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CRIAÇÃO DE TISSUE ARRAY DE MELANOMAS
CUTÂNEOS EXTENSIVOS SUPERFICIAIS PARA
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DE
FATORES LIGADOS À PROLIFERAÇÃO
E APOPTOSE CELULAR
BIANCA COSTA SOARES DE SÁ
Dissertação apresentada à Fundação Antônio
Prudente para a obtenção do título de Mestre
em Ciências.
Área de Concentração: Oncologia
Orientador: Dr. Gilles Landman
São Paulo
2005
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Livros Grátis
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do Centro de Tratamento e Pesquisa
Hospital do Câncer A.C. Camargo
Soares de Sá, Bianca Costa
Criação de “tissue array” de melanomas cutâneos extensivos
superficiais para estudo imunoistoquímico de fatores ligados à
proliferação e apoptose celular / Bianca Costa Soares de Sá-- São
Paulo, 2005.
117p.
Dissertação(mestrado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração:
Oncologia.
Orientador: Gilles Landman
Descritores: 1. MELANOMA. 2. ANÁLISE MICROARRAY. 3.
IMUNOHISTOQUÍMICA. 4.PROTEINA p16. 5.CICLINA D1. 6.PROTEINA
CDK. 7.PROTEINA DO RETINOBLASTOMA. 8.PROTEINA p53.
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Á minha família
que são aqueles que me
dedicam verdadeiro amor.
Ao querido
Dr. Fausto João Forin Alonso
(in memorian)
que será sempre um exemplo verdadeiro
de médico, mestre e amigo.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Dr Gilles Landman, por ter guiado os meus passos da melhor
maneira e jamais ter deixado de acreditar, estando ao meu lado sempre que
preciso.
Aos meus pais, pelo amor e dedicação recebidos durante toda a minha vida.
Ao meu marido e filhos, pela paciência e compreensão e principalmente por me
fazerem esquecer os momentos difíceis através do seu apoio e do seu amor.
Às amigas: Gisele, por ter aberto os caminhos para o início deste trabalho, e
Adriana, por ter me ajudado de maneira imprescindível em sua reta final.
Ao corpo docente da Pós-Graduação da Fundação Antônio Prudente pela
excelência na elaboração dos cursos e ensino dos alunos.
Ao Dr Luiz Fernando Lima Reis, Diretor da Pós-Graduação da Fundação Antônio
Prudente, por ter a mente e o coração sempre abertos e desta forma exercer o seu
cargo da melhor maneira possível.
Aos colegas de trabalho do Departamento de Oncologia Cutânea do Hospital do
Câncer de São Paulo pelo incentivo, auxílio e compreensão durante este período.
Aos funcionários do Departamento de Oncologia Cutânea do Hospital do Câncer de
São Paulo pela constante disposição em ajudar.
A todos do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer de São
Paulo por terem me auxiliado e me acolhido sem restrições.
Aos funcionários do arquivo de blocos e laboratórios do Departamento de Anatomia
Patológica, por todo trabalho realizado neste projeto.
Ao Sr. Carlos Eugênio Nascimento Braga, funcionário do Departamento de
Anatomia Patológica do Hospital do Câncer de São Paulo, pelo excelente trabalho
na confecção do tissue microarray.
À Sueli Nonogaki, funcionária do Centro de Pesquisas do Instituto Ludwig, pela
realização das reações imunoistoquímicas com extrema qualidade.
Aos funcionários do Serviço de Arquivo Médico e Estatístico (SAME) do Hospital do
Câncer de São Paulo pela ajuda na análise e seleção dos prontuários.
A todas as funcionárias da Biblioteca da Fundação Antônio Prudente, pela sua
prestatividade e auxílio nos levantamentos e revisão bibliográfica.
À Suely Francisco, Bibliotecária Chefe, pela formatação deste trabalho e pelo
constante incentivo.
À Ana Maria Rodrigues Alves Kuninari, coordenadora da Pós-Graduação da
Fundação Antonio Prudente, e Márcia Miwa Hiratani, funcionária da pós-graduação,
pela compreensão, paciência e carinho que me dedicaram durante todo o curso,
além de sua eficiência em seus trabalhos.
À Dra Karina de Cássia Braga Ribeiro, pelos ensinamentos na área de
bioestatística e pelo auxílio na análise estatística dos dados.
Aos Membros da Banca de Qualificação, Dr. Roger Chammas, Dra Mirian
Nacagami Sotto e Dra Mariângela Esther Alencar Marques, pela colaboração e por
todas as sugestões que tanto auxiliaram à execução deste projeto.
Ao Dante Simionatto Neto, aluno do PIBIC da Fundação Antônio Prudente, pelo
auxílio na coleta de dados e material para a confecção do tissue microarray.
À Melissa Fugimori, aluna do PIBIC da Fundação Antônio Prudente, pelo auxílio na
avaliação da expressão de ciclina D1.
À FAPESP, pelo auxílio financeiro (projeto 02/13540.9).
RESUMO
Soares de Sá BC. Criação de tissue array de melanomas cutâneos
extensivos superficiais para estudo imunoistoquímico de fatores
ligados à proliferação e apoptose celular. São Paulo; 2005. [Dissertação
de Mestrado-Fundação Antônio Prudente]
Introdução. O melanoma cutâneo é a neoplasia de maior aumento anual em
incidência nas populações de pele clara, sendo refratário às terapêuticas
atuais quando ocorrem metástases. Esta neoplasia origina-se da
transformação maligna de melanócitos epidérmicos, processo multifatorial
que envolve as vias de controle do ciclo celular e morte celular programada,
como as vias p16/pRb e p53. A técnica de tissue microarray permite a
avaliação de diversas amostras teciduais simultaneamente, além da análise
de grande variedade de marcadores biológicos em um mesmo experimento.
Um estudo combinando a análise da expressão de fatores de proliferação
celular e apoptose e a utilização da técnica de tissue microarray, seria de
grande utilidade para o entendimento da iniciação e progressão do
melanoma cutâneo. Objetivo. Estudar a expressão de proteínas
relacionadas à proliferação celular e apoptose em pacientes portadores de
melanomas extensivos superficiais in situ e invasivos e relacionar a
expressão destes fatores ao comportamento biológico tumoral e localização
das possíveis metástases. Pacientes e métodos. Estudo retrospectivo
incluindo 136 pacientes com diagnóstico de melanoma cutâneo do tipo
extensivo superficial realizado no Centro de Tratamento e Pesquisa Hospital
do Câncer A C Camargo, cujos blocos de parafina do tumor primário e
metastático estavam disponíveis nos arquivos do Departamento de
Anatomia Patológica. Os melanomas in situ e com espessura até 1,0 mm
foram analisados através de cortes convencionais, totalizando 64 amostras.
Os melanomas acima de 1,0 mm foram estudados através da técnica de
tissue microarray que incluiu 72 amostras de tumores primários e 29
amostras de tumores metastáticos, em duplicata. Foi estudada por
imunoistoquímica, através da técnica de estreptavidina-biotina-peroxidade, a
expressão das proteínas p16, ciclina D1, Cdk4, pRb, p53 e p21.
Resultados. Todos os melanomas acima de 1,0 mm perderam a expressão
de p16. Nos melanomas in situ e finos a sua expressão foi muito baixa. Os
melanomas com espessura até 1,0 mm apresentaram maior expressão de
ciclina D1 e Cdk4 citoplasmática. Os melanomas com espessura acima de
1,0 mm apresentaram maior expressão de Cdk4 nuclear, p53 e p21. A
expressão de pRb não mostrou associação com a espessura do tumor. As
variáveis ulceração e regressão não mostraram associação com a
expressão das proteínas estudadas. Os melanomas com IM ≥ 1
apresentaram menor expressão de ciclina D1. Os casos com IM > 6
apresentaram maior expressão de p53. Os tumores primários mostraram
maior expressão de Cdk4 citoplasmática em relação aos tumores
metastáticos. As metástases cutâneas apresentaram maior expressão de
p21 em relação ao grupo de metástases não cutâneas. A expressão das
proteínas estudadas não mostrou impacto na sobrevida global ou livre de
doença dos pacientes. Conclusões. A perda de expressão de p16
representou uma característica constante nos melanomas estudados. A
expressão de ciclina D1 pode estar relacionada às fases iniciais de
transformação maligna dos melanócitos. Os melanomas menos espessos
expressariam em maior quantidade a proteína Cdk4 citoplasmática e com a
aquisição de outras mutações nos melanomas mais avançados, haveria
ganho de expressão nuclear. A alteração na expressão da proteína pRb
parece ter pouca influência no comportamento biológico e na gênese dos
melanomas cutâneos. A alteração da proteína p53 pode representar evento
tardio na gênese dos melanomas. A expressão aumentada de p21 pode
estar relacionada a mecanismo de feedback para o controle da proliferação
celular nas células que deixam de expressar p16 ou incrementam a
expressão de Cdk4 nuclear.
SUMMARY
Soares de Sá BC. [Superficial spreading cutaneous melanoma tissue
microarray: evaluation of cell cycle and apoptosis proteins by
immunohistochemistry]. São Paulo; 2005. [Dissertação de Mestrado-
Fundação Antônio Prudente]
Background. The incidence of cutaneous melanoma has the highest rate of
annual growth in caucasian population and allows very few therapeutic
options once metastatic. Malignant transformation of epidermal melanocytes
is a multifactorial process involving cell cycle and death control pathways,
such as p16/pRb and p53. The tissue microarray technique allows evaluating
simultaneously numerous tissue samples for a great variety of biological
markers. Therefore, with this technique, it would be of great value to analyse
the cell cycle and apoptosis proteins in understanding the initiation and
progression of cutaneous melanoma. Objective: To analyse the expression
of cell cycle and apoptosis proteins in samples of cutaneous in situ and
invasive superficial spreading melanoma aiming to evaluate and establish the
correlation with the biological behavior and site of metastases. Patients e
methods. A retrospective study of 136 patients with cutaneous superficial
spreading melanoma, diagnosed and treated at the Centro de Tratamento e
Pesquisa Hospital do Câncer A C Camargo. Parafin blocks of primary and
metastatic tumors were obtained in the files of the Departament of Anatomic
Pathology. A total of 64 samples of in situ and less than or equal to 1,0 mm
melanomas were analysed in conventional sections. Melanomas over 1,0
mm were evaluated in the tissue microarray, including 72 samples of primary
and 29 from metastatic tumors. Two samples of each parafin blocks were
included. The sections were stained with antibodies against p16, cyclin D1,
Cdk4, pRb, p53 and p21 with streptavidine-biotin-peroxidase technique for
immunohistochemistry. Results. Melanomas above 1,0 mm lost p16
expression whereas in situ e and thin melanomas had low rate of expression.
On the other hand the latter showed higher expression of Cyclin D1 and
cytoplasmatic Cdk4. Thick melanomas had increased expression of nuclear
Cdk4, p53 e p21. No relationship to thickness has been found for pRb.
Ulceration and regression had no association with any of the studied
proteins. Melanomas with MR ≥ 1 had lower cyclin D1 expression, whereas
p53 had higher expression in melanomas wilh MR > 6. Primary tumors, when
compared to metastases had higher cytoplasmatic Cdk4 expression.
Cutaneous compared to non cutaneous metastases had higher p21
expression. None of the studied proteins had influence in overalll or disease-
free survival. Conclusions. Our results allow concluding that loss of p16
expression was a constant feature in these series. Cyclin D1 could be related
to initial phases of the malignant transformation. Thin melanomas would have
higher expression of cytoplasmatic Cdk4 whereas thick melanomas acquiring
other mutations would gain nuclear expression of this protein. Little influence
on biological behavior and pathogenesis of cutaneous melanoma appears to
be related to pRb, whereas overexpression p53 may be a late phenomenon.
An increase in p21 could represent a cell cycle feedback control for cells that
lack or lose p16 and/or increase nuclear Cdk4 expression.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Demonstração da comparação entre a expressão nuclear
do marcador no tumor e o controle negativo BSA. 25
Figura 2 Demonstração da comparação entre a expressão nuclear
do marcador no tumor e o controle negativo BSA. 26
Figura 3 Expressão nuclear de p16. 33
Figura 4 Expressão nuclear de ciclina D1. 35
Figura 5 Expressão nuclear e citoplasmática de Cdk4. 38
Figura 6 Expressão nuclear e citoplasmática de Cdk4. 39
Figura 7 Expressão nuclear e citoplasmática de Cdk4. 40
Figura 8 Expressão nuclear de pRb. 42
Figura 9 Expressão nuclear de pRb. 43
Figura 10 Expressão nuclear de pRb. 44
Figura 11 Expressão nuclear de p53. 46
Figura 12 Expressão nuclear de p53. 47
Figura 13 Expressão nuclear de p53. 48
Figura 14 Expressão nuclear de p21. 50
Figura 15 Expressão nuclear de p21. 51
Figura 16 Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com
melanoma invasivo. 78
Figura 17 Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com
melanoma invasivo, segundo idade. 78
Figura 18 Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com
melanoma invasivo, segundo espessura do tumor. 79
Figura 19 Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com
melanoma invasivo, segundo presença de ulceração. 80
Figura 20 Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com
melanoma invasivo, segundo o índice mitótico (IM). 81
Figura 21 Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma
invasivo, segundo expressão de p16. 82
Figura 22 Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma
invasivo, segundo expressão de ciclina D1. 83
Figura 23 Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma
invasivo, segundo expressão de Cdk4. 84
Figura 24 Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de pRb. 85
Figura 25 Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de p53. 86
Figura 26 Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de p21. 87
Figura 27 Análise da expressão das vias p16/pRb e p53 em melanomas
in situ e finos. 103
Figura 28 Análise da expressão das vias p16/pRb e p53 em melanomas
Espessos. 103
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição dos 136 pacientes com melanoma
extensivo superficial, de acordo com a espessura do tumor. 19
Tabela 2 Distribuição dos pacientes com melanoma cutâneo
extensivo superficial de acordo com o estadiamento ao
diagnóstico segundo o AJCC 2002. 31
Tabela 3 Distribuição dos 162 casos analisados de acordo com
a positividade e negatividade nuclear para p16. 32
Tabela 4 Distribuição dos 162 casos analisados de acordo com
a positividade e negatividade nuclear para ciclina D1. 34
Tabela 5 Distribuição dos 161 casos analisados de acordo com a
positividade e negatividade nuclear e citoplasmática para
Cdk4. 37
Tabela 6 Distribuição dos 161 casos analisados de acordo com
a positividade e negatividade nuclear para pRb. 41
Tabela 7 Distribuição dos 162 casos analisados de acordo com
a positividade e negatividade nuclear para p53. 45
Tabela 8 Distribuição dos 165 casos analisados de acordo com
a positividade e negatividade nuclear para p21. 49
Tabela 9 Distribuição dos 125 casos de melanomas primários
analisados de acordo com a positividade para p16 e
espessura do tumor. 53
Tabela 10 Distribuição dos 125 casos de melanomas
primários analisados de acordo com a positividade para
ciclina D1 e espessura do tumor. 53
Tabela 11 Distribuição dos 124 casos de melanomas primários
analisados de acordo com a positividade nuclear para
Cdk4 e espessura do tumor. 54
Tabela 12 Distribuição dos 124 casos de melanomas primários
analisados de acordo com a positividade citoplasmática
para Cdk4 e espessura do tumor. 54
Tabela 13 Distribuição dos 124 casos de melanomas primários
analisados de acordo com a positividade para pRb e
espessura do tumor. 55
Tabela 14 Distribuição dos 125 casos de melanomas primários
analisados de acordo com a positividade para p53 e
espessura do tumor. 56
Tabela 15 Distribuição dos 128 casos de melanomas primários
analisados de acordo com a positividade para p21 e
espessura do tumor. 56
Tabela 16 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p16 e presença de ulceração. 57
Tabela 17 Distribuição dos 107 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
ciclina D1 e presença de ulceração. 58
Tabela 18 Distribuição dos 104 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade nuclear
para Cdk4 e presença de ulceração. 59
Tabela 19 Distribuição dos 104 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a
positividade citoplasmática para Cdk4 e presença de
ulceração. 59
Tabela 20 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
Invasivos analisados de acordo com a positividade para pRb
e presença de ulceração. 60
Tabela 21 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p53 e presença de ulceração. 60
Tabela 22 Distribuição dos 108 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p21 e presença de ulceração. 61
Tabela 23 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p16 e presença de regressão. 62
Tabela 24 Distribuição dos 107 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
ciclina D1 e presença de regressão. 62
Tabela 25 Distribuição dos 104 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade nuclear
para Cdk4 e presença de regressão. 63
Tabela 26 Distribuição dos 104 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade
citoplasmática para Cdk4 e presença de regressão. 63
Tabela 27 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para pRb
e presença de regressão. 64
Tabela 28 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p53 e presença de regressão. 65
Tabela 29 Distribuição dos 108 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p21 e presença de regressão. 65
Tabela 30 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p16 e índice mitótico (IM). 67
Tabela 31 Distribuição dos 107 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
ciclina D1 e índice mitótico (IM). 68
Tabela 32 Distribuição dos 107 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
ciclina D1 e índice mitótico (IM) negativo ou positivo. 68
Tabela 33 Distribuição dos 104 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade nuclear
para Cdk4 e índice mitótico (IM). 69
Tabela 34 Distribuição dos 104 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade
citoplasmática para Cdk4 e índice mitótico (IM). 69
Tabela 35 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
pRb e índice mitótico (IM). 70
Tabela 36 Distribuição dos 105 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p53 e índice mitótico (IM). 71
Tabela 37 Distribuição dos 108 casos de melanomas primários
invasivos analisados de acordo com a positividade para
p21 e índice mitótico (IM). 71
Tabela 38 Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de p16. 72
Tabela 39 Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de ciclina D1. 73
Tabela 40 Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão nuclear de Cdk4. 74
Tabela 41 Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão citoplasmática de Cdk4. 74
Tabela 42 Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de pRb. 75
Tabela 43 Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de p53. 76
Tabela 44 Distribuição dos grupos de tumores metastásticos de
acordo com a expressão de p21. 77
Tabela 45 Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de p21. 77
LISTA DE ABREVISTURAS
Cdk Quinase dependente de Ciclina (do inglês Cyclin-dependent Kinase)
IM Índice mitótico
MR Mitotic rate
pRb proteína do retinoblastoma
TMA Tissue microarray
PCNA Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (do inglês Proliferating Cell
Nuclear Antigen)
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 1
2 OBJETIVOS 13
2.1 Objetivo geral 13
2.2 Objetivos específicos 13
3 PACIENTES E MÉTODOS 14
3.1 Pacientes 14
3.1.1 Critérios de inclusão 14
3.2 Análise histológica 15
3.3 Casuística 19
3.4 Confecção do tissue microarray 20
3.5 Estudo imunoistoquímico 21
3.5.1 Protocolo de reações 22
3.5.2 Leitura das lâminas 23
3.6 Análise estatística 28
4 RESULTADOS 30
4.1 Estatística descritiva 30
4.2 Estudo da associação entre a expressão dos marcadores
biológicos e espessura do tumor 52
4.3 Estudo da associação entre a expressão dos marcadores
biológicos e ulceração 57
4.4 Estudo da associação entre a expressão dos marcadores
biológicos e regressão 61
4.5 Estudo da associação entre a expressão dos marcadores
biológicos e índice mitótico 66
4.6 Tumor metastático 72
4.7 Sobrevida global e livre de doença 77
5 DISCUSSÃO 88
6 CONCLUSÕES 104
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 107
1
1 INTRODUÇÃO
O melanoma cutâneo é uma neoplasia relativamente rara, mas a sua
incidência tem se mantido crescente em várias populações de origem
européia, sendo a neoplasia de maior aumento anual em incidência nas
populações de pele clara (MACKIE et al. 2002; GERBAUD et al. 2003;
KATALINIC et al. 2003; DE VRIES et al. 2003). ARMSTRONG 2004).
Acomete indivíduos jovens, sendo refratário às terapêuticas atuais quando
ocorrem metástases (SLOMINSKI et al. 1998; SHEN et al. 2003).
Corresponde à sexta neoplasia maligna em mulheres e a quinta em homens
nos EUA e a segunda encontrada em Queensland, Austrália
(Queensland
Cancer Registry Health Information Centre Queensland Health Level 1998;
JEMAL et al. 2005).
No Brasil, dados do INCA revelam uma incidência global de
melanoma variando de zero a 8,73 por 100.000 habitantes, sendo estimados
5820 novos casos para o ano 2005, com a maior taxa de incidência no
Estado de Santa Catarina (Ministério da Saúde 2004).
O melanoma cutâneo origina-se da transformação dos melanócitos
epidérmicos, cuja principal função é a produção da melanina, pigmento que
confere fotoproteção à pele (GREEN e KHAVARI 2004; RIZOS et al. 2004).
Os melanócitos epidérmicos também atuam como células sensoriais e
regulatórias através da indução de respostas neuroendócrinas e
imunomodulatórias, participando, deste modo, da manutenção da
2
homeostase cutânea (SLOMINSKI et al. 1998). Os melanócitos humanos, na
idade adulta, estão normalmente quiescentes e podem apresentar atividade
mitótica discreta com a ação de estímulos externos específicos como
radiação ultravioleta e cicatrização (SLOMINSKI et al. 1998; RIZOS et al.
2004). Esta atividade proliferativa específica requer controle delicado do
ciclo celular e alterações em seus sinais regulatórios podem resultar em
divisão celular não controlada, podendo representar o início de processo de
transformação maligna (RIZOS et al. 2004). O processo de transformação
maligna dos melanócitos é provavelmente multifatorial e resulta de
interações complexas entre fatores genéticos, constitucionais e ambientais
(ALBINO et al. 1997; SLOMINSKI et al. 2001; SULAIMON e KITCHELL
2003).
O melanoma cutâneo é uma neoplasia que permite o estudo de
eventos celulares relevantes para a transformação maligna, pois sua história
natural mostra estágios progressivos de agressividade do tumor, de acordo
com a sua capacidade de infiltrar a derme (PARMITER e NOWELL 1993;
REED et al. 1995; SU e TRENT 1995; ROBERTSON et al. 1996; ALBINO et
al. 1997; KIM et al. 2002). Esta característica do tumor baseia-se no fato de
que a transição do padrão de crescimento radial para o padrão de
crescimento vertical, com infiltração da derme, é um marco de grande
importância em várias das propriedades biológicas do tumor, incluindo sua
capacidade de metastatização (ROBERTSON et al. 1996).
Assim como na maioria das neoplasias malignas em humanos, o
desenvolvimento do melanoma cutâneo resulta do rompimento da
3
integridade do genoma dos melanócitos que induz instabilidade sustentada,
produzida por alterações cromossômicas, que irão determinar as
características neoplásicas destas células (PARMITER e NOWELL 1993;
ROBERTSON et al. 1996; ALBINO et al. 1997). A tumorigênese envolve
alterações dinâmicas do genoma produzidas por mutações que determinam
ganho de função de oncogenes ou perda de função de genes supressores
de tumor (HANAHAN e WEINBERG 2000). Este processo ocorre em etapas,
determinando a transformação progressiva da célula normal em célula
neoplásica (HANAHAN e WEINBERG 2000).
Numerosos são os estudos em busca de anormalidades
cromossômicas relacionadas ao melanoma, muitas das quais envolvendo
locus gênicos relacionados a fatores de proliferação ou de apoptose, já que
alterações na expressão ou atividade das proteínas que regulam o ciclo
celular e a morte celular programada são essenciais para o aparecimento
das neoplasias e sua capacidade de metastatização (HANAHAN e
WEINBERG 2000; CZAJKOWSKI et al. 2002; KIM et al. 2002; RANE et al.
2002; BURY e CROSS 2003). Os princípios básicos da regulação do ciclo
celular estão na iniciação de reações em cascata que irão culminar na
fosforilação e desfosforilação de proteínas relevantes. Na fase G1 do ciclo
celular estas reações são controladas através das vias das proteínas pRb e
p53 (CZAJKOWSKI et al. 2002).
O gene CDKN2A, localizado no cromossomo 9p21, é um gene
supressor de tumor de grande interesse no estudo dos melanomas
cutâneos. A presença de deleções, mutações ou rearranjos deste gene,
4
tanto em melanomas familiais quanto em melanomas esporádicos, foi
descrita em diversos estudos (OHTA et al. 1994; HOLLAND et al. 1995;
REED et al. 1995; SU e TRENT 1995; FLORES et al. 1996; OHTA et al.
1996; ALBINO et al. 1997; MANGINI et al. 2002; BENNETT 2003; GREEN e
KHAVARI 2003; SVIDERSKAYA et al. 2003). O gene CDKN2A possui papel
crucial na regulação do ciclo celular e processos de senescência da célula
(BATAILLE 2003). Este gene codifica duas proteínas distintas através de
processamento alternativo e tradução dos produtos em janelas de leitura
diferentes: a proteína p16 e a proteína 14
ARF
(Alternative Reading Frame),
ambas atuando no controle do ciclo celular e apoptose, sendo a p16 através
da proteína do retinoblastoma (pRb) e a p14 via proteína p53 (BATAILLE
2003; HAYWARD 2003). A proteína p16, em células normais, liga-se às
quinases dependentes de ciclina (CDKs) 4 e 6, inibindo a formação do
complexo CDK-ciclina D e subseqüentemente evitando a fosforilação de
pRb, o que resulta na parada do ciclo celular. A pRb na sua forma não
fosforilada inibe a passagem da célula da fase G1 para a fase S do ciclo
celular. A fosforilação de pRb pelo complexo CDK-ciclina D leva à liberação
do fator de transcrição E2F que é necessário para que a célula entre na fase
S e inicie a replicação de DNA. O desequilíbrio deste processo produz
crescimento celular descontrolado e desenvolvimento tumoral. Desta forma,
a proteína p16 é considerada um regulador negativo do ciclo celular atuando
no ponto de checagem G1 (GRANA e REDDY 1995; ELLEDGE 1996;
SHERR e ROBERTS 1999; BATAILLE 2003; BURY e CROSS 2003;
SVIDERSKAYA et al. 2003; RIZOS et al. 2004; ZHANG e ROSDAHL 2004).
5
A perda de expressão da proteína p16 em melanomas está associada à
capacidade de invasão e metastização, além de recorrência do tumor e pior
prognóstico (HOLLAND et al. 1995; REED et al. 1995; OHTA et al. 1996;
SLOMINSKI et al. 1998; MANGINI et al. 2002; ZHANG e ROSDAHL 2004).
Demonstrou-se, também, que a proteína p16 é necessária para a
senescência dos melanócitos normais e a falta da sua expressão contribuiria
para a imortalização de células portadoras de mutações no gene CDKN2A
(SVIDERSKAYA et al. 2003). A via p16/ciclina D1/Cdk4/pRb é um alvo
freqüente na patogênese do melanoma e alguns estudos mostram que em
células de melanoma, pelo menos um de seus componentes apresenta
função alterada (BARTKOVA et al. 1996; MAELANDSMO et al. 1996a).
A ciclina D1 é codificada pelo gene CCND1, localizado no
cromossomo 11q13. A superexpressão de ciclina D1 está relacionada a
aparecimento precoce de câncer e risco de progressão tumoral e
desenvolvimento de metástases (FU et al. 2004). A amplificação e ou
superexpressão do gene CCND1 é um evento relativamente precoce no
processo de tumorigênese, ocorrendo em 15 a 50% dos tumores primários
de mama (SAUTER et al. 2002; FU et al. 2004). Altos níveis de ciclina D1
foram encontrados em nevos displásicos e em células de melanomas
esporádicos (CZAJKOWSKI et al. 2002). A expressão aumentada de ciclina
D1 pode resultar de amplificação gênica ou ativação de via acessória
através de mutação do gene codificador da proteína Ras (FILMUS et al.
1994; CZAJKOWSKI et al. 2002; SAUTER et al. 2002; FU et al. 2004).
Independentemente do mecanismo de superexpressão da ciclina D1, alguns
6
estudos sugerem que a determinação da atividade desta proteína em lesões
pigmentadas pode auxiliar na diferenciação entre melanoma maligno e
nevos comuns (CZAJKOWSKI et al. 2002). Porém, o papel desta proteína no
desenvolvimento dos melanomas ainda não está determinado (SAUTER et
al. 2002).
O gene Cdk4 está localizado no cromossomo 12q13-14 e apresenta-
se freqüentemente amplificado e ou superexpresso em diferentes tipos de
neoplasias como sarcomas e glioblastomas (MAELANDSMO et al. 1996a).
Em melanomas esporádicos, alguns casos mostraram superexpressão deste
oncogene (CZAJKOWSKI et al. 2002). Alguns estudos evidenciaram altos
níveis de Cdk4 RNA mensageiro em melanomas, geralmente
acompanhados de alta expressão de ciclina D1 (MAELANDSMO et al.
1996a). É descrita, ainda mutação missense no gene Cdk4, em melanomas
e linhagens celulares deste tumor, que leva à troca de arginina por cisteína
no códon 24, tornando a protéina resistente à inibição por p16 e
potencializando-o como oncogene (BARTKOVA et al. 1996).
A proteína pRb é codificada pelo gene RB1, localizado no
cromossomo 13q14, e a inativação de ambos alelos determina o
aparecimento do retinoblastoma. Pacientes com retinoblastoma e seus
parentes têm maior freqüência de nevos atípicos e risco aumentado de
melanoma (BARTKOVA et al.1996). A incidência de melanoma em familiares
de pacientes com retinoblastoma familiar é maior do que nos casos
esporádicos (BARTKOVA et al.1996). A inativação deste gene pode ocorrer
por mutações somáticas em osteossarcomas e carcinomas de pequenas
7
células (MAELANDSMO et al. 1996a). A perda de expressão da proteína
pRb apresenta maior impacto no controle da proliferação celular do qualquer
outra proteína desta via (BARTKOVA et al. 1996). A inativação do gene RB
parece ser um evento raro no desenvolvimento do melanoma, pois vários
estudos mostram que a expressão da pRb está inalterada na maioria destes
tumores (PIEPKORN 2000). Em 2001, KORABIOWSKA et al. mostraram
correlação entre perda de expressão do gene RB e maior infiltração dos
melanomas e menores taxas de sobrevida. Assim sendo, a forma de
expressão do gene RB na patogênese do melanoma ainda não está
estabelecido.
O gene p53 é um gene supressor de tumor localizado no cromossomo
17p13 cuja mutação é descrita em diversos tumores malignos (PARMITER e
NOWELL 1993; MANGINI et al. 2002). Possui função primária de
manutenção das células em estado de repouso após qualquer dano no DNA,
preservando a estabilidade do genoma da célula (BAE et al. 1996;
CZAJKOWSKI et al. 2002; MANGINI et al. 2002). A presença de dano no
material genético celular induz a expressão da proteína p53, que irá
intensificar a expressão do gene Cip1,que codifica a proteína p21. Esta
proteína leva à parada do ciclo celular na fase G1, através da sua ligação
com o complexo CDK-ciclina (CZAJKOWSKI et al. 2002). A proteína p53 é
capaz de induzir apoptose se não houve a devida reparação do DNA
danificado, protegendo a célula do acúmulo de mutações e subseqüente
transformação maligna. (BAE et al. 1996; CZAJKOWSKI et al. 2002;
MANGINI et al. 2002). Para a indução de apoptose, a proteína p53 induz a
8
expressão de proteínas que participam deste processo pela via mitocondrial
e via receptor de morte, incluindo Bax, NOXA e PUMA (HUSSEIN et al.
2003; WU et al. 2004). Foi descrita, ainda, a participação de p53 na
senescência tardia, dependente de encurtamento de telomerase, em
melanócitos com deficiência da proteína p16 (BURY e CROSS 2003;
SVIDERSKAYA et al. 2003). Em melanomas esporádicos, mutações
pontuais do gene p53 são raras, ocorrendo em menos de 25% dos casos
(CZAJKOWSKI et al. 2002; HUSSEIN et al. 2003). Alterações nos exons 7 e
8, que determinam a atividade da proteína p53, são mais comumente vistas
em melanomas nodulares localizados em áreas expostas (CZAJKOWSKI et
al. 2002). Apesar de estudos da expressão do gene p53 em melanomas
mostrarem resultados controversos, algumas conclusões importantes podem
ser definidas: mutações do gene p53 ocorrem em um pequeno número de
tumores melanocíticos, em porcentagem menor do que outros tumores
cutâneos não melanoma e outras neoplasias internas; estas mutações
podem ser vistas em lesões névicas benignas, mas quando ocorrem nos
melanomas, são mais comumente encontradas nos tumores metastáticos; o
mecanismo das mutações de p53 em melanomas ainda é desconhecido; e
para a determinação do valor prognóstico e diagnóstico destas mutações,
serão necessários ainda estudos futuros (HUSSEIN et al. 2003).
O gene waf1/Cip1 localizado no cromossomo 6p21.2 é também um
gene supressor de tumor e codifica a proteína p21, sendo um dos principais
genes efetores que participam do controle do ciclo celular através da via do
p53. A proteína p21 é um potente inibidor de quinases dependentes de
9
ciclina (CDKs) e impede a replicação do DNA, ligando-se ao complexo CDK-
ciclina e evitando a sua ação sobre a proteína Rb (ALBINO et al. 1997;
KARJALAINEN et al. 1999). Outra via de ação da proteína p21 é através de
sua ligação direta ao antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA),
anulando a atividade da enzima DNA polimerase (KARJALAINEN et al.
1999). Alguns estudos mostram que a diminuição da expressão da proteína
p21 está associada com progressão do melanoma e fenótipo metastatizante
(KARJALAINEN et al. 1999), porém outros estudos revelam que existe uma
correlação positiva entre o nível de expressão da proteína 21 e o avanço do
estadio da doença (SPARROW et al. 1998; BALES et al. 1999;
CZAJKOWSKI et al. 2002). Foi demonstrado que outros sinais podem induzir
à expressão do gene waf1/Cip1, independentemente de p53 (KARJALAINEN
et al. 1999; MANGINI et al. 2002). A expressão do gene waf1/Cip1 é
heterogênea e está relacionada à complexidade da função da proteína p21
na regulação do ciclo celular, que varia de acordo com a sua concentração
local (CZAJKOWSKI et al. 2002).
Técnicas para estudo da expressão gênica em melanomas cutâneos
As técnicas de análise de expressão gênica geralmente apresentam
contaminação por tecido estromal, em material obtido para estudo de lesões
melanocíticas, além da limitação no número de amostras que podem ser
estudadas em um único experimento (RUBIN 2001; KIM et al. 2002).
A técnica de microdissecção a laser tem permitido a obtenção de
pequeno número de células tumorais não contaminadas por células
10
estromais (EMMERT-BUCK et al. 1996). Mas esta técnica ainda mantém a
limitação no número de amostras a serem estudadas.
A técnica de tissue microarray foi descrita em 1998 por KONONEN et
al. e permite a avaliação de centenas de amostras teciduais, fixadas em
formalina em bloco de parafina, em uma única lâmina (RUBIN 2001;
KORABIOWSKA et al. 2004). Este método para análise de expressão gênica
é de extrema importância, dada a grande variedade de genes candidatos
descobertos através da técnica de cDNA microarray (FRANTZ et al. 2001;
RUBIN 2001). A técnica de tissue microarray baseia-se na análise de
amostras de tecidos em blocos de parafina que compõem os arquivos de
patologia. Desta forma, grande variedade de tumores, além de amostras
numerosas, pode ser estudada (ALIZADEH et al. 2001; LEWIS et al. 2001;
KIELHORN et al. 2003; PACIFICO et al. 2005). Mais importante ainda é o
fato de que as amostras podem ter sido coletadas há vários anos, permitindo
a devida análise de dados em relação ao acompanhamento e evolução
clínica dos doadores dos tecidos estudados (ALIZADEH et al. 2001;
BUBENDORF et al. 2001; KIELHORN et al. 2003). A técnica de tissue
microarray baseia-se na obtenção de amostras de blocos de parafina
coletadas através de agulha (punch) com diâmetro de 0,6; 1,0; 1,5 ou 2,0
milímetros, que são inseridas em um bloco receptor, através de um aparelho
chamado Tissue Microarrayer (BUBENDORF et al. 2001). Pode-se, assim,
coletar até 700 espécimes em cada bloco receptor, com pouca mutilação do
bloco de origem. O bloco receptor montado pode prover de 100 a 400 cortes
de 5 a 8 micras, que podem ser analisados através de grande variedade de
11
sondas de DNA, RNA e proteínas (ALIZADEH et al. 2001; BUBENDORF et
al. 2001; LEWIS et al. 2001; KORABIOWSKA et al. 2004; PACIFICO et al.
2004). Pode-se, então, realizar, simultaneamente, a análise de DNA, RNA e
expressão de proteínas em todos os espécimes em um único experimento e,
ainda, analisar centenas de marcadores moleculares no mesmo grupo de
espécimes.
Desta forma, é possível criar bancos compreendendo melanomas
primários em diferentes estadios e suas possíveis metástases, em
localizações diversas, permitindo o estudo de diversas proteínas para a
determinação de possíveis marcadores biológicos de prognóstico e resposta
terapêutica. Este tem sido o enfoque de diversos estudos em melanomas
cutâneos com a utilização da técnica de tissue microarray (SAUTER et al.
2002; SHEN et al. 2003; DAI et al. 2003; KIELHORN et al. 2003; ALONSO et
al. 2004; KASHANI-SABET et al. 2004; PACIFICO et al. 2005). Porém, em
tumores com grande heterogeneidade, como os melanomas, os dados
adquiridos através de material de tissue microarray poderiam ser
questionados em relação à sua verdadeira representatividade do tumor.
PACIFICO et al. publicaram em 2004 um estudo validando a técnica de
tissue microarray para análise imunoistoquímica de melanomas,
comparando os dados obtidos através desta técnica com os dados obtidos
através de cortes convencionais e sugerem o uso de quatro cores de cada
espécime para reduzir as chances de erro.
Um estudo combinando a análise da expressão de fatores de
proliferação celular e apoptose e sua participação no comportamento
12
biológico de grande número de melanomas em estadios diferentes e suas
respectivas metástases, seria de grande importância para o entendimento da
evolução desta neoplasia, além da possibilidade de identificação de
marcadores biológicos de prognóstico e possíveis alvos terapêuticos. Este
estudo seria possibilitado pela criação de um tissue microarray de
espécimes de melanoma cutâneo, incluindo melanomas primários invasivos
em fases radial e/ou vertical de crescimento, metástases linfonodais,
cutâneas e ou viscerais.
Ao invadirem a derme, os melanomas passam a adquirir capacidade
metastatizante. Portanto, o estudo de melanomas in situ ou em fase radial
de crescimento permitiria avaliar as mudanças de expressão de marcadores
de proliferação e apoptose, comparando-os aos melanomas invasivos. No
entanto, a escassez de elementos neoplásicos em melanomas in situ e em
fase radial de crescimento torna difícil a obtenção de quantidade suficiente
de tecido para sua inclusão em tissue microarray. A melhor técnica para o
estudo imunoistoquímico destes melanomas seria através de cortes
histológicos convencionais.
13
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Estudar a expressão de proteínas relacionadas à proliferação celular
e apoptose em pacientes portadores de melanomas extensivos superficiais
in situ e invasivos e relacionar a expressão destes fatores ao comportamento
biológico tumoral e localização das metástases, quando presentes.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Criação de um banco de dados com pacientes portadores de
melanoma cutâneo do tipo extensivo superficial in situ e invasivo.
2. Criação de tissue microarray para o estudo dos melanomas
extensivos superficiais invasivos com espessura maior que 1,0 mm e
suas metástases.
3. Estudar por imunoistoquímica a expressão das proteínas p16, ciclina
D1, Cdk4, pRb, p53 e p21 nos pacientes que compõem o banco de
dados.
4. Relacionar a expressão das proteínas estudadas com fatores
prognósticos (espessura do tumor, ulceração, regressão histológica e
índice mitótico), sobrevida global e livre de doença e localização das
possíveis metástases.
14
3 PACIENTES E MÉTODOS
3.1 PACIENTES
Foram selecionados os casos de melanoma cutâneo do tipo extensivo
superficial, diagnosticados no Centro de Tratamento e Pesquisa Hospital do
Câncer A C Camargo.
Os prontuários dos pacientes foram revistos para análise de variáveis
demográficas, dados clínicos, estadiamento, tratamento, evolução e status.
3.1.1 Critérios de Inclusão
1. Pacientes cujo diagnóstico de melanoma extensivo superficial tenha
sido realizado no Centro de Tratamento e Pesquisa Hospital do
Câncer e cujos blocos de parafina estavam disponíveis nos arquivos
do Departamento de Anatomia Patológica, dispondo de material
suficiente para confecção do tissue microarray.
2. Nos pacientes em que havia metástases para estudo, foram incluídas
aquelas cujos blocos de parafina estavam disponíveis nos arquivos do
Departamento de Anatomia Patológica e que dispunham de material
suficiente para confecção do tissue microarray.
3. Pacientes com pelo menos 2 anos de seguimento clínico encontrado
nos prontuários a partir do diagnóstico histopatológico de melanoma
cutâneo do tipo extensivo superficial.
15
3.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Foram revistas todas as lâminas dos tumores primários e metastáticos
selecionados, para confirmação diagnóstica e avaliação das variáveis
anatomopatológicas de acordo com o protocolo estabelecido pelo Grupo
Brasileiro de Melanoma e Sociedade Brasileira de Patologia. Foi dada
ênfase aos seguintes parâmetros histológicos:
1. Profundidade de infiltração segundo Breslow – Esta medida determina
o volume da neoplasia e correlaciona-se diretamente com a
profundidade de infiltração do tumor. É expressa em milímetros e
determinada a partir da camada granulosa até a célula neoplásica
mais profunda encontrada (BRESLOW 1970). A espessura do tumor é
considerada o fator prognóstico isolado mais importante nos
pacientes com melanoma localizado (estádios I e II) (BALCH et al.
2001a). O limite de 1 mm define os melanomas finos e de bom
prognóstico e o estadiamento, determinado pelo American Joint
Committee on Cancer , define para a categoria T (tumor) os limites de
1.0, 2.0 e 4.0mm (BALCH et al. 2001a e b) (Quadro1).
2. Ulceração - é definida como solução de continuidade da epiderme,
substituída por tampão fibrino-leucocitário sobre a lesão primária, em
decorrência da infiltração neoplásica (BALCH CM et al. 2001b). A
ulceração é o segundo fator prognóstico mais importante nos
16
melanomas localizados (estádios I e II) (BALCH et al. 2001a e b). Nos
melanomas em estádio III, é a característica histológica de pior
prognóstico do tumor primário (BALCH et al. 2001a e b). Nos
melanomas com espessura acima de 1 mm é considerada o fator
preditivo mais significativo, representando maior risco de
desenvolvimento de metástases (BALCH et al. 2001a e b). A
presença de ulceração define os subgrupos da categoria T (tumor) de
acordo com o novo estadiamento determinado pelo American Joint
Committee on Cancer (BALCH et al. 2001a e b) (Quadros 1 e 2)
3. Regressão histológica – é definida como uma área, dentro do
melanoma, onde há ausência de células neoplásicas na epiderme e
na derme, substituídas por tecido fibroso e aumento da
vascularização, podendo ser encontrados linfócitos e melanófagos
(CLARK et al. 1989). A regressão é encontrada em cerca de 1/3 dos
casos de melanoma. Ao contrário do que se esperaria, o encontro de
regressão tem sido associado a um pior prognóstico, possivelmente
indicando que a neoplasia antes do processo regressivo estaria a
uma profundidade maior do que a atualmente encontrada, portanto
com evolução mais reservada. Outra explicação possível indica que o
sistema imune reconheceria clones selecionados de células
neoplásicas, destruindo-os, o que por outro lado selecionaria clones
resistentes à resposta imune do hospedeiro (TRAU et al. 1983;
CLARK et al. 1989).
17
4. Índice mitótico – é expresso como o número de mitoses em 10
campos de grande aumento (400X)
na área invasiva do tumor. A
contagem inicia-se na área de maior número de mitoses. O índice
mitótico é também considerado um importante fator prognóstico nos
pacientes com melanoma e em alguns estudos até com maior
significância que a ulceração, mas estes dados ainda são
controversos, principalmente pelo uso de diferentes métodos de
mensuração nos diversos estudos sobre o tema (AZZOLA et al. 2003;
BUSAM 2004; FRANCKEN et al. 2004; BARNHILL et al. 2005;
NAGORE et al. 2005). Classificou-se o número de mitoses
encontradas em: ausente (0), de 1 a 6 e mais que 6 mitoses por dez
campos de grande aumento (400X).
Nos melanomas extensivos superficiais com espessura acima de 1,0 mm
e nas lesões metastáticas, as lâminas foram marcadas nas áreas de maior
quantidade de células neoplásicas para punção e transporte ao bloco
receptor do tissue microarray. Foram incluídas 10 lesões de nevo
melanocítico composto, como controle, que foram marcadas da mesma
forma em suas lâminas, após revisão e confirmação diagnóstica.
18
T Espessura Ulceração
Tis Melanoma in situ
T1 ≤ 1mm
a: sem ulceração e Clark II/III
b: com ulcaração ou Clark IV/V
T2 1,01 - 2mm
a: sem ulceração
b: com ulceração
T3 2,01 – 4mm
a: sem ulceração
b: com ulceração
T4 > 4mm
a: sem ulceração
b: com ulceração
N Nº de linfonodos metastáticos
Infiltração tumoral do
linfonodo
N1 1 linfonodo
a: micrometástase
∗
b: macrometástase
♣
N2 2 ou 3 linfonodos
a: micrometástase
∗
b: macrometástase
♣
c: metástases em
trânsito/satelitose sem
metástase nodal
N3
4 linfonodos ou mais, ou linfonodos
confluentes, ou metástases em
trânsito/satelitose com metástase
linfonodal
M Localização DHL sérico
M1a
Metástase cutânea, subcutânea ou
linfonodal à distância
Normal
M1b Metástase pulmonar Normal
M1c
Outras metástases viscerais
Qualquer metástase à distância
Normal
Elevada
∗
Micrometástases são diagnosticadas após realização de pesquisa do linfonodo sentinela
ou linfadenectomia.
♣
Macrometástases são definidas como linfonodos clinicamente detectados e confirmados
por linfadenectomia terapêutica ou quando as metástases linfonodais apresentarem
infiltração extra-capsular.
Fonte: Adaptado de BALCH et al. (2001b)
Quadro 1 - Classificação TNM do Melanoma, segundo American Joint
Committee on Cancer, 2002.
19
Estadio T N M
0
Tis N0 M0
IA
T1a N0 M0
IB
T1b
T2a
N0
N0
M0
M0
IIA
T2b
T3a
N0
N0
M0
M0
IIB
T3b
T4a
N0
N0
M0
M0
IIC
T4b N0 M0
IIIA
Qualquer T N1 M0
IIIB
Qualquer T N2a ou N2b ou N3 M0
IIIC
Qualquer T N2c M0
IV
Qualquer T Qualquer N Qualquer M
Fonte: Adaptado de BALCH et al. (2001b)
Quadro 2 - Estadiamento clínico do Melanoma, segundo American Joint
Committee on Cancer, 2002.
3.3 CASUÍSTICA
Em estudo retrospectivo, foram analisados prontuários de 1994 a
2000 e selecionados 136 pacientes de acordo com os critérios de inclusão,
como mostra a Tabela 1. Os melanomas invasivos com espessura menor ou
igual a 1,0 mm são chamados de melanomas finos.
Tabela 1 - Distribuição dos 136 pacientes com melanoma extensivo
superficial, de acordo com a espessura do tumor.
Espessura do tumor (mm) Número de pacientes
In situ
20
≤ 1,0
44
1,01 – 2,0 31
2,01 – 4,0 25
> 4,0
16
TOTAL 136
20
3.4 CONFECCÇÃO DO TISSUE MICROARRAY
Para a confecção do tissue microarray (TMA) foi utilizada
aparelhagem disponível no Departamento de Anatomia Patológica do
Hospital do Câncer – tissue microarrayer (Beecher Instrunents ®, Silver
Spring, EUA). A área identificada no bloco doador foi puncionada em 2 locais
diferentes (selecionados previamente) com agulha de 1mm e os cilindros
obtidos foram transferidos para o bloco receptor. Foram incluídas 111
amostras em duplicata, totalizando 222 amostras no TMA. As 111 amostras
incluíam 72 tumores primários (melanomas extensivos superficiais acima de
1 mm) , 29 tumores metastáticos (13 metástases cutâneas, 8 linfonodais e 8
pulmonares) e 10 nevos compostos.Todas as metástases cutâneas e
linfonodais e um caso de metástase pulmonar têm melanoma primário
incluído no TMA. As sete amostras restantes foram incluídas para possibilitar
a análise comparativa de expressão das proteínas estudadas entre os
diferentes grupos de tumor metastático.
Confeccionou-se 100 lâminas a partir do bloco receptor, em cortes
seqüênciais de 6 µm. As lâminas 01, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 foram coradas
com Hematoxilina e Eosina para controle do material incluído. Através de
mapa construído em panilha Excel®, com identificação detalhada de cada
cilindro, é possível a localização precisa de cada caso no bloco e lâminas do
TMA.
21
3.5 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
Estudaram-se os seguintes marcadores biológicos em lâminas obtidas
de TMA de melanomas extensivo superficiais invasivos com espessura
maior que 1,0 mm e metástases, e em cortes histológicos convencionais de
melanomas in situ e melanomas extensivos superficiais finos:
1. Anti p16
ink4a
- clone DCS-50 1/h4 Oncogene cat NA29, na diluição de
1/40
2. Anti-ciclina D1 – mouse anti-human - clone DCS-6 Dako cat. M7155,
na diluição de 1/300
3. Anti-Cdk4 - mouse anti-human - Santa Cruz – cat. SC-260, na
diluição de 1/100
4. Anti pRb - Anticorpo mouse anti-human clone Rb1 M7131 – Dako, na
diluição de 1/50
5. Anti p53 – clone D07, DAKO, código m7001, na diluição de 1/100
6. Anti-p21
waf-1
(Ab-1), clone EA10 – Oncogene cat 0p64T, na diluição de
1/30.
Para cada anticorpo foram selecionadas 2 lâminas de TMA, distantes
entre si pelo menos 10 cortes (aproximadamente 60 micras) e 1 lâmina para
cada caso a ser estudado em cortes convencionais. Então, para cada caso
incluído no TMA, estudou-se 2 amostras em duplicata em níveis diferentes.
22
3.5.1 Protocolo de Reações
As lâminas foram previamente tratadas com 3-aminopropiltrietoxi-
silano (Sigma, A-3648, USA) e deixadas por 24 horas em estufa a 60°C.
Foram submetidas a desparafinização em xilol a 60°C por 20 minutos e
então xilol à temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente foi
realizada a preparação das lâminas através de passagens sucessivas em
etanol a cada 30 segundos (100%, 95% e 70%) e então lavagem em água
corrente. As lâminas foram então submetidas à recuperação antigênica pelo
calor, utilizando-se panela de pressão (Eterna® , Nigro) e solução tampão
citrato 10 mM pH 6,0. A seguir, realizou-se o bloqueio da peroxidase
endógena com solução de peróxido de hidrogênio a 3% (água oxigenada 10
vol.), com quatro trocas de 5 minutos cada, seguida de lavagens com
solução salina tamponada com fosfatos (PBS - phosphate buffered saline –
10 mM e pH 7,2) por 5 minutos. Incubaram-se as lâminas com o anticorpo
primário diluído em título pré-estabelecido, em tampão PBS, contendo
albumina bovina (BSA) a 1% (SIGMA, A9647, USA) e azida sódica (NaN
3
) a
0,1%, por 18 horas, a 4ºC, em câmara úmida. Após a incubação, lavaram-se
as lâminas em tampão PBS com três trocas de 3 minutos cada. Iniciou-se,
então, a incubação das lâminas com o anticorpo secundário biotinilado-
reagente C (Biotinylated goat anti-mouse/rabbit Ig) do kit
StreptABComplex/HRP Duet (mouse/rabbit) (Dako A/S, K492, Denmark) no
título pré-estabelecido de 1:200, diluído em PBS, por 30 minutos a 37°C e
posterior lavagem em tampão PBS com três trocas de 3 minutos cada.
Incubou-se, então, o complexo reagente A (Streptavidin) no título pré-
23
estabelecido de 1:200 e reagente B (Biotinylated Peroxydase) no título pré-
estabelecido de 1:200, diluído em PBS, por 30 minutos a 37°C e posterior
lavagem em tampão PBS com três trocas de 3 minutos cada. As lâminas
foram então incubadas em solução substrato 3,3’ diaminobenzidine
tetrahydrochloride (DAB) 60mg%(Sigma, D-5637 USA), 1mL de
dimetilsulfóxido (DMSO), 1mL de água oxigenada 6%, 100mL de PBS, por 5
minutos a 37°C, ao abrigo da luz. Após a observação do desenvolvimento do
precipitado castanho, as lâminas foram lavadas em água corrente e água
destilada por 3 minutos e contracoradas com Hematoxilina de Harris (Merek)
por 1 minuto. Seguiu-se, então, a desidratação das lâminas em etanol e xilol
e subseqüente montagem das mesmas para a leitura. As reações foram
acompanhadas de controle positivo, em tecido sabidamente positivo para o
anticorpo testado, e controle negativo, realizado pela omissão do anticorpo
primário.
3.5.2 Leitura das Lâminas
A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico comum.
Para os espécimes incluídos no TMA, avaliou-se quatro amostras de cada
caso. Considerou-se representativa a amostra que contivesse neoplasia (ou
nevo) em pelo menos 25% do cilindro e expressou-se o resultado final como
a média das contagens daquelas consideradas representativas. Para todos
os anticorpos estudados considerou-se a marcação nuclear. Na análise de
Cdk4, considerou-se também a marcação citoplasmática. Para os casos que
apresentavam grande quantidade de melanina, utilizou-se lâminas
24
comparativas do mesmo corte, onde na reação imunoistoquímica foi omitido
o anticorpo primário, caracterizando um controle negativo chamado de BSA
(Figuras 1 e 2).
25
Legenda: A) controle negativo BSA de melanoma invasivo com grande quantidade de
melanina. B) ausência de expressão nuclear de p16 onde se visualiza os núcleos com o
mesmo aspecto do controle negativo (A). TMA (400X).
Figura 1 - Demonstração da comparação entre a expressão nuclear do
marcador no tumor e o controle negativo BSA.
A
B
26
Legenda: A) controle negativo BSA de melanoma invasivo com grande quantidade de
melanina. B) expressão nuclear de p53 onde as setas indicam os núcleos positivos, que não
são vistos no controle negativo (A). TMA (400X).
Figura 2 - Demonstração da comparação entre a expressão nuclear do
marcador no tumor e o controle negativo BSA.
B
A
27
Padronização da Leitura
Marcação Nuclear
Utilizou-se método semi-quantitativo considerando-se a proporção de
células dentro do tumor com positividade nuclear. O ponto de corte para
cada anticorpo foi determinado através de dados da literatura e está
representado no Quadro 3 (REED et al. 1995; MAELANDSMO et al. 1996a;
SPARROW et al. 1998; KARJALAINEN et al. 1999; FLORENES et al. 2000;
KLAES et al. 2001; TANAKA et al. 2001; ALONSO et al. 2004).
AC NEGATIVO POSITIVO
p16 < 5% ≥ 5%
Ciclina D1
< 5%
≥ 5%
CDK 4
< 5%
≥ 5%
pRb
< 10%
≥ 10%
p53
< 10%
≥ 10%
p21
< 10%
≥ 10%
Quadro 3 - Determinação de positividade para os anticorpos estudados, de
acordo com a proporção de células tumorais com marcação nuclear.
Marcação Citoplasmática
Realizou-se a análise da marcação citoplasmática apenas para o
anticorpo anti-Cdk4, utilizando-se método semi-quantitativo e considerando-
28
se a intensidade da marcação e a proporção de células tumorais marcadas,
como mostra a Quadro 4 e baseado em dados de literatura (SOINI et al.
2001; AN et al. 1999; BACHMANN et al. 2004). A pontuação final foi
determinada através da soma dos escores de intensidade e proporção.
Foram considerados positivos os casos com soma de escores final maior
que 4.
Cdk4 - marcação citoplasmática
Intensidade Proporção de células marcadas
0 = negativo 0 = negativo
1 = fraca 1 = 1 a 10%
2 = moderada 2 = 11 a 50%
3 = forte 3 = mais de 50%
Quadro 4 - Metodologia de determinação dos escores para análise de
marcação citoplasmática do anticorpo anti-Cdk4.
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para avaliação da relação entre as variáveis histológicas e expressão
dos marcadores estudados foi utilizado o teste de associação qui-quadrado
ou teste exato de Fisher, quando pelo menos uma das freqüências
esperadas foi menor que 5. A análise de sobrevida foi realizada através do
método de Kaplan-Meier e para comparação das curvas utilizou-se o teste
de log-rank.
29
Para a comparação da expressão dos diferentes marcadores nos
pares de amostras de tumores primários e tumores metastáticos, foi
utilizado, quando possível, o teste de McNemar.
Para todos os testes estatísticos, estabeleceu-se erro α = 5%, ou
seja, os resultados dos testes foram considerados estatisticamente
significativos quando p < 0,05.
Para as análises de sobrevida foram excluídos os casos de melanoma
in situ e para a análise comparativa de expressão entre tumores primários e
metastáticos foram excluídos os tumores primários correspondentes às
metástases incluídas no estudo.
Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa (CEP)
do Hospital do Câncer em 04/02/2003 (CEP – nº 465/03)
30
4 RESULTADOS
4.1 ESTATÍSTICA DESCRITIVA
Dos 136 pacientes selecionados, houve 81 (59,6%) do sexo feminino
e 55 (40,4%) do sexo masculino, com média de idade ao diagnóstico de
52,57 anos, variando de 14 a 89 anos. O tumor primário localizou-se no
tronco em 64 pacientes (47,1%), nas extremidades em 60 pacientes (44,1%)
e na região de cabeça e pescoço em 12 pacientes (8,8%). Houve
predomínio dos estadios IA e IB ao diagnóstico, como mostra a Tabela 2.
Dos 116 melanomas invasivos, 13 mostraram crescimento radial (11,2%) e
103 crescimento vertical (88,8%). Apenas 1 paciente referiu história familiar
de melanoma e em 107 pacientes esta informação não estava disponível. Os
outros 28 pacientes negaram antecedentes familiares de melanoma. O
tempo médio de acompanhamento dos pacientes foi de 59,67 meses,
variando de 5,63 a 391,55 meses, com 10,3% de perda de seguimento (12
pacientes).
31
Tabela 2 - Distribuição dos pacientes com melanoma cutâneo extensivo
superficial de acordo com o estadiamento ao diagnóstico segundo o AJCC
2002.
Estádio Nº de casos (%)
0 20 (14,7)
IA 40 (29,4)
IB 29 (21,3)
IIA 15 (11,0)
IIB 12 (8,8)
IIC 6 (4,4)
IIIA 8 (5,9)
IIIB 4 (2,9)
IV 2 (1,5)
TOTAL
136 (100)
p16
Das 136 amostras de tumores primários, foi possível a análise da
expressão de p16 em 125 casos. Os 11 casos restantes não apresentaram
material suficiente para análise (1 melanoma fino, 8 melanomas de 1,01 a
2mm e 2 melanomas de 2,01 a 4mm). Dos 10 nevos estudados, foi possível
a análise em 8 casos. Em todos os 29 casos de tumor metastático, a análise
de expressão de p16 foi realizada com sucesso. Do total de 162 casos
analisados, incluindo tumor primário, metastático e nevos, houve
positividade em 3,1% (5 casos). Todos os casos positivos correspondiam a
tumores com espessura menor ou igual a 1,0 mm, incluindo os melanomas
in situ, representando 4% dos tumores primários analisados. Todos os todos
os nevos, melanomas invasivos acima de 1,0 mm e todos os tumores
metastáticos foram negativos para p16 (Tabela 3).
32
Tabela 3
33
Legenda: A) melanoma in situ, onde nota-se a positividade nuclear também na epiderme
normal. As setas evidenciam os núcleos positivos das células tumorais. B) melanoma fino.
As setas indicam alguns dos núcleos positivos. Cortes convencionais (400X).
Figura 3 - Expressão nuclear de p16.
B
A
34
Ciclina D1
Das 136 amostras de tumores primários, foi possível a análise da
expressão de ciclina D1 em 125 casos. Os 11 casos restantes não
apresentaram material suficiente para análise (2 melanomas in situ, 3
melanomas finos, 4 melanomas de 1,01 a 2mm e 2 melanomas de 2,01 a
4mm). Dos 10 nevos estudados, foi possível a análise em 8 casos. Em todos
os 29 casos de tumor metastático, a análise de expressão de ciclina D1 foi
realizada com sucesso. Do total de 162 casos analisados, incluindo tumor
primário, metastático e nevos, houve positividade em 13% (21 casos). Os
tumores primários apresentaram positividade de 16% (20 casos) e as
metástases apresentaram positividade de 3,4% (1 caso). Nenhum dos nevos
apresentou positividade para ciclina D1 (Tabela 4).
Tabela 4 - Distribuição dos 162 casos analisados de acordo com a
positividade e negatividade nuclear para ciclina D1.
Ciclina D1 [número de casos / (%)]
negativos positivos
Melanomas in situ 14 (77,8) 4 (22,2)
Melanomas ≤ 1,0mm
31 (75,6) 10 (24,4)
Melanomas 1,01 – 2,0mm 25 (92,6) 2 (7,4)
Melanomas 2,01 – 4,0mm 20 (87,0) 3 (13,0)
Melanomas > 4,0mm
15 (93,8) 1 (6,3)
Metástases 28 (96,6) 1 (3,4)
Nevos 8 (100,0) -
TOTAL 141 (87,0) 21 (13,0)
35
A
B
Legenda: A) melanoma fino, onde se nota a positividade nuclear tanto na porção
invasiva quanto na porção intra-epidérmica do tumor. Corte convencional (400X). B)
melanoma invasivo acima de 1,0mm. TMA (400X).
Figura 4 - Expressão nuclear de ciclina D1.
36
Cdk4
Das 136 amostras de tumores primários, foi possível a análise da
expressão de Cdk4 em 124 casos. Os 12 casos restantes não apresentaram
material suficiente para análise (2 melanomas finos, 8 melanomas de 1,01 a
2mm e 2 melanomas de 2,01 a 4mm). Dos 10 nevos estudados, foi possível
a análise em 8 casos. Em todos os 29 casos de tumor metastático, a análise
de expressão de Cdk4 foi realizada com sucesso. Do total de 161 casos
analisados, incluindo tumor primário, metastático e nevos, houve
positividade nuclear em 51,6% (83 casos) e citoplasmática em 65,2% (105
casos). Nos tumores primários, houve positividade nuclear de 55,6% (69
casos) e citoplasmática de 71% (88 casos), enquanto nas metástases a
nuclear foi de 44,8% (13 casos) e a citoplasmática de 41,4% (12 casos).
Apenas 1 nevo apresentou positividade nuclear para Cdk4 (10%), enquanto
5 nevos apresentaram positividade citoplasmática para este anticorpo
(62,5%) (Tabela 5).
37
Tabela 5 - Distribuição dos 161 casos analisados de acordo com a
positividade e negatividade nuclear e citoplasmática para Cdk4.
Cdk4 [número de casos / (%)]
nuclear citoplasmático
negativos positivos negativos positivos
Melanomas in situ 12 (60,0) 8 (40,0) 5 (25,0) 15 (75,0)
Melanomas ≤ 1,0mm
28 (66,7) 14 (33,3) 8 (19,0) 34 (81,0)
Melanomas 1,01 – 2,0mm 1 (4,3) 22 (95,7) 7 (29,2) 17 (70,8)
Melanomas 2,01 – 4,0mm 8 (34,8) 15 (65,2) 12 (54,5) 10 (45,5)
Melanomas > 4,0mm
6 (37,5) 10 (62,5) 4 (25,0) 12 (75,0)
Metástases 16 (55,2) 13 (44,8) 17 (58,6) 12 (41,4)
Nevos 7 (87,5) 1 (12,5) 3 (37,5) 5 (62,5)
TOTAL 78 (48,4) 83 (51,6) 56 (34,8) 105 (65,2)
38
Legenda: A) melanoma in situ, onde se nota a positividade nuclear tanto na epiderme
normal quanto no tumor, que apresenta também positividade citoplasmática. Corte
convencional (400X). B) melanoma in situ. Verifica-se que as células tumorais apresentam
núcleos negativos com positividade citoplasmática. Corte convencional (400X).
Figura 5 - Expressão nuclear e citoplasmática de Cdk4.
A
B
39
Legenda: A) melanoma invasivo acima de 1,0mm.TMA (100X). B) maior aumento (400X)
do tumor representado em A, que mostra positividade nuclear e citoplasmática.
Figura 6 - Expressão nuclear e citoplasmática de Cdk4.
A
B
40
Legenda: A) metástase pulmonar de melanoma cutâneo. TMA (100X). B) maior aumento
(400X) da metástase representada em B, que mostra positividade nuclear e citoplasmática.
Figura 7 - Expressão nuclear e citoplasmática de Cdk4.
B
A
41
pRb
Das 136 amostras de tumores primários, foi possível a análise da
expressão de pRb em 124 casos. Os 12 casos restantes não apresentaram
material suficiente para análise (1 melanoma in situ, 1 melanoma fino, 8
melanomas de 1,01 a 2mm e 2 melanomas de 2,01 a 4mm). Dos 10 nevos
estudados, foi possível B(is-5.6(e)10.6(em( )-5.38( )-10.6cs-5.6a)30.2s(o)-7.4s.,)6.6( )-10.6Em( )-5.3todpo( )-5.3sos29( )-10.6cs-5.6a(o)-7.4ss de
metastáuticvno,laaise ldeexpaessãaelailal cs m
42
Legenda: A) melanoma in situ. As setas indicam núcleos com positividade. Corte
convencional (400X). B) melanoma fino. Verifica-se área com presença de núcleos positivos
e negativos. Corte convencional (400X).
Figura 8 - Expressão nuclear de pRb.
B
A
43
Legenda: A) melanoma invasivo acima de 1,0mm.TMA (100X). B) maior aumento (400X)
do tumor representado em A, evidenciando positividade nuclear.
Figura 9 - Expressão nuclear de pRb.
A
B
44
Legenda: A) metástase cutânea de melanoma cutâneo, representando mais de 25% do
cilindro. TMA (100X). B) maior aumento (400X) da metástase representada em A, que
mostra positividade nuclear.
Figura 10 - Expressão nuclear de pRb.
A
B
45
p53
Das 136 amostras de tumores primários, foi possível a análise da
expressão de p53 em 125 casos. Os 11 casos restantes não apresentaram
material suficiente para análise (1 melanoma fino, 8 melanomas de 1,01 a
2mm e 2 melanomas de 2,01 a 4mm). Dos 10 nevos estudados, foi possível
a análise em 8 casos. Em todos os 29 casos de tumor metastático, a análise
de expressão de p53 foi realizada com sucesso. Do total de 162 casos
analisados, incluindo tumor primário, metastático e nevos, houve
positividade em 34% (55 casos). Os tumores primários apresentaram
positividade de 32,8% (41 casos) e as metástases apresentaram
positividade de 44,8% (13 casos). Os nevos apresentaram positividade para
p53 de 12,5% (1 caso) (Tabela 7).
Tabela 7 - Distribuição dos 162 casos analisados de acordo com a
positividade e negatividade nuclear para p53.
p53 [número de casos / (%)]
negativos positivos
Melanomas in situ 17 (85,0) 3 (15,0)
Melanomas ≤ 1,0mm
36 (83,7) 7 (16,3)
Melanomas 1,01 – 2,0mm 13 (56,5) 10 (43,5)
Melanomas 2,01 – 4,0mm 10 (43,5) 13 (56,5)
Melanomas > 4,0mm
8 (50,0) 8 (50,0)
Metástases 16 (52,2) 13 (44,8)
Nevos 7 (87,5) 1 (12,5)
TOTAL 107 (66,0) 55 (34,0)
46
Legenda: A) melanoma in situ. As setas indicam núcleos com positividade. Nota-se que a
epiderme normal também apresenta positividade nuclear. Corte convencional (400X). B)
melanoma fino. Verifica-se positividade nuclear tanto na porção invasiva quanto na porção
intra-epidérmica do tumor. Corte convencional (400X).
Figura 11 - Expressão nuclear de p53.
B
A
47
Legenda: A) melanoma invasivo acima de 1,0mm.TMA (100X). B) maior aumento (400X)
do tumor representado em A, evidenciando positividade nuclear.
Figura 12 - Expressão nuclear de p53.
A
B
48
Legenda: A) metástase linfonodal de melanoma cutâneo. TMA (100X). B) maior aumento
(400X) da metástase representada em A, que mostra positividade nuclear.
Figura 13 - Expressão nuclear de p53.
A
B
49
p21
Das 136 amostras de tumores primários, foi possível a análise da
expressão de p21 em 128 casos. Os 8 casos restantes não apresentaram
material suficiente para análise (1 melanoma fino, 5 melanomas de 1,01 a
2mm e 2 melanomas de 2,01 a 4mm). Dos 10 nevos estudados, foi possível
a análise em 8 casos. Em todos os 29 casos de tumor metastático, a análise
de expressão de p21 foi realizada com sucesso. Do total de 165 casos
analisados, incluindo tumor primário, metastático e nevos, houve
positividade em 34,5% (57 casos). Os tumores primários apresentaram
positividade de 36,7% (47 casos) e as metástases apresentaram
positividade de 34,5% (10 casos). Nenhum dos nevos apresentou
positividade para p21 (Tabela 8).
Tabela 8 - Distribuição dos 165 casos analisados de acordo com a
positividade e negatividade nuclear para p21.
p21 [número de casos / (%)]
negativos positivos
Melanomas in situ 15 (75,0) 5 (25,0)
Melanomas ≤ 1,0mm
32 (74,4) 11 (25,6)
Melanomas 1,01 – ,02mm 15 (57,7) 11(42,3)
Melanomas 2,01 – 4,0mm 11 (47,8) 12 (52,2)
Melanomas > 4,0mm
8 (50,0) 8 (50,0)
Metástases 19 (65,5) 10 (34,5)
Nevos 8 (100,0) -
TOTAL 108 (65,5) 57 (34,5)
50
Legenda: A) melanoma in situ, positividade nuclear. Corte convencional (400X). B)
melanoma fino, positividade nuclear. Corte convencional (400X).
Figura 14 - Expressão nuclear de p21.
A
B
51
Legenda: A) melanoma invasivo acima de 1,0mm.TMA (100X). B) maior aumento (400X)
do tumor representado em A, evidenciando positividade nuclear.
Figura 15 - Expressão nuclear de p21.
A
B
52
4.2 ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DOS
MARCADORES BIOLÓGICOS E ESPESSURA DO TUMOR
O comportamento biológico dos melanomas finos se mostrou muito
semelhante ao comportamento dos melanomas in situ, quanto à expressão
dos marcadores estudados. Da mesma forma, os melanomas invasivos
acima de 1,0 mm também apresentaram comportamento semelhante entre
si. Assim sendo, optou-se pelo agrupamento dos melanomas de
comportamento semelhante, estudando-se 2 grupos de tumores primários:
melanomas com espessura menor ou igual a 1,0 mm (in situ e finos) e
melanomas com espessura maior que 1,0 mm.
p16
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a
espessura do tumor primário e a expressão de p16 (p = 0,058). Os 5 únicos
casos com positividade para este anticorpo representavam melanomas com
espessura menor ou igual a 1,0mm (positividade de 7,9% para este grupo de
melanomas). Nenhum dos melanomas invasivos com espessura maior que
1,0mm apresentou positividade para p16 (Tabela 9).
53
Tabela 9 - Distribuição dos 125 casos de melanomas primários analisados
de acordo com a positividade para p16 e espessura do tumor.
p16 [número de casos / (%)]
Espessura do tumor (mm)
Negativos Positivos
TOTAL
≤ 1,0
58 (92,1) 5 (7,9) 63 (50,4)
> 1,0 62 (100,0) - 62 (49,6)
TOTAL
120 (96,0) 5 (4,0) 125 (100,0)
Ciclina D1
Foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a
espessura do tumor primário e a expressão de ciclina D1 com p = 0,026. Os
melanomas com espessura menor ou igual a 1,0mm apresentaram
positividade de 23,7% e os melanomas acima de 1,0mm de 9,1% (Tabela
10).
Tabela 10 - Distribuição dos 125 casos de melanomas primários analisados
de acordo com a positividade para ciclina D1 e espessura do tumor.
Ciclina D1 [número de casos / (%)]
Espessura do tumor (mm)
Negativos Positivos
TOTAL
≤ 1,0
45 (76,3) 14 (23,7) 59 (47,2)
> 1,0 60 (90,9) 6 (9,1) 66 (52,8)
TOTAL
105 (84,0) 20 (16,0) 125 (100,0)
54
Cdk4
Tanto a expressão nuclear quanto a expressão citoplasmática de
Cdk4 mostrou associação estatisticamente significativa com a espessura do
tumor primário (p < 0,001 e p = 0,048, respectivamente). Os melanomas com
espessura menor ou igual a 1,0mm apresentaram positividade nuclear de
35,5% e citoplasmática de 79%. Os melanomas com espessura acima de
1,0mm apresentaram positividade nuclear de 78,5% e citoplasmática de
62,9% (Tabelas 11 e 12).
Tabela 11 - Distribuição dos 124 casos de melanomas primários analisados
de acordo com a positividade nuclear para Cdk4 e espessura do tumor.
Cdk4 nuclear [número de casos / (%)]
Espessura do tumor (mm)
Negativos Positivos
TOTAL
≤ 1,0
40 (64,5) 22 (35,5) 62 (50,0)
> 1,0 15 (24,2) 47 (75,8) 62 (50,0)
TOTAL
55 (44,4) 69 (55,6) 124 (100,0)
Tabela 12 - Distribuição dos 124 casos de melanomas primários analisados
de acordo com a positividade citoplasmática para Cdk4 e espessura do
tumor.
Cdk4 citoplasmática [número de casos / (%)]
Espessura do tumor (mm)
Negativos Positivos
TOTAL
≤ 1,0
13 (21,0) 49 (79,0) 62 (50,0)
> 1,0 23 (37,1) 39 (62,9) 62 (50,0)
TOTAL
36 (29,0) 88 (71,0) 124 (100,0)
55
pRb
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a
espessura do tumor primário e a expressão de pRb (p = 0,562). Os
melanomas com espessura menor ou igual a 1,0mm apresentaram
positividade de 33,9% e os melanomas com espessura acima de 1,0mm de
29,0% (Tabela 13).
Tabela 13 - Distribuição dos 124 casos de melanomas primários analisados
de acordo com a positividade para pRb e espessura do tumor.
pRb [número de casos / (%)]
Espessura do tumor (mm)
Negativos Positivos
TOTAL
≤ 1,0
41 (66,1) 21 (33,9) 62 (50,0)
> 1,0 44 (71,0) 18 (29,0) 62 (50,0)
TOTAL
85 (68,5) 39 (31,5) 124 (100,0)
p53
A expressão de p53 nos tumores primários mostrou associação
estatisticamente significativa com a espessura do tumor (p < 0,001). Os
melanomas com espessura menor ou igual a 1,0mm apresentaram
positividade de 15,9% e os melanomas com espessura acima de 1,0mm de
50,0% (Tabela 14).
56
Tabela 14 - Distribuição dos 125 casos de melanomas primários analisados
de acordo com a positividade para p53 e espessura do tumor.
p53 [número de casos / (%)]
Espessura do tumor (mm)
Negativos Positivos
TOTAL
≤ 1,0
53 (84,1) 10 (15,9) 63 (50,4)
> 1,0 31 (50,0) 31 (50,0) 62 (49,6)
TOTAL
84 (67,2) 41 (32,8) 125 (100,0)
p21
A expressão de p21 nos tumores primários mostrou associação
estatisticamente significativa com a espessura do tumor (p = 0,009).Os
melanomas com espessura menor ou igual a 1,0mm apresentaram
positividade de 25,4% e os melanomas com espessura acima de 1,0mm de
47,7% (Tabela 15).
Tabela 15 - Distribuição dos 128 casos de melanomas primários analisados
de acordo com a positividade para p21e espessura do tumor.
p21 [número de casos / (%)]
Espessura do tumor (mm) Negativos Positivos TOTAL
≤ 1,0
47 (74,6) 16 (25,4) 63 (49,2)
> 1,0 34 (52,3) 31 (47,7) 65 (50,8)
TOTAL
81 (63,3) 47 (36,7) 128 (100,0)
57
4.3 ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DOS
MARCADORES BIOLÓGICOS E ULCERAÇÃO
Dos 116 tumores primários invasivos, 19 eram ulcerados (16,4%) e 97
não ulcerados (83,6%).
p16
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a
presença ou não de ulceração no tumor primário invasivo e a expressão de
p16 (p = 1,0). Todos os melanomas ulcerados foram negativos para p16 e os
melanomas não ulcerados apresentaram positividade de 3,4% (Tabela 16).
Tabela 16 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p16 e presença de ulceração.
p16 [número de casos / (%)]
Ulceração
Negativos Positivos
TOTAL
sim 17 (100,0) - 17 (16,2)
não 85 (96,6) 3 (3,4) 88 (83,8)
TOTAL
102 (97,1) 3 (2,9) 105 (100,0)
Ciclina D1
A expressão de ciclina D1 não mostrou associação estatisticamente
significativa com a presença ou não de ulceração na lesão primária dos
tumores invasivos (p = 0,069). Todos os melanomas ulcerados foram
58
negativos para ciclina D1 e os melanomas não ulcerados apresentaram
positividade de 17,8% (Tabela 17).
Tabela 17 - Distribuição dos 107 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para ciclina D1 e presença de
ulceração.
Ciclina D1 [número de casos / (%)]
Ulceração
Negativos Positivos
TOTAL
sim 17 (100,0) - 17 (15,9)
não 74 (82,2) 16 (17,8) 90 (84,1)
TOTAL
91 (85,0) 16 (15,0) 107(100,0)
Cdk4
Tanto a expressão nuclear quanto a expressão citoplasmática de
Cdk4 não mostrou associação estatisticamente significativa com a presença
ou não de ulceração na lesão primária dos melanomas invasivos (p = 0,275
e p = 0,969, respectivamente). Os melanomas ulcerados apresentaram
positividade nuclear e citoplasmática de 70,6%. Os melanomas não
ulcerados apresentaram positividade nuclear de 56,3% e citoplasmática de
70,1% (Tabelas 18 e19).
59
Tabela 18 - Distribuição dos 104 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade nuclear para Cdk4 e presença de
ulceração.
Cdk4 nuclear [número de casos / (%)]
Ulceração
Negativos Positivos
TOTAL
sim 5 (29,4) 12 (70,6) 17 (16,3)
não 38 (43,7) 49 (56,3) 87 (83,7)
TOTAL
43 (41,3) 61 (58,7) 104 (100,0)
Tabela 19 - Distribuição dos 104 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade citoplasmática para Cdk4 e
presença de ulceração.
Cdk4 citoplasmática [número de casos / (%)]
Ulceração
Negativos Positivos
TOTAL
sim 5 (29,4) 12 (70,6) 17 (16,3)
não 26 (29,9) 61 (70,1) 87 (83,7)
TOTAL
31 (29,8) 73 (70,2) 104 (100,0)
pRb
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a
presença ou não de ulceração no tumor primário invasivo e a expressão de
pRb (p = 0,569). Os melanomas ulcerados apresentaram positividade de
35,3% e os melanomas não ulcerados de 28,4% (Tabela 20)
60
Tabela 20 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para pRb e presença de ulceração.
pRb [número de casos / (%)]
Ulceração
Negativos Positivos
TOTAL
sim 11 (64,7) 6 (35,3) 17 (16,2)
não 63 (71,6) 25 (28,4) 88 (83,8)
TOTAL
74 (70,5) 31 (29,5) 105 (100,0)
p53
A expressão de p53 nos tumores primários não mostrou associação
estatisticamente significativa com a presença ou não de ulceração na lesão
primária dos melanomas invasivos (p = 0,308). Os melanomas ulcerados
apresentaram positividade de 47,1% e os melanomas não ulcerados de
34,1% (Tabela 21).
Tabela 21 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p53 e presença de ulceração.
p53 [número de casos / (%)]
Ulceração
Negativos Positivos
TOTAL
sim 9 (52,9) 8 (47,1) 17 (16,2)
não 58 (65,9) 30 (34,1) 88 (83,8)
TOTAL
67 (63,8) 38 (36,2) 105 (100,0)
61
p21
A expressão de p21 nos tumores primários invasivos não mostrou
associação estatisticamente significativa com a presença ou não de
ulceração (p = 1,0). Tanto os melanomas ulcerados quanto os melanomas
não ulcerados apresentaram positividade para p21 de 38,9% (Tabela 22).
Tabela 22 - Distribuição dos 108 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p21 e presença de ulceração.
p21 [número de casos / (%)]
Ulceração
Negativos Positivos
TOTAL
sim 11 (61,1) 7 (38,9) 18 (16,7)
não 55 (61,1) 35 (38,9) 90 (83,3)
TOTAL
66 (61,1) 42 (38,9) 108 (100,0)
4.4 ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DOS
MARCADORES BIOLÓGICOS E REGRESSÃO
Dos 116 melanomas primários invasivos, 23 mostraram regressão
(19,8%) e 93 não apresentaram esta característica histológica (80,2%).
p16
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a
presença ou não de regressão no tumor primário invasivo e a expressão de
62
p16 (p = 1,0). Todos os melanomas com regressão foram negativos para
p16 e os melanomas sem regressão apresentaram positividade de 3,5%
(Tabela 23).
Tabela 23 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p16 e presença de regressão.
p16 [número de casos / (%)]
Regressão
Negativos Positivos
TOTAL
sim 20 (100,0) - 20 (19,0)
não 82 (96,5) 3 (3,5) 85 (81,0)
TOTAL
102 (97,1) 3 (2,9) 105 (100,0)
Ciclina D1
A expressão de ciclina D1 não mostrou associação estatisticamente
significativa com a presença ou não de regressão na lesão primária dos
tumores invasivos (p = 0,494). Os melanomas com regressão apresentaram
positividade para ciclina D1 de 20,0% e os melanomas sem regressão de
13,8% (Tabela 24).
Tabela 24 - Distribuição dos 107 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para ciclina D1 e presença de
regressão.
Ciclina D1 [número de casos / (%)]
Regressão
Negativos Positivos
TOTAL
sim 16 (80,0) 4 (20,0) 20 (18,7)
não 75 (86,2) 12 (13,8) 87 (81,3)
TOTAL
91 (85,0) 14 (15,0) 107(100,0)
63
Cdk4
Tanto a expressão nuclear quanto a expressão citoplasmática de
Cdk4 não mostrou associação estatisticamente significativa com a presença
ou não de regressão na lesão primária dos melanomas invasivos (p = 0,659
e p = 0,195, respectivamente). Os melanomas com regressão apresentaram
positividade nuclear de 63,2% e citoplasmática de 57,9%. Os melanomas
sem regressão apresentaram positividade nuclear de 57,6% e citoplasmática
de 72,9% (Tabelas 25 e 26).
Tabela 25 - Distribuição dos 104 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade nuclear para Cdk4 e presença de
regressão.
Cdk4 nuclear [número de casos / (%)]
Regressão
Negativos Positivos
TOTAL
sim 7 (36,8) 12 (63,2) 19 (18,3)
não 36 (42,4) 49 (57,6) 85 (81,7)
TOTAL
43 (41,3) 61 (58,7) 104 (100,0)
Tabela 26 - Distribuição dos 104 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade citoplasmática para Cdk4 e
presença de regressão.
Cdk4 citoplasmática [número de casos / (%)]
Regressão
Negativos Positivos
TOTAL
sim 8 (42,1) 11 (57,9) 19 (18,3)
não 23 (27,1) 62 (72,9) 85 (81,7)
TOTAL
31 (29,8) 73 (70,2) 104 (100,0)
64
pRb
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a
presença ou não de regressão no tumor primário invasivo e a expressão de
pRb (p = 0,959). Os melanomas com regressão apresentaram positividade
de 30,0% e os melanomas sem regressão de 29,4% (Tabela 27).
Tabela 27 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para pRb e presença de regressão.
pRb [número de casos / (%)]
Regressão
Negativos Positivos
TOTAL
sim 14 (70,0) 6 (30,0) 20 (19,0)
não 60 (70,6) 25 (29,4) 85 (81,0)
TOTAL
74 (70,5) 31 (29,5) 105 (100,0)
p53
A expressão de p53 nos tumores primários invasivos não mostrou
associação estatisticamente significativa com a presença ou não de
regressão na lesão primária (p = 0,322). Os melanomas com regressão
apresentaram positividade de 26,3% e os melanomas sem regressão de
38,4% (Tabela 28).
65
Tabela 28 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p53 e presença de regressão.
p53 [número de casos / (%)]
Regressão
Negativos Positivos
TOTAL
sim 14 (73,7) 5 (26,3) 19 (18,1)
não 53 (61,6) 33 (38,4) 86 (81,9)
TOTAL
67 (63,8) 38 (36,2) 105 (100,0)
p21
A expressão de p21 nos tumores primários invasivos não mostrou
associação estatisticamente significativa com a presença ou não de
regressão (p = 0,280). Os melanomas com regressão apresentaram
positividade para p21 de 28,6% e os melanomas sem regressão de 41,4%
(Tabela 29).
Tabela 29 - Distribuição dos 108 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p21 e presença de regressão.
p21 [número de casos / (%)]
Regressão
Negativos Positivos
TOTAL
sim 15 (71,4) 7 (38,9) 21 (19,4)
não 51 (58,6) 36 (41,4) 87 (80,6)
TOTAL
66 (61,1) 42 (38,9) 108 (100,0)
66
4.5 ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DOS
MARCADORES BIOLÓGICOS E ÍNDICE MITÓTICO (IM)
Dos 116 melanomas primários invasivos estudados, o índice mitótico
foi de zero em 33 casos de (28,4%), de 1 a 6 em 61 casos (52,6%) e maior
que 6 em 22 casos (19,0%)
p16
Os 3 tumores primários invasivos positivos para p16 apresentaram
índice mitótico menor ou igual a 6. Todos os casos com IM > 6 foram
negativos para p16. Não foi possível a análise pelo teste de associação qui-
quadrado ou teste exato de Fisher, pois mais de uma das freqüências
esperadas foi menor que 5 e a tabela formada não correspondia a uma
tabela 2X2 (Tabela 30). Quando agrupados em melanomas com IM de 0 ou
IM maior ou igual a 1, não foi encontrada associação estatisticamente
significativa entre a expressão de p16 e o IM (p= 1,000). Os melanomas com
IM de zero apresentaram positividade de 3,6% e os melanomas com IM ≥ 1
de 2,6%.
67
Tabela 30 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p16 e índice mitótico (IM).
p16 [número de casos / (%)]
IM
Negativos Positivos
TOTAL
0 27 (96,4) 1 (3,6) 28 (26,7)
1 - 6 55 (96,5) 2 (3,5) 57 (54,3)
> 6 20 (100) - 20 (19,0)
TOTAL 102 (97,1) 3 (2,9) 105(100,0)
Ciclina D1
Apenas 1 caso com IM > 6 foi positivo para ciclina D1 (4,8%). Os
melanomas com IM de zero apresentaram positividade de 27,6% e os
melanomas com IM de 1-6 de 12,3%. Não foi possível a análise pelo teste
de associação qui-quadrado ou teste exato de Fisher, pois mais de uma das
freqüências esperadas foi menor que 5 e a tabela formada não correspondia
a uma tabela 2X2 (Tabela 31). Quando agrupados em melanomas com IM
de 0 ou IM maior ou igual a 1, foi encontrada associação estatisticamente
significativa entre a expressão de ciclina D1 e o IM (p= 0,025). Os
melanomas com IM de zero apresentaram positividade de 27,6% e os
melanomas com IM ≥ 1 de 10,3% (Tabela 32).
68
Tabela 31 - Distribuição dos 107 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para ciclina D1 e índice mitótico
(IM).
Ciclina D1 [número de casos / (%)]
IM
Negativos Positivos
TOTAL
0 21 (72,4) 8 (27,6) 29 (27,1)
1 - 6 50 (87,7) 7 (12,3) 57 (53,3)
> 6 20 (95,2) 1 (4,8) 21 (19,6)
TOTAL
91 (85,0) 16 (15,0) 107(100,0)
Tabela 32 - Distribuição dos 107 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para ciclina D1 e índice mitótico
(IM) negativo ou positivo.
Ciclina D1 [número de casos / (%)]
IM
Negativos Positivos
TOTAL
0 21 (72,4) 8 (27,6) 29 (27,1)
≥1 70 (89,7) 8 (10,3) 78 (72,9)
TOTAL
91 (85,0) 16 (15,0) 107(100,0)
Cdk4
Tanto a expressão nuclear quanto a expressão citoplasmática de
Cdk4 não mostrou associação estatisticamente significativa o índice mitótico
da lesão primária (p = 0,290 e p = 0,498, respectivamente). Os melanomas
com IM de zero apresentaram positividade nuclear de 46,4% e
citoplasmática de 64,3%. Os melanomas com IM de 1-6 apresentaram
positividade nuclear de 64,3% e citoplasmática de 69,6%. Os casos com IM
69
> 6 apresentaram positividade nuclear de 60,0% e citoplasmática de 80,0%
(Tabelas 33 e 34).
Tabela 33 - Distribuição dos 104 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade nuclear para Cdk4 e índice mitótico
(IM).
CDK 4 nuclear [número de casos / (%)]
IM
Negativos Positivos
TOTAL
0 15 (53,6) 13 (46,4) 28 (26,9)
1 - 6 20 (35,7) 36 (64,3) 56 (53,8)
> 6 8 (40,0) 12 (60,0) 20 (19,2)
TOTAL
43 (41,35) 61 (58,7) 105 (100,0)
Tabela 34 - Distribuição dos 104 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade citoplasmática para Cdk4 e índice
mitótico (IM).
CDK 4 citoplasmática [número de casos / (%)]
IM
Negativos Positivos
TOTAL
0 10 (35,7) 18 (64,3) 28 (26,9)
1 - 6 17 (30,4) 39 (69,6) 56 (53,8)
> 6 4 (20,00) 16 (80,0) 20 (19,2)
TOTAL
31 (29,8) 73 (70,2) 105 (100,0)
pRb
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre o
índice mitótico do tumor primário e a expressão de pRb (p = 0,500). Os
melanomas com IM de zero apresentaram positividade de 32,1% , os
70
melanomas com IM de 1-6 de 25,0% e os casos com IM > 6 apresentaram
positividade de 38,1% (Tabela 35).
Tabela 35 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para pRb e índice mitótico (IM).
pRb [número de casos / (%)]
IM
Negativos Positivos
TOTAL
0 19 (67,9) 9 (32,1) 28 (26,7)
1 - 6 42 (75,0) 14 (25,0) 56 (53,3)
> 6 13 (61,9) 8 (38,1) 21(20,0)
TOTAL
74 (70,5) 31 (29,5) 105 (100,0)
p53
A expressão de p53 nos tumores primários mostrou associação
estatisticamente significativa com o índice mitótico descrito na lesão primária
(p = 0,001). Os melanomas com IM de zero apresentaram positividade de
25,0% , os melanomas com IM de 1-6 de 28,6% e os casos com IM > 6
apresentaram positividade de 71,4% (Tabela 36).
71
Tabela 36 - Distribuição dos 105 casos de melanomas primários invasivos
analisados de acordo com a positividade para p53 e índice mitótico (IM).
p53 [número de casos / (%)]
IM
Negativos Positivos
TOTAL
0 21 (75,0) 7 (25,0) 28 (26,7)
1 - 6 40 (71,4) 16 (28,6) 56 (53,3)
> 6 6 (28,6) 15 (71,4) 21(20,0)
TOTAL
67 (63,8) 38 (36,2) 105 (100,0)
72
4.6 TUMOR METASTÁTICO
Em análise preliminar da expressão dos marcadores estudados nos
diferentes tipos de metástases, verificou-se a necessidade do agrupamento
em metástases cutâneas e não cutâneas, incluindo-se neste último grupo, as
metástases linfonodais e pulmonares.
p16
Todos os tumores metastáticos foram negativos para p16. Não foi
encontrada diferença estatisticamente significativa entre a expressão de p16
nos tumores primários quando comparados aos tumores metastáticos (p=
0,584), como mostra a Tabela 38. Quando comparado o tumor primário à
sua metástase cutânea correspondente ou à sua metástase linfonodal,
verificou-se que a expressão de p16 foi exatamente a mesma nos dois
grupos.
Tabela 38 - Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de p16.
p16 [número de casos / (%)]
Tumor
Negativos Positivos
TOTAL
primário 105 (95,5) 5 (4,5) 110 (79,1)
metastático 29 (100,0) - 29 (20,9)
TOTAL
134 (96,4) 5 (3,6) 139 (100,0)
73
Ciclina D1
Comparando-se a expressão de ciclina D1 entre os diferentes tipos de
metástases, não houve diferença estatisticamente significativa (p=0,448).
Também não foi encontrada diferença estatisticamente significativa na
comparação da expressão de ciclina D1 entre tumores primários e
metastáticos (p= 0,076), como mostra a Tabela 39. Quando comparado o
tumor primário à sua metástase cutânea correspondente ou à sua metástase
linfonodal, verificou-se que a expressão de ciclina D1 foi exatamente a
mesma nos dois grupos.
Tabela 39 - Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de ciclina D1.
Ciclina D1 [número de casos / (%)]
Tumor
Negativos Positivos
TOTAL
primário 89 (81,7) 20 (18,3) 109 (79,0)
metastático 28 (96,6) 1 (4,8) 29 (21,0)
TOTAL
117 (84,8) 21 (15,2) 138 (100,0)
Cdk4
Tanto a expressão nuclear quanto a expressão citoplasmática de
Cdk4 não mostrou diferença estatisticamente significativa nos diferentes
grupos de metástases (p= 0,379 e p= 0,774, respectivamente). Quando
comparados os tumores primários com os tumores metastáticos, a
expressão nuclear de Cdk4 não apresentou diferença estatisticamente
74
significativa (p= 0,449), ao contrário da expressão citoplasmática que foi
significativamente mais positiva nos tumores primários (p= 0,003), como
mostram as Tabelas 40 e 41. Quando comparados os pares de tumor
primário e metástase cutânea não foi encontrada diferença estatisticamente
significativa tanto na expressão nuclear quanto na expressão citoplasmática
de Cdk4 (p= 0,375 e p= 0,687, respectivamente).O mesmo ocorreu na
comparação dos pares de tumor primário e metástase linfonodal com p=
0,500 para a expressão nuclear e p= 1,000 para a expressão citoplasmática.
Tabela 40 - Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão nuclear de Cdk4.
Cdk4 nuclear [número de casos / (%)]
Tumor
Negativos Positivos
TOTAL
primário 52 (47,3) 58 (52,7) 110 (79,1)
metastático 16 (55,2) 13 (44,8) 29 (20,9)
TOTAL
68 (48,9) 71 (51,1) 139 (100,0)
Tabela 41 - Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão citoplasmática de Cdk4.
Cdk4 citoplasmática [número de casos / (%)]
Tumor
Negativos Positivos
TOTAL
primário 32 (29,1) 78 (70,9) 110 (79,1)
metastático 17 (58,6) 12 (41,4) 29 (20,9)
TOTAL
49 (35,3) 90 (64,7) 139 (100,0)
75
pRb
A expressão de pRb não mostrou diferença estatisticamente
significativa quando comparados os diferentes grupos de metástases (p=
0,183). Comparando-se a expressão de pRb nos tumores primários e
metastáticos não foi encontrada diferença estatisticamente significativa (p=
0,280) (Tabela 42). Os pares de tumor primário e metástase cutânea ou
metástase linfonodal não apresentaram diferença estatisticamente
significativa na expressão de pRb (p= 0,375 e p= 1,000, respectivamente).
Tabela 42 - Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de pRb.
pRb [número de casos / (%)]
Tumor
Negativos Positivos
TOTAL
primário 72 (69,1) 34 (30,9) 110 (79,1)
metastático 23 (79,3) 6 (20,7) 29 (20,9)
TOTAL
99 (71,2) 40 (28,8) 139 (100,0)
p53
Os diferentes grupos de metástases não apresentaram diferença na
expressão de p53 (p= 0,534). Os melanomas metastáticos não mostraram
diferença estatisticamente significativa na expressão de p53 quando
comparados aos melanomas primários (p= 0,131), como mostra a Tabela
43. Os pares de tumor primário e metástase cutânea ou metástase linfonodal
76
não apresentaram diferença estatisticamente significativa na expressão de
p53 (p= 1,000 em ambos os casos).
Tabela 43 - Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de p53.
p53 [número de casos / (%)]
Tumor
Negativos Positivos
TOTAL
primário 77(70,0) 33 (30,0) 110 (79,1)
metastático 16 (55,2) 13 (44,8) 29 (20,9)
TOTAL
93 (66,9) 46 (33,1) 139 (100,0)
p21
As metástases cutâneas apresentaram maior positividade para p21
quando comparadas às metástases não cutâneas (linfonodais e pulmonares)
(p= 0,016), como mostra a Tabela 44. Comparando-se a expressão de p21
nos tumores primários e metastáticos não foi encontrada diferença
estatisticamente significativa (p= 0,883) (Tabela 45). Quando comparado o
tumor primário à sua metástase cutânea correspondente ou à sua metástase
linfonodal, verificou-se que não houve diferença estatisticamente
significativa na expressão de p21 (p= 1,000 e p= 0,500, respectivamente).
77
Tabela 44 - Distribuição dos grupos de tumores metastásticos de acordo
com a expressão de p21.
p21 [número de casos / (%)]
Metástase
Negativos Positivos
TOTAL
cutânea 5 (38,5) 8 (61,5) 13 (44,8)
não cutânea 14 (87,5) 2 (12,5%) 16 (55,2)
TOTAL
19 (65,5) 10 (34,5) 29 (100,0)
Tabela 45 - Distribuição dos melanomas primários e metastásticos de
acordo com a expressão de p21.
p21 [número de casos / (%)]
Tumor
Negativos Positivos
TOTAL
primário 75(67,0) 37 (33,0) 112 (79,4)
metastático 19 (65,5) 10 (34,5) 29 (20,6)
TOTAL
94 (66,7) 47 (33,3) 141(100,0)
4.7 SOBREVIDA GLOBAL E LIVRE DE DOENÇA
A sobrevida global em 2 anos dos 116 pacientes com melanoma
invasivo analisados foi de 91,08% e em 5 anos de 85,58% (Figura 16A). A
sobrevida livre de doença destes pacientes em 2 anos foi de 86,06% e em 5
anos de 79,78% (Figura 16B). A nossa amostra não apresentou diferença na
sobrevida global ou livre de doença em relação ao sexo (p = 0,338; p=
0,388, respectivamente), localização da lesão primária (p = 0,123; p= 0,393,
respectivamente) ou à presença de regressão no tumor (p = 0,723; p= 0,883,
respectivamente).
78
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 16 - Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com melanoma invasivo.
Os pacientes com idade menor ou igual a 60 anos apresentaram
sobrevida global em 5 anos de 92,45% e sobrevida livre de doença em 5
anos de 85,33%. Os pacientes acima de 60 anos mostraram sobrevida
global em 5 anos de 69,83% e sobrevida livre de doença em 5 anos de
66.76%. A diferença foi estatisticamente significativa, tanto para sobrevida
global quanto para livre de doença (p < 0,001 e p= 0,018, respectivamente),
como mostra a Figura 17.
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 17 - Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com melanoma invasivo,
segundo idade.
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
B
A
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
≤ 60
> 60
p < 0,001
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
> 60
≤ 60
B
p = 0,018
A
79
Os melanomas finos apresentaram sobrevida global em 5 anos de
97,73% e sobrevida livre de doença em 5 anos de 97,73%. Nos melanomas
com espessura maior que 1,0mm a sobrevida global em 5 anos foi de
85,87%e a livre de doença no mesmo período de 76,61%. A diferença nas
taxas de sobrevida global e livre de doença, segundo a espessura do tumor,
foi estatisticamente significativa (p= 0,025 e p= 0,004, respectivamente),
como mostra a Figura 18.
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 18 - Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com melanoma invasivo,
segundo espessura do tumor.
Os melanomas não ulcerados apresentaram sobrevida global em 5
anos de 88,54% e sobrevida livre de doença no mesmo período de 83,64%.
Os melanomas ulcerados mostraram sobrevida global em 5 anos de 68,21%
e sobrevida livre de doença em 5 anos de 58,03% . A diferença nas taxas de
sobrevida foi estatisticamente significativa (p = 0,010 e p= 0,011), como
mostra a Figura 19.
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
≤ 1mm
> 1mm
p = 0,004
B
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
≤ 1mm
> 1mm
p = 0,025
A
80
p= 0,010
p= 0,011
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
B A
não
sim
não
sim
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 19 - Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com melanoma invasivo,
segundo presença de ulceração.
Os pacientes que tinham lesão primária com IM de zero mostraram
sobrevida global em 5 anos de 93,94% e sobrevida livre de doença em 5
anos de 84,85%. Os pacientes com IM de 1 a 6 mostraram sobrevida global
em 5 anos de 91,09% e livre de doença de 84,05% e os pacientes com IM
maior que 6 de 56,88% e 57,85%, respectivamente. A diferença nas taxas
de sobrevida encontradas para os diferentes IM foi estatisticamente
significativa com p < 0,001 para a sobrevida global e p= 0,034 para a
sobrevida livre de doença. (Figura 20).
81
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 20 - Curvas de sobrevida dos 116 pacientes com melanoma invasivo,
segundo o índice mitótico (IM).
p16
Os melanomas invasivos positivos para p16 (apenas 3 casos)
mostraram sobrevida global e livre de doença em 5 anos de 100%. Os
pacientes negativos para p16 apresentaram sobrevida global em 5 anos de
84,68% e livre de doença de 81,10%. A diferença nas taxas de sobrevida
global e livre de doença não foi estatisticamente significativa (p= 0,490; p=
0,429, respectivamente), como mostra a Figura 21.
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
82
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 21 - Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de p16.
Ciclina D1
Os melanomas primários invasivos com positividade para ciclina D1
apresentaram sobrevida global em 5 anos de 100% e os casos negativos de
82,55%, diferença que não se mostrou estatisticamente significativa (p=
0,056). Em relação à sobrevida livre de doença em 5 anos, esta diferença foi
estatisticamente significativa (p = 0,043). Nos melanomas primários
invasivos com positividade para ciclina D1 a sobrevida livre de doença em 5
anos foi de 100% e nos casos negativos foi de 76,51% (Figura 22). Quando
a comparação da sobrevida livre de doença em relação à expressão de
ciclina D1 foi feita em separado para os melanomas finos e melanomas
acima de 1,0mm, a diferença deixou de ser estatisticamente significativa.
Nos melanomas finos, os pacientes positivos para ciclina D1 mostraram
sobrevida livre de doença em 5 anos de 100% e os negativos de 96,77% (p=
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
negativo
positivo
B
p
= 0
,
429
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
negativo
positivo
A
p
= 0
,
490
83
0,570). Nos melanomas acima de 1,0mm os pacientes positivos para ciclina
D1 apresentaram sobrevida livre de doença em 5 anos de 100% e os
negativos de 65,98% (p= 0,139).
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 22 - Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de ciclina D1.
Cdk4
Os melanomas invasivos com positividade nuclear para Cdk4
mostraram sobrevida global em 5 anos de 84,86% e sobrevida livre de
doença de 80,21%. Os casos negativos para expressão nuclear de Cdk4
apresentaram sobrevida global em 5 anos de 85,61% e livre de doença de
85,77%. A diferença nas taxas de sobrevida global e livre de doença
segundo a expressão nuclear de Cdk4 não foi estatisticamente significativa
(p= 0,807 e p= 0,541, respectivamente) (Figuras 23A e 23B).
Os melanomas invasivos com positividade citoplasmática para Cdk4
mostraram sobrevida global em 5 anos de 88,47% e sobrevida livre de
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
B
p
=0
,
043
negativo
positivo
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
A
p
= 0
,
056
negativo
positivo
84
doença de 84,02%. Os casos negativos para expressão citoplasmática de
Cdk4 apresentaram sobrevida global em 5 anos de 76,44% e livre de doença
de 79,20%. A diferença nas taxas de sobrevida global e livre de doença
segundo a expressão citoplasmática de Cdk4 não foi estatisticamente
significativa (p= 0,112 e p= 0,605, respectivamente) (Figuras 23C e 23D).
Legenda: Expressão nuclear:
A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença. Expressão
citoplasmática: C) sobrevida global D) sobrevida livre de doença.
Figura 23 - Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de Cdk4.
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
C
p
= 0
,
112
negativo
positivo
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
A
p
= 0
,
807
negativo
positivo
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
B
p
= 0
,
541
negativo
positivo
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
D
p
= 0
,
605
negativo
positivo
85
pRb
Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa nas taxas
de sobrevida global e livre de doença para os casos de melanoma invasivo,
segundo a expressão de pRb (p= 0,213 e p= 0,998), como mostra a Figura
24. Os melanomas positivos para pRb apresentaram sobrevida global em 5
anos de 92,90% e livre de doença de 83,31%.Os melanomas negativos para
pRb apresentaram sobrevida global em 5 anos de 81,98% e livre de doença
de 82,58%.
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 24 - Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de pRb.
p53
A taxa de sobrevida global em 5 anos para os casos positivos para
p53 foi de 79,49% e para os casos negativos de 88,89% (p= 0,106), como
mostra a Figura 25A. A taxa de sobrevida livre de doença em 5 anos para os
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
A
p= 0,213
negativo
positivo
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
B
p= 0,998
negativo
positivo
86
melanomas positivos para p53 foi de 77,87% e para os melanomas
negativos de 84,06% (p= 0,353), como mostra a Figura 25B.
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 25 - Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de p53.
p21
Os melanomas invasivos com positividade para p21 mostraram
sobrevida global em 5 anos de 80,82% e sobrevida livre de doença de
71,84%. Os casos negativos para p21 apresentaram sobrevida global em 5
anos de 88,67% e livre de doença de 87,34%. A diferença nas taxas de
sobrevida global e livre de doença segundo a expressão nuclear de p21 não
foi estatisticamente significativa (p= 0,090 e p= 0,058, respectivamente),
como mostra a Figura 26. Quando a comparação da sobrevida livre de
87
estatisticamente não significativa. Nos melanomas finos, os pacientes
positivos para p21 mostraram sobrevida livre de doença em 5 anos de 100%
e os negativos de 96,88% (p= 0,557). Nos melanomas acima de 1,0mm os
pacientes positivos para p21 apresentaram sobrevida livre de doença em 5
anos de 61,29% e os negativos de 78,19% (p= 0,171).
Legenda: A) sobrevida global B) sobrevida livre de doença.
Figura 26 - Curvas de sobrevida dos pacientes com melanoma invasivo,
segundo expressão de p21.
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
A
p
= 0
,
090
negativo
positivo
tempo (meses)
60483624120
taxa de sobrevida
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
B
p
= 0
,
058
negativo
positivo
88
5 DISCUSSÃO
A variabilidade do comportamento biológico dos melanomas cutâneos
é apenas parcialmente explicada por fatores clínicos e histológicos, sendo
necessária a identificação de marcadores biológicos para a exata definição
dos diferentes grupos de pacientes em relação à evolução da doença. Os
eventos moleculares que determinam a gênese do melanoma cutâneo ainda
não estão completamente esclarecidos. As vias que controlam o ciclo celular
e apoptose são de fundamental importância na transformação maligna das
células e determinação da agressividade de diversas neoplasias. Em sua
fase de crescimento radial os melanomas podem apresentar deficiência da
via p16/pRb, o que determinaria um ganho em sua capacidade proliferativa.
Nesta fase sua sobrevivência depende da interação entre ceratinócitos e
melanócitos (SVIDERSKAYA et al. 2003). Para o desenvolvimento de
crescimento vertical e capacidade de produzir metástases seria necessária a
perda desta interação e poderia ser adquirida através de alterações
genéticas que determinariam a inibição da apoptose (SVIDERSKAYA et al.
2003). Deste modo, é também de grande importância o estudo da via p53
nos melanomas, incluindo o estudo da proteína p21.
O nosso estudo baseia-se na análise concomitante da expressão dos
componentes das vias p16/pRb e p53 em melanomas extensivos
superficiais.
89
Para a montagem do banco de dados, encontrou-se certa dificuldade
na seleção dos pacientes, pois muitos casos acompanhados em nosso
serviço não possuíam bloco da lesão primária disponível. Apesar disso, a
amostragem é composta por melanomas extensivos superficiais que cobrem
todo o espectro de distribuição dos melanomas cutâneos quanto à
profundidade, principal fator determinante do comportamento biológico
destes tumores. A amostragem neste estudo não revelou diferença em
relação ao sexo e abrange ampla faixa etária (14 a 89 anos) e todos os
estadios da doença. O tempo médio de acompanhamento foi ao redor de 5
anos (59,67 meses), com baixa taxa de perda de seguimento (10,3%).
A avaliação dos dados indica tratar-se de amostra que reproduz o
comportamento biológico habitual encontrado na literatura para melanomas
nos diversos estadios. Dentre estes dados, destacam-se as diferenças
significativas da sobrevida global e livre de doença em relação à idade,
espessura da neoplasia, ulceração e índice mitótico (BALCH et al. 2001a e
b; AZZOLA et al. 2003; BUSAM 2004; FRANCKEN et al. 2004; BARNHILL et
al. 2005; NAGORE et al. 2005). Embora vários trabalhos na literatura
indiquem que o índice mitótico seja relevante na avaliação do prognóstico de
melanomas, a falta de padronização na forma de contagem determinou que
o estadiamento atual para melanomas não incluísse esta variável (BALCH
CM et al. 2001a e b; AZZOLA et al. 2003; BUSAM 2004; FRANCKEN et al.
2004; BARNHILL et al. 2005; NAGORE et al. 2005). Nossos resultados
favorecem a inclusão deste dado como fator prognóstico, ressalvando-se
90
que a profundidade de Breslow possa ter influenciado como fator
preponderante no resultado estatístico.
O TMA proposto foi construído com sucesso, apresentando pequena
perda de material, situação mais comumente vista nos melanomas mais
finos (1,01 a 2,0mm), provavelmente por apresentarem menor volume de
tumor disponível para amostragem.
Dentre as dificuldades encontradas na leitura das lâminas, destaca-se
a grande quantidade de células carregadas de pigmento melânico em
algumas amostras, o que poderia alterar a interpretação na análise
imunoistoquímica. No entanto, a utilização de uma lâmina de controle
negativo apenas incubada com BSA permitiu evidenciar claramente
mudanças de intensidade na coloração imunoistoquímica. Além disto, como
a maioria das proteínas era de expressão nuclear, a influência do pigmento
melânico foi menos marcante.
A inclusão dos nevos melanocíticos no TMA foi proposta como
controle interno da expressão dos marcadores biológicos, em tecido não
neoplásico, e não com a finalidade de comparação com os melanomas
estudados. Surpreendeu-nos a ausência de expressão destas proteínas, à
exceção de Cdk4 citoplasmática em cinco nevos e Cdk4 nuclear e pRb em
apenas uma amostra.
91
Via p16/pRb
Expressão de p16
A proteína p16 age como supressor de tumor inibindo a fosforilação
de pRb ao ligar-se às ciclinas dependentes de quinase 4 e 6 (Cdk4 e 6). A
disfunção desta proteína leva à ausência de inibição das Cdks, resultando
em crescimento celular descontrolado, pela inativação de pRb, e
subseqüente desenvolvimento e progressão tumoral. É descrita também a
participação de p16 na senescência de melanócitos normais, processo
caracterizado pela perda da capacidade de proliferação após um número
limitado de divisões (SVIDERSKAYA et al. 2003). A disfunção das proteínas
responsáveis pela senescência celular seria o substrato através do qual as
células escapariam deste processo programado, aumentando a
probabilidade de transformação maligna (PIEPKORN 2000)
Neste estudo, praticamente todos os melanomas deixaram de
expressar p16. Apenas cinco casos foram positivos, todos representando
melanomas com espessura menor ou igual a 1,0 mm (2 melanomas in situ e
3 melanomas finos). Como a positividade para p16 foi muito baixa (4% dos
tumores primários), a amostra não teve poder estatístico para evidenciar
associação significativa com a espessura do tumor, ulceração, regressão e
índice mitótico. Todos os melanomas acima de 1,0 mm foram negativos para
p16, assim como todos os melanomas ulcerados, com regressão e com IM >
6.
92
A positividade de p16 em melanomas é descrita como variando de 20
a 90%, dependendo da metodologia e material utilizados (PAVEY et al.
2002). Diferentemente dos nossos dados, a maioria dos estudos mostra
maior grau de positividade nos melanomas menos agressivos e perda de
expressão p16 mais significativa nos melanomas mais profundos e nos
tumores metastáticos (REED et al. 1995; FLORES et al. 1996; SPARROW et
al. 1998; PAVEY et al. 2002; ALONSO et al. 2004; BACHMANN et al. 2004;
ZHANG e ROSDAHL 2004, 2005). Desta forma, a tendência é considerar a
perda de função de p16 como um evento tardio na transformação maligna
dos melanócitos, relacionado à progressão e capacidade de invasão tumoral
(REED et al. 1995; FLORES et al. 1996; SPARROW et al. 1998; PAVEY et
al. 2002; ALONSO et al. 2004; BACHMANN et al. 2004; ZHANG e
ROSDAHL 2004, 2005). A perda de expressão de p16 em nossos casos
ocorreu precocemente, pois apenas 2 dos 20 melanomas in situ
expressaram p16, mantendo a controvérsia já descrita na caracterização do
momento da ocorrência da alteração desta proteína nos melanomas
(PIEPKORN 2000).
Nenhum dos melanomas metastáticos apresentou expressão de p16,
não havendo diferença em relação à expressão nos tumores primários.
Apesar da perda de expressão de p16 ter sido um evento precoce na nossa
amostra, este evento manteve-se presente em toda a evolução dos
melanomas, desde os tumores primários mais agressivos até os tumores
metastáticos. Não foi encontrada diferença entre a expressão de p16 no
tumor e sua metástase correspondente. Considera-se que a perda ou
93
inativação de um dos alelos do gene codificador de p16 (CDKN2A) ocorra
precocemente no desenvolvimento tumoral dos melanomas e o segundo
alelo seria alterado ou perdido mais tardiamente, mantendo a disfunção da
proteína em todos os estágios da doença (PIEPKORN 2000).
Os pacientes com melanomas invasivos que expressaram p16
(apenas 3 casos) mostraram sobrevida global e livre de doença em 5 anos
de 100%. Da mesma forma que para as variáveis histológicas, o número de
pacientes com positividade para p16 não conferiu poder estatístico para que
a amostra identificasse diferenças nas taxas de sobrevida em relação à
expressão deste marcador.
Expressão de ciclina D1
A ciclina D1, juntamente com as ciclinas D2 e D3, é a primeira a ser
expressa na fase G1 do ciclo celular. Ao ligar-se à Cdk4, forma um complexo
que leva à inativação de pRb através de sua fosforilação. Este processo
permite que a célula prossiga para a fase S do ciclo celular, determinando
sua proliferação. As ciclinas D funcionam como sensores de fatores de
crescimento e estão ausentes em células quiescentes (PIEPKORN 2000).
São proteínas lábeis, com meia-vida curta e competem com a proteína p16
na ligação com as Cdks (PIEPKORN 2000).
A ciclina D1, em nosso estudo, foi expressa em 16% dos tumores
primários, estando significativamente mais expressa nos melanomas in situ e
finos (p= 0,026). Alguns estudos observaram que a expressão de ciclina D1
94
em melanomas extensivos superficiais primários varia de 53 a 67% dos
casos, não havendo diferença em relação à espessura do tumor
(FLORENES et al. 2000; GEORGIEVA et al. 2001). ALONSO et al. em 2004,
porém, observaram maior expressão de ciclina D1 na fase radial dos
melanomas primários, com diminuição da expressão na fase vertical,
sugerindo papel da ciclina D1 nas fases iniciais do desenvolvimento do
melanoma, ao contrário da proteína p16.
Não foi observada relação entre a expressão de ciclina D1 e a
presença de ulceração ou regressão, mas todos os melanomas ulcerados
foram negativos para ciclina D1. Os melanomas primários com IM ≥ 1
apresentaram menor positividade para ciclina D1 quando comparados aos
melanomas com IM = 0 (p= 0,025), indicando uma relação inversa entre a
presença de mitoses e a expressão de ciclina D1. Estes dados enfatizam a
importância da ciclina D1 nos estágios iniciais do melanoma, não se
relacionando, portanto, à progressão, invasão e agressividade do tumor.
A expressão de ciclina D1 nas metástases foi muito baixa (3,4%),
ficando prejudicada a análise estatística. Pelo teste exato de Fisher, os
tumores metastáticos não mostraram diferença na expressão de ciclina D1
em relação aos tumores primários (p= 0,076). Não houve diferença na
expressão entre as diferentes localizações de metástases e também entre
os tumores primários e suas respectivas metástases.
Os pacientes com melanomas positivos para ciclina D1 apresentaram
sobrevida global e livre de doença em 5 anos de 100%. Apesar da sobrevida
livre de doença ser maior nestes pacientes (p= 0,043), este dado não atingiu
95
significância estatística ao estudá-los separadamente quanto à espessura do
tumor, evidenciando a importância da medida de Breslow como fator
prognóstico nos melanomas cutâneos.
Expressão de Cdk4
A Cdk4 é uma das proteinoquinases atuantes na fase G1 do ciclo
celular. Quando ligada à ciclina D1 leva a fosforilação e inativação de pRb,
promovendo a proliferação celular. Em linhagens celulares de melanoma
cutâneo é descrita mutação que produz proteína Cdk4 mais resistente à
ligação com a proteína p16, dificultando a atuação deste supressor de tumor
(PAVEY et al. 2002).
Observou-se neste estudo que 71% dos tumores primários
apresentaram positividade citoplasmática para Cdk4 e 55,6% mostraram
positividade nuclear. A Cdk4 é descrita como fortemente expressa em 58%
dos melanomas (PIEPKORN 2000).
Tanto a expressão nuclear quanto a citoplasmática de Cdk4, neste
estudo, não mostrou associação com ulceração, regressão ou índice
mitótico. Os melanomas com espessura menor ou igual a 1,0 mm
apresentaram maior expressão citoplasmática de Cdk4 (p= 0,048) e os
melanomas com espessura acima de 1,0 mm apresentaram maior
expressão nuclear (p < 0,001). Os nossos dados diferem dos descritos na
literatura, que mostram maior expressão nuclear e citoplasmática de Cdk4
relacionada a melanomas finos e menos agressivos (BACHMANN et al.
96
2004). É descrita, ainda, associação entre a expressão aumentada de Cdk4
e maior expressão de ciclina D1 (MAELANDSMO et al.1996a), o que, em
nosso experimento, ocorreu apenas quando se avaliou a expressão
citoplasmática. Embora desconhecido o mecanismo, uma explicação para
nossos achados estaria relacionada a uma compartimentalização do
metabolismo da Cdk4, possívelmente iniciando sua produção no citoplasma
seguida de transporte ao núcleo. Desta forma, os melanomas menos
espessos expressariam em maior quantidade a proteína citoplasmática e
posteriormente, com a aquisição de outras mutações nos melanomas mais
espessos, com acúmulo de proteínas facilitadoras da sua produção ou
desequilíbrio nas vias metabólicas envolvidas, haveria aumento da
expressão nuclear de Cdk4.
Os tumores primários não mostraram diferença na expressão nuclear
de Cdk4 em relação aos tumores metastáticos e sim na expressão
citoplasmática que foi significativamente maior nos tumores primários (p=
0,003). Não houve diferença na expressão de Cdk4 nos diferentes tipos de
metástases ou entre os tumores primários e suas metástases
correspondentes. GEORGIEVA et al. (2001) observaram expressão
moderada de Cdk4 em melanomas, não havendo diferença entre tumores
primários e metastáticos ou associação com a espessura do tumor.
A expressão de Cdk4 não mostrou impacto na sobrevida global ou
livre de doença dos pacientes estudados.
97
Expressão de pRb
A proteína pRb é o ponto-chave no controle do ciclo celular durante a
fase G1. Em seu estado não fosforilado inibe a progressão para a fase S do
ciclo, recrutando o fator de transcrição E2F. Quando ocorre a sua
fosforilação pela ação do complexo ciclina D / Cdk, a proteína pRb dissocia-
se do fator de transcrição E2F e este pode, então, agir no núcleo da célula,
sendo sua presença necessária para que ocorra a replicação do DNA. A
inativação funcional de pRb pode ocorrer com aumento da expressão de
Cdk4 ou ciclina D1 ou pela perda da função inibitória de p16 (PIEPKORN
2000).
Os melanomas primários estudados mostraram positividade nuclear
de 31,4% para pRb, não havendo relação da expressão desta proteína com
nenhuma das variáveis estudadas. Os tumores metastáticos apresentaram
positividade de 20,7%. Não se observou diferença entre a expressão dos
tumores primários quando comparados aos metastáticos. Também não
houve diferença entre os diferentes tipos de metástases ou entre os tumores
primários e respectivas metástases. Vários estudos mostram que a
expressão de pRb está inalterada na maioria dos melanomas mostrando que
a inativação de pRb é um evento raro no desenvolvimento destes tumores
(MAELANDSMO et al. 1996a; PIEPKORN 2000).
A expressão de pRb não apresentou impacto na sobrevida global ou
livre de doença dos pacientes estudados, estando de acordo com os dados
encontrados por BACHMANN et al (2004).
98
Em suma, nossos dados indicam que a via p16 / pRb está alterada
nas diversas fases de desenvolvimento do melanoma. Nos melanomas in
situ e finos, predomina a expressão de ciclina D1 e Cdk4 citoplasmática com
baixa expressão de p16, enquanto nos melanomas acima de 1,0 mm,
predomina a expressão de Cdk4 nuclear, não havendo expressão de p16
(Figuras 27 e 28). Portanto, seja por perda da inibição exercida por p16, ou
por alteração do complexo ciclina D1 / Cdk4, através do aumento da
expressão de um de seus componentes, confere-se aos melanomas
cutâneos aumento da atividade proliferativa por inativação funcional de pRb,
mesmo que nossos dados não tenham evidenciado alteração marcante na
sua expressão.
Via p53
Expressão de p53
A proteína p53 é responsável pela manutenção da estabilidade do
genoma da célula. Na ocorrência de dano no DNA celular, p53 promove a
parada do ciclo celular na fase G1 através da indução de p21. Quando não
ocorre o reparo adequado do DNA, a proteína p53 induz apoptose celular,
através da indução de proteínas envolvidas neste processo como, por
exemplo, Bax. A proteína p53 normalmente está presente em pequenas
quantidades nos tecidos normais, não detectáveis através de
imunoistoquímica (HUSSEIN et al. 2003). A proteína p53 parece exercer
papel na senescência de melanócitos deficientes em p16 (SVIDERSKAYA et
al. 2003). A forma selvagem da proteína é de localização
99
predominantemente nuclear e age como supressora de tumor (HUSSEIN et
al. 2003). A proteína p53 está frequentemente mutada em diversos tipos de
células tumorais e estas mutações contribuem para a expansão clonal
celular e instabilidade genômica (WU et al. 2004). Os mecanismos de
inativação do gene codificador de p53 incluem diversas aberrações como
mutações pontuais, deleções e inserções que produzem proteínas truncadas
(BAE et al. 1996; SULAIMON e KITCHELL 2003). As taxas de mutações em
melanomas são descritas como variando de 10 a 30% (SVIDERSKAYA et al.
2003).
Os melanomas primários neste estudo apresentaram positividade
para p53 de 32,8%, sendo descrita na literatura expressão variando de 0 a
60% (HUSSEIN et al. 2003). A expressão de p53 foi maior nos melanomas
acima de 1,0 mm (p < 0,001), estando em concordância com dados da
literatura que definem a superexpressão de p53 com sendo um evento tardio
na gênese dos melanomas e estando relacionada à progressão tumoral
(PIEPKORN 2000; CZAJKOWSKI et al. 2002; HUSSEIN et al. 2003). A
expressão de p53 não mostrou associação com ulceração ou regressão,
porém foi significativa quando avaliado o IM, sendo a expressão maior nos
casos com IM > 6 (p= 0,001). Este dado poderia significar que a expressão
aumentada de p53 estivesse relacionada à maior agressividade do tumor ou
que o índice mitótico estaria aumentado em função da perda de atividade de
p53 na indução da apoptose. Porém, a expressão desta proteína não
mostrou associação com sobrevida global ou livre de doença. Além disso,
não houve diferença na expressão de p53 entre tumores primários e
100
metastáticos, entre as diferentes localizações de tumor metastático ou entre
o tumor primário e sua respectiva metástase. KARJALAINEN et al. em 1999,
observaram impacto da expressão de p53 na sobrevida livre de doença, mas
não foi verificada relação com a espessura do tumor.
Expressão de p21
A proteína p21 inibe a proliferação celular bloqueando a atividade do
complexo ciclina / Cdk ou ligando-se diretamente ao antígeno nuclear de
proliferação celular (PCNA), inibindo a ação da enzima DNA polimerase. A
ação de p21 está relacionada à sua ativação pela proteína p53, mas
linhagens celulares de melanoma mostraram mecanismo de ativação desta
proteína independente de p53 (KARJALAINEN et al. 1999; BEATTIE et al.
2005). Mutações no gene codificador de p21 são raras, tanto em melanomas
familiais quanto em melanomas esporádicos (HUSSEIN et al. 2003). É
descrito que a proteína p21 está presente tanto nos complexos Cdk ativos
quanto nos inativos, dependendo a sua ação da quantidade de moléculas
presentes no microambiente (MAELANDSMO et al. 1996b; CZAJKOWSKI et
al. 2002). Várias moléculas são necessárias para a inativação das Cdks e
pequenas quantidades de p21 podem funcionar como ativador destes
complexos (MAELANDSMO et al. 1996b; CZAJKOWSKI et al. 2002). Estas
características da proteína p21 determinam a heterogeneidade da expressão
do seu gene codificador.
101
Encontrou-se, neste estudo, expressão de p21 em 37,7% dos tumores
primários. A expressão de p21 é descrita como aumentada em melanomas
avançados quando comparada com a expressão em lesões benignas
(MAELANDSMO et al. 1996b; TROTTER et al. 1997; BALES et al. 1999).
Os melanomas acima de 1,0 mm apresentaram maior positividade
para p21 do que os melanomas menos espessos (p= 0,009). Os dados
descritos na literatura quanto à expressão de p21 e sua correlação com a
espessura do tumor são conflitantes. MAELANDSMO et al. em 1996b,
observaram maior expressão de p21 nos melanomas mais espessos.
TROTTER et al. em 1997, não evidenciaram relação da expressão de 21 e
espessura do tumor. KARJALAINEN et al. em 1999, verificaram o oposto,
mostrando melanomas finos com maior expressão de p21.
A maior expressão de p21 em melanomas mais avançados pode ser
induzida pela perda de expressão de outros inibidores de Cdks como, o p16,
e reflete mecanismo de feedback usado pelas células tumorais para tentar
controlar a proliferação celular (MAELANDSMO et al. 1996b). Esta
observação está de acordo com os nossos dados que mostram maior
expressão de p21 nos melanomas mais espessos quando estes não
expressaram p16.
A expressão de p21, em nossa amostra, não apresentou associação
102
às metástases, sugerindo que a perda da expressão de p21 esteja
relacionada com aquisição de fenótipo metastático. Em nosso estudo as
metástases não mostraram diferença na expressão de p21 em relação ao
tumor primário correspondente. Mas a expressão de p21 variou de acordo
com o tipo de metástase estudada, onde as metástases cutâneas
apresentaram maior positividade para p21 do que as metástases não
cutâneas (linfonodais e pulmonares) (p=0,016).
A expressão de p21 em nosso estudo não apresentou relação com a
sobrevida global ou livre de doença, dados concordantes com os observados
por MAELANDSMO et al. em 1996b. KARJALAINEN et al. em 1999
verificaram menor expressão desta proteína com impacto na sobrevida livre
de doença.
Os nossos resultados mostram que a via p53 também pode estar
alterada nos melanomas cutâneos. A expressão aumentada de p21 nos
melanomas mais espessos coincide com a maior expressão de p53,
confirmando a relação entre estas duas proteínas (Figuras 27 e 28).
As vias p16 / pRb e p53 parecem ter ação combinada, observando-se
que o aumento da expressão de p21 nos melanomas mais espessos pode
estar relacionado à perda de expressão de p16 e aumento de expressão de
Cdk4 nuclear, representando mecanismo de feedback na tentativa de
controlar a proliferação celular (Figuras 27 e 28).
Parte das análises estatísticas relacionadas à expressão das
proteínas nos pares de tumor primário e metastático e curvas de sobrevida
global e livre de doença, foi prejudicada pelo número de pacientes que
103
muitas vezes não conferiu poder estatístico para que a amostra revelasse
alterações nestes dados. Estudos futuros, com maior amostragem, poderão
permitir melhor comparação dos dados.
Nosso estudo baseia-se na avaliação da expressão de proteínas
através de imunoistoquímica, indicando presença ou não destas moléculas.
No entanto, não reflete a condição do gene, do RNA mensageiro ou da
proteína transcrita. Desta forma, os resultados desta pesquisa necessitariam
ser confirmados através de estudos moleculares mais específicos.
Figura 27
104
6 CONCLUSÕES
1. O banco de dados criado parece reproduzir o comportamento
biológico habitual encontrado na literatura para melanomas cutâneos
extensivos superficiais nos diversos estádios da doença.
2. O tissue microarray proposto foi confeccionado com sucesso e
permitiu a análise imunoistoquímica dos marcadores biológicos
propostos e disponibiliza mais de 70 lâminas para estudos futuros.
3. A análise imunoistoquímica das proteínas da via p16/pRb e via p53 foi
realizada na maioria dos pacientes incluídos no banco de dados e em
todos os tumores metastáticos.
Análise da expressão dos marcadores em relação à espessura do
tumor
1. Todos os melanomas acima de 1,0 mm perderam a expressão de
p16. Nos melanomas in situ e finos a sua expressão foi muito baixa.
2. Os melanomas com espessura até 1,0 mm apresentaram maior
expressão de ciclina D1 e Cdk4 citoplasmática.
3. Os melanomas com espessura acima de 1,0 mm apresentaram maior
expressão de Cdk4 nuclear, p53 e p21.
4. A expressão de pRb não mostrou associação com a espessura do
tumor.
105
Análise da expressão dos marcadores em relação à ulceração e
regressão
1. As variáveis ulceração e regressão não mostraram associação com a
expressão das proteínas estudadas.
Análise da expressão dos marcadores em relação ao índice mitótico
1. Os melanomas com IM ≥ 1 apresentaram menor expressão de ciclina
D1. Os casos com IM > 6 apresentaram maior expressão de p53.
Análise comparativa da expressão dos marcadores entre tumores
primários e metastáticos
1. Os tumores primários mostraram maior expressão de Cdk4
citoplasmática em relação aos tumores metastáticos.
2. As metástases cutâneas apresentaram maior expressão de p21 em
relação ao grupo de metástases não cutâneas.
Análise de sobrevida global e livre de doença
1. A expressão das proteínas estudadas não mostrou impacto na
sobrevida global ou livre de doença dos pacientes.
106
Considerações finais
1. A perda de expressão de p16 representou uma característica
constante nos melanomas estudados.
2. A expressão de ciclina D1 pode estar relacionada às fases iniciais de
transformação maligna dos melanócitos.
3. Os melanomas menos espessos expressariam em maior quantidade
a proteína Cdk4 citoplasmática e com a aquisição de outras mutações
nos melanomas mais espessos, haveria ganho de expressão nuclear.
4. A alteração na expressão da proteína pRb parece ter pouca influência
no comportamento biológico e na gênese dos melanomas cutâneos.
5. A alteração da proteína p53 pode representar evento tardio na gênese
dos melanomas
6. A expressão aumentada de p21 pode estar relacionada a mecanismo
de feedback para o controle da proliferação celular nas células que
deixam de expressar p16 ou incrementam a expressão de Cdk4
nuclear.
7. Em melanomas extensivos superficiais, mais de um componente das
vias p16/pRb e p53 está alterado. As duas vias parecem ter ação
combinada.
107
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