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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E INFECTOLOGIA
Área de concentração: Parasitologia e Imunologia Aplicadas
Cariotipagem molecular de cepas KP1(+) e KP1(−) de
Trypanosoma rangeli e sintenia gênica com Trypanosoma cruzi
Marlene Cabrine dos Santos Silva
Uberaba, MG
2007
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ii
Marlene Cabrine dos Santos Silva
Cariotipagem molecular de cepas KP1(+) e KP1(−) de
Trypanosoma rangeli e sintenia gênica com Trypanosoma cruzi
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em
Medicina Tropical e Infectologia, área de concentração
em Parasitologia e Imunologia Aplicadas, da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro para
obtenção do título de Doutor em Medicina Tropical e
Infectologia.
Orientador: Prof. Dr. Luis Eduardo Ramírez Giraldo
Co-orientador: Prof. Dr. André Luiz Pedrosa
Uberaba, MG
2007
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iii
Este trabalho foi realizado com recursos financeiros da FAPEMIG (Programa de
Apoio a Jovens Doutores, Processo EDT319-05) e do CNPq (Centro Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, bolsa de produtividade, nível 1D), no Laboratório
da Disciplina de Parasitologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro.
iv
A Deus, pelo dom da minha vida.
Ao meu querido José Augusto, que com seu amor suaviza a
minha vida em todos os seus momentos e que com zelo
inestimável me ajudou na formatação da tese.
Aos meus pais, Ivone e José Romualdo, que sempre me
estimularam em todos os meus projetos e que são o
exemplo para a minha vida.
Aos meus irmãos Maria Alice, Claúdio, Márcia e Adriane, que
sempre se empenharam em me auxiliar em alguma tarefa
“extra-tese” durante o desenvolvimento deste trabalho,
refletindo o amor e carinho que me dedicam.
À minha sogrinha, Ziquinha, pelas suas orações.
Aos meus sobrinhos, Josué Filho, Guilherme, Talles José,
Henrique, Anderson Filho e Isadora, que foram
“abandonados” por mim durante este período e que sempre
foram uma das minhas grandes alegrias.
v
AGRADECIMENTOS
vi
Ao Prof. Dr. André Luiz Pedrosa pela sua valiosa co-orientação e ensinamento, sem os
quais o desenvolvimento deste trabalho não teria sido possível. Também pela sua atenção,
amizade e estímulo que foram e continuam sendo muito preciosos na minha caminhada.
Ao Prof. Dr. Luis Eduardo Ramírez Giraldo pela sua orientação, apoio e amizade em
todos os momentos e por sempre confiar na minha capacidade e me estimular.
À Profa. Dra. Márcia Benedita de Oliveira Silva pelo constante apoio durante o
trabalho, pela amizade constante e por sempre ouvir os meus desabafos.
Aos Profs. de Parasitologia Dra. Eliane Lages Silva e Dr. Wendell Sérgio Ferreira
Meira pela disponibilidade em me auxiliar em tudo em que foram solicitados.
Às amigas Keila, Deisy e Dani, pelo grande auxílio no desenvolvimento deste trabalho
e por tantos momentos compartilhados.
vii
À Profa. Dra. Angela Kaysel Cruz, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo (FMRP-USP) pelo acolhimento em seu laboratório para a
realização das hibridações radioativas e por disponibilizar o aparelho para eletroforese em
campo pulsátil, etapas fundamentais para a conclusão deste trabalho.
Ao Dr. Luiz Ricardo Orsini Tosi, FMRP-USP, pelo acolhimento e pela
disponibilização de seu laboratório para a utilização do CHEF Mapper, fundamental para
estabelecer os polimorfismos cariotípicos em T. rangeli.
À Viviane, Tânia, Marlei e demais funcionários e alunos do laboratório de
Parasitologia e Bioquímica da FMRP-USP.
À “turma do laboratório de Parasitologia”: Cidinha, Cida, Ana Cláudia, Luciano,
Átila, Patrícia, Pollyana, Cristina, Elaine, Jorge Marcelo, Gabriel, Sandra, Mariana, Cristiane,
e Tatiane, pela alegre convivência.
À Rosiley por muitas vezes auxiliar nas minhas atividades.
Aos Profs. Dr. Dalmo Correia Filho, Dr. Mário Leon Silva Vergara e Dr. Aluízio
Prata, que sempre confiaram no meu trabalho, e aos demais professores do curso de pós-
graduação. Também à Liliana, que sempre desenvolveu o seu trabalho com alegria e
competência.
Aos amigos da Pós-graduação, especialmente Luciana, Lúcio, Karine e Ana Cristina,
pela constante troca de informações.
Aos amigos Lílian, Ismael, Emerson, Walcilene, Ana Teresa, Odair e Mara que apesar
de tantos momentos não vividos, continuam leais no afeto por mim.
Aos meus cunhados e cunhada e a todos que de alguma forma contribuíram para a
realização deste trabalho.
viii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS............................................................................................................V
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................X
LISTA DE TABELAS........................................................................................................ XIII
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................XV
RESUMO...............................................................................................................................XX
ABSTRACT ..................................................................................................................... XXIII
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................26
1.1. Tripanossomíase americana: aspectos gerais............................................................27
1.2. Classificação do T. rangeli ..........................................................................................29
1.3. Diagnóstico diferencial entre T. rangeli e T. cruzi ....................................................30
1.4. Caracterização genética de T. cruzi e T. rangeli........................................................33
1.4.1. Caracterização genética de T. cruzi.....................................................................33
1.4.2. Caracterização genética de T. rangeli.................................................................38
1.5. Cariotipagem molecular .............................................................................................43
1.5.1. PFGE e os cromossomos de tripanossomatídeos...............................................45
1.5.2. PFGE e os cromossomos de T. rangeli................................................................49
1.6. Sintenia gênica.............................................................................................................52
2. OBJETIVOS.......................................................................................................................54
Objetivos específicos...........................................................................................................55
3. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................56
3.1. Cepas.............................................................................................................................57
3.1.1. Cultivo e manutenção das cepas..........................................................................57
3.1.2. Identidade e classificação das cepas....................................................................58
3.2. Análise de ácido nucléico ............................................................................................60
3.2.1. Obtenção e preparação de amostras de DNA....................................................60
3.2.1.1. Extração de DNA genômico..........................................................................60
3.2.1.2. Preparo de blocos de agarose com DNA genômico imobilizado ...............62
3.2.1.3. Extração de DNA plasmidial........................................................................62
3.2.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)......................................................................63
3.2.2.1. Amplificação da região telomérica de T. cruzi e subtelomérica de T.
rangeli pela PCR duplex ............................................................................................63
3.2.2.2. Amplificação pela PCR do gene de uma proteína hipotética de T. rangeli
......................................................................................................................................64
3.2.2.3. Amplificação pela PCR de um segmento gênico anônimo de T. rangeli...65
3.2.3. Condições de eletroforese em campo pulsátil (PFGE)......................................66
3.2.4. Digestão de DNA...................................................................................................68
3.2.4.1. Digestão de DNA genômico com endonucleases.........................................68
3.2.4.2. Digestão de DNA plasmidial com endonucleases........................................68
3.2.5. Transferência de DNA de T. rangeli e T. cruzi para suportes sólidos (Southern
blotting)............................................................................................................................69
3.2.6. Hibridação molecular...........................................................................................70
3.2.6.1. Obtenção de sondas.......................................................................................70
ix
3.2.6.2. Coleta das bandas para marcação radioativa.............................................70
3.2.6.3. Marcação radioativa .....................................................................................71
3.2.6.4. Condições de pré-hibridação, hibridação e lavagem das membranas......72
3.3. Estratégia para investigação de sintenia gênica entre T. cruzi e T. rangeli............72
3.4. Análise filogenética......................................................................................................74
4. RESULTADOS...................................................................................................................75
4.1. Caracterização cromossômica de T. rangeli..............................................................76
4.1.1. Determinação dos tamanhos dos cromossomos.................................................76
4.1.2. Determinação do número de bandas cromossômicas........................................80
4.1.3. Análise filogenética dos perfis de cariótipo molecular......................................82
4.2. Determinação do polimorfismo da região subtelomérica........................................82
4.3. Associação de marcadores moleculares ao DNA de T. rangeli................................84
4.3.1. Marcadores moleculares de T. rangeli de seqüências conhecidas....................85
4.3.1.1. Ubiquitina Hidrolase (UH) ............................................................................85
4.3.1.2. Proteína quinase (PK)....................................................................................85
4.3.1.3. Tirosina aminotransferase (TAT)................................................................86
4.3.1.4. Transportador de hexose (HT).....................................................................87
4.3.1.5. Proteína hipotética (HyP) .............................................................................89
4.3.2. Marcadores moleculares anônimos de T. rangeli ..............................................89
4.3.2.1. An01-04A........................................................................................................89
4.3.2.2. An02-09G........................................................................................................91
4.3.2.3. An04-01E........................................................................................................93
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................................102
6. CONCLUSÕES.................................................................................................................121
7. REFERÊNCIAS ...............................................................................................................124
x
LISTA DE ABREVIATURAS
xi
× g
aceleração da gravidade no sistema MKS (9,81 m/s
2
)
µg micrograma
18SrDNA gene que codifica a subunidade 18S do RNA ribossômico
24Sα rDNA gene que codifica a subunidade 24S alfa do RNA ribossômico
An01-04A seqüência anônima obtida do clone 01-04A da BGPTr
An01-04E seqüência anônima obtida do clone 01-04E da BGPTr
An02-09G seqüência anônima obtida do clone 02-09G da BGPTr
BGPTr biblioteca genômica parcial de Trypanosoma rangeli
BLAST
basic local alignament search tool
CA citosina adenina
CHEF
coutour-clamped homogeneous eletric field electrophoresis
CRK2
cycle control gene 2-related kinases
dATP desoxinucleosídeo adenina trifosfatado
dCTP desoxinucleosídeo citosina trifosfatado
DGCs
directional gene clusters
DGF-1 dispersed gene family-1
dGTP desoxinucleosídeo guanina trifosfatado
DNA ácido desoxirribonucléico
dTTP desoxinucleosídeo timina trifosfatado
EF1-α
elongation factor-1 alpha
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
ESAG
expression site-associated gene
gp glicoproteína
H2A histona 2A
hsp70
heat shock protein 70
HT
hexose transporter
xii
HyP
hypothetic protein
ITS
internal transcribed spacers
kb kilobases
kDa kilodalton
kDNA DNA do cintetoplasto
KMP-11 kinetoplastid membrane protein 11
KP1 minicírculo com uma região conservada
KP2 minicírculo com duas regiões conservada
KP3 minicírculo com quatro regiões conservada
LIT
liver infusion tryptose
LSSP
low-strigency single primer
M molar
MASP
mucin associated protein
Mb megabases
mers abreviação de oligomers
MLEE
multiloci enzyme electrophoresis
mM milimolar
NT
nick translation
pb pares de bases
PCR
polymerase chain reaction
PFGE
pulsed field electrophoresis
PK
protein kinase
pmol picomol
PSMD6
proteasome non-ATPase regulatory subunit 6
RAPD
random amplified polymorphic DNA
RHS retrotransposon hot spot
RIFI reação de imunofluorescência indireta
RNA ácido ribonucléico
rRNA RNA ribossômico
rRNAmtr
ribosomal RNA methyltransferase
SAPA
shed acute phase antigen
SIRE
short interspersed repetitive element
snoRNA small nucleolar RNA
SSU rRNA
small subunit ribosomal RNA
SubTr região subtelomérica de T. rangeli
TAT
tyrosin aminotransferase
TIGR
The Institute for Genomic Research
TM Triângulo Mineiro
TRF
terminal restriction fragment
Tritryps denominação dada por El-Sayed et al. (2005) aos parasitos T.
brucei, T. cruzi e L. major
TS
trans-sialidases
U unidades
UBE2
ubiquitin-conjugating enzyme 2
UH
ubiquitin hydrolase
UPGMA
unweighted pair group method with arithmatic mean
UV ultravioleta
V volts
VIPER
vestigial interposed retroelement
VSG
variant superficie glycoprotein
xiii
LISTA DE TABELAS
xiv
Tabela 1
Padronização da nomenclatura de Trypanosoma cruzi de acordo com
ANONYMOUS, 1999.....................................................................................
36
Tabela 2
Características das cepas de Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi
analisadas.........................................................................................................
59
Tabela 3
Iniciadores utilizados nas reações de amplificação em cadeia da polimerase
de segmentos gênicos de cepas de Trypanosoma rangeli e Trypanosoma
cruzi.................................................................................................................
61
Tabela 4
Sondas utilizadas em experimentos de hibridação em Southern blotting dos
cromossomos de Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi e do DNA
genômico digerido com diferentes enzimas de restrição desses
parasitos...........................................................................................................
73
Tabela 5
Determinação do número aproximado de bandas cromossômicas de cepas
de Trypanosoma rangeli separadas por eletroforese em campo pulsátil.........
81
Tabela 6
Resumo dos experimentos de hibridação realizados em Southern blotting de
cromossomos separados por eletroforese em campo pulsátil ou de DNA
genômico de cepas de Trypanosoma rangeli e de Trypanosoma cruzi
digerido com enzimas de restrição..................................................................
96
Tabela 7
Resultados da hibridação com as sondas UBE2, rRNAmtr e PSMD6 de
Trypanosoma cruzi aos cromossomos de cepas de T. cruzi e Trypanosoma
rangeli..............................................................................................................
101
xv
LISTA DE FIGURAS
xvi
Figura 1 Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando produtos de amplificação pela PCR
de um segmento do gene 24Sα do loco rDNA de Trypanosoma cruzi e
Trypanosoma rangeli a partir dos iniciadores D72/D75/RG3.......................
61
Figura 2 Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando produtos de amplificação pela PCR
de um segmento das regiões teloméricas de Trypanosoma cruzi e
subtelomérica de Trypanosoma rangeli com os iniciadores TrF3, TrR8,
Tc189Fw2 e Tc189Rv3.................................................................................
64
Figura 3 Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando produtos de amplificação pela PCR
de segmentos que codificam o gene de uma proteína hipotética e de uma
seqüência anônima de Trypanosoma rangeli a partir dos iniciadores ALP-
Tr01/ALP-Tr02 (A) e ALP-Tr07/ALP-Tr08 (B), respectivamente...............
65
Figura 4 Amplificação pela PCR dos segmentos dos genes que codificam
segmentos dos genes UBE2, rRNAmtr e PSMD6 de cepas de
Trypanosoma cruzi com os iniciadores Tc2F/Tc2R, Tc4F/Tc4R e
Tc9F/Tc9R, respectivamente.........................................................................
67
Figura 5 Gel de agarose 1% contendo fragmentos de DNA plasmidial obtidos da
biblioteca genômica parcial de T. rangeli digerido com as endonucleases
EcoRI e HindIII.............................................................................................
69
xvii
Figura 6 Fluxograma representativo dos procedimentos realizados para a obtenção
de sondas por PCR (A) ou por digestão enzimática dos plasmídeos com
insertos de Trypanosoma rangeli (B)............................................................
70
Figura 7 Representação esquemática no contig de Trypanosoma cruzi dos genes
que codificam a enzima E2 conjugadora de ubiquitina (UBE2), a rRNA
metiltransferase (rRNAmtr) e a subunidade 6 não-ATPase regulatória do
proteassomo, disponível no bando de dados www.tigr.org...........................
74
Figura 8 Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio.
O aparelho foi programado para separar cromossomos entre 300kb e
900kb.............................................................................................................
78
Figura 9 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio.
O aparelho foi programado para separar bandas cromossômicas entre
900kb e 3.000kb. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda SubTr
correspondente à região subtelomérica de T. rangeli....................................
78
Figura 10 Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio.
O aparelho foi programado para separar cromossomos entre 300kb e
1.500kb. B. Fenograma gerado pela análise dos perfis de bandas
cromossômicas das cepas de T. rangeli apresentadas em A..........................
79
Figura 11 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio.
B. Hibridação em Southern blotting com a sonda SubTr correspondente à
região subtelomérica de T. rangeli................................................................
81
Figura 12 Representação esquemática do cariótipo de Trypanosoma rangeli...............
83
Figura 13 A. Gel de agarose 1% corado pelo brometo de etídio contendo DNA
genômico de cepas de Trypanosoma rangeli e de Trypanosoma cruzi
digerido com RsaI. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda
SubTr correspondente à região subtelomérica de T. rangeli.........................
84
Figura 14 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados pela PFGE no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio.
B. Hibridação em Southern blotting com a sonda UH de T.
rangeli............................................................................................................
85
Figura 15 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio.
O aparelho foi programado para separar cromossomos entre 300 e 950kb.
B. Hibridação em Southern blotting com a sonda PK de T. rangeli.............
86
xviii
Figura 16 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda TAT de T. rangeli........................................
87
Figura 17 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda HT de T. rangeli..........................................
88
Figura 18 A. Gel de agarose 1% contendo os fragmentos de restrição do DNA
genômico de cepas de Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi
digerido com EcoRV e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda HT de T. rangeli. C. Superexposição ao
filme de raios-X da hibridação com a sonda HT...........................................
88
Figura 19 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda HyP de T. rangeli que alinhou com uma
proteína hipotética de T. cruzi no banco genômico.......................................
90
Figura 20 A. Gel de agarose 1% mostrando os fragmentos de restrição do DNA
genômico de cepas do Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi
digerido com EcoRI e corado pelo brometo de etídio B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda HyP de T. rangeli que alinhou com uma
proteína hipotética de T. cruzi no banco genômico.......................................
90
Figura 21 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados pela PFGE no CHEF DR II e corados pelo brometo de etídio. B.
Hibridação em Southern blotting com a sonda An01-04A de Trypanosoma
rangeli. C. Hibridação em Southern blotting com a sonda An02-09G de T.
rangeli............................................................................................................
92
Figura 22 A. Gel de agarose 1% contendo os fragmentos de restrição do DNA
genômico digerido de cepas do Trypanosoma rangeli e Trypanosoma
cruzi com EcoRI e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda An01-04A de T. rangeli...............................
92
Figura 23 A. Gel de agarose 1% contendo os fragmentos de restrição do DNA
genômico digerido de cepas de Trypanosoma rangeli e Trypanosoma
cruzi com BamHI e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda An02-09G de T. rangeli...............................
93
Figura 24 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli
separados por PFGE e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda An04-01E de T. rangeli...............................
94
Figura 25 A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma cruzi
separados por PFGE e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação em
Southern blotting com a sonda An04-01E de T. rangeli...............................
94
xix
Figura 26 Representação esquemática da associação de marcadores moleculares ao
cariótipo de T. rangeli...................................................................................
95
Figura 27 A, C e E. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma
cruzi separados por PFGE e corados com brometo de etídio. B, D e F:
Hibridação em Southern blotting com as sondas UBE2, rRNAmtr e
PSMD6 de T. cruzi, respectivamente............................................................
98
Figura 28 A, C e E. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma
rangeli separados por PFGE e corados com brometo de etídio. B, D e F.
Hibridação em Southern blotting, a 62ºC, com as sondas UBE2, rRNAmtr
e PSMD6 de T. cruzi, respectivamente..........................................................
99
Figura 29 Representação esquemática do cariótipo de T. rangeli, associado com o
marcador molecular UBE2............................................................................
100
Figura 30 Representação esquemática dos possíveis genótipos para o perfil de
hibridação gerado pelas sondas An01-04A e An02-09G no cariótipo
molecular das cepas de T. rangeli KP1(+) e KP1(−).....................................
109
xx
RESUMO
xxi
O Trypanosoma rangeli é um protozoário não patogênico ao homem e outros
hospedeiros vertebrados, que compartilha com o Trypanosoma cruzi os vetores, os
hospedeiros e a distribuição geográfica. Da mesma forma que o T. cruzi, o T. rangeli
apresenta extensa variabilidade genética, refletida tanto na organização do DNA nuclear
quanto na organização de minicírculos do kDNA. Neste estudo o cariótipo molecular de dez
cepas T. rangeli, seis do genótipo KP1(+) e quatro do genótipo KP1(−), foi analisado e
associado com oito novos marcadores moleculares de T. rangeli, sendo cinco deles
correspondentes às seqüências das proteínas ubiquitina hidrolase, proteína quinase, tirosina-
aminotransferase, transportador de hexose e de uma proteína hipotética e três deles
representantes de seqüências anônimas. O perfil cariotípico observado foi polimórfico entre as
cepas tanto em relação ao número como ao tamanho dos cromossomos. Apesar da
heterogeneidade detectada, a análise dos perfis cariotípicos permitiu a divisão das cepas do
xxii
parasito em dois grupos, que foram coincidentes com os genótipos KP1(+) e KP1(−). Os
resultados de hibridação mostraram que, com exceção da sonda transportadora de hexose,
todas as sondas tiveram um padrão de hibridação distinto entre as cepas KP1(+) e as cepas
KP1(−). O sinal de hibridação foi menos intenso nas cepas KP1(−), mostrando que existe
divergência de seqüência destes segmentos gênicos entre os dois genótipos. A análise da
região subtelomérica de T. rangeli, que em outros tripanossomatídeos está associada à origem
de polimorfismo de tamanho dos cromossomos, revelou um perfil distinto de hibridação nas
cepas KP1(+) e KP1(−), sugerindo a ocorrência de particularidades na organização das
regiões subteloméricas nos dois genótipos. Adicionalmente, foi associada ao estudo de
cariotipagem de T. rangeli a investigação da ocorrência de sintenia gênica entre este parasito e
T. cruzi. Assim, três segmentos de genes sintênicos previamente detectados entre os parasitos
T. cruzi, T. brucei, L. major, L. braziliensis e L. infantum, que codificam a enzima E2
conjugadora de ubiquitina, a rRNA metiltransferase e a subunidade 6 não-ATPase regulatória
do proteassomo, foram amplificados a partir do DNA genômico de T. cruzi e hibridados aos
cromossomos de T. rangeli separados por PFGE. Os resultados mostraram o mesmo padrão
de hibridação das três sondas aos cromossomos de T. rangeli e expandiram a ocorrência de
sintenia em tripanossomatídeos para este parasito. A investigação de sintenia gênica entre os
tripanossomatídeos patogênicos e o T. rangeli pode levar à caracterização de alvos candidatos
para uma terapêutica contra os primeiros e para o desenvolvimento de ferramentas para o
diagnóstico diferencial entre T. cruzi e T. rangeli. Em conclusão, as cepas de T. rangeli deste
trabalho apresentaram diferenças importantes em relação ao cariótipo, organização da região
subtelomérica e associação de marcadores moleculares aos cromossomos dos parasitos que
puderam ser correlacionadas com os genótipos KP1(+) e KP1(−), sugerindo que as variações
biológicas observadas entre as cepas podem ser correlacionadas com características genéticas
observadas.
xxiii
ABSTRACT
xxiv
Trypanosoma rangeli is a non-pathogenic protozoan parasite for humans and other
vertebrates that share with Trypanosoma cruzi their vectors, hosts and the geographical
distribution. Similarly to T. cruzi, T. rangeli presents extensive genetic variability, which is
reflected both in the organization of nuclear DNA and of kDNA minicircles. In this study, the
molecular karyotype of ten T. rangeli strains, six of the KP1(+) genotype and four of the
KP1(−) genotype, was analyzed and associated with eight new molecular markers of T.
rangeli; five of them correspond to the sequences coding for the ubiquitin hydrolase, protein
kinase, tyrosine-aminotransferase, hexose transporter, and a hypothetical protein and three of
them represent anonymous sequences. The observed karyotype profile was polymorphic
between the strains, as determined by both the number and the size of chromosomal bands.
Despite the heterogeneity detected, the analysis of karyotypic profiles allowed the division of
parasite strains in two clusters, that were entirely coincident with the KP1(+) and KP1(−)
xxv
genotypes. Hybridization results showed that, with exception of the probe hexose transporter,
all the other probes presented a hybridization pattern capable of distinguishing between the
KP1(+) and KP1(−). The hybridization signal was consistently less intense in KP1(−) strains,
probably due to the result of sequence divergence of these gene segments among the two
genotypes. The analysis of T. rangeli subtelomeric region, which in other trypanosomatids is
associated to the origin of chromosomal size polymorphism, revealed distinct hybridization
profiles for KP1(+) and KP1(−) strains, suggesting the occurrence of particularities in the
organization of the subtelomeric regions in the two genotypes. Additionally, the investigation
of the gene synteny occurrence between T. rangeli and T. cruzi was associated to the
karyotyping study of T. rangeli. Accordingly, three syntenic segments of genes previously
detected in T. brucei, T. cruzi, L. major, L. braziliensis and L. infantum parasites that codify
the ubiquitin-conjugating enzyme E2, the ribosomal RNA methytransferase and the
proteasome non-ATPase regulatory subunit 6, were amplified from the T. cruzi genomic DNA
and hybridized to the PFGE-separated chromosomes of T. rangeli. The results showed the
same hybridization profile for the three probes to chromosomes of T. rangeli and expanded
the occurrence of synteny in trypanosomatids for this parasite. The investigation of gene
synteny between pathogenic trypanosomatids and T. rangeli can lead to the characterization
of candidate targets for therapeutic interventions against the first and for the development of
differential diagnostic tools between T. cruzi and T. rangeli.
In conclusion, the T. rangeli strains studied in this work presented important
differences associated to the molecular karyotype, the organization of subtelomeric regions
and the association of molecular markers to the parasite’s chromosomes that could be
correlated with the KP1(+) and KP1(−) genotypes, suggesting that the biological diversity
described among the strains can be correlated with the genetic characteristics of the parasite.
26
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
1. INTRODUÇÃO
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
1.1. Tripanossomíase americana: aspectos gerais
Nas Américas existem duas espécies de tripanossomas que infectam o homem: o
Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli. O T. cruzi causa a doença de Chagas, que afeta
em torno de 18 milhões de pessoas na América Latina, levando a 21 milhões de mortes por
ano e deixando 100 milhões expostas ao risco de infecção (WHO, 2002). A doença apresenta
uma fase crônica diferente em cada hospedeiro, que pode evoluir para as seguintes formas
clínicas: indeterminada, cardíaca e digestiva (BRENER e CHIARI, 1967; KOBERLE, 1968;
LOPES et al., 1989). Tais manifestações apresentam também variação regional, sendo no
Brasil, a forma indeterminada a mais comum (60-70%), seguida pela forma cardíaca (20-
30%) (CASTRO et al., 1992; LUQUETTI et al., 1986; PRATA, 2001). Tal variação é
28
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
atribuída principalmente à heterogeneidade genética das cepas de T. cruzi e, possivelmente, à
interação parasito-hospedeiro (MACEDO, 2002).
O T. rangeli, diferente do T. cruzi, é um parasito não-patogênico para o homem,
animais domésticos e silvestres, mas patogênico para diferentes espécies de triatomíneos .
Está distribuído em ampla região geográfica, sendo encontrado em diferentes países da
América Central e do Sul (D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999), inclusive no Brasil, em
diferentes vetores e hospedeiros vertebrados (BARRETT e SILVA OLIVEIRA, 1977;
D'ALESSANDRO e HINCAPIE, 1986; D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999; DEANE,
1958; DIOTAIUTI et al., 1992; GURGEL-GONCALVES et al., 2004; LUCENA e
VERGETTI, 1973; MILES et al., 1983; RAMIREZ et al., 2002; RAMIREZ et al., 1998;
STEINDEL et al., 1991).
Infecções humanas com este parasito têm sido observadas em diferentes países da
América Central e do Sul, como na Venezuela (D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999;
MAEKELT e DIAZ-VASQUEZ, 1962), Guatemala (DE LEÓN, 1949; PAZ-BAILEY et al.,
2002), Panamá (SALDANA et al., 2005; SOUSA e JOHNSON, 1971), Honduras (ACOSTA
et al., 1991), Colômbia (D'ALESSANDRO, 1976), Brasil (COURA et al., 1996), além de
outros (GUHL e VALLEJO, 2003).
Infecções mistas com T. cruzi e T. rangeli podem ocorrer uma vez que eles coexistem
na mesma área geográfica, compartilhando os mesmos hospedeiros e vetores. O diagnóstico
parasitológico poderia distinguir a infecção pelo exame de suas formas tripomastigotas
sangüíneas, que apresentam diferenças morfológicas importantes. No entanto, a parasitemia é
baixa em seu hospedeiro, tornando necessária a realização da hemocultura ou xenodiagnóstico
para demonstração dos parasitos, o que não os distinguiria uma vez que as formas
epimastigotas observadas por estes métodos, são morfologicamente semelhantes
(D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999).
29
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
1.2. Classificação do T. rangeli
O estudo de T. rangeli envolve questões que se referem à sua posição taxonômica e ao
seu ciclo de vida no hospedeiro vertebrado. Sua classificação é incerta porque ele apresenta
tanto características de tripanossomas da seção Salivaria quanto da Stercoraria
(D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999). Como características da seção Stercoraria, ele
possui as formas tripomastigotas sangüíneas semelhantes às do Trypanosoma lewisi, um
parasito de rato, representante desta seção e do subgênero Herpetosoma, e as formas
epimastigotas que são predominantes no intestino dos triatomíneos e de fácil cultivo em meios
axênicos. No entanto, semelhante aos parasitos da seção Salivaria, o T. rangeli é transmitido
pela inoculação nos hospedeiros vertebrados de metatripomastigotas, desenvolvidas nas
glândulas salivares do vetor (D'ALESSANDRO, 1976), embora seja discutido na literatura a
possibilidade de transmissão pela via contaminativa, uma vez que formas epimastigotas e
tripomastigotas longas, presentes nas fezes do vetor, não são lisadas pelo complemento do
hospedeiro vertebrado (D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999; MARINKELLE et al., 1985;
SCHOTTELIUS, 1982). Além disso, D'ALESSANDRO e SARAVIA (1999) consideram que
a transmissão pela via inoculativa é ocasional, pois a taxa natural de infecção das glândulas
salivares entre Rhodnius prolixus, seu vetor mais importante, é de 10%. HOARE (1972),
analisando esses dados, considerou que o T. rangeli tinha mais características de Stercoraria
do que de Salivaria e, por isso, o classificou na seção Stercoraria, subgênero Herpetosoma.
Segundo ANEZ (1982) tal classificação precisa ser revista uma vez que o T. rangeli
apresenta características específicas, tais como: patogenicidade e capacidade de se estabelecer
e multiplicar na hemolinfa e glândulas salivares do vetor (D'ALESSANDRO, 1976), infecção
não-patogênica em ampla variedade de hospedeiros vertebrados e manutenção na circulação
sangüínea por tempo limitado, apesar de não ser conhecido o mecanismo de sua multiplicação
(D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999). Com base nestas diferenças, ANEZ (1982) propôs
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
que o T. rangeli fosse classificado dentro da seção Salivaria, num subgênero novo que seria
denominado de Tejeraria. No entanto, essa classificação é questionável uma vez que, foi
demonstrada posteriormente, a formação de amastigotas em histiócitos humanos (OSORIO et
al., 1995) e em tecidos de camundongos infectados experimentalmente (SCORZA et al.,
1986; URDANETA-MORALES e TEJERO, 1986), apesar destes últimos resultados serem
controversos (D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1999).
Mais recentemente, alguns autores (MAIA-DA-SILVA et al., 2004b; STEVENS e
GIBSON, 1999; STEVENS et al., 2001; STEVENS et al., 1999) sugeriram que o T. rangeli
permaneça na seção Stercoraria, mas dentro do subgênero Schizotrypanum, uma vez que, a
análise filogenética das seqüências do gene 18S rDNA e do gene do mini-exon de várias
espécies de tripanossomas mostrou que o T. rangeli ficava agrupado na chave de T. cruzi e
separado da chave de parasitos do subgênero Herpetosoma. No entanto, cautela é sugerida na
avaliação dos dados filogenéticos e que mais de um marcador molecular seja analisado, com
maior número e diversidade de cepas, antes de uma reclassificação (GRISARD, 2002;
STEVENS et al., 1999).
1.3. Diagnóstico diferencial entre T. rangeli e T. cruzi
Um método sorológico adequado para rotina de laboratório que diferencie a infecção
por T. cruzi e T. rangeli ainda não foi definido, visto que reações cruzadas podem ser
observadas, dependendo do método e antígenos utilizados, e que alguns deles apresentam
custo elevado além de exigirem treinamento de pessoal. Isso faz com que o quadro
epidemiológico real da rangeliose permaneça desconhecido (CUBA CUBA, 1998).
A imunoreatividade cruzada entre T. cruzi e T. rangeli pode ocorrer porque eles
compartilham 60% do conteúdo antigênico (AFCHAIN et al., 1979; GUHL e
MARINKELLE, 1982) e foi observada por vários autores pelas técnicas RIFI, ELISA e
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
immunoblotting (ANTHONY et al., 1981; BASSO et al., 1989; O'DALY et al., 1994;
SALDANA e SOUSA, 1996; VASQUEZ et al., 1997). Em revisões, CUBA CUBA (1998) e
D'ALESSANDRO e SARAVIA (1999) chamam a atenção para o fato de que nesses trabalhos
tem-se demonstrado que a imunoreatividade cruzada é marcante entre anticorpos anti-T. cruzi
e antígenos de T. rangeli e ausente ou fraca entre anticorpos anti-T. rangeli e antígenos de T.
cruzi. Esses dados mostram que o aumento da especificidade dos métodos sorológicos, pelo
uso de antígenos recombinantes, pode auxiliar na resolução deste problema. Alguns autores
mostraram que o uso de anticorpos monoclonais em RIFI e ELISA com epimastigotas obtidos
de cultura ou da ampola retal de triatomíneos infectados experimentalmente com T. rangeli ou
T. cruzi eliminou a reação cruzada observada entre soro total de camundongos imunizados
com um ou outro parasito (ACOSTA et al., 1991; ANTHONY et al., 1981; HUDSON et al.,
1987; SALDANA e SOUSA, 1996). No entanto, anticorpos monoclonais anti-T. rangeli
reagiram fortemente com cepas de T. rangeli isoladas de diferentes hospedeiros em Honduras,
na Venezuela e na Colômbia e apresentaram fraca reação com duas cepas de Santa Catarina,
mostrando que existem diferenças na constituição antigênica da superfície das cepas do
parasito que devem ser levadas em consideração na padronização do método (GRISARD et
al., 1999a).
Além desses métodos, nos últimos anos, várias proteínas capazes de diferenciar a
infecção de T. rangeli e T. cruzi foram purificadas, tais como a proteína de 48kDa
(SALDANA; HARRIS et al., 1998) e as proteínas de membrana de 90kDa, 85kDa e 56kDa
de T. rangeli e de 30kDa, 70kDa e 100kDa de T. cruzi ancoradas por glicofosfatidil-inositol
(ANEZ-ROJAS et al., 2006). Além dessas proteínas, peptídeos sintéticos, tais como o
antígeno de fase aguda (SAPA), também foram capazes de distinguir as duas infecções
(CAZZULO e FRASCH, 1992; SALDANA et al., 1993), embora isso não foi observado por
VASQUEZ et al. (1997). Apesar do conhecimento de peptídeos e proteínas específicas de T.
32
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
rangeli, nenhum método diagnóstico foi definido, ainda, para a utilização em rotina. É
necessário que estes peptídeos e/ou proteínas sejam testados com vários soros de pacientes
procedentes de diferentes áreas endêmicas para a doença de Chagas e rangeliose.
Além dos métodos parasitológicos e sorológicos, métodos bioquímicos e moleculares
podem ser utilizados para diferenciar T. cruzi e T. rangeli. Destacam-se entre estes aqueles
baseados na análise de proteínas e perfis antigênicos, tais como lecitinas (SCHOTTELIUS et
al., 1986), atividade de sialidase (MEDINA-ACOSTA et al., 1994; SALDANA;SOUSA et
al., 1998), produção de neuramidase (PEREIRA e MOSS, 1985) e isoenzimas (MIRALLES et
al., 2002; SARAVIA et al., 1987; STEINDEL et al., 1994; STEINDEL et al., 1992) e aqueles
baseados na análise do DNA nuclear ou do kDNA. Estes últimos podem ser divididos em
métodos de detecção direta e aqueles de amplificação do DNA ou kDNA por PCR
(polymerase chain reaction). Os métodos de detecção direta do DNA incluem análise de
esquizodema (GONCALVES et al., 1991), hibridização molecular (GREIG et al., 1990) e
DNA fingerprinting (MACEDO et al., 1993). Os métodos baseados na amplificação do DNA,
por sua vez, podem ser subdivididos naqueles de amplificação específica de fragmentos de
DNA (PCR), de amplificação aleatória do DNA (RAPD - Randomly Amplified Polymorphic
DNA) (STEINDEL et al., 1994; STEINDEL et al., 1993) e aqueles que avaliam
polimorfismos do fragmento amplificado (LSSP - Low-strigency single primer) (GRISARD et
al., 1999b; MARQUEZ et al., 2007). No entanto, os métodos de amplificação específica do
DNA são os mais empregados devido à sua praticidade e alta sensibilidade. Vários alvos são
utilizados para a PCR, tais como, os genes que codificam o arranjo do mini-exon (GRISARD
et al., 1999b; MURTHY et al., 1992; RAMOS et al., 1996), uma proteína flagelar (SILBER
et al., 1997), uma cisteína proteinase (TANAKA, 1997), a subunidade maior do RNA
ribossômico (SOUTO et al., 1999; VALLEJO et al., 1999), o snoRNA (small nucleolar
RNA) (MORALES et al., 2002) e a histona H2A/SIRE (PAVIA et al., 2007), além dos
33
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
minicírculos do kDNA (VALLEJO et al., 1999), do elemento repetitivo P452 (VARGAS et
al., 2000) e das regiões teloméricas e subteloméricas dos cromossomos (CHIURILLO et al.,
2003).
Contudo, os métodos discutidos, ainda não são apropriados para diagnóstico de rotina,
uma vez que requerem treinamento de pessoas e ambientes próprios, além do custo
permanecer elevado.
Os métodos de diagnóstico molecular têm permitido além da diferenciação das
espécies, a caracterização genética intraespecífica das cepas de T. rangeli, que será discutida
no item 1.4.2.
1.4. Caracterização genética de T. cruzi e T. rangeli
A caracterização molecular dos tripanossomas pode auxiliar no esclarecimento dos
aspectos relacionados à evolução, epidemiologia, patogenia e biologia das diferentes espécies
e de suas conseqüências para o hospedeiro. Esta tem sido realizada há muitos anos por vários
pesquisadores e muitas técnicas diferentes têm sido utilizadas para a caracterização de
diversos parasitos e, muitas vezes, um método utilizado para um organismo é útil também
para a caracterização de outro. Dessa forma, a caracterização molecular de T. cruzi tem sido
modelo para a caracterização molecular de T. rangeli.
1.4.1. Caracterização genética de T. cruzi
Desde o início do estudo da doença de Chagas é observado que o T. cruzi apresenta
heterogeneidade genotípica e fenotípica entre as cepas em relação ao comportamento
biológico, patológico e imunológico. A heterogeneidade em nível molecular foi inicialmente
verificada por TOYE (1974), pela análise dos perfis eletroforéticos de isoenzimas gerados por
cepas de T. cruzi. Esses perfis foram chamados de zimodemas por (MILES et al., 1977).
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Introdução
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A análise de isoenzimas de alguns isolados de T. cruzi mostrou perfis diferentes entre
eles e permitiu agrupá-los em três a quatro grupos maiores ou três a quatro zimodemas
(MILES et al., 1980; ROMANHA et al., 1979). Quando este tipo de estudo foi ampliado para
15 isoenzimas e maior número de isolados, pelo menos 43 zimodemas puderam ser
identificados (TIBAYRENC e BRENIERE, 1988). No entanto, a análise dos perfis de
isoenzimas e RAPD levou à hipótese de que, apesar das diferenças individuais das cepas, os
isolados de T. cruzi poderiam ser subdivididos em duas linhagens principais (TIBAYRENC,
1995; TIBAYRENC et al., 1993).
A análise de esquizodemas, que são perfis genéticos observados para as cepas do T.
cruzi, gerados a partir da digestão enzimática do produto de PCR de 330pb do kDNA,
confirmaram e estenderam os resultados obtidos pela análise dos zimodemas (MOREL et al.,
1980). Posteriormente, foi avaliada a caracterização das cepas pela análise do DNA nuclear,
pela técnica do DNA fingerprinting, que detecta simultaneamente diferenças em um grande
número de loci hipervariáveis, por uso de sondas multiloci (MACEDO et al., 1992). No
entanto, os resultados encontrados foram similares aos obtidos pela análise de esquizodemas
(MACEDO e PENA, 1998).
Estudos posteriores compararam as seqüências do gene 24Sα rDNA de T. cruzi
(ARRUDA et al., 1990) com os ortólogos de outros tripanossomatídeos (Crithidia fasciculata
e Trypanosoma brucei) e mostraram que eles apresentam alta identidade, exceto para regiões
discretas. O domínio mais divergente corresponde a um segmento de cerca de 100pb
localizado na porção 3’ final do gene de T. cruzi, para o qual os iniciadores específicos (D71 e
D72) foram desenhados (SOUTO e ZINGALES, 1993) a fim de amplificar o DNA de
diferentes cepas de T. cruzi e observou-se que um grupo de cepas amplificou um produto de
125pb (grupo ou linhagem 1) e o outro um produto de 110pb (grupo ou linhagem 2).
35
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Posteriormente, a amplificação pela PCR de uma porção da repetição em tandem do
gene do mini-exon mostrou que 88 isolados de T. cruzi de diferentes origens também foram
divididos em dois grupos, os que amplificaram produtos de 300pb e aqueles que amplificaram
produtos de 350pb. Para surpresa dos autores, estes dois marcadores independentes
produziram resultados que puderam ser associados e, juntos, eles confirmaram a divisão das
populações de T. cruzi em três grupos ou linhagens: grupo 1, aquelas populações de T. cruzi
que amplificavam o produto de 125pb do DNA e o produto de 300pb do mini-exon; grupo 2,
aquelas que amplificavam o produto de 110pb do gene do rRNA e de 350pb do mini-exon e o
grupo 1/2, aquelas que apresentavam ambos os produtos de amplificação do rDNA e o
produto de 300pb do mini-exon. Além disso, a análise dos perfis gerados destes isolados pela
RAPD produziu um fenograma que indicou claramente dois braços principais, um que
agregava as cepas do grupo 2 e outro que associava as cepas do grupo 1 e 1/2 (SOUTO et al.,
1996).
Em outro estudo, 157 isolados de T. cruzi obtidos de humanos, triatomíneos e
diferentes mamíferos silvestres de 12 estados brasileiros foram analisados pela PCR com estes
dois marcadores (24Sα rDNA e mini-exon), sendo demonstrado que os parasitos do grupo 1
estavam circulando no ciclo doméstico e os do grupo 2 circulavam tanto no doméstico quanto
no silvestre, mas, principalmente, neste último (ZINGALES et al., 1998). Essa relação
epidemiológica já tinha sido sugerida por outros autores em relação aos zimodemas, onde os
parasitos do grupo Z1 foram relacionados ao ciclo silvestre e os do grupo Z2 ao ciclo
doméstico (MILES et al., 1977).
Todos estes métodos utilizados mostram a grande diversidade genética do T. cruzi,
descrita pelos diferentes autores pelo uso de vários termos, dificultando a correlação dessa
diversidade com as manifestações clínicas e a epidemiologia da doença e a interação com os
diferentes hospedeiros e vetores. Por isso, em uma reunião no Rio de Janeiro, em 1999, vários
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
pesquisadores analisaram a nomenclatura atribuída às cepas de T. cruzi em cada método e
definiram uma nomenclatura padrão, que passou a ser adotada desde então (Tabela 1). As
cepas que não se enquadrarem nestes grupos ou que ainda não foram classificadas podem ser
chamadas simplesmente de T. cruzi (ANONYMOUS, 1999).
Tabela 1 – Padronização da nomenclatura de Trypanosoma cruzi de acordo com
ANONYMOUS, 1999.
Cepas não híbridas Cepas supostamente
híbridas
Metodologia Referências
T. cruzi I T. cruzi II T. cruzi
(1)
Isoenzimas (BARRETT et al.,
1980; MILES et al.,
1984; MILES et al.,
1978; MILES et al.,
1977)
Z1 Z2 Z2b
Z3 (não híbrida)
Isoenzimas (ROMANHA et al.,
1979)
−
ZA ZB
Parâmetros
biológicos e
histopatológicos
(ANDRADE, 1974) Tipo III TipoII TipoI
PCR: 24Sα
rRNA, mini-exon
RAPD
(SOUTO et al., 1996) linhagem 2 linhagem 1 grupo1/2
MLEE
RAPD
(TIBAYRENC, 1995) linhagem 1 linhagem 2 genótipo 39
18S rRNA (CLARK e PUNG,
1994)
Ribodema
II/III
Ribodema I
−
(1)
A designação destas cepas não foi definida.
Apesar da divisão do T. cruzi em dois grupos, cada um deles mostra considerável
heterogeneidade em relação à diversidade genética, geográfica e ecológica. Com essa visão,
(BRISSE;BARNABE et al., 2000) investigaram a diversidade dentro de cada grupo, pelo
estudo de 50 cepas de T. cruzi pela RAPD com 20 iniciadores e MLEE (multiloci enzyme
electrophoresis) com 20 enzimas. A análise filogenética dos dados gerados mostrou que o T.
cruzi II poderia ser subdividido em cinco linhagens, que denominaram de 2a, 2b, 2c, 2d e 2e,
e posteriormente foi padronizado como IIa-IIe (BRISSE;DUJARDIN et al., 2000).
37
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Uma combinação dos produtos obtidos pela PCR que amplificam os genes 24Sα
rDNA, 18S rDNA e os espaçadores internos não-transcritos (ITS) do gene do mini-exon foi
realizada por (BRISSE et al., 2001). Isso permitiu a classificação de 44 cepas nas seis
linhagens propostas anteriormente (BRISSE;BARNABE et al., 2000). A utilização dessas
técnicas na caracterização de 28 cepas de T. cruzi isoladas no Paraguai, de diferentes
hospedeiros silvestres e vetores, permitiu a diferenciação dos subgrupos IIc e IId, mas não IIb
e IIe, que apresentaram produtos de amplificação de 125pb para o gene 24Sα rDNA, 300 para
o mini-exon e 165pb para o 18S rDNA (YEO et al., 2005).
BRISSE; BARNABE et al. (2000) observaram que os subgrupos IIa e IIc eram quase
exclusivamente encontrados em ambientes silvestres, enquanto que os subgrupos IIb, IId e IIe
foram encontrados em humanos e triatomíneos domésticos. Os parasitos do grupo I foram
encontrados tanto em humanos e vetores domésticos quanto em ambientes silvestres. YEO et
al. (2005) apresentaram evidências de que existe associação entre T. cruzi I e gambás e T.
cruzi II e tatus.
Recentemente, a análise de 75 cepas de T. cruzi pela amplificação de cinco
microssatélites nucleares de repetição CA, do domínio divergente D7 do gene 24Sα rDNA e
do gene mitocondrial da subunidade II da citocromo oxidase mostrou a existência de uma
linhagem do parasito, denominada de T. cruzi III (FREITAS et al., 2006). De acordo com os
autores, existem três linhagens de T. cruzi: o T. cruzi I, o T. cruzi II, representado pelos
parasitos classificados como IIb, e o T. cruzi III, representado pelos parasitos classificados
como IIc. As linhagens IId e IIe seriam originárias de genótipos híbridos das cepas de T. cruzi
IIb e IIc ao longo da evolução. A linhagem IIa não pôde ser encaixada neste modelo,
mostrando a complexidade da diversidade de T. cruzi.
Em resumo, muito se tem a esclarecer sobre a interação T. cruzi-hospedeiro-vetor e
sabe-se que os estudos moleculares são fundamentais para essa compreensão.
38
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
1.4.2. Caracterização genética de T. rangeli
Até a década de 1990, poucos estudos dos aspectos moleculares e bioquímicos do T.
rangeli haviam sido feitos, mas eles já apontavam a diversidade molecular deste parasito,
embora menor do que a observada em T. cruzi (D'ALESSANDRO e SARAVIA, 1992).
A análise dos padrões de isoenzimas de apenas duas cepas de T. rangeli, uma do
Brasil e outra da Venezuela, e a comparação com 13 cepas de T. cruzi levou à distinção dos
dois parasitos e mostrou que as cepas de T. rangeli apresentavam grande variabilidade
isoenzimática (TIBAYRENC e LE RAY, 1984). Esse dado foi confirmado por MACEDO et
al. (1993), pela análise pelo DNA fingerprinting de nove cepas de T. rangeli isoladas de
Honduras, da Colômbia, da Venezuela e do Brasil, que observaram um padrão hipervariável
de multibandas entre as cepas. A análise do fenograma gerado mostrou uma grande
divergência entre as cepas de T. rangeli isoladas no sul do Brasil e aquelas isoladas em
Honduras, na Colômbia e na Venezuela, que foram muito similares entre si e levou os autores
a sugerir a existência de dois grupos de cepas de T. rangeli cuja divergência poderia estar
relacionada com a distribuição geográfica.
TIBAYRENC et al. (1993), pela análise de cepas de T. rangeli por RAPD e MLEE,
também sugeriram a presença de grupos populacionais divergentes entre as cepas,
provavelmente, associados com a distribuição geográfica ou o ancestral filogenético.
Quando as nove cepas analisadas por MACEDO et al. (1993) e mais sete isoladas no
sul do Brasil foram analisadas pela RAPD e pelos perfis isoenzimáticos, esse resultado pôde
ser confirmado (STEINDEL et al., 1994). O mesmo ocorreu com a análise de seis destas
cepas pela LSSP-PCR e PCR do gene do mini-exon, com os iniciadores TrINT-1, 2, 3 e 4, que
produziram um fragmento de 430pb para as cepas do sul do Brasil e de 360pb para as cepas
de Honduras, da Colômbia e da Venezuela (GRISARD et al., 1999b). O polimorfismo do
gene do mini-exon foi medido pela comparação das seqüências do produto do DNA
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
amplificado de uma cepa do sul do Brasil e outra de Honduras revelando que tal polimorfismo
ocorre pela inserção ou deleção de um a quatro nucleotídeos nos íntrons ou genes 5S rDNA e
por repetições de dinucleotídeos ou tetranucleotídeos nas regiões intergênicas do mini-exon
(GRISARD et al., 1999b). Além disso, pelo seqüenciamento, novamente as cepas de T.
rangeli do Brasil ficaram agrupadas separadamente das demais cepas estudadas, levando os
autores a pensar que a variabilidade intraespecífica da cepa aumenta com a distância
geográfica dos isolados. Em todos esses experimentos citados o T. cruzi sempre formou um
grupo diferente na árvore filogenética.
No entanto, esses dados são diferentes dos encontrados por KREUTZER e SOUSA
(1981) que observaram diferenças nos perfis de isoenzimas de sete cepas, isoladas de
humanos, no Panamá, mostrando que dentro de uma mesma região o T. rangeli pode
apresentar variabilidade intraespecífica. Isso também foi mostrado quando seis cepas de T.
rangeli isoladas do homem e de R. prolixus no vale do Rio Magdalena (Cundinamarca), rio
Catatumbo (Norte de Santander) e Costa Atlântica (Guajira e Sucre) na Colômbia foram
avaliadas pela análise de 12 isoenzimas (MONTILLA et al., 2002), ou quando cepas, também
da Colômbia, foram avaliadas pela RAPD e LSSP-PCR (MARQUEZ et al., 2007). É
interessante notar que a divergência molecular das cepas do sul do Brasil com aquelas de
Honduras, da Colômbia e da Venezuela pôde ser correlacionada com as características
biológicas das cepas em relação à suscetibilidade em triatomíneos e capacidade de
transmissão do parasito (GRISARD et al., 1999a).
A divisão do T. rangeli em dois grupos foi confirmada quando os minicírculos desse
parasito foram caracterizados por RECINOS et al. (1994) e VALLEJO et al. (1994). De
acordo com RECINOS et al. (1994) as cepas de T. rangeli têm minicírculos de tamanhos de
1,6kb e 1,7kb, que são heterogêneos no número de regiões conservadas. Isso não ocorre com
o T. brucei, Leishmania tarentolae, C. fasciculata e T. cruzi que tem 1, 1, 2 e 4 regiões
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
conservadas, respectivamente. Segundo os autores, a cepa El Tocuyo apresentou minicírculos
com uma ou duas regiões conservadas e a San Augustin minicírculos com duas ou quatro
regiões conservadas.
Paralelamente, VALLEJO et al. (1994) encontraram em diferentes cepas, minicírculos
com uma ou duas regiões conservadas, que foram chamados de minicírculos KP1 e KP2,
respectivamente. Os autores, por questões metodológicas, não observaram minicírculos com
quatro regiões conservadas. Posteriormente, esses minicírculos foram observados em
diferentes cepas de T. rangeli e passaram a ser conhecidos como KP3 (VALLEJO et al.,
2002).
Após a caracterização dos minicírculos de T. rangeli e a observação que dentro das
regiões conservadas existem três blocos conservados com seqüências muito similares às de T.
cruzi, os iniciadores S35 e S36, que amplificam, pela PCR, um fragmento de 330pb dos
minicírculos de T. cruzi (STURM et al., 1989), foram utilizados para amplificar os
minicírculos de uma cepa de T. rangeli e uma de T. cruzi, que foram recuperadas de
camundongos infectados experimentalmente, com o fim de distinguir os dois parasitos. A
diferenciação pôde ser feita e um produto de 760pb derivado de um minicírculo de 1,6kb com
duas regiões conservadas (KP2) foi amplificado na cepa de T. rangeli, além de outros dois de
300 a 350pb, derivados de minicírculos de 1,6kb com quatro regiões conservadas (KP3). A
amplificação do minicírculo com uma região conservada não foi observada (VALLEJO et al.,
1999).
A fim de obter um produto amplificado do minicírculo KP1, o iniciador KP1L
(VALLEJO et al., 1994) foi combinado com o S36 e, então, um produto de 165pb pôde ser
observado. Surpreendentemente, este não foi amplificado nas cepas de T. rangeli isoladas de
Rhodnius colombiensis ou Panstrongylus megistus e na cepa LMC12 do Panamá (VALLEJO
et al., 2002). Baseados nesses resultados, os autores amplificaram por uma PCR duplex, que
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
utilizou os iniciadores S35/S36/KP1L, 37 cepas de T. rangeli isoladas de P. megistus no
Brasil, de R. prolixus e de R. colombiensis na Colômbia, de humanos em Honduras, de um
homem no Panamá (LMC12) e de cão, homem e R. prolixus, na Venezuela. Todas as cepas
isoladas de R. prolixus, a cepa isolada do cão e as do homem, com exceção da LMC12,
apresentaram os produtos da PCR de 760pb, 300-450pb e 165pb, sendo chamadas de KP1(+).
As cepas isoladas em P. megistus, em R. colombiensis e a cepa LMC12 apresentaram os
produtos de 760pb e os de 300-450pb, sendo chamadas de KP1(−) (VALLEJO et al., 2002).
Uma relação epidemiológica entre o genótipo da cepa e a sua infecção em vetores e
hospedeiros foi sugerida pelos autores após análise de 150 espécimes de R. colombiensis e de
90 de R. prolixus. Em vários espécimes de R. colombiensis, cepas KP1 (+) e KP1 (−) foram
encontradas no intestino, enquanto na glândula salivar de 15 destes vetores, foram observadas
somente cepas KP1(−). O contrário ocorreu na glândula salivar de 12 R. prolixus, onde foram
encontradas somente cepas KP1(+), contra cepas KP1(+) e KP1(−) observadas no intestino
(GUHL e VALLEJO, 2003).
Posteriormente, demonstrou-se que cepas de T. rangeli KP1(+) e KP1(−) isoladas das
glândulas salivares de R. prolixus, R. pallescens e R. colombiensis da Colômbia podiam ser
relacionadas a produtos de amplificação pela PCR do gene do mini-exon de tamanhos
diferentes. Assim, cepas de T. rangeli KP1(+) apresentaram amplificação do produto de
340pb, enquanto cepas de T. rangeli KP1(−) amplificaram um produto de 380pb (VALLEJO
et al., 2003). Esses resultados levaram VALLEJO et al. (2003) a sugerirem que a divergência
molecular observada entre as cepas de T. rangeli do sul do Brasil e as isoladas em Honduras,
na Colômbia e na Venezuela pela análise do DNA fingeprinting (MACEDO et al., 1993),
RAPD e isoenzimas (STEINDEL et al., 1994), LSSP-PCR e mini-exon (GRISARD et al.,
1999b) deve ser, provavelmente, devida à adaptação da cepa ao vetor local e não às barreiras
geográficas, como sugerido anteriormente.
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
A associação dos perfis de amplificação de mini-exon e do kDNA foi observada por
URREA et al. (2005) que estudaram cepas de T. rangeli isoladas da glândula salivar de
Rhodnius ecuadorensis do Peru, R. colombiensis e R. prolixus da Colômbia e R. pallescens do
Panamá. Eles verificaram que apenas as cepas isoladas de R. prolixus eram KP1(+) e
associaram tal informação àquela de que as cepas isoladas de Rhodnius neglectus do
Triângulo Mineiro (MARQUEZ et al., 2007; RAMIREZ et al., 2002) e do Distrito Federal
(GURGEL-GONCALVES et al., 2004), Brasil, também eram KP1(+), levantando a hipótese
de que este genótipo pode ser associado aos triatomíneos do grupo prolixus (R. prolixus, R.
neglectus, Rhodnius nasatus, Rhodnius domesticus, Rhodnius robustus) e o genótipo KP1(−)
aos do grupo pallescens (R. pallescens, R. colombiensis, R. ecuadorensis), definidos como
linhagens adaptativas de Rhodnius por alguns autores (CHAVEZ et al., 1999; DUJARDIN et
al., 1999; SCHOFIELD et al., 1999). Segundo URREA et al. (2005) isso sugere uma co-
evolução de cepas de T. rangeli associadas com diferentes espécies de Rhodnius.
MAIA-DA-SILVA et al. (2004a), utilizando RAPD com quatro iniciadores diferentes,
agruparam 22 isolados de T. rangeli da Colômbia, Venezuela, Honduras, Panamá, El Salvador
e Brasil, incluindo 14 de mamíferos silvestres, um de triatomíneo e sete de humanos, em
quatro grupos distintos, A, B, C e D. No grupo A foram incluídos os isolados da Colômbia,
Venezuela, Honduras e alguns do Brasil (Pará e Rondônia); no grupo B exclusivamente os do
Acre, Amazônia e Pará (Brasil); no grupo C os do Panamá e El Salvador e no grupo D o
isolado do sul do Brasil. Os grupos mantiveram uma relação parcial com a distribuição
geográfica das cepas, mostrando que ela é importante, mas não a única responsável pela
divergência das cepas. Não houve separação distinta entre os isolados do homem e de outros
mamíferos sugerindo que a mesma população de T. rangeli pode circular entre animais
silvestres, homem e triatomíneos. Estes resultados foram confirmados pela análise do
polimorfismo das seqüências do gene que codifica a subunidade menor do ribossomo (SSU
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
rRNA) e os ITS dos isolados anteriores e de mais 12 isolados, incluindo T. rangeli da
Guatemala e T. lewisi, obtidos de roedores da Inglaterra e França (MAIA-DA-SILVA et al.,
2004b). De forma geral, esses dados mostram que quando isolados de T. rangeli de vários
hospedeiros são analisados com diferentes marcadores nucleares, eles podem ser divididos em
quatro grupos e não apenas em dois, como analisado anteriormente por outros autores também
com marcadores nucleares (GRISARD et al., 1999b; MACEDO et al., 1993; STEINDEL et
al., 1994; TIBAYRENC e LE RAY, 1984; TIBAYRENC et al., 1993) ou pela análise do
kDNA (VALLEJO et al., 2002; VALLEJO et al., 2003).
Entretanto, BELTRAME-BOTELHO et al. (2005) analisando apenas o polimorfismo
dos espaçadores transcritos internos (ITS-1 e ITS-2) flanqueadores do gene da subunidade
5.8S do rRNA de nove isolados, dentre os quais seis cepas estudadas por MAIA-DA-SILVA
et al. (2004b) conseguiram separar apenas T. cruzi de T. rangeli, mas não dentro de T.
rangeli.
A diversidade genética de cepas do T. rangeli, do mesmo modo que a de T. cruzi,
também tem sido avaliada pelo estudo do cariótipo molecular desse parasito, que será
detalhado a seguir.
1.5. Cariotipagem molecular
A cariotipagem molecular, associada à análise de restrição e hibridação radioativa de
DNA, tem sido útil para a compreensão de alguns aspectos da biologia dos parasitos
protozoários e tem levado ao desenvolvimento de ferramentas que podem ser utilizadas para o
diagnóstico diferencial entre diferentes espécies (GIANNINI et al., 1986).
A análise dos cromossomos dos tripanossomatídeos foi, durante muito tempo,
inviabilizada pela ausência de condensação significativa de seus cromossomos durante o ciclo
celular. Pela eletroforese convencional a separação dos cromossomos intactos não é possível
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
uma vez que ela consegue separar, eficientemente, apenas fragmentos de DNA menores do
que 30kb (CHU et al., 1986). Por isso, a cariotipagem molecular só pode ser realizada após o
desenvolvimento da eletroforese em campo pulsátil (PFGE - pulsed-field gel electrophoresis),
que é um método de separação de longas moléculas lineares de DNA e envolve a aplicação de
pulsos alternados de corrente em duas direções, por várias horas (SCHWARTZ e CANTOR,
1984). As moléculas de DNA podem ser tão grandes quanto alguns cromossomos de
eucariotos unicelulares e o padrão eletroforético fornecido pela separação dos mesmos é
chamado de cariótipo molecular.
Todavia, algumas considerações devem ser feitas no estudo da cariotipagem
molecular, pois há polimorfismo no tamanho, intensidade da coloração e número de bandas
cromossômicas. Cromossomos diferentes de um parasito podem ser encontrados comigrando
na mesma banda e cromossomos homólogos podem apresentar tamanhos diferentes e, então,
migrar como duas bandas em PFGE. Ademais, a intensidade de coloração de bandas
cromossômicas pelo brometo de etídio de uma única amostra é diferente e variável, refletindo
a presença de múltiplos cromossomos em algumas das bandas.
Entretanto, pela utilização de enzimas de restrição e métodos de hibridação com
sondas marcadas, evidências suficientes têm mostrado que existe correlação entre o número
de bandas cromossômicas mostradas pela PFGE e o número de cromossomos (BASTIEN et
al., 1992; BONTEMPI et al., 1993; BORST, 1986; HENRIKSSON et al., 1990;
HENRIKSSON; ASLUND et al., 1996; HENRIKSSON et al., 1993; JOHNSON e BORST,
1986). Atualmente, o número de bandas cromossômicas e o tamanho do genoma dos parasitos
podem ser definidos com maior fidelidade pela análise densitométrica da intensidade de
fluorescência das mesmas, após coloração com SYBR Green I e associação a modelos
matemáticos (VARGAS et al., 2004).
45
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
A técnica de PFGE vem sendo empregada para a caracterização genética e estudos de
cariotipagem molecular de subpopulações de diferentes organismos, tais como Trypanosoma
sp (HENRIKSSON;ASLUND et al., 1996; TOALDO et al., 2001; VAN DER PLOEG, L. H.
T. et al., 1984), Leishmania spp (GIANNINI et al., 1986), Giardia (ADAM et al., 1988),
Plasmodium (FOOTE e KEMP, 1989; KEMP et al., 1987), entre outros.
1.5.1. PFGE e os cromossomos de tripanossomatídeos
Os parasitos do gênero Leishmania são os tripanossomatídeos cujos cariótipos
moleculares têm sido melhor estudados. A elucidação de mecanismos que controlam a
evolução da estrutura dos cromossomos e sua propagação em Leishmania contribui para a
compreensão de como esses processos ocorrem em outros protozoários, como estes
organismos expressam sua patogenicidade e como ela pode ser regulada (DUJARDIN et al.,
1993; LIGHTHALL e GIANNINI, 1992).
Vários estudos de associação de marcadores moleculares aos cromossomos de
Leishmania, separados por PFGE, indicaram que o genoma do parasito consistia de
aproximadamente 36Mb de DNA, divididos em 20-30 bandas cromossômicas e organizado
em 36 cromossomos de 0,28-2,8Mb de tamanho (WINCKER et al., 1996; WINCKER et al.,
1997). Estes resultados foram confirmados e estendidos pelo seqüenciamento completo do
genoma deste parasito, que informou um tamanho de 33Mb para o genoma haplóide, com
aproximadamente, 8.311 genes (IVENS et al., 2005).
Em parasitos do gênero Trypanosoma a cariotipagem molecular pela PFGE não é
diferente e maiores variações no tamanho de seus genomas têm sido observadas quando
comparadas com Leishmania.
O genoma nuclear haplóide do T. brucei é estimado em torno de 35Mb que varia em
torno de 25% entre os diferentes isolados (EL-SAYED et al., 2000). O DNA nuclear deste
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
organismo diplóide é distribuído entre três classes de cromossomos, 11 pares de
megacromossomos (1-6Mb), vários cromossomos intermediários (200-900kb) e cerca de 100
minicromossomos, relacionados com a expressão dos seus antígenos variantes de superfície,
(50-150kb), os VSG (EL-SAYED et al., 2000; VAN DER PLOEG et al., 1984). Após o
seqüenciamento do DNA deste parasito pelo projeto genoma estes dados foram confirmados
(BERRIMAN et al., 2005; EL-SAYED; MYLER; BLANDIN et al., 2005).
Em vários estudos de cariotipagem do T. cruzi, um padrão de aproximadamente 20
bandas cromossômicas, entre 0,45Mb e 1,6Mb foi observado (AYMERICH e
GOLDENBERG, 1989; CANO et al., 1995; ENGMAN et al., 1987; GIBSON e MILES,
1986). Em T. cruzi, minicromossomos não foram observados. Como a intensidade das bandas
coradas pelo brometo de etídio é muito variável, pôde-se presumir que o número de
cromossomos é consideravelmente maior que as 20 bandas cromossômicas separadas. Quando
condições de separação na PFGE foram modificadas para que a zona de compressão (ZC)
pudesse ser separada, um tamanho variável máximo dos cromossomos entre 2,5 e 4Mb foi
observado (HENRIKSSON et al., 1995). Baseando-se na estimativa do tamanho do genoma
nuclear em cerca de 100Mb (BORST et al., 1982), com uma média no tamanho do
cromossomo de 1,2Mb, foi feita uma estimativa de que o T. cruzi teria aproximadamente 80
cromossomos ou 40 pares de cromossomos homólogos, considerando que ele é diplóide
(HENRIKSSON; ASLUND et al., 1996; HENRIKSSON et al., 1995).
Outro estudo do cariótipo pela análise densitométrica de bandas cromossômicas de
nove cepas de T. cruzi, representantes do grupo I e do grupo II (IIb, IId e IIe), demonstrou
que o tamanho do genoma deste parasito variou entre 47Mb e 78Mb, sendo que uma cepa
híbrida apresentou o maior genoma (94Mb). Além disso, foi observado que o genoma de
cepas de T. cruzi I é menor do que o de T. cruzi II, sendo constituído de 17 a 18 bandas entre,
47
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
aproximadamente, 0,5Mb e 2,7Mb e 19 a 22 bandas entre 0,45Mb e 3,3Mb (VARGAS et al.,
2004).
Com o projeto de seqüenciamento do genoma da cepa CL Brener (IIe) do T. cruzi,
escolhida por ser bem caracterizada experimentalmente (ZINGALES et al., 1997), sabe-se
hoje que o tamanho do seu genoma diplóide é estimado entre 106,4 e 110,7Mb, dividido em,
aproximadamente, 28 cromossomos por genoma haplóide, que apresentam diferentes
tamanhos de seus homólogos (EL-SAYED; MYLER; BARTHOLOMEU et al., 2005; EL-
SAYED; MYLER; BLANDIN et al., 2005). Vários estudos têm demonstrado que esta cepa é
um híbrido entre os subgrupos IIb e IIc do T. cruzi, assim como as cepas do grupo IId
(BRISSE et al., 1998; BRISSE et al., 2003; FREITAS et al., 2006; MACHADO et al., 2001).
O caráter híbrido da cepa IId poderia explicar o tamanho estimado de 94Mb para o genoma de
uma cepa estudada por VARGAS et al. (2004) considerada pertencer a este subgrupo.
No T. cruzi, uma variação considerável do cariótipo entre cepas diferentes e entre
clones de uma mesma cepa foi observada (ENGMAN et al., 1987; HENRIKSSON;ASLUND
et al., 1996). Tem sido demonstrado que tal polimorfismo pode ser correlacionado com os
resultados obtidos com outras técnicas de caracterização das cepas desse parasito (ENGMAN
et al., 1987; HENRIKSSON; ASLUND et al., 1996; HENRIKSSON et al., 1993).
Especula-se que em tripanossomatídeos a variação de tamanho dos cromossomos
possa ser devida a mecanismos intracromossômicos de amplificação/deleção de seqüências
repetidas nas regiões teloméricas e subteloméricas ou entre seqüências repetidas em tandem.
Isso foi sugerido para L. major e Leishmania infantum (BLAINEAU et al., 1991;
IOVANNISCI e BEVERLEY, 1989; PAGES et al., 1989; RAVEL et al., 1996; WINCKER et
al., 1996), para T. brucei (PAYS e STEINERT, 1988) e para T. cruzi (FREITAS-JUNIOR et
al., 1999; VARGAS et al., 2004). Diferentes tripanossomatídeos têm sido caracterizados pela
determinação do comprimento da região telomérica dos cromossomos (FREITAS-JUNIOR et
48
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
al., 1999; FU e BARKER, 1998; MUNOZ e COLLINS, 2004; RUDENKO et al., 1998;
RUDENKO et al., 1996; VAN DER PLOEG, L. H. et al., 1984; VARGAS et al., 2004).
Os telômeros são estruturas especializadas presentes nas extremidades dos
cromossomos lineares de eucariotos, ricas em G, repetidas em tandem e que têm a
extremidade 3’ em fita simples. O DNA telomérico é associado com proteínas e esse
complexo é importante para a manutenção da integridade do cromossomo, evitando a sua
degradação e prevenindo eventos de fusão indesejados, ou seja, são importantes para a
manutenção da vida dos organismos (LANGE et al., 1990).
A compreensão dos mecanismos que controlam o crescimento pode levar a
importantes alvos no combate das doenças causadas pelos tripanossomatídeos (FREITAS-
JUNIOR et al., 1999). Além disso, próximo das repetições teloméricas, alguns organismos
possuem seqüências associadas aos telômeros ou a repetições subteloméricas que, ao
contrário dos telômeros, não são conservadas e têm sua função não esclarecida (LANGE et
al., 1990). Sabe-se, por exemplo, que em T. brucei as VSG, responsáveis pela evasão do
sistema imune, estão localizadas nas regiões subteloméricas (RUDENKO et al., 1998), o
mesmo ocorrendo com os genes responsáveis pela variação antigênica em Plasmodium
falciparum (HERNANDEZ-RIVAS et al., 1997). Em T. cruzi, foi demonstrado que o gene da
gp85 também está localizado na região subtelomérica (CHIURILLO et al., 1999; FREITAS-
JUNIOR et al., 1999). Em Leishmania, uma seqüência altamente conservada entre L. major,
L. braziliensis, Leishmania lainsoni e Leishmania mexicana é observada na região adjacente
ao telômero (FU e BARKER, 1998).
O estudo dos telômeros tem se baseado no fato de que as repetições teloméricas não
têm sítios de reconhecimento para várias enzimas de restrição (LANGE et al., 1990). Assim, a
digestão com endonucleases que cortam quatro bases liberam o arranjo em tandem dos
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
telômeros, chamados de fragmentos de restrição terminais ou TRF que podem ser utilizados
para verificação da organização da mesma (FREITAS-JUNIOR et al., 1999).
1.5.2. PFGE e os cromossomos de T. rangeli
Apesar da importância do estudo dos cromossomos dos diferentes parasitos, a
cariotipagem molecular do T. rangeli tem sido pouco explorada. VAN DER PLOEG et al.
(1984) analisando o cariótipo de vários cinetoplastídeos, incluindo uma única cepa de T.
rangeli estimou um número mínimo de 20 bandas cromossômicas com tamanhos entre 0,7Mb
e 4Mb para esse parasito. Posteriormente, para o estudo do gene da cisteína proteinase o
cariótipo da cepa V de T. rangeli foi analisado, sendo demonstrado que esta cepa apresentava
14 bandas cromossômicas de 0,35Mb a 2Mb, em duas condições de PFGE distintas
(TANAKA et al., 1994). Do mesmo modo que em T. cruzi, minicromossomos não foram
observados em nenhuma dessas análises.
A análise posterior do gene da cisteína proteinase por MARTINEZ et al. (1995), em
três cepas de T. rangeli, demonstrou que o cariótipo dessas cepas era constituído de
cromossomos entre 0,4Mb e 5,7Mb e com polimorfismo na localização do gene, pois em duas
cepas eles estavam localizados na banda cromossômica de 5,7Mb e em uma cepa nas bandas
de 0,48 e 0,52kb. O polimorfismo de tamanho dos cromossomos que contêm esse gene
também foi observado por TANAKA et al. (1994) na cepa estudada e, posteriormente, por
TOALDO et al. (2001) em nove cepas de T. rangeli.
O primeiro estudo visando a análise cariotípica de várias cepas de T. rangeli foi
realizado por HENRIKSSON; SOLARI et al. (1996). Eles utilizaram 16 cepas de T. rangeli
em três condições de PFGE diferentes e propuseram a divisão dos cromossomos deste
parasito em dois grupos, os de tamanho intermediário com 16 a 20 cromossomos de 0,35Mb a
1,5Mb e os maiores com alguns poucos cromossomos de 3Mb e de até 5,7Mb.
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Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Minicromossomos não foram detectados com as condições ótimas de separação de moléculas
de DNA entre 50kb e 350kb em nenhuma cepa.
Foi demonstrado que o T. rangeli apresenta um polimorfismo entre as diferentes
cepas, em relação ao número e tamanho dos cromossomos e que T. rangeli e T. cruzi
apresentam diferenças importantes em seus cariótipos (HENRIKSSON; ASLUND et al.,
1996; TOALDO et al., 2001). Apenas os clones derivados de uma cepa de T. rangeli isolada
do mesmo paciente e três cepas isoladas na Colômbia, LDG, J1 e J2, mostraram cariótipos
moleculares idênticos pela coloração com brometo de etídio (HENRIKSSON; SOLARI et al.,
1996).
A hibridação com sondas diferentes (uma derivada de T. rangeli e cinco de T. cruzi)
mostrou a variação de tamanho de cromossomos individuais entre as diferentes cepas de T.
rangeli estudadas por (HENRIKSSON; SOLARI et al., 1996). Cinco sondas hibridaram com
uma ou duas bandas cromossômicas distintas, como esperado para um loco único em um
organismo diplóide. Uma sonda (P20) apresentou um padrão complexo e variável de
hibridação entre três e oito bandas nas cepas estudadas. Três sondas (Tc1, Tc2 e Tc10)
apresentaram padrão de hibridação variável em diferentes cepas de T. rangeli em
cromossomos de tamanho intermediário. Resultados similares haviam sido demonstrados para
T. cruzi com a utilização dessas mesmas sondas (BONTEMPI et al., 1993; HENRIKSSON et
al., 1990).
TOALDO et al. (2001) confirmaram os dados de HENRIKSSON; SOLARI et al.
(1996) pelo estudo de nove cepas de T. rangeli, sendo duas dessas já analisadas por esses
autores (R1625 e San Agustin). Foram observados para as diferentes cepas desse parasito em
torno de 16 a 24 cromossomos de 0,39Mb a 3,13Mb e algumas bandas cromossômicas acima
de 5,7Mb. Essas cepas também apresentaram polimorfismo de tamanho e número de
cromossomos e algumas cepas, H-9, H-14, Macias e Choachi, apresentaram ausência de
51
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
cromossomos na região de 0,75Mb a 1,05Mb. As cepas do sul do Brasil mostraram cariótipos
muito similares. A árvore filogenética construída a partir do cariótipo dessas cepas agrupou o
T. rangeli e o T. cruzi em dois braços diferentes. Além disso, o braço de T. rangeli foi
subdividido em dois grupos: um formado pelas cepas colombianas, Choachi e San Agustin e o
outro pelas demais cepas. Este segundo pode ser subdividido também em mais dois braços, o que
agrupava as cepas de Santa Catarina e outro que agrupava as demais (TOALDO et al., 2001). Tal
polimorfismo foi também observado pela comparação
dos cariótipos moleculares de T. rangeli
com os cariótipos de diferentes tripanossomatídeos, como T. cruzi, L. mexicana e C.
fasciculata (HENRIKSSON et al., 1995; HENRIKSSON; SOLARI et al., 1996).
Quando a hibridação do cariótipo das cepas de T. rangeli foi realizada com as sondas
que correspondem aos segmentos gênicos da β-tubulina, cisteína proteinase, hsp70 e actina
foi observado que o gene da β-tubulina pode ser usado para caracterização intra-específica de
T. rangeli e os demais, para diferenciação interespecífica com o T. cruzi (TOALDO et al.,
2001), o que já foi demonstrado por outros autores com o uso de outras sondas
(HENRIKSSON et al., 1995; HENRIKSSON; SOLARI et al., 1996; TRIANA et al., 2006).
Pela localização dos genes β-tubulina, as cepas de T. rangeli foram separadas em dois grupos:
um com as cepas do sul do Brasil e uma do Panamá, e o outro que englobava as demais cepas
(TOALDO et al., 2001). Esses dados puderam ser correlacionados com a caracterização das
cepas por outros autores, por diferentes técnicas, como já detalhado anteriormente (GRISARD
et al., 1999b; MACEDO et al., 1993; STEINDEL et al., 1994). Genes da hsp70 e β-tubulina
hibridaram em uma ou duas bandas cromossômicas nas cepas de T. rangeli sugerindo a
ocorrência de pares homólogos com tamanhos diferentes.
Em resumo, a caracterização molecular do T. rangeli tem mostrado que vários fatores
estão envolvidos na diversidade genética deste parasito, sendo necessários estudos que
analisem a relação parasito-vetor-hospedeiro (doméstico e silvestre) com vários marcadores
52
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
nucleares e do kDNA. A cariotipagem molecular/hibridação pode ser útil no esclarecimento
de dúvidas básicas sobre a biologia do T. rangeli, tais como: o tamanho do seu genoma, o
número de cromossomos, o número de genes que variam entre as espécies, de que maneira
eles estão organizados, como são transcritos e como evoluíram.
1.6. Sintenia gênica
O termo sintenia (do grego: syn=juntos, taenia=pedaços) era usado em genética para
indicar a presença de dois ou mais marcadores genéticos no mesmo cromossomo, sem levar
em conta a ordem gênica (RENWICK 1972). Quando ela ocorre é dito que se tem um grupo
de ligação conservado entre os cromossomos das diferentes espécies (CARLTON et al., 1999;
EICHLER e SANKOFF, 2003; VASQUEZ et al., 2004).
A relevância original do termo data da era pré-genômica quando a localização dos
genes em cromossomos não utilizava dados do seqüenciamento genômico. Hoje, o conceito
de sintenia tem sido discutido e, para alguns autores, ela existe quando a ordem gênica é
conservada entre as espécies diferentes (EL-SAYED; MYLER;BLANDIN et al., 2005;
GHEDIN et al., 2004).
A ocorrência de sintenia entre segmentos de seqüências de vários organismos tem sido
utilizada para investigar a evolução dos cromossomos, pois ela sugere as alterações que
podem ter ocorrido na organização dos cromossomos de dois genomas eucarióticos a partir de
um ancestral comum (EICHLER e SANKOFF, 2003). Por exemplo, em Plasmodium
falciparum, Plasmodium berghei e Plasmodium knowlesi foi demonstrada a sintenia para os
genes EF1-α (fator de elongação 1) e o gene CRK2 (CDC 2-related kinases). Como a ordem
e a orientação dos genes é idêntica nas três espécies, a duplicação do gene EF1-α e sua
ligação com CRK2 deve ser de origem ancestral (CARLTON et al., 1998). Grupos sintênicos
foram observados também entre as espécies de plasmódios que infectam o homem, P.
53
Introdução
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale, apesar das
diferenças existentes entre os tamanhos dos cromossomos (CARLTON et al., 1999).
Adicionalmente, o conhecimento da ordem gênica conservada entre espécies
semelhantes pode predizer a localização de um gene alvo dentro do cromossomo da outra
espécie (MCCOUCH, 2001). Um exemplo seria a busca de genes de Plasmodium que
codificam antígenos que estão implicados em mecanismos de resistência a drogas e que são
difíceis de clonar por causa dos problemas de hibridação cruzada do DNA entre espécies
(CARLTON et al., 1998).
Em tripanossomatídeos a conservação de grupos de ligação foi mostrada em espécies
de Leishmania do Velho e do Novo mundo (BRITTO et al., 1998; WINCKER et al., 1996),
entre as cepas de T. brucei (MELVILLE et al., 1998), entre T. brucei, T. cruzi e Leishmania
donovani (BRINGAUD et al., 1998) e entre T. brucei, T. cruzi e L. major, apesar da alta
divergência das seqüências de nucleotídeos. Isso demonstra a manutenção da ordem dos genes
entre tripanossomatídeos por milhares de anos de evolução (GHEDIN et al., 2004).
Apesar do polimorfismo observado entre os cariótipos moleculares de T. cruzi I e T.
cruzi II, VARGAS et al. (2004) descreveram a ocorrência de oito grupos sintênicos entre as
duas subpopulações do parasito, pela associação de 29 marcadores genéticos. Isto sugere que
a conservação do conteúdo cromossômico é uma característica importante do genoma do T.
cruzi.
Nenhum estudo desse tipo foi feito em relação ao T. rangeli, apesar das contribuições
importantes que eles poderiam trazer para a compreensão da sua biologia e, por análise
comparativa, para a doença de Chagas.
2. OBJETIVOS
55
Objetivos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
O objetivo desse trabalho foi caracterizar o cariótipo molecular de cepas de T. rangeli
KP1(+) e KP1(−), isoladas no Triângulo Mineiro, Brasil e Colômbia, pela associação de
diferentes marcadores moleculares a fim de avaliar o polimorfismo intraespecífico das
mesmas e avaliar a ocorrência de sintenia gênica com T. cruzi.
Objetivos específicos
1. Determinar e comparar os cariótipos moleculares de cepas de T. rangeli isoladas no
Brasil e na Colômbia;
2. Associar marcadores moleculares gerados a partir de uma biblioteca genômica
parcial de T. rangeli aos cromossomos das diferentes cepas estudadas;
3. Investigar a organização da região subtelomérica entre as diferentes cepas de T.
rangeli.
4. Determinar a ocorrência de sintenia gênica entre T. cruzi e T. rangeli.
3. MATERIAL E MÉTODOS
57
Material e Métodos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
3.1. Cepas
3.1.1. Cultivo e manutenção das cepas
Foram utilizadas neste trabalho dez cepas de T. rangeli, P02, P07, P18, P19, P21,
Cas4, SO18, SO28, SO29 e SO48, 11 cepas de T. cruzi, AQ-2, Alv, 1008, VIC, ROM, JG,
RNL1, RNL2, Y, PV e Mut e o clone CL Brener de T. cruzi. O clone CL Brener foi
gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Égler Chiari (Departamento de Parasitologia, UFMG). As
origens geográficas de todas as cepas e os hospedeiros de onde foram isoladas estão listadas
na Tabela 2. Todas as cepas foram mantidas em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) de acordo
com LAGES-SILVA et al. (2006), a 28ºC, para congelamento, obtenção do sedimento de
parasitos para extração do DNA e confecção dos blocos de agarose para a realização da
PFGE.
58
Material e Métodos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
3.1.2. Identidade e classificação das cepas
A confirmação das espécies dos parasitos foi realizada pela PCR multiplex (Figura 1)
com os iniciadores D72/D75/RG3 (Tabela 3), que permitem a amplificação do domínio
variável do gene que codifica a subunidade maior (24Sα) do RNA ribossômico de acordo
com SOUTO et al. (1999) e pela PCR duplex (Figura 2) que amplifica a junção telomérica de
189pb do T. cruzi com os iniciadores Tc189Fw2/Tc189Rv3 (Tabela 3) e a região
subtelomérica conservada do T. rangeli com os iniciadores TrF3/TrR8 (Tabela 3) de acordo
com CHIURILLO et al. (2003), descrita no item 3.2.2.1.
As cepas de T. rangeli isoladas no Triângulo Mineiro, Brasil (P02, P07, P18, P19,
P21) e a cepa Cas4 da Colômbia foram classificadas por MARQUEZ et al. (2007) como
cepas KP1(+) e as demais cepas da Colômbia (SO18, SO28, SO29 e SO48) foram
classificadas por VALLEJO et al. (2003) como KP1(−).
O clone CL Brener de T. cruzi é classificada como T. cruzi IIe (BRISSE;BARNABE
et al., 2000) e a cepa Y é classificada no grupo IIb (VARGAS et al., 2004). As demais cepas
de T. cruzi foram classificadas por LAGES-SILVA (comunicação pessoal) em T. cruzi I, AQ-
2 e Alv, T. cruzi IIb/IIe, 1008, VIC, Rom, JG, L1 e L2 de acordo com a metodologia sugerida
por BRISSE et al. (2001), que utilizaram as PCRs que amplificam segmentos dos genes do
mini-exon (SOUTO et al., 1996), 18S rDNA (CLARK e PUNG, 1994) e 24Sα rDNA
(SOUTO e ZINGALES, 1993). A classificação das cepas PV e Mut foi inconclusiva.
Tabela 2: Características das cepas de Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi analisadas.
Espécie Isolado Característica
genética
Hospedeiro Origem (Referência)
T. rangeli
P02 KP1+
Didelphis albiventris
Triângulo Mineiro, Brasil/ (RAMIREZ et al., 1998)
T. rangeli
P07 KP1+
Didelphis albiventris
Triângulo Mineiro, Brasil/ (RAMIREZ et al., 1998)
T. rangeli
P18 KP1+
Didelphis albiventris
Triângulo Mineiro, Brasil/ (RAMIREZ et al., 1998)
T. rangeli
P19 KP1+
Didelphis albiventris
Triângulo Mineiro, Brasil/ (RAMIREZ et al., 1998)
T. rangeli
P21 KP1+
Didelphis albiventris
Triângulo Mineiro, Brasil/ (RAMIREZ et al., 1998)
T. rangeli
Cas4 KP1+
Rhodnius prolixus
Casanare, Colômbia
(1)
T. rangeli
SO18 KP1-
Rhodnius pallescens
Sucre, Colômbia
(1)
T. rangeli
SO28 KP1-
Rhodnius pallescens
Sucre, Colômbia
(1)
T. rangeli
SO29 KP1-
Rhodnius pallescens
Sucre, Colômbia
(1)
T. rangeli
SO48 KP1-
Rhodnius pallescens
Sucre, Colômbia
(1)
T. cruzi
AQ-2 I
Triatoma sordida
Bahia, Brasil
(2)
T. cruzi
Alv I
Panstrongylus megistus
Triângulo Mineiro, Brasil
(2)
T. cruzi
PV Inconclusiva Humano Rondônia, Brasil
(2)
T. cruzi
Mut Inconclusiva
Panstrongylus megistus
Triângulo Mineiro, Brasil
(2)
T. cruzi
1008 IIb/IIe Humano Triângulo Mineiro, Brasil
(2)
T. cruzi
VIC IIb/IIe Humano Triângulo Mineiro, Brasil/ (RAMIREZ et al., 1994)
T. cruzi
Rom IIb/IIe Humano Triângulo Mineiro, Brasil
T. cruzi
JG IIb/IIe Humano Triângulo Mineiro, Brasil/ (ANDRADE, 1999)
T. cruzi
RNL1 IIb/IIe Humano Goiás, Brasil
(2)
T. cruzi
RNL2 IIb/IIe Humano Goiás, Brasil
(2)
T. cruzi
Y IIb Humano São Paulo, Brasil/ (SILVA e NUSSENZWEIG, 1953)
T. cruzi
CL Brener
(3)
IIe
Triatoma infestans
Rio Grande do Sul, Brasil/ (BATISTA et al., 1994)
(1)
Dr. Jaime Moreno em comunicação pessoal;
(2)
LAGES-SILVA em comunicação pessoal,
(3)
Clone da cepa CL (BRENER e
CHIARI, 1963).
60
Material e Métodos
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3.2. Análise de ácido nucléico
3.2.1. Obtenção e preparação de amostras de DNA
3.2.1.1. Extração de DNA genômico
Para a extração do DNA todas as cepas foram cultivadas até serem obtidos 2,5 ×10
6
parasitos/mL. Logo, foram centrifugadas a 2.200×g, por 10min, a 4ºC e lavadas por 2 vezes
em solução de NaCl 0,95%, nessas mesmas condições. O sobrenadante foi desprezado e o
sedimento ressuspendido em 2mL dessa mesma solução e dividido em dois tubos para a
última centrifugação (2.200×g por 10min a 4ºC). O sobrenadante foi descartado e os tubos
invertidos em cima de um papel absorvente para retirada do excesso de líquido.
Ao sedimento parasitário foi acrescido 0,5mL de tampão de lise (NaCl 80mM, EDTA
45mM, SDS 1%, pH=8,0) contendo proteinase K (100µg/mL) e incubado a 37ºC, por
aproximadamente 24h. A desproteinização foi realizada pela adição de fenol destilado e
tamponado ao sedimento (v/v). Em seguida foi adicionado ao sobrenadante coletado da fase
anterior fenol/clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) v/v. O DNA foi precipitado pela adição de
dois volumes de etanol absoluto gelado ao sobrenadante coletado da fase anterior. A seguir,
procedeu-se a digestão de RNAs com 0,5mL de tampão RNAse (Tris-HCl 10mM, pH=7,7,
NaCl 15mM) contendo 50µg de RNAse por 2h, a 37ºC, seguida de nova extração como
descrito anteriormente. O DNA foi solubilizado com tampão Low-TE (Tris-HCl 10mM,
pH=8,0; EDTA 1mM, pH=8,0) e estocado a 4ºC até sua quantificação (VALLEJO et al., 1999
modificado por LAGES-SILVA et al., 2001).
61
Material e Métodos
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Tabela 3 – Iniciadores utilizados nas reações de amplificação em cadeia da polimerase de
segmentos gênicos de cepas de Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi.
Nome
Iniciador 5’→3’
Segmento do gene
amplificado
Produto
(pb)
D72 TTTTCAGAATGGCCGAACAGT Tr – 210
D75 GCAGATCTTGGTTGGCGTAG Tc I- 250
RG3 GGCCAAAGGGTAAGGCTC
24Sα rDNA
TcII- 265
TrF3 CCCCATACAAAACACCCTT 170
TrR8 TGGAATGACGGTGCGGCGA
Região subtelomérica de
T. rangeli
Tc189Fw2 CCAACGCTCCGGGAAAAC 100
Tc189Rv3 GCGTCTTCTCAGTATGGACTT
Região telomérica de
T. cruzi
ALP-Tr01 CGTATGGCCAAAATCAAATG 189
ALP-Tr02 TTTATGCACATGCACGCAA
Proteína hipotética
ALP-Tr07 TAGAGGACTCCGTCCTGTCG 262
ALP-Tr08 TATCTATTGGCGCGGAACTC
Anônimo
Tc2F AGCAGGTAGTGGTGGTTTGG 379
Tc2R AAGAGGTGGCAAAACACCAC
Enzima E2 conjugadora
de ubiquitina
Tc4F TAGCACCAGGTGGGAGAAAC 377
Tc4R ATCGACCACTTACGACGACC
rRNA metiltransferase
Tc9F CCGCAAGGCATTACACTACA 329
Tc9R CCTTGCCTATTTGCTGAAGC
Subunidade 6 não-
ATPase regulatória do
proteassomo
Tr: T. rangeli, TcI: T. cruzi I, TcII: T. cruzi II
210-
-250
265-
KP1+
II
KP1−
I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314 1516 1718 19 20212223 24
Inc
T. rangeli T. cruzi
pb
210-
-250
265-
KP1+
II
KP1−
I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314 1516 1718 19 20212223 241 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314 1516 1718 19 20212223 24
Inc
T. rangeli T. cruzi
pb
Figura 1 – Amplificação pela PCR de um segmento do gene 24Sa do lócus rDNA de Trypanosoma cruzi (Tc)
e Trypanosoma rangeli (Tr) a partir dos iniciadores D72/D75/RG3. 1- M: 100pb, 2- Tr-P02; 3- Tr-P07; 4- Tr-
P18; 5- Tr-P19; 6- Tr-P21; 7- Tr-Cas4; 8- Tr-SO18; 9- Tr-SO28; 10- Tr-SO29; 11- Tr-SO48; 12- Tc-Y; 13-
Tc-Rom; 14- Tc-VIC; 15- Tc-JG; 16- Tc-CL Brener; 17- Tc-RNL1; 18- Tc-RNL2; 19- Tc-1008; 20- Tc-PV;
21- Tc-Mut; 22- Tc- Alv; 23- Tc-AQ-2; 24- Branco da PCR. Inc= cepas de classificação inconclusiva.
62
Material e Métodos
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As amostras foram quantificadas pela leitura da absorbância em espectrofotômetro, no
comprimento de onda de 260nm (Biophotometer, Eppendorf AG, Hamburg). Em seguida,
foram diluídas para a obtenção de uma concentração de 1ng/mL, que foi a quantidade de
DNA utilizada para a realização de todas as reações de PCRs utilizadas neste trabalho.
3.2.1.2. Preparo de blocos de agarose com DNA genômico imobilizado
Os parasitos obtidos das culturas em fase exponencial de crescimento foram
quantificados em câmera de Neubauer. A seguir, a cultura foi centrifugada a 2.200×g, por
10min, a 4ºC e o sedimento lavado três vezes com NaCl 0,95% e ressuspenso na mesma
solução para a obtenção de 5×10
8
parasitos/mL. A essa suspensão foi adicionada (v/v) uma
solução, pré-aquecida a 42ºC, de agarose 2% de baixo ponto de fusão diluída (v/v) em tampão
PSG (NaCl 130mM, Na
2
HPO
4
142mM, NaH
2
PO
4
8mM, glicose 2%). Sessenta e três
microlitros dessa mistura foram imediatamente distribuídos em moldes de acrílico para gerar
pequenos blocos de agarose com, aproximadamente, 10
7
parasitos/bloco. Uma vez
solidificados os blocos foram incubados com solução de lise (SDS 1%, proteinase K 0,5µg/µL
e EDTA 0,5M, pH=9,0) a 42ºC, por 48h. Após a digestão protéica, os blocos foram lavados 2
vezes em High TE (Tris-HCl 200mM, pH=7,4, EDTA 100mM, pH=8,0), por 48h e estocados
a 4ºC.
3.2.1.3. Extração de DNA plasmidial
Para a extração de DNA plasmidial os oito clones isolados de uma biblioteca
genômica parcial de T. rangeli (01-01A, 01-04B, 04-11D, 04-02H, 03-07C, 02-09G, 04-01E,
01-04A - Tabela 4), construída pela clonagem de fragmentos de aproximadamene 2kb de
DNA genômico do parasito no sítio BamHI do plasmídeo puC18 (FERREIRA, 2006) foram
63
Material e Métodos
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inoculados em 2mL de meio Luria-Bertani (triptose 2%, extrato de levedura 0,5%, NaCl
8,5mM), contendo 50µg/mL de ampicilina e incubados a 37ºC, por 18h. A cultura (1,5mL) foi
transferida para um tubo de 1,5mL e centrifugada a 13.000×g por 30s. O sobrenadante foi
desprezado e o sedimento de bactérias foi ressuspenso em 100µL de solução I (glicose 50mM,
EDTA 10mM, pH=8,0; Tris-HCl 25mM, pH=8,0) com agitação no vórtex. A seguir, 2V da
solução II (NaOH 0,2N, SDS 1%), preparada no momento do uso, foram adicionados aos
tubos e agitados, suavemente, por inversão dos mesmos. Após cinco minutos, a 25ºC, 0,5V da
solução III (acetato de sódio 3M, ácido acético 2N) foi adicionado aos tubos. Após agitação
da mistura por inversão, os tubos foram deixados no gelo por cinco minutos e, em seguida,
centrifugados a 13.000×g, por 10min. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e 400µL
da mistura fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) foram adicionados, agitados no
vórtex e centrifugados a 13.000×g por cinco minutos. A fase aquosa foi transferida para novos
tubos e dois volumes de etanol absoluto P.A. foram adicionados, sendo os tubos deixados no
gelo por cinco a 10min e centrifugados, novamente, a 13.000×g por 15min. O sobrenadante
foi desprezado e o DNA plasmidial lavado com etanol 70%, centrifugado a 13.000×g, por
cinco minutos e ressuspendido em 50µL de TE (Tris-HCl 10mM, pH=7,4, EDTA 1mM,
pH=8,0) contendo 20µg/mL de RNAse e incubado a 37ºC por 30min. O DNA foi estocado a –
20ºC até o momento do uso (SAMBROOK et al., 1989).
3.2.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
3.2.2.1. Amplificação da região telomérica de T. cruzi e subtelomérica de T. rangeli pela
PCR duplex
Esta PCR foi feita de acordo com CHIURILLO et al. (2003) com algumas
modificações. A reação foi realizada num volume final de 30µL de solução contendo de 1-
64
Material e Métodos
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10ng de DNA, 0,24mM de cada desoxiribonucleosídeo trifosfatado, 2,5mM de MgCl
2
, 60mM
de KCl, 12mM de Tris-HCl, pH=9,0, 1,25U de Taq DNA polimerase Platinum (Invitrogen),
0,4µM dos iniciadores Tc189Fw2 e Tc189Rv3 e 0,67µM dos iniciadores TrF3 e TrR8 (Tabela
3). Uma desnaturação inicial a 94ºC, por 4min, foi seguida por 35 ciclos de 30s a 55ºC, 40s a
72ºC e 1min a 94ºC e pela extensão final de 1min a 55ºC e 3min a 72ºC. Os produtos da PCR
de 100pb para T. cruzi e 170pb para T. rangeli foram observados no gel de poliacrilamida 9%,
após coloração pelo nitrato de prata 1% (Figura 2) e auxiliaram na confirmação da identidade
das cepas, conforme descrito anteriormente (item 3.1.2).
O produto de 170pb foi utilizado como sonda, sendo chamado de SubTr, em
experimentos de hibridação conforme descrito no item 3.2.6.
3.2.2.2. Amplificação pela PCR do gene de uma proteína hipotética de T. rangeli
A reação de amplificação do gene codificador de uma proteína hipotética (HyP) de T.
rangeli foi realizada num volume final de 30µL de solução contendo 12mM Tris-HCl
(pH=9,0), 2,5mM de MgCl
2
, 30mM de KCl, 0,24mM de cada desoxinucleosídeo trifosfatado,
1,25U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 30pmol de cada iniciador, ALP-Tr01 e ALP-
Tr02 (Tabela 3) e 1ng de DNA. O programa de amplificação consistiu de uma desnaturação
100-
200-
pb
1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 121314 1516 17 18 19 20 21222324
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1−
II
IInc
100-
200-
pb
1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 121314 1516 17 18 19 20 21222324
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1−
II
IInc
Figura 2 - Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando os produtos de amplificação pela PCR de
segmento da região telomérica de Trypanosoma cruzi (Tc) e subtelomérica de Trypanosoma
rangeli (Tr) com os iniciadores TrF3, TrR8, Tc189Fw2 e Tc189Rv3. 1- M: 100pb, 2- Tr-P02; 3-
Tr-P07; 4- Tr-P18; 5- Tr-P19; 6- Tr-P21; 7- Tr-Cas4; 8- Tr-SO18; 9- Tr-SO28; 10- Tr-SO29; 11-
Tr-SO48; 12- Tc-Y; 13- Tc-Rom; 14- Tc-VIC; 15- Tc-JG; 16- Tc-CL Brener; 17- Tc-RNL1; 18-
Tc-RNL2; 19- Tc-1008; 20- Tc-PV; 21- Tc-Mut; 22- Tc- Alv; 23- Tc-AQ-2; 24- Branco da PCR.
Inc= cepas de classificação inconclusiva.
65
Material e Métodos
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inicial a 95ºC por 4min, 30 ciclos de 95ºC, 55ºC e 72ºC por 40s cada e extensão final a 72ºC
por 10min (FERREIRA, 2006).
O produto de 189pb foi observado no gel de poliacrilamida a 7,5%, após coloração
pelo nitrato de prata 1% (Figura 3A) e foi utilizado como sonda nos experimentos de
hibridação descritos no item 3.2.6.
3.2.2.3. Amplificação pela PCR de um segmento gênico anônimo de T. rangeli
Esta reação foi realizada de acordo com FERREIRA (2006), seguindo as mesmas
condições descritas no item anterior, sendo substituídos os iniciadores ALP-Tr01 e ALP-Tr02
pelos iniciadores ALP-Tr07 e ALP-Tr08 (Tabela 3). Um produto de 262pb foi obtido (Figura
3B) e este também foi utilizado nos experimentos de hibridação, descritos no item 3.2.6,
sendo chamado de An02-09G.
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1-
1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718 192021M
*
A
-189
pb
200-
300-
-262
pb
200-
300-
1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718 192021M
B
*
100-
100-
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1-
1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718 192021M
*
A
-189
pb
200-
300-
-262
pb
200-
300-
1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718 192021M
B
*
100-
100-
Figura 3 - Amplificação pela PCR de segmentos que codificam o gene de uma proteína hipotética e de um
a
seqüência anônima de Trypanosoma rangeli a partir dos iniciadores ALP-Tr01/ALP-Tr02 (A) e ALP-
Tr07/ALP-Tr08 (B), respectivamente. 1- Tr-P02; 2- Tr-P07; 3- Tr-P18; 4- P19; 5- Tr-P21; 6- Tr-SO18; 7-
Tr-SO28; 8- Tr-SO29; 9- Tr-SO48; 10- Tr-Cas4; 11- Tr-AQ-2; 12- Tc- Alv; 13- Tc-Y; 14- Tc-Rom; 15- Tc-
CL Brener; 16- Tc-JG; 17- Tc-VIC; 18- Tc-1008; 19- Tc-Mut; 20- Tc-PV; 21- Branco da PCR. M: 100pb;
*cepa KP1 (+). Figura retirada de FERREIRA, 2006.
66
Material e Métodos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
3.2.2.4. Amplificação pela PCR de segmentos gênicos para investigação de sintenia
Três segmentos dos genes correspondentes à enzima E2 conjugadora de ubiquitina
(UBE2), à rRNA metiltransferase (rRNAmtr) e à subunidade 6 não-ATPase regulatória do
proteassomo (PSMD6) da cepa VIC do
T. cruzi foram independentemente amplificados pela
PCR com os iniciadores Tc2F/Tc2R, Tc4F/Tc4R Tc9F/TC9R (Tabela 3), sendo obtidos os
produtos de 379pb, 377pb e 329pb, respectivamente (Figura 4) que foram utilizados como
sondas em experimentos de hibridação (vide o item 3.2.6), a fim de verificar a ocorrência de
sintenia entre
T. cruzi e T. rangeli (vide o item 3.3).
A PCR foi realizada num volume final de 20µL de solução contendo 1ng de DNA,
12mM de Tris-HCl, pH=9,0, 0,2mM de cada desoxinucleosídeo trifosfatado, 1,5mM de
MgCl
2
, 75mM de KCl e 2U de Taq DNA polimerase Platinum (Invitrogen) e 20 pmol de cada
um dos iniciadores citados acima. A reação de amplificação foi feita com uma desnaturação
inicial a 94ºC, por cinco minutos, seguida de 35 ciclos a 94ºC, 57ºC e 72ºC, por 40s cada,
com extensão final a 72ºC, por cinco minutos. Os produtos foram observados no gel de
poliacrilamida 7,5%, corado pelo nitrato de prata 1% (Figura 4).
3.2.3. Condições de eletroforese em campo pulsátil (PFGE)
Os blocos de agarose contendo o DNA genômico das diferentes cepas de T. rangeli
foram aplicados em gel de agarose 1%. A fim de verificar a variação de tamanho dos
cromossomos de
T. rangeli foram estabelecidas condições para a separação de cromossomos
por PFGE, em três aparelhos diferentes, dois comerciais (
CHEF DRII ou CHEF Mapper,
BioRad) e outro não industrializado, conforme especificado na legenda de cada figura do
cariótipo molecular. Concatâmeros do fago lambda (48,5kb – 1.018,5kb,
New England
BioLabs
) e cromossomos de Saccharomyces cerevisiae (225kb a 1.900kb, New England
BioLabs
) foram utilizados como marcadores moleculares.
67
Material e Métodos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
A fim de comparar algumas hibridações no DNA de
T. rangeli com o DNA de T. cruzi
a separação dos cromossomos de
T. cruzi pela PFGE foi realizada em aparelho não
industrializado, de acordo com as condições especificadas em cada figura do cariótipo
molecular.
A temperatura durante a corrida eletroforética foi de 14ºC, sendo utilizado o tampão
TBE 0,5
× (Tris 45mM, ácido bórico 45mM, EDTA 1mM, pH=8,0), exceto quando a PFGE
foi programada para separar os cromossomos entre 900kb e 3.000kb. Neste caso, o tampão
utilizado foi o TAE 1
× (Tris-acetato 40mM, EDTA 1mM, pH=8,0) e está especificado na
legenda da Figura 6.
Após a PFGE, o gel foi corado por imersão em solução de brometo de etídio 0,5µg/ml
por 1h e parcialmente descorado por imersão em água destilada por 40min. As bandas foram
observadas pela radiação ultravioleta em um transiluminador e fotografadas em câmera
digital, com filtro específico.
312
M
300-
pb
400-
-
-
UBE2
12 43
377-
rRNAmtr
12 43
329-
PSMD6
312
M
300-
pb
400-
-
-
UBE2
12 43
377-
12 4312 43
377-
rRNAmtr
12 43
329-
12 4312 43
329-
PSMD6
Figura 4 – Amplificação pela PCR dos segmentos dos genes que codificam segmentos dos genes UBE2,
rRNAmtr e PSMD6 de cepas de Trypanosoma cruzi com os iniciadores Tc2F/Tc2R, Tc4F/Tc4R e
Tc9F/Tc9R, respectivamente. UBE2: a enzima E2 conjugadora de ubiquitina; rRNAmtr: rRNA
metiltransferase ; PSMD6: subunidade 6 não-ATPase regulatória do proteassomo. 1- Alv; 2- VIC; 3- CL
Brener; 4- PV. M: 100pb.
68
Material e Métodos
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3.2.4. Digestão de DNA
3.2.4.1. Digestão de DNA genômico com endonucleases
A fim de avaliar o comportamento dos segmentos de DNA hibridados com as
diferentes sondas, amostras de DNA extraído de todas as cepas de
T. rangeli e T. cruzi,
contendo aproximadamente 1µg de DNA, foram digeridas por 16h, a 37ºC, com as enzimas
de restrição
BglII, BamHI, EcoRI, EcoRV e HindIII (Q-BIOgene), de acordo com as
instruções do fabricante.
O polimorfismo da região subtelomérica das cepas de
T. rangeli estudadas foi avaliado
pela digestão com a enzima de restrição
RsaI, que tem a propriedade de fazer um grande
número de cortes na molécula de DNA. A digestão foi realizada de acordo com as instruções
do fabricante (
BioLabs, R0167S).
O DNA digerido foi aplicado no gel de agarose 1%/TBE 1
× e submetido à voltagem
constante de 80V, de 3-6h. Em seguida, o gel foi corado com solução de brometo de etídio
0,5µg/mL, durante 30min, descorado por 15min, submetido à radiação UV e fotografado com
câmera digital. As amostras de DNA presentes no gel foram transferidas para membranas de
nitrocelulose ou de náilon de acordo com o procedimento do item 3.2.5.
3.2.4.2. Digestão de DNA plasmidial com endonucleases
As amostras de DNA plasmidial da biblioteca genômica parcial de T. rangeli (Tabela
4) foram digeridas simultaneamente com as endonucleases
EcoRI e HindIII, de acordo com as
instruções do fabricante (Q-BioGene). Em seguida, os fragmentos digeridos foram separados
por eletroforese e corados pelo brometo de etídio de acordo com o exposto no item 3.2.4.1
(Figura 5). Os fragmentos observados tinham um tamanho aproximado entre 0,3kb e 2,1kb e
foram coletados para serem utilizados como sondas (vide o item 3.2.6).
69
Material e Métodos
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3.2.5. Transferência de DNA de T. rangeli e T. cruzi para suportes sólidos (Southern
blotting)
Os géis contendo os cromossomos de T. rangeli ou T. cruzi separados por PFGE foram
preparados para a transferência à membrana de nitrocelulose ou de náilon pela lavagem com
as seguintes soluções: despurinizante (HCl 0,2N), por 15min/2 vezes; desnaturante (NaCl
1,5M, NaOH 0,5N), por 15 min/2 vezes e neutralizante (Tris 0,5M, NaCl 1,5M, pH7,0), por
15 min/2 vezes. A transferência do DNA para a membrana de nitrocelulose ou náilon foi feita
em presença do tampão SSPE 10
× (NaCl 1,5M, NaH
2
PO
4
0,2M, EDTA 0,01M, pH=7,4), por
capilaridade (BEVERLEY, 1988). Após a transferência, as membranas foram cuidadosamente
imersas em SSPE 2
×, por dois minutos e, em seguida, colocadas em folhas de papel
absorvente para retirada do excesso de tampão. Assim, elas foram levadas para o
transluminador e expostas à luz UV por 5min, para a realização do
cross-linking. Depois de
secas foram guardadas entre papel de filtro até o momento do uso. O mesmo procedimento foi
realizado com o DNA genômico digerido com endonucleases (item 3.2.4.1).
Figura 5 – Gel de agarose 1% contendo fragmentos de DNA plasmidial obtidos da biblioteca genômic
a
parcial de T. rangeli digerido com as endonucleases EcoRI e HindIII. 1. pl01-04; 2. pl01-17; 3; pl01-27; 4.
pl01-38; 5. pl01-94; 6. pl01-11; 7. pl01-44; 8. pl01-49; 9. pl01-16; 10. pl01-90; 11. pl01-01; 12. pl02-21; 13.
pl02-24; M: marcador molecular de 100pb.
12 3 12456789 1110 13M
200-
600-
2072-
pb
12 3 12456789 1110 13M
200-
600-
2072-
12 3 12456789 1110 13M123 12456789 1110 13M
200-
600-
2072-
pb
70
Material e Métodos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
3.2.6. Hibridação molecular
3.2.6.1. Obtenção de sondas
As sondas utilizadas nos experimentos de hibridação foram obtidas ou pela
amplificação pela PCR dos segmentos gênicos UBE2, rRNAmtr e PSMD6 da cepa VIC de
T.
cruzi, de segmentos gênicos de uma cepa KP1(+) de T. rangeli (SubTr, HyP e An02-09G) ou
pela digestão, com enzimas de restrição, de plasmídeos com insertos de
T. rangeli (cepa P07,
KP1+), conforme especificado no item 3.2.4.2 (Figura 6). Os insertos obtidos e marcados
foram correspondentes aos genes que codificam a tirosina-aminotransferase (TAT), a proteína
quinase (PK), o transportador de hexose (HT), a ubiquitina hidrolase (UH) e a dois segmentos
gênicos anônimos, que não alinharam com nenhuma seqüência depositada no banco de dados,
que foram chamados de An04-01E e An01-04A (Tabela 4).
Figura 6 – Fluxograma representativo dos procedimentos realizados para a obtenção de sondas por PCR (A) ou
por digestão enzimática dos plasmídeos com insertos de Trypanosoma rangeli (B).
3.2.6.2. Coleta das bandas para marcação radioativa
Para a coleta de bandas de T. rangeli e T. cruzi para marcação radioativa com [α-P
32
]
dCTP foi feita eletroforese dos produtos gerados pelas diferentes PCRs realizadas (vide o item
3.2.2) em gel de agarose 1%. Os géis foram corados com brometo de etídio 0,5µg/mL e os
Coleta da banda
170pb
Subtelomérica
Marcação
radioativa
Purificação
Coleta da banda
189pb
262pb
Proteína hipotética
Anônima
Coleta da banda
379pb
377pb
329pb
UBE2
rRNAmtr
PSMD6
PCR
Marcação radioativa
Coleta de bandas
Eletroforese
Digestão com
endonucleases
Extração do
DNA plasmidial
Cultura de bactérias
com insertos
A B
71
Material e Métodos
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produtos amplificados observados no transiluminador. As bandas foram recortadas do gel e
colocadas dentro de um tubo de polipropileno de 0,5mL com um filtro no fundo vazado. Este
tubo foi acoplado dentro de um tubo de 1,5mL e centrifugado a 13.000
×g, por cinco minutos.
O DNA filtrado foi armazenado a 4ºC. O mesmo procedimento foi realizado com o DNA
plasmidial digerido com
EcoRI e HindIII (vide o item 3.2.4.2).
3.2.6.3. Marcação radioativa
Os produtos da PCR utilizados (Tabela 4) foram marcados pela incorporação de [α-
P
32
] dCTP seguindo a técnica de random priming (FEINBERG e VOGELSTEIN, 1983) pela
utilização do kit
Read-To-Go DNA labelling beads [-dCTP] (Amersham BioSciences, 27-
9240-01). Dez microlitros de DNA (100ng) foram adicionados a 38µL de água deionizada e
autoclavada e desnaturados a 98ºC, por cinco minutos, sendo imediatamente resfriados em
banho de gelo, por três minutos. O DNA, diluído e desnaturado, foi adicionado aos tubos do
kit, que continham tampão, dATP, dGTP, dTTP, fragmento Klenow e
oligodesoxinucleotídeos aleatórios, principalmente os de 9-mers. Dois microlitros de [α-P
32
]
dCTP foram adicionados a essa mistura, incubados a 37ºC por 15min.
A sonda obtida foi purificada em coluna de sephadex G50 equilibrado em tampão NT
(Tris-HCl 1M, pH=7,4, NaCl 5M, EDTA 0,5M, pH=8,0) da seguinte forma: o sephadex G50
foi colocado em uma seringa de 1mL com um filtro no fundo e centrifugado a 1.300
×g, por
dois minutos. Este procedimento foi repetido por mais duas vezes, quando 100µL de tampão
NT foram adicionados à coluna, que foi novamente centrifugada nas mesmas condições.
Nesse momento, 50µL de tampão NT contendo azul de bromofenol foram adicionados
aos 50µL de sonda. Essa mistura foi adicionada à coluna de sephadex previamente preparada
e centrifugada a 1.300
×g, por dois minutos. A sonda filtrada foi coletada num tubo de 0,5mL,
72
Material e Métodos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
desnaturada a 97ºC, por cinco minutos e deixada no gelo, por igual tempo. Em seguida, foi
utilizada nos experimentos de hibridação.
3.2.6.4. Condições de pré-hibridação, hibridação e lavagem das membranas
As membranas de náilon ou de nitrocelulose foram pré-hibridizadas a 67ºC, por 3h,
em solução composta de SSPE 2
× (NaCl 0,3M, NaH
2
PO
4
0,2M, EDTA 2mM, pH=7,4),
solução de Denhardt 5
× (BSA 0,2%, PVP 0,2% e Ficoll 0,2%), SDS 0,5% e 50µg/mL de
DNA de esperma de salmão sonicado e desnaturado. Essa solução foi desprezada e 10mL de
solução de hibridação (SSPE 2
×, SDS 0,5%, 50µg/mL de DNA de esperma de salmão
sonicado e desnaturado, Denhardt’s 1
×) pré-aquecida a 67ºC, foram adicionados aos tubos de
hibridação. Em seguida, a sonda desnaturada foi adicionada e a hibridação foi realizada a
67ºC por 16h.
As membranas foram lavadas duas vezes, em SSPE 2
×, por 15min cada, a 67ºC e em
SSPE 2
×/SDS 0,5%, por duas vezes, de 15min cada, à 25ºC. As membranas foram expostas a
filmes de raios-X, que foram revelados.
3.3. Estratégia para investigação de sintenia gênica entre T. cruzi e T. rangeli
Para verificar a ocorrência de sintenia em T. cruzi e T. rangeli, todas as seqüências de
T. cruzi depositadas no TIGR (www.tigr.org/tdb/e2k1/tca1/) foram examinadas. Após este
passo, as seqüências foram ordenadas de acordo com o número de genes dentro dos
contigs,
sendo pré-selecionadas aquelas que tiveram maior número de genes. Estes foram analisados e,
aleatoriamente, foram escolhidos três genes conhecidos presentes num mesmo
contig que
codificam a UBE2, a rRNAmtr e a PSMD6 (Figura 7).
Tabela 4 - Sondas utilizadas em experimentos de hibridação em
Southern-blotting dos cromossomos de Trypanosoma rangeli
e
Trypanosoma cruzi e do DNA genômico digerido com diferentes enzimas de restrição desses parasitos.
Origem Nome da sonda Sigla Clone da
BGPTr
Tamanho
(pb)
Experimento Cepa
Enzima E2 conjugadora de ubiquitina UBE2 - 379 PCR TcII
Região subtelomérica conservada SubTr - 170 PCR KP1+
rRNA metiltransferase rRNAmtr - 377 PCR TcII
Subunidade 6 não-ATPase regulatória do proteassomo PSMD6 - 329 PCR TcII
Tirosina aminotransferase (
T. cruzi) TAT 1-01A 1.400 BGPTr KP1+
Proteina quinase (
T. cruzi) PK 1-04B 1.200 BGPTr KP1+
Transportador de hexose (
T. cruzi) HT 4-11D 1.800 BGPTr KP1+
Ubiquitina hidrolase (
T. cruzi) UH 4-02H 2.072 BGPTr KP1+
Proteína hipotética (
T. cruzi) HyP 3-07C 190 PCR KP1+
Anônima An02-09G 2-09G 260 PCR KP1+
Anônima An04-01E 4-01E 1.800 BGPTr KP1+
Anônima An01-04A 1-04A 1.200 BGPTr KP1+
BGPTr: Biblioteca Genômica Parcial de T. rangeli, PCR: Polymerase Chain Reaction.
74
Material e Métodos
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
As seqüências obtidas foram utilizadas para o desenho dos iniciadores específicos,
Tc2F/Tc2R, Tc4F/Tc4R e Tc9F/Tc9R (Tabela 3), que foram utilizados para amplificar estes
segmentos gênicos, que foram, posteriormente, utilizados como sondas em experimentos de
hibridação em
Southern blotting dos cromossomos de T. rangeli e T. cruzi, separados por
PFGE de acordo com o descrito nos itens 3.2.2.4 e 3.2.6.
3.4. Análise filogenética
A análise filogenética dos perfis de separação dos cromossomos de T. rangeli
estudados, foi realizada com base no cariótipo da Figura 9A pelo programa TREECON
for
Windows, versão 1.2 (VAN DE PEER e DE WACHTER, 1994). Uma matriz pareada de
distâncias genéticas ou similaridades entre as bandas cromossômicas foi construída a partir da
proporção de bandas compartilhadas (NEI e LI, 1979). A matriz de distância resultante foi
utilizada para construir uma árvore pelo método UPGMA (
unweighted pair-group method
using arithmetic averages
). Os valores de bootstrap (100 replicatas), que avaliam a
confiabilidade da árvore gerada, foram calculados pelo TREECON e considerados
significativos os valores acima de 50%.
rRNAmtr
UBE2 PSMD6
5’
3’
[57125X
[69596X
60079
60786 61608
62780
63190
64770
rRNAmtr
UBE2 PSMD6
5’
3’
[57125X
[69596X
60079
60786 61608
62780
63190
64770
Figura 7 – Representação esquemática no contig de Trypanosoma cruzi dos genes que codificam a enzima E2
conjugadora de ubiquitina (UBE2), a rRNA metiltransferase (rRNAmtr) e a subunidade 6 não-ATPase
regulatória do proteassomo, disponível no bando de dados www.tigr.org
. As flechas cinza representa
m
segmentos gênicos adjacentes aos estudados.
4. RESULTADOS
76
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.1. Caracterização cromossômica de T. rangeli
4.1.1. Determinação dos tamanhos dos cromossomos
A fim de determinar os tamanhos mínimos dos cromossomos das diferentes cepas de
T. rangeli, foi estabelecida uma condição de PFGE que separasse os cromossomos que
estivessem entre 300kb e 900kb. Em todas as cepas KP1(+) foi observado que a menor banda
cromossômica tem aproximadamente 436,5kb e nas cepas KP1(
−) aproximadamente 388kb,
sendo que nestas últimas pode ser observada uma pequena variação de tamanho entre elas
(Figura 8).
Para a determinação dos tamanhos dos maiores cromossomos de
T. rangeli foi
estabelecida uma condição de separação em PFGE para bandas cromossômicas entre 0,9Mb e
3Mb (Figura 9A). A maior banda observada em cada cepa tem tamanho aproximado de 2Mb,
77
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
com pequena variação entre elas. É interessante notar uma região corada pelo brometo de
etídio acima de 2Mb, semelhante a bandas cromossômicas, embora de menor intensidade. No
entanto, quando uma sonda correspondente à região subtelomérica de
T. rangeli (SubTr) foi
utilizada nos experimentos de hibridação, um sinal muito fraco e desproporcional à
intensidade de bandas pôde ser observado, sendo as demais bandas marcadas, com exceção
das bandas cromossômicas de aproximadamente 2,0Mb das cepas KP1(
−) de T. rangeli
(Figura 9B). Em função disso, essa região corada não foi considerada como cromossomo do
parasito, sendo, então, determinado o tamanho de 2Mb para o maior cromossomo dessas
cepas de
T. rangeli.
Expandindo a caracterização cariotípica para os cromossomos de tamanhos
intermediários uma condição de separação dos mesmos entre 300kb e 1.500kb foi
estabelecida. A análise do cariótipo molecular nesta condição revelou que a maioria dos
cromossomos das cepas de
T. rangeli KP1(+) está localizada entre 436,5kb e
aproximadamente 1.400kb, e que a maioria dos cromossomos das cepas KP1(
−) está
localizada entre 388kb e 1.000kb, com uma banda adicional de aproximadamente 1,3Mb na
cepa SO48 e nas outras três cepas na região de aproximadamente 1,6Mb (Figura 10A). Sob
essas condições, em todas as cepas alguns poucos cromossomos se acumulam na zona de
compressão na região de 1,9Mb. Destaca-se também a ausência de cromossomos entre 1,4Mb
e 1,9Mb nas cepas KP1(+) e entre 1Mb e 1,55Mb e 1,6Mb e 1,9Mb nas cepas KP1(
−). Tais
resultados também foram observados quando a PFGE foi realizada num aparelho não
industrializado nas condições definidas na legenda da Figura 11A. Como o gel produzido
apresenta uma distorção, o tamanho das bandas cromossômicas foi estimado por análise
comparativa com o gel da Figura 10A.
78
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Figura 9 – A. Gel de agarose 0,8% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE no
CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio. O aparelho foi programado para separar bandas cromossômicas
entre 0,9kb e 3Mb: 2V/cm, pulsos 20min–24min29s, 72h e 6V/cm, 71,55s-145,98s, por 10h35min, em tampão
TAE 1×. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda SubTr correspondente à região subtelomérica do T.
rangeli. 1- M: Saccharomyces cerevisiae; 2- M: concatâmeros do fago lambda; 3- P02; 4- P07; 5- P18; 6- P19;
7- P21; 8- Cas4; 9- SO18; 10- SO28; 11- SO29; 12- SO48.
225-
450-
680-
945-
1900-
kb
1234567 981110 12 13
-194
-291
-388
-533
kb
KP1(+)
KP1(–)
-436,5
225-
450-
680-
945-
1900-
kb
1234567 981110 12 13
225-
450-
680-
945-
1900-
kb
1234567 981110 12 131234567 981110 12 13
-194
-291
-388
-533
kb
KP1(+)
KP1(–)
-436,5
Figura 8– Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE no CHEF
M
apper e corados pelo brometo de etídio. O aparelho foi programado para separar cromossomos entre 300kb e
900kb: 6V/cm, pulsos de 35-40s, por 28h. 1 e 13- M: concatâmeros do fago lambda; 2- M: Saccharomyces
cerevisiae; 3- P02; 4- P07; 5- P18; 6- P19; 7- P21; 8- Cas4; 9- SO18; 10- SO28; 11- SO29; 12- SO48.
12 6 7 98101211345
225-
1900-
815-
kb
KP1(+) KP1(–)
1640-
12 6 7 9810121134 5
KP1(+) KP1(–)
AB
-
-
-
-
1120-
-
-
12 6 7 98101211345
225-
1900-
815-
kb
KP1(+) KP1(–)
1640-
12 6 7 9810121134 5
KP1(+) KP1(–)
AB
-
-
-
-
1120-
-
-
79
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
12 6 7 9810121134 5
680-
1640-
1120-
kb
KP1(+) KP1(–)
450-
A
1900-
12 6 7 9810121134 5
680-
1640-
1120-
kb
KP1(+) KP1(–)
450-
A
1900-
P19
Cas4
P21
P18
P02
P07
SO28
SO29
SO18
SO48
84%
41%
64%
77%
79%
100%
99%
85%
B
KP1(+)
KP1(−)
P19
Cas4
P21
P18
P02
P07
SO28
SO29
SO18
SO48
84%
41%
64%
77%
79%
100%
99%
85%
B
P19
Cas4
P21
P18
P02
P07
SO28
SO29
SO18
SO48
84%
41%
64%
77%
79%
100%
99%
85%
B
KP1(+)
KP1(−)
Figura 10 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE
no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio. O aparelho foi programado para separar os
cromossomos entre 0,3Mb e 1,5Mb: 6V/cm, 46,67s-192,64s, por 32h31min. B. Fenograma gerado pel
a
análise dos perfis de bandas cromossômicas das cepas de T. rangeli apresentadas em A. Porcentagens
indicam valores de bootstrap, sendo considerados significativos valores acima de 50%. 1- M: concatâmeros
do fago lambda; 2- M: Saccharomyces cerevisiae; 3- P02; 4- P07; 5- P18; 6- P19; 7- P21; 8- Cas4; 9- SO18;
10- SO28; 11- SO29; 12- SO48.
80
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.1.2. Determinação do número de bandas cromossômicas
A imagem do gel apresentado na Figura 9A foi utilizada para determinar o número
aproximado de bandas cromossômicas em cada cepa de
T. rangeli (Tabela 5). As cepas
KP1(+), originárias do Brasil (P02, P07, P18, P19 e P21) e a da Colômbia (Cas4)
apresentaram uma média de 22 e 16 bandas cromossômicas, respectivamente. Destaca-se que,
na cepa Cas4, blocos com várias bandas cromossômicas de tamanhos ligeiramente diferentes,
mas sobrepostos foram freqüentes não permitindo uma quantificação mais precisa do número
de bandas cromossômicas. As cepas KP1(
−) da Colômbia, SO18, SO28, SO29 e SO48
apresentaram uma média de 13 bandas (Tabela 5, Figura 11A).
Como a PFGE realizada nas condições apresentadas na Figura 10A mostrou a melhor
separação das bandas cromossômicas, esse DNA foi transferido para uma membrana de
náilon e utilizado na hibridação com a sonda SubTr. Um sinal de hibridação proporcional à
intensidade das bandas cromossômicas coradas pelo brometo de etídio (Figura 11A) foi
observado em cada banda cromossômica, embora, às vezes, pouco nítido (Figura 11B). A
cepa Cas4 mostrou um sinal mais forte que todas as demais e que foi desproporcional à
intensidade de suas bandas. Como esperado nesse tipo de experimento, as bandas
cromossômicas das diferentes cepas apresentaram intensidades distintas quando coradas pelo
brometo de etídio, podendo haver mais de um cromossomo em cada banda.
81
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Tabela 5 – Determinação do número aproximado de bandas
cromossômicas de cepas de
Trypanosoma rangeli separadas
por eletroforese em campo pulsátil.
Cepa Genótipo Nº de bandas
cromossômicas
(1)
Intervalo das bandas
cromossômicas (kb)
(2)
P02 KP1(+) 22 436-1640
P07 KP1(+) 22 436-1640
P18 KP1(+) 21 436-1640
P19 KP1(+) 22 436-1640
P21 KP1(+) 21 436-1640
Cas4 KP1(+) 16 436-1640
SO18
KP1(
−)
13 388-1100
SO28
KP1(
−)
13 388-1100
SO29
KP1(
−)
14 388-1100
SO48
KP1(
−)
12 388-1300
(1)
Alguns poucos cromossomos ficaram agrupados na zona de compressão, não
sendo incluídos nessa determinação.
(2)
Valores determinados a partir da Figura
9A.
123 1091145678
AB
225-
610-
375-
555-
450-
680-
815-
945-
1120-
1640-
1900-
*
123 1091145678
*
KP1(+) KP1(–)
KP1(+) KP1 (–)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
kb
123 1091145678123 1091145678
AB
225-
610-
375-
555-
450-
680-
815-
945-
1120-
1640-
1900-
*
123 1091145678123 1091145678
*
KP1(+) KP1(–)KP1(+) KP1(–)
KP1(+) KP1 (–)KP1(+) KP1 (–)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
kb
Figura 11 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados po
r
PFGE nas seguintes condições: 5V/cm constantes, pulsos de 60s por 24h, 120s por 22h, 180s por 22h e
corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação com a sonda SubTr correspondente à região subteloméric
a
do T. rangeli. 1- P02; 2- P07; 3- P18; 4- P19; 5- P21; 6- M: Saccharomyces cerevisiae; 7- SO18; 8-
SO28; 9- SO29; 10- SO48; 11- Cas4.
82
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.1.3. Análise filogenética dos perfis de cariótipo molecular
O cariótipo molecular das cepas de T. rangeli foi variável em relação ao número e
tamanho das bandas cromossômicas, como demonstrado anteriormente (Tabela 5). Para
avaliar tal polimorfismo, o cariótipo fornecido pela separação dos cromossomos na faixa de
300kb a 1.500kb (Figura 10A) foi analisado pelo programa TREECON. O fenograma gerado
mostrou que as cepas de
T. rangeli foram separadas em dois braços diferentes. Em um deles
ficaram todas as cepas KP1(+), inclusive a Cas4, que foi isolada na Colômbia. No outro
braço, ficaram agrupadas todas as cepas KP1(
−) isoladas na Colômbia (Figura 10B).
Os padrões de separação das bandas cromossômicas das várias cepas de
T. rangeli, nas
diferentes condições de eletroforese em campo pulsátil, gerou um cariótipo molecular que está
representado esquematicamente na Figura 12.
4.2. Determinação do polimorfismo da região subtelomérica
A fim de determinar o polimorfismo das regiões subteloméricas das cepas de T.
rangeli, a sonda SubTr foi hibridada aos fragmentos de DNA de cada cepa de T. rangeli e
também de
T. cruzi gerados pela digestão com a endonuclease RsaI (Figura 13A). Todas as
cepas KP1(+) apresentaram vários fragmentos marcados entre 1.300pb e 4.000pb e as cepas
KP1(
−) vários fragmentos entre aproximadamente 300pb e aproximadamente 3.000pb (Figura
13B). Nenhuma hibridação foi observada com o DNA genômico de
T. cruzi. Novamente, a
cepa Cas4 (KP1+) apresentou sinal de hibridação mais intenso do que todas as demais cepas
estudadas, apesar de mostrar a mesma intensidade de coloração pelo brometo de etídio nos
fragmentos digeridos.
83
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
225-
275-
375-
450-
555-
610-
680-
745-
785-
815-
915-
945-
1120-
1640-
1900-
kb
M
P
0
2
P
0
7
P
1
8
P
2
1
C
as
4
S
O
1
8
S
O
2
8
S
O
2
9
S
O
4
8
P
1
9
225-
275-
375-
450-
555-
610-
680-
745-
785-
815-
915-
945-
1120-
1640-
1900-
kb
M
P
0
2
P
0
7
P
1
8
P
2
1
C
as
4
S
O
1
8
S
O
2
8
S
O
2
9
S
O
4
8
P
1
9
Figura 12 – Representação esquemática do cariótipo de Trypanosoma rangeli. M: separação dos
cromossomos do fungo Saccharomyces cerevisiae, que apresentam os tamanhos indicados no lado
esquerdo da figura.
84
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.3. Associação de marcadores moleculares ao DNA de T. rangeli
Neste trabalho, oito marcadores moleculares originários da biblioteca genômica
parcial de
T. rangeli, foram utilizados em experimentos de hibridação em Southern blotting de
cromossomos intactos ou do DNA genômico digerido com enzimas de restrição de cepas de
T. rangeli e de T. cruzi (Tabela 4). Destes, cinco representam seqüências que alinharam com
seqüências conhecidas de
T. cruzi no banco genômico e quatro não alinharam com nenhuma
seqüência depositada em banco de dados. Destaca-se que naqueles experimentos de
hibridação realizados nos cromossomos de
T. rangeli separados por PFGE no aparelho não
industrializado, que gera distorção na separação dos fragmentos, o tamanho das bandas
cromossômicas marcadas pela sonda radioativa foi estimado por comparação dessas bandas
com aquelas apresentadas nas Figuras 8, 9A ou 10A.
-
-
-
2072-
600-
1500-
pb
I
KP1(+) KP1(–) II Inc
T. rangeli T. cruzi
A
KP1(+)
KP1(–)
II
I
Inc
T. rangeli T. cruzi
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021 2322
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 161718192021 2322
200-
-
-
-
-
2072-
600-
1500-
pb
I
KP1(+) KP1(–) II Inc
T. rangeli T. cruzi
A
KP1(+)
KP1(–)
II
I
Inc
T. rangeli T. cruzi
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021 23221 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021 2322
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 161718192021 23221 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 161718192021 2322
200-
-
Figura 13 - A. Gel de agarose 1% contendo os fragmentos de restrição terminais (TRF) do DNA genômico de
cepas do Trypanosoma rangeli (Tr) e Trypanosoma cruzi (Tc) digerido com RsaI e corados pelo brometo de etídio.
B. Hibridação em Southern blotting com a sonda SubTr correspondente à região subtelomérica do T. rangeli. 1- M:
100pb; 2- Tr-P02; 3- Tr-P07; 4- Tr-P18; 5- Tr-P19; 6- Tr-P21; 7- Cas4; 8- Tr-SO18; 9- Tr-SO28; 10- Tr-SO29; 11-
Tr-SO48; 12- Tc-Y; 13- Tc - Rom; 14- Tc-VIC; 15- Tc-JG; 16- Tc-CL Brener; 17- Tc-RNL1; 18- Tc-RNL2; 19-
Tc–1008; 20- Tc-PV; 21- Tc-Mut; 22- Tc-Alv; 23- Tc-AQ-2. Inc= cepas de classificação inconclusiva.
85
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.3.1. Marcadores moleculares de T. rangeli de seqüências conhecidas
4.3.1.1. Ubiquitina Hidrolase (UH)
A hibridação da sonda UH foi feita aos cromossomos de T. rangeli, separados pela
PFGE (Figura 14A). Um forte sinal de hibridação foi observado em uma única banda
cromossômica de, aproximadamente, 945kb, somente nas cepas KP1(+) tanto do Triângulo
Mineiro quanto da Colômbia (Figura 14B). Este experimento também foi realizado nos
cromossomos de
T. cruzi separados pela PFGE e nenhum sinal foi observado (Tabela 6).
4.3.1.2. Proteína quinase (PK)
A hibridação da sonda PK foi realizada aos cromossomos de T. rangeli separados pela
PFGE (Figura 15A). Todas as cepas de
T. rangeli KP1(+) apresentaram um forte sinal em
uma única banda cromossômica de 1,9Mb na ZC. Nas cepas KP1(
−) nenhum sinal foi
observado (Figura 15B).
Assim como ocorreu com a hibridação com a sonda UH, nenhum sinal foi observado
quando a sonda PK foi utilizada na hibridação dos cromossomos de
T. cruzi (Tabela 6).
225-
450-
1900-
680-
kb
1
910 12112678345
KP1(+) KP1(–)
1 9 10 12112678345
KP1(+) KP1(–)
-
-
-
-
A
B
1120- -
225-
450-
1900-
680-
kb
1
910 12112678345
1
910 12112678345
KP1(+) KP1(–)
1 9 10 121126783451 9 10 12112678345
KP1(+) KP1(–)
-
-
-
-
A
B
1120- -
Figura 14 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados pela PFGE no
CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio. O aparelho foi programado para separar cromossomos entre
300kb e 1,9Mb: 6V/cm, pulsos 35,40s–192,64s, por 29h. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda UH de
T. rangeli. 1- M: Saccharomyces cerevisiae; 2- M: concatâmeros do fago lambda; 3- P02; 4- P07; 5- P18; 6- P19;
7- P21; 8- Cas4; 9- SO18; 10- SO28; 11- SO29; 12- SO48.
86
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.3.1.3. Tirosina aminotransferase (TAT)
Os cromossomos de T. rangeli, separados pela PFGE, foram o alvo para a hibridação
com a sonda TAT (Figura 16A). Nas cepas KP1(+) foram observados sinais em três ou quatro
bandas cromossômicas acima de 1,8Mb, principalmente na cepa Cas4, que apresentou um
sinal mais forte. Nas cepas KP1(
−) um sinal muito fraco foi observado na mesma região
anterior, mas não foi possível distinguir o padrão de hibridação (Figura 16B).
1234567 981110 12 1234567 981110
12
225-
450-
680-
945-
kb
1900-
A
KP1 (+) KP1 (–) KP1 (+) KP1 (–)
B
-
-
-
-
-
1234567 981110 121234567 981110 121234567 981110 12 1234567 981110
12
1234567 981110
12
225-
450-
680-
945-
kb
1900-
A
KP1 (+) KP1 (–) KP1 (+) KP1 (–)
B
-
-
-
-
-
Figura 15 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE
no CHEF Mapper e corados pelo brometo de etídio. O aparelho foi programado para separar cromossomos
entre 300 e 950kb: 6V/cm, pulsos de 35s a 40s, por 28h. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda
PK de T. rangeli. 1- M: concatâmeros do fago lambda; 2- M: Saccharomyces cerevisiae; 3- P02; 3- P07; 5-
P18; 6- P19; 7- P21; 8- Cas4; 9- SO18; 10- SO28; 11- SO29; 12- SO48.
87
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.3.1.4. Transportador de hexose (HT)
A sonda HT foi utilizada nas hibridações dos cromossomos de T. rangeli separados
pela PFGE (Figura 17A) e no DNA genômico de
T. rangeli e T. cruzi digerido com a
endonuclease
EcoRV (Figura 18A). No primeiro experimento, esta sonda hibridou em uma
banda cromossômica principal de, aproximadamente, 610kb e, em outra de menor
intensidade, de 500kb em todas as cepas de
T. rangeli. Além disso, uma forte hibridação
ocorreu nos poços de aplicação da amostra e na ZC em todas as cepas de
T. rangeli (Figura
17B).
No DNA genômico digerido com
EcoRV esta sonda apresentou um padrão
homogêneo e forte de hibridação em um único fragmento de DNA de todas as cepas de
T.
A
*
KP1(–)
KP1(+)
8 9 10 11765432112
1900-
1120-
945-
450-
295-
kb
1640-
M1M2
B
8 9 10 11765432112
*
KP1(–)
KP1(+)
-
-
-
-
-
-
M1
M2
A
*
KP1(–)
KP1(+)
8 9 10 117654321128 9 10 11765432112
1900-
1120-
945-
450-
295-
kb
1640-
M1M2
B
8 9 10 11765432112
*
KP1(–)
KP1(+)
-
-
-
-
-
-
M1
M2
B
8 9 10 11765432112
*
KP1(–)
KP1(+)
-
-
-
-
-
-
M1
M2
Figura 16 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE nas
seguintes condições: 5V/cm, pulsos de 60s por 8h, 120s por 14h, 180s por 24h, 250s por 20h e corados pelo
brometo de etídio. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda TAT de T. rangeli. 1- P02; 2- P07; 3- P18;
4- P19; 5- P21; 6- M1: Saccharomyces cerevisiae; 7- M2: concatâmeros do fago lambda; 8- Cas4; 9- SO18;10-
SO28; 11- SO29; 12- SO48. * Cepa KP1(+).
88
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
rangeli. Nas cepas de T. cruzi, foi observada uma fraca hibridação, que se tornou evidente
após exposição de 15 dias desse DNA ao filme de raios-X. Além disso, pôde-se notar que as
cepas de
T. cruzi I (AQ-2 e Alv) e uma cepa de classificação inconclusiva (Mut) apresentaram
além do fragmento citado um outro de menor tamanho, que mostrou sinal mais forte que o
anterior (Figura 18B e 18C).
Figura 17 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE
nas seguintes condições: 5V/cm, pulsos de 180s por 40h e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação e
m
Southern blotting com a sonda HT de T. rangeli. 1- P02; 2- P07; 3- P18; 4- P19; 5- P21; 6- M: Saccharomyces
cerevisiae; 7- SO18; 8- SO28; 9- SO29; 10- SO48; 11- Cas4; 12- M: concatâmeros do fago lambda.
*
KP1(+) KP1(–)
kb
12 1034 95678 11
12
12 1034 95678 11
12
*
KP1(+) KP1(–)
AB
225-
1120-
1900-
1640-
-
-
-
-
610- -
*
KP1(+) KP1(–)
kb
12 1034 95678 11
12
12 1034 95678 11
12
*
KP1(+) KP1(–)
AB
225-
1120-
1900-
1640-
-
-
-
-
610- -
23
Inc
A
2072-
600-
100-
pb
111
T. rangeli
T. cruzi
II
I
23
Inc
11
T. rangeli
T. cruzi
II
I
C
-
-
-
1111 23
T. rangeli
T. cruzi
II Inc
I
B
-
-
-
23
Inc
A
2072-
600-
100-
pb
111
T. rangeli
T. cruzi
II
I
23
Inc
11
T. rangeli
T. cruzi
II
I
C
-
-
-
1111 23
T. rangeli
T. cruzi
II Inc
I
B
-
-
-
Figura 18 - A. Gel de agarose 1% contendo os fragmentos de restrição do DNA genômico de cepas de
Trypanosoma rangeli (Tr) e Trypanosoma cruzi (Tc) digerido com EcoRV e corados pelo brometo de etídio.
B. Hibridação em Southern blotting com a sonda HT de T. rangeli. C. Superexposição da hibridação com
a
sonda HT. 1- P02; 2- P07; 3- P18; 4- P19; 5- P21; 6- SO18; 7- SO28; 8- SO29; 9- SO48; 10- Cas-4; 11- M:
100pb; 12- CL Brener; 13- Y; 14- JG; 15- VIC; 16- Rom; 17- RNL1; 18- RNL2; 19- 1008; 20- AQ-2; 21- Alv;
22- Mut; 23- PV. Inc= cepas de classificação inconclusiva.
89
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.3.1.5. Proteína hipotética (HyP)
A hibridação da sonda HyP foi feita nos cromossomos de T. rangeli separados pela
PFGE (Figura 19A) e no DNA genômico de
T. rangeli e T. cruzi digerido com a enzima
EcoRI (Figura 20A).
Os resultados observados mostraram que esta sonda hibridou em três bandas
cromossômicas das cepas KP1(+) do TM de aproximadamente 1,1Mb, 1,2Mb e 1,3Mb e em
quatro bandas cromossômicas entre 1,1Mb e 1,5Mb na cepa Cas4. Nas cepas KP1(
−) a
hibridação ocorreu em duas bandas de aproximadamente 845kb e 960kb nas cepas SO28 e
SO29 e de 900kb e 945kb na cepa SO18. Na cepa SO48 a hibridação ocorreu em apenas uma
banda cromossômica de aproximadamente 1,2Mb (Figura 19B). As cepas KP1(
−)
apresentaram um sinal de menor intensidade do que as cepas KP1(+).
No DNA genômico de
T. rangeli e T. cruzi digerido com EcoRI, essa sonda hibridou
em um fragmento de DNA em todas as cepas de
T. rangeli (Figura 20B). Nas cepas de T.
cruzi, observa-se um sinal muito fraco de hibridação na mesma região anterior.
4.3.2. Marcadores moleculares anônimos de T. rangeli
4.3.2.1. An01-04A
A sonda An01-04A foi utilizada nos experimentos de hibridação dos cromossomos de
T. rangeli separados pela PFGE (Figura 21A). Um forte sinal, proporcional à intensidade das
bandas coradas pelo brometo de etídio, foi observado somente nas cepas KP1(+) em uma
banda cromossômica de aproximadamente 1,4Mb (Figura 21B).
90
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
AB
1900-
945-
680-
450-
kb
12 1034 956 7 8 11
*
KP1(+) KP1(–)
12 1034 956 7 8 11
*
KP1(+) KP1(–)
-
-
-
-
MM
1640-
1120-
AB
1900-
945-
680-
450-
kb
12 1034 956 7 8 1112 1034 956 7 8 11
*
KP1(+) KP1(–)
12 1034 956 7 8 1112 1034 956 7 8 11
*
KP1(+) KP1(–)
-
-
-
-
MM
1640-
1120-
Figura 19 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE
nas seguintes condições: 5V/cm, pulsos de 59s por 24h, 120s por 24h, 180s por 24h e corados pelo brometo
de etídio. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda HyP de T. rangeli que alinhou com uma proteín
a
hipotética de T. cruzi no banco genômico. 1- P02; 2- P07; 3- P18; 4- P19; 5- P21; 6- M: Saccharomyces
cerevisiae
;
7- SO18
;
8- SO28
;
9- SO29
;
10- SO48
;
11- Cas4.
AB
2072-
600-
100-
pb
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1–
*
M
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1 –
*
M
-
-
-
AB
2072-
600-
100-
pb
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1–
*
M
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1 –
*
M
-
-
-
2072-
600-
100-
pb
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1–
*
M
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1 –
*
M
-
-
-
Figura 20 – A. Gel de agarose 1% mostrando os fragmentos de restrição do DNA genômico de cepas do
Trypanosoma rangeli (Tr) e Trypanosoma cruzi (Tc) digerido com EcoRI e corados pelo brometo de etídio B.
Hibridação em Southern blotting com a sonda HyP de T. rangeli que alinhou com uma proteína hipotética de
T. cruzi no banco genômico. 1- Tr - P02; 2- Tr - P07; 3- Tr - P18; 4- Tr - P19; 5- Tr - P21; 6- Tr - SO18; 7- T
r
- SO28; 8- Tr - SO29; 9- Tr - SO48; 10- Tr - Cas4; 11- M: 100pb; 12- Tc - CL Brener; 13- Tc - Y; 14- Tc -
JG; 15- Tc - VIC; 16- Tc - Rom; 17- Tc - RNL1; 18- Tc - 1008; 19- Tc - AQ-2; 20- Tc - Alv; 21- Tc - Mut;
22- Tc - PV.
91
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Essa sonda também foi utilizada para marcar a membrana contendo o DNA genômico
de todas as cepas de
T. rangeli e T. cruzi digerido com EcoRI (Figura 21A).
Surpreendentemente, ela apresentou um forte sinal de hibridação nas cepas KP1(
−), além do
sinal já esperado nas cepas KP1(+), num dos maiores fragmentos resultantes da digestão
(acima de 2072pb). Nenhuma hibridação foi observada no DNA das cepas de
T. cruzi (Figura
22B).
4.3.2.2. An02-09G
Os cromossomos separados na Figura 20A também foram hibridados com a sonda
An02-09G. O resultado mostrou um perfil de hibridação diferente nas cepas KP1(+) e KP1(
−)
e que foi proporcional à intensidade das bandas cromossômicas coradas pelo brometo de
etídio. Nos cromossomos das cepas KP1(+) a sonda hibridou em três bandas cromossômicas
de cada cepa, de aproximadamente 485kb, 582kb e 1,4Mb. Nas cepas KP1(
−) duas bandas
cromossômicas muito próximas e em torno de 582kb foram hibridadas (Figura 20C). Deve-se
notar ainda que a hibridação desta sonda à banda cromossômica de 1,4Mb das cepas KP1(+)
foi também observada pela hibridação com a sonda An01-04A (Figuras 21B e 21C).
A hibridação desta sonda ao DNA genômico de
T. rangeli e T. cruzi digerido com
BamHI (Figura 23A) mostrou um sinal de hibridação num único fragmento nas cepas KP1(+)
e dois fragmentos nas cepas KP1(
−) de T. rangeli (Figura 23B). Nenhuma hibridação foi
observada nas cepas de
T. cruzi.
92
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
C
12 34 56 78910
12 34 56 78910 12 34 56 78910
KP1(+)
KP1(– )
AB
KP1(+)
KP1(–)
KP1(+)
KP1(–)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
485-
679-
873-
970-
1018,5-
388-
-
C
12 34 56 7891012 34 56 78910
12 34 56 7891012 34 56 78910 12 34 56 7891012 34 56 78910
KP1(+)
KP1(– )
AB
KP1(+)
KP1(–)
KP1(+)
KP1(–)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
485-
679-
873-
970-
1018,5-
388-
-
Figura 21 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados pela PFGE
no CHEF DR II a 5V/cm, com pulsos de 59s por 36h e corados pelo brometo de etídio. B. Hibridação e
m
Southern blotting com a sonda An01-04A de T. rangeli. C. Hibridação em Southern blotting com a sond
a
An02-09G de T. rangeli. As sondas usadas em B e C não alinharam com nenhuma seqüência depositada no
banco genômico. 1 e 10- M: concatâmeros do fago lambda; 2- SO18; 3- SO28; 4- SO29; 5- SO48; 6- Cas4;
7- P02; 8- P19; 9- P21.
AB
2072-
600-
100-
pb
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
-
-
-
19234567
8
10 11121314 151617181920 21
22
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
AB
2072-
600-
100-
pb
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
-
-
-
19234567
8
10 11121314 151617181920 21
22
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
Figura 22 – A. Gel de agarose 1% contendo os fragmentos de restrição do DNA genômico digerido de
cepas do Trypanosoma rangeli (Tr) e Trypanosoma cruzi (Tc) com EcoRI e corados pelo brometo de etídio.
B. Hibridação em Southern-blotting com a sonda An1-4A de T. rangeli, que não alinhou com nenhum
a
seqüência depositada no banco genômico. 1- Tr - P02; 2- Tr - P07; 3- Tr - P18; 4- Tr - P19; 5- Tr - P21; 6-
Tr - SO18; 7- Tr - SO28; 8- Tr - SO29; 9- Tr - SO48; 10- Tr - Cas4; 11- M: 100pb; 12- Tc - CL Brener; 13-
Tc - Y; 14- Tc - JG; 15- Tc - VIC; 16- Tc - Rom; 17- Tc - RNL1; 18- Tc - 1008; 19- Tc - AQ-2; 20- Tc -
Alv; 21- Tc - Mut; 22- Tc - PV.
93
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.3.2.3. An04-01E
Os experimentos de hibridação com a sonda An04-01E foram realizados nos
cromossomos de
T. rangeli e T. cruzi separados pela PFGE (Figuras 24A e 25A). Nas cepas
de
T. rangeli foi observado um forte sinal de hibridação na banda de aproximadamente 610kb
tanto naquelas do genótipo KP1(+) quanto naquelas KP1(
−). Além disso, sinais mais fracos
foram observados em bandas de aproximadamente 380, 680 e 915kb em todas as cepas. Nas
cepas KP1(+), além dessas, três bandas de aproximadamente 1,2Mb, 1,25Mb e 1,3Mb foram
marcadas (Figura 24B).
No cariótipo de
T. cruzi um fraco sinal de hibridação foi observado em torno de
1,3Mb, mas não foi possível afirmar se outras bandas foram marcadas (Figura 25B).
2072-
600-
100-
pb
-
-
-
19234567
8
10 11121314 151617181920 21
22
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
AB
2072-
600-
100-
pb
-
-
-
19234567
8
10 11121314 151617181920 21
22
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
19234567
8
10 11121314 151617181920 2122
T. rangeli
T. cruzi
KP1+
KP1
–
*
M
AB
Figura 23 – A. Gel de agarose 1% contendo os fragmentos de restrição do DNA genômico digerido de cepas
de Trypanosoma rangeli (Tr) e Trypanosoma cruzi (Tc) com BamHI e corados pelo brometo de etídio. B.
Hibridação em Southern blotting com a sonda An02-09G de T. rangeli que não alinhou com seqüências
depositadas nos bancos de dados. 1- Tr - P02; 2- Tr - P07; 3- Tr - P18; 4- Tr - P19; 5- Tr - P21; 6- Tr- SO18;
7- Tr - SO28; 8- Tr - Tr - SO29; 9- Tr - SO48; 10- Tr - Cas-4; 11- Tc - CL Brener; 12- M:100pb; 13- Tc - Y;
14- Tc - JG; 15- vazia; 16- Tc - VIC; 17- Tc - Rom; 18- Tc - RNL1; 19- Tc -RNL2; 20- Tc - 1008; 21- Tc -
AQ-2; 22- Tc - Mut.
94
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
AB
891011765432112
kb
*
KP1(−)
KP1(+)
891011765432112
KP1(−)
KP1(+)
*
1900-
1120-
225-
450-
680-
-
-
-
-
-
1640-
-
AB
891011765432112
kb
*
KP1(−)
KP1(+)
891011765432112
KP1(−)
KP1(+)
*
1900-
1120-
225-
450-
680-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1640-
-
Figura 24 - A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados por PFGE nas
seguintes condições: 5V/cm, pulsos de 120s po12h, 200s por 20h, 250s por 24h e corados pelo brometo de etídio.
B. Hibridação em Southern blotting com a sonda An04-01E de T. rangeli. 1- P02; 2- P07; 3- P18; 4- P19; 5- P21;
6- Cromossomos de Saccharomyces cerevisiae; 7- SO18; 8- SO28; 9- SO29; 10- SO48; 11- Cas4; 12-
Concatâmeros do fago lambda.
1640-
1120-
225-
450-
kb
8 9 10 117654321121389101176543211213
-
-
-
-
* *
II II I
* *
II
II
I
M
M
AB
1900- -
1640-
1120-
225-
450-
kb
8 9 10 11765432112138 9 10 1176543211213891011765432112138 9 10 1176543211213
-
-
-
-
-
-
-
-
* *
II II I
* *
II
II
I
M
M
AB
1900- -
Figura 25 – A. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma cruzi separados por PFGE
nas seguintes condições: 5V/cm, pulsos de 120s por 12h, 200s por 20h, 250s por 24h e corados pelo
brometo de etídio. B. Hibridação em Southern blotting com a sonda An04-01E de T. rangeli. 1- CL Brener;
2- Y; 3- VIC; 4- Rom; 5- JG; 6- 1008; 7- M: Saccharomyces cerevisiae; 8- PV; 9- RNL1; 10- RNL2; 11-
Alv; 12- AQ-2; 13- Mut. * cepas de classificação inconclusiva.
95
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Os resultados obtidos com a associação de marcadores genéticos ao cariótipo
molecular do
T. rangeli estão resumidos na Figura 26 e na Tabela 6.
225-
275-
375-
450-
555-
610-
680-
745-
785-
815-
915-
945-
1120-
1640-
1900-
kb
M
P
0
2
P
0
7
P
1
8
P
2
1
C
as
4
S
O
1
8
S
O
2
8
S
O
2
9
S
O
4
8
P
1
9
225-
275-
375-
450-
555-
610-
680-
745-
785-
815-
915-
945-
1120-
1640-
1900-
kb
M
P
0
2
P
0
7
P
1
8
P
2
1
C
as
4
S
O
1
8
S
O
2
8
S
O
2
9
S
O
4
8
P
1
9
HyP (proteína hipotética);
Figura 26 – Representação esquemática da associação de marcadores moleculares ao cariótipo de T. rangeli.
M: cromossomos separados do fungo Saccharomyces cerevisiae, cujos tamanhos estão indicados no lado
esquerdo da figura.
An02-09G;
PK (proteína quinase);
TAT (tirosina aminotransferase);
HT (transportador de hexose);
An01-04A;
An04-01E.
UH (ubiquitina hidrolase);
HyP (proteína hipotética);HyP (proteína hipotética);
Figura 26 – Representação esquemática da associação de marcadores moleculares ao cariótipo de T. rangeli.
M: cromossomos separados do fungo Saccharomyces cerevisiae, cujos tamanhos estão indicados no lado
esquerdo da figura.
An02-09G;
PK (proteína quinase);
TAT (tirosina aminotransferase);
HT (transportador de hexose);
An01-04A;
An04-01E.
UH (ubiquitina hidrolase);
Figura 26 – Representação esquemática da associação de marcadores moleculares ao cariótipo de T. rangeli.
M: cromossomos separados do fungo Saccharomyces cerevisiae, cujos tamanhos estão indicados no lado
esquerdo da figura.
An02-09G;An02-09G;
PK (proteína quinase);PK (proteína quinase);
TAT (tirosina aminotransferase);
TAT (tirosina aminotransferase);
HT (transportador de hexose);HT (transportador de hexose);
An01-04A;An01-04A;
An04-01E.
UH (ubiquitina hidrolase);
96
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Tabela 6 – Resumo dos experimentos de hibridação realizados em
Southern blotting de
cromossomos separados por eletroforese em campo pulsátil ou de DNA genômico de cepas de
Trypanosoma rangeli e de Trypanosoma cruzi digerido com enzimas de restrição.
T. rangeli T. cruzi
Sonda utilizada Tipo de Alvo
KP1(+)
KP1(
−)
I II Inc
UBE2 PFGE + + + + +
DE-BglII + + + + +
rRNAmtr PFGE + + + + +
DE-
HindIII (-) (-) + + +
PSMD6 PFGE + + + + +
DE-
EcoRV + + + + (+)*
TAT PFGE + + NR NR NR
PK PFGE + (-) (-) (-) (-)
HT PFGE + + NR NR NR
DE-
EcoRV + + + + +
UH PFGE + (-) (-) (-) (-)
HyP PFGE + + NR NR NR
DE-
EcoRI + + (-) (-) (-)
An02-09G PFGE + (+)* (-) (-) (-)
DE-
BamHI + + (-) (-) (-)
An04-01E PFGE + + + + +
An01-04A PFGE + (-) NR NR NR
DE-
EcoRI + + (-) (-) (-)
SubTr PFGE + + NR NR NR
DE-
RsaI + (+)* (-) (-) (-)
DE: digestão enzimática; PFGE: pulsed field gel electrophoresis, *Padrão distinto de
hibridação, NR: não realizado, Inc: cepas de classificação inconclusiva.
97
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.4. Investigação de sintenia gênica entre T. cruzi e T. rangeli
Para a investigação de sintenia, as sondas UBE2, rRNAmtr e PSMD6 foram utilizadas
em experimentos de hibridação em
Southern blotting dos cromossomos de T. cruzi (Figura
27A, 27C e 27E, respectivamente) e de
T. rangeli (Figura 28A, 28C e 28E, respectivamente)
separados pela PFGE.
No cariótipo de
T. cruzi a sonda UBE2 hibridou em apenas uma banda cromossômica
nas cepas 1008, VIC e PV, de tamanho de 850kb, 915kb e 1,4Mb, respectivamente. A
hibridação ocorreu em duas bandas cromossômicas nas cepas AQ-2, Alv, Mut, CL Brener, Y,
Rom, JG, RNL1 e RNL2 (Figura 27B e Tabela 7). As sondas rRNAmtr e PSMD6 hibridaram
nas mesmas bandas cromossômicas que a anterior, mostrando que os três genes estão
presentes no mesmo cromossomo, como já esperado (Figura 27D e 27F).
Da mesma forma que o anterior, a hibridação dessas sondas aos cromossomos de
T.
rangeli, embora fraca, mostrou que eles estão localizados no mesmo cromossomo, porém de
tamanhos diferentes em cada cepa. Nas cepas KP1(+) do Brasil e da Colômbia foi observado
um sinal em duas bandas cromossômicas. Nas cepas KP1(
−) a hibridação em duas bandas foi
observada somente na cepa SO18. Na cepa SO28 e SO29 a hibridação ocorreu em uma banda
cromossômica de 930kb e na cepa SO48 na banda de 745kb (Figura 28A a 28F e Tabela 7).
A hibridação dos segmentos gênicos analisados aos cromossomos de
T. rangeli foi
esquematizada na Figura 29.
98
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
295-
-
13
*
13
*
kb
610-
945-
450-
295-
*
71 2 3 4 5 6 8 9 10 1112
*
BA
**
71 2 3 4 5 6 8 9101112
II II I II II I
M
M
-
-
-
-
-
1900-
1640-
-
295-
DC
945-
1900-
450-
-
-
-
-
1120-
-
-
1640-
12
123456
8
910111212 123456 89101112
kb
M
M
*
*
*
77
*
*
*
II II I
II II I
E
F
kb
1120-
450-
1900-
-
-
-
1640-
-
945-
-
71 2 3 4 5 6 8 910 1112
7123456
89
101112
MM
II II I
II
II I
*
*
**
295-
-
13
*
13
*
kb
610-
945-
450-
295-
*
71 2 3 4 5 6 8 9 10 1112
*
BA
**
71 2 3 4 5 6 8 9101112
II II I II II I
M
M
-
-
-
-
-
1900-
1640-
-
295-
DC
945-
1900-
450-
-
-
-
-
1120-
-
-
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12
123456
8
910111212 123456 89101112
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M
M
*
*
*
77
*
*
*
II II I
II II I
E
F
13
*
13
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945-
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295-
*
71 2 3 4 5 6 8 9 10 1112
*
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**
71 2 3 4 5 6 8 9101112
II II I II II I
M
M
-
-
-
-
-
1900-
1640-
-
13
*
13
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kb
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450-
295-
*
71 2 3 4 5 6 8 9 10 1112
*
BA
**
71 2 3 4 5 6 8 9101112
II II I II II I
M
M
-
-
-
-
-
1900-
1640-
-
295-
DC
945-
1900-
450-
-
-
-
-
1120-
-
-
1640-
12
123456
8
910111212 123456 89101112
kb
M
M
*
*
*
77
*
*
*
II II I
II II I
295-
DC
945-
1900-
450-
-
-
-
-
1120-
-
-
1640-
12
123456
8
910111212 123456 89101112
kb
M
M
*
*
*
77
*
*
*
II II III II I
II II I
E
F
kb
1120-
450-
1900-
-
-
-
1640-
-
945-
-
7123451 2 3 4 5 6 8 910 1112
7123456
89
101112
MM
II II III II I
II
II I
*
*
**
Figura 27 – A, C e E. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma cruzi separados po
r
PFGE e corados com brometo de etídio. Os cromossomos em A e C foram separados nas seguintes condições:
5V/cm, pulsos de 60s por 24h, 120s por 24h, 180spor 24h e em E a 5V/cm, pulsos de 120s por 12h, 200s po
r
20h e 250s por 24h. B, D e F: Hibridação em Southern blotting com as sondas UBE2, rRNAmtr e PSMD6 de
T. cruzi, respectivamente. 1- CL Brener; 2- Y; 3- VIC; 4- Rom; 5- JG; 6- 1008; 7- M: cromossomos de
Saccharomyces cerevisiae; 8- PV; 9- RNL1; 10- RNL2; 11- Alv; 12- AQ-2; 13- Mut. *cepas de classificação
inconclusiva.
99
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
BA
1900-
1120-
680-
450-
kb
-
-
-
-
945-
-
*
12 1034 95678
12 1034 95678
KP1+
KP1−
KP1+
KP1−
*
M1M2 M1 M1M2M1
1640-
-
CD
-
-
-
-
-
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1640-
295-
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12 1034 756
12 1034 856
M2
*
KP1+
KP1−
KP1+
KP1−
*
M1M2
M2
M2
M1
89
97
FE
kb
450-
945-
1900-
1640-
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815-
1120-
-
-
-
-
-
-
-
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M1
612 1034 95
M1
6789 87
KP1+
KP1−
KP1+
KP1
−
**
BA
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kb
-
-
-
-
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-
*
12 1034 95678
12 1034 95678
KP1+
KP1−
KP1+
KP1−
*
M1M2 M1 M1M2M1
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-
BA
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kb
-
-
-
-
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-
*
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12 1034 95678
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KP1+
KP1−
*
M1M2 M1 M1M2M1
*
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12 1034 95678
KP1+
KP1−
KP1+
KP1−
*
M1M2 M1 M1M2M1
1640-
-
CD
-
-
-
-
-
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1900-
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295-
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12 1034 756
12 1034 856
M2
*
KP1+
KP1−
KP1+
KP1−
*
M1M2
M2
M2
M1
89
97
CD
-
-
-
-
-
450-
1900-
1640-
295-
680-
945-
1120-
12 1034 756
12 1034 856
M2
*
KP1+
KP1−
KP1+
KP1−
*
M1M2
M2
M2
M1
89
97
FE
kb
450-
945-
1900-
1640-
680-
815-
1120-
-
-
-
-
-
-
-
12 10345
M1
612 1034 95
M1
6789 87
KP1+
KP1−
KP1+
KP1
−
**
FE
kb
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-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
12 10345
M1
612 1034 95
M1
6789 87
KP1+
KP1−
KP1+
KP1
−
**
Figura 28 – A, C e E. Gel de agarose 1% contendo os cromossomos de Trypanosoma rangeli separados po
r
PFGE e corados com brometo de etídio. Condições de separação dos cromossomos: A. 5V/cm,
p
ulsos de
60s por 17h30min, 120s por 14h, 180s por 24h e 250s por 20h; C. 5V/cm, pulsos de 60s por 8h, 120s po
r
14h, 180s por 24h e 250s 20h; E. 5,5V/cm, pulsos de 60s por 20h; 120s por 24h e 180s por 12h. B, D e F.
Hibridação em Southern blotting, a 62ºC, com as sondas UBE2, rRNAmtr e PSMD6 de T. cruzi,
respectivamente. 1- P02; 2- P07; 3- P18; 4- P19; 5- P21; 6- M1: cromossomos de Saccharomyces
cerevisiae; 7- M2: concatâmeros do fago lambda; 8- Cas4; 9- SO18; 10- SO28; 11- SO29; 12- SO48. * cep
a
KP1
(
+
)
.
100
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
225-
275-
375-
450-
555-
610-
680-
745-
785-
815-
915-
945-
1120-
1640-
1900-
kb
M
P
0
2
P
0
7
P
1
8
P
2
1
C
as
4
S
O
1
8
S
O
2
8
S
O
2
9
S
O
4
8
P
1
9
225-
275-
375-
450-
555-
610-
680-
745-
785-
815-
915-
945-
1120-
1640-
1900-
kb
M
P
0
2
P
0
7
P
1
8
P
2
1
C
as
4
S
O
1
8
S
O
2
8
S
O
2
9
S
O
4
8
P
1
9
Figura 29– Representação esquemática do cariótipo de T. rangeli, associado com o marcador molecula
r
UBE2. Os marcadores rRNAmtr e PSMD6 foram associados aos mesmos cromossomos do marcador UBE2.
M: cromossomos separados do fungo Saccharomyces cerevisiae, cujos tamanhos estão indicados no lado
esquerdo da figura.
101
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Tabela 7 – Resultados da hibridação com as sondas UBE2, rRNAmtr e PSMD6*
de
Trypanosoma cruzi aos cromossomos de cepas de T. cruzi e Trypanosoma
rangeli.
Espécie Cepa Genótipo Nº de bandas
cromossômicas
hibridadas
Tamanho aproximado das
bandas cromossômicas
hibridadas (kb)
T. cruzi Alv I 2 600 e 650
T. cruzi
AQ-2 I 1 500 e 550
T. cruzi
Mut - 2 600 e 650
T. cruzi
PV - 1 1400
T. cruzi
VIC IIb/IIe 1 915
T. cruzi
1008 IIb/IIe 1 850
T. cruzi
CL Brener IIe 2 850 e 945
T. cruzi
Y IIb 2 850 e 945
T. cruzi
Rom IIb/IIe 2 915 e 1120
T. cruzi
JG IIb/IIe 2 915 e 1120
T. cruzi
RNL1 IIb/IIe 2 915 e 1120
T. cruzi
RNL2 IIb/IIe 2 915 e 1120
T. rangeli
P02 KP1(+) 2 785 e 930
T. rangeli
P07 KP1(+) 2 785 e 930
T. rangeli
P18 KP1(+) 2 785 e 930
T. rangeli
P19 KP1(+) 2 785 e 930
T. rangeli
P21 KP1(+) 2 785 e 930
T. rangeli
Cas4 KP1(+) 2 650 e 1000
T. rangeli
SO18
KP1(
−)
2 745 e 930
T. rangeli
SO28
KP1(
−)
1 930
T. rangeli
SO29
KP1(
−)
1 930
T. rangeli
SO48
KP1(
−)
1 745
*UBE2: enzima E2 conjugadora de ubiquitina; rRNAmtr: rRNA metiltransferase;
PSMD6: subunidade 6 não-ATPase regulatória do proteassomo.
102
Discussão
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
5. DISCUSSÃO
103
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
4.1. Cariotipagem molecular e associação de marcadores ao DNA de T. rangeli
Os resultados deste trabalho mostram que o cariótipo das 10 cepas de T. rangeli
estudadas compreende cromossomos com tamanhos que variam de aproximadamente 388kb a
2.000kb, sendo observadas uma média de 22 bandas cromossômicas para as cepas KP1(+),
com exceção da cepa Cas4, que apresentou uma média de 16 bandas cromossômicas, e de 13
bandas cromossômicas para as cepas KP1(
−). No entanto, a distribuição da maioria dos
cromossomos foi distinta entre as cepas KP1(+) e as cepas KP1(
−), com ausência de
cromossomos em algumas regiões comuns aos dois genótipos e, em outras regiões, somente
nas cepas KP1(
−). Os dados encontrados neste trabalho estão de acordo com os de TANAKA
et al. (1994), que observaram em uma cepa de T. rangeli, 14 bandas cromossômicas entre
350kb e 1.600kb e algumas de 2Mb e com os de HENRIKSSON; SOLARI
et al. (1996), que
104
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
observaram, aproximadamente, 16 a 20 bandas cromossômicas de 350kb a 1.500kb.
Entretanto, os mesmos pesquisadores relataram o achado de algumas bandas entre 3Mb e
5,7Mb, também observadas por TOALDO
et al. (2001), que não foram observadas neste
trabalho.
TOALDO
et al. (2001) relataram que a maioria dos cromossomos das nove cepas de
T. rangeli analisadas por eles está localizada entre 390kb e 3.130kb. Contudo, uma reanálise
do cariótipo apresentado no artigo mostra que esta faixa está entre, aproximadamente, 390kb e
2.000kb, com DNA presente na ZC em torno de 3Mb, o que estaria de acordo com os dados
apresentados neste trabalho, com exceção dos cromossomos da ZC.
A ausência de cromossomos em algumas regiões do cariótipo foi observada por
HENRIKSSON; SOLARI
et al. (1996) e TOALDO et al. (2001) e foi variável de acordo com
a cepa. TOALDO
et al. (2001) observaram que a ausência de cromossomos em determinadas
faixas de tamanho foi marcante nas cepas H9 e H14, isoladas em Honduras, na cepa Macias,
isolada na Venezuela, e na cepa Choachi, isolada na Colômbia; no entanto, os minicírculos
das cepas não foram caracterizados nesse estudo. Atualmente, é sabido que estas cepas são
classificadas como KP1(+) (VALLEJO
et al., 2002). Dessa forma, os dados produzidos neste
trabalho não puderam ser correlacionados com os destes autores, uma vez que a ausência de
cromossomos em algumas faixas de separação foi uma característica de ambos os genótipos,
mas que se destacou nas cepas KP1(
−). Em T. cruzi, essa ausência de cromossomos em
algumas regiões não é observada e a distribuição dos cromossomos ocorre entre 450kb e
3.000kb (HENRIKSSON
et al., 1995).
O verdadeiro número de cromossomos para as cepas de
T. rangeli deve ser maior que
o número de bandas cromossômicas observadas, pois algumas delas apresentam-se
intensamente coradas, podendo representar mais de um cromossomo, como descrito na
literatura para este tripanossoma e outros tripanossomatídeos (BASTIEN
et al., 1992;
105
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
HENRIKSSON et al., 1995; HENRIKSSON; SOLARI et al., 1996; MELVILLE et al., 1998;
TOALDO
et al., 2001).
A presença de minicromossomos tem sido relatada em
T. brucei (VAN DER PLOEG,
L. H. T.
et al., 1984; WEIDEN et al., 1991), contudo, em T. rangeli tais cromossomos não
tem sido observados (HENRIKSSON; SOLARI
et al., 1996; MARTINEZ et al., 1995;
TANAKA
et al., 1994; TOALDO et al., 2001). HENRIKSSON; SOLARI et al. (1996)
sugeriram que os cromossomos de
T. rangeli na faixa de 350kb a 1.500kb sejam chamados de
cromossomos intermediários e os acima de 3Mb de cromossomos maiores. Como em
T.
rangeli não é observada a presença de minicromossomos e foi determinada, em todas as
cepas, ausência de cromossomos entre 1,6Mb e, aproximadamente, 1,9Mb, sugere-se neste
trabalho que seja atribuída nova denominação aos cromossomos de
T. rangeli, sendo os
cromossomos de 350kb a 1.600kb chamados de cromossomos menores e os acima de 1.600kb
de cromossomos maiores.
Neste trabalho, foi observado que o cariótipo das cepas de
T. rangeli é polimórfico em
relação ao número e tamanho dos cromossomos individuais e entre alguns pares de
homólogos, com exceção das cepas P02 e P07, que apresentaram padrão idêntico de bandas
cromossômicas. O polimorfismo do cariótipo tem sido demonstrado por diferentes autores em
T. rangeli (HENRIKSSON; SOLARI et al., 1996; TOALDO et al., 2001), em T. cruzi
(ENGMAN
et al., 1987; HENRIKSSON; ASLUND et al., 1996; HENRIKSSON et al.,
1995), em
T. brucei (EL-SAYED et al., 2000; MELVILLE et al., 1998) e em Leishmania
(BASTIEN
et al., 1992; LIGHTHALL e GIANNINI, 1992; WINCKER et al., 1996;
WINCKER
et al., 1997). Em relação ao tamanho, todos os autores demonstraram que
cromossomos heterólogos podem comigrar numa mesma região e cromossomos homólogos
podem ter tamanhos diferentes, o que é visto pela associação de marcadores moleculares aos
cromossomos desses parasitos.
106
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
A associação de oito novos marcadores moleculares de T. rangeli às bandas
cromossômicas confirmou, neste trabalho, o polimorfismo do tamanho dos cromossomos
entre as cepas e o polimorfismo de tamanho de alguns cromossomos homólogos dentro das
cepas estudadas, embora com pequena variação. Essa diferença no tamanho de cromossomos
homólogos foi observada pela hibridação com a sonda HT, que ocorreu em duas bandas
cromossômicas de 500 e 610kb em todas as cepas de
T. rangeli. Este gene deve estar presente
em uma cópia no genoma, uma vez que a digestão total do DNA genômico de
T. rangeli
mostrou apenas um fragmento hibridado em todas as cepas, o que já foi demonstrado para
outros tripanossomatídeos (BRINGAUD et al. 1998). Apesar da hibridação também ocorrer
no DNA genômico de
T. cruzi, ela é mais fraca, sugerindo a existência de divergência de
seqüência entre os dois parasitos. Além disso, os perfis de hibridação observados com essa
sonda foram diferentes para os genótipos
T. cruzi I e T. cruzi II. VARGAS et al. (2004)
mostraram a localização deste gene nos cromossomos de 2,2Mb e 3,5Mb em
T. cruzi I e de
3,5Mb em
T. cruzi II.
A sonda HyP, que representa o gene que codifica uma proteína hipotética, apresentou
um padrão polimórfico de hibridação entre as cepas, que foi mais homogêneo nas cepas
KP1(+). Nestas, a hibridação em três bandas cromossômicas com intensidades diferentes,
sugere a presença deste gene ou em cromossomos homólogos de tamanhos distintos ou em
cromossomos heterólogos. A primeira hipótese parece a mais provável, visto que no DNA
genômico digerido com endonuclease, observa-se apenas um fragmento marcado. Como
observado na literatura, genes de múltiplas cópias no genoma estão contidos em fragmentos
de restrição com tamanhos distintos (CAMPETELLA
et al., 1992; HENRIKSSON et al.,
1995). Além disso, nas cepas KP1(
−) a hibridação ocorreu, em uma banda cromossômica em
uma cepa, e nas outras, em duas bandas cromossômicas, reforçando a hipótese da diferença de
homólogos. A hibridação nas cepas KP1(+) em três bandas cromossômicas próximas, com a
107
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
banda intermediária apresentando maior intensidade, pode sugerir a ocorrência de uma
trissomia deste cromossomo, como observado para espécies de
Leishmania, T. brucei e T.
cruzi embora isso não pareça ser um evento comum (MYLER et al., 1999; SQUINA et al.,
2007, MARTINEZ-CALVILLO
et al. 2005; SUNKIN et al. 2000; BASTIEN et al. 1992).
É interessante observar que um gene que codifica uma proteína hipotética tenha um
comportamento diferente entre as cepas KP1(+) e as KP1(
−). Segundo (GULL, 2001), as
proteínas hipotéticas, que representam 40-60% dos genes obtidos pelo seqüenciamento de um
genoma, podem incluir muitos genes que poderão trazer esclarecimento para as funções
relacionadas com sobrevivência e virulência nos hospedeiros vertebrados e invertebrados.
A hibridação das sondas An04-01E e TAT ocorreu em três ou mais bandas
cromossômicas na maioria das cepas, embora com padrão diferente de hibridação entre as
KP1(+) e as KP1(
−), sugerindo que estes segmentos gênicos estão presentes em mais de uma
cópia no genoma, como ocorre com vários outros genes em diferentes organismos
(CAMPETELLA
et al., 1992; HENRIKSSON et al., 1995).
A sonda TAT mostrou um sinal de hibridação muito fraco nos cromossomos das cepas
KP1(
−) em relação às cepas KP1(+), sugerindo uma divergência de seqüência deste gene
entre os parasitos destes dois genótipos. A hibridação ocorreu em bandas cromossômicas
acima de 1,8Mb, o que está de acordo com os achados de (HENRIKSSON, SOLARI
et al.,
1996) que mostraram a localização deste gene em cromossomos de
T. rangeli acima de
1,7Mb.
A hibridação da sonda An02-09G, específica de
T. rangeli, em três bandas
cromossômicas de 485kb, 582kb e 1.400kb nas cepas KP1(+) e em apenas duas bandas, muito
próximas, em torno de 582kb nas cepas KP1(
−) sugere que ela representa seqüências com
números distintos de cópias nos diferentes genótipos do parasito. A hibridação da sonda
An02-09G nos dois fragmentos menores, em ambos os genótipos, sugere que estes
108
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
cromossomos sejam homólogos com ligeira diferença de tamanho. Essa hipótese é reforçada
pela análise da hibridação dessa sonda ao DNA genômico digerido, que mostra um fragmento
de igual tamanho em todas as cepas e um outro fragmento de menor tamanho apenas nas
cepas KP1(
−).
Destaca-se o fato de a sonda An01-04A hibridar na banda cromossômica de 1,4Mb,
previamente reconhecida pela sonda An02-09G. Trata-se de um caso particular, pois como
exposto acima, a sonda An02-09G, reconheceu duas bandas cromossômicas adicionais nas
mesmas amostras do parasito. Este perfil diferencial de hibridação pode ser justificado por
duas hipóteses. A primeira é a de que a banda cromossômica de 1,4Mb representa dois
cromossomos heterólogos de mesmo tamanho e cada um deles foi reconhecido por uma sonda
diferente. A segunda hipótese é a de que houve co-hibridação em um cromossomo com
homólogos de tamanhos iguais, que apresentam alvos para hibridação das sondas An01-04A e
An02-09G, que também reconheceu os cromossomos menores. Porém os dados produzidos
neste trabalho não são suficientes para confirmar uma delas. Tais hipóteses foram
esquematizadas na Figura 30.
Diferente dos dados anteriores, as sondas UH e PK hibridaram em bandas
cromossômicas únicas, sugerindo que tais cromossomos sejam homólogos de mesmo
tamanho. A hibridação ocorreu apenas nas cepas KP1(+), indicando uma divergência de
seqüência destes segmentos gênicos entre as cepas KP1(+) e KP1(
−), também observada com
outros marcadores. Ainda, estes segmentos gênicos não hibridaram nos cromossomos de
T.
cruzi, como mostrado na Tabela 6. Este resultado chama a atenção, uma vez que a análise das
seqüências de segmentos gênicos de
T. rangeli em bancos de dados identificou quatro
membros de proteína quinases que tinham similaridade significante de seqüência protéica com
o
T. cruzi (FERREIRA, 2006). O fato de não ser observada hibridação da sonda PK nos
cromossomos de
T. cruzi pode ser justificado pela degeneração do código genético.
109
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
MELVILLE
et al. (1998) observaram que os pares de cromossomos homólogos de T.
brucei
diferem em tamanho em, aproximadamente, 15% em cada cepa por eles estudadas,
com exceção dos cromossomos IV e V que variaram em 43 e 66%, respectivamente, e que a
variação de pares de homólogos entre as cepas é da ordem de 20%, podendo chegar a valores
como 147% em alguns cromossomos. Apesar da variação de tamanho dos pares de
homólogos entre as cepas, os autores demonstraram que esse polimorfismo não afeta as
regiões centrais dos cromossomos, ou seja, o conteúdo gênico dos homólogos é conservado
entre as cepas. Assim, o polimorfismo de tamanho observado entre cromossomos homólogos
seria resultado de seqüências repetidas nas extremidades cromossômicas, como descrito em
Figura 30 - Representação esquemática dos possíveis genótipos para o perfil de hibridação gerado pelas
sondas An01-04A e An02-09G no cariótipo molecular das cepas de T. rangeli KP1(+) e KP1(−). CrA e CrA’,
CrB e CrB’, CrC e CrC’ representam pares de cromossomos homólogos. CrA e CrB representam a band
a
cromossômica de 1,4Mb. CrC representa a banda cromossômica de a
p
roximadamente 582kb. As caixas
vermelhas indicam a suposta região de associação da sonda An01-04A e as caixas azuis a associação da sond
a
An02-09G.
Cr D
Cr D’
Cr C’
Cr C
KP1(+)
KP1(−)
1.400-
582-
kb
KP1(+)
KP1(−)
Cr A’
Cr A
Cr C
Cr C’
An02-09G
Cr B
Cr B’
Hipótese 2
Cr A
Cr C’
An02-09G
An01-04A
Cr A’
Cr C
An02-09G
Cr B
Cr B’
An02-09GAn01-04A
An02-09G
Hipótese 1
T. rangeli
Cr D
Cr D’
Cr C’
Cr C
KP1(+)
KP1(−)
1.400-
582-
kb
KP1(+)
KP1(−)
Cr A’
Cr A
Cr C
Cr C’
An02-09G
Cr B
Cr B’
Hipótese 2
Cr A
Cr C’
An02-09G
An01-04A
Cr A’
Cr C
An02-09G
Cr B
Cr B’
An02-09GAn01-04A
An02-09G
Hipótese 1
T. rangeli
KP1(+)
KP1(−)
1.400-
582-
kb
KP1(+)
KP1(−)
Cr A’
Cr A
Cr C
Cr C’
An02-09G
Cr B
Cr B’
Cr B
Cr B’
Hipótese 2
Cr A
Cr C’
An02-09G
An01-04A
Cr A’
Cr C
An02-09G
Cr B
Cr B’
Cr B
Cr B’
An02-09GAn01-04A
An02-09G
Hipótese 1
T. rangeli
110
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Plasmodium (LANZER et al., 1993), Leishmania (MYLER et al., 1999) e T. cruzi (EL-
SAYED; MYLER; BARTHOLOMEU
et al., 2005).
Em
T. cruzi, foi demonstrado que pelo menos 50% do seu genoma é constituído de
seqüências repetitivas que consistem, principalmente, de grandes famílias de genes que
codificam proteínas de superfície, de retrotransposons e de repetições subteloméricas (EL-
SAYED;MYLER;BARTHOLOMEU
et al., 2005). A análise comparativa das seqüências
genômicas de
T. brucei, T. cruzi e L. major (EL-SAYED;MYLER;BLANDIN et al., 2005)
mostrou que a organização e o conteúdo gênico das regiões subteloméricas é completamente
diferente em cada um deles. As regiões subteloméricas de
T. cruzi são grandes (10 a >125kb)
e não são sintênicas, consistindo de muitos arranjos interespaçados de superfamílias de trans-
sialidases (TS), mucinas, proteínas de superfície associadas a mucinas (MASP) e famílias de
proteases gp63, DGF-1 (
dispersed gene family-1), seqüências de retrotransposons hot spot
(RHS) e vários retroelementos, como VIPER (
vestigial interposed retroelement), SIRE (short
interpersed repetitive element), dentre outros (EL-SAYED;MYLER;BARTHOLOMEU et al.,
2005). Em
L. major as regiões subteloméricas são curtas (<20kb), com relativamente poucas
seqüências repetitivas e
T. brucei contém grandes blocos de genes não-sintênicos nos
telômeros (>650kb) de todos os cromossomos e grandes arranjos de VSG e ESAGs
(
expression site-associated genes), assim como grande número de retroelementos e RHS (EL-
SAYED, MYLER, BLANDIN
et al., 2005).
De fato, EL-SAYED, MYLER, BLANDIN
et al. (2005) pela análise comparativa do
genoma dos Tritryps (
T. cruzi, T. brucei e L. major) confirmaram que grandes arranjos de
genes que codificam proteínas de superfície próximos aos telômeros e/ou a presença de
numerosos retroelementos dentro destas regiões, poderia promover a recombinação entre
homólogos. De acordo com os autores isso pode levar à rápida variação de seqüência de genes
responsáveis pela variação antigênica do
T. brucei (BORST e ULBERT, 2001; PAYS et al.,
111
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
2004) e à diversidade antigênica do T. cruzi (MACEDO et al., 2004; MACHADO et al.,
2006)
.
Neste contexto, as regiões teloméricas e subteloméricas dos tripanossomatídeos podem
ser utilizadas também para avaliar o polimorfismo entre as cepas desses parasitos. Neste
trabalho, a associação da sonda SubTr aos fragmentos do DNA genômico das cepas de
T.
rangeli e T. cruzi digerido com RsaI, mostrou dois padrões distintos de hibridação, um
associado às cepas KP1(+) e outro às cepas KP1(
−) de T. rangeli. Isso sugere que a
organização da região subtelomérica das cepas KP1(+) deve ser distinta daquela das cepas
KP1(
−).
Pela hibridação da sonda SubTr ao DNA genômico de
T. rangeli separado por PFGE
também foi possível dividir as cepas deste parasito em dois grupos que puderam ser
correlacionados com os genótipos KP1(+) e KP1(
−). De modo semelhante, a análise dos TRFs
em
T. cruzi mostrou que os telômeros apresentam diferenças de tamanho dentro dos
cromossomos de uma cepa e entre as diferentes cepas (FREITAS-JUNIOR
et al., 1999;
VARGAS
et al., 2004). FREITAS-JUNIOR et al. (1999) associaram a ocorrência de
telômeros curtos ao
T. cruzi II e de telômeros longos ao T. cruzi I. No entanto, VARGAS et
al.
(2004) não conseguiram associar a diferença da região telomérica aos grupos de T. cruzi I
e II.
A divergência das seqüências subteloméricas entre as cepas representantes de
genótipos distintos poderia explicar a ausência de hibridação da sonda SubTr, obtida de uma
cepa de
T. rangeli KP1(+), em uma banda de aproximadamente 2Mb nas cepas KP1(−),
observada em gel de agarose (Figura 8B). Isso também ocorreu em alguns cromossomos de
L.
lainsoni que falharam em hibridar com uma sonda telomérica, que hibridou em outros
cromossomos dessa espécie e também em cromossomos de
L. braziliensis, L. major e L.
mexicana
, levando os autores a sugerir que esse parasito tem repetições teloméricas
112
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
conservadas e outras regiões teloméricas que não são compartilhadas entre as espécies (FU e
BARKER, 1998). CHIURILLO
et al. (2002) pelo seqüenciamento da região telomérica do T.
rangeli e sua comparação com a região telomérica de T. brucei e T. cruzi demonstraram que
elas apresentam a mesma repetição final GGGTTA e que a região subtelomérica de
T. rangeli
tem seqüência e organização específicas, apresentando também uma região subtelomérica
conservada e uma não-conservada.
Recentemente, o seqüenciamento em pequena escala de 221 segmentos de DNA de
T.
rangeli (FERREIRA, 2006), indicou que várias seqüências codificadoras de proteínas
preditas, como TS, RHS e MASPs, detectadas no banco de dados de
T. rangeli mostraram alta
identidade com seqüências de proteínas preditas de
T. brucei e T. cruzi, demonstrando a
conservação do conteúdo gênico nestes dois parasitos, apesar da divergência de seqüência em
nível de DNA genômico, como descrito por vários autores e confirmado pela análise
comparativa dos genomas de
T. brucei, T. cruzi e L. major (EL-SAYED, MYLER,
BLANDIN
et al., 2005). Estudos posteriores podem indicar se tais genes estão associados às
seqüências subteloméricas de
T. rangeli da mesma forma que nos outros tripanossomatídeos.
O seqüenciamento da região telomérica de
T. rangeli, permitiu que CHIURILLO et al.
(2003) elaborassem dois pares de iniciadores que foram capazes de distinguir entre
T. cruzi e
T. rangeli por PCR. O estudo das regiões teloméricas e subteloméricas de T. rangeli em
diferentes cepas poderia, então, nos levar a seqüências que poderiam ser utilizadas não só para
o diagnóstico diferencial destes parasitos, mas também à caracterização intraespecífica das
mesmas.
A análise do perfil de hibridação gerado por sete dos oito marcadores utilizados neste
trabalho (UH, PK, HyP, TAT, An01-04A, An02-09G e An04-01E) foi capaz de reunir as 10
cepas de
T. rangeli estudadas em dois grupos, um relacionado com o genótipo KP1(+) e outro
com o genótipo KP1(
−). Isso também foi observado por URUENA et al. (2004) e DIEZ et al.
113
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
(2005), pela hibridação do gene que codifica a proteína KMP-11 (kinetoplastid membrane
protein) aos cromossomos de 3,1Mb e 3,4Mb de uma cepa KP1(−) e aos cromossomos de
1,6Mb em duas cepas KP1(+) de
T. rangeli, sendo que uma cepa apresentava uma localização
extra no cromossomo de 1,4Mb. Adicionalmente, CUERVO
et al. (2006), demonstraram que
em duas cepas KP1(+) e duas KP1(
−) o gene que codifica a histona H2A localiza-se em dois
cromossomos de 1,1Mb e 1,9Mb e de 1,7Mb e 1,9Mb, respectivamente, podendo esse
marcador ser utilizado para diferenciá-las.
Com exceção da hibridação com as sondas HT e An01-04E, que hibridaram com a
mesma intensidade, as demais sondas ou não hibridaram ou hibridaram fracamente nas cepas
KP1(
−). Esse dado reforça a hipótese de que existe divergência de seqüências de vários genes
entre cepas de
T. rangeli KP1(+) e KP1(−), uma vez que todos os fragmentos da BGPTr ou da
PCR gerados para a hibridação eram de apenas uma cepa KP1(+), e levam ao questionamento
de qual seria a importância biológica desse achado.
A associação de dados biológicos, que mostram que algumas cepas deste parasito são
patogênicas para o vetor e outras não (D'ALESSANDRO, 1976; ZELEDÓN e MONGE,
1966), com dados moleculares, que mostram que diferentes marcadores podem ser associados
aos genótipos KP1(+) e KP1(
−), permitem especular sobre a associação entre a diferença de
patogenicidade e suscetibilidade do vetor aos genótipos KP1(+) e KP1(
−) de T. rangeli.
Trabalhos recentes têm demonstrado diferença na suscetibilidade do vetor ao
T.
rangeli
(MACHADO et al., 2001; MARQUEZ et al., 2006). MACHADO et al. (2001)
utilizaram três cepas diferentes (SC-58, Macias e Choachi) para infectar experimentalmente
espécies de
Rhodnius (R. prolixus, R. neglectus, R. nasastus e R. domesticus) e mostraram que
existia diferença na taxa de infecção da hemolinfa e das glândulas salivares dependente da
cepa e do vetor utilizados e da via de infecção, se intracelômica ou por xenodiagnóstico de
camundongos inoculados com as diferentes cepas de
T. rangeli. Os resultados com a infecção
114
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
pelo xenodiagnóstico (realizado somente com R. domesticus e R. prolixus) mostraram que
todos os
R. domesticus apresentaram parasitos na glândula salivar quando infectados com a
cepa SC-58, mas nenhum mostrou parasitos nesta glândula quando as cepas Macias e Choachi
foram utilizadas. Por outro lado, metade dos
R. prolixus infectados com a cepa SC-58 tinham
o parasito na glândula salivar, enquanto 100% apresentaram o parasito quando a infecção era
realizada com as cepas Macias e Choachi. Os autores não caracterizaram as cepas de acordo
com os minicírculos, mas hoje sabe-se que a SC-58 é KP1(
−) (apud VALLEJO et al., 2002) e
que as cepas Macias e Choachi são KP1(+) (VALLEJO
et al., 2002).
MARQUEZ
et al. (2006) também mostraram diferença na susceptibilidade de
diferentes vetores (
P. megistus, R. neglectus, Triatoma braziliensis, Triatoma infestans,
Triatoma sordida e Triatoma viticeps) à cepa P02 de T. rangeli, que pertence ao genótipo
KP1(+), sendo importante ressaltar que o
P. megistus, apesar de ter apresentado parasitos nas
fezes, não apresentou infecção na hemolinfa. Esse dado está de acordo com os de VALLEJO
et al. (2002) que encontraram T. rangeli KP1(−) apenas no intestino de P. megistus e de
D'ALESSANDRO (1976), que relatava o achado de
T. rangeli no intestino de vários vetores,
sem invasão da hemolinfa e glândulas salivares. Todos esses dados indicam mais uma
evidência de que existe adaptação da cepa ao vetor, que pode estar relacionada com os
genótipos KP1(+) e KP1(
−).
Apesar do polimorfismo do cariótipo, foi observado em nosso trabalho que as cepas
KP1(+) tinham o perfil cariotípico mais próximo entre elas, o mesmo ocorrendo com as cepas
KP1(
−). Isso foi confirmado pela observação de uma árvore filogenética construída após
análise da matriz de distância gerada pelos dados do cariótipo, que mostrou dois braços
distintos, um que agregava as cepas KP1(+) (Brasil e Colômbia) e outro que agregava as
cepas KP1(
−) (Colômbia). É interessante observar que a hibridação do cromossomo ou DNA
genômico da cepa Cas4 com os oito marcadores utilizados e com a sonda SubTr foi
115
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
consistentemente mais próxima do perfil obtido para as demais cepas KP1(+), assim como o
perfil do cariótipo molecular.
Os dados do cariótipo das cepas de
T. rangeli estudadas neste trabalho podem ser
correlacionados com os de MARQUEZ
et al. (2007), que pelo estudo das mesmas cepas,
demonstraram que as cepas KP1(+) e as cepas KP1(
−) podiam ser associadas com perfis de
RAPD distintos. Isso sugere que apesar da associação das cepas à distribuição geográfica
sugerida por outros autores (GRISARD
et al., 1999a; MACEDO et al., 1993; STEINDEL et
al.
, 1994), a divisão dos dois grupos deve ser estabelecida pelas suas características em
relação ao genótipo (URREA
et al., 2005; VALLEJO et al., 2002; VALLEJO et al., 2003).
De acordo com VALLEJO
et al. (2002) existe uma adaptação específica do parasito a
um vetor particular, que seleciona sua população e a transmite por inoculação aos hospedeiros
vertebrados. Estes autores demonstraram pela caracterização do kDNA que, em infecções
naturais, as duas populações KP1(+) e KP1(
−) existem no intestino do vetor, sendo
selecionados um desses genótipos até a sua chegada à glândula salivar. Essa hipótese foi
respaldada pela observação de cepas KP1(
−) na glândula salivar de R. colombiensis e R.
pallescens e cepas KP1(+) na glândula salivar de R. prolixus isolados na Colômbia (URREA
et al.
, 2005). Além disso, esses autores demonstraram pelo estudo de 37 cepas de diferentes
regiões e hospedeiros que o genótipo KP1(+) era encontrado em triatomíneos específicos, ou
relacionados filogeneticamente, e nos hospedeiros vertebrados da mesma região desses
vetores, o mesmo ocorrendo com as cepas KP1(
−).
Esses resultados estão de acordo com os de VALLEJO
et al. (2003), que relacionaram
os genótipos KP1(+) e KP1(
−) aos produtos de 340pb e 380pb do mini-exon amplificado de
cepas de
R. colombiensis, R. pallescens e R. prolixus, sugerindo que as características do
kDNA podiam ser estendidas ao DNA nuclear e à adaptação do parasito ao vetor. A
caracterização do rDNA e mini-exon de um isolado humano na Colômbia e de isolados de
R.
116
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
prolixus, R. colombiensis, R. pallescens e R. ecuadorensis capturados na Colômbia, Panamá e
Peru confirmaram estes dados e levaram URREA
et al. (2005) a associar as cepas KP1(+) ao
grupo
prolixus e as cepas KP1(−) ao grupo pallescens, corroborando a hipótese de VALLEJO
et al. (2002) de que existe uma co-evolução entre vetor e parasito.
No entanto, estes dados não estão de acordo com os de outros autores que utilizaram
mais de um marcador na RAPD (MAIA-DA-SILVA
et al., 2004a) e análise do polimorfismo
do gene 18S rDNA e do ITS (MAIA-DA-SILVA
et al., 2004b) para caracterizar cepas de
diferentes vetores, hospedeiros silvestres e áreas geográficas. Estes autores dividiram os
isolados em quatro grupos (A, B, C e D), porém, esse resultado não foi observado por
BELTRAME-BOTELHO
et al. (2005) pela avaliação da região ITS de cepas de diferentes
regiões.
Neste trabalho, os isolados de
T. rangeli apresentaram características distintas, que
foram consistentes com o perfil cariotípico estabelecido para as cepas e com a associação de
marcadores moleculares diferentes ao DNA genômico. Tais características levaram à reunião
das cepas em dois grupos que puderam ser associados à presença ou à ausência do minicírculo
KP1. É a primeira vez que a correlação das características do
T. rangeli em relação à presença
ou ausência do minicírculo KP1 é realizada com mais de um marcador molecular e com maior
número de cepas.
4.2. Sintenia gênica
A apresentação do seqüenciamento genômico de T. brucei, T. cruzi e L. major
(BERRIMAN
et al., 2005; EL-SAYED, MYLER, BARTHOLOMEU et al., 2005; IVENS et
al., 2005) permitiu a comparação do genoma das três espécies e revelou semelhanças e
especificidades entre os mesmos (EL-SAYED, MYLER, BLANDIN
et al., 2005). Um dos
grandes benefícios dessa análise comparativa foi a observação de que o conteúdo gênico
117
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
desses tripanossomatídeos é altamente sintênico, sendo considerado pelos autores que sintenia
é a conservação da ordem gênica nos cromossomos. Isso já tinha sido demonstrado em menor
escala entre leishmânias do Velho e Novo mundo (BRITTO
et al., 1998), entre T. brucei e L.
major (GULL, 2001) e entre T. brucei, T. cruzi e L. major pela análise do genoma desses
parasitos quando eles ainda não haviam sido completados (GHEDIN
et al., 2004). Pela
análise comparativa do genoma completo dos Tritryps, EL-SAYED, MYLER, BLANDIN
et
al. (2005) observaram que 94% dos grupos de genes ortólogos, isto é, genes de diferentes
espécies que descendem de um ancestral comum, estão dentro de regiões de sintenia
conservada. Os genomas de
T. brucei e L. major mostram 110 blocos sintênicos que
correspondem a 19,9Mb e 30,7Mb de seus genomas de 25Mb e 33Mb, respectivamente (EL-
SAYED, MYLER, BLANDIN
et al., 2005). A análise detalhada dos pontos de quebra de
sintenia por esses autores revelou que 40% deles estavam associados com expansão de
famílias de gênicas e a presença de retroelementos e/ou RNAs estruturais.
Neste trabalho, expandimos a organização dos genes de tripanossomas em blocos
sintênicos para
T. rangeli pela associação de três genes que codificam a enzima E2
conjugadora de ubiquitina, a rRNA metiltransferase e a subunidade 6 não-ATPase regulatória
do proteassomo, sem levar em conta a ordem gênica. A associação de genes a uma dada
banda cromossômica, independentemente da ordem, foi utilizada para investigar sintenia
gênica de plantas,
Plasmodium spp e T. cruzi (CARLTON, 2003; MCCOUCH, 2001;
VARGAS
et al., 2004) e pela definição do termo a ordem não é necessária (RENWICK 1972;
PASSARGE et al. 1999). No entanto, a busca pela organização dos genes UBE2, rRNAmtr e
PSMD6, realizada no banco de dados de domínio público, mostrou que em
T. brucei, T. cruzi,
L. major e L. braziliensis e L. infantum estes genes encontram-se presentes na mesma ordem
no cromossomo (www.genedb.org)
. Isso nos leva a supor que a ordem também deve ser
mantida em
T. rangeli.
118
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
Em T. rangeli, a hibridação de fragmentos desses genes, amplificados pela PCR,
ocorreu em cromossomos de mesmo tamanho nas cepas KP1(+) e em cromossomos de
tamanhos diferentes nas cepas KP1(
−). Situação similar foi observada por VARGAS et al.
(2004) em
T. cruzi, que observaram que o padrão de hibridação com diferentes marcadores
em
T. cruzi I diferiu daquele observado em T. cruzi II e que houve sintenia entre eles. Neste
trabalho, esta clara divisão não pôde ser estabelecida em
T. cruzi, mas pela análise do
polimorfismo observado com a hibridação, houve uma tendência a formar dois grupos, um
associado ao
T. cruzi I e outro associado ao T. cruzi II. A cepa Mut, cujo genótipo ainda não
foi esclarecido, apresentou um padrão de hibridação muito próximo ao da cepa Alv de
T. cruzi
I. Isso é muito interessante uma vez que ela foi isolada de
P. megistus, mesmo vetor da cepa
Alv A cepa PV, que também apresenta um genótipo inconclusivo, apresentou um perfil de
hibridação distinto, que não pôde ser associado aos perfis previamente observados.
A hibridação das três sondas aos cromossomos de todas as cepas de
T. rangeli foi
muito mais fraca do que nos cromossomos de
T. cruzi e ocorreu em condições de baixa
estringência, indicando uma divergência de seqüência destes genes nos cromossomos dos dois
parasitos. É interessante observar que, apesar da suposta divergência de seqüência, os três
genes foram sintênicos. EL-SAYED, MYLER, BLANDIN
et al. (2005) observaram que 43%
dos pontos de quebra de sintenia no
T. brucei, T. cruzi e L. major ocorre, além de nas regiões
teloméricas e subteloméricas, em regiões muito próximas a pontos de inflexão que separam os
grupos de genes direcionais (DGCs), que são característicos e únicos dos genomas de
tripanossomatídeos. Para os autores, parece haver uma forte pressão seletiva para manter a
ordem e os DGCs intactos, apesar da divergência de seqüências entre genes. É provável que
isso também ocorra com o
T. rangeli.
Certo grau de divergência de seqüência entre genes de
T. rangeli e outros organismos,
como
T. brucei, T. cruzi e L. braziliensis, foi, recentemente, demonstrada por FERREIRA
119
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
(2006). A análise das 221 seqüências geradas pelos autores revelou que 15,8% não tinham
identidade com nenhuma seqüência depositada em banco de dados, 76,1% foram similares às
seqüências de
T. cruzi e apenas 0,9% e 0,45% foram similares ao T. brucei e a L. braziliensis.
Apesar da extensa sintenia observada entre os Tritryps, muitas inserções locais,
deleções ou substituições foram vistas em diferentes regiões sintênicas, com inserções e
substituições sendo mais comuns do que as deleções (EL-SAYED, MYLER, BLANDIN
et
al., 2005; GHEDIN et al., 2004). Tais processos resultam em grupos de genes ortólogos não
sintênicos e em genes espécie-específicos, que podem explicar a aparente divergência de
seqüências dos três genes entre
T. cruzi e T. rangeli encontradas neste trabalho. Além disso,
nos Tritryps o alinhamento de seqüências de aminoácidos dos grupos de genes ortólogos
revelou uma média de 57% de identidade entre
T. brucei e T. cruzi e, aproximadamente, 44%
entre cada um deles e
L. major. O restante do proteoma seria composto de genes espécie-
específicos, sendo que
T. cruzi e T. brucei apresentariam 32% e 26% desses genes,
respectivamente, em relação a 12% dos de
L. major (EL-SAYED, MYLER, BLANDIN et al.,
2005). De acordo com os autores, a diferença desses números pode estar relacionada a
diferentes estratégias de sobrevivência e evasão do sistema imune em cada organismo, uma
vez que a maioria das proteínas específicas parece corresponder a membros de famílias de
antígenos de superfície.
VARGAS
et al. (2004) observaram para as cepas de T. cruzi I e II que, apesar do
polimorfismo do cariótipo, os grupos sintênicos estudados por eles foram conservados nas
nove cepas, sugerindo que a conservação do conteúdo cromossômico é uma importante
característica do genoma do
T. cruzi, o que foi confirmado pelo seqüenciamento do seu
genoma (EL-SAYED; MYLER; BARTHOLOMEU
et al., 2005). Nas cepas de T. rangeli
estudadas neste trabalho, os dois fenômenos foram observados, ou seja, polimorfismo do
cariótipo e sintenia gênica, sugerindo que, da mesma forma que em
T. cruzi, T. rangeli deve
120
Resultados
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
ter o seu conteúdo gênico conservado em relação ao T. brucei, T. cruzi e L. major. No entanto,
um maior número de genes deve ser avaliado para confirmar esses dados. De qualquer forma,
a informação obtida aqui é relevante, visto que indica que o seqüenciamento do genoma de
T.
rangeli pode levar a vários esclarecimentos em relação ao estabelecimento da infecção e
patogenia causada pelo
T. cruzi e não observada para o T. rangeli.
Seria muito interessante que a ocorrência de sintenia fosse verificada com vários
marcadores entre
T. brucei, T. cruzi, L. major e T. rangeli, uma vez que este último parasito
não é patogênico para o homem. Genes presentes nos grupos sintênicos entre
T. brucei, T.
cruzi e L. major e ausentes no T. rangeli seriam alvos candidatos para uma terapêutica contra
os primeiros e também para o diagnóstico diferencial entre
T. cruzi e T. rangeli. Além disso,
tal estudo poderia levar ao esclarecimento de mecanismos relacionados com a virulência e
patogenicidade dos tripanossomatídeos que infectam humanos. A verdadeira extensão da
sintenia gênica entre
T. rangeli e outros tripanossomatídeos poderá ser obtida somente após o
seqüenciamento do genoma de
T. rangeli, ainda sem perspectiva, e sua análise comparativa
com outros organismos. Dessa forma também será possível investigar se estes genes mantêm
a ordem e orientação nos vários tripanossomatídeos.
6. CONCLUSÕES
122
Conclusões
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
122
6.1. Pela análise do cariótipo de
T. rangeli pela PFGE conclui-se que:
6.1.1. o cariótipo deste parasito apresentou aproximadamente 22 bandas
cromossômicas para as cepas KP1(+) localizadas entre 436kb e 2.000kb e 13 bandas
cromossômicas para as cepas KP1(
−), localizadas entre 388kb e 2.000kb. Além disso,
nas cepas KP1(
−) não foram observados cromossomos na região de 1Mb e 1,6Mb.
6.1.2. apesar do polimorfismo do cariótipo do
T. rangeli em relação ao número e
tamanho dos cromossomos, o perfil de separação de bandas cromossômicas obtido
permitiu a reunião das cepas em dois grupos, que foram coincidentes com os genótipos
KP1(+) e KP1(
−).
6.2. A associação de oito novos marcadores moleculares aos cromossomos e ao DNA
genômico digerido de
T. rangeli mostrou que:
123
Conclusões
Marlene Cabrine dos Santos Silva Tese de Doutorado
123
6.2.1. os cromossomos de
T. rangeli apresentam polimorfismo intraespecífico e
também entre homólogos.
6.2.2. o padrão de hibridação obtido com sete marcadores moleculares foi capaz de
separar as cepas em dois grupos, que também foram coincidentes com os genótipos
KP1(+) e KP1(
−).
6.3. o padrão de associação de uma sonda correspondente à região subtelomérica de
T. rangeli
ao DNA genômico digerido deste parasito foi distinto entre as cepas KP1(+) e as cepas
KP1(
−), mostrando que a organização dessa região deve ser diferente nos dois genótipos.
6.4. A associação dos genes de
T. cruzi que codificam a enzima E2 conjugadora de ubiquitina,
a rRNA metiltransferase e a subunidade 6 não-ATPase regulatória do proteassomo aos
cromossomos de
T. rangeli mostrou a ocorrência de sintenia entre os dois organismos, que
pôde ser estendida aos parasitos
T. brucei, L. major, L. braziliensis e L. infantum pela análise
do banco de dados de domínio público.
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