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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
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Cristina Claumann Freygang
Orientadora: Profa. Dra. Margarete Suñé Mattevi
Co-orientadora: Profa. Dra. Loreta Brandão de Freitas
Tese submetida ao Programa de Pós-
graduação em Genética e Biologia
Molecular da UFRGS como requisito
parcial para a obtenção do grau de Doutor
em Ciências
Porto Alegre
Novembro/2006
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Este trabalho foi desenvolvido na
Universidade Federal do Rio Grande do
Sul - UFRGS e financiado pelos
seguintes órgãos: CNPq, G7/FINEP,
CAPES, FAPERGS e OEA
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O sentido da vida by Quino
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AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, profa. Dra. Margarete Suñe Mattevi, por acreditar em
meu potencial e aceitar trabalhar com organismos tão diferentes de sua linha de
pesquisa acrescentando muito a minha formação profissional;
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Loreta Brandão de Freitas;
Ao Prof. Sérgio L. Althoff Msc, por toda ajuda;
Ao Prof. Dr. Thales R.O. de Freitas, ao Prof. Dr. Luiz F.B. de Oliveira, a
Fernanda Trierveiler Msc., Denis Sana e à bióloga Andréa Nunes pelo
fornecimento das amostras;
À Gabriela Camargo pela ajuda com a extração do material e a Ana Letícia
Pereira pela valiosa ajuda no laboratório:
Aos meus colegas da sala 107, Bianca Carvalho, Gustavo Miranda,
Jaqueline Andrades-Miranda, Martin Montes e Luciano Silva, a todos os colegas
do lab. 108 e demais agregados especialmente a Andréa Marrero, Paula Quiroga,
Taiana Haag e Teresa V. Freire, além de todos os muitos amigos da Genética;
À Valéria Muschner pelas dicas com o PAUP;
Ao Elmo e a Ellen por todos os galhos quebrados;
A todos os meus amigos de “caminhadas orientadas”;
Ao CNPq, pelo fornecimento da bolsa e ao G7/FINEP, CAPES, FAPERGS
e OEA pelo apoio financeiro;
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular,
Aos meus pais, Maria Claudete e Frederico, e a minha irmã Tatiana por
tudo;
Aos muitos que ajudaram e que não foram citados aqui, devido à
caduquice de uma mente estressada;
Aos meus morceguinhos...
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Agradecimentos................................................... ............................................III
Sumário..............................................................................................................IV
Lista de Figuras.................................................................................................VI
Lista de Tabelas.................................................................................................IX
Resumo...............................................................................................................X
Abstract.............................................................................................................XII
Capítulo 1: INTRODUÇÃO..................................................................................1
1.1. A ordem Chiroptera.... .................................................................... 1
1.2. Família Phyllostomidae................................................................... 6
1.3. Marcadores moleculares e estudos em quirópteros ..................... 10
Capítulo 2: OBJETIVOS....................................................................................15
Capítulo 3: ARTIGO 1.………………………………………………………………16
3.1. Abstract ........................................................................................ 17
3.2. Introduction................................................................................... 17
3.3. Materials and Methods ................................................................. 19
3.4. Results.......................................................................................... 23
3.5. Discussion .................................................................................... 27
3.6. References ................................................................................... 34
Capítulo 4: ARTIGO 2.………………………………………………………………47
3.1. Abstract ........................................................................................ 48
3.2. Introduction................................................................................... 48
3.3. Materials and Methods ................................................................. 50
3.4. Results.......................................................................................... 53
3.5. Discussion .................................................................................... 56
3.6. References ................................................................................... 60
Capítulo 5: ARTIGO 3……………………………………………………………….69
3.1. Abstract ........................................................................................ 70
3.2. Introduction................................................................................... 71
3.3. Materials and Methods ................................................................. 73
3.4. Results.......................................................................................... 76
3.5. Discussion .................................................................................... 79
3.6. References ................................................................................... 84
Capítulo 6: DISCUSSÃO...................................................................................94
ANEXO 1..........................................................................................................105
ANEXO 2..........................................................................................................109
ANEXO 3..........................................................................................................116
ANEXO 4..........................................................................................................130
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................135
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Capa: De baixo para cima 1- Desmodus rotundus. Retirado de http://www.uni-
bayreuth.de/departments/ddchemie/umat/knoblauch2/knoblauch2.htm; 2-
Rhinophyla pumilio. Foto de Nancy Simmons; 3- Espécie não
identificada. Retirado de http://www.batcon.org/vrcnew/index.asp?curpa
ge=5&sortField=#; 4- Vampyressa pusilla. Foto de Marcos Tschapka; 5-
Espécie não identificada. Retirado de
www.cpap.embrapa.br/peld/peld_temas2.htm. Importante salientar que
as relações apresentadas na capa não refletem as relações filogenéticas
entre as espécies.
Capítulo 1
Figura 1: Biodiversidade de morcegos baseada no número de espécies em
500km2 (Retirado de FINDLEY,1993). O gradiente de cores aumenta a
cada 20 espécies e vai do branco (sem morcegos presentes) até
vermelho (120 espécies ou mais)............................................................1
Figura 2: Apêndice nasal. Foto de Marcos Tschapka.............................................7
Figura 3: Principais características morfológicas externas utilizadas para
reconhecimento das famílias de Quiroptera. Uropatágio equivale a
membrana interfemural. Figura cedida por Sérgio L. Althoff...................8
Capítulo 3
Figure 1: 1a. Maximum Likelihood tree for cytochrome b gene. Likelihood settings
from best-fit model (TrN+G) selected by hLRT: Lset Base=(0.2908
0.3014 0.1296) Nst=6 Rmat=(1.0000 4.1839 1.0000 1.0000 16.3966)
Rates=gamma Shape=0.2132 Pinvar=0. Numbers above branches are
bootstraps values. Cerrado Atlantic Rainforest northern South
America ♦ Central America. 1b. Neighbor-Joining analysis tree for
combined analyses of cyt b ad RAG2 genes under ML parameters.
7
Likelihood settings from best-fit model (TrN+I+G), gamma shape=1.3359
and Pinvar=0.6767. Numbers above branches are bootstraps
values……………………………………………………………45
Figure 2: Mismatch distributions of Artibeus lituratus of cyt b gene. The histogram
shows the observed distribution of pairwise differences between the
individuals of analysed populations. The line shows the expected
distribution for a growing population under the sudden expansion model.
The x-axis refers to the number of differences between pairs of
haplotypes; the y-axis shows the observed/expected occurrence of each
pairwise difference. 2b: Mismatch distributions of Artibeus lituratus of cyt
b + RAG2 genes. 2c: Mismatch distributions of Artibeus fimbriatus. 2d:
Mismatch distributions of Artibeus fimbriatus of cyt b + RAG2 genes. 2e:
Median-joining network for mitochondrial cyt b haplotypes of Artibeus
lituratus. Gray circles represent Atlantic Forest haplotypes; black circles
represent Cerrado haplotypes; hollow circles represent haplotypes not
sampled or that have become extinct. Correspond to the haplotypes
listed in Table 1. 2f: Median-joining network for mitochondrial cyt b
haplotypes of Artibeus fimbriatus………………………………………….46
Capítulo 4
Figure 1: Figure 1: A) Maximun likelihood tree for RAG2 gene. Likelihood settings
from best-fit model (K80+G) selected by hLRT Lset Base=equal Nst=2
TRatio=3.0953 Rates=gamma Shape=0.0845 Pinvar=0. Numbers
above branches are the bootstraps values. B) Results from Bayesian
analysis of concatenated cyt b and RAG2 genes. Likelihood settings from
best-fit model (GTR+I+G) selected by hLRT. Lset Base=(0.2860 0.2628
0.1885) Nst=6 Rmat=(1.6334 3.7942 0.9114 0.3789 14.5266)
Rates=gamma Shape=0.2266 Pinvar=0.3133. Numbers above
branches are posterior probabilities values…………………………….68
8
Capítulo 5
Figure 1: A) Bayesian analysis tree for cytochrome b gene. Likelihood settings
from best-fit model (GTR+I+G) selected by hLRT: Lset Base=(0.3837
0.3647 0.0620) Nst=6 Rmat=(0.2724 5.4353 0.5994 0.3884 10.7232)
Rates=gamma Shape=0.4763 Pinvar=0.4352. Numbers above
branches are posterior probabilities values. B) Bayesian analysis tree for
RAG2 gene. Likelihood settings from best-fit model (K80+G) selected by
hLRT (Lset Base=equal Nst=2 TRatio=3.0666 Rates=gamma
Shape=0.3396 Pinvar=0). Numbers above branches are posterior
probabilities values.…………………………………………………………92
Figure 2: A) Results from Bayesian analysis of concatenated cyt b and RAG2
genes. Likelihood settings from best-fit model (GTR+I+G) selected by
hLRT. Lset Base=(0.2980 0.2885 0.1806) Nst=6 Rmat=(2.2294 3.8488
1.0797 0.4228 14.8018) Rates=gamma Shape=0.4488 Pinvar=0.4149.
Numbers above branches are posterior probabilities values. B) Figure
adapted from Fig. 5A and 5B from Baker et al.
(2003).....................................................................................................93
Anexo 2
Figura 4: Representação parcial da mitocôndria mostrando os genes tRNA-Glu,
citocromo b e tRNA-Thr. Nas caixas cinzas se apresenta a posição de
inicio e fim do gene cit b e as caixas brancas os “primers” e suas
posições segundo a seqüência da mitocôndria de Mus musculus. Setas
vermelhas indicam os primers utilizados.............................................111
Figura 5: Diagrama representando os genes RAG, mostrando os sítios de
anelamento, com destaque para os primers utilizados. Figura retirada de
BAKER et al. (2000)........................................................................112
Figura 6: Pontos de coleta das amostras utilizadas neste estudo (1) Palmeirante,
(2) Colinas do Sul, (3) Jaraguá do Sul, (4) Indaial, (5) Gaspar, (6)
Blumenau, (7) Porto Belo, (8) Gov. Celso Ramos, (9) Florianópolis, (10)
Sto Amaro da Imperatriz, (11) Treze de Maio, (12) Nova Veneza, (13)
9
Jacinto Machado, (14) Santa Rosa do Sul (15) Itaiópolis....................115
Anexo 3
Figura 7: Mapa de cobertura da vegetação nativa da Mata Atlântica. Em laranja,
área de cobertura original e em verde, áreas remanescentes. Retirado
de HERINGER & MONTENEGRO (2000)...........................................131
Figura 8: Área de cobertura do bioma Cerrado em vermelho. Figura retirada da
home-page da Conservation International...........................................133
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Capítulo 1
Tabela 1: Classificação geral da ordem Quiroptera, segundo SIMMONS (2005b)
com destaque para as espécies existentes nos gêneros estudados. A
divisão em subgêneros não foi apresentada...........................................2
Capítulo 3
Appendix Accession numbers (in parenthesis) of sequences corresponding to the
voucher number, and next the collection site…………………………….40
Table 1: Species (acronyms), collection sites, morphoclimatic domains, number of
individuals, cytochrome b haplotypes found in this sample, and GenBank
accession numbers of literature.............................................41
Table 2: Pairwise sequence divergence (in %) estimated by Kimura-2 parameters
for cytochrome b in large Artibeus and outgroups……………………….42
Capítulo 4
Table 1: Species, morphoclimatic domains of the collect sites, localities, and
GenBank accession numbers of specimens analyzed…………...……..65
Capítulo 5
Table 1: Species, morphoclimatic domains of the collect sites, localities, and
GenBank accession numbers of specimens analyzed……..…………...89
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A ordem Quiroptera pode ser considerada um componente importante das
comunidades neotropicais. Seus membros são de particular interesse para a
biologia evolutiva, pois, devido a sua capacidade de voar a longas distâncias,
podem apresentar, potencialmente, padrões de dispersão distintos daqueles
exibidos por outros pequenos mamíferos que não voam. Além disso, são
excelentes ilustrações de radiação adaptativa, ótimo forrageamento, altruísmo
recíproco e coevolução, entre outros atributos. A família Phyllostomidae é a mais
diversificada dos morcegos neotropicais e apresenta grande diversidade
morfológica, relacionada aos variados hábitos alimentares. Esta variedade de
hábitos dificulta a reconstrução da história filogenética do grupo. Os diversos
estudos feitos não têm alcançado um consenso quanto às relações de parentesco
em vários níveis (desde o subfamiliar ao genérico) com conseqüente variação nos
arranjos classificatórios e a monofilia de algumas dessas subfamílias, bem como
a monofilia de muitos gêneros. O único consenso parece ser com relação ao
monofiletismo da família em si, consensualmente evidenciado por vários estudos.
Utilizando seqüências dos genes mitocondrial citocromo b e nuclear RAG2
analisou-se espécies de morcegos da família Phyllostomidae coletadas ao sul do
paralelo 07°S em território brasileiro e comparamos com outras seqüências
obtidas no GenBank visando verificar se a inclusão de espécimes do sul da região
Neotropical altera ou não as relações já descritas para esta família, basicamente
com representantes da América Central e Norte da América do Sul. Além disso,
testaram-se as diferentes hipóteses de agrupamento dentro dos Stenodermatinae
tendo por base representantes dos biomas brasileiros Mata Atlântica e Cerrado,
regiões sub-amostradas em outras análises filogenéticas e, mais especificamente,
investigou-se as relações filogenéticas das espécies de grandes Artibeus com
ênfase àquelas provenientes do território brasileiro. Estudou-se, também, a
variação genética e possível estruturação geográfica de duas espécies deste
gênero, A, fimbriatus e A. lituratus. Com relação à análise filogenética, na base da
árvore gerada situou-se o gênero Macrotus. A seguir, encontrou-se o clado
formado por Diphylla e Desmodus. O próximo clado une duas espécies - Tonatia
12
silvIcola e Trachops cirrhosus, e, logo a seguir, no próximo nodo colocou-se a
espécie Glossophaga soricina, que, na análise realizada apenas com o gene
RAG2 agrupou-se ainda com Anoura geoffroyi. Rhinophyla pumilio situou-se no
ramo seguinte e, na seqüência, observou-se um clado formado pelos
representantes da subfamília Stenodermatinae. Dentro dos Stenodermatinae, as
espécies do gênero Sturnira representam a linhagem mais basal. O segundo
clado inclui os gêneros Chiroderma, Vampyressa, Uroderma, Vampyrodes e
Platyrrhinus. O último clado apresenta um ramo representado por Enchisthenes
hartii e, então, se divide em dois grupos-irmãos, o primeiro incluindo os gêneros
Ametrida, Pygoderma, Sphaeronycteris, Stenoderma e Phyllops. No outro grupo
irmão (o grupo dos Artibeus), as relações encontradas estão de acordo com a
maioria dos trabalhos que discutem a filogenia deste gênero. Especificamente na
árvore dos Artibeus encontrou-se que A. obscurus é o grupo irmão de Artibeus
sp., localizando-se na posição mais basal, seguida por A. fimbriatus. A
jamaicensis ocupa uma posição intermediária, seguida por um clado formado por
A. hirsutus, A. inopinatus e A. fraterculus. Já A. lituratus, A. amplus e A.
planirostris estão entre as espécies mais derivadas. Vale a pena destacar na
filogenia dos Artibeus, no entanto, que a posição basal observada para A.
obscurus diverge da encontrada em outras análises filogenéticas. Além disso, os
resultados aqui obtidos reforçam a idéia de que A. planirostris é uma espécie
plena e não uma subespécie de A. jamaicensis e indicam que Artibeus sp. possa
ser uma nova espécie. Quanto aos marcadores moleculares utilizados neste
trabalho observa-se que o gene mitocondrial citocromo b foi bastante eficiente
para detectar relações filogenéticas no nível intragenérico, mas foi limitado em
termos de resolução para estudos de níveis taxonômicos superiores. Já o gene
nuclear RAG2 apresentou uma boa resolução para o estudo dos Phyllostomidae,
mas demonstrou-se ineficaz na tentativa de desvendar as relações genéticas
entre as espécies de morcegos do gênero Artibeus.
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The order Chiroptera may be considered a very important component of
Neotropical communities. Its members are particularly interesting to evolutionary
biology, as, due to its ability to long distances fly, they could present, potentially,
dispersal patterns distinct from those depicted by other small mammals that do not
fly. Besides these, they constitute excellent examples of adaptive radiation,
optimal feed habits, reciprocal altruism, and co-evolution, among other attributes.
The Phyllostomidae family is the most diversified of Neotropical bats, presenting
significant morphologic diversity that is linked to the varied food habits they show.
This variety in food habits makes it difficult to reconstruct the phylogenetic history
of the group. The numerous studies that have been carried out did not reach a
consensus about the multi-level kinship relationships (from sub-family to genus).
Consequently, taxonomic arrangements vary considerably, side by side with the
monophyly of some of these sub-families, and also the monophyly of several
genera. The only consensus may lie in the monophyly of the family itself, reached
after the conduction of several studies. This study analyzed sequences of the
cytochrome b mitochondrial gene and RAG2 nuclear gene of bats of the
Phyllostomidae family collected south of parallel 07° S in the Brazilian territory,
which were compared to other sequences deposited in GenBank, aiming to
ascertain whether the inclusion of specimens collected south of the Neotropical
region alters the relationships previously described for the family, basically done
with representatives from Central America and northern South America. Apart
from this, different cluster hypothesis were tested within Stenodermatinae, based
on specimens of the Brazilian biomes Atlantic Forest and Cerrado, regions that
have been but under-sampled in other phylogenetic analyses. More specifically,
the phylogenetic relationships of the large Artibeus species were investigated, with
emphasis on species inhabiting the Brazilian territory. Also, the genetic diversity
and the possibility that two species ranked under the genus, namely A. fimbriatus
and A. lituratus, were geographically structured were investigated. Concerning the
phylogenetic analysis, the Macrotus genus took the base of the generated tree.
Next, the clade formed by Diphylla and Desmodus was found. A clade that joint
14
two species, Tonatia silvicola and Trachops cirrhosus, followed and then, in the
forthcoming node is located the species Glossophaga soricina. This specie, in the
analysis of the RAG2 gene alone clustered also with Anoura geoffroyi. Rhinophyla
pumilio was found at the same branch, followed by a clade formed by the
representatives of the Stenodermatinae sub-family. Among the Stenodermatinae,
the species of the Sturnira genus represented the most basal lineage. The second
clade included the genera Chiroderma, Vampyressa, Uroderma, Vampyrodes, and
Platyrrhinus. The last clade presented a branch formed by Enchistenes hartii,
which branches out into two sister-groups, the first including the genera Ametrida,
Pygoderma, Sphaeronycteris, Stenoderma and Phyllops. In the other sister-group
(the Artibeus group), the relationships observed are in accordance with what has
been reported in most studies that address the phylogeny of the genus.
Concerning the Artibeus tree, A. obscurus is a sister-group of Artibeus sp., lying at
a more basal position, followed by A. fimbriatus. A. jamaicensis takes an
intermediary position, followed by a clade formed by A. hirsutus, A. inopinatus, and
A. fraterculus. As for A. lituratus, A. amplus, and A. planirostris, these species are
among the most derived It is worth mentioning that the basal position observed for
A. obscurus in the Artibeus phylogeny. Nevertheless this place differs from that
observed in other phylogenetic studies. Moreover, the results obtained in the
present study underline the notion that A. planirostris is a species itself, and not a
sub-species of A. jamaicensis, and also suggest that Artibeus sp. may be a new
species As regards the molecular markers employed in the present study, the
mitochondrial gene cytochrome b was found to be more efficient in the detection of
phylogenetic relationships at intra-genus level, but failed to afford an enhanced
resolution for higher taxonomic levels. In turn, the RAG2 gene showed good
resolution in the study of Phyllostomidae, but was incapable to shed more light on
the genetic relationships between the species of the Artibeus genus.
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1.1. A ordem Chiroptera
Os morcegos representam um dos grupos mais antigos e especializados
dos mamíferos, a ordem Chiroptera. Ocorrem no mundo todo com exceção dos
pólos (Fig. 1), sendo, por exemplo, os únicos mamíferos nativos do Hawaii e da
Nova Zelândia (MENDES, 1972; FUTUYMA, 1992; SIMMONS, 2005a).
Figura 1: Biodiversidade de morcegos baseada no número de espécies em 500km
2
(Retirado de
FINDLEY,1993). O gradiente de cores aumenta a cada 20 espécies e vai do branco
(sem morcegos presentes) até vermelho (120 espécies ou mais).
A ordem Chiroptera, com ao todo mais de 1.100 espécies, representa cerca
de 20% dos mamíferos atuais (SIMMONS, 2005b), sendo esse número excedido,
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dentro da classe dos mamíferos, apenas pelos roedores (NOWAK, 1999,
EISENBERG & REDDFORD, 1999; SIMMONS, 2005b).
Apresentam-se tradicionalmente subdivididos em duas subordens bem
diferenciadas: a subordem Megachiroptera, restrita a algumas regiões da África,
Índia, Austrália, sudeste da Ásia e algumas ilhas do Oceano Pacífico e que inclui
apenas a família Pteropodidae, e a subordem Microchiroptera, que inclui as
demais famílias.
Os Microchiroptera são geralmente menores que os megaquirópteros e
possuem um complexo sistema de ecolocalização laringeal, que funciona através
da transmissão e recepção de sinais ultra-sônicos permitindo orientar-se e
localizar as presas (KOOPMAN, 1993, WILSON, 1997; NOWAK, 1999). Os
Megaquiroptera, ao contrário, possuem uma aguçada visão e não apresentam
ecolocalização, com exceção de algumas espécies (Rousettus spp.), nas quais
existe outro tipo de ecolocalização baseada em estalos da língua (JEPSEN, 1970;
KOOPMAN, 1993; NOWAK, 1999). Esta subdivisão, porém, gera controvérsias,
pois muitos estudos moleculares recentes indicam que Microchiroptera não é um
grupo monofilético (SIMMONS, 2005c). A classificação recente de SIMMONS
(2005b), por exemplo, já não apresenta essa subdivisão (Tab. 1).
Tabela 1: Classificação da ordem Chiroptera, segundo SIMMONS (2005b) com destaque para as
espécies existentes nos gêneros estudados. A divisão em subgêneros não foi
apresentada.
Família Pteropodidae
Família Rhinolophidae
Família Hipposideridae
Família Megadermatidae
Família Rhinopomatidae
Família Phyllostomidae
Subfamília Phyllostominae
Gênero Micronycteris: M. brosseti; M. hirsuta; M.homezi; M. matses; M. megalotis; M.
microtis; M. minuta; M. sanborni; M. schmidtorum
Gênero Chrotopterus: Chrotopterus auritus
Gênero Mimon: Mimon bennettii; M. cozumelae; M. crenulatum; M. koepckeae
Gênero Phyllostomus: P. discolor; P. elongates; P. hastatus; P. latifolius
Gênero Tonatia: T.bidens; T. saurophila
Gênero Trachops: Trachops cirrhosus
Subfamília Stenodermatinae
Tribo Stenodermatini
Gênero Artibeus: A. toltecus; A. watsoni; A. amplus; A. anderseni; A. aztecus; A.
cinereus. A. concolor; A. fimbriatus; A.fraterculus; A. glaucus;
3
A.gnomus; A. hirsutus; A. incomitatus; A. inopinatus; A. jamaicensis; A.
lituratus; A. obscurus; A. phaeotis
Gênero Chiroderma: Chiroderma doriae; C.improvisum; C. salvini; C.trinitatum; C.
villosum
Gênero Platyrrhinus: P. aurarius; P. brachycephalus; P. chocoensis ; P. dorsalis ; P.
helleri, P. infuscus; P. lineatus; P.recifinus; P. umbratus; P.vittatus;
Gênero Pygoderma: Pygoderma bilabiatum
Gênero Uroderma: Uroderma bilobatum; U. magnirostrum
Gênero Vampyressa: V.bidens; V.brocki; V.melissa; V.nymphaea; V. pusilla; V. thyone
Tribo Sturnirini
Gênero Sturnira: S. aratathomasi; S.bidens; S.bogotensis; S.erythromos; S. lilium; S.
ludovici; S. luisi; S. magna; S.mistratensis; S. mordax; S. nana;
S.oporaphilum; S. thomasi; S. tildae
Subfamília Desmodontinae
Gênero Desmodus: Desmodus rotundus
Gênero Diphylla: Diphylla ecaudata
Subfamília Brachyphyllinae
Subfamília Phyllonycterinae
Subfamília Glossophaginae
Tribo Glossophagini
Gênero Glossophaga: G.commissarisi; G. leachii; G. longirostris; G. morenoi; G. soricina
Tribo Lonchophyllini
Subfamília Carolliinae
Família Craseonycteridae
Família Emballonuridae
Subfamília Taphozoinae
Subfamília Emballonurinae
Família Nycteridae
Família Myzopodidae
Família Mystacinidae
Família Molossidae
Subfamília Molossinae
Subfamília Tomopeatinae
Família Vespertilionidae
Subfamília Vespertilioninae
Tribo Eptesicini
Tribo Nycticeiini
Tribo Nyctophilini
Tribo Lasiurini
Tribo Pipistrellini
Tribo Plecotini
Tribo Vespertilionini
Subfamília Antrozoinae
Subfamília Myotinae
Subfamília Miniopterinae
Subfamília Murininae
Subfamília Kerivoulinae
Família Mormoopidae
Família Noctilionidae
Família Furipteridae
Família Thyropteridae
Família Natalidae
A maioria dos morcegos é pequena (em media cerca de 60g), contudo
existe uma grande variação em tamanho de corpo dentro da ordem. Essa
variação inclui desde uma das menores espécies de mamíferos, o morcego
4
asiático Craseonycteris thonglongyai com cerca de 2g (HULVA & HORACEK,
2002), até o indiano Pteropus giganteus com mais de 1.5kg. A forma da cabeça e
asas também varia enormemente entre as diferentes espécies sendo essas
características correlacionadas com os nichos de forrageamento (JONES, 2002).
A Região Neotropical destaca-se por possuir a mais rica fauna de
microquirópteros do mundo, podendo-se dizer que os morcegos constituem um
grupo principalmente tropical (TADDEI, 1980). Essa diversidade deve-se, em
grande parte, à variedade de hábitos alimentares incluindo herbivoria (sensu lato),
insetivoria, carnivoria, piscivoria e hematofagia (TRAJANO, 1984). A diversidade e
densidade relativa de suas populações sugerem uma importância notável desse
grupo na dinâmica dos ecossistemas tropicais (MARINHO FILHO, 1985).
Devido à variedade de morcegos herbívoros, esses são considerados
importantes na dispersão de recursos genéticos (pólen e sementes) a longas
distâncias, pois o raio de ação desses animais é relativamente grande e variável
de acordo com a espécie (KAGEYAMA, 1996), sendo responsáveis por até 25%
da dispersão em algumas regiões (HUMPHREY & BONACCORSO, 1979). Para
SILVA & PERACCHI (1995) os morcegos são os mamíferos
visitantes/polinizadores mais comuns de uma grande variedade de flores. Além de
serem importantes na polinização, tanto em matas como em capoeiras, são
grandes controladores de populações de insetos (REIS, 1982). ESBERÁRD
(2000) exemplifica esta importância citando que um morcego de 145 gramas
espalha 6.000 sementes em uma única noite. Os insetívoros ingerem cerca de
600 insetos em 70 minutos de vôo.
Além disso, morcegos têm grande potencial como indicadores dos níveis
de disrupção de habitat, sendo também um bom material para o estudo da
diversidade, interação competitiva e respostas para o estudo das flutuações do
ambiente, tanto pela sua abundância quanto pelo número de espécies
encontradas coexistindo numa mesma área (FENTON et al., 1992). Pode-se
encontrar mais de 100 espécies de morcegos coexistindo em uma mesma
comunidade ecológica, um número que está longe de ser excedido por qualquer
outro grupo de mamíferos (SIMMONS, 2005a).
5
No entanto, sua conservação ainda entra em conflito com os interesses em
controlar os problemas de saúde pública causados por hematófagos e com a
perda de habitat provocada pela mineração, desmatamento e uso recreativo de
cavernas (BREDT et al.,1999).
Possuem hábitos noturnos ou crepusculares (SILVA, 1985; RYDELL &
SPEAKMAN, 1995), sendo os únicos mamíferos com vôo verdadeiro, o que foi um
passo evolutivo fundamental que lhes abriu novos e desocupados espaços no
ambiente. As oportunidades representadas por esse nicho, incluindo vida noturna,
vôos, insetos, frutas tropicais e flores, permitiram-lhes uma imensa radiação
adaptativa, evoluindo em uma grande diversidade em um período relativamente
curto.
Além do amplo espectro dos nichos ecológicos, outro fator de sucesso dos
microquirópteros é a utilização de abrigos diurnos, que lhes fornecem a proteção
contra o clima adverso, predadores e parasitos não residentes (CRESPO et al.,
1961; HUMPPREY & BONACCORSO, 1979) e o fato de, diferentemente de aves
ou ainda de outros vertebrados terrestres, a maioria das espécies utilizar a
ecolocação para localizar e capturar suas presas (SIMMONS, 2005a)
Possuem um registro fóssil bastante incompleto, talvez o mais pobre dentre
os mamíferos, mas acredita-se que essa ordem tenha surgido pelo menos há 50
milhões de anos atrás no Eoceno (ALTRINGHAM, 1996; JONES, 2002),
coincidindo com um significante aumento da temperatura global, da diversidade e
abundância de plantas e no apogeu da diversidade de insetos do Terciário
(TEELING et al, 2005), sendo Icaronycteris indexam considerado o fóssil mais
antigo. Esta, juntamente com outras espécies fósseis como Archaeonycteris,
Hassianycteris e Palaeochiropteryx são consideradas os representantes mais
basais das espécies de microquirópteros atuais e Archaeopteropus transiens dos
megaquirópteros (JONES, 2002).
Evidências, contudo, sugerem que os morcegos possam ter evoluído muito
mais cedo do que estas datas fósseis sugerem, colocando a sua origem como se
sobrepondo ao fim da era dos dinossauros. Uma dessas evidências é a aparente
relação, baseada em comparações imunológicas e morfológicas, entre as
espécies de Noctilio da América do Sul e Mystacina tuberculata, uma das únicas
6
espécies nativas de mamíferos da Nova Zelândia, o que pode ser considerada
evidência circunstancial de que estas famílias foram separadas durante a
separação do Gondwana, no Cretáceo (PIERSON et al., 1986, JONES et al.,
2002; TEELING et al., 2003).
Além disso, Icaronycteris index, apesar de possuir algumas características
consideradas ancestrais em morcegos (e algumas semelhantes a
megaquirópteros), apresenta não só as características necessárias ao vôo batido,
como análises cranianas que indicam uma capacidade de ecolocalização igual as
dos microquirópteros atuais (JEPSEN, 1970; SIMMONS & GEISLER, 1998).
Estas características avançadas sugerem que os morcegos tenham surgido em
algum ponto do final do Paleoceno e se diversificaram muito rapidamente
(JEPSEN, 1970; SIMMONS & GEISLER, 1998).
Na região Neotropical ocorrem nove famílias: Emballonuridae; Furipteridae;
Mollossidae; Mormoopidae; Natalidae; Noctilionidae; Phyllostomidae;
Thyropteridae; Vespertilionidae. No Brasil, cerca de 140 espécies são conhecidas
(AGUIAR & TADDEI, 1995; MARINHO-FILHO & SAZIMA, 1998; BREDT et al.,
2002), representando, aproximadamente, um terço das espécies de mamíferos
brasileiros (MARINHO-FILHO & SAZIMA, 1998).
1.2. A família Phyllostomidae
Os morcegos nariz de folha (Família Phyllostomidae, do grego: phyllo =
folha + stoma = boca) incluem mais de 160 espécies, na sua maioria adaptadas a
baixas altitudes e regiões tropicais e subtropicais do Novo Mundo, confinados ao
hemisfério ocidental e distribuídos do sul da Califórnia e Arizona, bem como da
planície costeira do Texas, até o norte da Argentina (NOWAK, 1999, SIMMONS,
2005b).
O fóssil do mais antigo representante dessa família, Notonycteris
magdalensis data do Mioceno (13-25 Ma) (ALTRINGHAM, 1996) e acredita-se
que a família tenha surgido entre o Mioceno e Pleistoceno na América do Sul e no
Pleistoceno na América do Norte (NOWAK, 1999).
7
A principal característica para o reconhecimento dos morcegos desta
família é a presença de um apêndice nasal, conhecido também como “folha nasal”
(Fig. 2) uma protuberância carnosa do nariz com uma certa forma lanceolada,
podendo ser longa e ultrapassar a cabeça do animal em tamanho em algumas
espécies, ou ainda ser quase ausente em outras. Na Subfamília Desmodontinae,
por exemplo, o apêndice nasal é bastante reduzido, apresentando a forma
discóide (NOWAK, 1999).
Figura 2: Apêndice nasal. Foto de Marcos Tschapka
São caracterizados pela ausência de processo pós-orbital. Além disso, o
terceiro dedo possue três falanges completas e o tamanho da cauda e da
membrana interfemural é variável (Fig. 3). As asas são, em geral, largas e a
coloração da pelagem varia desde o castanho claro ou alaranjado até o castanho
escuro ou negro (EISENBERG & REDFORD, 1999).
Apresentam grande diversidade morfológica, relacionada aos variados
hábitos alimentares, entre os quais são incluídos: insetivoria, frugivoria, carnivoria,
frugivoria, folivoria, granivoria, nectarivoria, onivoria e hematofagia (NOWAK,
1999; PERACCHI et al., 2006). Um exemplo desta variação morfológica é o
número de dentes, que varia entre 26 até 34, refletindo, em parte, a diversidade
de hábitos alimentares (EISENBERG & REDFORD, 1999).
Esta variedade de hábitos tem se tornado um problema para sistematas,
dificultando a reconstrução da história filogenética do grupo. Como conseqüência,
8
as relações filogenéticas do grupo são estudadas por mais de um século sem
chegar a nenhum consenso (WETTERER et al., 2000).
Figura 3: Principais características morfológicas externas utilizadas para reconhecimento das
famílias de Chiroptera. Uropatágio equivale à membrana interfemural. Figura cedida
por Sérgio L. Althoff.
9
Historicamente Phyllostomidae pode ser dividido em pouco mais de duas
até mais que oito subfamílias. A classificação de KOOPMAN (1993), bastante
utilizada até recentemente pela maioria dos autores reconhece um grande
número de subfamílias, incluindo uma subfamília de hematófagos
(Desmodontinae), uma de insetívoros, carnívoros e onívoros (Phyllostominae),
quatro de nectarívoros e polinívoros (Brachyphyllinae, Phyllonycterinae,
Glossophaginae e Lonchophyllinae), e duas de frugívoros (Carolliinae e
Stenodermatinae).
No Brasil, os filostomídeos estão representados por 92
espécies e 40 gêneros, agrupados em seis subfamílias - Phyllostominae,
Lonchophyllinae, Glossophaginae, Carolliinae, Stenodermatinae e Desmodontinae
e
que correspondem a 55,76% e 62,5%, respectivamente, dos morcegos já
registrados no país (PERACCHI et al., 2006), sendo, dentre as famílias de
Chiroptera brasileiras, a mais diversa (MARINHO-FILHO & SAZIMA, 1998).
No entanto, a monofilia tanto de algumas dessas subfamílias quanto de
muitos gêneros, incluindo Micronycteris, Mimon, Phyllostomus, Artibeus, e
Vampyressa, tem sido questionada por muitos autores (WETTERER et al., 2000).
Os conjuntos de dados utilizados para tentar resolver esses problemas
incluem aloenzimas, morfologia cromossômica, associações parasita-hospedeiro,
distâncias imunológicas, sítios de restrição de rDNA e seqüências de DNA
mitocondrial e nuclear. As análises destes dados tem produzido um grande
número de hipóteses divergentes sobre as relações dos Phyllostomidae
(WETTERER et al., 2000).
Exemplos recentes das tentativas de resolver os problemas dentro de
Phyllostomidae são os trabalhos de WETTERER et al. (2000), que analisaram
diversos dados existentes na literatura para produzir uma “árvore de evidência
total” (total evidence tree) para todos os gêneros atuais de filostomídeos. Outro
exemplo foi o trabalho de JONES et al. (2002), que utilizaram o método MRP
(Matrix Representation using Parcimony), o de BAKER et al. (2000) que
realizaram uma análise cladística de 66 taxa utilizando o gene nuclear RAG2 e o
de BAKER et al. (2003) que investigaram as relações filogenéticas entre 48
gêneros utilizando 2,6kb dos genes mitocondriais 12S rRNA, TrnaVal, 18S rRNA
e cerca de 4,0kb do gene nuclear RAG2.
10
1.3. Os marcadores moleculares e os estudos em quirópteros
O surgimento, a partir da década de 70 do século XX, de metodologias
capazes de decifrar as seqüências de DNA como eletroforese, reações de
hibridação e seqüenciamento, aliada à implantação da técnica da PCR (reação
em cadeia da polimerase, MULLIS et al., 1986) disponibilizaram aos geneticistas
um potente arsenal tecnológico para poder utilizar as variações das seqüências
de DNA do núcleo ou de organelas como marcadores informativos para os mais
diversos estudos (MATTEVI, 2003).
Estes marcadores permitem a mensuração de parâmetros fundamentais da
demografia das espécies (tamanho efetivo da população, efeito-fundador de
“gargalos de garrafa”, fluxo gênico sexo-específico, etc), além de serem usados
para inferir as relações históricas e geográficas entre grupos (HEDRICK, 2001).
Podem ainda ser uma ferramenta poderosa na detecção de espécies crípticas, já
que as diferenças genéticas que se acumulam entre as espécies com o passar do
tempo nem sempre se refletem em caracteres morfológicos (MAYER & VON
HELVERSEN, 2001a), além de serem utilizados em análise forense onde podem
ser utilizados para identificar a origem biológica de amostras provenientes de
espécies caçadas/coletadas ilegalmente ou ameaçadas de extinção, tais como
sangue, carcaça, carne, penas, ovos ou de produtos comercializados como
chifres, marfim, cascos de tartarugas, etc.
Seu uso, obviamente, não descarta a importância da utilização de
caracteres morfológicos e citológicos. O ideal é tentar utilizar-se das ferramentas
mais eficazes para a resolução do problema específico, levando em consideração
as condições de trabalho de que se dispõe, o problema que se queira estudar e o
material biológico existente.
Muitos trabalhos descrevendo padrões de diferenciação geográfica
intraespecífica em morcegos têm utilizado diferentes marcadores, o que dificulta
comparações e gera conflitos. Alguns estudos, por exemplo, relatam baixos níveis
de divergência genética e pouca estruturação geográfica, como no caso de
DITCHFIELD (2000), que afirma que a divergência em morcegos é 10 vezes mais
11
lenta do que em outros mamíferos. Outros estudos, como os de WILKISON &
FLEMING (1996), COOPER et al. (2001) e MAYER & VON HELVERSEN (2001a)
apresentam níveis bem mais altos de divergência.
Esses conflitos podem estar relacionados aos marcadores moleculares
utilizados, que variam de estudo para estudo, pois, diferentes tipos de marcadores
moleculares podem transmitir informações de forma diversa. A comparação dos
resultados obtidos para marcadores moleculares mitocondriais e nucleares pode
revelar uma diferente contribuição de machos e fêmeas para a dinâmica dos
genes nas populações de uma espécie. Outra possível explicação é a tentativa de
comparar em uma mesma análise, espécies de hábitos diferentes, como as
migratórias e sedentárias, por exemplo (BURLAND & WILMER, 2001).
Mesmo com os problemas de comparações, os estudos moleculares têm
proporcionado novas e importantes idéias sobre a ecologia, organização social e
outros aspectos relacionados aos morcegos, além de abrir novos e excitantes
campos de estudos (BURLAND & WILMER, 2001), como nas análises de padrões
de migração (PETIT & MAYER, 2000), estrutura de populações (MILLER-
BUTTERWORTH et al., 2003), caracterização de espécies crípticas (MAYER &
VON HELVERSEN, 2001a; MAYER & VON HELVERSEN, 2001b), testes de
modelos evolutivos (LEWIS-ORITT et al., 2001a), introgressão (HOOFMANN et
al., 2003) além de estudos de estrutura de populações baseada em testes de
paternidade como os realizados por PETRI et al. (1997).
No que se refere especificamente à sistemática e filogenia diversos grupos
tem sido estudados como Mormoopidae (LEWIS-ORITT et al., 2001b; DAVALOS,
2006), Vespertilionidae (HOOFER & VAN DEN BUSSCHE, 2003), Natalidae (VAN
DEN BUSSCHE & HOOFER, 2001; DÁVALOS, 2005), Phyllostomidae (BAKER et
al., 2000; WETTERER et al., 2000; BAKER et al., 2003), Stenodermatini (VAN
DEN BUSSCHE et al., 1993) e Lonchophyllini (DAVALOS & JANSA, 2004) só
para citar alguns exemplos.
Apesar dos estudos com marcadores moleculares em quirópteros
encontrarem-se bastante difundidos no meio científico nos últimos anos, não
existe ainda um trabalho que inclua todas as famílias para resolver os problemas
de classificação da ordem (SIMMONS, 2005b).
12
Além disso, os estudos moleculares realizados com morcegos brasileiros
estão, em geral, incorporados em trabalhos com amostragem geográfica mais
ampla, com objetivos diversos onde as amostras são apenas mais uma localidade
para os estudos filogenéticos e filogeográficos (LEE et al., 2002; HOFFMANN &
BAKER, 2003; HOFFMAN et al., 2003). Por isso, a estrutura populacional e a
história evolutiva dos morcegos no Brasil são muito pouco conhecidas e os
animais endêmicos do país, como Chiroderma doriae, por exemplo, são
basicamente desconhecidos do ponto de vista molecular (DITCHFIELD et al., in
press).
Atualmente, o marcador dominante para esses estudos é o DNA
mitocondrial (mtDNA). O mtDNA é circular, haplóide, e, em animais, costuma ser
de pequeno tamanho (aproximadamente 16.500 pares de bases) podendo variar
entre 6kb e 20kb dependendo do organismo estudado (SHIMKO et al., 2001).
Encontra-se localizado no citoplasma do interior das mitocôndrias, com
centenas de milhares de cópias por célula (MOREIRA, 2001) sendo quase todo o
genoma mitocondrial envolvido em funções codificantes. Pseudogenes, íntrons,
famílias de DNA repetitivo e seqüências espaçadoras entre genes são raras
(AVISE, 1994).
O mtDNA apresenta padrão de herança matrilinear e a capacidade de
acumular substituições de bases, inserções e deleções com uma taxa média de 5
a 10 vezes mais rápida do que a do DNA nuclear cópia simples (BROWN et
al.,1979) devido, provavelmente, ao excesso de resíduos metabólicos, baixa
fidelidade na replicação e ausência de mecanismo de reparo (LI, 1997).
Estas características o tornam apropriado para a investigação de
diferenciações genéticas recentes, podendo, deste modo, auxiliar no
estabelecimento de relações filogenéticas entre os organismos em estudo
(MOREIRA, 2001), sem a ambigüidade causada pela recombinação meiótica que
ocorre em genes nucleares, ou ainda, introduzir análises comparativas ao nível
das populações (DINIZ FILHO, 2000).
A filogeografia baseada no mtDNA permite a descrição aperfeiçoada da
distribuição geográfica, distâncias genéticas e tempos de divergência entre
linhagens evolutivas de animais, o que leva à maior compreensão de
13
biogeografias regionais e áreas de endemismo, bem como à elaboração de
propostas de áreas de conservação (SILVA & PATTON, 1998).
O marcador mitocondrial mais extensivamente utilizado nas filogenias
moleculares, principalmente nas que avaliam as relações entre hierarquias
taxonômicas superiores, é o gene do citocromo b. Este gene é um dos treze
codificadores de proteína do genoma mitocondrial (IRWIN et al., 1991), sendo
considerado o marcador que pode prover a melhor resolução em estudos de taxa
de mamíferos com tempos de divergência entre aproximadamente 4 a 44 MA
(IRWIN et al., 1991; SMITH & PATTON, 1991).
Uma das limitações desses marcadores, é que, dependendo do tempo de
divergência entre linhagens e das taxas de mutação, muitas das homologias
observadas podem ser, na verdade, homoplasias.
No que se refere aos trabalhos sobre Chiroptera, esse marcador é
considerado apropriado para elucidar relações dentro de gêneros, mas a
saturação de alguns tipos de mutação complica a resolução em níveis
taxonômicos mais elevados (BAKER et al., 2000), o que tem levado recentemente
os pesquisadores a utilizar também como marcador o gene nuclear RAG2
(recombination activating gene).
As proteínas RAG são codificadas por dois pares de genes (RAG1 e
RAG2) que, nos tetrápodes, não são interrompidos por íntrons e situados 8Kb um
em relação ao outro no genoma nuclear e possuem 1,043 e 527 aminoácidos,
respectivamente. Esses genes aparentemente chegaram como transposons no
ancestral dos gnastostomados (jawed vertebrates), assumindo, após sua
inserção, significante função no sistema imune, catalisando a recombinação V(D)J
(BAKER et al., 2000).
Estes genes são expressos somente nos linfócitos B e T, onde os níveis do
transcrito variam nos diferentes estágios de desenvolvimento e formam as
nucleases responsáveis pela clivagem do DNA no processo de recombinação
V(D)J (SADOFSKY, 2001; KLEIN,2004).
O potencial de RAG2 na análise filogenética está bem claro nos trabalhos
realizados com a ordem Chiroptera por BAKER et al. (2000), CARSTENS et al,
(2004) e BAKER et al. (2003), principalmente dentro da família Phyllostomidae,
14
grupo altamente controverso onde a magnitude da adaptação morfológica para
estratégias mais eficientes de alimentação pode resultar em fenótipos tão
modificados que mascaram as relações filogenéticas basais (BAKER et al., 2000).
RAG2
pode, particularmente, ser de grande utilidade para estudos da
evolução dos filostomídeos, pois, além de evoluir mais lentamente que o
citocromo b, sua função na resposta imunológica provavelmente não está ligada
às características morfológicas utilizadas freqüentemente como critérios
diagnósticos na taxonomia do grupo.
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Considerando que estudos filogenéticos em níveis genérico e específico no
contexto regional brasileiro são mais raros e que nossa amostra consta de
populações e espécies de morcegos habitantes de diferentes biomas do Brasil, no
presente trabalho, baseados em seqüências do gene mitochondrial citocromo b e
do gene nuclear RAG2, nos propomos a:
- Analisar 19 espécies de morcegos da família Phyllostomidae coletadas ao
sul do paralelo 07°S em território brasileiro e compará-las com outras seqüências
obtidas no GenBank visando verificar se a inclusão de espécimes do sul da região
Neotropical altera ou não as relações descritas para esta família com
representantes da América Central e Norte da América do Sul.
- Testar as diferentes hipóteses de agrupamento dentro dos
Stenodermatinae pela análise das relações entre 09 gêneros tendo por base
representantes dos biomas brasileiros Mata Atlântica e Cerrado, regiões sub-
amostradas em outras análises filogenéticas.
- Investigar as relações filogenéticas das espécies de grandes Artibeus
(com ênfase àquelas provenientes do território brasileiro) em cinco espécies do
Brasil e seqüências de seis espécies acessadas através do GenBank.
-Estudar a variação genética e possível estruturação geográfica de duas
espécies de Artibeus: A. fimbriatus e A. lituratus.
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RELATIONSHIPS OF BRAZILIAN AND OTHER SOUTH AMERICAN ARTIBEUS
SPECIES OF PHYLLOSTOMIDAE BAT GENUS
Artigo submetido à revista Molecular Phylogenetics and Evolution
Cristina Claumann Freygang
1
, Sérgio L. Althoff
2
, Ana Letícia Pereira
3
,
Margarete Suñé Mattevi
1-3*
1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Caixa Postal 15053, CEP 91501-970, Porto Alegre, Rio Grande do Sul
2
Universidade Regional de Blumenau, Caixa Postal 1507, CEP 89010971, Blumenau, Santa
Catarina
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, Av. Farroupilha, n. 8001, CEP
92450-900, Canoas, Rio Grande do Sul, Brazil.
*Corresponding author: Fax and Phone: 55 (51) 33113386
E-mail address: [email protected]
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Abstract
This study describes the analysis of the mitochondrial cytochrome b (cyt b)
and the nuclear recombination activator (RAG2) genes in 39 specimens belonging
to 5 Artibeus species, A. fimbriatus, A. lituratus, A. planirostris, A. obscurus, and
Artibeus sp obtained from 14 sites of the Brazilian territory plus 18 representatives
of the Artibeus species from GenBank. The phylogenetic relationships between
the large Artibeus were investigated, with emphasis placed on those species from
the Brazilian territory that had never been included in previous molecular
phylogenetic analyses. A. obscurus was found to be a sister group of Artibeus sp.
(which seemed to be a new species) at the most basal position, followed by A.
fimbriatus. A. jamaicensis takes an intermediary position, followed by a clade
formed by A. hirsutus, A. inopinatus, and A. fraterculus. As for the group A.
lituratus and A. amplus plus A. planirostris, they are among the most derived
species.
Keywords: Chiroptera; Artibeus phylogeny; Phyllostomidae; mitochondrial DNA;
cytochrome b; nuclear DNA; RAG2.
1. Introduction
The Artibeus genus Leach, 1821, according to the classifications of
Koopman (1993) and Simmons (2005) belongs to the Phyllostomidae family,
subfamily Stenodermatinae. The species of this genus present a V-shaped narrow
interfemural membrane. Pelage texture is velvety, and varies in color from brown
to grayish or black, with silvery hues on the back that lighten up ventrally. Four
white facial bands are normally present, but a clear dorsal line is not observed.
Artibeus differs from other related genera in cranial and dental features (Nowak,
1999). The total number of teeth depends on the number of molars, and can be
28, 30 or 32, varying from species to species and, at times, from individual to
18
individual (Nowak, 1999; Rui and Drehmer, 2004). Concerning food habits,
Artibeus species are essentially frugivorous, but may also feed on pollen, nectar,
flower organs, and insects (Barquez et al., 1993).
The genus systematic remains a controversial subject matter mainly
because the paucity of accurate information about the geographic distribution and
variation within the different Artibeus taxa, with several authors relating specimens
wrongly assigned (Taddei et al., 1998).
Koopman (1993) and Marques-Aguiar (1994) have advocated the
assignment of Artibeus species under four sub-genera: Artibeus Leach, 1821
(classified as “large Artibeus species”), Dermanura Gervais, 1856, Enchistenes
Andersen, 1906, and Koopmania Owen, 1991. Nevertheless, no consensus has
been reached about the real taxonomic status of these groups, which are
considered by other authors as distinct genera (Van den Bussche et al., 1998;
Wetterer et al., 2000). In a more recent classification, Simmons (2005) recognizes
three sub-genera only, Artibeus, Dermanura and Koopmania, and considers
Enchistenes as a genus. In her classification, the author assigns a total of 18
species to the Artibeus genus, with eight being included in the Artibeus sub-genus,
nine in the Dermanura sub-genus, one in the Koopmania sub-genus, and also
considers Enchistenes as a monotypic genus.
Artibeus is found in the whole Neotropical region, occurring from Mexico
and throughout all the Central and South Americas up to northern Argentina and
southern Brazil (Koopman, 1993; Eisenberg and Redford, 1999).
Some Artibeus species are among the most common and abundant
Phyllostomidae of the Neotropical communities. For instance, in southernmost
Brazil, A. lituratus (Olfers, 1818) and A. fimbriatus Gray 1838 account for more
than 70% of the bat specimens collected in Atlantic Forest domain (Rui and
Fabián, 1997). But studies on the probable geographic variation patterns of the
large Artibeus (sub-genus Artibeus) in the Brazilian territory are very scarce. The
complex communities of large Artibeus found in the south-southeastern Brazilian
territory (geographically associated to the Atlantic Forest and Cerrado
environments) could be to pointed out as a case which invites a comprehensive
revision, in which the comparisons with all other geographic forms should be
19
include. The documentation available for the Artibeus diversity in the southern,
southeastern and west-central Brazilian regions is also poor (Tavares et al., in
press).
The interspecific phylogenetic relationships in the Artibeus genus have
been investigated by means of morphological (Marques-Aguiar, 1994; Wetterer et
al., 2000; Guerrero et al., 2003) and molecular characters. As regards molecular
studies, valuable contribution has been made the analyses of several Artibeus
species using the cytochrome b gene carried out by Van Den Bussche et al.
(1998), the investigations of the taxonomic status of Artibeus jamaicens triomylus
and other six taxa of large Artibeus found in the Gulf of Mexico, Caribbean and
Central America made by Guerrero et al. (2004), and the study also with the group
of large Artibeus performed by Lim et al. (2004). Nevertheless, all these research
papers have preferentially focused on specimens representative of Central and
North of South America, while a considerable portion of the distribution area of the
genus was sampled to a minor extent.
This study investigates the phylogenetic relationships of the large Artibeus
species, with emphasis placed on those species found in the Brazilian territory
that, to the present, have not been included in other previous molecular studies.
These relationships were analysed using the mitochondrial gene cytochrome b
(cyt b) and nuclear recombination activating gene (RAG2) sequences in 5
Brazilian species obtained from 14 sites, complemented by the sequences of 6
species retrieved from GenBank. A second purpose consisted in the evaluation of
the genetic variation and the search of a possible geographic structuration of two
species, A. fimbriatus and A. lituratus, whose sampling procedure generated
useful information.
2. Materials and Methods
2.1. Sampling
Tissues from 39 specimens, 19 of Artibeus lituratus, 4 of A. planirostris, 3 of
20
A. obscurus, 8 of A. fimbriatus and 5 of Artibeus sp, were obtained from 14 sites in
an area ranging from 7º to 28ºS and 47° to 49°W, of the Brazilian territory (Table
1). The skins and skulls of these specimens are stored in the Mammals Collection
of Universidade Regional de Blumenau and Mammals Collection of the Museu
Nacional, Rio de Janeiro.
To this analysis, 18 representatives of 6 Artibeus species from the
GenBank, collected in 10 different South American localities were added. Nine of
these sites ranged from Peru to Mexico, with only one individual being native to
Brazil (Table 1).
The sequences of five microchiroptera taxa, Sturnira lillium, S. tildae,
Artibeus (Dermanura) cinereus, Enchisthenes hartii and Glossophaga soricina
were included as outgroups. The choice of the outgroups was based on Baker et
al. (2003) and Simmons (2005).
2.2. Nucleotide acid sequence analysis
DNA was extracted from kidney, liver, heart or muscle (stored at–20
o
C or in
ethanol 70% purity) using the standard protocol described in Medrano et al.
(1990). The mitochondrial cyt b gene sequences were isolated via polymerase
chain reaction (PCR) using the primers MVZ05, MVZ23 (light-strand), MVZ16
(heavy-strand) suggested by Smith and Patton (1993) and MUS15398 (heavy-
strand) suggested by Anderson and Yates (2000). PCR reaction were run in a total
volume of 25µl containing: 10x PCR buffer, MgCl
2
2.6 mM, dNTP 0.56 µM, 0.2µM
of each primer, 1 unit Taq polymerase, and 1-2ul template DNA. Reaction
conditions were as follows: Initial denaturation (92
o
C – 5min); followed by 5 cycles
in Touchdown (denaturation: 92
o
C - 1 min; annealing temperature step-downs
every cycle 1
o
C from 50
o
C to 46
o
C - 1 min; extension: 72
o
C - 1 min). The
annealing temperature for the final 35 cycles was 46
o
C with denaturation and
Table 1 here
21
extension phases as above. Final extension: 72
o
C – 10 min. Each round of PCR
reactions also included one negative control to check for contamination.
For the amplification of nuclear RAG2, the primers RAG2F1 (light-strand),
RAG2F2 (heavy-strand) suggested by Baker et al. (2000) were used. PCR
reactions were run in a total volume of 25µl containing: 10x PCR buffer, 2,6mM of
MgCl
2
, 1,12µM de dNTP, 0,32µM of each primer, 1 unit of Taq polymerase, and 1-
2ul of template DNA. Reaction conditions were as follows: Initial denaturation
(92
o
C – 5min); followed by 35 cycles (denaturation: 92
o
C – 60s; annealing
temperature 60
o
C – 45s; extension: 72
o
C – 90s). Final extension: 72
o
C – 10 min.
Each round of PCR reactions also included one negative control to check for
contamination.
PCR products were purified with exonuclease I and shrimp alkaline
phosphatase (Amersham Biosciences). All taxa were sequenced directly from
purified PCR products using the primers cited above and the ABI Prism BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied
Biosystems), according to the manufacturer’s instructions. Sequencing of both
strands was carried out using an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). All sequences are available in GenBank as displayed in Table 1.
2.3. Data analysis
The sequences obtained were read employing the Chromas 1.45 program,
aligned using the Clustal X 1.81 program (Thompson et al., 1997) under the
default setting costs and manually refined with the aid of the Genedoc (Nicholas
and Nicholas, 1997). Saturation plots were obtained with Data Analysis in
Molecular Biology and Evolution software (DAMBE; Xia and Xie, 2001). The
composition of bases and genetics distances (Kimura-2 parameters) was
accomplished by the use of Molecular Evolution Genetics Analysis software -
MEGA3 (Kumar et al., 2004).
The phylogenetic analyses were performed using the maximum parsimony
(MP) algorithm obtainable in PAUP*, version 4.0b10 (Swofford, 2001) by heuristic
22
search with tree bisection-reconnection (TBR) branch swapping, the MULPARS
option, and 100 random-addition replicates. Bootstrap statistical support
(Felsenstein, 1985) was carried out with 1,000 replications of heuristic search and
simple taxon addition, with the all trees saved option.
The ML maximum-likelihood (ML) tree estimation was conducted with
PHYML (Guindon and Gascuel, 2003), under appropriate model of nucleotide
substitution, determined using the MODELTEST 3.06 program (Posada and
Crandall, 1998). Reliability of the trees was tested using 1,000 bootstrap
replications.
The neighbor-joining analysis (NJ – Saiton and Nei, 1987) was conducted
under a ML model, with parameter settings estimated by MODELTEST, as
described by Xiang et al. (2002) with 1,000 bootstrap replications.
Bayesian analyses (BI) of the data were performed using MrBayes 3.0b4
(Huelsenbeck and Ronquist, 2001) to generate a posterior probability distribution
using Markov chain Monte Carlo (MCMC) methods following Baker et al. (2003).
We ran three independent analyses. No a priori assumptions about the topology of
the tree were made and all searches were provided with a uniform prior. The
models of DNA substitution used were those estimated by MODELTEST and used
in the standard ML analyses. The MCMC processes were set so that four chains
(one cold and three incrementally heated Markov chains) were run simultaneously
for 1 million generations, with trees being sampled every 10 generations. Bayesian
likelihoods reached at 500,000 generations (burn-in=5000). The values were
established by empirical evaluation of tree likelihood scores and following Baker et
al. (2003). To calculate the posterior probability of each bipartition, a 50% majority-
rule consensus tree was constructed from the remaining trees using PAUP*
To detect the presence of character conflict between cyt b and RAG2
genes, the incongruence length difference (ILD) test was computed as described
by Farris et al. (1994, 1995) and implemented in WINCLADA version 0.9.9+
(BETA) (Nixon, 2002). A subset of the individuals for which sequences from both
data sets were available was combined into a single analysis.
The population genetics software package ARLEQUIN (Schneider et al.,
2000) was used to examine patterns of mismatch distribution (Rogers, 1995) using
23
the observed number of differences between pairs of haplotypes, and the
hierarchy analyses of genetic diversity of populations were carried out using
AMOVA (Excoffier et al., 1992).
The haplotype data were subjected to a median joining analysis (Bandelt et
al.,1999) using the NETWORK 4.1 programme (www.fluxus-engineering.com) and
the Tajima’s D test (Tajima, 1989) was computed using de DnaSP software
(Rozas et al, 2003).
3. Results
3.1. Sequence data
Thirty-seven individuals were sequenced for the cyt b analysis, with 12
having the gene completely sequenced (1,140 bp). In order to obtain a similar
representativeness among the different Artibeus species, a 761-bp fragment was
chosen for the analysis of the 16 representative specimens within the range of the
collection sites investigated. To this sample, 17 other selected sequences
deposited in GenBank were added, performing a total of 33 Artibeus specimens
analysed (Table 1).
The sequence analysis has revealed a significant guanine deficiency,
specially in the 3
rd
position (P <0.01). The values found for base frequencies (not
shown) were similar to those observed by Pumo et al. (1998) for Artibeus
jamaicensis.
For the RAG2 analysis, a 770-bp fragment from 37 Artibeus specimens
(from 5 species) was sequenced, which were analysed together with other two
species deposited in GenBank, thus totaling 39 individuals (Table 1). The RAG2
alleles showed an overall even pattern of base composition.
3.2. Phylogenetic analysis
24
In the cyt b analysis, considering exclusively the ingroup, the haplotypes
were defined by 261 variable sites (41 of which corresponded to the first codon
position, 21 to the second, and 199 to the third). In the maximum parsimony
analysis (MP), the heuristic search of the cyt b data resulted in 84 most
parsimonious trees with 629 evolutionary steps under a consistency index (CI) of
0.512 and a retention index (RI) of 0.661. Among these sites, 159 produced
parsimony information, and in the strict-consensus tree (not shown) the bootstrap
values varied between 55 - 100, with the tree generated by this analysis showing
few polytomies.
The NJ, ML, and BI trees presented similar topologies. The Bayesian
analysis (not shown) revealed nodes with posterior probability values between 58
– 100, yet with some polytomies. The tree obtained by the NJ method (not shown)
using the MODELTEST parameters, though similar to the other trees, showed
minor differences between some specific groups.
The model selected for the maximum-likelihood analysis using the
MODELTEST was TrN+G and the gamma shape parameters of 0.2132 and the
tree generated therefrom (Fig. 1a) presented considerably varied bootstrap values
(between 18.2 and 100%). In this tree it is possible to observe A. concolor as the
most basal taxon, followed by a clade composed of two sister groups performed
by the species Artibeus sp. and A. obscurus. Next comes A. fimbriatus and, after,
a set of heterogeneous taxa, A. hirsutus, A. inopinatus, A. fraterculus. Then A.
jamaicensis is found after that, to which two sister groups join in, respectively
formed by A. lituratus and A. planirostris plus A. amplus.
The RAG2 analysis (tree not shown), considering only the ingroup, revealed
70 variable sites with 12 corresponding to the first codon position, 10 to the
second, and 48 to the third. In the MP analysis, the heuristic search data resulted
in 54 most parsimonious trees with 67 steps, and with a CI of 0.940 and RI of
0.933. The number of informative characters for parsimony was 16 and in the
Fig 1 here
25
strict-consensus tree (not shown) the bootstrap values varied between 62 and
100. As regards the maximum likelihood analysis, the selected model using the
MODELTEST was K80+G with gamma shape parameters estimated as 0.3311.
The MP, NJ, BI and ML analyses for RAG2 (not shown) revealed all trees to
have the same topology, with several polytomies and lower bootstraps and
posterior probability values for most branches. Nevertheless, in all trees
generated, A. lituratus separates from the other species, but the gene did not
prove its suitability to differentiate the other taxa from each other.
The saturation curve obtained (not shown) both for cyt b and RAG2 genes
indicated that there is no clear evidence of multiple substitution (saturation) in any
codon position; thus, there should be no loss of phylogenetic signal among the
more divergent taxa (i.e., outgroup – ingroup) in the analysis.
To the combined analysis, two “small Artibeus” species — Artibeus
(Dermanura) cinereus and Enchisthenes hartii - were also added to test the
position taken by A. concolor in comparison to the small and large Artibeus.
Concerning the combined phylogenetic analysis of the cyt b and RAG2 genes, the
ILD test revealed that the amount of character conflict between both genes is not
significant (P = 0.8333), therefore, the concatenated alignment of the data
obtained has resulted in 1,531 characters analysed for five species belonging to
our sample and two from GenBank, besides the four outgroups (listed in Table 1).
In these analyses, (the combined dataset), 6,898 most parsimonious trees with
650 steps and 147 parsimony-informative characters were found (CI = 0.603; RI =
0.733). The model selected was TrN+I+G, with a gamma shape parameter of
1.1051.
All the trees generated (MP, NJ, ML, and BI) presented identical topology.
One NJ tree is shown in Fig. 1b. By comparing the arrangements seen in this tree
with those presented by cyt b gene in Fig. 1a (taking in account the difference in
the number of taxa analysed), we observed that both genes produced the same
main species clusters, namely: A. fimbriatus and A. obscurus (more basal), and A.
lituratus and A. planirostris (more derived). Artibeus (Dermanura) cinereus was the
most basal species, followed by A. concolor, while Enchisthenes hartii was found
to be closer to Sturnira than to Artibeus (Fig. 1b).
26
3.3 Genetic diversity and population structure
The instraspecific genetic diversity and structure of populations were tested
in two species, A. lituratus and A. fimbriatus, using 761-bp fragments of the
mitochondrial gene cyt b and 770-bp fragments of the RAG2 gene.
Artibeus lituratus presented a high level of genetic diversity, with 13
different haplotypes in 14 individuals (Table 1) analysed from 8 localities, and an
average genetic distance of 1.2% for cyt b gene (Table 2). These 13 haplotypes
differ in only a few mutations (2 to 9) and the two individuals sharing a haplotype
belonged one to the Cerrado biome and the other to the Atlantic Forest biome
(haplotype 2, Table 1). As for A. fimbriatus, the species presented 7 different
haplotypes in 7 individuals (Table 1) analysed (from 5 localities), and an average
genetic distance of 0.7% for the cyt b gene (Table 2). In this situation, the
haplotypes likewise differ but in few mutations (2 to 7). When a GenBank
sequence from a specimen collected in the state São Paulo, Brazil, was added to
the analysis, it exhibited a distinct haplotype, which differed from the nearest one
in, at least, 38 mutations.
The RAG2 data (not shown) were not informative, as although each of the
species analysed showed a considerable genetic diversity (13 haplotypes in 18 A.
lituratus individuals, and 6 haplotypes in 7 A. fimbriatus individuals), a high number
of haplotypes was shared by the two species. This reveals that RAG2 does not
afford the best results as an intrageneric marker.
The results of the mismatch analysis with A. lituratus¸ both for cyt b (Fig. 2a)
and combined gene analysis (Fig. 2c), are in accordance with the sudden
expansion model (Rogers, 1995), indicating that the species apparently is
undergoing a population expansion process.
Table 2 here
Fig 2 here
27
As regards A. fimbriatus, the histogram constructed with the cyt b analysis
did not produce conclusive information (not shown); however, the combined gene
analysis (Fig. 2b) produced results in accordance to the expansion model.
However, when the São Paulo individual is added, the sample moved on to reveal
a pattern suggestive of geographic subdivision (Fig. 2d). The results obtained by
the Tajima neutrality test for A. lituratus and A. fimbriatus (Tajima’s D = -1.14456
and D = -1.51757, respectively) also indicate expansion, in spite of the fact that the
P values were not significant, an observation very likely explained by the small
sample size.
The median-joining analysis conducted in Network has shown the absence
of any type of haplotypes structuration, both for A. lituratus and A. fimbriatus (fig.
2e and 2f), with both graph exhibiting a star-like pattern.
A molecular variance analysis (AMOVA) was also carried out to test the
hypothesis that the A. lituratus individuals collected in the Cerrado biome and in
Atlantic rainforest biome belong to distinct populations yielded a non-significant
value for FST (P = 0.9765). These results indicate that the A. lituratus is not
geographically structured in populations.
4. Discussion
4.1. Phylogenetic analysis
In the present study, one mitochondrial gene (cytochrome b) and one
nuclear gene (RAG2) were employed in an attempt to shed more light on the
genetic relationships between bat species of the Artibeus genus, specially with the
inclusion of Brazilian taxa so far under-sampled in previous molecular
phylogenetic studies. By comparing the results obtained with the two genes
individually, cyt b has shown high phylogenetic definition, whereas RAG2 failed to
prove itself as an efficient marker. Our choice for this gene is explained by the
28
abundance of sequences available in GenBank, as the database has been
intensively employed in phylogenetic and phylogeographic studies of several bat
taxa (Baker et al., 2000; Baker et al., 2003; Hoffer et al., 2003; Dávalos, 2005;
Dávalos, 2006). In these investigations, the results obtained were, as a whole,
useful in the elucidation of the relationships between upper taxonomic categories.
Yet, in the present study, which addressed intrageneric relationships, RAG2 was
but little efficient, probably due to the relatively recent emergence of the genus and
also to the slower evolution of the marker.
Cyt b, in turn, has generated trees with well-resolved relationships, such as
shown in Fig. 1a, in which A. concolor takes a more basal position. This species is
found in a region stretching from the south of Colombia, Venezuela, the Guineas
and north of Brazil, generally in moist environments (Eisenberg and Redford,
1999). Some controversy hovers around the classification of this species, as Owen
(1991) assigned it to the Koopmania genus (which encompasses the small
Artibeus), based on morphologic information. Other authors, nevertheless,
consider Koopmania as an Artibeus sub-genus (Marques-Aguiar, 1994; Van den
Bussche et al., 1998; Simmons, 2005). Based on molecular analysis, other
authors, on the other hand, propose that the Koopmania (A.) concolor should
cluster with the other large Artibeus species, thus being pulled into the Artibeus
genus (Lim et al., 2004). It is important to observe that, irrespective of the
systematic classification adopted, this taxon is always found at a more basal
position in the phylogenies produced by all studies (morphologic investigations as
Marques-Aguiar, 1994; molecular investigations, as Van den Bussche et al., 1998;
Lim et al., 2004; and the present study). Such basal position is coupled to the fact
that A. concolor has shown an average genetic distance of 10.3% in comparison
to the other large Artibeus species analysed (minimum genetic distance 8.2%
between A. concolor and A. obscurus; and maximum genetic distance 12.5%
between A. concolor and A. hirsutus, Table 2). These data cast some doubt over
the assignment of the taxon to the Artibeus genus, thus corroborating the proposal
as emerged from the morphologic analyses. Although these genetic distance were
the highest found in this analysis (in which the average distances between species
were = 10.3%), it is important to stress that such values are compatible with the
29
value put forth to describe intrageneric variation for bats ( = 10.45%, ranging
from 2.51% to 19.83%) as suggested by Bradley and Baker (2001). In the tree
obtained with the combined gene data, A. concolor was shown to occupy a basal
position.
Next in order comes A. obscurus, clustering with a still undescribed Artibeus
species (Artibeus sp., whose specimens were collected in the Atlantic Forest
biome and have initially been ranked as A. aff jamaicensis by Althoff, 1996). The
cluster obtained presents a considerable consistence within this tree and all other
trees generated by the MP, NJ, ML, and BI analyses. This association with A.
obscurus is confirmed also by the analysis of morphologic and cytogenetic data
(Althoff, 1996). This taxon seems to be of restrict distribution, across the southern
Atlantic Forest and has so far been trapped between parallels 26°55’S – 49°03’W
and 27°18’S – 48°33’ W. The interest in this association lies in the fact that the
sister species to this taxon is A. obscurus which is widely distributed, occurring
from Venezuela on the north, Guineas on the east, Colombia, Ecuador and Peru
on the west, and moving on southwards, to southern Brazil along the Atlantic
Forest (Marques-Aguiar, 1994; Taddei et al., 1998; Simmons, 2005; and the
present study). Both taxa differ in sequence divergence values between 3.2% and
4.3%, with an average value of 3.78%. Such number is above the average
suggested by Bradley and Baker (2001) for bat intraspecific divergence, but falls
within both the intraspecific divergence values ( = 3, ranging from 0.09% to
8.7%) and between two sister species ( = 6.8%, ranging from 2.50% to 16.42%).
These results suggest that the two taxa may be separated into different taxonomic
categories, intraspecific (subspecies, for instance) or specific. Bradley and Baker
(2001) proposed that the low divergence values, as observed between A.
obscurus and Artibeus sp., may be the effect of recent divergence times. It is
likely, therefore, that Artibeus sp. represents a recent regional differentiation within
the southern limit of the A. obscurus domain.
The more basal position in the tree as occupied by A. obscurus diverges
from that found in other phylogenetic analyses in which the species is revealed as
a more derived taxon of Artibeus (Marques-Aguiar, 1994; Van den Bussche et al.,
1998; Guerrero et al., 2003, 2004; Lim et al., 2004). Thus, the inclusion of
30
representative specimens collected in the species’ southern domain in the present
phylogenetic analysis seems to alter the relationships held by A. obscurus with the
other species under the genus (Fig. 1a). The combined analysis of the two genes
(Fig. 1b), nevertheless, places A. obscurus in a more intermediary position (50.9%
bootstrap) and, also, as a sister species to Artibeus sp.
It is also observed that A. obscurus presents a strong geographic
subdivision (with high bootstrap values) between the representatives (specimens
collected in Surinam and French Guinea) of the northern South American territory
and those of the Brazilian Cerrado (Fig. 1a). While the intra-group divergence
values are small (2.8% and 0.8% genetic distances, respectively), the inter-group
divergence figure is higher (3.9%), stressing the evidence of a likely incipient
geographic differentiation. Perhaps this nominal taxon represents a higher
taxonomic group (macro-species), as some degree of geographic structuration has
also been reported by Ditchfield (2000) among the species inhabiting the South
American and Atlantic Forest northern regions, and by Lim et al., (2004), among
the specimens of the east (Guineas), and west (Venezuela). The average
divergence values found in both studies, 3.3% and 3.2%, respectively, among the
geographic groups were very similar to those observed in our analysis.
After A. obscurus, appears, A. fimbriatus whose species formed a highly
consistent cluster which occupied a relative baseline position in the tree (Fig.1a), a
location observed also in the combined gene analysis (Fig. 1b). Such basal
position of A. fimbriatus was in accordance with the morphology-based phylogeny
described by Marques-Aguiar (1994) and with the molecular phylogenies depicted
by Van den Bussche et al. (1998) and Lim et al., (2004). A. fimbriatus occurs in
several restricted areas in the eastern Brazilian regions, inhabiting the states of
Bahia to Rio Grande do Sul, and also the Paraguayan territory with populations
concentrated in some specific remaining areas of the Atlantic Forest, is more
abundant in environments near the coasts (Taddei et al., 1998). Marques-Aguiar
(1994), taking into account that the species carries the smallest number of
advanced characters in the genus Artibeus, considers A. fimbriatus a relict.
Next, an assemblage of three species is produced (A. hirsutus, A.
inopinatus, and A. fraterculus). The same arrangement is also observed by
31
Marques-Aguiar (1994), Van den Bussche et al. (1998), Lim et al. (2004), and
Guerrero et al. (2004). The three species are restricted to the arid regions of
Central America (A. hirsutus, A. inopinatus), and northern South America, towards
the Pacific Ocean (A. fraterculus) (Marques-Aguiar, 1994; Eisenberg and Redford,
1999). The proposal of Marques-Aguiar (1994) and by Van den Bussche et al.
(1998) in which A. hirsutus and A. inopinatus would be sister species has been
confirmed by our results (genetic distance 8.1%, i.e., sister species level). Only A.
hirsutus was investigated in the RAG2 gene analysis and it was placed at the base
of the tree generated by the combined gene analysis (Fig. 2b).
The next node shows A. jamaicensis, a species considered to be a complex
taxon that exhibits a morphological variability among populations that had led to
the recognition of eigth subspecies differing primarily in characters such as size,
color, and number of upper molars. The geographic and morphometric patterns of
these subspecies have never been clearly established, and the status of many of it
has also been put to test (such is the case of A. j. planirostris and A. j. triomylus,
Guerrero et al., 2004). The intermediary position occupied by A. jamaicensis in the
phylogenetic analysis we carried out has also been observed in the studies of Van
den Bussche et al. (1998), Lim et al. (2004), and Guerrero et al. (2004).
Further on, a highly consistent clade is observed, including A. lituratus and
A. intermedius. A. lituratus is one of largest species of the genus with the most far-
reaching distribution span, occurring across the whole Neotropical American
region (except for the Antilles) and electing moist areas and evergreen multistratal
forests therein as preferred habitats. The species nevertheless tolerates man-
made forest clearings and, together with A. jamaicensis, is among the most
common species of Artibeus. A. intermedius has been suggested as a synonym to
A. lituratus (Jones and Carter, 1976), and the fact that both taxa were arranged
clustered reinforced this proposal. The very low average divergence values, as
observed between A. lituratus and A. intermedius (between 0.8% and 3%, at
intraspecific level, Table 2) are allied to this finding. Another interesting feature to
be commented is that the species occupies a derived position, both in the cyt b
tree (Fig. 1a) and in the combined gene tree (Fig. 1b) such topology has also been
found by Marques-Aguiar (1994), Van den Bussche et al. (1998), and Lim et al.
32
(2004). Taddei et al. (1998), based on a morphometric study, also propose A.
lituratus as one of the most derived species within the genus.
Lastly, a clade is formed by assembling two taxa (with over 90% bootstrap),
which has at the base A. amplus and, as most derived species, A. planirostris.
These species are large Artibeus that are similar in size and have an overlapping
geographic distribution (Eisenberg and Redford, 1999). But, while A. amplus is
restricted to open forest and forested areas nearby streams and other moist
regions in the northern South America (Marques-Aguiar, 1994), A. planirostris
spreads more broadly, from the southern Orinoco River to the southeastern South
America (though without a delimited southern distribution threshold, as reported by
Lim et al.,2004). This more derived position shown in the tree generated by cyt b
gene is also observed when both genes are analysed in combination (Fig. 1b).
In the past, Handley (1987) and Marques-Aguiar (1994), in extensive
studies of the large Artibeus systematic, synonymized A. planirostris and A.
jamaicensis (this species as senior-synonym), based on the phylogenetic analysis
of morphologic data. In the present study, the A. planirostris specimens
investigated were originated from the Cerrado biome, and clustered with this
species’ exemplars natural to the northern South American territory (Fig. 1a),
suggesting that the individuals analysed belong to a large clade which includes
representatives found from the Brazilian Cerrado to Venezuela. This mentioned
clade, however, showed a subdivision (91.5% bootstrap), sorting out the Cerrado
A. planirostris and the specimens from Central America and northern South
America, suggesting a possible geographic structuration. The data obtained in the
present study corroborate the Lim et al. (2004) proposal, in which A. planirostris
and A. jamaicensis are held to be distinct species.
4.2. Genetic diversity and population structure
The genetic diversity and the possible geographic structure of populations
has been investigated in two species, A. lituratus and A. fimbriatus, both with high
genetic diversity and low divergence, but differing as regards the likely
33
structuration patterns.
Fourteen A. lituratus individuals were analysed, revealing 13 haplotypes, a
level similar to that observed by Ditchfield and Burns (1998) and Ditchfield (2000),
who reported 24 haplotypes in 36 individuals sequenced in a sample that included
species of the genus collected from the southern Mexican territory to the southern
Brazilian territory (a stretch of land covering round 8,000 km), as well as shared
haplotypes observed between sampling sites distant as much as 3,200 km from
one another. The average nucleotide divergence found was as little as 1.5%,
similar to the 1.2% obtained with our sample. The results of the mismatch
analyses, Tajima’s neutrality test, AMOVA, and Network conformation suggest
that, very likely, the shared haplotype here found for A. lituratus is in fact the result
of the expansion of the species populations.
As regards A. fimbriatus, the analysis likewise indicates the population
expansion (Fig. 2b), but when the São Paulo individual is added to the analysis,
there seemed to emerge a geographic structure pattern for the species within the
Atlantic Forest biome (Fig. 2d). A geographic divergence has also been reported in
other Phyllostomidae species, such as Glossophaga soricina, Sturnira lilium,
Artibeus obscurus, A. cinereus, Trachops cirrhosus, and Carollia perspicillata
(Ditchfield, 2000). In the case of A. fimbriatus it is nonetheless necessary to
expand sample sizes to characterize this population pattern accurately.
All in all, our findings corroborate the conclusions of Ditchfield (2003), who
demonstrated that Brazilian bats undergo a low intraspecies phylogeographic
structuration process. On the other hand, some of these species show a
concomitantly higher geographic differentiation, in a larger scale, from Mexico to
southern Brazil, or even in areas inside the Atlantic Forest biome. Such
differentiations would correspond to the geographic patterns found also for rodents
and other organisms, suggesting that the certain specific regions underwent an
isolation process, drastic enough in intensity, to be visibly reflected in the genomes
of several species, among which those of bats.
34
Acknowledgements
The authors are grateful to Drs. Denis Sana, Fernanda Trierveiler, Luiz
Flamarion B. Oliveira, and Thales R.O. de Freitas for field work, to Gabriela
Camargo, Luciano S. Silva, and Valéria C. Muschner for help in the Lab analysis
and to Dr. Loreta B. de Freitas by several facilities provided.
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), and the Organization of the American
States (OAS) have supported this study.
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History, New York, 248: 1-200.
40
APPENDIX
Access numbers (in parenthesis) of sequences corresponding to the voucher number,
and next the collection site.
A. fimbriatus: FURB-SLA1104 (DQ985478, DQ985528
), FURB-SLA468 (DQ985479
,
DQ985510), FURB-SLA969 (DQ985477,
DQ985526
) - Blumenau 26º55'S 49º03'W;
FURB-SLA1013 (DQ985527), FURB-SLA739 (DQ903820
,
DQ903835
) - Gaspar
26º55'S 48º57'W; FURB-SLA1580 (DQ985476
,
DQ985533) - Indaial 26º53'S 49º13'W;
FURB-SLA930 (DQ985500,
DQ985525)- Jacinto Machado 28º59'S 49º45'W; FURB-
SLA1482 (DQ985501
,
DQ985531) - Jaraguá do Sul 26º29'S 49º04'W.
A. planirostris: AN1882 (DQ985487) – Palmeirante 07º51'S 47º55'W; MN36311
(DQ985489,
DQ985505), MN36318 (DQ985486,
DQ985506
), MN36380 (DQ985490
,
DQ985507) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W.
A. lituratus: MN36783 (DQ985491
,
DQ985508), MN36807 (DQ985492,
DQ985509
),
MN36827 (DQ985493) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W; FURB-SLA1110
(DQ985485
,
DQ985529) - Blumenau 26º55'S 49º03'W; FURB-SLA1575 (DQ985532) -
Indaial 26º53'S 49º13'W; FURB-SLA581 (DQ985484
,
DQ985511), FURB-SLA641
(DQ985494,
DQ985512), FURB-SLA657 (DQ985495
,
DQ985513
) FURB-SLA754
(DQ985496
,
DQ985516), FURB-SLA756 (DQ985517) - Florianópolis 27º35'S
48º32'W; FURB-SLA924 (DQ985499
,
DQ985524) - Jacinto Machado 28º59'S
49º45'W; FURB-SLA884 (DQ985483
,
DQ985520), FURB-SLA889 (DQ985521),
FURB-SLA890 (DQ985480
,
DQ985522) - Nova Veneza 28º38'S 49º29'52W; FURB-
SLA822 (DQ903819
,
DQ903837); FURB-SLA844 (DQ985519) - Porto Belo 27º09'S
48º33'W; FURB-SLA922 (DQ985523) - Santa Rosa do Sul 29º08'S 49º42'W; FURB-
SLA738 (DQ985482
,
DQ985515), FURB-SLA1113 (DQ985530) - Santo Amaro da
Imperatriz 27º41'S 48º46'W; FURB-SLA658 (DQ985481
,
DQ985514) - Treze de Maio
28º33'S 49º08'W.
A. cf obscurus: MN36263 (DQ985488
,
DQ985504
), MN36388 (DQ903818
,
DQ903836) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W; FURB-SLA841 (DQ985498
) - Porto
Belo 27º09'S 48º33'W.
Artibeus sp: FURB-SLA775 (DQ985497,
DQ985518
) - Gov. Celso Ramos 27º18'S
48º33'W, FURB-SLA1773 (DQ985502
,
DQ985534) FURB-SLA1835 (DQ985503
,
DQ985535), FURB-SLA1928 (DQ985536
) FURB-SLA1928 (DQ985537) - Blumenau
26º55'S 49º03'W.
41
Table 1
Species (acronyms), collection sites, morphoclimatic domains, number of individuals, cytochrome b
haplotypes found in this sample, and GenBank accession numbers of literature
Species Locality Biomes Number of
individuals
Cyt b
haplotypes
A. fimbriatus (AFI)* Jaraguá do Sul (3) Atlantic RF 1 1
A. fimbriatus (AFI) Indaial (4) Atlantic RF 1 2
A. fimbriatus (AFI) * Gaspar (5) Atlantic RF 2 3, -
A. fimbriatus (AFI) Blumenau (6) Atlantic RF 3 4, 5, 6
A. fimbriatus (AFI)* Jacinto Machado (13) Atlantic RF 1 7
A. planirostris (APL)* Palmeirante (1) Cerrado-Amazon** 1 1
A planirostris (APL)* Colinas do Sul (2) Cerrado 3 2, 3, 4
A. lituratus (ALI)* Colinas do Sul (2) Cerrado 3 1, 2, 3
A. lituratus (ALI) Blumenau (6) Atlantic RF 1 4
A. lituratus (ALI) * Porto Belo (7) Atlantic RF 2 5, -
A. lituratus (ALI) Florianópolis (9) Atlantic RF 5 6, 7, 8, 9, -
A. lituratus (ALI) Sto Amaro da Imperatriz (10) Atlantic RF 2 2, -
A. lituratus (ALI)* Treze de Maio (11) Atlantic RF 1 10
A. lituratus (ALI) Nova Veneza (12) Atlantic RF 3 11, 12, 13
A. lituratus (ALI) Jacinto Machado (13) Atlantic RF 1 13
A. lituratus (ALI) Santa Rosa do Sul (14) Atlantic RF 1 -
A. cf obscurus (AOB)* Colinas do Sul (2) Cerrado 2 1, 2
A. obscurus (AOB) Porto Belo (7) Atlantic RF 1 3
Artibeus. sp. (ASP)* Blumenau (6) Atlantic RF 4 1, 2, -
A. aff jamaicensis (ASP)* Gov. Celso Ramos (8) Atlantic RF 1 1
GENBANK
Species Locality GenBank Accession No.
Cyt b RAG2
A. amplus (AAM) * Venezuela, Pozon
AY642923
a
A. concolor (ACO) * Suriname,
U66518
b
A. concolor (ACO)
AF316432
a
A. fimbriatus (AFI) * Brazil, São Paulo
U66498
b
A. fraterculus (AFR) * Peru
U66499
b
A. hirsutus (AHI) * Mexico
U66500
b
A. inopinatus (INO) * Honduras
U66501
b
A. intermedius (AIN) * Mexico
AY144338
c
A. intermedius (AIN) * Costa Rica, Guanacaste
U66502
b
A. jamaicensis (AJA) *
AY144346
c
A. jamaicensis (AJA) * Panama
AY144347
c
A. jamaicensis (AJA) * Honduras
AY382783
c
A. lituratus (ALI) * Trinidad
U66505
b
A. obscurus (AOB) * Suriname
U66506
b
A. obscurus (AOB) * French Guiana
U66507
b
A. planirostris (APL) * Venezuela, Pozon
AY642913
a
A. planirostris (APL) *
AY642914
a
A. planirostris (APL) *
AY642915
a
OUTGROUPS
Glossophaga soricina (GSO)
AF423081
d
Glossophaga soricina (GSO)
AF316452
f
Sturnira lillium (SLI) Colinas do Sul (2)
DQ903815
e
AF316488
f
Sturnira tildae (STI) Sto Amaro da Imperatriz (10)
DQ903816
e
DQ903847
d
Artibeus (dermanura) cinereus (DCI)
U66511
b
AF316443
f
Enchisthene hartii (EHA)
U66517
b
AF316449
f
*Individuals included in the phylogenetic analyses with cyt b; **Cerrado-Amazon transition;
a
Lim et al.
(2004);
b
Van Den Bussche et al.(1998);
c
Guerrero et al. (2004);
d
Dávalos and Jansa (2004);
e
Freygang
et al. (unpublished);
f
Baker et al.(2000); - Cyt b sequence absent.
Table 2. Pairwise sequence divergence (in %) estimated by Kimura-2 parameters for cytochrome b in large Artibeus and outgroups.[1] DQ985487 AJP [2] DQ985488 AOB [3] DQ985489 AJP [4] DQ985486 AJP [5]
DQ985490 AJP [6] DQ903818
AOB [7] DQ985491 ALI [8] DQ985492 ALI [9] DQ985493ALI [10] DQ985479 AFI [11] DQ985484 ALI [12] DQ985494 ALI [13] DQ985495 ALI [14] DQ985481 ALI [16] DQ903820
AFI [17]
DQ985496 ALI [18] DQ985497 ASP [19] DQ903819
ALI [20] DQ985498 AOB [21] DQ985483 ALI [23] DQ985499 ALI [24] DQ985500 AFI [25] DQ985477 AFI [26] DQ985478 AFI [27] DQ985485 ALI [28] DQ985501 AFI
[29] DQ985476 AFI [30] DQ985502 ASP [31] DQ985503 ASP [32] U66498 AFI [33] U66499 AFR [34] U66500 AHI [35] U66501 INO [36] U66502 AIN [37] U66506 AOB[38] U66507 AOB [40] AY144338 AIN [41] AY144346
AJA [42] AY144347 AJA [43] AY382783 AJA [44] AY642913 APL [45] AY642914 APL [46] AY642915 APL [47] AY642923 AAM [48] MN36314 SLI [49] AF423081 GSO.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
[1] [ 2]
0.061
[ 3]
0.004
0.057
[ 4]
0.005
0.055
0.004
[ 5]
0.012
0.060
0.011
0.007
[ 6]
0.061
0.008
0.057
0.055
0.060
[ 7]
0.051
0.060
0.046
0.045
0.049
0.060
[ 8]
0.046
0.055
0.042
0.041
0.045
0.055
0.010
[ 9]
0.048
0.057
0.044
0.042
0.046
0.057
0.011
0.007
[10]
0.075
0.061
0.071
0.072
0.077
0.063
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0.086
0.055
0.060
0.057
0.080
0.052
0.057
0.057
0.077
0.080
0.081
0.061
0.078
0.083
0.060
0.063
0.081
0.088
0.099
0.095
0.055
0.070
0.062
0.112
0.072
0.070
0.066
0.076
0.016
0.018
[47]
0.039
0.060
0.038
0.033
0.041
0.060
0.058
0.051
0.052
0.074
0.054
0.061
0.057
0.057
0.052
0.081
0.054
0.058
0.061
0.075
0.051
0.058
0.055
0.072
0.075
0.077
0.060
0.074
0.078
0.058
0.061
0.080
0.089
0.094
0.090
0.057
0.074
0.067
0.097
0.067
0.064
0.063
0.068
0.033
0.035
0.042
[48]
0.162
0.137
0.156
0.156
0.163
0.137
0.143
0.148
0.144
0.149
0.148
0.141
0.144
0.137
0.144
0.153
0.149
0.139
0.139
0.156
0.148
0.143
0.143
0.153
0.153
0.151
0.148
0.153
0.156
0.139
0.143
0.149
0.162
0.156
0.166
0.144
0.152
0.152
0.167
0.148
0.148
0.153
0.153
0.156
0.155
0.158
0.160
[49]
0.178
0.189
0.177
0.177
0.186
0.189
0.191
0.202
0.198
0.176
0.202
0.195
0.200
0.191
0.198
0.178
0.200
0.182
0.193
0.176
0.193
0.191
0.200
0.173
0.173
0.167
0.204
0.171
0.174
0.182
0.185
0.184
0.193
0.191
0.198
0.200
0.181
0.190
0.173
0.200
0.197
0.197
0.202
0.178
0.173
0.173
0.191
0.216
44
Figure Legends
Figure 1a: Maximum Likelihood tree for cytochrome b gene. Likelihood settings from
best-fit model (TrN+G) selected by hLRT: Lset Base=(0.2908 0.3014 0.1296) Nst=6
Rmat=(1.0000 4.1839 1.0000 1.0000 16.3966) Rates=gamma Shape=0.2132
Pinvar=0. Numbers above branches are bootstraps values. Cerrado Atlantic
Rainforest northern South America ♦ Central America. 1b. Neighbor-Joining
analysis tree for combined analyses of cyt b ad RAG2 genes under ML parameters.
Likelihood settings from best-fit model (TrN+I+G), gamma shape=1.3359 and
Pinvar=0.6767. Numbers above branches are bootstraps values.
Fig 2a: Mismatch distributions of Artibeus lituratus of cyt b gene. The histogram
shows the observed distribution of pairwise differences between the individuals of
analysed populations. The line shows the expected distribution for a growing
population under the sudden expansion model. The x-axis refers to the number of
differences between pairs of haplotypes; the y-axis shows the observed/expected
occurrence of each pairwise difference. 2b: Mismatch distributions of Artibeus
lituratus of cyt b + RAG2 genes. 2c: Mismatch distributions of Artibeus fimbriatus. 2d:
Mismatch distributions of Artibeus fimbriatus of cyt b + RAG2 genes. 2e: Median-
joining network for mitochondrial cyt b haplotypes of Artibeus lituratus. Gray circles
represent Atlantic Forest haplotypes; black circles represent Cerrado haplotypes;
hollow circles represent haplotypes not sampled or that have become extinct.
Correspond to the haplotypes listed in Table 1. 2f: Median-joining network for
mitochondrial cyt b haplotypes of Artibeus fimbriatus.
46
47
A
A
r
r
t
t
i
i
g
g
o
o
2
2
PHYLOGENETIC ANALYSIS OF STENODERMATINAE BATS FROM
CERRADO AND ATLANTIC RAINFOREST BIOMES BASED ON MITOCHONDRIAL
AND NUCLEAR DNA
Artigo submetido à revista Acta Chiropterologica
Cristina Claumann Freygang
1
, Sérgio L. Althoff
2
; Ana Letícia Pereira
3
&
Margarete Suñé Mattevi
1-3
*
1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Caixa Postal 15053, CEP 91501-970, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil
2
Universidade Regional de Blumenau. Caixa Postal 1507, CEP 89010971, Blumenau, Santa Catarina,
Brazil
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, Av. Farroupilha, n
o
8001, CEP
92450-900, Canoas, Rio Grande do Sul, Brazil.
*Corresponding author: Fax and Phone: 55 (51) 33113386
E-mail address: [email protected]
Keywords: Chiroptera, Stenodermatinae, phylogeny, cytochrome b; RAG2; Cerrado;
Atlantic rainforest
Running Title: DNA PHYLOGENETIC ANALYSIS OF STENODERMATINAE BATS
FROM DIFFERENT BIOMES
C
C
a
a
p
p
í
í
t
t
u
u
l
l
o
o
V
V
I
I
48
Abstract
In this article, we investigate the manner in which the different groupings
amongst the Stenodermatinae are formed by analyzing the relationships between
their genes based on the sequences of the mitochondrial cytochrome b and the
nuclear RAG2 of species representative of the Brazilian Atlantic Rainforest and
Cerrado biomes, regions which have been but little sampled in other phylogenetic
analyses. The study involves the analysis of 27 sequences, 13 of the cytochrome b
and 14 of the RAG2 genes in 9 species of 6 genera collected in 6 sites in an area
located between 14º to 27ºS and 47° to 49°W. These species were grouped with
another 32 species obtained from the Genbank. The various analyses performed
demonstrated that this sub-family includes bats of the Sturnirini and Stenodermatini
tribes and that this, in turn, was subdivided into two sub-groups corresponding to the
Stenodermatini (sub-tribe Vampyressina) and to the Mesostenodermatinae tribe. This
latter is further sub-divided in two sub-tribes, Artibeina and Stenodermatina. These
results indicate that the inclusion of representatives from the South of the Neotropical
Region shows the same clades found in the phylograms already described, but the
clusters generated do not fall in the same ranks as are proposed in these analyses.
1. Introduction
The subfamily Stenodermatinae belongs to the Phyllostomidae family of
Neotropical bats which is found widely distributed from Arizona (USA) and Mexico to
Argentina, (Simmons, 2005). The morphological characteristics include small ears, a
medium sized nose-leaf and short, broad jaws. Species frequently bear white stripes
on the face or on the back. They are fruit eaters and because of their fruit-based diet,
the bats of the Stenodermatinae sub-family are considered some of the most
important seed dispersers essential for the regeneration of forests and the
colonization of new areas by plants (Altringham, 1996).
49
Cytogenetic studies of the majority of the Stenodermatinae have demonstrated
a marked intra and interspecific karyotype stability, and the Artibeus (with 2n=30/31)
genus is considered to be the carrier of the primitive karyotype of this sub-family
(Silva et al., 2005).
Stenodermatinae comprises 18 genera (Simmons, 2005) grouped at first by
Gervais, 1856 within the Stenodermina tribe, and later ranked in the sub-family
category (Stenodermatinae) by Miller (1907) (the taxon may also be referred to as
Stenoderminae - Vieira, 1942). Some few genera, such as Artibeus, Chiroderma,
Platyrrhinus, Sturnira and Vampyressa comprise almost half the existing species
while many other genera are monotypics.
Several of the members of this sub-family are considered problematical and
many genera need revision – for example, Artibeus, Dermanura, Chiroderma,
Mesophylla, Platyrrhinus and Vampyressa. Also, the relationships between the
genera are obscure (Gregorin and Tavares, in press). Sturnira, for instance, is a
problematic taxon that has both been included in its own sub-family, (Sturnirinae,
Miller, 1907) or transferred as a tribe into the sub-family Stenodermatinae (Wetterer
et al., 2000; Baker et al, 2003).
Based on molecular analyses, Baker et al. (2003) demonstrated that the
Stenodermatinae is monophyletic. Owen (1987, 1991) and Lim (1993), using
craniodendental characters, analyzed the phylogenetic relationships amongst the
species of the sub-family, emphasizing those between the Artibeus, Dermanura and
Koopmania genera. On the other hand, Koopman (1993) in his revision, considered
Stenodermatinae as being made up of two tribes, (i) Sturnirini (with the Corvira and
Sturnira genera only) and (ii) Sternodermatini with the remaining 16 genera. Wetterer
et al. (2000) proposed, within the Stenodermatinae, the same two tribes, (Sturnirini
and Stenodermatini) previously described by Koopman (1993), but differently to this
author, made a subdivision of this last tribe into 2 sub-tribes, Stenodermatina and
Ectophyllina, with the first proven to be monophyletic (Wetterer et al., 2000). In turn,
Baker et al. (2003), using the sequences of the mitochondrial cytochrome b and
nuclear RAG2 genes, divide the Stenodermatinae into three tribes, Sturnirini,
50
Sternodermatini, and Mesostenodermatini (the last including also the Enchisthenina,
Ectophyllina, Artibeina and Stenodermatina sub-tribes). Simmons (2005), in a recent
revision, considers only two tribes, joining Stenodermatini and Mesostenodermatini in
the Sternodermatini tribe, without their subdivisions, which would include the genera
Ametrida, Ardops, Ariteus, Artibeus, Centurio, Chiroderma, Ectophylla, Enchistenes,
Mesophylla, Phyllops, Platyrrhinus, Pygoderma, Sphaeronycteris, Stenoderma,
Uroderma, Vampyressa, and Vampyrodes.
In this article, we investigate the manner in which the different groupings
amongst the Stenodermatinae are formed by analyzing the relationships between
their genera based on the sequences of the mitochondrial cytochrome b and the
nuclear RAG2 genes of species representative of the Brazilian Atlantic Rainforest and
Cerrado biomes, regions which have been but little sampled in other phylogenetic
analyses.
2. Materials and Methods
2.1. Sampling
The sample consists of 28 sequences, 13 of cyt b gene and 14 of RAG2 gene
of 9 species from 6 genera trapped in 6 sites located in an area ranging from 14º to
27ºS and 47° to 49°W, in two morphoclimatic domains of the Brazilian territory (Table
1). These species were grouped with other 32 sequences obtained from GenBank.
The skins and skulls of these specimens are stored in the Mammals Collection of
Universidade Regional de Blumenau, Blumenau, Santa Catarina and Mammals
Collection of the Museu Nacional, Rio de Janeiro, Brazil.
Table 1 here
51
The sequences of two microchiroptera taxa, Glossophaga soricina and
Rhinophylla pumilio were included as outgroups. The choice of the outgroups was
based on phylogenetics relationships of these taxa with the sub-family
Stenodermatinae, as evidenced in Baker et al. (2003).
2.2. Nucleotide acid sequence analysis
DNA was extracted from kidney, liver, heart or muscle (stored at–20
o
C or in
ethanol 70% purity) using the standard protocol described in Medrano et al. (1990).
The mitochondrial cytochrome b gene (hereafter cyt b) sequences were isolated via
polymerase chain reaction (PCR) using the primers MVZ05, MVZ23 (light-strand),
MVZ16 (heavy-strand) suggested by Smith and Patton (1993), and MUS15398
(heavy-strand) suggested by Anderson and Yates (2000). PCR reaction were run in a
total volume of 25µl containing: 10x PCR buffer, 2,6mM of MgCl
2
, 0,56µM of dNTP,
0,2µM of each primer, 1 unit of Taq polymerase, and 1-2ul of template DNA. Reaction
conditions were as follows: Initial denaturation (92
o
C – 5min); followed by 5 cycles in
Touchdown (denaturation: 92
o
C - 1 min; annealing temperature step-downs every
cycle 1
o
C from 50
o
C to 46
o
C - 1 min; extension: 72
o
C - 1 min). The annealing
temperature for the final 35 cycles was 46
o
C with denaturation and extension phases
as above. Final extension: 72
o
C – 10 min. Each round of PCR reactions also included
one negative control to check for contamination.
For the amplification of nuclear recombination activating gene (hereafter
RAG2), the primers RAG2F1 (light-strand), RAG2F2 (heavy-strand) suggested by
Baker et al., (2000) were used. PCR reactions were run in a total volume of 25µl
containing: 10x PCR buffer, 2,6mM of MgCl
2
, 1,12µM de dNTP, 0,32µM of each
primer, 1 unit of Taq polymerase, and 1-2ul of template DNA. Reaction conditions
were as follows: Initial denaturation (92
o
C – 5min); followed by 35 cycles
(denaturation: 92
o
C – 60s; annealing temperature 60
o
C – 45s; extension: 72
o
C –
52
90s). Final extension: 72
o
C – 10 min. Each round of PCR reactions also included one
negative control to check for contamination
PCR products were purified with exonuclease I and shrimp alkaline
phosphatase (Amersham Biosciences). All taxa were sequenced directly from purified
PCR products using the primers cited above and the ABI Prism BigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems), according
to the manufacturer’s instructions. Sequencing of both strands was carried out using
an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). All sequences are
available in GenBank as displayed in Table 1.
2.3. Data analysis
The sequences obtained were read employing the Chromas 1.45 program,
aligned using the Clustal X 1.81 program (Thompson et al., 1997) under the default
setting costs and manually refined with the aid of the Genedoc (Nicholas and
Nicholas, 1997). Saturation plots were obtained with Data Analysis in Molecular
Biology and Evolution software (DAMBE; Xia and Xie, 2001). The composition of
bases was accomplished by the use of Molecular Evolution Genetics Analysis
software -MEGA3 (Kumar et al., 2004).
The phylogenetic analyses were performed using the maximum parsimony
(MP) algorithm obtainable in PAUP*, version 4.0b10 (Swofford, 2001) by heuristic
search with tree bisection-reconnection (TBR) branch swapping, the MULPARS
option, and 100 random-addition replicates. Bootstrap statistical support (Felsenstein,
1985) was carried out with 1,000 replications of heuristic search and simple taxon
addition, with the all trees saved option.
The ML maximum-likelihood (ML) tree estimation was conducted with PHYML
(Guindon and Gascuel, 2003), under appropriate model of nucleotide substitution,
determined using the MODELTEST 3.06 program (Posada and Crandall, 1998).
Reliability of the trees was tested using 1,000 bootstrap replications.
53
The neighbor-joining analysis (NJ – Saiton and Nei, 1987) was conducted
under a ML model, with parameter settings estimated by MODELTEST, as described
by Xiang et al. (2002) with 1,000 bootstrap replications.
Bayesian analyses (BI) of the data were performed using MrBayes 3.0b4
(Huelsenbeck and Ronquist, 2001) to generate a posterior probability distribution
using Markov chain Monte Carlo (MCMC) methods following Baker et al. (2003). We
ran three independent analyses. No a priori assumptions about the topology of the
tree were made and all searches were provided with a uniform prior. The models of
DNA substitution used were those estimated by MODELTEST and used in the
standard ML analyses. The MCMC processes were set so that four chains (one cold
and three incrementally heated Markov chains) were run simultaneously for 1 million
generations, with trees being sampled every 10 generations. Bayesian likelihoods
reached 500,000 generations (burn-in=5000). The values were established by
empirical evaluation of tree likelihood scores and following Baker et al. (2003). To
calculate the posterior probability of each bipartition, a 50% majority-rule consensus
tree was constructed from the remaining trees using PAUP*.
To detect the presence of character conflict between cyt b and RAG2 genes
incongruence length difference (ILD) test was computed as described by Farris et al.
(1994, 1995) and implemented in WINCLADA version 0.9.9+ (BETA) (Nixon, 2002). A
subset of the individuals for which sequences from both data sets were available was
combined into a single analysis.
3. Results
3.1. Sequence data
For the cyt b gene, 13 individuals were sequenced. To this sample, 15 other
selected sequences deposited in GenBank were added plus 3 outgroups, making up
the total of 31 specimens analyzed (Table 1). A fragment of 731 bp was chosen for
54
the analysis. Considering only the ingroup, 289 variable sites were observed, with 50
corresponding to the first codon position, 15 to the second, and 224 to the third
position.
In the case of the nuclear RAG2 gene, 791pb were sequenced in 14 samples,
together with another 8 from the GenBank plus 2 outgroups (Table 1). In the analysis
of the ingroup alone, 113 variable sites were found of which 19 corresponded to the
first codon position, 8 to the second, and 86 to the third position.
For both genes, the saturation curve obtained (not shown) indicated that there
is no clear evidence of multiple substitution (saturation) in any codon position, and
thus there should be no loss of phylogenetic signal among the more divergent taxa in
this analysis.
In the combined analysis of the cyt b and RAG2 genes, 12 exemplars from 8
species were used, as well as 9 sequences from the GenBank and 2 outgroups.
3.2. Phylogenetic Analysis
In the maximum-parsimony (MP) analysis, performed with the mitochondrial gene
cyt b, the heuristic search resulted in 3 most-parsimonious trees of 1,200 evolutionary
steps with a consistency index (CI) of 0.352 and a retention index (RI) of 0.557. In this
analysis, 246 sites were informative for parsimony and in the strict-consensus tree
(not shown) the bootstrap values varied between 53 and 100, and the tree generated
by this analysis presented many polytomies.
For the remaining analyses, the model selected by MODELTEST was GTR+I+G
with a gamma shape of 1.0317. The trees resulting from the cyt b analysis (not
shown) were not well-resolved, presenting contradictory relationships in the different
analyses.
Concerning the RAG2, the number of characters that produced information for the
parsimony analysis was 54. In the MP analysis, the heuristic search of RAG2 data
55
resulted in 2 most parsimonious trees with 154 steps, with a CI = 0.792 and an RI =
0.851. K80+G with a gamma shape =0.0845 was the model selected.
In the phylogenetic analysis of the cyt b and RAG2 genes combined, the ILD test
revealed that the amount of character conflict between both genes is not significant
(P=0.1667), therefore the combined alignments resulted in 1,502 characters analyzed
for the 9 species belonging to our sample, plus 8 from those from the GenBank, in
addition to 2 outgroups (listed in Table 1). In the MP analysis, the combined data set
generated 7 most-parsimonious trees of 1,073 steps with 271 parsimony-informative
characters, a CI of 0,459 and a RI of 0,591. As regards the maximum likelihood
analysis, the selected model using the MODELTEST was GTR+I+G with gamma
shape parameters estimated as 0.2266.
Both in the RAG2 analysis and in the combined analysis of the two genes, all the
trees (not shown) generated (MP, NJ, and BI for RAG2 and MP, NJ, and ML for the
concatenated analysis) presented the same topology with high indices of consistency.
The trees resulting from the ML analysis of the RAG2 gene and the BI of the
concatenated genes are shown in Figure 1A and Figure 1B, respectively. In these
figures, a clade can be observed at the base of the tree formed by the species of the
Sturnira genus (bootstrap of 99.7% – Fig. 1A and posterior probability of 98% - Fig.
1B). Another group follows made up of an assemblage of genera: Chiroderma,
Uroderma, Platyrrinus and Vampiressa (bootstrap de 76.6% – Fig. 1A, and posterior
probability of 100% - Fig. 1B). The Enchisthenes hartii species is located in the next
branch (94.9% bootstrap – Fig. 1A and 100% posterior probability - Fig. 1B) and,
finally, a grouping formed by the species of the genera Artibeus, Ametrida,
Pygoderma, Sphaeronycteris, Stenoderma and Phyllops can be observed. In the
latter, a subdivision has occurred separating Artibeus from the other genera (75.3%
bootstrap – see Fig. 1A, and 52% of posterior probability – see Fig. 1B).
Fig. 1 here
56
4. Discussion
The results obtained by the analyses of the cyt b gene did not show a good
resolution in the discrimination of the relationships between the taxa studied, probably
because of saturation of some types of mutations, a fact that was observed also by
Baker et al. (2000) in analyses of some genera of Phyllostomidae. RAG2, on the
contrary, showed good phylogenetic resolution and for this reason, the discussion of
the main findings that we detected in Stenodermatinae will based on this gene and its
combination with cyt b gene.
In our data, both the analysis of the RAG2 gene and the concatenate analysis
of the cyt b and RAG2 genes showed three principal branches (Fig. 1A and Fig. 1B).
One of these branches is characterized by having only one genus - Sturnira.
These are predominately fruit-eating bats feeding principally on plants of the Solanum
genus although they will also eat fruit from other genera, such as Ficus, Piper and
Cecropia (Müller and Reis, 1992).Their species can be found from Mexico to northern
Argentina and Uruguay (Eisenberg and Redford, 1999). Sturnira is a polytypic genus,
which, in Brazil, presents 4 species (Simmons, 2005; Peracchi et al., 2006). Two of
them are included in this analysis - Sturnira lillium (E. Geoffroy, 1810) with samples
from the Cerrado and Atlantic Rainforest and Sturnira tildae de la Torre, 1959, with
representatives from Atlantic Rainforest. Analysis of the RAG2 gene alone could not
distinguish between the Sturnira species but this was not the case in the combined
analysis where the Sturnira lillium exemplars were grouped in a branch having
Sturnira tildae as a base.
In the past, the clade grouping the Sturnira species has often been re-ranked,
(i) in its own sub-family (Sturnirinae, Miller, 1907); (ii) as a member of the
Stenodermatini tribe - Sturnirina subtribe (McKenna and Bell, 1997); or (iii) simply as
a member of Stenodermatinae (Jones et al., 2002). Our data, by the strong
consistency presented (99.7% bootstrap – Fig. 1A, and posterior probability of 98% -
Fig. 1B) indicated a tribal status (Sturnirini) within the Stenodermatinae sub-family for
this taxon. This position was also found in recent molecular data generated by other
57
investigators (Wetterer et al., 2000; Baker et al, 2003). It is important to note that, in
all the molecular analyses performed to date, Sturnira always occupies a basal
position in relation to the other Stenodermatinae.
The next clade includes several genera such as Chiroderma, Platyrrhinus,
Uroderma, Vampyressa and Vampyrodes (Fig. 1A and 1B) and is classified by Baker
et al. (2003) as of the sub-tribe Vampyressina of the Stenodermatini tribe.
Vampyressine bats comprise approximately 29 species of the phyllostomid genera
Chiroderma, Mesophylla, Platyrrhinus, Uroderma, Vampyressa, Vampyriscus, and
Vampyrodes (Hoofer and Baker, 2006).
The genera of this clade exhibit one white line down the center of the back as
the main morphologic characteristic they have in common. Additionally,
morphologically, Ectophylla alba (not included in this analysis) shares close affinities
with Mesophylla macconnelli, and also has been recognized as part of the
Vampyressines (Wetterer et al., 2000) whereas nearly all molecular studies suggest a
sister relationship between Mesophylla and Vampyressa, and a distant relationship
for Ectophylla (Porter & Baker, 2004; Hoofer and Baker, 2006; Peracchi et al, 2006).
Furthermore, questions also exist about the monophyly and rank status of
Vampyressa and Vampyriscus, and their relationships with the remaining species.
Several alternative relationships have been proposed for vampyressine bats
(Owen, 1987; Koopman, 1994; Wetterer et al., 2000; Baker et al., 2003), perhaps
reflecting a rapid and contemporaneous radiation among these fruit-eating specialists.
Comparing the trees generated by the RAG2 gene alone and the combined cyt b and
RAG2 genes, it can be observed that, in stand-alone RAG2 , Chiroderma is the most
basal taxon while by the combined analysis of the two genes, this position is occupied
by Uroderma. Only in this analysis also are the Vampyressa exemplars discriminated
from those of Platyrrhinus (with posterior probability of 91% - Fig. 1B).
A branch represented by Enchisthenes hartii (Fig. 1A and 1B) follows. This is a
monotypic genus considered by Koopman (1993) as a sub-genus of Artibeus, but
lately treated as a separate genus (Wetterer et al., 2000; Simmons, 2005). Its
distribution is limited at North in Tucson, Arizona, USA, being found in Michoacan,
58
Jalisco, and Tamaulipas in México, to Trinidad, Bolívia and Venezuela (Simmons,
2005). Lately, this species was related in the State of Rondônia, Brazil (Peracchi et
al., 2006).
The next clade includes two sister-groups, (denominated in the Baker et al.,
2003, classification as sub-tribe Artibeina and sub-tribe Stenodermatina – both
belonging to the Mesostenodermatini tribe). The first contains two subgenera,
(Artibeus and Dermanura) belonging to the Artibeus genus Leach, 1821, an
heterogeneous group of taxa formed by bats which feed preferentially on fruit, but
which can also consume pollen, nectar, flower parts and insects (Barquez et al.,
1993). The Artibeina spread from Mexico to northern Argentina (Eisenberg and
Redford, 1999), and some of the species of this group are among the most common
and abundant phyllostomids in Neotropical communities (Rui and Fabián 1997).
The systematic of the Artibeus genera still raises much controversy, many
times due to a lack of adequate information on the geographic distribution and
variation of the different taxa, causing many authors referring exemplars incorrectly
classified (Taddei et al.,1998). In this grouping we find Artibeus (Dermanura) cinereus
to be the most basal and the species of the sub-genera Artibeus (Artibeus fimbriatus,
A. cf obscurus e A. lituratus) as the most derived. Analyzing this sub-genera
separately, and taking into account the data obtained with the RAG2 gene only (Fig.
1A), we find that A. obscurus is the most basal species, although in the combined
gene tree, A. fimbriatus takes up the most basal position of the three species (Fig.
1B). This last result is in agreement with the relationships found by Marques-Aguiar
(1994), Van den Bussche et al. (1998) and Lim et al. (2004).
The sister-group includes the stenodermatine frugivorous bats known popularly
as "short-faced" due to extreme antero-posterior cranial compression. Included in this
assemblage are the monotypic genera Ametrida centurio, Pygoderma bilabiatum,
Sphaeronycteris toxophyllum and Stenoderma rufum and one genus (Phyllops) with
two representatives: P. falcatus and a fossil species, P. vetus. In this clade there is
also a subdivision (with 100% bootstrap – Fig. 1A, and 100% of posterior probability –
Fig 1B), separating the two genera endemic of the Minor Antilles (Phyllops and
59
Stenoderma) from the other genera having continental distribution, occurring between
South and/or Central America. The relationships between the Ametrida, Pygoderma
and Sphaeronycteris taxa present differences in the two trees. Very little is known
about the natural and evolutionary history of these taxa that only recently were
considered, together with Ardops nichollsi, Ariteus flavescens, and Centurio senex, as
belonging to the same tribe, based on evidence about the monophyly of the group.
The molecular studies we carried out, which gave greater emphasis to the
inclusion of the Stenodermatinae taxa from the Southern portion of the Neotropical
Region (scarcely sampled in other analyses), demonstrated that this subfamily groups
bats from the Sturnirini (Baker et al., 2003 and Simmons, 2005) and Stenodermatini
tribes (Simmons, 2005). This one, in turn, is sub-divided into two sub-groups,
corresponding to the Vampyressina sub-tribe, and Mesostenodermatini tribe,
Artibeina and Stenodermatina sub-tribes as proposed by Baker et al. (2003). These
results indicate that the inclusion of representatives from the southern part of the
Neotropical Region produces the same clades as were seen in the previous
phylograms performed, but that the clusters generated do not fall into the same ranks
as are proposed in these analyses.
Acknowledgments
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), and the Organization of the American
States (OAS) have supported this study. The authors are grateful to Drs. Denis Sana,
Fernanda Trierveiler, Luiz Flamarion B. Oliveira, and Thales R.O. de Freitas for field
work, to Gabriela Camargo, Luciano S. Silva, and Valéria C. Muschner for help in
the Lab analysis and to Dr. Loreta B. de Freitas by several facilities provided.
60
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Table 1. Species, morphoclimatic domain of the collect sites, localities, and GenBank accession numbers of
specimens analyzed.
CYTOCROME B
Species Biome/Country Locality Coordenates Genbank
Acc. Nº
Artibeus fimbriatus *
Atlantic RF Gaspar 26º55'S 48º57'W DQ903820
Artibeus lituratus *
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903819
Artibeus ac. obscurus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903818
Chiroderma villosum *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903823
Platyrrhiynus lineatus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903827
*
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903826
Pygoderma bilobatum *
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903821
DQ903822
Sturnira lillium *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903814
DQ903815
Sturnira tildae *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903816
Vampiressa pusilla *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903825
*
Atlantic RF Gov. Celso Ramos 27º18'S 48º33'W DQ903824
Country Authors Coordenates GenBank
Acc. Nº
Ardops nicholls
Antilhas Carstens, et al. (2004) 12º15'N 68º45'W AY572337
Ametrida centurio *
- Davalos. unpubl. data - AY604446
Ariteus flavescens
- Davalos. unpubl. data - AY604436
Centurio senex
- Davalos. unpubl. data - AY604444
Chiroderma doriae
Brazil Hoffmann et al. (2003) 23º32'S 46º37'W AY169958
Artibeus (dermanura)
cinereus *
-
Van Den Bussche et al.
(1998)
-
U66511
Enchisthene hartii * -
Van Den Bussche et al.
(1998)
-
U66517
Ectophylla Alba
Panama Hoofer and Baker (2006) 9º00'N 80º00'W DQ312401
Erophylla bombifrons
- Davalos, unpubl. data - AY620438
Mesophylla macconnelli
Ecuador Hoofer and Baker (2006) 2º00'S 77º30'W DQ312422
Phyllonycteris aphylla
- Wright et al. (1999) - AF187033
Phyllops falcatus *
- Davalos, unpubl. data - AY604450
Platalina genovensium
Peru Davalos (2004) 10º00'S 76º00'W AF423101
Platyrrhinus helleri
Bolívia Hoofer and Baker (2006) 14°37'S 60°45'W DQ312408
Rhinophylla pumilio *
French Guiana Hoofer and Baker (2006) 00ºN 53º00'W DQ312397
Sphaeronycteris toxophyllum
*
- Davalos. unpubl. data - AY604452
Stenoderma rufum *
Puerto Rico Hoofer and Baker (2006) 18º15'N 66º30'W DQ312400
Uroderma. bilobatum *
Panama Hoffmann et al. (2003) 9º00'N 80º00'W AY169955
Vampyrodes caraccioli *
- Hoofer and Baker (2006) - DQ312407
RAG2
Species Biome/Country Locality Coordenates GenBank
Acc. Nº
Artibeus fimbriatus *
Atlantic RF Gaspar 26º55'S 48º57'W DQ903835
Artibeus lituratus *
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903837
Artibeus ac. obscurus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903836
Chiroderma villosum *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903842
Platyrrhiynus lineatus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903841
*
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903840
Pygoderma bilobatum *
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903838
DQ903839
66
Sturnira lillium *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903846
*
DQ903848
*
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903845
Sturnira tildae *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903847
Vampiressa pusilla *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903844
*
Atlantic RF Gov. Celso Ramos 27º18'S 48º33'W DQ903843
Species Country Authors Coordenates GenBank
Acc. Nº
Ametrida centurio *
French Guiana Baker et al. (2000) 00º N, 53º 00'W AF316430
Artibeus (dermanura)
cinereus *
-
Baker et al. (2000)
-
AF316443
Enchisthene hartii * -
Baker et al. (2000)
-
AF316449
Glossophaga soricina *
Venezuela Baker et al. (2000) 08º00'N 66º00'W AF316452
Phylloderma stenops
Suriname Baker et al. (2000) 04º44'N 56º12'W AF316480
Phyllops falcatus *
- - AY604453
Rhinophylla pumilio *
French Guiana Baker et al. (2000) 00º N 53º 00'W AF316484
Sphaeronycteris toxophyllum
*
Peru Baker et al. (2000) 10º00'S 76º00'W AF316486
Stenoderma rufum *
Puerto Rico Baker et al. (2000) 18º19'N 65º49'W AF316487
Uroderma bilobatum *
El Salvador Baker et al. (2000) 13º50'N 88º55'W AF316491
Vampyrodes caraccioli *
Trinidad Baker et al. (2000) 11º00'N 61º00'W AF316494
*specimens utilized in the combined analysis; when the coordinates of the localities of collect of the GenBank
sequences were not located, the coordinates of the capital of the country were utilized; Atlantic RF = Atlantic
Rain Forest **Cerrado-Amazon transition.
67
Figure legends
Figure 1: A) Maximum likelihood tree for RAG2 gene. Likelihood settings from best-fit
model (K80+G) selected by hLRT Lset Base=equal Nst=2 TRatio=3.0953
Rates=gamma Shape=0.0845 Pinvar=0. Numbers above branches are the
bootstraps values. B) Results from Bayesian analysis of concatenated cyt b and
RAG2 genes. Likelihood settings from best-fit model (GTR+I+G) selected by hLRT.
Lset Base=(0.2860 0.2628 0.1885) Nst=6 Rmat=(1.6334 3.7942 0.9114 0.3789
14.5266) Rates=gamma Shape=0.2266 Pinvar=0.3133. Numbers above branches
are posterior probabilities values.
69
A
A
r
r
t
t
i
i
g
g
o
o
3
3
RELATIONSHIPS OF SOUTH AMERICAN PHYLLOSTOMIDS BATS STUDIED WITH
CYTOCHROME B AND RAG2 GENES
Artigo submetido à revista Zoological Journal of Linnean Society
CRISTINA CLAUMANN FREYGANG
1*
, SÉRGIO L. ALTHOFF
2
, ANA LETÍCIA
PEREIRA
3
and MARGARETE SUÑÉ MATTEVI
1,3
1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Caixa Postal 15053, CEP 91501-970, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil
2
Universidade Regional de Blumenau. Caixa Postal 1507, CEP 89010971, Blumenau, Santa Catarina,
Brazil
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, Av. Farroupilha, n
o
8001, CEP
92450-900, Canoas, Rio Grande do Sul, Brazil.
SHORT RUNNING TITLE: Relationships of South American phyllostomids bats
*Corresponding author: E-mail address: [email protected]
C
C
a
a
p
p
í
í
t
t
u
u
l
l
o
o
V
V
70
ABSTRACT
Phyllostomidae is the largest bat family of the Neotropical Region, including about
160 species of varied morphology derived from broad-spectrum food habits. This
feature hindered the reconstruction of the phylogenetic history of the group, and the
investigations carried out have raised conflicting hypotheses about the relationships
among members. Another obstacle lies in the fact that the researches made,
especially the molecular investigations, employed specimens collected almost
exclusively in Central America and North/northeastern South America. The present
study describes the analyses of the mitochondrial cytochrome b (cyt b) and the
nuclear recombination activator (RAG2) genes in 19 phyllostomid bat species
collected south of parallel 07°S in South America. The results obtained from these
taxa were analysed together with other 27 GenBank sequences from species outside
this region to verify if the inclusion of representatives from the southern of the
Neotropical Region alters the phylograms already described without these
representatives. The most information-rich result was obtained by the combined
analysis of the two genes which showed topologically similar trees that generated
nine main clusters (some of them including subgroups) with consistently high
bootstrap values. These clusters are in accordance with the main taxonomic
classification proposals reported in the literature.
ADDITIONAL KEYWORDS: Chiroptera, Phyllostomidae, phylogeny, mitochondrial
DNA, cytochrome - b; nuclear DNA; RAG2
71
INTRODUCTION
The Chiroptera order represents one of the oldest and most specialized groups
among placental mammals (Simmons, 2005a). The group is typically subdivided into
two subgroups, Microchiroptera (echolocating bats) and Megachiroptera (Old World
fruit bats, which do not echolocate). These subgroups have been considered
reciprocally monophyletic and are formally recognized as suborders by most
taxonomic classifications. Nevertheless, recent sequence analyses of both nuclear
and of mitochondrial genes indicate that Microchiroptera may not be monophyletic
(Simmons, 2005a), with this classification already not being adopted by Simmons
(2005b). Also, the evolutionary relationships between the families have remained,
until recently, only partially cleared (Faria & Morielle-Versute, 2006).
Among the existing Microchiroptera families, Phyllostomidae are the largest
endemic family inhabiting the Neotropical Region. The family includes round 160
species, the majority of which adapted to New World tropical and semi-tropical
lowlands, spreading from California and Arizona as well as from the coastal plains of
Texas, to northern Argentina (Eisenberg & Redford, 1999; Nowak, 1999; Simmons,
2005b).
The main feature used in the identification of this family’s bat species is the
occurrence of a nose spear, also known as noseleaf, a fleshy and somewhat
lanceolate nose protuberance. The protuberance may be quite long, stretching
beyond head size in some species, or even only barely perceptible in others
(Koopman, 1994).
Phyllostomidae exhibit a significant morphologic diversity, related to the broad-
spectrum food habits that include insects, fruit, pollen, nectar, leaves, arthropods,
small vertebrates, and the blood of endothermic animals (like birds and mammals).
This great variety of habits has become an issue to taxonomists, making it more
difficult to recover the phylogenetic history of the group. As a consequence, although
72
the phylogenetic relationships of the taxon have been studied for over a century, no
consensus has yet been reached (Wetterer, Rockman & Simmons, 2000).
Phyllostomidae may be divided into three or else into more than eight
subfamilies, paradoxically enough. The monophyly of some of these subfamilies, as
well as of a number of many genera — specially Micronycteris Gray, 1866; Mimon
Gray, 1847; Phyllostomus Lacépède, 1799; Artibeus Leach, 1821; and Vampyressa
Thomas, 1900 — has been questioned by many authors (Wetterer et al., 2000).
The datasets used to try to solve these taxonomic problems include the results
of studies with restriction enzymes, chromosomal morphology, parasite-host
associations, immunological-distances, rDNA restriction sites, as well as
mitochondrial and nuclear DNA sequences. Among the recent attempts towards
solving these issues in Phyllostomidae systematic are, more outstandingly, the
studies by Wetterer et al. (2000), which investigated a variety of literature data and
proposed a novel taxonomy for all current genera, and the research of Jones et al.
(2002) in which a supertree for the family’s taxa was generated by the method known
as MRP (Matrix Representation using Parsimony).
Baker et al. (2000) analysed the relationship between the Phyllostomidae
species carrying out a cladistc analysis with 66 taxa using the nuclear gene RAG2.
The authors concluded that the trees constructed based on one single gene are not
suitable to distinguish and define the taxonomic relationships between these
Phyllostomidae species. Therefore, they suggest that more genes are needed to
prove or disprove the contradictory hypotheses put forward. More recently, the same
group of researchers (Baker et al., 2003) analysed the phylogenetic relationships
between 48 genera using a 2.6-kb fragment from mitochondrial 12S rRNA, tRNA
VA1, 16S rRNA genes and an approximately 4.0-kb fragment from the nuclear gene
RAG2. Karyotypes, among other kinds of data, were compared also, and a novel
classification to the family was proposed based on a dataset the authors understood
as more consistent.
All these papers that have employed molecular methods — both in taxonomy
and in the investigation of the interspecies relationships in Phyllostomidae bats —
73
have almost always used samples that included specimens collected in Central
America, as well as in North and northeastern South America. In these researches
the vast majority of the specimens was collected in sites stretching to 02° latitude
south (Baker et al., 2000; Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Baker et al., 2003).
The present study describes the results of the analyses of the mitochondrial
cytochrome b (cyt b) and the nuclear recombination activator (RAG2) genes in 22
phyllostomid bat species collected south of parallel 07°S in South America. The
results obtained from these taxa were analysed together with other 27 GenBank
sequences from species out of this region aiming to verify if the inclusion of
representatives from the southern of the Neotropical Region alters or not the
phylograms already described in which these representatives are absent
MATERIALS AND METHODS
S
PECIES ANALYSED
The sample consists of 25 sequences of 19 species from 14 genera trapped in 8 sites
located in an area ranging from 7º to 28ºS and 47° to 49°W, in two morphoclimatic
domains of South America (Table 1). These species were grouped with other 27 taxa
plus Furipterus horrens, Noctilio leporinus and Pteronotus personatus (as outgroup)
obtained from GenBank. The choice of outgroups was based on Baker et al. (2003)
and Simmons (2005a).The skins and skulls of these specimens are stored in the
Mammals Collection of the Universidade Regional de Blumenau, Blumenau, Santa
Catarina and in the Mammals Collection of the Museu Nacional, Rio de Janeiro,
Brazil.
Table 1 here
74
N
UCLEOTIDE ACID SEQUENCE ANALYSIS
DNA was extracted from kidney, liver, heart or muscle (stored at–20
o
C or in
ethanol 70% purity) using the standard protocol described in Medrano, Aasen &
Sharrow (1990). The mitochondrial cytochrome b gene (hereafter cyt b) sequences
were isolated via polymerase chain reaction (PCR) using the primers MVZ05, MVZ23
(light-strand), MVZ16 (heavy-strand) suggested by Smith & Patton (1993) and
MUS15398 (heavy-strand) suggested by Anderson and Yates (2000). PCR reaction
were run in a total volume of 25µl containing: 10x PCR buffer, 2,6mM of MgCl
2
,
0,56µM of dNTP, 0,2µM of each primer, 1 unit of Taq polymerase, and 1-2ul of
template DNA. Reaction conditions were as follows: Initial denaturation (92
o
C –
5min); followed by 5 cycles in Touchdown (denaturation: 92
o
C - 1 min; annealing
temperature step-downs every cycle 1
o
C from 50
o
C to 46
o
C - 1 min; extension: 72
o
C -
1 min). The annealing temperature for the final 35 cycles was 46
o
C with denaturation
and extension phases as above. Final extension: 72
o
C – 10 min. Each round of PCR
reactions also included one negative control to check for contamination.
For the amplification of nuclear recombination activating gene (hereafter
RAG2), the primers RAG2F1 (light-strand), RAG2F2 (heavy-strand) suggested by
Baker et al. (2000) were used. PCR reactions were run in a total volume of 25µl
containing: 10x PCR buffer, 2,6mM of MgCl
2
, 1,12µM de dNTP, 0,32µM of each
primer, 1 unit of Taq polymerase, and 1-2ul of template DNA. Reaction conditions
were as follows: Initial denaturation (92
o
C – 5min); followed by 35 cycles
(denaturation: 92
o
C – 60s; annealing temperature 60
o
C – 45s; extension: 72
o
C –
90s). Final extension: 72
o
C – 10 min. Each round of PCR reactions also included one
negative control to check for contamination
PCR products were purified with exonuclease I and shrimp alkaline
phosphatase (Amersham Biosciences). All taxa were sequenced directly from purified
PCR products using the primers cited above and the ABI Prism BigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems), according
to the manufacturer’s instructions. Sequencing of both strands was carried out using
75
an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). All sequences are
available in GenBank as displayed in Table 1.
D
ATA ANALYSIS
The sequences obtained were read employing the Chromas 1.45 program,
aligned using the Clustal X 1.81 program (Thompson et al., 1997) under the default
setting costs and manually refined with the aid of the Genedoc (Nicholas & Nicholas,
1997). Saturation plots were obtained with Data Analysis in Molecular Biology and
Evolution software (DAMBE; Xia & Xie, 2001). The composition of bases was
accomplished by the use of Molecular Evolution Genetics Analysis software -MEGA3
(Kumar, Tamura and Nei, 2004).
The phylogenetic analyses were performed using the maximum parsimony
(MP) algorithm obtainable in PAUP*, version 4.0b10 (Swofford, 2001) by heuristic
search with tree bisection-reconnection (TBR) branch swapping, the MULPARS
option, and 100 random-addition replicates. Bootstrap statistical support (Felsenstein,
1985) was carried out with 1,000 replications of heuristic search and simple taxon
addition, with the all trees saved option.
The maximum-likelihood (ML) tree estimation was conducted with PHYML
(Guindon & Gascuel, 2003), under the appropriate model of nucleotide substitution,
determined using the MODELTEST 3.06 program (Posada and Crandall 1998).
Reliability of the trees was tested using 1,000 bootstrap replications.
The neighbor-joining analysis (NJ – Saiton & Nei, 1987) was conducted under
a ML model, with parameter settings estimated by MODELTEST, as described by
Xiang et al. (2002) with 1,000 bootstrap replications.
Bayesian analyses (BI) of the data were performed using MrBayes 3.0b4
(Huelsenbeck & Ronquist 2001) to generate a posterior probability distribution using
Markov chain Monte Carlo (MCMC) methods following Baker et al. (2003). We ran
three independent analyses. No a priori assumptions about the topology of the tree
were made and all searches were provided with a uniform prior. The models of DNA
76
substitution used were those estimated by MODELTEST and used in the standard ML
analyses. The MCMC processes were set so that four chains (one cold and three
incrementally heated Markov chains) were run simultaneously for 1 million
generations, with trees being sampled every 10 generations. Bayesian likelihoods
reached at 200,000 generations (burn-in=2000) for cyt b and RAG2 analysis and after
500,000 generations (burn-in=5000) for combined analysis. The values were
established by empirical evaluation of tree likelihood scores and following Baker et al.
(2003). To calculate the posterior probability of each bipartition, a 50% majority-rule
consensus tree was constructed from the remaining trees using PAUP*
We chose Bayesian analysis over Maximum likelihood because it is quick and
efficient for large data sets, provides reliable estimates (i.e., branch support) by
straightforward posterior probabilities, and utilizes a statistically robust procedure to
extract the maximum amount of information from the sequence data (Whelan et al.,
2001).
To detect the presence of character conflict between cyt b and RAG2 genes
incongruence length difference (ILD) test was computed as described by Farris et al.
(1994, 1995) and implemented in WINCLADA version 0.9.9+ (BETA) (Nixon, 2002). A
subset of the individuals for which sequences from both data sets were available was
combined into a single analysis.
RESULTS
C
YTOCHROME B
One 739-bp fragment was analysed for a total of 49 bats, with 21 specimens
belonging to 18 Brazilian species (13 genera) plus 25 Phyllostomidae sequences
obtained form GenBank, and 3 outgroups. The sequence analyses revealed a
significant guanine deficiency (P<0.01), specially in the third position. The values
found (not shown) were similar to those obtained by Pumo et al. (1998) in Artibeus
jamaicensis (Olfers, 1818) and by Ruedi & Mayer (2001) in Myotis Kaup 1829, and
77
are within the expected values for the composition of the mitochondrial DNA bases for
mammals in general (Irwin, Kocher & Wilson, 1991).
Taking into account only the sequences belonging to the ingroup, the
haplotypes were defined by 371 variable sites (88 of which corresponding to the first
codon position, 41 to the second, and 242 to the third), and 306 parsimony-
informative sites. In the maximum parsimony analyses, the heuristic search of cyt b
data resulted in 1 most parsimonious tree with 2,482 evolutionary steps, with a
consistency index (CI) of 0.246 and a retention index (RI) of 0.417.
The selected model for the maximum-likelihood analysis using MODELTEST
was GTRI+I+G (see Posada and Crandall,1998, for details of the models) and the
gamma shape parameters of 0.4763.
The topologies of all trees (MP, NJ, ML, and BI) were very similar. Therefore,
only selected examples of those obtained by Bayesian analysis will be presented
(Fig. 1A). As can be seen, the tree generated shows only one main clade (clustering
the Stenodermatinae subfamily members exclusively) and several polytomies. This
9configuration, therefore, strongly points to cytochrome b gene as unsuitable for
discrimination of the relationships and/or affinities between species of phyllostomid
bats. Some of these polytomies gather 2 or 3 genera that, in some cases, include
related species but in most do not reflect the taxonomic proposals formulated. This is
the case of Micronycteris, and Sturnira Gray, 1842 or Rhinophyla Peters, 1865 and
Macrotus Gray, 1843, for instance.
RAG2
For the RAG2 analyses, a 763-bp fragment was sequenced totaling 21
specimens belonging to 16 species and 11 genera. These sequences were
complemented with other 11 sequences deposited in GenBank and three outgroups.
RAG2 alleles show an overall even pattern of base composition. Considering only the
Fig. 1 here
78
ingroup, 216 variable sites were observed, with 39 corresponding to the first codon
position, 19 to the second, and 158 to the third position. The number of characters
that produced information for the parsimony analysis was 78. In the MP analysis, the
heuristic search of RAG2 data resulted in 140 most parsimonious trees with 339
steps, with a CI = 0.711 and an RI = 0.756.
The selected model for the maximum-likelihood analysis using the
MODELTEST was K80+G. The gamma shape parameters were estimated as 0.3311.
The topologies of all trees, independently of the types of analyses employed,
were very similar; therefore, only the selected examples of those obtained by
Bayesian analysis will be presented (Fig. 1B). RAG2 generated one tree with almost
no polytomy, with yet high posterior probabilities (17 of the 26 nodes being above
0.95) and the majority of species clusters in accordance with the more modern
taxonomic proposals for Phyllostomidae. The arrangement observed shows the
genus Macrotus at the basis of the tree, and Stenodermatinae as the most derived
group.
COMBINED ANALYSES
For both genes, the saturation curve obtained (not shown) indicated that here
is no clear evidence of multiple substitution (saturation) in any codon position, and
thus there should be no loss of phylogenetic signal among the more divergent taxa
(i.e., outgroup – ingroup) in this analysis.
The ILD test revealed that the amount of character conflict between both genes
is not significant (P = 0.1667), and therefore the combined alignment of cyt b and
RAG2 data resulted in 1,502 characters analysed from 14 species belonging to our
sample plus 8 from GenBank, and 3 outgroups.
With the combined dataset, 1 most parsimonious tree of 1805 steps and 363
parsimony-informative characters were found (CI = 0.416 and RI = 0.501). The model
selected was GTR+I+G, with a gamma shape parameter of 0.4763.
79
The topologies of all trees (MP, NJ, BI), independently of the types of analysis
employed, were very similar; therefore, only selected examples among those
obtained by Bayesian will be presented (Fig. 2A).
In the combined analysis, the posterior probabilities values for the majority of
the tree branches were consistently high, with 17 of the 24 branches generated
presenting posterior probabilities higher than 0.95, and with 15 of the branches
exhibiting a probability of 1.00 in the Bayesian analysis. By comparing the combined
analysis to the independent analysis for each gene, only 9 clusters observed in the
cyt b isolated analysis (Fig. 1A) found correspondence in the two-gene combined
analysis (Fig. 2A). As regards the RAG2 analysis, 11 of the 24 nodes observed in the
isolated analysis (Fig. 1B) are present in the combined analysis (Fig. 2A). This
number rises to 13 in the tree obtained by Baker et al. (2003). These data indicate
that there is a greater consistency between gene RAG 2 and the combined analysis
of the two genes, as opposed to isolated cyt b gene analysis.
In turn, the comparison between the combined analyses of our data and of
those by Baker et al. (2003) shows a good consistency of results, with the nodes,
here called A-N (Fig. 2A) corresponding, respectively, to nodes 1, 3, 5, 6, 9, 10, 11,
14, 16, 22, 24, 25 and 42 in Baker et al. (2003).
DISCUSSION
The present study analysed the mitochondrial cyt b and RAG2 genes in the
Phyllostomidae taxa collected in Brazil, together with the specimens retrieved from
GenBank. As regards the studies carried out with cyt b gene, all the analyses
conducted (MP, ML, NJ, and BI) were able to cluster only the members of the
Stenodermatinae family and some closer taxa, with the remaining taxa appearing as
polytomies.
Fig. 2 here
80
This suggests that the evolution of the cyt b gene in Phyllostomidae could be
more appropriate to clarify the relationships on the genus level, but is more limited in
terms of resolution when higher taxonomic levels are studied.
In turn, the trees generated by isolated analyses of the RAG2 gene or RAG2 +
cyt b combined analysis were much more informative, giving taxonomic arrangements
which tally better with the literature proposals and/or with the biogeography of the
species. Although in this study, in the combined analyses the mitochondrial cyt b
gene was employed instead of the 12sRNA, tRNA and 16sRNA as used by Baker et
al. (2003), the trees generated in the two searches were essentially similar. This may
be explained by the fact that all mitochondrial genes are connected and, thus, present
inform the same phylogenetic history.
By observing the tree resulting from the combined analysis (Fig. 2A), the genus
Macrotus (node A) is found on its base. This genus has only two species recognized,
distributed in North and Central America. Both species are of average size and
morphologically similar to the members of the Micronycteris genus. This basal
position is found also in the Baker et al. (2003) analysis, which proposes this genus to
constitute a sub-family – Macrotinae. Simmons (2005b), on the other hand, placed
Macrotus as belonging to Phyllostominae, in spite of the fact that the genus’ inclusion
in Macrotinae is more logical, as this is the taxonomic position it was given in the two
molecular investigations carried out (the present study and that of Baker et al., 2003),
as well as in the cytogenetic study by Patton and Baker (1978), which considered the
karyotype as being the most basal among Phyllostomidae. Additionally, according to
the proposal by Simmons (2005b), which includes Macrotus in Phyllostominae, there
would have been one cluster which joining two subfamilies (Phyllostominae +
Desmondontinae).
Next, there is a clade formed by Diphylla Spix, 1823 and Desmodus Wied-
Neuwied, 1826. This clade is recognized, as Desmondontinae by Baker et al. (2003),
and considered by Wetterer et al. (2000) and Simmons et al. (2005b) as the most
basal branch of the Phyllostomidae family. Nevertheless, Wetterer et al. (2000)
suggested that the basal branching pattern of the family may change in future
81
analyses, as additional characters are added to the data matrix. Thus, they believe it
would not be prudent to give a name to this group until basal relationships among
phyllostomids are better supported. These two species (Diphylla and Desmodus) are
widely distributed, specialized in feeding on blood of warm-blooded vertebrates
(mammals to Desmodus and birds to Diphylla) with total body size varying between
65 and 90 mm, incisive and canine teeth specialized in slashing, which are employed
to bite the prey, and presenting no tail and a small noseleaf (Eisenberg & Redford,
1999). This arrangement (Desmondontinae = Desmodus + Diphylla) was one of the
few to be present both in the combined and individual gene analyses.
The next clade (node N) joins two species - Tonatia silvicola (d’Orbigny, 1836)
and Trachops cirrhosus (Spix, 1823), ranked as Phyllostominae both by Baker et al.
(2003) and Simmons (2005b). These authors include Mimon crenulatum (E. Geoffroy,
1810) and Phylloderma stenops Peters 1865 in this subfamily. We did not carry out
the combined cyt b and RAG2 analysis for these two species: only the RAG2 gene
analysis was conducted. Considering the tree obtained, it is observed that these two
species may be added to this sub-family. These 4 species, which resort to insects as
the staple article in their diets, are formed by medium-sized animals which preferably
inhabit multistratal tropical evergreen forests, and may generally be found at over
altitudes 400 m (Eisenberg & Redford, 1999).
The next node (D) separates the species Glossophaga soricina Pallas, 1766
from the other taxa. This arrangement was also observed in the molecular analysis by
Baker et al. (2003), which resulted in the clustering, also, of the following genera
forming the sub-family Glossophaginae: Anoura Gray, 1838; Hylonycteris Thomas,
1903; Choeroniscus Thomas, 1928; Choeronycteris Tschudi, 1844; Musonycteris
Schaldach & McLaughlin, 1960; Erophylla Miller, 1908; Brachyphylla Gray, 1834;
Monophyllus Leach, 1821; Leptonycteris Lydekker, 1891; and Glossophaga E.
Geoffroy, 1818. The RAG2 data obtained in the present study revealed that the
species Anoura geoffroyi Gray, 1838 also clusters under this clade. Glossophaga and
Anoura are two genera that have already been included in the subfamily
Glossophaginae in previous classifications, as that by Eisenberg & Redford (1999).
82
Both are genera of relatively small bats, of very similar morphology with small or
virtually absent interfemoral membrane and primitive tail. These bats may feed on
fruit, nectar, pollen and insects, and live preferably in humid zones.
Rhinophyla pumilio Peters, 1865 branches out in the following node (E). This
species belongs to a frugivorous genus, which prefers multistratal tropical evergreen
forests. Traditionally, the genus is ranked under the sub-family Carollinae (Eisenberg
& Redford, 1999; Simmons, 2005b), being very similar in morphology to Carollia
Gray, 1838, yet distinguished from the genus mentioned by the absence of a tail.
Thus, according to Baker et al. (2003), the genus comprises one single sub-family,
Rhinophyllinae. As in the present study the genus Carollia was not analysed for
combined cyt b and RAG2, it is not possible to ascertain whether the two genera
would have clustered under the same sub-family, in our sample. Both genera were
studied only for cyt b, but the results obtained were inconclusive.
Node F includes Stenodermatinae. This subfamily is ranked by Baker et al.
(2003) under three tribes: Sturnirini, Sternodermatini, and Mesostenodermatini (which
includes subdivisions), while Simmons (2005b) considers only two tribes, joining
Stenodermatini and Mesosternodermatini in the Sternodermatini tribe. In our data, we
observed three branches, markedly due to the presence of node F, which separates
Sturnirini tribe from the other two, and of node G, which separates Sternodermatini
from Mesostenodermatini. The clade formed by node H includes two sister-groups,
one of them containing only the Artibeus Leach, 1821 species and the other
clustering the taxa having round eyes of the genera Phyllops Peters, 1865,
Stenoderma E.Geoffroy & St. Hilaire, 1818; Sphaeronycteris Peters, 1882; Ametrida
Gray, 1847; and Pygoderma Peters, 1863. The genes we analysed showed the same
arrangement proposed by Baker et al. (2003), although with species from other
places in the Neotropical Region.
As regards the intra-tribe clusters, tribe Sturnirini (separated by node F),
formed by only one genus, branching out to many frugivorous bat species that may
also resort to pollen and nectar to feed. These species spread from Mexico to
northern Argentina and Uruguay (Eisenberg & Redford, 1999). In the past, this genus
83
has often been re-ranked (Koopman, 1993; McKenna and Bell, 1997; Jones et al.,
2002), but the recent molecular data have clearly indicated the tribal status.
The tribe Stenodermatini (node J), in turn, includes several specimens as
Chiroderma Peters, 1860, Vampiressa Thomas, 1900, Uroderma Peters, 1866 and
Platyrrhinus Saussure, 1860, which exhibit the presence of one white line down the
center of the back as the main morphologic characteristic in common.
In Mesostenodermatini (node H), apart from the “round-eyed” group, one other
cluster occurred, formed by Phyllops that, independently of the gene investigated,
behaved as a sister-taxon to Stenoderma (100% posterior probability). In the present
study, Phyllops is for the first time analysed simultaneously for cyt b and RAG2, but
the cluster that this species formed with Stenoderma had already been suggested via
morphologic comparisons by Novak (1999), who propose that Ardops Miller, 1906
and Ariteus Gray, 1838 are species closely related also to Phyllops and Stenoderma.
This group would have a white spot on both shoulders as the common characteristic.
These last two species (Ardops and Ariteus) were included in Mesostenodermatini by
Baker et al. (2003). When our dataset is analysed, Phyllops is also included in this
tribe, and Baker et al. (2003) enclose this assemblage of genera under the name of
Stenodermatina. The sister-group to Stenodermatina subtribe is formed by the
species of the Artibeus genus, an heterogeneous group of taxa formed by bats that
which feed on fruit and spread from Mexico to northern Argentina.
In recent years, the classic taxonomy of Phyllostomidae has been revised by
Wetterer et al. (2000), who took into account morphologic, chromosomal and
restriction enzyme data to re-classify Phyllostomidae. Baker et al. (2003), in turn,
constructed trees based on mitochondrial and nuclear genes, whereas Simmons
(2005b) summarized all these findings in the classification proposed by her. These
three taxonomic revisions, though having many proposals in common, present also
significant differences.
These differences in the taxonomy of Phyllostomidae are visible, in like
manner, in the analyses of the phylogenetic relationships between its taxa. The
molecular data analysed in this study and in other studies published have, however,
84
apparently been able to underline this kind of relationship. It seems that, even when
the target species are from very geographically distant locations, similar phylograms
are often generated when the investigation focuses on the appropriate genes. More
specifically in this study, in which the aim was to investigate Phyllostomidae
representatives collected south of the Equator (such species as had not been
targeted by phylogenetic studies in the literature), no significantly different results
were observed. The phylogenetic trees generated with Central American and North of
South American representatives, and those trees constructed with data from
specimens collected in the southern Neotropical region showed very similar phylletic
groups. It is possible that, in the case of bats, this similarity is the result of a genetic
“homogenization” — a consequence of the migration possibilities afforded by flight.
This genetic cohesion may also be imputed to the recent origin of bat species.
Nevertheless, these are hypotheses that invite more study to be validated.
ACKNOWLEDGEMENTS
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), and the Organization of the American
States (OAS) have supported this study. The authors are grateful to Drs. Denis Sana,
Fernanda Trierveiler, Luiz Flamarion B. Oliveira, and Thales R.O. de Freitas for field
work, to Gabriela Camargo, Luciano S. Silva, and Valéria C. Muschner for help in
the Lab analysis and to Dr. Loreta B. de Freitas by several facilities provided.
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89
Table 1. Species, morphoclimatic domains of the collect sites, localities, and GenBank
accession numbers of specimens analysed.
Species Biome/Country Locality Coordinates Genbank
Acc. Nº
Artibeus fimbriatus *
Atlantic RF Gaspar 26º55'S 48º57'W DQ903820
Artibeus lituratus *
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903819
Artibeus ac. obscurus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903818
Chiroderma villosum *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903823
Desmodus rotundus *
Atlantic RF Itaiópolis 26º20'S 49º54'W DQ903817
Diphylla ecaudata *
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903813
Glossophaga soricina *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903831
Micronycteris megalotis
Atlantic RF Gov. Celso Ramos 27º18'S 48º33'W DQ903812
Mimon benneti
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903832
Platyrrhiynus lineatus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903827
*
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903826
Pygoderma bilobatum *
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903821
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903822
Sturnira lillium *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903814
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903815
Sturnira tildae *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903816
Tonatia bidens
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903829
Tonatia.silvicola *
Cerrado-Amazon
**
Palmeirante 07º51'S 47º55'W DQ903830
Trachops cirrosus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903828
Vampiressa pusilla *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903825
*
Atlantic RF Gov. Celso Ramos 27º18'S 48º33'W DQ903824
Country Authors Coordinates GenBank
Acc. Nº
Ardops Nicholls
Antilhas Carstens,BC. et al. (2004) 12º15'N 68º45'W AY572337
Ametrida centurio *
- Davalos LM. unpubl. data - AY604446
Ariteus flavescens
- Davalos LM. unpubl. data - AY604436
Brachyphylla pumila
- Davalos LM. unpubl. data - AY620450
Carollia perspicillata
- Baker RJ & Hoffman BC.
unpubl. data
- AF511984
Centurio senex
- Davalos LM. unpubl. data - AY604444
Chiroderma doriae
Brazil Hoffmann et al. (2003) 23º32'S 46º37'W AY169958
Ectophylla Alba
Panama Hoofer and Baker (2006) 9º00'N 80º00'W DQ312401
Erophylla bombifrons
- Davalos LM, unpubl. data - AY620438
Lionycteris spurrelli
- Davalos (2004) - AF423100
Lonchophylla mordax
- Davalos (2004) - AF423095
Macrotus waterhousii *
-Porter et al., unpubl. data
***
- AY380745
Mesophylla macconnelli
Ecuador Hoofer and Baker (2006) 2º00'S 77º30'W DQ312422
Monophyllus redmani
- Hoffmann and Baker
(2001)
- AF382888
Phyllonycteris aphylla
- Wright et al. (1999) - AF187033
Phyllops falcatus *
- Davalos, unpubl. data - AY604450
Platalina genovensium
Peru Davalos (2004) 10º00'S 76º00'W AF423101
Platyrrhinus helleri
Bolívia Hoofer and Baker (2006) 14°37'S 60°45'W DQ312408
Rhinophylla pumilio *
French Guiana Hoofer and Baker (2006) 00ºN 53º00'W DQ312397
Sphaeronycteris toxophyllum *
- Davalos LM. unpubl. data - AY604452
Stenoderma rufum *
Puerto Rico Hoofer and Baker (2006) 18º15'N 66º30'W DQ312400
Trachops cirrhosus
Ecuador Fonseca et al, in press 2º00'S 77º30'W DQ233669
Uroderma. bilobatum *
Panama Hoffmann et al. (2003) 9º00'N 80º00'W AY169955
Vampyrodes caraccioli *
- Hoofer and Baker (2006) - DQ312407
Furipterus horrens *
- Davalos, 2005 - AY621004
90
Noctilio leporinus *
Mexico Lewis-Oritt et al (2001a) 19º25'N 99º10'W AF330801
Pteronotus personatus *
Mexico Lewis-Oritt et al (2001b) 19º25'N 99º10'W AF338680
Species Biome/Country Locality Coordinates GenBank
Acc. Nº
Artibeus fimbriatus *
Atlantic RF Gaspar 26º55'S 48º57'W DQ903835
Artibeus lituratus *
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903837
Artibeus ac. obscurus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903836
Chiroderma villosum *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903842
Chrotopterus auritus
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903851
Desmodus rotundus *
Atlantic RF Itaiópolis 26º20'S 49º54'W DQ903833
Diphylla ecaudata *
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903834
Mimon crenulatum
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903850
Platyrrhiynus lineatus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903841
*
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903840
Pygoderma bilobatum *
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903838
Atlantic RF Blumenau 26º55'S 49º03'W DQ903839
Sturnira lillium *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903846
*
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903848
*
Atlantic RF Porto Belo 27º09'S 48º33'W DQ903845
Sturnira tildae *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903847
Tonatia.silvicola *
Cerrado-Amazon ** Palmeirante 07º51'S 47º55' W DQ903849
Trachops cirrosus *
Cerrado Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W DQ903852
Vampiressa pusilla *
Atlantic RF Sto. Amaro da Imperatriz 27º41'S 48º46'W DQ903844
*
Atlantic RF Gov. Celso Ramos 27º18'S 48º33'W DQ903843
Species Country Authors Coordinates GenBank
Acc. Nº
Ametrida centurio *
French Guiana Baker et al. (2000) 00º N, 53º 00'W AF316430
Anoura geoffroyi
El Salvador Baker et al. (2000) 13º50'N 88º55'W AF316431
Glossophaga soricina *
Venezuela Baker et al. (2000) 8º00'N 66º00'W AF316452
Macrotus waterhousii *
Cuba Baker et al. (2000) 21º30'N 80º 00'W AF316461
Phylloderma stenops
Suriname Baker et al. (2000) 04º 44'N 56º12'W AF316480
Phyllops falcatus *
- - AY604453
Rhinophylla pumilio *
French Guiana Baker et al. (2000) 00º N 53º 00'W AF316484
Sphaeronycteris toxophyllum *
Peru Baker et al. (2000) 10º00'S 76º00'W AF316486
Stenoderma rufum *
Puerto Rico Baker et al. (2000) 18º 19'N 65º49'W AF316487
Uroderma bilobatum *
El Salvador Baker et al. (2000) 13º50'N 88º55'W AF316491
Vampyrodes caraccioli *
Trinidad Baker et al. (2000) 11º00'N 61º00'W AF316494
Furipterus horrens *
- Hoofer et al (2003) - AY141016
Noctilio leporinus *
Mexico Lewis-Oritt et al (2001a) 19º25'N 99º10'W AF330814
Pteronotus personatus *
Mexico Lewis-Oritt et al (2001b) 19º25'N 99º10'W AF338699
*specimens utilized in the combined analysis; when the coordinates of the localities of
collect of the GenBank sequences were not located, the coordinates of the capital of the
country were utilized; Atlantic RF = Atlantic Rain Forest **Cerrado-Amazon transition.
***Porter CA, Hoofer SR, Cline CA, Hoffmann FG, Baker RJ. Unpublished
91
FIGURE LEGENDS
Figure 1: A) Bayesian analysis tree for cytochrome b gene. Likelihood settings from
best-fit model (GTR+I+G) selected by hLRT: Lset Base=(0.3837 0.3647 0.0620)
Nst=6 Rmat=(0.2724 5.4353 0.5994 0.3884 10.7232) Rates=gamma Shape=0.4763
Pinvar=0.4352. Numbers above branches are posterior probabilities values. B)
Bayesian analysis tree for RAG2 gene. Likelihood settings from best-fit model
(K80+G) selected by hLRT (Lset Base=equal Nst=2 TRatio=3.0666 Rates=gamma
Shape=0.3396 Pinvar=0). Numbers above branches are posterior probabilities
values.
Figure 2: A) Results from Bayesian analysis of concatenated cyt b and RAG2 genes.
Likelihood settings from best-fit model (GTR+I+G) selected by hLRT. Lset
Base=(0.2980 0.2885 0.1806) Nst=6 Rmat=(2.2294 3.8488 1.0797 0.4228 14.8018)
Rates=gamma Shape=0.4488 Pinvar=0.4149. Numbers above branches are
posterior probabilities values. B) Figure adapted from Fig. 5A and 5B from Baker et
al. (2003).
94
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
A família Phyllostomidae, cujo primeiro gênero reconhecido foi Phyllostomus
por LACÉPÈLE (1799) é a mais diversificada dos morcegos neotropicais, com mais
de 160 espécies, apresentando, como uma característica marcante a presença de
um apêndice nasal, conhecido também como “folha nasal” (NOWAK, 1999). Este
clado também é extremamente diverso em termos de adaptações morfológicas
correlacionadas aos hábitos alimentares
Além de várias questões taxonômicas para Phyllostomidae, as relações
evolutivas dentro da família têm sido extensivamente discutidas na literatura, sendo
que um breve resumo dos mesmos será descrito a seguir.
Os primeiros trabalhos que visavam tentar esclarecer estas relações foram
baseados em caracteres morfológicos, destacando-se o trabalho de MILLER (1907),
um dos primeiros estudos sobre as relações entre subfamílias. Este autor incluiu, por
exemplo, Mormoopidae (então Chilonycterinae) dentro de Phyllostomidae e
considerou Desmodontidae como uma família à parte. A seguir, DE LA TORRE
(1961), baseado em caracteres cranianos e morfológicos, descreve extensivamente
as relações dentro dos Phyllostomidae, sugerindo que Phyllostominae representaria
o ramo mais basal da família. Já SLAUGHTER (1970) propõe, baseado na evolução
dos caracteres dentais, entre outras relações, que Brachyphylla e Sturnira são os
gêneros que apresentam as características mais primitivas. Também reconhece duas
linhagens dentais entre os Desmodontinae: Diphylla (a mais basal) e Desmodus (a
mais derivada). SMITH (1976) analisa dados já publicados de caracteres dentais,
imunológicos, cariológicos, pós-cranianos e parasitológicos em uma tentativa de
C
C
a
a
p
p
í
í
t
t
u
u
l
l
o
o
V
V
I
I
95
montar um cladograma para Phyllostomidae, no qual as subfamílias Phyllostominae
e Glossophaginae não se apresentaram monofiléticas.
MACDANIEL (1976) trabalhando com anatomia cerebral, reconhece
Phyllostomatinae como a subfamília mais basal.
OWEN (1987, 1991), utilizando caracteres discretos e contínuos de medidas
craniodentais e caracteres externos, apresentou uma chamada “melhor hipótese
filogenética” para os stenodermatíneos enfatizando o gênero Artibeus, que considera
como não monofilético e sugerindo que os pequenos Artibeus fossem agrupados em
um gênero próprio – Dermanura. Além disso, propõe que Enchisthenes seja
considerado um gênero próprio e que Dermanura concolor seja colocado em um
novo gênero - Koopmania. Em uma re-análise dos dados de OWEN (1991), LIM
(1993) obtém uma árvore muito diferente das do trabalho original, sugerindo que
estes resultados devem ser vistos com muito cuidado.
Já há bastante tempo outras ferramentas foram empregadas para o
esclarecimento das relações filogenéticas dentro da família. GERBER e LEONE
(1971), utilizando comparações imunológicas, obtiveram, assim, entre outras
conclusões, que os Desmodontinae representavam uma subfamília de filostomídeos
e Sturnira pertenceria à Stenodermatinae. Já STRANEY et al. (1979) usam dados de
alozimas para produzir o que chamam de “estimativa filogenética” das relações entre
vários gêneros (Ametrida, Anoura, Artibeus (Dermanura) cinereus, Artibeus
jamaicensis, A. lituratus, Carollia, Chiroderma, Desmodus, Glossophaga,
Phyllostomus, Sturnira, Uroderma e Vampirops [=Platyrrinus]). HONEYCUTT e
SARICH (1987) utilizando dados imunológicos da albumina encontraram que
Macrotus é o Phyllostominae mais divergente e, associado com os Desmodontinae,
forma a linhagem mais basal dos Phyllostomidae.
A partir da década de 1960, o avanço metodológico por meio de preparações
de medula e cultura de células e o desenvolvimento de técnicas de bandamento nos
anos 70 permitiram a marcação diferencial de regiões cromossômicas. Com a
descoberta que as diferenças encontradas quanto à quantidade e distribuição dos
rearranjos cromossômicos entre diferentes táxons, bem como os diferentes padrões
96
encontrados em determinados grupos podem ser traçados e utilizados para auxiliar a
interpretação dos relacionamentos entre espécies (QUIMISIYEH & BAKER, 1988), a
ferramenta empregada passa a ser a análise cromossômica.
Assim, em 1973 BAKER et al. utilizam a morfologia cromossômica para
resolver as relações entre os Stenodermatinae, propondo que o cariótipo primitivo
para estes morcegos seria similar ao de Artibeus, Sturnira, Vampyrodes e
Vampyrops (=Platyrrinus). GARDNER (1977a) apresenta uma árvore “arbitrariamente
derivada” para os filostomídeos baseada em similaridades cromossômicas e
hipotetiza que Desmodontinae, Phyllostominae, Carolinae e Stenoderminae são taxa
monofiléticos. Além destes, surgem os trabalhos de SMITH (1976) e o estudo de
PATTON e BAKER (1978) que, utilizando bandeamento G, propõem que o cariótipo
de Macrotus waterhousii seria o primitivo dos Phyllostomidae.
Já BAKER et al. (1989), incorporando aos dados cromossômicos, dados
prévios de imunologia e morfológicos, excluíram os mormopídeos de Phyllostomidae,
incluíram Desmodontinae e propuseram, também, o reconhecimento das subfamílias
Vampyrinae e Phyllostominae. Neste mesmo trabalho, os gêneros Macrotus e
Micronycteris (sensu lato) foram excluídos de Phyllostominae e transpostos para
incertae sedis.
Atualmente, técnicas moleculares como hibridização in situ, destacando-se a
técnica de hibridização fluorescente in situ transformaram-se em ferramenta
importante para a análise não apenas estrutural e funcional, mas também
evolucionária dos cromossomos (MANDRIOLI et al, 1999). Surgem então trabalhos
como o de PIECZARKA et al. (2005) que produziram sondas específicas para duas
espécies brasileiras Phyllostomus hastatus e Carollia brevicauda, utilizando então
pinturas cromossômicas recíprocas, concluindo que esta técnica é muito útil para
estudar relações filogenéticas entre Phyllostomidae e FARIA & MORIELLE-
VERSUTE (2006) utilizando bandas G e ZOO-FISH estudaram sete espécies de
Chiroptera pertencentes às famílias Phyllostomidae e Mollossidae concluindo que
as homologias e rearranjos cromossômicos observados reforçam a hipótese da
monofilia do grupo. Os mesmos autores concluem também que a técnica de ZOO-
97
FISH falha em detectar diferenças intracromossômicas entre as espécies estudadas,
mas confirma a conservação do DNA durante a evolução cromossômica.
O surgimento, a partir da década de 70 do século XX, de metodologias
capazes de decifrar as seqüências de DNA, como eletroforese, reações de
hibridação e seqüenciamento, aliado à implantação da técnica da PCR (reação em
cadeia da polimerase) disponibilizou um potente arsenal tecnológico para poder
utilizar as variações das seqüências de DNA do núcleo ou de organelas como
marcadores informativos para os mais diversos estudos (MATTEVI, 2003),
permitindo assim que na década de 90 surgissem as primeiras análises empregando
ferramentas moleculares.
VAN DEN BUSSCHE (1991) analisou dados de sítios de restrição do DNA
ribossômico, mas encontrou poucos caracteres informativos e a grande quantidade
de homoplasia observada impediu de construir uma hipótese de relações baseada
nestes dados, acabando por incluir em sua análise dados de filogenias anteriores.
Já WETTERER et al. (2000), utilizarou dados morfológicos, cromossômicos e
de sítios de restrição, totalizando 150 caracteres para montar sua árvore de
“evidência total”. Seus resultados indicaram que todas as subfamílias
tradicionalmente reconhecidas são monofiléticas e que a maioria dos taxa que
compartilham hábitos alimentares agrupam-se em clados. Este trabalho propõe,
ainda, entre outras conclusões, que se redefina Glossophaginae, a inclusão de
Glossophagini e Lonchophyllini nesta subfamília, divida-se os Phyllostominae em
tribos (Lonchorrhinini, Micronycterini, Phyllostomini e Vampyrini) e reconheça-se
formalmente, dentro dos Stenodermatinae, a tribo Stenodermatini, já proposta
anteriormente por vários autores. A novidade da subdivisão desta última em duas
subtribos, Stenodermatina (“short-faced”) e Ectophyllina (“long-faced”). Além disso,
propõe que a afirmação de que Macrotus apresenta o cariótipo primitivo para os
Phyllostomidae deva ser revisada.
BAKER et al. (2000) utilizam dados de seqüências do gene nuclear RAG2
para discutir a filogenia do grupo, encontrando algumas pequenas discrepâncias
entre seus resultados e os da literatura. Concluiram que, apesar de RAG2 ser um
98
bom marcador para o estudo de relações filogenéticas dos Phyllostomidae por sua
função na resposta imunológica não se encontrar ligada às feições morfológicas
relacionadas aos hábitos alimentares, podendo mascarar algumas destas relações, a
utilização de apenas um gene para propor mudanças taxonômicas pode ser
inapropriada.
BAKER et al. (2003), por sua vez, em uma análise concatenada dos genes
mitocondrial citocromo b e RAG2 e por meio de inferência Bayesiana, propuseram
inúmeras novas categorias (muitas não nomeadas) e subcategorias (p. ex. subtribos)
para refletir as relações filogenéticas encontradas por eles, dividindo, por exemplo, a
família em 11 subfamílias (Macrotinae, Micronycterinae, Desmodontinae,
Lonchorhininae, Carollinae, Glyphonycterinae, Rhynophyllinae e Stenodermatinae.
Esta classificação, no entanto, é considerada por GREGORIN e TAVARES (in press)
precipitada e não necessariamente reflete resultados filogenéticos.
Existem, ainda, trabalhos específicos para determinadas subfamílias e tribos,
dentre eles os recentes trabalhos de PORTER & BAKER (2004) que analisa as
relações entre as espécies de Vampyressa com outros gêneros relacionados
utilizando o gene citocromo b; DAVALOS & JANSA (2004) que utilizam 150
caracteres gerados a partir de marcadores morfológicos, cromossômicos e
moleculares analisando as relações dentro da tribo Lonchophyllinae; e o de
HOOFER e BAKER (2006) que investigam as relações entre os membros da tribo
Vampyressina (Stenodermatinae), utilizando para isso seqüências dos genes
citocromo b e ND3-ND4.
Especificamente com o gênero Artibeus, gênero este investigado nesta tese,
MARQUES-AGUIAR (1994) realizou uma extensa revisão sistemática com
inferências filogenéticas em espécies de grandes Artibeus e VAN DEN BUSSCHE et
al. (1998) examinou seqüências completas do gene do citocromo b em 26 espécies
de Artibeus e, entre outras conclusões, concorda com o reconhecimento de
Enchisthenes como gênero distinto.
Apesar do enorme volume de trabalhos gerados utilizando os mais diversos
marcadores, estes estudos não têm alcançado um consenso quanto às relações de
99
parentesco em vários níveis (desde o subfamiliar ao genérico) com conseqüente
variação nos arranjos classificatórios e a monofilia de algumas dessas subfamílias,
bem como a monofilia de muitos gêneros, especialmente Micronycteris, Mimon,
Phyllostomus, Artibeus e Vampyressa (WETTERER et al., 2000). O único consenso
parece ser com relação ao monofiletismo da família em si, consensualmente
evidenciado por vários estudos. Além disso, estes trabalhos concentram suas
amostras em regiões da América Central e Norte da América do Sul, ficando as
demais regiões da distribuição de muitas espécies, sub-amostradas.
Este trabalho visou melhorar a representatividade destes estudos, incluindo
morcegos brasileiros até então praticamente ausentes nestas análises moleculares,
enfocando as relações entre espécies de morcegos pertencentes à família
Phyllostomidae (Anexo 1), utilizando seqüências dos genes mitocondrial citocromo b
e nuclear RAG2. O foco desta tese foi testar se a inclusão destas espécies de
morcegos, coletadas ao sul do paralelo 07°S na região Neotropical, alteram ou não
as relações descritas para esta família, para a subfamília Stenodermatinae e,
especificamente para o gênero Artibeus, quando comparadas aos estudos que
analisam apenas representantes da América Central ou porção Norte da América do
Sul. Além disso, visou também estudar a variação genética e possível estruturação
geográfica de algumas espécies estudadas.
Inicialmente estudamos 25 seqüências de 19 espécies pertencentes a 14
gêneros de filostomídeos, obtidos em 8 pontos de coleta distintos e analisadas junto
com 27 seqüências da literatura, além de 2 outgroups (Capítulo V). No geral, os
resultados obtidos com a análise combinada dos dois genes seqüenciados
apresentou a melhor resolução filogenética, discutindo-se agora, então, apenas
estes resultados.
Na base da árvore situou-se o gênero Macrotus. Esta posição basal já foi
descrita por inúmeros autores com os mais diversos marcadores (veja revisão em
WETTERER et al., 2000).
A seguir encontra-se o clado formado por Diphylla e Desmodus. Este clado é
reconhecido como Desmodontinae por BAKER et al. (2003) e considerado por
100
WETTERER et al. (2000) e SIMMONS et al. (2005b) como o ramo mais basal da
família Phyllostomidae.
O próximo clado une duas espécies - Tonatia silvIcola e Trachops cirrhosus, e,
logo a seguir, no próximo nodo coloca-se a espécie Glossophaga soricina, que, na
análise realizada apenas com o gene RAG2 agrupou-se ainda com Anoura geoffroyi.
No próximo ramo situou-se Rhinophyla pumilio e, na seqüência, um clado
formado pelos representantes da subfamília Stenodermatinae.
As relações dentro da subfamília Stenodermatinae foram descritas mais
detalhadamente no capítulo V desta tese. Neste artigo testamos as diferentes
hipóteses de agrupamento dentro dos Stenodermatinae pela análise das relações
entre 10 espécies e 7 gêneros, tendo por base 28 seqüências, 13 de citocromo b e
14 de RAG2 oriundos de seis pontos de coleta distintos, representando os biomas
brasileiros Mata Atlântica e Cerrado, regiões sub-amostradas em outras análises
filogenéticas.
Nesta análise, pode-se observar a existência de três clados. O primeiro, mais
basal, agrupa apenas espécies do gênero Sturnira (S. lillium e S. tildae).
O segundo clado inclui os gêneros Chiroderma, Vampyressa, Uroderma,
Vampyrodes e Platyrrhinus.
O último clado apresenta um ramo representado por Enchisthenes hartii e,
então, se divide em dois grupos-irmãos, o primeiro incluindo os gêneros Ametrida,
Pygoderma, Sphaeronycteris, Stenoderma e Phyllops. Neste grupo há ainda uma
subdivisão, separando os gêneros Phyllops e Stenoderma dos demais gêneros.
O grupo irmão é formado por dois subgêneros (Artibeus e Dermanura),
pertencentes ao gênero Artibeus Leach, 1821, um grupo heterogêneo de espécies,
melhor discutido no capítulo III, onde analisamos o gene mitocondrial citocromo b e o
nuclear RAG2 de 39 espécimes pertencentes a 5 espécies de Artibeus: A. fimbriatus,
A. lituratus, A. planirostris, A. obscurus e Artibeus sp, obtidos em 14 pontos de coleta
do território brasileiro de dois biomas diferentes (Cerrado e Mata Atlântica) além de
18 representantes de 6 espécies de Artibeus do GenBank pertencentes a 10
localidades diversas da América do Sul e 4 outgroups.
101
Nestas análises, a espécie A. concolor que, para a maioria dos autores, não
pertence aos “grandes” Artibeus, mas classificada por LIM et al. (2004) como
pertencente a este grupo, sendo por isso acrescentada nesta análise, ocupou a
posição mais basal, seguido por um clado formado por A. obscurus e seu grupo
irmão Artibeus sp.
A seguir um clado formado por A. hirsutus, A. inopinatus e A fraterculus e no
próximo ramo encontra-se A. fimbriatus, e, logo após, A. jamaicensis que se pode
dizer que ocupa uma posição intermediária, também observada nos estudos de VAN
DEN BUSSCHE et al. (1998), LIM et al. (2004) e GUERRERO et al. (2004).
Já A lituratus, A. amplus e A. planirostris estão entre as espécies mais
derivadas.
Em resumo, os clados e as relações obtidas pela análise combinada de
citocromo b e RAG2 estão de acordo com o trabalho de BAKER et al. (2003) e
também, no geral, com a classificação mais recente proposta por SIMMONS (2005b).
Diverge desta última, sobretudo no que concerne à inclusão de Macrotus como
Phyllostominae, já que isto exigiria que considerássemos esta subfamília como não
monofilética.
As relações entre os Desmodontinae, Phyllostominae (se não considerarmos
Macrotus) e Glossophaginae também estão de acordo com a literatura.
No que se refere a Rhinophylla pumilio, a ausência de gêneros como Carollia
em nossa análise nos impedem de inferir mais profundamente sobre seu status
taxonômico.
Dentro dos Stenodermatinae, as espécies do gênero Sturnira representam a
linhagem mais basal. Sua classificação taxômica foi muitas vezes revisada, mas em
estudos recentes existe um consenso de que sejam colocadas em uma tribo própria,
Sturnirini, o que é corroborado por nossos dados.
Nossas análises indicaram, também, que os morcegos denominados de
“short-faced” (devido à extrema compressão antero-posterior do crânio) formam um
grupo distindo sendo incluídos neste grupo estão os gêneros Ametrida, Pygoderma,
Sphaeronycteris, Stenoderma e Phyllops. Neste grupo há ainda uma subdivisão,
102
separando os dois gêneros endêmicos de ilhas nas Antilhas menores (Phyllops e
Stenoderma) dos demais gêneros Sphaeronycteris, Pygoderma e Ametrida, que
apresentam distribuições continentais, com ocorrência entre as Américas do Sul e/ou
Central. Além disso, Phyllops e Stenoderma encontraram-se sempre associados,
independente da análise realizada, enquanto os taxa Sphaeronycteris, Pygoderma e
Ametrida, no entanto, apresentaram diferenças entre as árvores geradas.
No que se refere ao outro grupo encontrado para os Stenodermatinae (o grupo
dos Artibeus), as relações encontradas estão de acordo com a maioria dos trabalhos
que discutem a filogenia de Artibeus como o de MARQUES-AGUIAR (1994) e o de
VAN DEN BUSSCHE et al. (1998). Vale a pena destacar, no entanto, a posição basal
observada para A. obscurus, que diverge da encontrada em outras análises
filogenéticas feitas nas quais A. obscurus apresenta-se como um taxon mais
derivado de Artibeus (MARQUES-AGUIAR, 1994; VAN DEN BUSSCHE et al.,1998;
GUERRERO et al., 2003, 2004; LIM et al., 2004). Aparentemente, com a inclusão na
analise filogenética que fizemos de exemplares representantes do sul da distribuição
da espécie, a presença de Artibeus sp parece modificar as relações de A. obscurus
com as outras espécies do gênero.
Além disso, nossos resultados indicam que Artibeus sp, possa ser uma nova
espécie, já que formou um agrupamento próprio e com uma divergência genética
relativamente alta. Para maiores conclusões, no entanto, são necessários mais
estudos de morfologia e um aumento no número de amostras, mas, independente do
status taxonômico, é provável que Artibeus sp represente uma diferenciação regional
recente dentro do limite sul da área de distribuição de A. obscurus.
Destaca-se também o fato de que Artibeus planirostris e A. jamaicensis
colocarem-se em posições distintas da árvore, o que reforça os últimos trabalhos que
descrevem A. planirostris como uma espécie plena e não uma subespécie de A.
jamaicensis, como se acreditava até recentemente. Notar que os espécimes
coletados no Cerrado pertencem à espécie A. planirostris.
Quanto à diversidade genética e a possível estruturação geográfica das
populações de A. lituratus e A. fimbriatus, ambas apresentaram grande variabilidade
103
genética e baixa divergência entre as seqüências, diferindo, no entanto, quanto aos
possíveis padrões de estruturação.
Em A. lituratus, praticamente todos os indivíduos estudados apresentaram
haplótipos distintos, com exceção de um único haplótipo compartilhado entre
espécimes da Mata Atlântica e do Cerrado, sendo que os resultados das análises de
mismatch, teste de neutralidade de Tajima, AMOVA e a conformação do network
sugerem que, provavelmente, este haplótipo compartilhado seja resultado da
expansão de suas populações.
Já para A. fimbriatus, a análise também indica expansão populacional, mas a
adição na análise de um indivíduo de São Paulo parece sugerir um padrão de
estruturação geográfica para esta espécie dentro da Mata Atlântica. Divergência
geográfica já foi também relatada em outras espécies de filostomídeos por
DITCHFIELD (2000). No caso de A. fimbriatus é necessário, no entanto, um
aumento no número amostral para que este padrão populacional possa ser afirmado
com segurança.
No que se refere especificamente aos marcadores utilizados, podemos
observar que o gene mitocondrial citocromo b foi bastante eficiente para detectar
relações filogenéticas no nível intragenérico como se pode observar nas árvores
geradas para as análises realizadas no gênero Artibeus. Para análises em níveis
taxonômicos mais elevados, como a realizada com a família Phyllostomidae, no
entanto, este marcador só foi capaz de diferenciar a subfamília Stenodermatinae,
mesmo assim, com relações controversas. Isto sugere que este marcador seja
limitado em termos de resolução para estudos de níveis taxonômicos superiores,
provavelmente pela saturação de alguns tipos de mutações, fato este, observado
também, por BAKER et al. (2000).
Já o gene nuclear RAG2 apresentou uma resolução muito boa para o estudo
dos Phyllostomidae, provavelmente por evoluir mais lentamente que o citocromo b e
por sua função na resposta imunológica provavelmente não estar ligada às feições
morfológicas que freqüentemente são critérios diagnósticos para a taxonomia do
grupo. Provavelmente pelo mesmo motivo, este marcador demonstrou-se ineficaz na
104
tentativa de desvendar as relações genéticas entre as espécies de morcegos do
gênero Artibeus possivelmente pelo surgimento relativamente recente do gênero.
Neste trabalho, pudemos concluir que, ao compararmos os trabalhos
realizados com espécies de Phyllostomidae e Stenodermatinae coletadas, em geral,
na América Central e norte da América do Sul, com espécies provenientes do
território brasileiro, utilizando-se para isso os mesmos marcadores, não se observa
diferenças significativas.
Especificamente em relação aos Stenodermatinae, os estudos moleculares
que realizamos, mostraram que esta subfamília agrupa os morcegos das tribos
Sturnirini (BAKER et al., 2003 e SIMMONS, 2005b) e Stenodermatini (SIMMONS,
2005), que, por sua vez subdividiram-se em dois subgrupos, correspondentes à tribo
Stenodermatini - sub-tribo Vampyressina e à tribo Mesosternodermatinae, sub-tribo
Artibeina e sub-tribo Stenodermatina de BAKER et al. (2003), indicando que, apesar
da presença dos clados descritos em outros trabalhos, estes não parecem estar nas
mesmas categorias taxonômicas propostas por estas análises.
Além disso, nossos dados sobre o gênero Artibeus parecem corroborar os de
DITCHFIELD (2000) que demonstram que em morcegos brasileiros a estruturação
filogeográfica dentro das espécies é baixa, existindo alguma estrutura intra-
específica em espécies como Artibeus obscurus. Algumas destas espécies também
mostram, contudo, uma estruturação geográfica numa escala maior, o que pode
indicar que os morcegos, devido a sua capacidade de voar, produzem um efeito de
homogeneização que previne a existência de uma forte estruturação geográfica
devido a altos níveis de fluxo gênico, como já foi observado nos estudos de
DITCHFIELD & BURNS (1998).
105
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106
A. fimbriatus: FURB-SLA1104 (DQ985478, DQ985528), FURB-SLA468 (DQ985479,
DQ985510), FURB-SLA969 (DQ985477, DQ985526) - Blumenau 26º55'S 49º03'W;
FURB-SLA1013 (DQ985527), FURB-SLA739 (DQ903820, DQ903835) - Gaspar
26º55'S 48º57'W; FURB-SLA1580 (DQ985476, DQ985533) - Indaial 26º53'S
49º13'W; FURB-SLA930 (DQ985500, DQ985525)- Jacinto Machado 28º59'S
49º45'W; FURB-SLA1482 (DQ985501, DQ985531) - Jaraguá do Sul 26º29'S
49º04'W.
A.planirostris: AN1882 (DQ985487) – Palmeirante 07º51'S 47º55'W; MN36311
(DQ985489, DQ985505), MN36318 (DQ985486, DQ985506), MN36380 (DQ985490,
DQ985507) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W.
A. lituratus: MN36783 (DQ985491, DQ985508), MN36807 (DQ985492, DQ985509),
MN36827 (DQ985493) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W; FURB-SLA1110
(DQ985485, DQ985529) - Blumenau 26º55'S 49º03'W; FURB-SLA1575 (DQ985532)
- Indaial 26º53'S 49º13'W; FURB-SLA581 (DQ985484, DQ985511), FURB-SLA641
(DQ985494, DQ985512), FURB-SLA657 (DQ985495, DQ985513) FURB-SLA754
(DQ985496, DQ985516), FURB-SLA756 (DQ985517) - Florianópolis 27º35'S
48º32'W; FURB-SLA924 (DQ985499, DQ985524) - Jacinto Machado 28º59'S
49º45'W; FURB-SLA884 (DQ985483, DQ985520), FURB-SLA889 (DQ985521),
FURB-SLA890 (DQ985480, DQ985522) - Nova Veneza 28º38'S 49º29'52W; FURB-
SLA822 (DQ903819, DQ903837); FURB-SLA844 (DQ985519) - Porto Belo 27º09'S
48º33'W; FURB-SLA922 (DQ985523) - Santa Rosa do Sul 29º08'S 49º42'W; FURB-
SLA738 (DQ985482, DQ985515), FURB-SLA1113 (DQ985530) - Santo Amaro da
Imperatriz 27º41'S 48º46'W; FURB-SLA658 (DQ985481, DQ985514) - Treze de Maio
28º33'S 49º08'W.
107
A. cf obscurus: MN36263 (DQ985488, DQ985504), MN36388 (DQ903818,
DQ903836) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W; FURB-SLA841 (DQ985498) - Porto
Belo 27º09'S 48º33'W.
Artibeus sp: FURB-SLA775 (DQ985497, DQ985518) - Gov. Celso Ramos 27º18'S
48º33'W, FURB-SLA1773 (DQ985502, DQ985534) FURB-SLA1835 (DQ985503,
DQ985535), FURB-SLA1928 (DQ985536) FURB-SLA1928 (DQ985537) - Blumenau
26º55'S 49º03'W.
Chiroderma villosum: MN36375 (DQ903823, DQ903842) - Colinas do Sul 14º09'S
48º04'W.
Chrotopterus auritus : FURB-SLA1799 (DQ903851) - Blumenau 26º55'S 49º03'W.
Desmodus rotundus: FURB-SLA1355 (DQ903817, DQ903833) – Itaiópolis 26º20'S
49º54'W.
Diphylla ecaudata: FURB-SLA1298 (DQ903813, DQ903834) - Blumenau 26º55'S
49º03'W.
Glossophaga soricina: MN36857 (DQ903831) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W.
Micronycteris megalotis: FURB-SLA809 (DQ903812) - Gov. Celso Ramos 27º18'S
48º33'W.
Mimon benneti: MN36387 (DQ903832) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W.
Mimon crenulatum: MN36684 (DQ903850) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W.
108
Platyrrhiynus lineatus: MN36260 (DQ903827, DQ903841) - Colinas do Sul 14º09'S
48º04'W; FURB-SLA835 (DQ903826, DQ903840) - Porto Belo 27º09'S 48º33'W.
Pygoderma bilobatum: FURB-SLA964 (DQ903821, DQ903838); FURB-SLA965
(DQ903822, DQ903839) - Blumenau 26º55'S 49º03'W.
Sturnira lillium: MN36638 (DQ903814, DQ903846), MN36314 (DQ903815,
DQ903848) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W; FURB-SLA820 (DQ903845) - Porto
Belo 27º09'S 48º33'W
Sturnira tildae: FURB-SLA1120 (DQ903816, DQ903847) - Sto. Amaro da Imperatriz
27º41'S 48º46'W.
Tonatia bidens: MN37301(DQ903829) - Colinas do Sul 14º09'S 48º04'W.
Tonatia.silvicola: AN1918 (DQ903830, DQ903849) – Palmeirante 07º51'S 47º55'W
Trachops cirrosus: MN36720 (DQ903828, DQ903852) - Colinas do Sul 14º09'S
48º04'W.
Vampiressa pusilla: FURB-SLA1116 (DQ903825, DQ903844) - Sto. Amaro da
Imperatriz 27º41'S 48º46'W; FURB-SLA777(DQ903824, DQ903843) - Gov. Celso
Ramos 27º18'S 48º33'W.
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O DNA foi extraído de tecidos congelados ou preservados em etanol, usando,
em princípio, o método de extração por sal, sem fenol-clorofórmio (MEDRANO et al.,
1990).
O protocolo de extração encontra-se resumido a seguir:
- Cortar o tecido e lavar com tampão STE. Adicionar o tampão de lise e a
proteinase K. Levar ao banho-maria a 37
º
C por 12 horas.
- 1 hora antes de retirar os tubos do banho-maria, colocar RNAse. Adicionar
NaCl 4M e centrifugar por 30 minutos. Adicionar etanol absoluto e deixar 12
horas na geladeira (4
º
C).
- Centrifugar por 30 minutos e adicionar álcool 70%. Centrifugar por 5 minutos.
- Deitar fora o sobrenadante, secar na estufa a 37
º
C e adicionar TE e levar ao
banho-maria a 37
º
C por cerca de 1 hora. Guardar na geladeira.
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A dupla-fita foi amplificada por meio da reação em cadeia de polimerase
(PCR) seguindo o método de SAIKI et al. (1988), de acordo com as condições
específicas descritas a seguir. Cada reação de PCR incluiu, também, um controle
negativo para checagem de possíveis contaminações.
Citocromo b:
Para a amplificação do gene do citocromo b, utilizou-se os primers MVZ05 (5'-
CGA AGC TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G -3'), MVZ16 (5'-AAA TAG GAA
111
RTA TCA YTC TGG TTT RAT-3'), MVZ23 (5'-TAC TCT TCC TCC ACG AAA CJG
GNT C-3') descritos por SMITH & PATTON (1993) e MUS15398 (5'-GAA TAT CAG
CTT TGG GTG TTG RTG-3') descritos por ANDERSON & YATES (2000). A
localização dos primer em relação no citocromo b está descrito na figura 4.
Figura 4: Representação parcial da mitocôndria mostrando os genes tRNA-Glu, citocromo b e tRNA-
Thr. Nas caixas cinzas se apresenta a posição de inicio e fim do gene cit b e as caixas brancas os
“primers” e suas posições segundo a seqüência da mitocôndria de Mus musculus. Setas vermelhas
indicam os primers utilizados.
As reações de PCR foram realizadas em um volume total de 25µl contendo:
2,5µl de tampão de PCR 10x; 2,6mM de MgCl
2
, 0,56µM de dNTP; 0,2µM de cada
primer, 1 unidade de Taq polimerase, 1-2ul of DNA molde e água para completar o
volume total. As condições de amplificação foram as seguintes: Desnaturação inicial
(92
o
C – 5min) seguido de 05 ciclos em Touchdown (desnaturação: 92
o
C - 1 min;
temperatura de anelamento decaindo 1
o
C a cada ciclo, começando em 50
o
C até
46
o
C - 1 min; extensão: 72
o
C - 1 min). A temperatura de anelamento dos 35 ciclos
seguintes foi de 46
o
C com as fases de extensão e desnaturação como as descritas
para o touchdown e extensão final a 72
o
C – 10 min.
MVZ 5
14115
14133
14139
tRNA-Glu
Citocromo b
tRNA-Thr
15282
MUS
15398
MVZ 16
14940
MVZ 23
14752
112
RAG2
Para a amplificação do gene nuclear RAG2 foram utilizados os primers
RAG2F1 (5'- GGC YGG CCC AAR AGA TCC TG -3'), RAG2R1 (5'- AAC YTG YTT
ATT GTC TCC TGG TAT GC -3'), RAG2F2 (5'- TTT GTT ATT GTT GGT GGC TAT
CAG -3') and RAG2R2 (5'- GRA AGG ATT TCT TGG CAG GAG T -3') sugeridos por
BAKER et al. (2000). Sua localização no gene está representada na figura 5.
Figura 5: Diagrama representando os genes RAG, mostrando os sítios de anelamento, com destaque
para os primers utilizados. Figura retirada de BAKER et al. (2000).
As reações de PCR foram realizadas em um volume total de 25µl contendo:
2,5µl de tampão PCR 10x; 2,6mM de MgCl
2
, 1,12µM de dNTP; 0,32µM de cada
primer, 1 unidade de Taq polimerase, 1-2ul of DNA molde e água para completar o
volume total. As condições de amplificação foram as seguintes: Desnaturação inicial
(92
o
C – 5min), seguido por 35 ciclos (desnaturação: 92
o
C – 60s; temperatura de
anelamento 60
o
C – 45s e extensão de 72
o
C – 90s). Extensão final a 72
o
C – 10 min.
113
Para ambos os genes, as reações de PCR incluiram um controle negativo
para verificar possíveis contaminações.
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As extrações de DNA e os produtos de amplificação foram testados por
eletroforese em gel de agarose, 1,4% em tampão TBE 1x, a 80V por 30 minutos,
aplicando-se as amostras juntamente com azul de bromo-fenol. A coloração foi feita
com brometo de etídio e a visualização em transluminador ultravioleta.
A quantificação dos produtos de amplificação foi realizada por meio de
comparação com marcador de peso molecular (Low DNA Mass Ladder – Gibco).
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Os produtos de PCR devidamente quantificados foram purificados utilizando-
se o kit enzimático de pré-seqüenciamento da Amersham Pharmacia (US 70995),
onde duas enzimas, a exonuclease I e a fosfatase alcalina, degradam os resíduos de
primers e dNTPs formado pelas reações de PCR utilizando para isso 0,33µL de EXO
(3,3U), 0,33µL de SAP (0,66U); 0,34 µL de água e 6µL de produto de PCR em uma
reação no termociclador de 30 min – 37 ºC e 15 min – 80 ºC ou então o protocolo de
purificação por PEG (Polietilenoglicol) 8000, descrito a seguir:
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Após a etapa de purificação, foi realizada a reação de seqüenciamento
(SANGER et al., 1977), utilizando o seqüenciador automático
ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer armado com capilares de 50cm e polímero
POP6 (Applied Biosystems). Os DNAs-molde (30 a 45ng) foram marcados por
PCR utilizando-se 3,2pmol dos primers envolvidos e 2mL do
114
reagente BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems)
em um volume final de 10mL. As reações de marcação foram realizadas em
termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) com uma etapa
de desnaturação inicial a 96 ºC por 3 min seguida de 25 ciclos de 96 ºC por 10 seg,
5 ºC por 5 seg e 60ºC por 4 min. Após marcadas, as amostras foram purificadas
pela precipitação com isopropanol e lavagem com etanol 70%. Os produtos
precipitados foram diluídos em 10mL de formamida, desnaturados a 95ºC por 5
min, resfriados em gelo por 5 min e eletroinjetados no seqüenciador automático. Os
dados de seqüenciamento foram coletados utilizando-se o programa Data
Collection v1.0.1 (Applied Biosystems) com os parâmetros Dye Set "Z"; Mobility
File "DT3100POP6{BDv3}v1.mob"; BioLIMS Project "3100_Project1"; Run Module 1
"StdSeq50_POP6_50cm_cfv_100"; e Analysis Module 1 "BC-
3100SR_Seq_FASTA.saz".
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As amostras foram obtidas preferencialmente a partir de material depositado
em coleções zoológicas ou coletadas com o auxílio de redes do tipo “mistnets” e
consistiram em 103 seqüências (49 do gene mitocondrial citocromo b e 54 do gene
nuclear RAG2) de 21 espécies de 14 gêneros (Anexo 1 e 3 ) coletados em 15 pontos
de amostragem (Fig.6) abrangendo dois biomas brasileiros (Cerrado e Mata
Atlântica, Anexo 4) entre as coordenadas 7º to 28ºS and 47° to 49°W além de 27 de
citocromo B e 20 seqüências de RAG2 depositadas no GenBank.
As seqüências geradas foram depositadas no GenBank sob os seguintes
números de acesso: DQ903812 – DQ903852 e DQ985476
- DQ985537 (ver Tabela
1 – capítulo 2, apêndice – capítulo 3 e Anexo 1).
Os crânios e peles dos exemplares utilizados encontram-se depositados na
coleção de morcegos da Universidade Regional de Blumenau (FURB) e na coleção
de Mamíferos do Museu Nacional do Rio de Janeiro (MNRJ).
115
Figura 6: Pontos de coleta das amostras utilizadas neste estudo (1) Palmeirante, (2) Colinas do
Sul, (3) Jaraguá do Sul, (4) Indaial, (5) Gaspar, (6) Blumenau, (7) Porto Belo, (8) Gov.
Celso Ramos, (9) Florianópolis, (10) Sto Amaro da Imperatriz, (11) Treze de Maio, (12)
Nova Veneza, (13) Jacinto Machado, (14) Santa Rosa do Sul (15) Itaiópolis.
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Morcego de tamanho médio em relação às outras espécies. As faixas faciais
estão ausentes ou tênues. As pontas das asas apresentam em geral, um padrão de
coloração negra. A cor da pelagem do dorso apresenta grande variação, com a
maioria tendendo ao castanho escuro. A pelagem do ventre também apresenta
grande variação (ALTHOFF, 1996). São essencialmente frugívoros (BARQUEZ et
al.,1993). Possui 2n= 30,XX (SANTOS et al, 2002).
Distribuição: nordeste ao sul do Brasil (da Bahia até Santa Catarina),
estendendo-se ao nordeste do Paraguai (KOOPMAN, 1993; MARQUES-AGUIAR,
1994; FABIÁN et al., 1999) e ao norte da Argentina (BARQUEZ et al.,1993; DIAZ &
OJEDA, 2000).
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Folha nasal curta, larga e em forma de ferradura. O lábio superior apresenta
pequenas verrugas marginais e o inferior uma grande verruga central, circundada por
verrugas menores. As faixas faciais são, na maioria, bem evidentes, mas podem
chegar a estar ausentes em alguns casos. Na maioria das vezes a ponta das asas é
creme. A mebrana interfemural (uropatágio) é profundamente sulcada, apresentando
diversos graus de pilosidade. A cor da pelagem apresenta grande variação
(ALTHOFF, 1996).
Possui 2n=30/31,XY1Y2 (ALTHOFF, 1996; SANTOS et al.,2002).
Distribuição: desde a região central do México, passando pela América
Central até a região sul do Brasil, Norte da Argentina e Paraguai (KOOPMAN, 1993;
MARQUES-AGUIAR, 1994; CIMARDI, 1996; FABIÁN et al., 1999; DIAZ & OJEDA,
2000).
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Apresenta alta variabilidade morfológica entre populações o que leva a ao
reconhecimento de várias subspécies que diferem primariamente em caracteres
como tamanho, cor e número de molares, sendo que os limites geográficos e
morfométricos destas subespécies nunca foram muito claros e o status de muitas
dessas subespécies vem sendo também questionadas (GUERRERO et al., 2004).
Possui 2n=30/31,XY1Y2 (SANTOS et al.,2002).
Distribuição: Apresenta-se distribuída do México até o sul do Brasil
(MARQUES-AGUIAR, 1994), mais precisamente, até Santa Catarina (ALTHOFF,
1996).
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Espécie considerada pequena em relação às demais. As faixas faciais
também se encontram ausentes ou tênues. As pontas das asas são negras. A cor
pode apresentar-se sob três tonalidades: castanha-escura, castanha-clara e negra. A
pelagem do ventre apresenta-se também três variações na tonalidade, sendo a
maioria, cinza-escura (ALTHOFF, 1996).
Distribuição: Pode ser encontrada desde a Colômbia, Venezuela, Guianas,
Equador, Peru, Bolívia e Brasil (KOOPMAN, 1993), distribuindo-se inclusive nos
estados do Paraná e Santa Catarina (ALTHOFF, 1996).
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Esta espécie é considerada por autores como Handley (1987) e Marques-
Aguiar (1994) como sinônimo de Artibeus jamaicensis, sendo esta última o sinônimo-
sênior. Outros autores, como Lim et al. (2004) consideram estas duas como espécies
distintas, com A. planirostris ocorrendo desde o sul do Rio Orinoco até o sudeste da
América do Sul.
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Este é um morcego de tamanho médio, pesando cerca de 25 a 30g, medindo
de 50 a 75mm de cabeça-corpo e 48 a 56mm de antebraço. A coloração é cinzenta,
sendo dorsalmente mais claro. Apresenta folha nasal e faixas brancas na face e
também no dorso, que se estendem até metade do corpo. Pode ser confundido com
as espécies do gênero Platyrrhinus, distinguindo-se destes especialmente pela
extensão da listra dorsal e pela ausência do osso nasal. Está sempre associado a
ambientes florestais. É noturno e gregário, deslocando-se pelo dossel inferior e
médio da floresta. Apresenta reprodução sazonal associada ao início do período
chuvoso e em geral produz apenas um filhote; os demais aspectos da sua
reprodução são desconhecidos (MIKICH & BÉRNILS, 2004).
Chiroderma doriae apresenta dieta frugívora pouco diversificada e tem sido
capturada em áreas com intensa atividade antrópica, como no Rio de Janeiro. A área
de vida é desconhecida e a variação populacional ocorre de acordo com a
disponibilidade de seu alimento principal (Ficus spp.). A abundância desse recurso é
muito baixa em áreas de Floresta Ombrófila Mista e esse pode ser o principal motivo
para C. doriae não ocorrer nesse bioma (MIKICH & BÉRNILS, 2004).
Distribuição: ocorre na região Sudeste do Brasil até o Paraná (MIKICH &
BÉRNILS, 2004).
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Trata-se de um morcego de tamanho médio com 18 a 23g de peso, 42 a
46mm de antebraço e 60 a 70mm de cabeça e corpo. A folha nasal está presente e
sua coloração é levemente marrom, sem distinção entre o dorso e o ventre. As faixas
faciais, que são bem marcantes em Chiroderma doriae, são pouco visíveis ou
ausentes em C. villosum. Este morcego pode ser confundido com as espécies do
gênero Platyrrhinus, distinguindo-se destes especialmente na extensão da listra
dorsal e na ausência do osso nasal. Noturna e gregária, esta espécie está sempre
associada a ambientes florestais, deslocando-se pelo dossel inferior e médio da
floresta. Apresenta reprodução sazonal, geralmente associada ao início do período
chuvoso (EISENBERG & REDFORD, 1999; NOWAK, 1999).
É frugívora, de dieta pouco diversificada, incluindo especialmente Ficus spp.
(Moraceae). Sua área de vida é desconhecida e os dados populacionais são
insuficientes para uma análise confiável. Contudo, aparenta ser mais comum que C.
doriae (MIKICH & BÉRNILS, 2004).
Distribuição: Bolívia, Brasil, Belize, Colômbia, Costa Rica, Equador, Guiana
Francesa, Guatemala, Guiana, Honduras, México, Nicarágua, Panamá, Peru,
Suriname, El Salvador, Trinidad e Tobago e Venezuela (KOOPMAN, 1993;
NOWAK,1999). No Brasil a distribuição deste morcego é ampla, sendo citado da
região Norte até o Paraná, que aparenta ser o seu limite meridional (MIKICH &
BÉRNILS, 2004).
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Este é um dos cinco maiores morcegos do Brasil. O corpo mede entre 100 e
112mm, e o antebraço entre 75 e 87mm. A coloração dorsal é escura, pardo-
acinzentada e o ventre é acinzentado. As membranas das asas são largas e escuras,
121
com as pontas esbranquiçadas. As orelhas são muito grandes e separadas entre si;
quando dobradas, ultrapassam as narinas. A folha nasal é bem desenvolvida, assim
como a membrana interfemural que se apresenta larga, formando pregas e dobras
quando o animal está em repouso. A cauda é rudimentar. Esta é uma espécie
encontrada em cavernas, túneis, ocos de árvores e habitações humanas, de vários
tipos de ambiente (NOWAK,1999).
É noturna e gregária, formando grupos que podem ter até sete indivíduos.
Fêmeas grávidas foram capturadas em abril e julho. O período de gestação é de 99
dias, após o qual nasce apenas um filhote. Carnívoro, alimenta-se de pequenos
vertebrados como aves, répteis, morcegos e roedores, embora alguns autores
tenham relatado a presença de insetos e frutos na sua dieta. Nada se sabe sobre
sua capacidade de adaptação, como também são poucas as informações sobre sua
área de vida. As taxas de captura desta espécie são baixas, o que resulta em uma
deficiência dessas informações (MIKICH & BÉRNILS, 2004).
Distribuição: do sul do México até Paraguai e norte da Argentina
(NOWAK,1999). No Brasil esta espécie encontra-se amplamente distribuída (MIKICH
& BÉRNILS, 2004).
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Apenas está espécie é descrita para o gênero atualmente. Espécies como D.
stocki e D. draculae são descritas para o Pleistoceno (NOWAK,1999).
D. rotundus é considerada de médio à grande porte, com corpo medindo entre
70 e 90mm, antebraço entre 50-63mm e cauda ausente (NOWAK,1999). Alimenta-se
de sangue de mamíferos ou ocasionalmente de aves, para o que está perfeitamente
adaptado, tendo se aprimorado anatômica e comportamentalmente para a retirada
de sangue de suas presas (RUSCHI, 1951; BREDT & SILVA, 1996). Possui 2n= 28
(EISENBERG & REDFORD, 1999).
122
Habita tanto áreas áridas quanto úmidas em regiões tropicais e subtropicais.
Geralmente utiliza cavernas como abrigo, mas podem também ocupar buracos de
árvores, minas antigas e prédios abandonados e pode ser encontrado sozinho, em
pequenos grupos ou em colônias de mais de 2.000 indivíduos (NOWAK,1999).
São considerados poliéstricos (NOWAK,1999) e um dos únicos grupos que
possuem altruísmo recíproco (WILKINSON,1990)
Suas populações têm crescido com a oferta de alimento proporcionada pelo
desenvolvimento da pecuária na América do Sul e Central, regiões de sua
distribuição.
Distribuição: América do Sul, desde a Colômbia, Venezuela e Guianas até
Valparaíso no Chile, Córdoba e o Norte de Santa Fé na Argentina (KOOPMAN, 1993;
NOWAK, 1999).
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Única espécie descriata para este gênero. Este é um morcego de tamanho
médio, com peso variando entre 23 e 30g e medindo entre 50 e 55mm de antebraço
e de 65 a 90mm de cabeça e corpo. A coloração é marrom escura ou mesmo
avermelhada. A membrana interfemural é densamente pilosa. Tem 26 dentes,
enquanto que os demais gêneros de morcegos-vampiros, Diaemus e Desmodus,
têm, respectivamente, 22 e 20 dentes. Habita ocos de árvores, habitações humanas
e cavernas. É noturno e não gregário. A fêmea pode parir duas vezes por ano,
sempre um filhote. É uma espécie hematófaga, alimentando-se de sangue de
vertebrados, principalmente aves. Sua plasticidade é desconhecida (NOWAK,1999;
MIKICH & BÉRNILS, 2004).
Distribuição: Sul do Texas e leste do México até o norte da Bolívia
(NOWAK,1999). No Brasil esta espécie está distribuída em todos os estados
(MIKICH & BÉRNILS, 2004).
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É um morcego pequeno (comprimento do corpo em média de 53,9mm para
machos e 54,9mm para fêmeas). Apresenta um focinho comprido, língua extensível,
orelhas pequenas, triangulares com a ponta arredondada. O uropatágio é bem
desenvolvido, com cauda na parte dorsal e sem pêlos na borda. O trago comprido e
pontiagudo e a folha nasal pequena (EISENBERG & REDFORD,1999). Possui 2n=
32 (EISENBERG & REDFORD,1999; SANTOS et al.,2002).
Prefere ambientes úmidos, sendo raramente encontrado em lugares secos.
Pode viver em ambientes alterados pelo homem, mas em ambientes naturais prefere
florestas bem preservadas, com vários extratos arbóreos (EISENBERG &
REDFORD,1999).
Animal crepuscular noturno. Alimenta-se principalmente de néctar, mas
também de pólen, flores, frutos e insetos. Solitários ou coloniais. Forma colônias
maternais em cavernas e ocos de árvores. Podem reunir-se várias centenas de
fêmeas e seus filhotes. Fêmeas apresentam ciclo de reprodução poliestro, tendo
duas a três ninhadas por ano, sempre com um filhote por ninhada (EISENBERG &
REDFORD,1999).
Distribuição: México ao nordeste da Argentina e sudeste do Brasil
(EISENBERG e REDFORD,1999).
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Apresenta comprimento de corpo médio de 43,8mm para machos e 44,6mm
para fêmeas. Possui número cromossômico 2n=40 (EISENBERG &
REDFORD,1999).
Esta espécie é tolerante a ambiente de florestas perenes multiestratificadas.
Pouco se sabe sobre a história natural das espécies de Micronycteris, em grande
124
parte pelo fato das mesmas não serem comumente capturados por redes de neblina,
o método de coleta de morcegos preferido entre os mastozoólogos neotropicais,
mas, apesar de raramente serem capturados em grandes números, estudos indicam
que as espécies de Micronycteris constituem uma grande fração da fauna de
morcegos insetívoros das florestas úmidas neotropicais, onde muitas espécies
podem ocorrer simpatricamente (SIMMONS et al., 2002).
Abrigam-se em ocos de árvores, cavernas, em grupos de até 12 indivíduos
(EISENBERG & REDFORD,1999).
Distribuição: sudeste do México e sul do Peru, leste da Colômbia, Venezuela,
Guiana Francesa até o sul do Brasil (EISENBERG & REDFORD,1999).
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Trata-se de um morcego de tamanho pequeno, com 20 a 25g e 85 a 95mm de
cabeça e corpo. Sua coloração é marrom claro, esmaecida no dorso. É uma espécie
florestal que utiliza cavernas como abrigo. Noturno e gregário, este morcego vive em
pequenos grupos de dois a quatro indivíduos. Ao final de cada gestação nasce
apenas um filhote, estando o período de nascimento relacionado ao início do período
chuvoso. Alimentam-se de insetos, pequenos vertebrados e frutos (MIKICH &
BÉRNILS, 2004).
Distribuição: Colômbia, Guiana Francesa, Guiana, Suriname, Venezuela
(KOOPMAN, 1993; NOWAK,1999), no Brasil esta espécie ocorre em áreas florestais
do Amazonas ao Rio Grande do Sul (MIKICH & BÉRNILS, 2004).
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Mimon crenulatum é localmente rara, porém ocorre amplamente dentro dos
limites de distribuição do gênero (CAMARGO & FISCHER, 2005). Pode ser
125
encontrada em florestas decíduas, mas prefere florestas perenes multiestratificadas.
Alimentam-se de insetos e frutas. Possui 2n=32 (EISENBERG & REDFORD, 1999).
Distribuição: Bolívia, Brasil, Belize, Colômbia, Costa Rica, Equador, Guiana
Francesa, Guatemala, Guiana, Honduras, México, Nicarágua, Panamá, Peru,
Suriname, Trinidad e Tobago, Venezuela (KOOPMAN, 1993; EISENBERG &
REDFORD, 1999; NOWAK,1999).
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É um morcego pequeno. Possui uma listra clara, branca ou cinza, que se
estende desde as orelhas até o início do uropatágio, podendo estar pouco evidente.
Quatro linhas faciais claras no rosto, duas infra e duas supra orbitais, podendo estar
pouco aparentes. Possui uma franja de pêlos bastante visíveis que reveste a borda
do uropatágio que é reduzido. Folha nasal bem desenvolvida (EISENBERG &
REDFORD, 1999; NOWAK,1999). Possui 2n=30,XY (SANTOS et al.,2002)
São frugívoros, podendo alimentar-se também de insetos e néctar. Forrageam
em grandes grupos, mas descansam durante o dia formando pequenos haréns com
um macho e de sete a quinze fêmeas (EISENBERG & REDFORD, 1999).
Distribuição: Colômbia, Guiana Francesa, Brasil, Argentina (NOWAK,1999).
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É considerado um morcego pequeno. Apresentam uma mancha branca em
cada ombro próximo a asa. Os machos tem um grande glândula subdermal ao redor
do olho e a borda das orelhas e do trago são amarelados. O número cromossômico é
de 2n = 30-31(EISENBERG & REDFORD, 1999).
Distribuição: Argentina, Bolívia, Brasil, Paraguai, Suriname (NOWAK,1999).
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Morcego de tamanho médio, com antebraço medindo entre 37 e 44mm, é
pardo-amarelado na parte superior do corpo. São desprovidos de membrana
interfemural e cauda (SILVA, 1994). Possui 2n=30,XY (SANTOS et al, 2002)
Alimenta-se principalmente de frutos, mas pode também utilizar insetos e
pólen (GARDNER,1977b). Como outros morcegos frugívoros, esta espécie tem
grande potencial para ser dispersora de sementes.
São encontrados em uma variedade de habitats, com exceção de grandes
elevações (acima de 1000m) e regiões secas (HANDLEY, 1976).
Quanto à reprodução esses morcegos apresentam dois picos anuais, um entre
março e abril e outro entre julho e agosto (REIS,1982).
Distribuição: Amplamente distribuída desde do México até o Norte da
Argentina (EISENBERG & REDFORD, 1999).
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Trata-se de um morcego de tamanho médio, com 24 a 28g de peso, 46 a
48mm de antebraço e 67 a 70 mm de cabeça e corpo. Suas orelhas são largas e a
base dos pêlos dorsais é mais clara que a ponta, que é marrom, dando um efeito de
variação entre o marrom e o branco, enquanto o ventre é marrom-claro. Sturnira
tildae é uma espécie florestal e gregária que apresenta atividade noturna. Nasce um
filhote a cada gestação, que parece ser anual. Outros dados reprodutivos são
desconhecidos, mas ao que tudo indica há uma variação no seu período de prenhez
de acordo com a latitude. É uma espécie frugívora que demonstra preferência por
plantas pioneiras, mas a sua plasticidade é desconhecida e os registros desta
127
espécie geralmente estão associados a áreas com bom grau de preservação
(MIKICH & BÉRNILS, 2004).
Distribuição: Norte e centro da América do Sul (NOWAK,1999). É citado para
todo o Brasil (MIKICH & BÉRNILS, 2004).
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Este é um morcego de tamanho médio a grande, com 35 a 45g, 56 a 60mm de
antebraço e 90 a 100mm de comprimento total. Apresenta coloração dorsal cinzenta
e região ventral mais clara e amarelada. As orelhas são bem desenvolvidas e
separadas, com as bordas internas com pêlos claros. Apresenta folha nasal e
pequenas papilas sob o lábio. É uma espécie florestal e noturna que pode ser
gregária, formando grupos de poucos indivíduos, ou solitária. É onívora, com dieta
baseada principalmente em insetos, pequenos vertebrados e frutos. Nada se sabe
sobre os seus aspectos reprodutivos e sobre sua capacidade adaptativa (NOWAK,
1999; MIKICH & BÉRNILS, 2004; ESBÉRARD & BERGALLO, 2004). Apresenta
2n=16,XY (SANTOS et al.,2002).
Distribuição: É amplamente distribuída, ocorrendo deste o sudeste da
Guatemala até o sudoeste do Brasil (EISENBERG & REDFORD,1999). Ocorre em
todo o Brasil, exceto no Rio Grande do Sul (MIKICH & BÉRNILS, 2004).
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Comprimento total em média de 73,3mm para machos e 71,5 para fêmeas.
Esta espécie ocorre desde Honduras até sul da Bolívia e Brasil. Apesar de ser
coletado algumas vezes em florestas decíduas próximos a rios, muitos espécimes
são coletados em florestas perenes multiestratificadas. Ocasionalmente se abrigam
128
em ninhos de térmitas e na caatinga brasileira esta espécie é um insetívoro catador.
Possui 2n= 34 (EISENBERG & REDFORD,1999).
Distribuição: Leste de Honduras até a Bolívia e norte da Argentina
(NOWAK,1999).
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A espécie Trachops cirrhosus é o único membro do gênero (NOWAK,1999). É
um morcego de tamanho médio, com comprimento de antebraço de 57-64mm,
comprimento do corpo de 76-88mm e comprimento de cauda de 12-21mm. A
pelagem varia do preto ou castanho-avermelhado até cinamomo com as partes
inferiores acinzentadas (NOWAK,1999). Apresenta 2n=30,XY (SANTOS et al.,2002).
É uma das quatro espécies carnívoras na família Phyllostomidae. Alimentam-
se de insetos, pequenos vertebrados e algumas frutas. A seletividade nos hábitos
alimentares ainda é debatida, mas o hábito de se alimentar do sapo Tungara -
Physalaemus pustulosus, tem merecido considerável atenção. A variação encontrada
nos trabalhos sobre reprodução sugere que a estação de reprodução de Trachops
pode variar geograficamente e até dentro de uma localidade em particular. Podem
ser encontrados habitando ocos de árvores, cavernas, túneis abandonados, bueiros
e prédios (GOROG, 1999).
É fortemente associado com florestas tropicais multiestratificadas, mas ocorre
em regiões de floresta decídua, próximo a habitats úmidos (EISENBERG &
REDFORD,1999).
Distribuição: Bolivia, Brasil, Belize, Colombia, Costa Rica, Ecuador, French
Guiana, Guatemala, Guiana, Honduras, Mexico, Nicaragua, Panama, Peru,
Suriname, El Salvador, Trinidad e Tobago, Venezuela (KOOPMAN, 1993;
NOWAK,1999).
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São inteiramente frugívoros e são descritos como comum figo-especialistas.
São fortemente associados a habitats úmidos e florestas perenes multiestratificadas.
Possuem número cromossômico variável sendo o 2n=18,24 (EISENBERG &
REDFORD, 1999)
Distribuição: México, Peru, Paraguai, Brasil, Guiana Francesa
(NOWAK,1999).
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A Floresta Atlântica ou Mata Atlântica se estende ao longo da costa brasileira
desde o norte do estado do Rio Grande do Norte a até o sul do Rio Grande do Sul.
Ela se estende do interior para o leste do Paraguai, província das Missiones, no
nordeste da Argentina e por uma estreita faixa ao longo da costa do Uruguai.
Também estão inclusos neste bioma a vegetação do arquipélago de Fernando de
Noronha e muitas outras ilhas da costa brasileira (MITTERMEIER et al., 2005).
Figura 7: Mapa de cobertura da vegetação nativa da Mata Atlântica. Em laranja, área de cobertura
original e em verde, áreas remanescentes. Retirado de HERINGER & MONTENEGRO (2000).
Em termos gerais, a Mata Atlântica pode ser vista como um mosaico
diversificado de ecossistemas, apresentando estruturas e composições florísticas
diferenciadas, em função de diferenças de solo, relevo e características climáticas
existentes na ampla área de ocorrência desse bioma no Brasil (JOLY et al., 1999;
COSTA, 2003).
132
Estende-se cerca de 500-600km para o interior e vai deste o nível do mar até
cerca de 2.000m de altitude. A altitude determina pelo menos três tipos de vegetação
na Mata Atlântica. As florestas da planície costeira, as florestas de “montanha” e os
campos de altitude ou campos rupestres (MITTERMEIER et al., 2005).
A Mata Atlântica e seus ecossistemas associados cobriam, à época do
descobrimento 1.360.000km
2
(HERINGER & MONTENEGRO, 2000). Atualmente,
apenas 8% da área do bioma preserva suas características bióticas originais. Apesar
da devastação a que foi submetido, abriga ainda altíssimos níveis de riqueza
biológica e de endemismos, como é exemplo o recorde mundial de diversidade de
plantas lenhosas encontradas – 458 espécies – em um único hectare no sul da
Bahia, sendo inclusive identificada como a quinta área mais ameaçada e rica em
espécies endêmicas do mundo (HERINGER & MONTENEGRO, 2000;
MITTERMEIER et al., 2005) e o segundo bioma brasileiro em termos de diversidade
de mamíferos, mas possuindo um número significativamente maior de espécies (total
e endêmicas) do que o esperado dado sua área (COSTA et al., 2005).
A riqueza específica de morcegos dentro da Mata Atlântica apresenta um
gradiente latitudinal do sudeste para o sul do Brasil, com, por exemplo, 67 espécies
ocorrendo no Espírito Santo e 28 no Rio Grande do Sul (MARINHO-FILHO, 1996a).
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O Cerrado brasileiro é reconhecido como a savana mais rica do mundo em
biodiversidade com a presença de diversos ecossistemas. A área nuclear encontra-
se distribuída pelo Planalto Central Brasileiro nos Estados de Goiás, Tocantins, Mato
Grosso, Mato Grosso do Sul, parte de Minas Gerais, Bahia e Distrito Federal,
abrangendo originalmente cerca de 2.031.990km². É o segundo maior bioma
brasileiro, depois da Amazônia, sendo a mais extensiva região de savana da América
do Sul (MITTERMEIER et al., 2005).
133
Figura 8: Área de cobertura do bioma Cerrado em vermelho. Figura retirada da
home-page da Conservation International
.
O clima é tropical, com chuvas concentradas no período de abril a outubro. A
estação da seca é bem definida, provocando, em algumas áreas, falta de água.
Muitas das espécies de plantas típicas do Cerrado são próprias de região seca. As
queimadas, tanto as naturais quanto as provocadas pelo homem, são uma
característica importante da ecologia do Cerrado. A flora mostra um grupo de
adaptações ao fogo, inclusive cascas de árvore grossas, folhas resistentes e uma
capacidade de regeneração rápida (MITTERMEIER et al., 2005).
O Cerrado típico é constituído por árvores relativamente baixas (até vinte
metros), esparsas, disseminadas em meio a arbustos, subarbustos e uma vegetação
baixa constituída, em geral, por gramíneas. A típica vegetação que ocorre no
Cerrado possui troncos tortuosos, de baixo porte, ramos retorcidos, cascas espessas
e folhas grossas (JOLY et al., 1999), o que favorece a presença de espécies de
morcegos de áreas abertas, como os vespertilionidae e embalunoridae (MARINHO-
FILHO, 1996b).
As formações abertas predominam no Cerrado, porém formações florestais
como as florestas de galeria e florestas mesofíticas, geralmente associadas a
formações cársticas e cavernas podem explicar a predominância de Phyllostomidae
134
em alguns trabalhos, como os de TRIERVEILER (1998) que registrou cerca de
95,31% de sua amostra como pertencente a essa família. Essa variedade de habitats
parece desempenhar importante papel na manutenção das populações de
quirópteros, que representam nesta região cerca de 40% do total de espécies de
mamíferos (MARINHO-FILHO, 1996b).
135
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