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KELLY CRISTINA ELEUTÉRIO LEITE
Análise da Estrutura Genética e Biologia Reprodutiva do Papagaio
-
Verdadeiro (
Amazona aestiva
)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia da Universida
de
Católica de Brasília como requisito para obtenção
do Título de Mestre em Ciências Genômicas e
Biotecnologia.
Orientadora
: Dra. Rosane Garcia Collevatti
Co
-
orientador
: Dr. Rena
to Caparroz
Brasília
-
DF
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
A minha família pelo apoio incondicional e aos amigos
Rosane e Renato pela imensa e válida contribuição na
minha formação profissional.
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais
Solon
e
Geralda
e irmãos
Anne
e
So
lon Filho
que nunca mediram esforços
para que eu realizasse os meus sonhos e insistem sempre em me apoiar e me incentivar.
Pelo incondicional amor que me fortalece cada vez mais e me torna a cada dia uma pessoa
mais realizada.
A minha orientadora e amiga Dra. Rosane Garcia Collevatti por ter me oferecido muitas
oportunidades contribuindo intensamente na minha formação pessoal e profissional. Pelas
intermináveis horas de atenção e disponibilidade em ensinar e aconselhar em todos os
momentos. Pela sabedoria e seriedade que conduziu a orientação deste trabalho e pela
confiança depositada em mim. Sinto
-
me honrada por aprender com seus ensinamentos.
Ao meu co-orientador e amigo Dr. Renato Caparroz pelas horas de dedicação e
imensurável contribuição nesse trabalho. Pelos preciosos ensinamentos e conselhos e por
sempre se mostrar disponível e paciente para mostrar os caminhos para o melhor
desenvolvimento deste trabalho. Tenha consigo minha imensa admiração.
As amigas Roberta Nency e Luciana Bezerra pela amizade, lealdade e cumplicidade, e
por sempre me oferecer muito apoio e incentivo compartilhando momentos de dificuldade e
de felicidade.
As amigas Jackeline Leite
,
Karoline Silva
,
Andréia Souza
,
Elizabeth Cândido, Ana
Borges
e
Aline Castro
pelas longas horas de est
udo e diversão.
As amigas Aline Braga e Alessandra Reis pela ajuda sempre disponível no laboratório, e
por todos os momentos de aprendizado e de boas risadas.
Aos
demais amigos e familiares por sempre, presentes ou não, estarem torcendo por mim
e pelo êxit
o na conclusão deste trabalho.
Ao
Dr.
Rinaldo Pereira
pelos ensinamentos e pela ajuda cedida nos momentos solicitados,
e por ter aceitado participar da banca examinadora na qualificação e na defesa dessa
dissertação.
Ao
Dr. Ruy Caldas, coordenador do curso de Pós-graduação em Ciências Genômicas e
Biotecnologia, pelo incentivo sempre oferecido em palavras de encorajamento e pela
exemplar coordenação deste curso.
A
Danielle de Moura e ao secretário Fábio Costa pela ajuda e atenção sempre
disponíveis.
Aos técn
icos
André Ramos
,
Idacuy
e Willian Baião pela ajuda sempre prestativa no
laboratório que foi de grande contribuição para o desenvolvimento desse trabalho.
A
Universidade Católica de Brasília e ao
CNPq
pelo apoio financeiro que tornou
possível a realização desse trabalho.
A
SEMARH
que autorizou a realização das coletas na Estação Ecológica de Águas
Emendadas e ao funcionário
Gilvan
que auxiliou nesse processo.
Aos
funcionários do Jardim Botânico e da Estação Ecológica do IBGE que permitiram
a realização das
coletas nessas áreas.
RESUMO
Informações sobre a biologia, ecologia e variabilidade genética de uma espécie são
fundamentais para subsidiar a elaboração de estratégias de conservação de suas populações
naturais. O papagaio-
verdadeiro
(Amazona aestiva) possui ampla distribuição geográfica e ainda é
abundante
em algumas áreas de ocorrência, por isso não é considerado ameaçado de extinção. No
entanto, é um dos psitacídeos neotropicais mais capturado na natureza para abastecer o comércio
ilegal de animais silvestres. O objetivo deste trabalho é analisar a estrutura genética de cinco
populações naturais de A. aestiva e verificar se estas apresentam efeito de gargalo genético
(genetic bottleneck), bem como analisar a biologia reprodutiva desta espécie quanto aos aspectos
da monogamia e da fidelidade ao ninho. Neste trabalho, foi testada a transferibilidade de 12 pares
de iniciadores para amplificação de locos microssatélite desenvolvidos para A. guildinguii e cinco
desenvolvidos para Ara arar
auna
. Dos 17 pares de iniciadores, 14 apresentaram produtos de
amplificação, sendo nove destes polimórficos (com cinco alelos ou mais por loco). A estrutura
genética das cinco populações de A. aestiva foi averiguada com base na análise de seis pares de
loc
os microssatélite em uma amostra de 74 indivíduos, incluindo amostras das duas subespécies de
A. aestiva atualmente reconhecidas (A. a. aestiva e A. a. xanthopteryx). Foi encontrada uma baixa
estruturação genética entre as populações dos extremos da distribuição geográfica (
= 0,012
;
p =
0,0007
) e a análise de efeito de gargalo genético não indicou redução recente no tamanho para
nenhuma população. A análise da biologia reprodutiva foi baseada em testes de parentesco entre
ninhegos do mesmo ninho (para verificar a hipótese de monogamia) e entre ninhadas coletadas no
mesmo ninho em estações reprodutivas diferentes (para testar a hipótese de fidelidade ao ninho). O
estudo de parentesco baseado em 44 ninhadas forneceu evidências que corroboram a hipótese de
mo
nogamia da espécie. A análise de fidelidade ao ninho foi significativa para três dos sete ninhos
analisados. Os resultados genéticos obtidos nesse trabalho poderão auxiliar na compreensão da
atual situação taxonômica de A. aestiva e dos processos envolvidos na evolução desta espécie,
além de contribuir com informações importantes sobre as populações naturais e sobre o
comportamento reprodutivo do papagaio-verdadeiro, proporcionando maior subsídio para a
elaboração de futuros programas de conservação.
Palavras
-
chave
:
Amazona aestiva, microssatélites, estrutura genética, comportamento
reprodutivo, monogamia, parentesco.
ABSTRACT
Information on biology, ecology and
genetic
variability of a specie
are ultimate to subsidize
the elaboration of strategies of conservation of its natural populations. The blue-fronted amazon
(Amazona aestiva) presents a widespread distribution and is still abundant in some areas of
occurrence, therefore it is not under threat of extinction. However, it is one of the
most
neotropica
l
parrots captured in the nature to supply the illegal trade of wild animals. The goals of this study is
to analyze the genetic structure of five A. aestiva populations and verify if there are effects of
bottleneck in population size, and moreover analyze the reproductive biology under aspects of
monogamy and nest fidelity. In this study, we tested the transferability of the 12 microsatellite
primers developed for
A. guildinguii
and five for
Ara ararauna
. From the 17 markers, 14 presented
amplification products, of which nine were polymorphic (with five or more alleles per locus). The
genetic structure of five
A. aestiva
populations was investigated by analyzing six microsatellite loci
in 74 samples, including samples from two subspecies recognized (A. a. ae
stiva
e A. a.
xanthopteryx
). There was a
low
evidence of genetic structure between the populations of the limits
of the geographic distribution (
= 0,012
;
p = 0,0007) and the bottleneck analysis did not show
recent reduction on population size. The analysis of reproductive biology was based on parentage
tests among nestlings from the same nest (to verify the monogamy hypothesis) and among clutches
collected in the same nest in different breeding seasons (to verify the nest fidelity hypothesis). The
parenta
ge assignment performed in 44 clutches yields evidences that corroborate with the
monogamy hypothesis. Three out of seven analysis of nest fidelity was significant. The results
obtained on this study must
enlighten
the taxonomic situation of A. aestiva and the evolution
processes involving this species. F
urthermore
, contribute to important information on the natural
populations and the reproductive behavior of the blue-fronted amazon, providing subsidy for the
elaboration of future programs of conservation.
Keywords:
Amazona aestiva
, microsatellites, genetic structure, reproductive behavior, monogamy,
parentage
.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Vórtices da extinção
13
Figura 2
Modelos de estrutura populacional
18
Figura 3
Distribuição geográfica de
Amazona
aestiva
e das duas subespécies
atualmente reconhecidas (
A. a aestiva
e
A. a. xanthopteryx
)
26
Figura 4
Locais de obtenção das amostras de
A. aestiva
.
32
Figura 5
Distribuição em classes das freqüências alélicas para as cinco
populações estudadas de
A. ae
stiva
segundo o programa
Bottleneck
.
46
Figura 6
Valores dos índices de relação genética (r) entre pares de indivíduos
obtidos por 1.000 simulações utilizando as freqüências alélicas
estimadas para 115 amostras de A. aestiva e seis pares de locos
microssa
télite segundo o programa
Kinship 2.1
.
49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Locais de obtenção das amostras de
Amazona aestiva
31
Tabela 2
Características de 18 pares de locos microssatélite desenvolvidos para as
espécies
A. guildinguii e Ara ararauna, testados em 22 indivíduos de
A.
aestiva
41
Tabela 3
Caracterização de nove pares de locos microssatélite desenvolvidos para
as espécies A. guildinguii e Ara ararauna, testados em 22 indivíduos de
A. aestiva
.
43
Tabela 4
Caracterização das cinco populações de A. aestiva
baseadas em seis
pares de locos microssatélite.
44
Tabela 5
Estrutura genética de cinco populações de A. aestiva
baseada na análise
da variância das freqüências alélicas e no tamanho dos alelos para seis
pares de locos microssatélite
(
R
ST
).
44
Tabela 6
Valores de theta par a par para cinco populações de A. aestiva
baseada
na análise de seis pares de locos
microsatélite
45
Tabela 7
Resultados da análise de filhotes de A. aestiva
encontrados no mesmo
ninho em diferentes localidades: r
azões de probabilidades (LOD) e
estimativa das relações genéticas (r) obtidas pela análise de seis
pares de
locos
microssatélite.
47
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%
Porcentagem
°C
Grau Celsius
µg
Micrograma
µl
Microlitro
µM
MicroMolar
DNA
Ácid
o Desoxirribonucléico
DNAmt
DNA mitocondrial
dNTP
Desoxirribonucleotídeo Trifosfato
EHW
Equilíbrio de Hardy
-
Weinberg
ESU
Evolutionary Significant Unit
(Unidade evolutivamente significativa)
g
Grama
kb
Kilobase
M
Molar
mg
Miligrama
MgCl
2
Cloreto de Mag
nésio
mM
MiliMolar
MU
Management Unit
(Unidade de Manejo)
NaCL
Cloreto de sódio
pb
Pares de Base
PCR
Reação em cadeia de polimerase
PVA
Análise da viabilidade populacional
STR
S
hort
tandem
repeat
(microssatélite)
SMM
Stepwise Mutation Model
Taq
Thermus
aquaticus
TPM
Two
-
Phase Mutation Model
U
Unidade
SUMÁRIO
1. Introdução
1.1
Genética da Conservação
12
1.2
Estrutura Populacional e Conservação
16
1.3
O estabelecimento de ESUs e MUs
19
1.4
Os microssatélites
21
1.5
A espécie
Amazona aestiva
(Papagaio
-
verdadeiro)
25
2. Objetivos
2.1
Objetivo Geral
30
2.
2
Objetivos Específicos
30
2.3
Hipóteses de trabalho
30
3. Material e Métodos
3.1
Caracterização das amostras e extração de DNA
31
3.2
Transferibilidade e caracterização dos locos
microssatélite
33
3.3
Estrutura genética
35
3.3.1
Seleção da amostra
35
3.3.2
Análise genética
36
3.4
Gargalo genético
37
3.5
Parentesco e fidelidade ao ninho
38
3.5.1
Seleção da amostra
38
3.5.2
Análise genética
38
4. Resultados
4.1
T
ransferibilidade e caracterização dos locos microssatélite
41
4.2
Estrutura Genética
43
4.3
Gargalo genético
45
4.4
Parentesco e fidelidade ao ninho
46
5. Discussão
5.1
Transferibilidade e caracterização dos locos microssatélite
50
5.2
Estrutura
Genética
52
5.3
Gargalo genético
54
5.4
Parentesco e fidelidade ao ninho
56
5.5
Implicações para a conservação
58
6. Conclusões
62
8. Referências
63
9. Anexos
9.1
Characterization of microsatellite
loci
in three species of Amazona
(Psittaciformes:
Aves) using heterologous primers
9.2
Distribuição das
freqüências
alélicas para cada loco microssatélite e para
cada
popula
ção.
12
1. INTRODUÇÃO
1.1
Genética da Conservação
A ciência da Biologia da Conservação, iniciada na década de 80 (SOULÉ E
WILCÓX
,
1980;
SOUL
É
1986,
1987) proporciona a identificação das causas e conseqüências referentes aos
processos de extinção e evolução de uma população ou espécie, permitindo a elaboração e
aplicação de estratégias de conservação que sejam efetivas na redução ou eliminação dos riscos de
extinção (TERBORGH
E WINTER
, 1980;
SOULÉ, 1986;
FRANKHAM
et al
.
, 2002
).
Desde os estudos iniciais nessa área do conhecimento, a perda de diversidade genética é
considerada um dos principais fatores atribuídos ao aumento dos riscos de extinção
(ALLENDORF
E LEARY, 1986; SOULÉ 1986, 1987). Como as populações pequenas tendem a
apresentar baixa variabilidade genética, os processos de extinção e evolução nessas populações
formaram as bases iniciais do desenvolvimento teórico da
Genética
da
Conservação, campo
intimamente relacionado com a Biologia da Conservação (FRANKLIN, 1980; SOULÉ, 1987;
FRANKHAM, 1995;
FRANKHAM
et al.
, 2002a
).
Os primeiros estudos foram direcionados à determinação do tamanho mínimo de uma
população para que esta fosse mantida viável em longo prazo, termo conhecido como MVP
(minimum viable population) (
GILP
IN, 1987
).
Porém, somente a estimativa do tamanho
efetivo
populacional de u
ma espécie não é suficiente para inferir os
riscos de extinção (
GILPIN
E SOULÉ
,
1986). Como cada espécie apresenta uma história de vida particular (por exemplo, distribuição
temporal e espacial, nível de variação genética), este tamanho deve ser associado a
fatores
biológicos, ecológicos, demográficos e genéticos, associados aos seus respectivos elementos
estocásticos, para que as ameaças de extinção acentuadas em pequenas populações
sejam
devidamente
caracterizadas
(
GILPIN E SOULÉ, 1986
).
A partir dessa associação
GILPIN E SOULÉ
(1986) desenvolveram um processo de análise
de viabilidade (ou vulnerabilidade) populacional, conhecido como PVA (population viability
analysis
). Pela avaliação desse processo, foi possível a identificação dos chamados vórtices da
extinção , os quais auxiliam na identificação e compreensão dos eventos envolvidos no process
o
de extinção de uma espécie (
GILPIN E SOULÉ, 1986
).
13
Figura 1
: Os vórtices da extinção proposto por Gilpin e Soulé (1986)
Adaptado: Frankham,
2002.
Segundo
GILPIN E SOULÉ (1986), o processo de extinção é iniciado pela redução do
tamanho populacional. Essa redução pode ser induzida por
vários
fatores como a perda de habitat
(RUSSELLO et al., 2004;
FUNK
et al., 2005, JUMP et al., 2006), a superexploração de uma
determinada espécie (BAUM et al., 2003; PERES et al., 2003), ou a introdução de espécies
exótic
as
(COBLENTZ, 1990; BOUZAT et al., 1998; CASSEY et al., 2005); ou pode ser
provocada por fatores estocásticos demográficos ou ambientais (ELDRIDGE et al., 1999;
STENSETH et al., 1999
).
Pequenas populações também podem ser originadas pelo deslocamento
de poucos indivíduos de uma determinada área que passam a ocupar uma nova
região
, evento
conhecido como efeito fundador (CLEGG et al., 2001; HEDRICK et al., 2001; GRANT, 2002).
Quando a redução do tamanho populacional ocorre de maneira
repentina
e intensa, é dito que tal
população sofreu um evento conhecido como efeito
de
gargalo
genético (
genetic
bottleneck
) e
muitas vezes a recuperação de um tamanho viável
por meio de planos de manejo populacional,
no
s
quais
os riscos de extinção são reduzidos ou eliminados, pode ser uma tarefa extremamente difícil
e demorada.
(
TEMPLE, 1986; GLENN et al., 1999; BAUM et al., 2003
).
A redução no tamanho populacional pode alterar a distribuição espacial de uma população,
originando populações fragmentadas, pequenas e isoladas, int
roduzindo ou aumentando o processo
14
de subdivisão populacional (GILPIN E SOULÉ, 1986). Esse isolamento é responsável pelo
aumento dos riscos de extinção por duas razões: as populações pequenas podem ser
completamente eliminadas
por
flutuaç
ões demográficas ou ambientais, ou por catástrofes naturais
(fatores estocásticos)
; ou podem
apresentar declínio da diversidade genética devido à ocorrência
de
processos como
endocruzamento
e deriva genética, tornando-se mais vulneráveis a extinção
(FRANKLIN, 1980; GILPIN E SOULÉ, 1986
;
TERBORGH
E WINTER, 1987;
FRANKHAM,
1995, FRAN
KHAM
et al.
, 2002a
).
O endocruzamento
é interpretado como
a
alta freqüência de acasalamentos entre indivíduos
aparentados, e quando se trata de pequenas populações, esse processo é acentuado de tal maneira
que
em poucas gerações é inevitável que todos os indivíduos sejam
aparentados
(FRANKHAM
et
al.
, 2002b). A alta freqüência de acasalamentos entre indivíduos geneticamente relacionados
proporciona o declínio da variabilidade genética pelo
decréscimo
da freqüência de heterozigotos e
pelo
aumento da probabilidade dos alelos deletérios ocorrerem em homozigose (
SOULÉ
E
WILCÓX
, 1980a; RALLS et al., 1986; FRANKHAM, 1995
).
Como a alta freqüência de
heterozigotos
está associada a altas taxas de
sobrevivência
, crescimento, resistência a doenças e
reprodução
em
muitas espécies (ALLENDORF E LEARY, 1986), a baixa freqüência desses
genótipos
pode ser diretamente relacionada com a baixa adaptabilidade da população
.
A
baixa
adaptabilidade decorrente da expressão de alelos deletérios em uma população é chamada de
depressão endogâmica e em muitos casos pode-se verificar que esse processo torna as populações
mais susceptíveis ao processo de extinção (FRANKLIN, 1980; FRANKHAM, 1995; BOUZAT et
al., 1998;
SACCHERI et al., 1
998).
Porém, não é somente o acasalamento entre indivíduos aparentados
que
proporcion
a
o
declínio
da variabilidade genética e da adaptabilidade em
populações pequenas. Mesmo que ocorra
acasalamento entre indivíduos não relacionados geneticamente, a variabilidade genética po
de
ser
reduzida
devido
ao
processo chamado deriva genética
,
dado pela mudança aleatória das
freqüências alélicas de uma geração para outra,
induzindo
a fixação de determinados alelos, e
consequentemente, a perda de outros (FRANKLIN, 1980;
HEDRICK
E
KALINOWSKI,
2000;
FRANKHAM
et al., 2002a; GAUTSCHI et al.,
2003).
O processo de deriva genética é mais
pronunciado
em
populações que sofreram
efeito
de
gargalo
genético (GLENN et al., 1999)
ou
efeito fundador (CLEGG et al., 2001; HEDRICK et al., 2001), e pode ser diretamente relacionado
à baixa adaptabilidade destas populações (
HEDRICK
E
KALINOWSKI
, 2000)
.
Por exemplo, os
15
indivíduos derivados das
populações
que sofreram estes eventos, podem, ao acaso, carregar uma
freqüência menor dos
genótipos
favoráveis (adaptados) em relação à freqüência destes nas
populações anteriores (HEDRICK E KALINOWSKI
, 2000
).
O processo de análise da viabilidade populacional (PVA)
(GILPIN
E
SOULÉ
1986)
funciona
como uma ferramenta indispensável nos estudos de conservação para o
estabele
cimento
de
estratégias de recuperação de populações naturais. Estudos sobre fatores como redução no
tamanho populacional, perda da diversidade genética e declínio da adaptabilidade, sobrevivência e
reprodução de populações naturais permite
m
a elaboração de
planos de manejo
in situ
e
ex situ
que
sejam
efetivamente
direcionados
para a redução ou eliminação dos riscos de extinção de
populações e espécies.
1.
2 Estrutura Populacional e Conservação
Na determinação da PVA de uma espécie,
a
estrut
ura espacial dos indivíduos,
principalmente no que tange a formação de pequenas populações, apresenta um papel importante
na dinâmica que envolve os vórtices da extinção (GILPIN, 1987). A principal conseqüência de
uma população que se apresenta
de forma fr
agmentada no espaço é a limitação do fluxo gênico que
ocorre entre indivíduos de grupos populacionais distintos, o que pode gerar pequenos grupos
isolados, e consequentemente, uma diferenciação genética entre estes (BLEICH et al., 1990;
COLLEVATTI et al., 2001; ZUCCHI et al., 2003; D
ALEN et al., 2006)
.
Em longo prazo, a principal conseqüência deste isolamento reprodutivo é
a
formação de
populações localmente adaptadas, ou seja, populações que
apresenta
m um conjunto de alelos
favorecido
pelas
condições locais
, e
pode
, portanto
, favore
cer
o processo de especiação
(WRIGHT,
1978
)
.
Por outro lado, a manutenção do fluxo gênico gera uma maior variabilidade genética
permitindo
uma menor diferenciação entre as populações e proporcionando maior pot
encial
evolutivo
para estas
(BALLOUX
E LUGON-
MO
ULIN
, 2002). Desse modo, é fundamental
compreender como ocorre o fluxo gênico entre os indivíduos e os efeitos deste em estudos
de
estrutura genética de populações. Do ponto de vista da conservação, a estimativa da diferenciação
genética entre as populações faz-se necessário, uma vez que a identificação de populações isoladas
ou contínuas
pode
rá direcionar corretamente as estratégias de manejo
para
uma determinada
espécie.
16
Em
estudos de populações naturais, a identificação da estrutura genética pode ser rea
lizada
a partir da utilização dos coeficientes de endocuzamento descritos por SEWALL WRIGHT
(1951)
F
IS
, F
ST
e F
IT
.
Esses coeficientes são baseados nos níveis de heterozigisodade presentes nos três
níveis hierárquicos de uma
estrutura populacional: o indiví
duo, a subpopulação e a população total.
Posteriormente, C
OCKERHAM
(1969) descreveu medidas de diferenciação genética análogas aos
coeficientes de
S. WRIGHT
(
f
,
,
F
,)
, baseadas na análise de var
iância das freqüências alélicas.
Populações estruturadas em subgrupos podem ser identificadas na maioria das espécies,
onde os indivíduos são organizados em manchas populacionais (GILPIN, 1987; HARTL E
CLARCK
, 1997; FRANKHAM et al., 2002b). Essa
estruturação
interfere diretamente no modo
como ocorre o fluxo gênico entre os indivíduos. Por essa razão, alguns modelos foram propostos
para explicar como a variabilidade genética é distribuí
da dentro e entre as populações (Figura 2).
No modelo de
ilhas
todas as subpopulações apresentam o mesmo tamanho e o fluxo gênico
en
tre
estas é independente da proximidade geográfica, ou seja a taxa de migração é a mesma em
qualquer direção (WRIGHT, 1942)
.
Segundo o
modelo
isolamento
por distância a distribuição dos
indivíduos é contínua no espaço, porém o fluxo gênico é restrito a curtas distâncias permitindo a
formação
de vizinhanças genéticas
(WRIGHT, 1942; 1951)
.
No
modelo
stepping
-
stone
o fluxo
gênico ocorre entre
subpopulações
adjacentes que são distribuídas em dimensões limitadas
espacialm
ente
(KIMURA
E WEISS
, 1964
).
Figura 2: cinco diferentes modelos de estrutura de população: A) isolamento por distância; B)
stepping
-
stone
; C)
modelo de ilha
s; D) metapopulação; E)
source
-
sink
.(Adaptado: Frankham.
2002).
17
Estudos baseados no modo como ocorre o fluxo gênico e como este interfere na estrutura
de uma população auxiliam na inferência de fatores associados à distribuição da
variabilidade
genética, e conseqüentemente, são de grande importância na definição de estratégias de
conservação
(PAETKAU et al., 1999, SHERWIN et al., 2000; COLLEVATTI et al., 2001;
EIZIRIK et al., 2001)
.
Por
exemplo, caso as populações não sejam diferenciadas geneticamente,
seria viável concentrar esforços em apenas uma área, utilizando indivíduos desta para eventual
recolonização de outras regiões (HAIG, 1998). Porém, populações isoladas geograficamente, com
baixa ou nenhuma ocorrência de fluxo gênico, podem ao longo das gerações apres
entarem
composição genética completamente diferente, o que direciona as propostas de conservação para
cada área isoladamente.
1.3
O estabelecimento de ESUs e MUs
Nas três últimas décadas, a identificação de diferenciação genética entre populações tem
sid
o indispensável para a elaboração de propostas de conservação. Em meados da década de 80, foi
proposto o conceito de Unidade Evolutivamente Significativa
ESU (Evolutionary Significant
Unit
)
(RYDER, 1986), definida como grupos de indivíduos isolados por um período de tempo
suficiente para que estes apresentem alta diversidade genética entre si. Como essa definição
apresenta limites para atender as propostas de conservação, uma vez que o estabelecimento de
ESUs deve ser associado com diferentes tipos de informação (ecológicas, fisiológicas e outras)
(RYDER, 1986; PAETKAU, 1999; FRASER et al., 2001), esse conceito tem sido amplamente
reformulado (CRANDALL et al., 2000; FRASER et
al
., 2001).
No início dos anos 90, surgiram mais duas definições para ESUs. Uma dessas propõe que
ESUs sejam populações isoladas reprodutivamente
apresentando
diferenciação adaptativa, o que
representa
um importante componente na evolução de espécies (WAPLES, 1995) Quanto a
determinação da estrutura populacional, a aplicação dessa definição não seria difícil, uma vez que
esse fator pode ser detectado por métodos moleculares (FRASER et al., 2001). O limite dessa
aplicação está na representatividade da diferenciação adaptativa, uma vez que esta pode
ser
decorrente de adaptação local
mesmo
quando existe fluxo gênico (CRANDRAL et al., 2000).
Outra definição seria dada por populações nas quais as linhagens do DNA mitocondrial (DNAmt)
são reciprocamente monofiléticas, ou seja, todas as linhagens dentro de uma subpopulação
18
compartilham um ancestral comum mais recente do que o compartilhado por linhagens de grupos
distintos (MORITZ, 1994).
As
ESUs podem também ser classificadas como populações que apresentam baixo fluxo
gênico entre si e que estão sofrendo efeitos de forças evolutivas como deriva genética e seleção
(CRANDALL et al., 2000
).
Essa proposta é uma das mais recomendadas para atender ao
estabelecimento de
ESUs
por duas razões: aborda a existência de diferenciação adaptativa entre
populações baseada em modificações genéticas e ecológicas; e as possibilidades histórica ou
recente de ocorrência do fluxo gênico (CRANDALL et al., 2000; FRANKHAM
et al.
, 2002b).
A diferenciação genética entre populações também serviu de base na proposta de um
conceito menos específico que o de ESU. M
ORITZ
(1994) propôs o conceito de Unidade de
Manejo (Management Unit - MU) baseado nas diferenças das freqüências alélicas entre
subpopulações. Porém esse conceito apresenta uma limitação importante: a detecção de estrutura
populacional é dependente da variabilidade e
do número de marcadores moleculares, bem como do
tamanho amostral, o que nem sempre é possível para muitos estudos de populações naturais
(
PAETKAU, 1999).
Independente do conceito de ESU ou de MU, a decisão de conservar uma espécie deve ser
tomada cuidadosamente. Os resultados obtidos por análise genética não devem ser considerados
isoladamente para o estabelecimento de MUs, e sim associados a dados ecológicos e históricos, o
que é fundamental para que as estratégias de conservação sejam efetivas (SHERWIN et al., 2000).
Além disso, como cada população ou espécie apresenta características particulares
,
como
por
exemplo,
níve
l de fluxo gênico, distribuição e história de vida, os objetivos
associados
à
conservação
devem
ser atenciosamente instituídos, e ainda, os riscos de extinção devem ser
identificados e considerados para que finalmente possam ser definidas tais unidades (TAYLOR et
al., 1999).
1.
4 Os m
icrossatélites
O desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas moleculares têm permitido a
identificação e o acesso a diferentes tipos de marcadores moleculares, auxiliando no
desenvolvimento de muitos princípios teóricos e práticos aplicados na Genética da Conservação
.
Segundo
A
VISE
(1994)
,
os marcadores moleculares podem ser definidos
como
qualquer loco
19
gêni
co
, ou seu produto, que apresenta variabilidade que permita estudar um problema biológico.
Nas últimas décadas, os marcadores moleculares do tipo microssatélite ou STR (
Short
Tandem
Repeats
)
têm atraído a atenção dos pesquisadores pelo seu potencial de apl
icação em diversas áreas
do conhecimento (
GOLDSTEIN
E SCHLÖTTERER
, 1999
), inclusive sendo amplamente utilizado
em estudos populacionais auxiliando extensivamente na compreensão e resolução de diversos
problemas biológicos.
Os
microssatélites
são unidades de seqüências repetidas lado a lado que podem variar de 1
a 6 pb (TAUTZ, 1989, LITT
E
LUTY
, 1989).
São marcadores
altamente polimórficos e a variação
entre os alelos é atribuída ao número de repetições lado a lado para determinado loco (TAUTZ,
1989,
LITT E
LUTY
, 1989
). Acredita
-
se que o número de unidades repetitivas sofra alguma forma
de restrição, e a principal evidência é a ausência de microssatélites muito longos (alelos com mais
de 60 repetições são raramente observados)
(GOLDSTEIN et al., 1997)
. Evolutivamente, a seleção
natural é considerada o processo mais importante para a manutenção de tamanhos restritos dos
marcadores
microssatélite
(LI et al., 2002), ou seja, algumas seqüências particulares podem sofrer
forte pressão de seleção contra a ocorrência de repetições (TÓTH et al., 2000)
.
Essa manutenção
também explica porque deleções são mais comuns do que adições em alelos maiores, e p
orque
deleções geralmente envolve
m mais do que uma unidade de repetição (
PRIMMER
E ELLEGREN
,
1998
).
Além de polimórficos, os
microssatélites
apresentam outras características que os tornam
uma ferramenta altamente informativa para diversos tipos de estudo: apresentam herança
codomina
n
te
(RAFALSKI et al., 1996), o que permite diferenciar indivíduos homozigotos de
indivíduos heterozigotos, e apresentarem alta taxa de mutação, cerca de 10
-4
, quando comparada à
taxa estimada de mutação pontual, cerca de 10
-
10
(
HANCOCK,
1999
).
O modelo que explica a maioria das mutações nos marcadores
microssatélite
é o
Stepwise
Mutation Model
(SMM)
(OHTA E KIMURA, 1973)
,
para o qual é assumido que uma mudança no
estado alélico ocorre pela perda ou ganho de uma unidade de repetição. Porém, é
importante
ressaltar que mutações em maiores escalas também ocorrem, porém com menos freqüência
(VALDES et al., 1993; GOLDSTEIN et al.1997). Outros dois modelos propõem explicações para
tais eventos de mutação
:
o modelo de alelos infinitos
(K
IMURA
E CROW,
1964)
e o
Two
-
phase
mu
tation model
(TPM)
(DI RIENZO et al., 1994). O modelo de alelos infinitos considera uma
situação extrema na qual o número possível de estados alélicos em um determinado loco pode ser
20
extremamente grande, no qual cada novo alelo mutante é um novo estado alélico não existente
anteriormente em uma população. Já o
Two
-phase mutation model propõe que a instabilidade dos
alelos é devida principalmente ao aumento ou diminuição de uma unidade repetitiva, com
probabilidade igual a p, mas que mutações envolvendo mais de uma unidade repetitiva também
podem ocorrer, com pr
obabilidade igual a 1
-p.
Em estudos populacionais é essencial saber qual modelo de mutação deve ser aplicado,
uma vez que os parâmetros populacionais, tais como diferenciação genética e número de migrantes
são dependentes do modelo de mutação assumido para os marc
adores
microssatélite
utilizados
(
ESTOUP
E
CORNUET
, 1999)
.
Estudos relacionados à distribuição dos
microssatélites
em diversos genomas têm sido
amplamente
realizados, mostrando que estes marcadores não ocorrem de forma
aleatória
ao longo
do genoma
.
Em genomas de plantas, motivos com repetição de três bases, são encontrados com
maior freqüência em regiões transcritas do que em regiões não transcritas do
DNA
(MORGANTE
et al., 2002). Em humanos, estes motivos de
trinucleotídeos
são responsáveis por doenç
as
neurodegenarativas e são mais comuns em regiões gênicas, enquanto que nas regiões não gênicas
estão presentes em maiores proporções os motivos dinucleotídeos e tetranucleotídeos
(GOLDSTEIN
et al., 1997). Os motivos hexanucleotídeos constituem o segundo grupo de motivos
mais freqüentes em éxons de diversos táxons, e em invertebrados são mais freqüentes do que os
tetranucleotídeos em íntrons e em regiões intragênicas (TÓTH et al., 2000). Repetições de
mononucleotídeos estão frequentemente presentes nas regiões que controlam o sistema de reparo
do DNA, desde procariotos até em humanos (CHANG et al., 2001). Os marcadores
microssatélite
também são associ
ados
a diversos outros mecanismos celulares como, por exemplo, organização
da cromatina, regulação da atividade gênica e de processos metabólicos, tais como
transcrição,
tradução, replicação e recombinação
(LI et al., 2002)
, associados
com a pressão de seleção positiva
nos processos meióticos (LI et al., 2002) e com a e
specificidade
da síntese de determinados
aminoácidos (MORGANTE
et al.
, 2002)
.
Uma das limitações para o uso de
marcadores
microssatélite
é a
quantidade
de tempo e
recursos financeiros necessários para o desenvolvimento dos iniciadores utilizados na amplificação
destes
via PCR (Polimerase Chain Reaction). Entretanto, estudos de transferibi
lidade
pelo uso de
iniciadores heterólogos mostram que é possível reduzir o custo e o tempo das pesquisas biológicas
(PARKER et al., 1998). Uma alta taxa de transferibilidade de
iniciadores
tem sido observada entre
21
espécies de planta (WHITE et al., 1997; COLLEVATTI et al., 1999; ZUCCHI et al., 2003;
BRAGA et al., 2007), entre espécies de cervídeos (ROED, 1998a; LEITE et al.; 2007), entre
papagaios (RUSSELLO et al., 2001; TAYLOR et al., 2006; CAPARROZ et al., 2007), bovinos e
caprinos
(ENGEL et al., 1996; KUHN et al., 1996; ROED, 1998; SLATE et al., 1998), entre
cachorros e raposas (FREDHOLM et al., 1995) e entre humanos e chimpanzés (DEKA et al.,
1994)
.
Devido às amplas vantagens descritas anteriormente, estes marcadores têm si
do
amplamente utilizados em diversas áreas como genética forense (HENKE et al., 2001; TRACEY,
2001; DEJEAN et al., 2004), estudos de pa
rentesco
(BLOUIN et al., 1996; VAN DE CASTEELE
et al., 2001; COLLEVATTI et al., 2007), estudos de paternidade
(M
ARSHALL et al., 1998;
SLATE et al., 2000; ALCAIDE et al., 2005)
e
estrutura de populações e conservação (
PAETKAU
et al, 1999; COLLEVATTI et al, 2001; EIZIRIK et al, 2001;
BALLOUX
E LUGON-
MOULIN
,
2002
).
Em aves, os primeiros
marcadores
microssatélite
foram identificados em uma espécie de
andorinha (Hirundo rústica) e em
flycatcher
(Ficedula hypoleuca) (ELLEGREN 1991,
1992).
Entre os
psitacídeos, os primeiros
marcadores STR
foram descritos para uma espécie neotropical, o
Forpus passerinus (HUGHES et al., 1998). Posteriormente, foram desenvolvidos marcadores
microssatélite
para várias espécies de psitacídeos neotropicais, como por exemp
lo, para o papagaio
da Ilha de St. Vicent (Amazona guildinguii) (RUSSELLO et al., 2001; RUSSELLO et al., 2005),
para a arara-canindé (Ara ararauna
)
(CAPARROZ, 2003), e para o papagaio-
do
-Congo (
Psittacus
erithacus
)
(TAYLOR et al., 2007)
.
Em estudos de aves, nos quais certos tipos de informações são difíceis de serem obtidas
apenas por observação direta no campo, estudos genéticos realizados com o auxílio de ferramentas
co
mo os marcadores microssatélite, podem fornecer evidências para melhor compreensão da
estrutura populacional e do comportamento nestas espécies.
1.
5 A espécie
Amazona aestiva
(Papagaio
-
verdadeiro)
A espécie Amazona aestiva, conhecida popularmente como papagaio-
verdadeiro
, é um
representante neotropical da família Psittacidae, pertencente à Ordem Psittaciformes. Os
indivíduos representantes desta espécie não apresentam dimorfismo sexual, apresentam porte
22
médio, com cerca de 37 cm de comprimento e 400g de peso, a coloração é predominantemente
verde, apresentando fronte e loros azuis, cabeça amarela e pés e bico pretos (FORSHAW, 1989)
(Figura 3
).
A distribuição desta espécie é ampla, ocorrendo do nordeste do Brasil, passando pelo leste
da Bolívia e do Paraguai, até o norte da Argentina (FORSHAW, 1989; SICK, 1997)
.
Taxonomicamente,
A. aestiva é representada por duas subespécies, as quais se diferenciam
principalmente pela coloração do encontro das asas: A a. aestiva apresenta o encontro da asa
vermelho e ocorre no Brasil oriental; enquanto que A. a. xanthopter
yx
apresenta o encontro das
asas e coberteiras pequenas superiores amarelo, e ocorre no Brasil ocidental, Bolívia, Paraguai e
Argentina
(DARRIEU, 1983) (Figura 3). Nos estados brasileiros do Mato Grosso e Mato Grosso
do Sul existe uma área de sobreposição, onde se podem encontrar indivíduos com o encontro das
asas de coloração mista vermelha e amarela (Figura 3).
Os papagaios-verdadeiros são vistos em bandos, principalmente durante a noite
(SEIXAS
et al., 200
0)
e nestes é possível sempre notar os casais pareados. São aves de hábitos monogâmicos
e fiéis. Durante o período reprodutivo, nidificam em diversos tipos de árvores, vivas ou mortas,
encontradas isoladas em pastos, em áreas de savanas abertas, em manchas de floretas e
preferencialmente em áreas alagadas
(SEIXAS E MOURÃO, 2002)
.
O casal se reproduz apenas uma vez por ano e o período reprodutivo ocorre entre setembro
e fevereiro (FORSHAW, 1989; SICK, 1997). Isso pode ser explicado pelo comportamento
evolutivo da espécie, uma vez que os filhotes são dependentes do cuidado parental por um longo
período, cerca de quatro a cinco meses, até os filhotes adquirirem capacidade de vôo e saírem
ninho
(FORSHAW, 1989; SICK, 1997). A fêmea põe de dois a quatro ovos que são chocados
durante 24 a 29 dias, gerando um a três filhotes/ano em média.
O pap
agaio
-verdadeiro destaca-se como a espécie mais popular entre os papagaios por ser
considerado como um animal sociável, relativamente inteligente, além de ser capaz de imitar as
palavras humanas, adquirindo um notável vocabulário (SICK, 1997), além de apresentar uma
coloração exuberante da plumagem
(FORSHAW, 1989)
.
23
Figura
3: Distribuição geográfica do papagaio- verdadeiro (Amazona aestiva) e das duas subespécies
atualmente
reconhecidas:
A)
A. a. aestiva
; B
)
A. a.
xanthopteryx
.
Para a IUCN (
Internation
al Union for Conservation of Nature and Natural Resources) essa
espécie é classificada como Least Concern devido a sua distribuição ampla, de aproximadamente
4.200.000 km
2
. O tamanho populacional não foi ainda quantificado, mas acredita-se que este seja
gr
ande o suficiente para classificar esta espécie como abundante em grande parte de sua
distribuição
.
Uma
importante
ameaça às populações naturais de A. aestiva é a interferência da
A
B
24
espécie humana nos ecossistemas. Devido ao aumento acelerado das populações humanas, e
conseqüentemente, a crescente expansão das atividades agropecuárias, construção de usinas
hidroelétricas, o aumento da exploração imobiliária e o desflorestamento, o habitat natural desta
espécie tem sido progressivamente destruído. (
COLLAR
E JU
NIPER
, 1988). Estudos realizados
na Argentina apontam um tipo pontual de ameaça em relação ao habitat natural desta espécie,
mostrando que aproximadamente 40% das árvores utilizadas como ninho para a reprodução são
derrubadas no momento da captura de filho
tes
(BOLKOVIC
E RAMADORI,
2006)
. Fatores
naturais, como tempestades, fogo e competição por cavidades ocupadas por abelhas, marimbondos,
for
migas, corujas, outros psitacídeos e pequenos vertebrados como gambás e sagüis, também estão
relacionados à perda de ambiente natural
(
COLLAR, 1988
).
Outra importante ameaça a esta espécie é o captura de filhotes e/ou adultos para abastecer o
comércio ilegal de animais silvestres. Existem alguns levantamentos pontuais realizados em
território brasileiro indicando a dimensão da atividade do tráfico ilegal desta espécie no Brasil.
Entre 1988 e 1998, o Centro de Reabilitação de Animais Silvestres (CRAS) localizado na cidade
Campo Grande/MS recebeu cerca de 2.000 filhotes de papagaio-verdadeiro decorrente de
apreensão dos animais retirados ilegalmente da natureza (SEIXAS E MOURÃO, 2000). Em
apenas dois municípios do Mato Grosso, o papagaio-verdadeiro foi o psitacídeo mais encontrado
como animal de estimação, representando cerca de 30% dos psitacídeos em cativeiro (PINHO et
al., 2000)
.
Desd
e 1981, a espécie
A. aestiva
está incluída no Apêndice II da CITES (
Convention on
International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora
).
Segundo o levantamento realizado pela Rede Nacional de Combate ao Tráfico de Animais
Silvestres (RENCTAS, 2002), de cada 10 animais capturados, somente um chega vivo ao
consumidor, os demais morrem durante a captura ou transporte. Como a maioria das aves
capturadas é composta de filhotes, a taxa de recrutamento pode estar seriamente
comprometida, ou
seja, o número de filhotes que nascem na população natural pode
ser
significativamente menor do
que o número de filhotes que permanecem nesta. Esta espécie sempre foi uma presença comum
nos lares no Brasil e no exterior, como animal de estimação.
No
Brasil, desde 19
67 (lei n° 5.197 de
3 de janeiro de 1967), é proibido a utilização, perseguição, destruição, caça ou apanha de animais
silvestres, bem como de seus ninhos, abrigos e criadouros naturais. Entretanto, a partir de 1997, o
Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis
IBAMA
através das
portarias 117 e 118-N de 15 de outubro de 1997, tornou lícita a criação de animais da fauna
25
silvestre nacional para fins comerciais. Desde então, um número crescente de criadores tem se
dedicado
à criaç
ão comercial do papagaio
-
verdadeiro.
Segundo G
OULART
(2006
),
existia
26 criadouros comerciais de psitaciformes em
atividade, todos tendo o papagaio-verdadeiro como foco principal. Atualmente, existem
aproximadamente 60 criadouros comerciais de A. aestiva em plena atividade (IBAMA, 2007). O
dobro de criadouros comerciais abertos no intervalo de apenas um ano indica que estão sendo
tomadas iniciativas para que seja evitado o tráfico ilegal dessa espécie, permitindo a compra desses
animais de forma legal pela sociedade a fim de atender ao mercado de animais de estimação.
Porém, a retirada desses animais na natureza ainda ocorre com alta freqüência de forma ilegal
em
praticamente toda sua área de distribuição
para proporcionar maiores lucros aos criadouros.
Mes
mo esta espécie apresentando ampla distribuição geográfica e sendo a mais capturada
na natureza, informações sobre a biologia e ecologia em condições naturais são restritos a estudos
realizados na Argentina, na Província de Salta
(BOLKOVIC
E RAMADORI, 2006) e em Córdoba
(FERNANDEZ
-
JURIDI
C et al., 1998), e no Brasil, na região do Pantanal sul-
mato
-
grossense
(SEIXAS E MOURÃO, 2000; SEIXAS E MOURÃO, 2002). Estudos genéticos são ainda
mais
escassos, restringindo-
se
a estudos filogenéticos e biogeográficos (EBERHARD
E
BERMINGHAM
, 2004; RIBAS et al., 2007; RUSSELLO E AMATO, 2004). O único estudo
populacional
foi realizado por C
APARROZ
(1998) envolvendo um grupo de indivíduos
provenientes da região leste da Bahia baseado na técnica de identificação individual pelo DNA
(
DNA fingerprinting
).
As populações de papagaio-verdadeiro estão sofrendo forte impacto das atividades
humanas, principalmente no que tange ao tráfico ilegal e a constante degradação de seu habitat, o
que pode representar alterações significativas na manutenção e evolução das populações naturais
desta espécie. Desta forma, se medidas de conservação efetivas não forem adotadas em um curto
espaço de tempo, nos próximos anos o papagaio-verdadeiro poderá ser incluído nas listas oficiais
de espécies ameaçadas. Portanto, informações sobre a biologia, ecologia e variabilidade genética
se fazem extremamente necessários. Com a utilização de marcadores moleculares
STR
é possível
se obter uma ampla visão do cenário comportamental e genético de A. aestiva permitindo o
estabelecimento de referências aplicáveis a esta espécie, o que é extremamente fundamental na
definição de metas e estratégias para subsidiar a elaboração de futuros programas de conservação.
26
2. OBJETIVOS
2.1. Objeti
vo Geral
Este trabalho tem como objetivo geral analisar a estrutura genética de cinco populações
naturais de Amazona aestiva (Psittacidae, Psittaciforme, Aves)
e
verificar se estas apresentam
efeito de gargalo genético (genetic bottleneck), bem como
anali
sar
a biologia reprodutiva
desta
espécie quanto aos aspectos da monogamia e da fidelidade ao ninho. Com os resultados obtidos
neste trabalho pretende-se gerar informações sobre a variabilidade genética e o comportamento
reprodutivo
desta
espécie, proporcionando subsídios para a elaboração de futuros programas de
conservação.
2.2. Objetivos específicos
2.2.
1 Analisar a estrutura genética do papagaio-verdadeiro em escala geográfica, incluindo
populações de Argentina, Mato Grosso do
S
ul, Distrito Fe
deral, M
inas Gerais e Tocantins;
2.
2.2
Analisar o
efeito de gargalo genético n
as cinco populações estudadas;
2.2.
3
Avaliar
o comportamento monogâmico
;
2.2.
4
Verificar se há fidelidade ao ninho pelo casal entre
uma estação reprodutiva e outra.
27
3. MATERIA
L E MÉTODOS
3.1
Caracterização das amostras e extração de DNA
Foram coletadas 172 amostras de A. aestiva em quatro estados do Brasil: Tocantins (TO),
Distrito Federal (DF), Minas Gerais (MG) e Mato Grosso do Sul (MS); e na Província del Chaco,
no norte da Argentina (Tabela 1, Figura 4). As amostras coletadas na Argentina, no DF e MS são
pertencentes a uma, três e quatro estações reprodutivas, respectivamente (Tabela 1).
Tabela 1: Locais de obtenção das 172 amostras de
A.
aestiva
(abreviatura)
; N: número de amostras obtidas em cada
região; A
no no qual as amostras foram obtidas (por apreensão) ou coletadas (referindo
-
se à estação reprodutiva na qual
a coleta foi realizada); coordenadas geográficas dos locais de coleta.
Locais de coleta
N
Ano
Coordenadas geo
gráficas
Gurupi
Tocantins (
TO
)
15
2006
11°43 44 S, 49°04 08 W
Distrito Federal (DF
)
24
2004/2005/2006
14°47 03 S, 47°55 25 W
Parque
Nacional Grande Sertão
Veredas
-
Minas Gerais (
MG
)
10
2001
15°17 06 S, 46°03 33 W
Pantanal Sul Matogrossense
M
ato
Grosso do Sul (
MS
)
81
2000/2001
/
2004/2005
20°15 24 S, 56°21 21 W
Província del Chaco
-
A
rgentina
(AR)
42
2004
28°04 28 S, 59°13 48 W
Total
172
- -
As amostras provenientes de MS e da A
rgentina
foram obtidas por meio de parcerias
estabelecidas
com o Projeto papagaio-verdadeiro coordenado pela Bióloga Gláucia Helena
Fernandes Seixas e com o Projeto Loro Hablador , coordenado pelo Biólogo Igor Berkunsky,
respectivamente. As amostras de MG e de TO foram obtidas por apreensões realizadas pelo
IBA
MA nestes estados.
T
oda amostragem
foi
composta de filhotes de até três meses de vida
.
Para a obtenção de amostras de DNA foram coletados cerca de 0,2 ml de sangue periférico
da veia branquial da parte inferior da asa ou 3 a 4 penas em crescimento. O material coletado foi
armazenado em microtubos de 1,5 ml contendo 0,7 ml de etanol absoluto a temperatura ambiente.
28
Figura
4
: Locais de obtenção das amostras de
Amazona aestiva
(Ver abreviação Tabela 1)
O DNA foi extraído de todas as amostras de sangue coletadas, utilizando o protocolo de
digestão
com
SDS
10
% e proteinase
K
seguida
de purificação com fenol:
clorofórmio
:
álcool
isoamílico (25:24:1) conforme descrito por
BRUDFORD
e colaboradores (BRUDFORD et al.,
1992
).
3.
2 Transferibilidade e caracterização do
s locos microssatélites
Inicialmente, foram utilizados dois indivíduos de A. aestiva para testar a transferibilidade
de 12 pares de iniciadores para amplificação de loco microssatélite desenvolvidos para o papagaio
de St Vincent (
A.
guildinguii
) por R
USS
ELLO
e colaboradores (RUSSELLO et al., 2001;
RUSSELLO et al., 2005), e cinco pares desenvolvidos para arara-
canind
é (Ara ararauna) por
CAPARROZ
e colaboradores
(CAPARROZ
et al.
, 2003)
(Tabela 2).
29
As reações de PCR foram feitas em um volume total de 10 l contendo
0,5
M de cada
iniciador, 1 U de Taq DNA polimerase (Phoneutria, BR), 200 M de dNTP, tampão 1X (10 mM
Tris
-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2
), e
9,0
ng de DNA. As amplificações foram
realizadas em um termociclador PE 9700 (Applied Biosystems, MD)
nas
seguintes condições:
95
o
C por 7 min; 35 ciclos de: 95
o
C por 1 min, 48 a 59
o
C por 1 min (de acordo com a temperatura
de anelamento de cada iniciador), 72
o
C por 1 min; e
um
ciclo final a
72
o
C for 20 min. As reações
para alguns pares de iniciadores foram otimizadas utilizando o ciclo
touchdown
como descrito por
RUSSELLO
e colaboradores (RUSSELLO et al.,
2001
). Os produtos das reações de PCR foram
visualizados em gel de agarose 1
,
5% corado com brometo de etídeo.
Os pares de iniciadores que apresentaram produtos de ampl
ificação
único e do tamanho
es
perado foram analisados em gel de poliacrilamida 4% corado com nitrato de prata (BASSAM et
al., 1991) para analisar o polimorfismo. Os locos microssatélite foram caracterizados quanto ao
número de alelos e intervalo de tamanho dos alelos obtidos (Tabela 2)
.
Os locos mais polimórficos (com cinco alelos ou mais) foram seqüenciados para verificar
se a região amplificada corresponde à região do micros
sat
élite.
Para isto, indivíduos homozigotos
foram seqüenciados utilizando o iniciador direto (
forward
) e o kit de sequenciamento
DYEnamic
TM
ET terminator (Amersham Pharmacia, Biotech, Sweden) conforme instruções do
fabricante, em sequenciador automático de DNA (ABI Prism 377 automated DNA, Perkin-
Elmer,
CA).
Esses locos foram então utilizados para
a
genotipagem de 22 amostras de A. aestiva
coletadas em MS (
2000/2001
)
.
Quatro
iniciadores foram marcados com fluorescência azul - 6-
FAM, três com fluorescência verde HEX, e dois com fluorescência amarela NED. As
reações
de
PCR foram diluídas 1:3 em três multiplexes com locos microssatélites marcados com diferentes
fluorescências
, da seguinte maneira: UnaCT
43
(FAM), AgGT
72
(FAM) e AgGT
21
(HEX);
AgGT
22
(FAM), AgGT
83
(HEX) e AgGT
12
(NED)
; e AgGT
29
(HEX), AgGT
07
(NED) e
AgGT
90
(FAM
). Um microlitro de cada reação diluída 1:3 foi adicionado a 0,25 L do marcador
interno (GeneScan 500 internal lane standard, ROX, Perkin-Elmer, CA), 0,45 L de tampão de
corrida (25mM EDTA e 50 mg/ml Blue-Dextran) e 2,3 L de formamida deionizada. As reações
de genotipagem foram denaturadas a 95
o
C por 3 min,
mantidas em gelo e submetidas a eletroforese
em géis desnaturantes de poliacrilamida 5% em um sequenciador automático de DNA (ABI Prism
30
377 automated DNA, Perkin
-
Elmer, CA). Os produtos foram interpretados utilizando os programas
Genescan (Perkin
-
Elmer, C
A) e Genotyper 2.1 (Perkin Elmer).
Esses locos foram caracterizados quanto à heterezogosidade observada e esperada com o
auxílio do programa GDA (LEWIS, 2001). Foi testado se estes se encontravam em Equilíbrio de
Hardy
-Weinberg (EHW) (NEI, 1978), e avalia
dos
quanto ao equilíbrio de ligação (Tabela 3)
utilizando o programa
FSTATS
2.9.3.2 (GOUDET, 2002).
A
distribuição das freqüências alélicas
,
bem como a identificação dos alelos privados, para cada loco microssatélite e para cada população
é demonstrada graficamente no Anexo 9.2
.
Adicionalmente, foram estimadas a probabilidade de
identidade genética (
I
) (CHAKRAVARAT
E LI
, 1983), a qual corresponde a probabilidade de dois
indivíduos escolhidos ao acaso apresentarem o mesmo genótipo, e a exclusão de paternidade (Q
)
(WEIR, 1996)
, que corresponde ao poder de excluir um falso candidato à paternidade escolhido ao
acaso. A probabilidade combinada da exclusão de paternidade,
QC
=1
-[
(1-Q
i
)] e a probabilidade
combinada da identidade genética
IC
=
I
i
também foram esti
madas (Tabela 3
).
Os locos que se apresentaram em Equilíbrio de Hardy-
Weinberg
e
e
m
equilíbrio de
ligação
foram utilizados para estudo da estrutura genética e parentesco.
3.
3
Estrutura Genética
3.3.1 Seleção das amostras
O tamanho amostral foi reduzido
baseado
em
dois
critérios: (1) eliminação dos indivíduo
s
supostamente aparentados, e (2) o período de coleta. Os motivos para a seleção das amostras são
descritos a seguir:
(1
)
Partindo da suposição de que os indivíduos coletados no mesmo ninho são irmãos, a
amostra
gem
para as populações da
Argentina
, DF e MS foi restrita a uma amostra de cada ninho.
No caso das amostras obtidas por apreensão (MG e TO) foi verificado se havia o
compartilhamento de 50% dos alelos em cada loco por comparação par a par entre todos os
indivíduos de cada uma das populações. Não foram encontrados indícios de que quaisquer dois
indivíduos amostrados ao acaso fossem irmãos, portanto, ambas não foram reduzidas em seus
tamanhos amostrais.
31
(2
) Como o intervalo entre geração em A. aest
iva
é de aproximadamente
quatro
anos
(R.
Caparroz, com. pessoal), as amostras provenientes de diferentes estações reprodutivas coletadas na
A
rgentina
, no DF, MG e TO foram tratadas como pertencentes a uma mesma geração (Tabela 1)
.
Como a população de MS continha amostras provenientes d
os
anos 2000/2001 e dos anos
2004/2005
(Tabela 1) foi verificado se essas duas amostra
gens
eram compostas de freqüências
alélicas distintas, o que poderia ser interpretado como amostras pertencentes a gerações
diferentes
.
Essa
análise foi realizada utilizando o programa F
STATS
2.9.3.2 (GOUDET, 2002). Verificou-
se
que não havia diferenciação entre as duas
amostra
gen
s de MS ( = 0, 007; p= 0,227), logo,
as
análises
seguintes
foram realizadas considerando somente as amostras proven
iente
s das estações
reprodutivas de 2004/2005. Essa seleção foi estabelecida por duas razões: esta última amostragem
apresentava
um número
menor
de indivíduos
(
N
e
=
24) do que
às
amostragens obtidas nas
estações
reprodutivas de 2000/2001 (N
e
=
27
), o que aproxima os tamanhos populacionais entre as cinco
populações estudadas, e também devido à
pro
ximidade estacional em relação às demais
amostragens realizadas.
Ao final do estabelecimento destes critérios, foram utilizadas 74 amostras de A. aestiva
distribuíd
as em cinco populações geográficas da seguinte maneira: 15 do TO, 11 do DF, 10 de
MG, 24 do MS e 14 da A
rgentina
.
3.3.2 Análise genética
Para esta análise foram utilizados seis pares de iniciadores (AgGT07, AgGT12, AgGT21,
AgGT29, AgGT72 e AgGT83)
.
O
n
ív
el
de
endocruzamento
dentro das populações de A. aestiva
e
a diferenciação entre as populações fora
m
m
ensurados
a partir dos coeficientes de
S.
W
RIGHT
(1951)
: f (coeficiente de endogamia)
,
(índice de fixação) e F (coeficiente de endogamia total)
,
respect
ivamente
,
obtido
s pela análise de variância das freqüências alélicas (COCKERHAM, 1969)
utilizando o programa
FSTAT
S
2.9.3.2
(GOUDET, 2002). A significância estatística foi baseada
em 10.000
randomizações
seguida pela correção de Bonferroni (GOUDET et al., 1996). Como a
maioria das mutações que ocorrem em marcadores
microsatélites
envolve
a adição ou subtração de
uma unidade de repetição, de acordo com o modelo SMM
(OTHA
e
KIMURA 1973
; VALDES et
al., 1993; SLATKIN, 1995), a diferenciação genética entre as populações também foi estimada
pelo
R
ST
(SLATKIN, 1995), obtido pela análise de variância do tamanho dos alelos
(GOODMAN,
32
1997)
.
R
ST
pode ser interpretado como uma correlação do tamanho dos alelos de diferentes
indivíduos de uma mesma população. Este índice é análogo ao , com exceção que para , a
correlação entre as freqüências alélicas de diferentes indivíduos na mesma população consi
dera
que os alelos são idênticos por descendência (COCKERHAM, 1969; WEIR E COCKERHAM
,
1984)
.
3.
4 G
argalo
genético
Devido
à intensa captura de indivíduos de A. aestiva em populações naturais para
abastecimento do tráfico ilegal de animais silvestres, além do acelerado ritmo de fragmentação e
degradação
de habitats naturais devido ao crescente e intenso impacto das atividades humanas, foi
verificado
se
a diversidade genética encontrada nas populações estudadas foi influenciada por
reduções
populacionais drásticas. A análise foi realizada com o auxílio do programa
Bot
tleneck
(CORNUET
E LUIKART, 1996). Para esta análise foram utilizadas as mesmas amostras e os
mesmos
locos
selecionados para a análise de estrutura genética (tópico anterior).
Em uma população que sofreu efeito
de
gargalo
genético
(redução no tamanho
populacio
nal ou
genetic
bottleneck
), a redução da diversidade alélica (heterozigosidade es
perada
pelo Equilíbrio de Hardy-
Weinberg)
ocorre mais
rápida
do que a redução da heterozigosidade
esperada pelo equilíbrio mutação-deriva para o número de alelos encontrados na população
(CORNUET
E LUIKART, 1996). Baseada nesse princípio, o programa estima para cada
população e para cada loco a distribuição da diversidade
alélica
esperada pelo número observado
de alelos (
k
), dado um tamanho amostral (
n),
sobre a hipótese do equ
ilíbrio entre mutação e deriva.
Essa distribuição
é obtida através da simu
lação de um processo de coalescê
ncia de
n
locos
baseada
estritamente
no modelo de mutação SMM
(OHTA
E KIMURA, 1973) ou na proporção diferencial
de SMM e
TPM
(DI RI
ENZO
et al., 1994)
.
Foram re
alizada
s duas aná
lises
, uma
assumindo
estritamente SMM e outra assumindo 70% das mutações para o modelo SMM e 30 % para o
modelo TPM.
A redução significativa na
heterozigosidade
média foi realizada pelo
teste estatístico
não par
amétrico
"Wilcoxon sign-rank test"
(LUIKART
et al., 1998). Adicionalmente, foi obtida a
distribuição de freqüência alélica, para todos os locos, e para cada população. A distribuição das
freqüências alélicas esperada em uma população que não sofreu um efei
to
de
gargalo
genético
33
recente
é representada graficamente em forma de L , com
muitos
alelos
nos intervalos de baixa
freqüência e poucos alelos nos intervalos de alta freqüência
(LUIKART
et al.
, 1998
a).
3.
5 Parentesco
e fidelidade ao ninho
3.5.1 Seleção das amostras
O tamanho amostral foi reduzido da seguinte maneira: foram eliminados 27 indivíduos
incluindo amostras de ninhadas de um ninhego e não reamostra
das
em outra estação reprodutiva, e
também
aquelas
obtida
s por apreensão,
provenientes
de TO e MG (respectivamente 15 e 10
indivíduos
). Para a análise de parentesco foram analisadas 44 ninhadas com mais de um ninhego
(filhote) distribuídas da seguinte maneira: 12 na A
rgentina
, 24 em MS e oito no DF, totalizando
115
indivíduos.
Para o estudo de fidelidade ao ninho, foram analisados sete ninhos (cinco do MS e
dois do DF
).
Com exceção de um ninho que possui ninhadas amostradas em três estações
reprodutivas diferentes, todos
possu
íam
ninhadas amostradas em duas estações reprodutivas
diferentes
.
3.5.2 Análise genética
Para testar a hipótese de monogamia e de fidelidade ao ninho entre estações reprodutivas
diferentes
foi calculado o valor
da
razão de verossimilhança
(LOD) entre as duas hipóteses testadas
(LOD =
verossimi
lhança
da hipótese primária /
verossimilhança
da hipótese nula) para cada par de
indivíduos com o auxílio do
programa
Kinship 1.2
(GOODNIGTH
E QUELLER, 1999)
.
Na
hipótese primária deste trabalho, os indivíduos foram considerados como sendo irmãos (rm = rp =
0,5; onde rm e rp significam a probabilidade dos indivíduos possuírem um alelo idêntico por
descendência por parte da mãe e do pai, respectivamente), enquanto na hipótese nula, os
indivíduos foram considerados como não relacionados (rm = rp = 0,0). Também foi estimada
a
probabilidade
da ocorrência de erro tipo II (rejeitar a hipótese nula sendo esta verdadeira
)
para os
valores de
p
< que 0,05, 0
,01
e
0,001. Os valores estatisticamente significativos de cada estimativa
do valor da razão de verossimilhança (LOD) foi obtida pelo método de simulação implementado
pelo mesmo programa.
34
Foi estimado o valor de parentesco entre os indivíduos (r - relatedness) descritos por
QUELLER
e
GOODNIGHT
(
1989)
também com o auxilio do programa Kinship 1.2
(GOODNIGTH
E QUELLER
, 1999)
. Esse valor é obtido pela freqüência de um determinado alelo
no indivíduo x (0,5
para
heterozigoto e 1,0
para
homozigoto) em relação a freqüência do mesmo
alelo no indivíduo y, sendo ambas freqüências reduzidas da freqüência deste alelo na população
total.
As freqüências alélicas obtidas pela genotipagem de todos os indivíduos foram utilizadas em
1.000 simulações para obtenção da amplitude de variação dos valores de r (
relatedness
)
descritos
para três hipóteses de relaçã
o genética: não relacionados (
rm
=
rp
= 0,0), meio
-
irmãos (
rm
= 0,5;
rp
= 0,0) e irmãos (
rm
=
rp
= 0,5)
.
Os valores de
r
foram utilizados para verificar o efeito do erro tipo
II
para os casos
nos
quais o
LOD foi não significativo.
35
4. R
ESULTADOS
4.
1 Transferibilidade e caracterização dos locos microssatélite
De 17 pares de
marcadores
microssatélite
analisados, 14 apresentaram produtos de
amplificação
(Tabela 2). Com exceção de cinco pares de marcadores (UnaCT74, UnaGT55,
AgGT08, AgGT17 e AgGT22), os locos microssatélite analisados apresentaram produtos de
amplificação dentro do intervalo (tamanho)
observado
nas
espécies para os quais for
am
desenvolvidos (Tabela 2)
.
Foram identificados
dez
locos micros
satélite
polimórficos, sendo nove
de
stes com cinco alelos ou mais, e para esses últimos, o número de alelos por loco variou entre
cinco
(AgGT22) e 17 alelos (AgGT83)
(Tabela 2)
com média de 10
,
8 alelos por loco.
Tabela 2. Características dos 17 pares de locos microssatélite desenvolvidos para as espécies
A.
guildinguii
1,2
e Ara ararauna
3
, testados em 22 indivíduos de A. aestiva provenientes do Pantanal Sul-
Matogrossense.
Loco
Unidade
de
repetição
T
A
N
A
Tamanho (pb)
UnaCT21
1
(GT)
n
(CTT)(GT)
n
- - -
UnaCT32
1
(GT)
n
- - -
UnaCT43
1
(GT)
n
52
6
19
9-
211
(199
-
219)
UnaCT74
1
(GT)
n
50
1
211
(
232
-
270
)
UnaGT55
1
(GT)
n
(AT)
n
50
1
166 (
184
-
192
)
AgGT02
2
(GT)
n
- - -
AgGT04
2
(GT)
n
48
4
254
-
262 (
264
-
272
)
AgGT07
2
(GT)
n
50 12
257
-
283 (
271
-
284
)
AgGT08
2
(GT)
n
(GCGT)
n
52
1
304 (321
-
330
)
AgGT12
2
(GT)
n
58
50
15
299
-
333 (
296
-
303)
AgGT17
2
(GT)
n
58
50
1
419 (
421
-
427)
AgGT21
2
(GT)
n
50 16
306
-
340 (
307
-
318
)
AgGT22
3
(CA)
n
59
5
190
-
198 (
199
-
211)
AgGT29
3
(CA)
n
59
12
190
-
224 (
199
-
203
)
36
Continuação: Tabela 2
Loco
Unidade de
repetição
T
A
N
A
Tamanho (pb)
AgGT72
3
(CA)
n
50 14
270
-
302
(283
-
291
)
AgGT83
2
(GT)
n
58
50
17
231
-
275
(247
-
271
)
AgGT90
3
(GT)
n
58
50
13
196
-
232
(216
-
228
)
1
Caparroz
et al
.
(2003);
2
Russello
et al
.
(2001),
3
Russello
et al. (2005); T
A
(ºC),
temperatura de anelamento otimizada
para
A. aestiva via touchdown (indicado por seta) ou PCR padrão; N
A
, número de alelos; intervalo entre o tamanho
mínimo e máximo do alelo em pares de base
(pb)
observado nas amostras de A. aestiva e nas espécies para as quais
foram desenvolvidos (entre parênteses
).
Os nove locos que apresentaram cinco alelos ou mais foram selecionados para a
caracterização (Tabela 3). Não foi observada diferença significativa (p > 0,05) entre a
heterozigosidade observada e a heterozigosidade esperada pelo Equilíbrio de Hardy-
Wei
n
berg
,
com exceção para os locos AgGT22 e UnaCT43 (Tabela 3). Os locos AgGT07 e AgGT90
encontraram
-se em de
se
quilíbrio de ligação (p > 0,
001786
).
As probabilidades
combinadas
de
exclusão de paternidade e
de
identidade genética apresentaram valores altos
(Tabela 3
).
Ta
bela 3: Caracterização de nove
locos
microssatélite
amplificados por iniciadores desenvolvidos para as
espécies
A. guildinguii
1,2
e
Ara ararauna
3
, testados em 22 indivíduos de
A. aestiva
.
Loco
He
Ho
f Q I
AgGT07
1
0,824
0,850
-
0,015
0,678
0,079
AgGT12
1
0,
931
0,912
0
,033
0,803
0,032
AgGT21
1
0,921
0,798
0,
115
0,820
0,028
AgGT22
2
0,527
0,217
0,
655
*
0,449
0,222
AgGT29
2
0,831
0,824
0,
028
0,683
0,074
AgGT72
2
0,911
0,889
0,
041
0,790
0,038
AgGT83
1
0,935
0,958
-
0,
028
0,828
0,026
AgGT90
2
0,830
0,818
0,
04
9
0,697
0,072
UnaCT43
3
0,741
0,348
0,
472
*
0,493
0,206
Total
0,833
0,729
0,132
QC =
0,999
8
IC =
1,684x10
-
11
1
Russello et al
.
(2001),
2
Russello et al. (2005),
3
Caparroz
et al
.
(2003); He, heterozigosidade esperada; Ho,
heterozigosidade observada; f, coeficiente de
endocruzamento
(significativo para todos os locos seguidos de *
:
p <
0,00010,
valor nominal ajustado); Q, probabilidade de exclusão de paternidade;
QC
, probabilidade combinada de
exclusão de paternidade;
I
, probabilidade de identidade;
IC
, pr
obabilidade combinada de identidade genética.
37
Análises
comparativas utilizando os locos AgGT22 e UnaCT43 indicaram alterações
significativas nos resultados em relação às
análise
s realizada sem estes locos, apresentando valores
maiores de f para cada população e valores de
que não pareciam condizer com a
distribuição
geográfica das populações
.
Com exceção dos locos AgGT22, UnaCT43 e AgGT90, todos os demais locos foram
utilizados nas análises de estrutura populacional e da biologia reprodutiva. Os seis loc
os
microssatélites selecionados para as análises apresentaram probabilidade combinada de identidad
e
genética igual a 3,
23
x10
-
09
e probabilidade combinada de ex
clusão de paternidade igual a 0,
9998.
4.2
Estrutura Genética
Não foi observada diferença
signif
icativa
entre os valores da heterozigosidade observada e
heterozigosidade
esperada pelo EHW para as cinco populações estudadas, resultando em valores
de
f não significativos (p > 0,
001
67
),
o que indica que essas populações não
apresentam
deficiência de
het
erozigotos
e que os acasalamentos são randômicos dentro das populações
(
Tabela
4).
Tabela 4:
Caracter
ização genética das cinco populações de A. aestiva, baseadas em seis
marcadores
microssatélite
.
População
N A
He
Ho
f
AR
14
11
,
60
0,
892
0,
903
-0,
013
MS
24
14
,
33
0,
873
0,
795
0,
091
DF
11
10,83
0,916
0,871
0,052
MG
10
9,50
0,880
0,900
-
0,024
TC
15
12,16
0,895
0,90
0
0,012
Total
74
11,68
0,891
0,875
N, número de indivíduos; A, número médio de alelos; He, heterozigosidade esperada; Ho, heterozigosidade observada;
f, coeficiente de endocruzamento (não significativo para todos os locos; p >
0,00167
, valor nominal ajustado);
abreviação das populações ver tabela 1.
A maioria dos valores de
foi muito próxima de zero, variando entre -
0,
003 (AgGT21) e
0,
033
(AgGT07) (Tabela 5). O valor
total
do
(0,
012)
indicou uma
significativa
, porém, baixa
diferenciação
genética (p > 0,
0007)
entre as
populações
estudadas
(Tabela 5). Os valores de R
ST
38
foram, para a maioria dos locos, menores do que os valores de
,
varian
do entre -
0,
011 (AgGT29)
e 0,
049 (AgGT07) e apresentou um valor total
não significativo (
R
ST
=
0,
007
;
p
< 0
,05)
(Tabela 5)
.
Tabela 5
:
Estrutura genética de cinco populações de A. aestiva baseada na análise da variância das
freqüências alélicas e no tamanh
o dos alelos para seis locos microssatélites
(
R
ST
).
Loco
f
F R
ST
AgGT07
1
-0,
015
0,
033
0,
019
0,
047
AgGT12
1
0,
033
0,
002
0,
035
-0,
009
AgGT21
1
0,115
-
0,003
0,112
-
0,007
AgGT29
2
0,028
0,034
0,061
-
0,011
AgGT72
2
0,041
0,007
0,048
0,022
AgGT83
1
-
0,028
0,005
-
0,037
0,000
Total
0,
028
0,
012*
0,
040
0,
007
1
Russello et al. (2001),
2
Russello et al. (2005), f, coeficiente de endocruzamento (não significativo para todos os
locos;
p < 0,
001
67
, valor nominal ajustado)
;
, índice de fixação (
signific
ativo para valor seguido de *; p < 0.0007
,
valor nominal ajustado); F, coeficiente de endocruzamento total; R
ST
, diferenciação genética populacional baseada no
tamanho dos alelos.
O valor de
entre pares de população foi significativo somente para as populações mais
distantes geograficamente, ou seja, a significância atribuída ao
total (
=
0,012;
Tabela 5)
pode
ser
derivada do desvio provocado pelo
estimado entre as populações da A
R
e de TO (
=
0,
0
07
)
(Tabela 6).
Tabela 6
:
Valores de
par a par
pa
ra
cinco populações de A. aestiva baseada na análise de
seis
locos
microsatélites
AR
MS
DF
MG
Valores de
MS
0,
007
DF
0,
020
0,
010
MG
0,
023
0,
021
0,
010
TO
0,
007
*
0,
001
0,
011
0,
029
p =
0,
005
;
significativo para valor seguido de *;
abreviaçã
o
das populações
ver T
abela 1
; número de indivíduos
em cada população ver Tabela 4.
39
4.3
Gargalo Genético
Para as duas análises realizadas (uma assumindo estritamente o modelo SMM e outra
assumindo 70% das mutações para o modelo SMM e 30 % para o modelo TPM) não foi detectad
o
excesso de heterozigotos
nas
cinco populações (p >
0,
05), indicando que não há evidência de
redução drástica recente no tamanho populacional. As freqüências alélicas dentro de cada
população mantiveram o padrão de distribuição esperado pelo equilíbrio entre mutação e deriva,
com a maioria dos alelos apresentando-se em uma baixa freqüência e poucos alelos apresentando-
se em alta freqüência (Figura 5
).
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.0 - 0.1 0.1 - 0.2
0.2 - 0.3
0.3 - 0.4 0.4 - 0.5 0.5 - 0.6 0.6 - 0.7 0.7 - 0.8 0.8 - 0.9
0.9 - 1.0
Frequência alélica
Frequência relativa
A
rgentina
(AR)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.0 - 0.1 0.1 - 0.2 0.2 - 0.3 0.3 - 0.4 0.4 - 0.5 0.5 - 0.6
0.6 - 0.7
0.7 - 0.8
0.8 - 0.9
0.9 - 1.0
Frequência alélica
Frequência relativa
Mato Grosso do Sul
(MS)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.0 - 0.1 0.1 - 0.2
0.2 - 0.3
0.3 - 0.4 0.4 - 0.5 0.5 - 0.6 0.6 - 0.7 0.7 - 0.8 0.8 - 0.9
0.9 - 1.0
Frequência alélica
Frequência relativa
D
istrito
F
ederal
(DF)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.0 - 0.1 0.1 - 0.2 0.2 - 0.3 0.3 - 0.4 0.4 - 0.5 0.5 - 0.6 0.6 - 0.7 0.7 - 0.8 0.8 - 0.9 0.9 - 1.0
Frequência alélica
Frequência relativa
M
inas
G
erais
(MG
)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.0 - 0.1 0.1 - 0.2 0.2 - 0.3 0.3 - 0.4 0.4 - 0.5 0.5 - 0.6 0.6 - 0.7 0.7 - 0.8 0.8 - 0.9 0.9 - 1.0
Frequência alélica
Frequência relativa
Tocantins
(TO)
Figura 5: Distribuição em classes das freqüências alélicas para as cinco populações estudadas de
A. aestiva
segundo o
programa
Bottleneck
.
40
4.
4
Parentesco e fidelidade ao ninho
No estudo de parentesco, das 44
ninhadas
analisadas
,
40
(91
%)
apresentaram valores da
razão de verossimilhança (LOD) estatisticamente significativos (Tabela 7
),
indicando que os
indivíduos amostrados no mesmo ni
nho podem ser irmãos.
Tabela
7:
Resultados da análise de filhotes de A. aestiva encontrados no mesmo ninho em diferentes
localidades;
razões de
verossimilhança
(LOD) e estimativa das relações genéticas (r -
relatedness
) obtidas
pela análise de seis locos de microssatélite.
Ninho
Localidade
LOD
r
1
AR
2004
***
0,522
2
AR
2004
***
0,394
3
AR
2004
**
0,519
4
AR
2004
*
0,540
5
AR
2004
**
0,406
6
AR
2004
**
0,490
7
AR
2004
*
0,721
8
AR
2004
**
0.434
9
AR
2004
**
0,503
10
AR
2004
*
0,601
11
AR
2004
***
0,796
12
AR
2004
*
0,360
14
MS
2000
***
0,456
15
MS
2000
ns -
0,024
16
MS
2000
**
0,315
16
#
MS
200
4
**
0,416
17
MS
2000
**
0,261
18
MS
2000
ns
0,152
19
MS
2000
ns
0,136
19
MS
2004
ns
0,210
20
MS
2000
***
0,683
21
MS
2000
**
0,550
22
MS
2001
***
0,403
23
MS
2004
***
0,718
24
MS
2004
***
0,343
25
MS
2004
***
0,392
26
MS
2004
***
0,584
27
MS
2004
**
0,621
28
MS
2004
*
**
0,568
29
MS
2004
***
0,671
30
MS
2005
**
0,827
31
MS
2005
***
0,599
32
MS
2005
***
0,584
33
MS
2005
*
0,663
34
MS
2005
**
0,525
35
MS
2005
***
0,552
36
DF
2004
*
0,613
41
Continuação Tabela 7
Ninho
Localidade
LOD
r
36
#
DF
200
6
*
0,759
37
DF
2004
***
0,486
38
DF
2004
**
0,227
39
DF
2005
*
0,613
39
#
DF
200
6
*
0,759
40
DF
2006
*
0,243
41
DF
2006
**
0,517
valores significativos de LOD para p < 0,001=
***;
p< 0,01= **; e p< 0,05=
*;
ninhos reamostrados em mais de uma
estação reprodutiva seguidos de
#
; ns: LOD
não significativo.
Os
valor
es de LOD não si
gnificativo
s
pode
m ser explicados pela ocorrência de erro tipo II
(aceitar
a hipótese nula sendo ela falsa)
.
Com base nos seis locos microssatélite analisados, a
proporção de ocorrência de erro tipo II observada foi de 4% para valor de
p
= 0,05
.
As simulações
realizadas para verificar a possibilidade de ocorrência de erro tipo II evidenciaram uma
sobreposição grande de valores
de
r
entre as diferentes hipóteses analisadas
(irmãos, meio
-
irmãos e
não relacionados) (Figura 6). Os valores de r para as
quatro
ninhadas que apresentaram LOD não
significativo encontraram-
se
dentro da distribuição observada para os valores de relação de
primeiro grau (Tabela 7, Figura 6
).
Contudo
, devido à ampla
sobreposição
de valores das
três
hipótese
s
de parentesco,
não é possível descartar as outras duas.
Dos sete ninhos utilizados no estudo de fidelidade ao ninho (amostrados em estações
reprodutivas diferentes) três apresentaram valores da razão de verossimilhança
(LOD)
estatisticamente
significativos entre as ninhadas analisadas, indicando
que
para estes três casos
os
casais
provavelmente
utiliza
ram
o mesmo ninho em estações reprodutivas diferentes. Para os
demais ninhos, o valor de LOD não significativo pode ser
devido
a erro tipo II. Com exceção de
um dos ninhos (ninho 13), os valores de r para os casos onde o valor de
LOD
foi
não significativo
encontraram
-se na área de sobreposição das três hipóteses de parentesco (ninho 18: r = 0,239;
ninho 19: r = 0,210; ninho 21: r = 0,252; Figura
6)
indicando que não é possível atribuir uma
relação de parentesco entre os indivíduos das ninhadas amostradas em
diferentes
estações
reprodutivas
.
Para o ninho 13
o valor de
r (-
0,185
) foi encontrado na área de sobreposição somente
das hipóteses de meio
-i
rmãos e não relacionados.
42
Figura
6
:
Valores dos índices de relação genética (r) entre pares de indivíduos obtidos por simulação (1.000 réplicas)
utilizando as freqüências alélicas estimadas para 115 amostras de A. aestiva com seis locos de microssatélite pelo
programa
Kinship 1.2
.; FS
irmãos; HS
-
meio
-
irmãos; e NR
-
não relacionados.
43
5. DISCUSSÃO
5.1
Transferibilidade e caracterização dos locos microssatélites
A
utilização de iniciadores heterólogos representa uma grande vantagem tendo em vista o
alto custo para o desenvolvimento desses marcadores, e tem sido
observada
em diversos estudo
s,
como por exemplo,
entre
espécies de famílias
diferentes
e mesma ordem como bovinos, cervos e
caprinos
(ENGEL et al., 1996; KUHN et al., 1996; ROED, 1998; SLATE et al., 1998) e
entre
espécies de gêneros
diferentes
e
mesma
família
como cervídeos (ROED, 1998a; LEITE et al.,
2007
), psitacídeos (RUSSELLO et al., 2001; TAYLOR et al., 2007) e canídeos (FREDHOLM et
al., 1995)
.
A t
ransferibilidade de 14
pares de iniciadores (Tabela 2) demonstrou que as seqüências que
flanqueiam as regiões desses marcadores microssatélites são conservadas entre as espécies em
questão. Porém, a maioria dos iniciadores testados não amplificou em temper
atura
de hibridação
semelhante à
utilizada para as espécies para a
s quais
estes
foram desenvolvidos
. Para a maioria dos
locos a temper
atura de anelamento foi reduzida, variando entre um (AgGTO7, AgGT12, AgGT17),
três (AgGT04) e sete graus Celsius (AgGT21, AgGT72, AgGT83, AgGT90)
.
A ocorrência de
mutações ou deleções no sítio de anelamento desses iniciadores é
um fator que pode ter
impedido a
amplificação desses locos. Dos 12 iniciadores desenvolvidos para A. guildinguii (RUSSELLO et
al., 2001; RUSSELLO et al., 2005), 11 (92%) apresentaram amplificação e dos cinco
desenvolvidos para Ara ararauna (CAPARROZ, 2003), apenas três apresentaram amplificação.
Estes resultados já eram esperados pela relação filogenética das espécies, ou seja, uma maior
transferibilidade entre espécies do mesmo gênero do que entr
e gêneros
diferentes.
Para os
seis
marcadores microssatélites utilizados nas análises deste trabalho,
os
níve
is de
polimorfismo (média de 14,3 alelos por loco) e os valores de heterozigosidade esperada (0,830-
0,
915)
(Tabelas
2 e 3)
foram
maiores do que os
observados para outr
as espécies de psitacídeos.
Por
exemplo, para espécies ameaçadas de extinção como o papagaio-charão (A. pr
etrei
), o papagaio-
da
-
cara
-
roxa (
A. brasiliens
is
)
e o papagaio da Ilha
de St. Vincent (
A. guildinguii)
,
a média de alelos
por loco
foi menor
do que a encontrada para
A. aestiva
(sendo 9,5, 7,5 e 4,2 respectivamente)
, bem
como os valores de heterozigosidade esperada (entre 0,628-0,925, 0,469-0,844 e 0,190-
0,800,
respectivamente
) (RUSSELLO et al., 2001, RUSSELLO et al., 2005;
CAPARROZ
et al, 2007
44
em anexo). Mesmo considerando uma espécie de ampla distribuição e não ameaçada de extinção
esses valores
também
foram menores, como por exemplo, para o
papagaio
-
do
-congo (
Psittacus
erithacus
) (média de 7,3 alelos para 12 locos
microssatélite
;
he
terozigosidade esperada entre 0,
360
e 0,
915)
(TAYLOR, 2007)
.
Locos
com
poucos
alelos, como AgGT07 e AgGT29 tendem a apresentar menor valor de
heterozigosidade e consequentemente menor probabilidade de exclusão de paternidade e maior
probabilidade de identidade genética (Tabela 3). A probabilidade combinada de identidade
genética, isto é, a probabilidade de que dois indivíduos amostrados ao acaso em uma população
apresentem genótipos idênticos para os seis locos, foi de 3.23
x10
-
09
. Este valor mostra que e
stes
marcadores microssatélites são
úteis
na discriminação de indivíduos de A. aestiva. O alto valor da
probabilidade combinada de
exclusão de
paternidade (
0,
9998) também indica que estes marcadores
podem permitir estudos
detalhados
de parentesco em populações naturais ou populações de
cativeiro
, mesmo em situações como a presente,
nas
quais a maternidade e paternidade não são
identificadas
a priori
.
De uma forma geral, a caracterização dos
marcadores
STR
utilizados neste
trabalho
proporciona
novas perspectivas para a geração de dados fundamentais em estudos de
estrutura
populacional e conservação para
populações
in situ e ex situ de A. aestiva e
de
esp
écies
relacionadas
a esta
.
5.
2
Estrutura Genética
A
análise
de estrutura genética das populações
de
A. ae
stiva
mostrou que há
uma
baixa
diferenciação
entre as cinco populações estudadas (
= 0,
012;
p = 0,0007; Tabela 5).
Embora
possa subestimar a diferenciação, o fato de R
ST
ter sido menor que
mostra que não há
divergência entre identidade por descendência e por estado nos locos utilizados
.
Portanto, o valor
de diferenciação genética
encontrado
realmente
indica uma baixa diferenciação entre as
populações
de
A. aestiva. A comparação par a par entre as populações indicou que a significância
deste valor
pode
ter sido influenciada pelo valor de
estimado
entre as populações da A
rgentina
e
de T
ocantins
(
=
0,007
; p = 0,005; Tabela 6)
.
Como
estas duas populações
são
as mais distantes
geograficamente,
a variabilidade genética observada parece estar distribuída de forma clinal,
45
conforme observado pela variação na coloração da plumagem das duas subespécies de A. aestiva
descrita
por D
ARRIEU
(1983). Fenotipicamente, os papagaios da região oriental do Brasil
apresentam encontro da asa vermelho (
A. a aestiva
) e os da
região da Bolívia, norte da Argentina e
do Brasil ocidental apresentam encontro da asa amarelo (
A. a
xanthopteryx
)
, en
quanto que no meio
da distribuição são
observado
s indivíduos com encontro da asa
misto
(DARRIEU, 1983)
(Figura
3
).
Dessa forma, a
evidente
diferenciação fenotípica, assim como
a encontrada pela análise dos seis
marcadores microssatélite
, só é encontrada entre os extremos da distribuição geográfica da espécie.
Adicionalmente,
f foi não significativo para cada uma das populações (Tabela 4
)
e c
onsiderando
todas as populações
(Tabela 5)
, indicando que
o
acasalamento entre indivíduos
é aleatório dentro
e
entre as populações estudadas.
A dispersão a longa distância pode explicar o padrão encontrado, uma vez que A. aestiva
pode voar a longas distânc
ias, aproximadamente de 1.000 a 3.000 hectares (SEIXAS E
MOURÃO,
2000). A baixa, ou até mesmo não significativa estrutura genética de populações de psitacídeos já
foi verificada em outras espécies de aves que potencialmente podem voar a longas distâncias,
como
papagaios (
e.g.
A
mazona
auropalliata
,
WRIGHT et al., 2005), araras (CAPARROZ, 2003) e
passeriformes (MACDOUGALL
-
SHACKLETON E MACDOUGALL
-
SHACKLETON, 2001).
Adicionalmente, a diferenciação entre as populações da Argentina e do Tocantins, nos
extremos da distribuição, pode ser
explicada
pela
hipótese
de introgressão proposta por RIBAS e
colaboradores (2007).
Segundo
essa hipótese,
as espécies
A. ochrocephala
e
A. aestiva
forma
m
um
grupo parafilético (
RUSSELLO
E AMATO, 2004; EBERHARD E BERMINGHAM,
2004
)
co
mpartilhando haplótipos devido ao processo de hibridização. RIBAS e colaboradores
verificaram que há duas linhagens mitocondriais diferentes: uma composta basicamente por
indivíduos de A. a. aestiva (região centro-nordeste da distribuição geográfica da esp
écie),
e
A. o.
xantholaema
; outra linhagem composta por A. a. aestiva
,
A. a. xanthopteryx (oeste-sudoeste da
distribuição geográfica da espécie), A. o. nattereri
,
A. o. ochrocephala. Além disso, foi verificado
que as duas
linhagens
mitocondriais
se mistura
m em uma área
que coincide com a região
onde não
foi verificada diferenciação genética significativa para os seis marcadores microsatélites analisados
(região de MS, DF e MG), o que supostamente, poderia indicar tal região como a região de
contato (hibridização) entre as linhagens. Adicionalmente, aves com o encontro da asa misto
(amarelo e vermelho) são encontradas na região do Pantanal Sul-
Mato
-Grossense (MS)
(DARRIEU, 1983), o que fornece uma evidência morfológica de hibridização das duas linhagens.
46
Ad
icionalmente, Areta identificou uma nova variante morfológica da característica em
questão em uma população do noroeste da Argentina em uma região chamada Sierra de Santa
Bárbara (CSB) (Areta, 2007). Amostras provenientes do oeste de CSB apresentaram uma v
ariação
maior do que a esperada, com indivíduos com encontro das asas verde, misto e amarelo, enquanto
que os indivíduos amostrados na região leste de CSB apresentaram somente coloração amarela
(Areta, 2007). Essa ampla variação morfológica
(característica
de zona de hibridização) na região
sudoeste da distribuição de A. aestiva sustenta a hipótese de tal
região
ser considerada a área de
contato
das duas linhagens.
É importante ressaltar que para fornecer maior subsídio à inferência evolutiva proposta
,
bem
como ao atual padrão filogenético
de
A.
a
estiva
, além de
proporcionar mais informações sobre
os
fatores envolvidos na
estrutura
ção
populacional, deve ser realizado um
estudo
incluindo tanto
populações em áreas de sobreposição com subespécies de A
.
ochrocep
hala
, quanto um maior
número de populações do
papagaio
-
verdadeiro
abrangendo uma maior cobertura geográfica desta
espécie.
5.
3 Gargalo genético
Os riscos de extinção são maiores em populações pequenas, nas quais os processos
responsáveis pela redução da variabilidade genética são acentuados (FRANKLIN, 1980; SOULÉ,
1987; FRANKHAM, 1995; FRANKHAM et al., 2002a) e a recuperação de um tamanho vi
ável
para a redução ou eliminação destes riscos pode ser uma tarefa difícil e demorada (TEMPLE,
1986; GLENN et al., 1999; BAUM et al., 2003). Caso a detecção de uma redução populacional
(efeito
de
gargalo
genético
ou
genetic
bottleneck
)
seja
tardia, provavelmente a população não terá
tempo suficiente para se adaptar às conseqüências
tais como perda da variabilidade gen
ética, maior
efeito da deriva genética e de depressão endogâmica (LUIKART et al., 1998
a)
. Portanto, v
erificar
o comportamento demográfico das populações naturais permite que sejam definidas e
estabelecidas,
caso necessárias, estratégias de conservação
que
sejam
efetiva
s em tempo hábil para
evitar
o surgimento ou aumento dos
riscos de extinção.
Neste trabalho foi utilizado o teste de CORNUET e LUIKART (1996) para conferir a
proporção de heterozigotos e verificar se a distribuição alélica dentro das populações de A. aestiva
tem sido interferida pelo tamanho das mesmas. A análise das freqüências alélicas, baseada no
47
modelo de mutação SMM e na proporção de 70% deste último e 30% do modelo TPM,
mostrou
que estas se comportam como o esperado para populações que apresentam equilíbrio entre
mutação e deriva genética (a maioria dos alelos apresentou-se em baixa freqüência e poucos alelos
apresentaram
-
se
em alta freqüência) (Figura 5)
(CORNUET
E LUIKART, 1996). Sendo assim,
não há evidências
de que as
populações em questão
tenham sofrido
efeito
de
gargalo
genético.
Porém, outros fatores tornam-se muito preocupantes na análise da variação demográfica
das populações do papagaio-
verdadeiro.
Por exemplo, durante este estudo na região do DF, mais
precisamente no ano de 2005,
hou
ve uma grande queimada em uma das áreas de
coleta
que
compreende a área das Estações Ecológicas do Jardim Botânico e do IBGE, e uma temporada de
consecutivas tempestades que afetou principalmente a área da Estação Ecológica Águas
Emendadas. Esses eventos não foram somente responsáveis pela perda de ovos e filhotes, como
também pela perda de cavidades nas respectivas áreas de reprodução. Outro fator
agravante
foi a
grande quantidade de ovos furtados durante as estações reprodutivas de 2005 e 2006,
para,
supo
stamente, serem utilizados no aumento de lucros em criadouros comerciais legalizados ou
para o abastecimento do tráfico ilegal.
Outros
trabalhos mostram que ovos e filhotes desta espécie
são intensamente capturados (
BOLKOVIC
E RAMADORI,
2006;
GOULART, 2006; PINHO et
al., 2000; SEIXAS E MOURÃO, 2000), o que pode interferir diretamente na taxa de recrutamento
das populações naturais (número de filhotes/número de ovos). Além disso, o
ritmo
acelerado da
fragmentação e degradação de habitats naturais devido ao crescente e intenso impacto das
atividades humanas também pode contribuir efetivamente para a redução de populações
naturais
do papagaio
-
verdadeiro
.
Esses dados associados ao fato do papagaio-verdadeiro viver cerca de 70 anos
(FORSHAW, 1989; SICK, 1997) gera uma grande
preocupaç
ão
para os estudiosos dessas
populações naturais.
É
possível que
as
populações
de
A. aestiva que vemos hoje sejam compostas
principalmente por indivíduos
velhos
, e quando estes começarem a morrer, em poucas gerações
essa
s populações poderão sofrer um
gargalo
genético, o que futuramente poderá impulsionar a
redução da variabilidade genética tornando essa espécie mais vulnerável aos vários fatores
associados ao aumento dos riscos de extinção.
Vale salientar que os efeitos decorrentes de tais ameaças podem ainda não ter sido
percebidos e detectados devido a fatores como a longevidade e o tempo de geração desta espécie,
48
porém são efeitos que podem interferir diretamente na distribuição e no tamanho das populações
de papagaio
-
verdadeiro em médio e longo prazo.
5.
4 Parentesco e fidelidade ao ninho
O papagaio-
verd
adeiro
, assim como a maioria dos psitacídeos, é considerado uma espécie
estritamente monogâmica, vivendo rigorosamente aos casais (FORSHAW, 1989; SICK, 1997
SEIXAS E MOURÃO, 2000). As bases que sustentam esta afirmação são quase
exclusivamente
constituídas
de observações de campo do comportamento de casais durante o período reprodutivo.
Apesar das limitações técnicas inerentes deste tipo de estudo, como a dificuldade em observar a
ocorrência de acasalamentos extra-par esporádicos, a fidelidade entre os pare
s
desta espécie
é
amplamente aceit
a pela comunidade ornitológica.
O advento das técnicas moleculares tem fornecido maior embasamento para refutar a
hipótese de monogamia de diversas espécies de aves antes
consideradas estritamente monogâmicas
(GRIFFITH et al., 2002; ALCAIDE et al., 2005), e mesmo assim, ainda há, para espécies de
psitacídeos, poucos estudos relacionados ao comportamento reprodutivo que corroborem
ou
refutem a
hip
ótese de monogamia dos casais. Em 2001, C
APARROZ
e colaborado
res
avaliaram a
hipótese de monogamia para duas espécies de araras, Ara ararauna e Ara chloroptera, analisando
nove e 16 amostras de cada espécie, respectivamente (CAPARROZ et al., 2001). Até o momento
não há estudos
genéticos
relacionados ao comportamento reprodutivo do papagaio-
verd
adeiro.
Desta forma, os resultados deste estudo são importantes para a compreensão do comportamento
reprodutivo de
A. aestiva
em populações naturais.
Os resultados
fornecem
evidências que corroboram a hipótese de monogamia para esta
espécie
.
Para 40 ninhadas (91
%)
das 44 analisadas,
a
razão de verossimilhança (LOD) obtida pela
análise de seis locos microssatélite foi estatisticamente significativa, sugerindo que estes filhotes
podem ser irmãos. Nas demais comparações, os resultados não foram estatisticament
e
significativos. Porém, isto não invalida a hipótese de que os filhotes analisados possam ser irmãos.
O nível de significância do teste aplicado pelo programa (
Kinship
) é determinado empiricamente
por meio de simulações empregando as freqüências alélicas observadas. O método utilizado
identifica a proporção de erros do tipo II (aceitar a hipótese nula sendo esta falsa) para um
determinado nível de significância obtida na estimativa do parâmetro. Com base nos seis locos
49
microssatélite, a proporção de erro tipo II observada foi de 4% (p
= 0,05), proporção que poderia
ser atribuída aos casos onde a hipótese de monogamia não foi aceita. Para os casos de parentesco
onde
o val
or de LOD foi não significativo
, foram verificados os valores de
r
atribuídos, os quais
se
encontraram na área de sobreposição das três hipóteses de parentesco (irmãos, meio-irmãos e não
relacionados) (Tabela 7, Figura 6), o que dificulta a inferência da relação genética para estes casos
exclusivamente com base na análise dos seis pares de lo
co
s microssatélite. De maneira geral, os
resultados obtidos indicam fortes evidências de monogamia para A. aestiva (hipótese aceita em
91
% dos casos), o que consequentemente, elimina a hipótese de ocorrência de acasalamento extra-
par para esta espécie.
P
ar
a três das sete análises realizadas o estudo de fidelidade ao ninho apresentou evidências
de que os casais de A. aestiva voltam à mesma cavidade em diferentes estações reprodutivas.
Estudos ecológicos, de observação e de análise do ambiente dos sítios repr
odutivos
auxiliam no
levantamento de algumas hipóteses que podem justificar os resultados obtidos. Para os três casos
onde a hipótese de fidelidade ao ninho foi aceita, é sugerido que a baixa densidade de papagaios-
verdadeiros ou de outros competidores por cavidades sejam responsáveis por uma maior
disponibilidade de ninhos, o que facilita o regresso dos casais a tais regiões. Outra justificativa é a
alta
disponibilidade de alimentos ou a baixa densidade de predadores nos sítios de reprodução
possibilitando
o retorno dos casais ano após ano.
Os resultados mostram, também, que A. aestiva pode
apresentar
um comportamento
flexível em relação a fidelidade ao uso de cavidade, o que pode ser vantajoso para uma espécie que
compete por cavidade. Evidências de competição por cavidade foram observadas em alguns locais
(no DF, observação pessoal e MS, G. Seixas, com. pessoal). Em um dos casos no qual a hipótese
de fidelidade ao ninho não foi aceita (ninho 13) há evidências obtidas por observação de campo de
que realmente não foi o mesmo casal que utilizou o ninho em estações reprodutivas diferentes
(neste caso, 2000 e 2004), o que mostra o quanto é importante o monitoramento constante dos
indi
víduos nas populações naturais, e principalmente, o quanto a análise molecular desse tipo de
comportamento pode auxiliar na inferência de hipóteses relacionadas ao comportamento
reprodutivo para espécies de
aves.
50
5.2.1 Implicações para conservação
As populações do papagaio-
verdadeiro
são vulneráveis aos efeitos da fragmentação do
habitat
, principalmente no que tange a perda de potenciais áreas de reprodução, e
aos
altos níveis
de captura para abastecimento do tráfico ilegal de animais silvestres (BUCHER E MARTELLA,
1988; COLLAR E JUNIPER, 1988). Essas ameaças devem ser consideradas caso seja necess
ário
estabelecer estratégias de
conservação
para esta espécie, uma vez que essas podem ser
responsáveis pela redução do tamanho populacional, e consequentemente, do fluxo gênico e da
variabilidade genética dentro e entre populações naturais. Os resultados obtidos neste trabalho
sugerem que estas ameaças não têm
provocado forte impacto na estrutura genética e na diversidade
das populações
do papagaio
-
verdadeiro
.
Contudo
, devido a alta expectativa de vida desta espécie, é provável que os imp
actos
provocados por tais ameaças não puderam, ainda, ser detectados
.
Um estudo sobre a
flutuação
demográfica das populações do papagaio-verdadeiro em longo prazo provavelmente poderá
elucidar quais são os fatores associados com a manutenção ou alteração da variabilidade genética
de tais populações. Infelizmente, os problemas atualmente reconhecidos e associados à
vulnerabilidade das populações do papagaio
-
verdadeiro podem ser acentuados nas gerações futuras
caso não sejam tomadas medidas de conservação, e assim, uma menor variabilidade genética pode
ser acentuada pela redução repentina do tamanho populacional e
pelo
isolamento de tais
populações.
Em relação
à
estruturação genética encontrada, e do ponto de vista de
U
nidade
de M
anejo
MU
(MORITZ, 1994), no qual tais unidades são representadas pela diferenciação das freqüências
alélicas entre as populações, os resultados obtidos pela análise de
seis
marcadores microssatélite,
favoreceriam o estabelecimento de tais unidades de forma clinal, tal como se encont
ra
m
distribuída
s as variabilidades genética e morfológica para as cinco populações estudadas. Seria
ideal o estabelecimento de unidades de manejo nos extremos da distribuição, tanto para preservar
as populações geneticamente distintas (Argentina e Tocantins) quanto as populações
f
enotipicamente
distintas (com o encontro da asa amarelo no sul da distribuição e com encontro da
asa vermelho no norte da distribuição)
,
e ao longo da distribuição das populações, onde
os
resultados obtidos neste trabalho indicam que há fluxo (não há diferenciação genética entre as
51
populações do MS, DF e MG) e os dados morfológicos evidenciam que há mistura entre as
populações dos extremos (encontro da asa misto)
.
Por outro lado, a análise filogenética deste
taxon
mostra que A. a ae
stiva
e A. a.
xanthopteryx
não são subespécies válidas, ou seja, o padrão estabelecido pela taxonomia atual não
reflete a evolução destas subespécies
(RIBAS
et al.,
2007
). Portanto, focar esforços baseados na
taxonomia
atual
poderia direcionar erroneamente
as estratégias de conservaç
ão para o
complexo de
espécie
s
(A. aestiva- A. ochrocephala
)
no qual se encontram as subespécies em questão.
Nesse
sentido, é importante reforçar a necessidade de uma revisão taxonômica
deste complexo.
Adicionalmente, os resultados das análises de parentesco e fidelidade ao ninho fornecem
informações importantes sobre o comportamento reprodutivo do papagaio-
verdadeiro
. Espera-
se
que tais informações auxiliem na elaboração dos planos de manejo in situ e ex situ e
que
contribuam não somente com a conservação da espécie per si, mas também com a conservação e
preservação do habitat onde vivem
e reproduzem
as
populações naturais do papagaio
-
verdadeiro.
52
7. CONCLUSÕES
1
-
A
transferibilidade de 14 marcadores microssatélite, sendo nove destes polimórficos
(com cinco alelos ou mais por loco), e a utilização de seis marcadores microssatélites com baixa
probabilidade combinada de identidade genética e alta probabilidade combinada de exclusão de
paternidade
proporciona novas perspectivas para a geração de dados fundamentais em estudos
de
parentesco e de estrutura
genética
e conservação para populações
in situ
e
ex situ
de
A. aestiva
.
2
A análise de estruturação populacional mostrou que há fluxo gênico entre as populações
es
tudadas ao longo da dis
tribuiç
ão (MS, DF e MG) e baixa diferenciação genética entre os
extremos
(Argentina e Tocantins)
.
3
Os resultados obtidos pela análise de efeito de gargalo genético para as cinco
populações estudadas mostraram que não há evidências de redução drástica recente no tamanho
populacional.
4
Os resultados obtidos pela análise de parentesco entre os ninhegos fornecem fortes
evidências que corroboram a hipótese de monogamia para a espécie A. aestiva. O estudo de
fidelidade ao ninho mostrou que o papagaio-verdadeiro apresenta um comportamento flexível em
relação à fidelidade ao u
so de cavidade para reprodução.
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