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UNIVERSIDADE FEDERAL
DO TRIÂNGULO MINEIRO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL METASTÁTICO E
DA VASCULARIZAÇÃO NAS NEOPLASIAS
EPITELIAIS DE GLÂNDULAS SALIVARES
Kelen Christine do Nascimento Souza
Uberaba-MG
Junho/2007
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ii
Kelen Christine do Nascimento Souza
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL METASTÁTICO E
DA VASCULARIZAÇÃO NAS NEOPLASIAS
EPITELIAIS DE GLÂNDULAS SALIVARES
Tese apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Patologia, área de
concentração em Patologia Geral”, da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro,
como requisito parcial para obtenção do
Título de Doutorado.
Orientador: Prof. Dr. Adriano Mota Loyola
Uberaba-MG
Junho/2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
S713a
Souza, Kelen Christine do Nascimento.
Avaliação do Potencial Metastático e da vascularização nas Neoplasias
Epiteliais de glândulas salivares / Kelen Christine do Nascimento Souza. - -
2007.
134 f. : tab. ; graf. ; fig.
Tese (Doutorado em Patologia) - Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, Uberaba, MG, 2007.
Orientador: Prof. Dr. Adriano Mota Loyola.
1. Glândulas salivares - Tumores - Teses. 2. Proteínas - Pesquisa. 3.
Proteína VEGF - Teses. 4. Proteína PDEGF - Teses. 5. Imunohistoquímica
- Teses. I. Título. II. Loyola, Adriano Mota.
CDU - 616.31- 006
iii
AGRADECIMENTOS
iv
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Adriano Mota Loyola, meu orientador, mestre, amigo e conselheiro.
Essa convivência diária tem revelado o seu brilhantismo como profissional, além de sua
paixão e crença no desenvolvimento da pesquisa no Brasil. Esses ensinamentos e sua
perseverança são pedras preciosas que vou levar em minha vida. A você, a minha gratidão
por acreditar e me apoiar durante esses anos.
Ao Prof. Dr. Fernando Luiz Dias, que prontamente nos recebeu no Instituto
Nacional do Câncer, apoiando os nossos projetos e estabelecendo essa colaboração de tão
grande valor! Muito obrigada, pela credibilidade, atenção e presteza que tem demonstrado
a nossa equipe.
Ao Prof. Dr. Paulo Antônio Silvestre de Faria, por permitir nosso acesso à Divisão
Interna de Patologia do INCA, que sob sua exemplar chefia e organização, possibilitou-nos
um excelente ambiente de trabalho. Obrigada pela compreensão.
v
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Deus, meu Senhor e melhor amigo, obrigada por ter me abençoado a cada dia!
Ao meu amado esposo, Clovis, pelo amor, carinho e atenção! Muito obrigada por
estar ao meu lado, suportando em amor todos os momentos que vivenciamos nessa etapa.
A você, o meu amor!
Ao meu filho João Pedro e minha filha Júlia, que nasceram durante o doutorado!
Vocês são os melhores presentes que a mamãe poderia ganhar! Com vocês tenho
aprendido a valorizar a vida, cada minuto que temos juntinhos, cada gesto, abraço e
beijinhos! Foram momentos muito bons, às vezes ausente, mas sempre presentes no meu
coração! Obrigada, por vocês e o papai, terem sido o meu porto seguro! Amo vocês!
Aos meus pais, Edson e Aires, meus irmãos Edson Júnior e Érika, meus cunhados e
sobrinhos Pablo, Maria Eduarda e Lavínia, que durante esses anos estiveram sempre
pertos, amando, brincando, apoiando e motivando! Obrigada por terem ajudado a amar e
cuidar das crianças!
Aos meus amigos e conselheiros Rogério, Sônia e Eliana sempre presentes, com
uma palavra de bom ânimo, carinho, apoio e oração. Muito obrigada!
Aos meus grandes amigos e professores, Dr. Sérgio Vitorino Cardoso e Dr. Paulo
Rogério de Faria, foi uma honra trabalhar e conviver com vocês! Muito obrigada pelo
apoio e dedicação!
Aos alunos e amigos, Sergio Sargenti, Marco Túlio, Luciana, Nadim, Gabriel,
Leandro e Débora, que nos apoiaram na coleta de dados e atividades do laboratório. A
presença de vocês foi fundamental para o desenvolvimento do trabalho.
Ás funcionárias do Laboratório de Patologia Bucal Selma e Ângela, pelo empenho
e participação ativa nesse trabalho. Em especial, a Ângela que dedicou horas extras e finais
vi
de semana para que pudéssemos cumprir os prazos com material do INCA, muito
obrigada!
Às doutoras e preceptoras do Instituto Nacional do Câncer (INCA), Ana Lúcia A.
Eisenberg e Marilena F. Nascimento, pela confiança, disponibilidade e grande incentivo na
realização deste trabalho.
Às funcionárias do Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do INCA,
Márcia Oliveira Andrade e Vânia Jorge Farah, pela paciência e disponibilidade diante de
nossas dificuldades e solicitações.
Aos funcionários da Divisão Interna de Patologia do INCA: Anderson, Eanes, Sra.
Zezé e Sr. Almir, pela presteza e receptividade.
Aos funcionários do Arquivo médico do INCA: Carlos, Claudionor, Fernando,
George, Gerônimo, Helena, Sr. Ildálio, Lula, Lucinéia, Rolão, Rômulo, Valdenir, Vanilda
e Vera, por colaborar com a pesquisa e tornar nossos os momentos de trabalho mais
felizes.
Aos companheiros e professores do Curso de Pós-graduação em Patologia da
UFTM, os quais tive o privilégio de conviver e compartilhar conhecimentos no doutorado.
Em particular, a Elisângela que foi uma grande motivadora e companheira de viagem!
Aos que contribuíram financeiramente para a realização das viagens: Programa de
Pós-graduação em Odontologia da UFU, na pessoa do Prof. Carlos José Soares e ao
Programa de Pós-graduação da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro (UFTM), na
pessoa do Prof. Vicente de Paula Antunes Teixeira e Profa. Roseli Aparecida Silva Gomes,
além do apoio contínuo da CAPES, FAPEMIG e CNPq.
vii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................1-3
2. REVISÃO DA LITERATURA .....................................................................4-31
3. HIPÓTESES ..................................................................................................32-33
4. OBJETIVOS ..................................................................................................34-36
5. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................37-48
6. RESULTADOS .............................................................................................49-79
7. DISCUSSÃO .................................................................................................80-96
8. CONCLUSÃO...............................................................................................97-98
9. RESUMO.......................................................................................................99-100
10. ABSTRACT...................................................................................................101-102
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................103-119
viii
LISTA DE FIGURAS
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Expressão de VEGF em glândula salivar normal. A) Presença de
parênquima salivar apresentando unidades secretoras e seguimentos de ductos salivares
intralobulares. Observar a presença de marcação intensa nos túbulos e ausência de
marcação nas células acinares. Expressão antigênica também é observada em pequenos
vasos no interstício glandular; B) Estroma de região periglandular, onde se observam
feixes musculares esqueléticos com positividade moderada e pequenos vasos
intensamente marcados.(Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X)......................................
54
FIGURA 2-Expressão de VEGF em AP. Área predominada pela presença de estruturas
discreta expressão em células ductais luminais (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X).
ductais onde prevalece .......................................................................................................
55
FIGURA 3- Expressão de VEGF em APBG. A) Observam-se pequenos vasos expressos
no estroma tumoral permeando áreas sólidas da lesão. Nesta região, as células
neoplásicas são negativas; B) Presença de crescimento papilar, mostrando a marcação de
células cubóides, em intensidade moderada; C) Área do tumor predominada pela
presença de áreas ductais e sólidas justapostas. Aqui, nota-se intensa expressão
antigênica citoplasmáticas em todas as células tumorais. (Streptavidina-biotina-
peroxidase, 400x).................................................................................................................
56
FIGURA 4- Expressão de VEGF em CME. Em A, nota expressão antigênica
predominantemente fraca associada ás células intermediárias e epidermóides, incluindo
aquelas situadas no revestimento do espaço cístico. Ausência de marcação nas células
mucosas; B) Áreas cístico-papilares mostrando células colunares intermediárias com
marcação de moderada intensidade; C) Nódulos com padrão de crescimento sólido, com
presença de estruturas ductais. Todas as células, com aspecto de células intermediárias e
epidermóides com intensa marcação para VEGF (Streptavidina-biotina-peroxidase,
400X)...................................................................................................................................
56
FIGURA 5- Expressão de VEGF em CAC. A) Área da lesão com padrão cribriforme de
crescimento. A marcação fraca é observada em células ductais luminais e,
aparentemente, em células não luminais; B) área do tumor com padrão tubular
apresentando marcação moderada em células luminais das estruturas ductais. Alguns
vasos são positivos no mesmo padrão de intensidade de marcação, com expressão
antigênica também presente em hemácias; C) Área com padrão tubular de crescimento
com marcante expressão em células ductais luminais. (Streptavidina-biotina-peroxidase,
400X)..................................................................................................................................
57
FIGURA 6- Expressão de PDEGF em AP. A) Áreas com predomínio de estruturas
ductais, apresentando fraca expressão de PDEGF em células luminais; B) Outra área
com estruturas epiteliais-mioepiteliais, onde os ductos mostram uma expressão
antigênica mais acentuada (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X..................................
58
FIGURA 7- Expressão de PDEGF em APBG. A) Área do tumor predominada por
estruturas sólidas e tubulares em que a expressão aparece fraca. B) Outra área
caracteristicamente tubular em que as células luminais apresentam expressão antigênica
intensa (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X)...............................................................
.
59
FIGURA 8- Diferentes áreas do CME expressando PDEGF. A) Área constituída por
estrutura cística e presença de células mucosas. Células intermediárias e epidermóides
apresentando fraca expressão. B) Expressão variando de fraca a moderada nas células
intermediárias e epidermóides em área sólida do CME; C) Padrão de crescimento
tumoral semelhante ao visto em B, apresentando marcações fortes em células
intermediárias e epidermóides (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X)...........................
60
x
FIGURA 9- Expressão de PDEGF em CAC. A. Marcação de intensidade fraca (A) e
moderada (B), observada principalmente em células luminais de estruturas cribriformes
e tubulares (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X).........................................................
60
FIGURA 10- Expressão de CD34 nos tumores de glândulas salivares. A) Presença de
vasos marcados em áreas hialinizadas de uma área celular mioepitelial do AP (seta); B)
Vasos marcados em estroma permeando áreas sólidas do APBG (seta); C) Marcação
vascular em delicados septos CME (seta) e D) CAC com nódulos sólidos e estruturas
tubulares mostrando estroma permeado por discretos vasos positivos (seta)
(Streptavidina-biotina-peroxidase, 400)...............................................................................
62
FIGURA 11- Expressão de CD105 nos tumores de glândulas salivares. A) Região de
AP com estroma parcialmente hialinizado, apresentando pequenos vasos com uma
intensidade fraca de marcação (setas). Alguns destes vasos não mostram positividade de
expressão; B) Região periférica ao crescimento do APBG mostrando pequenos vasos
positivos para CD105 (setas); C) Pequenos vasos com marcação de moderada
intensidade em estroma intra-tumoral (setas); D) Região estroma do CAC mostrando
vasos com moderada intensidade de expressão antigênica (Streptavidina-biotina-
peroxidase, 400X)..............................................................................................................
64
FIGURA 12 - Comparação da expressão de CD34 entre o grupo de tumores benignos
(AP) e os tumores Pmalig (APBG, CME e CAC)..............................................................
69
FIGURA 13- Comparação da expressão de CD34 entre os tipos histológicos das
neoplasias malignas primárias entre si (APBG, CME e CAC)............................................
70
FIGURA 14- Comparação da expressão de CD105 entre o grupo de tumor benigno (AP)
e os tumores Pmalig (APBG, CME e CAC).......................................................................
71
FIGURA 15- Comparação da expressão de CD105 entre os tipos histológicos das
neoplasias malignas primárias entre si (APBG, CME e CAC..............................................
71
FIGURA 16 - Curva de sobrevida (Kaplan-Meier) dos pacientes estudados, segundo
estadia5 0ç0.01 Tc0.0026 Tw[(estad)-4.1(i)1.3(a5 0ç0.01 Tc0.0026 Tw[(estad)-4.1(i)1.3(a5 0ç[(estad)-4.1(i)1.4clíestad)-as)1(i)1.4p1(i)1.e3.9(6(C(...))1(i)1.4sas (...)e e )6(a5 0ç[a TNM 2(i)3.90012 Tc0.00035.74 )6(de C9(A)4.326.9003 Tp 1)-5.1(.5(bre)0.74 )6(de C7.491 0 TD-0.0034 Tc< 0,4.58(D34 .7(...)80 -1.180 -1.180 -...)80 -1.180 -1.180 -1.180 -1.180 -1.180 -1.180 1.180 -...)80 -1.180 -1.180 -1.180 -1.180 -1.180Tj/TT8 1 Tf10.43.46 31(708 99.24 326.9003 Tm-0.TT2 1 Tf5.1856 0 TD0.093 TD( )TTm-0.T8 1 Tf10.62.20.05.04 0 TD0.0004 Tc0.RA)-4.56 16
xi
LISTA DE TABELAS
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Tipos tumorais epiteliais de glândulas salivares reconhecidos pela Classificação
dos Tumores de Glândulas Salivares de origem epitelial da OMS (BARNES et al,
2005)
39
Tabela 2 -
Distribuição dos casos selecionados classificadas segundo o tipo histológico e a
presença ou não de metástases após reavaliação histopatológica e preenchimento
dos critérios de inclusão, provenientes do Instituto Nacional do Câncer no período
de 1998 a 2003.
40
Tabela 3 -
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AP – Adenoma Pleomórfico
ANG- Angiopoetina
APBG- Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau de Malignidade
BX- biópsia incisional
CAC- Carcinoma Adenóide Cístico
CCA- Carcinoma de Células Acinares
CE- Carcinoma Epidermóide
CD- grupos de diferenciação
CID- Código Internacional de Doenças
CME- Carcinoma Mucoepidermóide
cut-off- ponto de corte
DMV- densidade microvascular
EC- enucleação cirúrgica
ELISA- ensaio imunoenzimático
FCP- fator de crescimento placentário
FGFb- fator de crescimento fibroblástico básico
HIF- Fator Indutor de Hipóxia
hot spots- áreas de maior vascularização
HUVEC- células endoteliais da veia humana umbilical
IH- Imuno-histoquímica
MC- metástases cervical
md- mediana
MD- metástases à distância
xv
mm²- milímetro quadrado
N- número da amostra
NA - não se aplica
OñRC- Óbito não relacionado ao câncer
ORC- Óbito relacionado ao câncer
PDEGF- Fator de crescimento Endotelial derivado de Plaquetas
Pmalig- primários malignos, incluindo todos os tipos histológicos PM e PNM
PM- grupo de tumores primários metastatizantes formados pelo APBG, CME e CAC.
pm- neoplasias primárias metastatizantes
PNM- grupo de tumores primários não metastatizante formados pelo APBG, CME e CAC.
pnm- neoplasias primárias não metastatizantes
RXT- radioterapia
TGF - fator transformador de crescimento
TP- Timidina fosforilase
VCDm- Vivo com Doença metastática
VCDp- Vivo com doença primária
VCDr- Vivo com doença recidiva
VEGF- Fator vascular de crescimento endotelial
VSD -Vivo sem doença
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
INTRODUÇÃO
2
1- INTRODUÇÃO 1
2
As neoplasias epiteliais de glândulas salivares constituem um grupo de doenças 3
cuja expressão clínico-patológica traduz-se em uma ampla variedade de lesões. Embora 4
tais tumores sejam incomuns, não são raros. A incidência anual de tumores das glândulas 5
salivares no mundo está em torno de 0,5 a 1,2 casos por 100.000 pessoas por ano e 6
correspondem a aproximadamente 3% a 10% das neoplasias que acometem a região de 7
cabeça e pescoço (EVESON & CAWSON, 1985). Entre as neoplasias benignas e malignas 8
que comumente afetam as glândulas salivares, podemos citar: Adenoma Pleomórfico (AP), 9
Carcinoma Mucoepidermóide (CME), Carcinoma Adenóide Cístico (CAC) e 10
Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau (APBG) (ELLIS & AUCLAIR, 1996). 11
Para as neoplasias malignas, a ocorrência de metástases tem sido considerada um 12
fator prognóstico relevante. A ausência de metástases está relacionada a um melhor 13
prognóstico e uma maior sobrevida, enquanto a ocorrência de metástases tumoral é a 14
principal intercorrência relacionada à mortalidade em pacientes com câncer 15
(VERMEULEN et al., 2002). Metástases regionais e à distância no CME afetam cerca de 3 16
a 15% e 6 a 15% dos pacientes, respectivamente (NASCIMENTO et al., 1986a; 17
BRADLEY et al., 2001), e as taxas de sobrevida de cinco e dez anos, situam-se em torno 18
de 60% e 40%, respectivamente (HICKMAN et al.., 1984; CLODE et al., 1991; SUZUKI 19
et al., 1998; OKABE et al., 2001). Para o CAC, a ocorrência de metástases regionais e à 20
distância chegam a 47% e 50%; a sobrevida de cinco anos fica entre 45% a 80%, 21
diminuindo para entre 22% e 44% em 10 anos (COWIE & POINTON, 1984; SPIRO & 22
HUVOS, 1992). Nos APBG as metástases regionais podem ocorrer em 9% dos casos, as 23
metástases à distância são raras e o prognóstico parece relativamente bom, sendo que cerca 24
3
de 80% dos pacientes ficam livres da doença após o tratamento (VINCENT et al., 1994; 1
CASTLE et al., 1999; BRADLEY, 2001). 2
Grande número de evidências tem apontado o fenômeno da angiogênese como 3
intimamente vinculado ao desenvolvimento das metástases. Incertezas ainda persistem se 4
sua participação se dá de forma passiva ou ativa neste processo (BOCKHORN et al., 5
2007). Em função disto, nas últimas décadas têm se formado a opinião que a angiogênese 6
pode vir a se constituir em um potencial marcador biológico de prognóstico e um fator 7
preditivo de metástases em tumores sólidos humanos (HASAN et al., 2002). Neste sentido, 8
avaliações da distribuição e quantificação da angiogênese têm sido realizadas utilizando-se 9
de marcadores moleculares de endotélio, fatores associados ao crescimento e inibição da 10
angiogênese. Dentre os fatores estudados destacam-se o Fator Vascular de Crescimento 11
Endotelial (VEGF) e marcadores endoteliais como o CD31 e CD34 sem, contudo, se obter 12
resultados consistentes. Esta situação em parte é decorrente das circunstâncias vinculadas 13
ao estudo como qualidade da amostra estudada, variações na técnica de identificação 14
antigênica, e dos antígenos pesquisados. 15
No presente trabalho foi proposta uma ampliação nesta investigação, a partir do 16
estudo da expressão dos fatores de crescimento vascular VEGF e PDEGF (ainda não 17
avaliado em tumores de glândulas salivares) e os marcadores de endotélio vascular CD34 e 18
de CD105, este em especial considerado marcador específico de angiogênese, em um 19
grupo de neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares. Nesta avaliação, 20
procuramos identificar a associação entre a expressão destes antígenos e a ocorrência de 21
metástases. 22
23
24
25
4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
REVISÃO DA LITERATURA
5
2. REVISÃO DA LITERATURA 1
2.1. NEOPLASIAS EPITELIAIS DE GLÂNDULAS SALIVARES 2
• Adenoma Pleomórfico 3
O Adenoma Pleomórfico (AP) é a neoplasia benigna de glândula salivar mais comum. 4
Pode ocorrer em qualquer idade, porém é mais comum em pacientes acima de quarenta 5
anos e possui uma discreta tendência a acometer preferencialmente o sexo feminino 6
(NARDONE et al., 2002). Clinicamente, o AP apresenta-se como crescimento nodular 7
lento e indolor. Para as glândulas menores, os locais mais acometidos são palato, lábio 8
inferior e bochecha; para as glândulas maiores a parótida é o sítio preferencialmente 9
afetado (ELLIS et al., 1991). 10
Histologicamente observam-se estruturas epiteliais-mioepiteliais caracterizadas 11
pela presença de espaços ductiformes revestidos por células colunares luminais e 12
envolvidos por uma ou mais camadas de células poligonais com diferentes padrões de 13
diferenciação mioepitelial. Essa variabilidade é que dá um aspecto pleomórfico ao tumor, 14
traduzido pela presença de áreas mixóides, condróides, hialinas, osteóides e lipomatosas 15
(ELLIS et al., 1991; ELLIS & AUCLAIR, 1996; BARNES et al., 2005). 16
Devido à sua natureza benigna, os APs são tratados por excisão cirúrgica 17
conservadora, observando sempre a necessidade de extensão extra-capsular (BRADLEY, 18
2001). A incidência de recidiva do AP na parótida varia de 20 a 45% quando se realiza 19
apenas a enucleação; em 2 a 5%, depois de uma parotidectomia parcial e até 0,4% quando 20
a parotidectomia total é realizada (MERCANTE et al., 2002; ITO et al., 2005). Nas 21
glândulas salivares menores, o risco de recidiva varia de 5 a 30% nas excisões cirúrgicas 22
com margem de segurança. O prognóstico é considerado excelente, com um índice de cura 23
de aproximadamente 95% (MERCANTE et al., 2002; ITO et al., 2005). 24
6
As lesões recidivantes apresentam maior potencial de transformação maligna, 1
principalmente nos casos de AP localizados nas glândulas salivares menores. A 2
transformação maligna do AP tem sido descrita, especialmente nos casos de longa duração 3
e recidivas freqüentes (ELLIS & AUCLAIR, 1996). Nestes casos, as neoplasias são 4
classificadas como tumor misto metastatizante ou Carcinoma ex-Adenoma Pleomórfico 5
(ELLIS & AUCLAIR, 1996; BRADLEY, 2001). As metástases usualmente são observadas 6
em pulmões, ossos e outras vísceras (BRADLEY, 2001). 7
8
• Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau de Malignidade 9
O Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau de Malignidade (APBG) é 10
considerado menos agressivo apresentando crescimento lento e indolor. O local de maior 11
ocorrência é o palato (EVANS & BATSAKIS, 1984). No entanto, pode ser encontrado em 12
outros locais, como lábio superior e bochecha (LOYOLA et al., 1995; KELSCH et al., 13
1997). Alguns autores mostraram a ocorrência de APBG em glândulas parótidas 14
(RITLAND et al., 1993). Esta neoplasia tende a acometer mais mulheres, com maior 15
incidência entre quarenta a setenta anos (VINCENT et al., 1994). 16
Histologicamente, as células tumorais apresentam forma cuboidal ou colunar, núcleos 17
ovóides, vesiculosos, com homogeneidade em forma e tamanho. Vários padrões de 18
crescimento são identificáveis entre os quais sólido, em cordões, ductal, cribriforme e 19
cístico-papilar. As figuras mitóticas são incomuns. O estroma pode apresentar 20
transformação mucóide ou hialinizações (KELSCH et al., 1997; ARAUJO et al., 1999). 21
Invasão perineural é um achado comum (LUCARINI et al., 1994). 22
O tratamento mais adequado é a excisão cirúrgica. A sua recorrência é observada em 23
17% dos casos e as metástases variam de 0,1% à 57,5% (VINCENT et al.,1994; 24
CASTLE et al., 1999; EVANS & LUNA, 2000; POGODZINSKY et al., 2006). 25
7
• Carcinoma Mucoepidermóide 1
Os Carcinomas Mucoepidermóides (CME) são os tumores malignos mais 2
freqüentes de glândulas salivares, podendo representar 3 a 20% dos tumores de glândulas 3
salivares e 12 a 40% das lesões malignas (AUCLAIR et al., 1992; LOYOLA et al., 1995; 4
GUZZO et al., 2002). Podem acometer pacientes em qualquer faixa etária, mas apresentam 5
pico de prevalência na 4ª e 5ª décadas, afetando ambos os sexos igualmente e acometendo 6
preferencialmente a parótida e o palato entre as glândulas menores intra-orais (SPIRO et 7
al., 1978; NASCIMENTO et al., 1986a, AUCLAIR & ELLIS, 1991; LOYOLA et al., 8
1995, BRANDWEIN et al., 2001). Usualmente, apresentam-se como aumento de volume 9
assintomático, eventualmente associado à ulceração superficial, dor e parestesia 10
(LOYOLA et al., 1995; GUZZO et al., 2002). 11
Histopatologicamente são caracterizados por crescimentos sólidos e císticos, 12
constituídos por vários tipos celulares, tais como: células mucosas, epidermóides, 13
intermediárias, claras e colunares (AUCLAIR et al., 1992). A gradação histológica dos 14
carcinomas mucoepidermóides tem sido realizada utilizando vários critérios (AUCLAIR 15
et al., 1992; BRANDWEIN et al., 2001). No entanto, estas classificações apresentam 16
limitações quanto à reprodutibilidade de certos parâmetros, visto que incluem potencial 17
subjetivo de avaliação, em especial o grau de anaplasia do tumor (AUCLAIR et al., 18
1992; HICKS et al., 1994; ELLIS & AUCLAIR, 1996; PIRES, 2002). Mais 19
recentemente, a OMS (BARNES et al, 2005) tem recomendado os critérios 20
desenvolvidos por Auclair et al. (1992) que se baseiam na proporção do componente 21
intra-cístico, presença de invasão neural, necrose e anaplasia, quantificação de mitoses 22
que favoreceram a distinção entre os três graus histológicos: baixo, moderado e alto. 23
A modalidade terapêutica está vinculada à gradação histopatológica, localização e 24
estágio clínico do tumor. Usualmente, o a ressecção cirúrgica ampla é a mais indicada, 25
8
associada ou não ao esvaziamento cervical, com indicação eventual de radioterapia pós-1
operatória (HAMPER et al., 1989; BRANDWEIN et al., 2001). O prognóstico depende 2
do estágio e do grau histológico do tumor (BRADLEY, 2001). 3
As taxas médias de recidivas locais do CME situam-se próximas a 15%, variando de 4
10% para os tumores de baixo grau a 75% para os de alto grau (PIRES et al., 2002). As 5
taxas de sobrevida de cinco e dez anos, para todos os graus de malignidade situam-se 6
em torno de 60 a 70% e 40 a 60%, respectivamente (HICKMAN et al., 1984; CLODE et 7
al., 1991; SUZUKI et al., 1998; OKABE et al., 2001). 8
As metástases regionais e à distância do CME afetam cerca de 3 a 15% e 6 a 15% dos 9
pacientes, respectivamente (NASCIMENTO et al., 1986a; BRADWEIN et al., 2001; 10
PIRES, 2002) e são influenciadas pelo grau histológico, estágio clínico e a localização 11
dos tumores (SPIRO et al., 1978; AUCLAIR et al., 1992). As metástases à distância têm 12
sido identificadas entre treze e sessenta meses após o tratamento dos CMEs de alto grau, 13
e normalmente estão localizadas nos pulmões, fígado, osso e parede abdominal 14
(BRADLEY, 2001). Não obstante, há uma ampla variação cronológica descrita para o 15
aparecimento de metástases. 16
17
• Carcinoma Adenóide Cístico 18
O Carcinoma Adenóide Cístico (CAC) é um dos mais comuns e bem reconhecidos 19
tumores malignos glandulares. Os locais de ocorrência mais freqüentes são glândula 20
parótida, glândula submandibular e glândulas salivares menores do palato (SPIRO & 21
HUVOS, 1992; KIM & SUNG, 1994; FIGUEIREDO, 1995; ELLIS & AUCLAIR, 1996). 22
Raramente acomete pacientes com menos de vinte anos de idade, sendo comum entre a 4ª e 23
a 6ª década de vida (ELLIS & AUCLAIR, 1996). Não há predileção por sexo (SPIRO & 24
HUVOS, 1992). Geralmente, o crescimento é lento e a dor um achado comum desde o 25
9
início da doença. Em alguns casos pode provocar paralisia facial resultante da infiltração 1
neoplásica nos espaços perineurais desta lesão (SPIRO & HUVOS, 1992; KIM & SUNG, 2
1994). 3
Histopatologicamente são reconhecidos três padrões morfológicos: cribriforme, 4
representado por cordões celulares que se anastomosam, originando espaços 5
pseudocísticos e ductais; tubular com presença de estruturas tubulares em um estroma 6
hialinizado; e sólido, no qual observam-se ilhotas ou ninhos celulares com raras 7
formações pseudocisticas ou ductais, onde a necrose pode ser encontrada. Em geral, os 8
três padrões podem ser vistos na mesma lesão (BATSAKIS et al., 1990; BARNES et 9
al., 2005). 10
Geralmente, o tratamento de escolha é excisão cirúrgica radical combinada à 11
radioterapia pós-operatória. A dissecção dos linfonodos é recomendada para os casos 12
clinicamente positivos (MACIEJEWSKI et al., 2002). O prognóstico para o CAC é 13
considerado pobre. Usualmente, o paciente vai a óbito devido a recidivas locais e 14
metástases à distância (NASCIMENTO et al., 1986b; SPIRO & HUVOS, 1992; KIM & 15
SUNG, 1994). 16
De acordo com Witten et al., 1990 e Spiro et al., 1992 a recorrência local é 17
observada em quase 32% dos casos. O risco de metástase à distância também é alto (40%) 18
e pode ocorrer em menos de oito anos depois do tratamento (SPIRO & HUVOS, 1992). O 19
CAC apresenta uma alta probabilidade de desenvolver metástase quando ocorre em 20
glândula submandibular e língua, com médias em torno de 47.1% e 50% , respectivamente. 21
Na região do palato a incidência de metástase é baixa (HAUNG et al., 1997). A 22
disseminação metastática ocorre mais comumente para os pulmões, linfonodos e ossos 23
(HAUNG et al., 1997 e BRADLEY, 2001). Os pacientes com CAC têm uma sobrevida de 24
cinco anos em 45% a 80% dos casos. Em dez anos, esta sobrevida diminui para 22 a 44% e 25
10
em 25 anos cai para 15% (COWIE & POINTON, 1984; NASCIMENTO et al., 1986b; 1
SPIRO & HUVOS, 1992;). 2
A despeito dos progressos alcançados no diagnóstico e terapêutica dos tumores 3
malignos, a elaboração do seu prognóstico está calcada preferencialmente nos aspectos 4
morfogenéticos e no estadiamento clínico das lesões. A identificação de marcadores 5
moleculares que prenunciassem o comportamento da lesão poderia contribuir 6
significantemente para o aperfeiçoamento do prognóstico e tratamento. Entre estes se 7
destacam aqueles associados à progressão tumoral, em especial à metástase. 8
O processo de metastatização é complexo, requer angiogênese, desprendimento das 9
células do tumor primário, adesão e invasão da membrana basal, migração no estroma, 10
penetração no sistema vascular ou linfático, escape da vigilância imunológica e 11
colonização de locais distantes (ELLIS & FIDLER, 1996; VERMEULEN et al., 2002; 12
BOCKHORN et al., 2007). No entanto, várias funções celulares associadas à metástase 13
ainda não foram esclarecidas em nível bioquímico e genético. A elucidação destes 14
fenômenos levaria às novas estratégias para o diagnóstico e tratamento do câncer, que 15
reduziriam a incidência de metástase e melhorariam o prognóstico das lesões (HASAN et 16
al, 2002). 17
2.2. ANGIOGÊNESE 18
Pouco se conhece sobre os mecanismos que desencadeiam a carcinogênese e a 19
progressão dos tumores de glândulas salivares. Da mesma forma, permanece por ser 20
esclarecido o significado de vários marcadores moleculares associados a estes eventos e 21
sua relação com o prognóstico tumoral
(LIM et al., 2003; SOUZA et al., 2006). 22
Neste contexto, assume especial significado a angiogênese tumoral que tem se 23
apresentado como potencial marcador de comportamento biológico e prognóstico. 24
11
Inúmeros trabalhos têm investido na identificação de seu papel como preditor de 1
metástases em tumores sólidos (HASAN et al., 2002; VERMEULEN et al., 2002; 2
SHARMA et al., 2005). 3
A formação de vasos sanguíneos tem sido identificada sob duas designações: 4
angiogênese e vasculogênese. A angiogênese foi estabelecida como brotamento de novos 5
vasos a partir de células endoteliais diferenciadas de um vaso pré-existente. A 6
vasculogênese é a formação de novos vasos sanguíneos in situ, em local onde não há 7
vasos, através de estímulo de proliferação dos angioblastos (células precursoras do 8
endotélio), originários do mesoderma esplâncnico. (CONWAY et al., 2001). 9
O processo de angiogênese desenvolve-se em duas fases: brotamento e maturação 10
(FOLKMAN, 1995; CARMELIET, 2000). O brotamento é um processo complexo que 11
envolve quatro etapas principais: 1) Lise da membrana basal que circunda o vaso por 12
proteases secretadas pelas células endoteliais; 2) Migração de células endoteliais 13
circulantes para o sítio de formação do vaso, onde proliferam e formam uma espécie de 14
broto; 3) Nova proliferação e diferenciação das células endoteliais com conseqüente 15
crescimento e formação da luz do novo vaso; e 4) Secreção de fatores de crescimento pelas 16
células endoteliais que atraem células de suporte (pericitos e células musculares lisas), e 17
formam a membrana basal. Tanto as células de suporte quanto a membrana basal são 18
essenciais para o funcionamento e estabilidade do vaso formado. Nesse estágio final, os 19
vasos adquirem características especializadas adequadas ao tecido ou órgão a que 20
pertencem (CARMELIET, 2000). 21
A angiogênese é uma etapa essencial no desenvolvimento tecidual pré e pós-natal e 22
também participa na cicatrização, reprodução, doenças inflamatórias e degenerativas, 23
distúrbios metabólicos e neoplasia. A angiogênese associada aos tumores sólidos é um 24
12
processo em que novos capilares são formados no estroma tumoral a partir de células 1
endoteliais de vasos pré-existentes (LIOTTA et al., 1991; FOLKMAN, 1995). 2
Diversos estudos têm procurado identificar marcadores de angiogênese, 3
principalmente após 1971 quando Folkman propôs que a terapia anti-angiogênica poderia 4
ser coadjuvante no tratamento do câncer. Desde então, considerou-se que o crescimento 5
tumoral é angiogênese-dependente, a partir do isolamento do "fator de angiogênese do 6
tumor". Numerosos fatores angiogênicos têm sido identificados e os mais freqüentemente 7
encontrados em tumores são o fator de crescimento fibroblástico básico (FGFb), o fator de 8
crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento endotelial derivado de 9
plaquetas (PDEGF) (SENGUPTA et al., 2003). Estes são liberados pelas células tumorais, 10
células endoteliais ou a partir da matriz extracelular. A formação de novos vasos 11
sangüíneos também requer a inibição dos fatores inibidores da angiogênese, tais como: 12
trombospondina-1, fator plaquetário 4, inibidores teciduais das metaloproteinases, 13
prolactina, angiostatina, FGFb, fator transformador de crescimento (TGF-β) e interferon 14
(FOLKMAN, 1995; BOCKHORN et al., 2007; RUDDON, 2007). 15
Na angiogênese tumoral tem sido verificado que tumores com mais de 1 mm de 16
diâmetro necessitam de recrutar novos vasos, para garantir o suprimento de oxigênio e 17
nutrientes, e a remoção de metabólicos tóxicos (FOLKMAN, 1995). Evidências 18
experimentais demonstram que a angiogênese também contribui com o processo 19
metastático, pois na medida em que há expansão da vascularização, maior é a superfície 20
para o escape de células tumorais para a circulação. Este fenômeno pode em parte ser 21
facilitado pela imaturidade dos novos vasos formados (FOLKMAN et al., 1989). Além 22
disso, os fatores angiogênicos produzidos pelas células tumorais induzem a produção de 23
enzimas, tais como, ativadores de plasminogênio e colagenases que contribuem para a 24
13
degradação da membrana basal. Estes eventos facilitam a penetração de células tumorais 1
no interior dos vasos neoformados e favorecendo a metástase, indicando que o fenômeno 2
de metástase é dependente da angiogênese intratumoral (VORAVUD et al.,1999; 3
BOCKHORN et al., 2007; RUDDON, 2007). 4
O papel da angiogênese na progressão do tumor primário e sua associação com 5
metástases hematogênicas e sobrevida tem sido extensivamente estudado, principalmente 6
no carcinoma de mama, tumores de pulmão, trato gastrintestinal e geniturinário, 7
demonstrando associação significativa entre a intensidade da neovascularização e um pior 8
prognóstico (WEIDNER et al., 1991; DICKINSON et al., 1994). 9
2.2.1. Fator Vascular de Crescimento Endotelial 10
Um número muito grande de fatores angiogênicos associados a tumores já foi 11
isolado, sendo um dos mais importantes o fator angiogênico derivado de tumor 12
reconhecido como fator vascular de crescimento endotelial (VEGF). 13
O VEGF é uma glicoproteína com um peso molecular de aproximadamente 45 kDa, 14
sendo sintetizada e expressa em larga variedade de tecidos humanos normais (FOLKMAN, 15
1992; FERRARA et al., 2003). 16
VEGF foi purificado e clonado em 1980 baseado em sua atividade indutora de 17
permeabilidade vascular (SENGER et al., 1986; KECK et al., 1989; DVORAK et al., 18
1995) e como mitogênico para células endoteliais (FERRARA & HENZEL 1989; LEUNG 19
et al, 1989). 20
Até o presente momento, cinco isoformas e dois receptores de VEGF foram 21
seqüenciados. O VEGF-A, que regula o crescimento sanguíneo, VEGF-B está 22
preferencialmente expresso no endotélio sanguíneo, o VEGF-C e o VEGF-D que regulam 23
a angiogênese linfática, e o fator de crescimento placentário (PIGF) que é um fraco indutor 24
14
de angiogênese e de permeabilidade vascular (KECK et al., 1989; DVORAK et al., 1995; 1
FERRARA et al., 2003). 2
A regulação da expressão de VEGF tem sido associada à tensão de oxigênio, sendo 3
aumentada na presença de hipóxia e de fatores de crescimento como fator de 4
transformação de crescimento (TGFα, TGFβ), fator de crescimento derivado de plaquetas 5
(PDGF), fator de crescimento semelhante a insulina, e fator de crescimento de 6
queratinócitos (FERRARA et al., 2003). 7
Por mais de uma década o papel de VEGF na regulação da angiogênese foi objeto 8
de intensa investigação (FERRARA et al., 2003). O crescimento de um novo vaso e a sua 9
maturação são processos altamente complexos e coordenados, e requerem a ativação de 10
uma série de receptores por numerosos ligantes (YANCOPOULOS, 1992; FERRARA, 11
1999), mas o sinal de VEGF parece representar um passo limitante na fisiologia 12
angiogênica. VEGF também é importante na angiogênese patológica, como aquela 13
associada ao crescimento tumoral (FERRARA & DAVIS-SMYTH, 1997). Outro papel 14
importante do VEGF é o de fator de sobrevida para as células endoteliais. Em estudo in 15
vitro, VEGF inibiu a apoptose induzindo a expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2 16
(GERBER et al., 1998). In vivo, a inibição de VEGF resultou em extensa apoptose com 17
mudanças nos vasos dos neonatos, mas não dos camundongos adultos (GERBER et al, 18
1999). Além disso, uma dependência marcante de VEGF pelas células endoteliais 19
neoformadas, mas não nos vasos estabilizados dos tumores tem sido identificada (YUAN 20
et al., 1996) A cobertura dos pericitos tem sido proposta como uma das chaves de eventos 21
que resultam na perda da dependência de VEGF (BENJAMIN et al., 1998). A importância 22
clínica do VEGF é enfatizada pelo fato que a inibição de VEGF inibe a angiogênese e o 23
crescimento tumoral em modelos in vivo (KIM et al., 1993; SALEH et al., 1996). 24
15
Em tecidos normais de adultos a expressão de VEGF foi encontrada no cérebro, 1
rins, pâncreas, glândulas salivares, músculo, adipócitos, pulmão e vasos de grande calibre 2
(MAHARAJ et al., 2006). Os autores concluíram que a baixa expressão de VEGF nos 3
tecidos normais favorecia a sobrevivência dos vasos. 4
Nos tecidos neoplásicos, o aumento da expressão de VEGF tem sido correlacionado 5
com o aumento da densidade microvascular (DMV), influenciando o aparecimento de 6
metástases e um pior prognóstico em carcinoma gástrico (MAEDA et al., 1996; 1999), 7
carcinoma de cólon (TAKAHASHI et al., 1997), carcinoma de pulmão que não os de 8
pequenas células (FONTANINI et al., 1998), carcinoma de mama linfonodo negativo 9
(LINDERHOLM et al., 1998) e carcinoma epidermóide oral (MAEDA et al., 1998; SHIH 10
et al., 2000). Mas, em outros estudos têm sido observada ausência de correlação entre 11
VEGF e MVD como no carcinoma epidermóide oral (MORIYAMA et al., 1997). 12
Poucos trabalhos estudaram a expressão de VEGF em neoplasias de glândulas 13
salivares, e os resultados ainda são bastante controversos. DOI et al. (1999) estudaram a 14
expressão de p53, VEGF e DMV (CD34) em 31 tumores de glândulas salivares, sendo 11 15
CAC, 10 CME, sete carcinomas de células acinares (CCA) e três Carcinomas 16
Epidermóides (CE). A DMV foi significantemente maior no CME e CE que no CAC e 17
CCA. A expressão de VEGF e DMV não mostrou associação significativa com a presença 18
ou ausência de metástases, embora a expressão de VEGF tenha sido mais alta nos casos 19
metastatizantes. Contudo, o pequeno número de casos não permitiu uma conclusão 20
definitiva, e esses resultados podem refletir o comportamento biológico de cada tipo 21
histológico. A expressão de p53 foi significativamente associada à presença de metástases. 22
Uma maior expressão de p53, VEGF e DMV estava relacionada à redução na sobrevida. 23
Diante disso, estes resultados indicam que a expressão de p53 correlacionado com VEGF e 24
16
DMV, pode ser um fator de prognóstico nos pacientes com carcinoma de glândula salivar, 1
independente do tipo histológico 2
Li et al. (2001) avaliaram a expressão imuno-histoquímica de VEGF e a DMV em 3
55 pacientes com CAC. Alta expressão de VEGF estava associada ao sítio e estádio 4
clínico, mas não com a recidiva, metástases à distância, metástases regionais, gradação 5
histológica e sobrevida. Não foi observada uma associação significativa entre DMV e estas 6
variáveis. A média de DMV foi significantemente maior nos casos com alta expressão de 7
VEGF, que em casos com baixa expressão. Do estudo, concluiu-se que para o CAC a 8
DMV e VEGF podem ser utilizados como fatores prognósticos. 9
Lim et al. (2003) realizaram estudos imuno-histoquímicos para verificar a 10
expressão de VEGF, p53 e Ki-67, em 45 carcinomas de glândulas salivares, consistindo de 11
15 CAC, 14 CME, seis adenocarcinoma, quatro APBG, quatro carcinoma ex AP, e dois 12
carcinomas do ducto salivar. Uma positividade moderada para VEGF foi observada nas 13
células do endotélio vascular e fraca marcação no músculo, ácinos serosos, células ductais, 14
macrófagos e polimorfonucleares. A expressão de VEGF foi baixa em 14 casos (31,1%), 15
moderada em 15 casos (33,3%) e alta em 16 casos (35,6%). Uma associação significativa 16
foi observada entre a marcação de VEGF e idade, tamanho do tumor, metástases para 17
linfonodo, estádio clínico, invasão perineural, invasão vascular, recidiva e sobrevida, 18
enquanto nenhuma associação foi encontrada entre sexo e localização do tumor. Os autores 19
concluíram que VEGF é um importante fator prognóstico para carcinomas de glândulas 20
salivares. 21
Yu et al. (2003) realizaram estudo com objetivo de discernir se DMV e expressão 22
de VEGF poderiam ser indicadores de prognóstico para metástases e sobrevida de 23
pacientes com CAC após cirurgia radical. Foi realizada análise imuno-histoquímica, 24
utilizando anticorpos monoclonais anti-CD34 e anti-VEGF em 31 CAC primários, com 25
17
seguimento mínimo de 60 meses. Os valores de DMV foram estatisticamente maiores nos 1
grupos óbito, metástases, recidiva, tumores sólidos e estádio avançado. Associação 2
significativa também pode ser observada entre valores de DMV e a presença de metástases 3
à distância nestas lesões. A análise univariada mostrou que os subtipos histológicos de 4
CAC, o estadiamento clínico e a DMV estavam associados de forma significativa à pior 5
sobrevida dos pacientes. Apenas a DMV mostrou-se como fator de prognóstico 6
independente na análise multivariada. 7
Zhang et al. (2005) avaliaram a expressão de fator nuclear κB, iNOS, VEGF e 8
DMV (utilizando CD34) em 80 CAC. Os autores observaram expressão citoplasmática de 9
VEGF nas células neoplásicas. A marcação de VEGF foi baixa em 19 casos (23,8%), 10
moderada em 24 casos (30,0%), e alta em 37 casos (46,2%), e associando-se de forma 11
estatisticamente significativa com tamanho, estádio clínico, invasão vascular, recidiva, e 12
metástases à distância. A expressão de VEGF foi maior no CAC que nas glândulas 13
salivares normais e positivamente associada à DMV. Esses resultados mostraram que 14
VEGF no CAC pode ter um importante papel na estimulação da proliferação das células 15
endoteliais. Além disso, na análise univariada os fatores associados a um pior prognóstico 16
foram tipo histológico, invasão perineural, invasão vascular, metástases, expressão de fator 17
nuclear κB, iNOS ,VEGF e CD34. Na análise multivariada fator nuclear κB, iNOS ,VEGF, 18
CD34, subtipos histológicos e invasão perineural foram marcadores independentes de 19
prognóstico para sobrevida. Esses resultados sugerem que esses marcadores podem ter um 20
papel importante no prognóstico do CAC. 21
Swelan et al. (2005) para melhor entender a pobre vascularização do AP, estudaram 22
por imuno-histoquímica a expressão qualitativa de marcadores endoteliais de angiogênese 23
(VEGF, CD31, Flk-1 e Flt-1) e de condições de hipóxia (Lactato desidrogenase –LDH e 24
HIF-1α) em 20 amostras de AP e sete glândulas submandibulares normais. Nas glândulas 25
18
salivares normais foi observada marcação de VEGF nos ácinos serosos e nos ductos 1
epiteliais. A marcação de VEGF ocorreu nas formações ductais e áreas sólidas, sendo 2
nestas mais fortes que nos ninhos tumorais. Nas áreas mixóides as células mioepiteliais 3
também marcaram fortemente. Não ocorreu marcação de CD31 nas áreas sólidas e 4
condróides, indicando à pobre vascularização do AP. A presença de VEGF nas células do 5
AP mostra que a pobre vascularização desse tumor leva a uma condição de hipóxia que 6
induz a expressão de VEGF. Além disso, VEGF pode estar associado à proliferação e 7
diferenciação tubular no AP. 8
Shi et al. (2007) estudaram a expressão de caveolin-1, VEGF e CD34 em 75 9
pacientes com CME em função de características clínico-patológicas. A expressão de 10
VEGF foi observada nas células intermediárias e epidermóides, nas mucosas não foi 11
observada marcação. Imunomarcação de VEGF foi observada em 54,7% dos casos, com 12
uma DMV variando de 9 a 56 vasos (24,45 ± 10.72). Foi observada correlação positiva da 13
expressão de VEGF e DMV, suportando o papel que o VEGF também é um fator de 14
crescimento para células do endotélio vascular no CME. Maior DMV foi notada nos casos 15
com estádio clínico avançado, alto grau de malignidade, e localizados em glândulas 16
menores, associação que se deu de forma significativa. Ademais, a presença de 17
sintomatologia clínica, sexo masculino, estádio clínico avançado, alto grau e aumento da 18
DMV associaram-se significantemente com menor sobrevida. Pela análise multivariada foi 19
observado que estádio clínico, grau histológico e DMV constituíram-se fatores 20
prognósticos independentes. 21
22
23
24
25
19
2.2.2. Fator Endotelial de Crescimento Vascular Derivado de Plaquetas / 1
Timidina Fosforilase 2
Em 1987, uma nova proteína angiogênica foi isolada de plaquetas por Miyazono et 3
al., a qual foi denominada fator de crescimento endotelial derivado de plaquetas (PDEGF). 4
É considerado quimiotático para células endoteliais, não mitogênico in vitro e angiogênico 5
in vivo (ISHIKAWA et al., 1989; TOI et al., 2005). A transfecção de PDEGF em 6
fibroblastos transformados de camundongos resultou em aumento da vascularização 7
(ISHIKAWA et al., 1989). A atividade angiogênica de PDEGF ocorre por estimulação da 8
migração de células endoteliais, não atuando como um fator de crescimento de células 9
endoteliais por aumento da proliferação (MOGHADDAM et al., 1995). No ambiente 10
tumoral a expressão de PDEGF é induzida pelo estresse causado por fatores como hipóxia, 11
e atua impedindo a apoptose da célula, auxiliando na sua sobrevivência pelo estímulo do 12
metabolismo do nucleosídeo e angiogênese (SÁNCHEZ-ELSNER et al., 2002; TOI et al., 13
2005). 14
Tsujitani et al. (2004) discute que o efeito do PDEGF na angiogênese pode não ser 15
direto, mas pode ser via outro fator de angiogênese ou facilitando a invasão endotelial pela 16
sua atividade enzimática. Esses autores observaram uma alta expressão de VEGF nas 17
células tumorais associadas à alta expressão de PDEGF nas células invasivas e a alta 18
DMV. 19
Em 1992, Usuki et al. verificaram que o PDEGF compartilhava uma significante 20
identidade com a timidina fosforilase (TP) da Escherichia coli. Na década de 70, TP foi 21
purificada da Escherichia coli e da Salmonella typhimurium (MIYAZONO et al., 1987; 22
MIYAZONO et al., 1991). A análise estrutural da TP revelou um homodímero de 110 kDa 23
em mamíferos e 90 kDa na Escherichia coli (MIYAZONO et al., 1987, MIYAZONO et 24
20
al., 1991). Posteriormente, a seqüência de aminoácidos de todos os quatro fragmentos de 1
peptídeos purificados da TP humana foi detectada como idêntica à seqüência do PDEGF. 2
(SUMIZAWA et al., 1993). Adicionalmente, foi descrita a atividade angiogênica do 3
metabólito da timidina 2-deoxi-D-ribose que atua estimulando por quimiotaxia a migração 4
das células endoteliais (HARAGUCHI et al., 1994). 5
A expressão de PDEGF é altamente regulada por citocinas liberadas durante a 6
inflamação, angiogênese e hipóxia em tecidos neoplásicos malignos ou desordens de 7
inflamação crônica. Dentre essas citocinas podemos citar o TNF-α e Interleucina-1, 8
VEGF, Fator Indutor de Hipóxia-2α (HIF-2α) e Interferon-δ (FUJIMOTO et al., 1998, 9
AKIYAMA et al., 2004). 10
Fox et al. (1995) encontraram imunoreatividade de PDEGF no núcleo e/ou 11
citoplasma do endotélio de algumas regiões placentárias, no ovário, glândula salivar, e 12
cérebro; além de macrófagos e células de Kupffer. Contudo, nenhuma marcação foi 13
observada no epitélio gastrointestinal, nas células musculares, glândula adrenal, pulmão e 14
testículo. Nas glândulas salivares a expressão de PDEGF foi evidenciada nos ácinos 15
serosos, epitélio ductal e endotélio. Além disso, a marcação imuno-histoquímica de 16
PDEGF tem sido observada no núcleo e citoplasma de carcinomas gástricos, de colo 17
uterino, mama, cólon, e pulmão tipo “não de pequenas células” (FOX et al., 1995; 18
TAKEBAYASHI et al., 1996; KOUKOURAKIS et al., 1998; TOKUNAGA et al., 2002; 19
RYU et al., 2003). Esses diferentes padrões de marcação celular podem evidenciar os 20
vários mecanismos de atuação do PDEGF/TP: no núcleo pode indicar a sua atuação como 21
reguladora da replicação celular, e no citoplasma, a regulação e interação com enzimas 22
localizadas nesse compartimento celular (FOX et al., 1995). 23
21
A expressão de PDEGF é estimulada após tratamentos radioterápicos e 1
quimioterápicos, mostrando sua função enzimática na recuperação das células do estresse 2
causado por essas terapias (RYU et al., 2003; TOI et al., 2005). 3
O valor prognóstico de PDEGF é reconhecido no câncer de mama (FOX et al., 4
1996). Uma correlação positiva entre alta expressão de PDEGF e DMV tem sido associada 5
a atividade angiogênica do tumor e pior sobrevida em carcinoma de colo uterino, 6
carcinoma de pulmão “não de pequenas células”, carcinoma cervical e carcinoma gástrico 7
(KOUKOURAKIS et al., 1998; UEDA et al., 1999; FUJIWAKI et al., 2000; TSUJITANI 8
et al., 2004). Por outro lado, tem sido observada a ausência de associação da expressão de 9
PDEGF e DMV, embora seja identificado como fator prognóstico independente, sugerindo 10
que a expressão de PDEGF atua na progressão tumoral independente da angiogênese 11
(KITAZONO et al., 1998). Outros estudos não têm verificado associação de PDEGF com 12
prognóstico (YAMAMOTO et al., 1998; MORINAGA et al., 2003). 13
Em carcinomas de pulmão, mama e gástrico, a atividade de PDEGF nos tumores 14
primários tem sido associada à presença de metástases à distância (NISHIDA et al., 1996; 15
TAKEBAYASHI et al., 1996). 16
Em 1995, Moghaddam et al. observaram a expressão de PDEGF por imuno-17
histoquímica nos carcinomas ductais invasivos de mama e em mama normal. Na mama 18
normal a marcação foi mais fraca e ocorreu no epitélio ductal e as células mioepiteliais 19
foram negativas. Nos carcinomas ductais invasivos a positividade foi observada nas células 20
tumorais, nas áreas inflamatórias, no endotélio vascular e em algumas células do estroma, 21
sendo usualmente maior que nas células normais. Não foi observada associação da 22
expressão de PDEGF e DMV. Kitazono et al. (1998) sugeriram que essa maior expressão 23
de PDEGF no carcinoma de mama estivesse relacionada a resistência conferida pelo 24
22
PDEGF a apoptose induzida por hipóxia, permitindo um crescimento in vivo sem aumento 1
na DMV. 2
Konno et al. (2003) verificaram a expressão de PDEGF em 116 pacientes com 3
carcinoma gástrico e encontraram uma associação significativa de alta marcação de 4
PDEGF com invasão, metástases para linfonodo, estádio clínico, recidiva e metástases à 5
distância. Esses achados sugerem que PDEGF está associado à incidência de metástases 6
nos carcinomas gástricos. 7
Morinaga et al. (2003) estudaram por ELISA (ensaio imunoenzimático, do inglês 8
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) a expressão de PDEGF nos carcinomas 9
hepatocelulares, no fígado adjacente ao tumor e em fígado normal. A proteína PDEGF foi 10
detectada tanto no tecido normal quanto no carcinoma hepatocelular, mas sua expressão foi 11
maior no carcinoma hepatocelular e no fígado adjacente ao tumor, que no fígado normal. 12
As concentrações de PDEGF foram maiores nos carcinomas menos diferenciados com 13
maior DMV, mas não estava associada ao prognóstico. 14
Ryu et al. (2003) avaliaram a expressão de PDEGF e VEGF em pacientes com 15
adenocarcinoma de colo uterino com radioterapia prévia, e observaram marcações de 16
VEGF e PDEGF no citoplasma e/ou núcleo das células tumorais. A positividade para 17
VEGF foi encontrada em 54,7% dos casos, para PDEGF em 44,6% dos casos e 76,6% dos 18
casos expressavam ambas as marcações. Não foi observada associação de VEGF e PDEGF 19
com idade, grau de malignidade, subtipo histológico. Contudo, a expressão de PDEGF foi 20
maior nos casos estádio II e II que nos III e IV. Assim, foi identificado como fator 21
prognóstico independente associado à melhor sobrevida. Não foi observada correlação da 22
expressão de VEGF e PDEGF. Esses resultados sugerem que a alta expressão de PDEGF 23
proporcione um incremento na oxigenação do tecido favorecendo o efeito da radioterapia e 24
melhora na sobrevida dos pacientes. 25
23
2.3. DENSIDADE MICROVASCULAR (DMV) 1
A natureza vascular dos tumores foi reconhecida há muitos séculos quando Fallopio 2
em 1600 notou a presença de vasos dilatados e Hunter em 1828 identificou o aumento do 3
número de vasos nos tumores. Contudo, o estudo sistemático de Goldman (1907) e 4
subsequentemente de Lewis (1927), Ide (1939) e Algire (1945) revelaram a natureza 5
seqüencial da vascularização do tumor. 6
Entretanto, a quantificação histológica da angiogênese tumoral humana teve início 7
em 1991 quando Noel Weidner e colegas estudaram por imuno-histoquímica a expressão 8
do fator VIII nos vasos sanguíneos e contaram o número de microvasos na área mais 9
vascularizada do tumor (hot spots), determinada como DMV. Weidner et al. (1991) 10
demonstraram associação das metástases para linfonodo e a DMV nos carcinomas de 11
mama, e posteriormente (WEIDNER et al., 1992) mostraram que a DMV foi um fator 12
prognóstico independente para sobrevida. Subsequentemente, uma avalanche de estudos 13
foi realizada utilizando uma diversidade de anticorpos marcadores de endotélio e 14
metodologias de contagem variadas para diferentes tipos tumorais, cujos resultados foram 15
parcialmente concordantes. 16
Não obstante, depois desses estudos iniciais utilizando imuno-histoquímica e 17
confirmando que a DMV era um significante fator de prognóstico em carcinoma de mama, 18
ovário e glândula salivar (WEIDNER et al., 1991; 1992; OBEMAIR et al., 1999; LIM et 19
al., 2003), e indicador de metástases em carcinoma de mama, carcinoma gástrico 20
(WEIDNER et al., 1991; MAEDA et al., 1995; VERMEULEN et al., 2002) apareceram 21
estudos contradizendo esses achados, inclusive em carcinomas de mama, (FOX & 22
HARRIS, 2004). 23
Trabalhos como o de Moriyama et al. (1997) em carcinoma epidermóide de boca 24
encontraram maior DMV nos casos não metastáticos em relação aos metastatizantes. Essa 25
24
variação nos achados tem sido atribuída às variações na metodologia de seleção e tamanho 1
das amostras, tipo de anticorpo utilizado, diversidade de marcadores endoteliais (CD31, 2
CD34, Fator VIII), técnicas de identificação antigênica, metodologias de quantificação de 3
vaso, e às diferenças biológicas entre os tumores estudados (HASAN et al., 2002; 4
VERMEULEN et al., 2002). 5
Dentre os marcadores de endotélio, o Fator VIII identifica apenas uma pequena 6
proporção de capilares, e também identifica vasos linfáticos. O CD34 é atualmente 7
considerado por Fox & Harris (2004) como um ótimo marcador para quantificação da 8
angiogênese em tumores, superando o CD31 como marcador endotelial de escolha para 9
cânceres invasivos (VERMEULEN et al., 2002). Contudo, tem sido relatada a expressão de 10
CD34 no estroma de células da mama e de neoplasias de glândulas salivares (SOMA et al., 11
2001), bem como marcação de vasos linfáticos (HASAN et al., 2002). As desvantagens 12
associadas à marcação de CD31 incluem marcação das células inflamatórias, que podem 13
ser facilmente distinguidas das células endoteliais pelas características morfológicas. 14
Mais recentemente, têm sido introduzidos nesta discussão marcadores considerados 15
específicos para endotélio em proliferação, o CD105, apresentando fraca marcação para 16
vasos linfáticos e vasos sanguíneos normais. Em estudo com 106 pacientes com carcinoma 17
de mama, a MVD foi verificada pela marcação de CD34 e CD105, apenas o último pode 18
ser associado a pior sobrevida (KUMAR et al., 1999). 19
20
2.3.1. CD34 21
O CD34 (CD- cluster of differentiation do inglês: grupos de diferenciação) é um 22
antígeno protéico na transmembrana de 120 kD expresso nas células progenitoras 23
hematopoiéticas, cujo gene codificador foi mapeado no cromossomo 1q (NIKOLLOF, 24
1991; VAN de RIJN and ROUSE, 1994). 25
25
É encontrado na superfície de células endoteliais, especialmente durante a 1
angiogênese (KUZU et al., 1992), cuja expressão pode ser observada tanto em tecido 2
normal quanto neoplásico. Este marcador também pode ser evidenciado em outras células 3
como as dendríticas da derme, células ao redor da estrutura vascular, nervos, músculos, e 4
anexos da pele normal (NIKOLOFF, 1991; LINDENMAYER & MIETTINEN 1995). 5
Acredita-se que o CD34 tenha um papel de suporte na maturação ou na proliferação 6
das células adjacentes aos vasos (WEISS & NICKOLOFF, 1993). 7
Sua presença nas lesões malignas tem sido investigada na tentativa de auxiliar na 8
formulação do prognóstico destas lesões. Vários autores têm encontrado um aumento da 9
DMV obtida por CD34 associada a um pior prognóstico em carcinoma de ovário, 10
carcinoma de esôfago, carcinoma epitelial de glândulas salivares (DOI et al., 1999; 11
OBEMAIR et al., 1999; ELPEK et al., 2001; ZHANG et al., 2005 ) e a ocorrência de 12
metástases em carcinoma de esôfago, carcinoma epitelial de glândulas salivares (HANSEN 13
et al., 2000; ELPEK et al., 2001, YU et al., 2003; ZHANG et al., 2005). 14
Por outro lado, a expressão da DMV pelo CD34 mostra resultados conflitantes, 15
como nos carcinomas gástricos, onde Maeda et al. (1995) observaram que a alta DMV 16
estava associada apenas a metástases para linfonodos. Tanigawa et al. (1996) relataram 17
que alta DMV estava associada a metástases do carcinoma gástrico para fígado, mas não 18
estava associada a metástases para linfonodo. 19
Gleich et al. (1997) em pacientes com carcinoma epidermóide (CE) de boca T2-T4, 20
não tem encontrado a DMV como preditor de metástase tumoral ou sobrevida. Diante 21
desses achados os autores sugeriram que o crescimento tumoral do CE é independente de 22
angiogênese, ou que a angiogênese é mais um dos muitos fatores que regulam o 23
crescimento tumoral. 24
26
Na literatura, a maioria dos trabalhos que verificaram a associação de DMV com 1
prognóstico e metástases em neoplasias de glândulas salivares utilizou o CD34 como 2
marcador vascular (DOI et al., 1999; YU et al., 2003; ZHANG et al., 2005; SHI et al, 3
2007). Nesses tumores, Yu et al. (2003) e Zhang et al. (2005) encontraram a DMV 4
associada a metástases e pior prognóstico, mas Doi et al. (1999) e Shi et al. (2007) 5
encontraram associação da DMV apenas com pior prognóstico. 6
A marcação de CD34 em glândulas salivares foi verificada por Nakayama et al. 7
(1999) que estudaram 21 AP realizando estudo imuno-histoquímico com CD31 e CD34 8
para distinguir os vasos sanguíneos das células intersticiais positivas. Foi encontrada 9
positividade de CD31 e CD34 nas células endoteliais, mas CD34 foi positivo nas células 10
estromais ao redor dos ninhos tumorais. Os autores consideram o CD31 um melhor 11
marcador para obter a DMV, devido a sua maior especificidade em relação ao CD34. 12
Devido à forte marcação e a facilidade do uso, o CD34 tem sido considerado um 13
ótimo marcador de endotélio vascular, que sobrepuja o CD31 e o fator VIII 14
(VERMEULEN et al., 2002). 15
16
2.3.2. CD105 (Endoglina) 17
CD105, também conhecida como endoglina, é uma glicoproteína de membrana, 18
com peso molecular de 180kDa, que interage com receptores de vários membros da família 19
do fator transformador de crescimento (TGF-β) (GOUGOS & LETARTE, 1988; LI et al., 20
2001). Foi inicialmente descrita em 1988, como uma glicoproteína homodimérica, 21
associada à leucemia, por meio de anticorpos monoclonais específicos (GOUGOS & 22
LETARTE, 1988). No 5º Workshop Internacional de Antígenos de Diferenciação da 23
Leucemia Humana (LETARTE et al., 1995), a endoglina foi reconhecida como o grupo de 24
diferenciação (CD- do inglês cluster of diferentiation) número 105. 25
27
O gene codificador para endoglina encontra-se localizado no cromossomo humano 1
9q34 e foi identificado como gene alvo para uma doença autossômica dominante 2
conhecida como telangiectasia hemorrágica tipo I. Sua identificação foi realizada 3
utilizando hibridização in situ por imunofluorescência e sua região decodificadora contém 4
14 exons (FERNÁNDEZ-RUIZ et al., 1993). Duas isoformas diferentes, a L e S, foram 5
encontradas com capacidade de se ligar ao TGF-β. A isoforma L-CD105 consiste em 633 6
aminoácidos, enquanto a S-CD-105 tem 600 aminoácidos. Ambas as formas foram 7
detectadas utilizando-se o PCR na célula endotelial, nas células promonocíticas HL-60 e 8
U-937, e na placenta. Quando se realizou a técnica de Western-Blot a isoforma L-CD105 9
foi à forma predominante na célula endotelial (LI et al., 2000). 10
CD105 atua suprimindo o sinal do TGF-β1 e TGF-β3, bloqueando seus receptores, 11
e modulando sua resposta. O TGF-β é uma citocina que regula várias funções celulares 12
incluindo proliferação, diferenciação, migração, síntese da matriz extracelular e 13
hematopoiese (MASSAGUÉ, 1987). Também está envolvido na vasculogênese, 14
cicatrização e angiogênese (ROBERTS et al., 1986). A hipóxia é um potente estimulador 15
para expressão do gene CD105 nas células endoteliais e também potencia a combinação de 16
CD105 com receptores de TGF-β1 (DUFF et al, 2003). Acredita-se que o desenvolvimento 17
da resposta angiogênica também possa depender de um balanço entre os níveis de ativação 18
de TGF-β e a expressão de CD105 (LI et al., 2000). 19
A seqüência aminoácida do CD105 contém o tripeptídeo ácido arginina-glicina-20
aspartato (RGD) localizado na região exposta do domínio extracelular. O polipeptídeo 21
RGD é a chave para a estrutura de reconhecimento encontrada em proteínas como a 22
fibronectina, vitronectina, fator de Von Willebrand, colágeno tipo I e fibrinogênio sendo 23
reconhecido pelas integrinas de superfície celular. Por isso tem sido proposto o papel de 24
28
CD105 como ligante para arginina e/ou outros receptores RGD (GOUGOS & LETARTE, 1
1990). 2
Endoteliócitos vasculares e os sinciotrofoblastos da placenta são as células que 3
mais expressam CD105. Em outras células incluindo células da musculatura estriada, 4
fibroblastos, macrófagos, células estromais, células leucêmicas pré-B ou de origem 5
mielomonocítica e precursores eritróides, a marcação é fraca (GOUGOS & LETARTE, 6
1988; FONSATTI et al., 2001; DUFF et al., 2003). 7
Investigações realizadas em tumores sólidos de diferentes tipos histológicos 8
utilizando anticorpos monoclonais anti-CD105 mostraram que a expressão antigênica foi 9
identificada quase exclusivamente no endotélio venoso e arterial dos vasos peri e 10
intratumorais (BODEY et al., 1998; KUMAR et al., 1999; FONSATTI et al., 2001). 11
Ocasionalmente, as marcações se deram fracamente no citoplasma das células do sarcoma 12
de diferentes subtipos, carcinomas de ovário, carcinomas de mama, componentes do 13
estroma de carcinomas endometrióides ovarianos (FONSATTI et al., 2001). 14
Além disso, vale ressaltar que Burrows et al. (1995) encontraram altos níveis de 15
expressão de CD105 nas células endoteliais da veia humana umbilical (HUVEC – do 16
inglês human umbilical vein endothelial cells) com níveis de proteína, RNA e DNA 17
consistentes com ativação e proliferação. Em adição a essa observação, foram encontrados 18
altos níveis de expressão de CD105 em HUVEC em proliferação em cultura (FONSATTI 19
et al., 2000), bem como associados aos marcadores de proliferação celular como Ki-67 em 20
tumores endoteliais (MILLER et al., 1999). Adicionalmente, foi demonstrado que a 21
expressão de CD31 está inversamente correlacionada a HUVEC em proliferação 22
(FONSATTI et al., 2000). Ademais, foi observada forte intensidade de marcação para 23
CD105 no endotélio vascular de tecidos normais com atividade angiogênica ativada, como 24
nos processos de regeneração e inflamação (BODEY et al., 1998; KUMAR et al., 1999). 25
29
As pesquisas têm mostrado uma imunomarcação forte para CD105 nos vasos ao 1
redor do tumor, e nenhuma marcação tem sido detectada nos grandes vasos ou vasos 2
sanguíneos dos tecidos normais (BODEY et al., 1998; KUMAR et al., 1999). Por isso, 3
alguns estudos têm sugerido que o CD105 é um marcador mais específico e sensitivo para 4
vasos neoformados em relação aos outros anticorpos pan-endoteliais (CD31, CD34 e fator 5
VIII) nos carcinomas de cervix, cólon, endométrio e mama (BODEY et al., 1998; 6
BREWER et al., 2000; SAAD et al., 2003). 7
Minhajat et al. (2006) compararam a expressão de CD31 e CD105 em carcinomas 8
de cólon. Os autores evidenciaram que CD31, estava expresso universalmente nos 9
pequenos vasos e capilares, e CD105 expressou marcação mais intensa nas células 10
endoteliais do carcinoma em relação ao adenoma e não foi encontrado no tecido normal e 11
nos vasos linfáticos. Esses resultados confirmam que CD105 é expresso apenas nos novos 12
vasos do carcinoma de cólon. 13
Alta densidade microvascular obtida pela expressão de CD105 tem sido relatada 14
como indicadora de prognóstico independente em uma série de neoplasias, sendo 15
relacionada com uma redução da sobrevida (SRIVASTAVA et al., 1988; TANIGAWA et 16
al., 1997; KUMAR et al., 1999). Entretanto, outros autores não conseguiram encontrar tal 17
relação (GLEICH et al, 1997; TAE et al, 2000; GRUDZINSKI et al., 2006). Alguns 18
trabalhos têm encontrado associação da expressão de CD105 e a ocorrência de metástases 19
em carcinoma de hipofaringe, carcinomas de mama, carcinoma de endométrio (SAAD et 20
al., 2003; DALES et al., 2004; CHIEN et al., 2006) 21
Kumar et al. (1999) estudaram a expressão de CD34 e CD105 em 106 carcinomas 22
de mama por meio de ensaio imuno-histoquímico. A marcação de CD105 foi forte nas 23
células endoteliais dos vasos do estroma tumoral, mas não foi detectada ou apenas fraca 24
marcação foi identificada nos vasos da maioria dos tecidos normais. Não foi possível 25
30
encontrar correlação significativa entre os valores de DMV obtidos a partir da expressão de 1
CD34 e CD105. A expressão de CD105 teve uma correlação estatisticamente significativa 2
com sobrevida e tempo livre de doença, mas com o CD34 isto não foi observado. Análise 3
multivariada confirmou que valores de DMV usando CD105 o identificaram como 4
marcador de prognóstico independente. Esses resultados mostraram que o uso de CD105 5
deve reduzir a incidência de marcação falso-positiva em vasos sanguíneos induzidos pelo 6
tumor, diferenciando-os daqueles localizados próximos à massa tumoral e que por serem 7
maduros podem não estar associados ao crescimento tumoral. Os autores chamam a 8
atenção para o fato de que seria importante na determinação da angiogênese tumoral 9
considerar a distinção entre a neovascularização tumoral e a existência de vasos pré-10
existentes. A investigação desta diferença deveria ser relevante para o estabelecimento da 11
potencial influência da vascularização no potencial metastático e no prognóstico dos 12
tumores. 13
Atualmente, várias evidências suportam a idéias que o CD105 está envolvido na 14
angiogênese e representa um poderoso marcador de neovascularização (FONSATTI et al., 15
2001). 16
Li et al. (2000) relataram um aumento do nível de CD105 em amostra de plasma de 17
pacientes com câncer de mama quando comparado com um grupo controle, sugerindo que 18
o CD105 também pode ser utilizado para identificar pacientes com alto risco de metástase 19
e recidivas. 20
Schimming & Marmé (2002), estudaram 51 casos de carcinoma epidermóide de 21
boca, e evidenciaram a expressão aumentada da endoglina no endotélio vascular dos 22
tecidos tumorais, quando comparados com a mucosa normal. A expressão de CD 105 23
também foi maior nos casos com estádio III, sugerindo que a endoglina tenha um 24
importante papel na progressão do carcinoma epidermóide de boca. 25
31
Chien et al. (2006) estudaram a marcação de VEGF e CD105 em 73 casos de 1
carcinoma epidermóide de hipofaringe. Foi encontrada uma alta marcação de VEGF no 2
tecido tumoral que se correlacionou de forma significativa com os estádios mais avançados 3
da doença. A imunomarcação de CD105 ocorreu apenas nos vasos do tumor e mostrou 4
significativa correlação com metástases para linfonodos e os estádios mais avançados da 5
doença. Além disso, foi observada uma correlação positiva da expressão de VEGF e 6
CD105. Diante disso, os autores concluíram que um maior número de vasos neoformados 7
no tumor, permite que esse seja mais agressivo, e que CD105 pode ser um marcador 8
promissor na predição do prognóstico nesses tumores. 9
Recentemente, alguns autores têm observado uma associação entre a alta DMV 10
determinada pelo CD105 e menor sobrevida em câncer retal, e valor de CD105 como 11
marcador de prognóstico (ROMANI et al., 2006). 12
Nikiteas et al (2007) avaliaram a expressão imuno-histoquímica de VEGF e CD105 13
em 100 carcinomas gástricos. A expressão de VEGF foi forte no citoplasma de 36% dos 14
casos. Em todos os casos, a alta expressão de VEGF foi acompanhada de alta expressão de 15
CD105, mostrando-se também relacionados à menor sobrevida. Também foi observada 16
associação da expressão de VEGF e CD105 com a presença de metástases para linfonodo. 17
Acredita-se que VEGF e CD105 são dois valiosos indicadores de metástases. Esses 18
resultados mostram que VEGF pode induzir a neoformação de vasos sanguíneos e a 19
expressão de CD105 em células endoteliais proliferativas na vasculatura do tumor pode ser 20
um bom alvo para terapia anti-angiogênica. 21
22
. 23
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22
HIPÓTESE
33
3. HIPÓTESES 1
3.1. Os tumores malignos apresentariam diferenças na expressão de fatores de 2
crescimento endoteliais (VEGF e PDEGF) e de angiogênese (representados pela 3
quantificação de CD34 e CD105) relativamente aos benignos; entre os tumores malignos, 4
sua expressão seria diferenciada entre os grupos metastatizantes e não metastatizantes, 5
sendo a expressão mais acentuada associada às lesões metastatizantes. 6
7
3.2. A expressão dos fatores angiogênicos e dos marcadores de angiogênese estaria 8
associada ao potencial metastático como fatores preditivos independentes de outros fatores 9
clínico-patológicos classicamente reconhecidos nesta predição como estadiamento clínico 10
e o grau histológico de malignidade. 11
12
3.3. A superexpressão dos antígenos VEGF, PDEGF, CD34 e CD105 estaria 13
associada ao pior prognóstico expresso pela sobrevida dos pacientes investigados, de forma 14
independente de outros parâmetros clínico-patológicos, clássicos marcadores de 15
prognósticos, tais como localização, tamanho, estadiamento clínico e a gradação 16
histológica de malignidade. 17
18
3.4. Independentemente do tipo tumoral estudado, acreditamos encontrar uma 19
correlação positiva entre os índices de marcação de VEGF, PDEGF e os marcadores 20
vasculares CD34 e CD105. 21
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24
25
OBJETIVO
35
4. OBJETIVOS 1
2
4.1. OBJETIVO GERAL: Estudar a angiogênese tumoral e sua associação com 3
potencial metastático de neoplasias epiteliais primárias de glândula salivar. 4
5
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 6
4.2.1. Caracterizar os aspectos sócio-demográficos, clínico-patológicos e de 7
comportamento biológico da amostra de tumores de glândula salivar selecionada. 8
4.2.2. Caracterizar qualitativamente na amostra selecionada, a expressão 9
imuno-histoquímica de antígenos associados à angiogênese, a saber: CD34, CD105, Fator 10
Endotelial de Crescimento Vascular (VEGF), Fator de Crescimento Endotelial Derivado de 11
Plaquetas (PDEGF). 12
4.2.3. Avaliar a densidade microvascular da amostra de tumores selecionada 13
por meio de análise quantitativa da expressão imuno-histoquímica de antígenos marcadores 14
vasculares CD34 e CD105. 15
4.2.4. Avaliar, por meio de análise semi-quantitativa, a expressão tumoral 16
dos antígenos VEGF e PDEGF na amostra selecionada. 17
4.2.5. Investigar a existência de diferenças de índices de expressão dos 18
antígenos mencionadas no item 4.2.2 entre os grupos de tumores benignos e malignos, e 19
entre os tumores malignos primários metastatizantes e não metastatizantes como grupo e a 20
partir dos diferentes subtipos histológicos. 21
4.2.6. Investigar a existência de associações entre os índices de expressão 22
imuno-histoquímica dos antígenos descritos no item 4.2.2 e o potencial metastatizante dos 23
tumores malignos amostrados. 24
36
4.2.7. Verificar a associação entre a expressão imuno-histoquímica dos 1
antígenos descritos no item 4.2.2 e o prognóstico das lesões traduzido pela sobrevida dos 2
pacientes, procurando validá-los como fatores prognósticos independentes de outros 3
classicamente conhecidos (localização, estadiamento tumoral, dimensão). 4
4.2.8. Investigar a existência de correlação entre os índices de expressão 5
antigênica tumoral descritos nos itens 4.2.3. e 4.2.4. 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
37
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
MATERIAIS E MÉTODOS
38
5. MATERIAIS E MÉTODOS 1
Inicialmente, foram recuperados 732 casos de tumores epiteliais de glândulas 2
salivares diagnosticados e tratados no Instituto Nacional do Câncer do Ministério da 3
Saúde, localizado na cidade do Rio de Janeiro (RJ) (INCA)
1
, no período de 1998 a 2003 4
(KALLUF, 2006). Esta seleção foi realizada a partir da pesquisa ativa de prontuários de 5
pacientes portadores de tumores epiteliais de glândulas salivares, baseada nos dados 6
registrados nos arquivos da Divisão de Patologia e do Departamento de Cirurgia de Cabeça 7
e Pescoço daquela Instituição. Para o levantamento inicial foram considerados os seguintes 8
parâmetros: 1- a relação dos diferentes tipos histológicos dos tumores descritos pela 9
Organização Mundial de Saúde (OMS) (SEIFERT & SOBIN, 1991; BARNES et al., 10
2005); 2- termos descritores dos tipos de glândulas salivares maiores (parótidas, 11
submandibulares, sublinguais); e 3- termos descritores de topografias das glândulas 12
salivares menores (lábio, mucosa de bochecha, mucosa de sulco vestibular, trígono 13
retromolar, palato, palato mole, assoalho bucal, língua). Esta pesquisa ainda foi 14
complementada pela utilização dos códigos identificadores de doenças descritos no Código 15
Internacional de Doenças para Oncologia – CID ONCO 10 (FRITZ et al., 2000). 16
Todos os casos levantados foram reavaliados quanto ao diagnóstico 17
histopatológico, tendo como base os critérios estabelecidos pela OMS (BARNES et al., 18
2005) (TABELA 1). 19
1
Esta cooperação foi desenvolvida por intermédio dos Drs. Fernando Dias e Roberto Araújo Lima (Departamento de
Cirurgia de Cabeça e Pescoço, INCA-MS, Rio de Janeiro, RJ) e das Drs. Ana Lúcia Eisenberg Amaral e Marilena
Figueira do Nascimento (Divisão de Patologia do INCA-MS, Rio de Janeiro, RJ).
39
TABELA 1 - Tipos tumorais epiteliais de glândulas salivares reconhecidos pela Classificação dos 1
Tumores de Glândulas Salivares de origem epitelial da OMS (BARNES et al., 2005). 2
3
Neoplasias Benignas Neoplasias Malignas
Adenoma Pleomórfico Carcinoma Adenóide Cístico
Tumor de Warthin Carcinoma Mucoepidermóide
Adenoma de células basais Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau
Mioepitelioma Carcinoma de Células Acinares
Oncocitoma Adenocarcinoma de Células Basais
Adenoma canalicular Carcinoma epitelial Mioepitelial
Adenoma sebáceo Carcinoma mioepitelial
Linfadenoma Carcinoma de Células Claras
Sebáceo Adenocarcinoma SOE
Não Sebáceo Carcinoma epidermóide
Papiloma ductal Carcinoma de ductos salivares
Papiloma ductal invertido Carcinoma ex Adenoma Pleomórfico
Papiloma intra-ductal Carcinossarcoma
Sialadenoma papilífero Carcinoma de células pequenas
Cistoadenoma Carcinoma linfoepitelial
Carcinoma oncocítico
Adenoma pleomórfico metastatizante
Adenocarcinoma mucinoso
Cistoadenocarcinoma
Linfadenocarcinoma sebáceo
Sialoblastoma
Cistadenocarcinoma cribriforme de baixo grau
4
A partir deste levantamento (KALLUF, 2006), foram selecionados todos os casos 5
identificados como Adenoma Pleomórfico (AP), Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo 6
Grau de Malignidade (APBG), Carcinoma Adenóide Cístico (CAC) e Carcinoma 7
Mucoepidermóide (CME) de glândulas salivares, independentemente de sua localização. 8
Estes tipos tumorais foram selecionados em função de sua maior freqüência, e de seu 9
comportamento biológico, que favoreceram o estabelecimento de grupos definidos como 1. 10
Tumores Benignos representados pelos APs; 2. Tumores malignos de baixo grau, com 11
baixos índices metastáticos constituídos por APBGs; e 3. Tumores malignos de alto grau, 12
classicamente conhecidos por apresentarem maiores índices de metástases, a saber: CACs 13
e CMEs (SPEIGHT & BARRET, 2002; BARNES et al., 2005). 14
A partir desta amostra, foram registrados os seguintes dados: sócio-demográficos 15
dos pacientes, dados clínico-patológicos dos tumores (localização, dimensão do tumor, 16
tempo de evolução, sinais e sintomas, tipo histológico e estadiamento clínico), tipo de 17
40
tratamento, tempo de seguimento dos pacientes e dados de intercorrência na evolução pós-1
operatória (presença de recorrências, metástases regionais e distantes). 2
Para a seleção da amostra utilizada no desenvolvimento do presente trabalho, os 3
seguintes critérios foram adotados: 1. tumores primários que não receberam nenhum tipo 4
de tratamento; 2. comprovação de metástases regionais ou distantes a partir de exames de 5
imagem obtidos por radiografia (RX), tomografia computadorizada (TC), e ressonância 6
magnética (RM), e/ou exame cito e histopatológico revelador do comprometimento 7
linfonodal e/ou de outros órgãos; 3. presença de material em quantidade suficiente para a 8
realização das análises pretendidas; 4. presença de todos os dados sócio-demográficos e 9
clínico-patológicos mencionados anteriormente. O detalhamento dos fatores relacionados à 10
exclusão de casos na composição da presente amostra e a relação dos casos excluídos deste 11
estudo estão descritos no ANEXO 1 e 2. A TABELA 2 mostra a distribuição da amostra 12
incluída no presente estudo. 13
14
TABELA 2 - Distribuição dos casos selecionados classificadas segundo o tipo histológico e a presença 15
ou não de metástases após reavaliação histopatológica e preenchimento dos critérios de inclusão, 16
provenientes do Instituto Nacional do Câncer no período de 1998 a 2003. 17
18
Neoplasia
Primários não metastatizantes
(PNM)
Primários metastatizantes
(PM)
1
Total de casos
2
AP
30
−
30
APBG
17 2 19
CME
37 3 40
CAC
39 11 50
TOTAL
123 16 139
1 –
Considerou-se primários metastatizantes (PM) os tumores dos quais as metástases originaram. 19
2 –
O número total de casos compreende as lesões primárias benignas e malignas não metastatizantes (PNM), 20
e malignas metastatizantes (PM). 21
AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma 22
mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico 23
24
25
41
Após a seleção da amostra, realizamos a imunomarcação de VEGF, PDEGF, CD34 1
e CD105. Para isto utilizamos o método estreptavidina-biotina-peroxidase descrito por Hsu 2
e et al., 1981, adaptando a técnica às nossas condições laboratoriais de trabalho: incubação 3
com anticorpo primário por 19 horas em temperatura ambiente e resgate antigênico em 4
microondas com 1mM EDTA – NaOH, pH 8.0 (Nuclear, Diadema-SP, Brasil) (SOUZA et 5
al., 2003). 6
Todos os espécimes foram fixados em formol a 4% e incluídos em parafina. Cortes 7
histológicos de 3µm foram obtidos e montados em lâminas de vidro previamente 8
recobertas com organosilano (3-aminopropyltriethoxy-silano, Sigma Chemical Co., St. 9
Louis, MO, USA). Inicialmente, os cortes histológicos foram desparafinados por meio de 10
duas passagens de 20 minutos em xilol novo à temperatura ambiente, e hidratados em 11
concentrações decrescentes de etanol (100%, 90% e 70%) por 5 minutos cada. Em seguida, 12
os cortes histológicos foram submetidos à lavagem em água corrente por 10 minutos e 13
subseqüentemente em água destilada por cinco minutos. 14
Para a recuperação dos epitopos antigênicos, os cortes foram submersos em 500 ml 15
de tampão EDTA 1mM, pH 8.0, e submetidos a três ciclos de aquecimento por 5 minutos 16
cada em microondas em potência máxima. A cada ciclo, o volume evaporado foi restituído 17
com água bidestilada e tampão de forma alternada. Em seguida, a cuba foi colocada em 18
local fresco e arejado, à temperatura ambiente, para o devido resfriamento por 20 minutos. 19
Alcançado o equilíbrio térmico, os cortes foram lavados em água corrente por cinco 20
minutos e em seguida colocados em cubas de Couklin, onde receberam quatro banhos de 21
cinco minutos cada de água oxigenada (10 V), para bloqueio da atividade da peroxidase 22
endógena. Logo após, as lâminas novamente foram lavadas em água corrente e colocadas 23
em Tampão fosfato salina (PBS, do inglês, phosphate buffer saline, traduzido como 24
tampão fosfato salino) 0,1M pH 7.4, por 5 minutos. Em seguida, os cortes foram incubados 25
42
com solução bloqueadora de biotina endógena (DAKO, Co Carpenteria, CA, USA), 1
seguido da incubação com a solução de avidina, por um período de 20 minutos e lavados 2
com três banhos de PBS por 3 minutos cada. Logo após foi realizada a incubação dos 3
cortes histológicos com solução de biotina, por 20 minutos. Imediatamente, após os três 4
banhos de três minutos cada em PBS, as lâminas foram incubadas com anticorpos 5
primários, os quais foram mantidos em câmara escura por 19 h a temperatura ambiente. 6
Para bloquear a coloração de fundo devido a interações hidrofóbicas entre tecidos e 7
proteínas reagentes, acrescentou-se à solução PBS (utilizada como diluente do anticorpo 8
primário), 1% de soro albumina bovina (Sigma Chemical Co, USA) com 0,1% de azida 9
sódica (Sigma Chemical Co, USA). 10
Subseqüentemente à incubação com os anticorpos primários, os cortes histológicos 11
foram lavados em PBS (três banhos de três minutos), re-incubados com o anticorpo 12
secundário biotinilado (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) por 30 minutos, a 13
37
o
C. Em seguida, procedeu-se a lavagem em três banhos de três minutos cada em PBS e 14
os cortes foram incubados com complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (DAKO, Co 15
Carpenteria, CA, USA). 16
A revelação da reação foi feita utilizando 0,08g do cromógeno DAB (3’, 3’ 17
Diaminobenzidine Tetrahydrocloride). Os fragmentos teciduais foram contra-corados com 18
a solução de hematoxilina de Harris. Como controle negativo, substituiu-se o anticorpo 19
primário por solução de BSA a 1%, diluída em tampão PBS, pH 7,4. Os controles positivos 20
para as reações com diferentes anticorpos foram obtidos seguindo-se as orientações dos 21
fabricantes, a saber: CD34, tumor do estroma gastrointestinal; CD105, linfoma e amígdala; 22
PDEGF, amígdala; e VEGF, carcinoma ductal de mama. Vários casos apresentavam 23
fragmentos teciduais de glândulas salivares onde se observavam parênquima e estroma 24
43
com aspectos usuais de normalidade, cujos componentes também foram observados quanto 1
à expressão ou não dos antígenos pesquisados. 2
Na TABELA 3 estão distribuídos os dados referentes às procedências e condições 3
de trabalho que foram utilizadas nas reações. 4
TABELA 3 – Anticorpos primários e condições de trabalho utilizadas na técnica imuno-histoquímica. 5
6
Reagentes Clone Procedência Titulação de
Ac Primário
Fonte
CD105 SN6h DAKO
1
1:100 Camundongo
CD34 QBend10 DAKO
1
1:300 Camundongo
PDEGF P-GF. 44c Novocastra
2
1:400 Camundongo
VEGF VC-1 Santa Cruz
3
1:50 Coelho
1 – Dako Cyto Co, Carpenteria, CA, USA. 7
2 – Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, UK. 8
3 – Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA. 9
10
5.1. ANÁLISE QUALITATIVA DA EXPRESSÃO ANTIGÊNICA 11
TUMORAL 12
A análise qualitativa foi desenvolvida a partir da observação e descrição do padrão 13
de expressão dos diferentes antígenos pesquisados considerando o parênquima e o estroma 14
tumoral, a saber: 15
1. Parênquima tumoral: Este padrão de descrição foi adotado para os antígenos 16
PDEGF e VEGF. As marcações foram consideradas segundo a 17
compartimentalização celular (citoplasma, núcleo e membrana 18
citoplasmática), os tipos celulares marcados (células luminais, não luminais, 19
epidermóides, intermediárias, mucosas, claras), e a localização das 20
marcações nos diversos padrões arquiteturais dos tumores investigados. 21
2. Estroma tumoral: Esta topografia foi considerada particularmente para 22
avaliação de CD34 e CD105 nos vasos sanguíneos. Aí foram consideradas 23
as localizações dos vasos marcados assim caracterizadas: próximas aos 24
44
lóbulos tumorais, seja na periferia ou no seu interior do lóbulo (estroma 1
englobado pelo parênquima tumoral); distantes do tumor, considerando as 2
áreas do estroma mais afastadas do parênquima tumoral, seja no interior ou 3
na periferia do crescimento neoplásico. 4
5
5.2. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO ANTIGÊNICA TUMORAL: 6
Para a avaliação dos padrões de expressão antigênica estudados, foram utilizadas 7
duas análises: quantitativa e semi-quantitativa. 8
9
Avaliação Quantitativa: 10
A análise quantitativa dos antígenos CD34 e CD105 para quantificação 11
microvascular tumoral foi realizada a partir da construção de índices de expressão 12
antigênica ou índices de marcação imuno-histoquímica (IM) do antígeno. O método de 13
quantificação microvascular utilizado foi o de Weidner et al, (1991), recentemente 14
modificado conforme Consenso Internacional para Avaliação da Angiogênese em Tumores 15
Sólidos Humanos (VERMEULEN, 2002). Inicialmente, a secção histológica foi observada 16
sob média ampliação (ampliação original de 200 X, área do campo 0,82 mm²) utilizando-se 17
um microscópio de luz visível (NIKON Eclipse E-400, Nikon Inc., Japão) a fim de 18
identificar áreas com maior densidade vascular, designadas como hot spots (“áreas 19
quentes”), traduzidas pela maior densidade de coloração de tonalidade marrom. Nessas 20
áreas, foi realizada a contagem de 10 diferentes campos com ampliação original de 400x 21
(área do campo 0,2 mm²). Para a facilitação dos trabalhos, foram capturados, nestas áreas, 22
10 campos seqüenciais por meio de câmara fotográfica digital acessória ao microscópio 23
(Coolpix 4300, Nikon Inc., Japão). As imagens foram transferidas e salvas como arquivos 24
com extensão “JPG” no software Adobe Photoshop
®
CS2, versão 9.0 (Adobe Systems Inc., 25
45
USA, 2005), sendo a contagem realizada a partir destes arquivos. As contagens médias 1
para cada caso foram então registradas como densidade microvascular (DMV). Não foram 2
incluídos na contagem os vasos marcados em áreas próximos à inflamação, necrose e 3
fibrose (WEIDNER et al., 1991; UZZAN et al., 2004; SHARMA et al., 2005). 4
Além disso, para realizar-se análise de associação e sobrevida foi utilizada a 5
mediana de marcação dos AP para determinar o valor de cut-off no CD34 e CD105. Para 6
CD34 valores acima de 8,3 foram considerados positivos, e para CD105, valores acima de 7
0,1 foram considerados positivos. 8
Vale ressaltar que todas as avaliações foram realizadas por quatro observadores, 9
Kelen Christine do Nascimento Souza, Prof. Dr. Adriano Mota Loyola (Orientador, Doutor 10
e Professor em Patologia da Universidade Federal em Uberlândia), Paulo Rogério de Faria 11
(Doutor e Professor em Patologia) e Sérgio Vitorino Cardoso (Pós-doutor e Professor em 12
Patologia da Universidade Federal em Uberlândia). 13
14
Avaliação Semi-Quantitativa: 15
Para os antígenos PDEGF e VEGF a análise semi-quantitativa foi empregado um 16
índice obtido, considerando dois padrões: o padrão de intensidade de expressão 17
predominante, e o percentual de marcação antigênica tumoral, independente do padrão de 18
intensidade predominante (LIM et al, 2003; ZHANG et al, 2005). O desenvolvimento desta 19
metodologia obedeceu a seguinte dinâmica: inicialmente, em aumento original de 400X, 20
foram avaliadas as intensidades que predominavam nos tumores, classificando-as em três 21
categorias: 1 – fraca; 2 – moderada; e 3 - forte. Em seguida, utilizando-se objetiva de 22
200X, estimou-se o percentual de células marcadas nos tumores, categorizando-o nos 23
seguintes intervalos: 0 a 19% (0), 20 a 39% (1), 40 a 59% (2), e 60-100% (3). Daí, os 24
valores obtidos foram somados, resultando em índices de marcação traduzindo três 25
46
categorias semi-quantitativas de expressão antigênica: 1-2: expressão fraca; 3-4: expressão 1
moderada, e 5-6: expressão forte. 2
Todas as avaliações e análises foram realizadas por três observadores. Os casos 3
discordantes foram reavaliados e discutidos para o estabelecimento de um padrão comum 4
de interpretação. 5
6
5.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA 7
Os resultados obtidos foram descritos segundo os princípios da estatística descritiva 8
utilizando-se médias, desvio-padrão e percentuais de observações. Previamente as análises 9
estatísticas pertinentes, os dados foram testados quanto a normalidade de sua distribuição 10
pelo teste de KOLMOGOROV-SMIRNOV (SIEGEL, 1975). 11
Os resultados desta análise determinaram a utilização de testes não paramétricos 12
para CD105, VEGF e PDEGF, e paramétricos para CD34 nas diferentes análises propostas 13
e explicitadas a seguir (SIEGEL, 1975) 14
1. Com o objetivo de verificar a existência ou não de diferenças nos resultados 15
obtidos da quantificação de CD34 e CD105, os testes t de Sudent (CD34) e U de 16
Mann-Whitney (CD105) foram aplicados nas seguintes situações: 17
a. Comparar AP (tumores benignos) e o conjunto dos tumores primários 18
malignos (Pmalig, representados pelo conjunto de todos os tumores 19
metastatizantes e não metastatizantes); 20
b. Comparar o conjunto dos tumores primários metastatizantes (PM) e não 21
metastatizantes (PNM) 22
c. Comparar os tumores primários metastatizantes (pm) e não metastatizantes 23
(pnm) para cada subtipo histológico (APBG, CME, CAC), 24
47
2. A investigação de diferenças de angiogênese entre os diferentes subtipos 1
histológicos (APBG, CME e CAC), a partir da expressão de CD34 e CD105 foi 2
analisada utilizando-se o teste ANOVA com pós-teste de Tuckey, para CD34 e 3
Kruskall-Wallis, com correção de Dunn para os valores de CD105. 4
3. A análise dos resultados de VEGF e PDEGF foi realizada utilizando os testes Qui-5
48
os programas KMSurv e CoxSurv para análise uni e multivariada, respectivamente 1
(CAMPOS-FILHO & FRANCO, 1990). 2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
49
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
RESULTADOS
50
6. RESULTADOS 1
2
Os dados relativos à idade, ao sexo e à localização dos tumores, bem como os 3
relativos à classificação histológica são mostrados na TABELA 4 e TABELA 5, 4
respectivamente. 5
Os tumores malignos primários não metastatizantes tiveram um período de 6
acompanhamento que variou de zero a noventa meses. 7
Na amostra de AP (30 casos) todos os casos foram tratados com enucleação 8
cirúrgica (100%), não foi observada recorrência e todos os casos estavam vivos sem 9
doença (VSD) (100%) (TABELAS 4 e 5). O tempo de acompanhamento foi em média de 10
10 meses. 11
Nos APBG (19 casos), a recorrência foi observada em 5,2% dos casos. Metástases 12
ocorreram em 10,5% dos casos (dois casos): um caso apresentou metástase regional e à 13
distância (5,2%) e outro desenvolveu metástases à distância para pulmão (5,2%). O 14
tratamento cirúrgico exclusivo foi à modalidade terapêutica empregada em cinco casos 15
(26,3%); para 13 casos (68,4%) foram tratados com cirurgia e radioterapia adjuvante; em 16
um caso (5,2%) após biópsia incisional realizou apenas radioterapia. No período de 17
acompanhamento, 14 pacientes estavam vivos sem doença (VSD) (73,6%), três pacientes 18
foram à óbito relacionado ao câncer (ORC) (15,7%), um vivo com doença primária 19
(VCDp) (5,2%), e um vivo com doença recorrente (VCDr) (5,2%) (TABELAS 4 e 5). O 20
tempo de acompanhamento foi em média de 41,5 meses. 21
Em relação ao CME (40 casos), metástases foram detectadas em 7,5% dos casos 22
(três casos). Em dois casos as metástases foram para linfonodo (5,0%); em um acometeu 23
linfonodo e pulmão (2,5%). Nenhuma recorrência foi observada. Vinte e um casos (52,5%) 24
foram tratados exclusivamente por cirurgia, 18 tratados por cirurgia associada à 25
51
radioterapia (45,0%) e um, por ter sido considerado fora de possibilidade de tratamento 1
realizou apenas radioterapia paliativa após a biopsia incisional (2,5%). No período de 2
acompanhamento considerado, 36 pacientes estavam VSD (90,0%) e quatro pacientes 3
foram a ORC (10,0%) (TABELAS 4 e 5). O tempo de acompanhamento foi em média de 4
48,5 meses. 5
Dos 50 casos de CAC incluídos no estudo, onze pacientes tinham metástases 6
(22,0%), desses cinco apresentaram metástases à distância (10,0%), dois cervicais (4,00%) 7
e três cervicais e à distância (8,00%). Seis pacientes apresentaram recidivas (12,0%). 8
Trinta e cinco casos (70,0%) foram tratados por cirurgia e radioterapia, 11 tratados 9
exclusivamente por cirurgia (22,0%), dois após biópsia incisional, apenas radioterapia 10
(4,0%) e dois realizaram apenas biópsia incisional (4,0%). Quanto aos dados do 11
acompanhamento dos pacientes, 31 estavam VSD (62,0%), nove pacientes foram a ORC 12
(18,0%), três estavam vivos com doença metastática (VCDm) (6,0%), cinco VCDr 13
(10,0%), um VCDp (2,0%) e um óbito não relacionado ao câncer (ORnC) (2,0%) 14
(TABELAS 4 e 5). O tempo de acompanhamento foi em média de 46,5 meses. 15
52
TABELA 4- Distribuição dos tumores epiteliais de glândulas salivares da amostra estudada, provenientes do INCA, diagnosticadas e tratadas
no período de 1997 a 2003, de acordo com sua natureza histológica e principais dados sócio-demográficos e clínico.
Cor (%)
β
Estadiamento
Neoplasias
δ
Nº
#
Idade
(α)
B P N
M:F
Dimensão
(α)
(cm)
Tempo de queixa
(β)
(meses)
Sinais e sintomas
Prevalentes
I II III IV
AP 30
48,13 ± 16,2
40,0% 14,3% 46,7% 0,5 : 1 3,2 ± 1,7
43,2 ± 36,5
Tumoração
assintomática
NA NA NA NA
APBG 19
60,50 ± 9,4
58,0% 21,0% 21,0% 0,9 : 1
4,2 ± 2,2 41,5 ± 20,0
Tumoração e dor 3 5 8 3
CME 40
39,8 ± 18,7
37,5% 40,0% 22,5% 0,5 : 1
3,5 ± 1,8 48,5 ± 23,2
Tumoração e dor 9 19 6 6
CAC 50
51,4 ± 16,9
48,0% 40,0% 12,0% 0,5 : 1
3,7 ± 2,3 46,3 ± 24,1
Tumoração e dor 8 21 8 13
δ - AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico;
# N - número da amostra; α - valores calculados por média e desvio padrão; β - B - branco; P - pardo; N - negro; NA - não se aplica;
53
TABELA 5- Distribuição das neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares de origem epitelial selecionadas para compor a amostra, registradas no
INCA/MS-RJ, no período de 1998 a 2003, segundo: tipos histológicos, localização, procedimento realizado, recorrência, metástases, e estado atual.
Neoplasia N Tipos Histológicos Localização Intervenção realizada Recorrência Metástases Estado atual
AP 30 NA
Parótida (17)
Submandibular (7)
Palato (5)
Bochecha (1)
30 EC
- -
30 VSD
APBGpnm 17 NA
Palato (11)
Bochecha (5)
Parótida (1)
5 EC
12 EC + RT
1
-
14VSD
1VCDr
1VCDp
1 ORC
APBGpm 2 NA
Base da língua (1)
Lábio inferior (1)
1 EC + RT
1 BX + RT
1 MD
1 MC + MD
2 ORC
CMEpnm 37
Alto grau (11)
Moderado (9)
Baixo grau (17)
Parótida (14)
Palato (11)
Base da língua (3)
Assoalho (2)
Trígono retromolar (2)
Mucosa bochecha (2)
Submandibular (2)
Lábio superior (1)
21 EC
15 EC + RT
1 BX + RT
-
34 VSD
3 ORC
CMEpm 3
Alto grau (2)
Baixo grau (1)
Parótida (1)
Assoalho (1)
Trígono retromolar (1)
3 EC + RT
-
2 MC
1 MC + MD
2 VSD
1 ORC
CACpnm 39
Tubular (13)
Cribriforme (22)
Sólido (4)
Palato (11)
Parótida (8)
Base de língua (5)
Submandibular (4)
Bochecha (4)
Sublingual (3)
Lábio Superior (2)
27 EC + RT
9 EC
2BX + RT
1 BX
6
-
33 VSD
3 VCDr
2 ORC
1OnRC
1VCDp
CACpm 11
Tubular (1)
Cribriforme (4)
Sólido (6)
Submandibular (6)
Trígono retromolar (2)
Assoalho (1)
Base de língua (1)
Parótida (1)
8 EC + RT
2 EC
1 BX
-
2 MC
3 MC + MD
6 MD
5 ORC
3 VCDm
3 VSD
AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico, pnm – primário não metastatizantes,
pm – primário metastatizante, EC- enucleação cirúrgica, VSD – vivo sem doença, ORC – óbito relacionado ao câncer, VCDr- vivo com doença recidivada, VCDp- vivo com doença primária,
VCDm- vivo com doença metástases, BX- biópsia incisional, RXT- radioterapia, MD- metástases a distância, MC- metástases cervical, NA - não se aplica, VSD – vivo sem doença; ORC –
óbito relacionado ao câncer; VCDr- vivo com doença recidivada; VCDp- vivo com doença primária; VCDm- vivo com doença metástases.
54
6.1. ANÁLISE QUALITATIVA DO PADRÃO DE EXPRESSÃO 1
ANTIGÊNICA 2
Fator Endotelial de Crescimento Vascular - V E G F 3
4
• Glândula Normal 5
Em geral, os ductos intercalares e interlobulares não marcaram ou apresentaram uma 6
expressão antigênica fraca. Os ductos excretores apresentaram uma marcação mais forte. Em 7
todos os casos avaliados, os ácinos mucosos não apresentaram imuno-reatividade ao VEGF. 8
Nos ácinos serosos, observou-se positividade no citoplasma e sobreposta a um segmento da 9
membrana, sugerindo marcação de célula mioepitelial. As estruturas vasculares presentes nas 10
glândulas apresentaram expressão imuno-histoquímica variando de fraca a forte (FIGURA 11
1A). 12
• Epitélio de Revestimento Normal e outros Tecidos 13
A marcação do tecido epitelial de superfície ocorreu no citoplasma das células da camada 14
basal, parabasal e intermediária, variando de fraca a forte. Alguns segmentos epiteliais não 15
mostraram imunomarcação. As camadas mais superficiais foram homogeneamente negativas. 16
Na lâmina própria papilar e reticular a marcação mostrou-se forte nos vasos sanguíneos. O 17
músculo estriado presente em vários cortes apresentou marcação citoplasmática de fraca a 18
moderada (FIGURA 1B). Os adipócitos apresentaram marcação na membrana citoplasmática 19
de fraca a moderada. 20
21
FIGURA 1- Expressão de VEGF em glândula salivar normal. A) Presença de parênquima salivar 22
apresentando unidades secretoras e seguimentos de ductos salivares intralobulares. Observar a presença 23
de marcação intensa nos túbulos e ausência de marcação nas células acinares. Expressão antigênica 24
também é observada em pequenos vasos no interstício glandular; B) Estroma de região periglandular, 25
onde se observam feixes musculares esqueléticos com positividade moderada e pequenos vasos 26
intensamente marcados.(Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X). 27
55
• AP 1
Quando observadas, as marcações variaram de fraca a moderada, localizadas em 2
estruturas ductais, tanto em células luminais quanto em células não luminais. A maior 3
intensidade de marcação prevaleceu nas células luminais. As áreas condróides e mixóides 4
não apresentaram marcação. A marcação vascular também variou de fraca a moderada 5
(FIGURA 2). Todavia, alguns vasos não expressaram reatividade. 6
7
8
FIGURA 2-Expressão de VEGF em AP. Área predominada pela presença de estruturas 9
discreta expressão em células ductais luminais (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X). 10
ductais onde prevalece 11
12
• APBG 13
A marcação variou de fraca a moderada intensidade, sendo observada no citoplasma 14
tanto das células luminais quanto das não-luminais, prevalecendo maior intensidade nas 15
primeiras. Nas áreas sólidas, cribriformes e cístico-papilares não foi possível observar um 16
padrão particular e repetitivo de expressão. Nestas áreas, notou-se uma expressão em 17
mosaico (heterogeneidade de intensidade) (FIGURA 3). Nas células margeando áreas de 18
necrose foram observadas marcações mais intensas. 19
56
1
2
FIGURA 3- Expressão de VEGF em APBG. A) Observam-se pequenos vasos expressos no estroma 3
tumoral permeando áreas sólidas da lesão. Nesta região, as células neoplásicas são negativas; B) 4
Presença de crescimento papilar, mostrando a marcação de células cubóides, em intensidade 5
moderada; C) Área do tumor predominada pela presença de áreas ductais e sólidas justapostas. Aqui, 6
nota-se intensa expressão antigênica citoplasmáticas em todas as células tumorais. (Streptavidina-7
biotina-peroxidase, 400x) 8
9
10
• CME 11
Neste tumor a marcação ocorreu tanto nas áreas císticas quanto nas áreas sólidas, 12
mas foi menos intensa na primeira. A imuno-reatividade, também num padrão em mosaico, 13
foi mais evidente no citoplasma das células intermediárias, epidermóides e luminais 14
(FIGURA 4). Células superficiais das estruturas císticas, células colunares, caliciformes e 15
mucosas foram negativas para essa proteína. Os vasos apresentaram marcação de 16
moderada a forte. Células neoplásicas margeando áreas de necrose mostraram maior 17
intensidade de expressão antigênica. 18
19
20
FIGURA 4- Expressão de VEGF em CME. Em A, nota expressão antigênica predominantemente fraca 21
associada ás células intermediárias e epidermóides, incluindo aquelas situadas no revestimento do 22
espaço cístico. Ausência de marcação nas células mucosas; B) Áreas cístico-papilares mostrando 23
células colunares intermediárias com marcação de moderada intensidade; C) Nódulos com padrão de 24
crescimento sólido, com presença de estruturas ductais. Todas as células, com aspecto de células 25
intermediárias e epidermóides com intensa marcação para VEGF (Streptavidina-biotina-peroxidase, 26
400X). 27
57
• CAC 1
Neste tumor, a marcação variou de fraca a moderada intensidade, com áreas 2
desprovidas de marcação. Localizavam-se preferencialmente no citoplasma das células 3
luminais e não-luminais e também num padrão em mosaico (FIGURA 5). Nas formações 4
sólidas, as marcações foram mais fortes. Nas áreas ductais das formações cribriformes e 5
tubulares, as expressões mais intensas foram observadas nas células luminais. Diferentes 6
intensidades de imunomarcação foram observadas nos vasos sanguíneos do estroma 7
tumoral. Células neoplásicas margeando áreas de necrose mostraram maior intensidade de 8
expressão antigênica. Para todos os tumores analisados, não foi possível verificar uma 9
preferência de imunomarcação vascular vinculada à topografia dos vasos no estroma 10
tumoral. 11
12
13
FIGURA 5- Expressão de VEGF em CAC. A) Área da lesão com padrão cribriforme de crescimento. A 14
marcação fraca é observada em células ductais luminais e, aparentemente, em células não luminais; B) 15
área do tumor com padrão tubular apresentando marcação moderada em células luminais das 16
estruturas ductais. Alguns vasos são positivos no mesmo padrão de intensidade de marcação, com 17
expressão antigênica também presente em hemácias; C) Área com padrão tubular de crescimento com 18
marcante expressão em células ductais luminais. (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X) 19
20
21
Fator endotelial de crescimento endotelial derivado de plaquetas - PDEGF 22
• Glândula normal e tecido epitelial 23
No geral, o tecido epitelial e ácinos mucosos e serosos foram negativos; alguns 24
casos, contudo, marcação nos ácinos foi observada, com a intensidade variando de fraca a 25
forte; quando negativas, a marcação era visível apenas nos ductos intralobulares e 26
interlobulares (intensidade forte), apesar de que ductos não marcados também foram 27
observados; em poucos casos era possível notar marcação em tecido epitelial de superfície 28
ora restringindo-se às camadas mais profundas ora às mais superficiais. 29
58
• AP 1
No geral, a imunoreatividade foi negativa, mas focos de marcação fraca a moderada 2
foi observada em algumas estruturas ductais. Nestes casos, a marcação se restringia a 3
células luminais. Áreas condróides e condromixóides foram sempre negativas. Células 4
mioepiteliais foram usualmente negativas, mas em alguns casos uma fraca marcação pode 5
ser verificada (FIGURA 6). 6
7
8
FIGURA 6- Expressão de PDEGF em AP. A) Áreas com predomínio de estruturas ductais, 9
apresentando fraca expressão de PDEGF em células luminais; B) Outra área com estruturas epiteliais-10
mioepiteliais, onde os ductos mostram uma expressão antigênica mais acentuada (Streptavidina-11
biotina-peroxidase, 400X). 12
13
• APBG 14
Uma variação intratumoral e intertumoral foi observada: em alguns tumores, a 15
imunoreatividade era difusa, mas, em outros, focal; a marcação era predominantemente 16
citoplasmática, mas células isoladas apresentavam também uma discreta marcação nuclear; 17
naqueles de marcação difusa, a mesma era observada nas áreas sólidas, tubulares, 18
glomerulares. Em um caso em particular, a imunoreatividade se restringia as estruturas 19
tubulares e glandulares, de intensidade moderada a forte, e citoplasmática (FIGURA 7). 20
59
1
2
FIGURA 7- Expressão de PDEGF em APBG. A) Área do tumor predominada por estruturas sólidas e 3
tubulares em que a expressão aparece fraca. B) Outra área caracteristicamente tubular em que as 4
células luminais apresentam expressão antigênica intensa (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X). 5
6
• CME 7
Nos tumores cuja marcação foi predominantemente de intensidade fraca, uma 8
variação intralesional foi observada, ou seja, áreas de marcação de intensidade um pouco 9
mais forte eram notadas nas regiões mais sólidas do tumor (FIGURA 8); regiões 10
constituídas pelas células mucosas e intermediárias eram negativas. 11
Nos tumores de marcação forte a imunoreatividade era difusa e, no geral, 12
homogênea; contudo áreas de intensidade mais forte foram observadas dentro do mesmo 13
tumor, principalmente nas áreas mais epidermóides. Células mucosas eram negativas, mas 14
células intermediárias mostravam marcação predominantemente citoplasmática e de 15
60
1
2
FIGURA 8- Diferentes áreas do CME expressando PDEGF. A) Área constituída por estrutura cística e 3
presença de células mucosas. Células intermediárias e epidermóides apresentando fraca expressão. B) 4
Expressão variando de fraca a moderada nas células intermediárias e epidermóides em área sólida do 5
CME; C) Padrão de crescimento tumoral semelhante ao visto em B, apresentando marcações fortes em 6
células intermediárias e epidermóides (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X). 7
8
9
• CAC 10
A imunoreatividade, no geral, em praticamente todos os tumores foi fraca; quando 11
presente ela apresentava um padrão difuso e citoplasmático, inclusive em células ductais. 12
Células revestindo as estruturas microcísticas também foram negativas; nos tumores 13
sólidos, histologicamente mais agressivos, a imunoreatividade era a mesma quando 14
comparado aos demais tipos histológicos, ou seja, ou era ausente ou fraca (FIGURA 9). 15
16
17
FIGURA 9- Expressão de PDEGF em CAC. A. Marcação de intensidade fraca (A) e moderada (B), 18
observada principalmente em células luminais de estruturas cribriformes e tubulares 19
(Streptavidina-biotina-peroxidase, 400X). 20
21
22
23
61
CD34 1
• Glândula Normal 2
Foi observada marcação nos vasos presentes no estroma de todos os tipos de 3
glândulas salivares maiores e menores. Nas áreas de inflamação foi observada maior 4
densidade vascular reconhecida pela expressão do CD34. 5
• AP 6
Presença de marcação nos vasos que margeiam o tumor em áreas bem 7
celularizadas. Ausência de marcação nas áreas condróides, e menos freqüente nas áreas 8
mixóides. Eventualmente, as áreas próximas à cápsula fibrosa apresentavam maior 9
vascularização (FIGURA 10A). 10
• APBG 11
A marcação ocorreu nos vasos que margeavam o tumor e também nos vasos 12
localizados no estroma que separa as ilhas tumorais. Eventualmente, foi observada maior 13
densidade de expressão (vascularização) em áreas de invasão tumoral (FIGURA 10B). 14
• CME 15
Foi observada marcação nos vasos que margeam o tumor e no tecido conjuntivo 16
que dá sustentação as ilhotas, sendo observada maior densidade de marcação 17
(vascularização) nas áreas mais celularizadas que nas áreas císticas (FIGURA 10C). Nas 18
áreas próximas as ilhotas de células mucosas, foram observadas menor quantidade de 19
vasos. A densidade tumoral próxima à necrose e inflamação não foi aparentemente 20
semelhante aquelas observadas próximas ao tumor. 21
• CAC 22
Os vasos apresentaram marcação nas áreas do estroma que envolve a lesão e 23
margeando as ilhotas tumorais (FIGURA 10D). Eventualmente foi observada maior 24
vascularização nas áreas de invasão de tecido adiposo, epitélio de revestimento (em 25
62
neoplasias de glândulas menores) e músculo. Em algumas áreas de inflamação foi 1
observada maior densidade de vasos. 2
Em todas as lesões malignas, muitos lóbulos aparentemente sólidos dispunham-se 3
em torno de vasos, dando a impressão que o crescimento tumoral apresenta uma tendência 4
de crescimento angiocêntrico. 5
6
7
8
FIGURA 10- Expressão de CD34 nos tumores de glândulas salivares. A) Presença de vasos 9
marcados em áreas hialinizadas de uma área celular mioepitelial do AP (seta); B) Vasos marcados 10
em estroma permeando áreas sólidas do APBG (seta); C) Marcação vascular em delicados septos 11
CME (seta) e D) CAC com nódulos sólidos e estruturas tubulares mostrando estroma permeado 12
por discretos vasos positivos (seta) (Streptavidina-biotina-peroxidase, 400). 13
14
15
63
CD105 1
• Glândula Normal 2
Ausência de marcação dos vasos presentes no estroma, independente do tipo 3
glandular analisado. 4
• AP 5
Foi observada marcação vascular de intensidade fraca em apenas três casos. Esses 6
vasos estavam margeando as ilhotas tumorais, na periferia da lesão em áreas de estroma 7
hialino (FIGURA 11A). 8
• APBG 9
A intensidade de marcação e a densidade vascular foram aparentemente reduzidas 10
comparativamente àquela observada para CD34. Estes vasos estavam localizados 11
preferencialmente no estroma marginal as ilhotas tumorais (FIGURA 11B). 12
Eventualmente, observou-se maior densidade de marcação (vascularização) na periferia 13
dos fragmentos ensaiados. 14
• CME 15
As marcações observadas variaram em intensidade, de fraca a forte. Pode-se 16
perceber uma aparente densidade vascular que superava aquela observada nos outros 17
tumores analisados (FIGURA 11C). As expressões observadas mostraram localizações 18
margeando as ilhotas tumorais de áreas mais celularizadas. 19
• CAC 20
Foram observadas marcação dos vasos em apenas cinco casos: dois correspondendo 21
a lesões metastáticas, e três primários metastatizantes. A quantidade de vasos marcados foi 22
aparentemente menor que para CD34, e esses estavam localizados tanto no centro quanto 23
na periferia dos cortes (FIGURA 11D). 24
64
Foi marcante a diferença em intensidade de marcação observada entre os tumores. 1
Enquanto no CME predominou marcação mais forte, nas outras lesões observaram-se 2
marcações variando de fracas a moderadas. 3
Na Figura 7 estão ilustrados os aspectos mais significativos da expressão antigênica 4
do CD105 nos diferentes tumores estudados. 5
6
7
8
FIGURA 11- Expressão de CD105 nos tumores de glândulas salivares. A) Região de AP com estroma 9
parcialmente hialinizado, apresentando pequenos vasos com uma intensidade fraca de marcação 10
(setas). Alguns destes vasos não mostram positividade de expressão; B) Região periférica ao 11
crescimento do APBG mostrando pequenos vasos positivos para CD105 (setas); C) Pequenos vasos 12
com marcação de moderada intensidade em estroma intra-tumoral (setas); D) Região estroma do CAC 13
mostrando vasos com moderada intensidade de expressão antigênica (Streptavidina-biotina-14
peroxidase, 400X). 15
16
17
18
19
20
65
5.2. AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA EXPRESSÃO DE CD34 E CD105 1
NAS NEOPLASIAS BENIGNAS E MALIGNAS DE GLÂNDULAS 2
SALIVARES: 3
4
Nas Tabelas 6 e 7 podemos observar a distribuição dos diferentes grupos de 5
tumores avaliados e suas respectivas médias percentuais de marcação para CD34 e CD105, 6
respectivamente. 7
A densidade microvascular (DMV) obtida pela imunomarcação de CD34 foi maior 8
no grupo de tumores malignos (Pmalig) sendo 14,4 vasos que no grupo de tumores 9
benignos (AP), 9,9 vasos. Além disso, a DMV do grupo de tumores não metastatizantes 10
(PNM) foi de 12,7 vasos, sendo menor que no grupo de tumores metastatizantes (PM), que 11
foi de 14,2 vasos. Para cada subtipo histológico, notou-se maior DMV nos casos primários 12
não-metastatizantes (pnm) que nos primários metastatizantes (pm), sendo que as maiores 13
DMV foram observadas no CMEpnm (17,0 vasos) e no CMEpm (14,2 vasos). 14
15
TABELA 6- Distribuição dos casos de neoplasias de glândulas salivares ensaiados para 16
identificação de CD34 segundo a média e a variação percentual de células marcadas. 17
Neoplasia
1
N
2
CD34
Média % (variação)
AP
30 9,9 (2,1 - 39,2)
Pmalig
109 14,4 (3,9 - 35,9)
PNM
93 12,7 (5,2 - 33,4)
PM
16 14,2 (3,9 - 35,9)
APBGpnm
17 11,3 (6,0 - 20,5)
APBGpm
2 9,3 (7,30 - 11,30)
CMEpnm
37 17,0 (5,3 - 35,8)
CMEpm
3 14,2 (10,4-16,9)
CACpnm
39 12,9 (3,9 - 33,9)
CACpm
11 13,3 (5,2 - 33,4)
1 - AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma 18
mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico, pnm – primário não metastatizantes, pm – 19
primário metastatizante, Pmalig – primários malignos. 20
2 - número 21
22
66
Nas marcações obtidas pelo CD105, foi verificada menos DMV que no CD34. 1
Novamente, foi observada maior DMV no grupo Pmalig (2,2 vasos) que no AP (0,1 vaso). 2
Além disso, a DMV do grupo de PNM (2,2 vasos) foi maior que do grupo de PM (1,6 3
vasos). Para cada subtipo histológico, as maiores DMV foram observadas no CMEpm (5,0 4
vasos) e no CMEpnm (4,8 vasos). No APBGpm e CACpnm não foram observados vasos 5
com expressão de CD105. 6
7
TABELA 7- Distribuição dos casos de neoplasias de glândulas salivares ensaiados para identificação de 8
CD105 segundo a média e a variação percentual de células marcadas. 9
Neoplasia
1
N
2
CD105
Média% (variação)
AP
30 0,1 (0 – 3,6)
Pmalig
109 2,2 (0 – 26,2)
PNM
93 2,2 (0 – 26,2)
PM
16 1,6 (0 – 8,6)
APBGpnm
17 1,6 (0 – 6,6)
APBGpm
2 0 (0)
CMEpnm
37 4,8 (0 – 26,2)
CMEpm
3 5,0 (4,8-8,6)
CACpnm
39 0 (0)
CACpm
11 0,6 (0 - 3,4)
1 - AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma 10
mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico, pnm – primário não metastatizantes, pm – primário 11
metastatizante, Pmalig – primários malignos. 12
2 – número. 13
14
5.3. AVALIAÇÃO SEMI-QUANTITATIVA DA EXPRESSÃO DE VEGF E 15
PDEGF NAS NEOPLASIAS BENIGNAS E MALIGNAS DE GLÂNDULAS 16
SALIVARES: 17
18
Nas Tabelas 8 e 9, os tumores de glândulas salivares estão distribuídos segundo os 19
padrões semi-quantitativos de marcação para VEGF e PDEGF, respectivamente. 20
A marcação de VEGF no grupo de lesões benignas (AP) foi mais FRACA (70,0%) 21
que MODERADA (30,0%), não sendo observado nenhum caso FORTE. No grupo de 22
67
tumores malignos (Pmalig) a maioria dos casos tiveram marcação MODERADA (38,5%) e 1
FORTE (40,4%). No grupo de tumores PNM a maioria dos tumores foi FORTE (43,0%) e 2
MODERADO (35,5%), já no grupo de tumores PM a maioria foi MODERADO (56,2%) e 3
FORTE (25,0%). Para cada subtipo histológico, o APBGpnm teve a maior quantidade de 4
MODERADO (53,0%) e o APBGpm 50,0% foram MODERADO e 50,0% FORTE. Nos 5
CMEpnm e CMEpm a maioria foi MODERADO (40,5% e 66,7%, respectivamente). Para 6
o CACpnm foi observada a maior expressão de FORTE (56,4%) e no CACpm uma maioria 7
de MODERADA (54,4%). 8
TABELA 8 - Distribuição dos casos de neoplasias de glândulas salivares, benignas e malignas 9
(primários não metastatizantes e primários metastatizantes), ensaiadas segundo a presença de 10
reatividade para VEGF. 11
VEGF
Neoplasias
1
N
2
FRACA
(N/%)
MODERADA
(N/%)
FORTE
(N/%)
AP
30 21 (70,0) 9 (30,0) 0 (0)
Pmalig
109 23 (21,1) 42 (38,5) 44 (40,4)
PNM
93 20 (21,5) 33 (35,5) 40 (43,0)
PM
16 3 (18,8) 9 (56,2) 4 (25,0)
APBGpnm
17 3 (17,6) 9 (53,0) 5 (29,4)
APBGpm
2 0 (0) 1 (50,0) 1 (50,0)
CMEpnm
37 9 (24,3) 15 (40,5) 13 (35,2)
CMEpm
3 0 (0,0) 2 (66,7) 1 (33,3)
CACpnm
39 8 (20,5) 9 (23,0) 22 (56,4)
CACpm
11 3 (27,3) 6 (54,5) 2 (18,2)
1 - AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma 12
mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico, pnm – primário não metastatizantes, pm – primário 13
metastatizante, Pmalig – primários malignos, n- número e %-porcentagem. 14
2 – número 15
16
A expressão de PDEGF no grupo de lesões benignas (AP) foi sempre FRACA 17
(100,0%). No grupo Pmalig a maioria dos casos tiveram marcação FRACA (74,3%). No 18
grupo de tumores PNM a maioria dos tumores também foi FRACA (72,0%), sendo 19
observados maior número de FORTE (16,2%) que no grupo de tumores PM 20
(FORTE,12,5%), nesses a maioria foi FRACA (87,5%). Para cada subtipo histológico, o 21
68
APBGpnm teve a maior quantidade de FRACA (82,3%) e o APBGpm todos foram 1
FRACA (100,0%). Nos CMEpnm a maioria foi FRACA (46,0%) e MODERADA (16,2%), 2
já no CMEpm a maioria foi FORTE (66,7%). Para o CACpnm foi observada a maior 3
expressão de FRACA (92,3%) e no CACpm todos os casos foram FRACA (100,0%). 4
5
TABELA 9 - Distribuição dos casos de neoplasias de glândulas salivares, benignas e malignas 6
(primários não metastatizantes, primários metastatizantes), ensaiadas segundo a presença de 7
reatividade para PDEGF. 8
PDEGF
Neoplasias
1
N
2
FRACA
(N/%)
MODERADA
(N/%)
FORTE
(N/%)
AP
30 30 (100,0) 0 (0) 0(0)
Pmalig
109 81 (74,3) 11 (10,0) 17 (15,7)
PNM
93 67 (72,0) 11 (11,8) 15 (16,2)
PM
16 14 (87,5) 0 (0) 2 (12,5)
APBGpnm
17 14 (82,3) 3 (17,7) 0 (0)
APBGpm
2 2 (100,0) 0 (0) 0 (0)
CMEpnm
37 17 (46,0) 6 (16,2) 4 (10,8)
CMEpm
3 1 (33,3) 0 (0) 2 (66,7)
CACpnm
39 36 (92,3) 2 (5,2) 1 (2,5)
CACpm
11 11 (100,0) 0 0
1 - AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma 9
mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico, pnm – primário não metastatizantes, pm – primário 10
metastatizante, Pmalig – primários malignos, n- número e %-porcentagem. 11
2 – número 12
13
5.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS 14
CD34 15
Observou-se que o índice médio de marcação de CD34 foi maior no grupo Pmalig 16
que em AP, conforme mostrado na FIGURA 12, e que essa diferença se mostrou 17
estatisticamente significativa (p = 0,003). Por outro lado, a DMV foi significativamente 18
maior nos CME do que em APBG ou em CAC (p < 0,0001), mas não entre esses dois 19
últimos grupos de lesões primárias, como apresentado na FIGURA 13. 20
Por meio da quantificação de CD34 pode-se também observar que a DMV das 21
lesões malignas PNM foi um pouco superior que a das neoplasias malignas PM; entretanto, 22
69
essa diferença não foi significativa. Ainda, quando analisadas por subtipos histológicos 1
isoladamente (CME, APBG e CAC), não se verificou diferença na expressão de CD34 2
entre os grupos de comportamento metastáticos diferentes (pnm ou pm). 3
4
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
AP PMALIG
DMV
(número médio de vasos)
∗
∗
5
6
FIGURA 12 - Comparação da expressão de CD34 entre o grupo de tumores benignos (AP) e os 7
tumores Pmalig (APBG, CME e CAC). 8
1- Teste t de Student, p = 0,003 9
2- AP- Adenoma Pleomórfico, Pmalig- grupo de tumores primários malignos 10
11
70
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
APBG CME CAC
DMV
(número médio de vasos)
∗
∗
1
FIGURA 13- Comparação da expressão de CD34 entre os tipos histológicos das neoplasias malignas 2
primárias entre si (APBG, CME e CAC). 3
1- ∗Teste ANOVA, com pós-teste de Tuckey, p < 0,0001 4
2- APBG- Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau de Malignidade, CME- Carcinoma 5
Mucoepidermóide, CAC- Carcinoma Adenóide Cístico. 6
7
CD105 8
O índice médio de marcação para CD105 foi maior no grupo Pmalig que em AP, 9
conforme mostrado na FIGURA 14, e que essa diferença se mostrou estatisticamente 10
significativa (p = 0,003). Por outro lado, a DMV foi significativamente maior nos CME do 11
que em APBG ou em CAC (p < 0,0001), mas não entre esses dois últimos grupos de lesões 12
primárias, como apresentado na FIGURA 15. 13
Segundo a identificação da expressão de CD105, a DMV das lesões PNM foi um 14
pouco maior que a das neoplasias PM; entretanto, essa diferença não foi significativa, 15
estatisticamente. Ainda, quando analisadas isoladamente, não se verificou diferença na 16
expressão de CD105 entre os grupos de comportamento metastático diferente (PNM ou 17
PM) para cada tipo histológico das lesões malignas (APBG, CME, CAC). 18
19
71
0
1
2
3
4
5
6
7
AP PMALIGN
DMV
(número medio de vasos)
∗
∗
1
FIGURA 14- Comparação da expressão de CD105 entre o grupo de tumor benigno (AP) e os tumores 2
Pmalig (APBG, CME e CAC). 3
1- ∗ Teste U de Mann-Whitney, p = 0,003 4
2- AP- Adenoma Pleomórfico, Pmalig-grupo de neoplásicas primárias malignas 5
6
7
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
APBG CME CAC
DMV
(número médio de vasos)
∗
∗
8
FIGURA 15- Comparação da expressão de CD105 entre os tipos histológicos das neoplasias malignas 9
primárias entre si (APBG, CME e CAC). 10
1- ∗Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn, p < 0,0001 11
2- APBG- Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau de Malignidade, CME- Carcinoma 12
Mucoepidermóide, CAC- Carcinoma Adenóide Cístico. 13
72
VEGF 1
A análise estatística para verificação de associação entre a expressão de VEGF e 2
metástases foi realizada com base na estratificação das amostras em duas categorias: um 3
grupo com as freqüências de marcação FRACA (soma final dos escores intensidade e 4
freqüência igual a 1 ou 2), e outro com freqüências correspondentes a marcação FORTE 5
(escore final entre 3 e 6) entre os diversos grupos de interesse. 6
Assim, observou-se significativa associação de FORTE marcação com o grupo dos 7
tumores Pmalig (Teste do Qui-quadrado, p < 0,0001) (TABELA 10). Por outro lado, não 8
se identificou nenhuma associação significativa entre o subtipo histológico das lesões 9
malignas primárias com a marcação do VEGF. 10
Da mesma forma, não foi identificada nenhuma associação significativa entre a 11
presença de metástases e a marcação de VEGF para as lesões malignas metastatizantes, 12
quer seja como grupo (PM) ou como quando analisadas isoladamente (pm) a partir dos 13
subtipos histológicos (APBG, CAC e CME). 14
15
TABELA 10 – Associação da expressão de VEGF nos AP e no grupo de neoplasias Pmalig
1
. 16
Neoplasias
FRACA
(n/%)
FORTE
(n/%)
AP 21 (70,0) 9 (30,0)
Pmalig 23 (21,1) 86 (78,9)
2
1. Pmalig- Neoplasias malignas primárias, AP- Adenoma Pleomórfico, n- número e %-porcentagem. 17
2. Teste de Qui-quadrado (p < 0,0001) 18
19
PDEGF 20
Houve diferença significativa entre os grupos de AP e Pmalig, com uma associação 21
significativa de marcação FORTE com as neoplasias primárias malignas (Teste exato de 22
Fisher, p = 0,0006) (TABELA 11). Por outro lado, a ocorrência de marcação de FORTE 23
73
intensidade foi significativamente maior nos CME do que em APBG ou em CAC (p < 1
0,01), não havendo diferença significativa para essas duas últimas lesões (TABELA 12). 2
Da mesma forma, não foi identificada nenhuma associação significativa entre a 3
ocorrência (PM) ou não (PNM) de metástase e a freqüência de marcação do PDEGF. 4
Ainda, quando analisadas isoladamente, não se verificou associação na freqüência de 5
marcação FRACA ou FORTE de PDEGF entre os grupos de comportamento metastático 6
diferente (pnm e pm) para cada tipo histológico das lesões malignas (APBG, CME, CAC). 7
8
TABELA 11 – Associação da expressão de PDEGF nos AP e no grupo de neoplasias Pmalig
1
. 9
Neoplasias
FRACA
(n/%)
FORTE
(n/%)
AP
30 (100,0) 0 (0)
Pmalig
81 (74,3) 28 (25,7)
2
1. Pmalig- Neoplasias malignas primárias, AP- Adenoma Pleomórfico, n- número e %-porcentagem. 10
2. Teste exato de Fisher, p=0,0006 11
12
13
14
TABELA 12 – Associação da expressão de PDEGF entre APBG, CME e CAC
1
. 15
Neoplasias FRACA
(n/%)
FORTE
(n/%)
APBG 16 (84,2) 3 (15,8)
CME 18 (45,0) 22 (55,0)
CAC 47 (94,0) 3 (6,0)
1. APBG- Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau de Malignidade, CME- Carcinoma Mucoepidermóide, 16
CAC- Carcinoma Adenóide Cístico, n- número e %-porcentagem. 17
2- Teste Exato de Fisher (p < 0,01) 18
19
20
21
Na análise de sobrevida, a mediana de marcação para CD34 e CD105 dos AP foi 22
estabelecida como cut-off, sendo negativo abaixo desse valor e positivo acima. A mediana 23
de marcação do AP para CD 34 foi de 8,25; e para CD105, 0,1. A distribuição dos casos 24
positivos e negativos para imunomarcação de CD34 e CD105, utilizando o cut-off está na 25
TABELA 13. Os dados correlacionados com a sobrevida estão nas TABELAS 14 a 16 e 26
nas FIGURAS 16 a 21. 27
74
TABELA 13 - Distribuição dos casos de neoplasias de glândulas salivares, benignas e malignas 1
(primários não metastatizantes, primários metastatizantes e lesão metastática), ensaiadas segundo a 2
presença de reatividade para CD34 e CD105. (cut-off foi a mediana de marcação no AP, md= 8,25 para 3
CD34 e md=0,1 para CD105). 4
CD34 CD105
Neoplasias
1
(n)
2
Positivo (n/%) Positivo (n/%)
AP
30
15 (50,0) 2 (6,6)
Pmalig
75
TABELA 15 – Avaliação do impacto prognóstico de marcadores angiogênicos neoplasias malignas de 1
glândulas salivares. 2
1 0,002
VEGF
2+3 0,002
0,85
1 0,002
PDEGF
2+3 0,002
0,79
0 (< 10%) 0,002
PDEGF-N
1 (> 10%) 0,001
0,54
< ou = AP (0.1) 0,003
CD105
> AP 0,002
0,48
< ou = AP (8,3) 0,006
CD34
> AP 0,001
0,02∗
1- ∗ Teste de Breslow ou Log-Rank p<0,05. 3
2- md- mediana, PM- primários metastatizantes, PNM- primários não metastatizantes. 4
5
6
7
8
TABELA 16 – Avaliação do impacto prognóstico de marcadores angiogênicos nos subtipos histológicos 9
das neoplasias malignas de glândulas salivares. 10
< ou = md AP (8,3) 0,006
APBG CD34
> md AP 0,003
0,52
< OU = md AP (0.1) 0,005
APBG CD105
> md AP 0,003
0,53
1 0,002
APBG PDEGF
2+3 0,008
0,29
1 0,000
APBG VEGF
2+3 0,004
0,31
< ou = md AP (8,3) 0,005
CME CD34
> md AP 0,001
0,14
< ou = md AP (0.1) 0,002
CME CD105
> md AP 0,001
0,65
1 0,002
CME PDEGF
2+3 0,000
0,44
1 0,002
CME VEGF
2+3 0,001
0,71
< ou = md AP (8,3) 0,007
CAC CD34
> md AP 0,002
0,05∗
< ou = md AP (0.1) 0,003
CAC CD105
> md AP 0,009
0,32
1 0,003
CAC PDEGF
2+3 0,007
0,40
1 0,004
CAC VEGF
2+3 0,003
0,73
1- ∗ Teste de Breslow ou Log-Rank p<0,05. 11
2- APBG- Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau, CME- Carcinoma Mucoepidermóide, CAC- 12
Carcinoma Adenóide Cístico. 13
3- md- mediana, PM- primários metastatizantes, PNM- primários não metastatizantes. 14
76
1
FIGURA 16 - Curva de sobrevida (Kaplan-Meier) dos pacientes estudados, segundo estadiamento 2
clínico pelo sistema TNM (p < 0,0001). 3
4
5
6
7
8
FIGURA 17 - Curva de sobrevida (Kaplan-Meier) dos pacientes estudados, segundo o tamanho da 9
lesão (p < 0,0001). 10
11
12
13
14
15
16
FIGURA 18- Curva Curva de sobrevida (Kaplan-Meier) dos pacientes estudados, segundo a presença 17
(PM) ou ausência (PNM) de metástases (p < 0,0001). 18
19
20
21
22
23
77
1
FIGURA 19- Curva de sobrevida (Kaplan-Meier) dos pacientes estudados, segundo a imunomarcação 2
de CD34 (p =0,02). 3
4
5
6
7
8
9
10
FIGURA 20- Curva de sobrevida (Kaplan-Meier) dos pacientes estudados, segundo o grau histológico 11
(tubular, cribriforme e sólido) (p =0,01). 12
13
14
15
16
17
18
FIGURA 21- Curva de sobrevida (Kaplan-Meier) dos pacientes com CAC, segundo a imunomarcação 19
de CD34 (p =0,05). 20
21
22
23
78
Tendo em vista que os parâmetros “estadiamento clínico”, tamanho, ocorrência de 1
metástases e imunomarcação do antígeno CD34 foram capazes de diferenciar os casos na 2
análise univariada, os mesmos foram então avaliados quanto à sua utilidade em um modelo 3
multivariado. Após a realização da rotina estatística de razão proporcional (modelo de 4
Cox), utilizando-se do programa CoxSurv, obteve-se um modelo em que as variáveis 5
tamanho e ocorrência de metástases mostraram valor independente na previsão da 6
sobrevida (p < 0,001), enquanto que o estadiamento clínico e a expressão de CD34 não se 7
mostraram úteis. 8
Os resultados obtidos na análise de correlação utilizando o teste de Correlação de 9
Rank de Spearman, entre a expressão de CD34, CD105, VEGF e PDEGF, estão expressos 10
na TABELA 15. Foi encontrada uma correlação positiva da expressão de VEGF e CD34 11
apenas para o CACpm. Uma correlação positiva também foi verificada entre PDEGF e 12
CD34 no grupo de PNM; e entre PDEGF e CD105 nos grupos PNM e PM, e para o 13
CMEpnm e CMEpm Além disso, uma correlação positiva também foi observada entre 14
CD34 e CD105 para o CMEpnm. 15
79
TABELA 17- Correlação entre a expressão de CD34, CD105, VEGF e PDEGF nos diferentes grupos 1
de neoplasias. 2
Neoplasias
VEGF
x
PDEGF
VEGF
x
CD34
VEGF
x
CD105
PDEGF
x
CD34
PDEGF
x
CD105
CD34
x
CD105
AP NA
p = 0,24
rs = 0,22
p =0,15
rs =0,26
NA NA
p =0,10
rs =0,30
Pmalig
p =0,59
rs =0,05
p =0,31
rs =0,09
p =0,44
rs =-0,07
p =0,61
rs =-0,04
p =0,29
rs =0,10
p =0,07
rs =0,17
PNM
p =0,56
rs =-0,05
p =0,27
rs =0,11
p =0,36
rs =-0,09
p =0,04∗
rs =0,20
p =0,002∗
rs =0,30
p =0,06
rs =0,19
PM
p =0,34
rs =0,25
p =0,06
rs =0,47
p =0,46
rs =-0,19
p =0,76
rs =0,08
p =0,01∗
rs =0,61
p =0,82
rs =0,05
APBGpnm
p =0,59
rs =0,13
p =0,28
rs =0,27
p =0,63
rs =0,12
p =0,54
rs =-0,15
p =0,35
rs =0,23
p =0,38
rs =0,22
APBGpm NA NA NA NA NA NA
CMEpnm
p =0,98
rs =0,00
p =0,23
rs =0,20
p =0,17
rs =0,22
p =0,93
rs =0,01
p =0,03∗
rs =0,33
p =0,007∗
rs =0,43
CMEpm
p =0,66
rs =0,50
p =0,33
rs =-0,86
p =0,33
rs =-0,86
p =0,33
rs =-0,86
p =0,000∗
rs =0,000
p =0,66
rs =0,50
CACpnm
p =0,50
rs =0,08
p =0,84
rs =0,03
p =0,40
rs =0,13
p =0,75
rs =-0.05
p =0,77
rs =-0,04
p =0,82
rs =-0,03
CACpm NA
p =0,03∗
rs =0,64
p =0,06
rs =-0,58
NA
NA
p =0,31
rs =-0,33
1- ∗ teste de Correlação de Rank de Spearman, p< 0,05 3
2- AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma 4
mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico, Pmalig- grupo de tumores malignos; PM- grupo 5
de tumores primário metastatizante; PNM- grupo de tumores primário não metastatizantes; pnm – 6
primário não metastatizantes, pm – primário metastatizante. 7
8
9
10
11
12
80
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
DISCUSSÃO
81
1
7- DISCUSSÃO 2
No presente trabalho, procurou-se avaliar a expressão de VEGF e PDEGF e dos 3
marcadores endoteliais vasculares CD34 e CD105 em neoplasias malignas epiteliais de 4
glândulas salivares, considerando sua aplicabilidade na predição do potencial metastático 5
das lesões malignas glandulares. A partir dos nossos resultados, foi possível observar uma 6
associação entre a natureza do tumor e a maior expressão dos fatores angiogênicos 7
estudados, ocorrendo maior expressão nas lesões malignas, comparativamente às benignas. 8
Todavia, não conseguimos observar uma associação entre o aumento dos fatores de 9
angiogênicos e a agressividade dos tumores malignos, representada pelo seu maior 10
potencial metastático, desde que nenhuma diferença significativa foi encontrada entre a 11
expressão destes fatores entre os grupos PM e PNM. Por outro lado, foi possível evidenciar 12
que na análise univariada, a angiogênese, dada pela expressão de CD34 (mas não de 13
CD105, VEGF e PDEGF), mostrou-se associado com pior prognóstico. Este fato não se 14
repetiu em uma análise multivariada. Desta forma, nossos achados não evidenciaram 15
associação entre angiogênese tumoral e metástases ou prognóstico das lesões. 16
Cabe, então, fazer a apreciação de alguns tópicos relacionados ao desenho e 17
aspectos metodológicos do estudo que, a nosso ver, poderão auxiliar na visibilidade e na 18
interpretação dos resultados. 19
Para este trabalho, foi selecionada uma amostra constituída por tumores benignos e 20
malignos. No primeiro grupo, escolheu-se o Adenoma Pleomórfico (AP), que é a lesão 21
benigna de glândula salivar mais comum (BARNES et al., 2005). No segundo grupo, 22
foram selecionados três tipos de lesões malignas em que a metástase aparece como um 23
evento provável. Deste fizeram parte o Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau de 24
Malignidade (APBG), o Carcinoma Mucoepidermóide (CME) e o Carcinoma Adenóide 25
82
Cístico (CAC) (EVANS & LUNA, 2000; BRADLEY, 2001; BARNES et al., 2005; 1
POGODZINSKY et al., 2006). A partir daí, foram obtidas amostras de tumores primários 2
não metastatizantes (pnm) e primários metastatizantes (pm). 3
Com este desenho, procuramos atender a possibilidade de avaliar tumores para os 4
quais o evento de metástases é conceitualmente ausente, ou pelo menos improvável, os 5
quais foram representados pelo AP. Por outro lado, para compor o grupo de lesões 6
malignas, em que as metástases surgem como eventos possíveis e prováveis, escolhemos o 7
APBG, onde o evento tem sido descrito com menor freqüência. E, para aquelas lesões onde 8
as metástases são mais freqüentes, selecionamos o CAC e o CME, especialmente porque se 9
constituem nas neoplasias malignas mais comuns desta localização. Aqui, vale ressaltar 10
que há lesões mais agressivas em glândulas salivares tais como o carcinoma do ducto 11
salivar, carcinossarcoma, carcinoma ex-adenoma pleomórfico e adenocarcinoma NOS, por 12
exemplo. Não obstante, não foi possível recuperar um número suficiente de tumores 13
representativo para o trabalho. Especialmente ao que tange a não inclusão dos 14
adenocarcinomas NOS no estudo, entendemos que se trata de um grupo heterogêneo e mal 15
definido do ponto de vista morfológico que também não apresenta ainda um padrão de 16
comportamento conhecido. 17
As neoplasias de glândulas salivares correspondem a aproximadamente 3% das 18
neoplasias que acometem a região de cabeça e pescoço (ELLIS et al., 1991; BARNES et 19
al., 2005). Por serem tumores incomuns, foram observadas dificuldades na seleção e 20
aproveitamento de casos para a composição de uma amostra numericamente 21
representativa. Além disto, consideramos necessário, especialmente para os casos de 22
neoplasias malignas, não considerar para o estudo tumores recidivantes e que tenham 23
recebido terapia prévia, incluindo radio e/ou quimioterapia. Assim, todos os tumores foram 24
83
primários, o que favoreceu uma redução significativa dos casos disponíveis para estudo, o 1
que pode ser revisto no ANEXO 1. 2
Para os Adenomas Pleomórficos (AP), observou-se uma idade média de 48 anos, 3
com predileção pelo sexo feminino (EVESON & CAWSON, 1985; ITO et al., 2005; 4
KALLUF, 2006). A parótida foi o sítio de acometimento mais freqüente, assim como 5
observados por outros autores (AUCLAIR & ELLIS, 1991; LOYOLA et al., 1995; 6
BARNES et al., 2005). Todos os casos foram tratados com enucleação cirúrgica 7
(MERCANTE et al., 2002; ITO et al.; 2005). Nenhum caso de recorrência foi identificado, 8
e todos os pacientes estavam vivos sem doença dentro do período de seguimento 9
registrado. O tempo de acompanhamento foi em média de 10 meses, com um tempo 10
máximo de 62 meses. O período de acompanhamento para o AP, apesar de curto, está 11
dentro daquele considerado no protocolo de condutas do Instituto Nacional do Câncer 12
(INCA) que orienta um seguimento de 12 meses para os pacientes com neoplasias 13
benignas. Após este período, estando os pacientes bem, recebem alta. 14
Em relação ao APBG, a idade média foi de 60,5 anos, prevalecendo o sexo 15
feminino (VINCENT et al., 1994; KALLUF, 2006). A maioria dos casos não 16
metastatizantes ocorreram no palato, conforme descrito na literatura (EVANS & 17
BATSAKIS, 1984; KELCH et al., 1997; BARNES et al., 2005), os dois casos primários 18
metastatizantes ocorreram no lábio inferior e base de língua. Dezoito casos foram tratados 19
por excisão cirúrgica, e nesses, 13 receberam radioterapia posterior. Em um caso foi 20
realizada apenas biópsia incisional seguida por radioterapia paliativa devido à extensão do 21
tumor no momento do diagnóstico. A taxa de recorrência foi de 5%, e um caso 22
desenvolveu metástases regionais e à distância (5,0%) e outro apenas metástases à 23
distância (5,0%). Estas freqüências de recidiva e metástases encontram-se dentro daquelas 24
encontradas na literatura, cujos valores situam-se entre 0,1% e 57,5% (EVANS & LUNA, 25
84
2000; POGODZINSKY et al., 2006). Esses casos metastáticos evoluíram para óbito 1
relacionado ao câncer. 2
Para o grupo dos CME, observou-se uma idade média de 39,8 anos, mais comum 3
no sexo feminino (BARNES et al., 2005). A parótida foi o sítio de acometimento mais 4
freqüente, assim como observados por outros autores (AUCLAIR & ELLIS, 1991; 5
LOYOLA et al., 1995; BRANDWEIN et al., 2001). O tratamento de escolha foi a 6
ressecção cirúrgica ampla, e para alguns casos, seguida do esvaziamento cervical e 7
radioterapia pós-operatória (ELLIS & AUCLAIR, 1996; BRANDWEIN et al., 2001). Os 8
resultados mostraram que, à semelhança dos achados da literatura (NASCIMENTO et al., 9
1986a; BRANDWEIN et al., 2001; GUZZO et al., 2002; BARNES et al., 2005), a maioria 10
dos tumores primários não metastatizantes foi classificada como de baixo grau de 11
malignidade. Em contrapartida, a maioria dos CMEpm foram classificados como de alto 12
grau de malignidade. Não foi observada recidiva local. A ocorrência de metástases foi 13
observada em dois casos para linfonodo (5,0%); e em um acometeu linfonodo e pulmão 14
(2,5%) (NASCIMENTO et al., 1986a; BRADWEIN et al., 2001 e PIRES et al., 2002). 15
A predileção para o sexo também foi encontrada para o grupo dos CAC. A média 16
de idade dos pacientes foi de 51,4 anos, dados esses semelhantes aos descritos por Spiro & 17
Huvos (1992) e Ellis & Auclair (1996). Os locais mais acometidos foram glândulas 18
submandibulares e palato (NASCIMENTO et al., 1986b; SPIRO & HUVOS, 1992; ELLIS 19
& AUCLAIR, 1996). O tratamento de escolha foi ressecção local ampla e, em alguns 20
casos, seguida de esvaziamento cervical e radioterapia pós-operatória. A recidiva local foi 21
observada em 41,7% dos CACpm e em 14,3% dos CAC primários não metastatizantes; 22
dados semelhantes aos observados por Witten et al. (1990) e Spiro & Huvos (1992). A 23
ocorrência de metástases regionais, à distância e ambas foi de 4,0%, 6,0% e 12,0% dos 24
casos, respectivamente (SPIRO & HUVOS,1992; HAUNG et al., 1997). 25
85
Desta forma, foi possível observar que a amostra resultante apresentou 1
características sócio-demográficas e clínico-patológicas semelhantes àquelas já descritas na 2
literatura. 3
Vários fatores prognósticos tumorais já têm sido identificados para as neoplasias 4
malignas, independentemente de sua histogênese, a saber: subtipo histológico, tamanho e 5
extensão topográfica do tumor, e status do linfonodo no tempo do diagnóstico e a presença 6
de metástases à distância. 7
Entre estes, a ocorrência de metástases tem sido relatada como principal causa de 8
morte em pacientes com tumores malignos (ELLIS & FIDLER, 1996). Assim, tem sido 9
considerado na literatura como altamente desejável a identificação de marcadores 10
específicos previamente ao tratamento, genéticos ou não, preditivos de agressividade 11
tumoral, neste caso, de metástases. Esta identificação favoreceria precocemente a 12
percepção deste comportamento e, consequentemente, maior pertinência na formulação do 13
tratamento e do prognóstico. 14
Neste sentido, muita atenção tem sido dada à compreensão do processo metastático 15
para, a partir daí, analisar os diferentes fatores potencialmente envolvidos no processo que 16
sejam também identificáveis e aplicáveis na predição de comportamento tumoral. 17
É classicamente conhecido que o processo de metástases consiste em um processo 18
múltiplo, complexo, interativo e interdependente. Para tanto, as células tumorais destacam-19
se uma das outras devido a redução da sua adesividade; a seguir as células apresentam 20
potencial de invadir tanto a matriz extracelular quanto a circulação. Após a invasão 21
vascular as células precisam sobreviver ao sistema de defesa imune e novamente atravessar 22
o endotélio e assim atingir o parênquima de algum órgão, e neste responder a fatores de 23
crescimento e induzir proliferação e angiogênese (RUBBIN, 2007). 24
86
Desta forma, os antígenos envolvidos direta ou indiretamente no processo de 1
angiogênese tumoral, constituem-se em um grupo alvo para estudo. 2
Dentre estes marcadores encontram-se as proteínas VEGF e PDEGF e os 3
marcadores endoteliais vasculares CD34 e CD105. Sua relação com a angiogênese e 4
progressão tumoral nos tumores sólidos foram revistos na introdução deste trabalho. 5
Foi assim construída uma hipótese a qual considerou que maior angiogênese 6
tumoral quantificada pela expressão de CD34 e CD105, e maior expressão dos fatores de 7
crescimento endoteliais tumorais (VEGF e PDEGF), estaria associada à ocorrência de 8
metástases e, portanto, ao pior prognóstico, de forma independente de outros fatores 9
clínico-patológicos já descritos anteriormente. Também foi proposto que esta investigação 10
seria realizada a partir da expressão imuno-histoquímica dos antígenos mencionados. Esta 11
abordagem foi escolhida tendo em vista que se constitui uma ferramenta amplamente 12
utilizada nos laboratório de patologia para diagnóstico, em especial na identificação da 13
histogênese tumoral. Ademais, seu emprego tem sido rotineiro na identificação de 14
marcadores de agressividade e na melhoria da formulação de prognósticos do câncer de 15
mama, por exemplo. Para estes casos, o protocolo de formulação do diagnóstico já prevê a 16
inclusão e quantificação da expressão de marcadores hormonais e de proliferação celular. 17
A imunomarcação de VEGF foi observada no citoplasma das neoplasias epiteliais 18
de glândulas salivares, no endotélio vascular, músculo estriado, membrana citoplasmática 19
dos adipócitos, ductos das glândulas mucosas e serosas normais; e macrófagos (LIM et al., 20
2003; ZHANG et al., 2005; MAHARAJ et al., 2006). 21
Dados da literatura mostram que a expressão de VEGF nos CAC é 22
predominantemente forte, com um número menor, mas aproximado, de casos com 23
expressão moderada (LIM et al., 2003; ZHANG et al., 2005). Para a expressão de VEGF 24
em CME, a literatura tem mostrado resultados contraditórios. Em um (LIM et al., 2003) 25
87
predominou fraca expressão; em outro (DOI et al., 1999) foram observados 1
aproximadamente 70% dos casos com expressão distribuída entre moderada e forte. Este 2
padrão de expressão também se repetiu para os APBG. Assim, nossos resultados estão 3
mais próximos dos de DOI et al. (1999), já que observamos mais de 70 % das lesões 4
malignas expressando VEGF em moderada e forte intensidade. Este padrão de expressão 5
nas neoplasias malignas é o inverso daquela observada para as benignas. Embora 6
heterogênea, a expressão de VEGF no AP foi predominantemente FRACA (70,0%). 7
Todavia, quando observadas, as marcações estavam localizadas em estruturas ductais, 8
tanto em células luminais quanto em células não luminais, com maior intensidade de 9
marcação nas luminais. As áreas condróides e mixóides não apresentaram marcação, 10
achados estes que foram semelhantes aos descritos por SWELAN et al. (2005). Este 11
quadro pode estar consoante a função de VEGF na manutenção e diferenciação ductal. 12
Quando analisamos a expressão de CD34 e CD105, pudemos perceber que a 13
angiogênese foi significativamente maior nas lesões malignas de todos os tipos 14
histológicos, comparativamente às lesões benignas. Estes achados acompanham a 15
expressão diferenciada de VEGF nas mesmas lesões, embora não pudéssemos observar 16
uma correlação positiva apenas nos CAC primários metastatizantes. Um achado curioso foi 17
que a angiogênese foi mais acentuada no CME (CD34 e CD105) que no CAC (DOI et al., 18
1999) e no APBG. Todavia, nenhuma diferença foi observada entre os dois últimos. 19
A expressão distinta entre tumores malignos e benignos parece sugerir que VEGF 20
teria um papel diferenciado na progressão das neoplasias malignas, favorecendo, 21
provavelmente, por um lado, aumento da sobrevida celular. A propósito, um aumento 22
gradativo na expressão de VEGF tem sido relacionado com a progressão da displasia para 23
carcinoma epidermóide invasivo (TAE et al., 2000; JOHNSTONE & LOGAN, 2007). 24
Neste sentido, nossos achados são similares, apontando na mesma direção, desde que a 25
88
expressão nas neoplasias malignas foi maior que nas benignas. Vale salientar que embora 1
este dado não seja objetivamente comprovador da associação de VEGF com a proliferação 2
celular, há evidências de que VEGF está diretamente envolvido na indução de bcl-2, cuja 3
atividade é anti-apoptótica (FERRARA et al., 2003), o que poderia favorecer a entrada da 4
célula em atividade proliferativa. Nesta linha, há inúmeras evidências mostrando maiores 5
frações de proliferação celular nos tumores de glândula salivar malignos comparativamente 6
aos benignos (SOINI et al., 1992; SOUZA et al., 2003). 7
Outro aspecto favorecedor da progressão neoplásica é a relação da expressão de 8
VEGF com a angiogênese. Neste sentido, o aumento da expressão de VEGF tem sido 9
correlacionado com aumento da densidade vascular intratumoral (DMV), influenciando 10
metástases e prognóstico em carcinoma gástrico (MAEDA et al., 1996, 1999), cólon 11
(TAKAHASHI et al., 1997), pulmão não de pequenas células (FONTANINI et al., 1998), 12
câncer de mama linfonodo negativo (LINDERHOLM et al., 1998) e carcinoma 13
epidermóide oral (MAEDA et al., 1998). Contudo, poucos estudos têm sido publicados 14
mostrando a relação da expressão de VEGF e pior prognóstico em carcinomas de glândulas 15
salivares (DOI et al., 1999; LIM et al., 2003; YU et al., 2003; ZHANG et al., 2005). 16
Correlação entre expressão de VEGF e DMV tem sido notada em diferentes tipos 17
de neoplasias, inclusive de glândulas salivares (ZHANG et al., 2005; SHI et al., 2007). 18
Este fato é relevante, tendo em vista que indica maior angiogênese e maior permeação 19
tumoral pelos vasos sanguíneos. Com isto, teoricamente, haveria maior chance de ocorrer 20
permeação vascular metastática. Assim, nossa expectativa era de que encontrássemos não 21
só a associação de VEGF com DMV, mas também com a presença de metástases. Todavia, 22
no presente estudo a expressão de VEGF não possibilitou a discriminação dos tumores 23
primários não metastatizantes (pnm) dos tumores primários metastatizantes (pm), tanto 24
para o grupo de tumores malignos (APBG, CAC e CME), quanto na comparação entre pnm 25
89
e pm para cada tipo histológico. Resultados semelhantes também foram descritos por DOI 1
et al. (1999) e YU et al. (2003). Este fato também se repetiu na avaliação da DMV (DOI et 2
al., 1999). 3
Além disso, também não observamos correlação entre a expressão de VEGF e 4
DMV com sobrevida, nem para os tumores malignos como grupo (Pmalig, PNM e PM), 5
nem para cada subtipo histológico (APBG, CME, CAC). Estes resultados discordam do 6
que foi relatado por Yu et al. (2003) e Shi et al. (2007) que encontraram uma associação 7
entre DMV e prognóstico. Nesta linha, Li et al. (2001) e Zhang et al. (2005) encontraram 8
associação entre VEGF e DMV e entre estes marcadores e o prognóstico, e Lim et al. 9
(2003) que encontraram associação entre VEGF e prognóstico. Esta ausência de 10
homogeneidade nos resultados presentes na literatura e em nosso trabalho não parece ter 11
uma explicação simples. Embora possamos discutir questões relativas à modulação da 12
expressão de VEGF, nossos resultados e os estudos descritos não apresentam metodologia 13
que permita esta apreciação. Talvez uma avaliação do tempo de evolução do tumor, a 14
presença de fatores intercorrentes não identificados ou relatados pelos autores e mesmo a 15
utilização de casos recidivantes possam eventualmente ser considerados em uma futura 16
investigação para melhor elucidação destas diferenças. A propósito, Shi et al. (2007) e Doi 17
et al. (1999) relatam que utilizaram casos recidivantes na sua amostra, mas não fizeram 18
qualquer comentário sobre a expressão de VEGF ou de DMV nestes casos. Seria 19
importante avaliar se estas diferenças de expressão poderiam refletir ambientes tumorais 20
distintos entre lesões primárias estabelecidas e lesões recidivantes. 21
Ainda outra questão que merece reflexão, diz respeito à metodologia utilizada tanto 22
para a avaliação de VEGF quanto da DMV. Diretrizes estabelecidas pelo 2º Consenso 23
Internacional sobre Metodologia e Critérios de Avaliação da Quantificação de 24
Angiogênese em Tumores Sólidos Humanos orientam que as mensurações de DMV devem 25
90
excluir as áreas de necrose e esclerose (VERMEULEN et al., 2002). Nenhum dos trabalhos 1
referidos anteriormente cita explicitamente que utilizaram estas orientações em suas 2
avaliações. Embora descrevam a utilização da metodologia preconizada por Weidner et al., 3
(1991) também considerada referência pelo VERMEULEN et al. (2002), não consideram a 4
exclusão das áreas de necrose e esclerose. 5
Muito embora tenhamos seguido as orientações do “Consenso”, julgamos que uma 6
outra avaliação deveria ser considerada. Isto porque, a priori, embora não esteja ainda bem 7
definida se a permeação vascular seja um processo passivo ou ativo (BOCKHORN et al, 8
2007), acreditamos que uma maior exposição vascular ao tumor poderia favorecer maior 9
chance de escape celular pelos vasos sanguíneos. Assim, vale considerar que nas áreas de 10
necrose, rompimentos vasculares poderiam favorecer maior exposição à drenagem de 11
células neoplásicas. Além disto, a presença de fatores de crescimento induzíveis por 12
hipóxia nestas regiões, poderia favorecer o aumento da vascularização pelo aumento de 13
VEGF que, consequentemente, teria o mesmo efeito por aumentar a DMV (RUDDON, 14
2007). 15
A expressão de VEGF tem sido determinada por métodos semi-quantitativos, mas 16
a ausência de padronização justifica em parte a variedade de resultados encontrados na 17
literatura. Alguns estudos obtiveram a expressão de VEGF pela freqüência de marcação, 18
positiva se mais de 10% das células estiverem marcadas (TSUJITANI et al., 2004), ou 19
mais de 20% (DOI et al., 1999), ou se mais de 80% do tumor apresentar marcação (SHIH 20
et al., 2000). Outros estudos se basearam na intensidade, classificando subjetivamente a 21
marcação em fraca, moderada e forte; outros agrupam em duas categorias: moderada e 22
forte (SAUTER et al., 1999). Soma-se a esses os que classificam a intensidade baseada no 23
parâmetro de marcação de VEGF no vaso: marcação igual a do vaso era considerada 24
moderada, abaixo é fraca e acima forte (MORYAMA et al., 1997). Finalmente, outros 25
91
estudos associam a freqüência e a intensidade de marcação, somando-as ou multiplicando-1
as e obtendo-se daí, um escore que determinava se a expressão era fraca, moderada ou 2
forte (LIM et al., 2003; RYU et al., 2003; ZHANG et al., 2005; SHI et al., 2007). Nosso 3
estudo seguiu aqueles princípios estabelecidos por Lim et al. (2003), Weidner et al., 4
(1991), Zhang et al., (2005) e Shi et al., 2007 utilizando escores compostos. Todavia, como 5
já mencionado, nossos resultados foram diversos, como já discutido acima. 6
Vale ressaltar, que seleção e o tamanho da amostra, a fixação e o processamento 7
dos tumores, a utilização de anticorpos policlonais para VEGF, CD34 e CD105, diferentes 8
técnicas de recuperação antigênica, a subjetividade de interpretação dos observadores tem 9
também influenciado a divergência dos achados para marcação de VEGF, CD34 e CD105 10
em um mesmo tipo de tumor. Neste sentido, mais estudos devem ser desenvolvidos, 11
considerando a possibilidade de melhor adequação metodológica, direcionando-a no 12
sentido de se obter uma padronização que evite as variações comentadas. 13
Ainda outra questão levantada pelos autores que trabalham com estimativa de 14
angiogênese tumoral diz respeito a utilização de um ou vários fragmentos na sua 15
mensuração. Neste ponto, as opiniões são contraditórias (DE JONG et al., 1995; PAGE & 16
JENSEN, 1995; VERMELEUM et al., 1995, MARTIN et al., 1997). 17
Os estudos que descreveram a expressão imuno-histoquímica de PDEGF tem 18
descrito marcações citoplasmáticas e/ou nucleares (FOX et al., 1995; TAKEBAYASHI et 19
al., 1996; KOUKOURAKIS et al., 1998; TOKUNAGA et al., 2002; RYU et al., 2003), o 20
que também foi verificado no presente trabalho. Nossos resultados não puderam identificar 21
nenhuma associação de sua expressão com a angiogênese, metástases ou prognóstico, dado 22
pela redução de sobrevida nos pacientes quer seja pela expressão citoplasmática ou nuclear 23
do PDEGF. Essa compartimentalização da expressão de PDEGF foi discutida por Fox et 24
al. (1995) sugerindo que no núcleo PDEGF pode indicar a sua atuação como reguladora da 25
92
replicação celular, e no citoplasma, a regulação e interação com enzimas localizadas nesse 1
compartimento celular. Todavia, não foram observadas outras investigações que possa 2
elucidar mais claramente esse assunto. 3
O único estudo realizado em glândulas salivares foi o de Fox et al. (1995) que 4
encontrou expressão do PDEGF em glândulas salivares normais evidenciada nos ácinos 5
serosos, epitélio ductal, e endotélio vascular (FOX et al., 1995). No presente estudo, foi 6
evidenciado esse mesmo padrão de marcação nas glândulas normais. 7
A expressão do PDEGF nos tumores sólido tem sido encontrada mais alta que em 8
tecidos normais adjacentes (MOGHADDAM et al., 1995; TAKEBAYASHI, 1996; 9
AKIYAMA et al., 2004). Nossos achados também mostraram esta relação. Acredita-se que 10
esta expressão tenha uma relação com o papel do PDEGF na resistência à apoptose 11
induzida pela hipóxia, permitindo um crescimento celular neoplásico in vivo, sem aumento 12
da DMV. 13
Uma correlação positiva entre PDEGF e DMV é reportada em outros tumores 14
sólidos (TOI et al., 1995; UEDA et al., 1999). Nossos resultados mostraram uma 15
correlação positiva entre PDEGF e CD34 no grupo de lesões PNM; e entre PDEGF e 16
CD105 nos grupos PNM e PM, e para o CMEpm e CMEpnm. Estes dados também não nos 17
permitem uma visão homogênea do papel do PDEGF na angiogênese destas lesões. Talvez, 18
aqui também, tenhamos evidência de que o processo de angiogênese não seja 19
significativamente diferente entre as lesões glandulares. Contudo, chama a atenção o fato 20
de, novamente, o CME apresentar uma marcação diferenciada o que, mais uma vez pode 21
sugerir que sua progressão esteja mais vinculada com a angiogênese e, desta forma, possa 22
influenciar nas associações identificadas quando se considerou para a análise todo o grupo 23
de lesões malignas. 24
93
A expressão de PDEGF tem sido relacionada com invasão e aparecimento de 1
metástases de alguns tumores sólidos (MOGHADDAM et al., 1995; TAKEBAYASHI et 2
al., 1996, GRIFFITHS & STRATFORD 1998; BROWN et al., 2000; JONES et al., 2002). 3
Além disso, o valor prognóstico de PDEGF é reconhecido no câncer de mama (FOX et al., 4
1995) e câncer de útero (RYU et al., 2003), traduzido pela associação entre maior 5
expressão e menor sobrevida dos pacientes. No presente trabalho a expressão de PDEGF 6
conseguiu diferenciar o grupo de neoplasias benignas (AP) do grupo de neoplasias 7
malignas (Pmalig) e mostrou uma maior expressão nos CME quando comparados com 8
CAC e APBG. A priori, não conseguimos obter na literatura nenhuma explicação 9
convincente para este dado. De forma semelhante ao VEGF, o PDEGF pode também 10
favorecer a resistência a apoptose (TOI et al., 2005) e com isto favorecer o crescimento dos 11
tumores que apresentam maior fração de proliferação celular. Uma explicação alternativa, 12
que careceria de confirmação, é o fato de que subtipos histológicos de tumores de glândula 13
salivar, como por ex. o CME, podem ter sua progressão menos dependente da angiogênese 14
do que outros tipos como o CAC e APBG, cuja morfologia é semelhante, mas o 15
comportamento biológico é completamente distinto. Não foi também possível distinguir as 16
neoplasias pnm das pm, analisadas como grupos ou entre os diferentes tipos histológicos 17
separadamente. Logo, o PDEGF não mostrou ser um bom marcador de potencial 18
metastático e de prognóstico para os tumores de glândulas salivares. Como foi mencionado 19
anteriormente, este é o primeiro trabalho estudando o significado da expressão de PDEGF 20
no comportamento biológico dos tumores de glândulas salivares. Portanto, não há como 21
discutir os seus resultados para tumores desta topografia. Em carcinomas gástricos e de 22
mama também tem sido relatado ausência de correlação da expressão de PDEGF e DVM, e 23
PDEGF e prognóstico. (YAMAMOTO et al., 1998; MORINAGA et al., 2003). 24
94
Como era de se esperar, o CD105 só foi demonstrado no endotélio de vasos 1
tumorais (KUMAR et al., 1999). Foi observada uma menor densidade microvascular que a 2
marcada por CD34. Além disso, vários tumores não apresentaram vasos corados pelo 3
CD105 como no CAC, onde apenas 5,4% dos casos foram positivos. Nos tecidos normais 4
não foram observadas marcações no endotélio vascular, e nos AP apenas três casos 5
apresentaram reduzida quantidade de vasos marcados. Uma alta expressão do CD105 tem 6
sido relatada na literatura em tumores sólidos, onde este marcador está intensamente 7
expresso apenas em vasos neoformados, não sendo expresso em vasos pré-existentes e 8
tecido normal (BODEY et al., 1998; KUMAR et al., 1999; MINHAJAT et al., 2006). 9
Os achados mostraram maior expressão de CD105 nos CME em relação ao AP, 10
APBG e CAC (p<0,0001). Também não foi possível encontrar valores de expressão que 11
pudessem discriminar o comportamento biológico dos tumores primários metastatizantes 12
dos primários metastatizantes. Da mesma forma, não foi possível associá-lo ao pior 13
prognóstico. Grudzinski et al. (2007) estudando a expressão de CD105 em câncer de 14
mama, também encontraram 52,8% dos casos negativos. Os autores concluíram que a 15
expressão de CD105 não apresentou significância estatística como fator prognóstico (p= 16
0,145). 17
Embora estes resultados possam refletir aspectos ainda não esclarecidos da função 18
biológica destas proteínas, é importante salientar a influência da metodologia utilizada 19
nestas avaliações, tanto nos resultados como na sua interpretação. Diferentes fatores têm 20
sido implicados, em maior ou menor grau, nos resultados finais das reações imuno-21
histoquímicas; entre eles, os aspectos do processamento prévio à reação, que podem 22
interferir na conservação dos antígenos. É possível citar a fixação tecidual (natureza do 23
fixador empregado, tempo de fixação, tempo transcorrido entre a retirada do material e o 24
95
início da fixação); o processo de inclusão em parafina (temperatura) e a diafanização das 1
secções teciduais (LOYOLA, 1996). 2
Vale ressaltar também que a expressão de CD105 parece ser específica para vasos 3
neoformados. Como considerado anteriormente, o processo de metástases é diretamente 4
associado a participação vascular, já que o transporte de células para sítios distantes é 5
preferencialmente realizado a partir de sua entrada nos vasos. Não obstante, não se sabe 6
ainda se este escape vascular se dá de forma passiva ou ativa. Alguns autores defendem a 7
idéia de que este fenômeno está desvinculado de qualquer participação ativa das células, 8
sendo as metástases dependentes apenas da aproximação da célula neoplásica do vaso e 9
sua entrada facilitada ou por um dano estrutural ou por uma deficiência estrutural, 10
representada pela imaturidade presente nos vasos neoformados. Já outros, consideram que 11
há uma migração celular ativa para os vasos e uma penetração nestes facilitada pela ação 12
de enzimas e, provavelmente de receptores específicos para estas células. Se os dois 13
mecanismos ocorrem ou um mecanismo prevalece não é possível afirmar com certeza 14
dentro do que se conhece atualmente (BOCKHORN et al., 2007). A definição desta 15
situação pode explicar, talvez, estas diferenças de significado da expressão de CD105 e 16
também de CD34 nos tumores avaliados. Vasos preexistentes e neoformados não teriam 17
diferenças significativas no processo caso a migração ativa prevalecesse. De outra forma, 18
vasos neoformados, imaturos, seriam extremamente importantes na definição da 19
potencialidade metastática se a migração passiva fosse mais importante. 20
Assim, nossos resultados mostram que a angiogênese e os fatores de crescimento 21
VEGF e PDEGF a ela associada puderam discriminar apenas os grupos tumorais com 22
naturezas diferentes: lesões malignas e benignas. Contudo, não houve uma homogeneidade 23
de expressão que pudesse ser característica para cada grupo de neoplasia maligna, seus 24
correspondentes metastáticos, definindo, pelos resultados, que a expressão destes fatores 25
96
não deve, a priori, aplicável para predição de potencial metastático e mesmo de 1
prognóstico. Não obstante, outros estudos devem ser realizados para verificar a influência 2
das diferentes áreas tumorais no padrão geral de expressão antigênica, a inclusão de áreas 3
necróticas na avaliação da angiogênese, a avaliação de índices compostos de mensuração 4
vascular que incluam valores de CD105 e CD34 e a inclusão de casos recidivantes que 5
também produziram metástases. 6
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25
CONCLUSÃO
98
8- CONCLUSÃO 1
2
Dos resultados obtidos nesse estudo, pode-se concluir que: 3
4
1. Não houve diferença na expressão de VEGF, PDEGF, CD34 e CD105 para cada 5
tipo tumoral individualmente, a partir do parâmetro morfo-histogenético. 6
7
2. As expressões de VEGF, PDEGF, CD34 e CD105, possibilitaram a discriminação 8
do grupo de tumores benignos dos malignos de glândulas salivares. 9
10
3. As expressões de PDEGF, CD34 e CD105, possibilitaram a discriminação de CME 11
e APBG, e CME e CAC. Enquanto, as expressões de VEGF não possibilitaram a 12
discriminação dos tipos histológicos dos tumores malignos entre si. 13
14
4. As expressões de VEGF, PDEGF, CD34 e CD105 não possibilitaram a 15
discriminação do comportamento biológico das neoplasias malignas de glândulas 16
salivares em não metastatizantes e metastatizantes. 17
18
5. VEGF, PDEGF, CD34 e CD105 não são bons marcadores de prognóstico e 19
preditores de metástases para as neoplasias epiteliais de glândulas salivares. 20
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RESUMO
100
9- RESUMO 1
2
A angiogênese tumoral é um potencial marcador biológico de prognóstico e um fator 3
preditivo de metástases em tumores sólidos humanos. Para avaliar a distribuição e 4
quantificação da angiogênese, tem-se utilizado marcadores de endotélio e fatores de 5
crescimento vascular, dentre esses selecionamos o Fator Vascular de Crescimento 6
Endotelial (VEGF), o fator de crescimento endotelial derivado de plaquetas (PDEGF) e os 7
marcadores de endotélio vascular CD34 e CD105. O objetivo deste trabalho foi avaliar, 8
morfo-histogenética, quantitativa e semi-quantitativamente, a expressão imuno-9
histoquímica das proteínas VEGF e PDEGF, e dos marcadores de endotélio vascular CD34 10
e CD105, e suas associações com a existência (pm) ou não de metástases (pnm) em 11
tumores epiteliais de glândulas salivares. Para tanto, foram selecionados 139 casos de 12
neoplasias epiteliais de glândulas salivares do salivares diagnosticados e tratados no 13
Instituto Nacional do Câncer do Ministério da Saúde, localizado na cidade do Rio de 14
Janeiro (RJ) (INCA), no período de 1997 a 2003, sendo 30 casos de Adenomas 15
Pleomórfico (AP), 19 Adenocarcinomas Polimorfo de Baixo Grau de Malignidade 16
(APBG), 50 Carcinomas Adenóide Cístico (CAC) e 40 Carcinomas Mucoepidermóide 17
(CME). Uma diferença estatisticamente significante (p < 0,05) foi encontrada entre: 1)AP e 18
o grupo de lesões primárias malignas (Pmalig) para VEGF (p < 0,0001), PDEGF (p = 19
0,006), CD34 (p = 0,003) e CD105 (p = 0,003); 2) APBG, CAC e CME para PDEGF (p < 20
0,01), CD34 (p < 0,0001), e CD105 (p < 0,0001), onde a diferença ocorreu entre CME e 21
APBG, e CME e CAC. A análise entre pnm e pm para cada tipo histológico e para o grupo 22
de malignos não foram significativas. Os marcadores VEGF, PDEGF, CD34 e CD105 não 23
refletiram o potencial metastático das neoplasias de glândulas salivares e não foram 24
marcadores independentes de prognóstico. 25
Palavras chaves: angiogênese, VEGF, PDEGF, CD34, CD105, neoplasias de glândulas 26
salivares. 27
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27
ABSTRACT
102
10- ABSTRACT 1
Tumoral angiogenesis represents a potential bimolecular marker for prognosis and 2
predictive factor for metastasis in human solid tumors. Recently, endothelial markers and 3
growth vascular factors such as the vascular endothelial growth factor (VEGF) and the 4
platelet derived endothelial growth factor (PDEGF), as well as the vascular endothelial 5
markers CD34 and CD105 have been employed to evaluate the distribution and to quantify 6
of angiogenesis. The objective of this study was to perform morpho-histogenetic, 7
quantitative and semi-quantitative analysis of the immunohistochemical expression of 8
VEGF, PDEGF, CD34, and CD105 in primary epithelial salivary gland tumors, as well as 9
compare this expression with the biological behavior of those neoplasms as determined by 10
the existence (pm) or absence (pnm) of metastasis. In this sense, it was selected 139 cases 11
of epithelial salivary gland tumors diagnosed and treated in the Brazilian National Cancer 12
Institute (INCA), placed in Rio de Janeiro City (RJ), from 1997 to 2003, consisting in 30 13
pleomorphic adenomas (PA), 19 polymorphic low grade adenocarcinoma (PLGA), 50 14
adenoid cystic carcinoma (ACC) and 40 of mucoepidermoid carcinoma (MEC). Statistic 15
significant difference (p < 0.05) was found between: 1) PA and the group of primary 16
malignant lesions (Pmalig) for VEGF (p < 0.0001), PDEGF (p = 0.006), CD34 (p = 0.003) 17
and CD105 (p = 0.003); 2) PLGA, ACC and MEC for PDEGF (p < 0.0001), CD34 (p < 18
0.0001) and CD105 (p < 0.0001), where the difference occurred between MEC and PLGA, 19
and MEC and ACC. The comparison between pm and pnm for each histological type and 20
for each malignant group did not reveal significant differences. In conclusion, the present 21
results suggest that VEGF, PDEGF, CD34 and CD105 do not represent good predictors for 22
metastasis and prognosis in epithelial salivary gland tumors, albeit they may reflect some 23
pathogenetic differences among specific groups of these neoplasms. 24
25
Key words: Angiogenesis, VEGF, PDEGF, CD34, CD105, salivary gland tumors. 26
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29
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gastric carcinoma in relation to the expression of vascular endothelial growth 31
factor and Thymidine phosphorylase. Anticancer Research 24: 1853-1859, 32
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159. UEDA, M; TERAI, Y; KUMAGAI, K; UEKI,K; OKAMOTO, Y; UEKI,M. 35
Correlation between tumor angiogenesis and expression of thymidine 36
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39
160. USUKI, K; SARAS, J; WALTENBERGER, J; MIYAZONO, K; PIERCE, G; 40
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84, 1994. 50
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1
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methodology and criteria of evaluation of angiogenesis quantification in solid 9
human tumors. European Journal of Cancer 38: 1564-1579, 2002. 10
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38
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chinês. 49
50
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5
176. ZHANG, J; PENG, B; CHEN, X. Expressions of Nuclear Factor κB, Inductible 6
Nitric Oxide Synthase, and Vascular Endothelial Growth Factor in Adenoid 7
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Clinical Outcome. Clinical Cancer Res 11(20): 7334-7343, 2005. 9
10
120
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
ANEXOS
121
ANEXO 1 1
2
Tabela 1 - Distribuição dos casos excluídos do presente estudo, segundo os tipos histológicos e os 3
diferentes motivos alegados para sua exclusão. 4
CASOS EXCLUÍDOS (N)
1
FATORES DE EXCLUSÃO
CME CAC APBGM
Casos recidivantes 24 25 3
Ausência de dados no prontuário 1 1 -
Ausência de tumor no bloco 2 - 2
Revisão de lâmina 4 4 3
Casos tratados fora do INCA - 1 3
Ausência de blocos 4 6 -
Casos anteriores a 1998 13 13 2
Alteração no diagnóstico histopatológico 8
2
10
3
10
4
Tratamento radioterápico exclusivo 2 5 -
Recusou tratamento no INCA 1 2 -
Material autolisado - 1 1
Total de casos excluídos (N)
1
59 68 24
1 – Número de casos; 5
2- Mudança de diagnóstico para: Adenocarcinoma (3 casos), Carcinoma de ductos salivares (2 casos), 6
Carcinoma Ex-Adenoma Pleomórfico (2 casos), e Carcinoma epidermóide (1 caso); 7
3- Mudança de diagnóstico para: Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau (5 casos), Carcinoma de ductos 8
salivares (3 casos), Adenocarcinoma de células basais (1 caso), Carcinoma Ex –Adenoma pleomórfico (1 9
caso); 10
4- Mudança de diagnóstico para: 4 Carcinoma adenóide cístico, 4 Adenocarcinoma, 2 Carcinoma de Ductos 11
salivares 12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
122
ANEXO 2 1
2
TABELA 2 - Distribuição de todos casos de neoplasias de glândulas salivares classificadas segundo o 3
tipo histológico e a presença ou não de metástases pelo Instituto Nacional do Câncer encontrados no 4
período de 1998 a 2003. 5
Neoplasia
Primários não
metastatizantes
Primários
metastatizantes
1
Total de casos
2
AP
308
_ 308
APBG
30
5
35
CME
89
10
99
CAC
83
29
112
TOTAL
509
44
554
6
1 –
Consideram-se metastatizantes primários as lesões das quais as metástases se originaram. 7
2 –
O número total de casos compreende as lesões primárias e metastatizantes. 8
AP – adenoma pleomórfico; APBG – Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau; CME – carcinoma 9
mucoepidermóide; CAC – carcinoma adenóide cístico 10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
123
1
ANEXO 3 2
3
4
5
1. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo 6
Mineiro. 7
2. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional do Câncer, Rio 8
de Janeiro/RJ. 9
10
11
12
13
14
15
16
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