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AVALIAÇÃO DO PAPEL DA PENTRAXINA PTX3
NA TUMORIGÊNESE UTILIZANDO MODELOS
ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS
ANDRÉA CRISTINE MOTTA DE OLIVEIRA
Dissertação apresentada à Fundação Antônio
Prudente para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Dr. Luiz Fernando Lima Reis
São Paulo
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do Centro de Tratamento e Pesquisa
Hospital do Câncer A.C. Camargo
Oliveira, Andréa Cristine Motta de
Avaliação do papel da pentraxina PTX3 na tumorigênese utilizando
modelos animais geneticamente modificados / Andréa Cristine Motta de Oliveira
-- São Paulo, 2007.
71p.
Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração: Oncologia.
Orientador: Luiz Fernando Lima Reis
Descritores: 1. PENTRAXINA 2. PTX3. 3. CAMUNDONGOS
TRANSGÊNICOS. 4. ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS. 5.
TUMORIGÊSE.
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Tentar e falhar é, pelo menos, aprender.
Não chegar a tentar é sofrer a inestimável
perda do que poderia ter sido.
(Geraldo Eustáquio)
DEDICATÓRIA
A minha mãe, avó e tios, Adriana e Wlademir, pelo apoio e
amor incondicionais, por serem meu eterno porto seguro e por
terem apoiado meus sonhos.
Aos amigos de todas as horas, em especial ao Filipe, que
sempre confiou na minha capacidade e me deu todo apoio e
suporte quando precisei.
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Luiz Fernando Lima Reis e Adriana Abalen
Martins Dias, pela oportunidade concedida e orientação durante todo o trabalho.
Muito obrigada pela disponibilidade e paciência. Em especial ao Dr. Luiz Fernando
por ter sido um excelente chefe, mas também por ter sido um amigo e muitas vezes
exercer papel de “paizão”.
Ao Prof. Dr. Ricardo Brentani, Diretor do Hospital do Câncer A. C.
Camargo, e a Prof. Dra. Luisa Villa, Diretora do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre
o Câncer, pela excelente administração e oportunidade.
Ao Dr. Gilles Landman pelas explicações e por sua colaboração na
verificação das análises histológicas e de imunocítoquímica feitas durante o projeto.
Agradeço imensamente por toda a paciência e disponibilidade.
À Dra. Karina Ribeiro pela colaboração nas análises estatísticas presentes no
trabalho, por sua disponibilidade e explicações.
Ao Prof. Dr. Roger Chammas não apenas pela cessão das células que foram
utilizadas durante o projeto, mas também por seus ensinamentos como professor em
algumas disciplinas e por sua disponibilidade para discutir sobre alguns pontos do
projeto.
Ao Dr. Alex Fiorini de Carvalho por se mostrar sempre atencioso e solícito
em todos os momentos em que fui pedir algum tipo de ajuda.
À Graziela por todos os ensinamentos técnicos dentro do laboratório, por
toda a ajuda dispensada durante o andamento do projeto, mas também por ter sido,
por várias vezes, uma “mãezona” nos momentos mais difíceis e por ter sido uma
amiga companheira e divertida em diversos momentos do meu mestrado. Até o que
não sabíamos, juntas achávamos uma maneira sábia para solucionar o caso!
A Regina Nomizo, hoje não mais presente entre o quadro de funcionários,
mas sempre presente em nossas mentes e corações, agradeço por ter sido grande
professora sobre cultura de células e pela imensa paciência nas horas de desespero e
de dúvidas.
À Evânia pela colaboração e amizade durante as horas e horas na sala de
cultura, por seu excelente trabalho no gerenciamento da sala de cultura.
Ao Vlademir pelos momentos de debates e discussões, pelos ensinamentos
transmitidos. Não posso deixar de agradecê-lo pela segunda chance dada a nossa
amizade, que prezo muito.
Às companheiras de laboratório Mariana Moratto, Juliana Monte Real e
Vivian (que não é mais aluna dessa instituição), pelo companheirismo, troca de
experiências, pela ótima convivência e por terem escutado meus desabafos por tantas
e tantas vezes.
Aos funcionários do biotério do Instituto Ludwig, Wanderley, Oraci e
Ederval, pela colaboração constante durante esses dois anos. Por terem me ensinado
com muita paciência o manejo com os animais (já que inicialmente a luta foi grande
e tive que vencer um grande obstáculo, o medo!), por serem excelentes profissionais
e por terem se tornado grandes amigos, confidentes e leais.
Ao Dr. Raphael B. Parmigiani, pelas dicas de como utilizar o Reference
Mannager.
Aos funcionários e amigos da Anatomia Patológica, Gilmara, Yukie,
Fernanda, Hugo e Ivan, pelas horas agradáveis de trabalho que passamos juntos e
pelas dicas ao trabalhar com análise histológica. Também ao Carlinhos e Severino
pela confecção das lâminas de histologia, e à Suely pela confecção das lâminas de
imunocitoquímica e pelo aprendizado que tive sobre a técnica e outros detalhes, sem
contar pela disponibilidade, atenção e amizade de todos.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica,
especialmente Erico, Ana Paula, Ricardo, Valéria, Newton, Daniel e Murilo por
toda ajuda nas mais diversas situações, pelas dicas, pelos ensinamentos não só
profissionais e técnicos como pessoais.
À Ana Paula e Valéria pela força, preocupação e amizade. Não tivemos
muito tempo de contato, mas esse pouco tempo tenho certeza de que firmaram-se
laços de amizades sinceros e duradouros.
À Alainizinha pela ajuda de TODAS as horas e por tornar o ambiente de
trabalho sempre tão agradável, descontraído e cheio de “paquitagem”.
Às grandes amigas que fiz no LaBRI, Nair, Bárbara, Letícia e Pagotto,
amigas para todas as horas e mais diversas programações. Amiga do peito, sempre
prontas a ajudar, a estender a mão, emprestar um ombro amigo, brigar junto comigo
pelo que é certo, brigar comigo quando estou errada, a rir muito e também a ensinar
bastante, não só profissionalmente como lições de vida também. Cada uma de vocês,
a seu modo, tiveram grande peso e grande importância nesse momento da minha vida
e, estou certa de que esta amizade irá durar por longos anos.
Às novas amigas e companheiras de laboratório Tati e Kátia, pela amizade,
por serem sempre solícitas, pelos almoços e momentos de distração fora do Lab.
À Wal amiga de discussões e aprendizados não apenas de cunho profissional.
Seu apoio foi muito importante.
À Patrícia Possik, pela amizade e por ter me apresentado a ONG “O DNA
vai à escola”, da qual faço parte praticamente desde que entrei no mestrado. O que
me possibilitou ganhar conhecimentos em outras áreas da ciência.
À todos os integrantes do “O DNA vai à escola”.
À Colo, Sarah, Mariana Santos, e Cham pela contribuição indispensável a
este e a outros trabalhos, pessoas sempre de alto-astral colaborando para um
ambiente de trabalho favorável e descontraído.
À Lara pelos conselhos e dicas das mais variadas, e principalmente pela
leitura minuciosa desse trabalho e pela amizade.
Aos membros da Banca de Qualificação pelo acompanhamento, correções e
sugestões.
Aos funcionários da Zaiats & Zaiats, pelo pronto socorro nos momentos de
mais profunda ignorância sobre sistemas, formatações, problemas técnicos, etc.
Ao meu “filho” Léo Maguetas Devai pela amizade e apoio enquanto esteve
nessa instituição.
À todos os funcionários do Instituto Ludwig, Hospital A. C. Camargo e
Fundação Antônio Prudente, não só pelo excelente trabalho mas também pela
prazerosa convivência.
À Ana Maria Kuninari e Luciana Pitombeira, da secretaria da Pós-
graduação, pela competência, paciência e atenção dispensadas aos alunos.
À Suely Francisco e aos demais funcionários da biblioteca da Fundação
Antônio Prudente, pela atenção e boa vontade na organização e revisão desta
dissertação, bem como para atender aos vários pedidos de artigos durante esses mais
de dois anos.
À CAPES pelo suporte financeiro.
À Suzana pela grande colaboração nas discussões sobre esse trabalho, sobre
PTX3 e sobre imunologia, por sua receptividade e amizade dispensadas a mim.
Às amigas Luciana, Cristina e Tati pelo apoio inicial nessa empreitada.
Às amiga de moradia, que se tornaram além de amigas, uma espécie de
família, Karinne, Simone, Renata e a novata Luciana, pela convivência agradável
e pelo carinho e amizade durante esses anos que passamos juntas.
Aos meus grandes amigos Renata, Lud, Danilo, Mari Kubo, Fabiana,
Daniel, Caio e Branda, pelo apoio sempre que precisei, por me jogarem pra cima
dando ânimo e força, pelas conversas, amizade e carinho. Cada um, do seu jeito, fez
com que cada resultado ruim fosse amenizado e rapidamente superado.
À Família Bach pelo apoio moral, psicológico, físico, espiritual e intelectual.
Agradeço à todos pela hospitalidade, pelo carinho, atenção, preocupação, enfim por
tudo que fizeram por mim no momento em que mais precisei. Num piscar de olhos
tornara-se como uma segunda família, sempre de braços abertos. Ao André ainda
pela confiança em meu trabalho e por apostar em mim profissionalmente, me
apresentando novas oportunidades.
Ao Filipe, pelo seu carinho, dedicação, confiança e apoio que foram
imprescindíveis para a superação de muitos dos obstáculos encontrados durante a
trajetória desse trabalho. Muito obrigada por acreditar no meu sonho que, com sua
ajuda, agora se torna realidade.
À minha família de Petrópoles, por terem compreendido minha ausência nas
horas difíceis que passaram e por me apoiarem mesmo de longe.
À minha mãe Marli, avó Alice, bisavó Izabel, tios (Wlademir e Adriana)
que me empurraram “ladeira acima”. Sempre! Obrigada pelo apoio financeiro e
moral, pelos incentivos, pelo amor e amparo incondicionais durante cada um dos
meus passos dados até aqui.
À Deus pelo amor, conforto e força.
RESUMO
Oliveira ACM. Avaliação do papel da pentraxina PTX3 na tumorigênese
utilizando modelos animais geneticamente modificados. São Paulo; 2006.
[Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente].
PTX3 é uma proteína da família das pentraxinas, produzida principalmente pelas
células endoteliais, fibroblastos, macrófagos, monócitos e células dendríticas.
Estudos in vivo, utilizando animais geneticamente modificados, mostraram que PTX3
tem papel preponderante na resposta inflamatória. A ação biológica de PTX3 envolve
o reconhecimento de motivos comuns presentes em patógenos (PAMPs), ativação do
complemento e estimulação da fagocitose pelos macrófagos. Além disso, estudos
realizados pelo nosso grupo sugerem que PTX3 modula a expressão de várias
citocinas e quimiocinas dentre elas TNF, IL-1β, KC(CXCL1) e MCP-1 (CCL2). Este
trabalho teve como objetivo analisar o impacto biológico da expressão de PTX3 no
implante e desenvolvimento de tumores induzidos experimentalmente pela
inoculação de células de melanoma murino em camundongos geneticamente
modificados para PTX3. Para tanto, utilizamos camundongos transgênicos que
apresentam em seu genoma cópias extras do gene que codifica para PTX3 ou ainda,
camundongos mutantes, onde o gene PTX3 foi deletado por recombinação
homologa. A linhagem celular de melanoma utilizada foi a B16-F10 e sua sub-
linhagem B16-F10 NEX2. Nossos resultados mostraram que o implante e
desenvolvimento dos tumores de induzidos experimentalmente parece ser mais lento
no grupo de camundongos que têm expressão aumentada de PTX3. Isso pode indicar
que a super-expressão da proteína PTX3 pode conferir uma proteção contra o
crescimento de tumores. Os resultados dos parâmetros histológicos, analisados na
tentativa de identificar os fatores biológicos que indicassem o mecanismo de ação de
PTX3 no processo de progressão tumoral, mostraram que a diferença existente entre
os animais que super-expressam PTX3 e seus respectivos controles acontece
precocemente. Notamos diferença significativa entre os grupos após 48 horas do
implante de células nos parâmetros área de necrose (p=0,007), porcentagem de
infiltrado inflamatório (p=0,015) e número de células tumorais (p=0,007). Assim,
sugerimos que PTX3 pode funcionar como um mediador da resposta inata com papel
importante na biologia dos tumores.
SUMMARY
Oliveira ACM. [Evaluation of pentraxin PTX3’s role on tumor genesis using
genetically modified animal models] São Paulo; 2006. [Dissertação de Mestrado-
Fundação Antônio Prudente].
PTX3 is a member of the pentraxin family of proteins, mainly produced by
endothelial cells, dendritcs cells, fibroblasts, macrophages and monocytes. In vivo
studies, using genetically modified mice showed that PTX3 has a critical role on
inflammatory response. Its biological activity involves the recognition of the
pathogens-associated molecular pattern (PAMPs), activation of classical complement
pathway and phagocytosis. Moreover, data from our group suggest that PTX3
modulates the expression of several cytokines and chemokines amongst them TNF,
IL-1b, KC (CXCL1) e MCP-1 (CCL2). The goal of this work was to analyze the
impact of PTX3 expression on tumor implantation and tumor development upon
injection of melanoma cells in mice genetically modified to overexpress as well as in
PTX3 deficient mice. Our results suggest that tumor implantation and tumor
development is diminished in mice with increased expression of PTX3. In PTX3tg
mice, we observed increased tumor necrosis (p=0,007), percentage of infiltrated
inflammatory (p=0,015) and number of tumor cells (p=0,007). Our data suggest that
PTX3 overexpression might lead to a protection against the growth of melanoma
tumors.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Avaliação de contaminação por micoplasma das linhagens de
melanoma 24
Figura 2 Imunohistoquímica das linhagens B16-F10 e B16-F1 utilizando os
marcadores HMB45 e S100 26
Figura 3 Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais WTTg2 34
Figura 4 Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais Tg2 35
Figura 5 Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais WTKO 36
Figura 6 Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais Tg2 versus WTTg2 37
Figura 7 Gráficos de crescimento tumoral pontual 39
Figura 8 Gráfico demonstrando o “Take Rate” entre os grupos 40
Figura 9 Curva de crescimento dos tumores e sobrevida dos animais KO
versus WTKO 41
Figura 10 Gráfico de área de necrose em tempos iniciais e tardios 44
Figura 11 Gráfico de área tumoral em tempos iniciais e tardios 45
Figura 12 Gráfico de número de células tumorais em tempos iniciais e tardios 45
Figura 13 Gráfico de infiltrados de células inflamatórias em tempos iniciais e
tardios 46
Figura 14 Lâminas de H.E. de amostras de tumor em tempo inicial e tardio 46
LISTA DE ABREVIATURAS
A. fumigatus Aspergillus fumigatus
BSA do inglês Bovine Serum Albumine
CCL2 do inglês chemokine (C-C motif) ligand 2
cDNA DNA complementar
CLP do inglês Cecal Ligation and Puncture - Ligadura e Perfuração
do Ceco
cm
2
centímetro quadrado
CO
2
Gás Carbônico
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CRP do inglês C-Reactive Protein – Proteína C Reativa
C-terminal carboxi-terminal
CXCL1-3 do inglês chemokine (C-X-C motif) ligand 13
DAB 3,3’-diaminobenzidina
DMEM do inglês Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTP do inglês deoxynucleoside 5’ triphosphato
EDTA do inglês ethylenediamine tetraacetate - ácido
etilenodiaminotetracético
EPM/UNIFESP Escola Paulista de Medicina / Universidade Federal de São
Paulo
ETOH etanol
FGF do inglês Fibroblastic Growth Factor – Fator de crescimento
de fibroblasto
FGFR do inglês Fibroblastic Growth Factor Receptor – Receptor
para o Fator de crescimento de fibroblasto
Fw do inglês Foward
GAPDH do inglês glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase
HCL do inglês chloridric acid – ácido clorídrico
ICLAS International Council for Laboratory Animal Science
IFN Interferon
IGF-I do inglês Insulin-like growth factor 1
IL Interleucinas
ILPC Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer
INCA Instituto Nacional do Câncer
IR Isquem ia e Reperfusão
JNK do inglês c-Jun N-terminal kinase
kDa do inglês kilodaltons (medida de peso)
KO camundongos nocautes
LDL do inglês Low-Density Lipoprotein - Proteína de baixa
densidade
LPS do inglês lipopolysaccharide - Lipossacarídeo (componente da
parede celular de bactérias Gram negativas )
MCP-1 do inglês monocyte chemotactic protein-1
Mef CW fibroblastos provenientes de camundongos do tipo selvagem
MgCl
2
do inglês magnesium chloride – Cloreto de Magnésio
MICO Micoplasma
MIP-2 do inglês macrophage-inflammatory protein-2
mM do inglês millimolar
N
2
Nitrogênio
N2a Neuro-2a - neuroblastoma murino
NaCl do inglês sodium chloride – ácido clorídrico
Narp do inglês Neuronal Activity Regulated Pentraxin – pentraxina
regulada pela atividade neuronal
NF-IL-6 do inglês Nuclear factor IL-6
NF-κB do inglês Nuclear Factor kappa B
ng nanograma
NPI do inglês Neuronal Pentraxin I – Pentraxina Neuronal I
NPII do inglês Neuronal Pentraxin II – Pentraxina Neuronal II
N-terminal amino-terminal
OmpA do inglês Outher membrane protein A
ORF do inglês Open Reading Frame – janela aberta de leitura
OSM do inglês Oncostatin M
pb pares de bases
PBS solução tampão fostato
PC fosfocolina
PCR do inglês Polimerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da
Polimerase
PDGF do inglês Platelet-derived growth factor
PE fosfoetanolamina
pH do inglês hydrogen ionic potencial – potencial hidrogeniônico
PK do inglês protein kinase
PTX3 Pentraxina 3
PTX3KO Camundongos nocautes para PTX3
PTX3Tg camundongos trangênicos para PTX3
q.s.p. quantidade suficiente para
RNA Ácido ribunucléico
RNAm RNA mensageiro
rpm do inglês rotation per minute – rotação por minuto
RPMI do inglês Roswell Park Memorial Institute Media
Rv do inglês Reverse
SAP do inglês Serum Amyloid P Component – Componente soro
amilóide P
SDS lauril sulfato de sódio
SFB Soro Fetal Bovino
siRNA do inglês short interference RNA – Pequeno RNA de
interferência
TAM do inglês Tumor-associated macrophage – Macrófagos
associados ao tumor.
Tg2 ou PTX3Tg2 camundongos trangênicos contendo 2 cópias extras
Tg4 ou PTX3Tg4 camundongos trangênicos contendo 4 cópias extras
TGF do inglês Transforming Growth Factor
TLR do inglês Tool Like Receptors – Receptores do tipo Toll
TNF do inglês Tumor Necrosis Factor – Fator de necrose tumoral
Tris do inglês hydroxymethyl aminomethane-tris (hidroximetil)
aminometano
TSG-14 do inglês TNF Stimulated Gene-14-Gene 14 estimulado por
TNF
TSG-6 do inglês TNF Stimulated Gene-6-Gene 6 estimulado por NF
TSGs do inglês TNF-Stimulated Genes-Genes estimulados por TNF
VEGF do inglês Vascular Endothelial Growth Factor-Fator de
Crescimento do Endotélio Vascular
WT do inglês Wild Tipe – tipo selvagem
μg do inglês microgram
μl do inglês microliter
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Definição de PTX3 2
1.1.1 As pentraxinas curtas 3
1.1.2 As pentraxinas longas 4
1.1.2.1 Propriedades do gene e da proteína PTX3 5
1.1.2.2 Funções exercidas por PTX3 7
1.1.2.3 Interação PTX3 / FGF-2 10
1.2 Melanoma Cutâneo 11
1.2.1 Definição, estimativa, progressão e critérios de avaliação 11
1.2.2 Fatores de crescimento e citocinas em células melanocíticas 12
2 JUSTIFICATIVA 15
3 OBJETIVO 16
3.1 Geral 17
3.2 Específico 17
4 MATERIAL E MÉTODO 19
4.1 Camundongos 20
4.2 Células 21
4.3 Avaliação da contaminação por micoplasma nas linhagens celulares B16-
F1 e B16-F10 e, caracterização das mesmas, utilizando marcadores
imunohistoquímicos 22
4.4 Expansão e congelamento das linhagens celulares de melanoma murino 27
4.5 Determinação das curvas de crescimento tumoral dos camundongos 28
4.4 Análise Histológica 29
5 RESULTADOS 31
5.1 Padronização do número de células a serem injetadas nos camundongos e
confirmação da dose ideal para injeção 32
5.2 Curva de crescimento tumoral versus tempo dos animais Tg x WTTg 36
5.3 Curva de crescimento tumoral versus tempo e sobrevida dos animais
KO x WTKO 40
5.4 Indução de tumor e coleta de material em tempos precoces e tardios após
a injeção das células tumorais 42
5.5 Análises histológicas das lâminas de amostras de pele e tumor coletados 43
6 DISCUSSÃO 47
7 CONCLUSÃO 58
8 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 60
1
INTRODUÇÃO
2
1 INTRODUÇÃO
1.1 DEFINIÇÃO DE PTX3
Com o objetivo de elucidar o mecanismo molecular de ação do TNF, LEE et
al. (1990) isolaram genes induzidos por TNF através da hibridização de uma
biblioteca de cDNAs originários de fibroblastos normais humanos. Dentre os
diversos genes induzidos por TNF (TSGs) identificados, o gene tsg-14 (tumor
necrosis factor-stimulated gene 14) foi o mais frequentemente encontrado nessa
sequência da biblioteca de cDNAs e sua função era desconhecida (LEE et al. 1990).
Independentemente, BREVIARIO et al. (1992) isolaram o mesmo gene (exceto por
uma metionina, na posição 202, no lugar de uma leucina) em células endoteliais de
cordão umbilical humano estimuladas com IL-1β (interleucina 1β) e, nomearam-no
de pentraxina 3 (ptx3) devido à homologia apresentada pela porção C-terminal da
proteína codificada por este gene com as outras proteínas pertencentes à família das
pentraxinas, a proteína C-reativa (CRP) e o componente soro amilóide P (SAP). Esta
última denominação é a mais utilizada até os dias atuais (GARLANDA et al. 2005).
PTX3 é membro de uma superfamília de proteínas inflamatórias de fase
aguda, as pentraxinas. As pentraxinas são proteínas conservadas, caracterizadas por
uma organização estrutural baseada em cinco subunidades idênticas arranjadas não
covalentemente em simetria pentamérica radial (EMSLEY et al. 1994). Outra
característica própria dessa família é a presença de uma “assinatura da família das
3
pentraxinas” conservada, em seu domínio carboxi-terminal (HxCxS/TWxS, onde x
pode representar qualquer aminoácido) (BAIROCH 1991).
Esta superfamília pode ser dividida em duas classes (subfamílias), divisão
esta baseada no tamanho dos seus membros: a classe das pentraxinas curtas ou
clássicas, cujo protótipo é a proteína C-reativa (CRP); e a classe das pentraxinas
longas ou novas, cujo protótipo é a PTX3.
1.1.1 As pentraxinas curtas
As pentraxinas curtas, CRP e SAP, são proteínas inflamatórias de fase aguda
em humanos e murinos, respectivamente, pesando 25-kDa (RUBIO et al. 1993), e
produzidas por hepatócitos em resposta a mediadores inflamatórios, principalmente
IL-6 (BAUMANN e GAUDIE 1994). Essas duas proteínas têm um mecanismo de
ligação dependente de cálcio, interagindo com diversos ligantes como,
fosfoetanolamina (PE), fosfocolina (PC) (SCHWALBE et al. 1992), DNA e
cromatina (BUTLER et al. 1990), componentes do sistema complemento (ROBEY et
al. 1984), complexos imunes, carboidratos, glicolípides (LOVELESS et al. 1992) e
componentes de matriz extracelular (PEPYS e BUTLER 1987; BUTLER et al.
1990). Devido a essas propriedades, elas regulam a resistência natural contra
microrganismos e clarificação de debri e componentes da matriz extracelular
(PEPYS 1983). SAP liga-se também a várias bactérias (HIND et al. 1985;
NOURSADEGHI et al. 2000), ao vírus influenza (ANDERSEN et al. 1997), a
fibronectina, a proteína ligante C4b e a todas as formas de fibrilas amilóides (PEPYS
e BUTLER 1987; BUTLER et al. 1990).
4
1.1.2 As pentraxinas longas
As pentraxinas longas apresentam em sua região C-terminal domínios
homólogos aos encontrados nas pentraxinas curtas. Porém, as pentraxinas longas
adquiriram, durante o processo evolutivo, novos domínios na região N-terminal
resultantes, talvez, da fusão dessas novas extremidades às pentraxinas ancestrais
(GOODMAN et al. 1996). Apesar da semelhança relatada acima entre as pentraxinas
curtas e longas, essas últimas diferem quanto à organização gênica, localização
cromossomal, fonte celular, estímulo indutor e reconhecimento de ligantes
(MANTOVANI et al. 2003). Além de diferirem também, obviamente, quanto ao
tamanho, que neste caso é em média de 40-50 kDa.
A primeira pentraxina longa descrita, foi a TSG-14 (LEE et al. 1990),
posteriormente denominada de PTX3 (BREVIARIO et al. 1992), sendo então
considerada o protótipo desta subfamília. Recentemente, outras pentraxinas longas
foram descritas, como a XL-PXN1, isolada a partir de uma biblioteca de cDNA do
fígado de Xenopus laevis (SEERY et al. 1993), a Apexin/p50, localizada no
acrossomo de espermatozóides de porcos da índia (NOLAND et al. 1994; REID e
LOBEL 1994) e é a que possui maior homologia com PTX3 (26%) (GOODMAN et
al. 1996), a NPI, pentraxina neuronal do cérebro de rato (SCHLIMGEN et al. 1995),
a NPII, pentraxina neuronal do cérebro humano (HSU e PERIN 1995) e a Narp,
outra pentraxina neuronal do cérebro de rato (TSUI et al. 1996).
Várias funções têm sido atribuídas às pentraxinas neuronais, por exemplo, a
NPI ao ligar-se a taipoxina tem papel na absorção sináptica. Além disso, NPI
juntamente com Narp possuem uma atividade sinaptogênica (XU et al. 2003).
5
1.1.2.1 Propriedades do gene e da proteína PTX3
PTX3 é codificada por um gene de cópia única, formado por três éxons e dois
íntrons, localizado no cromossomo 3 humano (q25), e o equivalente em murinos está
localizado no cromossomo 3, banda (q24-28). A identidade entre a seqüência de
aminoácidos da proteína humana e murina é de 82%, e a porção C-terminal de PTX3
apresenta homologia de 57% de aminoácidos conservados em relação as pentraxinas
clássicas (INTRONA et al. 1996). Os dois primeiros éxons codificam o peptídeo
sinal e o domínio N-terminal da proteína, respectivamente, e o terceiro éxon detém o
domínio de identidade das pentraxinas (C-terminal), exatamente como nos outros
membros da família (BREVIARIO et al. 1992).
A seqüência nucleotídica do cDNA de PTX3, revelou a existência de uma
ORF que codifica para 381 aminoácidos (BREVIARIO et al. 1992; LEE et al. 1993),
incluindo um peptídeo sinal de 17 aminoácidos.(GARLANDA et al. 2005). Sendo
que a região C-terminal apresenta 203 aminoácidos e a porção N-terminal apresenta
178 aminoácidos ainda inéditos, ou seja, não descritos em nenhuma outra proteína.
Análises da seqüência humana indicaram a presença de um sítio de N-glicosilação na
posição 220 da porção C-terminal, que confere o peso molecular de 45 kDa à
glicoproteína secretada (GARLANDA et al. 2005).
O promotor de ptx3 contém sítios para os fatores de transcrição Pu1, AP-1,
NF-κB, Sp1 e NF-IL-6. Foi demonstrado que NF-κB é o fator de transcrição
essencial para que haja indução por TNF e IL-1β (ALTMEYER et al. 1995; BASILE
et al. 1997). Entretanto estudos realizados por HAN et al. (2005), utilizando células
epiteliais pulmonares, demonstraram outra via de regulação gênica para PTX3, que
não fosse NF-κB, responsável pela indução de TNF; pois quando este fator de
6
transcrição foi bloqueado através de seus inibidores, a indução por TNF não foi
abolida. O estudo em questão utilizou-se, então, siRNA contra JNK1 ou JNK2 e
observou uma regulação para PTX3 independente de NF-κB porém dependente de
JNK, que é uma via conhecida por regular a expressão de genes envolvidos em
eventos relacionados ao estresse (HAN et al. 2005).
Diversos tipos celulares são capazes de produzirem PTX3 in vitro em
resposta ao tratamento com TNF (LEE et al. 1990), IL-1β (BREVIARIO et al. 1992),
lipoarabinomananas (BREVIARIO et al. 1992 e VOURET-CRAVIARI et al. 1997a
e b), LPS (lipopolissacarídeo) (VOURET-CRAVIARI et al. 1997a e b), LDL
oxidado (KLOUCHE et al. 2004) e OmpA (CAMOZZI et al. 2005) e outros
agonistas para diferentes membros da família “Toll Like Receptors” (TLR). Estas
células incluem: células dendríticas mielóides (principal produtora de PTX3), células
endoteliais, fagócitos mononucleares, células de músculo liso, adipócitos,
fibroblastos, células sinoviais, condrócitos, miócitos normais, células do epitélio
renal e alveolar, e células do cúmulus dos oócitos (BREVIARIO et al. 1992; LEE et
al. 1994; INTRONA et al. 1996; POLENTARUTTI et al. 2000; PERI et al. 2000;
GOODMAN et al. 2002; GARLANDA et al. 2002; VARANI et al. 2002; LATINI et
al. 2004; NAUTA et al. 2005).
Citocinas anti-inflamatórias ou citocinas associadas
com à resposta do tipo Th 2 (IL-4, IL-13), não exercem efeitos sobre a produção de
PTX3, e além disso, IL-6 se mostrou um indutor não muito eficaz desta proteína
(ALLES et al. 1994). Contrariamente, IFN-γ e IL-10 têm efeitos divergentes na
produção de PTX3. IFN-γ inibe a expressão e a produção de PTX3 em diferentes
contextos celulares, por exemplo, em macrófagos e monócitos (GOODMAN et al.
1996, 2000; POLENTARUTTI et al. 1998), enquanto IL-10 possui um perfil de
7
indutor da expressão de PTX3 em células dendríticas e monócitos (PERRIER et al.
2004).
O primeiro ligante caracterizado para PTX3 é o C1q, componente de ativação
da cascata do complemento da via inflamatória clássica (BOTTAZZI et al. 1997), e
essa interação ocorre independentemente de cálcio. (NAUTA et al. 2003). Como
CRP e SAP, PTX3 liga-se às células apoptóticas, inibindo seu reconhecimento pelas
células dendríticas (ROVERE et al. 2000). Além disso, se liga a alguns patógenos
como Aspergillus fumigatus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhirium,
Paracoccidioides brasilienses e ao componente de parede celular, o zymosan
(GARLANDA et al. 2002; DINIZ et al. 2004). TSG-6, uma proteína multifuncional
geralmente associada à inflamação, liga-se também à proteína PTX3, e através dessa
interação, PTX3 atua sobre a matriz extracelular rica em ácido hialurônico, que é
essencial para a fertilidade das fêmeas (SALUSTRI et al. 2004). Mais recentemente,
RUSNATI et al. (2004), demonstraram que PTX3 se liga especificamente ao fator de
crescimento de fibroblasto-2 (FGF2), através da extensão N-terminal de PTX3
(CAMOZZI et al. 2005).
1.1.2.2 Funções exercidas por PTX3
Visando investigar a relevância de PTX3 na resposta inflamatória
desencadeada in vivo, nosso grupo desenvolveu modelos animais geneticamente
modificados que expressam cópias extras do gene em questão. Os transgenes
inseridos no genoma dos animais contêm toda a seqüência codificadora do gene e
também a região regulatória que confere a indutibilidade por TNF e IL-1β, na qual o
sítio NFκB é imprescindível (ALTMEYER et al. 1995; BASILE et al. 1997). Os
8
animais transgênicos para PTX3 (PTX3Tg) se mostraram mais resistentes à infecção
bacteriana induzida experimentalmente pelo procedimento de ligadura e perfuração
do ceco (CLP), bem como ao choque endotóxico em reposta à administração de altas
doses de LPS (DIAS et al. 2001). Entretanto, quando submetidos à isquemia e
reperfusão (IR) da artéria mesentérica superior, os animais PTX3Tg apresentaram
uma taxa de sobrevida menor do que a observada no grupo dos animais do tipo
selvagem (WTs) (SOUZA et al. 2002). Neste caso, os camundongos geneticamente
modificados, mostraram uma resposta inflamatória exacerbada que se refletia em um
aumento exagerado da permeabilidade vascular, hemorragia e infiltrado neutrofílico
no duodeno, íleo e pulmão. Nos animais PTX3Tg submetidos à IR, concentrações
bem mais elevadas de TNF, IL-1β, MIP-2/KC (CXCL1) e MCP-1 (CCL2) foram
encontradas, em comparação com as presentes nos tecidos dos animais do tipo
selvagem submetidos ao mesmo tratamento (SOUZA et al. 2002). Nossos estudos
prévios também demonstraram que macrófagos peritoneais isolados dos animais
PTX3Tg apresentam uma capacidade aumentada de fagocitose de partículas
fúngicas, independentemente de opsonização, em relação à observada nos fagócitos
provenientes dos animais WTs (DINIZ et al. 2004). Além disso, estes produziram
maiores quantidades de óxido nítrico em resposta à estimulação por TNF e/ou LPS
(DIAS et al. 2001). Este papel importante na resistência aos patógenos foi também
mostrado por GARLANDA et al. (2002), utilizando animais nocaute para PTX3. Os
trabalhos que utilizaram animais deficientes para o gene ptx3, apontaram a existência
de uma função inédita e inesperada para esta proteína relacionada à fertilidade. As
fêmeas nocaute homozigotas apresentam um fenótipo de infertilidade relacionado à
desestabilização da interação da matriz extracelular que agrega as células do cumulus
9
aos oócitos no período periovulatório (VARANI et al. 2002; GARLANDA et al.
2005).
Como relatado anteriormente, PTX3 liga-se à conidia do fungo A. fumigatus,
facilitando a internalização e morte desta, além da produção de MCP-1 (também
conhecida como CCL-2) por fagócitos mononucleares. O nível de PTX3 plasmático
foi encontrado aumentado em camundongos infectados com A. fumigatus e em
pacientes neutropênicos com doenças hematopoiéticas e infecção sistêmica por esse
tipo de fungo (GARLANDA et al. 2002). PTX3 também foi detectado no lavado
broncoalveolar de camundongos e em humanos durante essa infecção. Esses
resultados demonstraram que PTX3 atua como um receptor padrão de
reconhecimento solúvel, o qual atua tanto na resistência aos patógenos oportunistas,
em particular A. fumigatus, como também na fertilidade das fêmeas (MANTOVANI
et al. 2003).
Altos níveis de PTX3 têm sido observados em diversas doenças infecciosas,
incluindo sepsis, infecção por A. fumigatus, tuberculose e dengue (MULLER et al.
2001; GARLANDA et al. 2002; MAIRUHU 2005). Em algumas dessas doenças, o
nível de PTX3 foi correlacionado com a atividade ou severidade da doença
(GARLANDA et al. 2005).
Pentraxinas, incluindo SAP e PTX3, ligam-se às células apoptóticas e liberam
componentes nucleares, regulando seu “clearance”, e bloqueia a ativação da
autoimunidade (ROVERE et al. 2000). Desordens autoimunes como artrite
reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica e vasculite de pequenos
vasos, foram investigadas quanto aos níveis de PTX3. Níveis elevados foram
observados em artrite reumatóide e vasculite de pequenos vasos. Neste último caso,
10
os níveis de PTX3 estão correlacionados com a atividade da doença e a resposta a
terapia (LUCHETTI et al. 2000; FAZZINI et al. 2001).
1.1.2.3 Interação PTX3/FGF-2
RUSNATI et al. (2004) demonstraram que PTX3 se liga especificamente ao
fator de crescimento de fibroblasto-2 (FGF-2), através da extensão N-terminal de
PTX3 (CAMOZZI et al. 2005). Esse fator de crescimento induz a proliferação
celular, quimiotaxia, induz angiogênese in vivo e modula a neovascularização
durante a cicatrização, inflamação, arteriosclerose e crescimento tumoral. A
interação entre FGF-2 e PTX3, neutraliza a capacidade deste fator de crescimento de
se ligar aos seus receptores, fato que resulta na inibição da sua atividade mitogênica
in vitro, e angiogênica, in vivo, demonstrada pelos autores em modelo de membrana
corioalantóide de ovo de galinha (RUSNATI et al. 2004). Os ensaios realizados
sugerem que PTX3 possa inibir o mecanismo autócrino de estimulação por FGF-2
nas células endoteliais, levando à uma significante inibição de migração celular,
proliferação, morfogênese e crescimento tumoral. Os autores também relatam a
ligação de PTX3, em afinidade bem mais baixa do que a observada para FGF-2, aos
fatores FGF-8 e VEGF, mas não observou-se sua ligação com FGF-1 ou FGF-4.
Além disso, foi relatado que PTX3 pode agir como um potente inibidor da
estimulação exercida por FGF-2 sobre as células musculares lisas das artérias
coronarianas, exercendo dessa forma, uma ação modulatória das funções destas
células após uma lesão no vaso sanguíneo (LAZAR-MOLNAR et al. 2000).
Enquanto melanócitos normais não expressam FGF-2, quase todos os
melanomas produzem esse fator em altos níveis durante a progressão tumoral (REID
11
et al. 1994; AL-ALOUSI et al. 1996; HALABAN et al. 1988). Ao contrário de FGF-
2, os receptores de membrana para esse fator, principalmente o FGFR-1, são
expressos tanto em melanócitos normais quanto em células de melanoma. FGF-2 tem
demonstrado ter papel como estimulante autócrino do crescimento, durante a
progressão tumoral (WANG e BECKER 1997, YAYON et al. 1997). Entretanto,
também têm sido postulados efeitos parácrinos na angiogênese e na formação do
estroma (NESBIT et al. 1999).
1.2 MELANOMA CUTÂNEO
1.2.1 Definição, estimativa, progressão e critérios de avaliação
Melanomas são neoplasias malignas de melanócitos que figuram entre os
cânceres humanos menos responsivos a diversos tratamentos. Diferentemente do que
vem sendo observado com outros tumores, a incidência de melanoma tem crescido
nas últimas décadas (HENDERSON et al. 1991). Segundo dados do INCA
(www.inca.gov.br), o melanoma representa apenas 4% dos tipos de câncer de pele,
porém é o mais grave, devido à sua alta possibilidade de metástase. Por isso, apesar
de sua baixa incidência, apresenta elevada taxa de mortalidade. Para 2006, estão
previstos 2.710 casos novos em homens e 3.050 casos novos em mulheres. O
melanoma representa uma grupo de doenças definidos por critérios patológicos e
clínicos, que sugerem uma sequência de passos distintos para sua progressão
(MEIER 2003):
12
melanócitos → nevo → nevo displásico → melanoma primário em fase de
crescimento radial sem competência para mestastatisar → melanoma primário em
fase de crescimento vertical competente para metastatizar → melanoma metastático
Fonte: MEIER (2003)
Histologicamente, a classificação do melanoma reflete a localização e / ou a
profundidade do mesmo. Por exemplo, o melanoma in situ, caracterizado por um
padrão de crescimento radial, está confinado primariamente à epiderme. Em
contrapartida, a fase de crescimento vertical dos melanomas malignos denota uma
transição para uma condição mais agressiva e maligna, a qual é caracterizada pela
invasão tumoral ultrapassando a derme e podendo alcançar sítios distantes, levando à
metástase. Embora o melanoma tenda a se propagar para sítios não viscerais como
pele ou linfonodos, os sítios viscerais mais comumente envolvidos na metástase do
melanoma são pulmão, fígado, cérebro, ossos e intestino delgado (CHIN et al. 1988)
Entre os vários fatores de avaliação, a espessura total do tumor é o melhor
determinante independente para prognóstico de melanomas não-metastáticos. O
sistema descrito por Breslow, o qual mensura a espessura tumoral do topo da camada
nucleada da epiderme até a maior profundidade da invasão tumoral, (CHIN et al.
1998).
1.2.2 Fatores de crescimento e citocinas em células melanocíticas
A regulação autócrina de células tumorais envolvem a produção endógena de
fatores de crescimento, os quais atuam na produção de receptores celulares
específicos e estimulam a proliferação celular (LAZAR-MOLNAR et al. 2000).
13
Os fatores de crescimento produzidos pelas células de melanoma podem ter
efeito parácrino sobre outras células do estroma circundante, enquanto células
endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, monócitos, linfócitos e granulócitos, e estas
células, por sua vez, produzem vários fatores de ativação, como IGF-I, PDGF e
enzimas proteolíticas, ou inibitórios como IL-1, IL-6, OSM, TGF-β, IFNs e TNF.
Esses fatores parácrinos aumentam o crescimento tumoral, angiogênese, adesão ou
mobilidade, promovem a disseminação ou inibem o crescimento tumoral, ou causam
diferenciação (LAZAR-MOLNAR et al. 2000).
Como relatado anteriormente, o FGF-2 é o fator de crescimento mais
expresso pelas células de melanoma. O mecanismo pelo qual FGF-2 é expresso
abundantemente pelas células de melanoma, pode ser explicado pela co-expressão do
proto-oncogene c-MYB, o qual transativa o promotor de FGF-2 e estimula a
expressão do seu RNAm e da sua proteína, resultando em um descontrolado
crescimento (LAZAR-MOLNAR et al. 2000).
Fatores de crescimento como FGF-2 não atuam somente estimulando a
proliferação de melanócitos. A persistente expressão de FGF-2 está associada ao
recrutamento, à proliferação e migração de células endoteliais, o que favorece a
invasão da massa tumoral por vasos neoformados (angiogênese) (DE CRISTAN et
al. 1990). Mais ainda, FGF-2 é um potente modulador da migração de melanócitos e
melanomas, favorecendo o processo de metástase. Assim, além de estar associado à
formação de nevos, FGF-2 também está associado à progressão de melanomas em
fase de crescimento radial e para melanomas em fase de crescimento vertical
(NUGENT e IOZZO 2000).
14
Esse fator de crescimento é bem conhecido por suas propriedades
angiogênicas e efeitos mitogênicos em vários tipos celulares. Além disso, FGF-2
ativa enzimas extracelulares, atribuindo uma capacidade invasiva às células de
melanoma (LAZAR-MOLNAR et al. 2000).
15
JUSTIFICATIVA
16
2 JUSTIFICATIVA
Com base em dados anteriores do nosso laboratório que evidenciaram a
participação importante de PTX3 na modulação da resposta inflamatória observada in
vivo; suportados por dados da literatura que documentam o importante papel de
citocinas tais como TNF, IL-1β, das quimiocinas CXCL1-3 (MIP-2/KC) e CCL2
(MCP-1), e de moléculas como o óxido nítrico no desenvolvimento e progressão
tumoral todos estes mediadores se encontram elevados nos animais PTX3Tg (DIAS
et al. 2001; SOUZA et al. 2002); baseados também na evidência do efeito anti-
angiogênico da ligação de PTX3 ao FGF-2 (RUSNATI et al. 2004), resolvemos
investigar a participação de PTX3 em processos tumorais utilizando modelos de
implante de células tumorais in vivo.
O modelo escolhido neste estudo foi o do melanoma cutâneo. Para esta
escolha consideramos o fato de que citocinas e quimiocinas como IL-8, IL-10, IL-1 e
TNF, serem encontradas elevadas nos animais PTX3Tg (DIAS et al. 2001; SOUZA et
al. 2002) e serem conhecidamente importantes no desenvolvimento deste tipo de
neoplasia (LAZAR-MOLNAR et al. 2000). Além disso, este tipo de câncer pode ser
implantado de forma experimental em camundongos pela injeção intravenosa ou
subcutânea de células tumorais em animais susceptíveis. Este modelo experimental já
está padronizado e bem estabelecido no nosso grupo, uma vez que tem sido
largamente empregado em nossos estudos visando o conhecimento da biologia do
melanoma e avaliação da resposta deste tipo de tumor ao tratamento com drogas
alquilantes e TNF.
17
OBJETIVOS
18
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
Analisar o papel biológico de PTX3 no desenvolvimento de tumores induzidos
experimentalmente pela inoculação subcutânea de células de melanoma murino em
camundongos geneticamente modificados para PTX3.
3.2 ESPECÍFICO
1. Estabelecer a curva de crescimento de tumores induzidos pela injeção
subcutânea das linhagens de melanoma B16F-10 Nex2 em camundongos
transgênicos (Tg2) e compará-la com a curva obtida de seus respectivos
camundongos do tipo selvagem (WTTg2).
2. Estabelecer a curva de crescimento de tumores induzidos pela injeção
subcutânea das linhagens de melanoma B16-F10 em camundongos nocaute
para PTX3 (PTX3KO ou KO) os quais, não produzem a proteína codificada
por este gene, e compará-la com a curva obtida de seus respectivos
camundongos do tipo selvagem (WTKO).
3. Avaliar, através da análise histológica de cortes de pele no local da injeção
das células tumorais (tempos de 24, 48 e 72 horas) ou dos tumores recolhidos
dos animais (10 dias), a presença de áreas de necrose, área tumoral,
porcentagem de infiltrado de células inflamatórias e o número de células
tumorais.
19
MATERIAL E MÉTODO
20
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 CAMUNDONGOS
Foram utilizados animais transgênicos para PTX3 gerados e caracterizados
por DIAS et al. (2001). Estes animais foram gerados no background CD1 e carregam
duas (PTX3Tg2 ou Tg2) ou quatro (PTX3Tg4 ou Tg4) cópias extras do transgene,
sob controle do próprio promotor de PTX3. Foram usados nos ensaios, animais
heterozigotos e, como controles, animais WT da linhagem CD1 (WTTg2).
Os animais deletados para PTX3 (PTX3KO ou KO) foram gerados e
caracterizados por VARANI et al. (2002) e foram gentilmente cedidos pelo Dr.
Martin Matzuk da Baylor College of Medicine (Houston, Texas). Em linhas gerais,
os animais foram obtidos pela deleção, por recombinação homóloga, dos éxons 1 e 2
do gene ptx3. Os camundongos PTX3KO apresentam background genético misto de
C57BL/6 e 129/SvEv e os animais WT (WTKO) usados como controle apresentam o
mesmo background.
Foram utilizados camundongos machos, apresentando entre 6 a 10 semanas
de idade, mantidos em biotério, em mini-isoladores e sob regime de 12 horas de luz,
no biotério do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer e recebendo água
acidificada e ração autoclavadas ad libitum.
Os animais foram sacrificados, pelo método de anestesia profunda com
Halotano, em tempos determinados pelo experimento ou sempre que os tumores
21
induzidos apresentarem tamanho igual ou maior que 3cm
2
para evitar o sofrimento
dos mesmos.
Todos os procedimentos empregados na manipulação dos camundongos
seguiram as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA) que segue as normas do International Council for Laboratory Animal
Science (ICLAS).
4.2 CÉLULAS
Foram utilizadas três linhagens celulares de melanoma murino, B16-F1,
células de melanoma murino metastático obtidas originalmente após uma passagem
em pulmão (FIDLER 1973), B16-F10 Nex2, uma sub-linhagem derivada da B16-F10
e, a B16-F10, células de melanoma murino metastático obtidas originalmente após
10 passagens em pulmão (FIDLER 1973). A linhagem B16-F1 utilizada neste estudo
era proveniente do banco de células do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer
(ILPC), a B16-F10 Nex2 foi cedida pela UNOEX - UNIFESP, e a linhagem B16-F10
foi gentilmente cedida pelo Dr. Roger Chammas, vindas do banco de células do
laboratório de Oncologia da EPM/UNIFESP.
As células B16-F1 foram cultivadas em meio DMEM (Gibco) e as células
B16-F10 e B16-F10 Nex2 em meio RPMI (Gibco), ambos os meios suplementados
com 10% de soro bovino fetal e acrescidos de 40μg/ml de gentamicina, à 37°C em
estufa com atmosfera de 5% de CO
2
.
22
4.3 AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR MICOPLASMA NAS
LINHAGENS CELULARES B16-F1 E B16-F10 E, CARACTERIZAÇÃO
DAS MESMAS, UTILIZANDO MARCADORES
IMUNOHISTOQUÍMICOS
Antes de preparar o estoque de células a serem utilizadas neste projeto,
procedemos à avaliação das mesmas no que se refere à contaminação por
micoplasma e também à expressão de marcadores de superfície característicos de
células de melanoma.
A avaliação da presença ou não da contaminação por micoplasma foi feita
pelo método de PCR duplex. O protocolo utilizado para esta técnica, foi adaptado em
nosso laboratório a partir do sugerido pelo aluno de mestrado em andamento Clayton
Fagundes Machado, o qual gentilmente nos cedeu os iniciadores utilizados na reação.
• GAPDH: Foward: 5’ CTG CAC CAC CAA CTG CTTA 3’
Reverse: 5’ CAT GAC GGC AGG TCA GGTC 3’
• MICO: Foward: 5’GGC TGG GTG AGT AAC ACG 3’
Reverse: 5’CGG ATA ACG CTT GCG ACC TATG 3’
O tamanho do amplicon usando o iniciador GAPDH é de 350pb e o
empregando o iniciador para detecção de DNA de micoplasma 500pb.
Como controle positivo das reações foram usados DNAs extraídos de uma
linhagem, contaminada por micoplasma, N2a (Neuro-2a, neuroblastoma murino).
23
Como controle negativo foram usados DNAs da linhagem Mef CW
(fibroblastos provenientes de camundongos do tipo selvagem), livre de
contaminação. Estes controles nos foram gentilmente cedidos pela pesquisadora
Regina Nomizo.
Foi descongelada uma alíquota contendo 1ml de cada linhagem na quantidade
de 1x10
6
células (B16-F1 e B16-F10), em meio DMEM e RPMI respectivamente, e
as células foram centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos. Os sedimentos de células
foram lavados duas vezes em PBS e, finalmente homogeneizados em 500µl de
Solução de Lise (100mM Tris HCL pH 8,5; 5mM EDTA pH 7,5; 0,2% SDS; 200mM
NaCl; 100mg/ml PK; água q.s.p.) e, levados ao Termomix por 3 horas à 1000 rpm,
seguido de centrifugação por 5 minutos à 14.000 rpm. Foram acrescentados 500µl de
Isopropanol seguido de centrifugação por 5 minutos a 8000 rpm; lavados com etanol
(ETOH) 70% e novamente centrifugados por 5 minutos a 8000 rpm. Depois de secos,
os DNAs foram ressuspendidos em 30µl de água autoclavada.
Foi feito um “mix” para a PCR Duplex contendo, lX PCR buffer 10X; 1,5mM
MgCl
2
25mM; 4% DMSO; 0,25mM dNTP 25mM; 0,4 pmol/ μl MICO Fw 5pmol/μl;
0,4 pmol/ μl MICO Rv 5pmol/μl; 0,4 pmol/ μl GAPDH Fw 5pmol/μl; 0,4 pmol/ μl
GAPDH Rv 5pmol/μl; 0,125μl Taq Polimerase 5u/λ; água q.s.p. (feito dentro do
fluxo). Foram colocados 25 μl do “mix” em cada eppendorf acrescidos de 2 μl da
amostra. Os parâmetros da PCR foram: 1 ciclo de 5 minutos à 95°C; 29 ciclos de 1
minuto à 95°C, 1 minuto à 62°C, 1 minuto à 72°C por; 1 ciclo de 7 minutos à 72°C.
Foram aplicados 10 μl de cada produto amplificado, para serem fracionados
eletroforeticamente em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, em um
total de 6 amostras, sendo duas delas referentes aos controles (negativo e positivo).
24
Observamos, na amostra 7 (Figura 1), correspondente ao controle positivo, o
aparecimento de duas bandas amplificadas, uma de aproximadamente 500pb e outra
de aproximadamente 350pb, correspondentes respectivamente ao micoplasma e ao
GAPDH. Já nas amostras de DNA extraídas das culturas, vemos a amplificação de
apenas uma banda correspondente ao GAPDH. Mediante essas observações,
concluímos que o resultado do teste de PCR para micoplasma foi negativo para as
duas amostras de linhagens celulares testadas.
MICO
GAPDH
123 4 576
3801pb
265pb
678pb
1051pb
1718pb
2079pb
Legenda: Eletroforese em gel de agarose 1% dos DNAs extraídos dos cultivos das linhagens celulares
(B16-F1 e B16-F10). Foi realizada uma PCR duplex empregando iniciadores para micoplasma e
GAPDH, e como molde, DNAs extraídos de 1X10
6
células das linhagens B16-F1 e B16-F10. O
produto dessa PCR foi fracionado eletroforeticamente em gel de agarose 1%, corado com brometo de
etídio. Canaleta 1: Pel 45 digerido com Hind III usado como marcador de tamanho. Canaletas 2 e 3:
produto amplificado por PCR a partir do DNA extraído de B16-F1 e B16-F10, respectivamente.
Canaletas 4 e 5: produto amplificado por PCR a partir do DNA extraído de B16-F1 e B16-F10,
respectivamente, diluídos 1:10. Canaletas 6 e 7: produto amplificado por PCR a partir do DNA
extraído de amostras correspondentes, respectivamente, aos controles negativo e positivo.
Figura 1 - Avaliação de contaminação por micoplasma das linhagens de melanoma.
25
Para a caracterização das linhagens, foi descongelada uma alíquota contendo
1ml de cada linhagem celular na quantidade de 1x10
6
células e, cada uma foi
expandida até que atingisse uma confluência entre 70 – 90% em uma garrafa grande
(162 cm
2
). As células foram tripsinisadas e ressuspendidas em 10 ml de meio
apropriado. Foram feitas diluições seriadas (1:10), para obter-se os números de 10
6
,
10
5
, 10
4
, 10
3
células. Em cada poço da placa “Lab Tek” foram colocados 0,4 ml de
cada diluição (em duplicata). A placa permaneceu por 16 horas a 37°C em estufa
com atmosfera de 5% de CO
2
; após esse período
o meio foi aspirado e cada poço
lavado duas vezes com PBS. As lâminas foram cobertas com PBS e submetidas à
reação de imunocitoquímica utilizando os marcadores HMB45 e S100, com o auxílio
de Suely Nonogaki. Entretanto, o emprego deste protocolo acarretou em grandes
áreas de descolamento e perda das células.
O experimento foi, então, repetido com algumas alterações. Para tal, utilizou-
se uma garrafa grande (162 cm
2
) de cada linhagem celular. Os mesmos passos foram
seguidos, com exceção da ressuspensão dos sedimentos, que foi feita em 5 ml de
meio e, dessa vez, antes de plaquear as células as lâminas foram incubadas com SFB
por 30 minutos em estufa, nas mesmas condições descritas acima (por sugestão da
pesquisadora Dra. Ana Lepique). As células foram plaqueadas na quantidade de 10
5
células, por poço, em uma placa Lab Tek de oito poços. O restante do procedimento
seguiu como descrito anteriormente.
Foi realizada a reação de imunocitoquímica com os marcadores específicos
para melanoma, S100 (anticorpo policlonal) e o clone HMB45, ambos fabricados
pela DAKO A/S. O marcador S100, em tecido epitelial, marca melanócitos e células
de Langerhan. Sua marcação é tanto citoplasmática quanto nuclear. O HMB45 é um
26
marcador específico para melanossomo. O fabricante recomenda fazer sempre um
painel para S100 em paralelo com o HMB45, pois um resultado negativo para
HMB45 não descarta a possibilidade de um melanoma, como é o caso dos
melanomas desmoplásticos. Os controles negativos ficaram apenas sob tratamento
com BSA (Sigma).
Como pode ser observado na Figura 2, as células apresentam um forte padrão
de coloração para os marcadores S100 e HMB45, demonstrando que as linhagens
celulares que serão utilizadas durante o projeto são de origem melanocítica.
BC
FE
A
D
BC
FE
A
D
Legenda: As células B16-F1 (painéis A, B e C) e B16-F10 (painéis D, E e F) foram cultivados na
densidade 10
5
por 16 horas em placas Lab Tek de 8 poços. Após esse período as células foram
lavadas, fixadas e, a imunohistoquímica foi realizada com os marcadores específicos para melanoma,
HMB45 (painéis B e E) e S100 (C e F). Os painéis A e D são controles com BSA. Visualização no
aumento de 1000X.
Figura 2 – Imunohistoquímica das linhagens B16-F10 e B16-F1 utilizando os
marcadores HMB45 e S100.
27
4.4 EXPANSÃO E CONGELAMENTO DAS LINHAGENS CELULARES
DE MELANOMA MURINO
Uma vez verificada a integridade das linhagens celulares B16-F1 e B16-F10,
prosseguiu-se na preparação de um estoque congelado na mesma passagem para ser
usado em todo o projeto.
A linhagem celular B16-F1 foi cultivada em meio DMEM (D10),
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de L-glutamina. Já a
linhagem B16-F10 foi cultivada em meio RPMI (R10) suplementado com 10% de
SFB. As células permaneceram, durante sua cultura, em estufa à 37˚C com atmosfera
de 5% de CO
2
, até atingirem uma confluência de 80 a 90%. Neste momento o meio
das células era substituído por um novo e, três horas após essa troca as culturas eram
submetidas ao congelamento nos respectivos meios de cultura acrescidos de 40%
SFB e 10% DMSO. Os criotubos contendo as células foram estocados à -70˚C por 16
horas e posteriormente transferidos para o nitrogênio líquido (N
2
). Foram estocados
51 criotubos contendo 1x10
6
células B16-F1 e 15 contendo 2x10
6
células. Para a
linhagem B16-F10 foram armazenados 39 criotubos contendo 1x10
6
células e, 07
contendo 2x10
6
.
Antes de cada procedimento experimental onde se utilizaram as linhagens
celulares acima relatadas, foi seguido o seguinte padrão de descongelamento e
expansão; as células foram descongeladas no seu respectivo meio de cultura em
garrafa pequena (25 cm
2
de área) e cultivadas até atingirem uma confluência entre 70
– 90%; passaram para uma garrafa média (75 cm
2
de área) e, depois para 2 garrafas
grandes (162 cm
2
de área). Ao final, quando atingiram 70 a 90% de confluência, o
28
meio foi retirado, as células lavadas abundantemente com PBS e tripsinizadas,
utilizando tripsina 0,02%, durante 1 ou 2 minutos; sendo imediatamente
ressuspendidas em seu respectivo meio. Para avaliação do número de células e da
viabilidade celular, as células foram contadas em câmara de Neubauer utilizando-se
o método de exclusão pelo azul de Trypan. Só foram utilizadas nos experimentos as
preparações que apresentarem mais de 90% de viabilidade.
4.5 DETERMINAÇÃO DAS CURVAS DE CRESCIMENTO TUMORAL
DOS CAMUNDONGOS
Os camundongos tiveram os flancos previamente depilados com a ajuda de
um depilador elétrico e tesoura, e as células, em número indicado de acordo com
cada experimento, foram injetadas com agulha de 27,5G em volume de 0,2ml no
flanco direito. Em cada dois dias os dois maiores diâmetros do tumor foram medidos
e a área calculada. Os animais foram sacrificados quando o tumor atingir medida de
aproximadamente 3cm
2
para minimizar o sofrimento.
Para análise de sobrevida dos animais foi utilizado o teste de Log-Rank e para
a comparação entre as curvas a análise foi feita através do teste de Kruskal-Wallis.
Para todos os testes foi estabelecido um erro α=5%, isto é, os valores foram
considerados estatisticamente significativos quando p<0,05. Estas análises foram
conduzidas com o auxílio da Dra Karina Ribeiro do departamento de Registro
Hospitalar do Hospital do Câncer AC Camargo (RHC).
29
4.6 ANÁLISE HISTOLÓGICA
A pele ou tumor presentes na área de inoculação das células tumorais foram
removidos, com os animais já sacrificados pelo método de anestesia profunda, em
diferentes tempos após a inoculação. Os tumores ou peles que foram empregados na
análise histopatológica, foram imediatamente colocados, para fixação, em formol
tamponado. Após processamento, emblocamento em parafina e coloração com
hematoxilina-eosina, foram analisados com a supervisão do patologista Dr. Gilles
Landman, Departamento de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer AC
Camargo. Avaliaram-se os seguintes parâmetros: porcentagem de infiltrado
inflamatório, número de células tumorais, extensão de áreas necróticas e da área
tumoral. A confecção das lâminas foi realizada por Carlos Ferreira Nascimento e
Severino S. Ferreira, funcionários do Laboratório de Anatomia Patológica do
Hospital do Câncer A. C. Camargo.
A verificação de infiltrado inflamatório presente em cada lâmina foi realizada
com o auxílio de uma lente com gratículo; cuja grade é numerada de 0 a 100. A
estratégia utilizada foi contar os infiltrados inflamatórios presentes sobre a
intersecção das retas, contando-se até 10 campos por lâmina. A partir disso, obteve-
se a média dos valores, em porcentagem, dos campos registrados de cada lâmina.
Para a contagem do número de vasos foi utilizada uma lente com gratículo em linhas,
contando-se apenas os vasos presentes sob as retas, foram verificados até 10 campos
por lâmina.
No processo de análise fotomicrográficas, foram fotografados até dez campos
representativos de cada lâmina (uma lâmina por tumor / pele). Para isso utilizou-se
30
equipamentos como o fotomicroscópio Zeiss Axioskop 40, munido de câmera digital
Sony Cyber-Shot (3.3 mega pixels), acoplado ao computador Pentium III Fujitsu,
portador software AxioVision versão 3.1 (Zeiss) para análise das imagens. Os dados
registrados foram os referentes área de necrose. Em seguida calculou-se as médias
dos valores dos campos registrados de cada lâmina.
Já para a análise do parâmetro área tumoral, foram fotografadas a área
tumoral total de cada lâmina, num aumento de 1,25x, e escala de 680 x 512, com o
auxílio de microscópio Olympus IX70 acoplado a uma câmera Olympus DP70 e
através dos programas DPC Controller e DP Mannager da Olympus Optical. Para
análise dessas imagens foi utilizado o programa Image-Pro Plus versão 4.5.1.
31
RESULTADOS
32
5 RESULTADOS
5.1 PADRONIZAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS A SEREM
INJETADAS NOS CAMUNDONGOS E CONFIRMAÇÃO DA DOSE IDEAL
PARA INJEÇÃO
Para indução experimental do melanoma nos camundongos, as células de
cada linhagem foram injetadas no flanco traseiro direito dos animais, previamente
depilados com o auxílio de uma tesoura cirúrgica e um depilador manual. As
quantidades de células escolhidas para teste foram 1x10
6
, 1x10
5
, 5x10
5
e 5x10
4
. Os
camundongos foram contidos fisicamente e com cuidado, pela base da cauda e pela
pele da nuca contra a grade da tampa de uma gaiola. Em cada animal foi injetada a
quantidade de células estipulada, num volume total de 200 µl em PBS,
subcutâneamente no flanco direito, utilizando seringa de 1ml e agulha de 27,5G.
Foram utilizados 05 animais para cada experimento com quantidades de células
diferentes.
O crescimento tumoral foi monitorado a cada dois dias, utilizando-se um
paquímetro de precisão (Mitutoyo, Brasil), para medir os dois maiores diâmetros do
tumor e a área foi calculada. Os animais foram sacrificados quando os tumores
atingiram tamanho igual ou superior a 3cm
2
. Os dados foram utilizados na
construção de curvas de crescimento tumoral versus tempo de crescimento tumoral
utilizando o software GraphPad Prism4. Assim, pudemos analisar quais as duas
melhores quantidades de células que foram confirmadas em novo experimento, com
33
as quantidades de células escolhidas. A quantidade ideal de célula a ser escolhida
deveria formar tumor em praticamente 100% dos animais em menor tempo.
A inoculação das células de melanoma nos animais WTTg2, nas diferentes
quantidades celulares empregadas, levou ao desenvolvimento de tumores medindo
no máximo 0,5 cm
2
, em alguns animais, mas a partir, de paroximadamente, dia 10
após inoculação, esses animais iniciavam um quadro de regressão tumoral até que o
nódulo sumisse completamente (Figura 3). Testou-se, então, a eficiência de uma
quantidade maior de células, 2x10
6
e 3x10
6
células/animal (n= 05 para cada
experimento), mas o resultado observado foi semelhante ao das outras doses
aplicadas, como mostra a figura 3C. Alguns desses animais, enquanto restavam um
pequeno nódulo ou apenas a presença de mancha na pele, foram sacrificados pelo
método de anestesia profunda e autopsiados (Figuras 3 A e B). A análise histológica
da região de inoculação, obtida desses animais, mostrou a presença de macrófagos
contendo melanina em seu interior e total ausência de células tumorais de melanoma
viáveis.
Os dados obtidos a partir dos experimentos com a linhagem de camundongos
CD1 (WTTg2) indicavam que esses camundongos eram resistentes ao
desenvolvimento de tumores decorrentes da inoculação das linhagens celulares de
melanoma usadas. Uma vez que, tanto as células B16-F1 como a B16-F10, são
linhagens de melanoma murino originadas espontaneamente em camundongos
C57BL/6J, elas não são singenéicas à linhagem de camundongos CD1, portanto, a
incapacidade de originarem tumores nesta outra linhagem de camundongos é
compreensível. Entretanto, ainda na tentativa de avaliar se a expressão aumentada de
PTX3, nos animais Tg2, poderia alterar a resposta obtida na linhagem CD1, foram
34
feitos experimentos inoculando-se as quantidades de 2X10
6
e 3X10
6
células
tumorais/animal (n= 05 para cada experimento), tanto para B16-F1 quanto para B16-
F10. Como pode ser observado na Figura 4, o resultado obtido nos animais Tg2 foi
semelhante aos obtidos com os animais do tipo selvagem, apesar de observarmos em
alguns animais Tg2 tumores de 0,5cm
2
em média, metade do tamanho observado nos
animais WTTg2.
0 2 4 6 8 10 12 14
0. 00
0. 05
0. 10
0. 15
0. 20
0. 25
1X10
6
5X10
5
1X10
5
5X10
4
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
A
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0. 0
0. 5
1. 0
1X10
6
1X10
5
5X10
4
5X10
5
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
B
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
0. 00
0. 05
0. 10
0. 15
0. 20
0. 25
0. 30
0. 35
0. 40
0. 45
0. 50
2X10
6
3X10
6
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
C
)
Legenda: Os gráficos representam a média e o desvio padrão do crescimento e regressão dos tumores
experimentalmente induzidos pela inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F1
(painel A) e B16-F10 (painéis B e C) nas diferentes quantidades de células 1x10
6
, 5x10
5
, 1x10
5
, 5x10
4
(painéis A e B) e 2x10
6
e 3x10
6
(painel C) em animais WTTg2. A quantidade de animais utilizadas em
cada experimento foi igual a 05. As medidas foram tomadas a cada dois dias com auxílio de um
paquímetro manual.
Figura 3 - Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais WTTg2.
35
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
0.0
0.5
1.0
3X10
6
2X10
6
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
A
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3X10
6
2X10
6
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
B)
Legenda: Os gráficos representam a média e o desvio padrão do crescimento e regressão dos tumores
experimentalmente induzidos pela inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F1
(painel A) e B16-F10 (painel B) nas diferentes quantidades de células 2x10
6
e 3x10
6
em animais Tg2
(n=05). As medidas foram tomadas a cada dois dias com auxílio de um paquímetro manual.
Figura 4 - Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais Tg2.
Na Figura 5 são mostradas as curvas de crescimento de tumores
experimentalmente induzidos pela inoculação de células B16-F10 e B16-F1 em
camundongos WTKO. Todas as doses foram capazes de induzir tumor nesses
animais, porém a dose 1x10
6
células/animal (n=10) obedeceu melhor aos critérios
estabelecidos. Nesta dose, todos os animais apresentaram tumor no 8º dia pós-
inoculação, enquanto na dose de 5x10
5
células/animal (n=10), todos os animais
apresentaram tumor no 10º dia.
36
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
1X10
6
5X10
5
1X10
5
5X10
4
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
A
B)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
0
1
2
3
4
Dias após a injeção
Tamanho do tumor (cm
2)
B)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
0
1
2
3
4
Dias após a injeção
Tamanho do tumor (cm
2)
Legenda: Os gráficos representam a média e o desvio padrão do crescimento de tumores
experimentalmente induzidos pela inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F1
(painel A) e B16-F10 (painel B) nas diferentes quantidades de células; 1x10
6
, 5x10
5
, 1x10
5
e 5x10
4
,
em animais WTKO. Nas quantidades de células 1x10
6
, 5x10
5
foram utilizados 10 animais para cada
experimento, e nas demais quantidades foram utilizados 05 animais em cada experimento. O
crescimento do tumor foi monitorado a cada dois dias até que o mesmo atingisse aproximadamente
3cm
2
, quando, então os animais eram sacrificados. As medidas foram tomadas a cada dois dias com
auxílio de um paquímetro manual.
Figura 5 - Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais WTKO.
5.2 CURVA DE CRESCIMENTO TUMORAL VERSUS TEMPO DOS
ANIMAIS TG X WTTG
Visto que a linhagem celular, B16-F10, utilizada nos experimentos não
induziu tumores nos animais de background CD1, resolveu-se utilizar uma outra
linhagem celulas existente no laboratório, denominada B16-F10 Nex2, que já havia
sido avaliada, caracterizada, padronizada e utilizada em outro projeto do mesmo
grupo, mostrando-se capaz de induzir tumor nos animais da linhagem CD1. A partir
desse momento, os experimentos com essa nova linhagem celular, foram realizados
em parceria com a Dra Elaine G. Rodrigues, do Departamento de Disciplina Biologia
Celular – UNIFESP.
37
Em um primeiro momento, para construção da curva de crescimento tumoral,
foram inoculadas 1x10
6
células da linhagem B16-F10 Nex2 em 05 camundongos
Tg2 e, em 05 camundongos WTTg2 (Figura 6). O protocolo seguido foi o mesmo
que os anteriores. Apesar de que quando observamos o gráfico, ele nos sugerira a
existência de uma diferença entre os grupos; a analise estatística, de acordo com os
parâmetros anteriormente descritos para indução tumoral, demonstrou não haver
diferença estatística relevante entre os grupos; o que nos levou a supor que a
quantidade de células utilizadas era muito alta.
0 2 4 6 8 10 1214 1618202224 262830 32
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Wt
Tg2
Dias após inoculação
Tamanho tumor
Legenda: O gráfico representa a média e o desvio padrão do crescimento dos tumores
experimentalmente induzidos pela inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F10
Nex2 nas quantidades de 1x10
6
células em animais Tg2 e seus respectivos animais controles
(n=05/grupo). O crescimento do tumor foi monitorado a cada dois dias até que o mesmo atingisse
aproximadamente 3cm
2
, quando, então os animais eram sacrificados. As medidas foram tomadas a
cada dois dias com auxílio de um paquímetro manual.
Figura 6 - Curva de crescimento dos tumores induzidos experimentalmente em
animais Tg2 versus WTTg2.
Diante desse resultado, no experimento subseqüente utilizaram-se 17 animais
Tg2, 15 animais Tg4 (contendo quatro cópias extras para o gene PTX3) e, 17 animais
38
WTTg. Inoculou-se a quantidade de 5x10
5
células/animal, e os mesmos foram
monitorados em dias pontuais (18º, 22º, 25º, 29º e 31º). Com o auxílio do paquímetro
de precisão, mediu-se os dois maiores diâmetros do tumor e, com isso obteve-se a
área tumoral. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram tamanho
aproximado a 3cm
2
. Foi construído um gráfico, onde podemos notar que os animais
WTTg atingiram a medida máxima mais rapidamente do que os animais trangênicos.
Os dados coletados em cada dia foram analisados estatisticamente, através do teste
de comparações múltiplas de Tukey HSD, que demonstrou diferença significante
entre alguns grupos analisados nos dias específicos (Figura 7). Através do teste
Kruskal Wallis verificamos uma diferença estatisticamente relevante entre os três
grupos nos dias 22 (p= 0,007), 25 (p= 0,02), 29 (p= 0,019) e 31 (p= 0,011). No dia
18 nenhum dos animais apresentavam tumor. Com base nesse mesmo experimento,
foi feita uma análise para verificar o “Take Rate” (Figura 8) desses animais, ou seja,
a quantidade de animais que não apresentaram tumor até o final do experimento, o
resultado mostrou que cerca de 80% dos animais transgênicos (Tg2 e Tg4) não
apresentaram tumor, contra 41% dos animais WTs (p = 0,017 – teste de Q-
quadrado).
39
WT Tg2 Tg4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
p= 0,0067 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
A)
WT Tg2 Tg4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
p= 0,0205 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
B)
WT Tg2 Tg4
Legenda: Os gráficos representam o crescimento tumoral em dias aleatórios, 18º, 22º (gráfico A), 25º
(gráfico B), 29º (gráfico C) e 31º (gráfico D), dos animais Tg2 (n=17), Tg4 (n=15) e WTTg (n=17)
após inoculação de 5x10
5
células. O crescimento do tumor foi monitorado a cada dois dias até que o
mesmo atingisse aproximadamente 3cm
2
, quando, então os animais eram sacrificados. As medidas
foram tomadas a cada dois dias com auxílio de um paquímetro manual. O teste de “Kurskal-Wallis”
revelou diferença estatisticamente relevante entre o grupo WT versus Tg2 nos dias 22°, 25°, 29° e
31°, e entre o grupo WT versus Tg4 as diferenças estatísticas foram notadas apenas nos dias 29° e 31°.
Figura 7 - Gráficos de crescimento tumoral pontual.
0
1
2
3
4
5
p= 0,0188 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
C)
WT Tg2 Tg4
0
1
2
3
4
5
6
7
p= 0,0111 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
D)
WT Tg2 Tg4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
p= 0,0067 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
A)
WT Tg2 Tg4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
p= 0,0067 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
A)
WT Tg2 Tg4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
p= 0,0205 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
B)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
WT Tg2 Tg4
3.0
p= 0,0205 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
B)
WT Tg2 Tg4
0
1
2
3
4
5
p= 0,0188 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
C)
WT Tg2 Tg4
0
1
2
3
4
5
p= 0,0188 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
C)
WT Tg2 Tg4
0
1
2
3
4
5
6
7
p= 0,0111 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
D)
6
5
4
3
2
1
0
WT Tg2 Tg4
7
p= 0,0111 (Teste Kruskal Wallis)
Grupos
Tamanho tumor (cm
2
)
D)
40
Tg2 Tg4 WT
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
grupos
animais sem tumor (%)
Legenda: O gráfico representa o “Take Rate”, ou seja, a quantidade de animais que não apresentaram
tumor até o final do experimento. Os dados dessa análise foram retirados do experimento de dias
pontuais, representado pela figura acima. (p valor de 0,017 – teste Q-quadrado).
Figura 8 - Gráfico demonstrando o “Take Rate” entre os grupos.
5.3 CURVA DE CRESCIMENTO TUMORAL VERSUS TEMPO E
SOBREVIDA DOS ANIMAIS KO X WTKO
Para a realização da curva de crescimento tumoral foram utilizados 08
camundongos KO e 17 camundongos WTKO. Nesses animais foram inoculadas
1x10
6
células da linhagem B16-F10 por animal, seguindo o mesmo protocolo de
inoculação mencionado anteriormente. O crescimento tumoral foi monitorado a cada
dois dias, medindo-se os dois maiores diâmetros do tumor e a área foi calculada. Os
animais foram sacrificados quando os tumores atingiram tamanho aproximado a
3cm
2
.
Os dados foram utilizados na construção da curva de crescimento tumoral
versus tempo utilizando o software GraphPad Prism4, como mostra a figura 9. Esses
dados foram analisados estatisticamente com o auxílio da Dra Karina Ribeiro do
departamento de Registro Hospitalar do Hospital do Câncer AC Camargo, e
41
demonstraram não haver diferença estatística relevante entre os grupos. A análise da
curva de sobrevida desses animais demonstrou não ter diferença estatística relevante.
Esse resultado revelou que, possivelmente, a quantidade de células injetadas tenha
sido muito alta, podendo mascarar as possíveis diferenças entre os grupos. A partir
disso, resolvemos utilizar uma quantidade menor de células, 1x10
5
células/animal.
Para tal, foram utilizados 14 camundongos KO e 15 camundongos WTKO. As
análises da curva de crescimento tumoral versus tempo. E as curvas de sobrevida
desses animais, não demonstraram diferença estatística relevante.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
WTKO
KO
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
A
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
WTKO
KO
Dias após inoculação
Tamanho do tumor (cm
2
)
C
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Wt
KO
Dias após inoculação
% sobrevida
B
0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
KO
WTKO
Dias após a inoculação
% sobrevida
D
Legenda: Os gráficos A e C representam a média e o desvio padrão do crescimento dos tumores
experimentalmente induzidos pela inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F10
nas diferentes quantidades de células (A-1x10
6
e C-1x10
5
) em animais KO e WTKO. O crescimento
do tumor foi monitorado a cada dois dias até que o mesmo atingisse aproximadamente 3cm
2
, quando,
então os animais eram sacrificados. As medidas foram tomadas a cada dois dias com auxílio de um
paquímetro manual. Os gráficos B e D representam as curvas de sobrevida referente às doses descritas
para os gráficos A e C, respectivamente.
Figura 9 - Curva de crescimento dos tumores e sobrevida dos animais KO versus
WTKO.
42
5.4 INDUÇÃO DE TUMOR E COLETA DE MATERIAL EM
TEMPOS PRECOCES E TARDIOS APÓS A INJEÇÃO DAS CÉLULAS
TUMORAIS
Os animais Tg2 e seus respectivos WTs foram inoculados com 1X10
6
células
da linhagem B16-F10 Nex2, enquanto os animais KO e seus respectivos WTs
receberam a mesma quantidade de células da linhagem de melanoma B16-F10,
utilizando o método de inoculação já descrito anteriormente. Essa quantidade de
células foi escolhida porque foi preciso coletar amostras de tecido em 24 horas, um
tempo muito precoce, portanto era mais certeza de que com 1x10
6
as células já
estivessem em processo de implantação do que se usassemos a quantidade menor, de
5x10
5
, que foi a que demonstrou diferença estatisticamente significante entre os
grupos avaliados.
Para cada linhagem de camundongos, foram utilizados cinco animais para
cada tempo de sacrifício, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 10 dias, totalizando quarenta
animais. Em cada tempo, foram coletados soro e amostras de pele ou tumor, estas
últimas foram coletadas para a realização de lâminas para análise histológica. Logo
após a coleta as amostras foram fixadas em formol tamponado. Após processamento,
emblocamento em parafina e coloração com hematoxilina-eosina, foram preparados
cortes histológicos para análise.
43
5.5 ANÁLISES HISTOLÓGICAS DAS LÂMINAS DE AMOSTRAS
DE PELE E TUMOR COLETADOS
Essas análises foram feitas com a supervisão do patologista Dr. Gilles
Landman, Departamento de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer AC
Camargo.
Para analisar os parâmetros área de necrose (Figura 10) e número de células
tumorais (Figura 12), foram fotografados até dez campos representativos de cada
lâmina, num aumento de 400x e, as imagens foram analisadas através do software
AxioVision versão 3.1, e foi calculada a média por lâmina, para cada um dos
parâmetros. A verificação da porcentagem de infiltrados inflamatórios (Figura 13)
presentes em cada lâmina, foi realizada com uso de lente com gratículo (grade
numerada de 0 a 100), num aumento de 1000x; onde foram contadas as células
inflamatórias presentes sobre a intersecção das retas. Foram contados até 10 campos
por lâmina. Foi calculada a média dos valores, em porcentagem, dos campos
registrados de cada lâmina.
Já para a análise do parâmetro área tumoral (Figura 11), foram fotografadas a
área tumoral (Figura 14) total de cada lâmina, num aumento de 1,25x escala de 680 x
512, através dos programas DPC Controller e DP Mannager da Olympus Optical.
Para mensurar essas áreas foi utilizado o programa Image-Pro Plus versão 4.5.1.
Os dados referentes à área tumoral, número de células tumorais, média da
área de necrose, e média da porcentagem de infiltrados inflamatórios por lâmina,
foram utilizados para a construção dos gráficos representados pelas Figuras 10-13
44
feitos através do software GraphPad Prism 4. O teste estatístico utilizado foi o Mann-
Whitney.
0
10000
20000
30000
40000
50000
Tg2
10dias72hs
WtTg2
48hs
Tg2
Wt
24hs
Wt Wt
WT
Tg2
Tg2
Ár
Legenda: O gráfico representam a média e o desvio padrão da área de necrose das lâminas
histológicas confeccionadas a partir de amostras de pele ou tumor experimentalmente induzidos pela
inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F10 Nex2 na quantidade de 1x10
6
células em animais Tg2 e WTTg2. A análise foi feita com a utilização do programa AxioVision
versão 3.1, e a análise estatística foi feita pelo teste de Mann-Whitney.
Figura 10 - Gráfico de área de necrose em tempos iniciais e tardios.
De acordo com os resultados demonstrados pelos gráficos das figuras 10, 11,
12 e 13, referentes ao grupos Tg2 e WTTg2 nota-se uma diferença estatisticamente
significante somente em 48 horas nos parâmetros infiltrado inflamatório (p= 0,015),
área de necrose (p= 0,007) e número de células tumorais (p= 0,007).
ea de necr e ( m
2
os
μ
)
p = 0,007
0
10000
20000
30000
40000
50000
Tg2
10dias72hs
WtTg2
48hs
Tg2
Wt
24hs
Wt Wt
WT
)Ár ecr e ( m
2
Tg2
μ
os
p = 0,007
e nea d
Tg2
45
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tg2
24hs
Wt
Tg2
48hs
Wt
Tg2
10 dias
Wt
Área Tumoral (
μ
m
2
)
Legenda: O gráfico representam a média e o desvio padrão da área tumoral das lâminas histológicas
confeccionadas a partir de amostras de pele ou tumor experimentalmente induzidos pela inoculação
subcutânea das células de melanoma murino B16-F10 Nex2 na quantidade de 1x10
6
células em
animais Tg2 e WTTg2. A análise foi feita com a utilização do programa Image-Pro Plus versão 4.5.1,
e a análise estatística foi feita pelo teste de Mann-Whitney.
Figura 11 - Gráfico de área tumoral em tempos iniciais e tardios.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tg2 Wt
24hs
Tg2
48hs
WtTg2
72hs
Tg2
Wt
10dias
Wt
p=
0.0079
WT
Tg2
ulas
de cél
Nº
Legenda: O gráfico representa a média e o desvio padrão do número de células presentes nas lâminas
histológicas confeccionadas a partir de amostras de pele ou tumor experimentalmente induzidos pela inoculação
subcutânea das células de melanoma murino B16-F10 Nex2 na quantidade de 1x10
6
células em animais Tg2 e
WTTg2. A contagem foi feita com a utilização do programa Image-Pro Plus versão 4.5.1. A análise estatística foi
feita pelo teste de Mann-Whitney.
Figura 12 - Gráfico de número de células em tempos iniciais e tardios.
46
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tg2 Wt
24hs
Tg2 Wt
48hs
WtTg2
72hs
Tg2
Wt
Tg2
WT
10dias
% Infiltrados
0.0159
p=
Legenda: O gráfico representa a média e o desvio padrão da porcentagem de infiltrados inflamatórios
presentes nas lâminas histológicas confeccionadas a partir de amostras de pele ou tumor
experimentalmente induzidos pela inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F10
Nex2 na quantidade de 1x10
6
células em animais Tg2 e WTTg2. A contagem foi feita com a
utilização de uma lente com gratículo, contando-se até 10 campos de cada lâmina. A análise estatística
foi feita pelo teste de Mann-Whitney.
Figura 13 - Gráfico de infiltrados inflamatórios em tempos iniciais e tardios.
Legenda: As fotos representam lâminas confeccionadas a partir de amostras de pele ou tumor
experimentalmente induzidos pela inoculação subcutânea das células de melanoma murino B16-F10
Nex2 na quantidade de 1x10
6
células em animais Tg2 (A e C) e WTTg2 (B e D), em tempo inicial de
24 horas (A e B) e tardio de 10 dias (C e D). Verificamos a área total de tumor presente em cada
lâmina.
A
C
B
D
A
C
B
D
Figura 14 - Lâminas de H.E. de amostras de tumor em tempo inicial e tardio.
47
DISCUSSÃO
48
6 DISCUSSÃO
Para o desenvolvimento do presente trabalho utilizamos duas linhagens de
melanoma murino, B16-F1 e B16-F10. Por não apresentarem diferenças no que diz
respeito ao desenvolvimento tumoral, em nenhuma das linhagens de camundongos,
escolhemos continuar apenas com a linhagem B16-F10. A partir disso, realizamos
experimentos com intuito de padronizar a quantidade ideal de células a ser utilizada
para os experimentos de crescimento tumoral. Estipulamos um critério de escolha
(como relatado anteriormente no item 4.3), segundo o qual, a quantidade de células
seria de 1x10
6
para a linhagem B16-F10 nos camundongos do tipo selvagem.
Contudo, ao realizarmos a inoculação da referida quantidade de células nos animais
WTTg2, os resultados revelaram que esses camundongos eram resistentes ao
desenvolvimento dos tumores decorrentes da inoculação das linhagens celulares de
melanoma usadas. Uma vez que, tanto as células B16-F1 como a B16-F10, são
linhagens de melanoma murino originadas espontâneamente em camundongos
C57BL/6J (inbred), elas não são singenéicas à linhagem CD1 (outbred, originados a
partir de camundongos Swiss), demonstrando assim, incapacidade de originarem
tumores que progridam nesta outra linhagem de camundongos. Camundongos
utilizados como modelo tumoral, podem apresentar regressões espontâneas ou falha
na progressão do tumor, sugerindo uma incompatibilidade tumor-hospedeiro, que
acaba dificultando o uso de camundongos dessa linhagem como modelo tumoral
(CORBETT et al. 2002). É sabido que a incompatibilidade tecido-hospedeiro pode
ser explicada pela diferença alélica de MHC entre raças diferentes de camundongos
49
(ABBAS et al. 2003). Os camundongos C57BL/6J apresentam MCH H-2b, e os
CD1 possuem MHC diferente, já que são originados dos camundongos Swiss e, estes
possuem MHC H-2k, o que pode ter contribuído para que ocorra uma
incompatibilidade tumor-hospedeiro. Prévios estudos realizados em nosso
laboratório revelaram que uma outra linhagem de melanoma murino denominada
pelo laboratório como B16-F10 Nex2 se mostrava capaz de induzir tumor nesse
grupo de animais (background CD1). Linhagens celulares que são mantidas em
cultura por longo período, submetidas a muitas passagens, podem apresentar perda
ou ganho da expressão de algumas moléculas (LANGDON 2004), tornando-as mais
ou menos agressivas quando utilizadas em experimentos in vivo. Por esses motivos
essa sub-linhagem, Nex2, pode conseguir driblar a incompatibilidade tumor-
hospedeiro, desenvolvendo-se em camundongos CD1. Resolvemos, então, utilizar
essa linhagem em nosso projeto, solucionando assim a problemática de implantação
de tumores nos camundongos do grupo dos transgênicos.
Estipuladas as linhagens celulares ideais para cada grupo, B16-F10 para os
camundongos do grupo dos nocautes e B16-F10 Nex2 para os camundongos do
grupo dos transgênicos, ambos na concentração de 1x10
6
por animal inoculados no
tecido subcutâneo, demos seguimento aos experimentos.
Os resultados obtidos na comparação do crescimento tumoral dos animais
Tg2 em comparação com seus respectivos selvagens (WTTg), demonstraram que na
quantidade de células estipuladas, 1x10
6
, não observamos diferenças estatisticamente
significativas no crescimento dos tumores.
Diante desses resultados, decidimos observar se ao diminuir a quantidade de
células inoculadas nesses mesmos grupos de animais, essa diferença estatística de
50
crescimento tumoral entre os grupos poderia ser observada. Testamos, então, a
quantidade de 5x10
5
células, cuja diferença estatística entre os grupos demonstrou
significância no experimento de dias pontuais. No dia 22° os animais WTTg2
apresentaram uma média de área tumoral de 0,24 cm
2
enquanto os Tg2 apresentaram
uma média de aproximadamente 0,03 cm
2
(p= 0,007), no dia 25° os animais WTTg2
apresentaram uma média de área tumoral de 0,60 cm
2
enquanto os Tg2 apresentaram
uma média de aproximadamente 0,07 cm
2
(p= 0,02), no dia 29° os animais WTTg2
apresentaram uma média de área tumoral de 1,25 cm
2
enquanto os Tg2 apresentaram
uma média de aproximadamente 0,10 cm
2
(p= 0,019) e no dia 31º os animais WTTg2
apresentaram uma média de área tumoral de 2,0 cm
2
enquanto os Tg2 apresentaram
uma média de aproximadamente 0,20 cm
2
(p= 0,011). No dia 18 nenhum dos animais
apresentavam tumor. Além disso, os animais WTTg apresentou um maior “Take
Rate”, ou seja, maior número de animais que apresentaram tumor (59%), contra
aproximadamente 20% dos animais transgênicos (Tg2 e Tg4) com tumor (p= 0.017).
Analisando os resultados do experimento de dias pontuais em conjunto, podemos
sugerir que os animais que possuem uma super-expressão de PTX3, apresentam não
só um crescimento tumoral mais retardado, mas também uma maior dificuldade de
implantação desse tumor.
Para o entendimento dos possíveis mecanismos envolvidos na implantação,
crescimento e progressão tumoral realizamos a análise histológica dos tumores
provenientes de inoculação de 1x10
6
células B16-F10 nos animais WTTg e Tg2. Ao
analisarmos as lâminas quanto a área tumoral, não verificamos existência de
diferença estatisticamente significativa entre os grupos em nenhum dos tempo
analisados (24 e 48 horas, e 10 dias), sendo que em 10 dias os animais Tg2
51
apresentaram uma área tumoral um pouco maior em relação aos seus controles. A
inexistência de diferença entre os grupos pode ser explicada pelo fato dos tempos
analisados serem muito precoces, afinal só conseguimos ver tumor mensurável a
partir do 4º dia após inoculação de 1x10
6
células e só detectamos diferença estatística
significativa a partir do 22° dia após inoculação de 5x10
5
células. Com relação ao
infiltrado de células inflamatórias na massa tumoral evidencia-se diferença
significante apenas no tempo de 48 horas, com menor quantidade de células nos
animais Tg2 do que nos WTTg (p= 0,015). Porém, os resultados obtidos nos outros
tempos sugerem que enquanto nos animais WTTg o perfil de células infiltrantes
dimunui com o tempo, no grupo Tg2 ocorre o inverso, ou seja, o aumento do
infiltrado inflamatório durante os mesmos períodos observados. Tumores sólidos
freqüentemente apresentam células inflamatórias infiltrantes (MANTOVANI et al.
1992). Desta maneira, níveis elevados de leucócitos infiltrantes dentro de tumores
primários são sinais de bom prognóstico (MASSI et al. 1999). Em contrapartida, a
presença dessas células têm sido correlacionado com a produção de citocinas e
fatores de crescimento, que podem promover um favorável microambiente para a
progressão neoplásica (ROLLINS 1997; NAGTEGAAL et al. 2001; LIN et al. 2001;
POLLARD 2004). É consenso na literatura que o processo inflamatório crônico
propicia o desenvolvimento de tumores, pois em meados do século XIX, Rudolf
Virchow pela primeira vez hipotetizou que a origem de neoplasias ocorreria em sítios
de inflamação crônica, baseado na observação que alguns agentes irritantes,
juntamente com injúria tecidual e conseqüente inflamação, aumentava a proliferação
celular (COUSSENS e WERB 2002). Além disso, alguns estudos mostram que um
processo inflamatório agudo pode favorecer a progressão tumoral de melanoma, a
52
partir de uma injeção de um elevado número de células apoptóticas em conjunto com
uma pequena quantidade de células tumorais (CORREA et al. 2005). Isso corrobora
os resultados encontrados, pois a porcentagem de células infiltrantes nos
camundongos WTTgs é mais intenso nas primeiras horas, revelando um processo de
inflamação aguda que diminui com o tempo. A presença de células do sistema
imune, principalmente fagócitos como neutrófilos, macrófagos e em alguns casos
eosinófilos, suporta a observação da inflamação. Neutrófilos são as primeiras células
recrutadas para o sítio de inflamação aguda, atuando na fagocitose de células mortas
ou agentes infecciosos presentes na região (COUSSENS e WERB 2002). Além
disso, secretam moléculas que favorecem o aumento e/ou a manutenção do processo
inflamatório. No processo de iniciação e promoção da carcinogênese, o papel dessas
células continua incerto, embora elas estejam presentes em pequeno número em
alguns tumores, podendo tanto favorecer a resposta do hospedeiro ao tumor, como
favorecer o crescimento e a progressão tumoral, por exemplo, produzindo uma fonte
abundante de fatores angiogênicos, como IL-8, VEGF e metaloproteínases
(CORREA et al. 2005). Monócitos, que se diferenciam em macrófagos dentro dos
tecidos, são as próximas células a migrar para o sítio de injúria, guiados por
moléculas quimioatraentes, fagocitando células mortas, agentes infecciosos e quando
ativados, produzem são a principal fonte de citocinas e fatores de crescimento
(COUSSENS e WERB 2002). A presença de macrófagos associados ao tumor
(TAMs) está relacionada com um duplo papel na progressão tumoral, pois pode atuar
eliminado células neoplásicas, quando ativadas por interferon e IL-12, podem
também produzir potentes fatores angiogênicos, citocinas e proteases que favorecem
a progressão do tumor (COUSSENS e WERB 2002) mas o aumento do número
53
dessas células está também relacionado com um pior prognóstico em alguns tumores
(SICA et al. 2006). A ativação dessas células para esse perfil acontece pela
fagocitose de células em apoptose e pela presença certas de moléculas, como por
exemplo TGFβ. Dentre os fatores de crescimento produzidos pelos TAMs temos o
FGFs e EGF que promovem o aumento do número de células, a angiogênese, a
capacidade invasiva e metastática das células tumorais. Além disso, é evidenciado
um acúmulo dessas células em áreas de hipóxia e produção de diversas moléculas
promovendo a angiogênese (LEWIS e MURDOCK 2005). Diante desses aspectos, a
menor concentração do infiltrado inflamatório nos animais Tg2 nas primeiras horas
após a inoculação pode, diferentemente dos animais do tipo selvagem, não
proporcionar a produção de moléculas e a “limpeza” desse microambiente,
dificultando a progressão tumoral. De acordo com Dias 2001, no plasma dos animais
Tg2 (7.16 ng/ml) existe um nível basal maior da citocina imunoregutadora IL-10 em
comparação com os seus controles (0.18 ng/ml). IL-10 é uma importante citocina
imunoregulatória produzida por diversos tipos celulares. Sua principal função
biológica é limitar e ajudar na resolução do processo inflamatório e também da
regulação da diferenciação e diferenciação de várias células do sistema imune
(ASADULLAH et al. 2003). Essa citocina atua de forma indireta no sistema imune,
inibindo a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-8 GM-CSF e TNF)
pelas células T helper, monócitos/macrófagos e células polimorfonucleadas (ZHENG
et al. 1996). A inibição da secreção de IL-8 resulta na diminuição da quimioatração
de leucócitos para o ambiente tumoral onde existe um processo inflamatório. Além
disso, a produção de PTX3 nos animais Tg2 fica prejudicada pelo fato dessa citocina
inibir a secreção de IL-10 e TNF, que são responsáveis pelo estímulo que leva a
54
produção de PTX3. Os resultados mostram que durante os tempos analisados, o
crescente aumento do infiltrado inflamatório no ambiente tumoral pode estar
relacionado a uma possível mudança no perfil de citocinas, com o aumento de
citocinas pró-inflamatórias, favorecendo uma maior quimioatração bem como a
produção de PTX3.
Na análise das curvas de crescimento tumoral para o grupo de camundongos
deficientes para o gene PTX3 e seus respectivos controles, observamos não haver
diferença estatística quanto ao crescimento tumoral. Isso pode ser explicado pelo fato
de que 1x10
6
é uma grande quantidade de células inoculadas, dificultando a obtenção
de uma possível diferença entre esses grupos. Diante disso, utilizou-se uma nova
concentração de células, 1X10
5
, na tentativa de encontrar diferença no crescimento
tumoral entre os grupos de animais. Porém, mesmo com essa nova estratégia, os
resultados demonstraram que independentemente da quantidade de células utilizada,
não foi observada diferença no crescimento tumoral entre esses animais, sugerindo
que a expressão basal ou a falta de expressão da proteína PTX3 não causa impacto
biológico significativo que influencie o crescimento tumoral do melanoma. A análise
histológica da quantidade de células infiltrantes na massa tumoral nos tempos de 24,
48, 72 horas e 10 dias, bem como a quantidade de vasos encontrados (dado não
apresentado), na mesma região e nos mesmos tempos, mostra que não ocorre
diferença entre os grupos, fato que corrobora com os resultados de crescimento
tumoral.
A expressão de PTX3 está relacionada ao desenvolvimento de um processo
inflamatório, pois o aumento dessa molécula evidencia o aumento da inflamação. Ela
é produzida localmente em sítios inflamatórios sob o controle de sinais pró-
55
inflamatórios. As principais células produtoras dessa proteína são as células
endoteliais ou fibroblastos, e células de linhagens monocíticas (ALLES et al. 1994;
GOODMAN et al. 1996). Outro aspecto relatado à uma possível função do PTX3 é
sua ligação a células em apoptose, favorecendo o reconhecimento e a eliminação
dessas células mortas pelos fagócitos (ROVERE et al. 2000). Um processo intenso
de inflamação pode promover a indução de apoptose em uma grande quantidade de
células, pois estipula-se que a apoptose não gera inflamação, em parte, devido à
produção de citocinas supressoras, como por exemplo IL-10 e TGF-β, por células
fagocíticas (OGASAWARA et al. 1993; HEASMAN et al. 2003). Contudo, células
;apoptóticas podem promover uma resposta inflamatória dependendo de como a
apoptose foi iniciada, em quais tipos celulares está ocorrendo e da presença ou não
de co-fatores (FREIRE-DE-LIMA et al. 2000; RESTIFO 2001; MISAWA et al.
2001; LORIMORE et al. 2001). A existência de um intenso processo de apoptose em
um órgão fisiologicamente não preparado para esse evento, pode falhar na
eliminação das células apoptóticas com conseqüente necrose, e início de uma
resposta inflamatória (OGASAWARA et al. 1993; HEASMAN et al. 2003). De
acordo com os resultados obtidos, nos animais WTTg2 a presença de necrose é maior
do que nos animais transgênicos (p= 0,007), especialmente em 48 horas. Esses dados
sugerem que a expressão aumentada de PTX3 pode favorecer o reconhecimento e a
eliminação de muitas células mortas, tanto tumorais como infiltrantes, pelo fato da
PTX3 atuar como opsonina (DINIZ et al. 2004). Como discutido anteriormente, a
menor porcentagem de infiltrado inflamatório e uma menor produção de PTX3 nos
animais Tg2, pela ação da IL-10, nos tempos iniciais juntamente com a evolução
56
gradativa do processo inflamatório, sugere uma relação com os dados observados nas
áreas de necrose no ambiente tumoral.
A angiogênese é o processo de formação de novos vasos a partir de outros
pré-existentes, tendo um papel importante em diversas condições fisiológicas e
patológicas (incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização, a inflamação e
o crescimento tumoral) (CARMELIET e JAIN 2000). Numerosos indutores
angiogênicos foram identificados incluindo os membros da família do VEGF,
angiopoetinas, TGF-α e TGF-β, PDGF, TNF, interleucinas, quimiocinas e membros
da família do FGF (PRESTA et al. 2005). O FGF-2 é o mais importante fator de
crescimento autócrino em melanoma (NORRBY 2000). Estudos mostram que a
interação de PTX3 com FGF-2, em células endoteliais, inibe a proliferação celular,
bem como a angiogênese em membrana córeo alantóide embrionária (RUSNATI et
al. 2004). Os resultados obtidos na contagem dos vasos, marcados com anti-CD34
(dados não apresentados) existentes no tumor, não apresentaram diferença
estatisticamente significante tanto entre o grupo dos animais Tg2 versus WTTg2,
quanto no grupo dos animais KO versus WTKO. Apesar da elevada concentração
sérica de PTX3 nos animais WTTg2 nas primeiras horas após a inoculação das
células tumorais, o processo de angiogênese não foi alterado pela interação PTX3 /
FGF-2, com desenvolvimento progressivo do tumor. Nos animais Tg2 o aumento
progressivo de PTX3 sérico também não alterou o processo de angiogênese. A
análise imunohistoquímica para FGF-2 não mostrou diferença na expressão desse
fator de crescimento entre os grupos Tg2 versus WTTg2 em amostras de tumores
coletados 10 dias após a inoculação das células tumorais. Uma possível explicação
para a não diferença encontrada é que ao invés do PTX3 agir somente na inibição da
57
ação do FGF-2 sobre a célula tumoral, esta molécula estaria favorecendo o processo
inflamatório e promovendo a eliminação das células em apoptose, como já discutido
acima. Além disso, como mencionado acima, outras moléculas tem função
angiogênicas e podem ter sido produzidas em substituição ao FGF-2.
Os resultados obtidos na contagem de células tumorais revelaram que em 24
horas a quantidade de células de melanoma era maior nos animais Tg2, especulando-
se que esse fato é devido a existência de uma menor quantidade de células
infiltrantes. Nos animais WTTg, onde a presença de células inflamatórias foi maior,
notamos haver uma menor quantidade de células tumorais. Em 48 (p= 0,007) e 72
horas observa-se um aumento do número de células tumorais com diminuição do
infiltrado inflamatório nos animais WTTg. Já nos animais Tg2 em 48 e 72 horas,
graças ao aumento do infiltrado inflamatório no microambiente tumoral, o número de
células tumorais diminui. Isso mostra que, possivelmente, exista uma correlação
inversa entre a presença do infiltrado inflamatório e número de células tumorais nas
áreas analisadas.
58
CONCLUSÕES
59
7 CONCLUSÕES
• As linhagens de melanoma B16F-10 Nex2 em camundongos transgênicos e
seus respectivos controles, promoveram menor crescimento tumoral e uma
maior dificuldade de implantação desse tumor nos camundongos
transgênicos.
• Os resultados observados nos camundongos nocautes e seus respectivos
controles, sugerem que a expressão basal ou a falta de PTX3 não causa
impacto biológico significativo que influencie no crescimento de tumores de
melanoma.
• Notamos uma menor concentração de células inflamatórias nos animais
transgênicos em 24, 48 e 72 horas após a inoculação das células de
melanoma, e maior concentração dessas células nos animais transgênicos.
• Os animais WTTg2 apresentaram maior área de necrose em comparação com
os Tg2, especialmente em 48 horas, sugerindo que a expressão aumentada de
PTX3 pode favorecer o reconhecimento e a eliminação de células em
processo de morte, tanto as tumorais quanto as inflamatórias, devido essa
proteína atuar como opsonina.
• Notamos um aumento do número de células tumorais em 48 e 72 horas nos
animais WTTg2. Ao analisarmos esse dado em conjunto com a análise de
infiltrado inflamatório, notamos a existência de uma correlação inversa entre
a presença de células inflamatórias e o número de células tumorais.
60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
61
8 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. Cellular and molecular immunology. 5
th
ed.
Philadelphia: W B Saunders; 2003. Transplante of immunology; p.363-82.
Al-Alousi S, Barnhill R, Blessing K, Barksdale S. The prognostic significance of
basic fibroblast growth factor in cutaneous malignant melanoma. J Cutan Pathol
1996; 23:506-10.
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