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FABÍOLA XOCHILT VALDEZ DOMINGOS
BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL
EM PEIXES E OSTRAS DE TRÊS ESTUÁRIOS BRASILEIROS
E CINÉTICA DE DERIVADOS SOLÚVEIS DO PETRÓLEO
EM PEIXES
Tese apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e Molecular,
Setor de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Paraná, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Ciências
Biológicas com Área de Concentração em
Biologia Celular e Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Ciro A. Oliveira Ribeiro
Co-orientora: Prof
a
. Dra. Helena C. Silva de Assis
Colaboração: Dr. Émilien Pelletier
Dr. Claude Rouleau
CURITIBA
2006
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
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i
Esta tese é dedicada à meus pais Ailton (in memoriam) e Maria Luisa e à minha
filha Bianca por todo seu auxílio, incentivo e
dedicação incondicionais.
ii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro a quem considero meu “Pai
Científico”, pelos 9 anos de orientação, confiança e apoio nos momentos difíceis.
A minha Co-Orientadora Prof. Dr. Helena Cristina da Silva de Assis por sua orientação,
paciência e confiança.
Aos meus Orientadores na Université do Quebéc a Rimouski Prof. Dr. Emilien Pelletier
(Institut des Sciences de la Mer de Rimouski - ISMER, Université du Québec à Rimouski) e Dr.
Claude Rouleau (IML – Institut Maurice Lamontagne), pela acolhida pessoal e profissional e por
sua contribuição significativa na minha formação durante os 7 meses em que estive no
Canadá.
A meus pais Ailton (in memoriam) e Maria Luisa, sem seus ensinamentos, incentivo e
auxílio eu não estaria concluído esta tese.
A minha filha Bianca, por ter me privado de sua companhia em diversos momentos de
minha formação, por paciência, motivação e esperança.
A minha família pelo incentivo, entusiasmo, e confiança.
A meus amigos, pessoas maravilhosas, com quem compartilho vitórias e tropeços.
A Manuela da Silva Dreyer, Nara Bobko, Patícia de Souza Diogo, Michele da Cunha
Torres, pelo auxílio na preparação das amostras.
Aos colegas do Laboratório de Toxicologia Celular em especial a Francisco Filipak Neto
pelo auxílio imediato nas mais diversas tarefas, especialmente àquelas relacionadas a
informática.
A Gislaine Canuel, Stephane, Coraline, Isabelle Desbiens pelo auxílio na preparação dos
experimentos, coleta de amostras e manuseio de equipamentos.
A Irene Sloss, Gustavo, Antônio Curtosi, Emilie Doussantouse e Stephane pela calorosa
acolhida no Canadá e auxílio nos mais diversos momentos.
Ao Centro de Estudos do Mar – CEM, professores Henry Louis Spach, Paulo Lana e suas
equipes pela disponibilidade e auxílio logístico nas coletas realizadas em Paranaguá.
A todos os pesquisadores e suas respectivas equipes pelo auxílio nas coletas e no
processamento inicial das amostras nas universidades: UFPE, UFRPE e UFES.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFPR.
A Marlene Camargo, por sua atenção e eficiência.
Aos professores desta academia especialmente Cloris Faraco, Célia Franco, Marco
Randi, Luís Fernando Favaro, Sílvio Sanches Veiga, Stênio que tanto contribuíram para a minha
formação.
A finalmente a UFPR, instituição na qual passei grande parte dos últimos 11 anos de
minha vida.
iii
Ao PROJETO RECOS – INSTITUTO DO MILÊNIO – Ministério da Ciência e Tecnolgia pelo
financiamneto do projeto (
www.mileniodomar.org.br).
Ao Centro de Microscopia Eletrônica (CME) – UFPR, especialmente a Regina, Rosângela,
Sérgio e Matilde.
A CAPES pela bolsa de doutorado no país e pela bolsa sanduíche no exterior.
iv
O que seria da ciência sem a curiosidade?
v
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................................................vii
LISTA DE TABELAS..................................................................................................................................viii
RESUMO..................................................................................................................................................ix
ABSTRACT................................................................................................................................................x
INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................................................ 1
1. CONTAMINAÇÃO EM AMBIENTES AQUÁTICOS .............................................................................. 1
1.1. METAIS PESADOS..................................................................................................................................2
1.2. HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS ........................................................................3
1.3. PESTICIDAS ORGANOCLORADOS......................................................................................................5
1.4. PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS.....................................................................7
1.5. ORGANOESTANHOS: TRIBUTIL-ESTANHO (TBT) E DIBUTIL-ESTANHO (DBT) .....................................7
2. PEIXES E MOLUSCOS COMO BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL.............................. 10
3. BIOMONITORAMENTO..................................................................................................................... 12
4. BIOMARCADORES........................................................................................................................... 14
5. CINÉTICA DE CONTAMINANTES EM ORGANISMOS AQUÁTICOS COMO FERRAMENTA PRÉVIA A
ESTUDOS DE BIOMONITORAMENTO....................................................................................................16
CAPÍTULO I: BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL EM PEIXES NOS ESTUÁRIOS
BRASILEIROS DE PARANAGUÁ (PR), PIRAQUÊ-AÇÚ (ES) E ITAMARACÁ (PE)....................................18
I. 1. INTRODUÇÃO................................................................................................................................19
I.2. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................. 21
I.2.1. ESPÉCIES BIOINDICADORAS ...........................................................................................................21
I.2.2. ÁREAS DE ESTUDO E ESTRATÉGIA AMOSTRAL................................................................................21
I.2.2.1. Itamaracá - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE.................................................23
I.2.2.2. Piraquê - Sistema Estuarino dos rios Piraquê–Açu e Piraquê-Mirim - ES .............................24
I.2.2.3. Paraná - Complexo Estuarino Baía de Paranaguá.................................................................25
I.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS..............................................................................................................26
I.2.4. BIOMARCADORES SOMÁTICOS .....................................................................................................26
I.2.5. BIOMARCADORES MORFOLÓGICOS.............................................................................................27
I.2.5.1. Avaliação Histopatológica.........................................................................................................27
I.2.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão ...................................................................................28
I.2.5.3. Microscopia Eletrônica de Varredura.......................................................................................28
I.2.6. BIOMARCADOR BIOQUÍMICO - AVALIAÇÃO DA COLINESTERASE...........................................28
I.2.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS DADOS........................................................................................29
I.3. RESULTADOS.........................................................................................................................................30
I.3.1. INDICES SOMÁTICOS........................................................................................................................30
I.3.2. HISTOPATOLOGIA DE BRÂNQUIAS.................................................................................................32
I.3.3. HISTOPATOLOGIA DE FÍGADO .......................................................................................................32
I.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE ......................................................................................................37
I.4. DISCUSSÃO.................................................................................................................................... 38
CAPÍTULO II: BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL EM OSTRAS NOS ESTUÁRIOS
BRASILEIROS DE PARANAGUÁ (PR), PIRAQUÊ-AÇÚ (ES) E ITAMARACÁ (PE)................................... 45
II. 1. INTRODUÇÃO...............................................................................................................................46
II.2. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................ 48
II.2.1. ESPÉCIE BIOINDICADORA...............................................................................................................48
II.2.2. ÁREAS DE ESTUDO E ESTRATÉGIA AMOSTRAL..............................................................................48
II.2.2.1. Itamaracá - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE................................................50
II.2.2.2. Piraquê - Sistema Estuarino dos rios Piraquê–Açu e Piraquê-Mirim - ES ............................51
II.2.2.3. Paraná - Complexo Estuarino Baía de Paranaguá................................................................52
II.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS..............................................................................................................53
II.2.4. BIOMARCADOR SOMÁTICO ..........................................................................................................54
II.2.5. BIOMARCADORES MORFOLÓGICOS...........................................................................................54
vi
II.2.5.1.Avaliação Histopatológica.........................................................................................................54
II.2.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão .................................................................................55
II.2.5.3. Microscopia Eletrônica de Varredura.....................................................................................55
II.2.6. BIOMARCADOR BIOQUÍMICO - AVALIAÇÃO DA COLINESTERASE..........................................55
II.2.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS DADOS ......................................................................................56
II. 3. RESULTADOS................................................................................................................................. 57
II.3.1. PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DA ÁGUA................................................................................57
II.3.2. ÍNDICE SOMÁTICO ..........................................................................................................................57
II.3.3. HISTOPATOLOGIA.........................................................................................................................59
II.3.3.1. Lesões Detectadas......................................................................................................................59
II.3.3.2. Ocorrência de Lesões ................................................................................................................63
II.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE.....................................................................................................65
II. 4. DISCUSSÃO..................................................................................................................................66
CAPÍTULO III: CINÉTICA DE DERIVADOS DE PETRÓLEO EM Fundulus heteroclitus E Salvelinus
alpinus APÓS EXPOSIÇÃO HÍDRICA................................................................................................... 73
III.1. INTRODUÇÃO...............................................................................................................................74
III.2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................... 75
III.2.1. ESPÉCIES BIOINDICADORAS........................................................................................................75
III.2.1. EXPERIMENTO COM RADIOISÓTOPOS.......................................................................................76
III.2.1.2. Autoradiografia (WBARG – “Whole-body Autoradiography”)............................................77
III.2.2. SIMULAÇÃO DE DERRAMAMENTO DE PETRÓLEO....................................................................77
III.2.2.1.Análise de HPAs na água ........................................................................................................ 79
III.2.2.2.Análise de HPAs na bile ........................................................................................................... 80
III.3. RESULTADOS................................................................................................................................. 81
III.3.1. Experimento com radioisótopos................................................................................................81
III.3.1.1. Análise Qualitativa................................................................................................................... 81
III.3.1.2. Análise Quantitativa................................................................................................................ 83
III.3.2. SIMULAÇÃO DE DERRAMAMENTO DE PETRÓLEO....................................................................84
III.3.2.1.Análise de HPAs na água ........................................................................................................ 85
III.3.2.2. Análise de HPAs na bile .......................................................................................................... 86
III.4. DISCUSSÃO.................................................................................................................................. 87
CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................................................... 91
CONCLUSÕES ......................................................................................................................................93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................................... 94
vii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 1. Localização geográfica dos pontos referência (R) e contaminado (C) nas três regiões
estuarinas avaliadas na costa brasileira...................................................................................23
Figura 2. Índice hepatossomático (IHS), e fator de condição (FC) de peixes coletados em três
estuários brasileiros.......................................................................................................................31
Figura 3. Histopatologia de brânquias de peixes das áreas
estuarinas avaliadas....................................................................................................................34
Figura 4. Índice histopatológico de lesões branquiais de indivíduos coletados nas áreas estuarinas
estudadas.....................................................................................................................................34
Figura 5. Histopatologia de fígado em indivíduos coletados nas áreas estuarinas
avaliadas...................................................................................................................................35
Figura 6. Índice histopatológico de lesões hepáticas de indivíduos coletados nas áreas
estuarinas estudadas...................................................................................................................37
Figura 7. Ocorrência de centros de melanomacrófagos (CMM) e melanomacrófagos livres (MM)
no fígado de indivíduos coletados nas áreas estuarinas estudadas....................................37
Figura 8. Atividade da colinesterase no músculo de indivíduos coletados nas áreas
estuarinas estudadas...................................................................................................................36
CAPÍTULO II
Figura 1. Localização geográfica dos pontos referência (R) e contaminados (C1 e C2) nas três
regiões estuarinas avaliadas na costa brasileira.....................................................................48
Figura 2. Índice de condição (IC) de Crassostrea rhizophora coletada no inverno e verão em três
estuários brasileiros......................................................................................................................57
Figura 3. Lesões histopatológicas observadas nas brânquias de
Crassostrea rhizophorae.............................................................................................................57
Figura 4. Organização ultraestrutural e lesões detectadas nos filamentos branquiais de
Crassostrea rhizophorae..........................................................................................................59
Figura 5. Microscopia eletrônica de varredura das brânquias de
Crassostrea rhizophorae.............................................................................................................60
Figura 6. Ocorrência comparativa de lesões histopatológicas nas brânquias de Crassostrea
rhizophorae entre três regiões estuarinas da costa brasileira.............................................62
CAPÍTULO III
Figura 1. Recipiente de contenção de petróleo.....................................................................................48
Figura 2. Autoradiogramas de Fundulus heteroclitus após exposição de 24h. ..................................79
Figura 3. Índice de concentração (IC) de Naftaleno, Naftol e Fenantreno em Fundulus heteroclitus
durante 21 dias de experimento...............................................................................................81
Figura 4. Eliminação de Naftaleno, Naftol e Fenantreno durante o período de depuração em
Fundulus heteroclitus durante 21 dias de experimento..........................................................81
Figura 5. Presença de HPAs na água durante o experimento de simulação de derramamento de
petróleo em Salvelinus alpinus...................................................................................................82
Figura 6. Cromatogramas de bile obtidos por HPLC-FL. ........................................................................83
viii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1. Exemplos de fatores de importância utilizados no cálculo do índice de lesões segundo
Bernet et al. (1999)....................................................................................................................27
Tabela 2. Parâmetros físico-químicos da água nos três estuários avaliados.......................................30
Tabela 3. Parâmetros físico-químicos da água nos três estuários avaliados. .....................................30
CAPÍTULO II
Tabela 1. Parâmetros físico-químicos da água nos três estuários avaliados. .....................................56
Tabela 2. Alterações histopatológicas relacionadas a exposição à contaminantes observadas por
alguns autores nas brânquias de bivalves................................................................................66
CAPÍTULO III
Tabela 1. Características dos contaminantes testados..........................................................................74
Tabela 2. Estimativa da concentração de HPAs metilados em amostras provenientes da
simulação de derramamento de petróleo...........................................................................83
Tabela 3. Características dos metabólitos naftol, fenantrol e pirenol..................................................83
ix
RESUMO
Ambientes aquáticos, particularmente regiões estuarinas, constituem o destino
final de diversos tipos de contaminantes. Este estudo apresenta duas
abordagens diferentes: a avaliação comparativa de biomarcadores em três
regiões estuarinas brasileiras e avaliação da cinética de derivados do petróleo
através de bioensaios. Para o biomonitoramento dos estuários de Paranaguá
(PR), Piraquê (ES) e Itamaracá (PE) foram utilizados três organismos
bioindicadores: peixes (Cathorops spixii e Lutjanus synagris) e ostras (Crassostrea
rizophorae). Biomarcadores somáticos, histopatológicos (brânquias e fígado) e
bioquímico (atividade da acetilcolinesterase) foram avaliados em ambas as
espécies. Diferenças nos índices somáticos e atividade da colinesterase, bem
como a ocorrência de lesões histopatológicas foram detectadas nos peixes. As
ostras apresentaram índices de condição e atividade da colinesterase similar
entre as áreas avaliadas, além disso, lesões histopatológicas foram observadas
nestes organismos. Em todas as áreas amostradas os peixes apresentaram
diferenças no fator de condição, nas lesões histopatológicas hepáticas e
branquiais, bem como na atividade da colinesterase nos diferentes pontos de
coleta. A avaliação cinética e toxicológica de derivados de petróleo foi
realizada através de dois experimentos (1) exposição a derivados de petróleo
(naftaleno, naftol e fenantreno) marcados com
14
C e (2) simulação de
derramamento de petróleo. Através do experimento (1) foi possível observar a
cinética dos compostos avaliados na espécie de peixe Fundulus heteroclitus. Os
principais órgãos alvo destes compostos foram vesícula biliar, intestino e fígado.
Através da simulação de derramamento de petróleo foi possível detectar a
presença de derivados de HPAs na água através de espectofotometria e de
HPLC-FL, porém estes compostos não foram detectados na bile de Salvelinus
alpinus através da análise ao HPLC-FL. Os resultados obtidos nos estuários
brasileiros revelam que todas as áreas avaliadas estão impactadas, bem como
a importância da abordagem de múltiplos biomarcadores em estudos de
biomonitoramento. Os estudos relativos à cinética contribuem para uma melhor
compreensão dos mecanismos de dispersão, biocumulação e distribuição de
HPAs leves em peixes.
Palavras-chave: atividade da acetilcolinesterase, biomarcadores,
biomonitoramento, cinética de derivados de petróleo, fenantreno,
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, histopatologia, naftaleno, naftol.
x
ABSTRACT
Aquatic environments, particularly estuarine regions, receive a expressive load of
contaminants. This study presents two different approaches: a comparative
biomarker evaluation in three Brazilian estuarine areas and a kinetic evaluation of
petroleum derivatives through bioassays. The biomonitoring of Paranaguá (PR),
Piraquê (ES) and Itamaracá (PE) estuaries were carried out on three bioindicator
species: fishes (Cathorops spxii and Lutjanus synagris) and oysters (Crassostrea
rizophorae). Somatic, histopathologic (gills and liver) and biochemical biomarkers
(cholinesterase activity) were evaluated on these species. Differences on
somatic indexes and cholinesterase activity as well as the occurrence of
histopathologic lesions were detected on fishes. Oysters presented somatic
indexes and cholinesterase activity values similar between evaluated areas,
besides that, histopathologic lesions were observed on these organisms. Fishes
presented differences on condition factor, histopathologic lesions on liver and
gills, as well on cholinesterase activity. In order to evaluate the kinetic parameters
of petroleum derivatives two experiments were done: (1) a waterborne exposition
to selected petroleum derivatives (naphthalene, naphtol and phenantrene)
radiollabeled with
14
C and (2) a simulation of an oil spill. The results of the first
experiment showed that the main target organs for naphthalene, naphtol and
phenantrene in Fundulus heteroclitus, were gall blader, intestine and liver. The
presence of petroleum derivatives was detected on the aquaria water trhough
spectophotometry and HPLC-FL after the oil spill simulation. However these
compounds were not detected on the bile of evaluated animals anlysed through
HPLC-FL. The results obtained on the Brazilian estuaries suggest that all evaluated
areas are impacted, as well the relevance of a multibiomarker approach on
biomonitoring studies. The kinetic results contribute to a better understanding of
dispersion, bioaccumulation and distribution of light PAHs on fishes.
Key-words: acetilcholinesterase activity, biomarkers, biomonitoring,
histopathology, kinetic of petroleum derivatives, naphtalene, naphtol,
phenentrene, polycyclic aromatic hidrocarbons.
INTRODUÇÃO GERAL
1. CONTAMINAÇÃO EM AMBIENTES AQUÁTICOS
Os ecossistemas aquáticos são considerados receptores finais de
contaminantes liberados no ambiente, estando susceptíveis a ação de
contaminantes aéreos, que chegam aos corpos d´água por deposição
atmosférica e contaminantes terrestres que atingem os ambientes aquáticos
através do escoamento destes pelas chuvas.
Os estuários são ambientes aquáticos de transição entre ecossistemas
dulcícolas e marinhos. São regiões parcialmente fechadas nas quais a água do
mar é bastante diluída pelo aporte de água doce do continente (Thurman e
Trujillo, 1999). As regiões estuarinas são extremamente importantes do ponto de
vista biológico, pois apresentam alta riqueza de espécies e podem ser
consideradas como “berçário” para diversas espécies marinhas, tanto pela
proteção quanto pela grande disponibilidade de nutrientes (Thurman e Trujillo,
1999).
Situados em regiões costeiras, os estuários freqüentemente encontram-se
localizados em áreas de grande atividade antropogênica, sendo, portanto
susceptíveis aos impactos decorrentes destas atividades. As principais fontes de
impacto ambiental em estuários seriam o escoamento de esgoto proveniente de
áreas urbanas, a liberação de diversos produtos químicos (orgânicos e
inorgânicos) pela atividade industrial, a agricultura e o fluxo de embarcações,
atividade a partir da qual podem ocorrer vazamentos acidentais de petróleo e
derivados, combustíveis e outros produtos transportados por via marítima (Kennish,
1991).
Através das diversas fontes acima citadas, os poluentes mais comumente
encontrados em estuários são: metais pesados (em especial os compostos
2
organoestanhos); hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs); pesticidas como
bifenilas policloradas(PCBs), organoclorados (OC) e organofosforados; dioxinas e
furanos; detergentes e outros componentes do esgoto urbano e da ocupação
humana.
1.1. METAIS PESADOS
Os metais pesados correspondem a um grupo de elementos químicos que
apresenta massa atômica variando entre 63,54 a 200,59 (Viarengo, 1989). A
maioria dos metais pesados apresenta potencial tóxico comprovado, ou seja,
são capazes de induzir efeitos deletérios aos organismos vivos expostos (Dallinger
e Raimbow, 1993). Alguns metais pesados como ferro, cobre, zinco e cobalto, são
considerados elementos essenciais aos processos biológicos, mas podem ser
tóxicos quando em concentrações mais elevadas (Kennish, 1991; Heath, 1995).
A atividade industrial de mineração, processamento de metais e geração
de despejos industriais e domésticos vem contribuindo para o aumento da
concentração de diversos metais pesados nos ambientes naturais (Abel, 1989).
Os organismos vivos podem bioacumular metais pesados, incorporando-os na
cadeia trófica e atingindo grande parte dos diferentes estratos que constituem os
ecossistemas aquáticos (Viarengo, 1989).
Experimentos agudos com peixes através de estudos de laboratório
mostraram que o mercúrio é capaz de induzir alterações branquiais como a
fusão de lamelas secundárias nas espécies Trichomycterus zonatus e Salvelinus
alpinus (Oliveira Ribeiro et al., 1996; Oliveira Ribeiro et al., 2000). No entanto
3
existem relatos de que outros metais pesados, como o chumbo, também podem
afetar a estrutura das brânquias em peixes (Alves Costa, 2001).
Alterações hepáticas em peixes expostos a metais também foram
relatadas em nosso grupo de pesquisa. Áreas de necrose, danos nucleares e
morte celular foram relatados por Rabitto et al (2005) em Hoplias malabaricus
após exposição crônica a chumbo inorgânico. Oliveira Ribeiro et al. (2002)
observaram desorganização citoplasmática e áreas de necrose após exposição
trófica ao metil-mercúrio.
1.2. HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS
Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), são compostos
orgânicos que apresentam dois ou mais anéis carbônicos fundidos. Alguns HPAs
como o benzo[a]pireno, são formados através da combustão incompleta de
compostos orgânicos e subseqüente recombinação com outras partículas
orgânicas, constituindo portanto uma fonte importante destes compostos
(Harvey,1991).
HPAs podem ser introduzidos naturalmente no ambiente através de
queimadas de florestas, pastagens e atividades vulcânicas. Como fontes
antropogênicas de HPAs é possível destacar: descargas e derramamentos de
petróleo, geração de energia elétrica, esgotos urbanos e industriais, incineração
de lixo e madeira, aquecimento de casas além da produção de carvão e asfalto
(Albers, 1995).
A presença de HPAs em ambientes aquáticos contaminados pode ser
detectada tanto nos componentes bióticos quanto nos componentes abióticos
4
do ecossistema. Mamíferos, aves, peixes e vários macroinvertebrados são
capazes de metabolizar os hidrocarbonetos ingeridos, porém, organismos que
vivem muito próximos à fonte de contaminação ou que não possuem sistemas
de detoxificação bem desenvolvidos, como os bivalves, tendem a bioacumular
estes compostos mais intensamente (Albers, 1995).
Em invertebrados tem-se registrado que os HPAs são capazes de causar a
indução de danos celulares, presença de tumores, prejuízos na reprodução,
redução das taxas de crescimento e desenvolvimento, e em casos de
contaminação muito severa, a morte dos organismos (Hsu e Deng, 1996 e Ueno
et al, 1995). Além dos efeitos descritos, em peixes os HPAs freqüentemente estão
associados a mutações, malformações, tumores e câncer (Collier et al. 1998), e
ainda a alterações fisiológicas e morfológicas nos rins e fígado, hiperplasia nas
brânquias e erosão em nadadeiras observadas por Hsu e Deng (1996).
Dados mostram que os hidrocarbonetos derivados do petróleo provocam
danos estruturais nas lamelas respiratórias das brânquias (DiMichele e Taylor, 1978;
Engelhardt et al., 1981; Poirier et al.,1989; Correa e Garcia, 1990; Prasad, 1991,
Nero et al., 2006), comprometendo as trocas gasosas do organismo com o meio
e resultando em hipóxia, sendo esta a principal causa de morte em massa de
peixes. Além disso, Spiers et al. (1996) identificaram lesões hiperplásicas em
células mucosas e de cloreto nas brânquias de peixes expostos a HPAs.
Hidrocarbonetos podem se acumular em ovos de peixes e são
transferidos para as larvas após a eclosão dos ovos (Goksoyr et al., 1991). Spiers et
al. (1996) observaram necroses múltiplas e um variável número de macrófagos e
linfócitos no fígado de organismos expostos em um derramamento de petróleo
5
no canal de Santa Bárbara. Segundo estudos de diversos autores os
hidrocarbonetos provenientes do petróleo elevam as concentrações de cortisol
no plasma (Di Michele eTaylor, 1978; Levitan e Taylor, 1979; Engelhardt et al., 1981;
Leloup-Hatey e Hardy, 1985). O aumento na concentração deste hormônio
deprime a função da tireóide (Redding et al., 1986; Brown et al., 1991), podendo
apresentar como conseqüência alterações no comportamento reprodutivo e
alimentar dos organismos expostos.
Estudos recentes realizados em nosso laboratório mostraram que a fração
solúvel do petróleo é capaz de causar inibição na atividade da
acetilcolinesterase (AChE) em Astyanax sp após exposição aguda, bem como
várias das lesões mencionadas acima (Akaishi et al., 2004).
1.3. PESTICIDAS ORGANOCLORADOS
Após a Segunda Guerra Mundial, ocorreu um súbito aumento no uso dos
inseticidas. Logo após o seu uso começou-se a observar que tais compostos eram
encontrados com freqüência no ambiente natural, principalmente em
organismos que não constituíam seu alvo inicial. Sua toxicidade, persistência e
características lipofílicas, causavam o acúmulo de resíduos em tecidos,
mortalidade, efeitos na reprodução e declínio de populações selvagens. Estudos
sobre os efeitos de pesticidas em peixes tiveram início logo após a introdução do
DDT (dimetil-difenil-tricloroetano) em 1943 (Blus,1995).
Além da vasta utilização na agricultura, como pesticidas, outros
organoclorados (PCBs - bifenilas policloradas, DDT, dioxinas e furanos),
principalmente os PCBs têm sido extensivamente utilizados nas indústrias
6
eletrônicas, manufatura de adesivos, aditivos de óleo hidráulico, tintas, extintores,
plásticos e em copiadoras de papel (Tam e Yao, 2002).
Assim como os HPAs, vários dos compostos organoclorados pertencem a
classe dos poluentes orgânicos persistentes (POPs), os quais são compostos que
apresentam resistência à degradação e, portanto, encontram-se por períodos
de tempo prolongados no ambiente (Ali e Sreekrishnan, 2001; Fillman et al., 2002).
Os POPs podem ser transportados por longas distâncias, pois tem sido detectados
em amostras biológicas coletadas em locais distantes das fontes de
contaminação (Simonich e Hites, 1995 apud Vives e Grimalt, 2002) e podem
participar de diversos ciclos biogeoquímicos sem sofrerem degradação (Vives e
Grimalt, 2002).
Por sua toxicidade e persistência no ambiente, os POPs tem sido o alvo
principal de atuação dos órgãos de proteção ambiental no Canadá (Canadian
Environmental Protection) e Estados Unidos (United States Protection Agency -
EPA) (Ali e Sreekrishnan, 2001). Os POPs, por serem de difícil degradação, tendem
a se concentrar no ambiente e serem bioacumulados pelos organismos vivos
afetando a saúde dos ecossistemas e da mesma forma colocando em risco a
saúde humana (Fillman et al., 2002). Os compostos organoclorados persistem por
longos períodos no ambiente, com isso atuam cronicamente sobre os organismos
vivos sendo capazes de induzir alterações genéticas nos organismos expostos,
podendo levar a alterações congênitas e neoplasias diversas (Ali e Sreekrishnan,
2001). Sendo assim, estes compostos estão associados a graves efeitos
ambientais, atuando sobre uma ampla variedade de espécies e atingindo todos
os níveis tróficos (Blus,1995). A exposição a organoclorados tem sido associada ao
7
declínio de populações de animais marinhos (Tanabe et al,. 1994 apud Fillman et
al., 2002).
1.4. PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS
Os organofosforados e carbamatos são pesticidas que tem sido utilizados
no controle de insetos e outros invertebrados (Hill, 1995). Esta classe de pesticidas
é rapidamente metabolizada ou excretada pela maioria dos organismos vivos,
não havendo bioconcentração nas cadeias tróficas. Portanto, os
organofosforados e carbamatos apresentam um tempo relativamente curto de
permanência no ambiente. Esses fatores, associados à sua eficiência tem
favorecido a substituição dos organoclorados pelos organofosforados e
carbamatos.
Os organismos podem ser afetados pelos organofosforados e carbamatos
através do contato direto, que pode ocorrer na aplicação do pesticida, na
ingestão de água, solo, presas ou alimentos contaminados. Vários estudos
mostram que organismos aquáticos expostos à organofosforados e carbamatos
afetam a atividade das colinesterases (De la Torre et al., 2002; Rofriguez-Fuentes e
Gold-Bouchot, 2000; Tortelli et al., 2006).
1.5. ORGANOESTANHOS: TRIBUTIL-ESTANHO (TBT) E DIBUTIL-ESTANHO (DBT)
O TBT (tributil-estanho) é um composto organometálico que tem sido
amplamente utilizado como biocida em tintas de embarcações desde a
década de 70, e talvez seja o agente químico mais tóxico que tem sido
introduzido deliberadamente nos ecossistemas aquáticos (Pelletier, 1995). Além
8
disso, este composto é utilizado também na indústria de PVC como estabilizador,
na proteção de madeira contra fungos e bactérias, como agente desinfetante e
como pesticida na agricultura. Apesar de regulamentado o uso do TBT em vários
países, a contaminação ainda persiste em níveis tóxicos crônicos, havendo
registros da presença deste composto nos organismos aquáticos e sedimento
(Fent e Hunn, 1995).
Em vários animais (como mamíferos, peixes e invertebrados) foi
demonstrado que o TBT é metabolizado em produtos intermediários hidroxilados
como o dibutil-estanho (DBT) e monobutil-estanho (MBT) (Fent, 1996).
Experimentos in vivo e in vitro têm demonstrado que xenobiontes como o TBT
podem inibir o sistema enzimático citocromo P450 em peixes, através da
inativação de algumas enzimas deste complexo, alterando-as e inibindo o seu
funcionamento (Fent e Stegman, 1993; Fent e BucheliI, 1994). Desta forma, o TBT
pode alterar tanto o seu próprio metabolismo quanto o de outros poluentes que
são biotransformados pelo sistema P450. Além disso pode interferir em outras vias
metabólicas do organismo como a biosíntese de hormônios, processo do qual
este complexo multienzimático participa (Pádros et al., 2000).
Segundo Fent e Meier (1992), a presença de TBT na água leva a um alto
índice de mortalidade de larvas de Phoxinus phoxinus, além de deformação no
eixo do corpo, paralisia e presença de olhos opacos. Também foi observado
nesta mesma espécie degeneração na pele, músculo esquelético, rim e epitélio
da córnea, com algumas células apresentando vacuolização do citoplasma e
picnose. Dados recentes e ainda não publicados pelo nosso grupo, mostram que
o TBT quando dissolvido na água, leva à mortalidade de 100% da população de
9
alevinos de Phaloceros caudimaculatus, em concentrações consideradas
subletais para outros organismos de clima nórdico. Estes resultados mostram que
alevinos de Phaloceros caudimaculatus são mais sensíveis do que peixes de clima
temperado. A sensibilidade e suscetibilidade mais acentuada em organismos
tropicais do que nórdicos foi demonstrada no estudo realizado por Oliveira
Ribeiro et al. 2000, neste trabalho a espécie brasileira Trichomycterus zonatus foi
capaz de acumular maiores concentrações de Hg do que espécie nórdica
Salvelinus alpinus em condições experimentais similares. Estes resultados reforçam
ainda mais o argumento de que a legislação referente a níveis máximos
permissíveis da presença de contaminantes na água deveria ser estabelecida a
partir de resultados obtidos com espécies nativas, dados esses que ainda são
escassos na literatura.
Trabalhos desenvolvidos no nosso laboratório demonstraram ainda que
exemplares de Salvelinus alpinus submetidos a injeções intraperitoneais de 0,3 mg
TBT/kg apresentaram necroses hepáticas e alterações na organização da
cromatina em hepatócitos (Valdez Domingos, 1999). A presença de necroses
associada à exposição ao TBT também foi relatada por outros autores (Holm et
al., 1991; Schwaiger et al., 1992; Ueno et al., 1994 e Ueno et al., 1995 e Oliveira
Ribeiro et al, 2002), evidenciando este tipo de alteração como um importante
elemento na identificação do potencial tóxico do TBT em fígado de peixes. O
fígado é um importante órgão-alvo para o TBT e seus derivados, onde a ação
deletéria deste composto pode comprometer as condições de vida do
organismo tanto pela importância do órgão, quanto pela gravidade das
alterações diagnosticadas.
10
Dada sua toxicidade faz-se necessária a quantificação e discussão dos
níveis de TBT e DBT na costa brasileira, bem como estudos para diagnosticar de
forma mais ampla seus reais efeitos sobre os organismos aquáticos tropicais
brasileiros. A utilização de espécies nativas nestes estudos, mesmo quando
realizados em condições de laboratório, constituem dados importantes
auxiliando na escolha de espécies bioindicadoras em estudos de
biomonitoramento e diagnóstico de áreas impactadas por estes contaminantes.
Diante das múltiplas fontes de impacto antropogênico sobre as regiões
costeiras, principalmente nas áreas estuarinas, faz-se necessário o
desenvolvimento e a padronização de metodologias e de biomarcadores que
possam contribuir para a avaliação e diagnóstico dos impactos a que estão
sujeitas estas regiões no Brasil.
2. PEIXES E MOLUSCOS COMO BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL
Bioindicadores são espécies de organismos vivos cujas características
favorecem sua utilização na avaliação da saúde de um determinado
ecossistema. Alguns fatores devem ser considerados na escolha de espécies
bioindicadoras em estudos de biomonitoramento: (1) a espécie deve ser
representativa da área de estudo; (2) deve possuir hábito preferencialmente
sedentário ou de baixa mobilidade, constituindo assim populações fixas a fim de
que sua exposição aos contaminantes possa refletir as condições da região em
estudo (Radtke, 1979); (3) os organismos bioindicadores devem ser de fácil
identificação e coleta em todas as estações do ano; (4) o tamanho do animal é
um fator importante, pois deve possibilitar a obtenção de material biológico
11
suficiente para garantir a realização das análises propostas no estudo (Stewart e
Malley, 1997); e (5) o nível trófico da espécie a ser utilizada também deve ser
avaliado, pois espécies que ocupam níveis tróficos superiores geralmente são
mais representativas, uma vez que podem fornecer informações relacionadas
aos fenômenos de bioacumulação e biomagnificação (Oliveira Ribeiro et al.,
1999; Vives e Grimalt ,2002).
A utilização de espécies de vertebrados e de invertebrados em um mesmo
estudo de biomonitoramento ambiental gera resultados que possibilitam uma
análise mais ampla das condições de impacto do ambiente, visto que existem
diferenças na fisiologia e complexidade de respostas que estes organismos
podem apresentar. Desta forma o uso de um número variado de biomarcadores
como avaliações somáticas, moleculares, bioquímicas, genéticas, imunológicas
e morfológicas torna o estudo mais representativo. No entanto, dependendo do
biomarcador selecionado, os protocolos para estes parâmetros diferem,
podendo ser específicos para grandes grupos taxonômicos ou mesmo para
famílias, gêneros e espécies, fazendo-se necessária uma padronização prévia
dos protocolos antes do início das amostragens definitivas.
Peixes e moluscos apresentam várias das características acima citadas e
têm sido considerados excelentes bioindicadores. Estes organismos vêm sendo
amplamente utilizados em estudos de toxicologia e monitoramento ambiental, na
avaliação da saúde dos ecossistemas aquáticos tanto com relação à presença
quanto aos efeitos de poluentes (Carajaville et al., 2000; Silva et al., 2001; Nasci et
al., 2002; Svärdh, 2003; Amado et al., 2003 e 2006; Joyeux et al., 2004; Medeiros et
12
al., 2005; Oliveira Ribeiro et al., 2005; Binelli et al., 2006; Rabitto et al., 2005; Nigro et
al., 2006; Teles et al., 2006; Zanette et al., 2006).
3. BIOMONITORAMENTO
Através de programas de monitoramento é possível identificar e
acompanhar impactos antropogênicos em determinadas áreas ao longo do
tempo (Lange, 1996). Inicialmente os estudos de monitoramento enfocavam a
detecção de contaminantes no compartimento abiótico de ambientes
aquáticos (coluna d’água e sedimento) (Van der Oost et al., 1996; Rainbow et al.,
1995; Silva et al., 2001), posteriormente começou-se a avaliar a presença de
xenobiontes nos componentes bióticos desses contaminantes (Kehrig et al., 1998;
Schmitt et al., 1999; Watanabe et al., 1999). Alguns autores como Meyer et al.
(1998), Silva et al. (2001), Joyeux et al. (2004), Pereira e Kuch (2005) e Silva et al.
(2006) relatam a presença de contaminantes em águas costeiras brasileiras.
Estudos de biomonitoramento direcionados a detecção e avaliação de
efeitos em organismos vivos são bem mais recentes (Doran et al., 2001; Barreiro et
al., 2002; Nasci et al., 2002; Monteiro et al., 2005; Munteanu e Munteanu, 2006) e
vêm sendo bastante utilizados em ambientes estuarinos e marinhos na Europa e
América do Norte (Nasci et al., 2002; Petrovic et al., 2004; Munteanu and
Munteanu, 2006; Nigro et al., 2006). Na costa brasileira ainda são escassos os
dados relativos à biomonitoramento, estes estudos foram recentemente inciados
e vêm sendo realizados mais intensamente nos últimos anos (Ventura et al., 2002;
Lemos et al., 2005; Martins et al., 2005; Amado et al., 2006; Camargo and
Martinez, 2006; Zanette et al., 2006), como o projeto RECOS financiado pelo
13
Ministério da Ciência e Tecnologia através do Instituto do Milênio, do qual faz
parte o presente trabalho.
O Projeto Instituto do Milênio - RECOS - Uso e Apropriação dos Recursos
Costeiros, é um projeto amplo, aprovado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia
(Dez/2001), e financiado pelo Banco Mundial, no qual estão envolvidas diversas
instituições brasileiras: FURG, CECO (UFRGS); UNISUL, CLIMERH/EPAGRI (SC), UFSC,
UFPR, IAG (USP), UFFL, UFES, UFRPE, UFPE, UFMA, UFPA e Museu Goeldi.
Quatro grandes áreas temáticas constituíram o Projeto Instituto do Milênio:
(1) Modelo Gerencial da Pesca, (2) Maricultura Sustentável, (3) Monitoramento,
Modelagem, Erosão e Ocupação Costeira e (4) Qualidade Ambiental e
Biodiversidade. Na área temática Qualidade Ambiental e Biodiversidade do
Projeto Instituto do Milênio está inserido o programa Qualidade Ambiental –
Biomarcadores, que realizou estudos em 5 regiões da costa brasileira nos estados
do Pará (PA), Pernambuco (PE), Espírito Santo (ES), Paraná (PR) e Rio Grande do
Sul (RS).
O presente trabalho está inserido no programa acima citado, que objetivou
avaliar e comparar cinco diferentes regiões da costa brasileira impactadas por
atividades antropogênicas, através da utilização de diferentes classes de
biomarcadores, bem como estabelecer e padronizar metodologias que possam
ser efetivamente aplicadas em estudos de biomonitoramento em regiões
costeiras do Brasil.
14
4. BIOMARCADORES
Biomarcadores são respostas bioquímicas, fisiológicas ou parâmetros
morfológicos alterados, causados pela exposição de um organismo a um
determinado xenobionte (Melancon, 1995). Os biomarcadores também podem ser
definidos como alterações biológicas em nível molecular, celular e fisiológico, as
quais expressam a exposição e os efeitos tóxicos causados pelos poluentes (Walker
et al., 1996).
Alguns critérios devem ser avaliados na definição de biomarcadores a
serem utilizados em um estudo: especificidade, o biomarcador deve demonstrar
o efeito específico de um determinado contaminante no funcionamento de um
determinado órgão alvo e/ou de estrutura vital; fácil reprodutibilidade
(metodologia e logística acessível) e ainda, clareza na interpretação dos
resultados, de forma que seja possível diferenciar resultados devidos à exposição
aos contaminantes de oscilações fisiológicas normais (Stegeman et al., 1992;
Bainy, 1993).
A utilização de biomarcadores em estudos de toxicologia apresenta
várias vantagens, pois permite: (1) detectar precocemente a existência de
contaminação por substâncias tóxicas biologicamente significativas, (2)
identificar espécies ou populações em risco de contaminação, (3) avaliar a
magnitude da contaminação, e (4) determinar o grau de severidade dos efeitos
causados pelos contaminantes (Stegeman et al., 1992).
Segundo Oost et al. (2003), biomarcadores podem ser classificados como:
(1) Biomarcadores de efeito, constituem parâmetros mensuráveis em
compartimentos celulares que permitem inferir efeitos prejudiciais ou adversos
15
aos organismos; como a indução das enzimas CYP1A1 e CYP1A2 do citocromo
P450 na presença de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. (2) Biomarcadores
de exposição, através dos quais é possível detectar e/ou quantificar a presença
do xenobionte, seus metabólitos ou sua associação a componentes celulares ou
moleculares do organismo; como a detecção de metábólitos na bile em animais
expostos a HPAs. Há ainda biomarcadores inespecíficos, que respondem a vários
contaminantes e podem ser utilizados como indicadores gerais de exposição. Os
biomarcadores inespecíficos, como avaliação de lesões histopatológicas e
índices somáticos, auxiliam na detecção da presença e efeito de xenobiontes
em ambientes aquáticos, sendo altamente recomendada sua utilização em
estudos de biomonitoramento ambiental e diagnóstico de áreas impactadas.
Neste estudo os biomarcadores serão classificados, segundo Adams et al (1989),
de acordo com nível de organização biológica em biomarcadores somáticos,
bioquímicos e morfológicos.
A avaliação de contaminação de ambientes aquáticos através de
biomarcadores tem sido bastante utilizada em estudos de biomonioramento,
porém a maioria dos estudos tem avaliado apenas um único nível de
organização biológica (Sturm et al., 1999; Coughlan et al., 2002; Lionetto et al,
2003; Galloway et al., 2004; Binelli et al., 2006; Zanette et al., 2006). A utilização de
biomarcadores pertencentes a dois ou mais níveis de organização biológica
como realizado por Noaksson et al., 2005; Amado et al. 2006, Camargo e
Martinez (2006) e no presente estudo, possibilita a obtenção de diferentes tipos
de respostas que podem ser comparadas e confrontadas. Este tipo de
abordagem proporciona um diagnóstico mais preciso e confiável da situação da
16
área estudada e representa a tendência atual em estudos de
biomonitoramento.
5. CINÉTICA DE CONTAMINANTES EM ORGANISMOS AQUÁTICOS COMO
FERRAMENTA PRÉVIA A ESTUDOS DE BIOMONITORAMENTO
Organismos aquáticos são capazes de absorver, e bioacumular
contaminantes presentes na água ou alimento (Akaishi et al. 2004).
Através da cinética de contaminantes é possível compreender as vias de
absorção e distribuição de contaminantes em organismos aquáticos (Arukwe et
al., 1999; Rouleau et al., 1999; Inza et al., 2001; Fowler et al., 2004; Bianchini et al.,
2005; Edginton and Rouleau, 2005; Wood et al., 2002). Este tipo de estudo fornece
subsídios aos estudos de biomonitoramento, pois identifica de forma mais precisa
tecidos e órgãos alvos.
A autoradiografia (WBARG - whole-body autoradiography) é uma
metodologia que vem sendo muito utilizada em estudos de cinética, pois permite
quantificar e qualificar a presença e distribuição de contaminantes através de
organismos expostos a xenobiontes radioativamente marcados. A cinética de
alguns contaminantes como zinco, cádmio (Inza et al., 2001; Rouleau et al., 1998
e 2001; Fowler et al., 2004), mercúrio (Rouleau et al., 1998 e 1999), mercúrio
inorgânico e metilmercúrio (Oliveira Ribeiro et al., 1999), prata (Wood et al., 2002;
Fowler et al., 2004; Bianchini et al., 2005), nonilfenol (Arukwe et al., 1999), tributil-
estanho (Rouleau et al., 1999 e 2003) e bifenilas policloradas (PCBs) (Fowler et al.,
2004) em peixes já foram avaliadas através de WBARG. No entanto há uma
17
grande quantidade de contaminantes que ainda não tiveram seus potenciais de
absorção, bioacumulação e eliminação elucidados.
Esta tese foi estruturada em 3 capítulos, os capítulos I e II trazem os resultados
obtidos em um estudo de biomonitoramento em três regiões da costa brasileira
utlizando três organismos biondicadores e um abordagem de múltiplos
biomarcadores, o capítulo III traz uma abordagem cinética de alguns derivados
de baixa massa molecular de petróleo e também apresenta uma simulação de
derramamento de petróleo em laboratório como uma nova abordagem para
estudo dos efeitos da fração solúvel do petróleo na água.
18
CAPÍTULO I
BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL EM
PEIXES NOS ESTUÁRIOS BRASILEIROS DE PARANAGUÁ
(PR), PIRAQUÊ-AÇÚ (ES) E ITAMARACÁ (PE)
COLABORAÇÃO:
Patrícia de Souza Diogo
Michelle da Cunha Torres
Manuela Dreyer da Silva
Prof. Dra. Helena Cristina da Silva de Assis
Publicação relacionada:
Valdez Domingos, F.X.; Silva de Assis, H.C.; Silva, M.D.; Damian, R.C.; Almeida, A.I.
M.; Cestari, M.M.; Randi, M.A.F.; Oliveira Ribeiro, C.A.
Biomonitoring of Estuarine
Areas in the Brazilian Coast: a Multi-Biomarker Approach. Manuscrito submetido a
revista Ecotoxicology and Environmental Safety.
19
I. 1. INTRODUÇÃO
Despejos urbanos, agrícolas e industriais representam as principais fontes de
contaminação em rios, estuários e oceanos (De la Torre et al. 2005; Nigro et al.
2006). Poluentes como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), bifenilas
policloradas (PCBs), compostos organoclorados (OCs) e metais pesados estão
entre as principais classes de contaminantes que são frequentemente
encontrados nestes ecossistemas (Oliveira Ribeiro et al., 2005; Munteanu e
Munteanu, 2006; Nigro et al. 2006).
Para medir efeitos agudos e crônicos de contaminantes no ambiente
alguns parâmetros como crescimento, fator de condição, índice
gonadossomático e hepatossomático podem ser avaliados (Deviller et al., 2005;
Teles e Santos, 2006).
Lesões histopatológicas e alterações em atividades enzimáticas são alguns
dos efeitos relatados em estudos prévios em organismos aquáticos em áreas
impactadas (Akaishi et al., 2004; Mouchet et al. 2006). A ocorrência de danos
celulares e teciduais em fígado e brânquias de peixes ambientalmente expostos
a HPAs, PCBs, metais pesados, esgoto, efluentes portuários e industriais tem sido
descrita por vários autores (Stentiford et al., 2003; Norena-Barroso et al., 2004;
Oliveira Ribeiro et al., 2005). Além desses efeitos, a avaliação da atividade da
colinesterase (Dellali et al., 2001; Tortelli et al., 2006; Quintaneiro et al. 2006)
representa um parâmetro bastante utilizado em programas de monitoramento
ambiental.
20
Estudos que avaliam o impacto das atividades humanas em áreas costeiras
brasileiras tem aumentado recentemente principalmente nas regiões sul e
sudeste (Joyeux et al., 2004; Medeiros et al., 2005; Pereira e Kuch, 2005; Lemos et
al., 2005; Martins et al., 2005; Amado et al., 2006; Camargo e Martinez, 2006; Silva
et al., 2006; Umbuzeiro et al., 2006; Zanette et al., 2006), mas não há registros de
estudos comparativos entre áreas costeiras brasileiras nem investigações que
utilizem diferentes classes de biomarcadores. Aqui no Brasil, assim como em outros
países, os impactos ambientais em áreas costeiras representam causa de
preocupação no que se refere aos efeitos de poluentes na saúde dos organismos
aquáticos e na qualidade dos alimentos de origem marinha e estuarina.
O Projeto Instituto do Milênio - RECOS - Uso e Apropriação dos Recursos
Costeiros (vide introdução geral) objetivou avaliar e comparar cinco diferentes
regiões da costa brasileira impactadas por atividades antropogênicas, através da
utilização de diferentes classes de biomarcadores, bem como estabelecer e
padronizar metodologias que possam ser efetivamente aplicadas em estudos de
biomonitoramento em regiões costeiras do Brasil.
O objetivo deste capítulo foi avaliar comparativamente três regiões
estuarinas impactadas por ocupação humana devido à liberação de efluentes
industriais e urbanos e também por atividades portuárias que ocorrem ao longo
da costa brasileira, empregando-se diferentes classes de biomarcadores como
índices somáticos, histopatologia e neurotoxicidade em duas espécies de peixes.
21
I.2. MATERIAIS E MÉTODOS
I.2.1. ESPÉCIES BIOINDICADORAS
O bagre amarelo, Cathorops spixii (Siluriformes, Ariidae) habita áreas
costeiras marinhas, estuários, lagoas e desembocaduras de rios, podendo ser
encontrado até em águas hipersalinas. Esta espécie distribui-se desde Belize
(América Central) até o sul do Brasil, podendo ser encontrado em profundidades
de até 50 m (Figueiredo e Menezes, 1978). Os adultos podem apresentar
comprimento total máximo de 30 centímetros (Fishbase, 2006). Esta espécie de
bagre é abundante na Baía de Paranaguá (Fávaro et al. 2005), e
economicamente importante na pesca artesanal da região sul do Brasil. C. spixii
apresenta hábito carnívoro e utiliza invertebrados e pequenos peixes como itens
principais de sua dieta (Fishbase, 2006).
O vermelho arioco, Lutjanus synagris (Perciformes, Lutjanidae) apresenta
registros de ocorrência desde o atlântico oeste (Carolina do Norte, USA) até o
sudeste do Brasil, incluindo o golfo do México e o Caribe. Esta espécie pode
encontrar-se associada a diferentes tipos de substrato, desde áreas de recifes de
coral até áreas lodosas; alimenta-se em geral a noite de invertebrados
bentônicos e pequenos peixes e pode atingir até 60 cm de comprimento total na
fase adulta (Fishbase, 2005).
I.2.2. ÁREAS DE ESTUDO E ESTRATÉGIA AMOSTRAL
O projeto foi desenvolvido em três regiões da costa brasileira: nos estados
de PE, ES e PR (Figura 1). As coletas foram realizadas através de rede de arrasto
pelos integrantes da área temática de Biodiversidade, pertencentes ao Projeto
22
Instituto do Milênio – RECOS, nas universidades envolvidas em cada região (UFPR-
CEM em Paranaguá, UFES em Piraquê-Açu, UFPE e UFRPE em Itamaracá).
Para as amostragens foram escolhidas duas áreas em cada estuário (Figura
1). A área contaminanda (C) representa a área mais próxima as fontes de
impacto antrópico e área referência (R) constitui uma área afastada da
influência de atividades humanas. Em cada uma dessas áreas foram coletados
dez indivíduos de cada espécie nas duas estações amostrais: inverno (agosto de
2003) e verão (fevereiro de 2004). Alguns parâmetros fisico-químicos (salinidade,
temperatura e pH) foram coletados durante as amostragens.
23
Figura 1. Localização geográfica dos pontos referência (R) e contaminado (C) nas três regiões
estuarinas avaliadas na costa brasileira. Adaptado de Zanette et al. 2006.
I.2.2.1. Itamaracá - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE
A Baía de Itamaracá onde está localizado o Complexo Estuarino Canal de
Santa Cruz (Figura 1) está situada no nordeste do Brasil, 40 km ao norte de Recife,
Pernambuco (7º34´-7º55´S; 34º49´-34º52´W, Meyer et al., 1998). Existem duas
estações bem definidas na região: a estação seca, compreendida entre
setembro a janeiro, e a estação chuvosa, que ocorre entre fevereiro e agosto. O
rio Botafogo é o principal rio que desemboca no Canal de Santa Cruz, e segundo
Meyer et al. (1998), até 1991 recebeu grande aporte de mercúrio proveniente de
uma fábrica de soda cáustica na região (Cavalcanti, 2003).
Atualmente ainda existem fábricas de soda cáustica operando na região
do canal de Santa Cruz, também há fábricas de cloro e papel bem como de
plantações de cana-de-açúcar (Manuel de Jesus Flores Montes, membro da
UFPE e participante do Projeto do Milênio-RECOS, comunicação pessoal). Além
do aporte de efluentes industriais e agrícolas é muito provável que esgotos
urbanos estejam chegando ao Canal de Santa Cruz.
O ponto C no Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz localiza-se no rio
Botafogo (7º40’047”S; 34º51’486”W). No rio Carrapicho, considerado isento de
impacto antropogênico, foi determinanda a área R (7º43’042”S; 34º53’383”W). A
precipitação média mensal de chuvas em agosto permaneceu na faixa de 100 a
150mm enquanto que em fevereiro atingiu a faixa de 150 a 200mm (CPTEC,
2005).
24
I.2.2.2. Piraquê - Sistema Estuarino dos rios Piraquê–Açu e Piraquê-Mirim - ES
Situado no distrito de Santa Cruz em Aracruz, Espírito Santo encontra-se o
Sistema Estuarino dos rios Piraquê–Açu e Piraquê-Mirim (Figura 1). Este estuário
apresenta 65 km de extensão e área de 73,38 km
2
, estando apenas 2,25% de sua
área protegida pela Reserva Biológica de Manguezais dos rios Piraquê–açú e
Piraquê-mirim (Luiz Fernando Loureiro Fernandes, membro da UFES e participante
do Projeto do Milênio-RECOS, comunicação pessoal). Segundo Luiz Fernando
Loureiro Fernandes (comunicação pessoal), o manguezal do rio Piraquê-mirim
avança aproximadamente 9 km em direção ao continente, enquanto o rio
Piraquê–açú avança cerca de 13 km, representando o maior avanço de maré
do Espírito Santo. As épocas de maior ocorrência de precipitação estão
compreendidas entre outubro e maio nesta região, não havendo estação seca
pronunciada na região (Cuzzuol e Lima, 2003).
No município de Aracruz há uma indústria de fabricação de celulose de
fibra curta e branqueada de eucalipto (que é utilizada como matéria prima para
produção de papel) que é reconhecida como a maior do mundo no gênero, e
que está em plena atividade desde 1978. Associado a esta indústria existe um
terminal portuário privativo especializado no transporte da celulose exportada,
que embarca 2 milhões de toneladas que vão para os Estados Unidos, Europa e
Ásia e 900 mil toneladas produzidas por outra indústria localizada em Minas
Gerais, que concentra suas vendas para o Japão e Ásia. Ainda nesta região
existem indústrias de produção de peróxido de hidrogênio, metal-mecânicas e
eletrônicas (Prefeitura de Aracruz, 2005). Além das atividades industriais existe
ainda atividade agrícola expressiva (IBGE, 2005) e aporte de esgoto da cidade
25
de Aracruz. De acordo com as atividades acima descritas espera-se que os
principais contaminantes presentes no Sistema Estuarino dos rios Piraquê–açú,
onde está localizada a área C (19°55'20,22"S; 40°11'31,24"W), sejam metais,
organoclorados, pesticidas e esgoto doméstico. O ponto R está situado no rio
Piraquê-mirim (19°56'14,67"S; 40°12'42,33"W).
I.2.2.3. Paraná - Complexo Estuarino Baía de Paranaguá
O Complexo Estuarino Baía de Paranaguá (25º16’34”S; 48º17’42”W, Figura
1) constitui o maior estuário do Paraná, estendendo-se aproximadamente 50 km
para o interior do continente (Kolm et al., 2002). Às margens deste estuário
localiza-se a cidade de Paranaguá, cuja população é estimada em mais de
140.000 pessoas (IBGE, 2005). Kolm et al. (2002), citam que a região ainda não
possui tratamento de esgotos adequado, sendo a maior parte do esgoto urbano
lançado em dois rios da região: Itiberê e Emboguaçú. Além do esgoto urbano,
existe ainda o aporte de fertilizantes, pesticidas e efluentes industriais gerados
pelas atividades agropecuárias e industriais da região, respectivamente.
O Porto de Paranaguá é considerado o maior porto do Sul do Brasil e possui
expressiva participação na exportação de granéis sólidos, principalmente de
soja, na América Latina. Em 2002 e 2003, os principais produtos exportados foram
grãos e as principais importações foram fertilizantes (Portos do Paraná, 2005).
Além de resíduos dos produtos importados e exportados, a região do porto está
diretamente exposta à presença de combustíveis devido ao fluxo de
embarcações. As influências antrópicas regionais sugerem a presença de metais,
26
hidrocarbonetos, pesticidas e grande aporte orgânico no Complexo Estuarino
Baía de Paranaguá.
No complexo Estuarino Baía de Paranaguá o ponto C (25º19’430” S;
48º29’690” W) situa-se na região próxima ao terminal de carga/descarga
portuária de fertilizantes de Paranaguá (Fospar), onde há o aporte de efluentes
industriais, resíduos de combustíveis (devido ao intenso tráfego de navios) e
resíduos de mercadorias carregadas/descarregadas no Porto de Paranaguá. O
ponto R está situado na Baía de Laranjeiras (25º31’271” S; 48º29’690” W; Figura1).
I.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS
Imediatamente após a coleta os peixes foram acondicionados em caixas
isotérmicas (contendo água do local de captura) providas de aeração
constante e transportados ao laboratório.
Os peixes foram anestesiados com ácido-etil éster-3-aminobenzóico (MS
222) à 0,02% e as medidas de peso total (g), comprimento total (cm) e peso do
fígado foram tomadas, previamente à dissecção.
I.2.4. BIOMARCADORES SOMÁTICOS
Os fígados coletados foram pesados (P) e os índices somáticos calculados
segundo as seguintes fórmulas: IHS = índice hepatossomático [(P
fígado
/P
peixe
)] x 100
e o fator de condição, FC = P
peixe
/C
b
, onde b é o coeficiente angular da relação
peso-comprimento (C = comprimento total).
27
I.2.5. BIOMARCADORES MORFOLÓGICOS
I.2.5.1. Avaliação Histopatológica
Fígado e brânquias dos animais coletados foram fixados em Alfac (Etanol,
formol e ácido acético), desidratados e incluídos em Paraplast (Sigma©). O
índice de lesões utilizado na avaliação do material foi descrito por Bernet et al.
(1999), para a aplicação deste índice é necessário atribuir um valor númerico a
cada lesão observada (0, 2, 4 ou 6), esse valor deve ser multiplicado por um valor
de fator de importância apresentado por Bernet et al. (1999) e exemplificado na
tabela 1 (1, 2 ou 3), dessa forma é obtido um índice para cada tipo de lesão em
cada órgão avaliado, todos os índices de cada órgão são somados obtendo-se
assim um índice por órgão. A ocorrência de melanomacrófagos foi avaliada de
acordo com Rabitto et al. (2005), de acordo com esta metodologia centros de
melanomacrófagos e melanomacrófagos livres são contados em 15 campos de
cada lâmina.
Tabela 1. Exemplos de fatores de importância utilizados no cálculo do índice de lesões segundo
Bernet et al. (1999).
Órgão
Lesão
Fator de
Importância
Brânquias descolamento de epitélio 1
fusão de lamelas 2
hiperplasia 2
desorganização de lamelas secundárias 1
neoplasias 2
Fígado Necrose 3
infiltrações de leucócitos 2
vacuolização de hepatócitos 1
28
I.2.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão
As brânquias dos peixes e os fragmentos de fígado foram fixados em
Glutaraldeído 2,5%, Paraformaldeído 2%, CaCl
2
2,5 mM, NaCl em tampão
cacodilato 0,1 M pH 7,2-7,4 por duas horas, emblocados em resina PoliEMBED 812
(Electron Microscopy Sciences©) e analisados no microscópio eletrônico de
transmissão (MET) JEOL – 1200.
I.2.5.3. Microscopia Eletrônica de Varredura
As brânquias foram fixadas em 3% glutaraldeído, 0,1 M cacodilato de sódio,
pH 7,2 - 7,4 desidratadas com etanol (Merck®) submetidas ao ponto crítico (CO
2
),
e observadas no microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-6360LV.
I.2.6. BIOMARCADOR BIOQUÍMICO - AVALIAÇÃO DA COLINESTERASE
Fragmentos de músculo branco sem pele e sem sangue foram coletados
da região dorsal dos peixes e congelados. No laboratório as amostras de músculo
foram homogenizadas (5% p/v) em tampão fosfato (0,05 M à 4° C ) com 20% de
glicerol pH 7,0 e centrifugados a 850 x g (4° C) por 15 min. O sobrenadante foi
centrifugado novamente a 12.800 x g (4° C) por 15 min e utlizado como fonte de
enzima. 9mM de iodeto de acetiltiocolina (AcSCh) foram utilizados na realização
dos ensaios. A atividade colinesterásica foi analisada de acordo com Ellman et al.
(1961), com adaptações para microplaca, e a concentração de proteínas foi
determinada segundo o método de Bradford (1976).
29
I.2.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS DADOS
Dois tipos de comparação foram realizadas. A avaliação de
contaminação foi feita através da comparação da área contaminada e
referência em cada estuário, exceto para Itamaracá que foi comparada com a
área de referência de Paranaguá. Comparações sazonais também foram
realizadas em cada um dos estuários avaliados. Os dados de histopatologia
foram comparados através do teste Mann-Whitney. Os parâmetros cinéticos
enzimáticos (Vmax e Km) foram estimados pela equação de Michaelis-Menten; e
a atividade enzimática foi avaliada através de teste T de “student”. Índices
somáticos e ocorrência de melanomacrófagos foram avaliados através de teste
T. A correlação entre peso, comprimento dos peixes e atividade da colinesterase
foi analisado através da correlação de Pearson. O teste Kruskal-Wallis foi utilizado
nas comparações sazonais (Zar, 1984). O nível de significância considerado foi de
0,05.
30
I.3. RESULTADOS
Nos estuários de Paranaguá e Itamaracá foi coletada a espécie Cathorops
spixii, como esta espécie não ocorre no complexo estuarino Piraquê-Açú, foi
necessário definir outro bioindicador para esta área. Por apresentar hábito
alimentar carnívoro e ser abundante na área de interesse, Lutjanus synagris foi a
espécie selecionada como bioindicadora para amostragem no complexo
estuarino Piraquê-Açú.
Os parâmetros físico-químicos obtidos durante as amostragens são
apresentados na Tabela 2. Diferenças expressivas de temperatura entre verão e
inverno foram detectadas apenas em Paranaguá. Itamaracá apresenta uma
estação seca e uma estação chuvosa bem definida em fevereiro e agosto,
respectivamente.
Tabela 2. Parâmetros físico-químicos da água nos três estuários avaliados.
Áreas Estudadas Pontos Inverno Verão
T (°C) S (ppm) pH T (°C) S (ppm) pH
Itamaracá Contaminado 28 21,7 7,8 29.9 13,7 8,1
Piraquê Referência 23,9 35 6,1 29,7 20,8 10,1
Contaminado 24,1 33,5 7,1 28,7 17,6 11,3
Paranaguá Referência 20 25 8,0 28 20 8,2
Contaminado 22 23 7,9 28 17 8,4
T = Temperatura; S = Salinidade
I.3.1. INDICES SOMÁTICOS
Os índices IHS e FC são apresentados na Tabela 3. Comparando-se as áreas
referência e contaminada de cada estuário durante o inverno ou verão
observou-se fator de condição similar nos indivíduos entre as áreas referência (R)
31
e contaminada (C) em Paranaguá no inverno, enquanto o IHS apresentou
valores mais altos na área contaminada no verão. Em Piraquê valores mais altos
no FC foram encontrados na área contaminada durante o inverno. Tanto o IHS
quanto o CF foram similares em Piraquê durante o verão. Quando comparado
com a área referência de Paranaguá os valores de IHS de Itamaracá
apresentaram-se menores no inverno e maiores no verão.
Através de comparações sazonais em cada estuário, foi observado que no
ponto R de Paranaguá o IHS apresentou valores maiores no inverno e o FC foi
similar. Na área referência de Piraquê o FC foi maior no verão e o IHS não variou
sazonalmente. Todos os índices apresentaram valores similares nas áreas
Paranaguá C e Piraquê C entre as estações. Em Itamaracá C o IHS foi mais alto
no verão enquanto o FC foi similar entre as estações.
Figura 2. Índice hepatossomático (IHS), e fator de condição (FC) de peixes coletados em três
estuários brasileiros, n=10. * Indica diferença entre referência e contaminado, **indica dferença
na mesma área amostral entre inverno e verão (p<0,05, Teste T).
32
I.3.2. HISTOPATOLOGIA DE BRÂNQUIAS
Descolamento de epitélio, fusão de lamelas, hiperplasia, desorganização
de lamelas secundárias e neoplasias foram as lesões mais relevantes observadas
nas brânquias (Figura 3). O descolamento de epitélio é caracterizado pelo
descolamento de células epiteliais na lamela secundária (Figura 3C). Áreas de
fusão de lamelas estão frequentemente associadas com hipertrofia e
proliferação de células mucosas (Figura 3D). A fusão integral e parcial base das
lamelas secundárias identificada através de microscopia de luz foi confirmada
pela análise ao MEV (Figura 3F e G).
As lesões histopatológicas nas brânquias apresentaram ocorrência similar
entre os pontos R e C de Paranaguá, Piraquê e Itamaracá no inverno e em
Piraquê no verão (Figura 4). Os peixes coletados nas áreas contaminadas de
Paranaguá e Itamaracá no verão que apresentaram índices de lesão menores
do que na área referência de Paranaguá (Figura 4).
I.3.3. HISTOPATOLOGIA DE FÍGADO
Necroses, infiltrações de leucócitos e vacuolização de hepatócitos foram
as lesões mais expressivas identificadas no fígado das espécies estudadas (Figura
5). Proliferação do retículo endoplasmático (Figura 5B) e a presença de
numerosos grânulos elétron densos nos hepatócitos (Figura 5C e E) foram
observados através de MET. As necroses observadas através de microscopia de
luz também foram visualizadas através de MET como focos de necrose (Figura 5D,
E, F). Na coleta de inverno os animais amostrados no ponto R de Paranaguá
apresentaram índice de lesões hepáticas maior que as áreas C de Paranaguá e
33
Itamaracá, enquanto a ocorrência de lesões hepáticas foi similar entre os pontos
R e C em Piraquê (Figura 6). No verão os indivíduos coletados em Paranaguá
apresentaram índices de lesões similares entre os pontos R e C, enquanto em
Piraquê foi detectado maior índice de lesões no ponto R. As lesões hepáticas
detectadas nos animais coletados em Itamaracá foram similares as do ponto R
de Paranaguá no verão (Figura 6).
Melanomacrófagos (MM) podem ser visualizados como células
pigmentadas ou grupos de células pigmentadas que são denominados centros
de melanomacrófagos (CMM) em órgãos como fígado, rim anterior e intestino de
peixes. Seu material granular apresenta coloração que oscila entre amarelo e
preto quando corado com hematoxilina e eosina. Os indivíduos coletados no
estuário de Piraquê não apresentaram CMM nem MM hepáticos em ambas as
áreas amostradas (R e C). A ocorrência de CMM foi similar entre os pontos R e C
nos indivíduos amostrados em Paranaguá tanto no inverno quanto no verão,
enquanto a ocorrência de MM foi maior em Paranaguá R apenas no inverno
(Figura 7). Itamaracá apresentou valores menores de MMC e MM quando
comparadas com Paranaguá R no inverno e ocorrência de MM similar à
Paranaguá no verão (Figura 7).
34
Figura 3. Histopatologia de brânquias de peixes das áreas estuarinas avaliadas. (A)
Estrutura normal das brânquias. (B) Dilatação de vasos nas extremidades das lamelas
secundárias e inchaço das células de cloreto. (C) Descolamento de epitélio nas
lamelas secundárias. (D) Fusão de lamelas secundárias, hipertrofia e proliferação de
células de muco (mc). (E) Estrutura normal das brânquias em MEV. Barra = 100μm. (F)
Fusão na base das lamelas secundárias. Barra = 100μm. (G) Fusão completa de lamelas
secundárias. Barra = 200μm. pl= lamela primária, sl= lamela secundária, cc=célula de
cloreto, el=descolamento de epitélio, f=fusão de lamelas secundárias. Barra A, B, C, D
= 50μm. Cathorops spixii: B, C, D, F; Lutijanus synagris: A, E, G.
Figura 4. Índice histopatológico de lesões branquiais de indivíduos coletados
nas áreas estuarinas estudadas (medianas). Diferenças entre as áreas
estudadas são indicadas por letras (p<0,05).
35
Figura 5. Histopatologia de fígado em indivíduos coletados nas áreas
estuarinas avaliadas. (A) Estrutura característica do fígado. (B)
Vacuolização do citosol dos hepatócitos; (C) Presença de diversos
grânulos elétron densos (g) e vacúolos (seta) no citosol dos
hepatócitos; (D) Desorganização citosólica indicativa de necrose; (E)
Área de necrose focal e presença de grânulos elétron densos; (F)
Detalhe da desorganização do citosol (setas); (G) Espaço de Disse (d).
Barra = 50μm. Cathorops spixii: A, B, C, E, F; Lutijanus synagris: D, G.
36
37
I.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE
As espécies estudadas não apresentaram correlação entre os parâmetros:
peso, comprimento e a atividade colinesterásica nas áreas avaliadas. A
atividade enzimática foi mais alta nas áreas C de Paranaguá, Piraquê e
Itamaracá quando comparadas com as respectivas áreas R no inverno (Figura
8A). Durante o verão Piraquê e Paranaguá apresentaram atividade da
colinesterase similar, enquanto Itamaracá C apresentou maior atividade se
comparado com Paranaguá R (Figura 8B). A atividade da colinesterase
apresentou-se mais elevada nos indivíduos coletados no inverno se comparados
aos coletados no verão em todas as áreas estudadas (Figura 8A e B).
38
I.4. DISCUSSÃO
Estudos de biomonitoramento são geralmente focados em uma única ou
em poucas áreas de rios, estuários ou lagoas, a utilização de biomarcadores
nestes estudos é frequentemente restrita a uma ou poucas classes de
biomarcadores (Shailaja e Silva, 2003; Petrovic et al., 2004; de la Torre et al., 2005;
Oliveira Ribeiro et al., 2005; Munteanu e Munteanu, 2006; Nigro et al., 2006). Este
trabalho apresenta respostas de três classes de biomarcadores (somáticos,
histopatológicos e bioquímicos) de três diferentes áreas estuarinas impactadas
por atividades humanas ao longo da costa brasileira.
Um dos parâmetros de avaliação dos organismos neste estudo foi a
aplicação de índices somáticos, como utlizado por outros autores (Khan et al.
1994, Karels et al., 1998; Couillard et al., 1999; Oliveira Ribeiro et al., 2005). Segundo
Huuskonen e Lindstrom Seppa (1995) e Teles et al. (2006) IHS pode indicar estado
metabólico alterado em peixes. Alguns estudos reportam que animais coletados
em áreas contaminadas frequentemente apresentam aumento no IHS e
decréscimo no FC (Adams e Ryon, 1994; Karels et al., 1998; van der Oost et al.,
1996), um aumento no IHS foi observado na área C de Paranaguá durante o
verão, porém o FC permaneceu similar ao da área referência. Como Cathorops
spixii apresenta hábito alimentar carnívoro é possível que esteja ocorrendo
biomagnificação e bioacumulação de poluentes nesta espécie, estes fenômenos
poderiam estar associados aos altos valores IHS observados em Paranaguá e
Itamaracá durante o verão. Segundo Soimasuo et al. (1995), Felder et al. (1998) e
de la Torre et al. (2005), indivíduos expostos a contaminantes podem apresentar
baixos valores de FC como também índices similares entre os grupos avaliados,
39
como foi observado neste trabalho em Paranaguá em ambas estações sazonais
e em Piraquê no verão. Incrementos no FC nos indivíduos de Piraquê no inverno
podem ser atribuídos a uma maior disponibilidade de alimento que ocorre nesta
estação, especialmente em ecossistemas tropicais (Townsend et al., 2006).
Lesões histopatológicas tem sido frequentemente descritas como
importantes ferramentas em estudos de biomonitoramento devido à facilidade
de interpretação tanto em situações de exposição aguda quanto crônica
(Wester et al., 1991; Couillard et al., 1999; Wester et al., 2002; Gül et al., 2004;
Oliveira Ribeiro et al., 2005). Assim como relatado neste trabalho, a ocorrência de
lesões branquiais e hepáticas em animais expostos ambientalmente a
contaminantes tem sido reportada em organismos aquáticos por outros autores
como Gül et al. (2004), Lyons et al. (2004), Noreña-Barroso et al. (2004) e Oliveira
Ribeiro et al. (2005).
A presença de lesões nas brânquias de peixes pode ser interpretada como
resultado de efeitos agudos de xenobiontes (Zodrow et al. 2004). Neste estudo a
ocorrência de fusão de lamelas foi detectada em todas as áreas avaliadas. A
ocorrência de fusão lamelar já foi relacionada por alguns autores à fontes de
contaminação específica como: efluente de indústria de papel clorado
(Pacheco e Santos, 2002; Valdez Domingos, 2001), cobre (Arellano et al., 1999) e
efluente de esgoto com tratamento secundário (Coutinho and Gokhale, 2000,
Valdez Domingos, 2001). O descolamento de epitélio observado neste estudo
também foi relatado por Arellano et al. (1999) e Fanta et al. (2003) em peixes
expostos a cobre e organofosforados, respectivamente. Tanto o descolamento
de epitélio quanto a fusão de lamelas aumenta a distância entre as células
40
epiteliais e os capilares sanguíneos causando prejuízo nas trocas gasosas e
também pode levar à distúrbios na osmorregulação, mecanismos essenciais à
sobrevivência de peixes. A ocorrência de proliferação nas células de muco
observada em indivíduos de diferentes áreas está relacionada a um mecanismo
de proteção em situações de injúria causada por contaminantes aquáticos ou
respostas de estresse devido a exposições agudas e/ou crônicas, ocorre uma
maior secreção de muco nestas situações a fim de minimizar o contato do tecido
afetado com a água. Hipertrofia celular e tecidual podem ser indicativas de
disfunção celular e podem levar ao desenvolvimento de neoplasias em situação
de exposições crônicas a certos poluentes como HPAs, pesticidas clorados ou
PCBs (Ali e Sreekrishnan, 2001; Shailaja e Silva, 2003).
Devido aos processos de absorção e metabolização as lesões observadas
no fígado estão relacionadas à exposição crônica a poluentes. A ocorrência de
áreas de necroses foi a lesão hepática mais evidente neste estudo, este tipo de
lesão tem sido registrada em peixes de áreas impactadas por múltiplos
contaminantes (Simpson et al., 2000; Pacheco e Santos, 2002; Schmalz et al., 2002;
Marty et al., 2003; Stehr et al., 2003; Stentiford et al., 2003; Oliveira Ribeiro et al.,
2005). No presente trabalho a presença de necroses em indivíduos das áreas
referência e contaminadas representa um indicativo de que os estuários estão
impactados, o que poderia ser confirmado através de análises químicas de biota,
água e sedimento nestas áreas. Este tipo de lesão causa prejuízos funcionais e
estruturais no fígado de peixes (Stentiford et al., 2003), diminui a funcionalidade,
podendo causar a falência do órgão e consequentemente afetar maiores níveis
de organização biológica (Rabitto et al., 2005). Embora a ocorrência de áreas
41
necróticas não tenha correlação específica com um determinado
contaminante, a ocorrência de necrose tem sido frequentemente observada em
áreas estuarinas associadas à presença de contaminantes como HPA’s (Stentiford
et al., 2003), pesticidas clorados (Oliveira Ribeiro et al. 2005), metais pesados
(Schmalz et al., 2002), organofosforados (Fanta et al., 2003), efluente de indústria
de papel clorado e ácido dehidroabiético (Pacheco e Santos, 2002). A presença
de vesículas lipídicas observada no fígado de indivíduos das áreas estudadas
sugere um mecanismo de imobilização de compostos lipofílicos como descrito
por Oliveira Ribeiro et al. (2005) em Anguilla anguilla ambientalmente exposta a
pesticidas clorados, HPAs e PCBs.
A incidência de melanomacrófagos (CMM ou MM) no fígado e outros
tecidos está relacionada a um aumento na atividade fagocítica como resposta
imune a lesões em indivíduos expostos a contaminantes (Couillard et al., 1999;
Mondon et al., 2001; Oliveira Ribeiro et al., 2005; Rabitto et al., 2005). No presente
trabalho a ocorrência de CMM ou MM não apresentou resultados expressivos
para o diagnóstico das áreas estudadas.
Embora as lesões histopatológicas não apresentem relação específica com
os contaminantes este tipo de abordagem tem sido uma ferramenta bastante
utilizada em biomonitoramento na avaliação da qualidade da água de áreas
supostamente impactadas (Wester et al., 2002). As áreas R e C de Paranaguá,
Piraquê e Itamaracá apresentaram índices de lesão branquial e hepático
similares durante o inverno e o verão, indicando que ambas as áreas estão sendo
afetadas pela liberação de compostos químicos nestes estuários em
conseqüência de atividades humanas.
42
A atividade da colinesterase em peixes e outros organismos aquáticos tem
sido utilizada globalmente como biomarcador de contaminação em peixes em
programas de monitoramento por diferentes grupos (Sturm et al., 1999; Monserrat
e Bianchini, 2001; Rodriguez-Fuentes e Gold-Bouchot, 2000; Monserrat et al., 2002;
Ventura et al., 2002; Corsi et al., 2003; Monteiro et al., 2005; Binelli et al. 2006; Tortelli
et al., 2006). A atividade da colinesterase representa um eficiente biomarcador
para detectar efeitos subletais de xenobiontes, principalmente organofosforados,
carbamatos e alguns metais pesados (Sturm et al., 1999; Monserrat e Bianchini,
2001; Silva de Assis et al. 2005; Rabitto et al, 2005), compostos que são reportados
na literatura como inibidores da colinesterase. Além dos contaminantes acima
citados, hidrocarbonetos também podem alterar a atividade da colinesterase
em peixes, inibindo-a em diluições da fração solúvel na água de 15 e 33% na
espécie Astyanax sp. (Akaishi et al., 2004), porém os mecanismos de ação dos
hidrocarbonetos sobre a atividade da colinesterase ainda não foram
esclarecidos. No presente estudo uma maior atividade da colinesterase foi
observada na maioria das áreas C estudadas durante o inverno. A indução da
atividade desta enzima foi também descrita em Puntius conchonius após
exposição a endosulfano em músculo e fígado (Gill et al. 1990). O trabalho
realizado por Tortelli et al. (2006) nas mesmas áreas de estudo mostrou que as
constantes de Michaelis–Menten, Km e Vmax apresentaram diferentes padrões
no cérebro de C. spixii coletado nas áreas R e C de Paranaguá, neste trabalho os
autores sugerem que o complexo reversível enzima-inibidor é mais facilmente
formado em peixes coletados na área C, enquanto a formação do complexo
irreversível enzima-inibidor ocorre com maior facilidade nos animais das áreas R.
43
Embora não tenham sido realizados em amostras de músculo, estes resultados
poderiam ser atribuídos como uma possível hipótese para justificar os menores
valores de atividade da colinesterase observados nestas áreas.
Dados que relacionam a atividade da acetilcolinesterase com variações
de temperatura estão disponíveis apenas para peixes, nestes estudos os autores
atribuem a temperatura como fator responsável pelas diferenças sazonais
observadas na atividade enzimática, apresentando de forma geral maiores
valores de atividade enzimática nas estações mais quentes e vice-versa
(Bocquené e Galgani, 1991; Kirby et al. 2000).
Os resultados apresentados sugerem que os maiores valores na atividade
da colinesterase observada nos espécimens das áreas estudadas no inverno
possam estar relacionados a presença de compostos anticolinesterásicos nas
áreas R, ou de compostos indutores da colinesterase nas áreas C. Acredita-se que
todos os resultados apresentados neste estudo estejam sendo influenciados por
contaminantes como metais pesados, hidrocarbonetos, pesticidas, os quais
infere-se que estejam presentes nas áreas estudadas através da avaliação das
influências antrópicas de cada estuário (item I.2.2.).
De acordo com os dados apresentados, as três regiões estuarinas estão
seriamente impactadas por atividades antropogênicas. Entre os biomarcadores
utilizados a medida da atividade da colinesterase em músculo mostrou-se como
o biomarcador mais eficiente para a realização do diagnóstico das áreas
estudadas. Embora a atividade da colinesterase permita diferenciar as áreas R e
C nos estuários avaliados durante o inverno, as lesões histopatológicas ocorreram
em ambas espécies em todas as áreas e estuários avaliados tanto no inverno
44
quanto no verão, o que sugere um impacto por xenobiontes decorrente de
atividades antrópicas em todas as áreas avaliadas dos três estuários, tanto nas
áreas R quanto nas áreas C, os índices somáticos também sustentam esta
conclusão.
Os presentes dados reforçam a importância da utilização de diferentes
biomarcadores em programas de biomonitoramento e validam a utilização de
lesões histopatológicas como uma resposta sensível e representativa no
diagnóstico de ecossistemas aquáticos impactados.
Os resultados apresentados neste trabalho (índices somáticos,
histopatologia de brânquias e fígado e atividade da colinesterase) podem ser
considerados como respostas de curto e médio prazo as quais podem ser
prejudiciais ao ecossistema se medidas de controle de contaminação ambiental
não forem implementadas.
45
CAPÍTULO II
BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL EM
OSTRAS NOS ESTUÁRIOS BRASILEIROS DE PARANAGUÁ (PR),
PIRAQUÊ-AÇÚ (ES) E ITAMARACÁ (PE)
COLABORAÇÃO:
Patrícia de Souza Diogo
Michelle da Cunha Torres
Manuela Dreyer da Silva
Prof. Dra. Helena Cristina da Silva de Assis
Publicação relacionada:
Valdez Domingos, F. X.; Azevedo, M.; Silva, M. D.; Randi, M. A. F.; Freire, C.A.; Silva
de Assis, H. C.; Oliveira Ribeiro, C. A. Multibiomarker Assessment of three Brazilian
estuaries using oysters as bioindicators. Manuscrito submetido à revista
Environmental Research.
46
II. 1. INTRODUÇÃO
Os bivalves representam um dos grupos de organismos aquáticos mais
estudados em programas de biomonitoriamento (Viarengo e Canesi, 1991; Silva
et al., 2001; Alves et al., 2002; Lionetto et al., 2003; Ricciardi et al., 2006; Zanette et
al., 2006) e em estudos toxicológicos (Monserrat et al., 2002; Valbonesi et al., 2003;
Corsi et al., 2003; Binelli et al., 2006). As vantagens mais evidentes da utilização
destes organismos são a sua ampla distribuição geográfica, hábito séssil e
habilidade de concentrar compostos químicos em até 10
2
-10
5
vezes em relação
às concentrações detectas na água (Sunila, 1987). Vários estudos de
biomonitoramento tem utilizado bivalves para monitorar os efeitos de
contaminantes (Nicholson, 1999; Shaw et al., 2004; Ricciardi et al., 2006), no
entanto, a grande maioria dos estudos tem baseado suas conclusões em
biomarcadores de um único ível de organização biológica, como o nível
bioquímico, por exemplo (Lowe, 2000; Doran et al., 2001; Alves et al. 2002; da Ros
et al., 2002; Nasci et al., 2002; Svärdh, 2003; Riba et al., 2005; Binelli et al., 2006;
Nigro et al., 2006; Zanette et al., 2006).
A presença de contaminantes no ambiente freqüentemente leva a
depleção de reservas energéticas nos animais como um mecanismo
compensatório à alta demanda de energia requerida pelos processos de
detoxificação (Lucas e Beninger, 1985). Assim, índices somáticos ou de condição
corporal têm sido seguidamente avaliados em programas de biomonitoramento
(Guolan e Yong, 1995; Granby e Spliid, 1995; Nicholson, 1999; Bainy et al., 2000;
Mubiana et al., 2006; Silva et al., 2006).
47
Avaliações histopatológicas das brânquias podem identificar lesões
causadas por exposição à contaminantes. Alterações como fusão de filamentos
lamelares, inchaço de células epiteliais, e desorganização ou perda de cílios são
reportadas como importantes respostas nas brânquias de bivalves (Sunila, 1987;
Gregory et al., 1999; Riba et al., 2005).
A bioacumulação de compostos organofosforados em sedimentos tem
sido documentada em níveis consideráveis em áreas costeiras, especialmente
em estuários, e estes contaminantes representam uma potencial fonte de injúrias
aos organismos aquáticos (Readman et al., 1992). Respostas na atividade da
colinesterase em bivalves tem sido frequentemente reportadas como sensíveis a
presença de organofosforados e carbamatos (Fulton e Key, 2001; Valbonesi et al.,
2003), além disso a atividade desta enzima já foi previamente empregada como
um eficiente biomarcador de contaminanção em bivalves (Doran et al., 2001;
Alves et al., 2002; Ventura et al, 2002; Valbonesi et al., 2003; Bonaci et al., 2004;
Binelli et al., 2006; Ricciardi et al., 2006).
O objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto de atividades
antrópicas em três diferentes áreas estuarinas ao logo da costa brasileira. Os
biomarcadores propostos para se fazer esta avaliação foram índices somáticos,
histopatologia de brânquias e avaliação da atividade da colinesterase em uma
espécie de organismo bivalve, Crassostrea rizophorae. A padronização de
métodos para utilização desta espécie também é proposta e poderá ser utilizada
em outras regiões estuarinas da costa brasileira em futuros estudos de
biomonitoramento.
48
II.2. MATERIAIS E MÉTODOS
II.2.1. ESPÉCIE BIOINDICADORA
A ostra do mangue Crassostrea rhizophorae (Ostreidae) é uma espécie
eurialina que está distribuída desde o sul do Brasil até o Caribe, pode ser
encontrada em substratos como rochas e raízes de árvores que ocorrem em
áreas de mangue (Mancera e Mendo, 1996; Silva et al., 2001), e como os demais
bivalves, apresenta hábito alimentar filtrador. Esta espécie representa uma
importante fonte alimentar nas áreas costeiras do Brasil e Colômbia (Mancera e
Mendo, 1996; Silva et al., 2001; Silva et al., 2006), e já vem sendo utilizada como
modelo biológico para estudos toxicológicos ambientais no Brasil (Silva et al.,
2001; Alves et al., 2002; Ferreira et al., 2004; Zanette et al., 2006).
II.2.2. ÁREAS DE ESTUDO E ESTRATÉGIA AMOSTRAL
O projeto foi desenvolvido em três regiões da costa brasileira: nos estados
de PE, ES e PR (Figura 1). As coletas foram realizadas com auxílio de integrantes
da área temática de Biodiversidade, pertencentes ao Projeto Instituto do Milênio
– RECOS, nas universidades envolvidas em cada região (UFPR-CEM em
Paranaguá, UFES em Piraquê-Açu, UFPE e UFRPE em Itamaracá).
49
Figura 1. Localização geográfica dos pontos referência (R) e contaminados (C1 e C2) nas três
regiões estuarinas avaliadas. Adaptado de Zanette et al. 2006.
Em todos os estuários foram definidas 3 áreas de coleta para amostragem
das ostras: duas áreas contaminadas e uma área considerada referência (R).
Uma das áreas contaminadas localizava-se mais próxima, contaminado 1 (C1) e
outra mais afastada da principal fonte de poluição, contaminado (C2), para
avaliação de um gradiente de contaminação. Em cada uma das áreas foram
coletados 10 indivíduos em cada uma das regiões propostas em duas estações
amostrais: agosto de 2003 (inverno) e fevereiro de 2004 (verão). Alguns
parâmetros fisico-químicos da água (temperatura, pH e salinidade) foram
coletados durante as amostragens.
50
II.2.2.1. Itamaracá - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE
A Baía de Itamaracá onde está localizado o Complexo Estuarino Canal de
Santa Cruz (Figura 1) está situada no nordeste do Brasil, 40 km ao norte de Recife,
Pernambuco. Existem duas estações bem definidas na região: a estação seca,
compreendida entre setembro a janeiro, e a estação chuvosa, que ocorre entre
fevereiro e agosto (Medeiros e Kjerfve, 1993).
O rio Botafogo é o principal rio que desemboca no Canal de Santa Cruz,
segundo Meyer et al. (1998) até 1991 este rio recebeu grande aporte de mercúrio
proveniente de uma fábrica de soda cáustica na região. Em 2003, ainda foram
detectados altos níveis de mercúrio nas ostras desta região (Cavalcanti, 2003).
Atualmente ainda existem fábricas de soda cáustica operando na região do
canal de Santa Cruz, também há fábricas de cloro, papel e de plantações de
cana-de-açúcar (Manuel de Jesus Flores Montes, membro da UFPE e participante
do Projeto do Milênio-RECOS, comunicação pessoal). Além do aporte de
efluentes industriais e agrícolas é muito provável que esgotos urbanos estejam
chegando ao Canal de Santa Cruz.
Os pontos C1 (7º40’047”S; 34º51’486”W) e C2 (7º40’574”S; 34º50’564”W) no
Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz localizam-se no rio Botafogo (Figura 1).
No rio Carrapicho, considerado isento de impacto antropogênico, foi
determinanda a área R (7°43’042”S: 34°53’383”W) (Figura 1). A precipitação
média mensal de chuvas em agosto permaneceu na faixa de 100 a 150mm
enquanto que em fevereiro atingiu a faixa de 150 a 200mm (CPTEC, 2005).
51
II.2.2.2. Piraquê - Sistema Estuarino dos rios Piraquê–Açu e Piraquê-Mirim - ES
Situado no distrito de Santa Cruz em Aracruz, Espírito Santo encontra-se o
Sistema Estuarino dos rios Piraquê–Açu e Piraquê-Mirim (Figura 1). Este estuário
apresenta 65 km de extensão e área de 73,38 km
2
, estando apenas 2,25% de sua
área protegida pela Reserva Biológica de Manguezais dos rios Piraquê–açú e
Piraquê-mirim (Luiz Fernando Loureiro Fernandes, membro da UFES e participante
do Projeto do Milênio-RECOS, comunicação pessoal). Segundo Luiz Fernando
Loureiro Fernandes (comunicação pessoal), o manguezal do rio Piraquê-mirim
avança aproximadamente 9 km em direção ao continente, enquanto o rio
Piraquê–açú avança cerca de 13 km, representando o maior avanço de maré
do Espírito Santo. As épocas de maior ocorrência de precipitação estão
compreendidas entre outubro e maio nesta região, não havendo estação seca
pronunciada na região.
No município de Aracruz há uma indústria de fabricação de celulose de
fibra curta e branqueada de eucalipto (que é utilizada como matéria prima para
produção de papel) que é reconhecida como a maior do mundo no gênero, e
que está em plena atividade desde 1978. Associado a esta indústria existe um
terminal portuário privativo especializado no transporte da celulose exportada,
que embarca 2 milhões de toneladas que vão para os Estados Unidos, Europa e
Ásia e 900 mil toneladas produzidas por outra indústria localizada em Minas
Gerais, que concentra suas vendas para o Japão e Ásia. Ainda nesta região
existem indústrias de produção de peróxido de hidrogênio, metal-mecânicas e
eletrônicas (Prefeitura de Aracruz, 2005). Além das atividades industriais existe
ainda atividade agrícola expressiva (IBGE, 2005) e aporte de esgoto da cidade
52
de Aracruz. Segundo dados da CPTEC a precipitação média mensal de chuvas
na região em agosto permaneceu na faixa de 100 a 150 mm enquanto que em
fevereiro atingiu a faixa de 150 a 200mm em 2005. De acordo com as atividades
acima descritas espera-se que os principais contaminantes presentes no Sistema
Estuarino dos rios Piraquê–açu e Piraquê-mirim sejam metais, organoclorados,
pesticidas e esgoto doméstico. No rio Piraquê–Açu estão situados os pontos C1
(
19°55'20,22"S; 40°11'31,24"W) e C2 (19°56'31,52"S; 40°10'37,60"W) e o ponto R
(
19°56'14,67"S; 40°12'42,33"W) está situado no rio Piraquê-mirim (Figura 1).
II.2.2.3. Paraná - Complexo Estuarino Baía de Paranaguá
O Complexo Estuarino Baía de Paranaguá (25º16’34”S; 48º17’42”W, Figura
1) constitui o maior estuário do Paraná, estendendo-se aproximadamente 50 km
para o interior do continente (Kolm et al., 2002). Às margens deste estuário
localiza-se a cidade de Paranaguá, cuja população é estimada em mais de
140.000 pessoas (IBGE, 2005). Kolm et al. (2002), citam que a região ainda não
possui tratamento de esgotos adequado, sendo a maior parte do esgoto urbano
lançado em dois rios da região: Itiberê e Emboguaçú. Além do esgoto urbano,
existe ainda o aporte de fertilizantes, pesticidas e efluentes indústriais gerado
pelas atividades agropecuárias e industriais da região, respectivamente.
O Porto de Paranaguá é considerado o maior porto do Sul do Brasil e possui
expressiva participação na exportação de granéis sólidos, principalmente de
soja, na América Latina. Em 2002 e 2003, os principais produtos exportados foram
grãos e as principais importações foram fertilizantes (Portos do Paraná, 2005).
Além de resíduos dos produtos importados e exportados, a região do porto está
53
diretamente exposta à presença de combustíveis devido ao fluxo de
embarcações. As influências antrópicas regionais sugerem a presença de metais,
hidrocarbonetos, pesticidas e grande aporte orgânico no Complexo Estuarino
Baía de Paranaguá.
No complexo Estuarino Baía de Paranaguá os pontos C1 e C2 situam-se na
região próxima ao terminal de carga/descarga portuária de fertilizantes de
Paranaguá (Fospar), onde há o aporte de efluentes industriais, resíduos de
combustíveis (devido ao intenso tráfego de navios) e resíduos de mercadorias
carregadas/descarregadas no Porto de Paranaguá. O ponto R está situado na
Baía de Laranjeiras (25º31’271” S; 48º29’690” W; Figura 1).
Os pontos mais contaminados no complexo Estuarino Baía de Paranaguá
foram escolhidos em áreas com histórico diferente de contaminação: o ponto C1
(25º19’430” S; 48º29’690” W) situa-se na região próxima ao terminal de
carga/descarga portuária de fertilizantes de Paranaguá (Fospar), onde há o
aporte de efluentes industriais, resíduos de combustíveis (devido ao intenso
tráfego de navios) e resíduos de mercadorias carregadas/descarregadas no
Porto de Paranaguá. O segundo ponto contaminado, C2 (25º21’050” S; 48º25’97”
W), está localizado em uma região próxima à desembocadura do rio Itiberê, que
recebe a maior parte do esgoto da cidade de Paranaguá e que possivelmente
recebe restos de pesticidas carreados de lavouras da região.
II.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS
Foram coletados fragmentos de raízes de árvores do mangue que as ostras
utilizam como substrato, este material foi acondicionados em recipientes plásticos
54
e transportado ao laboratório, onde as ostras foram retiradas das raízes co auxílio
de faca. Antes da obtenção dos tecidos (brânquias e músculo adutor) as ostras
foram anestesiados em gelo, medidas (comprimento total) e pesadas (peso da
massa visceral.
II.2.4. BIOMARCADOR SOMÁTICO
O índice de condição (IC) é muito utilizado em ostras como indicador geral
de saúde. Este índice representa a relação entre a massa visceral e a massa da
concha. Quanto maior a proporção de massa visceral em relação à concha,
melhores são as condições gerais de saúde do organismo avaliado. O
IC=PMV/PCx1000 (onde PMV representa o peso da massa visceral em gramas e
PC representa o peso da concha em gramas).
II.2.5. BIOMARCADORES MORFOLÓGICOS
II.2.5.1.Avaliação Histopatológica
As lesões histopatológicas foram identificadas e descritas através de
microscopia óptica e eletrônica, os resultados serão apresentados de forma
qualitativa. Para a microscopia óptica as brânquias das ostras foram fixadas em
ALFAC (Etanol, formol e ácido acético), desidratadas e incluídas em Paraplast
(Sigma©). Os cortes (5μm) foram corados com hematoxilina e eosina.
55
II.2.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão
Fragmentos de brânquias foram fixados em Karnovsky modificado
(Glutaraldeído 2.5%, Paraformaldeído 2%, CaCl
2
2.5 mM, NaCl 200 mM em
cacodilato de sódio 100 mM pH 7.2-7.4) por 2 horas, incluídos em resina PoliEMBED
812 (Electron Microscopy Sciences©) e avaliados no microscópio eletrônico de
transmissão JEOL 1200 EXII.
II.2.5.3. Microscopia Eletrônica de Varredura
As brânquias foram fixadas em glutaraldeído 3%, cacodilato de sódio 100
mM, pH 7,2 – 7,4, lavadas em tampão cacodilato 100mM, desidratadas em etanol
(Merck®), submetidas ao ponto crítico (CO
2
), e observadas no microscópio
eletrônico de varredura JEOL JSM-6360LV em baixo vácuo.
II.2.6. BIOMARCADOR BIOQUÍMICO - AVALIAÇÃO DA COLINESTERASE
Após a dissecção o músculo adutor das ostras foi congelado. Em
laboratório estas amostras foram homogenizadas (5% p/v) em tampão fosfato (50
mM à 4° C) com 20% de glicerol pH 7,0 e centrifugados a 850 x g (4° C) por 15
min. O sobrenadante foi centrifugado novamente a 12.800 x g (4° C) por 15 min e
utilizado como fonte de enzima, esta foi exposta a 5, 10, 15, 20 e 30 mM de iodeto
de acetiltiocolina (AcSCh) a fim de determinar a afinidade pelo substrato (Km) e
velocidade máxima (Vmax). A partir destes resultados foram utilizados 30mM de
iodeto de acetiltiocolina (AcSCh) para os ensaios. A atividade colinesterásica foi
analisada de acordo com Ellman et al. (1961), com adaptações para
56
microplaca, e a concentração de proteínas de cada amostra foi determinada
segundo o método de Bradford (1976).
II.2.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS DADOS
Dois tipos de comparação foram realizadas para avaliar todos os
resultados. Os dados foram comparados de acordo com o nível de
contaminação de cada área (R, C1 ou C2) em cada estuário, e os resultados de
cada estuário foram comparados sazonalmente (inverno e verão). Os dados
foram testados para verificar sua normalidade e homogenidade de variâncias.
Tanto os dados de atividade da colinestease quanto os de IC não apresentaram
homocedasticidade e foram avaliados através do teste de Kruskal-Wallis seguido
pelo pós teste de Dunn (Zar, 1984). O nível de significância considerado foi de
0,05.
57
II. 3. RESULTADOS
II.3.1. PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DA ÁGUA
As maiores temperaturas e menores salinidades foram observadas no
verão, a estação que apresenta maiores índices pluviométricos (Tabela 1). Um
gradiente de temperatura latitudinal pode ser detectado em Piraquê e Paranguá
no inverno, como esperado. Altos valores de pH foram registrados no estuário de
Piraquê no verão (Tabela 1).
Tabela 1. Parâmetros físico-químicos da água nos três estuários avaliados.
Áreas Pontos Inverno Verão
T (°C) S (ppm) pH T (°C) S (ppm) pH
R 27,3 29,9 8,2 30,4 20,7 8,3
Itamaracá C1 28,0 21,7 7,8 29,9 13,7 8,1
C2 28,5 26,5 8,0 30,1 21,0 8,6
Piraquê R 23,9 35,0 6,1 29,7 20,8 10,1
C1 24,1 33,5 7,1 28,7 17,6 11,3
C2 24,4 37,6 7,8 28,5 23,2 13,3
Paranaguá R 20,0 25,0 8,0 28,0 20,0 8,2
C1 22,0 23,0 7,9 28,0 17,0 8,4
C2 21,0 26,0 7,8 30,0 20,0 7,9
T = Temperatura; S = Salinidade; R=Referência; C1= Contaminado 1; C2=Contaminado 2.
II.3.2. ÍNDICE SOMÁTICO
O índice de condição foi similar nas ostras entre as áreas amostrais (R, C1 e
C2) em cada um dos estuários avaliados. Paranaguá foi o estuário que
apresentou os maiores valores de IC, se comparado aos demais, tanto no inverno
quanto no verão (Figura 2).
58
59
II.3.3. HISTOPATOLOGIA
II.3.3.1. Lesões Detectadas
As brânquias de ostras apresentam filamentos paralelos bem delimitados
denominados filamentos ordinários (Figuras 3A e 5A), os quais são
interconectados por filamentos principais (Figura 3A) e fisicamente sustentados
pela estrutura de suporte (Figura 4A). Um filamento ordinário apresenta pequenos
e numerosos cílios na região frontal (Figuras 5C e 5E), longos cílios nas regiões
laterais (Figuras 4E, 5C e 5E) e microvilosidades na região apical (Figuras 4B, 4C e
4G) do filamento ordinário. A maioria das amostras analisadas mostraram cílios
laterais normais (Figuras 4A e 4E) e desorganização ou perda de cílios nas células
frontais (Figura 5D). Algumas das alterações observadas por microscopia óptica
foram confirmadas por microscopa eletrônica de transmissão e de varredura,
como a hiperplasia tecidual observada nos filamentos ordinários (Figuras 3B e 5B),
estas áreas de proliferação celular apresentaram um aspecto inchado (Figura 5B)
e um caráter basofílico que não é evidente em brânquias normais (Figura 3B).
Outra lesão observada em algumas ostras foi a vacuolização e desorganização
celular na base dos filamentos ordinários (Figura 3C), e aumento na ocorrência
de fusão nos filamentos ordinários (Figura 3D). As áreas de necrose detectadas
por microscopia óptica foram confirmadas pela observação de células
necróticas em MET (Figuras 4C, 4F e 4G). Áreas epiteliais de intensa atividade
secretora foram também observadas (Figuras 4D, 4H, 5F e 5G). A presença de
mucócitos (Figura 4H) justifica a alta liberação de muco na superfície dos
60
filamentos (Figura 5G). Áreas de grande desorganização celular no epitélio foram
observadas nas Figuras 4F e 4G.
A hiperplasia epitelial foi uma importante lesão identificada através de
microscopia de luz (Figura 3B), foi também evidente ao MEV nos filamentos
ordinários (Figura 5B), sendo que em alguns indivíduos estes filamentos parecem
ser menos individualizados (Figura 5B) que o normal (Figura 5A). A intensa
atividade secretora foi também confirmada por MEV (Figuras 5F e 5G).
Desorganização celular com perda de cílios foi detectada nos filamentos
ordinários (Figura 4E e 5D). Perda de cílios frontais foi observada através de
microscopia de luz, a perda de cílios laterais não foi detectada, apresentando
um aspecto similar entre as amostras (Figura 4A, 4E, 5C e 5E).
Legenda da página 61.
Figura 4. Organização ultraestrutural dos filamentos branquiais de Crassostrea
rhizophorae. (A) Aspecto geral do epitélio branquial, note o padrão de
organização das células no filamento ordinário, estrutura de suporte (seta) e cílios
laterais (LC). Barra = 10μm. (B) Liberação de muco na superfície epitelial (seta
grande), observe a presença de numerosas mitocôndrias (setas) nas células
epiteliais, cílios (C) e microvilosidades (M). (C) Área epitelial mostrando
degeneração celular, necrose (seta), note a presença de microvilosidades (M).
(D) Área epitelial com intensa atividade de secreção, observe células com
grânulos de secreção elétron densos (setas). (E) Visão da extremidade dos
filamentos ordinários mostrando o aspecto bem organizado deste epitélio e uma
área de tecido desorganizado (seta). Barra = 10μm. (F) Foco de necrose epitelial
(seta), note a degeneração celular na superfície do epitélio. (G) Área necrótica
evidente no epitélio do filamento ordinário (seta), note também a
desorganização epitelial associada a esta área, cílios (C) e microvilosidades (M).
(H) Epitélio dos filamentos ordinários mostrando a intensa proliferação de
mucócitos (setas). Barra B, C, D, F, G e H = 5 μm.
61
62
Figura 5. Microscopia eletrônica de varredura das brânquias de Crassostrea rhizophorae. (A) Vista
geral dos filamentos ordinários (OF) e sulco alimentar (FG). Observe os limites evidentes entre os
filamentos ordinários. Barra = 500 μm. (B) Filamentos ordinários inchados, note que o limite entre os
filamentos é menos evidente (setas). Barra = 100 μm. (C) Detalhe da organização dos filamentos
ordinários mostrando cílios laterais (lc) e cílios frontais (fc). Barra = 100 μm. (D) Aspecto alterado da
superfície dos filamentos com áreas sem cílios (setas). Barra = 50 μm. (E) Aspecto geral da
desorganização dos cílios laterais e frontais. Barra = 20 μm. (F) Aspecto geral da intensa atividade
de secreção de muco nos filamentos ordinários (seta). Barra = 50 μm. (G) Detalhe da secreção
mucosa nos filamentos ordinários. Barra = 20 μm.
63
II.3.3.2. Ocorrência de Lesões
Necroses foram observadas em todas as áreas amostrais de Paranaguá,
Piraquê e Itamaracá durante o inverno, com a menor ocorrência (menor que
20%) em Paranaguá C2 (Figura 6A). Durante o verão necroses foram observadas
apenas em Piraquê C1 e C2 e Itamaracá R e C2 (Figuras 6A e 6B). Alta ocorrência
de hiperplasia (acima de 80%) foi detectada em todas as áreas e em ambas
estações amostrais (Figuras 6C e 6D), exceto por Paranaguá C1 no inverno onde
não foi registrada a ocorrência de hiperplasia (Figura 6C). Hipertrofia de
mucócitos foi observada em todas as áreas amostrais e estações, exceto em
Itamaracá C1 e C2 em no inverno (Figuras 6E) e em Itamaracá C2 no verão
(Figuras 6F). A ocorrência mais expressiva de hipertrofia de mucócitos (acima de
50%) foi observada nas áreas C1 de Paranaguá e Piraquê no inverno (Figura 6E) e
em Piraquê R e C1 bem como em Itamaracá R (Figura 6F). Dois tipos de fusão nos
filamentos branquiais foram detectados: fusão das regiões frontal e abfrontal (AB)
dos filamentos. As fusões abfrontais ocorreram em todos os estuários e ambas as
estações (Figuras 6G e 6H), em ao menos um ponto amostral (R, C1 ou C2) com
maior ocorrência em Paranaguá R e C1 no inverno (Figura 6G) e C1 e C2 no
verão (Figura 6H). Fusões frontais ocorreram em todos os estuários durante o
inverno (Figura 6I), e apenas em Piraquê R e C1 durante o verão (Figura 6J).
64
65
II.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE
A atividade da colinesterase foi medida no músculo das ostras e
apresentou-se similar entre as áreas amostradas (R, C1 e C2) em todas as áreas
estuarinas (Figura 7). Os valores da atividade da colinesterase no inverno foram
significativamente maiores que os valores obtidos no verão para as mesmas áreas
de cada estuário (Figura 7).
Figura 7. Atividade da colinesterase no músculo de Crassostrea rhizophorae entre três regiões
estuarinas da costa brasileira. Valores foram expressos como medianas, # indica deiferença entre
inverno e verão no mesmo ponto amostral.
66
II. 4. DISCUSSÃO
A maioria dos estudos de biomonitoramento que tem sido realizados
avaliam o efeitos de contaminantes em uma única área ou região (Petrovic et
al., 2004; De la Torre et al., 2005; Munteanu e Munteanu, 2006; Nigro et al., 2006).
Este estudo foi parte de uma amplo projeto de pesquisa brasileiro em recursos
costeiros o qual foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia. O
monitoramento químico de água e sedimento tem sido realizado globalmente
nas últimas décadas com foco principal na detecção e bioacumulação de
contaminantes (e.g., Joyeux et al. 2004; Ueno et al., 2005), enquanto estudos de
biomonitoramento avaliando os efeitos de contaminantes em organismos
aquáticos tem aumentado recentemente (Silva et al., 2001, Alves et al., 2002,
Lionetto et al, 2003, Ricciardi et al., 2006, Zanette et al., 2006). Ambos tipos de
abordagem são importantes especialmente quando é possível associar os efeitos
biológicos observados à quantificação e detecção de xenobiontes em uma área
específica.
Índices somáticos são indicativos do estado geral de saúde de um
organismo. Geralmente, o índice de condição é calculado em bivalves
desidratados (Orban et al., 2002); no entanto neste estudo este procedimento foi
feito com material obtido de animais frescos, a fim de utilizar os mesmos
espécimens na obtenção de todos os dados referentes à biomarcadores.
Segundo Granby e Spliid (1995), Guolan e Yong (1995) e Nicholson (1999) índices
de condição (IC) podem ser utilizados para avaliar contaminação ambiental.
Alterações nas taxas de crescimento podem ser induzidas por contaminantes,
67
pois o estresse causado pela poluição pode levar à utilização de energia para
detoxificação, depletando reservas que seriam originalmente destinadas ao
crescimento do organismo (Lucas e Beninger, 1985; Nicholson e Lam, 2005).
Animais coletados no campo frequentemente apresentam baixos valores de IC
em áreas contaminadas com HPA´s, PCB´s (Granby e Spliid, 1995), metais
(Nicholson, 1999) e TBTCl (Guolan e Yong, 1995), ou em áreas próximas a centros
urbanos (Nicholson, 1999). A ocorrência de valores similares no IC das ostras nas
áreas amostrais (R, C1 e C2), é um indicativo de que o estado de saúde destes
organismos seja similar em cada um dos estuários avaliados. Considerando-se
apenas este parâmetro poderia-se inferir que os altos valores de IC encontrados
em Paranaguá sugerem que um melhor estado geral de saúde das ostras é
encontrado em Paranaguá se comparado a Piraquê e em Itamaracá. Estes
índices de condição mais elevados em Paranaguá poderiam estar relacionados
a um incremento de material orgânico neste estuário devido à presença de um
grande centro urbano, indústria de fertilizantes e aporte orgânico resultante de
perdas geradas pela exportação de grãos no porto que se localiza próximo as
áreas C.
A ocorrência de lesões histopatológicas foi freqüente em todas as áreas
amostradas nos estuários avaliados, sugerindo que os níveis de contaminação
são similares nas áreas estudadas. Algumas das alterações histopatológicas
detectadas neste estudo como fusão de filamentos, desorganização celular,
necrose e hipertrofia de mucócitos foi observada por outros autores após
exposição à contaminantes no campo ou em experimentos de laboratório
(Tabela 3). Apenas a ocorrência de necroses apresentou um comportamento
68
mais diferenciado entre as estações, ocorrendo mais intensamente durante o
inverno (Figura 6), estação que possui em geral menor pluviosidade, na qual
talvez haja maior concentração de contaminantes na água. As alterações na
distribuição dos cílios nas brânquias das ostras reportadas neste estudo podem
estar relacionadas a prejuízos na circulação de água e ingestão alimentar
(Nicholson e Lam, 2005). Lesões como necroses, desorganização de células
epiteliais, fusão em filamentos frontais e abfrontais podem diminuir a eficiência
das trocas gasosas nas brânquias. Hiperplasia epitelial e aumento na atividade
secretora de muco provavelmente está associada à proliferação de mucócitos e
poderia ser interpretada como uma resposta ao estresse pela presença de
contaminantes. A secreção de muco tem sido relatada como um mecanismo de
proteção, pois este forma uma barreira protetora entre o epitélio e a água do
ambiente (Bigas et al., 2001).
Tabela 2. Alterações histopatológicas relacionadas a exposição à contaminantes observadas por
alguns autores nas brânquias de bivalves.
Espéice Efeitos Contaminante Autor
Mytilus edulis Inchaço de células endoteliais,
descolamento de células abfrontais,
dilatação das veias branquiais fusão
frontal e abfrontal de filamentos
branquiais
Cobre e cádmio Sunila, 1987
Mytilus edulis Alterações morfológicas nos filamentos
branquiais e distúrbio severo nas
células epiteliais ciliadas
Fração
acomodada de
diesel e cobre
Auffret, 1988
Crassostrea
virginica
Hiperplasia e necrose Exposição
ambiental a
Gold-Bouchot
et al., 1995
69
hidrocaronetos
de petróleo e
cádmio
Ostrea edulis Dilatação dos espaços intercelulares e
ruptura ocasional de células
Mercúrio Bigas et al.,
1997
Ostrea edulis Bolhas nas membranas das
microvilosidades de células absortivas
e ciliadas, disocilia, lise celular e
hipertrofia de mucócitos
Mercúrio Bigas et al.,
2001
Perna perna Decréscimo na quantidade de cílios e
necroses
Mercúrio Gregory et al.,
1999
Scrobicularia
plana
Descamação do epitélio branquial e
necroses
Exposição
ambiental e
laboratorial a
metais pesados
Riba et al.,
2005
Crassostrea
angulata
Alterações nas estruturas epiteliais e
ciliares das brânquias
Exposição
ambiental e
laboratorial a
metais pesados
Riba et al.,
2005
Crassostrea
rizophorae
Decréscimo na quantidade de cílios,
hiperplasia, hipertrofia de mucócitos,
necroses e fusão nas regiões frontal e
abfrontal dos filamentos
Exposição
ambiental a uma
mistura de
contaminantes
Presente
estudo
Segundo Alves et al. (2002) C. rizophorae tem sido considerada uma espécie
sensível, sendo recomendada para a detecção de efeitos neurotóxicos. Estudos
referentes a atividade da colinesterase geralmente relatam inibição das amostras
de bivalves coletados em áreas impactadas. Galloway et al. (2002), Owen et al.
70
(2002), Binelli et al. (2006), Ricciardi et al. (2006) relataram a inibição da
colinesterase em tecidos moles e hemolinfa de várias espécies de bivalves.
Resultado similar foi observado em tecidos moles de Mytilus galloprovincialis
coletado em áreas costeiras italianas sob influência industrial e urbana (Lionetto et
al., 2003), e no músculo adutor de Amblema plicata após exposição aguda (96
horas) a clorpirifos (Doran et al., 2001). Pérez et al. (2004) relataram inibição da
colinesterase em Scrobicularia plana após exposição a esgoto doméstico não
tratado. No presente estudo a atividade da colinesterase apresentou-se similar
entre as áreas amostrais em cada uma das estações sazonais avaliadas, sugerindo
que provavelmente os níveis de compostos anticolinesterásicos sejam similares
entre os estuários avaliados. Porém observou-se que, de forma geral, a atividade
da colinesterase apresentou mais elevada no inverno do que no verão
contrariando os resultados relatados por Bocquené e Galgani (1991), Kirby et al.
(2000) e Ricciardi et al. (2006) que observaram incrementos na atividade da
colinetsterase em bivalves nas estações mais quentes do ano; bem como a
tendência de atividade metabólica mais intebsa no verão demosntrada em
Crassostrea gigas por Mão (2006) e Mytilus golloprovinciallis por Bochetti (2006).
Atividades agrícolas representam de fato fonte de contribuição antrópica
em todos os estuários avaliados. Alves et al. (2002) observaram inibição na
atividade da colinesterase após exposição de 96 h à 100 μg/L do pesticida
carbamato (furadan) nas brânquias de duas espécies de bivalves, C. rhizophorae
(a mesma espécie avaliada neste estudo) e Perna perna, estes autores
observaram que C. rhizophorae apresentou 64% de inibição, enquanto P. perna
71
apresentou apenas 35% de inibição da enzima, sugerindo que a ostra C.
rhizophorae é uma espécie sensível para este tipo de análise.
Diferenças na salinidade e pH podem estar associadas a diferentes taxas
de precipitação. De fato, dados das agências estaduais disponíveis on-line
indicam que os meses de verão de dezembro a fevereiro são os que apresentam
as maiores taxas pluviométricas nos estados do Espírito Santo e Paraná,
respectivamente onde estão localizados os estuários de Piraquê e Paranaguá
(CPTEC, 2005 e SIMEPAR, 2005). Diferentes taxas pluviométricas poderão alterar
não apenas a salinidade e o pH dos estuários, bem como a disponibilidade de
contaminantes pela turbulência da água e revolvimento de sedimentos (Fent,
1996; Bahena-Manjarrez et al., 2002), fator que pode estar relacionado aos
menores valores na atividade da colinesterase durante o verão (Figura 7). Além
disso, é durante o verão que ocorre um maior tráfego de barcos e a presença de
turistas contribui para um grande aumento na geração de efluentes domésticos,
incrementando a contaminação dos estuários.
O trabalho de Vidal et al. (2002) relata que a espécie de bivalve Corbicula
fluminea apresenta redução de paraâmentros como: catalase peroxidação de
lipídeos e NADH citocromo c redutase em pH alcalino (8-9); indicando que a
alcanização da água pode aumentar a suscetibilidade de bivalves a ação de
contaminantes aquáticos.
A uniformidade nas respostas observadas em Itamaracá poderia estar
associada a menor variabilidade nos parâmetros abióticos que ocorre nesta
região e também a resposta similar de bioacumulação de mercúrio observada
por Meyer et al. (1998) em um estudo que comparou as taxas de bioacumulação
72
entre as estações seca e chuvosa no estuário de Itamaracá, no nordeste do
Brasil, com C. rhizophorae.
A interpretação dos resultados de campo é sempre muito complexa, pois
um grande número de fatores pode influenciar as variáveis analisadas de
maneira não controlada (Roche et al., 2002; Zanette et al., 2006). Abordagens
realizadas com múltiplos biomarcadores fornecem uma melhor caracterização
de uma dada área durante um período de tempo em estudos de
biomonitoramento. Os presentes resultados apontam que em corpos aquáticos
relativamente próximos é pouco provável que exista uma área referência
totalmente desprovida de contaminação de origem antropogênica.
Estudos com múltiplos biomarcadores apresentam a vantagem de se
analisar diferentes respostas induzidas pela ação de contaminantes nos mesmos
organismos, proporcionando resultados que podem ser complementares. Além
disso, permite uma melhor compreensão e interpretação de respostas. As
respostas observadas neste trabalho através da abordagem de múltiplos
biomarcadores permite concluir que as ostras das áreas avaliadas apresentam
estado de saúde similar, ou seja, todas estão sob influência dos contaminantes
liberados nos estuários avaliados.
73
CAPÍTULO III
CINÉTICA DE DERIVADOS DE PETRÓLEO EM Fundulus
heteroclitus E Salvelinus alpinus APÓS EXPOSIÇÃO
HÍDRICA
COLABORAÇÃO:
Prof. Dr. Claude Rouleau - Université
du Québec à Rimouski - UQAR
Prof. Dr. Émilien Pelletier - Institute
Maurice Lamontagne (Fish and
Oceans)
Manuscrito em preparação:
Valdez Domingos, F. X.; Pelletier, E.
;
Oliveira Ribeiro, C. A.; Rouleau, C. Uptake
and distribution of waterborne
14
C-labelled naphthalene, naphthol-1, and
phenanthrene in Fundulus heteroclius.
74
III.1. INTRODUÇÃO
Ambientes aquáticos são frequentemente contaminados por derivados
de petróleo. Efluentes industriais, urbanos, deposição atmosférica, tráfego
marinho e derramamentos de petróleo representam as principais fontes de
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) em estuários e regiões costeiras. A
presença de HPAs derivados de petróleo nos ecossistemas aquáticos é causa de
preocupação, pois peixes e outros organismos aquáticos são capazes de
absorver HPAs tanto por via hídrica quanto por via trófica (Akaishi et al. 2004).
Além disso, evidências sugerem que hidrocarbonetos derivados de
derramamentos de petróleo podem persistir no sedimento por décadas (Reddy
et al., 2002) prolongando o contato com os organismos da área afetada.
Embora HPAs leves permaneçam menos tempo no ambiente (por serem
altamente voláteis) do que HPAs de maior massa molecular eles ainda
representam potencial tóxico aos organismos aquáticos (Akaishi et al., 2004).
HPAs leves são mais hidrofílicos e mais voláteis que HPAs mais pesados e podem
ser detectados em água contaminada com óleo cru, constituindo a FSA (fração
solúvel do petróleo na água) (Al-Yakoob et al., 1996; Akaishi, 2003). Alguns autores
como Al-Yakoob et al. (1996), Lockhart et al. (1996), Aas et al. (2000), Pollino e
Holdway (2002) reportaram que a FSA pode afetar a sobrevivência, crescimento,
reprodução e metabolismo de organismos marinhos. Além disso, a FSA pode
também induzir lesões histopatológicas como necroses hepáticas, aneurismas,
hiperplasia e desorganização nas brânquias de peixes e outros órgãos internos de
peixes expostos (Akaishi, 2003).
75
A autoradiografia (WBARG - whole-body autoradiography) tem sido
utilizada a fim de melhor compreender a absorção e distribuição de
contaminantes em organismos vivos (Amlund et al., 2006; Fowler et al., 2004;
Rouleau et al., 1998, 1999, 2001, 2003; Wood et al., 2002). Os objetivos deste
capítulo são verificar a absorção e distribuição de três HPAs leves: naftaleno,
fenantreno e naftol em Fundulus heteroclitus através de exposição hídrica a estes
contaminantes marcados com radioisótopos e também verificar a presença de
HPAs leves na água, e metabólitos na bile e fígado de Fundulus heteroclitus após
simulação de derramamento de petróleo.
III.2. MATERIAIS E MÉTODOS
III.2.1. ESPÉCIES BIOINDICADORAS
O “mummichog” Fundulus heteroclitus (Ciprinodontidae), é um dos peixes
eurialinos mais abundantes na costa leste da América do Norte (Radtke, 1979).
Esta espécie apresenta comprimento aproximado de 9 cm, sendo amplamente
utilizada como isca para peixes de maior porte. Pode ser encontrada em
ambientes estuarinos, principalmente em regiões próximas a vegetação em áreas
rasas e lodosas, constiuindo populações sedentárias (Radtke, 1979).
Pela facilidade de coleta, abundância e adaptabilidade às condições de
laboratório esta espécie vem sendo utilizada há mais de 20 anos tanto em estudos
de laboratório quanto de campo (Eisler, 1986; Mulvey et al., 2002; Radtke, 1979;
Roling et al., 2004; Rose et al., 2001).
A truta Salvelinus alpinus (Salmonidae) pode ser encontrada em algumas
áreas da Europa desde o Atlântico norte até o sul da Noruega, ao norte do Reino
76
Unido, Escandinavia, Finlândia, nos Alpes e também na américa do norte em
Quebec, (Canadá) e em Maine e New Hampshire (USA). Apresenta hábito
bentopelágico e é uma espécie anádroma. Alimenta-se de crustáceos
planctônicos, anfípodos, moluscos, insetos e peixes. É uma espécie extremamente
sensível a poluição aquática e oscilações no nível de oxigênio na água (Fishbase,
2006).
III.2.1. EXPERIMENTO COM RADIOISÓTOPOS
Exemplares adultos de Fundulus heteroclitus (8-10 cm de comprimento)
foram aclimatados em aquários de 40 litros durante duas semanas através de um
sistema de água em fluxo continuo. A temperatura da água variou entre 8,6°C e
16,5°C durante o experimento. Os peixes foram expostos a Naftaleno (NAPH),
Naftol -1 (NOH) e Fenantreno (PHE) radiomarcado com C
14
(Tabela 1) por via
hídrica durante 24h em sistema estático. NAPH e PHE foram adquiridos da
American Radiolabelled Chemicals e NAPH da Moravek Biochemicals. A
atividade por aquário foi de 1μCi/L para cada contaminante avaliado. Após o
período de exposição os animais foram mantidos em sistema de fluxo contínuo
de água e amostrados após 0, 1, 3, 7, 14 e 21 dias de depuração.
Tabela 1. Características dos contaminantes testados.
Contaminante MM Log
KOW
Solubilidade
(mg/L)
Concentração do
radiomarcador
(kBq/L)
Concentração
Química (µg/L)
NAPH 128,16
3,30 31 37 0,390
NOH 144,16
2,85 866 37 0,309
PHE 178,22
4,86 1,15 37 0,380
MM= massa molecular, KOW= coeficiente de partição octanol-água.
77
III.2.1.2. Autoradiografia (WBARG – “Whole-body Autoradiography”)
Após anestesia letal (MS222 0,1g/L), os peixes foram incluídos (inteiros) em
gel de carboximetilcelulose e congelados em etanol-gelo seco. Foram obtidos
cortes congelados (20 µm) de diferentes partes do corpo à -25°C, em micrótomo
LEICA CM3600, os quais foram coletados em fita adesiva e desidratados no
interior do micrótomo. Os cortes foram colocados em contato com telas de
fósforo (Cyclone Storage Phosphor Screen, Canberra-Packard) protegidos da luz
e da radiação cósmica. Após o período de sensibilização das telas de fósforo (3
dias), os cortes foram removidos e as telas escaneadas (Cyclone Storage
Phosphor Screen, Canberra-Packard). A distribuição da radioatividade foi
visualizada e quantificada em um mínimo de cinco cortes por peixe utilizando o
programa OptiQuant 4.0 (Canberra-Packard). Os resultados foram expressos de
acordo com o tempo de exposição em telas de fósforo e expressos como
unidade digital de luz por mm
2
(DLU/mm
2
). A distribuição dos contaminantes foi
expressa como índice de concentração relativo ao fígado (IC): IC= DLU/mm
2
figado
/DLU/mm
2
tecido
, DLU= unidade de densidade luminosa (Rouleau et al. 2001). A
constante de eliminação (K
e
), e a meia vida biológica (t
1/2
) foram calculadas:
t
1/2
=0.693/k
e
, tempo de equilíbrio de 95% t
0.95
= -(ln 0.05)/K
e
).
III.2.2. SIMULAÇÃO DE DERRAMAMENTO DE PETRÓLEO
Para a simulação de derramamento de petróleo (fonte: North Sea) foram
utilizados 6 aquários, 3 controles e 3 contaminados. Nove indivíduos de
Salvelinus alpinus (truta) (22-27 cm de comprimento) foram avaliados em
78
cada aquário. Os animais foram expostos a 300ml de petróleo (óleo cru) em
sistema de fluxo contínuo, para isso o petróleo foi acondicionado em recipientes
que permitiam o contato do óleo apenas com a água, portanto não houve
contato direto dos peixes com o óleo (Figura 1) a fim de expor os animais a
fração solúvel do petróleo na água (fonte de HPAs leves). Após 7 dias de
exposição o petróleo foi removido dos aquários e os animais permanceram em
período de recuperação durante 10 dias.
Ambos experimentos descritos neste capítulo foram realizados nas
dependência da Université du Quebéc à Rimouski (UQAR), em Rimouski, Quebec,
Canadá no período de julho de 2005 a janeiro de 2006.
79
Figura 1. Aparato utilizado para contenção de petróleo. (A) Vista geral do aparato, a parte
cilíndrica mede ~ 20 cm de diâmetro, a tela utilizada para cobrir o fundo da peça possui malha
de 1-2 mm. Em volta do cilindro é acoplada uma peça de isopor para viabilizar a flutuação do
aparato. (B) Vista do aparato de ntro do aquário. O petróleo é adicionado através da parte
superior e como o aparato flutua, permite a manutenção da interface petróleo-água durante o
experimento, assim os organismos tem contato direto apenas com compostos solúveis em água.
III.2.2.1.Análise de HPAs na água
A fim de verificar a presença de HPAs, amostras de água foram coletadas
após 0, 3, 7, 24 horas e 7 dias durante o período de exposição e também após 1,
4 e 10 dias de recuperação. Os HPAs foram obtidos a partir das amostras de água
do experimento através de extração líquido-líquido em hexano (10 mL para 500
mL de água dos aquários). Após a extração as amostras foram concentradas em
fluxo de N
2
até o volume final de 2-3 mL. Duas técnicas foram utlizadas para
avaliar a presença de HPAs na água, espectrofotometria (Perkin Elmer LS50B) e
HPLC (cromatografia líquida de alta perfomance). A HPLC foi realizada utilizando
coluna Supelcosil LC-HPA (25cm x 3mm. 5µm) com eluição em acetronitrilo 75%.
80
III.2.2.2.Análise de HPAs na bile
Após 7 dias de exposição os animais foram anestesiados com MS222
0,1g/L e sacrificados. A bile foi coletada com seringa e acondicionada em
frascos âmbar. A extração da bile foi realizada através da filtração com
metanol (1:20) sobre membrana Millex®-GV (PVDF Durapore) de 0,2 µm. Após a
extração as amostras eram protegidas da luz e injetadas no HPLC-fluorescência
durante o mesmo dia da extração a fim de evitar a degradação. A HPLC foi
realizada em coluna Zorbax C18 (25cm x 4,6 mm; 5,0µm) com metanol 80% em
água nano pura na fase móvel durante 8 minutos com débito de 0,8 mL/min.
Como padrões foram utilizados 1-naftol, 9-fenantrol e pirenol (1-hidropireno)
(Aldrich). O detector de fluorescência foi programado em 244 nm - λ emissão e
394 nm - λ excitação.
81
III.3. RESULTADOS
III.3.1. EXPERIMENTO COM RADIOISÓTOPOS
III.3.1.1. Análise Qualitativa
Observou-se a absorção e acumulação de todas as substâncias testadas
por via hídrica. Os órgãos radiomarcados após exposição a todos os
contaminantes foram vesícula biliar, fígado e intestino (Figura 2).
Animais expostos a naftaleno apresentaram marcação em apenas três
órgãos: vesícula biliar, fígado e intestino (Fig. 2). A radioatividade apresentou
decréscimo de acordo com a progressão do tempo de depuração (do dia 0 ao
dia 21) em todos os órgãos (Figs 3 e 4).
Após exposição ao fenantreno, os órgãos marcados radioativamente
foram os mesmos que os observados nos animais expostos ao naftaleno, vesícula
biliar, fígado, intestino e também no rim. Naftol foi o contaminante que
apresentou maior capacidade de distribuição e foi detectado em maior número
de órgãos que os demais contaminantes avaliados, estando presente na vesícula
biliar, fígado, intestino, rim, baço, pele e cérebro.
82
VB
F
I
A
P
C
I
F
VB
B
B
VB
I
C
Figura 2. Autoradiogramas de Fundulus heteroclitus após exposição de 24h. (A) Naftaleno,
(B) Naftol e (C) Fenantreno. As áreas em preto indicam os locais de maior concentração de
contaminantes. VB=vesícula biliar, F=fígado, I= intestino, B= brânquias, C= cérebro, P=pele.
83
III.3.1.2. Análise Quantitativa
A distribuição dos contaminantes foi quantificada e apresentada como
índice de concentração em relação ao fígado (IC) (Figura 3). Como tendência
geral detectou-se um maior acúmulo de contaminantes na vesícula biliar em
todos os tratamentos (Figura 3). Os animais expostos ao naftol apresentaram de
forma geral maior capacidade de absorção tanto quantitativa quanto
qualitativa. Os níveis mais altos de radioatividade na vesícula biliar foram
observados no dia 1 para NAPH, no dia 0 para NOH e no dia 3 para PHE. No
intestino a marcação mais expressiva foi observada no dia 1 para NAPH, no dia 0
para NOH e no dia 1 para PHE.
De forma geral, a marcação radioativa apresentou decréscimo durante
o período de depuração nos animais avaliados para todos os contaminantes
(Figura 3 e 4). Nos animais expostos ao naftaleno apenas o intestino e fígado
permaneceram marcados após 14 dias de eliminação e nenhum órgão
apresentou marcação no 21
o
dia de experimento. A resposta observada nos
animais expostos ao fenantreno foi similar a do naftaleno, observou-se marcação
apenas até o 14
o
dia de experimento. O único contaminante que apresentou
marcação nos animais até o 21
o
dia de experimento foi o naftol (Figura 4).
As maiores concentrações de contaminantes foram encontradas na
vesícula biliar>intestino>fígado para todos os contaminantes testados, exceto
para os animais expostos ao naftol nos quais as concentrações encontradas no
fígado foram maiores que as do intestino (Figura 4). Porém os sinais mais intensos
de radioatividade foram detectados na vesícula biliar (vesícula
biliar>fígado>intestino) (Figura 2).
84
III.3.2. SIMULAÇÃO DE DERRAMAMENTO DE PETRÓLEO
85
III.3.2.1.Análise de HPAs na água
HPAs foram detectados na água dos aquários durante o período
experimental través das duas técnicas utilizadas. Através de espectrofotometria
foi possível observar um acréscimo na concentração de HPAs a partir de 72 horas
de exposição que atingiu um pico em 7 dias de exposição (Figura 5).
Concentração de HPAs na água
0
15
30
45
60
75
0
h E
3
h
E
7
h E
24
h E
72 h E
7d E
1
d
R
4 d R
10
d
R
Tempo
Concentração (ppm)
Figura 5. Detecção espectrofotométrica da presença de HPAs na água durante o experimento de
simulação de derramamento de petróleo em Salvelinus alpinus. E=exposição, R=recuperação.
Através de HPLC a presença de HPAs metilados contendo 2-3 anéis
benzênicos foi detectada e quantificada (Tabela 2). Os mesmos compostos foram
identificados tanto na amostra de petróleo utilizada no experimento quanto na
amostra de água que foi exposta ao petróleo.
86
Tabela 2. Estimativa da concentração de HPAs metilados em amostras de água provenientes da
simulação de derramamento de petróleo por HPLC-FL.
Amostra
Petróleo Água
HPA TR ng/µL ng/µL
naftalenos- C1 5,55 0,34 0,03
naftalenos- C2 7,55 1,20 0,03
naftalenos- C3 8,55 0,97 0,05
antracenos - C1+C2 11,53 0,08 0,002
III.3.2.2. Análise de HPAs na bile
Os metabólitos naftol, fenantrol e pirenol não foram identificados na bile
dos animais avaliados, suas características são apresentadas na tabela 3. Nos
cromatogramas obtidos observou-se apenas um grande pico que eluiu em 3,4
minutos o qual acredita-se que seja o pigmento biliverdina (Figura 6).
Tabela 3. Características dos metabólitos naftol, fenantrol e pirenol.
Metabólito Massa Molecular Tempo de Retenção (min)
1-naftol 144,17 5,67
9-fenantrol 194,23 8,23
Pirenol 218,25 11,00
87
III.4. DISCUSSÃO
Alguns autores têm estudado a cinética de contaminantes como cádmio
(Inza et al., 2001), mercúrio (Oliveira Ribeiro et al., 1999; Rouleau et al, 1999), prata
(Wood et al., 2002; Bianchini et al., 2005), tributil estanho (Rouleau et al., 2003),
nonilfenol (Arukwe et al., 2005), arsenobetaína (Amlund et al., 2006) e zinco
(Rouleau et al, 1998; Persson et al., 2003) através de autoradiografia, porém ainda
não há muitos estudos sobre a cinética de derivados de petróleo. Exceto pelo
trabalho realizado por Mielbrecht et al. (2005) o qual relata a cinética do
fenantreno e sua relação com o uso de dispersantes, estudos relacionados a
compostos como naftaleno, fenantreno e naftol geralmente abordam a detecção
destes xenobiontes no ambiente ou nos organismos (Klumpp et al., 2002; Vives et
al., 2004; Silva et al., 2006), a cinética destes compostos ainda é pouco conhecida.
Dentre os três compostos avaliados o naftol foi observado em uma
divesidade maior de tecidos que o naftaleno e fenantreno, mostrando maior
capacidade de distribuição em F. heteroclitus do que os demais contaminantes
testados. O naftol também se mostrou mais persistente nos organismos avaliados
uma vez que foi detectado nos tecidos até o último dia de experimento, enquanto
que após 21 dias de depuração, não foi observada radioatividade nos animais
expostos ao naftaleno e fenantreno indicando que a metabolização destes
contaminantes seja mais rápida que a do naftol.
As concentrações de naftaleno, naftol e fenantreno na água utilizadas no
experimento com radioisótopos (0,300-0,390 μg/L,) foram baixas se comparadas
aos dados da literatura que citam concentrações de 0,06-1 mg/L (Aas et al., 2000),
3 mg/L (Çavas e Ergene-Gozukara, 2005) na água e apesar de estarem presentes
88
em baixas concentrações puderam ser detectados em vários órgãos dos animais
avaliados.
Acredita-se que os naftalenos e fenantrenos (HPAs com respectivamente 2
e 3 anéis aromáticos) sejam os principais responsáveis pela toxicidade aguda do
óleo cru (Anderson, 1974 apud Pollino e Holdway, 2002). Óleos crus contêm
aproximadamente 1,5% de HPAs, dos quais o naftaleno é o principal componente
perfazendo 65% da constituição de HPAs totais (Truscott et al, 1992).
Experimentos relacionados aos compostos solúveis do petróleo geralmente
utilizam a metodologia da obtenção da fração solúvel do petróleo para realizar os
estudos de toxicidade (Thomas e Budiantara, 1995; Al-Yakoob et al., 1996; Lockhart
et al., 1996; Escartín e Porte, 1999; Pollino e Holdway, 2002, Akaishi, 2003; Akaishi et
al., 2004; Ramachandran et al., 2004; Inunza et al., 2006). Neste estudo uma nova
metodologia foi empregada para avaliar a dispersão e acumulação de derivados
de petróleo através da realização de uma simulação de derramamento de
petróleo em aquário.
As técnicas de espectrofotometria e HPLC-FL permitiram detectar a
presença de derivados do petróleo nas amostras de água do experimento,
indicando que através desta metodologia é possível obter compostos solúveis na
água. Outra vantagem desta metodologia foi a utilização de um sistema de fluxo
contínuo de água que simulou a renovação de água que ocorre normalmente em
rios e estuários. Este tipo de abordagem permitirá simular e avaliar diversos
parâmetros que necessitam ser compreendidos e que fornecerão subsídios para
ações futuras em situações de derramamento de petróleo.
89
Os derivados de petróleo de 2-3 anéis benzênicos identificados por HPLC
corresponderam ao tipo de composto que se esperava encontrar dissolvido na
água dos aquários (HPAs leves). Em contrapartida, metabólitos de HPAs como
naftol, fenantrol e pirenol não foram identificados na bile dos animais durante o
experimento. Talvez a quantidade absorvida por esses organismos esteja abaixo do
limite de detecção do HPLC-FL nas amostras de bile. Metabólitos de HPAs tem sido
identificados na bile de peixes por outros autores tanto em estudos realizados em
laboratório quanto em campo (Lin et al., 1996; Escartín e Porte, 1999; Aas et al.,
2000; Klumpp et al, 2002; Oliveira Ribeiro et al., 2005; Yang e Bauman, 2005; Silva et
al., 2006).
Na análise da bile detectou-se um pico que elui antes do tempo de
retenção do naftol, o qual provalvelmente corresponde a biliverdina, que é um
pigmento normalmente presente na bile, acredita-se que este pico possa interferir
na interpretação dos resultados, revelando um falso positivo para a presença de
naftol, pois apresenta tempo de retenção similar ao deste composto. As
concentrações de hidrocarbonetos detectedas na água no experimento de
simulação de derramamento de petróleo foram de aproximadamente 0,03 ng/mL,
valores bem inferiores aos dados da literatura que citam concentrações de 0,06-1
mg/L (Aas et al., 2000) e 3 mg/L (Çavas e Ergene-Gozukara, 2005). As baixas
concentrações detectadas na água poderiam justificar a não detecção de
metabólitos na bile dos animais avaliados.
A compreensão dos processos cinéticos que envolvem naftaleno,
fenantreno e naftol é fundamental para o planejamento de ações e decisões a
serem tomadas em casos de contaminação aquática por estes compostos.
90
A simulação de derramamento de petróleo mostrou-se uma metodologia
eficaz para a avaliação da dispersão de derivados de petróleo, podendo também
utlizada para avaliar os efeitos da fração solúvel em organismos aquáticos.
Experimentos que avaliam o comportamento de derivados do petróleo e
os efeitos de sua fração solúvel na água, como os apresentados nos experimentos
do capítulo III, podem fornecer subsídios valiosos à exploração de petróleo e a
previsão de efeitos que podem ser gerados por derramamento acidental.
91
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os dados apresentados nos Capítulos I e II, foram obtidos através da
avaliação de 3 espécies (Cathorops spixii, Lutjanus synagris e Crassostrea
rizophorae) de níveis tróficos distintos (carnívoros e filtradores) através de múltiplos
biomarcadores (somáticos, histopatológicos e bioquímicos). Os resultados
demonstraram que todas as áreas estudadas em cada um dos estuários avaliados
(Paranaguá, Piraquê e Itamaracá) estão impactadas por atividades antrópicas. A
utilização de espécies de níveis tróficos diferentes na avaliação das mesmas áreas
foi testada a fim de observar se os resultados seriam convergentes, neste estudo os
resultados obtidos com os peixes forneceram respostas que permitiram diferenciar
melhor as áreas avaliadas, enquanto os resultados obtidos com as ostras
apresentaram-se bastante uniformes entre as áreas. Isto demonstra e consolida a
importância do uso de espécies de diferentes níveis tróficos no diagnóstico de área
impactadas.
A avaliação de respostas obtidas em campo representa um desafio, pois,
salvo casos específicos, são induzidas por múltiplos contaminantes os quais podem
interagir de forma sinérgica ou antagônica. Apesar das dificuldades interpostas na
interpretação, os estudos de biomonitoramento são extremamente relevantes para
que se possa diagnosticar o estado de saúde dos organismos expostos,
subsequentemente a saúde e o comprometimento das populações.
Os dados referentes à presença e quantificação de contaminantes nas áreas
amostradas constituem dados importantíssinmos para a interpretação dos dados
obtidos através da avaliação de biomarcadores, esses parâmetros foram
92
analisados pelo grupo de hidroquímica e contaminantes do projeto RECOS porém
esses dados infelizmente não estavam disponíveis no momento de elaboração
desta tese, esses dados certamente contribuíriam para uma melhor compreensão
dos resultados aqui apresentados. O Projeto RECOS, Instituto do Milênio, foi inovador
na costa brasileira, englobou vários grupos de pesquisa de diferentes áreas de
atuação. Nos seus quatro anos de duração viabilizou a interação entre diferentes
grupos de pesquisa e a geração de resultados importantes para o gerenciamento
da costa brasileira. È lamentável o indeferimento da continuidade da segunda
edição deste projeto, o qual após a primeira experiência, poderia trazer ainda mais
informações sobre diversos aspectos relacionados aos recursos costeiros no Brasil.
Estudos de laboratório fornecem subsídios para uma melhor compreensão dos
resultados obtidos em campo uma vez que apontam os tecidos alvos e identificam
melhor os efeitos em nível específico. Dentro desta perspectiva justifica-se a
realização dos estudos apresentados no Capítulo III, os quais tratam da dispersão,
cinética e distribuição de uma classe de contaminantes encontrada facilmente nas
áreas de estudo apresentadas nos dois primeiros capítulos, os HPAs. Estudos
semelhantes a este como a avaliação associada de dois ou mais contaminantes
em laboratório constituem uma ferramenta importante e geram resultados que
podem ser aplicados em avaliação de exposição a múltiplos contaminantes e
também em situações específicas como acidentes de petróleo e derivados, ou
outros poluentes.
93
CONCLUSÕES
• A utilização de múltiplos biomarcadores fornece um diagnóstico mais confiável
na avaliação dos danos provocados pela emissão de poluentes em áreas
estuarinas impactadas.
• Os resultados obtidos através da avaliação dos índices somáticos e
histopatologia em peixes e ostras indicam que todas as áreas avaliadas encontram-
se afetadas.
• A atividade da colinesterase em peixes foi o biomarcador que melhor permitiu
diferenciar as áreas avaliadas, diferentemente do encontrado para ostras.
• É importante e recomendável a utilização de organismos bioindicadores
diferentes, pois os resultados obtidos com os peixes permitiram diferenciar as áreas
estudadas e os obtidos com as ostras indicaram que todas as áreas avaliadas estão
impactadas.
• Os derivados de petróleo: naftaleno, fenantreno e naftol foram absorvidos,
acumulados e metabolizados em Fundulus heteroclitus após exposição hídrica
durante os 21 dias de depuração.
• A simulação em laboratório de derramamento de petróleo desenvolvida neste
trabalho constitui uma metodologia eficiente na reprodução das condições de
dispersão de HPAs dissolvidos na água.
94
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