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CentroUniversitárioFeevale
ProgramadePósGraduaçãoemGestãoTecnológica
MestradoemQualidadeAmbiental
GRAZIELAMARIASCHUH
ESTUDODAINSTABILIDADEGENÔMICACAUSADAPORVÍRUS,
DROGASANTIRETROVIRAISEOUTROSFATORESAMBIENTAISEM
PACIENTESHIVPOSITIVO
NovoHamburgo, 2007
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2
CentroUniversitárioFeevale
ProgramadePósGraduaçãoemGestãoTecnológica
MestradoemQualidadeAmbiental
GRAZIELAMARIASCHUH
ESTUDODAINSTABILIDADEGENÔMICACAUSADAPORVÍRUS,
DROGASANTIRETROVIRAISEOUTROSFATORESAMBIENTAISEM
PACIENTESHIVPOSITIVO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Gestão Tecnológica como requisito
para a obtenção do título de mestre em Gestão
Tecnológica:QualidadeAmbiental
Orientador:Prof.Dr.SharbelWeidnerMaluf
NovoHamburgo, 2007
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3
DADOSINTERNACIONAISDECATALOGAÇÃONAPUBLICAÇÃO(CIP)
Bibliotecáriaresponsável:RosângelaTerezinhaSilva–CRB10/1591
Schuh,GrazielaMaria
Estudo da instabilidade genômica causada por vírus, drogas anti
retrovirais e outros fatores ambientais em pacientes HIV positivo /
GrazielaMariaSchuh– 2007.
XXf.;30cm.
Dissertação (Mestrado em Qualidade Ambiental) –
Programa de PósGraduação em Gestão Tecnológica:
Mestrado emQualidade Ambiental ImpactoBiológico,
CentroUniversitárioFeevale,NovoHamburgo,2007.
Incluibibliografiaeapêndice.
“Orientador:Prof.Dr.SharbelWeidnerMaluf”.
1. Pessoas HIVPositivo. 2. Antiretrovirais. 3. Genotoxicidade. I.
Título.
4
GRAZIELAMARIASCHUH
ESTUDODAINSTABILIDADEGENÔMICACAUSADAPORVÍRUS,
DROGASANTIRETROVIRAISEOUTROSFATORESAMBIENTAISEM
PACIENTESHIVPOSITIVO
Dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora em 28 de fevereiro de 2007,
conferindoaoautorotítulodemestreemGestãoTecnológica:QualidadeAmbiental.
ComponentesdaBancaExaminadora:
......................................................................
Prof.Dr.SharbelWeidnerMaluf
FEEVALEOrientador
......................................................................
Prof.Dr.BernardoErdtmann
UFRGSExaminador
......................................................................
Prof.Dr.LucianoBassodaSilva
FEEVALE Examinador
5
AGRADECIMENTOS
AgradeçoaDeusporestarsempreaomeulado,mostrandoocaminhoaseguir.
Àminhafamília,agradeçoacompreensãoetodooamordedicadoparaqueeupudesseconcluir
maisumaetapaprofissional.
AoDr.Sharbelpelaincansáveldedicaçãoparaqueestetrabalhopudesseserrealizado,sempre
mostrandoadireçãoasertomadanosmomentosdedúvidas.
E não poderia esquecer dos grandes amigos que fiz ao longo do Curso Mestrado em Gestão
Tecnológica:QualidadeAmbiental,pelaamizadeecompanheirismo.
6
RESUMO
O vírusHIV podecausar mutaçõesnascélulas infectadas,proporcionando maiorrisco parao
desenvolvimento de tumores. Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a freqüência de
instabilidade genômica causada por vírus, por drogas antiretrovirais e outros fatores ambientais
atravésdatécnicademicronúcleoscombloqueiodacitocineseeensaiocometa,emindivíduosHIV+
sem o com o uso de drogas ARVs e como objetivos específicos: avaliar o efeito genotóxico da
contaminação viral através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de micronúcleo e
cometa;avaliaro efeito dasdrogasatravésdos índicesdedano de DNAmedidos pelastécnicas de
micronúcleoecometa;avaliaroefeitogenotóxicodeoutrosfatorescomoidade,sexoetabagismoem
indivíduosHIV+comesemusodeARVsenogrupocontroleatravésdosíndicesdedanodeDNA
medidospelastécnicasdemicronúcleoecometa.Aamostraconstoudeumtotalde135indivíduos.
Foramrealizadasastécnicasdocometaedemicronúcleoscomobloqueiodacitocienese.Osvalores
destaavaliação,assimcomooutrosparâmetros,comoacargaviral(CV)eataxadeTCD4+foram
analisadoserelacionadoscomousodedrogaseoutrosfatoresambientais.Osdadosdemonstraram
que os pacientes HIV+ sem ARVs apresentam os maiores níveis de dano de DNA pela técnicado
cometa,quandocomparadoscomoscontroles(p=0,007),demonstrandoumefeitogenotóxicodacarga
viral,queapresentouseelevadaemrelaçãoaospacientesemtratamento(p<0,001).AtaxadeTCD4+
nãoapresentoudiferençaestatisticamentesignificativaentreosgruposHIV+semecommedicação.
As drogas, quando analisadas individualmente, não apresentaram um efeito genotóxico detectável
pelas nossas avaliações. Entre os pacientes HIV+ com ARVs, os fumantes apresentaram uma
freqüênciademicronúcleosestatisticamentemaiordoqueosnãofumantes(p=0,020),indicandoum
possível efeito sinérgico entre as drogas ARVs e o tabagismo. Este achado é importante para o
7
aconselhamentodospacientesnosentidodemelhorarsuaqualidadedevidaeevitaroutrosproblemas
secundáriosdesaúde,comoodesenvolvimentodeneoplasias,quepodesercausadopeloacúmulode
mutações.Nãoficouevidenciado,nesteestudo,ainfluenciadosexoedaidadenosíndicesdedanode
DNA.
Palavraschave:vírusHIV,drogasantiretrovirais,genotoxicidade,técnicademicronúcleo,técnicado
cometa.
8
ABSTRACT
Thehumanimmunodeficiencyvirus(HIV)maycausemutationsininfectedcells.Thegeneral
objectiveofthepresentstudywastoevaluatethefrequencyofgenomicinstabilitycausedbyvirus,
antiretroviral drugs and other ambient f󰜲󰜳󱴡󱨴󱜱󰝕󵐋'󰼁󳰪󳭫󰜱󰜱󰜲tf󰜲󰜳󱴡󱨴󱜱󱠡󲀲󰜴󱨱󱜡󳭮󰼁󲼪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜺󱠶󰜴󱨱󱜡󳭮,󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󱠡󱤱󱴳󰜴󱨱󱜡󳬺󱴁󳭫󰜱󰜱󰜲󰜹󱠴󰜴󱨱󱜡󳭮󲀩l󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󳼡󱠱󱜴󰜴󱨱󱜡󳭮s󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󱠡󱠹󱠷󰜴󱨱󱜡󳭮󱜩ca󱁕󵄋󱠡󱜡󳌡󱠱󱬵󰜴󱨱󱜡󳭮n󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󱠡󱤵󱬡󱨴󱜱󰝕󵐲󱜩t󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󳄡󱠡󱠺󱬺󰜴󱨱󱜡󳭮󱠩i󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󱠡󱠳󱠹󰜴󱨱󱜡󳭮󱠩e󱁕󵄋󱠡󱜡󰜲󰜲󲀴󱜡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳜪󳭫󰜱󰜱󰝘󰜲󱠸󱠡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳠪󳭫󰜱󰜱󰝓󰜲󱠺󱰡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󲴁󲬪󳭫󰜱󰝏󰜲󱤹󰜴󱨱󱜡󳭮󰼁󳌪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜲󱨷󰜴󱨱󱜡󳭮󰼁󳠪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜵󱴱󰜴󱨱󱜡󳭮󵐋󰼁󳤪󳭫󰜱󰜱󰝉󰜲󱤹󰜴󱨱󱜡󳭮P󳴪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜲󱼲󱴡󱨴󱜱󰝕󵐴󱜁󳌪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜲󱨷󰜴󱨱󱜡󳭮󱠷󳴪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜲󱼲󱴡󱨴󱜱󰝕󵐴󰼁󳘁󳭫󳬋󳠑󲴱󰜶󱜡󳭧󳬋󵠋󱠡󱜡󱜡󱠡󱠲󱨷󰜮󱠳󱜸󰝤󱴲󱵕󰜱󰜱󰜲󰜱󰜴󱨱󱜡󳭮󱜡󳭍an󱁕󵄋󱠡󱜡󲰡󱠡󱤷󱜡󱨴󱜱󰝕󵐩o󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󱠡󱸷󱨡󱨴󱜱󰝕󵐩󱁕󵄋󱠡󱜡󱜡󲴁󳔡󱠡󱠴󱠺󰜴󱨱󱜡󳭮m
9
Key words: human immunodeficiency virus (HIV), antiretroviral drugs, genotoxicity, micronucleus
technique,comettechnique.
10
LISTADEABREVIATURAS
APRT Adeninafosforribosiltransferase
ARVs Antiretrovirais
AZT Zidovudina
BPDE Benzopirenodiolepóxido
CBMN Técnicademicronúcleocombloqueiodacitocinese
CCI Câncercervicalinvasivo
CEP ComitêdeéticadaFeevale
CONEP Conselhonacionaldepesquisa
CV CargaViral
d4T Stavudina
ddI Didanosina
DNA Ácidodesoxirribonucléico
DSTs Doençassexualmentetransmissíveis
EBV VírusEpsteinBarr
EFV Efavirenz
FDA Food anddrugadministration
HBV VírusdahepatiteB
HIV Vírusdaimunodeficiênciaadquirida
HPRT Genehipoxantinaguaninafosforribosiltransferase
HPV Papilomasvírus
ICPEMC Comissãointernacionaldeproteçãoamutágenose
carcinógenosambientais
KSHV Herpesvírusdosarcomade
11
PHA Fitohemaglutinina
Pis Inibidordaprotease
PN Pontenucleoplasmática
RNA Ácidoribonucléico
SIDA Síndromedaimunodeficiênciaadquirida
SK SarcomadeKaposi
TK Timidinaquinase
UVA UltravioletaA
UVB UltravioletaB
3TC Lamivudina
12
LISTADEFIGURAS
Figura1EnsaiodeMNcombloqueiodacitocinese..................................... 30
Figura2 TécnicadoCometa......................................................................... 46
13
LISTADEQUADROS
Quadro 1  FDA (Food and Drug Administration)  Agentes Anti
RetroviraisAprovados,Maio1999................................................................. 36
14
LISTADETABELAS
Tabela1Característicasdaamostraestudada...................................................... 42
Tabela 2 Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000
células,eíndicedeDNAdoEnsaioCometaem100célulasdosgruposControle
epacientesHIV+..................................................................................................... 47
Tabela 3 Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000
células,edanodeDNAdeacordocomoEnsaioCometaem100célulasdos
gruposControleepacientesHIV+semmedicaçãoecommedicação................... 48
Tabela4ComparaçãodataxadecélulasTCD4+eCargaViral(CV)entreos
gruposHIV+semecommedicação....................................................................... 49
Tabela5Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem
1000células,edanodeDNAdeacordocomoEnsaioCometaem100células
dos grupos Controle e pacientes HIV+ sem medicação e com medicação em
relaçãoaosexo........................................................................................................ 49
Tabela6Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem
1000células,edanodeDNAdeacordocomoEnsaioCometaem100células
dogrupocontroleemrelaçãoaosexo..................................................................... 50
Tabela7Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem
1000células,edanodeDNAdeacordocomoEnsaioCometaem100células
dogrupoHIV+emrelaçãoaosexo........................................................................ 50
Tabela8Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem
1000células,edanodeDNAdeacordocomoEnsaioCometaem100células
dogrupoHIV+semmedicaçãoemrelaçãoaosexo............................................... 50
15
Tabela9Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem
1000células,edanodeDNAdeacordocomoEnsaioCometaem100células
dogrupoHIV+commedicaçãoemrelaçãoaosexo.............................................. 50
Tabela10Médiasdas freqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebuds
em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100
células dos grupos HIV+ sem e com medicação e controle em relação ao
tabagismo................................................................................................................ 51
Tabela11Médiasdas freqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebuds
em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100
célulasdogrupoHIV+semecommedicaçãoemrelaçãoaotabagismo............... 52
Tabela12Médiasdas freqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebuds
em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100
célulasdogrupocontroleemrelaçãoaotabagismo............................................... 52
Tabela13Médiasdas freqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebuds
em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100
célulasdogrupoHIV+semmedicaçãoemrelaçãoaotabagismo.......................... 52
Tabela14Médiasdas freqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebuds
em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100
célulasdosgruposHIV+commedicaçãoemrelaçãoaotabagismo...................... 53
16
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 18
1.1– DanodeDNAempopulaçõeshumanas........................................................ 18
1.2 Exposiçãoaagentesgenotóxicosnoambiente............................................... 22
1.3– Fatoresquepodeminfluenciarnafreqüênciademutações........................... 23
1.3.1 –Idade............................................................................................................ 23
1.3.2 –Sexo............................................................................................................. 24
1.3.3 –Ohábitodefumar....................................................................................... 24
1.3.4 –Bebidasalcoólicas....................................................................................... 25
1.4– MÉTODOSDEDETECÇÃO........................................................................ 27
1.4.1 –Micronúcleo(MN),PontesNucleoplasmáticas(PN)eBuds..................... 27
1.4.2 –TécnicadoCometa..................................................................................... 30
1.5– SÍNDROMEDAIMUNODEFICIÊNCIAADQUIRIDA(SIDA)................ 32
1.6– DROGASANTIRETROVIRAIS(ARVs)................................................... 36
1.6.1 –AZT............................................................................................................. 37
1.6.2 –AZT+3TC................................................................................................... 39
1.6.3 –d4T.............................................................................................................. 40
1.6.4 –EFV............................................................................................................. 40
2–OBJETIVOS..................................................................................................... 41
2.1– ObjetivoGeral................................................................................................ 41
2.2– ObjetivosEspecíficos..................................................................................... 41
3–MATERIAL EMÉTODOS.............................................................................. 42
17
3.1– Delineamento................................................................................................. 42
3.2– Procedimentos................................................................................................ 43
3.2.1 –TécnicadeMicronúcleocomBloqueiodaCitocinese(CBMN)................ 43
3.2.2 –TécnicadoCometa..................................................................................... 45
4–RESULTADOS................................................................................................. 47
4.1– Sexo................................................................................................................ 49
4.2– Idade............................................................................................................... 51
4.3– Fumo.............................................................................................................. 51
5–DISCUSSÃO.................................................................................................... 56
REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 59
ANEXOS................................................................................................................ 74
AnexoI:TermodeConsentimentoInformado....................................................... 74
AnexoII:QuestionáriodeSaúdePessoal............................................................... 75
18
1INTRODUÇÃO
1.1DanodeDNAempopulaçõeshumanas
ODNAcarregaumcódigogenéticoparaaminoácidos,comcadaaminoácidosendorepresentado
porumaseqüênciadetrêsbasesdeDNA.Estestripletesdebasessãochamadosdecódons.Aordem
decódonsnaseqüênciadeDNArefletenaordemdosaminoácidosunidosemumacadeiadeproteína.
AseqüênciacompletadeDNAnecessáriaparadeterminaraseqüênciadeaminoácidosdeumaúnica
proteínaéchamadadegene(KreuzereMasey,2002).Nascélulas,oDNAestálocalizadodentrodos
cromossomos, no núcleo. O DNA contém as instruções para a produção de todas as proteínas do
corpo.Noentanto,asproteínassãoproduzidasnosribossomoslocalizadosnocitoplasma.Depoisque
a seqüência de bases de um gene (DNA) é copiada no RNA mensageiro, este mRNA viaja até o
ribossomo,ondeseucódigo é traduzidoem umaproteína.Opasso detradução é realizadopor um
segundo tipo de RNA, chamado de RNA transportador (tRNA). O tRNAcombina os aminoácidos
corretos aos códons do mRNA, e os aminoácidos são ligados uns aos outros para formar a nova
proteína(KreuzereMasey,2002).
Como entre outros genomas, o DNA do genoma humano não é uma entidade estática. Ao
contrário, ele está sujeito a diferentes tipos de mudanças hereditárias (mutações). Anormalidades
cromossômicas de grande escala envolvem a perda ou o ganho de cromossomos ou a quebra e a
reunião de cromátides. Mutações de menor escala podem ser agrupadas em diferentes classes de
mutaçõesepodem,também,sercategorizadascombaseseelasenvolvemsenumaúnicaseqüênciade
DNA (mutações simples) ou se elasenvolvemse em trocas entre duas seqüências alélicasou não
alélicas(StrachaneRead,2002).
19
O DNA, molécula que carrega a informação genética, possui estabilidade química limitada.
Alterações do material genético podem resultar de radiações externas, genotóxicos químicos no
ambiente,infecçõesviraise,tantodeorigemexógena,quantoendógena(MalufeErdtmann,1999).
AsalteraçõesqueocorremnoDNAsãodenominadascomomutações.Elaspodemserresultado
tantodeerrosduranteaduplicaçãodoDNA,nadivisãocelular,quantodedanoscausadosporagentes
externosdiretamentenoDNA.Ocorrememtodososseresvivos,sendofundamentaisparaaevolução
ediversificaçãodasespécies(Ribeiro
etal.,
2003;Silva
etal.
,2003).
Muitas vezesamutação causa mudanças nãodetectáveis,ou entãodeterminaa mortecelular.
Somente quando ocorrem em genes específicos podem evoluir para um crescimento celular
desordenado (Ribeiro
et al.,
2003; Silva
et al.
, 2003). Genes específicos são aqueles que estão
relacionados com a estimulação e inibição da proliferação celular. E, somente quando há um
determinadonúmerodealteraçõesnessesgenes,équesurgemascélulasneoplásicas,jáqueosdanos
noDNAalémdeirreversíveissãocumulativos.Osagentesmutagênicospodemacelerarouaumentaro
aparecimentodemutaçõesqueseassociamaosurgimentodeneoplasias(Ribeiro
etal.,
2003).
Aexposiçãoaagentesgenotóxicos no meioambiente podeproduzirumaampla variedadede
efeitosnasaúdehumana.Algunsdestesefeitosaparecemimediatamente,enquantoqueoutrosindicam
evidênciasmuitosanosdepois.Sabesequeefeitostardiosincluemcarcinogêneseedoençasgenéticas
quepodemafetargeraçõesfuturasedesenvolvendoincapacidades(Au,1991).
Em várias síndromes raras, a instabilidade genética, expressa como instabilidade
cromossômica, é conhecida. Pacientes com estassíndromestêmpredisposiçãoacâncer. Evidências
têmsidoacumuladas,mostrandoqueinstabilidadecromossômicaocorreemalgumasoutrasdoenças,
emboraafreqüêncianãosejatãoelevada.Instabilidadegenéticapodeinduziraumeventomutacional
em genes cujo homólogotenha uma alteração congênita, ou pode induzir dois eventos de mutação
nestes genes em indivíduos não portadores desta alteração, levando ao desenvolvimento de uma
neoplasianacélulaalvo.Éaltamenteprovávelqueainstabilidadegenéticanapopulaçãohumananão
seexpressecomo"presenteouausente"nosindivíduos.Graduaçõesdeinstabilidadegenéticapodem
20
existir por uma variedade de causas. Ocorrendo uma lesão no DNA nas células de pessoas com
sistemadereparodeficiente,haverápoucoounenhumreparo,logo,maior freqüênciadeaberrações
cromossômicas.Quandoascélulasdeindivíduoscomosistemadereparodeficientesãoexpostasa
agentesclastogênicos,podemseobservar aumentodastaxas deaberraçõescromossômicas,quando
comparadasapessoascommaiorestabilidadegenética(Hsu,1983).
A ativação de oncogenes e o conhecimento atual sobre as síndromes de instabilidade
cromossômicamostramquetantomutaçõesgênicascomoaberraçõescromossômicassãoimportantes
para iniciar o processo carcinogênico. Um agente pode produzir alterações genéticas em um
determinado tecido sem produzir câncer, dependendo da alteração e do tecido. Uma aberração
cromossômicapodeserirrelevanteaníveldeepitélio,massignificantenamedulaóssea,eviceversa.
Istotemimplicaçõesvitaisparaagenéticatoxicológica:(1)tantomutaçõesgênicascomoaberrações
cromossômicasdevemsermedidas,e(2)agentescarcinogênicaspodemsermutagênicosemtecidos
emquenãocausamcâncer(Heddle,1991).
Existeumavariaçãonafreqüênciadealteraçõescromossômicasentreindivíduossaudáveise,
células do mesmo doador podem mostrar diferentes níveis de aberrações em diferentes períodos.
Informações variadas vêm sendo reunidas e parece quase impossível encontrar indivíduos
completamente não expostos, porém é necessário, tanto quanto possível, conhecer a freqüência
espontâneanormal,suasvariânciaseosfatoresqueainfluenciam(Ganguly,1993).
Além disso, existem indivíduos que apresentam uma freqüência de alterações citogenéticas
elevada,semestarem,aparentemente,expostosaagentesmutagênicosforadopadrãonormal.Parece
existir um gradiente de instabilidade genética, com as síndromes de instabilidade cromossômica
representandooextremodoespectro.Indivíduosqueapresentamaumentonafreqüênciadealterações
cromossômicas nas células cultivadas sem qualquer indução, mostram uma sensibilidade maior
quando submetidos a um "stress" mutagênico. Isto foi testado pela exposição de fibroblastos em
culturaaumavariedadedeagentesmutagênicos.FoiusadairradiaçãocomUVcomoagentefísico,e
químicosselecionadosqueagempordiferentesmecanismosgenotóxicos,comomitomicinaC(MMC),
NmetilNnitroNnitrosoguanina (MNNG), e benzopirenodiolepóxido (BPDE) (Rümmelein
et al.
,
1992).
21
O aumento de instabilidade cromossômica está bem documentado em quatro doenças
autossômicasrecessivasassociadascomaltoriscodecâncer:anemiadeFanconi,síndromedeBloom,
xerodermapigmentosumeataxiatelangiectasia.Apesardasdiferençasclínicasegenéticasentreestas
quatro doenças, elas são, muitas vezes, tratadas juntas, não só pelo aumento na freqüência de
alteraçõescromossômicas,comotambémpeloriscoaumentadodospacientesdesenvolveremcâncer
(Schroeder,1982;Heim
etal
.,1992).
German(1969)sugerequexerodermapigmentosumesíndromedeDownsejamchamadasde
"síndromes de instabilidade cromossômica condicional", por que as taxas de aberrações
cromossômicas espontâneas nestas duas síndromes não são elevadas, mas as taxas de aberrações
induzidasporexposiçãomutagênicasãomaisaltasqueemcélulasnormais.AsíndromedeDownéa
anormalidade cromossômica mais comum no homem, sendo a principal causa de retardo mental.
Caracterizase pela trissomia do cromossomo 21 e ocorre com uma freqüência de 1/700 nascidos
vivos. Apredisposição dos indivíduosportadoresdestasíndromeparadesenvolver leucemia é bem
conhecida(Heidemann
etal
.,1985).
A anemia de Fanconi caracterizase como uma doença autossômica recessiva, envolvendo
pancitopeniaprogressivaeumasériedemalformaçõescongênitasemváriossistemas,comoosistema
nervoso central, musculoesquelético, urogenital, renal, tegumentário, cardíaco, ocular, auditivo e
gastrointestinal, e prédisposição ao desenvolvimento de câncer, especialmente leucemia mielóide
aguda (LMA) (Fanconi, 1927; Auerbach e Allen, 1991). Alguns distúrbios mitóticos, como pontes
entrenúcleos,fragmentosaberrantesemicronúcleosforamobservadosemmedulaósseadepacientes
com anemia de Fanconi, já em 1966, por Schroeder. Tem sido sugerido que uma deficiência no
sistemadereparoouprocessamentodeDNAdanificadoestejaassociadoaumaumentonaincidência
de câncer, e também com várias anormalidades clínicas. Um aumento no nível de aberrações
cromossômicas espontâneas tem sido detectado em cultura de linfócitos e fibroblastos obtidos de
pacientes com anemia de Fanconi (Schroeder
et al
., 1964; Zakrzewski e Sperling, 1989; Arwert e
Kwee,1989;Natarajan
etal
.,1989).
22
Emadição,instabilidadecromossômicatemsidodescritaempacientescomvariadostiposde
câncer (Hsu
et al
., 1985; Delhanty
et al
., 1983). Em fibroblastos cultivados, de pacientes com
melanoma, foi descrito um aumento espontâneo nas taxas de micronúcleos e um aumento na
sensibilidadeaUVAeUVB,quandocomparadosacontrolesnormais(Roser
etal
.,1989).
1.2Exposiçãoaagentesgenotóxicosnoambiente
A espécie humana tem atravessado sua evolução sendo exposta a uma infinidade de
genotóxicospelaingestãodealimentosebebidas(contaminantesnaturaisdadieta),epelainalaçãode
fumaças e irradiações diversas do meio ambiente. A análise de alterações citogenéticas devidas a
fatores genotóxicos em uma população requer um valor "normal" de micronúcleos para ser usado
comoreferênciadataxademutaçãobasal.Essevalorjáestariainfluenciadoporváriosfatores,alguns
destesendógenos,outrosexógenos(Koteles,1993),comoestilodevida,dietas,consumodefumoe
álcool, várias terapias médicas e até mudanças climáticas (aumento de exposição a radiação
ultravioleta devido àdestruição doozônioatmosférico). Por isso, tornaserelevante:(a) determinar
quaissãoosníveisaceitáveisdedanogenéticonapopulaçãohumana;(b)identificarindivíduosque
possam ser hipersensíveis a determinadas genotoxinas; (c) testar, de maneira efetiva, os novos
químicos que estão sendo sintetizados para serem lançados no meio ambiente; (d) monitorar,
rotineiramente, indivíduos expostos a agentes que possam ser perigosos a nível genético e (e)
determinar o nível de aumento na freqüência de alterações genéticas em uma população após
exposiçãoacidental(Fenech,1993).
Otipodecâncerquepredominanapopulaçãovariaemdiferentespartesdomundo:câncerde
estômago é o mais freqüente no Japão, câncer de fígado nos países do sudeste asiático, câncer
nasofaringialnosuldaChina,câncerdacavidadeoralnaÍndia,ecâncerdebexigaurinárianoEgito.
Suspeitasequeas diferençassedevam àscondiçõesrelativas aestilosdevidaparticulares,ou por
doençasendêmicasespecíficasdecadaregião.Destamaneira,câncerdebexigaurinárianoEgitoestá
relacionadoàinfecçãocom
Schistosomamansoni
,ecâncerdacavidadeoralnaÍndiaestárelacionado
aohábitodemascartabaco(Doll,1977).
23
Investigaçõesepidemiológicasresultaram naformulaçãodahipótesequepôdesertestadano
laboratório:altosníveisdegorduranadietaaumentamoriscodecâncerdemama.Guiasdedieta,com
respeito à gordura e câncer, costumam considerar a percentagem total de calorias derivadas da
gordura.Porestecaminho,obteveseumacorrelaçãopositivaparaincidênciademorteporcâncerde
mama,comparadacomaingestãodiáriadegorduraempopulaçõesdediferentespaíses.Nadietada
maioriadospaísesindustrializados,oconsumodegorduraficaemtornode40%dototaldecalorias
diárias, enquanto os guias de dieta recomendam apenas 30%. Resultados de outros estudos
epidemiológicostêmdemonstradocorrelaçãoentreconsumodegorduraeafreqüênciadecâncerem
outrosórgãos,particularmentenapróstataecólon(Renner,1990).
Duranteosúltimosdezanos,umagrandevariedadedequímicosmutagênicosecarcinogênicos
foramsendodetectadosnosalimentos,medicamentos,cosméticos,inseticidasetambémnaatmosfera
e na água que nós utilizamos diariamente. Alguns mutágenos agem diretamente nas células para
produzirmutações,eoutrosdevemser modificadosporenzimasououtrosfatoresparasetornarem
cancerígenos.Estesmutágenosindiretospodemsermetabolicamenteativadosporenzimasemórgãos
outecidos,oupodemser inativadoseinibidosporalgumcomponentedenossadietaouporfatores
presentesemnossascélulas(Kuroda,1990).
1.3Fatoresquepodeminfluenciarnafreqüênciademutações
Aseguirseguemalgunsfatoresquepodeminfluenciarnafreqüênciademutações.
1.3.1Idade
Tem sido demonstrado que a idade afeta significativamente a freqüência da formação
espontâneademicronúcleosouodanodeDNAemlinfócitosdehomensemulheres(Ganguly,1993).
Anormalidades cromossômicas numéricas surgem, usualmente, devido à nãodisjunção durante a
meiose.Tantocélulasaneuplóidesemmitosecomonãodisjunçãoemmeioseaumentamcomoavanço
da idade (Nakagome
et al
., 1984). Alterações cromossômicas estruturais também apresentaram
correlaçãocomaidade(MattevieSalzano,1975).Oaumentodemutaçõescomaidadepodetambém
24
serdevidoaoacúmulodeDNAlesadonãoreparadoe/ouàdiminuiçãodacapacidadederepararDNA
(FenecheMorley,1985b).Comaidade,aproporçãodecélulascomfaltadecromossomosdogrupo
Caumentaemmulheres,eafreqüênciadenãodisjunção meióticaaumentacomoavançodaidade
materna(TrimbleeBaird,1978).Nohomem,aincidênciadenãodisjunçãopodetambémaumentar
com o avanço da idade (Matsunaga
et al
., 1978). Fenech e Morley (1985b) demonstraram uma
correlaçãopositivanaexpressãodemicronúcleosemlinfócitos,comoaumentodaidade.Omesmo
sendoencontradoporKoteles
etal
.(1993)aomonitoraremumaamostrade188indivíduosresidentes
emumaáreaurbanaindustrial.
1.3.2Sexo
O"GrupodeEstudosColaborativosparaoTestedeMicronúcleos"(TheColaborativeStudy
GroupfortheMicronucleusTest,1986)demonstrouqueexistemdiferençasentreossexosquantoàs
freqüências de micronúcleos induzidas por algumas drogas em eritrócitos de camundongos. Estas
diferençassãoespecíficas,ouseja,cadadrogatestadasecomportademaneiradiferente,dependendo
dosmecanismosdeinteraçãodasmesmascomoorganismo.
Osexoéum fatorquedeve ser consideradona escolha dos indivíduoscontroles, apesarde
geralmentenãohaverdiferençasignificativaquantoàfreqüênciadeaberraçõescromossômicas.Para
troca de cromátides irmãs, há tanto estudos que demonstram não haver diferença entre os sexos
(GallowayeEvans,1975;Crossen
etal
.,1977;Livingston
etal
.,1983),quantoosquedemonstram
haver esta diferença. Margolin e Shelby (1985) encontraram uma diferença estatisticamente
significantedeaproximadamente0,5%maisaltaemmulheres.Umaumentosimilaremmulheresfoi
tambémencontradoporSoper
etal
.(1984).Emestudosondeasdiferençasesperadassãopequenas,o
pareamento dos controles deverespeitar o sexo. Freqüências maiselevadas de troca de cromátides
irmãsforamtambémencontradasemmulheresgrávidas(SharmaeDas,1986).
1.3.3Ohábitodefumar
25
Ohábitodefumartambémpodealterarafreqüênciademutações.Fumarcausaumavariedade
deproblemasnohomem.Destamaneira,umquartoaumterçodetodososfumantesmorremcomo
resultadodoseuhábito(DollePeto,1976).Evidênciasepidemiológicastêmdemonstradoclaramente
queofumoestárelacionadocomcarcinomabronquial(DollePeto,1976).Comrespeitoàinduçãode
câncerdepulmão,podeserobservadaumarelaçãodoseefeitoentreohábitodefumareaincidência
da doença (Doll e Peto, 1976). Extratos de cigarros demonstraram ter atividade de iniciadores de
tumor emtestescomroedoreseem células humanas
in vitro
(Benedict
etal
., 1975), enotestede
Ames são mutagênicos na presença de metabolizador preparado a partir de pulmão e fígado de
mamíferos(HuttoneHackney,1975;Mizusakiecols.,1977).ObeeHerha(1978)observaramque
linfócitosdefumantesmostramumaumentosignificantedecromossomosdicêntricos,anéisetrocas
cromatídicas, indicando uma forte correlação entre a atividade carcinogênica e mutagênica do cigarro.
Larramendy e Knuutila (1991) observaram um aumento na freqüência de micronúcleos, tanto em
linfócitosBcomoemlinfócitosT8defumantes,emrelaçãoaoscontroles.Ohábitodefumaraumenta
afreqüênciademicronúcleos(Cruz
etal
.,1994).
1.3.4Bebidasalcoólicas
Váriasbebidasalcoólicastêmsidodescritascomocontendosubstânciasmutagênicas(Loquet
et
al
., 1981; Bull
et al
.,1987; Obe e Anderson, 1987), mas as evidências indicam que a atividade
mutagênica associada a estes produtos não vem do etanol, mas preferencialmente de outros
componentesderivadosdosprocessosenvolvidosnaproduçãodebebidas(Yu
etal
.,1986;Brusick
et
al
.,1988).
Problemarelativo adanosdesaúde por exposiçãoquímicaestá dirigido aosagentesquímicos
produzidosouconcentrados,edeusointensivo,pelohomem.Contaminantesatmosféricosdepositados
nosoloenaáguaparticipamtambém,viaingestãodealimentosedaágua,doconjuntodesubstâncias
quepodemafetarasaúdehumana.Narealidade,modelosdeexposiçãohumanasãocomplicados,se
considerarmosaquantidadedeagentessimplesedemisturascomplexasenvolvidas.Oquadrotorna
se mais complicado quando consideramos agentes e exposições agindo sinergisticamente ou
moduladorescomefeitoscontraditóriosdeaumentoe/oureduçãodagenotoxicidade.Naavaliaçãode
26
exposiçõesbiologicamentesignificantes,podesermaisrelevantedaratençãoparaosprimeirosefeitos,
diretamentenosindivíduosougruposexpostos,doquetentarpreveroriscopotencialdeummodelo
deexposiçãotãocomplexo como este. Metodologiasaplicáveisao monitoramentohumano ganham
crescenteatenção(Sorsa
etal
.,1990).
Aexposiçãoaagentesgenotóxicosemnossoambientepodecausarumavariedadedeefeitos
sobreasaúdehumana.Algunsdelesseexpressamimediatamente,enquantooutroslevamanosparase
manifestarem.Efeitostardiosbemreconhecidosincluemainduçãodecâncer,doençasgenéticasnas
geraçõesseguintes,desordensdedesenvolvimento,entreoutros(Au,1991).Esforçoscontínuostêm
sido feitos para identificar os agentes perigosos, reconhecer condições de exposição danosa e
monitorar populações que podem estar sofrendo exposição excessiva, com o objetivo de prevenir
conseqüênciasadversassobreapopulação.
Écrescenteapreocupaçãosobreoefeitomutagênicoecarcinogênicodeagentesgenotóxicos
empopulaçõeshumanasexpostasocupacionalmente,acidentalmenteouporestilodevida(Carranoe
Natarajan,1988).Mutaçãoétodaaalteraçãodomaterialgenéticodeumacélula,quenãoresultade
recombinação
t
27
destesestágios,emboraexistammuitosoutrosfatoresenvolvidos.Muitosdosagentespotencialmente
carcinogênicosestãopresentesnanossaalimentaçãoenonossoambiente.Háevidênciasconvincentes
dequeosítiodeaçãodestesagenteséomaterialgenéticocelular,sendoquemuitosdoscarcinógenos
químicosconhecidosatuamviamutações(Wigley,1987).
Afreqüênciaespontâneadeaberraçõescromossômicasemrecémnascidosédaordemde6por
1000.Aanálisecromossômicadeabortosespontâneosemhumanosindicaquemaisde50%detodos
osabortossãocromossomicamenteanormais(ThompsoneThompson,1980).Populaçõesexpostasà
radiação ionizante e a genotóxicos químicos têm a freqüência de aberrações cromossômicas
aumentada em seus linfócitos. Muitas formas de câncer humano estão associados a aberrações
cromossômicasespecíficas e nãoespecíficas(Yunis,1983).Algumasdoençashereditárias humanas,
comoassíndromesdeinstabilidadecromossômicaresultamnumaumentodafreqüênciadeaberrações
cromossômicas e também estão associadas a um aumento na incidência de câncer. O aumento na
freqüênciadealteraçõescitogenéticasemrelaçãoataxabasaldapopulação,podeserumaindicação
desensibilidadegenéticaoudeexposiçãoamutágenos.Estassituaçõesproduzemsempreoaumento
doriscodecâncerededoençasgenéticas(CarranoeNatarajan,1988).SegundoAshby(1991),todos
osprodutosquesãoclastogênicos
invivo
sãotambémcancerígenosparaoorganismotestado.
Nas últimas décadas, a quantidade de produtos químicos produzidos e usados pelo homem
aumentou muito. Estas substâncias podem afetar a saúde humana por sua disseminação no meio
ambiente, mas são os trabalhadores que manipulam rotineiramente estes agentes que constituem o
maior grupo de risco, devido à constante exposição. Testes de mutagenicidade, incluindo
monitoramento citogenético em populações humanas, são de máxima importância para o
conhecimentoeprevençãodedoençaspúblicaseocupacionais(Koteles
etal
.,1993).
1.4MétodosdeDetecção
1.4.1Micronúcleo(MN),PontesNucleoplasmáticas(PN)eBuds
Dentre os testes que analisam mutações cromossômicas em mamíferos, destacase o teste de
micronúcleos em medula óssea de camundongo (Heddle, 1973), que detecta agentes genotóxicos
28
clastogênicoseosqueinterferemnaformaçãodofusomitótico,afetandoadistribuiçãoeqüitativados
cromossomos na divisão celular. O ensaio serve como primeiro passo no estudo de compostos
mutagênicos, tendo a vantagem de ser mais rápido do que a análise de quebras cromossômicas
(clastogênese), sendo mais eficiente para detectar a perda de cromossomos inteiros (aneugênese)
(Maluf,1994).
Micronúcleos são fragmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros perdidos durante a
divisãonuclear(Migliore
etal
.,1991).Sãoformadosduranteaanáfasepelafalhadaligaçãoaofuso
mitótico. Derivam de fragmentos de cromossomos ou cromossomos inteiros que foram perdidos
duranteestafase(Norppa,2003).Naanálisemicroscópica,pelaformaçãodecariotecaaoseuredor,é
possívelavisualizaçãodeumpequenonúcleoquepodeterumdiâmetroentre1/16e1/3dodiâmetro
dos núcleos principais. Acreditase que estas estruturas também podem ser formadas na fase S da
replicaçãocelular,atravésdaamplificaçãogênica,projetandobudsnucleares,osquaispossivelmente
serão cortadosapósatelófase(SchuberteOud,1997). Jáaspontes nucleoplasmáticasrepresentam
cromossomos dicêntricos que tiveram os centrômeros puxados para os pólos opostos da célula em
anáfase. Aproximadamente 60% das amostras que contêm esta difusão também apresentam
micronúcleos,poisquebrassãonecessáriasparaqueoscromossomosdicêntricossejam formadose,
ambos ocorrem em células expostas a agentes causadores de quebras no DNA, como radiação
ionizante(Maluf,2004).
A freqüência de micronúcleos em linfócitos do sangue periférico humano foi estudada por
Countryman e Heddle (1976), que observaram o efeito da radiaçãoX e mitomocina C
in vitro
,
mostrandoapossibilidadedesemedirdanocromossômicoatravésdaanálisedemicronúcleosemum
tecidodemaisfácilacesso,jáque,originalmenteatécnicademicronúcleostinhasidodescritaapenas
paraeritrócitosdemedulaóssea,em1975porSchmid.Adificuldadedestatécnicaeradistinguiras
célulasque,emcultura,haviampassadoporumciclodedivisão,daquelasquenãohaviamsedividido,
o que torna difícil quantificar a freqüência de micronúcleos com o propósito comparativo (Maluf,
1994).
Aexpressãodemicronúcleopodeserconseqüênciadeaberraçõescromossômicascausadaspor
quebras de DNA (clastogênese) ou por disfunção de fuso mitótico, caracterizando a perda de
29
cromossomos inteiros (aneugênese) (Surralés, 1992). Além da detecção de eventos clastogênicos e
aneugênicos, o micronúcleo pode expressar amplificação gênica. Com o bloqueio da citocinese, é
possívelanalisaraquelascélulasquecompletaramapenasumadivisãoeseapresentarambinucleadas
(Norppa,2003).
A freqüência de MN nas células humanas iniciou de um critério de testes citogenéticos por
monitorizaçãodepopulaçõesderisco.Otestedemicronúcleocomobloqueiodacitocinese(CBMN)
éométodopreferidoparamensurarmicronúcleosemculturadecélulashumanas,poisacontagemé
restritamenteespecíficaparaumadivisãocelular.Estascélulassãoreorganizadaspeloaparecimento
debinucleaçõesapósainibiçãodascitocinaspelascitocalasinaB(Maluf,2004).
Comparando com outratécnicacitogenética,o ensaio de MNpossui várias vantagenssobre a
quantificaçãodeMN,incluindoarapidezafacilidadedaanálise,esemorequerimentodecélulasem
metáfase (Tucker e Preston, 1996). Diferentes mecanismos podem ser envolvidos na formação do
micronúcleo(Heddle
etal
;1983;Evans,1988)incluindoorompimentocromossômico(clastogênese)
erupturadofuso(aneuploidogênese).Asvantagensobservadasnoensaiodebloqueiodacitocineseé
descritoporFenech(1997):identificaçãoconfiáveldascélulasqueforamcompletadasapenasemuma
divisão celular, sensitividade, precisão e detecção de outros pontos finais tal como as pontes
dicêntricas.
Oslinfócitosdesanguecirculantedemamíferos,inclusiveohomem,sãoumótimosistemapara
setestarumasubstânciaquantoàsuacapacidadeemproduziraberraçõescromossômicas.Atécnica
servetambémparaomonitoramentodepopulaçõesexpostasadrogas,sejaporrazõesprofissionais,
terapêuticasouporacidente(Natarajane Obe,1980).Supondoseque hajaumacorrelaçãoentre o
dano induzido no sangue e em outras células somáticas, os linfócitos serviram como um sistema
sentinelaparagruposdealtorisco(Nordenson
etal.
,1984).
Oslinfócitosdosangueperiféricoencontramseemumestágioderepouso,présíntese(G
0
).Ao
serem colocados em cultura, na presença de fitohemaglutinina (PHA) são estimulados, sintetizam
RNA,proteínaeDNA;apóscerca de48 horas estão, na maioria,emsua primeira mitose.A PHA
estimula,principalmente,oslinfócitosT,queconstituemde40a70%dapopulaçãototaldelinfócitos
30
(JanossyeGreaves,1972,Preston
etal
.,1987),masosBtambémsãoestimulados(Vischer,1972;
PhillipseRoitt,1973).
Omicronúcleoéexpressonadivisãodascélulasasquaispossuemquebrascromossômicascom
perda de centrômero (fragmentos acêntricos) e/ou perda de todo cromossomo, o qual é incapaz de
migrarparaospólosdofusoduranteamitose.Natelófase,asformasdoenvelopenuclearaoredordos
cromossomoslentosefragmentos,cujosgradualmenteassumemamorfologianonúcleointerfásico:
são pequenos e chamamse micronúcleos (MN). Ocasionalmente pontes nucleoplasmáticas entre os
núcleosnacélulabinucleadasãoobservadas.Provavelmentesãocromossomosdicêntricoscujosdois
centrômeros pularam para pólos opostos da célula e o DNA resultante da ponte é coberto pela
membranan 󱤷ras
31
O dano de DNA induzido por agentes genotóxicos depende do transporte entre as
membranascelularenuclear,a=󲀺󰜴󱨱󱜡󳭮󱠺N󰜱󰜱󰜲󰜶󱼱󰜴󱨱󱜡󲀵󱜡󳭮󱜡󳭍ãotó󱁕󵄋󱠡󱜁󲁊󱤁󱤲uc󱁕󵄋󱠡󱜡󱜁M󱼁Q󳸁nQ󲴁󱠹M󱤋󱠡󱜡󱜡󱠡󱠷󱤳󰜴󱨱󱜡󳭮t󱀁󱨳󱠴󱤵󱰡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󲴁󲼪󳭫󰜱󰜱󱠳󱰲󱠳󱸡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳴪󳭫󰜱󰜱󰜳󱸲󱰴󱴡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳴪󳭫󰜱󰜱󰜳otó󱁕󵄋󱠡󳭮t󱀁󱨴󱤲󱰴󱴡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳴪󳭫󰜱󰜱󰜴󱬁󱠴󱰶󱴺󱠡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󲼁󳠪󳭫󰜱󰜱󰜵󱜲󱰴󱴡󱨴󱜱󰝕󵑞󲸁󳤪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜡󱬴󱬡󱨴󱜱󰝕󵑍󵐋󰼁󳜪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜲󱰴󱴡󱨴󱜱󰝕󵑪󵐋󰼁󳸪󳭫󰜱󰜱󰜶󱠵󱠶󰜲󱬳󱴡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󲴁󳤪󳭫󰜱󰜱󰜶󱸵󱰴󱴡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳴪󳭫󰜱󰜱󰜲󱠡󱰺󱨡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳭫󰜱󰜱󰜲󰜺󱠲󰜲󱴳󱤡󱨴󱜱󰝕󵑒󰼁󲬪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜷󱴳󱤡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳸪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜲󰜷󱠡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳰪󳭫󰜱󰜱󰜲󱸁c󰼁󳰪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜲󱴳󱤡󱨴󱜱󰝕󵐁󲴁e󱠺l󰼁󳸪󳭫󰜱󰜱󰜲󰜸󱨱󱨡󱨴󱜱󰝕󵐋󰼁󳼪󳭫󰜱󰜱󱠡󱠴󱠺l󰼁󳸪󳭫󰜱󰜱󰜲'󰼁󲬁󲴁󲼪󳭫󰜱󰜱󱠹󲬁s
32
A utilização do ensaio cometa também está sendo desenvolvido em estudos relacionados a
intervençãodietética, no monitoramentodoaumentodosdanosdeDNA resultandoem doenças ou
tratamento com drogas genotóxicas e no monitoramento de grupos ou indivíduos expostos a
substânciasgenotóxicasdevidoaoestilodevida,poluiçãoambientalouocupacionaltemaumentado
substancialmente(Faust,2004).
Geralmente,célulascomaltosníveisdedanodeDNAexibemumaumentodosparâmetrosde
cometa, cujo pode ser expresso pelo comprimento da cauda, porcentagem de DNA na cauda e o
momentodacauda(comprimentodacaudaX%DNAnacauda),ousimplesmentedanoalto,médioou
baixo(Fairbairn
etal.
,1995).
OsefeitosdainteraçãodoDNAcomasdrogassãoobservadosemdiferentesníveis.Oprimeiro,
onívelmaisbásico,éainteraçãoquímicadadrogacomoDNAduplahélice.Variedadedetécnicas
temsidodesenvolvidasparaexaminarosníveisdeinteração,eémostradaqualaquímicadainteração
queé mais similar doestudo daregião expostado DNAou dascélulasemcultura.Alcalizaçãode
sítiosespecíficoseseqüênciasemcélulaspodemserexaminadasusandoensaiodeclivagemtérmica
(Nelson
etal
.,2004).
1.5SíndromedaImunodeficiênciaAdquirida(SIDA)
Asíndromedaimunodeficiênciaadquirida(SIDA)éumadoençaretroviral,causadapelovírus
da imunodeficiência adquirida (HIV), caracterizada por imunossupressão profunda, que leva a
infecçõesoportunistas,neoplasiassecundáriasemanifestaçõesneurológicas(Melo,2002).
As tentativas atuais de terapia gênica para desordens infecciosas são predominantemente
dirigidasaotratamentodepacientescomSIDA.Oagenteinfecciosodessadesordem,geralmentefatal,
é uma classe de retrovírus conhecida como HIV1, capaz de infectar linfócitos T auxiliares, um
subgrupo fundamental de células do sistema imune. Duas características do HIV1 o tornam
especialmentemortal:eleacabapormatarascélulasTauxiliares(tornandoospacientessuscetíveisa
outrasinfecções)eopróvírustendeapersistiremumestadolatenteantesdesersubitamenteativado
(a ausência de produção de vírus durante o estado latente complica o tratamento com drogas
33
antivirais). Um problema importante reside no fato de o genoma do HIV estar mutando com uma
freqüênciaextremamenteelevada(Melo,2002).
AestruturagenômicatípicadovírusHIV1consistededuasmonofitasidênticasdeRNA,com
aproximadamente 9,2 kb de comprimento, que, supostamente existe na forma de uma
ribonucleoproteínacontendoasenzimasRT,integrase,proteaseeaproteínap7de ligaçãoaoRNA
(Peçanha
etal
.,2002).Envolvendoogenoma,esuasenzimasassociadas,háumcerneoucapsídeo
formado pela proteína p24, que está contido em uma matriz protéica (proteína p17) circundante.
Finalmente, a parte mais externa do vírus é formada por um envelope de membrana fosfolipídica
(derivadadascélulasdohospedeiro),contendoproteínasdemembrana(gp41egp120)–codificadas
pelogenomaviral–queseligamàsmoléculasdeCD4damembranadohospedeiro(Peçanha
etal
.,
2003).
A infecçãose iniciacomaligaçãodassubunidadesdaproteínagp120àsmoléculasdeCD4e
seuscoreceptoresdequimiocinas.Emseguidaháumaalteraçãoconformacionaldaproteínagp41que
seinserenamembranacelular(fusãopeptídica)einduzafusãodamembranaviralcomamembrana
celulardacélulahospedeira.Ocorre,então,aliberaçãodogenoma viralnocitoplasmadacélula. A
partirdestemomentosãoativadasasenzimasviraisdocomplexonucleoprotéico,iniciandoseassimo
cicloreplicativodoHIV.OgenomaRNAdovírusétranscrito,pelaRTviral,formandooDNAviral
defitaduplaque,juntamentecomaintegraseviral,penetranonúcleodacélulae,comoauxíliodesta
enzima,integraseaogenomadohospedeiro(Hoffmann
etal
.,2005).
Emprincípio,váriasestratégiasdeterapiagênicapoderiamserutilizadasnotratamentodaSIDA.
Como no caso da terapiagênicado câncer, ascélulas infectadaspodem ser destruídas diretamente
(pela inserção de um gene codificando uma toxina ou uma pródroga) ou indiretamente, pela
estimulaçãodeumarespostaimunecontraelas.Isso,porexemplo,podeenvolveratransferênciade
um gene que codifica um antígeno de HIV1, como a proteína do envoltório viral gp120, e a sua
expressãodeum genecodificandoumacitocina,comouminterferon.(StrachaneRead,2002).
AsuscetibilidadedohospedeirodependedaentradadoHIVnascélulasatravésdosreceptoresde
superfície CD4 (linfócitos T auxiliares) e das quimiocinas. Entre as células que expressam esses
34
receptoresestãooslinfócitosT,ascélulasdeLangerhanseascélulasdendríticaseoutrosmacrófagos.
Com exceção dos linfócitos T, asoutrascélulas podem ser freqüentemente encontradas na mucosa
genital. Assim situações que aumentam a população local dessas células, tais como traumatismos
repetidos ou doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) associadas, aumentam a chance de
transmissão do vírus; por outro lado, pessoas que expressam baixo número de tais receptores de
superfície,ounãoosexpressam,temmenorchancedeseremcontaminadas.Dessaforma,indivíduos
homozigotosqueapresentammutaçãonoreceptorCCR5(comdeleçãonoalelo∆32)podemsermais
resistentes à transmissão sexual, pois não expressam essa quimiocina na superfície celular dos
macrófagos.Porfim,ainfectividadedapessoadependedafasedadoençaedaquantidadedevírusem
seuorganismo.Assim,pessoasnoperíodoagudodainfecçãotêmumamaiorchancedecontaminarem
outras pessoas, pois apresentam viremias plasmáticas extremamente elevadas. Da mesma forma,
pessoascomSIDA(faseavançadadadoença)têmchancemaiordecontaminaroutros(Sprinz
etal.
,
1999).
Omecanismobioquímicodealgumascélulaslinfóidesdesestabilizaseugenomaempacientes
infectados pelo vírus HIV. Os linfócitos de pacientes HIV+ são caracterizados por uma intensa
liberação de radicais oxidativos juntamente com a ativação da xantina oxidase. Estas mudanças
aumentam comoprogresso dadoençacomo estágio máximodaSIDA.O grau das manifestações
bioquímicasda instabilidadegenômicaaumentanadinâmicadainfecçãopeloHIV(Kozhemiakine
Bondarenko,1992).
Osarcomade Kaposi(SK) eoLinfomadenãoHodgkin(LNH)sãooscânceresrelacionados
diretamente com pacientes HIV+, e considerados endêmicos (Spina, 1999). Outros específicos
câncerestambémocorrememgrandeproporção,masoriscopaternodependedaregiãogeográficae
qualaexposiçãodogrupoHIVestudado(Biggar,2000;Frisch,2001).DeacordocomSpina(1999),
trêsmalignidadessãoconsideradasempacientescomSIDA:SK;grauintermediáriooualtodecélulas
BnoLNH;câncercervicalinvasivo(CCI).
Pacientes com HIV têm propensão ao desenvolvimento de neoplasia do sistema linfático,
presumivelmentedevidoàativaçãodainfecçãodovírusEpsteinBarr(EBV)queestálatente.OSK
podedesenvolversedevidoaovírusda herpeshumanatipo8,ouaneoplasiaanogenitalpodeestar
35
relacionadaainfecçãopelopapilomavírus(HPV).InfecçõespersistentesdevirosesdeDNAcomoo
HPV,EBV,vírusdahepatiteB(HBV)eoherpesvírusdosarcomadeKaposi(KSHV),temimplicado
nacarcinogêneseemhumanos.OgenomadasvirosesdeDNAoncogênicasestãointegradaseformam
umaforteligaçãocomogrupodogenomacelular.Infecçõessozinhasnãosãosuficientesparacausar
uma transformação neoplásica a menos que esteja acompanhada de mutações somáticas e eventos
epigenéticos, facilitados pela exposição de outros cofatores ambientais e alterações no mecanismo
imune(BeebeDimmereSchottenfeld,2006).
Pacientes com HIV possuem um risco consideravelmente maior de desenvolver um câncer
comparado a outras pessoas (Frisch, 2001). A infecção pelo vírus HIV está intimamente associada
com uma elevação do risco de desenvolvimento de linfomas sistêmicos da doença de Hodgkin e
tambémdelinfomasprimáriosnosistemanervosocentral(Parekh
etal
.,2003).Alémdisto,alguns
estudosdemonstraramque,emsituaçõesnasquaisosindivíduostêmseusistemaimunológicomuito
debilitado,aumentamatécemvezesosriscosdedesenvolveremcânceresassociadosaovírus.Emuma
pesquisarealizadacomdoisgruposdepacientesimunossuprimidosparaavaliaraincidênciadeSK–
umgrupodepessoasinfectadaspeloHIVeoutrodepessoasquereceberamtransplantesdeórgãose
utilizavamdrogasimunossupressorasparaevitararejeição–ficoudemonstradoqueoSKfoiquase
quatrovezesmaisfreqüenteemindivíduosinfectadospeloHIVdoqueemtransplantados,tornando
evidentequeoHIVéumagentepotencialmenteindutordestetipodeneoplasia(Serraino
etal
.,2005).
Neste mesmo estudo evidenciouse que o desenvolvimento do SK em indivíduos HIV+ é
significamentemais baixoemmulheresdoqueem homens,porém háumaumentosignificativodo
riscorelacionadocomaidade.Eohistóricoindividualdaadministraçãodedrogasantiretroviraisé
consistentementeassociadocomareduçãodoriscoaoSK(Serraino
etal
.,2005;Spin,1999).
DeacordocomHoffmann
etal
.(2005),asdrogasantiretroviraisnãodiminuemsignificamenteo
riscodedesenvolveroLNHeoSK.EconcluiquepacientescomSIDAterãoumasobrevidamaior,
porémoíndicedelinfomasmalignosserãoasprincipaiscausasdemorbidadeemortalidadenofuturo.
36
Umoutroagentecausadordelesõesescamosasintraepiteliais,dealtoebaixograu,precursoras
decâncercervicalemmulheres,éoHPV.MulheresinfectadaspelovírusHIVtêmumgranderiscode
desenvolvercâncercervicalemconseqüênciadeinfecçõessecundáriaspeloHPV.Omecanismopelo
qualainfecçãopeloHIVelevaosriscosdeneoplasiacervicalnãoécompletamenteconhecido.Uma
explicação plausíveléquea imunossupressão induzidapeloHIV leva a inabilidadeem controlar a
expressãodoHPVeaproduçãodeoncoproteínaspeloHPV(Hawes
etal
.,2006).
1.6DrogasAntiRetrovirais(ARVs)
UmadasprincipaisarmascontraoHIV,quepromoveumamaiorsobrevidanospacientes,sãoos
coquetéisparaotratamentodaSIDA.Porémamedicaçãocausamuitosefeitosadversos,fazendocom
queváriospacientesabandonemotratamento(Kotwal,2005).
O principal objetivo dos ARVs é agir na replicação viral, retardando a progressão da
imunodeficiênciaetentarrestauraraimunidadedopacienteparaaumentarotempoeaqualidadede
vidadospacientescomHIVouSIDA.Assim,asupressãomáximaecontínuadareplicaçãoviralé
desejávelparareduziroureverterodanoimunológico(Eron,1999).
Quadro1. FDA (FoodandDrugAdministration) AgentesAntiRetroviraisAprovados,Maio1999.
Inibidor Nucleosídeoda
TranscriptaseReversa(NRTIs)
InibidornãoNucleosídeoda
TranscriptaseReversa(NNRTIs)
InibidordaProtease(PIs)
AZT(zidovudina,ZDV,
Retrovir
)
ddI(didanosina,
Videx
)
ddC(zalcitabina,
Hivid
)
3TC(lamivudina,
Epivir
)
d4T(stavudina,
Zerit
)
abacavir(ABC,
Ziagen)
Nevirapina(NVP,
Viramune
)
Delavirdina(DLV,
Rescriptor
)
Efavirenz(EFV,
Sustiva
)
Saquinavirhardgelcápsulas
(SQVHGC,
Invirase
)
Ritonavir(RTV,
Norvir
)
Indinavir(IDV,
Crixivan
)
Nelfinavir(NFV,
Viracept
)
Saquinavirsoftgelcápsulas
(SQVSGC,
Fortovase
)
Amprenavir(APV,
37
Agenerase
)
AterapiaantiretroviralempacientesHIV+resultaemumavariedadevirológica,imunológica,e
benefícios clínicos. A diminuição da concentração do vírus no soro ou no plasma, o aumento da
contagem de linfócitosTCD4+,melhora no ganho de peso,diminuiçãodahepatoesplenomegaliae
linfadenopatia, e melhora na associação do HIV com aencefalopatia (Kline, 1998). Os ARVs tem
melhoradoaqualidadedevidaem indivíduosHIV+.Adiminuiçãodacarga viraltemmelhoradoo
sistemaimuneeaclínicadospacientes(Shah,2005).
Obenefíciodaterapiaantiretroviralpotente jáfoiclaramentedemonstradoempacientescom
doençasintomáticaavançadaenaquelesque,apesardeassintomáticos,apresentamimunodeficiência
acentuada (contagem de linfócitos TCD4+ abaixo de 200/mm
3
). Para os assintomáticos e com
contagem de linfócitos TCD4+ acima de 350/mm
3
, os benefícios parecem ser insuficientes para
contrabalançar os potenciais efeitos adversos e o risco de falha terapêuti
i
38
eDong,2001).Pancreatiteé maiscomumempacientesqueutilizamaDidanosina,Lamivudinaea
Stavudinaprovocaanemia;aneutropeniaémaiscomumquandoadministradoaZidovudina.Abacavir
pode causar uma reação fatal de hipersensibilidade em aproximadamente 5% dos indivíduos
infectadospelovírusHIV(HerveyePerry,2000).
O AZT também demonstrou ser um potente indutor de anormalidades estruturais dos
cromossomos,emconcentraçõesiguaisoumaioresque3µg.Ml
1
,emestudoscitogenéticosutilizando
culturadelinfócitoshumanos.Nestasmesmasculturas,addI(didanosina,2’,3’didesoxiinosina),em
altasconcentrações(≥5000 µg.Ml
1
), elevou a freqüênciade célulascom mutaçõescromossômicas
(Farmacopéia USPDI/98). A análise dos efeitos mutagênicos destas duas drogas, em cultura de
linfoblastoshumanos,revelouumaumentocomplementardaincorporaçãodoAZTnoDNAhumanoe
também um aumento da freqüência de indução de mutações quando as drogas foram utilizadas
associadasemcoquetéis,maioresquenasexposiçõesàsdrogasemmonoterapias.Foramobservados,
comosítiosalvodemutagêneseinduzida,ogenehipoxantinaguaninafosforribosiltransferase(
HPRT
)
ligado ao cromossomo X e dois genes autossômicos, timidina quinase (
TK
) e adenina
fosforribosiltransferase (
APRT
). Os níveis de incorporação do AZT e ddI, mensuradas por
radioimunoensaio,demonstraramaumentosnastaxasdeincorporaçãodeAZTnoDNA(Meng
etal
.,
2000ae b; Olivero
etal
., 1999). Também nos ensaios para
HPRT
e
TK
foramobservadosefeitos
mutagênicosemculturasdecélulasexpostasaoAZT,oudosesequimolaresdeAZTcombinadocom
ddI, em exposições a concentrações variando de 3 a 30 vezes os níveis máximos encontrados no
plasmahumano(Meng
etal
.,2000aeb).
Vpr, umgenepresentenoHIVtipo1,induz aanormalidadedo ciclocelular pelo acúmulo de
célulasnafaseG2M.MariShimura(1999)identificouqueoVprcausaformaçãodemicronúcleoe
aneuploidia.Tambéminduzquebrascromossômicaseamplificaçãogênica.AexpressãodoVprinduz
aumentodemaisde10dobrasresistentesàscolôniasparaN(phosphonacetyl)Laspartato,einibição
dasíntesedapirimidina(Shimura
etal.,
1999).
Odideoxynucleosídeoazidothymidina(AZT;Zidovudine)éumadrogaqueinduzaformaçãode
MN em células eritróides de ratos com uma dosagem baixa (terapêutica). Não foram observadas
mudançassignificativasnafreqüênciademicronúcleosnogrupocontrole,enquantoacontinuaçãodo
micronúcleonaentradaparaosangueperiféricopermanececomníveissecundários.Mutuamente,os
39
ratostratadoscomAZTexibiramumaestatísticasignificantenoaumentodelíquidonascélulascom
micronúcleoacima docurso dadosagemdoseritrócitoscomaalta incidênciademicronúcleosque
entramnosangueperiférico.(Dertinger
etal.,
1996).
OAZT,sozinhooucombinadocomumaoutradrogaantiretroviral,éusadoemrecémnascidos
parapreveniratransmissãodovírusHIVtipo1damãeparaofilho.OAZTémutagênico
invitro
e
mutagênicoecarcinogênicoquandoadministradoemratosneonatais(VonTungeln
etal.,
2004).
1.6.2 AZT+3TC
A associação zidovudina/lamivudina (AZT/3TC) foi considerada a dupla de análogos de
nucleosídeos de primeira escolha para compor o esquema triplo inicial. O perfil favorável de
toxicidade de ambos NRTI, a facilidade de adesão à combinação e a larga experiência com ela
justificamestaopção(MinistériodaSaúde).
Um dos componentes padrões no tratamento para a SIDA é o 3TC, segunda geração de
nucleosídioanálogodainibiçãodaNRTIqueésubstancialmentemelhor farmacologicamentequeo
AZT e os inibidores da dideoxinucleotídeo. 3TC também é um potente inibidor da polimerase
hepadnavirus.Foiobservadoqueotratamentocom3TCmostraumareduçãoacentuadadoHBV.A
resistênciainicialao3TCestáassociadoàsubstituiçãodaisoleucinapelametioninanaposição184da
transcriptase reversa do vírus HIV – 1, que resulta na troca de uma base simples (ATG – ATA)
(Serafianos,1999).
O tratamento com 3TC é um efetivo inibidorda replicação do vírus HIV, e associado com a
dideoxycytidine(ddC)eAZTmostraefetividadecontraoHIVpoispodemfosforilarpararesultarem
5’tripfosfato,cujoinibecompetitivamentesobreatranscriptasereversaviral(Hart,1992).
AtranscriptasereversaéumaenzimaquecopiaogenomadefitasimplesdoRNAdoretrovírus
paradentrodoDNAduplafita.Nestaenzimapodeocorrermutações,causandoresistênciadoHIV1
aotratamentocom3TC(Essink,1997).
40
1.6.3 d4T
OAZTeo2’,3’didehydro3’deoxthymidine(d4T;Stavudina)temmostradoeficáciaclínicaem
pacientescominfecçãodovírusHIVetambéméutilizadoemconjuntocomoutrasdrogas.Estudos
clínicosebásicosindicaramqueoAZTtemopotencialdecruzarasbarreirassangüíneasdocérebroe
dofluídocérebroespinhaleconsegueentrarnocérebro.Porémod4Tébemdistribuídonoorganismo,
masnãotemhabilidadedeentrarnofluídocerebral(Thomas,1998).
AStavudinaéumapiramidinanucleosídica,umpotenteagenteantiretroviralcomativação
in
vitro
contraoHIVeésimilaràZidovudina(Horton
etal.,
1995;Kline,1995).DeacordocomKline
(1995),estadrogaébemtoleradaenãopossuidoseclínicarelatadaoueventoslaboratoriaisadversos
comoaZidovudina.AativaçãodaStavudinaémensuradaindiretamentepelacontagemdelinfócitos
TCD4+epelasmudançasnaconcentraçãodoantígenoséricop24,econcluiqueaStavudinamostra
semuitoeficaznotratamentodeinfecçõesporHIVemcrianças.
1.6.4 EFV
Muitas drogas antiretrovirais, incluindo a efavirenz (EFV), estão associadas ao aumento dos
lipídiosséricos. AEFV,uma inibidora nãonucleosídeadatranscriptasereversa (NNRTI), éa mais
utilizada, pois promove maior eficácia e tolerabilidade. Também é um indutor do citocromo P450
(CYP)e3A4(Gerber,2005;Wire,2004),etambémreduzasconcentraçõesdoinibidordaproteaseno
plasma,incluindooAPV,indinavir,lopinavireoatazanavir(Wire,2004).
O regime alimentar é necessário quando é administrado a EFV devido a sua alta potência, a
longa meiavida eo potencialde efeitos adversos associadoscomo inibidor daprotease.Porém, o
princípiogenéticoparaaresistênciaàdrogaébaixacomaEFVdoquecomoinibidordaprotease:a
mutação simples no gene da transcriptase reversa do HIV1 produz altos níveis de resistência
fenotípicaparaaentradadoinibidornãonucleosídicodatranscriptasereversanaclassedeagentes,
enquanto a importância clínica da resistência do inibidor da protease geralmente requer múltiplas
mutações(Lucas,2001).
41
2OBJETIVOS
2.1ObjetivoGeral
Avaliar a freqüência de instabilidade genômica, através da técnica de micronúcleos com
bloqueio de citocinese e ensaio do cometa, em indivíduos HIV+ come sem o uso de drogas anti
retrovirais(ARVs)emrelaçãoaosindivíduoscontroles.
2.2.Objetivos Específicos
AvaliaroefeitogenotóxicodacontaminaçãoviralatravésdosíndicesdedanodeDNAmedidos
pelastécnicasdemicronúcleoecometa.
Avaliar o efeito das drogas através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de
micronúcleoecometa.
Avaliaroefeitogenotóxicodeoutrosfatorescomoidade,sexoetabagismoemindivíduosHIV+
com e sem uso de ARVs e no grupo controle através dos índices de dano de DNA medidos pelas
técnicasdemicronúcleoecometa.
42
3MATERIALEMÉTODOS
3.1.Delineamento
O trabalho é um estudo transversal, onde foram analisadas 135 amostras, sendo 34 (25,2%)
indivíduoscontrole,39(28,9%)indivíduosHIV+semtratamentoe62(45,9%)indivíduosHIV+com
tratamento. Apesquisa foi realizadana VigilânciaSanitáriado MunicípiodeNovo Hamburgo, Rio
Grande do Sul – Brasil. Os dados foram coletados a partir do “Questionário de Saúde Pessoal”
publicado pela Comissão Internacional de Proteção a Mutágenos e Carcinógenos Ambientais
(ICPEMC) (Carrano e Natarajan, 1988) e por revisão de prontuários. O protocolo do estudo foi
aprovadopeloComitêdeÉticada Feevale(CEP)epeloConselhoNacionaldePesquisa(CONEP).
Todos os participantes receberam e assinaram um “Termo de Conhecimento Livre e Esclarecido”
aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Universitário Feevale (Anexo I) e preencheram o
QuestionáriodeSaúdePessoal(AnexoII).Atabela1mostraascaracterísticasdaamostraestudada.
Tabela1.Característicasdaamostraestudada.
Controles HIVsemmedicação HIVcommedicação
Masculino 13(38,24%) 15(38,46%) 36(58,06%)
Feminino 21(61,76%) 24(61,54%) 26(41,94%)
Idade 42,97 ± 21,75 37± 7,61 38,89± 9,88
Fuma 11(32,35%) 18(46,15%) 22(35,48%)
Total 34(25,19%) 39(28,89%) 62(45,93%)
Foramcoletados4mLdesangueperiféricodospacientesHIV+comesemusodeARVsede
indivíduos controle no início da manhã. Esta quantidade foi suficiente para a realização do Ensaio
Cometaedatécnicademicronúcleoscombloqueiodacitocinese(CBMN).Otransportedasamostras
43
foi realizado pela executora do estudo nas normas de biossegurança, como também todo o
procedimentodasmesmasnoLaboratóriodeCitogenéticadoCentroUniversitárioFeevale.
3.2.Procedimentos
3.2.1.TécnicadeMicronúcleoscomBloqueiodaCitocinese(CBMN)
AsfreqüênciasdeMN,denúcleosligadosporpontesdematerialnuclearede“buds”nucleares
(indicativosdeamplificaçãogênica)foramdeterminadasem1000célulasbinucleadasporindivíduo,
em lâminas feitas a partir de cultura de linfócitos, em meios de cultura RPMI mais aditivos, com
bloqueiodacitocinesecelularconformeFenecheMorleyeN󰜱󰜱󰜲󰜲󱰱󰜴󱩘󰈁)󱁕󵄋󱠡󱜡󱜲󰜲󰜳󲀸󰜴󱨱󱜡󳭮c
44
8. Adicionar4gotasdeFormalina,previamenteaquecidaa37°Ceagitar;
9. Deixar5minutosembanhomaria;
10. Adicionar5mLdecitratodesódiojáaquecidoembanhomariaa37°C;
11. RessuspendercompipetaPasteur;
12. Deixarpor7minutosembanhomaria;
13. Adicionar0,5mLdefixador(3metanol/1ácidoacético);
14. Ressuspender;
15. Centrifugara1000r.p.m.por7minutos;
16. Adicionar5mLdefixador;
17. Ressuspender;
18. Centrifugara1000r.p.m.por7minutos;
19. Desprezarosobrenadante;
20. Adicionar5mLdefixador;
21. Ressuspender;
22. Estocarnocongeladorcomtampa,ouemgeladeirapor,nomínimo,15minutos.
ConfecçãodaLâmina:
1. Apóstirardocongelador,centrifugara1000r.p.m.por7minutos;
2. Desprezarosobrenadante;
3. Adicionar5mLdefixador;
4. Ressuspender;
5. Centrifugara1000r.p.m.por7minutos;
6. Desprezarosobrenadante,destavezdeixandoaproximadamente1mLnotubo;
7. Ressuspender;
8. Pingarduasgotasdomaterialaseranalisadonalâmina,aumaalturadeaproximadamente18
cm;
9. Esperarsecarnabancada;
10. Sobapia,preenchertodaalâminacomocoranteGiemsa(20%emáguadestilada)comuma
seringa;
11. Deixaragirpor4minutos;
45
12. Desprezarocoranteemáguacorrenteabundante,deixandoqueaáguaescorrapelalâminana
horizontal(nadireçãododedoparafora);
13. Desprezaroexcessodeáguabatendoalâminalateralmenteempapelabsorvente.
Foram utilizadas lâminas novas, lavadas com detergente e guardadas em álcool 70% no
refrigerador.Paraouso,foramlavadasnovamenteemáguacorrente(nascubetas)eporúltimo,com
água destilada. Estas foram retiradas das cubetas com pinça e permanecem com o lado superior
molhado.Todasaslâminasforamidentificadascomonúmerodaamostra.
3.2.2.Técnicado Cometa:
Oensaiocometa foidesenvolvidodeacordo comoprotocolopadrão de preparaçãoeanálise
(Tice
etal.,
2000).Lâminasforampreparadaspelaadiçãode300µldesoluçãodeagaroseecolocadas
emgeladeiraparasolidificarasolução(530mimà4ºC).Umamisturade5µldesanguetotalcom95
µl de 0,7% agarose lowmeltingpoint foi adicionado à lâmina. A lamínula foi imediatamente
adicionada e após a lâmina foi novamente colocada na geladeira por 5 min para que a agarose
solidificasse.Depoisdetranscorridoestetempoalamínulafoiretiradaeaslâminasforamsubmersas
nasoluçãodelisequeestavapreviamentepreparadanageladeira(2,5MNaCl,100mMEDTA,10mM
Tris,pH10,2,com1%deTritonX100e10%DMSOfoiadicionado).Após124hà4ºC,aslâminas
foramretiradasdasoluçãodelise,eoexcessodelíquidofoiretirado.Aslâminasforamcolocadasna
horizontal na cuba de eletroforese à 4ºC e cobertas com tampão alcalino (300 mM NaOH, 1 mM
EDTA,ph>13).Olíquidocobreaslâminas,queficamexpostasaotampãopor20min,semcorrente
elétrica.Aeletroforeseéentãoiniciadaa25Ve300mA(~0,95V/cm)por20min.Essespassossão
realizados sob luz vermelha para evitar dano de DNA que a luz branca pode causar. Depois da
eletroforese,aslâminassãogentilmenteretiradasdacubaeumtampãoneutralizador(0,4MTris,pH
7,5)éadicionadosobreaslâminastrêsvezes,comintervalode5mincadavez.Aslâminassãolavadas
tambémtrêsvezescomáguadestiladaecolocadasparasecarpor24hàtemperaturaambiente.Após,
sãofixadasecoradascomocorantedeprata,deacordocomNadin
etal
.(2001).Paraaavaliaçãodo
danodeDNA,100célulasporindivíduoforamanalisadascomomicroscópioópticoemaumentode
400x.Ascélulasforamclassificadasemcincoclasses,apartirdaintensidadedodano:nenhumdano=
46
0;danomáximo=4.Depoisdaanálise,osvaloresobtidosnacontagemdosdanospodemirde0a400
(Figura2)(MalufeErdtmann,2001).
Figura2:TécnicadoCometa.AsimagensforamobtidasdolaboratóriodeCitogéneticadoCentroUniversitário
Feevale.
Aslâminasdepacientesecontrolesforamanalisadaseosvaloresforamtabuladosparaposterior
avaliaçãoestatística.Ostestesutilizadosforam nãoparamétricos.Paraaanálisedecorrelaçãoentre
variáveis quantitativas foi realizado o teste de correlação de Pearson e Spearman, para analisar a
diferençaentre dois grupos foi utilizado o teste de MannWhitney. Para as análises foi utilizado o
programaSPSSversão10.0.
47
4RESULTADOS
Quando comparamos os pacientes HIV+ com e sem medicação com o grupo controle, não
encontramosdiferençasignificativaparanenhumdosindicadoresdedanodeDNAdatécnicadeMN.
Porém, ficou evidenciadaa diferença significativa entre estas duas amostras para o índice de dano
medidopeloensaiocometa(p=0,016).Outrosresultadosgeraiscomoasmédiaseosdesviospadrões
dos grupos HIV+ e controle, assim como os níveisde significância estatística encontrados quando
comparamosasamostras,estãoapresentadosnaTabela2.AsalteraçõesmedidaspelatécnicaCBMN
estão apresentadas em forma de médias e desviospadrão, obtidas a partir de valores absolutos da
contagemde1000linfócitosbinucleadosporindivíduo.Mesmoasanomaliasencontradasemcélulas
com mais de dois núcleos, seguemas médias e desviospadrão da contagem geral de 1000 células
binucleadas, ou seja, a contagem de todas as anomalias era feita até ser encontrado o linfócito
binucleado de número 1000, em cada indivíduo. Os índices de dados da técnica do cometa
apresentadossãoobtidosatravésdosomatóriodosdadosobservadosem100célulasporindivíduoe
naTabela2estãoapresentadosemformademédia.
Tabela2.Freqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,eíndicededanodeDNAdo
Ensaio Cometaem100célulasdosgruposControleepacientesHIV+.
Controles HIV+ p
Cometa 9,62±8,96 (n=34) 33,61±44,87 (n=101) 0,016
PN 0,88±0,88 (n=25) 1,13±1,34 (n=38) 0,800
BUD 1,32±1,35 (n=25) 1,92±1,95 (n=38) 0,213
MN 3,80±2,04 (n=25) 3,13±2,02 (n=38) 0,233
Amédiadasfreqüênciasdemicronúcleos,pontesdicêntricasebudseoíndicededanodeDNA
medidopelatécnicadocometadospacientesHIV+semecommedicaçãoeindivíduoscontroleestão
apresentadosnaTabela3.
48
Encontramosdiferençasignificativanodanomedidopeloensaiocometaquandocomparadoos
gruposHIV+semmedicaçãoecontrole(p=0,007).Paraestatécnicaamédiaeodesviopadrãofoide
38,03±45,43e9,62±8,96,respectivamente.OsgruposHIV+semmedicaçãoecontroleapresentaram
comomédiasparaMN,PNeBUDosseguintesvalores:3,71±1,96e3,80±2,04(p=1,000);1,35±1,62
e 0,88±0,88 (p=0,655) e 1,94±2,16 e 1,32±1,35 (p=0,323), respectivamente. As médias não
apresentaramdiferençaestatísticasignificante(Tabela3).
Tabela3.Freqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNAdeacordo
comoEnsaio Cometaem100célulasdosg
49
obtivemos diferenças estatisticamente significativas (cometa: p=0,751; MN: p=0,070; PN: p=0,950;
BUD:p=0,418).
Os pacientes HIV+ sem e com medicação possuem média das células TCD4+ igual a
415,29±205,38e388,84±299,38,respectivamente(p=0,169)(Tabela4).Amédiadacargaviral(CV)
dos respectivos grupos foi de 26.987,93±40.909,37 e 5.818,73±26.734,74, apresentando diferença
significativa,comp<0,001(Tabela4).
Tabela4.ComparaçãodataxadecélulasTCD4+(mm³)eCargaViral(cópias/mL)entreosgruposHIV+seme
commedicação.
HIV+semmedicação HIV+commedicação p
TCD4+ 415,29±205,38(n=35) 388,84±299,38(n=56) <0,169
CargaViral(CV) 26.987,93±40.909,37(n=34) 5.818,73±26.734,74(n=51) <0,001
ForamtestadasascorrelaçõesentreosgruposHIV+,HIV+semmedicaçãoecommedicaçãoem
relaçãoàCV.Nestaanálisenãohouveumacorrelaçãoestatisticamentepositivaparaestesdados.Este
resultadotambémfoiencontradoquandotestadoosreferidosgruposcomataxadeTCD4+.
4.1.Sexo
Considerandotodaaamostra(gruposcontrole,HIV+semecommedicação),osindivíduosdo
sexomasculinoapresentaramumamédiade3,34(n=32) linfócitosbinucleadoscommicronúcleose
umdesviopadrãode1,86,enquantoosdosexofeminino,umamédiade3,45,comdesviopadrãode
2,23.Nãoficouevidenciadadiferençaestatisticamentesignificanteentreossexos,quantoafreqüência
demicronúcleos,pontesdicêntricas,budseensaiocometa(Tabela5).
Tabela5.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaioCometaem100célulasdosgruposControleepacientesHIV+semmedicaçãoecom
medicaçãoemrelaçãoaosexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 25,77±34,99(n=64) 3,34±1,86(n=32) 1,12±1,18(n=32) 2,03±2,06(n=32)
Feminino 29,20±44,89(n=71) 3,45±2,23(n=31) 0,94±1,18(n=31) 1,32±1,30(n=31)
Total 27,57±40,39(n=135) 3,40±2,04(n=63) 1,03±1,18(n=63) 1,68±1,75(n=63)
50
Quando avaliamos o grupo controle em relação ao sexo, também não observamos diferença
estatística. Indivíduos do sexo masculino e do sexo feminino apresentaram as seguintes médias e
desviospadrão para a técnica do cometa, MN, PN e BUD: 9,62±6,44; 3,57±1,62; 1,00±1,00 e
1,86±1,35,respectivamente(Tabela6).
Tabela6.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordo comoEnsaio Cometaem100célulasdogrupocontroleemrelaçãoaosexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 9,62±6,44(n=13) 3,57±1,62(n=7) 1,00±1,00(n=7) 1,86±1,35(n=7)
Feminino 9,62±10,37(n=21) 3,89±2,22(n=18) 0,83±0,86(n=18) 1,11±1,32(n=18)
Total 9,62±8,96(n=34) 3,80±2,04(n=25) 0,88±0,88(n=25) 1,32±1,35(n=25)
Não obtivemos valores significativos para o grupo HIV+ em relação ao sexo. As médias e
desviospadrãoestãoapresentadosnaTabela7.
Tabela7.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaiodeCometaem100célulasdogrupoHIV+emrelaçãoaosexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 29,88±38,05(n=51) 3,28±1,95(n=25) 1,16±1,25(n=25) 2,08±2,23(n=25)
Feminino 37,42±51,00(n=50) 2,85±2,19(n=13) 1,08±1,55(n=13) 1,62±1,26(n=13)
Total 33,61±44,87(n=101) 3,13±2,02(n=38) 1,13±1,34(n=38) 1,92±1,95(n=38)
Nastabelas8e9estãoapresentadasasmédiasedesviospadrão,eapósanáliseverificouseque
osdadosnãoapresentamsignificânciaestatística.
Tabela8.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaio Cometaem100célulasdogrupoHIV+semmedicaçãoemrelaçãoaosexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 27,40±28,85(n=15) 3,44±2,01(n=9) 1,11±1,54(n=9) 2,00±2,69(n=9)
Feminino 44,67±52,75(n=24) 4,00±2,00(n=8) 1,63±1,77(n=8) 1,88±1,55(n=8)
Total 38,03±45,43(n=39) 3,71±1,96(n=17) 1,35±1,62(n=17) 1,94±2,16(n=17)
Tabela9.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaio Cometaem100célulasdogrupoHIV+commedicaçãoemrelaçãoaosexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 30,92±41,61(n=36) 3,19±1,97(n=16) 1,19±1,11(n=16) 2,13±2,03(n=16)
Feminino 30,73±49,41(n=26) 1,00±0,71(n=5) 0,20±0,45(n=5) 1,20±0,45(n=5)
51
Total 30,84±44,66(n=62) 2,67±1,98(n=21) 0,95±1,07(n=21) 1,90±1,81(n=21)
4.2.Idade
FoitestadaacorrelaçãodePearsonentreidadeetécnicadocometa,freqüênciademicronúcleos,
pontes dicêntricas e buds. Quando correlacionamos as técnicas do cometa e de CBMN de toda a
amostracomaidade,foiobservadoumacorrelaçãopositivaemumdosdanosdeDNAavaliadopela
técnica de MN, o BUD, com nívelde significância igual 0,024. Esta correlação estatística não foi
observadanatécnicadocometa(p=0,858),nasPN(p=0,119)enoMN(p=0,169).
Os grupos foram testados separadamente, e quando analisamos apenas o grupo HIV+ não foi
evidenciadocorrelaçãoestatísticasignificativaparacometa(p=0,453),MN(p=0,716),PN(p=0,581)e
BUD (0,696). O mesmo ocorre quando correlacionamos o grupo HIV+ sem medicação: Cometa
(p=0,829), MN (p=0,500), PN (0,192) e BUD (0,824); e o grupo HIV+ com medicação: Cometa
(p=0,400),MN(p=0,989),PN(p=0,718)eBUD(p=0,748).Porém,quandocorrelacionamosogrupo
controle com aidade obtivemos valorsignificativoparaBUD,comp=0,010. Atécnicado Cometa
(p=0,263),oMN(p=0,377)eaPN(p=0,115) nãoapresentaramcorrelaçõespositivas.
4.3.Fumo
Quando relacionamos os indivíduos de todos os grupos em fumantes e não fumantes,
observamosumadiferençasignificativaparaodanodeDNAmedidopelatécnicadeMN(p=0,006),
comoobservadonaTabela10.
Tabela10.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaioCometaem100célulasdosgruposHIV+semecommedicaçãoecontroleemrelação
aotabagismo.
Cometa MN PN BUDS
NãoFuma 26,69±41,74(n=84) 3,03±2,13(n=39) 0,97±1,09(n=39) 1,51±1,60(n=39)
Fuma 29,02±38,42(n=51) 4,00±1,74(n=24)* 1,13±1,33(n=24) 1,96±1,97(n=24)
Total 27,57±40,39(n=135) 3,40±2,04(n=63) 1,03±1,18(n=63) 1,68±1,75(n=63)
*p<0,05
52
Separamososgruposparaverificarapresençadealgumaalteração estatística significativa. O
níveldesignificância,paraatécnicadeMN,semanifestaquandocomparamospacientesHIV+que
fumamcomaquelespacientesHIV+quenãofumam(p=0,033).Atécnicadocometa(p=0,956),PN
(p=0,754) e BUD (p=0,611) não apresentou alterações significativas (Tabela 11). Já entre os
indivíduos controle não há diferença significativa entre fumantes e não fumantes para todas as
técnicas:Cometa(p=0,435),MN(p=0,120),PN(p=0,672)eBUD(p=0,970)(Tabela12).
Tabela11.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem e com medicação em relação ao
tabagismo.
Cometa MN PN BUDS
NãoFuma 33,46±47,13(n=61) 2,55±1,84(n=22) 1,05±1,29(n=22) 1,77±1,97(n=22)
Fuma 33,85±41,77(n=40) 3,94±2,02(n=16)* 1,25±1,44(n=16) 2,13±1,96(n=16)
Total 33,61±44,87(n=101) 3,13±2,02(n=38) 1,13±1,34(n=38) 1,92±1,95(n=38)
*p<0,05
Tabela12.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaiodeCometaem100célulasdogrupocontroleemrelaçãoaotabagismo.
Cometa MN PN BUDS
NãoFuma 8,74±7,21 (n=23) 3,65±2,37(n=17) 0,88±0,78(n=17) 1,18±0,88(n=17)
Fuma 11,45±12,04(n=11) 4,13±1,13(n=8) 0,88±1,13(n=8) 1,63±2,07(n=8)
Total 9,62±8,96(n=34) 3,80±2,04(n=25) 0,88±0,88(n=25) 1,32±1,35(n=25)
QuandoseparamososgruposdepacientesHIV+erealizamosacomparaçãocomastécnicasdo
cometa,danosdeDNAmedidopeloMN,observamosqueogrupoHIV+semusodemedicaçãonão
possui diferença significativa (cometa: p=0,877; MN: p=0,620; PN: p=0,646; BUD: p=0,878) em
relaçãoaofumo(Tabela13).EentreospacientesHIV+commedicaçãohádiferençasignificativanos
fumantes em relação aos não fumantes para a técnica de MN (p=0,020). As outras técnicas
apresentaramosseguintes valores:cometa(p=0,935),PN(p=0,316)eBUD(p=0,502).Estesdados
estãoapresentadosnaTabela14.
Tabela13.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaiodeCometaem100célulasdogrupoHIV+semmedicaçãoemrelaçãoaotabagismo.
Cometa MN PN BUDS
NãoFuma 35,95±42,07(n=21) 3,56±2,01(n=9) 1,56±1,74(n=9) 2,11±2,76(n=9)
Fuma 40,44±50,19(n=18) 3,87±2,03(n=8) 1,13±1,55(n=8) 1,75±1,39(n=8)
53
Total 38,03±45,43(n=39) 3,71±1,96(n=17) 1,35±1,62(n=17) 1,94±2,16(n=17)
Tabela14.Médiasdasfreqüênciasdemicronúcleo,pontesdicêntricasebudsem1000células,edanodeDNA
deacordocomoEnsaiodeCometaem100célulasdosgruposHIV+commedicaçãoemrelaçãoaotabagismo.
Cometa MN PN BUDS
NãoFuma 32,15±50,04(n=40) 1,85±1,41(n=13) 0,69±0,75(n=13) 1,54±1,27(n=13)
Fuma 28,45±33,67(n=22) 4,00±2,14(n=8)* 1,38±1,41(n=8) 2,50±2,45(n=8)
Total 30,84±44,66(n=62) 2,67±1,98(n=21) 0,95±1,07(n=21) 1,90±1,81(n=21)
*p<0,05
54
5DISCUSSÃO
Aproximadamente15%doscâncereshumanossãoassociadosainfecçõesporvírus.Nasúltimas
décadas, uma grande série de dados experimentais e epidemiológicos tem apontado vários vírus
humanoscomoagentescausaisdetumoresespecíficos(Hilleman,1998).
Osmecanismosatravésdosquaisosvíruspodemcontribuirparaodesenvolvimentodetumores
nohomemincluem a inflamaçãocrônica,oestímulodaproliferaçãocelular,aalteraçãodaresposta
imuneeoacúmulodemutaçõesnacélulainfectada.PacientesinfectadoscomovírusHIVapresentam
um risco maior de desenvolver certos linfomas. De fato, a tríade infecção viral, exposição a um
carcinógenoedeficiênciaimunológicadohospedeiroestá presente emmuitos tumores(Boccardoe
Villa,2006).
Apartirdestecontexto,comparamos101pacientesHIV+ com34controles,eobtivemosuma
diferençaestatisticamentesignificante(p=0,016)paraoíndicededanomedidopelatécnicadocometa.
Esteresultadopodeestarindicandotantoumefeitodovírus,quantoumefeitodasdrogasutilizadas.
Quando separamos os pacientes HIV+ seme comtratamento,observamos que o grupo constituído
pelospacientesHIV+semousodeARVstemumíndicededanodeDNAmaiordoqueospacientes
quejáestãoemtratamento.Estefatoédevidoàaçãodovírussobreascélulas,poispacientesquenão
administram os ARVs permitemque o vírus atue de forma mais agressiva sobre as células. Nosso
estudo deveser analisado a partir dedois gruposamostrais: em umdelesaação do víruspode ser
observadademaneiraisolada,tendointerferênciaapenasdosmesmosfatoresqueinterferemnodano
deDNAnaamostracontrole;nooutrogrupoamostral,temosumadiminuiçãodaaçãodovíruseo
acréscimodaaçãodasdrogascomofatoresqueinfluenciamnodanodeDNA.
55
Atécnicadocometadetectaprincipalmentequebrasdecadeiasimples,umalesãodeDNAque
pode ser efetivamente reparada pelas células, enquanto que a técnica de micronúcleos detecta o
resultadodaslesões,comomicronúcleos,pontesdicêntricasebudsnucleares,quenãosãoreparáveis.
Portanto, os resultados encontrados com o ensaio cometa são um indicativo de dano de DNA
aumentadoempacientesHIV+.Deummodogeral,éimportantesalientarosaltosvaloresdedesvio
padrão natécnica do cometa, que refletem uma grande variação interindividual, que é um achado
freqüentequandoestatécnicaéutilizada(DeMéo,
etal.,
1991;Tice,1995;Vaghef,
etal.,
1997).
QuandocomparadoosgruposHIV+commedicaçãoecontrole,notamosqueosvaloresparaa
técnica do Cometa e MN se aproximaram do nível de significância (p=0,078 e p=0,061,
respectivamente).Emrelaçãoaogrupoamostralsemtratamento,podemosdizerqueodanodeDNA
medido pela técnica do cometa está menor, porém parece haver um aumento na freqüência de
alteraçõesestabelecidasnãoreparáveis,medidaspelafreqüênciademicronúcleos.Esseachadopode
estarrelacionadocomofatodequeospacientesqueestãosendotratadosforamcontaminadoscomo
vírushámaistempo,estando,portanto,expostosaumagentegenotóxicobiológicoe,posteriormente,
aagentesgenotóxicosquímicosporumperíodomaiordetempo.
NaTabela4estáevidenciadoqueamédiadaCVestáaumentadaempacientesHIV+quenão
administramosARVs(p<0,001),porémataxadeTCD4+nãomostroualteraçõessignificantes.Este
resultadoestádeacordocomaalteraçãoencontradanogrupoHIV+semmedicação,osquaisestão
apresentando maior dano genômico. A combinação dos ARVs deve ser suficiente para suprimir a
replicaçãoviralabaixodoslimitesdedetecçãodoteste(<50cópias/mL).Asupressãomáximadiminui
a evolução viral, limitando o potencial para a seleção de cepas virais resistentes, pois o
desenvolvimento de resistência à determinada droga pode diminuir a potência de outras drogas
(principalmente dos ARVs com mecanismo de ação semelhante). Porém, Hatano
et al
(2000)
apresentaramemseuestudoqueareplicaçãoviralativapodepersistiremvárioslocaisdoorganismo
(células mononucleares do sangue periférico, fluido cerebroespinhal, nódulos linfáticos) depois de
baixosníveisdeviremia.Outroestudoapontaqueareplicaçãoviraliniciaquandoéretiradaasdrogas
ARVs.
56
Não percebemos diferença significativa nas drogas analisadas individualmente, isto é, não
detectamos alterações estatísticas quando um paciente HIV+ administrava alguma droga em
específico.EsteresultadofoicontraditórioaosestudosfeitosporVonTungeln
etal.
(1997),oqual
observouqueoAZTémutagênico
invitro
ecarcinogênicoquandoadministradoemratosneonatais.
NossosdadosapresentammuitosfatoresquepodeminfluenciarnastaxasdedanodeDNA,porisso,
talvez fosse necessário o aumento no tamanho das amostras que utilizam determinada droga para
detectarodanodeDNAcausadoporcadauma delas.Entretanto,ospacientesqueutilizam adroga
ARV 3TC apresentaram uma diferença estatisticamente próxima do significativo para a técnica de
MN,comp=0,070.Esteresultadodemonstraqueestadrogapodeestarpromovendoummaiordanode
DNA sobre as células. De acordo com Hoffman
et al
(2005), a Lamivudina (3TC) desenvolve
resistênciarapidamente: somenteum único pontodemutaçãoérequerido (M184V),entretanto esta
mutaçãopodeaumentarasensibilidadedealgunsvírusAZTresistentes,reduzindoaadaptaçãovirale
tornandoadrogabastanteeficiente.
Segundoaliteratura,asupressãodaviremiaplasmáticaparaareduçãode níveisdetectáveisé
conseguidoempacientesHIV+tipo1através dedrogasantiretroviraisadministradascorretamente
(Gulick
etal.
,1997;Perelson
etal.
,1996).Porém, areplicaçãodevíruscompetentepersistenestes
indivíduoseaviremiarapidamenteaumentaquandoasupressãodosARVséinterrompida(Davey
et
al.
,1999).Apartirdestesdados,verificamosqueovírusHIVprovocaalteraçõesimportantesanível
deDNAquandonãoéadministradoosARVsnoscasosdeviremiaplasmáticaalta(>50cópias/mL),
pois a replicação viral persistente é sinônimo de dano progressivo do sistema imunológico e,
conseqüentemente, aumento de alterações citogenéticas. E de acordo com os dados encontrados,
observamosquenossospacientesHIV+estãotendoboarespostaàmedicação,porémospacientesque
nãoestãorecebendoaindaosARVs,ouporteremabandonadootratamento,apresentaminstabilidade
genômicamaisacentuadaem relaçãoaospacientesemtratamento.
Quantoaofatorsexo,comoindicadonaliteratura,nãohouvediferençasignificativaentreosexo
masculinoe feminino. Para testarasensibilidadeaovírus eàs drogas,foramtestadasas diferenças
entre freqüênciasdemicronúcleos, pontesdicêntricasebuds,assim comooíndicededano medido
pelatécnicadocometaencontradasentreossexos,separadamente,nasamostrascontrole,HIV+não
tratadaeHIV+tratada.Nenhumadasamostrasapresentoudiferençasentreossexos,nastaxasdedano
57
deDNA.Esseachadoestáemconcordânciacomamaioriadaspublicaçõesquetestaramasdiferenças
entreossexos(GallowayeEvans,1975;Crossen
etal
.,1977;Livingston
etal
.,1983).
As médias de idade dos pacientes com HIV+ sem medicação, dos pacientes HIV+ com
medicaçãoedoscontroles foram de 37 ±7,61, 38,89 ± 9,88 e 42,97 ±21,75,respectivamente.As
médiasdospacientesHIV+demonstram umaumentodafaixaetária dos indivíduos infectados.No
Brasil houve aumento do número de casos em idosos e da proporção de indivíduos afetados nessa
faixaetáriaentreosanosde1991e2000(Melo
etal.
,2002).
OaumentonafreqüênciadeMNdependentedaidadeéumaquestãomuitodiscutida.Enquanto
alguns autores sugerem um aumento definitivo com a idade (Feneche Morley, 1986; Scarfi
et al.
,
1990;Cruz
etal.
,1994),outrosnãoencontramtalcorrelação(Hogstedt,1984;Sbrana
etal.
,1991).
Nossoestudonãoapresentoucorrelaçãoestatisticamentesignificativaentreasidadeseasfreqüências
deMN,pontesnucleoplasmáticaseoíndicededanodotestedecometa,quandoaamostratotalfoi
testada.Porémfoiencontradacorrelaçãoentreidadeefreqüênciadebuds(p=0,024).Quandoestas
correlaçõesforamtestadasemcadaamostra,tambémnãoforamencontradosresultadospositivosnas
amostrasdeindivíduosHIV+comtratamentoesemtratamento.Jáparaogrupocontrole,encontramos
uma correlação positiva entre idade e freqüência de buds (p = 0,010), o que explica o resultado
encontrado na amostra total. A freqüência de buds foi muito baixa em todas as amostras e,
particularmente,noscontroles,commédiade1,32±1,35nos25indivíduosanalisados.Alémdisso,o
desviopadrãotemumvalormaiordoqueamédia.Essesfatorescitadosinfluenciamnegativamentena
importânciadesseachado,podendoesta,serumaanálisecombaixopoderestatístico.
Nossa amostra total havia 51 fumantes e 84 não fumantes. Os fumantes apresentaram uma
freqüênciadeMNmaiorqueosnãofumantes(p=0,006)(ObeeHerha,1978;LarramendyeKnuutila,
1991; Cruz
et al.
, 1994). Esta diferença também foi observada no grupo de pacientes HIV+ que
utilizamamedicaçãoantiretroviral,noqual,ospacientesquefumamapresentammaiorfreqüênciade
MNemrelaçãoaospacientesnãofumantes(p=0,020).Jáestadiferençanãofoiencontradanosgrupos
HIV+quenãoutilizamamedicaçãoantiretroviralecontroleemrelaçãoaotabagismo.Esteachado
demonstraumefeitosinérgicoentreasdrogasantiretroviraiseotabagismo,oquedeveserlevadoem
consideração no aconselhamento destes pacientes, na busca de uma melhor qualidade de vida, no
58
sentidodeevitarodesenvolvimentodeneoplasiaspeloacúmulode mutaçõesocasionadasporestes
doisfatores.Paraogrupocontrole, nãoforamencontradasdiferençasestatisticamentesignificativas
entreasfreqüênciasdedanodeDNAemfumantesenãofumantes.Otabagismotemefeitogenotóxico
comprovado apenas em amostras maiores e quando o hábito é mais freqüente, ou seja, quando os
fumantesconsomemmaioresquantidadesdecigarros.
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74
ANEXOS
AnexoI:TermodeConsentimentoInformado
IJustificativaeobjetivosdapesquisa:
Este estudo consiste em uma avaliação das alterações no material genético (DNA) de cada
participante. Estas alterações ocorrem normalmente nas células em níveis bastante baixos, e são
apontadascomoresponsáveis,entreoutrosefeitos,pelosprocessosdeenvelhecimentoecâncer.
IIProcedimentosqueserãoutilizados:
Seráfeitaumacoletade5mldesangueperiféricocomopropósitodeavaliarafreqüênciade
mutações através da técnica de micronúcleos (que avalia quebras cromossômicas e perdas do
cromossomointeiro)edatécnicado"cometa"(queacusalesõesmenoresdomaterialgenético).
Pelo presente Consentimento PósInformação, declaro que fui informado de forma clara e
detalhada, dos objetivos, da justificativa, dos procedimentos que serei submetido, dos riscos,
desconfortosebenefíciosdopresenteProjetodePesquisa,assimcomodosprocedimentosalternativos
aosquaispoderiasersubmetido.
Fui igualmente informado: da garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou
esclarecimento a qualquer dúvida a cerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos
relacionados com a pesquisa; da liberdade de retirar meu consentimento, a qualquer momento, e
deixardeparticipardoestudo,semqueistotragaprejuízoàcontinuaçãodomeucuidadoetratamento;
dasegurançadequenãosereiidentificadoequesemanteráocaráterconfidencialdasinformações
relacionadascomaminhaprivacidade.
OPesquisadorResponsávelporesteProjetodePesquisaéGrazielaMariaSchuh(fone:9718
6622).
Data:___/___/___.
NomeeassinaturadoPacienteouVoluntário:
________________________________________________________________
NomeeassinaturadoResponsávelLegal,quandoforocaso:
________________________________________________________________
AssinaturadoPesquisadorResponsável:
_______________________________________________________________
75
AnexoII:
QUESTIONÁRIODESAÚDEPESSOAL
(Deacordocommodelorecomendadopor:InternationalCommissionforProtectionagainst
EnvironmentalMutagensandCarcinogens(ICPEMC)MutationResearch,204:379406,1988)
Este questionário, assim como o estudo a ele relacionado, deve ser de seu
interesse. A participação e espontânea e constará destas informações gerais sobre saúde e
dieta, mais uma coleta de sangue para estudo citogenético. O estudo consiste em uma
avaliação de mutações nos cromossomos de cada participante. Mutações cromossômicas
ocorrem normalmente nas células de todas as pessoas em nível bastante baixo, e são
apontadas,entreoutrosefeitos,nosprocessosdeenvelhecimentoedocâncer.
Trabalhadores em atividades de risco (por exemplo, radiologia, quimioterapia,
uso de óxido deetileno eoutras),se não seguirem normas adequadas de segurança, podem
aumentarafreqüênciademutaçõescromossômicasemsuascélulas.Esteestudopoderáservir
como sinal de alerta para prevenir e melhorar as condições de segurança. Caso não se
encontremdiferençasentretrabalhadoresdeatividadesderiscoeoutrosdeatividadesdiversas,
poderemos concluir que os itens de segurança são efetivos neste aspecto. Isto servirá de
estímuloparacontinuartomandocuidadoscomavidanolocaldetrabalho.
Leiaerespondacuidadosamenteasseguintesquestões.Ainformaçãodadapor
você não será associada com o seu nome, sendo conhecida apenas pelos pesquisadores
associados a este estudo. As respostas deste questionário poderão ter influência direta na
interpretação de nossos resultados. Por isso, contamos com sua cooperação em fornecer
informaçõescorretas.
Obrigadopeloseuinteresse.
1.Nome:________________________________________________________
Data:_____/_____/_______
2.Paraserpreenchidopelopesquisador: Códigon.:_____________.
Essa folha será destacada das demais do questionário e arquivada. Apenas o
númerodocódigoseráusadocomoidentificaçãonaspróximaspáginas.Seespaçosadicionais
foremnecessáriosparacompletarumaresposta,porfavorescrevaatrásdapáginaeidentifique
ocomplementodarespostacomonúmerodaquestão.
76
Códigon.:___________.
HISTÓRIAPESSOAL
3.Datadehoje:_________________________________________________.
4.Qualasuaidade?_______________(emanos).
5.Sexo:()Masculino()Feminino
6.Aqualgrupoétnicovocêpertence:
()Caucasiano()Negro()Chinês()Japonês
()Outro.Qual?____________________________________.
7.Qualoseuestadocivil?
()Casado()Solteiro()Separado()Divorciado()Viúvo
8.Dequantosfilhosvocêépainatural(istoé,nãoincluafilhosadotadosedecriação,einclua
filhosquemoramseparadamente)?______________________
HISTÓRIAOCUPACIONAL
9.Qualoseulocaldetrabalho?_______________________________________.
10.Háquantotempovocêtrabalhanestelocal?___________________________.
11.Se há menos de dez anos, onde você trabalhou previamente e por quanto tempo?
________________________________________________________.
12.Quetipodetrabalhovocêfaz?___________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
___________
EXPOSIÇÃO
13.Liste os agentes químicos (por exemplo, gases tóxicos, benzeno, chumbo, fármacos,
agrotóxicos,etc.) ou físicos (radiação) a que você se expôs nos últimos 10 anos em seu
trabalho.
Nosúltimos12meses:Quantasvezespormês:
______________________________________
______________________________________
______________________________________
Nosúltimos10anos:Quantasvezespormês:
______________________________________
______________________________________
______________________________________
77
Códigon.:__________
14.Liste os agentes químicos (agrotóxicos e outros que julgar necessário) ou físicos a que
vocêseexpôsnosúltimos10anosforadeseutrabalho.
Nosúltimos12meses:Quantasvezespormês:
______________________________________
______________________________________
______________________________________
Nosúltimos10anos:Quantasvezespormês:
_____________________________________
_____________________________________
HISTÓRIADEFUMO
15.Algumavezvocêfumou?()Sim()Não
Senão,passeparaaquestão16.Sesim,continue:
a).Quantotempovocêfumou?______________(emanos)
b).Vocêfumaatualmente?()Sim()Não
Sesim,passeparaa
15.c)
Senão:Quandovocêparoudefumar?___________________(mêseano).
c).Vocêfumacigarros?()Sim()Não
Sesim,quantascarteiraspordia? ()Menosde½carteira
()½a1carteira
()Maisde1carteira,quantas?______
Vocêfumacigarroscomfiltro? ()Sim()Não
Qualasuamarcausual?_________________________________.
d).Vocêfumacharutos?()Sim()Não
Sesim,quantoscharutospordia? ()1charuto
()2a3charutos
()4oumaischarutos.Quantos?____
e).Vocêfumacachimbo?()Sim()Não
Sesim,quantasvezespordia?()1vez
()2a3vezes
()4oumaisvezes.Quantas?_______
f)..Oquevocêfumavanopassado? ()Cigarros
()Charutos
()Cachimbo
g)..Vocêmastigatabaco?()Sim()Não
78
Códigon.:_________
MEDICAMENTOSEDOENÇAS
16.Você tem tomado algum medicamento prescrito pelo médico no último ano (por
exemplo,comprimidos para pressão, insulina, tranquilizantes, relaxantes musculares, etc.)?
()Sim()Não
Sesim,porfavorindique:
Período.
Tipodemedicamento:Dose:Quantospordia:Início(mês):Término(mês):
________________________________________________________
____________________________________ ____________________
________________________________________________________
17.Você tem tomado algum medicamento não prescrito por médico no último ano (por
exemplo,aspirina,antiácidos,antihistaminas,sedativosououtrasdrogas)?
()Sim()Não
Sesim,porfavorindique:
Período:
Tipodemedicamento: Dose:Quantospordia:Início(mês):Término(mês):
________________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
18.Vocêtomaoutomoualgumavitaminanosúltimos6meses?
()Sim()Não
Sesim,porfavorindique:
Tipodevitamina: Dose:Quantasvezesporsemana:
__________________________________________________
__________________________________________________
19.a).Vocêteveoutemalgumadessasdoenças?
Câncer ()Sim()Não
Hepatite ()Sim()Não
Mononucleose ()Sim()Não
Herpes ()Sim()Não
AIDS ()Sim ()Não
Meningite ()Sim()Não
Infecçãobacterianaouviral ()Sim()Não
Doençacardiovascular ()Sim()Não
Diabete ()Sim()Não
Outrasdoençasimportantes ()Sim()Não
79
Códigon.:__________
b).Sesim,indiqueabaixo:
Doença:Períododadoença:Tratamento:
____________________________________________
____________________________________________
c).Listeasvacinaçõesquevocêrecebeunosúltimos12meses.
Vacina:Data:
______________________________________________
______________________________________________
d).ListeosraiosXdiagnósticoseterapêuticos,recebidosnosúltimos10anos.
RazãoparaoraioXData(ano)
______________________________________
______________________________________
______________________________________
e).Vocêfezalgumacirurgiaduranteoúltimoano?
Data:Razão:
_____________________________________________________
_____________________________________________________
f).Dêasdatasdequandovocêtevefebrenosúltimos12meses.
Data(mês):Doençaassociada:Medicamentotomado:
_____________________________________________________
_____________________________________________________
DIETAS
(deverefletirapenasoshábitosfrequentes)
20.Vocêcomeapenasvegetais? ()Sim()Não
21.Vocêcomecarne? ()Sim()Não
a).Sesim,comquefrequênciavocêcomeoseguinte:
Diasporsemana:
1a2 3a4 5a6 todosdias
80
Carnebovina () () () ()
Peixe () () () ()
Galinha () () () ()
Porco () () () ()
Outras () () () ()
Códigon.:__________
b).Comovocêpreferesuacarne?()Malpassada()Noponto()Bempassada
22.Vocêusaadoçantes?()Sim()Não
Quantospordia?____________
23.Vocêbeberefrigerantes?()Sim()Não
Quantospordia?____________
24.Comente sobre sua dieta, caso ela tenha algo de especial (por exemplo, dieta rica em
proteínasepobreemcarbohidratos,etc).
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________
25.Vocêbebecafé?()Sim()Não
Quantosxícaraspequenaspordia?__________
26.Vocêbebechá?()Sim()Não
Quantosxícaraspordia?__________
27.Vocêtomachimarrão?()Sim()Não
Comquefreqüência?__________________________________________.
28.Vocêbebecerveja?()Sim()Não
Sesim,porfavorindiquesuamédiadeconsumosemanal:
()16garrafasporsemanaoumenos.
()712garrafasporsemana.
()1324garrafasporsemana.
()Maisde24garrafasporsemana.Quantas?_________.
29.Vocêbebevinho?()Sim()Não
81
Sesim,porfavorindiquesuamédiadeconsumosemanal:
()14coposporsemanaoumais.
()58coposporsemana.
()916coposporsemana.
()Maisde16coposporsemana.Quantos?__________.
30.Vocêbebeoutrasbebidasalcoólicas(excluindocervejaevinho)?
()Sim()Não
Sesim,qualouquais?____________________________
Códigon.:________
.Porfavor,indiquesuamédiadeconsumosemanal:
()14coposporsemanaoumenos.
()58coposporsemana.
()916coposporsemana.
()Maisde16coposporsemana.Quantos?___________.
HISTÓRIAGENÉTICA
31.Você tem conhecimento dealgumdefeitode nascimentoou outra desordem genética ou
doençahereditáriaquetenhaafetadoseuspais,irmãos,irmãsouseusfilhos?
()Sim()Não
Sesim,porfavorespecifique:___________________________________
32.Vocêouasuaesposateveoutemdificuldadeparaengravidar?
()Sim()Não
Sesim,porfavorespecifique:___________________________________
33.Vocêjáteveumfilhoquetenhanascidoprematuramenteouquetenhasidoabortado?
()Sim()Não
34.Vocêtemumgêmeoidênticovivo?()Sim()Não
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