain (2000) esclarecem que o processo de
cura de uma ferida tem quatro momentos: coagulação, inflamação, migração-proliferação
celular e remodelação Destacaram a presença dos fatores de crescimento e outros produtos
derivados da coagulação, tais como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o
fator ativador de plaquetas (FAP), o fator de crescimento transformador alfa e beta (TGF-α e
TGF-β), o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) e o fator de crescimento
epidérmico derivado de plaquetas (PDEGP), que são mitogênicos para fibroblastos e
quimiotáticos para neutrófilos e macrófagos. As plaquetas são entregadoras de trombina
capacitada a agir sobre o fibrinogênio transformando-o em fibrina, responsável para formar
uma plataforma a serviço do deslocamento e povoamento das células, além de entregadora de
vasodilatadores, como as prostaglandinas. Os neutrófilos e os monócitos/macrófagos são as
células do processo inflamatório que participam da fagocitose de restos celulares, restos da
degradação dos tecidos e de microorganismos (se houver), além da liberação de produtos para
a ativação de queratinócitos e fibroblastos. Os macrófagos produzem interleucina-1 (IL-1),
fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fator de crescimento de fibroblasto básico e ácido
(FGF-b e FGF-a), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento
epidérmico (EGF), responsáveis pelo estímulo e proliferação de fibroblastos e células
endoteliais. No processo de migração e proliferação, células como os macrófagos e linfócitos
estão presentes, mas os fibroblastos e as células endoteliais são predominantes. Na
55
epitelização, os queratinócitos começam a migrar horas após a lesão ser instalada,
expressando fator de crescimento queratinócito (KGF), que é angiogênico, FGF-b e VEGF,
auxiliados pelas células epiteliais dos folículos pilosos e pela contração da ferida produzida
pelos miofibroblastos. Na fibroplasia, os fibroblastos produzem colágeno e proteoglicanos,
para a formação de uma nova matriz extracelular ativados por PDGF e EGF. Os fibroblastos
produzem fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF) e fator de crescimento
queratinócito (KGF), que é angiogênico. Os fibroblastos produzem proteases, que ajudam a
dissolver os tecidos não vitais, e a fibrina, que facilita a remodelação, um dos estágios do
processo da cura que resulta da troca da composição da matriz. Dentre os eventos destaca-se a
orientação das fibras antes pouco orientadas e a formação dos cross-linking com aumento da
espessura das fibras. A angiogênese é importante no processo de cura, e dificilmente se
completaria na ausência da proliferação vascular para ofertar os diversos produtos necessários
às células. Os estímulos para a angiogênese, VEGF, KGF, FGF-β, TGF-α, são ofertados pelos
macrófagos e por queratinócitos resultantes das baixas concentrações de oxigênio e altas taxas
de lactatos. Os autores enfatizam o papel dos fibroblastos formando uma plataforma para o
espalhamento dos vasos e salientam que os macrófagos produzem interferon gama (IFN-γ).
A produção de interleucina-18 (IL-18) e interferon gama (IFN-γ) foi observada
em camundongos normais e diabéticos em processos normais de reparação de feridas através
de estudos histológicos, imunoistoquímicos, análise em Western Blot, enzimaimunoensaio
(ELISA), provas de Cdna, ensaio para o isolamento de ácido ribonucléico (RNA) e cultura de
células para avaliar o sobrenadante. A IL-18, um potente estímulo para a diferenciação de
células Th1 e para a produção de IFN-γ por essas células, foi detectada até o sétimo dia, mas
já no terceiro dia iniciou-se seu declínio. A despeito das taxas de IL-18 encontradas,
surpreendentemente não foi detectado IFN-γ, concluindo-se que possivelmente a IL-18 tenha
sido produzida na forma não madura (KAMPFER et al., 2000).
56
Dada a importância da interleucina-10 (IL-10) no controle negativo da produção
de interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8), citocinas pró-inflamatórias, utilizou-se a pele
de feto de camundongos transgênicos Balb-c deficiente em IL-10 e camundongos normais
Balb-c, que foi enxertada em adultos não transgênicos deficientes em IL-10 e adultos Balb-c
normais. Os camundongos normais que tiveram a sua pele retirada apresentaram uma
reparação com regeneração, e os animais transgênicos, uma reparação com formação de
cicatriz. Os animais normais que receberam a pele por enxerto tiveram uma resposta com
mínima inflamação e poucas células positivas para CD45 na análise imunoistoquímica. Os
animais deficientes em IL-10 que receberam a pele apresentaram alto grau de inflamação e
altos níveis de CD45 na análise imunoistoquímica. Concluiu-se que a pequena inflamação dos
animais normais que receberam enxerto e dos que curaram com regeneração deveu-se à IL-
10, forte inibidor da inflamação (LIECHTY et al., 2000).
Lim, Lee e Yeo (2000) pesquisaram um material que fosse capaz de substituir a
membrana absorvível por uma membrana não absorvível e também fatores capazes de
influenciar no tamanho crítico para a técnica da regeneração tecidual guiada. Para tanto, na
calvária de ratos foram criados defeitos de 8,0mm e implantados no seu interior diversos
materiais, dentre eles osso seco desmineralizado (DFDB), e os defeitos foram cobertos por
membranas dos tipos absorvível e não absorvível. Os resultados mais positivos foram obtidos
nos defeitos preenchidos com DFDB e cobertos por membranas não absorvíveis. Comprovou-
se a participação de macrófagos na diminuição do osso regenerado e a importância da barreira
física sobre o defeito, que suprimiu a infiltração do colágeno.
Levings e Roncarolo (2000) explicitaram o importante papel das citocinas na
qualidade da resposta dos tecidos a antígenos exógenos e que há dois tipos de células T: as
Th1, produtoras principais de interferon gama (IFN-γ), e as Th2, produtoras de interleucina-4
(IL-4), interleucina-13 (IL-13) e interleucina-15 (IL-15). As células Th2 são responsáveis pelo
57
aumento da resposta imune mediada por anticorpos, enquanto as Th1 promovem a resposta
mediada por células. Explicitaram também que recentemente tem sido reconhecido um
subtipo de células com a habilidade de produzir altos níveis de interleucina-10 (IL-10), essa
capaz de inibir fortemente a produção de citocinas inflamatórias pelos macrófagos,
interleucina-1 alfa (IL-1 α), interleucina-1 beta (IL-1 β), interleucina-6 (IL-6) e fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α). Essa nova classe de célula, chamada célula T regulatória um
(Tr1), além de produtora de altos níveis de IL-10, produz também níveis significativos de
IFN-γ, mas não de IL-4 e IL-2, capazes de inibir a ativação de células T virgens.
Em artigo de revisão, Oberholzer, Oberholzer e Moldawer (2000) trataram a
resposta inata como um sistema integrado de múltiplos órgãos que não somente combate a
infecção, mas atua diminuindo a lesão dos tecidos e a morte de células. A resposta imune
promove o restabelecimento do hospedeiro e reduz a infecção secundária ou oportunista nos
tecidos vizinhos à área lesada. Do sistema inato fazem parte o sistema de complemento, a
barreira física das células epiteliais, as substâncias químicas, as células e componentes do
sangue, os fluidos do corpo, as células residentes dos tecidos como os macrófagos, além de
neutrófilos e das células NK. O sistema imune inato assume, portanto, importante papel
protetor ao hospedeiro, servindo também para iniciar a resposta imune específica. As
citocinas fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6)
parecem desempenhar papel mais importante e são produzidas pelos macrófagos. A IL-6 é
produzida pelos macrófagos e fibroblastos e células endoteliais vasculares em resposta à IL-1.
A IL-1 é produzida por queratinócitos e fibroblastos. Os autores indicaram que a IL-10 é
supressora da função de macrófagos, expressada por células Th2 e macrófagos. Quanto às
citocinas, há três tipos de interferon: o produzido por macrófagos, o interferon alfa (IFNα); o
produzido por fibroblastos (IFNβ); e o IFN-γ produzido por células Th1, células NK e TCD8.
Os interferons aumentam o potencial lítico das células NK, e as células TCD8+ produzem
58
IFN-γ em resposta à interleucina- 12 (IL-12) que os macrófagos produzem; além disso, o IFN-
γ é mitógeno para as células TCD8+.
Tonnesen, Feng e Clark (2000) esclareceram que, quatro dias depois da lesão, tem
início a formação de novo estroma, e os macrófagos fornecem as citocinas e fatores de
crescimento para o processo de angiogênese e fibroplasia. O fator de crescimento fibroblasto
ácido e básico (FGF a, b) são angiogênicos. O fator de crescimento transformador beta (TGF-
β) estimula os macrófagos a produzirem o FGF, que age nos primeiros três dias. Do quarto dia
em diante, os macrófagos produzem fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) que dá
continuidade à angiogênese, e nesse período os capilares invadem a fibrina. Na ferida, a
fibrina persiste por mais ou menos oito dias e é substituída por fibronectina, hialuronatos e,
somente depois, os colágenos I e III a substituem, acumulando-se nas áreas a partir da
segunda semana.
A resposta inflamatória é uma reação imunológica a bactérias cujo papel é:
oferecer moléculas e células aos sítios de inflamação para ajudar os macrófagos na defesa do
organismo; proporcionar barreira física para prevenir a propagação da infecção; e promover
reparo dos tecidos danificados (papel não imunológico). As primeiras células a ocupar as
áreas inflamadas são os neutrófilos, seguidos pelos monócitos, que se transformam em
macrófagos, e, nas últimas etapas, os eosinófilos e linfócitos. Os macrófagos produzem de
imediato prostaglandinas e fator ativador de plaquetas (PAF) e também fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α), que é ativador de células endoteliais. Nos processos de combate aos
vírus, as células liberam os interferons. O interferon gama (IFN-γ), produzido por células
TCD8, induz as células assassinas naturais (NK) a produzirem essa citocina, ao tempo que as
estimulam a se tornarem mais líticas contra células portadoras de vírus ou células tumorais. O
IFN-γ é a principal citocina ativadora de macrófagos. A interleucina-12 (IL-12), produzida
59
por macrófagos, é uma citocina que estimula as células NK para produzirem IFN-γ
(JANEWAY et al., 2001).
O sistema imune mediado por célula depende da ativação de linfócito T do tipo
Th1, produzindo interferon gama e interleucina-2 (IL-2), contrariamente à célula Th2, que
produz interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5) e interleucina-10 (IL-10), que estão
envolvidas com a resposta imune humoral. O aumento da neopterina (componente excretado
pela urina e presente em certas doenças) pode ser atribuído ao aumento de células Th1 e de
interferon gama (IFN-γ) e IL-2, regulando negativamente o número de células Th2 e a
produção de imunoglobulina E (IgE) (LEDOCHOWSKI et al., 2001).
60
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a biocompatibilidade da membrana fibrosa da casca de ovo em Rattus
norvegicus albinus.
3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO
Investigar a natureza da resposta imune, considerando a infiltração linfocitária, os
macrófagos, a citocina IL-10 e o IFN-γ, bem como os aspectos histológicos de incorporação
ou rejeição da membrana fibrosa da casca de ovo.
3.3 JUSTIFICATIVA
Os processos que envolvem a redução de massa óssea representam fatores
limitantes aos procedimentos para os implantes dentários e tratamentos cirúrgicos de doenças
do periodonto de inserção. Para contornar esses problemas na técnica da regeneração tecidual
guiada têm sido usados enxertos de membranas ósseas, não ósseas e de outros materiais, para
evitar a absorção de osso original, ou para permitir a sua regeneração. No presente estudo, a
membrana fibrosa da casca de ovo foi usada como enxerto, servindo como membrana ou
barreira por se tratar de material de fácil obtenção e baixo custo.
61
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 PREPARO DA MEMBRANA
Ovos da Gallinea galli gallus domestica foram limpos com água e sabão, lavados
em uma solução de hipoclorito de sódio a 0,5%, postos em vasilhame de vidro e mantidos em
fluxo laminar por 20 minutos. Após esse tempo, a casca foi quebrada suavemente num dos
pólos para a remoção do conteúdo interno e limpeza com água destilada. A membrana fibrosa
interna da casca de ovo (MFCO) foi removida manualmente, cortada em pedaços de 3,0cm e
processada por quatro diferentes procedimentos. A membrana do tipo “a”, depois de lavada
diversas vezes com água destilada, foi dobrada, secada e inserida em envelopes previamente
esterilizados. A membrana do tipo “b” foi dobrada, imersa em uma solução de álcool a 70º
por duas horas, renovada a cada 30 minutos, lavada com água destilada nos intervalos, secada
e inserida em pacotes estéreis para esterilização em autoclave (Validator Plus-Siemens,
Germany - program 3) conforme OLIVEIRA (2001) modificado. A membrana do tipo “c”,
depois de lavada com água destilada, foi lavada novamente em solução fisiológica com pH
7,4 (previamente esterilizada); em seguida, foi imersa em solução de glutaraldeído a 0,5%
(Áster Produtos Médicos Ltda - Sorocaba-SP) em tampão fosfato pH 7,4, trocada duas vezes
nas primeiras 12 horas e mantida a 10
o
C pelo tempo de 15 dias. Depois desse tempo, usando-
se o fluxo laminar, a membrana foi dobrada, imersa em solução fisiológica por 15 minutos,
secada e posta em pacotes estéreis para esterilização em autoclave, conforme PINTO e
colaboradores (1993), modificado. A membrana do tipo “d” recebeu o mesmo procedimento
da do tipo “c”, mas não foi esterilizada em autoclave. Os aspectos macroscópicos e
microscópicos das membranas são vistos nas Figuras 1 a 4 e 5 a 8.
62
Figuras 1 a 4 - Membrana fibrosa da casca de ovo
Figura 1 - Fotografia do aspecto macroscópico da membrana do tipo “a” preparada em condições
estéreis
Figura 2 - Fotografia do aspecto macroscópico da membrana do tipo “b” esterilizada em pacotes
plásticos
Figura 3 - Fotografia do aspecto macroscópico da membrana do tipo “c” preparada com glutaraldeído
a 0,5% e esterilizada em autoclave
Figura 4 - Fotografia do aspecto macroscópico da membrana do tipo “d” preparada com glutaraldeído
a 0,5% e não esterilizada em autoclave
Figuras 5 a 8 - Membrana fibrosa da casca de ovo
Figura 5 - Fotomicrografia da membrana preparada em condições estéreis usando-se lavagens com
água destilada, montadas com bálsamo do Canadá, não coradas. Aumento original: 400x
Figura 6 - Fotomicrografia da membrana preparada com lavagens em água e álcool, esterilizadas em
autoclave, não coradas, montadas em bálsamo do Canadá. Aumento original: 400x
Figura 7- Fotomicrografia da membrana preparada com glutaraldeído a 0,5%, esterilizada em
autoclave, não corada, montada em bálsamo do Canadá. Aumento original: 400x
Figura 8- Fotomicrografia da membrana preparada com glutaraldeído a 0,5%, não esterilizada em
autoclave, não corada e montada em bálsamo do Canadá. Aumento original: 400x
63
64
4.2 ANIMAIS
Foram utilizados 125 Rattus norvegicus albinus, da linhagem Wistar, machos,
com idade entre dois e três meses, adultos, pesando 180-250g, procedentes do biotério do
Laboratório de Neurociências do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da
Bahia (UFBA) e alojados no Instituto de Ciências da Saúde da UFBA, onde tiveram 15 dias
para adaptação. Os animais foram confinados em gaiolas, em ambiente com iluminação 12
horas claro/12 horas escuro, sem ruído, mas sem controle de umidade. Alimentação comercial
e água foram fornecidas ad libitum.
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os 125 ratos foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos como segue, e um
animal serviu ao fornecimento de fibroblastos para a cultura primária de células.
Grupo 1, grupo controle (C) - constituído de dez animais não manipulados para as
análises histológicas do tecido conjuntivo do panniculus carnosus (1CS) e do tecido muscular
(1CM).
Grupo 2, grupo experimental (E) - constituído de dez animais nos quais foram
implantadas membranas do tipo “a” no panniculus carnosus (2ES).
Grupo 3 - constituído de 60 animais nos quais foram implantadas membranas do
tipo “b”. O grupo foi dividido em tempos pós-cirúrgicos e os animais serviram aos subgrupos
experimental e sham usando-se o tecido conjuntivo e muscular:
• Grupo 3 A - vinte e quatro horas: 3AES - experimental conjuntivo; 3AShS -
sham conjuntivo; 3AEM - experimental muscular; 3AShM - sham muscular.
65
• Grupo 3B - uma semana: 3BES - experimental conjuntivo; 3BShS - sham
conjuntivo; 3BEM - experimental muscular; 3BShM - sham muscular.
• Grupo 3C - duas semanas: 3CES - experimental conjuntivo; 3CShS - sham
conjuntivo; 3CEM - experimental muscular; 3CShM - sham muscular.
• Grupo 3D - três semanas: 3DES - experimental conjuntivo; 3DShS - sham
conjuntivo; 3DEM - experimental muscular; 3DShM - sham muscular.
• Grupo 3E - dez semanas: 3EES - experimental conjuntivo; 3EShS - sham
conjuntivo.
• Grupo 3F - doze semanas: 3FES - experimental conjuntivo; 3FShS - sham
conjuntivo; 3FEM - experimental muscular; 3FShM - sham muscular.
Grupos 4 e 5 - constituídos de 40 animais nos quais foram implantadas
membranas dos tipos “c” e “d”, respectivamente. Os grupos foram divididos em tempos pós-
cirúrgicos, servindo ao grupo experimental para o tecido conjuntivo:
• Grupos 4 e 5 - uma semana: 4AES e 5AES - experimentais tecido conjuntivo.
• Grupos 4 e 5 - duas semanas: 4BES e 5BES - experimentais tecido conjuntivo.
• Grupos 4 e 5 - três semanas: 4CES e 5CES - experimentais tecido conjuntivo.
• Grupos 4 e 5 - oito semanas: 4DES e 5DES - experimentais tecido conjuntivo.
• Grupo 6 - constituído de cinco animais submetidos à implantação, no
panniculus carnosus, da membrana do tipo “c”, na região dorsocefálica, e da
membrana do tipo “d”, na região dorsocaudal, no tempo de uma semana.
As Figuras 101 a 106 mostram os grupos controle, experimental e sham, as áreas
de trabalho e os tipos de membranas utilizados. No total de animais apresentados não estão
incluídos quatro outros que foram perdidos e substituídos.
4.4 ETAPAS EXPERIMENTAIS - PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
66
As etapas experimentais pré-operatório, ato operatório e pós-operatório foram
conduzidas como se segue:
Pré-operatório - A alimentação dos animais foi suspensa 12 horas antes da
anestesia e do ato operatório, mantendo-se água ad libitum. A anestesia aplicada associou o
uso de hidrocloridrato de cetamina (cetamina) e cloridrato de tiazina (xilazina) nas dosagens
de 100,0mg/kg e 5,0mg/kg, respectivamente (BARTEE; CARR, 1995), em injeção
intramuscular na coxa da perna traseira esquerda.
Ato operatório - Para os grupos 1 e 3 (experimental, controle e sham), cada animal
foi posto na posição operatória decúbito ventral e dorsal lateral direito e esquerdo. Os pêlos da
região dorsal e faces mediais das coxas foram tricotomizados em área de 10,0cm x 7,0cm de
altura e largura, respectivamente. Foi feita antissepsia com álcool iodado a 2,0% antes do
acesso ao tecido conjuntivo do panniculus carnosus, realizado através de incisões de 2,0cm na
área dorsocefálica e dorsocaudal, no sentido sagital do animal. Com o auxílio de uma espátula
de inserção, procedeu-se à divulsão até o conjuntivo do panniculus carnosus, onde foi
colocada uma membrana de MFCO quadrangular de 1,5cm, dobrada em duas partes, em cada
espaço criado. O retalho foi posto de volta e suturado com fio de náilon 3-0 (Tecnofio,
Goiânia-Brasil) em ponto simples. A seguir, com o animal em decúbito dorsal lateral direito,
após antissepsia da face interna da coxa da perna traseira direita com álcool iodado, foi feita
uma incisão de 2,0cm na pele; o tecido foi disjuncionado até o músculo, e este foi cortado no
sentido transversal ao longo eixo, onde foi interposta uma membrana de MFCO de 1,5cm. A
pele foi reposta e suturada com fio de náilon 3-0 (Tecnofio, Goiânia-Brasil) em ponto
simples. Os animais não receberam antibióticos e foram identificados com cortes nas orelhas.
Para o grupo sham, igual procedimento foi realizado sem a colocação da membrana de
MFCO, e os procedimentos cirúrgicos foram conduzidos em condições estéreis em decúbito
dorsal lateral esquerdo. Para os grupos 2, 4, 5 e 6, os procedimentos cirúrgicos,
67
corresponderam aos descritos para o ato operatório no dorso do animal, com duas incisões
para os grupos 4, 5 e 6 e uma para o grupo 2. Em todos os animais a eutanásia foi realizada
com éter, precedida de anestesia com xilazina-cetamina na dose previamente citada. As
Figuras 9 a 14 ilustram o procedimento cirúrgico.
Pós-operatório - Todos os animais foram acompanhados e observados até a
eutanásia, que foi realizada conforme descrito acima com uso do éter etílico em câmara
fechada, precedido de anestesia com cetamina-xilazina. As peças de tecidos foram colocadas
em formol a 10,0% em solução tamponada.
4.5 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
4.5.1 Estudo da membrana em microscopia de luz
e microscopia eletrônica de varredura
Para o estudo da membrana em microscopia eletrônica de varredura, foram usadas
as membranas dos tipos “a”, “b”, “c”, e “d”. Pedaços de aproximadamente 1,5cm de diâmetro
foram cortados e fixados em um suporte para metalização com ouro, no aparelho SCD 04
Metal Gold (Germany). Depois da metalização, as amostras fixadas em suporte foram lidas e
fotografadas no aparelho LEO 1430 VP (Carl Zeiss, Germany), no Laboratório de Pesquisa
em Microbiologia (LAPEM) do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade
Estadual de Feira de Santana (UEFS).
Para o estudo em microscopia de luz, pedaços das membranas de
aproximadamente 1,5cm, conforme os quatro tipos de preparação, foram montados em
lâminas, protegidos com lamínulas, fixados com bálsamo do Canadá e examinados em 400x
de aumento.
68
69
Figuras 9 a 14 - Procedimentos cirúrgicos
Figura 9 - Fotografia da preparação com raspagem do pêlo do animal na região dorsal
Figura 10 - Fotografia das incisões dorsocefálica e dorsocaudal no animal
Figura 11 - Fotografia da incisão no tecido conjuntivo da região dorsocefálica do animal
Figura 12 - Fotografia da incisão e implantação da membrana na região dorsocefálica do animal
Figura 13 - Fotografia da incisão e sutura em ponto simples depois de implantada a membrana no
tecido conjuntivo do animal
Figura 14 -Fotografia da ferida cirúrgica na perna do animal depois de implantada a membrana no
tecido muscular e suturada em ponto simples
70
71
4.5.2 Estudo da resposta histológica à membrana em microscopia de luz
As peças previamente fixadas em solução de formol tamponado a 10,0% foram
processadas no Serviço de Anatomia Patológica da União Metropolitana de Educação e
Cultura (UNIME). Foram emblocadas em parafina, cortadas em micrótomo, obtidas secções
de 5µ de espessura, aderidas em lâminas para preparação histológica e coradas por
hematoxilina-eosina. O estudo histológico da densidade vascular foi feito de acordo com
Elçin e colaboradores (2001), modificado, estabelecendo-se a contagem de capilares e vasos
sanguíneos em vinte campos de cada espécime em áreas de 4 x 10
2
µm
2
. Assim, cada vaso
e/ou capilar ao redor da membrana foi contado. Foi comparada a média dos vasos e/ou
capilares observados nos cortes histológicos dos grupos experimentais, controle e sham. A
avaliação histológica da biocompatibilidade foi feita usando-se o método de Sewell (apud
MOLEA et al., 2000). O protocolo é descrito a seguir:
1) Com uma ocular micrometrada foi avaliado o tamanho da resposta inflamatória
ao redor da membrana, para oferecer medidas relativas à irritação do tecido. O diâmetro da
reação inflamatória foi determinado pela medida da distância da margem da membrana que
atravessa a neovascularização. Foi calculada a média do tamanho para cada linha. Esses
diâmetros foram transferidos para uma graduação de 1 a 8 (Quadro 1).
2) O tipo predominante de célula envolvida na resposta inflamatória reconhecida
pela microscopia de luz foi considerado para cada espécime tecidual. A média contada por
campo de imersão foi determinada para cada tipo (neutrófilo, eosinófilo, macrófago, célula
gigante, linfócito, fibroblasto). Foram considerados dez campos de observação, e a média dos
valores obtidos foi então calculada para cada tipo celular. Uma graduação de 1 a 8 foi
transformada com base em um número médio de células por campo para cada material
(Quadro 2).
72
3) A densidade celular total foi avaliada em dez campos de observação das laterais
da membrana com lente de alto aumento (400x) e foi atribuída uma média de valores de 1 a 8
graus. Ao diâmetro da reação inflamatória, aos vários tipos de células e à densidade celular
total foi então atribuído um fator de peso (Quadro 3). Esses fatores foram multiplicados pelos
graus transferidos de cada parâmetro. Os valores obtidos foram adicionados para cima,
chegando-se a um escore final (S), indicativo da reação do tecido a cada membrana. As taxas
relativas foram transferidas para o escore de reação (S) dentro do limite reportado no Quadro
4.
Quadro 1 - Graduação do diâmetro da reação tecidual
Diâmetro da reação inflamatória Graduação
0,01-0,25 1
0,26-0,35 2
0,36- 0,50 3
0,51-1,0 4
1,1-2,0 5
2,1-3,0 6
3,1-4,0 7
Acima de 4,1 8
Quadro 2 - Graduação da celularidade
Células por campo de imersão Graduação
1-5 1
6-15 2
16-20 3
21-35 4
36-50 5
51-100 6
101-150 7
Acima de 150 8
73
Quadro 3 - Parâmetros histológicos e fatores de peso
Tipo celular Graduação
Diâmetro da reação inflamatória 5
Neutrófilos 6
Eosinófilos 2
Linfócitos 2
Células gigantes 2
Fibroblastos 1
Macrófagos (histiócitos) 1
Completa densidade celular 3
Quadro 4 - Qualidade da reação tecidual
Escore (S) Reação tecidual
0-16 Muito leve
17-32 Leve
33-48 Leve a moderada
49-64 Moderada
65-80 Moderada a satisfatória
81-96 Satisfatória
97-113 Satisfatória a severa
Acima de 113 Severa
4.5.3 Avaliação do colágeno total pela coloração Picrossírius
As peças previamente fixadas em solução de formal tamponado a 10% foram
processadas no Serviço de Anatomia Patológica da União Metropolitana de Educação e
Cultura (UNIME). Foram emblocadas em parafina, cortadas em micrótomo, obtidas
secções de 5µ de espessura e aderidas em lâminas para preparação histológica. No Serviço
de Anatomia Patológica do Hospital Universitário Prof. Edgar Santos (Hospital das
Clínicas) da Universidade Federal da Bahia, as lâminas foram coradas, usando-se solução
de Sírius Red (Sírius Red F3B 2000, Mobay Chemicol., Union, NJ-USA) a 0,1%,
dissolvida em ácido pícrico aquoso saturado. Após a lavagem em água corrente, os
74
materiais histológicos foram contracorados com hematoxilina-eosina e as lâminas
montadas para leitura.
4.5.4 Ensaio imunoenzimático (ELISA de captura)
Cinco ratos foram anestesiadas e operados conforme descrição anterior e
colocados, no tecido conjuntivo de cada um deles, fragmentos de membrana medindo
1,5cm, uma do tipo “c”, na região dorsocefálica, e uma do tipo “d”, na região dorsocaudal.
As membranas foram preparadas conforme descrição do item 4.1. Uma semana depois, os
animais foram anestesiados, e dois retalhos, um deles contendo a membrana do tipo “c”, e
o outro a do tipo “d”, foram removidos e postos em quatro dobras de gaze esterilizadas e
levados para o fluxo laminar. Para cada espécime, o operador usou luvas cirúrgicas
estéreis, lâmina de bisturi e todos os materiais esterilizados; e assim procedeu ao corte da
cápsula fibrosa formada, de onde foi removida a MFCO com uma pinça e imediatamente
imersa num tubo Falcon de 15,0mL. Com uma pipeta automática adicionou-se 2,0mL de
PBS previamente esterilizado e procedeu-se a movimentos por um tempo aproximado de
três minutos, após o que, o líquido foi transferido para um Eppendorf e centrifugado por
seis minutos a 3.000rpm. De volta ao fluxo laminar, o sobrenadante (1,8mL) foi aspirado,
alicotado e estocado a -20
o
C (conforme COONEY et al., 1997), modificado, e usado para
dosagem de IL-10 .
Para o ensaio imunoenzimático foi usado o kit R&D
. IL-10 de rato-Elisa
Sandwich: placas de Elisa não sensibilizadas de alta ligação, pipetas automáticas de 100µl
e 200µl, pipeta multicanal, leitora de Elisa, água deionizada, PBS filtrado (137mM NaCl,
2,7mM KCl, 8,1mM Na
2
HPO
4
, 1,5mM KH
2
PO
4
, pH7.2-7.4, 0,2µM); tampão de lavagem:
0,05% Tween 20 em PBS pH a 7,2-7,4; tampão de bloqueio: BSA (soro albumina bovino)
a 1,0%, sucrose a 5,0% em PBS com NaN
3
a 0,05%; diluente reagente: BSA 1,0% em
75
PBS, pH 7,2-7,4, 0,2mM filtrado; solução de substrato: reagente A adicionado ao reagente
(Tetrametilbenzidina) 1:1; solução stop: 2NH
2
SO
4
.
O diluente reagente foi preparado com BSA (soro albumina bovino) a 1% e
PBS filtrado pH 7,2 a 7,4, 0,2mM para 1,0 litro, obtendo-se 10,0g de BSA para 1000mL de
PBS filtrado. O anticorpo de captura é o anticorpo de camundongo anti-IL-10
(cc=720µg/mL) reconstituído com 1,0mL de PBS filtrado, aliquotado e estocado a 2-8ºC
negativos para uso imediato. Uma alíquota mãe foi diluída para 4µg/mL em PBS filtrado e
usada imediatamente, obtendo-se 5,5µl da solução mãe adicionados 994,5µl de PBS
filtrado. Para o preenchimento de 96 poços foram necessários 55µl da solução mãe para
produzir 10mL da segunda solução de cc de 4µg/ml, de que foram usados 100µl/poço. O
PBS filtrado foi preparado com a adição de 137mM NaCl - 8g/l, 2,7mM de KCl - 0,2g/l,
8,1mM de Na2HPO4 - 1,15g/l, 1,5mM de KHPO4 - 0,2g/l, em um litro de água deionizada
a 50ºC ou 60ºC, pH 7,2-7,4. O tampão de lavagem foi obtido adicionando-se 1,0 litro de
PBS filtrado e 500µl de Tween 20, homogeneizado em Vortex com agitador magnético. O
tampão de bloqueio foi obtido pelo uso de PBS filtrado adicionado a 5,0% de sucrose e
BSA a 1,0%, usando-se 30,0mL por placa. O anticorpo de detecção (anticorpo de cabra
anti IL-10 (cc=18µg/mL), reconstituído com 1,0mL de diluente-reagente-solução mãe e a
solução de trabalho diluída para 100ng/mL. Foram usados então 56µl da solução mãe, mais
10,0mL do diluente reagente. A streptoavidina para uma placa foi diluída a 1:200 (50µl da
solução mãe mais 10mL de diluente reagente). A placa foi sensibilizada adicionando-se em
cada poço 100µl de anticorpo de captura, foi coberta e incubada overnight à temperatura
ambiente. No dia posterior, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem (300µl
/poço) e, em seguida, bloqueada com 300µl/poço de tampão de bloqueio e incubada por
uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, foi lavada três vezes com tampão de
lavagem, ficando, assim, pronta para uso. Procedeu-se ao preparo da curva padrão que
76
segue com a reconstituição da solução mãe (cc= 55ng/mL) com 0,5mL de diluente
reagente. Foram alicotados para uso 100µl dessa solução mãe. Em seguida, procedeu-se à
diluição seriada, produzindo-se uma segunda solução mãe com cc=10000pg/mL (181µl de
solução mãe em 819µl de diluente reagente), em tubos numerados de 1 a 6, resultando nas
respectivas diluições:
Tubo 1 = 10000pg/mL - solução produzida.
Tubo 2 = 2000pg/mL - 200µl da solução mãe mais 800µl de diluente reagente.
Tubo 3 = 500pg/mL - 50µl da solução mãe mais 950µl de diluente reagente.
Tubo 4 = 250pg/mL - 25µl da solução mãe mais 975µl de diluente reagente.
Tubo 5 = 100pg/mL - 10µl da solução mãe mais 990µl de diluente reagente.
Tubo 6 = 50pg/mL - 5µl da solução mãe mais 995µl de diluente reagente.
Para a dosagem das amostras foi usada a placa previamente sensibilizada,
adicionando-se em seus poços 100µl dos padrões, brancos e amostras. No primeiro poço,
foi adicionado o branco feito com PBS comum; no segundo e terceiro poços, foi
adicionado meio RPMI 1640 puro. Os padrões foram pipetados em duplicata em ordem
crescente de concentrações, e pipetadas também as amostras. A placa foi coberta e isolada
com fita adesiva e incubada por duas horas em temperatura ambiente e depois lavada três
vezes com solução de lavagem usando-se 300µl/poço. Em seguida, foi adicionado em cada
poço o anticorpo de detecção (anticorpo cabra anti-IL-10), 100µl/poço. A placa foi coberta
e selada com fita adesiva e incubada por mais duas horas à temperatura ambiente. Depois
desse tempo, foi lavada três vezes com solução de lavagem (300µl/poço) e, a seguir, foram
adicionados 100µl/poço do conjugado de estreptoavidina, e a placa foi coberta e incubada à
temperatura ambiente por 20 minutos. A placa foi, então, lavada três vezes com
300µl/poço de tampão de lavagem e foram adicionados 100µl/poço de substrato, incubada
77
à temperatura ambiente por 20 minutos, no escuro. Por último, foram adicionados em cada
poço 50µl de solução de H
2
SO
4
a 2N (solução stop). A leitura da densidade óptica
realizou-se no aparelho ELX 800 Universal Microplate Reader (Bio Tek Instruments,
USA), ajustado para um comprimento de onda de 450nm.
4.5.5 Cultura primária para fibroblastos e ensaio MTT (estudo piloto)
A cultura primária de fibroblastos foi feita como segue:
1) Um Rattus norvegicus albinus foi anestesiado e implantada no seu dorso uma
MFCO do tipo “d” medindo 1,5cm x 1,5cm, como descrito anteriormente.
2) Depois de dez dias, o animal foi anestesiado e, em fluxo laminar, foi removido
um fragmento de pele, posto em uma gaze esterilizada com o tecido conjuntivo para cima,
dentro de uma de placa de Petri esterilizada. A placa coberta foi transferida para um outro
fluxo laminar no qual a cápsula fibrosa em volta da membrana foi removida com tesoura e
posta em uma outra placa de Petri com meio de cultura.
3) O tecido removido foi cortado em dez fragmentos de 3,0mm, que foram
inseridos em frascos de cultura (cinco fragmentos em cada frasco). A seguir, foram
adicionandos 3,0ml de meio RPMI 1640 em cada um deles. Os frascos foram postos em
estufa de cultura.
4) O crescimento celular foi acompanhado.
O ensaio MTT foi feito como segue, tendo-se procedido de acordo com
Mosmann (1983), modificado:
1) Em placa de cultura de 24 poços, foi colocado em cada poço 1,0mL de meio de
cultura contendo 3 x 105 células de rim de macaco MA104. Cada experimento foi feito em
quadruplicata, e em duplicata os poços contendo meio de cultura e células.
78
2) Em cada duplicata de poços, correspondente aos poços A1-B1, A2-B2, A3-B3,
A4-B4, foi adicionada uma membrana de 5,0mm x 5,0mm dos tipos “a”, “b”, “c”, “d”,
respectivamente, e, nos demais poços, foi adicionado somente o meio de cultura com as
células. Uma hora depois, foram adicionadas aos poços, em duplicata, 1C-1D, 2C-2D, 3C-3D,
4C-4D, membranas dos tipos “a”, “b”, “c”, “d”, respectivamente. Na coluna 5A, foi colocado
1,0mL de meio e adicionada uma esfera de acrílico de 2,0mm de diâmetro; na 5B, foram
colocados 1,0mL meio de cultura e células; na 5C, foi adicionado 1,0mL de meio de cultura,
células e um fragmento de acrílico; e na 5D, foi adicionado somente 1ml de meio de cultura
com célula.
3) A placa foi posta em estufa a 37ºC e 5% de CO2 pelo tempo de 36 horas.
4) Após esse período, o meio de cultura foi removido e adicionados 800µl de novo
meio de cultura/poço acrescidos de 200µl de 3-(4-5 dimethylthiazol-2-yl)-2-5 diphenyl
tetrazolium bromide (MTT) preparado na proporção de 5mg de MTT (MTT- M2128- Sigma,
Germany) para 1,0mL de PBS. O MTT foi filtrado e esterilizado previamente.
5) A placa foi colocada de volta à estufa e mantida por quatro horas. Depois desse
tempo, o meio foi removido e a ele adicionados 1000µl de isopropanol ácido a 0,04N/poço
nas fileiras A e B e 1000µl de SDS a 20%, por poço, nas fileiras C e D. Nos poços 5A e 5B,
depois de removido o meio de cultura anterior com o MTT, foram adicionados 1000µl de
isopropanol ácido a 0,04N/poço. Nos poços 5C e 5D, depois do mesmo procedimento, foram
adicionados 1000µl de SDS a 20% e procedeu-se a exaustiva homogeneização, para dissolver
os cristais de formazan, deixando-se a balançar por 20 minutos.
6) Depois de 20 minutos, 100µl do conteúdo foram transferidos para poços de
uma placa de ELISA. A leitura da densidade óptica foi feita com comprimento de onda
630nm e calibração 1,99 no aparelho Microplate Reader Bio-Rad, modelo 550.
79
4.5.6 Estudo imunoistoquímico
As peças de tecido foram processadas no Serviço de Anatomia Patológica da
União Metropolitana de Educação e Cultura (UNIME) e previamente fixadas em formol
tamponado a 10,0%. Foram emblocadas em parafina, cortadas em micrótomo, e obtidas
secções de 4µ de espessura, aderidas em lâminas previamente limpas em solução
sulfocrômica e tratadas com poly-L-lisina (Sigma Diagnostic) para evitar o
desprendimento dos cortes durante as reações. As lâminas foram incubadas em estufa a
37ºC para fixação dos cortes por 24 horas. Neste estudo foi utilizada a técnica da
estreptoavidina peroxidase para evidenciação do interferon gama (IFN-γ).
Quadro 5 - Especicificidade, concentração e fonte dos anticorpos usados na imunoistoquímica
Anticorpo Clone Especificidade
Dilui
ção
Fonte
Anti-IFN-γ.
Monoclonal
Interferon γ
1:100
R&D System
Abingdon-UK
Anticorpo secundário
LSAB
K0690
System HRP
DAKO
Citomation
Anticorpo secundário
e conjugado
LSAB
K0679
System H RP
DAKO
Citomation
DAB K3466
Chromogen
System
DAKO
Citomation
4.5.6.1 Procedimento para imunoistoquímica
As seções histológicas foram desparafinizadas em dois banhos de xilol, durante
cinco minutos cada, desidratadas em dois banhos de álcool absoluto por três minutos e, então,
hidratadas em água corrente e posteriormente estabilizadas em tampão PBS.
Para a identificação da citocina, as lâminas foram desparafinizadas e a peroxidase
endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 10,0% (H
2
O
2
) por 20 minutos,
80
desprezada, e com nova solução por mais 10 minutos. Após a lavagem com água corrente, a
recuperação antigênica foi realizada usando-se pronase na proporção de 100mg/100mL de
PBS (Sigma Diagnostic), por dez minutos, em temperatura ambiente. As ligações
inespecíficas foram inibidas com leite desnatado a 10,0% em PBS por 20 minutos.
Após esses procedimentos, as lâminas foram incubadas overnight com o anticorpo
primário, anti-IFN-γ diluído em PBS, atendendo-se às especificações do Quadro 5. A reação
foi seguida através de incubações com anticorpo secundário anti-IgG de coelho biotinilado
ligado a estreptoavidina peroxidase e revelação com DAB (3’3’ diaminobenzidina - DAKO),
segundo o procedimento que segue:
1) Os espécimes foram desparafinizados em xilol por cinco minutos, e a operação
foi repetida com novo xilol pelo mesmo tempo. O xilol foi removido dos espécimes através de
dois banhos de álcool absoluto pelo tempo de três minutos cada.
2) Os espécimes foram lavados em água corrente (três a cinco banhos).
3) A inibição da peroxidase endógena foi feita com imersão dos espécimes em
peróxido de hidrogênio a 10% (H
2
O
2
) pelo tempo de 25 minutos. A operação foi repetida com
novo H
2
O
2
pelo tempo de dez minutos.
4) Os espécimes foram lavados em água corrente (três a cinco banhos).
5) Procedeu-se à recuperação antigênica, incubando-se os espécimes com
Pronase-Sigma Diagnostic (100mg/100mL de PBS 0,15M, pH 7,5) pelo tempo de dez
minutos em temperatura ambiente.
6) Os espécimes foram lavados em água corrente (três a cinco banhos).
7) O bloqueio das ligações inespecíficas foi feito com leite desnatado diluído em
PBS 0,15M, pH 7,2 pelo tempo de 20 minutos.
8) Os espécimes foram lavados com PBS Tween 0,15M pH 7,5 (três banhos),
mantidos em PBS Tween, 0,15M pH 7,5 por cinco minutos.
81
9) Aos espécimes foi adicionado o anticorpo primário, e foram incubados
overnight, em câmara úmida, 100µl/corte. A diluição foi de 1/100.
10) Os espécimes foram lavados com PBS Tween 0,15M pH 7,5 e mantidos em
nova solução de PBS Tween 0,15M pH 7,5 por cinco minutos.
11) Em cada espécime foram vertidos 100µl/espécime do anticorpo biotinilado
(kit Dako), e eles foram mantidos em câmara úmida na estufa a 30ºC pelo tempo de 25
minutos.
12) Os espécimes foram lavados com PBS Tween 0,15M pH 7,5 e mantidos em
nova solução de PBS Tween 0,15M pH 7,5 por cinco minutos.
13) Em cada espécime foram vertidos 100µl/espécime de streptoavidina (kit
Dako), e eles foram mantidos em câmara úmida na estufa a 30ºC pelo tempo de 25 minutos.
14) Os espécimes foram lavados uma vez com PBS Tween 0,15M pH 7,5 e
deixados em nova solução de PBS Tween 0,15M pH 7,5 por cinco minutos.
15) A revelação foi feita com DAB (3’3’ diaminobenzidina - Dako)
100µl/espécime (solução 50µ- em 1,0mL de solução de uso - kit Dako). Acompanhou-se a
mudança de cor para marrom.
16) A reação foi interrompida com PBS Tween 0,15M pH 7,5.
17) Os espécimes foram lavados em água corrente (três a cinco banhos).
18) Os espécimes foram contracorados com hematoxilina de Harris filtrada, pelo
tempo de 15 segundos e, em seguida, lavados em água corrente através de três a cinco banhos.
19) Os espécimes foram desidratados em álcool absoluto pelo tempo de três
minutos. A operação foi repetida pelo mesmo tempo.
20) A clarificação dos espécimes foi realizada com xilol pelo tempo de cinco
minutos em duas passagens.
21) As lâminas foram montadas em bálsamo do Canadá.
82
4.5.6.2 Controle da imunorreação
Durante as reações foram utilizados controles positivo e negativo. Como controle
positivo foram utilizadas secções de tecido conjuntivo positivo para linfócitos, submetidos aos
mesmos procedimentos para recuperação antigênica. Como controle negativo o anticorpo
primário foi substituído por PBS. Os demais procedimentos não sofreram alteração.
4.5.6.3 Critérios de avaliação
A citocina IFN-γ foi avaliada de forma semiquantitativa e classificada em quatro
graus: ausente, leve, moderado e intenso. Foram contadas um total de 1000 células, entre
positivas e negativas em 10 campos, ou até completar 1000 células de cada espécime nas
áreas adjacentes às membranas. Foi usado microscópio de luz em objetiva de imersão,
conforme a classificação do grau com o critério que segue:
Ausente ( - ) 0% a 0,99% células positivas
Leve ( + ) 1,0% a 20,0% células positivas
Moderado ( ++ ) 21,0% a 49,0% células positivas
Intenso ( +++ ) > 50% células positivas
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise estatística dos resultados foram usados o teste t de Student, o teste de
Mann-Whitney e o ANOVA.
83
5 RESULTADOS
O exame em microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos quatro tipos de
membranas (“a”, “b”, “c” e “d”) revelou um material composto de uma grande quantidade de
fibras protéicas em uma estrutura em forma de rede. As fibras mostraram, individualmente,
espessura ligeiramente diversa, grandes ramificações e entrecruzamento nas diferentes
direções e sentidos. Algumas fibras pareciam resultar da coalescência de duas ou mais delas, e
sua superfície, individualmente, não estava completamente lisa, repousando sobre elas um
material de forma ovóide ou esférica de variado tamanho. Esse material foi identificado em
menor quantidade sobre as fibras tratadas com glutaraldeído, ou seja, as dos tipos “c” e “d”.
As fibras variaram de espessura entre si e ao longo do seu trajeto na formação da malha ou
rede, emergindo da superfície componentes cilióides curtos. O entrecruzamento das fibras
resultou na formação de espaços de variado formato, diâmetro e profundidade, compondo
túneis e canais que adentraram por toda a estrutura, nos sentidos longitudinal e transversal. As
Figuras 23 a 30 evidenciam essas observações.
O exame em microscopia de luz das membranas dos tipos “a” e “b”, montadas
diretamente em lâminas não coradas e protegidas com lamínulas aderidas com bálsamo do
Canadá, revelou um material de superfície aparentemente uniforme com áreas de aparentes
elevações e depressões de pequeno diâmetro em considerável quantidade, conforme. As
membranas dos tipos “c” e “d”, nas mesmas condições de exame, revelaram uma superfície
de uniformidade aparente, sugerindo a presença de elevações e depressões com diâmetro
maior e em quantidade menor. Todos os quatro tipos de membranas inseridas em parafina,
cortadas transversalmente e coradas por hematoxilina-eosina revelaram, em microscopia de
luz, um material disposto em forma de rede, eosinófilo, com inúmeros espaços ou porosidades
84
de diâmetros diversos, mas semelhantes, como evidenciam as Figuras 15 a 22. Em algumas
das amostras, revelou-se a presença de uma região central densa em forma de linha.
5.1 RESULTADO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
O resultado do ensaio imunoenzimático para interleucina 10 (IL-10) evidenciou a
presença dessa citocina no líquido das feridas colhido em uma semana após a implantação da
membrana dos tipos “c” e “d” no tecido conjuntivo dos animais. Os dados estão no Gráfico 15
em pg/mL.
5.2 RESULTADO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR PELO ENSAIO MTT
A absorção do MTT pelas células e sua transformação em formazan, ocorrida no
tempo de 36 horas, está demonstrada no Gráfico 14 através da leitura da densidade óptica
(DO).
5.3 RESULTADOS HISTOLÓGICOS
5.3.1 Grupo 1
Os resultados histológicos do grupo 1CS, correspondente ao controle (animais não
manipulados), revelaram, no tecido conjuntivo, a presença de uma matriz extracelular
composta de feixes de fibras colágenas espessas e direcionadas paralelamente ao corpo. Os
fibroblastos se distribuíram esparsamente pela matriz extracelular em posicionamento
semelhante às fibras, na grande maioria, enquanto estavam presentes os vasos capilares,
arteríolas e vênulas. Poucos macrófagos residentes foram identificados como indica a
85
Figuras 23 a 30 - Membrana fibrosa da casca de ovo
Figuras 23 e 24 - Microscopia eletrônica de varredura de membrana preparada em condições estéreis
com várias passagens em água destilada (tipo “a”). Aumento original: 2000x e 3000x
Figuras 25 e 26 - Microscopia eletrônica de varredura de membrana preparada em condições estéreis,
com lavagens em água e álcool, esterilizadas em autoclave (tipo “b”). Aumento
original: 2000x e 3000x
Figuras 27 e 28 - Microscopia eletrônica de varredura de membrana preparada com glutaraldeído e
esterilizada em autoclave (tipo “c”). Aumento original: 2000x e 3000x
Figuras 29 e 30 - Microscopia eletrônica de varredura de membrana preparada com glutaraldeído não
esterilizada em autoclave (tipo”d”). Aumento original: 2000x e 3000x
86
87
Figuras 15 a 22 - Membrana fibrosa da casca de ovo
Figura 15 - Fotomicrografia da membrana preparada em glutaraldeído a 0,5%, não esterilizada,
incluída diretamente na parafina, corada por hematoxilina-eosina. Aumento original: 400x
Figura 16 - Fotomicrografia da membrana preparada em glutaraldeído a 0,5%, não esterilizada,
incluída pela técnica da parafina, corada por hematoxilina-eosina. Aumento original: 400x
Figura 17 - Fotomicrografia da membrana preparada em condições estéreis, com lavagens em água e
álcool, esterilizada em autoclave, incluída diretamente na parafina, corada por
hematoxilina-eosina. Aumento original: 400x
Figura 18 - Fotomicrografia da membrana preparada em condições estéreis, com lavagens em álcool e
água, esterilizada em autoclave, processada e corada por hematoxilina-eosina. Aumento
original: 400x
Figura 19 - Fotomicrografia da membrana preparada com glutaraldeído a 0,5%, esterilizada em
autoclave, incluída diretamente na parafina, corada por hematoxilina-eosina. Aumento
original: 400x
Figura 20 - Fotomicrografia da membrana preparada com glutaraldeído a 0,5%, esterilizada em
autoclave processada e corada por hematoxilina-eosina. Aumento original: 400x
Figura 21 - Fotomicrografia da membrana preparada em condições estéreis, com várias passagens em
água destilada, incluída diretamente na parafina, corada por hematoxilina-eosina. Aumento
original: 400x
Figura 22 - Fotomicrografia da membrana preparada em condições estéreis com várias passagens em
água destilada, processada e corada por hematoxilina-eosina. Aumento original: 400x
88
89
normalidade, como mostra o Gráfico 6 através do número médio dessas células. Os Gráficos 1
e 5 evidenciam a densidade média de vasos, e o Gráfico 11, o número médio de fibroblastos e
macrófagos. As informações histológicas descritas estão demonstradas nas Figuras 31 e 32.
No tecido muscular do grupo 1CM, correspondente ao controle, foi identificada a
presença de miócitos com seus núcleos perifericamente distribuídos e suas estrias
transversais. O perimísio mostrou-se composto de fibroblastos esparsamente distribuídos,
adipócitos, alguns poucos macrófagos, mastócitos e o componente fibroso da matriz
extracelular, representado por feixes curtos de fibras colágenas sem orientação definida. Foi
identificada a presença de estruturas típicas do tecido muscular como os vasos capilares,
arteríolas e vênulas, como mostram as Figuras 33 e 34, e a densidade vascular, como expressa
o Gráfico 1.
5.3.2 Grupo 2
No grupo 2, no qual a membrana do tipo “a” foi implantada no tecido conjuntivo
dos animais, a resposta histológica desse tecido revelou, nas adjacências da membrana, duas
zonas contíguas, uma interna e outra externa, que apresentaram variação de espessura num
mesmo espécime e em diferentes espécimes do mesmo grupo. A zona mais próxima da
membrana, a interna, apresentou-se densamente povoada de fibroblastos e macrófagos com
núcleos intensamente corados identificando franca atividade proliferativa. Em algumas áreas
dessa zona, foram identificadas células gigantes aderidas à membrana e alguns poucos focos
de polimorfonucleares neutrófilos. O componente fibroso da matriz extracelular dessa zona
foi representado por feixes de fibras colágenas em fase de organização. A zona externa
mostrou-se com menor quantidade de vasos, povoada de fibroblastos e macrófagos, mas em
menor quantidade do que a zona interna. Os feixes colágenos correram paralelamente à
membrana e ao corpo, bem organizados. A descrição histológica desse grupo se evidencia nas
90
Figuras 35 a 38, e a média da densidade vascular pode ser lida no Gráfico 2 e a dos
fibroblastos, no Gráfico 10.
5.3.3 Grupo 3
O grupo 3AES, representante do tecido conjuntivo na qual foi implantada a
membrana do tipo “b”, com permanência de vinte e quatro horas, revelou histologicamente
nas adjacências a presença de grande quantidade de células do processo imunológico inato,
macrófagos e principalmente os polimorfonucleares neutrófilos, esses em maior concentração
perifericamente à membrana. Os macrófagos apresentaram distribuição uniforme não
privilegiando regiões específicas, embora estivessem em maior quantidade nas áreas
periféricas ao foco principal da inflamação. Nessas áreas e nas proximidades da membrana, os
neutrófilos foram as células de maior representatividade. A densidade das células do processo
inflamatório variou nos diversos espécimes estudados, e foram identificadas grandes áreas de
edema, acúmulo de fibrina e áreas de hemorragia. Poucos foram os fibroblastos presentes
numa matriz extracelular desfigurada, com evidência de lise em seu componente fibroso, mas
com numerosos vasos sanguíneos hiperemiados. Nas Figuras 41 a 46, podem ser observadas
as características histológicas descritas e, nos Gráficos 7 e 8, pode ser lida a média do número
de neutrófilos, macrófagos e fibroblastos.
O 3AShS, no tempo de vinte e quatro horas, revelou nas seções um tecido
conjuntivo ricamente povoado de polimorfonucleares neutrófilos e macrófagos, com
predominância desses na maioria das áreas, embora houvesse variação da densidade dessas
células entre os espécimes estudados, como demonstrado no Gráfico 9. Foi observada uma
matriz extracelular em lise, com feixes colágenos desorganizados, inúmeras áreas de edema,
regiões com depósito de fibrina e áreas de hemorragia. Uma pequena quantidade de
fibroblastos foi identificada, e as células do processo inflamatório não evidenciaram
91
concentração ou organização com inúmeros vasos hiperemiados, conforme características
mostradas nas Figuras 39 e 40.
O grupo 3AEM representou a resposta do tecido muscular à implantação da
membrana do tipo “b” que ficou inserida pelo tempo de vinte e quatro horas. A resposta do
tecido inflamado revelou duas situações: a primeira quando a membrana se inseriu nas fibras
musculares, e outra quando se inseriu no perimísio, localização em que o volume celular
encontrado foi maior do que na primeira, onde a membrana se inseriu entre os miócitos.
Adjacente à membrana, observou-se grande quantidade de polimorfonucleares neutrófilos e
muitos macrófagos em uma matriz extracelular desfigurada com inúmeros espaços que
correspondem às áreas de edema. Poucos foram os fibroblastos presentes, e muitos os vasos
hiperemiados nos campos observados.
O grupo 3AShM, que representou o sham do tecido muscular no tempo de 24
horas, revelou, nas áreas de tecido conjuntivo do músculo correspondente ao perimísio e
epimísio, a presença de grande quantidade de neutrófilos e muitos macrófagos, principalmente
daqueles. No endomísio, havia áreas de maior e menor densidade de células da inflamação
aguda, e os vasos presentes nas áreas estavam hiperemiados, com poucos fibroblastos.
O grupo 3BES, representando o tecido conjuntivo em que foi implantada a
membrana do tipo “b” no tempo de uma semana, revelou, histologicamente, adjacente à
membrana, duas zonas: a interna, densamente povoada de fibroblastos, macrófagos, vasos
sanguíneos neoformados e algumas células gigantes aderidas à membrana, conforme a média
do número dessas células registradas nos Gráficos 3, 7 e 10; e a externa, povoada com menor
número de fibroblastos, macrófagos e vasos; dessas células, os fibroblastos foram maioria
comparados ao número de macrófagos num componente rico em vasos sanguíneos. Em alguns
espécimes se observou em algumas áreas da zona interna a presença de neutrófilos, maior
concentração de macrófagos na zona externa e presença de áreas de edema. A maior parte do
92
Figuras 31 a 38 - Fotomicrografias dos grupos controles dos tecidos conjuntivo e
muscular normais, no tempo imediatamente após o sacrifício e do
grupo experimental com uso da membrana do tipo “a” no tempo de
três semanas
Figuras 31 e 32 - Tecido conjuntivo normal com fibroblastos esparsos, vasos sanguíneos e matriz
extracelular fibrosa (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 33 e 34 - Tecido muscular normal em corte longitudinal, mostrando as fibras musculares, os
núcleos periféricos, o endomísio com fibroblastos e fibras colágenas (H-E, aumento
original: 200x e 400x)
Figuras 35 e 36 - Fotomicrografia do grupo experimental de três semanas, mostrando a membrana do
tipo “a”, denso povoamento de fibroblastos, macrófagos e a identificação das zonas
interna e externa (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 37 e 38 - Detalhes dos fibroblastos e macrófagos
93
94
Figuras 39 a 46 - Fotomicrografias dos grupos sham do tecido conjuntivo experimental com
implantação de membrana fibrosa da casca de ovo (MFCO) do tipo “b” no
tempo de 24 horas
Figuras 39 e 40 - Grupo sham do tecido conjuntivo, mostrando áreas de edema, grande quantidade de
neutrófilos e macrófagos (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 41 e 42 - Grupo experimental do tecido conjuntivo, mostrando áreas de edema, grande
quantidade de neutrófilos e macrófagos adjacentes à membrana (H-E, aumento
original: 200x e 400x)
Figura 43 - Detalhe da Figura 39, grupo sham (H-E, aumento original: 200x)
Figura 44 - Detalhe da Figura 40 (H-E, aumento original: 400x)
Figura 45 - Grupo experimental tecido conjuntivo em 24 horas. Nas adjacências da membrana, grande
quantidade de neutrófilos e macrófagos (H-E, aumento original: 1000x)
Figura 46 - Detalhe da Figura 45
95
96
componente fibroso da matriz extracelular mostrou-se em formação, composta de fibrilas
colágenas sem arranjo e sem organização, porém em poucas áreas foram identificados feixes
organizados e de pouca espessura. A zona externa revelou-se mais espessa do que a interna,
mas ambas apresentaram espessura variada ao longo da membrana de um mesmo espécime e
em diferentes espécimes do mesmo grupo. As Figuras 51 a 54 revelam as características do
referido grupo.
O grupo 3BShS, que representou o sham no tempo de uma semana, revelou um
tecido conjuntivo sediando intensa densidade de fibroblastos, macrófagos, vasos sanguíneos
neoformados, como demonstrado no Gráfico 11, e congestão vascular. A população de
fibroblastos e macrófagos variou nos espécimes estudados, mas, em todos eles, os fibroblastos
foram as células predominantes. A matriz extracelular fibrosa mostrou-se desprovida de
organização, e neutrófilos foram observados em algumas áreas de alguns espécimes
estudados, com alguma organização na zona mais distante da proliferação, como revelam as
Figuras 47 e 48.
O grupo 3BEM, que representou a implantação da membrana do tipo “b” pelo
tempo de uma semana, revelou em observação histológica a presença de células gigantes,
grande quantidade de macrófagos e fibroblastos nas adjacências da membrana. No tecido
conjuntivo do perimísio, foram identificadas duas zonas distintas, considerando-se a
intensidade celular e a intensidade da coloração celular. A zona interna, mais próxima da
membrana, apresentou-se ampla, de maior celularidade, intensidade de coloração nuclear e
com grande quantidade de vasos neoformados. A zona mais afastada ou externa mostrou-se
menos celular e com coloração nuclear menos intensa. Em ambas as áreas, a matriz
extracelular em construção mostrou material colágeno aleatoriamente depositado sem
formação de feixes e, em algumas poucas áreas, foram observados neutrófilos. Nas regiões
97
em que a membrana se inseriu entre os miócitos, o quadro histológico foi semelhante, mas a
zona externa, de menor celularidade, não foi identificada.
O grupo 3BShM, representante do tecido muscular sham no tempo de uma
semana, evidenciou nos cortes histológicos, a presença de grande quantidade de fibroblastos e
macrófagos, aqueles melhor identificados no perimísio e estes no endomísio. A composição
fibrosa da matriz extracelular evidenciou fibrilas colágenas sem arranjo definido e distribuídas
dispersamente.
O grupo 3CES, que representou a resposta do tecido conjuntivo com a implantação
da membrana do tipo “b” pelo tempo de duas semanas, exibiu histologicamente uma
membrana envolta por duas zonas: uma interna, próxima à membrana, e outra externa,
distante da membrana. Na zona interna, foram identificadas células gigantes aderidas à
membrana, grande quantidade de fibroblastos, moderada quantidade de macrófagos, muitos
vasos sanguíneos neoformados e alguns poucos eosinófilos. A matriz extracelular dessa zona
foi composta de colágeno em organização e deposição exuberante. Essa zona formou uma
cápsula, com maior ou menor espessura, composta de macrófagos numa matriz extracelular
imatura. Em alguns espécimes, a cápsula não foi observada, ou se apresentava interrompida
por áreas de pouca densidade de macrófagos. A zona externa sediou grande quantidade de
fibroblastos paralelamente distribuídos, alguns macrófagos e matriz extracelular com
componente colágeno em organização e mostrando algum paralelismo com a membrana. As
Figuras 57, 58, 61 e 62 mostram o padrão histológico identificado.
O grupo 3CShS, representando o grupo sham do tecido conjuntivo no tempo de
duas semanas, revelou a presença predominante de fibroblastos, um número mínimo de
macrófagos, pequena quantidade de vasos sanguíneos, poucos hiperemiados, em uma matriz
extracelular com expressiva quantidade de fibras colágenas em organização formando grupos
de feixes de fibras colágenas mais espessas orientados no sentido do corpo, conforme
98
mostram as Figuras 55, 56, 59 e 60 e os Gráficos 1, 9 e 11, com a média do número de vasos
sanguíneos.
O grupo 3CEM, representando o tecido muscular onde foi inserida a membrana do
tipo “b” no tempo de duas semanas, evidenciou, nas adjacências de alguns espécimes, grande
quantidade de fibroblastos e macrófagos. Em outros espécimes, moderada quantidade foi
identificada, com variação da espessura desse conjunto celular em volta da membrana. A
matriz fibrosa também variou em amadurecimento e organização entre os espécimes
observados, e células gigantes foram vistas margeando a membrana.
O grupo 3CShM, representando o grupo sham do tecido muscular no tempo de
duas semanas, evidenciou histologicamente o perimísio sediando moderada quantidade de
macrófagos e fibroblastos e o endomísio com poucos macrófagos visíveis e vasos, cuja média
está estabelecida no Gráfico 1. A matriz extracelular foi composta de fibras colágenas em
organização, mas ainda não completamente definida.
O grupo 3DES representou a resposta do tecido conjuntivo em que foi implantada
a membrana do tipo “b” no tempo de três semanas, revelando nas suas adjacências duas zonas
distintas: uma interna, aderida à membrana, e outra externa, contígua à primeira. Na zona
interna, foram identificadas células gigantes nas proximidades da membrana e grande
quantidade de fibroblastos e macrófagos, principalmente daqueles, mas em algumas áreas de
alguns espécimes foi identificado maior número de macrófagos. Essa zona de variada
espessura mostrou células em intensa atividade, sediando inúmeros vasos sanguíneos. Alguns
eosinófilos foram observados, e a quantidade de vasos alternou ao longo da extensão da
membrana. O componente fibroso da matriz extracelular revelado como rico em fibras
colágenas bem organizadas, mas com os feixes em incompleto cross-linking, apesar do
arranjo paralelo à membrana. Na zona externa, a quantidade de fibroblastos e macrófagos foi
pequena, e os feixes colágenos assumiram uma orientação no sentido da membrana,
99
Figuras 47 a 54 - Fotomicrografias do grupo sham do tecido conjuntivo e experimental do tecido
conjuntivo, com implantação de membrana fibrosa da casca de ovo (MFCO)
do tipo “b” no tempo de uma semana
Figuras 47 e 48 - Grupo sham do tecido conjuntivo, mostrando grande densidade de fibroblastos,
vasos sanguíneos e macrófagos (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 49 e 50 - Detalhe da Figura 48, grupo sham do tecido conjuntivo, mostrando áreas de edema,
grande quantidade de neutrófilos e macrófagos (H-E, aumento original: 400x)
Figuras 51 e 52 - Grupo experimental do tecido conjuntivo apresentando, nas adjacências da
membrana, grande quantidade de fibroblastos, vasos neoformados e macrófagos (H-
E, aumento original: 200x)
Figuras 53 e 54 - Detalhe da Figura 51 (H-E, aumento original: 200x)
100
101
Figuras 55 a 62 - Fotomicrografias dos grupos sham e experimental do tecido conjuntivo com
implantação da membrana fibrosa da casca de ovo (MFCO) do tipo “b” no
tempo de duas semanas
Figuras 55 e 56 - Grupo sham do tecido conjuntivo, mostrando predominância de fibroblastos, poucos
macrófagos e poucos vasos (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 57 e 58 - Grupo experimental do tecido conjuntivo, mostrando junto à membrana, no tempo de
duas semanas, número expressivo de fibroblastos e moderado de macrófagos (H-E,
aumento original: 200x e 400x)
Figuras 59 e 60 - Detalhe das Figuras 55 e 56, respectivamente (H-E, aumento original: 200 e 400x)
Figuras 61 e 62 - Detalhe das Figuras 57 e 58, respectivamente (H-E, aumento original: 200 e 400x)
102
103
características que podem ser vistas nas Figuras 65, 66, 69 e 70. A média de células e vasos
está representada nos Gráficos 3, 8 e 10.
O grupo 3DShS, representando o grupo sham do tecido conjuntivo no tempo de
três semanas, exibiu microscopicamente variada quantidade de vasos nos espécimes
estudados. Nas áreas de menor densidade vascular, foi maior a presença de fibras colágenas
em processo de organização completa, embora não mostrassem o arranjo típico, se comparado
ao do tecido normal, e nas áreas de maior vascularização a matriz colágena foi menos
organizada. O componente celular foi representado por fibroblastos em sua maioria e por
macrófagos em menor quantidade, que podem ser observados nas Figuras 63, 64, 67 e 68. O
número médio dessas células e dos vasos está representado nos Gráficos 11 e 9.
No grupo 3DEM, que representou a resposta do tecido muscular à membrana do
tipo “b”, identificou-se microscopicamente, nas adjacências da membrana, um tecido
conjuntivo rico em fibroblastos, macrófagos, além de algumas células gigantes aderidas à
membrana. O tecido conjuntivo apresentou duas zonas contíguas com densidade celular,
atividade e espessura diferentes: a zona interna, mais próxima da membrana, evidenciou
maior atividade celular, e a externa, menor atividade, ricamente povoada de fibroblastos.
O grupo 3EES caracterizou a resposta do tecido conjuntivo à implantação da
membrana do tipo “b” no tempo de dez semanas. O exame microscópico mostrou uma
resposta semelhante, mas diferente em intensidade entre os vários espécimes estudados. Em
alguns dos espécimes, o tecido conjuntivo adjacente à membrana revelou-se espesso com duas
áreas ou faixas inflamatórias distintas: a primeira, aderida à membrana, mostrou-se larga e
densamente povoada de macrófagos, com moderada quantidade de fibroblastos, muitos vasos
sanguíneos e uma matriz extracelular com suas fibras em organização; na segunda área,
adjacente à primeira, observou-se uma faixa menos larga, composta principalmente de
fibroblastos, poucos macrófagos, dentro de uma matriz extracelular com feixes de fibras
104
colágenas completamente organizadas, seguindo a direção da membrana, conforme mostram
as Figuras 71 e 72, e a exposição da média do número de células e vasos nos Gráficos 8, 10, 3
e 1.
O grupo 3FES, no qual se implantou no tecido conjuntivo a membrana do tipo “b”
no tempo de doze semanas, permitiu a identificação microscópica, próxima à membrana, de
duas zonas distintas: uma interna, aderida à membrana, e outra externa, adjacente a esta. A
zona interna apresentou-se ricamente celular, mostrando espessura variável, e rica em vasos
sanguíneos, fibroblastos, macrófagos e algumas células gigantes, sediando uma matriz
extracelular menos fibrosa. Em muitas áreas dessa zona, a composição celular inclinou-se
para uma predominância de fibroblastos com matriz extracelular fibrosa, composta de feixes
de fibras colágenas orientadas no sentido da membrana, mas em algumas regiões as fibras
colágenas pareciam pouco organizadas. Na zona externa, fibroblastos e macrófagos foram
identificados em menor número, com densa presença de feixes colágenos compondo a matriz
extracelular, mostrando, em algumas regiões, forte presença vascular. Os macrófagos, os
poucos fibroblastos e os vasos sanguíneos formaram uma cápsula em volta da membrana na
maioria dos espécimes estudados. O padrão histológico desse grupo pode ser observado nas
Figuras 75 e 76, a média do número de fibroblastos e macrófagos nos Gráficos 7, 8 e 10, e o
número médio de vasos sanguíneos no Gráfico 3.
O grupo 3FShS representou a resposta do tecido conjuntivo do grupo sham no
tempo de doze semanas, exibindo em microscopia uma matriz extracelular composta de denso
conjunto de fibras colágenas formando grandes feixes colágenos curtos, orientados no sentido
do corpo. O componente celular foi representado por poucos fibroblastos, alguns macrófagos,
vasos capilares, arteríolas e vênulas, conforme mostram as Figuras 73 e 74.
O grupo 3FEM, representando a resposta do tecido muscular à membrana do tipo
“b” no tempo de doze semanas, evidenciou microscopicamente uma cápsula de tecido
105
conjuntivo envolvendo a membrana, limitada por fibras musculares. A cápsula fibrosa
apresentou-se larga ou estreita, ao longo da membrana, dentro de um mesmo espécime;
comparativamente, mostrou-se densamente povoada de macrófagos, mas com poucos
fibroblastos. Nas proximidades da área rica em macrófagos, foi visível a forte presença de
tecido conjuntivo rico em fibras colágenas com alguns poucos fibroblastos. Vasos sanguíneos
foram identificados nas duas regiões. Essas observações podem ser conferidas na Figura 78.
O grupo 3FShM representou a resposta do tecido muscular ao manuseio do tecido
no tempo de doze semanas. Microscopicamente, foram observadas fibras musculares cortadas
nos sentido transversal e longitudinal, visíveis o endomísio com fibroblastos e poucas fibras
colágenas e o perimísio com maior quantidade de fibras, fibroblastos e poucos macrófagos,
demonstrados pela média do número de vasos no Gráfico 1 e na Figura 77.
5.3.4 Grupo 4
No grupo 4AES, a resposta do tecido conjuntivo à implantação da membrana do
tipo “c” no tempo de uma semana evidenciou microscopicamente, no tecido conjuntivo
próximo da membrana, expressivo número de fibroblastos, macrófagos, intensa proliferação
vascular e vasos hiperemiados, conforme dados registrados nos Gráficos 4 e 5 para os vasos
sanguíneos, e nos Gráficos 10, 16 e 19 para os macrófagos e fibroblastos. Na matriz
extracelular, poucos vacúolos, restos de degeneração de eritrócitos foram observados em
alguns espécimes, assim como algumas áreas de edema em outros. A rede de colágeno
expressou-se por muitos feixes finos de pouca organização, correspondendo às fibrilas em
arranjo para a formação de fibras. Duas zonas desse tecido foram vistas: uma interna, de
atividade celular mais intensa, e outra externa, de menor atividade celular, ambas de espessura
variada ao longo da membrana, havendo, nas duas zonas, fibroblastos e macrófagos.
Células gigantes estavam presentes, em pequeno número, nas adjacências das membranas,
106
Figuras 63 a 70 - Fotomicrografias dos grupos sham do tecido conjuntivo e experimentais dos
tecidos conjuntivo e muscular com implantação de membrana fibrosa da casca
de ovo (MFCO) do tipo “b” no tempo de três semanas e do grupo experimental
do tecido conjuntivo com membrana do tipo “c” no tempo de seis dias
Figuras 63 e 64 - Grupo sham no tempo de três semanas do tecido conjuntivo, mostrando organização
das fibras colágenas e menor densidade vascular (H-E, aumento original: 200x e
400x)
Figuras 65 e 66 - Grupo experimental do tecido conjuntivo, mostrando junto à membrana, no tempo de
três semanas, muitos fibroblastos e macrófagos (H-E, aumento original: 200x e
400x)
Figuras 67 e 68 - Detalhe das Figuras 63 e 64, respectivamente (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 69 e 70 - Detalhe das Figuras 65 e 66, respectivamente (H-E, aumento original: 200x e 400x)
107
108
Figuras 71 a 78 - Fotomicrografias do grupo experimental do tecido conjuntivo, no tempo de dez
semanas, com implantação de membrana fibrosa da casca de ovo (MFCO) do
tipo “b”. Fotomicrografias do grupo sham do tecido conjuntivo no tempo de
doze semanas e experimental do conjuntivo, conforme preparação do tipo “b”,
no tempo de doze semanas
Figuras 71 e 72 - Grupo experimental de dez semanas mostrando tecido conjuntivo com colágeno,
poucos fibroblastos (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 73 e 74 - Grupo sham no tempo de doze semanas do tecido conjuntivo poucos fibroblastos
e matriz colágena madura (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 75 e 76 - Grupo experimental do tecido conjuntivo, mostrando junto à MFCO, no tempo de
doze semanas, áreas de maior densidade de macrófagos alternadas com algumas
áreas de fibroblastos e fibras colágenas (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figura 77 - Grupo sham de tecido muscular no tempo de doze semanas, mostrando poucos fibroblastos
e feixes colágenos maduros
Figura 78 - Grupo experimental de tecido muscular no tempo de doze semanas, mostrando junto à
membrana uma cápsula composta por macrófagos, fibras e poucos fibroblastos
109
110
mas não em todos os espécimes, conforme pode ser identificado parcialmente nas Figuras 79
e 80.
O grupo 4BES identificou a resposta do tecido conjuntivo à implantação da
membrana do tipo “c”, no tempo de duas semanas. Na histologia, o conjuntivo adjacente à
membrana expôs uma intensa proliferação celular com predominância de fibroblastos sobre os
macrófagos e a identificação de células gigantes do tipo corpo estranho, mas não em todos os
espécimes. O número médio de fibroblastos e macrófagos está demonstrado no Gráfico 16, e
a média do número de vasos, no Gráfico 4. Os feixes colágenos em organização assumiram
um sentido paralelo à membrana, e observou-se proliferação vascular de intensidade variada,
conforme os espécimes. Nesse tecido conjuntivo, duas zonas contíguas foram identificadas:
uma mais interna, próxima da membrana, e outra externa, mais distante, ambas de variada
espessura. Na zona interna, predominaram as células com núcleos intensamente corados,
representando as células inflamatórias e os fibroblastos em intensa atividade mitótica em uma
matriz colágena em organização. Na zona externa, predominaram os fibroblastos e a matriz
extracelular rica em colágeno, pouco organizado mas fortemente presente, que podem ser
observadas nas Figuras 81 e 82. Os Gráficos 16 e 4 expõem a média dessas células e dos
vasos.
O grupo 4CES, representante da resposta do tecido conjuntivo à implantação da
membrana do tipo “c” no tempo de três semanas, permitiu identificar microscopicamente, no
conjuntivo adjacente à membrana, duas zonas paralelamente dispostas, de variada espessura:
uma externa, mais rica em colágeno, e outra interna, mais celular, sede de algumas células
gigantes aderidas à membrana, mas não em todos os espécimes. Ambas as zonas mostraram
macrófagos, mas as células predominantes foram os fibroblastos, e a intensidade dos vasos
sanguíneos foi de pequena a moderada, como registrado no Gráfico 4, com poucos deles
congestos. O pequeno número de células gigantes, quando presente em alguns dos espécimes,
111
se localizou na periferia da membrana, e as fibras colágenas da matriz extracelular, ainda em
organização, assumiram disposição paralela à membrana, formando feixes em processo de
agrupamento, mas já apresentando espessura diferenciada, conforme as Figuras 83 e 84.
No grupo 4DES, a resposta do tecido conjuntivo à implantação da membrana do
tipo “c” no tempo de oito semanas mostrou-se uniforme nas adjacências da membrana, com
uma única zona rica em fibras colágenas formando feixes espessos seguindo a mesma
orientação da membrana e fibroblastos que se mostraram alinhados com o seu produto
colágeno, à semelhança da fase final do cross-linking, na maioria dos espécimes. Os vasos
sanguíneos foram identificados em pouca quantidade, e não houve hiperemia vascular,
embora fossem identificáveis, nas proximidades da membrana, algumas poucas células
gigantes do tipo corpo estranho na minoria dos espécimes. O tecido conjuntivo nas
proximidades da membrana e distante dela estava compatível com os tecidos normais,
informações que podem ser buscadas nas Figuras 85 e 86 e nos Gráficos 16 e 4, onde se pode
identificar o número médio de fibroblastos, macrófagos e vasos sanguíneos. Na zona interna
de alguns espécimes, foram identificadas diminutas áreas ocasionais, com presença de alguns
pequenos conjuntos de fibroblastos.
5.3.5 Grupo 5
O grupo 5AES, que sediou a resposta do tecido conjuntivo à implantação da
membrana do tipo “d” no tempo de uma semana, revelou na microscopia intensa presença de
macrófagos, fibroblastos, neovascularização e vasos hiperemiados. Foram observadas células
gigantes nas áreas adjacentes à membrana, mas não em todos os espécimes. O componente da
matriz extracelular revelou poucas áreas de edema, vacúolos e restos de degradação de
eritrócitos, além de feixes delicados de fibrilas colágenas sem organização. O tecido
112
conjuntivo organizou-se em duas zonas contíguas: uma interna, com células em maior
atividade mostrando maior intensidade de coloração, e outra mais distante, com uma menor
intensidade de células. Ambas as zonas apresentaram espessuras diversas ao longo da
membrana nos diferentes espécimes. A descrição histológica pode ser observada nas Figuras
87 e 88, e o registro do número de fibroblastos, macrófagos e vasos nos Gráficos 17, 19 e 4.
O grupo 5BES, cujo tecido conjuntivo respondeu histologicamente à implantação
da membrana do tipo “d” no tempo de duas semanas, apresentou-se com expressiva
quantidade de fibroblastos e macrófagos nas suas proximidades. Os vasos sanguíneos estavam
fortemente presentes, alguns hiperemiados em alguns espécimes. O componente da matriz
extracelular mostrou uma matriz de feixes finos de fibrilas colágenas organizado em fibras em
quantidade expressiva e assumindo uma orientação paralela à membrana. O componente
conjuntivo exibiu duas zonas contíguas: uma interna e outra externa, sendo aquela mais rica
em células inflamatórias, fibroblastos e com presença de células gigantes do tipo corpo
estranho, e esta com ausência dessas células em alguns espécimes. Ambas as zonas revelaram
espessuras variadas num mesmo e em diferentes espécimes. As Figuras 89 e 90 mostram as
características descritas para esse grupo, e o registro do número de fibroblastos, macrófagos e
vasos está nos Gráficos 17, 19 e 4.
O grupo 5CES representou a resposta do tecido conjuntivo à implantação da
membrana do tipo “d” no tempo de três semanas, revelando microscopicamente, nas
adjacências da membrana, o tecido conjuntivo dividido em duas zonas identificáveis: uma
interna, estreita, com algumas células gigantes, e outra externa, mais ampla, embora pudessem
variar no mesmo espécime e em espécimes diferentes. Em ambas as zonas, foi identificada
grande quantidade de fibroblastos e pequena de macrófagos, mas nem todos os espécimes
mostraram a presença de células gigantes. O componente fibroso da matriz extracelular
revelou fibras colágenas em feixes não completamente arranjados, mas moderadamente
113
espessos, preenchendo as duas zonas e seguindo uma orientação paralela à membrana;
idêntico foi o comportamento dos fibroblastos. A neovascularização foi de pequena
intensidade, e não houve hiperemia vascular. As informações podem ser confirmadas nas
Figuras 91 e 92 e na média do número de células nos Gráficos 17 e 19, para os fibroblastos e
macrófagos, e no Gráfico 4 para os vasos sanguíneos.
No grupo 5DES, a resposta do tecido conjuntivo à implantação da membrana do
tipo “d” no tempo de oito semanas mostrou à luz da microscopia, nas adjacências da
membrana, o predomínio do componente fibroso da matriz extracelular. As fibras colágenas
formaram feixes abundantes e espessos distribuídos paralelamente à membrana. Os
fibroblastos escassamente presentes seguiram uma orientação paralela ao produto expressado,
e alguns poucos macrófagos foram identificados. Poucos foram os vasos sanguíneos e as
células gigantes, que não estavam presentes em todos os espécimes. Em algumas poucas
áreas, foram observadas estreitas regiões de maior atividade, indicando duas faixas discretas e
estreitas, mas somente em alguns espécimes. As Figuras 93 e 94 mostram as observações
histológicas descritas, encontrando-se registrado o do número de fibroblastos, macrófagos e
vasos nos Gráficos 17, 19 e 4, respectivamente.
5.3.6 Índice de Sewell
A aplicação do índice de Sewell à qualidade da reação tecidual do conjuntivo do
Rattus em resposta à MFCO revelou, em todas as semanas, índice que variou de leve a leve a
moderado. Assim, a membrana do tipo “a” mostrou, em três semanas, índice leve a moderado;
a membrana do tipo “b”, uma resposta leve a moderada em uma, duas e três semanas; a
membrana do tipo “c”, uma resposta de leve (três e oito semanas) a leve a moderada (uma e
duas semanas); a membrana do tipo “d”, uma resposta leve (três e oito semanas) e leve a
moderada (uma e duas semanas). Esses dados estão na Tabela 43 e no Gráfico 13. As Tabelas
36 a 39 expressam os resultados da reação do tecido conjuntivo de acordo com Sewell
114
Figuras 79 a 86 - Fotomicrografias dos grupos experimentais no tecido conjuntivo subcutâneo
implantada a membrana fibrosa da casca de ovo (MFCO) do tipo “c”, no
tempo de uma, duas, três e oito semanas
Figuras 79 e 80 - Grupo experimental de uma semana mostrando expressivo número de fibroblastos e
macrófagos e intensa neovascularização (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 81 e 82 - Grupo experimental de duas semanas mostrando intensa proliferação de fibroblastos
e menor número de macrófagos (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 83 e 84 - Grupo experimental de três semanas mostrando muitos feixes de colágeno paralelos
à membrana (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 85 e 86 - Grupo experimental de oito semanas mostrando feixes colágenos maduros e poucos
fibroblastos (H-E, aumento original: 200x e 400x)
115
116
Figuras 87 a 94 - Fotomicrografias dos grupos experimentais do tecido conjuntivo, implantada a
membrana fibrosa da casca de ovo (MFCO) do tipo “d” no tempo de uma,
duas, três e oito semanas
Figuras 87 e 88 - Grupo experimental de uma semana com intensa presença de macrófagos e
fibroblastos. Zona interna e externa de espessura e celularidade diversas (H-E,
aumento original: 200x e 400x)
Figuras 89 e 90 - Grupo experimental de duas semanas com expressiva presença de fibroblastos e
macrófagos, feixes colágenos em orientação paralela (H-E, aumento original: 200x e
400x)
Figuras 91 e 92 - Grupo experimental de três semanas com feixes colágenos espessos, fibroblastos e
macrófagos em menor expressão (H-E, aumento original: 200x e 400x)
Figuras 93 e 94 - Grupo experimental de oito semanas. Poucos fibroblastos e expressiva presença de
colágeno maduro (H-E, aumento original 200x e 400x)
117
118
(MOLEA et al., 2000), individualizando-se os tipos celulares, o diâmetro da reação
inflamatória e a densidade celular. A Tabela 43 estabelece a graduação da qualidade da reação
tecidual para os grupos do tecido conjuntivo.
5.4 RESULTADO DO ESTUDO HISTOLÓGICO
PARA AVALIAÇÃO DO COLÁGENO
Em microscopia de luz, as áreas de colágeno apresentam variações que podem ser
descritas como de intensidade pequena ou mínima, média, grande e expressiva. Nas áreas de
tecido conjuntivo com células do processo inflamatório, a presença de colágeno foi
identificada como de pequena ou mínima intensidade, observação válida para as áreas com
predominância de qualquer dos tipos celulares da inflamação ou o seu conjunto.
O grupo controle, no tempo imediatamente após o sacrifício, revelou expressiva
quantidade de fibras colágenas em feixes orientados na direção do corpo.
No grupo experimental em que foi utilizada a membrana do tipo “a”, constatou-se
a presença de fibras colágenas nas proximidades da membrana, variando de média quantidade
para grande, com as fibras correndo em paralelo à membrana.
Nos grupos em que foi implantada a membrana do tipo “b”, as observações, nos
diferentes tempos pesquisados, foram as que seguem.
No tempo de vinte e quatro horas, no grupo sham, foram observadas, nas áreas de
intervenção, zonas de lise colágena, representadas por espaços claros e feixes colágenos
delicados, limitadas por uma região normal de densidade expressiva de fibras. Nas áreas de
inflamação, a quantidade de colágeno foi considerada de pequena densidade ou de pequena a
média. No grupo experimental, na junção membrana-tecido, havia mínima ou pequena
quantidade de colágeno, com a presença de muitas áreas claras representantes do edema
intercelular e quantidade mínima de feixes colágenos.
119
Após uma semana, a presença de colágeno no grupo sham foi avaliado como de
média intensidade, com as áreas de lise já preenchidas por fibras em feixes finos e curtos. No
grupo experimental, o colágeno, na maioria dos espécimes, foi considerado como de grande
quantidade, pelo menos na maioria das áreas observadas.
Em duas semanas, o grupo sham ostentou expressiva presença de colágeno, com
as fibras já em arranjo e condensação, enquanto o grupo experimental, no limite da junção
membrana-tecido, apresentou uma quantidade pequena de colágeno formando uma faixa bem
estreita, mas de grande intensidade nas adjacências imediatas.
Após três semanas, as fibras colágenas presentes no grupo sham se arranjaram
com orientação definida, correndo paralelamente ao corpo e em número bastante expressivo.
No grupo experimental, a quantidade de fibras colágenas alternou de grande intensidade, em
algumas áreas, a moderada, em outras. No grupo experimental de dez semanas, a quantidade
de colágeno identificada alternou de expressiva para grande quantidade.
No grupo sham de doze semanas, estava presente expressiva quantidade de
colágeno, como mostra a Figura 104, e o grupo experimental com a membrana do tipo “b”
mostrou áreas com quantidade de colágeno variando de grande a expressiva e ainda áreas de
pequena quantidade na periferia imediata à membrana.
Nos grupos experimentais em que se utilizou a membrana do tipo “c”, evidenciou-
se a presença de colágeno com intensidade média e grande na primeira e segunda semanas,
sendo grande e expressiva na terceira e oitava semanas, respectivamente.
Os grupos experimentais que sofreram a implantação da membrana do tipo “d”,
revelaram, em uma, duas, três e oito semanas, respectivamente, quantidade média para a
primeira e grande e média para a segunda em áreas alternadas; na terceira e oitava semanas,
foi expressiva a quantidade de fibras colágenas.
120
5.5 RESULTADO IMUNOISTOQUÍMICO
PARA AVALIAÇÃO DO INTERFERON GAMA (IFN-)
A contagem e identificação das células marcadas para interferon gama IFN-γ em
microscopia de luz revelou, no grupo experimental em que foi implantada a MFCO do tipo
“c”, em duas, três e oito semanas, a presença de células marcadas, entre 0,21% e 0,96%. Na
Tabela 45, estão os percentuais dos resultados, e as Figuras 95 a 100 mostram a completa
integração do tecido com a membrana, evidenciando algumas células marcadas para IFN-γ.
121
Figuras 95 a 100 - Fotomicrografias do tecido conjuntivo realizada a imunoistoquímica para
interferon gama (IFN) nos grupos experimentais, implantada a membrana
do tipo “c” nos
tempos de duas, três e oito semanas
Figuras 95 e 96 - Presença, em duas semanas, de poucas células marcadas (imunoistoquímica,
aumento original: 200x).
Figuras 97 e 98 - Áreas adjacentes à membrana com ausência, em três semanas, de células marcadas
para IFNγ (imunoistoquímica, aumento original: 200x)
Figuras 99 e 100 - Nenhuma célula marcada para IFNγ no tempo de oito semanas (imunoistoquímica,
aumento original: 200x).
122
123
TABELAS
As Tabelas 1 a 7 expressam os resultados da contagem dos vasos sanguíneos por
campo nos tecidos conjuntivo e muscular do grupo controle imediatamente após o sacrifício e,
em diferentes tempos, nos tecidos muscular e/ou conjuntivo dos diversos grupos
experimentais em que foram implantadas as MFCOs dos tipos “a”, “b”, “c” e “d”.
Nas Tabelas 8 a 24 figura a contagem dos tipos celulares por campo de imersão
nos tecidos conjuntivo e muscular do grupo controle imediatamente após o sacrifício e, em
diferentes tempos, nos tecidos muscular e/ou conjuntivo dos diversos grupos experimentais
em que foram implantadas as MFCOs dos tipos “a”, “b”, “c” e “d”.
As Tabelas 25 a 28 apresentam o número total de células por campo no tecido
conjuntivo do grupo controle imediatamente após o sacrifício e, em diferentes tempos, nos
tecidos muscular e/ou conjuntivo dos diversos grupos experimentais em que foram
implantadas as MFCOs dos tipos “a”, “b”, “c” e “d”.
As Tabelas 29 a 31 mostram o diâmetro da reação inflamatória do tecido
conjuntivo, em diferentes tempos, nos grupos experimentais em que foram implantadas as
MFCOs dos tipos “a”, “b”, “c” e “d”.
As Tabelas 32 a 35 retratam a reação do tecido conjuntivo do grupo controle
imediatamente após o sacrifício e, em diferentes tempos, dos diversos grupos experimentais
em que foram implantadas as MFCOs dos tipos “a”, “b”, “c” e “d”.
Das Tabelas 36 a 38 consta o número total de células por campo no grupo
controle imediatamente após o sacrifício e, em diferentes tempos, nos grupos sham e nos
grupos experimentais em que foram implantadas as MFCOs dos tipos “b” e “c”.
A Tabela 39 retrata a graduação da qualidade da reação do tecido conjuntivo à
implantação das MFCOs dos tipos “a”, “b”, “c” e “d” em diferentes tempos.
124
A Tabela 40 dá conta da presença da interleucina dez (IL-10) e respectiva
densidade óptica no líquido das feridas do tecido conjuntivo dos grupos experimentais em que
foram implantadas as MFCOs dos tipos “c” e “d” no tempo de uma semana.
Finalmente, da Tabela 41 consta o percentual do número de células do tecido
conjuntivo do grupo experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “c”, em diferentes
tempos, marcadas para interferon gama (IFNγ).
125
Tabela 1 - Contagem dos vasos sanguíneos por campo (4x10
2
m
2
) nos tecidos conjuntivo e muscular dos
animais do grupo controle imediatamente após o sacrifício e dos grupos sham nos tempos de
vinte e quatro horas, uma, duas, três e doze semanas
Grupo
controle
G r u p o s s h a m
Conj. Musc.
Tecido con juntivo Tecido muscular
Animais
Imed. Imed.
24h 1 sem 2 sem 3 sem 12 sem
24h 1 sem 2 sem 3 sem 12 sem
1 14,50 4,60 11,90 13,70 4,70 11,40 7,40 11,15 13,10 9,08 8,80 5,10
2 20,00 12,1 17,05 12,90 8,15 12,30 8,50 9,65 4,35 5,70 6,75 8,30
3 18,95 4,20 12,65 23,70 11,05 7,10 6,20 5,15 7,85 12,40 4,70 6,75
4 21,70 4,08 15,60 25,40 8,75 4,60 8,10 5,40 8,10 4,60 6,00 5,50
5 22,70 5,45 15,00 22,50 4,60 11,20 * 4,85 9,20 5,10 7,50 5,95
6 20,95 5,40 9,85 19,50 6,85 9,40 * 6,15 11,95 2,75 4,80 7,40
7 10,05 3,85 10,95 28,95 10,20 14,35 * 4,70 9,60 6,55 3,95 6,15
8 18,10 6,70 7,65 26,00 10,15 13,10 * 4,40 7,60 6,20 4,55 7,50
9 19,35 6,25 11,85 21,20 10,15 6,25 8,25 4,30 10,40 10,30 3,55 7,50
10 17,70 5,10 12,80 16,65 9,20 7,70 8,50 3,90 7,70 5,80 2,75 6,90
Total 184 57,73 125,3 210,05
83,8 97,4 45,95 59,65 89,85 68,48 53,35 67,05
V/cam
18,4 5,77 12,53 21,0 8,38 9,74 7,82 5,96 8,98 6,84 5,33 6,70
Conj = tecido conjuntivo; Musc = tecido muscular; Imed = imediatamente após o sacrifício;
24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s); * = membrana não localizada no animal; V/cam = média do
número de vasos por campo.
126
Tabela 2 - Contagem dos vasos sanguíneos por campo (4x10
2
m
2
) no tecido
conjuntivo dos animais do grupo experimental em que foi implantada a
MFCO do tipo “a” no tempo de três semanas
Grupo experimental com MFCO do tipo”a”
Animais
Tecido conjuntivo
3 semanas
1 22,00
2 18,30
3 24,30
4 19,90
5 22,20
6 27,25
7 17,30
8 16,80
9 20,30
10 27,30
Total 215,65
V/cam 21,56
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; V/cam = média
do número de vasos por campo.
127
Tabela 3 - Contagem dos vasos sanguíneos por campo (4x10
2
m
2
) nos tecidos conjuntivo e muscular
dos animais dos grupos experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “b” nos
tempos de vinte e quatro horas, uma, duas, três, dez e doze semanas
Grupos experimentais com MFCO do tipo “b”
Tecido conjuntivo Tecido muscular
Animais
24 h 1 sem 2 sem 3 sem 10 sem
12 sem
24h 1 sem 2 sem 3 sem 12 sem
1 11,70 11,80 14,60 18,90 21,45 14,20 4,25 3,95 6,80 7,30 11,00
2 10,05 15,30 12,30 16,55 15,65 13,25 5,75 9,30 10,10 3,45 8,70
3 13,65 24,30 14,30 12,05 21,30 15,90 4,70 15,10 7,65 5,80 12,05
4 16,15 29,70 18,55 13,00 20,35 15,90 3,20 12,45 10,45 4,00 6,35
5 10,05 22,30 20,50 17,60 16,45 * 3,50 17,25 7.20 2,70 5,30
6 12,20 17,80 20,10 14,40 15,50 * 5,10 14,35 8,95 9,10 4,35
7 11,15 27,90 13,35 15,10 20,25 * 4,30 15,10 7,85 4,85 4,45
8 9,05 18,40 20,55 22,70 18,30 * 4,45 9,00 9,10 7,65 4,45
9 7,45 19,05 14,45 20,25 20,90 15,65 3,65 19,90 7,15 4,95 3,65
10 14,10 25,65 15,90 13,25 16,60 13,95 4,75 9,55 8,25 3,00 3,40
Total 115,55 212,2 164,6 163,8 186,75 88,85 43,65 125,95 83,50 52,8 63,7
V/cam 11,55 21,22 16,46 16,38 18,67 8,88 4,36 12,59 8,35 5,28 6,37
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; 24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s); * =
membrana não localizada no animal; V/cam = média do número de vasos por campo.
Realizou-se a comparação dos valores médios dos grupos experimentais em que foi implantada
a MFCO do tipo “b” no tecido conjuntivo (Tabela 3) com os valores médios dos grupos sham
de uma semana do tecido conjuntivo (Tabela 1).
Teste “t” de Student
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,21. Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,23. Não se rejeitou Ho.
Para três semanas: p-valor = 0,23. Não se rejeitou Ho.
Para dez semanas: p-valor = 0,85. Não se rejeitou Ho.
Para doze semanas: p-valor = 0,016. Rejeitou-se Ho.
Para uma semana: p-valor = 0,95. Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,035. Rejeitou-se Ho.
Para três semanas: p-valor = 0,035. Rejeitou-se Ho.
Para dez semanas: p-valor = 0,23. Não se rejeitou Ho.
Para doze semanas: p-valor = 0,0052. Rejeitou-se Ho.
128
Tabela 4 - Contagem dos vasos sanguíneos por campo (4x10
2
m
2
) no tecido conjuntivo dos
animais dos grupos experimentais em que foram implantadas as MFCOs dos tipos
“c” e “d” nos tempos de uma, duas, três e oito semanas
T e c i d o c o n j u n t i v o
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “c”
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “d”
Animais
1 sem 2 sem 3 sem 8 sem 1 sem 2 sem 3 sem 8 sem
1 14,75 23,35 11,65 15,00 12,85 17,60 12,75 10,50
2 12,75 18,35 18,80 15,00 16,85 15,60 13,25 11,10
3 12,40 17,05 13,60 13,00 16,20 18,60 15,15 13,20
4 21,95 21,00 11,05 16,50 13,30 19,80 14,00 13,10
5 24,85 27,15 15,75 12,75 12,10 19,70 11,84 10,75
6 22,65 15,00 21,40 13,50 18,20 22,90 10,15 12,70
7 18,85 13,65 11,75 10,30 28,95 19,50 9,30 9,35
8 18,60 20,35 16,05 14,70 14,10 17,75 11,00 10,95
9 29,40 16,20 18,10 15,60 24,40 21,80 9,30 16,75
10 22,25 13,75 15,25 10,10 16,60 17,25 11,10 11,55
Total 198,45 185,86 153,40 136,45 173,55 190,50 117,84 119,95
V/cam 19,84 18,58 15,34 13,64 17,35 19,05 11,78 11,99
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; sem = semana(s); v/cam = média do número de
vasos por campo.
Realizou-se a comparação dos valores médios dos grupos experimentais em que foram implantadas as
MFCO dos tipos “c” e “d” no tecido conjuntivo (Tabela 4) com os valores médios do grupo controle
do tecido conjuntivo (Tabela 1).
Membrana do tipo “c”
Teste “t” de Student
Resultado e conclusão: Para uma semana p-valor = 0,50. Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,92. Não se rejeitou Ho.
Para três semanas: p-valor = 0,073. Não se rejeitou Ho.
Membrana do tipo “d”
Teste “t” de Student
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,62. Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,64. Não se rejeitou Ho.
Para três semanas : p-valor = 0,0003. Rejeitou-se Ho.
Membrana do tipo “c”
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,62. Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,28. Não se rejeitou Ho.
Membrana do tipo “d”
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,14. Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,30. Não se rejeitou Ho.
Para três semanas: p-valor = 0,000 Rejeitou-se Ho.
129
Tabela 5 - Total de vasos sanguíneos por campo (4x10
2
m
2
) nos tecidos conjuntivo e
muscular do grupo controle imediatamente após o sacrifício e dos grupos sham
nos tempos de 24 horas, uma, duas três e doze semanas
Grupo controle G r u p o s s h a m
Tecidos
Imed 24h 1 sem 2 sem 3 sem 12 sem
Conjuntivo 18,40 12,53 21,0 8,38 9,74 6,80
Muscular 5,77 5,96 8,98 6,84 5,33 6,70
Imed = imediatamente após o sacrifício; 24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s).
Tabela 6 - Total de vasos sanguíneos por campo (4x10
2
m
2
) no tecido conjuntivo dos
grupos experimentais em que foram implantados os quatro tipos de MFCO nos
tempos de 24 horas, uma, duas, três, oito, dez e doze semanas
Grupos experimentais
Tecido conjuntivo
24h 1 sem 2 sem 3 sem 8 sem 10 sem 12 sem
MFCO do tipo “a” 21,56
MFCO do tipo “b” 11,55 21,22 16,46 16,38 18,67 8,88
MFCO do tipo “c” 19,84 18,58 15,34 13,64
MFCO do tipo “d” 17,35 19,05 11,78 11,99
24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s).
Tabela 7 - Total de vasos sanguíneos por campo (4x10
2
m
2
) no tecido muscular dos grupos
experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “b” nos tempos de 24
horas, uma, duas, três e doze semanas
Grupos experimentais
Tecido muscular
24h 1 sem 2 sem 3 sem 12 sem
MFCO do tipo “b” 4,36 12,59 8,35 5,28 6,37
24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s).
130
Tabela 8 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido muscular dos animais
do grupo controle imediatamente após o sacrifício
Tecido muscular dos animais do grupo controle
imediatamente após o sacrifício
Tipo
de célula
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/cam
Gra
Neutrófilo
Macrófago 3,6 1,1 3,1 0,5 0,2 0,3 0,6 0,2 0,2 0,98 ---
Fibroblasto 24,2 17,7 17,0 10,2 11,8 14,2 10,4 15,0 13,8 12,4 14,67 (2)
Linfócito
Célula gigante
Eosinófilo
C/cam = média do número de células por campo; Gra = graduação.
Tabela 9 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos animais
do grupo controle imediatamente após o sacrifício
Tecido conjuntivo dos animais do grupo controle
imediatamente após o sacrifício
Tipo
de célula
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/cam
Gra
Neutrófilo 0,1 0,2
0,1
0,03
Macrófago 3,0 2,7 5,2 3,6 3,1 3,6 1,5 4,6 3,4 3,0 3,37 (1)
Fibroblasto 29,8 25,8 16,6 15,9 21,9 17,6 17,6 20,6 30,7 18,0 21,45 (4)
Linfócito
Célula gigante
Eosinófilo
C/cam = média do número de células por campo; Gra = graduação.
131
Tabela 10 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais do grupo experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “a” no
tempo de três semanas
Tecido conjuntivo dos animais do grupo experimental
com a MFCO do tipo “a” no tempo de três semanas
Tipo
de célula
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/cam Gra
Neutrófilo 10,5 --
4,8 1,7 0,8 11,7 -- -- -- 2,95 (1)
Macrófago 26,2 7,2 13,5 33,4 34,1 29,2 38,2 33,7 47,1 33,6 29,62 (4)
Fibroblasto 95,0 49,9 75,2 73,6 27,7 42,8 78,5 53,6 64,6 53,5 61,44 (6)
Linfócito -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 0 (0)
Célula gigante -- -- -- -- 1,2 -- -- -- 0,6 -- 0,18 (0)
Eosinófilo -- -- -- -- 0,2 2,1 -- 0,1 6,4 -- 0,88 (0)
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; C/cam = média do número de células
por campo; Gra = graduação.
Tabela 11 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais do grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo
“b” no tempo de 24 horas
Tecido conjuntivo do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
24h-Sh 24h-E 24h-Sh 24h-E 24h-Sh 24h-E 24h-Sh 24h-E 24h-Sh 24h-E 24h-Sh 24h-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante Eosinófilo
1 34,1 51,1 34,6 22.2 8,7 6,9 - 0,1- - - 0,1
2 11,7 54,8 28,7 26,2 7,4 5,2 0,2 - - - - -
3 15,9 33,9 33,4 26,8 9,1 7,0 - - - - - -
4 5,2 66,3 24,1 28,6 11,7 6,3 - - - - - 0,2
5 16,3 38,7 21,4 30,6 9,2 4,4 - - - - - 0,6
6 9,4 35,4 22,0 18,9 7,8 7,2 - 1,9 - - - 0,8
7 2,7 57,9 37,6 34,2 23,4 11,7 - - - - - 0,1
8 5,2 41,8 10,5 34,9 5,2 6,5 - - - - - -
9 4,9 46,9 35,0 23,6 9,7 5,0 - - - - - 0,1
10 8,3 44,4 29,7 32,0 0 10,2 - - - - - -
C/cam 11,37
47,12
27,7 27,8 9,22 7,04 0,02 0,20 0 0 0 0,19
Gra 3 5 4 4 2 2 0 0 0 0 0 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; 24h = vinte e quatro horas; Sh = sham;
E = experimental; C/cam = média do número de células por campo; Gra = graduação.
132
Tabela 12 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido muscular dos animais
do grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no
tempo de 24 horas
Tecido muscular do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
24h-Sh 24h-E
24h-Sh 24h-E
24h-Sh 24h-E
24h-Sh 24h-E
24h-Sh 24h-E
24h-Sh 24h-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 25,5 31,2 14,2 10,4 6,9 3,6 0,1 - - - - -
2 14,4 13,6 25,7 35,2 2,0 5,1 - - - - - -
3 8,0 31,6 40,2 28,2 3,4 2,2 - - - - - -
4 8,7 99,0 28,6 23,8 8,7 4,0 - - - - - -
5 19,0 39,6 25,7 15,3 6,8 5,7 - - - - - -
6 16,8 87,5 25,7 20,5 4,5 4,2 - - - - - -
7 11,3 26,3 23,5 15,8 3,9 3,0 - - - - - -
8 5,2 26,1 18,6 22,6 1,7 5,2 - - - - - -
9 7,3 60,9 16,7 24,9 12,7 3,4 - - - - - -
10 8,6 38,8 19,2 30,7 4,2 3,0 - - - - - -
C/cam 12,48 45,46 21,22 22,74 5,48 3,94 0,01
Gra 2 5 4 4 2 1 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; 24h = vinte e quatro horas; Sh = sham;
E = experimental; C/cam = média do número de células por campo; Gra = graduação.
133
Tabela 13 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos animais
do grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no
tempo de uma semana
Tecido conjuntivo do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 0,3 0,4 32,5 18,9 33,0 39,9
-
0,3 0,1 0,5 0,4
2 - 8,9 17,3 20,9 36,4 78,8 - - - 0,2 0,3
3 - 0,6 22,7 18,3 46,8 48,5 - - - 0,1 -
4 - - 17,8 14,5 31,3 53,7 - - - - -
5 - - 18,6 18,1 35,9 99,9 - 0,1 0,2 0,4 0,9
6 - - 15,5 19,0 24,3 56,3 - - - 0,2 -
7 2,1 0,2 11,0 15,7 36,6 80,4 - - - 0,6 0,1
8 - - 9,0 15,0 34,8 94,9 - - - 1,3 -
9 - 0,2 10,1 15,4 35,6 56,5 - 0,1 - 0,3 -
10 - - 11,8 12,3 31,2 34,4 - - - 0,3 -
C/cam 0,24 1,03 16,63
16,81
34,59
64,33
0 0,05 0,03 0,39 0,17
Gra 0 - 3 3 4 6 0 0 0 0 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semana; Sh = sham; E = experimental;
C/cam = média do número de células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos do grupo experimental em
que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tecido conjuntivo no tempo de uma semana (Tabela 13)
com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo no tempo de
uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t” de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,0025. Rejeitou-se Ho.
134
Tabela 14 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido muscular dos animais do
grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tempo
de uma semana
Tecido muscular do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E 1s-Sh 1s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 - 2,5 10,8 11,7 38,2 40,8 - - - 0,4 - 0,3
2 0,5 - 5,9 15,8 42,9 56,2 0,3 - - 0,7 - -
3 0,3 0,1 13,1 15,9 26,5 19,7 - 0,2 - 0,6 - -
4 - 1,6 9,0 18,9 53,1 25,9 - - - - - -
5 - *** 31,5 *** 44,9 *** - - - - 0,1
6 0,9 - 10,1 11,3 37,7 40,1 - - - - - -
7 *** *** 17,9 *** 31,9 - - - - - -
8 - - 10,1 18,9 44,6 41,4 - - - - - 0,2
9 6,6 13,3 11,9 14,5 64,0 36,2 - - - - - -
10 4,6 3,5 14,1 19,9 36,1 42,8 - - - 0,2 0,1
C/cam 1,33 2,33 12,94
16,08
43,11
37,22
0,03 0.02 0,21 0,01 0,06
Gra 0 0 2 3 5 5
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semana; Sh = sham; E = experimental;
*** = espécime inadequado para leitura; C/cam = média do número de células por campo; Gra =
graduação.
135
Tabela 15 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais do grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo
“b” no tempo de duas semanas
Tecido conjuntivo do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante Eosinófilo
1 - 1,3 13,0 30,6 37,0 64,7 - 0,2 - - - 0,8
2 - - 16,4 17,2 44,7 48,5 - - - - - -
3 - - 12,2 21,4 48,35
45,32
- - - 0,2 0,2 1,0
4 - - 11,3 19,0 51,6 48,4 - 0,2 - 0,2 - 10,1
5 - - 23,2 13,4 45,6 49,2 - - - - - 0,3
6 0,2 - 7,3 11,3 23,4 73,1 - - - - - -
7 0,1 - 20,0 10,4 40,9 62,6 - - - 0,6 0,2 -
8 0,2 - 10,1 16,0 50,7 57,4 - - 1,1 - 0,9
9 0,3 - 19,7 13,3 43,0 59,2 - - - 0,3 0,1
10 - - 15,2 37,1 46,7 92,1 - - - 0,1 - 2,7
C/cam 0,08 0,13 13,20
18,97
43,20
60,04
0 0,04 0 0,25 0,04 1,59
Gra 0 0 2 3 5 6 0 0 0 0 0 1
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semanas; Sh = sham; E = experimental; C/cam =
média do número de células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos do grupo experimental em
que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tecido conjuntivo no tempo de duas semanas (Tabela 15)
com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo no tempo de
uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t” de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para duas semanas: p-valor = 0,0003. Rejeitou-se Ho.
136
Tabela 16 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido muscular dos animais do
grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tempo
de duas semanas
Tecido muscular do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b
2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E 2s-Sh 2s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 4,0 1,4 14,4 18,8 36,7 47,4 - 1,0 - -
2 *** - *** 41,7 *** 64,9 *** *** ***
3 - - 19,6 16,4 48,7 33,4 - - - - 0,8
4 - - 10,7 15,2 61,8 32,4 - - - 0,7
5 *** *** 25,8 *** 42,6 *** *** ***
6 - - 1,7 38,5 18,1 53,4 - - - - 8,8
7 - 0,2 18,4 21,3 38,6 58,5 - 1,4 - 0,3
8 - 0,1 10,3 9,9 32,8 70,6 - - - -
9 - - 10,2 28,8 38,6 57,1 - - - -
10 - 0,1 8,9 24,9 22,6 63,2 - - - 0,1
C/cam 0,4 0,17 15,9 24,13
37,23
52,35
0,24 0,11 0,88 0,08
Gra 3 4 5 6
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semana(s); Sh = sham;
E = experimental; *** = espécime inadequado para leitura; C/cam = média do número de células
por campo; Gra = graduação.
137
Tabela 17 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais do grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo
“b” no tempo de três semanas
Tecido conjuntivo do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
3s-Sh 3s-E 3s-Sh 3s-E 3s-Sh 3s-E 3s-Sh 3s-E 3s-Sh 3s-E 3s-Sh 3s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 - - 5,4 11,2 28,2 50,3 - - - 0,1 4,7
2 - - 3,8 16,0 21,7 47,3 - - 0,1 0,4
3 - - 5,1 18,2 30,2 52,0 - 0,1 0,2
4 - - 3,8 19,2 21,4 54,3 - 0,1 0,1 3,3
5 - - 4,1 11,2 35,5 50,3 - - 0,1 4,7
6 - - 2,3 11,7 20,8 45,6 - 0,1 0,8
7 - - 3,6 9,6 25,8 44,1 - - 0,1
8 - - 4,3 9,1 28,4 53,3 - - 0,1
9 - - 4,0 21,6 21,4 49,5 - - 0,4 1,1
10 - - 2,6 11,5 26,7 77,0 - - - 4,2
C/cam 0 0 3,9 13,93
26,01
52,37
0 0 0 0,07 0,04 1,96
Gra 0 0 1 2 4 6 0 0 0 0 0 1
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semanas; Sh = sham; E = experimental; C/cam =
média do número de células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos do grupos experimental
em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tecido conjuntivo no tempo de três semanas (Tabela
17) com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo no
tempo de uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t” de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para três semanas: p-valor = 0,0003. Rejeitou-se Ho.
138
Tabela 18 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais do grupo experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no
tempo de dez semanas
Tecido conjuntivo do grupo experimental com a MFCO do tipo “b”
10s-E 10s-E 10s-E 10s-E 10s-E 10s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1
27,70 44,10
2
15,10 24,40
3
12,60 36,20
0,10
4
8,00 27,60
0,10
5
8,80 27,50
0,10
6
25,50 48,00
7
9,70 46,50
8
22,70 41,60
9
15,10 30,60
0,30
10
18,50 31.70
C/cam
16,90 35,82
0,06
Gra
3 4
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semanas; E = experimental; C/cam = média do
número de células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos do grupo experimental em
que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tecido conjuntivo no tempo de dez semanas (Tabela 18)
com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo no tempo de
uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t” de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para dez semanas: p-valor = 0,071. Não se rejeitou Ho.
139
Tabela 19 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais do grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo
“b” no tempo de doze semanas
Tecido conjuntivo do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
12s-Sh 12s-E 12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 - 2,1 16,8 5,6 40,1 - 0,4 - - - 4,7
2 - - 1,7 26,2 10,6 33,3 - - - 0,1 - -
3 - - 1,1 45,5 10,9 33,4 - - - - 0,1 -
4 - - 2,2 24,5 14,1 47,9 - - - 0,3 0,4 0,5
5 - - 2,4 17,2 - - - - - -
6 - - 0,7 10,1 - - - - - 0,1 -
7 - - 1,3 10,4 - - - - - 0,3 -
8 - - 1,3 9,3 - - - - - 0,2 -
9 - - 0,7 21,4 10,1 40,3 - - - - 0,2 -
10 - - 1,1 31,4 13,1 35,9 - - - - 0,1 0,1
C/cam 0 0 1,46
27,63
11,14
23,09
0 0,04 0 0,04 0,26 0,53
Gra 0 1 4 2 4 0 0 0 0 0 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semanas; Sh = sham; E = experimental C/cam =
média do número de células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos do grupo experimental em
que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tecido conjuntivo no tempo de doze semanas (Tabela 19);
com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo no tempo de
uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t”de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para doze semanas: valor-p = 0,21. Não se rejeitou Ho.
Para macrófagos, realizou-se a comparação dos valores médios de macrófagos do grupo experimental
em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no tecido conjuntivo no tempo de doze semanas (Tabela
19) com os valores médios de macrófagos do grupo controle do tecido conjuntivo (Tabela 9).
Método aplicado: Teste “t” para duas amostras independentes.
Resultado e conclusão: Para doze semanas: valor p = 0,02. Rejeitou-se Ho.
140
Tabela 20 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido muscular dos animais
do grupo sham e do experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “b” no
tempo de doze semanas
Tecido muscular do grupo sham e do experimental com a MFCO do tipo “b”
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
12s-Sh 12s-E
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito
Célula gigante
Eosinófilo
1 3,70 15,10 21,2 45,5 0,2
2 3,30 34,50 15,1 39,1 0,3
3 2,40 28,10 16,5 45,1 0,1
4 2,40 36,80 32,0 45,3
5 0,70 37,50 20,9 43,6
6 1,80 26,30 19,3 46,6
7 *** 16,70 *** 40,0 0,5
8 *** 15,80 *** 18,3 0,2
9 2,50 *** 17,3 ***
10
*** *** *** ***
C/cam 2,4 26,35 20,32
34,61
1,3
Gra 1 3 3 4
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semanas; Sh = sham; E = experimental;
*** = espécime inadequado para leitura; C/cam = média do número de células por campo; Gra =
graduação.
141
Tabela 21 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais dos grupos experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “c” nos
tempos de uma e duas semanas
Tecido conjuntivo do grupo experimental com a MFCO do tipo “c”
1s 2s 1s 2s 1s 2s 1s 2s 1s 2s 1s 2s
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 - - 21,1 17,3 61,5 51,1 - - 0,1 0,2 0,1 -
2 - - 20,0 16,0 46,9 84,2 - - 1,0 - 0,4 0,1
3 0,2 - 30,6 11,6 43,4 66,8 - - 0,3 0,3 - 0,1
4 - 0,3 14,4 22,0 82,4 67,3 - - 0,5 0,4 0,1 0,1
5 0,1 - 22,8 26,2 65,6 90,4 - - 1,0 0,1 0,6 -
6 0,2 - 31,9 38,4 71,8 94,4 - - 0,3 0,4 0,1 0,5
7 - - 20,6 19,7 56,9 53,9 - - - 1,3 0,1 0,1
8 - - 16,8 24,1 62,5 67,2 - - - - - 0,1
9 - 0,3 17,7 14,6 52,7 59,6 - - 1,0 - 0,1 0,2
10 - - 18,7 25,5 43,6 75,8 - - - - 5,0 -
C/cam 0,05 0,06 21,41
21,54 58,73
71,04
0 0 0,42 0,27 0,65 0,12
Gra 0 0 4 4 6 6 0 0 0 0 0 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semana(s); E = experimental; C/cam = média do
número de células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos dos grupos experimentais
em que foi implantada a MFCO do tipo “c” no tecido conjuntivo nos tempos de uma e duas semanas
(Tabela 21); com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo
no tempo de uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t”de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,0001. Rejeitou-se Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,0000 Rejeitou-se Ho.
Para macrófagos
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,11. Não rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,15 Não rejeitou Ho.
142
Tabela 22 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais dos grupos experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “c” no
tempo de três e oito semanas
Tecido conjuntivo do grupo experimental com a MFCO do tipo “c”
3s 8s 3s 8s 3s 8s 3s 8s 3s 8s 3s 8s
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 - - 12,1 5,6 52,6 32,6 - 0,3 0,1 - - -
2 0,1 - 18,0 7,0 67,0 44,2 - - - - 0,3 -
3 - - 19,4 13,5 51,2 34,7 - - 0,4 0,1 0,7 0,5
4 - - 16,9 14,2 51,2 31,7 - - - 0,3 0,3 0,1
5 - 0,1 16,6 11,4 44,0 50,9 - - - - 0,4 0,1
6 - - 13,7 6,1 52,5 29,4 - - - - 0,1 -
7 - - 20,8 9,7 42,3 32,4 - 0,2 - 0,1 - -
8 - - 17,1 11,6 56,0 30,0 - - - 0,4 0,1 -
9 - - 11,0 13,1 41,3 23,8 0,2 - 0,5 - 0,1 -
10 0,1 - 18,9 10,5 57,3 25,2 - - 0,3 - 1,1 -
C/cam 0,02 0,01 16,45
10,27 51,54
33,49
0,02 0,05 0,13 0,09 0,31 0,07
Grã 0 0 3 2 6 4 0 0 0 0 0 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semana(s); C/cam = média do número de
células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos dod grupos experimentais
em que foi implantada a MFCO do tipo “c” no tecido conjuntivo no tempo de três e oito semanas
(Tabela 22); com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo
no tempo de uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t” de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para três semanas: p-valor = 0,0000. Rejeitou-se Ho.
Para oito semanas: p-valor = 0,73. Não se Rejeitou Ho.
Para macrófagos
Resultado e conclusão: Para três semanas p-valor = 0,94. Não rejeitou-se Ho.
Para oito semanas: p-valor = 0,01. Rejeitou Ho
143
Tabela 23 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais dos grupos experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “d” no
tempo de uma e duas semanas
Tecido conjuntivo do grupo experimental com a MFCO do tipo “d”
1s 2s 1s 2s 1s 2s 1s 2s 1s 2s 1s 2s
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 0,1 0,1 22,2 15,0 52,2 67,1 - - 2,0 0,1 0,2 3,2
2 - - 15,8 15,5 66,8 77,6 - - 0,9 0,2 0,7 0,2
3 0,7 - 29,1 11,9 41,2 45,2 - - 0,9 0,4 - 0,1
4 - - 12,4 7,7 63,7 46,4 - - - 0,2 0,8 -
5 0,2 - 22,6 12,8 64,2 43,5 - - 0,7 0,7 0,1 -
6 25,7 - 13,7 17,0 59,7 57,8 - 0,1 0,2 - - 0,3
7 - 2,0 16,8 12,0 61,8 61,9 - - 2,2 - 0,3 0,9
8 0,2 - 27,5 7,6 48,6 54,7 - - 0,9 0,8 0,5 0,3
9 - - 7,4 8,6 61,8 59,8 - - 0,7 0,1 0,1 0,2
10 - - 13,5 16,6 56,9 89,5 - - - 0,4 0,2 0,2
C/cam 2,69 0,03 18,10
12,47 57,69
60,35
0 0,01 0,85 0,29 0,29 0,54
Grã 1 0 3 2 6 6 0 0 0 0 0 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semana(s); C/cam = média do número de células
por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos dos grupos experimentais
em que foi implantada a MFCO do tipo “d” no tecido conjuntivo no tempo de uma e duas semanas
(Tabela 23) com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo
no tempo de uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t” de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,0000. Rejeitou-se Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,0003. Rejeitou-se Ho.
Para macrófagos
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,64. Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,11. Não se rejeitou Ho.
144
Tabela 24 - Contagem dos tipos celulares por campo de imersão no tecido conjuntivo dos
animais dos grupos experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “d” no
tempo de três e oito semanas
Tecido conjuntivo do grupo experimental com a MFCO do tipo “b”
3s 8s 3s 8s 3s 8s 3s 8s 3s 8s 3s 8s
Animais
Neutrófilo Macrófago Fibroblasto Linfócito Célula gigante
Eosinófilo
1 - - 10,0 5,4 28,4 39,2 0,9 - 0,2 0,3
2 - - 7,8 4,8 62,6 44,3 0,2 0,4 - 0,1
3 - - 6,5 5,7 50,0 41,6 0,8 - -
4 - - 8,2 3,7 55,0 46,4 0,1 - 0,1 -
5 - - 2,0 5,3 52,9 46,2 0,5 - - -
6 - - 4,4 1,7 37,7 41,8 - - 0,8 -
7 - - 6,1 4,0 53,7 39,3 0,2 1,4 0,1
8 - - 8,5 4,9 57,3 49,2 0,3 - - 0,1
9 - - 4,3 6,7 59,6 46,6 0,3 - 0,9
10 - - 15,2 3,0 62,3 39,7 - 0,2 0,3 0,2
C/cam 0 0 7,3 4,52 51,95
43,43
0 0 0,02 0,19 0,28 0,17
Gra 0 0 2 1 6 5 0 0 0 0 0 0
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; s = semanas; C/cam = média do número de células
por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios de fibroblastos e macrófagos dos grupos experimentais
em que foi implantada a MFCO do tipo “d” no tecido conjuntivo no tempo de três e oito semanas
(Tabela 24); com os valores médios dos fibroblastos e macrófagos do grupo sham do tecido conjuntivo
no tempo de uma semana (Tabela 13).
Para fibroblastos, utilizou-se o teste “t” de comparação de médias, pois o teste de normalidade dos
dados foi positivo.
Resultado e conclusão: Para três semanas: p-valor = 0,0007. Rejeitou-se Ho.
Para oito semanas: p-valor = 0,0008. Rejeitou-se Ho.
Para macrófagos
Resultado e conclusão: Para três semanas: p-valor = 0,00. Rejeitou-se Ho.
Para oito semanas: p-valor = 0,00. Rejeitou-se Ho.
145
Tabela 25 - Número total de células por campo no tecido conjuntivo dos animais do grupo
controle imediatamente após o sacrifício e dos grupos sham nos tempos de 24
horas, uma, duas, três e doze semanas
T e c i d o c o n j u n t i v o
Grupo controle
Grupos sham
Animais
Imed
24h 1 sem 2 sem 3 sem
12 sem
1 32,9 77,4 66,3 50,2 34,3 7,7
2 28,7 48,0 54,0 61,1 25,6 12,3
3 21,9 58,4 69,5 60,7 35,3 12,1
4 19,5 41,6 49,1 62,0 25,2 16,7
5 25,0 46,9 56,6 68,8 39,7 19,6
6 21,2 39,2 39,8 30,9 23,1 10,9
7 19,1 72,3 49,8 61,0 29,4 12,0
8 25,2 20,9 43,8 51,0 32,9 10,8
9 34,2 49,6 45,9 63,0 25,4 10,8
10 21,0 44,5 43,0 61,9 29,3 14,9
C/cam 23,9 49,0 51,7 57,0 30,0 12,7
Grã 4 5 6 6 4 2
Imed = imediatamente após o sacrifício; 24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s); C/cam =
média do número de células por campo; Gra = graduação.
146
Tabela 26 - Número total de células por campo no tecido conjuntivo dos animais dos grupos
experimentais em que foram implantadas as MFCOs do tipo “a” no tempo de três
semanas e do tipo “b” nos tempos de 24 horas, uma, duas, três, dez e doze semanas
T e c i d o c o n j u n t i v o
Grupo experimental
com MFCO do tipo “a”
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “b”
Animais
3 sem 24h 1 sem 2 sem
3 sem
10 sem
12 sem
1 131,7 80,3 60,0 97,8 66,2 71,8 62,0
2 57,1 86,2 108,8 65,7 63,7 39,5 59,6
3 88,7 67,7 67,5 67,8 70,5 48,9 79,7
4 111,8 98,6 68,2 77,7 76,9 35,7 72,4
5 64,9 74,3 11,4 62,9 84,3 36,4 *
6 74,7 64,2 77,5 88,4 58,2 73,5 *
7 128,4 99,0 96,8 73,6 53,8 56,2 *
8 87,3 83,2 111,2 75,4 62,5 64,3 *
9 111,7 75,6 72,4 72,9 72,6 46,0 63,1
10 92,9 86,3 47,0 132,0 92,7 50,3 67,4
C/cam 94,9 81,5 72,0 81,4 70,4 52,26 67,3
Grã 6 6 6 6 6 6 6
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; 24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s); C/cam
= média do número de células por campo; gra = graduação.
147
Tabela 27 - Número total de células por campo no tecido muscular dos animais dos grupos
sham e experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “b”, nos tempos de
24 horas, uma, duas e doze semanas
T e c i d o m u s c u l a r
Grupos sham Grupos experimentais com MFCO do tipo “b”
Animais
24h 1 sem 2 sem
12 sem
24h 1 sem 2 sem 12 sem
1 46,4 49,0 55,10 24,90 45,20 55,7 68,80 60,80
2 42,1 49,6 *** 18,40 54,00 72,50 107,8 73,90
3 51,6 39,9 68,3 18,80 62,00 36,5 51,90 73,30
4 46,0 62,1 72,5 34,40 126,80 46,40 48,30 82,10
5 51,5 76,6 *** 30,60 60,60 * 68,40 81,10
6 47,0 48,7 19,80 21,10 112,20 51,4 100,70 72,90
7 38,6 *** 57,00 *** 45,10 49,8 94,50 57,20
8 25,5 54,7 43,10 *** 53,90 60,50 82,90 34,30
9 36,7 82,5 48,8 19,80 89,20 64,00 85,60 *
10 38,2 54,8 31,50 *** 72,70 61,90 88,30 *
C/cam 42,36 57,54 49,51 31,90 72,17 55,41 79,72 66,95
Grã 5 6 5 4 6 6 6 6
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; 24h = vinte e quatro horas; sem = semana(s); *** =
espécime inadequado para leitura; * = membrana não localizada no animal; C/cam = média do
número de células por campo; Gra = graduação.
148
Tabela 28 - Número total de células por campo no tecido conjuntivo dos animais dos grupos
experimentais em que foram implantadas as MFCOs dos tipos “c” e “d” nos
tempos de uma, duas, três e oito semanas
T e c i d o
Grupos experimentais com MFCO do tipo “c
c o n j u n t i v o
Grupos experimentais com MFCO do tipo “d”
Animais
1 sem 2 sem 3 sem 8 sem 1 sem 2 sem 3 sem 8 sem
1 82,8 68,6 64,8 38,5 76,5 88,5 39,5 44,9
2 68,3 100,3 86,2 49,2 84,2 57,0 70,6 49,6
3 74,5 77,8 71,7 48,8 71,9 57,6 56,6 48,1
4 97,5 90,1 68,4 46,3 76,9 54,3 63,4 50,1
5 90,7 116,7 51,0 62,5 87,8 57,0 55,4 51,4
6 104,3 113,7 55,3 35,5 99,3 75,2 42,9 43,5
7 78,3 75,0 63,2 42,4 71,1 76,8 61,2 43,6
8 79,3 91,4 73,2 42,0 77,7 63,4 66,1 54,2
9 71,5 74,7 53,1 35,9 70,0 68,7 63,9 54,5
10 67,3 101,3 77,8 35,7 70,6 76,8 77,8 43,1
C/cam 81,4 90,9 66,47 43,68 78,6 67,5 59,7 48,3
Grã 6 6 6 5 6 6 6 5
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; sem = semana(s); C/cam = média do número de
células por campo; Gra = graduação.
149
Tabela 29 - Diâmetro, em milímetros, da reação inflamatória do tecido conjuntivo dos animais
dos grupos experimentais em que foram implantadas as MFCOs do tipo “b” nos
tempos de uma, duas, três, dez e doze semanas e do tipo “a” no tempo de três
semanas
T e c i d o c o n j u n t i v o
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “b”
Grupo experimental
com MFCO do tipo “a”
Animais
1 sem 2 sem 3 sem 10 sem 12 sem 3 sem
1 0,43 0,32 0,23 0,15 0,09 0,45
2 0,46 0,43 0,20 0,08 0,08 0,33
3 0,47 0,51 0,18 0,15 0,17 0,46
4 0,40 0,41 0,25 0,07 0,08 0,42
5 0,54 0,27 0,13 0,07 * 0,48
6 0,58 0,54 0,20 0,10 * 0,44
7 0,38 0,49 0,16 0,11 * 0,38
8 0,45 0,28 0,16 0,12 * 0,35
9 0,44 0,34 0,28 0,10 0,08 0,39
10 0,33 0,31 0,21 0,11 0,08 0,38
Total 4,48 3,9 2,0 1,06 0,57 4,08
C/ cam 0,44 0,39 0,2 0,10 0,09 0,40
Grã 3 3 1 1 1 3
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; sem = semana(s); * = membrana não localizada no
animal; C/cam = média do número de células por campo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios do diâmetro da reação inflamatória do grupo
experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “a” no tecido conjuntivo no tempo de três
semanas (Tabela 29) com os valores médios dos diâmetros da reação inflamatória dos grupos
experimentais do tecido conjuntivo em que foi implantada a MFCO do tipo “b” nos tempos de uma,
duas, três, dez e doze semanas (Tabela 29).
Método aplicado: ANOVA de um critério
Resultado do teste: p-valor = 0,00
Conclusão: Rejeitada a hipótese nula no nível de 5% de significância, ou seja, há evidências de que as
médias do diâmetro da reação inflamatória no tecido conjuntivo dos grupos experimentais
em que foi implantada a MFCO do tipo “b” sejam diferentes.
Resultado e conclusão: Para uma semana: p-valor = 0,16 Não se rejeitou Ho.
Para duas semanas: p-valor = 0,61 Não se rejeitou Ho.
Para três semanas: p-valor = 0,00 Rejeitou-se Ho.
Para dez semanas: p-valor = 0,00 Rejeitou-se Ho
Para doze semanas: p-valor = 0, 00 Rejeitou-se Ho.
150
Tabela 30 - Diâmetro, em milímetros, da reação inflamatória do tecido conjuntivo
dos animais dos grupos experimentais em que foram implantadas as MFCOs dos
tipos “c” e “d” nos tempos de uma, duas, três e oito semanas
Tecido
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “c”
conjuntivo
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “d”
Animais
1 sem
2 sem 3 sem
8 sem
1 sem 2 sem 3 sem 8 sem
1 0,20 0,15 0,18 0,03
0,10 0,09 0,05 0,03
2 0,20 0,14 0,11 0,02
0,12 0,09 0,06 0,04
3 0,17 0,13 0,06 0,03
0,15 0,10 0,05 0,05
4 0,21 0,19 0,08 0,04
0,16 0,15 0,04 0,06
5 0,28 0,12 0,09 0,07
0,17 0,10 0,04 0,06
6 0,19 0,20 0,09 0,02
0,21 0,11 0,08 0,05
7 0,19 0,10 0,05 0,05
0,11 0,16 0,07 0,05
8 0,27 0,15 0,09 0,05
0,14 0,13 0,09 0,07
9 0,15 0,14 0,10 0,05
0,20 0,10 0,06 0,05
10 0,15 0,13 0,14 0,04
0,13 0,11 0,05 0,03
Total 2,0 1,45 0,99 0,40
1,49 1,14 0,59 0,49
D/gru 0,20 0,14 0,09 0,04
0,14 0,11 0,05 0,04
Gra 1 1 1 1
1 1 1 1
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; sem = semana(s); D/gru = média do diâmetro da
reação inflamatória por grupo; Gra = graduação.
Realizou-se a comparação dos valores médios do diâmetro da reação inflamatória dos grupos
experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “c” no tecido conjuntivo entre eles mesmos
(uma, duas, três e oito semanas) (Tabela 30).
Método aplicado: ANOVA de um critério.
Média do diâmetro da reação inflamatória do tecido conjuntivo nos grupos experimentais em que
foram implantadas MFCOs do tipo “c”.
Resultado do teste: p-valor = 0,00.
Conclusão: Rejeitada a hipótese nula no nível de 5% de significância, ou seja, há evidências de que as
médias do diâmetro da reação inflamatória no tecido conjuntivo dos grupos experimentais
em que foi implantada a MFCO do tipo “c” sejam diferentes.
Realizou-se a comparação dos valores médios do diâmetro da reação inflamatória dos grupos
experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “d” no tecido conjuntivo entre eles mesmos
(uma, duas, três e oito semanas) (Tabela 30).
Método aplicado: ANOVA de um critério.
Resultado do teste: p-valor = 0,00.
Conclusão: Rejeitada a hipótese nula no nível de 5% de significância, ou seja, há evidências de que as
médias do diâmetro da reação inflamatória no tecido conjuntivo nos grupos experimentais
em que foi implantada a MFCO do tipo “d” sejam diferentes.
151
Tabela 31 - Diâmetro, em milímetros, da reação inflamatória do tecido conjuntivo dos grupos
experimentais nos tempos de 24 horas, uma, duas, três, oito, dez e doze semanas
Grupos experimentais
Tecido
conjuntivo
24h 1 sem 2 sem 3 sem 8 sem 10 sem 12 sem
MFCO do tipo “a”
0,40
MFCO do tipo “b”
0,44 0,39 0,20 0,10 0,09
MFCO do tipo “c”
0,20 0,14 0,09 0,04
MFCO do tipo “d”
0,14 0,11 0,05 0,04
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; 24h = vinte e quatro horas;
sem = semana(s).
Tabela 32 - Reação do tecido conjuntivo do grupo controle imediatamente após o sacrifício e do
grupo experimental após a implantação da MFCO do tipo “a” no tempo de três
semanas
Diâmetro
da reação
Densidade Tipo de célula Total
Tempo
inflamatória
celular N H F L CG E
Imed 0 6 (2x3) 0 0 (0x1)
4(4x1)
0 0 0 10
3 sem 15 (3x5) 18 (6x3) 6(1x6)
4(4x1)
6(6x1)
0 0 2(1x2) 45
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; N = neutrófilo; H = histiócito/macrófago;
F = fibroblasto; L = linfócito; CG = célula gigante; E = eosinófilo; Imed = imediatamente após o
sacrifício; sem = semanas.
Tabela 33 - Reação do tecido conjuntivo à implantação da MFCO do tipo “b” nos tempos de
uma, duas, três, dez e doze semanas
Diâmetro
da reação
Densidade Tipo de célula Total
Tempo
inflamatória celular N H F L CG E
Uma sem 15 (5x3) 18 (6x3) 6 (6x1)
3 (3x1)
6 (6x1) 0 0 0 48
Duas sem 15 (5x3) 18 (6x3) 0 (0x1)
3 (3x1)
6 (6x1) 0 0 2 (1x2) 44
Três sem 5 (5x1) 18 (6x3) 0 (0x1)
2 (2x1)
6 (6x1) 0 0 0 31
Dez sem 5 (5x1) 18 (6x3) 3 (3x1)
4 (4x1) 0 0 0 30
Doze sem 5 (5x1) 18 (6x3) 4 (4x1)
4 (4x1) 0 0 0 31
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; N = neutrófilo; H = histiócito/macrófago;
F = fibroblasto; L = linfócito; CG = célula gigante; E = eosinófilo; sem= semana(s).
152
Tabela 34 - Reação do tecido conjuntivo à implantação da MFCO do tipo “c” nos tempos de
uma, duas, três e oito semanas
Diâmetro
da reação
Densidade
Tipo de célula Total
Tempo
inflamatória
celular
N H F L CG E
Uma sem 5 (5x1) 18 (6x3) 0 5 (5x1)
6 (6x1)
0 0 0 34
Duas sem 5 (5x1) 18 (6x3) 0 5 (5x1)
6 (6x1)
0 0 0 34
Três sem 5 (5x1) 18 (6x3) 0 3 (3x1)
6(6x1)
0 0 0 32
Oito sem 5 (5x1) 15 (5x3) 0 2 (2x1)
4(4x1)
0 0 0 26
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; N = neutrófilo; H = histiócito/macrófago;
F = fibroblasto; L = linfócito; CG = célula gigante; E = eosinófilo; sem =semana(s).
Tabela 35 - Reação do tecido conjuntivo à implantação da MFCO do tipo “d” nos tempos de
uma, duas, três e oito semanas
Diâmetro
da reação
Densidade Tipo de célula Total
Tempo
inflamatória
celular N H F L CG E
Uma sem
5 (5x1) 18(6x3) 6(1x6)
3(3x1)
6(6x1)
0 1(1x) 0 39
Duas sem
5 (5x1) 18(6x3) 0 2(2x1)
6(6x1)
0 0 0 37
Três sem
5 (5x1) 18(6x3) 0 3(3x1)
6(6x1)
0 0 0 32
Oito sem 5 (5x1) 15(5x3) 0 2 (2x1)
4(4x1)
0 0 0 26
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; N = neutrófilo; H = histiócito/macrófago;
F = fibroblasto; L = linfócito; CG = célula gigante; E = eosinófilo; sem = semana(s).
Tabela 36 - Número total de células por campo, nos tempos de 24 horas, uma, duas, três, dez e
doze semanas, dos grupos experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo
“b”
Tempo
Tecido conjuntivo
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “b”
Tecido muscular
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “b”
24h 81,5
72,17
1 sem 72,0
55,41
2 sem 81,4
79,72
3 sem 70,4
10 sem 52,2
12 sem
67,3
66,95
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; 24h = vinte e quatro
horas; sem = semana(s).
153
Tabela 37 - Número total de células por campo, nos tempos de uma, duas três e oito semanas,
dos grupos experimentais em que foi implantada a MFCO do tipo “c”
Tempo
Tecido conjuntivo
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “c”
Tecido muscular
Grupos experimentais
com MFCO do tipo “d”
1 sem 81,4
78,6
2 sem 90,9
67,5
3 sem 66,4
59,7
8 sem
43,6
48,3
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; sem = semana(s).
Tabela 38 - Número total de células por campo do grupo controle imediatamente após o
sacrifício e dos grupos sham nos tempos de 24 horas, uma, duas, três e doze
semanas
N ú m e r o t o t a l
Grupo controle
d e c é l u l a s
Grupos sham
Tempo
Tecido conjuntivo Tecido muscular Tecido conjuntivo
Tecido muscular
Imed 25,86 15,65
24h 49,0 42,36
1 sem 51,7 57,54
2 sem 57,0 49,51
3 sem 30,0
12 sem 12,7 31,90
Imed = imediatamente após o sacrifício; 24h =vinte e quatro horas; sem = semana(s).
Tabela 39 - Graduação da qualidade da reação do tecido conjuntivo, nos tempos de uma, duas,
três, oito, dez e doze semanas, à implantação das MFCOs dos tipos “a”, “b”, “c”
e”d”
Graduação da qualidade do tecido conjuntivo
Tecido
conjuntivo
1 sem 2 sem 3 sem 8 sem 10 sem 12 sem
MFCO do tipo “a” 45
MFCO do tipo “b” 48 44 31 30 31
MFCO do tipo “c” 34 34 32 26
MFCO do tipo “d” 39 37 32 26
MFCO = membrana fibrosa da casca de ovo; sem = semana(s).
Conforme SEWELL: graduações de 26 a 32 = leve; graduações de 34 a 48 = leve a moderada.
154
Tabela 40 - Presença da interleucina dez (IL-10), em cc = pg/ml, no tempo de uma semana, no
líquido das feridas do tecido conjuntivo dos animais dos grupos experimentais em
que foram implantadas as MFCOs dos tipos “c” e “d” e respectivas densidades
ópticas
Tecido conjuntivo com MFCO dos tipos “c” e “d”
Interleucina dez e densidade óptica no tempo de uma semana
MFCO do tipo “c” MFCO do tipo “d”
Animais
Densidade óptica cc =pg/ml Densidade óptica cc =pg/ml
1
0,137
52,2 0,133 46,8
2
0,186
125,4 0,235 211,6
3
0,123
33,8 0,211 167,7
4
0,140
56,3 0,162 87,9
5 0,162 87,9 0,179 114,1
Realizou-se a comparação dos valores médios de IL-10 (cc = pg/ml) entre os grupos em que foram
implantadas no tecido conjuntivo as MFCOs dos tipos “c” e “d” no tempo de uma semana.
Método aplicado: Teste “t” para duas amostras independentes.
Resultado do teste: p-valor =0,15
Conclusão: Não se rejeitou a hipótese nula no nível de 5% de significância, ou seja, não há evidências
de que a média da interleucina 10 da MFCO do tipo “c” seja diferente da média da MFCO
do tipo “d”.
155
Tabela 41 - Percentual do número de células marcadas para interferon gama (IFN), nos
tempos de duas, três e oito semanas, do tecido conjuntivo dos animais do grupo
experimental em que foi implantada a MFCO do tipo “c”
Tecido conjuntivo com MFCO do tipo “c”
Células marcadas para interferon gama
Animais
2 sem 3 sem 8 sem
1
1,5
0,8 0,5
2
3,0
0,3 0,0
3
0,8
0,3 0,5
4
1,2
0,8 0,0
5 0,9 0,3 0,0
6
0,2
0,5 0,5
7 0,6 0,2 0,3
8
0,1
0,4 0,3
9 1,1 0,5 0,3
10 0,2 0,0 0,2
Média dos grupos 0,96 0,42 0,21
Ausente (-) 0% a 0,99% de células positivas; leve (+) 1,0% a 20,0% de células positivas;
moderado (++) 21,0% a 49,0% de células positivas; intenso (+++) > 50,0% de células
positivas.
156
Gráfico 1. Média do número de vasos
sanguíneos nos tecidos conjuntivo e
muscular dos grupos controle e sham
0
5
10
15
20
25
Contr
24 hs
1 sem
2 sem
3 sem
12 sem
Tempo
Número de vasos
sanguíneos/400µm2
Controle conjuntivo
Controle muscular
Sham conjuntivo
Sham muscular
Gráfico 2. Número médio de vasos
sanguíneos nos grupos experimentais, no
tecido conjuntivo
16
17
18
19
20
21
22
1 sem 3 sem
Tempo
N
úmero de vasos
/
400µm2
Membrana "c".
Membrana "a".
Gráfico 3. Número médio de vasos
sanguíneos,
no tecido conjuntivo e muscular
dos grupos experimentais implantada a
membrana do tipo "b"
0
5
10
15
20
25
24 h
o
ras
1
sem
2
sem
3 sem
10
se
m
12
sem
Tempo
Número de vasos
sanguíneos/400µm2
Conjuntivo
membrana "b"
Muscular
membrana "b"
Gráfico 4. Média do número de vasos
sanguíneos,
nos grupos experimentais no
tecido conjuntivo, implantadas as
membranas dos tipos "c" e "d".
0
10
20
30
1 sem 2 sem 3 sem 8 sem
Tempo
Número de
vasos
/µ m2
Mem "c"
Mem "d"
Gráfico 5. Número de vasos sanguíneos
no tecido conjuntivo, nos grupos
controle e experimental, implantadas as
membranas dos tipos "b", "c" e "d"
0
5
10
15
20
Contr 8 sem 12sem
Tempo
Número de vasos/400µm2
Grupo controle
Membrana "b"
Menbrana "c"
Membrana "d"
GRÁFICOS
Gráfico 6. Média do número de
polimorfonucleares neutrófilos e
macrófagos, no tecido conjuntivo nos
grupos controle, sham e
experimental, no tempo de 24 horas
0
20
40
60
24horas
sham
Contr
Múmero de
neutrófilos e
macrófagos/ campo/
imersão
Neutrófilos
Macrófagos
157
Gráfico 7. Média do número de neutrófilos,
macrófagos
e fibroblastos, nos grupos controle e experimentais com
implantação da membrana do tipo "b", no tecido
conjuntivo
0
10
20
30
40
50
60
70
Contr 24
horas
1 sem
e
2 sem
e
3 sem
e
10
sem e
12
sem e
Tempo
Número de células /400µm2
Neutro
Macof
Fibrob
Gráfico 9. Média do número de neutrófilos
,
macrófagos e fibroblastos, nos grupos
controle imediatamente e sham, no tecido
conjuntivo
0
10
20
30
40
50
C
o
ntr
2
4
hor
as
c
1 se
m
c
2 sem c
3 se
m
c
12 sem
c
Tempo
Número de
células/campo/
imersão
Neutrófilos
Macrófagos
Fibroblastos
Gráfico 10. Média do número de
fibroblastos, no tecido conjuntivo dos
grupos experimentais implantadas as
membranas dos tipos "a", "b", "c" e "d "
0
10
20
30
40
50
60
70
80
24 horas
1 sem
2 se
m
3
se
m
8
se
m
10 sem
12 sem
Tempo
Número de
fibroblastos campo
imersão
Memb "a"
Memb "b"
Memb "c"
Memb "d"
Gráfico 12. Média do diâmetro da reação
inflamatória,
nos grupos experimentais no
tecido conjuntivo
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
sem
2
sem
3
sem
8
sem
10
sem
12
sem
Tempo
Diâmetro da reação
inflamatória em mm
Memb "d"
Memb "c"
Memb "b"
Memb "a"
Gráfico 8. Média do número de neutrófilos
,
macrófagos e fibroblástos, nos grupos
controle no tempo imediatamente e
experimentais com implanção da membrana
do tipo "b", no tecido conjuntivo
0
10
20
30
40
50
60
70
Cont
r
24
hora
s
1 sem
e
2 sem
e
3 sem
e
10
sem
e
12 sem e
Tempo
Número de células/campo/imersão
Neutrófilos
Macrófagos
Fibroblastos
Gráfico 11. Média do número de
fibroblastos e macrófagos no tecido
conjuntivo dos grupos controle e sham
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Contr
24 horas
1 sem
2 sem
3 sem
12 sem
Contr Sham Sham Sham Sham Sham
Tempo
Número de células/campo/
imersão
Fibroblastos
Macrófagos
158
Gráfico14.
Transformção mitocondrial do
MTT em formazan. Uso do SDS para
dissolver os cristais de formazan, nos
diversos tipos de membrana
0
0,05
0,1
0,15
0,2
36 horas
Tempo
Densidade óptica (D0)
Mem tipo "a".
Mem tipo "b".
Mem tipo "c".
Mem tipo "d".
Controle
Gráfico 17. Média do número de
neutrófilos,
macrófagos e fibroblastos nos
grupos experimentais, implantada a
membrana do tipo "d ", no tecido
conjuntivo
0
10
20
30
40
50
60
70
neutro macrof fibrob
Tipo de célula
Número de células
campo/imersão
1 semana
2 semanas
3 semanas
8 semanas
Grafico 18. Média do número total de
células nos grupos experimentais
implantadas as membranas dos tipos "c" e
"d" no tecido conjuntivo
0
20
40
60
80
100
1
sem
1
sem
2
sem
3
sem
8
sem
Tempo
Número de
células/
campo
Membrana tipo "c".
Membrana tipo "d".
Gráfico 13. Reação do tecido conjuntivo à
implantação das membranas dos tipos "a"
,
"b" "c" e "d"
0
10
20
30
40
50
60
1 sem 2 sem 3 sem 8 sem 10
sem
12
sem
Tempo
Graduação de Sewell
Mem "a"
Mem "b"
Mem "c"
Mem "d".
Gráfico 15. Presença de IL-10 em líquido
de ferida dos grupos experimentais com
implantação das membranas dos tipos "c
"
e "d" no tempo de 1 semana
0 100 200 300
1
3
5
Animais
IL-10. CC=pg/ml
Mem "d"
Mem "c"
Gráfico 16. Média do número de
neutrófilos, macrófagos e fibroblastos,
nos
grupos experimentais, com membrana do
tipo "c", implantada no tecido conjuntivo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Neut Macro Fibro
Tipo de célula
Número de
célula/campo/imersão
1 sem
2 sem
3 sem
8 sem
159
Gráfico 19. Número de fibroblastos no
tecido conjuntivo dos grupos controle e
experimentais
0
10
20
30
40
50
Contr 8 sem 12 sem 8 sem
Tempo
Número de
fibroblástos/campo/imersão
Membrana "d"
Membrana "c"
Membrana "b"
Grupo controle
160
6 DISCUSSÃO
Os organismos respondem aos agentes lesivos físicos, químicos ou bacterianos
através das células dos tecidos, com a resposta imune inata e a resposta específica,
culminando com a remodelação, processo não imunológico. Didaticamente, a resposta
tecidual aos agentes lesivos se efetiva através de quatro fases: coagulação, inflamação,
proliferação e remodelação (HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000; SCHULTZ et al., 2003) ou
exclui-se a coagulação (HUBNER et al., 1996). Desse modo, produtos ou materiais
biocompatíveis, quando inseridos no organismo, devem compartilhar com os tecidos,
permitindo a efetivação dessas quatro fases, ao tempo em que devem exibir harmonia com a
vida, com ausência de efeitos tóxicos ou lesivos á função biológica (NEWMAN, 1994). Seria
praticamente impossível encontrar um material que fosse completamente biocompatível com
os tecidos, desde que o organismo reconhece materiais implantados como estranhos, isolando-
os por encapsulação (IBIM et al., 1998). A tendência de qualquer material introduzido no
organismo é ser absorvido, extruído ou encapsulado (KHARMANDAYAN; GOLDENBERG;
VILLA, 1995; IBIM et al., 1998).
Nossos achados histológicos revelaram dados discordantes dos acima referidos,
uma vez que, em oito semanas, o tecido em volta da membrana fibrosa da casca do ovo
(MFCO) dos tipos “c” e “d” apresentou completa integração, com formação de colágeno na
direção da membrana, ausência de cápsula, de infiltrado linfoplasmocitário, de macrófagos e
presença de eventuais células gigantes. Contudo, a MFCO do tipo “b”, apresentou, em doze
semanas, alternadas áreas capsuladas com muitos macrófagos, e a membrana do tipo “a”, em
três semanas, grande celularidade nos tecidos à sua adjacência, exibindo maior reação
inflamatória, não permitindo, porém, outras comparações em virtude do seu único tempo de
161
estudo. Apesar da diferença da resposta dos tecidos entre as membranas “a”, “b”, “c” e “d”,
todas podem ser consideradas biocompatíveis, uma vez que os neutrófilos e linfócitos, células
determinantes da resposta não biocompatível, foram identificados somente na primeira
semana. As respostas teciduais à membrana do tipo “b” coincidem com os achados de
Oliveira (2001) ao utilizar uma MFCO semelhante à membrana do tipo “b” implantada em
tecido conjuntivo e muscular de ratos no tempo de uma, duas e três semanas; com os de
Sonohara e Greghi (1994), com uma membrana de politetrafluoretileno (PTFE), em que
houve formação de uma cápsula fibrosa intensa; com os de Ito e outros (1999), com uma
membrana de chitosan imersa em hidroxiapatita; e com as informações de Kharmandayan,
Goldenberg e Villa (1995) e Ibim e outros (1998).
As membranas dos tipos “b”, “c” e “d” apresentaram respostas teciduais de
superior biocompatibilidade quando comparadas com a membrana do tipo “a”, considerando-
se que apresentaram as menores reações inflamatórias, caracterizadas por diferenças
estatisticamente significativas. Por outro lado, nos testes iniciais, os quatro tipos de membrana
permitiram a sobrevivência e o crescimento celular em meio de cultura, indicando a sua não
toxicidade, através do ensaio 3-(4-5 dimethylthiazol-2-yl)-2-5 diphenyl tetrazolium bromide
(MTT), em estudo piloto por medição da densidade óptica do formazan, em concordância
com o trabalho de Yi e outros (2004), com a MFCO industrializada de Chuang e outros
(1999), com o chitosan misturado a álcool polivinílico, e confirmada pela proliferação de
fibroblastos em cultura primária dessas células, isoladas do tecido conjuntivo, no qual se
implantou uma membrana do tipo “d”. Ao final de três, oito e doze semanas, para as
membranas dos tipos “a”, “c-d”, e “b”, respectivamente, os tecidos em suas adjacências
estavam livres de linfócitos e plasmócitos, confirmando a biocompatibilidade através dos
critérios de Stanford (1980). Portanto, quando se compararam as respostas teciduais entre as
membranas dos tipos “a”, “b”, “c” e “d”, foi possível identificar que o tipo de processamento
162
do material influenciou na qualidade da resposta dos tecidos, conforme a afirmação de Calixto
e outros (2001) de que a biocompatibilidade pode ser alterada por características físicas dos
produtos, tais como tamanho, presença ou não de poros, forma, rugosidade da superfície e
tipo de processamento. Essas informações foram confirmadas através do uso de
hidroxicarbonato de apatita adicionado a uma membrana de ácido polilático (MAEDA;
KASUGA; HENCH, 2006); pela presença de poros numa membrana reabsorvível de colágeno
induzindo a presença de osteoblastos positivos para fosfatase alcalina e novo osso
(TAGUCHI et al., 2005); por uma membrana porosa e lisa (LIAO et al., 2005) que sofreu
diferente degradabilidade; e através de mudança da estrutura ou configuração do chitin
(KOSTOPOULOS et al., 2001). Além do mais, a presença de porosidade na MFCO, como
observada em microscopia eletrônica de varredura (MEV), foi, possivelmente, um fator
auxiliar no relacionamento da membrana enxertada com os tecidos, e a interação das
moléculas do glutaraldeído com as da proteína da membrana teria contribuído para uma
melhor biocompatibilidade com os tecidos, sugerindo que os poros apresentaram diâmetro
igual ou inferior a 5,8µm, e as fibras 64,0µm, conforme as experiências de Sanders e outros
(2005). Note-se que a ação do glutaraldeído na membrana não parece ter produzido alterações
visíveis nas observações em microscopia eletrônica, embora as tenha nas respostas dos
tecidos. A resposta de tecidos vasculares a próteses de poliuretano com poros de 30µm foi de
melhor desempenho comparada com o mesmo material com poros de outros diâmetros
(ZHANG et al., 2004), comprovando-se a importância dos poros em produtos usados em
tecido diferente do conjuntivo propriamente dito e ósseo. Park e outros (1998) fabricaram
uma membrana de polilactídeo com poros, inpregnando-a com fator de crescimento,
conseguindo resultados positivos na entrega de fator de crescimento derivado de plaquetas
(PDGF); King, King e Hughes (1998) utilizaram membrana de colágeno porosa associada a
proteína morfogenética, tendo obtido
dados semelhantes aos de Oliveira (2001), sem o uso de
163
fator de crescimento, e de Park e outros (2000), com membrana de polilactídeo impregnada de
tetraciclina.
A importância dos poros nas membranas enxertadas atuando como fixadores do
coágulo foi comentada por Linde (2000), que os associou aos fatores vindos das plaquetas
neles acumulados, como elementos que ficaram dentro dos espaços, favorecedores da resposta
tecidual de regeneração óssea, embora Bartee e Carr (1995) tenham concluído, utilizando uma
membrana de politetrafluoretileno de alta densidade (PTFEn), pela não importância da
porosidade na regeneração óssea, apesar de terem criado defeitos com metade do diâmetro
considerado crítico. Apesar disso, Oliveira (2001) constatou que os poros da MFCO foram
importantes na resposta tecidual óssea, e Rompen e outros (1999) obtiveram reparação óssea
com a implantação de câmaras oclusivas perfuradas e preenchidas com sangue periférico.
Provavelmente, a rede fibrosa ou os próprios poros da MFCO atuaram, tendo ancorado e
estabilizado o coágulo em dupla face, permitindo acúmulo e liberação lenta dos referidos
peptídeos, bem como a captação desses peptídeos no decorrer das fases do processo de
integração da membrana ao tecido.
Além disso, o tratamento para a industrialização dos materiais naturais pode
influenciar na correspondente biocompatibilidade. A MFCO tratada com glutaraldeído
enxertada nos tecidos mostrou resultado superior aos demais métodos de tratamento,
comportamento semelhante ao obtido por Apinhasmith e outros (2003) com uma membrana
de borracha esterilizada por raios gama (melhores resultados) e por meio químico. A MFCO
processada em glutaraldeído e autoclavada alterou a reação dos tecidos, provocando sua
melhor aceitação. É possível que a membrana tratada com glutaraldeído, à semelhança da
membrana de chitosan (UENO et al., 1999; MUZZARELLI et al., 1999) e da de sacchachitin
(HUNG et al., 2001), tenha aumentado a inflamação, complementada por possíveis outros
eventos. A MFCO fabricada por solubilização, de acordo com Yi e outros (2004), apresentou
164
biocompatibilidade semelhante à membrana de colágeno, enquanto a MFCO tratada com
solução de pepsina e ácido acético (DUPOIRIEUX et al., 2001) revelou resposta tecidual
aceitável mas de propriedades físicas inferiores ao politetrafluoretileno não reabsorvível. A
transformação de um produto in natura em produto industrial permitiu torná-lo solúvel, mas
as respostas teciduais às membranas in natura, industrializada e preparada com tripsina não
foram diferentes.
A resposta dos tecidos à MFCO tratada com glutaraldeído apresentou melhores
resultados do que o chitosan com hidroxiapatita investigado por Ito e outros (1999), que
mostrou degradação e resultados semelhantes ao politetrafluoretileno (PTFE) estudado por
Macedo, Jardini e Okamoto (1995) e Sonohara e Greghi (1994). No período de vinte e um
dias, os dados das MFCO tratadas com glutaraldeído foram semelhantes aos achados de
Kostopoulos, Karring e Uraguchi (1994) com cápsula de teflon, e aos de Viljanem, Gao e
Lindholm (1977), aos 35 dias, com cápsula de silicone. Segundo a graduação de Sewell, a
biocompatibilidade da MFCO do tipo “b” foi avaliada como leve a moderada, na primeira e
segunda semanas, e leve, na décima e décima segunda semanas; a das membranas dos tipos
“c” e “d”, em oito semanas, foi avaliada como leve, com menores escores, caracterizando uma
melhor tolerância dos tecidos em um tempo menor.
A MFCO é composta de proteína fibrosa com alto teor de cisteína, mais próximo
da queratina (PARSONS, 1982) e da cartilagem (DUPOIRIEUX; POURQUIER; SOUYRIS,
1995). Em estudo imunoistoquímico, Carrino e outros (1996) constataram a presença de
colágeno I, colágeno IV e colágeno X, esse comum em cartilagem hipertrófica, em
concordância com Hincke e outros (2000). A presença de colágeno na MFCO a torna
semelhante ao colágeno biológico das outras membranas (BRUNEL et al., 1996; KING;
KING; HUGHES, 1998) e diferente das outras membranas estudadas para a técnica da
regeneração tecidual guiada e regeneração óssea guiada, como o polihidroxibutirato
165
(KOSTOPOULOS; KARRING; URAGUCHI, 1994); o ácido poliglicólico e o ácido
poliláctico com fator de crescimento (CHUNG et al., 1997); o polilactídeo com fator de
crescimento e poliéster (PARK et al., 1998); o ácido lático (GIARDINO et al., 1999); o
chitosan, produto natural (ITO et al., 1999); a resina de mamona (CALIXTO et al., 2001); a
MFCO não industrializada (OLIVEIRA, 2001); o alginato (UEYAMA et al., 2002); a MFCO
industrializada (YI et al., 2004), o sacchachitin, produto natural de fruta (HUNG et al., 2001);
e o β fosfato tricálcio em associação com o poli (L-lactídeo co-glicoide co-εcoprolactone)
(KIKUCHI et al., 2004).
A composição dos materiais quase sempre decidiu o comportamento da resposta
inflamatória na direção da biocompatíbilidade ou não, podendo ser avaliada com
experimentos in vivo (STANFORD, 1980; CLARK, 1993; VILLA, 1995; GEHRKE;
WALBOOMERS; JANSEN, 2000; MOLEA et al., 2000; OLIVEIRA, 2001;
KHARMANDAYAN; GOLDENBERG; NARY FILHO et al., 2002; LEHLE et al., 2004); ou
avaliações in vitro, em culturas de fibroblastos e outras células (PINTO et al., 1993; HUNG et
al., 2001; APINHASMITH et al., 2003; YI et al., 2004). Chuang e outros (1999) e Yi e outros
(2004) utilizaram também a análise morfológica das células aderidas ao produto em
microscopia eletrônica de varredura, o que é referido por Costa (2001).
No processo de recuperação tecidual a um enxerto, é na fase de coagulação que as
plaquetas liberam a trombina, que age sobre o fibrinogênio plasmático, transformando-o em
fibrina. A fibrina forma um leito nos tecidos, servindo ao deslocamento de células (HUNT;
HOPF; HUSSAIN, 2000). Além da trombina, as plaquetas liberam PDGF, fator de
crescimento epidérmico derivado de plaquetas (PDEGP), fator de crescimento transformador
beta um e beta dois (TGF β
1
e β
2
), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e
citocinas, que são quimiotáticos para neutrófilos, monócitos e mitogênicos para fibroblastos
(DEUEL; KAWAHARA, 1991; HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000). Fluindo conjuntamente ao
166
exsudato, as proteínas do sistema de complemento C5a e C3a atuam estimulando a
permeabilidade vascular (SCHAFFER; BARBUL, 1998), ou agindo como quimiotáticos para
os neutrófilos (UENO et al., 1999). Foram obtidos resultados significativos para a
regeneração óssea usando-se coágulo e aproveitando-se os fatores de crescimento e citocinas
liberados pelas plaquetas (ROMPEN et al., 1999), assim como osso bovino sob um aparelho
convexo feito de silicone (SLOTTE; LUNDGREN, 1999).
Em nosso trabalho, as evidências histológicas nas adjacências da MFCO
enxertada, analisadas no tempo de 24 horas nos grupos experimentais e sham, revelaram a
formação de uma rede de fibrina, presença de exsudato, edema e congestão vascular, de forma
que a MFCO permitiu os passos normais da coagulação e inflamação, indicando que o
processo se desenvolveu dentro dos padrões fisiológicos, com presença de neutrófilos e
macrófagos. Esses resultados foram diferentes daqueles obtidos pelos experimentos de
Ueyama e outros (2002), que não constataram inflamação com a membrana de alginato,
apesar da biocompatibilidade ter sido confirmada, e pelos de Calixto e outros (2001), que
foram prejudicados por alterações negativas no afluxo de células do processo inflamatório.
O estudo da resposta inflamatória dos tecidos aos materiais naturais ou artificiais
usados em odontologia tem obedecido às regras dos organismos oficiais (STANFORD, 1980),
o que também tem sido preconizado em medicina e em medicina veterinária, pelo menos em
trabalhos experimentais (UENO et al., 1999). A observação histológica pela caracterização
morfológica das células é fundamentada na resposta imune inata e específica, através dos
granulócitos, mononucleares e dos fibroblastos, células não imunes (STANFORD, 1980;
MOLEA et al., 2000) ou pela incorporação de marcadores pela técnica da imunoistoquímica
para contagem de células imunocompetentes (LEHLE et al., 2004). A utilização e aferição da
resposta inflamatória levaram em consideração o tipo de célula presente, a intensidade dessas
células, a neoformação vascular, a formação de tecido de granulação e a quantidade de
167
colágeno (STANFORD, 1980; KHARMANDAYAN; GOLDENBERG; VILLA, 1995; IBIM
et al., 1998; SHIMITZJ et al., 1999; GEHRKE; WALBOOMERS; JANSEN, 2000; MOLEA
et al., 2000; CALIXTO et al., 2001; NARY FILHO et al., 2002; LEHLE et al., 2004). Os
critérios de Sewell (MOLEA et al., 2000) permitiram uma completa avaliação da resposta
inflamatória, oferecendo resultados detalhados, comparados aos critérios da Federação
Dentária Internacional (STANFORD, 1980). Assim, na avaliação dos tecidos adjacentes à
membrana enxertada, constatou-se, na fase inflamatória, a resposta imune inata com a
presença de neutrófilos, células de maior peso, segundo os critérios de Sewell, para avaliação
da reação inflamatória. Nary Filho e outros (2002) explicitaram a indesejável permanência
dos neutrófilos nas adjacências dos enxertos, além das primeiras horas e dias dos eventos.
Pelos critérios de Stanford (1980), é aceitável a presença de neutrófilos e linfócitos, desde que
eles decresçam ao longo das semanas, conforme ocorreu no experimento de Brunel e outros
(1996), em que a resposta tecidual a uma membrana de colágeno facultou a persistência de
neutrófilos nos dez primeiros dias.
Os experimentos realizados com a MFCO enxertada revelaram que o processo
inflamatório nas adjacências das membranas dos tipos “b”, “c” e “d” foi prolongado, tendo
em vista a não significância estatística da neoformação vascular entre os grupos sham e
experimentais no tempo de uma e duas semanas, exceto para a membrana do tipo “b”, e a
significância estatística entre os grupos sham e experimentais para as membranas dos tipos
“b”, “c” e “d” em três semanas. Houve a manutenção do número de macrófagos na segunda e
terceira semanas no grupo experimental em que foi implantada a membrana do tipo “c” em
comparação com o grupo sham de uma semana, em dados estatisticamente significativos, e
ausência de neutrófilos, comportamento considerado positivo para a aceleração da integração
do enxerto (HUNG et al., 2001), estimulado possivelmente pela ausência de IL-4
(YAMAMOTO et al., 1997). Subseqüentemente aos eventos da primeira semana, quando se
168
implantaram os diversos tipos de membranas, houve ausência dos neutrófilos, indicando uma
resposta na direção da aceitação, inclusive com fibroblastos, em número estatisticamente
significativo, nos grupos experimentais com a membrana do tipo “d”, em todas as semanas, e
com a membrana dos tipos “c” e “b”, em uma, duas e três semanas, em comparação com o
grupo sham de uma semana. O aumento do número de vasos nas proximidades da membrana
enxertada foi uma reação positiva que contribuiu para o fortalecimento da fase proliferativa,
aumentando na região a disponibilidade de oxigênio, de citocinas, de fatores de crescimento e
demais produtos necessários às células.
A fase inflamatória compreende a presença de neutrófilos, macrófagos e linfócitos
(DEUEL; KAWAHARA, 1991; IBIM et al., 1998), os neutrófilos presentes na inflamação
aguda e os macrófagos e linfócitos na crônica (HUNG et al., 2001). Schultz e outros (2003)
relacionaram a fase inflamatória com a migração de neutrófilos e macrófagos. Hung e outros
(2001) consideraram o aumento da inflamação como um evento auxiliar na integração dos
enxertos aos tecidos, determinando o quarto dia como o início da fase proliferativa com a
presença de linfócitos, enquanto outros entenderam que os neutrófilos e macrófagos estão nos
primeiros momentos do processo inflamatório (HUBNER et al., 1996). Oberholzer,
Oberholzer e Moldawer (2000) acrescentaram aos neutrófilos e macrófagos as células NK e,
segundo Schaffer e Barbul (1998), os macrófagos, células dendríticas e neutrófilos são as
células recrutadas para o sítio da inflamação. Ainda como participantes da resposta aguda,
foram apontados os neutrófilos, os linfócitos, as células endoteliais e as plaquetas
(ROSENBERG; GALLIN, 1999). A inflamação, em resposta a uma infecção, oferece
moléculas e células aos sítios afetados, barreira física para impedir a propagação da infecção e
promover o reparo (papel não imunológico). Em tais circunstâncias, as células envolvidas são
neutrófilos e monócitos que se transformam em macrófagos e, nas últimas etapas, em
eosinófilos e linfócitos. Discordamos dos achados de Hung e outros (2001) e das informações
169
de Rosenberg e Gallin (1999), que incluíram os linfócitos nas primeiras horas da inflamação;
de Greco Junior (1999), que incluiu os linfócitos nos primeiros quatro dias; e de Granjeiro e
outros (2006), que encontraram linfócitos ao redor da membrana estudada em um, três e sete
dias. Entendemos que quatro dias representa tempo insuficiente para o desenvolvimento de
uma resposta aos eventuais componentes solúveis, uma vez que eles necessitam ser
processados pelos macrófagos e células B, de forma a permitir uma interação entre as células
T e B, para que possam desencadear a proliferação de linhagens específicas e seus respectivos
clones. Os resultados obtidos com o enxerto da MFCO demonstraram a presença dos
neutrófilos e dos histiócitos que se transformaram em macrófagos, mas em alguns espécimes
o número de macrófagos ultrapassou o de neutrófilos, sendo mais forte a presença dessas
células nos tecidos dos grupos experimentais do que nos grupos sham. A presença de
linfócitos, no nosso entender, se justifica com a presença de infecção, mesmo que pequena, ou
pela liberação de produtos solúveis através do material testado ou, ainda, em conseqüência do
trauma cirúrgico, com liberação de antígenos intracelulares. Além do mais, mesmo com
infecção, os linfócitos só apareceriam depois da falência da resposta inata, o que exigiria
tempo para uma proliferação clonal dos linfócitos e plasmócitos. Na resposta dos tecidos à
MFCO dos tipos “a”, “b”, “c” e “d”, os linfócitos não foram identificados em grande
quantidade entre os tempos de uma a doze semanas, conforme os resultados histológicos e
imunoistoquímicos puderam revelar com a membrana do tipo “c”, indicando um processo de
aceitação e de interação da membrana com as células do tecido. Entendemos que, nos
processos de reparação de feridas não infecciosas ou não infectadas, os linfócitos sejam
poupados de comparecer aos sítios dos eventos, uma vez que, para se tornarem efetores,
necessitam encontrar os seus antígenos específicos. Portanto, se a resposta tecidual aos
enxertos ocorrer sem liberação de produto solúvel e ausência de infecção, não haverá
formação e/ou liberação de anticorpo, pois não haverá proliferação clonal.
170
Rosenberg e Gallin (1999) citaram a participação de linfócitos na resposta aguda,
o que nos parece equivocado, embora tenham citado essas células também como participantes
do processo crônico; portanto, o sistema imune adaptativo responde com linfócitos B
produtores de imunoglobulinas (resposta humoral), das células TCD8+, TCD4+ e dos
fagócitos mononucleares (resposta celular) (SCHAFFER; BARBUL, 1998). Esses mesmos
autores referiram que os linfócitos desempenham um papel modulatório na cura de feridas,
embora ainda não completamente compreendido, e que um número significativo de linfócitos
T aparece em feridas de ratos no quinto dia, com pico no sétimo dia. Entendemos que essas
informações carecem de detalhes, como saber se houve ou não infecção e até mesmo se a
identificação morfológica celular foi correta. Nos experimentos que realizamos, essas células
não foram identificadas depois de uma semana, havendo presença maciça de macrófagos que
poderiam ser inadequadamente vistos com linfócitos, se os detalhes de identificação não
forem observados.
O trabalho conduzido por Nary Filho e outros (2002) avaliou o infiltrado
mononuclear, mas os autores não especificaram se havia linfócitos e quais os seus percentuais
em relação ao fagócito mononuclear (macrófago) ou se eram somente macrófagos. Kurzer,
Erika e Kurzer (1999) expuseram a importante participação dos linfócitos na regulação e
função dos fibroblastos, de forma que a sua diminuição se associa a alterações na síntese de
colágeno, embora outras células possam desempenhar esse papel. Em nossa pesquisa, os
resultados da presença dos neutrófilos e macrófagos nos tecidos nos grupos sham e
experimentais nas adjacências da membrana “b” revelaram maior número dessas células nos
grupos experimentais. Os macrófagos foram identificados em número estatisticamente
significativo em todos os grupos sham, quando comparados ao controle, exceto na terceira
semana. No tempo de 24 horas, em alguns espécimes houve predominância de macrófagos, e
os neutrófilos se arranjaram mais próximos da membrana. A função dos neutrófilos e
171
macrófagos em feridas não infectadas é produzir citocinas e fatores de crescimento que
estimularão fibroblastos e células endoteliais, mas são importantes para a fagocitose de restos
celulares, de tecidos lesados e para digerir a fibrina para o povoamento de fibroblastos
(ROSENBERG; GALLIN, 1999; HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000) e invasão de capilares
(TONNESEN; FENG; CLARK, 2000). Os macrófagos são células produtoras de muitos
fatores de crescimento, dentre os quais: PDGF, que é mitógeno para fibroblastos (CLARK,
1993); interleucina 6 (IL-6) e interleucina 1 (IL-1) (SCHAFFER; BARBUL, 1998); fator de
necrose tumoral alfa (TNF α) (JANEWAY et al., 2001); interleucina 12 (IL-12) (SCHAFFER;
BARBUL, 1998; OBERHOLZER; OBENHOLZER; MOLDAWER, 2000); IL-1, interleucina
6 (IL-6), TNFα e interleucina 10 (IL-10); o fator de crescimento transformador (TGF) é
também produzido por macrófago (SCHULTZ et al., 2003).
A identificação das células inflamatórias em microscopia de luz exige atenção e
acuro. Lindblad (1998) afirmou que antes dos anticorpos era difícil a tarefa de identificar e
diferenciar as células somente pelo aspecto morfológico. Kessel (2001) descreveu o
macrófago do tecido conjuntivo frouxo como tendo um núcleo esférico, menor e mais
heterocromático do que o núcleo do fibroblasto, enquanto o linfócito apresenta um núcleo
mais escuro e cromatina mais condensada. Entretanto, nas células gigantes, os núcleos não
são todos redondos, embora mais escuros do que os fibroblastos e menos claros do que os
linfócitos. Hung e outros (2001) e Granjeiro e outros (2006) identificaram, na inflamação de
vinte e quatro horas, neutrófilos e linfócitos, mas algum equívoco pode ter ocorrido em seus
trabalhos, considerando-se que os linfócitos identificados poderiam ser, na verdade,
macrófagos, especialmente se analisamos o tamanho dos núcleos das células referidas com o
aumento especificado no trabalho de Hung e outros (2001).
Nos experimentos com a MFCO, seguramente, a função dos macrófagos e
neutrófilos foi a de produzir citocinas, fatores de crescimento e fagocitose de restos celulares.
172
Na fase inflamatória da cura de feridas, que dura cerca de uma semana, as células produzem
citocinas e fatores de crescimento que estimulam ou inibem a inflamação (CHEN; ROGERS;
LYNDON, 1992; SCHULTZ et al., 2003). Um dos controles inibitórios é a citocina IL-10,
expressada por várias células, como as Th2 (CHEN et al., 2000; LEDOCHOWSKI et al.,
2001); macrófagos e célula Th2 (OBERHOLZER; OBERHOLZER; MOLDAWER, 2000);
macrófagos, queratinócitos e células B (FELICIANI; GUPTA; SAUDER, 1996); macrófagos,
linfócitos e queratinócitos (SCHULTZ et al., 2003); macrófagos e célula TCD8+
(ROSEMBERG; GALLIN, 1999); macrófagos e um novo subtipo de célula T, a célula
reconhecida como célula T regulatória 1 (Tr1), produtora de altos níveis de IL-10, além de
significativa quantidade de interferon gama (IFNγ) (LEVINGS; RONCAROLO, 2000).
O líquido das feridas colhido em uma semana e analisado por ensaio
imunoenzimático em nossa experiência revelou a presença de IL-10, sugerindo a sua
participação na regulação negativa da inflamação, em concordância com esses autores. A IL-
10 encontrada no líquido colhido da membrana do tipo “d” apresentou maiores percentuais,
mas não foram estatisticamente significativos, comparados aos colhidos da membrana do tipo
“c”; originaram-se seguramente dos macrófagos, porque as células B e T não se fizeram
presentes em grande quantidade nos tecidos, e os queratinócitos estavam muito distantes da
zona de inflamação. Como os autores consultados não se referiram a percentuais dessa
citocina, esse conhecimento é necessário para estabelecer parâmetros entre os processos de
reparação de regular inflamação e os de infecção. De qualquer modo, a IL-10, segundo
Liechty e outros (2000), é inibidora da produção de IL-6 e interleucina 8 (IL-8), citocinas pró-
inflamatórias, comprovação feita em imunoistoquímica com camundongos deficientes em IL-
10, apresentando altos níveis de células CD45 (diferentes células T) e alto grau de células
semelhantes a mononucleares. Entendemos que a presença de IL-10 no líquido do tecido em
173
reparação inicial tenha sido um fator contribuinte, importante no processo de aceitação do
enxerto das membranas dos tipos “c” e “d”.
Na fase proliferativa, o processo de diferenciação celular envolve a proliferação
dos fibroblastos, uma nova matriz extracelular, incluindo o componente fibroso e o amorfo,
angiogênese e reepitelização. Nesse processo, segundo Clark (1993), os fibroblastos ocupam
o espaço da região em reparação no quarto dia, completando o povoamento no sétimo,
invadindo as áreas da fibrina, fagocitados pelos macrófagos e neutrófilos (ROSENBERG;
GALLIN, 1999).
Em nossa pesquisa, as áreas de regeneração dos grupos experimentais com a
MFCO dos tipos “b”, “c” e “d” mostraram-se povoadas de fibroblastos nessa fase e na fase
subseqüente, em todas as semanas, com número estatisticamente significativo dessas células
quando comparado ao dos grupos controle, considerando-se que somente na terceira semana
houve número semelhante de fibroblastos entre os grupos sham e controle. A quantidade de
macrófagos presente nos tecidos foi maior e estatisticamente significativa nos grupos da
membrana do tipo “b” em comparação com os das demais membranas, permanecendo essas
células até doze semanas, tempo que durou a experimentação. A diminuição da população de
macrófagos nas membranas dos tipos “c” e “d” ao longo da fase proliferativa e da fase de
remodelação foi evidente, diferente da maioria dos espécimes com membrana do tipo “b”, que
mostraram integralmente ou parcialmente um aumento de macrófagos em volta da membrana.
Na fase proliferativa, as células mais importantes são as endoteliais e os
fibroblastos (HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000), e há uma diminuição das células
inflamatórias com aumento dos fibroblastos e células endoteliais (SCHULTZ et al., 2003).
Por outro lado, o aumento de fibroblastos na fase proliferativa resulta no correspondente
aumento de fibras colágenas, produzindo também proteoglicanos e proteases, essas para
dissolver a fibrina, e aqueles para servir de plataforma ou arcabouço para a angiogênese
174
(HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000), além de elastina e fibronectina (SCHULTZ et al., 2003),
servindo para a contração tecidual que ocorre entre o sétimo e o décimo quarto dia. A
angiogênese é o processo no qual novos vasos sanguíneos são formadas, originados da rede
vascular pré-existente em resposta às irritações e infecções, através de estímulos químicos
produzidos por macrófagos e queratinócitos (ALBERT et al., 2002).
Consideramos que a membrana enxertada foi um fator irritativo para a produção
de novos vasos que se revelou estatisticamente significante em nossa experimentação,
comparando-se o grupo controle com o experimental de três semanas de implantadas as
membranas dos tipos “c” e “d”. O número de vasos neoformados nos grupos experimentais
comparado com o dos sham mostrou significância estatística, exceto na primeira semana, mas
não houve diferença entre o número de vasos neoformados entre as membranas “c” e “d” na
primeira e segunda semanas. Nos tecidos adjacentes às membranas “b”, “c” e “d”, não faltou
neovascularização, uma vez que a sua ausência resulta na dificuldade de regeneração tecidual
(HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000), como foi evidenciado nos resultados do trabalho de
Ueyama e outros (2002).
No início da formação da nova matriz (quarto dia), os macrófagos produzem fator
de crescimento de fibroblasto ácido e básico (FGFa e b) que são estimulantes da angiogênese,
agindo previamente ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)
(KHARMANDAYAN; GOLDENBERG; VILLA, 1995; KIBE; TAKENABA; KISHIMOTO,
2000; TONNESEN; FENG; CLARK, 2000). A membrana de alginato enxertada e estudada
por Ueyama e outros (2002) foi considerada biocompatível, embora tenha resultado em uma
resposta tecidual com ausência de angiogênese, sendo essa, possivelmente, a causa do retardo
no processo de regeneração. O produto usado pode ter inibido a ação do FGF b e do VEGF ou
a resposta imune inata, ou ainda a divisão dos macrófagos nos tecidos, de forma que a
biocompatibilidade do alginato pode ser questionada. Apesar dos resultados obtidos por
175
Ueyama e outros (2002), esferas desse mesmo material impregnadas de VEGF revelaram-se
biocompatíveis segundo Elçin, Dixit e Gitnick (2001), havendo produção significativa de
novos vasos e ausência de células inflamatórias.
Foi expressiva em nossa pesquisa a presença de novos vasos capilares,
especialmente na segunda semana em todos os quatro tipos de membrana, contribuindo para a
sua aceitação e resultando na biocompatibilidade. A quantidade de macrófagos reduziu-se ao
longo do tempo, com aumento da de fibroblastos e diminuição da neoformação vascular,
culminando com menor número de vasos sanguíneos em dez semanas para a membrana do
tipo “b”. Em condições normais, é na fase de proliferação e migração que ocorre a
angiogênese com a participação do FGF b e o fator de crescimento queratinócito (KGF),
produzidos por fibroblastos (HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000) e macrófagos (CLARK, 1993;
ROSEMBERG; GALLIN, 1999). No experimento com a MFCO, a neoformação vascular
ocorreu nessa fase com os fibroblastos e macrófagos, conforme os dados estatisticamente
significativos dos grupos experimentais de duas semanas comparados aos dos grupos sham e
controle. A angiogênese se expressou com significância estatística na segunda semana e
perdurou pelas semanas seguintes, o que pode ser explicado pela possibilidade de ter havido
reserva de citocinas estimuladoras da angiogênese sob a membrana, conforme sugestão de
Ueyama e outros (2002). Consideramos que a angiogênese e a sua permanência até semanas
após a fase da fibroplasia foi importante na interação enxerto-tecido, como evidenciaram os
dados estatisticamente significantes com a membrana do tipo “b” em doze semanas
comparados com os do grupo controle, embora não tenha sido determinante.
No experimento com a MFCO, a produção de colágeno intensificou-se com o
passar do tempo e, na terceira, oitava e décima segunda semanas, foi expressiva a sua
quantidade, já se identificando o paralelismo das fibras na direção da membrana. Essa
disposição do colágeno tem sido um dos pontos que indicam normalidade a serem avaliados
176
no processo da biocompatibilidade (LINSENMAYER, 1991), uma vez que, nos tecidos
normais, as fibras colágenas correm paralelamente à superfície do corpo
(KHARMANDAYAN; GOLDENBERG; VILLA, 1995; LINDBLAD, 1998), o que foi
observado na oitava semana do grupo tratado com glutaraldeído. O resultado das avaliações
com a MFCO é coincidente com os de Kharmandayan, Goldenberg e Villa (1995), em que o
aumento de fibras não resultou do número de fibroblastos. Entendemos a validade dessa
afirmação, mas somente quando o processo de regeneração está se consolidando ou
consolidado, como evidenciaram os resultados do grupo experimental de oito semanas, cuja
quantidade de fibras colágenas foi semelhante ao normal ou pouco maior, com quantidade
mínima de fibroblastos. O inverso dessa afirmação foi verdadeiro para a etapa proliferativa ou
de fibroplasia, resultando em uma proporção direta entre fibroblastos e produção de fibras dos
tipos I e III ou VI, que podem ser produzidas por macrófagos e neutrófilos (LINDBLAD,
1998).
Segundo Tonnesen, Feng e Clark (2000), os primeiros oito dias ou menos são
reservados para a substituição da fibrina por fibronectina e, a seguir, na segunda semana, é
que o colágeno I e III passam a ser acumulados. No experimento realizado com a MFCO,
evidenciou-se uma maior proliferação de fibroblastos na segunda e terceira semanas, com
grande produção de colágeno. Essa constatação coincide com a de Hunt, Hopf e Hussain
(2000), segundo os quais, na fase proliferativa ou de fibroplasia, os fibroblastos produzem
colágeno, para formar uma nova matriz, e cross-linking, para produzir o aumento da espessura
das fibras; também com as afirmações de Schultz e outros (2003), que acrescentam que há
continuidade na fase de remodelação ou maturação, e de Kharmandayan, Goldenberg e Villa
(1995), que consideram ser possível identificar o colágeno em sete dias. Segundo Clark
(1993), podem ser identificados feixes finos no sétimo dia; e para Welch, Odland e Clark
(1990), já no quarto dia ocorre produção de colágeno. Talvez esse colágeno seja o produzido
177
pelos macrófagos e neutrófilos, como refere Lindblad (1998). Uma análise do colágeno nos
processos de regeneração óssea com enxertos de PTFE evidenciou-se mais colágeno do tipo I
dentro do osso (IVANOVSKY et al., 2000). Em nossas observações histológicas, o colágeno
foi identificado em tecido conjuntivo, entendendo-se que as fibras tenham sido produzidas
pelos fibroblastos, na etapa de fibroplasia e maturação, e por macrófagos e neutrófilos, na
etapa inflamatória imediata, conforme Lindblad (1998), ocorrendo, dessa maneira, o colágeno
produzido para a substituição do perdido, e aquele para formar a reparação. Não foram
utilizados anticorpos para marcação de colágeno, como foi feito por Lehle e outros (2004)
para avaliar o colágeno I e III na cápsula fibrosa de discos e rede de politetraetileno e
propileno com cobertura e sem cobertura de titânio.
As observações histológicas dos espécimes corados pelo Picrossírius revelaram
uma relação inversa entre a concentração de células inflamatórias e a quantidade de fibras
colágenas em todos os períodos avaliados, indicando que a MFCO determinou uma resposta
de matriz extracelular fibrosa com maior qualidade, sugestiva de maior resistência mecânica
do tecido conjuntivo produzido. Tais observações concordam com as de Lehle e outros
(2004), inclusive nas áreas onde havia somente macrófagos, como no grupo experimental de
doze semanas com a membrana do tipo “b”. Em todos os grupos estudados, a produção de
colágeno aumentou com o passar do tempo, de maneira que, em oito semanas, no grupo
experimental com presença das membranas dos tipos “c” e “d”, a quantidade de colágeno se
equiparou à observada nos grupos controle e sham. Na fase de remodelação, o número de
fibroblastos e outras células diminuiu ao longo do tempo, mas houve continuidade na
produção de matriz extracelular para posteriormente entrar em equilíbrio (SCHULTZ et al.,
2003). A análise estatística revelou um número não significativo de fibroblastos entre os
grupos controle e experimental das membranas do tipo “c” da oitava semana, o que corrobora
a formação de um tecido igual entre controle e experimental. Com a MFCO dos tipos “c” e
178
“d”, a atividade celular e a produção de matriz extracelular parecem ter chegado ao equilíbrio
em oito semanas, se não antes. Nesse ponto, o paralelismo e os feixes de fibras mais grossos
estavam presentes nas áreas próximas da membrana, além de uma maior quantidade de
fibroblastos, em comparação com o grupo controle. Segundo Hunt, Hopf e Hussain (2000), é
nessa fase que ocorre a troca da composição da matriz extracelular no processo de reparação,
no início com fibrina, fibronectina, macrófagos e neutrófilos ativados, líquidos inflamatórios,
e depois com a deposição de glicosaminoglicano e proteoglicano.
A partir dos resultados apresentados e da discussão envolvida, ficou entendido
que as respostas dos tecidos aos quatro tipos de MFCO se efetivaram com a resposta imune
inata culminanda com a remodelação, processo não imune. Apesar dos dados apresentados,
dúvidas poderiam ser suscitadas quanto à presença de uma resposta imune adaptativa celular
ou humoral, uma vez que, segundo Lindblad (1998), há dificuldades na leitura de células sem
uso de marcadores específicos. Assim, as análises imunoistoquímicas da resposta do tecido
conjuntivo à MFCO do tipo “c”, nos tempos de duas, três e oito semanas, para a identificação
do interferon gama (IFNγ) mostraram percentuais de células positivas para IFNγ entre 0,21%
e 0,96%, ou seja, ausência de positividade para essa citocina. A ausência de células
produtoras de IFNγ indica ausência de linfócitos TCD4+, TCD8+ e células NK, confirmando
a leitura dos tipos celulares realizados nos tecidos em microscopia óptica, e demonstrando que
a leitura celular pode ser efetivada sem marcadores, quando se conhecem as características
das células. Esses dados foram concordantes com os achados negativos de IFNγ para
reparação de feridas normais obtidos por Kampfer e outros (2000), mas entendemos que a
ausência dessa citocina se deva à inexistência das células produtoras e não pela produção de
IL-18 em forma não madura, como concluíram esses autores (2000). Outros autores sugerem
que os macrófagos possam produzir IFNγ (HUNT; HOPF; HUSSAIN, 2000; KAMPFER et
al., 2000; KESSEL, 2001), mas essas informações são conflitantes, inclusive porque Kampfer
179
e outros (2000) afirmam que a maior fonte geradora de IFNγ são os linfócitos. Entendemos
que as respostas histológicas com materiais biocompatíveis ou nos processos de reparação
normal, linfócitos Th1, linfócitos TCD8+ e células NK estejam ausentes ou sejam ocasionais,
conforme os resultados obtidos com o enxerto da MFCO. As evidências que encontramos em
imunoistoquímica sugeriram que não há resposta adaptativa, conforme o pequeno número de
células marcadas para IFNγ, com a membrana do tipo “c”. Os dados obtidos com o IFNγ são
concordantes com as conclusões de Kampfer e outros (2000), que não encontraram, nos
tecidos em reparação provocada em camundongos normais e diabéticos, a presença dessa
citocina, a despeito de terem encontrado IL-18, forte estimuladora de linfócitos e células NK.
Os dados negativos para IFNγ e positivos para IL-10, em ensaio imunoistoquímico e
imunoenzimático, respectivamente, resultaram na confirmação molecular dos resultados
histológicos descritos para a resposta dos tecidos à MFCO nos diversos tipos de preparação.
Além disso, a presença de células TCD4+ responderia com uma inibição na formação de
colágeno, o que não foi observado em nossos resultados; ao contrário, houve crescente
formação de colágeno, conforme os dados obtidos com o uso do corante Picrossírius. Como
tem sido relatado na literatura, o IFNγ é produto expressado pelos linfócitos TCD4+ (Th1),
TCD8+ e células NK (OBERHOLZER; OBERHOLZER; MOLDAWER, 2000; JANEWAY
et al., 2001), sendo uma citocina envolvida nos processos infecciosos bacterianos e virais
(ROSENBERG; GALLIN, 1999); e, portanto, esperada a sua diminuta participação ou a sua
não participação nos processos inflamatórios na regeneração de feridas não infectadas. A
resposta negativa para IFNγ nos tecidos com a membrana do tipo “c” confirma os dados
histológicos da ausência das células TCD4+ e TCD8+.
A resposta do tecido muscular à membrana do tipo “b” resultou em dados
semelhantes aos encontrados para o tecido conjuntivo com a mesma membrana, mas, graças à
180
dificuldade de uniformização das regiões no músculo, isso poderia resultar em dados
conflitantes, indicativos da sua não utilização para esse tipo de avaliação.
Stanford (1980) incluiu a presença de células gigantes como um item de aferição
da biocompatibilidade dos materiais, graduando-a em mínimo ou inexistente, moderado e
severo. A resposta dos tecidos conjuntivo e muscular apresentou uma quantidade pequena
dessas células nas adjacências da MFCO, nas primeiras semanas, e mínima ou eventual nas
últimas, semelhante à resposta dos tecidos a uma membrana de PTFE (SONOHARA;
GREGHI, 1994; MACEDO; JARDINI; OKAMOTO, 1995; DUPOIRIEUX; NEVES;
POURQUIER, 2000); melhores do que a resposta dos tecidos a uma membrana de celulose
(SONOHARA; GREGHI, 1994; MACEDO; JARDINI; OKAMOTO, 1995); semelhante à
resposta dos tecidos conjuntivo e muscular a partículas de casca de ovo (DUPOIRIEUX;
POURQUIER; SOUYRIS, 1995); a uma membrana de colágeno (BRUNEL et al., 1996); e a
uma membrana de polímero anidro (IBIM et al., 1998). Além do mais, as células gigantes
presentes podem não estar relacionadas à membrana, mas decorrentes de corpos estranhos
introduzidos no ato cirúrgico.
A variedade de produtos naturais e artificiais usados na clínica médica estética, na
odontológica estética e funcional, na veterinária e em pesquisas justifica esforços para o
aproveitamento da MFCO, uma vez que, conforme Linde (2000), o colágeno é eficiente na
entrega de drogas, mas facilmente atacado pela colagenase, o que o torna pouco confiável
como barreira ou membrana para a RTG. Entendemos que, analogamente, a MFCO pode ser
usada como entregadora de drogas livre do risco da ação da colagenase, eliminando a
necessidade de mudanças na estrutura protéica, em função da natural durabilidade e não
solubilidade, uma vez que nos experimentos de oito e dez semanas foi observada completa
integridade do produto, sugerindo que, especialmente nos tipos de preparação “c” e “d”, a
membrana pode ser incorporada aos tecidos sem necessidade de remoção nas áreas não
181
gengivais. É sugestivo o estudo do produto em forma fragmentada para servir de
preenchimento em pequenos defeitos ou restauração estética. Acrescente-se que as
membranas podem ter preparações delicadas e de fácil manuseio, diferentemente das
existentes no mercado, que são, muitas vezes, provocadoras de perfurações nos tecidos e,
portanto, sendo de manuseio complicado. Os resultados experimentais com a MFCO
sugeriram também que novas formulações e propósitos podem ser buscados, como produtos
transformados em pó para uso de preenchimento ou como produto protetor de feridas e
entregador de drogas para áreas de queimaduras, como é sugerido por Yi e outros (2004). A
MFCO, sobretudo a dos tipos “c” e “d”, pode ser usada, à semelhança do chitosan, para
cobertura de ferimentos, em humanos e animais.
Concluindo, podemos afirmar que todo o processo inflamatório observado foi
resultado do trauma cirúrgico, e a persistência de células como os macrófagos esteve
relacionada com o processo de incorporação e fixação do material inerte da MFCO. Em
nenhum dos preparados foi notado um processo indicativo de rejeição, como infiltração
linfocitária.
182
7 CONCLUSÃO
Considerando os resultados histológico, imunoistoquímico e imunoenzimático da
resposta dos tecidos à membrana fibrosa da casca do ovo (MFCO) nas condições
experimentais expostas, é possível concluir o que segue:
1. A membrana preparada com glutaraldeído, esterilizada em autoclave e não
esterilizada, é completamente biocompatível, não rejeitada, podendo ser usada como
membrana ou barreira para a técnica da regeneração tecidual guiada ou outros procedimentos.
2. A membrana preparada com álcool e esterilizada em autoclave é biocompatível,
podendo ser usada como membrana ou barreira para a técnica da regeneração tecidual guiada
ou outros procedimentos, embora tenha sido encapsulada por fibras, fibroblastos e
macrófagos.
3. A membrana preparada com água destilada em condições estéreis necessita ser
avaliada em, pelo menos, um grupo de animais no tempo de doze semanas, para determinar a
sua compatibilidade.
4. As evidências sugerem que a membrana preparada com glutaraldeído a 0,5%
pode ser mantida nos tecidos implantados, sendo apta a ser usada como material permanente.
5. É sugestivo que preparações sob a forma de pó ou bandas possam conduzir o
seu uso como preenchedora de defeitos para fins estéticos ou reparadores ou como material de
cobertura de feridas.
6. A ausência de células marcadas para IFN-γ sugere que não há resposta imune
específica e que, portanto, a membrana não libera nenhum tipo de proteína imunogênica que
possa desencadear uma resposta imune celular ou humoral.
183
7. A presença de IL-10 sugere que essa citocina é produzida por macrófagos,
confirmando a sua ação antiinflamatória e a capacidade dos macrófagos de produzi-la, em
concordância com relatos da literatura.
184
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191
ANEXOS
ANEXO A - PROTOCOLO DE ANESTESIA DO ATO OPERATÓRIO
DATA DA OPERAÇÃO: diversas ocasiões
GRUPO: grupos diversos
PROCEDIMENTO ANESTÉSICO
Xilazina-cetamina
Via: ............................................
Intercorrências
ATO OPERATÓRIO
Início: .................... Término: ..........................
Fios usados: ..............................................................
Intercorrências: Perda de quatro animais de diversos grupos em procedimento de anestesia.
192
ANEXO B - PROTOCOLO DA EVOLUÇÃO PÓS-OPERATÓRIA
EUTANÁSIA
Grupo: 3FES
EVOLUÇÃO PRÉ-OPERATÓRIA
IMEDIATA...................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.............................................................................................................
MEDIATA....................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.............................................................................................................
EUTANÁSIA: 1- Perdidos dez animais. Não foram encontradas as membranas implantadas.
Animais não contabilizados no total usado para a pesquisa.
2 - Perdidos quatro animais. Não foram encontradas quatro membranas
implantadas.
DATA: 1- Em 13/12/2003.
2 - Em 09/05/2004.
XILAZINA-CETAMINA: Sim x Não
ÉTER: Sim
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