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FUNDAÇÃO FACULDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS MÉDICAS DE PORTO
ALEGRE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
O Papel das Subunidades α
αα
α-4 e γ
γγ
γ-2 do Receptor GABA
A
no
Hipocampo de Ratos no Efeito Antidepressivo da Alopregnanolona
MAURÍCIO SCHÜLER NIN
PORTO ALEGRE, 2006
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Livros Grátis
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O Papel das Subunidades α
αα
α-4 e γ
γγ
γ-2 do Receptor GABA
A
no
Hipocampo de Ratos no Efeito Antidepressivo da Alopregnanolona
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em
Ciências Médicas, da Fundação Faculdade Federal de
Ciências Médicas de Porto Alegre, como requisito parcial
para obtenção do título de mestre em Ciências Médicas.
Mestrando: MAURÍCIO SCHÜLER NIN
Orientadora: Profa. Dra. HELENA M. T. BARROS
Co-orientadora: Profa. Dra. ROSANE GOMEZ
Porto Alegre, 2006
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho e divido minha
felicidade com meus pais, Leandro e Lisiane.
Por me ensinarem a ser justo e ético; por me
incentivarem a estudar e dar sustentação para
isto; por me proporcionarem uma alternativa,
que talvez não puderam realizar, justamente
por minha causa. Por me amarem tanto quanto
os amo.
AGREDECIMENTOS ESPECIAIS
À Lú, por ter me encorajado a participar de um grupo de
pesquisa fora da minha faculdade mãe; por sempre estar de bom humor,
mas acima de tudo pelas ótimas conversas nas tardezitas tomando um
mate. Pelo carinho e amizade.
A Rô, por ter dado o melhor exemplo de como um
pesquisador deve ser: dedicado e persistente; por ter acreditado
em mim quando não acreditei; por me ensinar a andar sozinho e
por ensinar que andar sozinho significa cercar-se das pessoas
certas.
A professora Helena, por acima de tudo, abrir as
portas desta instituição; por ensinar-me a tratar a pesquisa
séria e eticamente, e por apesar de meus defeitos, valorizar
minhas virtudes.
Felipe: divido contigo parte deste trabalho. Tua
calma e eficiência na condução das tarefas tornaram
este caminho menos árduo. Orgulho-me de ter sido teu
co-orientandor.
AGREDECIMENTOS
À Vivi, por ter me ajudado do começo ao fim de meu trabalho; por apesar de sua
agitação, ter superado as difíceis etapas que qualquer mestrando passa, hora me dando
apoio, hora recebendo apoio. Enfim conseguimos.
Ao Alexandre, porque apesar de nossas diferenças e das discussões, sempre que
necessitei de uma ajuda ou socorro, em qualquer laboratório desta instituição, nunca
ouvi um “não posso agora”; pela amizade construída durante estes últimos quatro anos.
Ao Mário, não pelas “matérias-primas” fornecidas, nem pelo computador que eu
sempre acabava usando, mas pelas risadas, conversas e conselhos. Não te sintas
desprestigiado se algumas pessoas esquecem o valor dos servidores que ajudam de
maneira vital seus projetos.
À Ana Paula: tu és um exemplo de pesquisadora feliz e realizada; esta energia
que tu transmite torna mais fácil de superar a rotina, que por vezes o trabalho produz.
Ao Lucas, pois mesmo participado de nosso projeto somente no final, encarou
com a seriedade que faz parte de sua personalidade; por aceitar e completar desafios.
À Mari, pelas intermináveis ajudas, pelo computador sempre emprestado; pelo
bom humor constante; pela boa vontade.
À Darliza, pois ajudar pode significar ser ajudado; pela amizade.
Ao grupo do professor Rasia, Hélinton e Édson, pela prestatividade e suporte
na montagem da técnica de infusão.
Ao colega Thiaguinho, por mostrar que profissionais de diversas áreas podem
interagir e formar equipes profissionais e sempre amigas. Estendo este agradecimento ao
grupo da professora Cláudia, o qual me tratou como se eu fosse de seu divertido e
eficiente grupo de pesquisa.
À Ana Maria e ao Cássio, por, mesmo sendo voluntários, colaborarem sempre
com boa vontade.
Ao grupo do laboratório de biologia molecular: ao Alexandre pelas críticas e
sugestões sempre cabíveis; e a Grazi, em nome de todo pessoal, por ter me auxiliado
como a um colega de laboratório e me recebido como a um amigo, mesmo sendo apenas
um passageiro que logo depois de utilizar seus recursos estaria os deixando.
À CAPES, pela insistência com que acredita que um pesquisador deve formar-
se com apoio e deve dedicar-se a seu projeto.
À FFFCMPA, por ter aberto as portas e por sua excelência.
À Faculdade de Farmácia da UFRGS, pela excelente base que dá a seus
“filhos”.
Ao pessoal da secretaria de pós-graduação, pela agilidade com que resolvem
pequenos e grandes problemas, aliviando preocupações desnecessárias.
À professora Marilda pelas sugestões quando da montagem de meu projeto, mas
principalmente pelas sugestões enquanto relatora de meu trabalho; tive muita sorte em
escolhê-la.
À Letícia, pela boa vontade em providenciar os recursos técnicos que eu
necessitei para dar seguimento em meu projeto.
À minha Carolina, por dividir este difícil momento de tensão que compreende o
fim do prazo de entrega.
Aos meus irmãos, Luti e Titi, pelo carinho, companheirismo e suporte familiar
indispensável para superar os momentos difíceis.
Ao Diretório Acadêmico da Faculdade de Farmácia da UFRGS, por
constantemente lembrar-me dos valores necessários para que um possível futuro
professor universitário se torne um agente social.
“...los hermanos sean unidos
porque esta es la ley primera
tengan unión verdadera
en cualquier tiempo que sea
porque si entre ellos pelean
los devoran los de afuera...”
“Martín Fierro” (José Hernández)
“...Hay que tener una gran dosis de humanidad, una gran dosis de sentido
dela justicia y de la verdad, para no caer en extremos dogmáticos, en
escolasticismos fríos, en aislamientos de las masas...”
Che Guevara
“Sucesso só vem antes do trabalho no dicionário.”
Albert Einstein
SUMÁRIO
ABSTRACT...................................................................................................................XV
RESUMO.....................................................................................................................XVI
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................17
1.1 Depressão...................................................................................................................17
1.1.1Etiologia ……………………..................................................................................18
1.1.2 Epidemiologia....................…..................................................................................24
1.1.3 Modelos Animais de Depressão…..........................................................................25
1.1.3.1 Teste do Nado Forçado.…...................................................................................27
1.2 Neuroesteróides.................................................….....................................................30
1.2.1 Alopregnanolona..................................…...............................................................32
1.3 GABA..........................................................................................................................38
1.3.1 Subunidades do Receptor GABA
A
...........................................................................42
2. JUSTIFICATIVA..............................................................….....................................50
3. OBJETIVOS...............................................................................................................51
3.1 Objetivo Geral............................................................................................................51
3.2 Objetivos Específicos..................................................................................................51
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................……...............................52
ARTIGO CIENTÍFICO…............................................................…................................73
Abstract…..……………......................................................................................……….74
Introduction………......................................................................................……..….….75
Methods and Materials……..…...............................................................………....……78
Results…...……................................................................................................………....84
Discussion………..…....................................................................................…...............86
References……..……......................................................................................….............93
ANEXO 1: Roteiro para publicação na revista Journal of Psychopharmacology..........105
LISTA DE FIGURAS
Introdução
FIGURA 1 – Esquema da participação das áreas cerebrais envolvidas nas desordens do
humor ...............................................................................................................................23
FIGURA 2 – Esquema do metabolismo da alopregnanolona a partir de colesterol….…32
FIGURA 3 – Esquema molecular da alopregnanolona e GABA.....................................39
FIGURA 4 – Esquema do receptor GABA......................................................................45
FIGURA 5 – Esquema tridimensional do hipocampo de ratos........................................49
Artigo
FIGURA 1 – Ethidium bromate-stained gel showing RT-PCR analyses of α4 and γ2
GABA
A
subunit in the hippocampus of rats treated with allopregnanolone (1.25 µg/rat,
2.5 µg/rat, 5.0 µg/rat) and control solution………...………………………………….102
FIGURA 2 – Mean amounts in both hemispheres α4 mRNA and γ2 mRNA, and in the
Right Hippocampus (RH) and Left Hippocampus (LH), measured by RT-
PCR……………………….…………………………………………………………....103
LISTA DE TABELAS
Introdução
TABELA 1 – Alteração da expressão gênica das subunidades de receptores GABA
A
no
hipocampo de ratos durante a gravidez e lactação...........................................................48
Artigo
TABLE 1 – Analysis of duration and frequency of the behaviors in FST treated with
allopregnanolone 1.25µg/rat, 2.5 µg/rat, 5.0 µg/rat and control (0 µg/rat)..…………..100
TABLE 2 – Correlation among expression of the GABA
A
receptor α4 and γ2 subunits
(ratio) and the behaviors (immobility, climbing and total mobility) at FST…………..101
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3α,5β-THP 3αhidroxi-5β-pregnan-20-ona
5-HT
3
5-hidroxitriptamina tipo 3
serotonina
alopregnanolona 3α-hidroxi-5α-pregnan-20-ona;
3α,5α-tetrahidroprogesterona;
3α,5α-TH PROG;
3α,5α-THP
alotetrahidrodeoxicorticosterona 3α,21-dihidroxi-5α-pregnan-20-ona;
3α,5α tetrahidrodeoxicorticosterona;
3α,5α-THDOC
DHEA dehidroepiandrosterona
DHEAS dehidroepiandrosterona-sulfato
DSM-IV diagnostic and statistical manual of mental
disorders – fourth edition
FST teste do nado forçado
GABA ácido γ-aminobutírico
GABA
A
ácido γ-aminobutírico tipo A
GABA-BZ-Cl
-
complexo GABA-benzodiazepinico-Cl
-
GABA-T acido γ-aminobutírico transaminase
GAD ácido-glutâmico descarboxilase
ICD-10 international classification of diseases and
related health problems – tenth revision
IMAO inibidor da monoaminooxidase
ISRS inibidores seletivos da recaptação de
serotonina
LCR líquido céfalo raquidiano
pregnanolona 3-αhidroxi-5β-pregnan-20-ona
PREGS pregnenolona sulfato
PROG progesterona
SNC sistema nervoso central
SNP sistema nervoso periférico
SSA semialdeído sucinato
SSADH semialdeído sucinato desidrogenase
XV
ABSTRACT
Allopregnanolone (3α-hydroxy-5α-pregnan-20-one; 3α, 5α THP) is among the
most potent positive allosteric modulators of γ-aminobutyric acid type A (GABA
A
)
receptors, playing an important role in the maintenance of physiological GABAergic
tone. Expression of specific GABA
A
receptor subunit genes in neurons is affected by
this neurosteroid, and those alterations occur at different way depending on the brain
region. Brain areas related with mood disorders comprehends brain circuits, were the
hippocampus is included, with a high concentration of GABA neurons. Preclinical and
clinical evidences point to the importance of the α4 and γ2 GABA
A
receptor subunits in
this antidepressant effect. The antidepressants increase the lower levels of
allopregnanolone in rodent brains, and clinically effective antidepressant
pharmacotherapy is associated with normalization of plasma and cerebrospinal fluid
concentrations of endogenous neuroactive steroids are depressed patients. The amount of
the γ2 subunit and α4 GABA
A
receptor subunit is decreased in different brain areas,
when the levels of allopregnanolone are increased. Thus, suggesting a prime role of the
γ2 and α4 GABA
A
subunit in the allopregnanolone GABA
A
biding. Here we summarize
data that show how fluctuations in the concentration of allopregnanolone regulate both
the expression and function of GABA
A
receptors and consequently affect behavior.
Keywords: allopregnanolone, forced swim test, GABA
A
receptor, depression,
gamma2, alpha4.
XVI
RESUMO
A alopregnanolona (3α-hidroxi-5α-pregnan-20-one; 3α,5α-THP) está entre os
mais potentes moduladores alostéricos positivos do receptor ácido γ-aminobutírico tipo
A (GABA
A
), desempenhando um importante papel na manutenção do tônus fisiológico
GABAérgico. A expressão de genes de subunidades específicas do receptor GABA
A
em
neurônios é afetada por este neuroesteróide, e estas alterações acontecem de maneiras
diferentes dependendo da região cerebral. Áreas cerebrais relacionadas com desordens
do humor envolvem circuitos cerebrais, do qual faz parte o hipocampo, sendo ricos em
neurônios GABAérgicos. Evidências clínicas e pré-clínicas apontam para a importância
das subunidades α4 e γ2 do receptor GABA
A
neste efeito antidepressivo. Os
antidepressivos elevam os baixos níveis de alopregnanolona no cérebro de roedores, e a
farmacoterapia antidepressiva clinicamente efetiva está associada com a normalização
da concentração cerebral e plasmática de alopregnanolona em pacientes depressivos. Os
níveis de expressão gênica das subunidades γ2 e α4 do receptor GABA
A
estão
diminuídas em diferentes regiões cerebrais, quando os níveis de alopregnanolona estão
aumentados. Estes dados sugerem um papel principal destas subunidades no efeito
antidepressivo da alopregnanolona. Neste trabalho nós revisamos dados, que mostram
como as flutuações da concentração de alopregnanolona regulam tanto a expressão como
a função dos receptores GABA
A
, e conseqüentemente alterando comportamentos.
Palavras-chave: alopregnanolona, teste do nado forçado, receptores GABA
A
,
depressão, gama2, alfa4.
17
1. INTRODUÇÃO
1.1 Depressão
Conhecida há algumas décadas como uma “doença de fuga”, a depressão
emergiu como uma das doenças mais caras para a nossa sociedade (PANZARINO;
1998), não apenas pelo custo do tratamento, mas também pela perda de produtividade,
entre outros fatores. Segundo Wells e colaboradores (1989), a depressão causa
incapacidades funcionais maiores do que o diabetes, doenças crônicas cardíacas,
hipertensão ou artrite, resultando em um aumento da incapacidade funcional do
indivíduo de igual, ou maior valor, que a provocada por doença isquêmica do coração.
Depressão clínica pode ser observada tanto na Depressão Maior, como no
Distúrbio Bipolar. De acordo com o Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders – Fourth Edition (DSM-IV) “a característica essencial de um episódio
depressivo maior é um período mínimo de duas semanas, durante as quais há um humor
deprimido, ou perda de interesse e prazer por quase todas as atividades (anedonia),
podendo apresentar alterações no apetite ou peso, sono e atividade psicomotora;
diminuição da energia; sentimentos de desvalia ou culpa; dificuldade para pensar,
concentrar-se ou tomar decisões, ou pensamentos recorrentes sobre morte ou ideação
suicida, planos ou tentativas de suicídio”. Porém, um diagnóstico de episódio depressivo
maior somente será definido como tal, quando “o curso clínico seja caracterizado por um
18
ou mais episódios depressivos maiores, sem história de episódios maníacos, mistos ou
hipomaníacos” e ainda não seja explicado por outros fatores como: induzido por
substâncias (droga de abuso, medicamento, toxina), transtorno esquizoafetivo sobreposto
à esquizofrenia, transtorno esquizofreniforme, transtorno delirante ou transtorno
psicótico (American Psychiatric Association, 1994).
1.1.1 Etiologia
Embora não se conheça precisamente a etiologia da depressão, os fatores que
moldam as desordens do humor já estão fundamentados, quais sejam: fisiológicos,
psicológicos e sócio-culturais. Certos sistemas de neurotransmissores, como o ácido γ-
aminobutírico (GABA), serotonina, noradrenalina, e dopamina, são implicados na
etiologia da depressão, sendo que, suas reais responsabilidades na patofisiologia da
depressão, podem ser verificadas indiretamente através da pesquisa com fármacos
agonistas ou antagonistas destes sistemas. De maneira geral, o que atualmente se
compreende sobre a patofisiologia da depressão está baseado na farmacologia dos
agentes terapêuticos utilizados (KALIA, 2005).
O tratamento da depressão baseia-se em um grupo variado de agentes
terapêuticos, já que a depressão clínica refere-se a uma síndrome complexa de gravidade
amplamente variada. Durante os últimos 30 anos, teorias bioquímicas das desordens do
19
humor estiveram concentradas nas aminas biogênicas. Três destas aminas
neurotransmissoras, dopamina, serotonina e noradrenalina formam um grupo químico
chamado de monoaminas. As monoaminas produzem seu efeito induzindo mudanças
bioquímicas complexas nos neurônios pós-sinápticos do sistema nervoso central (SNC)
através da interação com receptores específicos ligados a proteína G no interior da
membrana celular pós-sináptica. O primeiro estudo que estabeleceu uma relação entre as
monoaminas e depressão foi realizado em 1954 (FREIS, 1954), onde o comportamento
tipo-depressivo apareceu como um efeito colateral em pacientes que utilizavam
reserpina – um depletor das aminas biogênicas - para o tratamento de hipertensão. A
partir deste momento, os inibidores da monoamino oxidase (IMAO), devido ao seu
mecanismo de ação de aumentar a concentração cerebral de muitas aminas, começaram
a ser empregados no tratamento da depressão. Atualmente sabe-se que, de maneira geral,
drogas que causam depleção ou inativação da ação central da noradrenalina, como a
reserpina, produzem sedação ou depressão, enquanto que, drogas que aumentam ou
potencializam a ação da noradrenalina (IMAOs e antidepressivos tricíclicos), estão
associados com comportamento estimulatório/excitatório e, geralmente, com efeito
antidepressivo (PRYOR ; SULSER, 1991).
Os primeiros agentes terapêuticos utilizados com mais sucesso para o tratamento
da depressão foram os antidepressivos tricíclicos, que provocam uma ampla gama de
efeitos neurofarmacológicos. Além de sua suposta ação primária, que é a inibição do
transporte de monoaminas para as terminações nervosas pré-sinápticas levando desta
forma à facilitação sustentada da função noradrenérgica e também, serotoninérgica no
20
cérebro, estes fármacos provocam uma gama de efeitos secundários e adversos,
existindo atualmente uma série de novos agentes terapêuticos com uma maior eficácia e
menores efeitos adversos (BALDESSARINI , 2001).
Nos últimos 20 anos, uma série de agentes inovadores bem sucedidos foi
colocada a disposição para o tratamento de desordens do humor, incluindo vários
inibidores do transportador de neurotransmissores, que bloqueiam seletivamente a
recaptação da serotonina ou noradrenalina, e vêm sendo extensivamente usados para o
tratamento de desordens depressivas (BALDESSARINI, 2001).
Mais recentemente, outros agentes vem sendo estudados por suas ações em
sistemas de neurotransmissão, que até então não eram considerados relacionados à
depressão, como os neurotransmissores aminoácidos. O glutamato e o GABA são os
principais neurotransmissores aminoácidos do SNC com função excitatória e inibitória,
respectivamente (PETROFF, 2002). Existem evidências de que alterações em ambos
sistemas destes neurotransmissores podem contribuir para a patofisiologia da depressão
(KRYSTAL et al., 2002; CRYAN; KAUPMANN, 2005), contudo o sistema
GABAérgico vem sendo cada vez mais estudado em relação a esta doença (LLOYD et
al., 1989; SHIAH; YATHAM, 1998; BRAMBILLA et al., 2003; TUNNICLIFF;
MALATYNSKA, 2003).
O papel do neurotransmissor GABA nas desordens do humor foi primeiramente
proposto há 25 anos, baseado na observação clínica de que o ácido valpróico, um
agonista GABAérgico, apresentava bons resultados no tratamento de desordem bipolar
21
(EMRICH et al., 1980). Através de ensaios clínicos, foi verificado que os níveis
plasmáticos de GABA encontravam-se mais baixos em pacientes com desordem
depressiva (PETTY et al., 1992), sendo que estes níveis plasmáticos estão diretamente
relacionados a concentrações de GABA nos espaços extracelulares cerebrais e no fluído
cerebroespinhal (PETTY et al., 1993). Já a severidade da depressão está inversamente
relacionada com a concentração de GABA no fluído cerebroespinhal (GERBER; HARE,
1981).
No mesmo sentido, estudos com modelos animais mostram que há uma
correlação inversa entre os níveis de GABA extracelulares e os comportamentos tipo
depressivos na natação forçada (GOMEZ; BARROS, 2003), além disso, a concentração
de GABA no estriado de ratos tratados com antidepressivos encontra-se aumentada
(PARENT et al., 2002). A administração crônica de certos antidepressivos diminui a
densidade de receptores GABA
A
corticais (SURANY-CADOTTE et al., 1985), onde os
níveis de GABA estão inversamente relacionados com a severidade da depressão
(HONIG et al., 1988). Uma simples, porém devida questão foi levantada por Petty e
colaboradores em 1995: “por que GABA não atraiu mais atenção em teorias de
depressão e mania?” (PETTY et al., 1995). As principais respostas residem no fato de
que existe uma tendência para explicações “serotoninérgicas e noradrenérgicas”
clássicas para esta doença e, pelo GABA ser considerado um neurotransmissor inibitório
com funções ainda pouco definidas. Entretanto, observações que levam em conta as
relações entre GABA e comportamento depressivo são menos freqüentes, o que dificulta
o delineamento de uma teoria complementar. Por exemplo, foi observado que animais
22
submetidos ao teste do nado forçado (FST), um modelo animal de depressão,
apresentam uma concentração mais elevada de GABA extracelular no estriado por um
período de 60 a 90 minutos, e os animais mais deprimidos tem elevações de GABA
menos acentuadas (GOMEZ; BARROS, 2003). No entanto, ainda não se sabe com
certeza se as alterações de GABA são causa ou conseqüência das manifestações
comportamentais. Na clínica se observa que sítios de ligação GABA
A
/benzodiazepina
estão elevados em suicidas depressivos (CHEETHAM et al., 1988). Contudo, outros
estudos apontam para respostas não tão positivas, já que nem os níveis de GABA
(KORPI et al., 1988), nem as enzimas relacionadas com a síntese de GABA estão
alteradas em suicidas depressivos (CHEETHAM et al., 1988; SHERIF et al., 1991).
Neste caso, as complicações podem estar relacionadas ao fato de que entre os pacientes
suicidas, nem todos eram deprimidos, e pelo fato da coleta de tecido ter sido feita após
várias horas da morte.
Nos últimos anos ocorreram muitos avanços nos conhecimentos anatômicos
relacionados à etiologia das desordens do humor, dentre elas a depressão, auxiliadas por
ferramentas mais avançadas, como a neuroimagem. Neste sentido, alguns trabalhos
mostram que pacientes deprimidos apresentam algumas anormalidades quanto ao fluxo
sangüíneo e metabolismo da glicose – um importante substrato da função neuronal– em
várias regiões cerebrais, como a amígdala (HARIRI et al., 2002), hipocampo e córtex
pré-frontal (EGAN et al., 2003). Em resumo, é proposto que a regulação
neuroanatômica do humor compreenda o córtex pré-frontal, o complexo amigdala-
hipocampo, tálamo, gânglios da base, e as diversas interconexões entre estas áreas. Para
23
que tenhamos uma visão mais específica, os dois principais circuitos neuroanatômicos
cerebrais envolvidos na regulação do humor são (Figura 1): circuito límbico-talâmico-
cortical, que inclui o complexo amígdala-hipocampo, o núcleo mediolateral do tálamo e
o córtex pré-frontal medial e ventrolateral; e o circuito límbico-palidal-talâmico-cortical,
que inclui o estriado, pálido ventral e regiões do circuito límbico-talâmico-cortical. De
acordo com este modelo, as desordens do humor podem resultar de disfunções em
quaisquer partes destes circuitos interconexos (SOARES; MANN, 1997).
Figura 1
FIGURA 1 - Esquema da participação das áreas cerebrais envolvidas nas
desordens do humor. As diversas áreas possuem interconexões, que envolvem os
circuitos límbico-talâmico-cortical (1) (complexo amígdala hipocampo - núcleo
mediolateral do tátamo - córtex pré-frontal medial e ventrolateral) e o circuito límbico-
1
2
2
2
1
2
1
2
Complexo
Amígdala
Hipocampo
Tálamo
mediolateral
Córtex
pré-frontal
Pálido
ventral
Estriado
24
estriatal-pálido talâmico-cortical (2) (estriado-pálido ventral- e as regiões do circuito 1).
Figura adaptada de SOARES e MANN (1997).
1.1.2 Epidemiologia
A utilização de drogas, com comprovada eficácia para o tratamento de desordens
psiquiátricas, se tornou difundida a partir de 1950. Sabe-se que o estado tipo depressivo
é o marcador fenotípico das duas principais desordens do humor (depressão maior e
distúrbio bipolar). Esta é a doença psiquiátrica mais comum, afetando 121 milhões de
pessoas no mundo. Os estudos sobre o transtorno depressivo maior relatam variabilidade
na proporção da população adulta afetada. O risco para transtorno depressivo maior
durante a vida em amostras comunitárias tem variado de 10% a 25% para as mulheres e
de 5% a 12% para os homens. Já a incidência-ponto de transtorno depressivo maior em
adultos, nas amostras comunitárias, tem variado de 5% a 12% (em média 9,5%) para as
mulheres e de 2% a 7% (5,8%) para os homens. De maneira geral, estes índices de
prevalência e incidência para transtorno depressivo maior parecem não ter relação com
etnia, educação, rendimentos ou estado civil (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2006a).
Depressão maior não tratada dura em média nove meses e 80% a 90% dos
pacientes que tiveram um episódio apresentarão recaída em até dois anos (KAPUR et
25
al., 1992). Mais recentemente, a depressão maior foi identificada como a quarta causa de
incapacidade e morte prematura no mundo, e previsões especulam que esta doença
alcance o segundo lugar, atrás apenas de cardiopatia isquêmica, até o ano de 2020
(MURRAY; LOPEZ, 1997), sendo que muito desta alta incapacidade resultante da
depressão é atribuída à cronicidade desta doença (MATTHEWS et al., 2005).
1.1.3 Modelos Animais de Depressão
De acordo com McKinney (1984), “nós usamos os modelos animais como um
experimento preparatório conduzido em uma espécie, com o objetivo de estudar
fenômenos que ocorrem em outra espécie”. Os modelos animais, que mimetizam
patologias humanas, são utilizados para diferentes propósitos e seus mecanismos estão
intensamente relacionados aos objetivos explícitos do modelo (WILLNER, 1984).
Tratando-se de distúrbios do humor, existe uma grande dificuldade em mimetizar
certos sintomas presentes em psicopatologias como depressão maior, distúrbio bipolar,
ansiedade, entre outros, pois envolve reproduzir, em animais, sintomas psicológicos e
fisiopatológicos conseqüentes destas doenças, posteriormente mensurá-los e finalmente
correlaciona-los com fenômenos que ocorrem nos seres humanos. Os modelos animais
que têm como objetivo mimetizar estas condições clínicas devem possuir características
de semelhança de sinais e sintomas, ou seja, validade externa ou de face; validade de
26
construto ou fisiopatológicas; e ainda detectar efeitos de medicamentos eficazes na
clínica, ou seja, validade preditiva (WILLNER, 1990).
Não é conhecida em animais nenhuma afecção que seja homônima à depressão
humana. Assim, a principal dificuldade em se mimetizar esta doença, ou o complexo de
comportamentos que resultam nesta doença, reside no fato em que não existem
sintomas, nem outra característica clínica, que sejam patognomônicos para depressão.
De fato, cada uma das características diagnósticas listadas, para “depressão maior”
(DSM-IV), ou “episódio depressivo”, para o international classification of diseases and
related health problems – tenth revision (ICD-10) (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2006b), podem ser encontradas em outras desordens psiquiátricas
(MATTHEWS et al., 2005). No entanto, alguns procedimentos que produzem
comportamentos tipo-depressivos nos animais, como isolamento social, perda do apetite,
redução da atividade motora, típicos da depressão humana, são utilizados para a
avaliação de diferentes tratamentos antidepressivos, onde alguns destes que possuem
comprovada eficácia clínica revertem tais comportamentos (KALUEFF; TUOHIMAA,
2004).
Ambos o DSM-IV e o ICD-10 operacionalizam diagnósticos psiquiátricos, de
acordo com as características clínicas, incluindo fatores de duração dos sintomas
apresentados, e excluindo outras causas potenciais, como induzidas por medicamentos.
Modelos de depressão animal contemporâneos usualmente tentam relatar observações
comportamentais ou neuroquímicas, induzidas por uma variedade de fatores, através de
uma ou mais características descritas no DSM-IV e ICD-10. Todavia, devido à
27
heterogeneidade clínica desta desordem, deve-se tomar precaução ao assumir que a
depressão possui uma patofisiologia específica e resultado previsível. Assim, a indução
em animais a alterações patofisiológicas discretas parece representar o melhor caminho
para um modelo de depressão. Apesar de tudo, a validação de modelos está totalmente
dependente da observação clínica confiável, ou seja, da resposta clínica frente ao mesmo
tratamento utilizado nos ensaios pré-clínicos. Para tanto, os ensaios pré-clínicos devem
demonstrar corretamente sua relevância clínica, considerando a validade de face, de
construto e preditiva (MATTHEWS et al., 2005).
Um modelo há tempos validado e amplamente utilizado e aceito para a triagem
de drogas com potencial efeito antidepressivo é o FST, também anteriormente conhecido
como teste do desespero comportamental. Este modelo possui uma boa validade
preditiva, pois o tratamento agudo com antidepressivos já é suficiente para reverter o
comportamento tipo-depressivo dos animais (PORSOLT et al., 1977).
1.1.3.1 Teste do Nado Forçado
Segundo a proposta de Porsolt e colaboradores (1977), quando os animais são
submetidos a este teste, apresentam um comportamento tipo-depressivo, revertido pelo
emprego de antidepressivos com comprovada eficácia clínica. No FST clássico, os ratos
são colocados em aquários cilíndricos contendo água suficiente para que não toquem no
28
fundo deste, a uma temperatura fria (25
o
C). Em um primeiro momento os animais
permanecem neste aquário durante 15 minutos, etapa chamada de “treino” ou “pré-
teste”, com o objetivo de ambientar o animal a este evento. Após 24 horas os animais
são recolocados no aquário, em seguida recebem três doses consecutivas do fármaco a
ser avaliado, 24 horas, 5 horas e 1 hora antes da etapa “teste”, que tem duração de 5
minutos. Quando são submetidos a esta etapa se observa um predomínio da imobilidade
dos animais frente a uma situação aversiva, o que estaria relacionado com um
comportamento tipo-depressivo. Este comportamento de imobilidade, onde o animal
realiza apenas movimentos suficientes para permanecer com o nariz para fora da água, e
então respirar, representaria um estado de desesperança frente a esta situação, que se
segue de um período de hipolocomoção e hipotermia.
Ao longo dos anos, este modelo foi largamente avaliado em suas variáveis
etofarmacológicas. Borsini e Meli (1988) observaram uma menor resposta
antidepressiva no modelo da natação forçada em ratos quando comparados com
camundongos, embora o uso de camundongos resulte em alguns resultados falsos
negativos (PORSOLT et al., 1991). Diferentes cepas de ratos –Sprague-Dawley e
Wistar-Kioto – também proporcionam resultados distintos no FST (LÓPEZ-
RUBALCAVA; LUCKI, 2000), quando se compara o efeito antidepressivo dos
inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) ou dos inibidores seletivos da
recaptação da noradrenalina. Algumas alterações nos métodos, como a profundidade da
água, foram propostos (DETKE; LUCKI, 1996), como o objetivo de reduzir o risco de
falsos negativos e positivos, ou seja, tornar o modelo mais seletivo e sensível para as
29
diversas classes de fármacos testadas.
A controvérsia deste modelo animal está na verificação do efeito antidepressivo
dos ISRS, uma vez que alguns estudos apontam para a incapacidade do FST de detectar
o efeito antiimobilidade para este grupo de fármacos (BORSINI; MELI, 1988). Porém,
duas décadas após a validação deste modelo animal, foram propostas algumas
modificações com o intuito de avaliar a atividade dos ISRS. Detke e colaboradores
(1995) propuseram a diferenciação dos componentes de ações e posturas que
compreendem o comportamento de imobilidade, em “nadar” e “escalar”, e relacionaram
estes comportamentos com a atividade de drogas nas vias serotoninérgica e
noradrenérgica, respectivamente. Esta diferenciação resulta em uma melhor
sensibilidade do teste para cada classe de fármacos antidepressivos.
Além da observação do tempo total de imobilidade no “teste”, se pode aferir a
latência para imobilidade (CONTRERAS et al., 1998). Neste caso, se considera o tempo
que o animal leva, desde sua introdução na água até ficar completamente imóvel.
Fármacos com atividade antidepressiva prolongam o tempo para que o animal apresente,
pela primeira vez o comportamento de imobilidade.
Neste modelo pode-se avaliar também o efeito antidepressivo das drogas
administradas através de escores de comportamento, onde a cada 5 segundos é
contabilizado o comportamento observado (DETKE et al., 1995; LOPÉZ-
RUBALCAVA; LUCKI, 2000), tendo todas estas variações com único objetivo
melhorar a aferição deste modelo.
30
1.2 Neuroesteróides
Neuroesteróides são esteróides sintetizados no SNC e no sistema nervoso
periférico (SNP), independentemente da estereoidogênese, a partir de precursores
esteroidais locais ou provenientes do sangue através de glândulas endócrinas
(BAULIEU et al., 2001; VAN BROEKHOVEN; VERKES 2003). Estes compostos
podem produzir alterações de maneira rápida e não genômica em diversas funções
cerebrais, através da interação com receptores ligados à membrana (LAMBERT et al.,
1995). De acordo com esta definição, esteróides neuroativos endógenos são um subtipo
funcional de neuroesteróides (UZUNOVA et al., 2005).
A importância dos neuroesteróides foi reconhecida na década de 1970
(HOLZBAUER, 1976), entretanto somente nos últimos anos tem se observado a
implicação dos esteróides na psiquiatria, uma vez que foi demonstrado seu papel na
sobrevivência e formação das conexões sinápticas durante a embriogênese e no período
pós-natal, além de indução da plasticidade no sistema nervoso adulto (GARCIA-
SEGURA et al., 1999). Após alguma injúria ou doença, os esteróides podem exercer
um efeito protetor em neurônios e células gliais e promover processos regenerativos (DE
NICOLA, 1993). No entanto, sob algumas circunstâncias, os esteróides podem
exacerbar danos já existentes no SNC (SCHUMACHER et al., 2000).
Existe uma grande quantidade de neuroesteróides, com grande semelhança
química, o que faz com que tenham afinidade pelo mesmo grupo de receptores,
influenciando a excitabilidade dos neurônios através de canais iônicos ligados à
31
membrana (MCEWEN, 1991). Um dos principais receptores-alvo dos neuroesteróides é
o complexo de receptores GABA
A
(ROBEL; BAULIEU, 1995), porém existem
afinidades próprias e, por conseqüência, diferentes atividades para os diversos
neuroesteróides biológicos.
Entre os esteróides neuroativos, a alopregnanolona (3α-hidroxi-5α-pregnan-20-
ona; 3α,5α-tetrahidroprogesterona; 3α,5α-TH PROG; 3α,5α-THP) e a
alotetrahidrodeoxicorticosterona (3α,21-dihidroxi-5α-pregnan-20-ona; 3α,5α THDOC;
3α,5α tetrahidrodeoxicorticosterona) (PUIA et al., 1990), somados à pregnanolona
(3αhidroxi-5β-pregnan-20-ona; 3α,5β-THP) (MAJEWSKA et al., 1986; RUPPRECHT,
2003) são os mais potentes moduladores alostéricos positivos endógenos dos receptores
GABA
A
. Alguns outros neuroesteróides, como o sulfato de pregnenolona (PREGS), a
dehidroepiandrosterona (DHEA) (MAJEWSKA, 1992) e seu metabólito conjugado
dehidroepiandrosterona-sulfato (DHEAS) (MAJEWSKA et al., 1990) também exercem
seus efeitos através da modulação dos receptores GABA
A
(Figura 2).
32
Figura 2
FIGURA 2: Esquema do metabolismo de Alopregnanolona a partir de colesterol.
Adaptado a partir de Rupprecht e Holsboer (1999).
1.2.1 Alopregnanolona
Os efeitos genômicos indiretos da alopregnanolona estão ligados ao seu
metabolismo ao entrar na célula. Dentro da célula, a alopregnanolona pode ser oxidada a
33
5α-DH PROG. Esta substância se liga ao receptor de progesterona (PROG) citosólico, e
subseqüentemente estimula a síntese de proteínas através da influência da expressão
gênica (RUPPRECHT et al., 1993), podendo alterar a composição do complexo de
subunidades do receptor GABA
A
, o que determina sua afinidade por neuroesteróides e
benzodiazepínicos (PUIA et al., 1990, 1993). Outros efeitos genômicos indiretos da
alopregnanolona compreendem a diminuição da expressão gênica do hormônio liberador
de corticotrofina, e do aumento do efeito reparador da mielina no SNC e SNP
(BAULIEU; SCHUMACHER, 2000; SCHUMACHER et al., 2001).
Já os efeitos não genômicos da alopregnanolona são semelhantes aos dos
benzodiazepínicos. A alopregnanolona é um modulador alostérico positivo do complexo
de receptores GABA
A
, sendo um dos mais potentes moduladores endógenos
(MAJEWSKA et al., 1986; ROBEL; BAULIEU, 1994), onde em baixas concentrações
(nanomolar) potencializa o influxo nos canais de cloro GABA-induzidos (MAJEWSKA
et al., 1986; PAUL; PURDY, 1992) prolongando a duração e aumentando a freqüência
de abertura dos canais. Isso implica em um aumento da duração da inibição resultante do
potencial pós-sináptico (HARRISON et al., 1987; LAMBERT et al., 1995). Já em
concentrações mais elevadas (micromolar) ocorre uma abertura direta dos canais de Cl
-
associados com os receptores GABA
A
(PAUL; PURDY, 1992).
Em certas condições fisiológicas como estresse, gravidez, estágios do ciclo
hormonal, os níveis de alopregnanolona podem atingir concentrações suficientes para
modular o complexo ionóforo GABA-benzodiazepínico-Cl
-
(GABA-BZ-Cl
-
) (PAUL;
PURDY, 1992). Mesmo sendo o efeito rápido sobre este complexo o mecanismo mais
34
importantemente relacionado e estudado na modulação por alopregnanolona, outros
mecanismos, que envolvem os canais iônicos ligados a portão (PAUL; PURDY, 1992),
os canais de Ca
2+
voltagem dependentes, a ligação aos receptores 5-hidroxitriptamina
tipo três (serotonina, 5HT
3
) (WETZEL et al., 1998) e a ligação aos receptores
nicotínicos da acetilcolina (BULLOCK et al., 1997), também tem participação no efeito
modulador sobre o SNC deste neuroesteróide.
Vários estudos apontam diferentes propriedades neurofarmacológicas para a
alopregnanolona, através da avaliação em variados modelos animais, como sedação-
hipnóse, epilepsias (FRYE; SCALISE, 2000), catalepsia (KHISTI et al., 1998),
ansiedade (BITRAN et al., 1999), estresse (ZIMMERBERG; BLASKEY, 1998;
PURDY et al., 1991), entre outras. Porém, grande parte dos estudos aponta para a
avaliação dos mecanismos de ação no medo/ansiedade da alopregnanolona, onde esta
demonstra ser uma importante substância para a manutenção do estado de inibição
tônica da amígdala durante eventos aversivos/estressores (LEDOUX, 2000).
Recentemente, a atividade antidepressiva deste neuroesteróide vem sendo
gradativamente mais estudada através de ensaios pré-clínicos e clínicos (ROMEO et al.,
1998; RUPPRECHT et al., 1998; GASIOR et al., 1999; MELLON; GRIFFIN, 2002).
Em 1996 Uzunov e colaboradores observaram um aumento no conteúdo de
alopregnanolona no estriado, no hipocampo e no córtex frontal, após o tratamento agudo
com os antidepressivos ISRS, fluoxetina e paroxetina, mas não com os precursores da
alopregnanolona, a 5α-dihidroxiprogesterona (5α-DHP), a progesterona e a
pregnenolona. Da mesma forma, o tratamento agudo com fluoxetina aumenta os níveis
35
de alguns esteróides (SERRA et al., 2001). Colaborando com estas informações se
observa um aumento dos níveis de alopregnanolona no córtex occipital de ratos após o
tratamento crônico, por três semanas, com fluoxetina ou venlafaxina, mas não com
desipramina e sertralina (UZUNOVA et al., 2005).
Camundongos injetados no ventrículo cerebral, ou sistemicamente com
alopregnanolona apresentam redução do tempo de imobilidade quando submetidos ao
FST, demonstrando o efeito antidepressivo da alopregnanolona nesta espécie animal,
porém sem alterações na atividade motora, já que não ocorre alteração alguma no teste
do campo aberto, comprovando que sua eficácia não se deve a estimulação central. Este
efeito antidepressivo da alopregnanolona no FST é potencializado pelo muscimol, um
agonista do receptor GABA
A,
e bloqueado por bicuculina, um antagonista do receptor
GABA
A
(KHISTI et al., 2000).
Molina-Hernandez e colaboradores (2004) demonstraram o efeito da
antiimobilidade no FST em ratas ovariectomizadas tratadas com alopregnanolona, e
também o aumento no tempo de “escalar”, ou seja, relacionado com o mecanismo de
ação, direto ou indireto, sobre o sistema noradrenérgico (DETKE et al., 1995; CRYAN
et al., 2002). Posteriormente, este mesmo grupo de pesquisadores propôs uma possível
mediação do núcleo accumbens no efeito antidepressivo da alopregnanolona, visto que
ao ser administrada diretamente nesta região, produz efeitos antidepressivos semelhantes
àqueles obtidos através da administração sistêmica (MOLINA-HERNANDES et al.,
2005). Neste mesmo experimento comprovaram a participação dos receptores GABA
A
no efeito antidepressivo da alopregnanolona no FST através da observação da
36
antagonização do efeito antiimobilidade pelo tratamento com picrotoxina e bicuculina –
antagonistas dos receptores GABA
A
-.
A área cerebral mais promissora no estudo do efeito antidepressivo da
alopregnanolona, provavelmente situa-se no hipocampo. Frye e Walf (2002) observaram
que ratas que possuíam um nível elevado de alopregnanolona no hipocampo, quando
comparadas com aquelas que possuíam baixos níveis, mostravam uma diminuição no
comportamento tipo depressivo no FST. Além disso, quando administrado a finasterida
(um inibidor da 5α-redutase, que metaboliza progesterona ao precursor da
alopregnanolona), no grupo de animais que possuía um elevado nível de
alopregnanolona no hipocampo, ocorria uma redução dos níveis endógenos de
alopregnanolona, e conseqüentemente um aumento no tempo de imobilidade. No
entanto, nesta área cerebral não há ainda demonstração da ação deste neuroesteróide
sobre os receptores GABA
A
.
Outros modelos animais utilizados para a avaliação do efeito antidepressivo da
alopregnanolona também mostram efetividade no tratamento desta doença. No teste de
isolamento social, que responde apenas a drogas antidepressivas, mas não a outros
grupos farmacológicos (GARZON et al., 1979), camundongos submetidos a este modelo
possuem um nível mais baixo de alopregnanolona em certas regiões cerebrais (DONG et
al., 2001; GUIDOTTI et al., 2001). O tratamento com fluoxetina não altera os níveis
corticais de alopregnanolona dos animais não isolados, no entanto aumenta os níveis
corticais de alopregnanolona nos animais isolados (MATSUMOTO et al., 1999).
37
Um outro modelo animal de depressão, que difere da maioria por ser um modelo
cirúrgico, é a bulbectomia olfatória. Segundo Uzunova e colaboradores (2003) há uma
substancial elevação dos níveis de alopregnanolona no cérebro total e córtex cerebral
total, assim como um decréscimo em algumas regiões específicas como a amígdala e o
córtex frontal de animais bulbectomizados quando comparados com animais submetidos
à cirurgia simulada, o que demonstra uma completa desregulação, ou regulação não
uniforme, no conteúdo de alopregnanolona cerebral, em animais “tipo depressivos”.
Em pacientes que sofrem de depressão maior, a concentração de alopregnanolona
no plasma e no líquido cefalorraquidiano (LCR) está mais baixa que nos controles
(ROMEO et al., 1998; STRÖHLE et al., 1999, 2000). Essa concentração é revertida
após o tratamento clinicamente eficaz com fármacos antidepressivos, como fluoxetina
ou fluvoxamina, por um período de tratamento de 8 a 10 semanas (UZUNOVA et al.,
1998). Embora a maioria dos estudos atribua tais efeitos antidepressivos a sua atividade
moduladora indireta sobre os sistemas serotoninérgico e noradrenérgico (VAN
BROEKHOVEN; VERKES, 2003), não se descarta a possibilidade deste efeito resultar
da ação sobre o sistema GABAérgico. Em uma conclusão bastante questionável, porém
desafiadora, Uzunova e colaboradores (2005) afirmam que não existem estudos clínicos
satisfatórios que estabeleçam fortes correlações entre as taxas de alopregnanolona e a
melhora dos sintomas da depressão, e, principalmente, a relação entre este
neuroesteróide no LCR e plasma com sintomas depressivos.
38
1.3 GABA
Aminoácidos, como o GABA e o glutamato, são os mais abundantes
neurotransmissores presentes no SNC. O GABA é o mais importante neurotransmissor
inibitório do cérebro, e existe uma forte e crescente comprovação da associação entre a
atividade deste neurotransmissor e o mecanismo de ação de algumas drogas
antidepressivas (SHIAH; YATHAM, 1998).
A atividade da alopregnanolona sobre os receptores GABAérgicos esta
diretamente associada com sua estrutura molecular (Fig. 3). O GABA é uma molécula
muito pequena (103 Da), e a sua função mais importante no SNC é controlar o influxo
de um ânion ainda menor, os íons Cl
-
, de aproximadamente 35 Da. Esta função se dá
através de canais de Cl
-
transmembrana, constituídos por um complexo de cinco
subunidades de proteínas, cada uma com aproximadamente 50.000 Da. A ativação de
alguns destes canais pelo GABA pode ser controlada por uma variedade de substâncias
químicas, como barbitúricos, benzodiazepínicos e esteróides. Este canal é conhecido
como o complexo receptor GABA
A
-benzodiazepínico-Cl
-
, sendo seletivamente inibido
pela bicuculina. Além disto, o GABA ativa outros receptores, ligados à proteína G,
alterando o sistema de segundos mensageiros, através de receptores não sensíveis à
bicuculina, denominados GABA
B
e GABA
C
. Portanto, as funções do GABA no SNC
são mediadas através da interação com uma diversidade de receptores de alto peso
molecular, enzimas, e transportadores (ROBERTS, 2000).
39
Figura 3.
Alopregnanolona GABA
FIGURA 3: Esquema molecular da alopregnanolona e GABA. Apesar das
diferenças em relação ao peso molecular, radicais, conformação molecular (que não
podemos observar nesta figura), a alopregnanolona pode ligar-se com alta afinidade ao
receptor GABA
A
.
Em 1950, o GABA foi identificado e descrito no cérebro de vertebrados
(AWAPARA et al., 1950; ROBERTS; FRANKEL, 1950). Mais tarde, outros trabalhos,
conduzidos primeiramente em crustáceos, estabeleceram o GABA como um
neurotransmissor inibitório também em invertebrados (OTSUKA et al., 1966). Mais
recentemente foi constatada a presença de GABA em neurônios do SNP, assim como em
outros tecidos, como o pâncreas, e fluídos corporais (ROBERTS, 2000). Entretanto,
altas concentrações (acima de milimolar) no SNC de vertebrados, resultaram em uma
dificuldade muito maior de se estabelecer, com certeza definitiva, seu papel como
neurotransmissor no cérebro de mamíferos. Esta questão foi elucidada nos anos 70,
O
OH
H
2
N
40
quando estudos classificaram o GABA como um neurotransmissor clássico
(KRNJEVIC, 1974).
Outro fato que resultou na dificuldade de se estabelecer a função
neurotransmissora do GABA foi a distribuição difusa dos neurônios GABAérgico no
SNC, em contraste com a localização mais discreta e menos abundante de outros
neurotransmissores, como as aminas biogênicas, além de técnicas adequadas para
identificar neurônios GABAérgicos. Estudos imunohistoquímicos revelaram que muitos,
se não a maioria dos neurônios GABAérgicos no cérebro são interneurônios, sendo,
portanto, igualmente capazes de alterar a excitabilidade de circuitos sem uma região
cerebral determinada (ROBERTS, 1986).
A formação e degradação de GABA se dá por uma via chamada “GABA
derivação”, sugerida por ROBERTS e colaboradores (1953). Resumidamente, o α-
cetoglutarato, provindo do metabolismo da glicose a partir do ciclo de Krebs, é
convertido a glutamato pela GABA transaminase (GABA-T), outras transaminases e
glutamato desidrogenase; seguido da conversão de glutamato a GABA pela ácido-
glutâmico descarboxilase (GAD
65
e GAD
67
) (ROBERTS, 1986); passando à degradação
de GABA a semialdeído sucinato (SSA) pela GABA-T; e finalmente a oxidação do SSA
a sucinato pela semialdeído sucinato desidrogenase (SSADH) (ALBERTS;
SALVADOR, 1958).
O metabolismo de GABA é altamente compartimentalizado. Em cérebros de
adultos, somente neurônios produzem GABA e conduzem a completa “GABA
41
derivação”. Já as isoenzimas GAD, primeiramente relatadas como presente no cérebro
de camundongos, são expressas apenas em neurônios GABAérgicos e em certos tecidos
periféricos, onde também se sabe que ocorre a síntese de GABA. Como a maioria dos
neurotransmissores, o GABA é estocado em vesículas sinápticas. A síntese e degradação
tomam lugar em diferentes compartimentos subcelulares: as enzimas responsáveis pela
síntese, GAD
65
e GAD
67
, são associadas às vesículas citoplasmáticas ou ao citosol,
enquanto as enzimas catabólicas GABA-T e SSADH são mitocondriais
(SALGANICOFF; DEROBERTIS, 1965). As células gliais não contêm GAD, mas
contribuem para a recaptação, degradação e liberação de GABA, desempenhando um
papel em seu metabolismo (SHOUSBOE; WESTERGAARD, 1994).
Durante uma sinapse é estimada que a concentração de GABA esteja em níveis
milimolares, o que parece ser suficiente para saturar os receptores pós-sinápticos
(CLEMENTS, 1996). No entanto, não são necessários níveis tão altos de GABA para
ativar os receptores GABA, uma vez que o GABA pode ativar receptores localizados a
uma distância considerável do sítio de liberação, isto é, GABA pode ativar receptores
mesmo que exista uma substancial diluição (ROSSI; HAMANN, 1998). Martin e Tobin
(2000) explicam que esta habilidade das células e de receptores parcialmente purificados
em se ligar com GABA, em baixas concentrações, é consistente com a sua idéia de que o
GABA “não sináptico” desempenha um importante papel no SNC, principalmente em
resposta a eventos estressores.
42
1.3.1 Subunidades do Receptor GABA
A
Diferentemente do receptor GABA
B
, que é metabotrópico, acoplado à proteína
G, o receptor GABA
A
é ionotrópico e sua ativação resulta no aumento da condutância
iônica de Cl
-
da membrana, hiperpolarizando as células. As proteínas dos receptores
GABA
A
foram muito bem caracterizadas devido à sua abundância e a sua utilidade em
quase todos circuitos neurais. O receptor também foi extensivamente caracterizado em
seu papel como local de ação de muitos agentes neuroativos (BALDESSARINI, 2001).
Já em 1987 alguns estudos usando subseqüências parciais de aminoácidos a partir
de receptores purificados do cérebro de bovinos sucederam na clonagem de algumas
subunidades que compreendem os receptores GABA
A
(BARNARD et al., 1987;
SCHOFIELD et al., 1987). A partir deste momento soube-se que o receptor GABA
A
é
um membro de uma superfamília de receptores ligados a canais iônicos, que inclui os
receptores nicotínicos-colinérgicos, glutamato ionotróficos, e receptores glicínicos
(BARNARD et al., 1987).
A ativação dos receptores GABA
A
por agonistas requer a ligação e interação de
duas moléculas de GABA, responsável pelo aumento da média do tempo de abertura dos
canais do íon Cl
-
. O GABA ativa o receptor GABA
A
em baixas concentrações,
sugerindo que deve haver uma alta compartimentalização dentro do tecido nervoso. O
aumento da condutância do íon Cl
-
observada após ativação dos receptores GABA
A
resulta em hiperpolarização das membranas neuronais, inibindo a geração de um
43
potencial de ação. Esse decréscimo na excitabilidade da membrana neuronal resulta na
ação inibitória do GABA (MACDONALD; TWYMAN, 1991). Como a maioria dos
receptores, o GABA
A
pode ser definido pelos fármacos e outros ligantes que têm
afinidade seletiva e ainda estimulam ou bloqueiam a atividade destes receptores.
O muscimol, um análogo do GABA, isolado do fungo alucinógeno Amanita
muscaria, é um dos mais seletivos e potentes agonistas GABA
A
conhecido. Já a
bicuculina é o protótipo dos antagonistas competitivos, antagonizando a ligação do
GABA com o receptor GABA
A
. A picotroxina e outros convulsivantes extremamente
potentes, como o t-butilbiciclofosforotionato, são antagonistas não competitivos dos
receptores GABA, que não competem diretamente pelo sítio de ligação dos receptores
GABA, mas ligam-se a um sítio diferente de reconhecimento, associado com o
complexo de receptores GABA (SQUIRES et al., 1983). Há mais de dez anos sugeriu-se
a ocorrência de interações diretas entre os receptores GABA
A
e os esteróides
anestésicos, os anestésicos voláteis e o álcool (FRANKS; LIEB, 1994).
O receptor GABA
A
é composto por cinco subunidades transmembrana e sua
função depende de seu arranjo (Fig. 4). Novas subunidades de receptores são
descobertas constantemente, e assim novas teorias são conhecidas sobre a atividade
funcional e especificidade para os vários ligantes desta classe de receptores. Evidências
mostram que existem múltiplos subtipos de receptor GABA
A
no cérebro, sendo esta
idéia sugerida pela primeira vez devido às diferenças farmacológicas (PRITCHET et al.,
1989). As oito classes de receptores, que são agrupadas de acordo com sua composição,
estereoquímica e farmacologia, que são fatores inter-relacionados, são: α1–6, β1–4, δ, ε,
44
γ1–4, π, θ e ρ1-2 (BATESON et al., 1991; HARVEY et al., 1993; HEDBLOM;
KIRKNESS, 1997; HEVERS; LUDDENS, 1998; MEHTA; TICKU, 1999;
SINKKONEN et al., 2000; FUJII; MELLON, 2001). Sendo o receptor GABA
A
uma
proteína pentamérica, na qual as subunidades aglomeram-se em torno de um ponto
central, todas as subunidades não podem fazer parte de um único complexo deste
receptor (WISDEN; SEEBURG, 1992). Assim, uma imensa quantidade de combinações
pode ser formada, resultando em uma diversidade de afinidade por seus ligantes,
portanto farmacológicas, como a alopregnanolona. (PRITCHET et al., 1989). As
principais subunidades protéicas no cérebro de ratos compreendem as α, β, δ e γ, e
mesmo que se admita como sendo necessária a presença de, ao menos, uma subunidade
α, uma subunidade β e uma subunidade γ, existe uma alta variabilidade de combinações
possíveis (LAURIE et al., 1992; PERSOHN et al., 1992; WISDEN et al., 1992;
FRITSCHY; MOHLER, 1995; JECHLINGER et al., 1998; SIEGHART et al., 1999).
Um experimento detalhado descreve a presença de subunidades no hipocampo, que são:
α1, α2, α3, α4, α5, β1, β2, β3, δ e γ2, e as diferentes combinações resultarão em
diferentes especificidades por inúmeros ligantes (PIRKER et al., 2000).
45
Figura 4
FIGURA 4: Esquema do receptor GABA. O receptor GABA possui cinco
subunidades, que podem combinar-se de diversas maneiras. Os agonistas do receptor
GABA (+) são o muscimol, benzodiazepínicos, barbitúricos, esteróides neuroativos,
álcool, anestésicos. Já os antagonistas são a bicuculina, picotroxina, convulsivantes.
Figura adaptada de Rupprecht (2003).
Mesmo sendo subunidades de receptores distintas, existe uma correlação de
aproximadamente 70% entre as seqüências de polipeptídios dentro de uma classe e
aproximadamente 30% entre as classes. Além dessas subunidades, que são produtos de
genes separados, foram descritas uniões variadas de mRNA para várias subunidades.
Então, algumas questões foram levantadas: esta diversidade de formas do receptor
GABA
A
expressa nos neurônios estaria relacionada com diferentes localizações
membrana
agonistas
antagonistas
???
46
subcelulares, tendo uma função diferente? Ou seria apenas uma conseqüência da
redundância evolucionária? Whiting e colaboradores ainda consideram o fato que os
receptores GABA
A
são o sítio de ação de inúmeros agentes terapêuticos importantes,
todos possuindo efeitos colaterais questionáveis, além do seu efeito principal benéfico,
em grande parte ligado a suas atividades não seletivas em diversas subunidades de
receptores (WHITING et al., 2000).
Uma das principais alternativas metodológicas para se estudar o efeito da
alopregnanolona na expressão gênica das subunidades do receptor GABA
A
é através de
modelos de gravidez, ou pseudogravidez (TABELA 1). O período de gravidez de ratos
tem uma duração de 21 dias, com um pico da concentração de alopregnanolona, assim
como de outros neuroesteróides, no 19
o
dia, passando a uma acentuada queda destes
níveis e retornando a níveis normais a partir do 2
o
dia após o parto, permanecendo
inalterados até o 7
o
dia de lactação. Estas alterações provocam mudanças na densidade e
função do receptor GABA
A
e da expressão gênica das subunidades dos receptores
GABA
A
, cronologicamente similares às mudanças na concentração de alopregnanolona
(FENELON; HERBISON, 1996; FOLLESA et al., 1998; CONCAS et al., 1999).
Durante a gravidez, a quantidade relativa de mRNA da subunidade γ2L diminui
no córtex cerebral (10
o
ao 19
o
dia) e no hipocampo (15
o
ao 19
o
dia) de ratas, sendo que
retornam a níveis semelhantes aos controles (estro) após o parto (lactação) (FOLLESA
et al., 1998; CONCAS et al., 1999). Nestes estudos foi observado que a subunidade γ2S
não é alterada em nenhum período. Entretanto, a administração de contraceptivos orais
em ratas, que provocam uma queda acentuada nos níveis córtico cerebral de
47
alopregnanolona, assim como dos níveis plasmáticos em mulheres, produzem um
aumento da quantidade de mRNA das subunidades γ2S e γ2L, 24 horas após a
descontinuação do tratamento (FOLLESA et al., 2002).
O mRNA da subunidade α4 permanece inalterado durante o período de gravidez,
diferentemente do período de lactação, quando ocorre um aumento desta subunidade no
hipocampo (CONCAS et al., 1999). Os altos níveis de alopregnanolona após
administração intermitente de progesterona (SMITH et al., 1998a) ou através de um
modelo animal de pseudogravidez (SMITH et al., 1998b) também ocasionam um
aumento da expressão gênica da subunidade α4 do receptor GABA
A
no hipocampo de
ratas. Contudo, em outros trabalhos foi observado que esta alteração não ocorre no
hipocampo de ratas durante o período de lactação (FOLLESA et al., 1998). Em outras
estruturas, como no córtex cerebral, também não ocorrem alterações nas quantidades de
mRNA da subunidade α4 após a descontinuação do tratamento como contraceptivos
orais (FOLLESA et al., 2002), assim como na amígdala, após a queda dos níveis de
alopregnanolona (GULINELLO et al., 2003).
48
TABELA 1. Alteração da expressão gênica das subunidades de receptores
GABA
A
no hipocampo de ratos durante a gravidez e lactação.
Subunidade Condição Hipocampo
α1
Gravidez sem alteração
Lactação sem alteração
α2
G sem alteração
L sem alteração
α3
G sem alteração
L sem alteração
α4
G sem alteração
L aumento
α5
G não medida
L não medida
β2
G sem alteração
L sem alteração
γ2
G diminuição
L sem alteração
γ2S
G sem alteração
L sem alteração
γ2L
G Diminuição
L sem alteração
Dados extraídos de Concas e colaboradores (1999), Fenelon e Herbison (1996) e Follesa
e colaboradores (1998).
A partir destes dados, acrescidos das observações em diversos trabalhos em que
não ocorre alteração alguma na expressão gênica dos outros subtipos de receptores (α1,
α2, α3, β1, β2, β3), concomitante às alterações dos níveis de alopregnanolona,
(FOLLESA et al., 1998; CONCAS et al., 1999; FOLLESA et al., 2000; FOLLESA et
al., 2002), hipotetiza-se que as subunidades α4, γ2L e γ2S, estejam principalmente
envolvidas nas alterações fisiológicas provocadas por variações dos níveis de
alopregnanolona, e que estas proporcionam diferentes plasticidades aos receptores
49
GABA
A
. Esta hipótese está sustentada no fato de que as diferentes regiões cerebrais
possuem papéis fundamentalmente distintos nas alterações neuroquímicas, onde as
subunidades α4 e γ2 parecem estar associadas com alterações dos níveis de
alopregnanolona no hipocampo de ratos (Fig. 5).
Figura 5
FIGURA 5: Esquema tridimensional do hipocampo de rato (LABORATORY OF
NEURO IMAGING, 2006).
50
2. Justificativa
Se observa, portanto a) que a alopregnanolona possui um efeito antidepressivo
quando administrada por diferentes vias; b) que pode haver alterações de subunidades
dos receptores GABA
A
com variações dos níveis cerebrais de alopregnanolona; c) que
cada subunidade sofre influência independente uma da outra, d) e que, dependendo da
região cerebral, pode ocorrer alterações da expressão de mRNA de cada subunidade
através de variações da concentração de alopregnanolona. Por outro lado, não existem
estudos relacionando as subunidades e comportamentos depressivos com a
administração de alopregnanolona em áreas específicas que compreendem o sistema
límbico. Imagina-se ocorram alterações, já que alguns estudos apontam para o efeito da
alopregnanolona como antidepressivo e porque variações hormonais relacionadas a
alterações do humor podem depender dos receptores GABA
A
. Portanto, este estudo foi
planejado para compreender o papel das subunidades α4 e γ2 do receptor GABA
A
nos
efeitos antidepressivos da alopregnanolona. É nossa expectativa que ocorra alteração da
expressão gênica destas subunidades após o tratamento com a alopregnanolona
diretamente sobre o hipocampo, havendo correlação entre estas alterações
neuroquímicas e as alterações comportamentais de ratos machos.
51
3. Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito antidepressivo e a influência na expressão gênica de receptores
GABA
A
da alopregnanolona administrada no hipocampo de ratos.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar o efeito antidepressivo de três diferentes doses de alopregnanolona
administradas no hipocampo de ratos através do FST.
Avaliar a expressão gênica das subunidades α4 e γ2 do receptor GABA
A
no
hipocampo de ratos após a administração de três diferentes doses de alopregnanolona.
52
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73
Antidepressant Effect and Changes of GABA
A
Receptor γ
γγ
γ2 Subunit mRNA After
Hippocampal Administration of Allopregnanolone in Rats
Allopregnanolone antidepressive and GABA A effects
Nin, M.S.; Salles, F.B.; Azeredo, L.A.; Frazon, A.P.G.; Gomez, R.; Barros, H.M.T.
Division of Pharmacology, Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto
Alegre, Sarmento Leite, 245, PC 90050-170, Porto Alegre, RS Brazil
Correspondent author
Helena M.T. Barros
Pharmacology Division, FFFCMPA
R. Sarmento Leite, 245
90050-170 - Porto Alegre, Brazil
Phone: 55 -51-32248822 ext. 151
Fax: 55-51-32271899
74
Abstract
The present study aimed to verify the effect of bilateral intra-hippocampus
administration of the neurosteroid allopregnanolone (3α-hydroxy-5α-pregnan-20-one;
3α,5α-THP) in the forced swimming test (FST) and in the α4 and γ2 GABA
A
receptor
subunits gene expression. Results showed that bilateral intra-hippocampal
allopregnanolone administration of 2.5 µg/rat (p < 0.05) reduced immobile behavior and
increased climbing behavior in the FST. Overall, for all doses of allopregnanolone tested
(1.25 µg/rat, 2.5 µg/rat, 5.0 µg/rat), an increase of γ2 (p < 0.05) GABA
A
subunit mRNA
was observed. There was a higher increase in the γ2 gene expression in the right
hemisphere than in the left hemisphere (p < 0.01) after allopregnanolone treatment.
Intra-hippocampal allopregnanolone did not change the expression of the α4 subunits.
In conclusion, intra-hippocampal administration of allopregnanolone produces an
antidepressant-like effect in the FST at an intermediate dose, confirming the potential of
neurosteroids as a new class of antidepressant drugs. Our findings suggest that the γ2,
but not the α4 GABA
A
subunit, needs further evaluation to be involved in the
antidepressant effect of allopregnanolone in the hippocampus and that there is a
hemispheric diversity in the biochemical effect of the drug.
Keywords: allopregnanolone, forced swim test, GABA
A
receptor, depression,
gamma2, alpha4.
75
Introduction
Initial studies showed that allopregnanolone could modulate anxiety behaviors
(Crawley et al., 1986; Purdy et al., 1991), like most GABA-acting agents. Its effect on
mood disorders, mainly depressive-like behaviors, has been more studied only in the last
few years both in the clinical setting and with animal models (Uzunova et al., 2005).
During menopause a dysregulation in the levels of allopregnanolone and other
neurosteroids (Pearlstein, 1995) has been associated with depression and other mood
disorders (Girdler et al., 2001). In depressive patients, decreased allopregnanolone
plasma concentrations (Romeo et al., 1998; Ströhle et al., 1999) and cerebrospinal fluid
(CSF) levels (Uzunova et al., 1998) have been found. Furthermore, the administration of
the antidepressants fluoxetine or fluvoxamine (Romeo et al., 1998), among a variety of
other antidepressant drugs (Ströhle et al., 1999) normalize those decreased
allopregnanolone concentrations.
After olfactory bulbectomy, an animal model to detect antidepressant effects, a
significant decline of allopregnanolone levels may be observed in different brain
structures (Uzunova et al., 2003). Antidepressant treatments reverse the lower
allopregnanolone levels in bulbectomized animals, suggesting that normalization of
allopregnanolone levels might contribute to the antidepressant effects (Uzunova et al.,
2004). With another animal model, the forced swimming test (FST), there is also a
coincidence between higher levels of allopregnanolone in the hippocampus and less
depressive-like behavior (immobility) in proestrus female rats (Frye et al., 2000; Frye
and Walf, 2002). The postpartum rats, that show lower plasma and hippocampal
76
allopregnanolone levels when compared with pregnant rats, present longer immobility in
the FST. Finasteride, reduces plasma and hippocampal allopregnanolone levels and
enhances the immobility behaviors in pregnant (Frye and Walf, 2004) and in proestrus
rats (Frye and Walf, 2002).
Furthermore, intraperitoneal or intracerebroventricular allopregnanolone reduces
immobility time in mice submitted to the FST. These antidepressant-like effects of
allopregnanolone are potentiated by the GABA
A
receptor agonist muscimol and blocked
by the GABA
A
receptor antagonist bicuculline (Khisti et al., 2000; Khisti and Chopde,
2000). Also, when administered into the nucleus accumbens allopregnanolone reduces
immobility duration by increasing climbing activity and not changing the swimming
behavior (Molina-Hernández et al., 2005). All of these data contribute to the recognition
of the antidepressant effects of the neurosteroids in animals.
GABA receptor functions are modulated not only by γ-aminobutyric acid
(GABA), but also by benzodiazepines, barbiturates, convulsants and neurosteroids that
include allopregnanolone (Compagnone and Mellon, 2000), which is one of the most
potent positive allosteric modulators of the γ-aminobutyric acid type A (GABA
A
)
receptor (Lambert et al., 1995; Paul and Purdy, 1992). The 3α-reduced neuroactive
steroid allopregnanolone (3α-hydroxy-5α-pregnan-20-one; 3α,5α-THP), interacts with
GABA
A
receptors at low nanomolar concentrations, increasing the frequency and/or
duration of openings of the GABA-gated chloride channel (Majewska et al., 1986; Paul
and Purdy, 1992).
77
The GABA
A
receptor is composed of five transmembrane subunits and its
function depends on the arrangement of a variety of subunits (Hevers and Luddens,
1998; Mehta and Ticku, 1999; Hedblom and Kirkness, 1997, Fujii and Mellon, 2001).
During pregnancy, when there is an increase of allopregnanolone, the amount of the γ2L
subunit mRNA decreases in the cerebral cortex and in the hippocampus of rats. The
brain γ2L subunit mRNA levels return to basal values around delivery, whereas the α4
subunit mRNA remains unchanged and increases later in the postpartum period (Concas
et al., 1999). Moreover, the withdrawal of allopregnanolone either after intermittent
progesterone administration (Smith et al., 1998a) or in a model of pseudopregnancy
(Smith et al., 1998b) results in an increased expression of the α4 GABA
A
receptor
subunit in the rat hippocampus.
Other studies report that after the decrease in brain concentrations of
allopregnanolone caused by oral contraceptives, an increase in the abundance of GABA
A
receptor γ2L and γ2S subunits mRNAs, but not of α1, α3, α4, α5, β1, β2, β3 subunits
mRNAs in the cerebral cortex (Follesa et al., 2002). Additionally, in cultures of
mammalian cerebellar granule cells, chronic progesterone treatment down-regulates the
expression of γ2L and γ2S subunit mRNAs, and of the α1, α3 and α5 GABA
A
receptor
subunits mRNAs (Follesa et al., 2000). These neurochemical studies suggest a major
role of the γ2 and α4 GABA
A
subunit in allopregnanolone GABA
A
binding.
Until now, it has been demonstrated that allopregnanolone may have
antidepressant properties and may induce changes in the α4 and of γ2 GABA subunits.
However, none of these studies verified if both observations could be found in the same
78
animals. The purpose of the present experiment was also to verify if local injection of
allopregnanolone in the hippocampus induces antidepressant effects in the FST and if
the local injection of allopregnanolone alters the α4 and γ2 GABA
A
subunits gene
expression in the hippocampus.
Methods and Materials
Animals
Male Wistar rats (250-350 g; n=48) were obtained from the Animal House of
Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA). The
animals were housed in groups of five per polypropylene cage, with wood shavings as
bedding before surgery. After surgery they were maintained in isolated cages. Food and
water were available ad libitum, except when otherwise stated and the animals were
maintained in a temperature-controlled room (22± 2
o
C) under a light-dark cycle (lights
on from 7:00 a.m. – 7:00 p.m.). All in vivo experiments followed the guidelines of the
International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS) and were approved by the
Ethical Committee for Research of FFFCMPA. All efforts were made to minimize
animal suffering and to use only the number of animals necessary to produce reliable
scientific data.
79
Treatments
Immediately before administration, allopregnanolone (Sigma, St Louis, USA)
was dissolved in a 20% (w/v) 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Fluka, Seelze,
Germany) solution prepared in artificial cerebrospinal fluid (ACSF) (NaCl 147 mM;
CaCl
2
2.3 mM; KCl 4.0 mM; MgCl
2
0.9 mM; with unadjusted pH 7.1–7.3), to obtain
1.25 µg/µl, 2.25 µg/µl and 5 µg/µl solutions. The vehicle (0 µg/rat) was the 20% 2-
hydroxypropyl-β-cyclodextrin ACSF solution. The animals were randomly divided in
four subgroups, and were injected with the doses of allopregnanolone: 1.25 µg/rat, 2.5
µg/rat, 5.0 µg/rat or vehicle, with a volume of 0.5 µl in each side. Solutions were infused
at a constant rate of 0.25 µl/min through a microperfusion pump (CMA/ 102. Acton)
connected to a 27 gauge needle that was introduced 0.2 mm below the end of the guide
cannulae. To avoid reflux, the injection needles were removed from the guide cannulae
only 2 min after the end of the infusions.
Surgery procedure
Rats were anaesthetized with xylazine HCl (5 mg/Kg) and ketamine HCl
(100mg/Kg) i.p. and placed in the stereotaxic frame (Kopf). Bilateral cannulae were
placed in the hippocampus (bregma: antero-posterior: -3.8 mm; lateral: ± 2.0 mm and
vertical: - 2.0 mm, according to Paxinos and Watson, 1998). Cannulae were fixed to the
skull with two screws and dental cement.
80
Forced swimming test
On the eighth day after surgery, animals were exposed to the behavioral test. The
procedure followed a slightly modified Porsolt forced swimming test protocol (Porsolt et
al., 1977; Detke et al., 1995; Ferigolo et al., 1998). Briefly, the animals were
individually introduced in cubic glass pools (25 cm X 25 cm X 40 cm), filled with 30 cm
of water at a temperature of 25 (±1)
o
C. Two swim sessions were conducted: an initial
15-min training section followed 24 h later by a 5-min test section. Following both
sections, rats were removed from the pools, carefully dried with towels, and placed in a
heated room for 10 min and then returned to their home cages. Allopregnanolone or
vehicle solution was bilaterally administered three times: 24 h, 5 h and 1 h before the
test section. Because it was previously observed that allopregnanolone decreases motor
behaviors (Vivian et al., 1997), the animals were not tested for hyperactivity after drug
administration. Behaviors, in the test section, were videotaped for posterior analysis
using a BASIC written software (Kevin Willioma, KD Ware Computer, Boston, MA) by
a trained researcher that was blind to the different treatments.
Cannulae placement verification and structures removal
At the end of the behavioral testing, animals were euthanized by decapitation.
The brains were rapidly removed, frozen in liquid nitrogen and then were kept in a
freezer (-80
o
C). After brief thawing, the brains were cut in the cannulae incision area
and photographed for posterior placement analysis (Samsung–DigimaxV5), followed
81
by the hippocampus removal. Only animals with accurately placed cannulae were
considered for neurochemical analysis. Correct cannulae placement was verified in
thirty one of the forty eight animals that were submitted to surgery: 1.25 µg/rat (n = 7),
2.5 µg/rat (n = 7), 5.0 µg/rat (n = 7) and vehicle (n = 10) (Fig. 1).
[Figure 1 near here]
RT-PCR procedure
Total RNA was extracted from the hippocampus using Trizol
TM
Isolation
Reagent Kit (Invitrogen, São Paulo, Brazil) according to the instructions of the
manufacturer. The yield of total RNA was determined by measuring the absorbance
(260/280 nm) of diethyllpyrocarbonate (DEPC)-treated water aliquots of samples. All
RNAs samples were resuspended in DEPC-treated water (Invitrogen, São Paulo, Brazil)
and stored at -80°C. A semi-quantitative RT-PCR technique was used to determine the
presence of α4 and γ2 GABA
A
subunit transcripts in the samples. A 3 µg aliquot of total
RNA extracted from the hippocampus was reverse transcribed using the SuperScript
TM
First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) according to
the instructions of the manufacturer. The cDNA obtained was PCR amplified in a DNA
thermal cycler (MJ Research, Watertown, Mass., USA) using specific primers derived
from the coding region α4 and γ2 GABA
A
subunits from Rattus novergicus. The
following set of specific α4 subunit was from 5’ to 3’: sense
GGTGAAAACTGATATATATGTCAC and antisense
82
CCACCTAAAAGGATACCTGCCA, that generates a 331 bp product; and γ2 subunit
was from 5’ to 3’: sense CAGCACCATAGCCCGGAAG and antisense
CTGTGCCCTCCTATGTGTAG, that generates a 354 bp product. The set of α4 and γ2
GABA
A
subunits primers were determined based on the National Center for
Biotechnology Information (NM_080587.1 and XM_ 220329.1, respectively) from
Rattus novergicus. In the same PCR reaction for GABA
A
subunit, the housekeeper gene
β-actin was coamplified in order to evaluate inter-sample variation in cDNA contents
and PCR efficiency. The β-actin specific primer pairs were: sense
TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG and antisense: TTGATGTCACGCACGATTTCC,
that generates a 515 bp product (Alonso et al., 1986).
The RT-PCR reaction amplification for the α4 and γ2 subunits were performed
in a final volume of 25µl and contained 1µl cDNA products, 1 U Taq DNA polymerase
(Invitrogen, São Paulo, Brazil), 1.5 mM MgCl
2,
0.2µM specific primer pairs, and
200µM dNTPs. The α4 amplification was performed with an initial denaturation step at
94°C for 3 min followed by 40 cycles; each cycle at 94ºC for 1 min; 60°C for 1 min and
72ºC for 1 min; and final extension at 72°C for 5 min. The 0.2µM of β-actin primers set
was added with the other components. The γ2 subunit was performed with an initial
denaturation step at 94°C for 3 min followed by 40 cycles; each cycle at 94ºC for 1 min;
56°C for 1 min and 72ºC for 1 min; final extension at 72°C for 5 min. The 0.2µM of β-
actin primers set was added after 5 cycles. The PCR products (10µl) were separated on
1.5% (W/V) ethydium bromide agarose gel, photographed under UV illumination. An
ImageMaster UDS System captured the images. The optical density (O.D.) of the α4
83
and γ2 GABA
A
subunits and β-actin bands were measured using the program “Software
Gel Analyzer”. The O.D. values obtained for α4 and γ2 GABA
A
subunit mRNA were
divided by the β-actin O.D. values. The α4/β-actin and γ2/β-actin ratios were used for
statistical analysis.
Behavioral analysis
The frequency and duration of acts and postures (climbing, swimming, diving,
head-shakes, total mobility and immobility) were detailed for each animal during the
300 sec of analysis in the test day section. These behavioral analyses have been
described previously and have shown both reliability and validity for detecting
antidepressant effects of both noradrenergic, serotoninergic and dopaminergic drugs in
the FST (Detke et al., 1995; Barros and Ferigolo, 1998, Miura et al., 1996; Ferigolo et
al., 1998). The animals were judged to be in immobile behavior when performing no
movements other than breathing, or when only slight paw movements to keep afloat,
with no dislocation across the water, were seen. The mobile acts could be characterized
as diving, swimming or climbing. Diving was considered when the animals tried to
escape through the bottom of the aquarium. Swimming was measured when the rats
were making vigorous lateral movements with their forepaws, displacing their bodies
parallel to the aquarium walls. Climbing was counted when the rats were performing
active up and down movements with both forepaws close to the aquarium walls, as if
trying to escape. Headshakes were counted when the animals made abrupt horizontal
84
head movements. The latency for the first immobility posture after any mobility act in
the beginning of the test session was also measured.
Statistical analysis
To verify the behavioral effects of the doses of allopregnanolone in the
hippocampus, parameters of the forced swimming test were analyzed with a One-Way
Analysis of Variance (One Way ANOVA), followed by the Student-Newman-Keuls test
when appropriate.
To compare the effects of allopregnanolone in α4 or γ2 GABA
A
mRNA
expression, data were analyzed using a Two Way ANOVA, considering the two
hemispheres and the four doses as dependent factors. One Way ANOVA, followed by
the Student-Newman-Keuls test was also used to analyze the mRNA expressions in each
hemisphere using doses as dependent variables. Pearson’s correlation was used to verify
if there was an association between the α4 and γ2 GABA
A
subunit expression and the
behaviors. All data were presented as means + standard error of the mean. Differences
were considered significant at p<0.05.
Results
Behavioral effects of allopregnanolone in the FST
85
When compared to controls, only the animals treated with 2.5 µg/rat of
allopregnanolone showed a significant decrease in immobility behavior in the test
section of the forced swimming test (F
(3, 27)
= 4.56; p = 0.011) (Table 1). Consequently,
these animals spent significantly more time performing the behaviors that compose the
mobility parameter (F
(3,27)
= 4.48; p = 0.012). Diving and swimming were quick active
behaviors, lasting a few seconds and therefore, did not contribute to the total mobility
time. Because climbing was the most common behavior within total mobility, it
increased significantly at the doses of 2.5 µg/rat, (F
(3,27)
= 4,24; p = 0.014).
When analyzing the frequency of the behaviors (Table 1), no differences were
found. The number of times that the animals changed from climbing to other mobile
behaviors or to immobility was similar in each dose group. The treatment with any of
the three doses of allopregnanolone showed a tendency to increase latency of immobility
(Table 1), not reaching statistical significance. Interestingly, there was a significant
inverse correlation between the latency and the duration of immobility (r = -0.549; p =
0.034), and a direct correlation between immobility latency and total mobility duration
(r = 0.567; p = 0.004) or climbing duration (r = 0.629; p < 0.001).
Effect of allopregnanolone in the expression of GABA
A
subunit mRNAs
The expression of α4 and γ2 subunit mRNA was measured by RT-PCR (Fig. 2).
[Figure 2 near here]
The analysis of α4 mRNA expression in the hippocampus of animals from the
86
three allopregnanolone treatment groups did not differ significantly from the control
group (Fig. 3A). When the two hemispheres were analyzed separately, no significant
difference of α4 mRNA expressions was seen (Fig. 3C). Also, no significant correlation
was observed between behaviors and α4 subunit mRNA expressions of both
hemispheres. By analyzing the hemispheres results separately, it was seen that there was
a weak inverse correlation between α4 subunit expression in the left hemisphere and
immobility (r = -0.401, p = 0.047); also, there was a weak direct correlation between α4
subunit expression in the left hemisphere with climbing (r = 0.415, p = 0.039) and with
total mobility (r = 0.411, p = 0.041) (Table 2).
[Figure 3 near here]
The three allopregnanolone treated groups showed an increase of the expression
of γ2 mRNA, when compared to the control group (F
(3, 61)
= 9.649, p = 0.003), as can be
seen in Fig. 3B. In the same groups, when analyzing different treatments effects in the
two hemispheres separately (Fig. 3D), there was a statistically significant difference
between the right hemisphere and the left hemisphere (F
(3, 61)
= 4.33, p = 0.008). There
was also a significant treatment effect (F
(3, 30)
= 6.049, p = 0.002), where
allopregnanolone doses increased the ratio of the γ2 GABA
A
subunit expression. This
was more evident in the right hemisphere then in the left hemisphere. Nevertheless, the
effect of different treatments did not depend on a significant interaction between
treatment and the hemispheres. When analyzing the correlation between the behaviors
and gene expression, the only significant association found was between the γ2 gene
expression in the right hemisphere and “climbing” (r = 0.407, p = 0.039) (Table 2).
87
Discussion
In this study it is shown that administration of allopregnanolone into the
hippocampus reduced immobile behavior and increased climbing behavior of rats in the
forced swimming test. This observation corresponds to reports of anti-immobile effects
after intraperitoneal or intracerebroventricular allopregnanolone administration (Khisti et
al., 2000; Khisti and Chopde, 2000). It also complements information regarding
physiological changes that influence neurosteroid levels in female rats, with the presence
of higher levels of allopregnanolone in the hippocampus and less depressive-like
behavior (Frye et al., 2000; Frye and Walf, 2002) or lower allopregnanolone levels in
the hippocampus and longer immobility in the FST (Frye and Walf, 2002; Frye and
Walf, 2004).
Key brain structures and neural circuits are involved in mood disorders. The
circuitry involves the caudate and putamen, which have major connections with other
structures like the hippocampus, which in turn have connections with the prefrontal
cortex. Dysfunction at different anatomical points of this neural circuitry may result in
depression (Soares and Mann, 1997). In this study it is shown that the administration of
a prospective antidepressant agent into one of the participating brain structures of the
circuitry decreases depressive-type behaviors in rodents. Allopregnanolone decreases
immobility of rats in the FST when infused into the hippocampus, increasing climbing
behavior similar to the effects seen when allopregnanolone was administered into the
nucleus accumbens (Molina-Hernández et al., 2005). The FST is largely used to predict
the clinical efficacy of many types of antidepressant treatments. It is performed in most
88
studies using circular pools (Porsolt et al., 1977; Detke et al., 1995) and reproducible
behavioral outcomes are seen when the experiments are performed in cubic pools with
similar surface area and same volume of water (Ferigolo et al., 2003; Barros and
Ferigolo, 1998). This animal model has a good sensitivity and good selectivity (Borsini
and Meli, 1988), which gives confidence that the behavioral effect for antidepressants
screening is robust.
GABA
A
receptor binding may be modulated by many classes of drugs used to
treat mood disorders and modify behaviors (Compagnone and Mellon, 2000). A
neurosteroid with antidepressant effects, allopregnanolone, is one of the most potent
positive allosteric modulators of this receptor (Majewska et al., 1986; Paul and Purdy,
1992; Lambert et al., 1995). The role of allopregnanolone in major depression is
consistently described. In depressive patients, allopregnanolone plasma concentrations
and cerebrospinal fluid (CSF) levels are decreased while treatment with fluoxetine
normalizes this decreased concentration, relieving depressive symptoms (Romeo et al.,
1998; Uzunova et al., 1998). The immobility behavior of rodents in the forced
swimming test is a phenomenon that models some aspects of depression in humans and
its decrease reliably leads to the detection of antidepressant substances (Porsolt et al.,
1977; Detke et al., 1995; Ferigolo et al., 1998; Barros and Ferigolo, 1998). Our findings,
showing an important role of the hippocampus on the antidepressant effects of
allopregnanolone match with the observations of high allopregnanolone levels in the
hippocampus of proestrus female rats, which also show a decrease in the immobile
duration in the FST (Frye et al., 2000; Frye and Walf, 2002). Moreover, these findings
are in accordance to the reports of allopregnanolone reducing immobility behavior in the
89
FST when given intraperitoneally, intracerebroventricularly (Khisti et al., 2000; Khisti
and Chopde, 2000) or intra-nucleus accumbens (Molina-Hernandez et al., 2005). As
described by Molina-Hernández et al. (2005), the antiimmobility effect of
allopregnanolone is accompanied by an increase in the climbing behavior, similar to the
behavioral effects of the selective norepinephrine reuptake inhibitors agents (Detke et
al., 1995). At a recent study, the minimum intraperitoneal allopregnanolone dose to
evoke an antiimmobility behavior in the FST was 1.0 mg/Kg. This dose does not induce
motor behavioral changes in the open-field test, excluding the fact that increased motor
activity might be an explanation for the anti-immobility effect of allopregnanolone
(Rodriguez-Landa, 2006). In fact, 10 to 30 times higher doses of allopregnanolone
decrease locomotion of rodents (Vivian et al., 1997).
The results described here also reveal that there is an increase of the γ2 subunit
mRNA, after allopregnanolone was administered into the hippocampus. Differently from
the results of the behavioral test, where only the intermediate dose induced an
antidepressive-like effect, all allopregnanolone doses increased the γ2 GABA
A
subunit
gene expressions. An easy tentative explanation for the dissociation between behavioral
and neurochemical results refers to the fact that the higher dose of allopregnanolone
could induce a non-specific behavioral effect that diminishes the expression of the
antidepressant outcome of the drug. A more elaborate explanation would have to involve
mechanisms that regulate the trafficking and membrane stability of GABAA receptors at
synapses, as recently reviewed by Luscher and Keller (2004). Future studies could
explore the many possible post-translational modifications of receptors involved in
90
functional modulation of GABA transmission. These studies should explore the
receptors intracellular loop interaction sites for putative trafficking and postsynaptic
scaffold proteins, as well as phosphorylation sites for diverse kinases. It still remains to
be described if prolonged exposure to neurosteroids down-regulate GABA
A
receptors. In
this case, there could be an internalization of GABA
A
receptors by endocytosis or even
allosteric uncoupling of GABA binding from neurosteroid binding sites, as seen with
benzodiazepines (Luscher and Keller, 2004). An alternate proposed explanation for our
observations with allopregnanolone could involve induction of tonic inhibition of cell
currents through extra-synaptic GABA
A
receptors with the higher doses of
allopregnanolone (Lambert et al., 2003)
GABA
A
receptor function depends on the combination of 18 presently known
subunits (α1–6, β1–4, δ, ε, γ1–3, π, and ρ1-2) (Hevers and Luddens, 1998; Mehta and
Ticku, 1999; Hedblom and Kirkness, 1997). Allopregnanolone is described to
selectively interact with γ2 GABA
A
receptor subunits, because increasing amounts of
circulating allopregnanolone during pregnancy induce a decrease of γ2L subunit mRNA
in the cerebral cortex and in the hippocampus (Concas et al., 1999). Persistent reduction
in the brain concentrations of allopregnanolone in rats is associated with increased
abundance of GABA
A
receptor γ2L and γ2S subunit mRNAs in the cerebral cortex
(Follesa et al., 2002). Additionally, chronic progesterone treatment down-regulates the
expression of γ2L and γ2S subunit mRNAs in cultures of mammalian cerebellar granule
cells (Follesa et al., 2000). It strongly calls ones attention that allopregnanolone
administration into the hippocampus in the present experiments increased the γ2
91
subunits mRNA instead of decreasing it, as expected. Our results of increased γ2 mRNA
expression after allopregnanolone treatment are completely different from these previous
observations. This difference could be due to the brain areas taken in account and we
may also propose that in the hippocampus increased amounts of allopregnanolone, in a
sub-acute treatment protocol, sensitize the γ2 subunit gene expression. Synaptic
receptors trafficking or extra-synaptic GABA
A
receptors need to be studied in
combination with the measurement of levels of mRNA for an accurate understanding of
the relationships between gene expression of receptors subunits and the antidepressant
effects of some doses of allopregnanolone (Lambert et al., 2003; Luscher and Keller,
2004).
An alteration of α4 gene expression in the hippocampus due to allopregnanolone
treatment was not observed in this study, in contrast with reported changes in the
amygdala (Gulinello et al., 2003) or in the hippocampus (Smith et al., 1998a; 1998b;
Concas et al., 1999). In accordance to our results, the α4 GABA
A
receptor subunit
remained unchanged during pregnancy and increased only at the postpartum period
suggesting that the changes in γ2L and α4 subunits due to progesterone metabolites are
time and region specific and do not represent a generalized phenomenon (Concas et al.,
1999). Herein, there is an inverse correlation between the α4 gene expression in the left
hemisphere and the immobility behavior, but there is no significant difference between
the treatments with allopregnanolone and the α4 gene expression within the two
hemispheres combined. This weak correlation may be biologically irrelevant.
Other factors analyzed, which were not a primary goal of this study, were the
92
neurochemical differences between the hemispheres. There is a difference between
hemispheres, with a higher γ2 GABA
A
receptor subunit gene expression in the right
hemisphere. However, the difference between the results of the hemispheres in the
control group of animals is lower than the difference after treatment with the higher dose
of allopregnanolone, pointing to a possible pharmacological difference in the two
hemispheres. Asymmetrical changes in brain biochemistry may also be present in mood
disorders in humans (Soares and Mann, 1997). As reviewed previously, regional brain
glucose metabolism studies of depressed patients found increased metabolism in the
right hemisphere and lower right-sided blood flow. In these studies, mood activation
tasks increased blood flow in the left amygdala and decreased blood flow in the right
amygdala (Schneider et al., 1995). Thus, there is conflicting evidence of changes in
brain hemisphere laterality in unipolar and bipolar patients in the functional
neuroimaging literature (Soares and Mann, 1997). Another difficulty with the clinical
studies is to interpret the evidence already gathered regarding antidepressant medication
effects on local and regional cerebral blood flow and metabolism. Thus, the pre-clinical
studies may be useful to help gather growing evidence of neurochemical and other
functional differences between brain hemispheres in regard to depression. Future studies
are needed in order to determine the importance of the asymmetric γ2 expression effects
for the pre-clinical and clinical antidepressant responses to allopregnanolone.
In summary, intra-hippocampal administration of the neuroactive steroid
allopregnanolone exhibits an antidepressant-like effect in the forced swimming test, in
accordance with other studies. Differing from other studies which induced indirect
93
changes in allopregnanolone levels by modification of progesterone metabolism or
secretion, our findings suggest that the γ2 and α4 GABA
A
receptor subunits in the
hippocampus of rats may not be the main targets involved in the antidepressant effect of
allopregnanolone. The importance of the serotonergic, dopaminergic and noradrenergic
neurotransmitter systems and of intracellular biochemical mechanisms for
allopregnanolone effects needs yet to be evaluated.
Acknowledgment
The authors thank the support from AAPEFATO and CNPq (HMTB) and the
fellowships from CAPES (APGF, MN) and CNPq (RG).
94
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A
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Withdrawal from 3α-OH-5α-pregnan-20-one using a pseudopregnancy model alters the
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the National Academy of Sciences USA 95: 3239–3244
43. Uzunova V, Wrynn A S, Kinnunen A, Ceci M, Kohler C, Uzunov D P (2004)
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vocalizations in rat pups: modulation at the γ-aminobutyric acid
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the neurosteroid recognition site. Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics 282(1): 318–325
100
FIG. 1. The approximate cannulae placement for injections in the hippocampus (from
top to bottom: -3.3, -3.6, -3.8, -4.0 mm from bregma) are indicated by the circles (n=31).
Representative sections were taken from Paxinos and Watson (1998).
FIG. 2. Ethidium bromate-stained gel showing semi-quantitative RT-PCR analyses of
α4 (A) and γ2 (B) GABA
A
subunit in the hippocampus of rats treated with
allopregnanolone (1.25 µg/rat, 2.5 µg/rat, 5.0 µg/rat) and control solution.
FIG. 3. Amounts of α4 mRNA (A) and of γ2 mRNA (B) in both brain hemispheres and
of α4 mRNA (C) and γ2 mRNA (D) in the right hippocampus (RH) and in the left
hippocampus (LH) measured by RT-PCR. Rats were treated with allopregnanolone or
control solutions 24 h, 5 h and 1 h before the forced swimming test. n = 7-10 rats per
group. Data are expressed as means ± S.E.M.of optical density ratio (GABA
A
subunit/β-
actin) *represents p<0.05 vs. control group. #represents p<0.05 RH vs. LH.
101
TABLE 1: ANALYSIS OF DURATION AND FREQUENCY OF THE BEHAVIORS
IN FST TREATED WITH ALLOPREGNANOLONE (ALLO) 1.25µg/rat, 2.5 µg/rat,
5.0 µg/rat AND CONTROL (0 µg/rat)
Treatment
Latency
Immobility
Climbing
Mobility
Head-Shake
0 (n=7) 25.0 ± 18.7
222.3 ± 41.3
75.9 ± 39.8
77.9 ± 41.5
-
1.25 (n=7) 51.6 ± 30.3
205.4 ± 40.3
91.6 ± 42.2
93.9 ± 39.8
-
2.5 (n=7) 47.8 ± 27.9
154.5 ± 34,8 *
140.3 ± 33.1 *
144.7 ± 34.7 *
-
5 (n=10) 44.6 ± 23.5
179.4 ± 28.9
116.6 ± 27.9
120.3 ± 29.0
-
F (3, 27) 1.51
4.559
4.243
4.483
-
Duration
P > 0.05
0.011
0.014
0.012
-
0 (n=7) -
7.9 ± 2.8
7.6 ± 2.9
8.4 ± 3.4
37.0 ± 19.0
1.25 (n=7) -
6.9 ± 2.7
6.0 ± 2.3
6.7 ± 3.0
43.5 ± 27.7
2.5 (n=7) -
8.3 ± 2.8
8.2 ± 2.9
10.5 ± 3.6
27.9 ± 17.4
5 (n=10) -
7.5 ± 2.3
8.5 ± 3.7
11.2 ± 6.6
23.0 ± 21.9
F (3, 27) -
0.38
0.42
1.48
1.47
Frequency
p -
> 0.05
> 0.05
> 0.05
> 0.05
The values are expressed as mean ± SEM
*Represents difference between treatments.
102
TABLE 2: CORRELATION AMONG EXPRESSION OF THE GABA
A
RECEPTOR
α4 AND γ2 SUBUNITS (RATIO) AND THE BEHAVIORS (IMMOBILITY,
CLIMBING AND TOTAL MOBILITY) AT FST.
Immobility Climbing Mobility
α4 RH
-0.064 0.072 0.064
α4 LH
-0.401 * 0.415 * 0.411 *
α4 M
-0.252 0.234 0.233
γ2 RH
-0.356
0.407 *
0.357
γ2 LH
-0.023 0.005 0.018
γ2 M
-0.312 0.340 0.308
*p<0.05 Pearson’s correlation;
103
FIG.1
104
FIG. 2
A
B
DNA
0 1.25 2.5 5.0
marker
515 bp (β
ββ
β-actin)
354 bp (
γ
γγ
γ
2)
515 bp (
β
ββ
β
-actin)
331 bp (
α4)
α4)α4)
α4)
105
A
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
0 1,25 2,5 5
Allopregnanolone (ug/rat)
Ratio
C
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0 1,25 2,5 5
Allopregnanolone (ug/rat)
Ratio
RH
LH
D
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0 1,25 2,5 5
Allopregnanolone (ug/rat)
Ratio
RH
LH
#
* * *
B
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
0 1,25 2,5 5
Allopregnanolone (ug/rat)
Ratio
* * *
FIG. 3
106
Journal of Psychopharmacology
Published in Association with British Association for Psychopharmacology
Editors:
David J Nutt University of Bristol, UK
Pierre Blier University of Ottawa, Canada
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108
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Cumulated Index Medicus.
Journal references:
Rickels K, Schweizer E, Clary C, Fox I, Weise C (1994) Nefazdone and
imipramine in major depression: a placebo-controlled trial. Br J
Psychiat 164: 802-805
Book references:
Eysenck M W (1992) The nature of anxiety. In Gale A, Eysenck M W
(eds), Handbook of individual differences: biological perspectives.
John Wiley, Chichester
Maxwell S, Delaney H (1990) Designing experiments and analysing
data: a model comparison perspective. Wadsworth, Belmont, CA
110
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the text, carry brief but complete titles, and be numbered
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near here]. They should, for preference, be supplied at reproduction
size (single- or double-column width), and lettering should be no
smaller than 8pt type. Computer-generated artwork must be
submitted as laser printed output at a resolution of 600 dots per inch.
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their place. Photographs should be supplied as sharp black and white
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markers; any symbols, arrows or letters used should be clearly visible
against the background.
Legends should be explanatory but succinct. They should carry the
arabic numerals applicable to the figures, and be provided as a
separate typed (double-spaced) list at the end of the paper, along
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whether the procedures followed were in accordance with the ethical
standards of the responsible committee on human experimentation
(institutional or regional) or with the Declaration of Helsinki 1975,
revised Hong Kong 1989. Do not use patients' names, initials or
hospital numbers, especially in illustrative material. When reporting
experiments on animals, indicate whether the institution's or the
National Research Council's guide for, or any national law on, the care
and use of laboratory animals was followed.
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