( PDF ) Análise da viabilidade e ciclo celular de fibroblastos eqüinos cultivados in vitro: comparação pré- e pós-descongelação

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

ANÁLISE DA VIABILIDADE E CICLO CELULAR DE

FIBROBLASTOS EQÜINOS CULTIVADOS IN VITRO :

COMPARAÇÃO PRÉ- E PÓS-DESCONGELAÇÃO

JOÃO FERREIRA DE LIMA NETO

BOTUCATU – SP

FEVEREIRO 2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

ANÁLISE DA VIABILIDADE E CICLO CELULAR DE

FIBROBLASTOS EQÜINOS CULTIVADOS IN VITRO :

COMPARAÇÃO PRÉ- E PÓS-DESCONGELAÇÃO

JOÃO FERREIRA DE LIMA NETO

Dissertação apresentada junto ao Programa

de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

para obtenção do título de Mestre

Orientadora: Profa Adj. Fernanda da Cruz

Landim-Alvarenga

BOTUCATU – SP

FEVEREIRO 2007

ads:

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO

DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus

Lima Neto, João Ferreira de.

Análise da viabilidade e ciclo celular de fibroblastos eqüinos cultivados in

vitro: comparação pré e pós-descongelação / João Ferreira de Lima Neto. –

Botucatu : [s.n.], 2007.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2007.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga

Assunto CAPES: 20204000

1. Eqüino - Genética 2. Clonagem 3. Apoptose 4. Genética animal

5. Cultivo in vitro

CDD 636.1089042

Palavras-chave: Anexina V; Apoptose; Citometria de fluxo; Ciclo celular;

Cultivo celular; Eqüino;

iii

“Aos meus pais”

Agradeço

A minha orientadora e amiga Professora Fernanda da Cruz Landim-

Alvarenga, por estar sempre ao meu lado, que contribuiu de forma intensa na minha

formação e de outros milhares de colegas neste país, pelas suas reflexões criativas

sobre nosso objeto de estudo, as quais muito nos ajudaram a compreendê-lo.

Fernanda, muito obrigado!

À minha família, pela sólida formação dada até minha juventude, que me

proporcionou a continuidade nos estudos até a chegada a este mestrado. Pai, mãe,

irmã, avôs e avós, meus eternos agradecimentos.

A Kéle, minha namorada, pelo amor e paciência.

Aos meus amigos, que com alegria, estão sempre presentes. Obrigado

pela força e companheirismo.

Aos colegas e amigos do laboratório, Cláudia, Camila Bianco, Camila,

Lílian, Tatiana, Mateus, Elen, Patrícia, Carla, Ana Augusta, Marcos e todos os

outros, muito obrigado pelo apoio e suas contribuições para a realização deste

trabalho.

As amigas Claudia, Camila Bianco, Marjorie e Léia, por terem ajudado

diretamente na realização desse trabalho.

Aos amigos Edmilson, Adriano, Vitor, Gustavo, Carla, Camila Porto,

Satie, Leandro, Hymerson, pela amizade e companheirismo.

À professora Lídia, do Departamento de Bioestatística da Unesp de

Botucatu, muito obrigado pela ajuda com a análise estatística.

A Profa Renée, do Departamento de Patologia Veterinária da Unesp de

Botucatu, pela análise de imunocitoquímica.

Ao Prof. Sony, do Departamento de Reprodução Animal da Unesp de

Botucatu, com quem partilhamos diversos interesses comuns, entre os quais a

temática de estudo que abrange indústria, tecnologia e meio ambiente, nossos

afetivos agradecimentos pela sua participação nesta banca de mestrado, o que com

certeza contribuirá para ampliar a qualidade desta dissertação.

Ao Prof. Visintin, que tem sido de uma disponibilidade irrestrita sempre

que procurado, nossos agradecimentos pela sua participação nesta banca de

Mestrado, o que certamente tornará nosso trabalho mais rico.

Ao Hemocentro da Faculdade de Medicina da Unesp de Botucatu.

Aos professores do Departamento de Reprodução Animal da FMVZ,

UNESP, Botucatu.

A todos os funcionários da FMVZ, aos funcionários do Departamento de

Reprodução Animal, às funcionárias da Biblioteca.

O Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq - que me concedeu uma bolsa

durante a realização deste mestrado, fato este que muito contribuiu para viabilização

desta dissertação. Portanto, deixamos aqui expressos nossos agradecimentos.

LIMA NETO, J.F. Análise da viabilidade e ciclo celular de fibroblastos equinos

cultivados in vitro : comparação pré- e pós-descongelação. 2007. 73p. Dissertação

(mestrado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,

UNESP, Botucatu, 2007.

Resumo

O primeiro sucesso na clonagem de eqüídeos através do uso de

transferência nuclear foi relatado em maio de 2003 após o nascimento de uma mula

clonada a partir de células fetais. Acredita-se que a utilização de células diplóides

em fase do ciclo celular G0 ou G1 facilite a coordenação entre o ciclo celular e a

reprogramação nuclear após a transferência de núcleo. Sendo assim, este

experimento objetivou estudar o comportamento de fibroblastos de eqüinos adultos

em cultura, analisando o estado do ciclo celular e a viabilidade das células em cultivo

pré- e pós-descongelação. Fragmentos de pele de 6 eqüinos adultos, sendo 3

machos e 3 fêmeas, foram divididos em pedaços de aproximadamente 1mm

acondicionados (10 fragmentos/garrafa) no fundo de duas garrafas de cultivo

(25cm

) umedecidas com 1mL SFB. As garrafas foram inclinadas para a posição

vertical e adicionado 5ml de meio DMEM alta glicose + 10% SFB, 100UI/mL

Penicilina / 100µg/mL Estreptomicina e 3,0µg/mL Anfotericina B. Após 30 minutos

em estufa com 5% CO

em ar, as garrafas foram dispostas em posição horizontal,

para que o meio de cultivo entrasse em contato com os fragmentos teciduais. Todas

as garrafas permaneceram por sete dias em estufa com 5% CO

em ar até o início

do crescimento celular. Com 70% de confluência, foi realizada a tripsinização e a

primeira passagem. O mesmo procedimento foi repetido para a segunda passagem.

Para os grupos de privação de soro (0,5% de SFB) foram produzidas garrafas de

cultivo em duplicata para a análise da viabilidade e do ciclo celular nos períodos de

24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de cultivo. Para os grupos de confluência foram

produzidas duas garrafas de cultivo para a análise da viabilidade e do ciclo celular

no período em que o tapete celular atingisse a confluência. Para análise de

viabilidade as células foram coradas com 30µl de Hoescht 33342 (10mg/ml) por 30

minutos, e 30µl de Iodeto de Propídeo (1mg/ml) por 5 minutos. A análise foi

realizada em microscopia de fluorescência, onde células com núcleo corado em azul

vii

representavam a população de vivas, e as coradas em vermelho representavam as

mortas. Foram observados 10 campos/ garrafa. O Citômetro de Fluxo FACS Calibur

foi utilizado para análise dos índices de apoptose e necrose, bem como das

fases do ciclo celular. As taxas de viabilidade celular foram altas tanto para os

grupos que sofreram privação de soro como o cultivo até confluência. A análise da

citometria de fluxo confirmou os dados observados na microscopia óptica, no entanto

este teste se mostrou mais preciso permitindo detecção de diferenças estatísticas

entre os grupos de células após o congelação. Tanto a confluência quanto a

privação de SFB foram eficientes na sincronização do ciclo celular nos momentos

pré-congelação. Entretanto, na pós-congelação observou-se uma superioridade do

método de privação de soro, por mais de 24 horas, sobre o cultivo até confluência,

apresentando taxas acima de 90% de células em G0/G1. O tempo de sincronização

do ciclo celular para a privação de soro foi estabelecido, estando ao redor das 96

horas tanto para as células pré- como pós-congelação. Os resultados deste

experimento permitem constatar que os fibroblastos eqüinos em cultivo

apresentaram índices de apoptose/necrose mais baixos do que os descritos na

literatura para outras espécies animais. Estes dados associados aos altos índices de

sincronização dos ciclo celular em G0/G1 observados, em especial nos grupos que

sofreram privação de SFB por mais de 90 h, indicam a eficiência da metodologia

utilizada para cultivo de fibroblastos eqüinos.

Palavras-chave: Cultivo celular, Fibroblastos, Citometria de Fluxo, Ciclo Celular,

Anexina V, Apoptose, Eqüino.

viii

LIMA NETO, J.F. Analysis of cell viability and cellular cycle in equine fibroblasts

cultured in vitro: comparison pre- and post-freezing. 2007. 73p. Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, 2007.

Abstract

The first success in equine cloning, using nuclear transfer, was reported in

May of the 2003 after the birth of a cloned mule obtained from fetal cells. Nowadays

there is an agreement, in the literature, that diploid cells in phase G0 or G1 of the cell

cycle facilitate coordination between the cell cycle and the nuclear reprogramming

after the nuclear transfer. This experiment aimed to study the behavior of equine

fibroblasts in culture though the analysis of the cellular cycle and the viability of cells

pre- and post-freezing. Skin fragments were obtained from 6 adult horses (3 females

and 3 males) and divided in pieces of about 1 mm

. For culture, the bottoms of two

culture bottles were moistened with 1 mL of FCS, 10 fragments of skin were

deposited, and 5 ml of DMEM high glucose + 10% FCS, 100 IU/mL penicillin,

100µg/mL streptomycin and 3 µg/ml amphotericin B were added with the bottles

raised vertically. After 30 min incubation in 5% CO

in air, the bottles were moved to

a horizontal position allowing the culture media to make contact with the tissue

fragments. All bottles were cultured for 7 days in 5% CO

in air until the beginning of

confluence. The complete culture media was replaced weekly and, at 70% of

confluence, trypsinization (ATV Vernese, Adolfo Lutz Institute) and the first passage

were performed. Two passages were performed before freezing. For the second

passage, the culture and trypsinization were repeated. For cells subjected to serum

starvation (0.5% FCS), culture bottles were produced in duplicate for viability and

cellular cycle analysis at 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours of culture. For the

confluence groups bottles were produced for the analysis of viability and cellular

cycle at the moment cells achieved confluence. Cellular viability was assisted by

staining the cells with 30µl of Hoescht 33342 (10mg/ml) (Sigma) and 30µl of

propidiun Iodide (1mg/ml). The samples were analyzed using a fluorescent

microscope were cells stained in blue were considered alive and cells stained in pink

considered dead. For each bottle 10 fields were analyzed. The analysis of

apoptosis/necrosis, as well as, the cellular cycle was performed using a flow

citometer FACS Calibur BD

. When optical microscopy was used cellular viability

was high for serum starvation and confluent groups. The flow citometer analysis

confirms this data. However the use of flow citometer was more precise to detect

statistic differences between groups of cells after thawing. Either culture until

confluence or serum starvation was efficient methods to synchronize the cellular

cycle of cells pre-freezing. After thawing, however, serum starvation, for more than

24hs, was superior than culture until confluence, with rates of cell synchronization in

G0/G1 above 90%. The time for synchronization of the cellular cycle was established,

for serum starvation groups, in 96 hs. either pre- or post freezing. The results of this

experiment showed lower rates of apoptosis/necrosis compared with other animal

species. This data analyzed together with the high rates of cellular cycle

synchronization indicates the efficiency of the method utilized to culture equine

fibroblasts destined to nuclear transfer.

Key words: Cellular culture, Fibroblasts, Flow citometer, Cellular cycle, Anexina V,

Apoptosis, Equine.

Sumário

1. Introdução 1

2. Revisão de literatura 3

2.1. Transferência nuclear 3

2.2. Cultivo celular de fibroblastos 5

2.3. Ciclo celular das células somáticas 8

2.4. Morte celular por apoptose 11

2.5. Criopreservacão e apoptose 14

3. Objetivos 16

4. Material e métodos 17

4.1. Obtenção das amostras 17

4.2. Cultivo primário de fibroblastos 18

4.3. Subcultivo 19

4.4. Criopreservação 20

4.5. Caracterização imunocitoquímica 21

4.6. Grupos experimentais 22

4.7. Viabilidade celular 22

4.8. Ciclo celular 23

4.9. Análise da apoptose 25

4.10. Metodologia estatística 27

5. Resultados 28

5.1. Viabilidade Celular 28

5.1.1. Teste Pré-Congelamento 28

5.1.2. Teste Pós-Congelamento 31

5.2. Citometria de Fluxo 34

5.2.1. Anexina V - Teste Pré-Congelamento 34

5.2.2- Anexina V - Teste Pós – Congelamento 38

5.3. Ciclo Celular 42

5.3.1. Ciclo Celular – Pré-Congelamento 42

5.3.2. Ciclo Celular – Pós-Congelamento 46

6. Discussão 52

7. Conclusão 58

8. Referências 59

9. Anexos – Meios e Soluções 70

9.1. Anexo – A – Soluções utilizadas no cultivo celular 70

9.1.1. Anexo – A.1 – Solução utilizada na coleta de tecido 70

9.1.2. Anexo – A.2 – Meio de cultivo – para cada 1 ml de meio de cultivo 70

9.1.3. Anexo - A.3 – Antibióticos 70

9.1.4. Anexo – A.4 – Antifúngicos 71

9.1.5. Anexo – A.5 – Solução de Congelamento 71

9.1.6. Anexo – A.6 – Azul de Trypan 71

9.1.7. Anexo – A.7 – Solução de Tripsina 0,2% e Versene 0,02% 71

9.2. Anexo – B – Soluções utilizadas análise da Viabilidade Celular 72

9.2.1. Anexo – B.1- Solução de Hoescht 33342 72

9.2.2. Anexo – B.2 – Solução de Iodeto de Propídio 72

9.3. Anexo – C – Soluções utilizadas na análise do Ciclo Celular 72

9.3.1. Anexo – C.1 – Solução de “ Cold GM” 72

9.3.2. Anexo – C.2 – Solução de Marcação 73

9.4. Anexo – D – Soluções utilizadas na análise da Apoptose 73

9.4.1- Anexo – D.1 – Solução tampão para anexina 73

9.4.2- Anexo – D.2 – Solução de Marcação 73

1- Introdução

Clonagem é a produção de organismos geneticamente idênticos, por

meios não sexuais (WILMUT, et al., 1998). Embora comum em plantas e alguns

animais inferiores, a reprodução assexuada usada é o método natural, não sendo

observada em vertebrados. Os primeiros resultados considerados animadores para

a clonagem em mamíferos foram obtidos por Willadsen (1986), com o nascimento de

ovinos clonados por transferência nuclear utilizando-se células de embriões de 8 a

16 células. O desenvolvimento da técnica com células embrionária e o crescente

interesse da indústria e centros de pesquisa na multiplicação de animais

geneticamente idênticos fez com que novos estudos fossem realizados. O relato do

nascimento da ovelha Dolly (WILMUT et al.,1997), primeiro clone produzido a partir

de células somáticas diferenciadas reprogramadas, mostrou ser possível a produção

de cópias genômicas de um indivíduo adulto. Desde então, muitos trabalhos tem

sido desenvolvidos objetivando a utilização de células somáticas como fontes para

técnicas como a de transferência nuclear e terapia gênica entre outras. Isto se deve

pelo aumento expressivo da disponibilidade de células doadoras de núcleos

geneticamente idênticas.

Os sistemas de cultivos de tecido e cultivos celulares foram criados no

início do século como modelo de estudo do comportamento de células animais livres

de variação no ambiente interno do organismo, pois o ambiente externo continua

atuar no cultivo, temperatura, composição do meio, etc, e passaram a ter uma

utilização fundamental em ciências como a Virologia, a Oncologia, a Farmacologia, a

Genética (FRESHNEY, 1992) e biologia molecular a partir dos anos 50 (século XX).

As dificuldades iniciais com a manutenção dos cultivos foram gradativamente

resolvidas com a utilização de meios de cultura apropriados, uso de materiais

descartáveis, esterilização adequada de vidraria e técnicas seguras de manipulação.

Na atualidade, a cultura de fibroblastos é um método largamente usado. Em cultura,

as células fibroblasticas apresentam-se alongadas, fusiformes e com pouca

capaciadade de formar lamina basal. Estas células são obtidas a partir de tecido

conjuntivo, cartilagens, revestimentos de vasos sanguíneos, músculos e estromas de

vários órgãos.

O tipo de célula somática utilizada na clonagem parece ter uma forte

influencia sobre os resultados obtidos. Alem disso já foi demonstrado que o estadio

do ciclo celular em que as doadoras de núcleo encontram-se no momento da

transferência nuclear influencia a reprogramação genética que deve ocorrer para o

desenvolvimento do embrião (WILMUT et al., 1997; WELLS et al., 2003).

O primeiro sucesso na clonagem de eqüídeos foi relatado em maio de

2003 após o nascimento de uma mula clonada a partir de células fetais (WOODS et

al., 2003). Posteriormente foi reportado, na Itália, o nascimento de uma potra

clonada a partir de células de um animal adulto (GALLI et al, 2003). O interessante

neste caso é que a doadora de células foi também a receptora que recebeu o

embrião clonado, abrindo novas perspectivas para o estudo das inter-relações

materno-fetais. A clonagem em eqüídeos é extremamente difícil, pois os ovócitos

não maturam bem in vitro, o que diminui significativamente a disponibilidade de

citoplasmas receptores de qualidade. Além disso, Woods et al. (2003) observaram

que as células eqüinas apresentam baixas concentrações de cálcio intra-celular, e

este fato seria responsável por um baixo desenvolvimento in vitro dos embriões

clonados.

Poucos laboratórios no Brasil têm se dedicado aos estudos dos processos

envolvidos na produção in vitro de embriões de eqüídeos. Ao contrário do que se

observam em bovinos, os avanços das biotécnicas em reprodução ocorrem mais

lentamente para eqüídeos. Este fato se deve principalmente a dificuldades na

obtenção de material em matadouros comerciais, ao alto custo e de manutenção dos

animais em fazendas. Entretanto, em face da dimensão e importâncias do rebanho

nacional aliado ao crescimento do mercado para o cavalo brasileiro a demanda por

técnicas que melhorem o desempenho reprodutivo e propiciem a preservação de

material genético de eqüídeos tem aumentado consideravelmente.

Desta forma o objetivo deste experimento é o de estudar o comportamento

de fibroblastos eqüinos em cultura, analisando o estado do ciclo celular e a

viabilidade das células em cultivo pré e pós-descongelação.

2- Revisão de literatura

2.1-

Transferência nuclear

A palavra clone, do grego klon, significa “broto” e foi inicialmente

empregada como definição para a reprodução assexuada de plantas, onde é

possível a produção de uma planta idêntica a partir de uma pedaço ou broto da

planta original (SEIDEL, 1983). Em animais, a clonagem pode ser definida como a

produção de indivíduos geneticamente idênticos (HEYMAN & RENARD, 1996). As

primeiras pesquisas com clonagem foram realizadas na década de 50 (século XX)

com anfíbios, e enfocaram a capacidade de uma célula embrionária individual

(doadora) em se diferenciar em um novo indivíduo após transplante para um

citoplasma receptor (BRIGGS e KING, 1952). Devidos aos inúmeros insucessos

obtidos utilizando-se células somáticas diferenciadas como doadoras de núcleo,

acreditava-se que a clonagem de vertebrados adultos não seria possível. Os

primeiros resultados considerados animadores para a clonagem em mamíferos

foram obtidos por Willadsen (1986), com o nascimento de ovinos clonados por

transferência nuclear utilizando-se células de embriões de 8 a 16 células. Entretanto,

uma vez que na clonagem realizada a partir de desagregação de blastômeros ou

bipartição não há reprogramação do núcleo dos embriões, e estes continuam seu

desenvolvimento a partir do estádio nuclear do embrião original, os blastocistos

produzidos possuem, invariavelmente, menor número total de células, o que pode

comprometer a viabilidade dos mesmos (YANG & ANDERSON, 1992; WOLF et al.,

1998).

Apesar disso, o sucesso no desenvolvimento da técnica com células

embrionárias e o crescente interesse da indústria e centros de pesquisa na

multiplicação de animais geneticamente idênticos para a redução da variabilidade

em experimentos fez com que novos estudos fossem realizados (WALES, 1995). O

relato do nascimento da ovelha Dolly (WILMUT et al.,1997), primeiro clone produzido

a partir de células somáticas reprogramadas, mostrou ser possível a produção de

cópias genômicas de um indivíduo adulto. Desde então, muitos trabalhos tem sido

desenvolvidos objetivando a utilização de células somáticas como fontes para

transferência nuclear.

A transferência de um núcleo para um óvulo fecundado enucleado

propiciou um excelente teste para averiguar se o núcleo de células somáticas seria

capaz de retornar a um estágio funcional similar ao núcleo de um zigoto original

totipotente. Esta suposição foi inicialmente sugerida por Speemann (1938) na teoria

da equivalência nuclear, onde o núcleo de células diferenciadas teria a capacidade

de iniciar e sustentar o desenvolvimento embrionário normalmente. Foram

necessárias mais duas décadas para que em 1952, Briggs & King demonstrassem

pela primeira vez, em suas pesquisas com anfíbios (Rana pipiens), que o núcleo de

células embrionárias em estádio de blástula (aproximadamente oito mil células),

após seu isolamento e direta introdução no interior do citoplasma de um zigoto

previamente enucleado, seria capaz de retornar o desenvolvimento normal até o

estádio larval de girino. Foi possível a utilização do núcleo de células da endoderme

do intestino de girinos como doador nuclear para produção de fêmeas adultas férteis

(GURDON & UEHLINGER, 1966).

Alguns estudos iniciais demonstraram a possibilidade do uso de células

somáticas para reconstrução em mamíferos, mas os embriões produzidos não

desenvolveram além das primeiras clivagens (BROMHALL, 1975). O primeiro relato

de mamíferos nascidos a partir de embriões reconstruídos foi descrito em

camundongos por Illmensee & Hoppe (1981). A técnica envolvia o isolamento do

núcleo de células da massa celular interna e a sua introdução diretamente no

citoplasma de zigotos dos quais haviam sido removidos os pró-núcleos.

McGrath & Solter (1983) são considerados os pioneiros da reconstrução

de embriões mamíferos utilizando um método não invasivo, denominado de

transferência nuclear, envolvendo a microcirurgia e fusão celular, não sendo

necessário o isolamento e injeção do núcleo no interior do citoplasma. A partir

destes experimentos, a clonagem por transferência nuclear foi inicialmente adaptada

e posteriormente aperfeiçoada para animais domésticos.

A possibilidade de estabelecimento e manutenção de culturas de células a

serem utilizadas como fonte doadora de núcleo foi fundamental para o

desenvolvimento da técnica descrita por Wilmut et al (1997), que resultou no

nascimento da ovelha “Dolly”, o primeiro clone produzido a partir de células

somáticas diferenciadas obtidas de um animal adulto.

2.2- Cultivo celular de fibroblastos

O cultivo celular se desenvolveu a partir dos últimos anos do século XIX

como uma continuação das técnicas de embriologia. O zoólogo americano Ross

Harrison (1908) é considerado o iniciador dos cultivos de tecido de animais. Por ser

o primeiro pesquisador a empregar técnicas in vitro para o estudo de fenômenos in

vivo, realizando cultivos de medula espinhal embrionária de anfíbios. Neste

experimento inicial foi possível observar o crescimento de axônios de neuroblastos,

e estabeleceu-se que o axônio se formava por expansão a partir do corpo neural e

não por fusão de uma cadeia de células.

A primeira limitação para o estabelecimento do cultivo celular foi a

obtenção de um meio nutritivo adequado. Burrows (1910) usou plasma de galinha

para nutrir os explantes de tecidos embrionários. Este meio permitiu observar o

crescimento de tecido nervoso, coração e pele. Posteriormente Burrows & Carrel

(1910) realizaram as primeiras iniciativas para estabelecer cultivos de células de

mamíferos, conseguindo manter explantes obtidos a partir de células de cães e

gatos e demonstraram que através de sub-cultivos se pode prolongar o período do

cultivo. Os meios empregados foram plasma e extrato embrionário.

Nestes estudos um dos principais fatores limitantes para o

estabelecimento de cultivos celulares era a ocorrência de múltiplas contaminações.

Entre os anos 1920 e 1940 se desenvolveram diferentes estratégias de obtenção de

cultivos e de manutenção de condições estéreis, mas sem grandes avanços e

sucessos. Somente a partir dos anos 40, com o advento dos antibióticos, se

desenvolveram numerosas aplicações para o cultivo de células. O aperfeiçoamento

dos atuais métodos de cultivo celular foi devido, em grande parte, ao grupo do

“National Câncer Institute – EUA”, liderado por Wilton Earle (1943), que foi o primeiro

a manter células em multiplicação in vitro e o primeiro a manter células em

suspensão.

Gey et al., em 1952 estabeleceram a primeira linhagem celular contínua,

células HeLa. O meio utilizado era extremamente complexo e pouco definido:

plasma de galinha, extrato de embrião de bovino e soro de cordão umbilical humano.

Eagle (1955) realizou a primeira pesquisa sistemática da necessidade de nutrientes

para o cultivo celular. No entanto, somente 10 anos mais tarde e que Ham (1965),

introduziu o primeiro meio definitivo livre de soro capaz de manter as células de

mamíferos em cultivo indefinidamente.

Células de mamíferos não são facilmente acessíveis para uma observação

detalhada em um animal intacto. Por isto, a maioria dos estudos sobre proliferação

celular em mamíferos utiliza células que crescem em cultivo. As duas maiores

vantagens da cultura de tecido são o controle fisico-químico ambiental (pH,

temperatura, osmolaridade, e a tensão de O

e CO

), que pode ser obtido de

maneira muito precisa, e as condições fisiológicas que podem ser mantidas

constantes, porem não definidas. Muitas linhagens celulares requerem

suplementação de um meio com soro ou outros constituintes indefinidos como

hormônios e outras substâncias reguladoras. A identificação de alguns dos

componentes essenciais do soro, em conjunto com o conhecimento de alguns

fatores reguladores da proliferação celular, fez com que a reposição do soro por

componentes conhecidos se tornasse possível (FRESHNEY, 2000).

Apesar dos avanços obtidos na manutenção de células somáticas em

cultivo por períodos relativamente longos, ainda existem algumas limitações. As

amostras de tecido são sempre heterogêneas. As replicações, mesmo que de um

mesmo tecido, variam em seus constituintes celulares. Depois de uma a duas

passagens, a cultura de linhagens celulares assume uma constituição mais

uniforme. Conforme as células são misturadas ao acaso a cada transferência, as

condições de cultura exercem uma pressão seletiva que tende a produzir uma

cultura homogênea dos tipos celulares mais vigorosos. A cada sub-cultura, as

amostras replicadas são idênticas às outras e as características da linhagem podem

ser perpetuadas por muitas gerações, ou mesmo indefinidamente se as células

forem armazenadas em nitrogênio líquido. A formação de uma linhagem celular de

uma cultura primaria implica em um aumento no número total de células por várias

gerações e a predominância de células ou linhagens celulares com a alta

capacidade de crescimento, resultando em um alto grau de uniformidade na

população. Normalmente o substrato é um pré-requisito para a proliferação celular

(FRESHNEY, 2000).

Mesmo em condições ideais de cultivo a maioria das células normais

mostra uma extraordinária relutância em continuar a proliferar por tempo

indeterminado. Isto as distingue das linhas celulares embrionárias. Fibroblastos

retirados de um feto normal humano, por exemplo, sofrerão cerca de 50 duplicações

em sua população quando cultivadas em um meio de cultivo padrão (MURRAY &

KIRSCHNER, 1989). No final deste período, a proliferação diminui e finalmente para,

as células entram em G0

e daí nunca mais saem. Células semelhantes retiradas de

um indivíduo de 40 anos de idade param de se dividir após 40 duplicações

aproximadamente, enquanto células de uma pessoa de 80 anos cessam após 30

duplicações. Fibroblastos de animais com uma vida média mais curta para de se

dividir após um pequeno número de divisões celulares em cultivo. Este fenômeno

tem sido chamado de senescência celular devido à sua correspondência com a

idade do organismo como um todo (MURRAY & KIRSCHNER, 1991).

Senescência celular é um assunto complicado sob vários aspectos e nem

sua função, ou seu mecanismo são conhecidos. Muitas teorias têm sido propostas

para explicar o fenômeno. Algumas sugerem, por exemplo, que ela é resultado de

um acúmulo de mutações aleatórias nocivas que refletem imprecisão na maquinaria

de reprodução celular; outras sugerem que ela é o efeito de um mecanismo que

evoluiu para nos proteger contra o câncer, limitando o crescimento de tumores

(URQUIDI et al, 2000). Há, no entanto, bons argumentos contra estas duas

interpretações. Sabe-se, porém, que a velocidade da senescência é, pelo menos

para alguns tipos de células, altamente dependente das concentrações de fatores de

crescimento no meio de cultivo. O processo aparentemente reflete alterações do

potencial proliferativo que pode ser regulado pelo ambiente celular (VARMUS &

WEINBERG, 1993)

Embora senescência ocorra de uma maneira previsível para uma dada

população de células ela não é rigorosamente programada ao patamar de célula

individual. Em um clone de fibroblastos normais aparentemente idênticos e

monitorizados sob condições padronizadas de cultivo, algumas células se dividem

muitas vezes, enquanto outras somente algumas vezes. Células individuais parecem

parar de se dividir como resultado de uma transição aleatória. Esta transição ocorre

com uma probabilidade cada vez maior em cada geração de células subseqüente

até que não haja células em proliferação na população (MURRAY & KIRSCHNER,

1989).

Muitas células de tumores apresentam uma capacidade proliferativa sem

limitações (REDDEL et al., 2000). Esta observação gerou a idéia que a senescência

replicativa atuaria como supressor tumoral in vivo. Senescência replicativa é o

progressivo declínio na habilidade proliferativa. Campisi (2001) demonstrou que a

senescência replicativa induz a uma mudança fenotípico nas células, onde os

maiores aspectos são: o controle irreversível da divisão celular; resistência a morte

apoptótica, para alguns tipos de células, e modificações da função celular tais como

mudanças na produção de moléculas (proteases, cytokinas, fatores de crescimento).

O número de divisões ao qual uma população de células senescentes esta

sujeita varia consideravelmente (CHIU & HARLEY, 1997), dependendo do tipo

celular e da espécie doadora, idade e genótipo. Este processo pode estar ligado

com o encurtamento dos telômeros (HARLEY et al., 1997; LANZA et al., 2000;

WHIKEHART et al., 2000). Há alguns anos, a proliferação celular e o encurtamento

do telômero eram os principais fatores na indução da senescência fenotípica (o

controle do crescimento irreversível, resistência a apoptose e alterações nas funções

celulares), no entanto, Campisi, (2000) mostrou evidências que certos tipos de DNA

danificados induzem células mamíferas normais a um processo de senescência. Isto

inclui danos oxidativos, ao qual pode não se limitar ao DNA e a fita dupla.

Desta forma, hoje em dia existem duvidas se o encurtamento dos

telômeros seria a causa da senescência replicativa em células de humanos, bovinos

e outras espécies. Existem várias discussões que as células podem estar adquirindo

as características senescentes por mecanismos independentes da quebra dos

telômeros. Na replicação das células humanas, há evidências que o comprimento do

telômero não necessariamente determina a senescência das células (OUELETTE et

al., 2000; CHEN et al., 1998).

2.3- Ciclo celular das células somáticas

Num organismo pluricelular, os mecanismos de divisão celular são

essenciais para permitir a embriogênese e o crescimento. Além disso, a divisão

celular assegura a reparação tissular ou celular após um ferimento que tenha

promovido uma perda de células. Mas, mesmo no estado basal em um adulto,

permanentemente, células morrem e é imperativa sua substituição (POIRIER et al.,

2003).

A vida de uma célula é ritmada pelo ciclo celular, onde cada célula de um

organismo sofre modificações cíclicas que a conduzem à divisão celular e à

formação de duas células-filhas. O ciclo celular esta dividido em 4 fases: a fase G1

(G para gap, que significa intervalo) durante a qual a célula cresce devido às

sínteses protéicas, a fase S (S para síntese) durante a qual a célula duplica seu

DNA, a fase G2 que é uma outra fase de crescimento e a fase M (M para mitose)

que representa a divisão celular propriamente dita (BRUCE et al. 2002).

Atualmente, distinguem-se dois períodos no curso da fase G1. O primeiro

período é caracterizado pela sensibilidade da célula ao meio ambiente. Nesse

momento a célula sofre a ação de substâncias que favorecem a mitose (fatores

mitogênicos) e de moléculas inibidoras como o TGF. Nesta fase as células estão

sujeitas as influências externas sobre o ciclo celular, principalmente durante a

transição G1/S. Sinais que estimulam a diferenciação fazem como que o ciclo celular

seja bloqueado e a célula entre em G0. Este bloqueio ocorre por volta da metade de

G1 que, nos mamíferos é conhecido como Ponto de Restrição. Essa fase G1

precoce termina então no ponto restrição e é seguida pela fase G1 tardia durante a

qual a célula se torna insensível ao seu meio e progride no ciclo, mesmo na

ausência do mitogênio. Essa sucessão no tempo é muito controlada, se bem que

não seja possível observar, no estado normal, fase M sem fase S. Por vezes o ciclo

celular é separado em duas fases: a interfase e a mitose. Assim, a interfase

corresponde aos três tempos G1, S e G2 (BRUCE et al., 2002).

Existem, entretanto, duas exceções nesse ciclo clássico. A primeira é

constituída pelas células embrionárias que não apresentam a fase G1, cada fase M

é imediatamente seguida por uma fase S, utilizam-se então os termos interfase e

mitose para caracterizar as fases do ciclo celular embrionário. A segunda exceção é

constituída pelas células me fase G0, células quiescentes, extraciclo, que não se

dividem mais (JESUS & WAITZBERG, 2000).

Diversos autores têm discutido a importância do estágio do ciclo celular da

célula doadora para uma eficiência na clonagem (WILMUT et al., 1997; WELLS et

al., 2003). Um aspecto epigenético importante da célula doadora de núcleo é o

estágio do ciclo celular. Progressão direta do ciclo celular requer continuas

mudanças na atividade do gene que não tem vinculo na seqüência de DNA e pode

consequentemente ser classificada como epigenético (OBACK & WELLS, 2002).

Wilmut et al. (1997) relatam que diferentes estágios do ciclo celular

podem ser mais efetivos na clonagem. O aspecto principal da coordenação do ciclo

celular entre o citoplasma receptor e o núcleo doador é a manutenção do ploidia

normal na reconstrução do embrião por transferência nuclear. Para células doadoras

que se encontram em fase S, ocorre falha no desenvolvimento embrionário por

causa da fragmentação parcial do DNA replicado e incorreta ploidia cromossômica.

Entre os estágios de divisão celular da célula doadora de núcleo os que são

compatíveis com a manutenção da ploidia são principalmente as, Fases G0/G1

(COLLAS et al., 1992).

Na fase G0/G1 a cromatina doadora ainda não foi replicada, e os

cromossomos não estão prontos para segregar. Ambas as fases, quiescentes - G0 e

proliferativa - G1, tem sido utilizadas com sucesso para produção de clones a partir

de células somáticas. O uso de células em G0 foi a maior contribuição para o

primeiro sucesso de nascimentos de clones animais por transferência nuclear com

cultura de células diferenciadas de ovinos (CAMPBELL et al., 1996).

A importância do estágio do ciclo celular foi questionada, pois a seleção

ao acaso de células doadoras, a partir de culturas sem privação de soro, também

resultou em totipotência após transferência nuclear em bovinos (CIBELLI et al.,

1998) e camundongos (WAKAYAMA & YANAGIMACHI, 1999). No entanto, nenhuns

destes estudos determinaram o estágio exato do ciclo celular que resultaram em

baixa proporção de embriões reconstruídos desenvolvendo-se ate gestações viáveis.

Wells et al (2003) comparou a eficiência da clonagem nuclear de células

doadoras em fase G0 e G1 do ciclo celular e demonstrou a coordenação entre o tipo

de célula doadora e o estágio do ciclo celular pode ser crítico para melhorar a

eficiência da clonagem nuclear.

Oback & WELLS (2002) cita que no caso de células em G0, não se aplica

um marcador para este estágio de ciclo celular durante os experimentos de

transferência nuclear. Células em G0 são usualmente obtidas depois da privação de

soro ou cultura em alta confluência para induzir a inibição por contato. A citometria

de fluxo tem sido uma eficiente ferramenta para analise do ciclo celular. A marcação

com iodeto de propídio (PI) é utilizado na marcação para distinguir a fase G0 da G1

do ciclo celular (YU, et al., 2003).

2.4- Morte celular por apoptose

A morte celular ocorre de duas formas bioquimicamente e

morfologicamente distintas, a “morte celular acidental”, necrose e a “morte celular

programada”, apoptose. A apoptose é um dos fenômenos biológicos de maior

relevância em diferenciação celular e tecidual, organogênese e desenvolvimento

normal e patológico, funcionando como sistema controlador da homeostase através

da eliminação não inflamatória de células desnecessárias ou irreversivelmente

lesadas. É um “tipo de autodestruição celular” que requer energia e síntese protéica

para a sua execução, e exerce um papel oposto ao da mitose (BARCINSKI, 1998).

A apoptose depende de um programa multigênico de “suicídio celular” que

é ativado quando uma dada célula deve desaparecer. É um fenômeno controlado

por interações multicelulares diretas e por ligantes solúveis com propriedades

ativadoras ou supressoras cujos mecanismos transdutores de sinais ainda não estão

bem esclarecidos (WELBURN et al., 1997). A mitocôndria tem a habilidade de

desencadear a apoptose, liberando para o citoplasma proteínas pró-apoptóticas,

como o citocromo c e Fator Indutor de apoptose. Usando células em cultura,

transfectadas através de vetores virais, foram estudadas duas proteínas (BAX e bcl-

2) que regulam a liberação mitocondrial de fatores pró-apoptóticos. Um

entendimento melhor da regulação mitocondrial da apoptose permitirá a elaboração

de estratégias mais adequadas para promover ou prevenir esta forma de morte

celular (KOWALTOWSKI et al., 2002)

Fisiologicamente, esse “suicídio celular” ocorre durante o desenvolvimento

embrionário, na organogênese, na renovação epitelial e hematopoiética, na

involução cíclica dos órgãos reprodutivos da fêmea, na atrofia induzida pela remoção

de fatores de crescimento ou hormônios, na involução de alguns órgãos e ainda na

regressão de tumores. Portanto consiste em um tipo de morte programada,

desejável e necessária que participa na formação dos órgãos e que persiste em

alguns sistemas adultos como a pele e o sistema imunológico (URQUIDI et al.,

2000).

A apoptose é um processo rápido, que se completa em aproximadamente

3 horas e não é sincronizado por todo o órgão, portanto diferentes estágios de

apoptose coexistem em diversas secções dos tecidos. Devido à taxa rápida de

destruição celular é necessário que apenas 2 a 3% das células estejam em

apoptose em determinado momento para que se obtenha uma regressão substancial

de tecido, atingindo mesmo a proporção de 25% por dia (AMEISEN et al., 1995).

As moléculas protéicas envolvidas na indução da apoptose são

constitutivamente expressadas nas células dos mamíferos, mas normalmente são

inativadas por outras proteínas, conhecidas como proteínas anti-apoptóticas, que

são sintetizadas pela mesma célula, possivelmente em resposta aos chamados

sinais de sobrevivência recebidos das células vizinhas, substratos extracelulares, ou

líquido extracelular. Esses sinais de sobrevivência são fatores de crescimento, a

matriz extracelular e diversos hormônios. A perda desses fatores inicia

espontaneamente a apoptose (JONES, 2000).

Morfologicamente, a célula em apoptose se encolhe e o citoplasma fica

mais denso e a cromatina se condensa. Em seguida o núcleo se fragmenta, ao

mesmo tempo em que a membrana emite projeções e forma brotamentos com

fragmentos do núcleo. Este brotamento termina com a fragmentação da célula em

corpos apoptóticos, que são endocitados por células vizinhas (ALBERTS, 2004).

Nas espécies de mamíferos, sabe-se que as proteínas codificadas pela

família bcl-2 de genes são inibidores da apoptose. Genes afins foram detectados em

animais inferiores como a mosca das frutas (Drosophila spp.) e em nematódos

(Ceaenorhabditis elegans). A conservação dos genes que regulam a apoptose em

faixa tão ampla de espécies filogenéticas atesta sua importância vital na biologia

(ALBERTS et al., 1997).

A detecção da apoptose pode ser realizada por métodos diretos e

indiretos. Microscopicamente ocorre fragmentação nuclear e celular em vesículas

apoptóticas. Diferente da necrose, não existe liberação do conteúdo celular para o

interstício e portanto não se observa inflamação ao redor da célula morta. Outro fato

importante e a fragmentação inter-nucleossômica do DNA, sem nenhuma

especificidade de seqüência, porém mais intensamente na cromatina em

configuração aberta; conseqüência da atividade de uma endonuclease. Essa

fragmentação característica do genoma pode ser identificada in situ pela técnica de

TUNEL (Terminal deoxinucleotidil transferase Uracil Nick End Labeling). A

fragmentação do DNA pode ser também visualizada laboratorialmente pela

eletroforese do DNA em gel de agarose, produzindo o clássico “padrão em escala”,

com a formação de bandas contendo múltiplos de 180-200 pb (ALBERTS et al.,

2002). Alem disso, os testes para ocorrência de apoptose podem evidenciar os

caminhos estruturais e funcionais utilizados pelas células, detectando a presença de

genes relacionados com a apoptose (como o bcl-2 e p53), bem como metabólitos

resultantes da expressão destes genes, como a caspase (GRIFFIN & HARDWICK,

1997; HOORNAERT et al., 1997; NEGOESCU et al, 1997; PETIT et al., 1995). Alem

do teste TUNEL existem várias outras Técnicas imunocitoquímicas que determinam

a ocorrência da apoptose,

A anexina V é uma proteína de 37KD com capacidade de se ligar

fortemente aos fosfolípides de carga negativa na superfície celular na presença de

íons cálcio. Nos estudos de ativação plaquetária, a anexina V se liga à superfície

das plaquetas ativadas e é considerada um marcador sensível, à medida que a

porcentagem de plaquetas positivas para anexina V apresenta relação direta com a

expressão das glicoproteínas CD62p e CD63 (LANDI et al., 2003).

Um evento presente na apoptose é a perda da simetria da membrana

plasmática. É conhecido que a apoptose é um processo de morte no qual a

integridade da membrana se mantém, o que significa que a característica de ser

semipermeável esta presente. No entanto, esta membrana passa a apresentar

mudanças em sua simetria. Segundo Benjamim et al., (1998), este é o caso da

distribuição da fosfatidil serina, a qual é uma molécula que normalmente se encontra

orientada para a face citoplasmática da membrana celular externa. Quando a célula

entra em processo de morte celular por apoptose, um dos eventos é a exposição da

fosfatidil serina para o exterior da membrana celular. Devido esta mudança na

simetria da célula, têm se desenvolvido métodos que permitem detectar a presença

de fosfatidil serina no exterior da membrana. Como a anexina V é uma molécula que

não é capaz de difundir através da membrana e que tem uma alta afinidade pela

fosfatidil serina, somente células com exposição da fosfatidil serina na face da

membrana voltada para o meio extracelular, e poretanto, em apoptose, serão

marcadas com anexina V (WALS et al., 1998).

Segundo Moreno (2000) a coloração com anexina V pode ser

acompanhada de uma marcação com iodeto de propídio, a qual nos permite saber

se a integridade da membrana foi perdida. Esta marcação dupla permite a

identificação de células que se encontram em uma etapa inicial ou tardia da morte

celular. O grupo com morte celular tardia deve ser individualizado, pois envolve tanto

células em estágios avançados de apoptose, como células em necrose. A anexina V

conjugada se liga a fosfatidil serina em superfície de células apoptoticas na

presença de Ca

, mas pode passar diretamente a membrana compromissada de

células mortas se ligando a fosfatidil serina no interior de células com lise de

membrana plasmática como no caso da necrose (ENGELAND et al., 1998).

2.5- Criopreservacão e apoptose

A criopreservação tem permitido a preservação de células por tempo

prolongado e mantém as propriedades biológicas destas depois de descongeladas.

A tecnologia desenvolveu protocolos de congelação/descongelação eficientes que

permitem preservar células e tecidos a temperaturas até -196

C usualmente com

mínimo efeito deleterio na sua estrutura e funcionalidade.

Vários trabalhos relatam a contribuição da criopreservação na indução de

apoptose em numerosos sistemas de cultivo, incluindo fibroblastos, hepatócitos,

células renais, etc. Os métodos de congelação podem induzir significantemente a

morte celular, danificação do tecido e expressão de proteínas de estresse. Tem se

observado que morte celular que ocorre neste caso, não é somente a necrose mas

também a apoptose (INDRA et al., 2006).

Indra et al. (2006) estudou a indução de apoptose e expressão de

proteínas de estresse em células bTC-tet criopreservadas utilizando a citometria de

fluxo e microscopia confocal. Neste estudo foram analisadas a ativação da caspase-

8, a exteriorização da fosfatidilserina, e o estágio da fragmentação do DNA. Os

dados sugerem que a exteriorização da fosfatidilserina ocorreu ao mesmo tempo em

que a ativação caspase-8 após congelamento, sendo que a fragmentação do DNA

ocorreu somente 24-48 h mais tarde. Além disso, os níveis da ativação caspase-8

não diminuíram ao longo do tempo, mas a exteriorização da fosfatidilserina retornou

ao estado basal após 48 h.

Baust & Baust (2006), investigaram a membrana celular como um sitio

iniciador para apoptose induzida pela criopreservação, especialmente focando o

envolvimento do FAS (receptor de superfície que sinaliza apoptose).

Alterações

substanciais da membrana celular durante o processo de congelamento, levam a

ativação da FAS, resultando na ativação da cascata da caspase com um papel

significante na morte celular.

Harding et al. (2006) cita que a criopreservação pode influenciar a

atividade metabólica e função celular mesmo em temperaturas extremamente baixas

(-196ºC). O processo de criopreservação pode induzir vários estresses, pela

formação de gelo intracelular, choque osmótico ou toxicidade dos crioprotetores. O

estresse oxidativo parece ser particularmente importante por resultar na formação de

radicais livres durante a crio-injuria causando dano irreversível e disfunção celular.

3- Objetivos

Este trabalho tem como objetivo principal estudar alguns fatores

envolvidos no cultivo celular de fibroblastos eqüinos. Para tanto será:

1) Comparada a eficiência da realização de cultivos primários de

fibroblastos antes e após a congelação, analisando-se a

viabilidade celular através de microscopia ótica e citometria de

fluxo;

2) Analisado o efeito da cultura até confluência e da privação de

soro por diferentes períodos na viabilidade celular e índice de

apoptose das células pré e pós-congelação;

3) Determinando o melhor momento para a sincronização do ciclo

celular antes e após a congelação, utilizando os dados de

viabilidade e índices de apoptose das células cultivadas até a

confluência ou expostas a privação de soro

4- Material e métodos

4.1- Obtenção das amostras

Foram coletadas amostras de pele de 6 animais adultos, sendo 3 machos

e 3 fêmeas eqüinas (propriedade do Departamento de Reprodução Animal e

Radiologia Animal FMVZ – UNESP, Botucatu – SP, Brasil). As amostras foram

coletadas da região da escápula, onde era realizada tricotomia no local seguido de

assepsia com álcool 70%. Com o uso de tesoura cirúrgica, as amostras foram

obtidas com um diâmetro de aproximadamente 0,5 cm

de comprimento por 3 mm

de profundidade (figura 1) . As amostras coletadas foram colocadas em uma placa

de petri de vidro contendo PBS 0,1M (solução tampão fosfato sem cálcio e

magnésio) com um pH de 7,4 e levado ao laboratório (figura 2).

No laboratório as amostras foram transferidas para uma nova placa de

petri contendo PBS mais penicilina (100UI/mL), sendo subdivididas em fragmentos

de aproximadamente 1mm

com o

auxilio de lâmina nº. 11 de bisturi tipo Bard-Paker.

Os fragmentos foram então lavados em tubo de centrifuga de 15 mL contendo PBS

mais penicilina para realizar a lavagem do tecido.

Foram realizadas três lavagens consecutivas, com o auxílio de um

agitador de tubos, e desprezando o PBS a cada lavagem.

Todos os procedimentos realizados no laboratório foram feitos dentro de

um fluxo laminar horizontal.

Figura 1- Região da Escápula

onde foi obtido o fragmento de

Pele

Figura 2 – Fragmento de

Pele obtido foi colocado em

uma placa de Petri contendo

PBS 0,1M com um pH de 7,4

4.2- Cultivo primário de fibroblastos

Após a lavagem das amostras de tecido, estas foram distribuídas em

número de seis fragmentos por garrafa de cultivo. O tecido foi cultivado em garrafa

de cultivo de 25 cm

específico para cultivo primário. Antes de inserir os fragmentos

nas garrafas, o fundo destas foi umedecidos com 1 mL de SFB (Gibco, 12657-029).

Logo após este passo os fragmentos foram adicionados e as garrafas inclinadas na

posição vertical sendo adicionado cinco mL de meio de cultivo completo DMEM alta

glicose (Gibco 11995-065) mais 10% SFB, 100UI/ml Penicilina / 100µg/ml

Estreptomicina (Sigma, P3539) e 3,0µg/ml Anfotericina B (Sigma, A9528). Os

fragmentos foram então incubados durante meia hora em estufa a 38,5Cº em

atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5%CO

, para favorecer sua adesão à

superfície. Após este período as garrafas foram viradas para a posição horizontal,

fazendo com que o meio de cultivo entrasse em contato com o tecido (figura 3).

As garrafas foram monitoradas a cada 24h para acompanhamento do

crescimento celular, onde após 7 dias de cultivo observou-se o início do crescimento

celular. Neste momento se realizou a primeira troca completa de meio. Uma vez que

se iniciou o crescimento celular ao redor dos fragmentos, o meio de cultivo foi

trocado a cada 3 dias. Quando 70% do fundo da garrafa de cultivo apresentou-se

coberto por células (este processo é chamado de subconfluência), essa cultura

primária foi subcultivada (figura 4).

200x

Figura 3 – Estufa de cultivo

contendo garrafas de 25cm

com células em cultivo

primário

Figura 4 – Fibroblastos em

cultivo primário atingindo a

subconfluência

4.3- Subcultivo

Após aproximadamente 3 semanas de cultivo as células atingiram

subconfluência de 70%. Após este período realizou-se a primeira passagem ou o

primeiro repique celular.

As passagens foram realizadas através do processo de tripsinização, que

consiste da adição de tripsina, para que ocorra o rompimento das junções entre as

células e estas se soltem do fundo da garrafa. O meio de cultivo das garrafas foi

descartado, e adicionado em seguida 1mL de tripsina (solução de tripsina a 0,2% e

versene 0,02%). Após o descarte da tripsina com o resíduo do meio de cultivo

antigo, foram adicionados 3mL de solução de tripsina (solução de tripsina 0,2% e

Versene 0,02%) a 37ºC, e as garrafas foram levadas para a estufa de cultivo por 5

minutos para que as células se soltassem do fundo da garrafa. Com a células em

suspensão, foram adicionados 4 mL de meio de cultivo contendo DMEM alta glicose

(Gibco 11995-065) mais 20% SFB, 100UI/ml Penicilina / 100µg/ml Estreptomicina

(Sigma, P3539) e 3,0µg/ml Anfotericina B (Sigma, A9528). Em todos os

procedimentos de passagens e ressuspensão das células foi utilizado 20% de SFB,

para inibição da ação da tripsina.

Após a ressuspensão, uma alíquota das células foi corada com azul de

trypan que cora em azul as células mortas, e realizada a contagem do número de

células por ml na garrafa com o auxílio de uma câmara de “Neubauer”.

Após o estabelecimento do número de células por ml nas garrafas, foi

realizada a primeira passagem, utilizando-se de uma concentração final de 2,0 x 10

células por ml e completando o meio de cultivo da garrafa para 5 ml de meio de

cultivo. Esta concentração era utilizado todas as vezes que se realizavam alguma

passagem.

A segunda passagem foi realizada quando as células do cultivo primário

da primeira passagem atingiram 70% de confluência, que levou em média uns 7

dias. O meio de cultivo completo foi trocado 2 dias após as passagem por um meio

de cultivo com SFB na concentração de 10%.

Quando se obteve uma monocamada de células com 70% de confluência

na segunda passagem estas foram criopreservadas para criação de um banco de

células e estudos da viabilidade das células pós-descongelação.

4.4- Criopreservação

As células das garrafas da segunda passagem foram ressuspendidas em

3 ml de solução de tripsina (solução de tripsina 0,2% e Versene 0,02%) seguindo o

mesmo processo realizado para a tripsinização no subcultivo pós as células serem

ressuspendidas, a ação da tripsina era bloqueada com a adição de meio de cultivo

completo com 20%SFB.

Foi realizada a contagem das células em câmara de “Neubauer”. Para o

congelamento foi utilizada uma concentração final de 2x10

células por mL.

Conhecendo a concentração das células, foi então preparado o meio de

congelação, composto de Meio de cultivo completo (DMEM alta glicose (Gibco

11995-065) mais 20% SFB, 100UI/mL Penicilina / 100µg/mL Estreptomicina (Sigma,

P3539) e 3,0µg/mL Anfotericina B (Sigma, A9528) mais 10% do crioprotetor DMSO

(Sigma – D2650).

A suspensão de células foi acondicionada em um tubo de centrifuga de 15

ml, centrifugada por 5 minutos a 500g. O meio sobrenadante foi descartado e o

pellet de células ressuspendido em meio com crioprotetor a uma concentração final

de 2x10

células por mL. As amostras foram colocadas em criotubos de 1mL,

devidamente etiquetado, contendo a linhagem celular, passagem, concentração de

células por mL e a data de congelamento.

As ampolas foram então colocadas em um suporte para ampolas

devidamente identificadas, e este suporte foi colocado em um tubo de congelação, e

levado a um Freezer -70ºC por 24h para que ocorra uma congelação lenta das

células. Após este período as células eram retiradas do freezer -70ºC e colocadas

rapidamente em botijão de nitrogênio líquido.

Uma ampola de cada amostra foi descongelada para análises posterior.

No processo de descongelação, a ampola é retirada do nitrogênio e colocada

rapidamente em água a 37ºC e aguardado por 5 minutos, agitando lentamente a

ampola para que o descongelamento seja uniforme. Após o conteúdo da ampola era

colocado em um tubo de centrifuga de 15 mL e adicionado 5mL de meio de cultivo

completo com 20% SFB para retirar o resíduo de DMSO que é tóxico para a célula.

O tubo era centrifugado por 5 minutos a 500g. O sobrenadante era descartado e o

pellet ressuspendido em 5 mL de meio de cultivo completo mais 20%SFB. Após, era

realizada a contagem das células. As células eram diluídas numa concentração de

5x10

células por ml e distribuídas nas garrafas de cultivo e levadas em estufa com

ambiente controlado.

4.5- Caracterização imunocitoquímica

A linhagem celular em segund passagem de todos os seis animais foram

ressuspendida e encaminhada a área de Patologia do Departamento de Clínica

Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Unesp, Botucatu –

SP, foram fixadas em laminas histológicas com o uso de álcool absoluto após serem

centrifugadas em cito centrifuga (200g por 4minutos).

As linhagens celulares (cultivo primário) isoladas a partir de fragmentos de

pele de eqüino adulto foram avaliadas por imunocitoquímica utilizando-se

marcadores celulares específicos de filamentos intermediários do citoesqueleto. Os

anticorpos primários empregados foram: anti-vimentina (figura 5) para células de

origem mesenquimal (VIM3B4, Dakocytomation, m7020) e anti-citoqueratina (figura

6) para células epiteliais (AE1AE3, Dakocytomation). A reação imunocitoquimica foi

demonstrada a partir do uso do kit avidina–biotina–peroxidase (ABC,

DakoCytomation, K0377). A marcação foi visualizada utilizando-se como cromógeno

Diaminobenzidina (Liquid DAB, DakoCytomation, código K3466), e contra-corada

com hematoxilina de Harris.

200x 200x

Figura 5 – Células positivas para

anti-vimentina aparecem em

coloração acastanhada

Figura 6 – Células negativas para

anti-citoqueratina aparecem em

coloração azulada

4.6- Grupos experimentais

Foram analisadas células obtidas de pele coletada de 06 animais, sendo

03 machos e 03 fêmeas adultas. Os testes foram realizados para os fibroblastos em

cultivo primário antes e após congelação. Os experimentos consistiam da análise da

viabilidade das células, período do ciclo celular e estudo da apoptose através da

citometria de fluxo para células em privação de soro (0,5%) e para células em

confluência.

A privação de soro consiste na redução do soro fetal bovino do meio de

cultivo utilizado (DMEM alta glicose (Gibco 11995-065) mais 10% SFB, 100UI/ml

Penicilina / 100µg/ml Estreptomicina (Sigma, P3539) e 3,0µg/ml Anfotericina B

(Sigma, A9528) para 0,5%, e as analises para privação de soro foi realizado para os

tempos de 24,48,72,96,120, 144 e 168hs.

A confluência consiste em permitir que o tapete de células em crescimento

na garrafa de cultivo ocupem todo o espaço, chegando o momento em que elas

param de se dividirem, neste momento foi realizado a análise. O meio de cultivo

utilizado para a confluência foi DMEM alta glicose (Gibco 11995-065) mais 10%

SFB, 100UI/ml Penicilina / 100µg/ml Estreptomicina (Sigma, P3539) e 3,0µg/ml

Anfotericina B (Sigma, A9528).

4.7- Viabilidade celular

A análise da viabilidade consistiu da marcação das células por

cromógenos fluorescentes. No período determinado do experimento para privação

(24,48,72,96,120,144 e 168hs) e para confluência (quando o tapete de células se

ocupem o espaço da garrafa por completo), o meio de cultivo da garrafa foi

removido, e era adicionado 0,5ml de PBS acrescida de 20µl de solução de Hoescht

33342 (10mg/ml), aguardado-se 30 minutos. Após este período era adicionado 5 µl

de solução de Iodeto de Propídio (1,0mg/ml) e aguardado por 5 minutos antes de

realizar a leitura. A leitura foi realizadas em microscopia de fluorescência (filtro azul,

excitação: 450 a 490nm, aumento de 400X). Células viáveis se apresentavam com o

núcleo em uma refringência azul brilhante. Células com membrana lesada se

apresentavam com o núcleo em uma refringência vermelha brilhante, devido a

penetração do iodeto de propídio (figura 7).

Figura 7 – Células em azul (viáveis) e células em vermelho (membrana lesada)

4.8- Ciclo celular

A análise do ciclo celular foi realizada de acordo com o protocolo

modificado descrito por Boquest et al., 1999.

As células foram ressuspendidas em 3 ml de solução de tripsina a 37ºC e

a tripsina foi bloqueada com a adição de meio de cultivo completo com 20%SFB. As

células foram contadas e a concentração ajustada para 100.000 cél/ml. Em seguida

as células foram centrifugada por 10 minutos a 500g, o pellet ressuspendido em 1ml

de “Cold GM” (glucose 6,1mM, NaCl 137mM, KCl 4,4mM, Na

HPO

1,5mM, KH

0,9mM, EDTA 0,5mM), adicionando-se lentamente 3ml de etanol a 4ºC e agitando

lentamente. As células foram fixadas por 30 minutos. Após este período, foram

centrifugadas e lavadas em PBS contendo 5mM EDTA e ressuspendidas após

lavagem, com 1ml de PBS 5mM EDTA, 50µg/ml de iodeto de propídio (PI) e

200x

0,3mg/ml de RNase A. Posteriormente a suspensão foi incubado por 1 hora em

temperatura ambiente.

A leitura foi feita utilizando-se de um Citômetro de fluxo FACS Calibur da

(figura 9), do Hemocentro da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp, SP,

Brasil. Os resultados obtidos demonstravam em qual o período do ciclo celular as

células se encontravam, G0/G1, S ou G2 e os dados eram apresentado em

porcentagem (figura 8).

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 30 60 90 120 150

Figura 8 – Histograma do Ciclo Celular – Exemplo de resultado para uma das

amostras

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

File analyzed: confi 182

ciclo_01.001

Date analyzed: 25-Apr-2006

Model: 1DA0n_DSF

Analysis type: Manual analysis

Diploid: 100.00 %

Dip G1: 86.34 % at 49.39

Dip G2: 0.00 % at 99.81

Dip S: 13.66 % G2/G1: 2.02

%CV: 19.32

Total S-Phase: 13.66 %

Total B.A.D.: 1.22 %

Debris: 2.51 %

Aggregates: 0.52 %

Modeled events: 10241

All cycle events: 9931

Cycle events per channel: 193

RCS: 2.751

Figura 9 - Citômetro de fluxo FACS Calibur da BD

4.9- Análise da apoptose

A detecção da apoptose foi realizada através da marcação da célula com

o anticoagulante anexina V que é uma proteína com propriedades de ligação aos

fosfolipídios como a fosfatidilserina. Em células normais a fosfatidilserina esta

localizada na região interna da membrana plasmática. Com a morte celular a

fosfatidilserina é translocada para a região externa da membrana, ficando exposta a

marcadores celulares como a anexina V. Diferentes opções de anexina V marcadas

podem ser utilizadas para detecção de células apoptóticas.

Como a translocação da fosfatidilserina também ocorre em processos de

necrose, utilizou-se o iodeto de propídio, que tinge as células necrosadas,

permitindo a diferenciação dos dois processos.

As células foram ressuspendidas em 3 ml de solução de tripsina a 37ºC e

a tripsina foi bloqueada com a adição de meio de cultivo completo com 20%SFB.

Após realizado a contagem, as células foram centrifugadas por 10 minutos

a 500g e ressuspendidas em uma concentração de 1x10

cél/ml em solução tampão

( 10mM HEPES, 140mM NaCl, 2,5mM CaCl

, pH 7,4). Desta concentração foi

retirada 100µl (1x10

cél/ml) e colocada em um novo tubo de centrífuga. Em seguida,

foi adicionado 5µl de anexina V (anexina V conjugada com Alexa Fluor

488,

Molecular Probes™ - A13201) e 1µg/ml (1,5µM) de iodeto de propídio. As amostras

foram incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente. Após este período foi

adicionado 400µl de solução tampão a 4ºC.

A leitura das amostras foi realizada utilizando-se de um Citômetro de fluxo

FACS Calibur da BD

, no Hemocentro da Faculdade de Medicina de Botucatu,

Unesp, SP, Brasil.

Os resultados obtidos demonstravam a porcentagem da população de

células vivas em necrose e em apoptose. Durante a leitura, as células vivas se

apresentavam sem nenhuma marcação. Células em apoptose se apresentavam com

marcação positiva para anexina V e negativa para iodeto de propídio. Células em

necrose se apresentavam positivas para anexina v e iodeto de propídio, ou

negativas para anexina V e positivas para iodeto de propídio (figura 10).

Figura 10 – Histograma da análise de apoptose - Exemplo de resultado para uma

das amostras

File: 172 anex 24hs04.001

Acquisition Date: 31-Aug-

Gate: G1

Gated Events:

9203

Total Events:

10200

Quad Events % Gated % Total

13 0.14 0.13

292 3.17 2.86

LL 7856 85.36

77.02

1042 11.32

10.22

LEGENDAS

Inferior Esquerdo: Células Vivas

Inferior Direito: Células em Apoptose

Superior Direito: Células em Necrose

Superior Esquerdo: Células em Necrose

4.10- Metodologia estatística

Para todas as variáveis foi utilizado o teste de Friedman na comparação

dos momentos, seguido do teste para comparações múltiplas, uma vez que as

mesmas não apresentaram distribuição normal ou homogeneidade de variâncias. O

nível de significância utilizado foi de 5%.

O modelo de regressão segmentada consiste em duas partes: uma reta

inclinada ascendente ou descendente seguida de uma linha horizontal, onde seus

pontos de interseção vão determinar o ponto de quebra. Este modelo de uma

inclinação é mais adequado para estimar parâmetros de crescimento. Para outros

tipos de variáveis biológicas, a equação do modelo de regressão segmentada

descreve duas linhas de interseção, ambas com inclinação diferente a zero.

O modelo de regressão utilizado é do tipo:

Yi = L + U(R-XLRi) + ei, i=1,2...ni, ni+1, ..., n

Cujo (R-XLRi) = 0 para i ≥ n1+1, e n1 é o número de observações até o

ponto de quebra, e n é o número de pares de observações.

5- Resultados

5.1- Viabilidade Celular

5.1.1- Teste Pré-Congelação

Os resultados do teste da viabilidade pela metodologia de marcação das

células por cromógenos fluorescentes, com células antes do congelamento estão

expressos na tabela 1 (células vivas), tabela 2 (células mortas) e figura 11.

Durante todo o período de privação de soro (24,48,72,96,120, 144 e

168hs), as taxas de viabilidade celular se mantiveram altas e superiores, em relação

às mortas. Em relação ao teste de confluência, as taxas de células vivas foram

numericamente mais altas quando comparadas com a privação de soro. No entanto,

não houve diferença estatística entre os grupos de privação de soro e a confluência

no que diz respeito ao índice de células vivas ou mortas.

Tabela 1: Índice de Viabilidade no Pré-congelação para os grupos de privação de

soro e a confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 82,0 70,0 89,0

48 81,5 77,0 89,0

72 86,0 74,0 91,0

96 81,5 69,0 89,0

120 81,5 79,0 84,0

144 81,0 80,0 87,0

168 84,0 70,0 88,0

Confluência 95,0 87,0 96,0

(P = 0,210) – O valor do P se refere a comparação entre os momentos

Tabela 2: Índice de células Mortas no Pré-Congelação para os grupos de privação

de soro e a confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 18,0 11,0 30,0

48 18,5 11,0 23,0

72 14,0 9,0 26,0

96 18,5 11,0 31,0

120 18,5 16,0 21,0

144 19,0 13,0 20,0

168 16,0 12,0 30,0

Confluência 5,0 4,0 13,0

(P = 0,210)

Figura 11 – Viabilidade Celular – Teste Pré-congelação (aumento 200x) – Relação

entre o tapete de células e a marcação com o cromógeno fluorescente para os

grupos de privação de soro e confluência

Tapete de Células Tempo Marcação com o cromógeno

24h

48h

72h

96h

120h

144h

168h

Confluência

Viabilidade Celular

5.1.2- Teste Pós-Congelação

Os resultados do teste da viabilidade com células após o descongelação

estão expressos na tabela 3 (células vivas), tabela 4 (células mortas) e figura 12.

As taxas de células vivas se mantiveram altas e iguais tanto nos tempos

de privação de soro com no teste de confluência. Novamente não houve diferença

estatística entre os grupos.

Tabela 3 - Índice de Viabilidade no pós-descongelação para os grupos de privação

de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 94,0 87,0 94,0

48 87,0 86,0 95,0

72 91,5 91,0 94,0

96 94,0 86,0 100,0

120 95,0 89,0 97,0

144 92,0 90,0 95,0

168 91,5 86,0 94,0

Confluência 93,0 89,0 95,0

(P = 0,661) – O valor do P se refere a comparação entre os momentos

Tabela 4 - Índice de células mortas no pós-descongelação para os grupos de

privação de soro e confluência

Momento

(h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 6,0 6,0 13,0

48 13,0 5,0 14,0

72 8,5 6,0 9,0

96 6,0 0,0 14,0

120 5,0 3,0 11,0

144 8,0 5,0 10,0

168 8,5 6,0 14,0

Confluência

7,0 5,0 11,0

(P = 0,661)

Quando foi comparado o teste de viabilidade no período pré e o pós-

congelação, não foram observadas diferenças entre a média ou a porcentagem de

células viáveis e mortas.

Figura 12 – Viabilidade Celular – Teste Pós-congelação (aumento 200x) - Relação

entre o tapete de células e a marcação com o cromógeno fluorescente para os

grupos de privação de soro e confluência

Tapede de células Tempo Marcação com o cromógeno

24h

48h

72h

96h

120h

144h

168hs

Confluência

5.2- Citometria de Fluxo

5.2.1- Anexina V - Teste Pré-Congelação

Os resultados do teste de Anexina V com células antes do congelamento

estão expressos na tabela 5 (células vivas), tabela 6 (células em apoptose), tabela 7

(células em necrose) e figura 13.

O índice de células vivas demonstrado na tabela 5, foi elevado tanto para

o teste de privação de soro como para a confluência. Não houve diferença

estatística entre os momentos de privação de soro ou a confluência.

Tabela 5 - Células vivas avaliadas através do teste de Anexina V no pré-congelação

para os grupos de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 94,7 91,9 96,6

48 95,0 93,8 96,2

72 96,2 91,3 96,9

96 92,9 91,3 93,6

120 91,8 88,3 95,5

144 89,7 85,7 92,8

168 91,8 90,7 96,9

Confluência 91,1 86,5 94,6

(P = 0,309) – O valor do P se refere a comparação entre os momentos

Para o teste de apoptose (tabela 6), as taxas foram baixas em todos os

grupos, tanto para privação como para confluência, no entanto, houve diferença

estatística para o tempo de 96hs de privação, período onde se iniciou a

sincronização do ciclo celular (Gráfico 1), onde ocorreu uma pequena redução na

taxa de apoptose. Não houve diferença quando comparado o teste de privação de

soro com a confluência para a apoptose.

Tabela 6 – Apoptose avaliada através do teste de Anexina V no pré-congelação para

os grupos de privação de soro e confluência

Momento

(h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 4,5

2,9 7,3

48 1,8

1,2 2,2

72 1,7

1,2 2,6

96 1,2

1,2 1,3

120 3,2

1,5 4,3

144 6,8

3,4 9,1

168 6,3

2,1 7,5

Confluência

3,2

1,6 8,2

(P = 0,009)

A, B - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

No teste para necrose, entretanto, houve um crescimento significativo

estatisticamente na taxa de necrose no período de 96hs, voltando a se reduzir nos

próximos períodos (tabela 7). Quando comparado o teste de privação de soro com a

confluência, não houve diferença nas taxas de necrose.

Tabela 7 - Necrose avaliada através do teste de Anexina V no pré-congelação para

os grupos de privação de soro e confluência

Momento

(h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 0,6

0,4 1,2

48 2,2

1,1 3,8

72 2,7

0,6 7,1

96 5,7

5,1 7,4

120 3,5

2,3 7,9

144 3,5

2,4 5,1

168 1,4

0,9 2,5

Confluência

3,9

1,9 10,6

(P = 0,008)

A, B - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

Figura 13 - Anexina V - Teste Pré-Congelação

LEGENDAS

Inferior Esquerdo: Células Vivas

Inferior Direito: Células em Apoptose

Superior Direito: Células em Necrose

Superior Esquerdo: Células em Necrose

5.2.2- Anexina V - Teste Pós – Congelação

Os resultados do teste de Anexina V com células após o congelamento

estão expressos na tabela 8 (células vivas), tabela 9 (células em apoptose), tabela

10 (células em necrose) e figura 14.

As taxas de células vivas demonstradas na tabela 8 foram altas tanto para

o teste de privação de soro como para a confluência. No entanto, houve diferença

estatística entre os grupos de privação e confluência. A menor taxa foi às 24hs,

sendo que, após este período, as taxas tenderam a aumentar, chegando à taxa mais

alta às 72 horas, e se estabilizando após este período.

Tabela 8 – Células vivas avaliadas através do teste de Anexina V no pós-congelação

para os grupos de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 90,9

87,5 93,9

48 96,6

93,2 97,9

72 98,8

98,6 99,1

96 94,2

93,2 95,3

120 96,9

94,1 97,5

144 95,3

94,4 96,5

168 95,9

94,3 96,2

Confluência 96,3

95,8 97,3

(P = <0,001)

A, B, C - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

Para o teste de apoptose (tabela 9), as taxas foram baixas em todos os

grupos, tanto para privação como para confluência. No entanto, houve diferença

estatística para o tempo de 96hs de privação, período onde se iniciou a

sincronização do ciclo celular (Gráfico 2), onde ocorreu uma maior redução na taxa

de apoptose quando comparado aos outros tempos. Para a confluência, houve um

aumento significativo da apoptose em relação ao teste de privação de soro. No

entanto, o índice de células vivas apresentado por este grupo na tabela 8 ainda foi

alto.

Tabela 9 - Apoptose avaliada através do teste de Anexina V no pós-congelação para

os grupos de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 0,4

0,3 0,6

48 2,1

0,9 3,4

72 0,3

0,2 0,5

96 0,01

0,00 0,02

120 0,3

0,2 0,4

144 0,4

0,3 1,2

168 0,5

0,4 0,9

Confluência 1,7

1,3 2,0

(P = <0,001)

A, B, C - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

No teste para análise da necrose (tabela 10), houve um crescimento

estatisticamente significativo da taxa de necrose no período de 96hs, voltando a se

reduzir nos períodos subseqüentes. Quando comparado o teste de privação de soro

com a confluência, houve uma redução nas taxas de necrose para este na

confluência, em relação às 24 horas, bem como após as 96 horas de privação de

soro.

Tabela 10 - Necrose avaliada através do teste de Anexina V no pós-congelação para

os grupos de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 8,6

5,6 11,9

48 1,1

0,6 1,5

72 0,7

0,7 0,9

96 5,7

4,7 6,8

120 2,8

2,1 5,0

144 3,9

3,2 5,1

168 3,7

3,5 4,6

Confluência 1,5

1,1 2,1

(P = <0,001)

A, B, C - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

Figura 14 - Anexina V - Teste Pós-Congelamento

apop 120hs desc

LEGENDAS

Inferior Esquerdo: Células Vivas

Inferior Direito: Células em Apoptose

Superior Direito: Células em Necrose

Superior Esquerdo: Células em Necrose

5.3- Ciclo Celular

5.3.1- Ciclo Celular – Pré-Congelação

Os resultados do teste de sincronização do ciclo celular em células antes

do congelamento estão expressos na tabela 11 (células em G1), tabela 12 (células

em G2), tabela 13 (células em S) e figura 15.

As taxas de células no estágio G1 do ciclo celular (tabela 11) foram altas

tanto nos grupos de privação de soro como para a confluência. Houve diferença

estatística significativa no início da privação de soro (24hs), onde apareceu a menor

porcentagem de células em G1. Após este período foi observado aumento entre as

taxas de células em G1, se mantendo semelhantes entre os períodos. A taxa de

células em G1 para o grupo confluência foi menor quando comparada com a

privação de soro.

A sincronização do ciclo celular, com o maior índice de células em G1

ocorreu a partir das 93hs (Gráfico 1), se estabilizando após este período.

Tabela 11 – Sincronização do ciclo celular em G1 - pré-congelação para os grupos

de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 72,6

71,9 78,0

48 92,3

90,9 94,9

72 96,4

95,3 97,4

96 95,8

94,8 97,2

120 98,9

98,0 99,2

144 93,3

83,2 97,7

168 95,6

93,8 96,2

Confluência 86,1

78,9 93,7

(P = <0,001)

A, B, C - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

Poucas células se apresentaram na fase G2 do ciclo celular (tabela 12).

No entanto, foi observada diferença significativa no início da privação de soro (24hs),

onde a taxa de células em G2 foi mais alta quando comparada aos demais

momentos. Houve redução nas taxas de células em G2 após 24hs se mantendo

constante nos demais momentos.

Tabela 12 - Sincronização do ciclo celular em G2 – pré-congelação para os

momentos de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 6,1

3,2 9,0

48 0,6A

0,0 1,0

72 0,4A

0,1 0,8

96 0,3A

0,0 0,6

120 0,3A

0,0 0,5

144 0,0

0,0 0,0

168 0,3A

0,0 1,1

Confluência 0,3A

0,0 1,4

(P = 0,004)

A, B - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

Em relação ao índice de células na fase S de ciclo celular, este se

apresentou mais elevado com 24hs de privação de soro, quando comparado aos

demais grupos (tabela 13). Quando comparado o teste de confluência com a

privação, a porcentagem de células em fase S foi maior no grupo confluência em

relação à privação de soro.

Quando comparado às três tabelas (tabelas 11, 12 e 13), foi observado

que as células entraram em processo de sincronização do ciclo celular após o

período de 24hs.

Tabela 13 - Sincronização do ciclo celular em fase S – pré-congelação para os

grupos de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 19,9

19,1 23,4

48 7,0

4,2 9,1

72 3,4

1,6 4,0

96 3,8

1,9 5,2

120 0,8

0,5 1,9

144 6,6

2,3 16,8

168 3,5

2,9 6,2

Confluência 13,9

3,4 21,0

(P = 0,038)

A, B - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística.

Figura 15 - Ciclo Celular – Pré-Congelamento

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 40 80 120 160

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 40 80 120 160

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 30 60 90 120 150

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 40 80 120 160 200

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 30 60 90 120 150

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 40 80 120 160 200

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

120hs 144hs

168hs Confluência

5.3.2- Ciclo Celular – Pós-Congelação

Os resultados do teste do ciclo celular com células após o congelamento

estão expressos na tabela 14 (células em G1), tabela 15 (células em G2), tabela 16

(células em S) e figura 16.

As taxas de células na fase G1 do ciclo celular G1 (tabela 14) foram altas

para os grupos com privação de soro. Houve diferença estatística significativa no

início da privação de soro (24hs), onde apareceu a menor porcentagem de células

em G1. Após este período foi observado um aumento das taxas de células em G1,

se mantendo constante nos demais momentos. Para o grupo confluência as taxas

de G1 foram menores em relação aos grupos com privação de soro por mais de

48hrs.

A sincronização do ciclo celular, com a maior taxa de células em G1

ocorreu a partir de 94,9hs (Gráfico 2), se estabilizando após este período.

Tabela 14 - Sincronização do ciclo celular em G1 - pós-congelação para os grupos

de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 75,2

72,5 78,2

48 94,1

93,5 95,9

72 97,3

96,9 97,9

96 98,7

97,3 99,2

120 85,8

78,0 97,2

144 94,7

93,6 97,4

168 97,9

96,5 98,9

Confluência 69,6

40,5 82,9

(P = <0,001)

A, B, C - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística.

As taxas de células na fase G2 do ciclo celular G2 (tabela 15) foram

baixas em todos os grupos. No entanto observou-se diferença significativa no início

da privação (24hs) com aumento semelhante ao apresentado na tabela 12 para o

teste antes do congelamento. Apesar disto às porcentagens de células em G2 foram

se reduzindo ficando em zero a partir de 120hs.

Tabela 15 - Sincronização do ciclo celular em G2 – pós-congelação para os grupos

de privação de soro e confluência

Momento (h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 2,9

1,4 4,2

48 1,4

1,2 1,7

72 1,0

0,6 1,1

96 0,7

0,3 1,0

120 0,0

0,0 0,0

144 0,0

0,0 0,1

168 0,0

0,0 0,1

Confluência 0,0

0,0 0,0

(P = <0,001)

A, B, C - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística.

As primeiras 24hs de privação de soro (tabela 16) também levaram a

maior taxa de células em fase S do ciclo celular. As 96hs foi observado o menor

índice de células em fase S, sendo este o período médio que se iniciou a

sincronização do ciclo celular (Gráfico 2).

Quando as três tabelas (tabelas 14, 15 e 16) foram comparadas também

se observou que a sincronização do ciclo celular iniciou-se após o período de 24hs

de privação de soro, a exemplo do que ocorreu com as células antes do

congelamento.

Tabela 16 - Sincronização do ciclo celular em fase S – Pós-congelação para os

grupos de privação de soro e confluência

Momento

(h)

Mediana

(%)

quartil

(%)

quartil

(%)

24 21,7

20,1 24,1

48 4,3

2,7 5,4

72 1,4

1,0 1,6

96 0,6

0,4 0,9

120 14,2

2,8 21,9

144 5,2

2,0 6,4

168 2,1

0,9 3,5

Confluência

30,4

17,1 58,9

(P = <0,001)

A, B, C - Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística

Figura 16 - Ciclo Celular – Pós-Congelamento

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 30 60 90 120 150

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 20 40 60 80 100 120

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 20 40 60 80 100

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 40 80 120 160 200

Channels (FL2-A)

0 40 80 120 160 200

Channels (FL2-A)

0 30 60 90 120

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

24hs 48hs

72hs 96hs

120hs 144hs

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 30 60 90 120 150

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

Debris

Aggregates

Dip G1

Dip G2

Dip S

168hs Confluência

Channels (FL2-A-FL2-Area)

0 40 80 120 160

O Gráfico 1 se refere ao período em que as células foram sincronizadas

na fase G1 do ciclo celular antes do congelação. As células se mantiveram em ciclo

celular G1 a partir de 93hs de privação de soro, apresentando um índice acima de

90% de células vivas. A metodologia utilizada foi a regressão segmentada,

comparando os tempos de privação de soro em relação a viabilidade das células nos

períodos (24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 hs), onde foi possível por este método

determinar o ponto de corte onde as células pararam de se dividir e entraram em

fase G0/G1 do ciclo celular.

Gráfico 1-Regressão segmentada referente ao G1 no pré-congelação (Ponto de

corte=93,0 h)

100

120

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo

Y = 93,0-19,0(25,0-XLRi)

O Gráfico 2 se refere ao período em que as células foram sincronizadas

na fase G1 do ciclo celular após o congelação. As células se mantiveram em G1 a

partir de 94,9hs de privação de soro, apresentando um índice acima de 90% de

células vivas. A metodologia utilizada foi a regressão segmentada, comparando os

tempos de privação de soro em relação a viabilidade das células nos períodos (24,

48, 72, 96, 120, 144, 168 hs), onde foi possível por este método determinar o ponto

de corte onde as células pararam de se dividir e entraram em fase G0/G1 do ciclo

celular.

Figura 2 - Regressão segmentada referente ao G1 no pós-congelação ( Ponto de

corte=94,9 h)

100

120

0 24 48 72 96 120 144 168 192

tempo

Y = 94,9-20,2(25,0-XLRi)

6- Discussão

Os métodos mais comuns para se obter a quiescência celular (G0) em

células destinadas a transferência nuclear são a privação de soro e o cultivo até a

obtenção da confluência. Embora diversos trabalhos comprovem a eficiência destes

métodos em bovinos e suínos, não foram encontrados, na literatura, artigos

utilizando fibroblastos de eqüinos. Desta forma, este experimento objetivou estudar o

comportamento de fibroblastos de eqüinos adultos em cultivo. Para tanto foram

comparados dois sistemas de sincronização do ciclo celular; a privação de soro e o

cultivo até confluência; analisando-se a viabilidade celular, o índice de células em

apoptose e necrose e o momento de ocorrência da sincronização do ciclo celular.

Utilizando-se a técnica de coloração do tapete celular com Iodeto de

Propídeo e Hoescht 33342 observou-se, na pré-congelação, baixa porcentagem de

células mortas tanto no grupo cultivado até a confluência como nos grupos que

sofreram privação de soro (24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168hs), tabela 1 e 2. Alem

disso, não foi observada diminuição da viabilidade celular com o aumento do tempo

de privação de soro. Estes resultados se repetiram quando a citometria de fluxo foi

utilizada para avaliação da viabilidade de células pré-congelamento e contradizem

os resultados apresentado por Gibbons et al. (2002), que observaram uma redução

na vida das células e fragmentação do DNA de fibroblastos de bovinos e de suínos,

após 48hs de cultivo em condições de privação de soro.

Nos grupos de fibroblastos cultivados após a descongelação, embora não

tenha sido observada diferença estatística no índice de células viáveis entre os

diferentes grupos quando se utilizou a análise visual, a citometria de fluxo mostrou

diferença estatística entre o grupo de células submetidas ao cultivo até confluência e

aqueles cultivados em privação de soro por 24 e por 72hs. No início da privação de

soro (24horas) observou-se o menor índice de células vivas sendo que após 72 hs

de privação de soro foi observado o maior índice de viabilidade, indicando uma

adaptação das células ao sistema de cultivo. Esta diferença entre as duas

metodologias era esperada, uma vez que a utilização da citometria de fluxo é uma

técnica muito mais acurada do que o exame visual por permitir a análise de um

número muito maior de células, evidenciando, portanto, o aparecimento de

diferenças estatísticas entre os grupos.

Quando se utilizou a técnica de marcação do tapete celular com corantes

fluorescentes e exame no microscópio de fluorescência, as células foram divididas

somente em duas categorias: vivas e mortas. No entanto, a utilização da anexina V

para marcação celular permitiu a diferenciação da população de células mortas em

apoptose e necrose. Esta diferenciação se mostra importante, pois, um alto número

de núcleos exibindo DNA fragmentado depois da privação de soro parece ser um

fator crítico no resultado da transferência nuclear. Aborto e morte neonatal em

bezerros obtidos de transferência nuclear podem estar relacionados com as

condições da cultura e ocorrência de fragmentação do DNA (KATO et al., 1998).

Tem sido demonstrada a importância da utilização de fatores de crescimento e

hormônios esteróides na estimulação mitótica e sobrevivência de fibroblastos

privados de soro (BROOKS et al., 1990). Estes produtos, no entanto, não foram

utilizados como aditivos dos meios de cultivo deste experimento. Apesar disso o

índice de morte celular observado foi baixo para quase todos os grupos estudados.

No pré-congelamento foi observado um baixo índice de células em

apoptose e em necrose em todos os grupos estudados. Alem disso não houve

diferença entre o grupo de células cultivadas até a confluência e aquelas submetidas

a privação de soro. Estes resultados diferem dos observados em linhagens de

fibroblastos adultos de humanos (RAWSON et al., 1991; LINDENBOIM et al., 1997;

MILLS et al., 1997; RUHL et al., 1999), bem como daqueles obtidos em fibroblastos

fetais de porco (KUES et al. 2000, 2002), onde se observou um aumento das taxas

de apoptose após 48hs de cultivo em privação de soro. Na verdade, o menor índice

de apoptose foi observado no grupo cultivado em privação de soro por 96hs (Tabela

6). Embora neste momento tenha sido observada a maior incidência de necrose,

ainda assim o índice de viabilidade celular não foi influenciado. Estes resultados

discordam dos observados na literatura, pois foi demonstrado em humanos, que a

privação de soro por mais de 48hs leva a alteração na expressão pelo menos 10

conjuntos do genes em um total de 462 genes (IYER et al. 1999). Após a

estimulação com adição de soro, os genes acima voltaram a ser regulados,

indicando que a privação do soro leva a alteração na transcrição, diminuição a

viabilidade celular (KUES et al. 2000).

A apoptose pode ser iniciada por estímulos diferentes, tais como a

privação de fatores de crescimento, agentes tóxicos, radiação, e estresse oxidativo

entre outros (NAGATA, 1997; ASHKENAZI e DIXIT, 1998; GREEN e REED, 1998).

Todos estes estímulos induzem ao estresse metabólico nas organelas da

célula, resultando em mudanças na permeabilidade da membrana mitocôndrial e

liberação do cytochromo c (PHILCHENKOV, 2004). A associação do cytochromo c

com o Apaf-1 e a procaspase-9 forma complexos chamados de apoptosomos,

essenciais para a ativação de caspases (PHILCHENKOV, 2004). As caspases, por

sua vez, são proteases responsáveis pelos os eventos bioquímicos complexos que

conduzem à morte programada da célula (THORNBERRY e LAZEBNIK, 1998).

Niesier et al. (2000) mostraram que a porcentagem de apoptose em pre-

adipócitos cultivados em meio com 10% de SFB era de menos de 2%, enquanto a

retirada do soro elevava este índice para mais de 10%. Estes resultados foram

corroborados por Yu et al. (2003) e por Cho et al. (2005) que observaram um alto

índice de apoptose (+ de 11%) em fibroblastos de caprinos e bovinos cultivados em

condições de privação de soro por mais de 120 hs. No presente estudo não foram

observadas diferenças entre os grupos nas taxas de apoptose quando os

fibroblastos eqüinos foram cultivados por 24, 48, 72 e mais de 120 horas. Esta maior

resistência dos fibroblastos em cultivo em sofrer fragmentação de DNA pode estar

relacionada ao baixo número de passagens realizadas antes do início da

sincronização do ciclo celular. Diversos trabalhos encontrados na literatura utilizam

um alto número de passagens (10 -15) no cultivo das células somáticas destinadas a

transferência nuclear. O aumento do número de passagens aumenta

significativamente a incidência de anormalidades cromossômicas favorecendo

quebras do DNA (KUBOTA et al., 2000; CHO et al., 2005)

De acordo com diversos autores a privação de soro leva a uma maior taxa

de apoptose, replicação inapropriada do DNA e alterações na transcrição quando

comparada com a confluência (S

por 5 dias, a porcentagem foi 11,7%, e no dia 10 de privação, estava em 90,3% de

células em apoptose. No presente experimento, foi utilizada a citometria de fluxo

como técnica para análise da presença de apoptose através da marcação por

anexina V conjugada com Alexa Fluor

488 (Molecular Probes™ - A13201) que se

liga a fosfatidilserina presentes na superfície da membrana em células apoptóticas, e

como resultado, observou-se a manutenção de baixos níveis de apoptose por todo o

período de cultivo (7 dias de privação de soro). Alem disso não foi observada

diferença significativa entre os grupos de privação de soro e os de confluência,

discordando mais uma vez da literatura que aponta a superioridade do cultivo até a

confluência celular como método de sincronização do ciclo celular. Quando o mesmo

estudo foi repetido em fibroblastos de eqüino após o congelamento observaram-se

resultados semelhantes onde, após 72hs de privação de soro, o índice de células

apoptóticas ficou abaixo de 0,5% em comparação com 1,7% encontrado nas células

em confluência. Mais uma vez os resultados são contraditórios em relação a

literatura já que diversos estudos mostraram que o dano causado a membrana

celular durante a criopreservação induz tanto a exteriorização da fosfatidilserina

(Indra et al., 2006) como a ativação da cascata da caspase (BAUST & BAUST,

2006).

Os índices de necrose observados também foram baixos para todos os

grupos. No entanto, após o descongelação, quando as células foram cultivadas em

privação de soro por 24 horas, observou-se 8,6% de células em necrose. Este dado

reflete diretamente o menor índice de viabilidade celular (90,9%) observado neste

grupo. Este aumento da morte celular pode estar relacionado a uma sensibilidade

dos fibroblastos em cultivo ao estresse térmico sofrido durante o abaixamento da

temperatura. No entanto, ao se iniciar a proliferação, as células responsáveis pela

formação do tapete celular apresentaram boa adaptação ao sistema de cultivo e

incide de viabilidade e de morte celular semelhantes aos observados antes da

criopreservação, indicando o sucesso do método de congelação utilizado.

A avaliação do efeito da confluência e da privação de soro sobre o ciclo

celular e a viabilidade das células foi realizada no citômetro de fluxo FACS Calibur

da BD

e a porcentagem relativa da proporção de células em G0/G1 foi elevada em

comparação aos resultados apresentados por Hayes et al. (2005), que trabalhou

com os efeitos da confluência e da privação de soro em fibroblastos de bovinos.

Hayes et al, (2005), demonstraram um declínio de 84% para 72% de células em

G0/G1 depois de 5 dias de cultivo, o que não foi constatado no presente

experimento, pois as células se mantiveram com taxas de G0/G1 acima de 90%

durante os períodos de privação de soro (48, 72, 96, 120, 144 e 168 hs).

As menores taxas de células em G0/G1 foram encontradas no primeiro

período de 24hs de privação de soro, onde a porcentagem foi em torno de 70%,

(tanto pré- quanto pós-congelação) indicando um período insuficiente de cultivo para

obtenção da sincronização do ciclo celular. Resultados semelhantes foram obtidos

por Hayes et al. (2005) que obtiveram somente 40% de células em G0 nas primeiras

24 horas de privação de soro. Estes autores denominaram esta fase de

“crescimento”.

Quando os grupos foram estudados antes das células serem submetidas a

criopreservação, não se observou diferenças nas taxas de células em G0/G1 entre

os grupos que sofreram privação de soro por mais de 24 h e o da confluência. Estes

resultados estão de acordo com o encontrado por Cho et al. (2005) que obtiveram

mais de 80% de fibroblastos fetais bovinos em G0/G1 utilizando tanto a confluência

como a privação de soro. Também Hayes et al. (2005) observaram semelhança

entre a confluência e a privação de soro para sincronização do ciclo celular quando

trabalharam com fibroblastos de bovinos adultos. No entanto, quando as células

foram analisadas após a criopreservação, os resultados obtidos foram conflitantes

com os da literatura. Nos grupos submetidos a privação de soro por mais de 24 hs,

foram observadas taxas de células em G0/G1 bastante elevadas e semelhantes

aquelas encontradas na pré-congelação. Por outro lado, para o grupo confluência

foram encontrados índices de G0/G1 significativamente mais baixos (69,6%). Neste

grupo, apesar das células terem crescido até preencher a base da garrafa, foi

observado um alto índice de células na fase S. Esta constatação pode indicar que

neste grupo celular o período de cultivo por 4 dias para obtenção da confluência

tenha sido insuficiente para a sincronização de um grande número de células em

G0/G1. Kubota et al. (2000), obtiveram 65% de células em fase G0/G1, em cultivos

de fibroblastos bovinos sem congelamento. Estes resultados foram semelhantes aos

obtidos, no presente experimento, no teste de pós-congelamento. No entanto

diferem dos resultados obtidos no teste de pré-congelamento, onde se observou

uma taxa alta de 86,1%. Como a maior parte dos trabalhos consultados na literatura

analisa as células antes de submetê-las ao processo de criopreservação, fica difícil

comparar os resultados, uma vez que células criopreservadas podem apresentar um

comportamento diferente quando em cultivo.

Tanto nos grupos pré- como pós-congelação foi observado que as células

entraram em processo de sincronização do ciclo celular (G0/G1) a partir de 48hs de

privação de soro, sendo concordante com os resultados obtidos por Kues et al.

2000. A sincronização do ciclo celular em G0/G1, através da privação de soro,

ocorreu às 93hs para células da pré-congelação e 94,9hs para células da pós-

descongelação. Neste momento também ocorreu diminuição na apoptose, no

entanto houve um aumento significativo na necrose. Este processo pode estar ligado

a ocorrência de estresse oxidativo, devido ao longo tempo de cultivo (FORMICHI et

al., 2000, 2006; KOWALTOWSKI, 1999)

As taxas de células em G2 na maior parte dos períodos de privação de

soro neste experimento mantiveram-se abaixo de 1%, o que contradiz com os dados

apresentados por (HAYES et al. 2005; ALBERIO et al. 2001), que foi de 11%. Estes

resultados indicam que nas condições do presente experimento houve uma alta

eficiência para sincronização do ciclo celular em G0/G1.

Os resultados deste experimento mostraram que os fibroblastos eqüinos

em cultivo apresentaram alta viabilidade em todos os momentos estudados, mesmo

após o processo de criopreservação. Alem disso, os índices de apoptose/necrose

encontrados foram mais baixos do que os descritos na literatura para outras

espécies animais. Estes dados associados aos altos índices de sincronização dos

ciclo celular em G0/G1 observados, em especial nos grupos que sofreram privação

de soro por mais de 90 hs, indicam a eficiência da metodologia utilizada para cultivo

de fibroblastos eqüinos destinados a transferência nuclear.

7- Conclusão

Nas condições experimentais apresentadas, pode-se concluir:

- A metodologia utilizada no cultivo de fibroblastos de eqüinos se

demonstrou-se eficiente.

- Ambas as metodologias de obtenção de quiescência celular, privação de

soro e confluência, resultaram em altas taxas de viabilidade celular e baixas taxas de

apoptose.

- Os dados obtidos através da microscopia óptica por fluorescência foram

confirmados através da citometria de fluxo, no entanto, com o primeiro foi possível

somente detectar células vivas e mortas, sem diferenciação do estadio da morte em

que a célula se encontrava.

- A citometria de fluxo com a utilização da anexina V demonstrou ser

eficiente na separação de células vivas, em apoptose e em necrose.

- Um número reduzido de passagens (até 2) pode ter contribuído para

evitar com que as células entrassem em apoptose.

- Em células analisadas antes da congelação não foram constatadas

diferenças entre a privação de soro e a confluência para sincronização do ciclo

celular.

- A privação de soro foi mais eficiente na obtenção da quiescência celular

do que a confluência, para células após a congelação, por apresentar porcentagens

de células em G0/G1 mais elevadas.

8- Referências

ALBERIO, R.; BRERO, A.; MOTLIK, J. WOLF, E.; ZAKHARTCHENKO, V.

Remodeling of donor nuclei, DNA-synthesis, and ploidy of bovine cumulus cell

nuclear transfer embryos: effect of activation protocol. Mol. Reprod. Dev., v.59,

p.371-379, 2001.

ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D.

Biologia Molecular da Célula. 3.ed., Artes Médicas, 1997, 1294p.

ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D. The

Cell. Garland Science, New York, London, 2002, 1616p.

ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.

Biologia Molecular da Célula. 4.ed, Editora Artmed, 2004. 1584p.

AMEISEN, J.C.; IDZIOREK, T.; BILLAUT-MULOT, O.; LAYENS, M.; TISSIER, J.;

POTENTIER, A; OUASSI, A. Apoptosis in a unicellular eukaryote (Trypanosoma

cruzi): implications for the evolutionary origin and role of programmed cell death in

the control of cell proliferation, differentiation and survival. Cell Death. Differ., v.2,

p.9-22, 1995.

ASHKENAZI, A.; DIXIT, V.M. Death receptors: Signalling and modulation. Science,

v.281, p.1305-1308, 1998.

BARCINSKI, M.A. Apoptosis in Trypanosomatids: Evolutionary and phylogenetic

considerations. Genet. Mol. Biol., v.21, n.1, 1998.

BARCINSKI, M.A.; MOREIRA, M.E.C. Cellular response of protozoan parasites to

host-derived cytokines. Parasitol. Today, v.10, p.352-355, 1994.

BAUST, J.M. Molecular Mechanisms of Cellular Demise Associated With

Cryopreservation Failure. Cell Preservation Technology, v.1, p.17-31, 2002.

BAUST, J.M.; BAUST, J.G. The role of membrane-mediated apoptosis in

cryopreservation failure. Cryobiology, v.53, p.387-388, 2006.

BENJAMIN, C.W.; HIEBSCH, R.R.; JONES, D.A. Caspase activation inMCF7 cells

responding to etoposide treatment. Mol Pharmacol., v.53, p.446-50, 1998.

BOQUEST, A.C.; DAY, B.N.; PRATHER, R.S. Flow cytometric cell cycle analysis of

cultured porcine fetal fibroblast cells. Biol. Reprod., v.60, p.1013-1019, 1999.

BRIGGS, R.; KING, T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into

enucleated frogs´ eggs. Proc. Natl. Acad. Sci., v.38, p.455-463, 1952.

BROCKBANK, K. G. M.; DONOVAN, T. J.; RUBY, S. T. Functional analysis of

cryopreserved veins. J. Vasc. Surg.,v.11, p.94-102, 1990.

BROMHALL, J.D. Nuclear transplantation in the rabbit egg. Nature, v.258, p.719-

722, 1975.

BROOKS, R.F.; HOWARD, M.; LEAKE, D.S.; RIDDLE, P.N. Failure of plateletderive

growth factor plus insulin to stimulate sustained proliferation of Swiss 3T3 cells.

Requirement for hydrocortisone, prostaglandin E1, lipoproteins, fibronectin and an

unidentified component derived from serum. J. Cell. Sci., v.97, p.71–78, 1990.

BRUCE, A.; ALEXANDER, J.; JULIAN, L.; MARTIN, R.; KEITH, R.; PETER, W.

Molecular Biology of the Cell. 4 ed. Garland Science, 2002. 1616p.

BURROWS, M.T. The cultivation of tissues of the chick embryo outside the body. J.

Amer. Med. Ass., v.55, p. 2057-2058, 1910.

BURROWS, M.T.; CARREL, A. Cultivation of adult tissues and organs outside of the

body. JAMA, v.55, p.

1379–1381, 1910.

CAMPBELL, K.H.; LOI, P.; OTAEGUI, P.J.; WILMUT, I. Cell cycle coordination in

embryo cloning by nuclear transfer. Rev. Reprod., v.1, p.40-46, 1996.

CAMPISI, J. Cancer, aging and cellular senescence. In Vivo, v.14, p.183-188, 2000.

CAMPISI, J. From cells to organisms: can we learn about aging from cells in culture?.

Experimental Gerontology, v.36, p.607-618, 2001.

CHEN, Q.; BARTHOLOMEW, J.C.; 3.36198 0 Td(C)Tj8.6451 0 Td(.)Tjy5468 0 Td(I.36198 0 Td(C)TjSI.36198 0 Td(C)TjQ)Tj9.36552 0 Td(.)Tj3.36198 0 Td(C)Tj8.6451 0 Td(.)Tj3.300354 0 Td(3.36198 0 Td(C)Tj8.6451 0 Td(.)TjE)Tj7.8046 0 Td(WS5468 0 Td()Tj9.24545 0 Td(LA5468 0 Td(Q)Tj9.36552 0 Td(.)Tj3.36198 0 Td(y )Tj7.08418 0 Td(3.3619800354 0 Td(.)Tj3.36198 0 Td(RTj8.6451 0 Td(,)Tj3.36198 0 Td( G)Tj7.8046 0 Td(W)Tj3.36198 0 Td(W)Tj7.08418 0 Td(Q)Tj9.36552 0 Td(.)Tj3.36198 0 Td(C)Tj8.6451 0 Td(.)Tj3.36198 0 Td(;DTj3.36198 0 Td( )Tj7.00354 0 Td(3.3619800354 0 Td(.)Tj-453ET8 -hW 4y)Tj3.36198 0 Td( SQ)Tj9.36552 0 Td(.)Tj3E4228 0 Td(R)Tj8.52503 0 Td()Tj3.36198 0 Td(;.)Tj3E4228 0 Td(yo)Tj9.96588 0 Td(l)Tj2W 4151 0 Td(e)Tj9.96588 0 Td(c)Tj0038348 0 Td(u)Tj9.96588 0 Td(l)Tj2W 4151 0 Td(a)Tj9.96588 0 Td(r)Tj3962340 Td(;.)Tj3E4228 0 Td(a)Tj9.605 0 Td(Ln8 0 Td(r)Tj3962340 Td(;.)Tj3E425Q)Tj9.e1.e1.e1.e1.e11 0 Td(r)Tj396234)Tj9.96588 0 Td(cf0 Td(48205 0 Td(r)Tj396234Tj9.(E)TjE42.04475 0 Td8(N)Tj267606.658.5(,)Tj2j9.(E)Tj8.04475 0 Td(N)Tj271.5(725606.6m()Tj9.(E)TjE42.04475 0 Td8(N)Tj2875 6.658.5(,)Tj2j9.4365259 0 Td(E)Tj8.04475 0 Td(N)Tj288606.655606.6m()1Q)Tj9.d Td(;.)Tj3E425)Tj9.96588 0 Td(rce Td(;.)Tj3E425dTj9.96588 0 Td(r 0 Td(r)Tj396234)Tj9.96588 0 Td(lQ)Tj9.)Tj9.96588 0 Td(l)Tj2W 4151 0 Td(a)Tj9.96588 0 Td(lQ)Tj9.to-Tj9.605 0 Td(Ln81k)Tj9.96588 0 Td(l 0 Td(r)Tj396234g Td(;.)Tj3E425)Tj9.605 0 Td(Ln8)Tj9.96588 0 Td(cwj6.72397 0 Td(O)t0 Td(48205hTj9.96588 0 Td(l 0 Td(r)Tj396234)Tj3E4228 0 Td(a)Tj9.605 0 Td(Ln8)Tj9.605 0 Td(Ln8)Tj9.96588 0 Td(lto 0 Td(r)Tj396234130 Td(lQ)Tj9. 0 Td(r)Tj396234n Td(;.)Tj3E425)Tj9.96588 0 Td(c)Tj9.605 0 Td(Ln8mTj3.0619590 Td(;.)Tj3E42552149 0 Tdy)hTj9.96588 0 Td(l)Tj9.96588 0 Td(rmTj2W 4151 0 Td(e)Tj3E4228 0 Td(aQ)Tj9. 0 Td(05 0 Td(Ln8f0 Td(482051bTj9.96588 0 Td(c)Tj9.605 0 Td(Ln8o Td(;.)Tj3E425bTj9.96588 0 Td(c)Tj3962340 Td(;.)Tj3E4228 0 Td(ato:o 0 Td461924p Td(;.)Tj3E4255 Td(;.)Tj3E4253Q)Tj9. 0 Td461924)Tj3E4228 0 Td(aQ)Tj9.dTj9.96588 0 Td(r 0 Td461924GbTj9.96588 0 Td(c 0 Td461924co Td(;.)Tj3E425Q)Tj9.to)Tj9.605 0 Td(Ln8)Tj9.96588 0 Td(c)Tj3962340 Td(;. 0 Td461924Tj7.08418 0 Td(Q)(Tj9.605 0 Td(Ln81Tj9.96588 0 Td(c)Tj9.605 0 Td(Ln8 0 Td461924)Tj3E4228 0 Td(a)Tj9.605 0 Td(Ln8)Tj9.605 0 Td(Ln8)Tj9.96588 0 Td(lto 0 Td461924bTj9.96588 0 Td(c)Tj9.96588 0 Td(rto 0 Td461924Q)Tj9.o Td(;.)Tj3E425to 0 Td461924ce Td(;6588 0 Td(c)Tj3962340 Td(;.)Tj3962340 Td(;. 0 Td461924)Tj9.605 0 Td(Ln8)Tj9.96588 0 Td(lp Td(;6588 0 Td(c)Tj3962340 Td(;.1c)Tj3E4228 0 Td(ato1)Tj9.96588 0 Td(cQ)Tj9.yo)Tj9(E)5j8.044461924B03962341o)Tj97.32432c.)Tj3E425hTj97.32432e Td(;.)Tj3E425mTj3.06566 0 Td(A)Tj8(E)Tj8.044(48205 0 Td(E)5j8.044y)J Td(;.)Tj3E425yo)Tj8.52503 0 Td()Tj3.(E)Tj8.044(2503 0 Td()vTj2W 4151 0 Td(ayo3Q)Tj9.3Q)Tj9.2Q)Tj9.)Tj8.52503 0 Td()Tj3.362503 0 Td()p Td(;6588 0 Td(c)Tj-453ET8 -hW 44Q)Tj9.3Q)Tj9.-Tj9.605 0 Td(Ln85 Td(;.)Tj3E4250Q)Tj9.)Tj8.52503 0 Td()Tj3.362503 0 Td()1 Td(;.)Tj3E4259Q)Tj9.9 Td(;.)Tj3E4258Q)Tj9.yo)Tj9-130.277 -38 41o3.36198 0 Td( )Tj7.08418 0 Td(Q)Tj9.36552 0 Td(.)Tj3.36198 0 Td(;)Tj3.36198 0 Td( )Tj7.032432YTj7.06198 0 Td(.6451 0 Td(.)Tj324323619800354 0 Td(.Tj9.36552 0 Td(.)GTj7.08418 0 Td(Q)UG)Tj3.36198 0 Td(CTj3.367651I.36198 0 Td(C)TjQ)Tj3.36198 0 Td( )Tj7.032432FTj7.032432.6451 0 Td(.)Tj32432)Tj3E4228 0 Td(UG3.36198 0 Td( )TKTj3E4228 0 Td()Tj3.36198 0 Td( )Tj7.032432Tj3.36198 0 Td( )Tj7.00354 0 Td(3.)Tj7.032432VTj3E4228 0 Td(1to0 Td(;.)Tj3E425mTj3.0619591Q)Tj9.)Tj7.032432Tj3.36198 0 Td( S)Tj7.0324321Q)Tj9.)Tj7.032432)Tj9.96588 0 Td(l)Tj9.605 0 Td(Ln8u Td(;.)Tj3E425mTj3.061959)Tj7.0324321 0 Td.032432)Tj9.96588 0 Td(r)Tj9.605 0 Td(Ln8vTj2W 4151 0 Td(a176163Td(Ln8vTj2W 4151 0 Td(ae1.e1.e1.e1.e1 0 Td.032432f0 Td(48205e1.e1.e1.e1)Tj2to)Tj9.96588 0 Td(c)Tj9.605 0 Td(Ln8 0 Td.020425f0 Td(48205)Tj9.96588 0 Td(c)Tj9.6r)Tj396234 0 Tdy52f0 Td(482051bTj9.96588 0 Td(c)Tj9.605 0 Td(Ln8o Td(;.)Tj3E425bTj9.96588 0 Td(c)Tj3962340 Td(;.)Tj3E4228 0 Td(ato)Tj-453ET8 -hW 4 0 Td(E)5j8.044oPj3.36198 0 Td( S)Tj94.6827)Tj97.32432c.)Tj3E425yo)Tj9.96198 0 Td(CTj3.368 0 Td( )T0 Td(;.)Tj3E425tTj9.605 0 Td(Ln8lTj9.96198 0 Td(Cyo)Tj9.948205Tj3.364049cQ)Tj9.e1.e1.e.)Tj3E425dTj9.032432.6451 0 Td(.)Tj)Tj9.96198 0 Td(C)Tj3E4228 0 Td(Rc.)Tj3E4251o)Tj8(E)Tj8.044(0 Td(C)TjQ)Tj3.36198 0 Td( )Tj7(2503 0 Td()vTj2W 4151 0 Td(ayo9Q)Tj9.4Q)Tj9.)Tj8.52503 0 Td()Tj3.362503 0 Td()p Td(;6588 0 Td(c)Tj-452503 0 Td()1 Td(;6588 0 Td(c0.)Tj3E4252Q)Tj9.0Q)Tj9.5 Td(;.)Tj3E425–Q)Tj9.1 Td(;6588 0 Td(c0.)Tj3E4252Q)Tj9.0Q)Tj9.8.;.

FENG, X. J.; VAN HOVE, C. E.; MOHAN, R. Effects of different antibiotics on the

endothelium of the porcine aortic valve. J Heart Valve Dis., v.2, p. 694-704, 1993.

FORMICHI, P.; BATTISTI, C.; TRIPODI, S.A.; TOSI, P.; FEDERICO, A. Apoptotic

response and cell cycle transition in ataxia telangiectasia cells exposed to oxidative

stress. Life Sciences, v. 66, p. 1893-1903, 2000.

FORMICHI, P.; RADI, E.; BATTISTI, C.; TARQUINI, E.; LEONINI, A.; Di STEFANO,

A.; FEDERICO, A. Human fibroblasts undergo oxidative stress-induced apoptosis

without internucleosomal DNA fragmentation. Journal of Cellular Physiology,

v.208, p.289-297, 2006.

FRESHNEY, R.I. Animal Cell Culture – A Practical Approach. Second Edition,

Oxford University Press, 1992. 352p.

FRESHNEY, R.I. Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Technique. 4 ed.

New York: Wiley-Liss, 2000. 577p.

GALLI C., LAGUITINA I., CROTTI G. et al. A cloned horse born to its dan twin.

Nature, 424: 635, 2003.

GEY, G.O.; COFFMAN, W.D.; KUBICEK, M.T. Tissue culture studies of the

proliferative capacity of cervical carcinoma and normal epithelium. Cancer Res.,

v.12, p.



264-265,



1952.

GIBBONS, J.; ARAT, S.; RZUCIDLO, J.; MIYOSHI, K.; WALTENBURG, R.;

RESPESS, D.; VENABLE, A.; STICE, S. Enhanced survivability of cloned calves

derived from Roscovitine-Treated adult somatic cells. Biology of Reproduction,

v.66, p.895-900, 2002.

GREEN, D.R.; REED, J.C. Mitochondria and apoptosis. Science, v.281, p.1309-

1312, 1998.

GRIFFIN, D.E.; HARDWICK, J.M. Regulators of apoptosis on the road to persistent

alphavirus infection. Annu. Rev. Microbiol., v.51, p.565-592, 1997.

GURDON, J.B.; UEHLINGER, V. Fertile intestine nuclei. Nature, v.210, p.1240-1241,

1966.

HAM, R.G. Clonal Growth of Mammalian Cells in a Chemically Defined, Synthetic

Medium.

Proceedings of the National Academy of Sciences, v.53, p.288-293,

1965.

HARDING, K.; BENSON, E.E.; MULLER, J.; TIMMERMANN, H.; LORENZ, M.;

FRIEDI, T.; DAY, J.G. Cryopreservation of storage recalcitrant algae through

fundamental studies of thermal behaviour and oxidative stress. Crybiology, v.53,

p.399-400, 2006.

HARLEY, C.B. Human ageing and telomeres. Ciba Found. Symp., v.211, p.129-

139, 1997.

HARRISON, R.G. Embryonic transplantation and development of the nervous

system. Anat. Rec., v.2, p.385-410, 1908.

HAYES, O.; RAMOS, B.; RODRIGUEZ, L.L.; AGUILAR, A.; BADÍA, T. Cell

confluency is as efficient as serum starvation for inducing arrest in the G0/G1 phase

of the cell cycle in granulose and fibroblast cells of cattle. Animal Reproduction

Science, v.87, p.181-192, 2005.

HEYMAN, Y.; RENARD, J.P. Cloning of domestic species. An. Reprod. Sci., v.42,

p.427- 436, 1996.

HOORNAERT, S.; HANON, J.; LYAKU, J.; PASTORET, P.P. The Use of Annexin for

Concomitant Detection of Apoptosis and Cellular Phenotype. Biochemica, v.3, p.19-

20, 1997.

ILLMENSE, K.; HOPPE, P.C. Nuclear transplantation in Mus musculus:

Developmental potential of nuclei from preimplantation embryos. Cell, v.23, p.9-18,

1981.

INDRA, N.M.; SUNG, J.; AHMAD, HAJIRA, SAMBANIS, A. Apoptosis and stress

protein expression in the cryopreservation of bTC-tet cells. Cryobiology, v.53, p.380-

381, 2006.

IYER, V.R.; EISEN, M.B.; ROSS, D.T.; SCHULER, G.; MOORE, T.M.; LEE, J.C.F.;

TRENT, J.M.; STAUDT, L.M.; HUDSON, J.; BOGUSKI, M.S.; LASHKARI, D.;

SHALON, D.; BOTSTEIN, D.; BROWN, P.O. The transcriptional program in the

response ofhuman fibroblasts to serum. Science, v.283, p.83–87, 1999.

JESUS, R.P.; WAITZBERG, F.G.C. Regeneração hepática: papel dos fatores de

crescimento e nutrientes. Rev. Ass. Med. Brasil, v.46, p.242-54, 2000.

JONES, T.C.;HUNT, R.D.; KING, N. W. Patologia Veterinária. 6.ed, Editora Manole,

2000, 1415p.

KATO, Y.; TANI, T.; SOTOMARU, Y.; KUROKAWA, K.; KATO, J.; DOGUCHI, H.;

YASSUE, H.; TSUNODA, Y. Eight calves cloned from somatic cells of as single adult.

Science, v.282, p.2095-2098, 1998.

KOWALTOWSKI, A.J. Permeabilização da membrana mitocondrial interna

induzida por Ca2+ em condições de estresse oxidativo. 1999. 110p. Tese

(Doutorado) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas,

Campinas.

KOWALTOWSKI, A.J.; COSSO, R.G.; CAMPOS, C.B.; FISKUM, G. Effect of Bcl-2

overexpression on mitochondrial structure and function. J. Biological Chemistry,

v.277, p.42802-42807, 2002.

KUBOTA, C.; YAMAKUCHI, H.; TODOROKI, J.; MIZOSHITA, K.; TABARA, N.;

BARBER, M.; YANG, X. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after

long-term culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., v.97, p.990-995, 2000.

KUES, W.A.; ANGER, M.; CARNWATH, J.W.; PAUL, D.; MOTKIK, J.; NIEMANN, H.

Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation

and reversible cell cycle inhibitors. Biol. Reprod., v.62, p.412-419, 2000.

KUES, W.A.; CARNWATH, J.W.; PAUL, D.; NIEMANN, H. Cell cycle synchronization

of porcine fetal fibroblasts by serum deprivation initiates a nonconventional form of

apoptosis. Cloning Stem Cells, v.4, p.231-243, 2002.

LANDI, E.P. Caracterização da ativação plaquetária nos concentrados de plaquetas

por citometria de fluxo. Rev. bras. hematol. Hemoter., v.25, p.39-46, 2003.

LANZA, R.P.; CIBELLI, J.B.; BLACKWELL, C.; CRISTOFALO, V.J.; FRANCIS, M.K.;

BAERLOCHER, G.M.; MAK, J.; SCHERTZER, M.; CHAVEZ, E.A.; SAWYER, N.;

LANSDORP, P.M.; WEST, M.D. Extension of cell life span and telomere length in

animals cloned from senescent somatic cells. Science, v.288, p.665-669, 2000.

LINDENBOIM, L.; DIAMOND, R.; ROTHENBERG, E.; STEIN, R. Apoptosis induced

by serum deprivation of PC12 cells is not preceded by growth arrest and can occur at

each phase of the cell cycle. Cancer Res., v.231, p.337-345, 1997.

McGRATH, J.; SOLTER, D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by

microcirurgy and cell fusion. Science, v.220, p.1300-1302, 1983.

MILLS, J.C.; KIM, L.H.; PITTMAN, R.N. Differentiation to an NGF-dependent state

and apoptosis following NGF removal both occur asynchronously in cultures of PC12

cells. Exp. Cell. Res., v.231, p.337-345, 1997.

MORENO, E.A.; CUÉLLAR, C.G.; GONZÁLEZ, A.D. Métodos de detección de la

apoptosis, aplicaciones y limitaciones. Cancerología., v.46, p.275-280, 2000.

MURRAY, A.W.; KIRSCHNER, M.W. Dominoes and clocks: the union of two views

of the cell cycle. Science, v. 246, p.614-621, 1989.

MURRAY, A.W.; KIRSCHNER, M.W. What controls the cell cycle? Sci. Am. V.264,

p.56-63, 1991.

NAGATA, S. Apoptosis by death factors. Cell, v.88, p.355-365, 1997.

NEGOESCU, A.; LORIMIER, P.; LABAT-MOLEUR, F.; AZOTI, L.; ROBERT, C.;

GUILLERMET, C.; BRAMBILLA, C.; BRAMBILLA, E. TUNEL: Improvement and

Evaluation of the method for In Situ Apoptotic Cell Identification. Biochemica, v.2,

p.12-17, 1997.

NIESIER, C.U.; URSO, B.; PRINS, J.B.; SIDDLE, K. IGF-I inhibits apoptosis induced

by serum withdrawal, but potentiates TNF--induced apoptosis, in 3T3-L1

preadipocytes. J. Endocrinol., v.167, p.165-174, 2000.

OBACK, B.; WELLS, D. Practical aspects of donor cell selection for nuclear cloning.

Cloning Stem Cells, v.4, p169-175, 2002.

OUELETTE, M.M.; LIAO, M.; HERBERT, B.S.; JOHNSON, M.; HOLT, S.E.; LISS,

H.S.; SHAY, J.W.; WRIGHT, W.E. Subsenescent telomere lengths in fibroblasts

immortalized by limiting amounts of telomerase. J. Biol. Chem., v.275, p.10072-

10076, 2000.

PETIT, P.X.; LECOEUR, H.; ZORN, E.; DAUGUET, C.; MIGNOTTE, B.; GOUGEON,

ML. Alterations in mitochondrial structure and function are early events of

dexamethasone-induced thymocyte apoptosis. J. Cell. Biol., v.130, p.157-167, 1995.

PHILCHENKOV, A. Caspases: Potential targets for regulating cell death. J. Cell.

Mol. Med., v.8, p.432-444, 2004.

POIRIER, J. Histologia Molecular – Texto e Atlas. 1º ed. Livraria Santos Editora,

São Paulo, 2003. 430 p.

RAWSON, C.L.; DUIMSTRA, J.R.; HEDSTROM, O.R.; SCHMIDT, D.W. Death of

serum-free mouse embryo cells caused by epidermal growth factor deprivation. J.

Cell. Biol., v.113, p.671-680, 1991.

REDDEL, R.R. The role of senescence and immortalization in carcinogenesis.

Carcinogen, v.21, p.477-484, 2000.

RUHL, M.; SAHIN, E.; JOHANNSEN, M.; SOMASUNDARAM, R.; MANSKI, D.;

RIECKEN, E.O.; SCHUPPAN, D. Soluble collagen VI drives serum-starved

fibroblasts through S phase and prevents apoptosis via down-regulation of Bax. J.

Biol. Chem., v.274, p.34361-34368, 1999.

SANFORD, K.K.; EARLE, W.R.; LIKELY, G.D. The growth in vitro of single isolated

tissue cells. J. Natl. Cancer Inst., v.9, p.229-246, 1948.

SEIDEL Jr., G.E. Production of genetically identical sets of mammals: cloning? J.

Exp. Zool., v.228, n.2, p.347-354, 1983.

SPEEMANN, H. Embryonic Development and Intuctrion. Yale University Press:

New Haven, Conn. 1938. 1935p.

STICE, S.L.; GIBBONS, J.; RZUCIDLO, J.R.; BAILE, C.A. Improvements in nuclear

transfer procedures will increase commercial utilization of animal cloning. Asian

Aust. J. Anim. Sci., v.13, p.856-860, 2000.

THORNBERRY, N.A.; LAZEBNIK, Y. Caspases: Enemies within. Science, v.281,

p.1312-131, 1998.

URQUIDI, V.; DAVID, T.; GOODISON, S. Role of Telomerase in Cell Senescence

and Oncogenesis. Ann. Rev. Med., v.51, p.65-79, 2000.

VARMUS, H,; WEINBERG, R.A. Genes and the Biology of Cancer. New York:

Scientific American Library, 1993. 207p.

WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells.

Nat. Genet., v.22, p.127-128, 1999.

WALES, R.G. From uncommitted to committed embryonic cells: opportunities for

their study and manipulation. Reprod. Fert. Dev., v.7, p.983-996, 1995.

WALS, G.M.; DEWSON, G.; WARDLAW, A.J.; LEVI-SCHAFFER, F.; MOQBELR. A

comparative study of different methods for the assessmentof apoptosis and necrosis

in human eosinophils. J. Immunol. Methods., v.217, p.153-63, 1998.

WEBER, T. R.; DENT, T. L.; LINDENAVER, M. Viable vein graft preservation. J.

Surg. Res., v.18, p.247-55, 1975.

WELBURN, S.C.; BARCINSKI, M.A.; WILLIAMS, G.T. Programmed cell death in

Trypanosomatids. Parasitol. Today., v.13, p.22-26, 1997.

WELLS, D.N.; LAIBLE, G.; TUCKER, F.C.; MILLER, A.L.; OLIVER, J.E.; XIANG, T.;

FORSYTH, J.T.; BERG, M.C.; COCKREM, K.; L´HUILLIER, P.J.; TERVIT, H.R.;

OBACK, B. Coordination between donor cell type and cell cycle stage improves

nuclear cloning efficiency in cattle. Theriogenology, v.59, p.45-59, 2003.

WHIKEHART, D.R.; REGISTER, S.J.; CHANG, Q.; MONTGOMERY, B. Relationship

of telomeres and p53 in aging bovine corneal endothelial cell cultures. Investig.

Ophthalmol. Vis. Sci., v.41, p.1070-1075, 2000.

WILLADSEN, S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature, v.320, p.63-

65, 1986.

WILMUT, I.; SCHNIEKE, A.E.; McWHIR, J.; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.S. Viable

offspring derived from fetal and adult mammalin cells. Nature, v.385, p.810-813,

1997.

WILMUT, I.; YOUNG, L.; CAMPBELL, K.H.S. Embryonic and somatic cell cloning.

Reprod. Fert. Dev., v.10, p.639-643, 1998.

WOLF, E.; ZAKHARTCHENKO, V.; BREM, G. Nuclear transfer in mammals: recent

developments and future perspectives. J. Biotechnol., v.65, p.99-110, 1998.

WOODS G.L., WHITE K.L., VANDERWALL D.K. et al. A mule cloned from fetal

cells by nuclear transfer. Science, 301: 1063, 2003.

YANG, X.; ANDERSON, G.B. Micromanipulation of mammalian embryos: principles,

progress and future possibilities. Theriogenology, v.38, p.315-335, 1992.

YU, Y.S.; SUN, X.S.; JIANG, H.N.; HAN, Y.; ZHAO, C.B.; TAN, J.H. Studies of the

cell cycle of in vitro culture skin fibroblasts in goats: works in progress.

Theriogenology, v.59, p.1277-1289, 2003.

9- Anexos – Meios e Soluções

9.1- Anexo – A – Soluções utilizadas no cultivo celular

9.1.1- Anexo – A.1 – Solução utilizada na coleta de tecido

PBS 0,1M – livre de cálcio e magnésio – pH 7,4

Componentes

Concentração

Na2HPO4 1,48 g

KH2PO4 0,43 g

NaCl 7,2 g

O ultrapura 1000 ml

Dissolver os componentes na água ultrapura sob agitação. Ajustar o pH para 7,4.

Alíquotar em frascos e autoclavar. Conservar em geladeira.

9.1.2- Anexo – A.2 – Meio de cultivo – para cada 1 mL de meio de cultivo

Componentes

Concentração

DMEN alta glicose (Gibco 11995-065) 1 mL

SFB (Gibco, 12657-029)

10%

Adicionou-se um dos antibióticos e antifúngicos sugeridos nos anexos – A.3 e A.4.

9.1.3- Anexo - A.3 – Antibióticos

Antibióticos

Concentração

Penicilina (Sigma, P3539) 100 UI/mL

Estreptomicina (Sigma, P3539) 100 ug/mL

Gentamicina (Sigma, G3632) 50 ug/mL

Neomicina (Sigma, N6386) 25 ug/mL

A combinação mais utilizada foi a Penicilina/Estreptomicina. A gentamicina e a

neomicina foi utilizada em alternância com a Penicilina/Estreptomicina.

9.1.4- Anexo – A.4 – Antifúngicos

Antifúngicos Concentração

Anfotericina – B (Sigma, A9528) 3,0 ug/mL

Micostatina/Nistatina 25 UI/mL

Os dois agentes devem ser utilizados com cuidado devido ao seu efeito tóxico sobre

algumas células.

9.1.5- Anexo – A.5 – Solução de Congelamento (para cada 1 mL de meio de

congelamento)

Componentes Concentração

DMEN alta Glicose (Gibco 11995-065) 1 mL

SFB (Gibco, 12657-029) 20%

DMSO (Sigma – D2650 10%

Adicionar um dos antibióticos e antifúngicos sugeridos nos anexos – A.3 e A.4.

9.1.6- Anexo – A.6 – Azul de Trypan (contagem das células)

Componentes Concentração

Azul de Trypan 0,2 g

PBS 0,01M 100 ml

Dissolver o Azul de Trypan em PBS 0,01M, filtrar em filtro 0,22 µm e conservar em

temperatura ambiente.

9.1.7- Anexo – A.7 – Solução de Tripsina 0,2% e Versene 0,02%

Adquirido no Instituto Adolfo Lutz – Seção de Cultura Celulares

9.2- Anexo – B – Soluções utilizadas análise da Viabilidade Celular

9.2.1- Anexo – B.1- Solução de Hoescht 33342

Componentes Concentração

Hoescht 33342 (invitrogen, H1399) 10 mg/mL

Dissolver o corante em água Milli-Q

9.2.2- Anexo – B.2 – Solução de Iodeto de Propídio

Componentes Concentração

Iodeto de Propídio (Sigma, P4170) 1,0 mg/mL

Dissolver o corante em água Milli-Q

9.3- Anexo – C – Soluções utilizadas na análise do Ciclo Celular

9.3.1- Anexo – C.1 – Solução de “ Cold GM”

Componentes Concentração

Glucose 6,1 mM

NaCl 137 mM

KCl 4,4 mM

HPO

1,5 mM

0,9 mM

EDTA 0,5 mM

9.3.2- Anexo – C.2 – Solução de Marcação

Componentes Concentração

PBS (anexo – A.1) contendo 5mM EDTA 1 mL

Iodeto de Propídio 50 µg/mL

RNase A (invitrogen, 10777-019) 0,3 mg/mL

9.4- Anexo – D – Soluções utilizadas na análise da Apoptose

9.4.1- Anexo – D.1 – Solução tampão para anexina

Componentes Concentração

Hepes 10 mM

NaCl 140 mM

CaCl

2,5 mM

Dissolver os componentes na água ultrapura sob agitação. Ajustar o pH para 7,4.

Alíquotar em frascos e autoclavar. Conservar em geladeira.

9.4.2- Anexo – D.2 – Solução de Marcação

Componentes Concentração

Anexina V conjugada com Alexa Fluor

488, Molecular Probes™ - A13201

5 µL

Iodeto de propídio 1 µg/mL

As amostras são incubadas por 15 minutos nesta solução em temperatura ambiente.

Após este período é adicionado 400µL de solução tampão a 4ºC.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 