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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUARIA
INSTITUTO AGRONOMICO DO PARANA
PROGRAMA DE MESTRADO EM GENETICA E BIOLOGIA MOLECULAR
José Pedro Friedmann Angeli
“AVALIAÇÃO DO EFEITO QUIMIOPROTETOR DE ß-
GLUCANAS DE ORIGEM FÚNGICA E VEGETAL NO DNA
DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS”
Londrina
2007
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1
José Pedro Friedmann Angeli
“AVALIAÇÃO DO EFEITO QUIMIOPROTETOR DE ß-
GLUCANAS DE ORIGEM FÚNGICA E VEGETAL NO
DNA DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Biologia Molecular da
Universidade Estadual de Londrina – UEL, como
requisito parcial à obtenção do titulo de mestre
Orientador: Profº. Dr. Mário Sérgio Mantovani
Londrina – PR
2007
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2
JOSÉ PEDRO FRIEDMANN ANGELI
“AVALIAÇÃO DO EFEITO QUIMIOPROTETOR DE ß-
GLUCANAS DE ORIGEM FÚNGICA E VEGETAL NO
DNA DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS”
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação
em Genética e Biologia Molecular da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia
Molecular.
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________________
Profª. Drª. Daisy Maria Fávero Salvadori
UNESP – Botucatu
__________________________________________
Profª. Drª. Ilce Mara de Syllus Cólus
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
__________________________________________
Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
3
Dedicatória
Aos meus pais Zé Mario e Rose, por me incentivarem e apoiarem,
desde 17 de Setembro de 1983.
4
Agradecimentos
Ao professor e amigo Dr. Mário Sergio Mantovani, pela orientação, paciência,
broncas e acima de tudo por acreditar em mim desde a minha iniciação cientifica, me
incentivando a continuar na vida acadêmica.
A professora Dra. Lucia Regina Ribeiro, pela orientação, amizade e por todos as
portas que esta me abriu, ajudando a minha formação profissional.
A banca examinadora composta pelas professoras Dra. Ilce Mara de Syllos
Cólus e Dra. Daisy Maria Fávero Salvadori, pelas criticas e sugestões que ajudaram na
melhoria deste trabalho.
A todo o pessoal do laboratório de Genética Toxicológica do Instituto do Câncer
de Viena, por terem me aceitado e me auxiliado durante quase 2 meses, onde tive o
privilegio de trabalhar com estes.
Aos professores Ana Lucia Dias, Leda M.K. Sodré, Josué Maldonado, Berenice
Quinzani Jordão, Silvia Helena Sofia e Lucia Caetano pelos ensinamentos passados
durante os dois anos de mestrado.
A coordenação do Curso de Mestrado em Genética e Biologia Molecular.
Ao departamento de Biologia Geral da UEL.
5
As agencias de fomento, CAPES, CNPq e Fundação Araucária, sem as quais não
teria sido possível o desenvolvimento deste trabalho.
Aos técnicos de Laboratório, Dario e Melissa pelos auxílios nos serviços
laboratoriais.
Aos amigos de turma, especialmente ao Bruno “Caboclo” pelos mais de 5 anos
de amizade, companheirismo, trapalhadas e todo tipo de robada que alguém pode se
envolver!
Ao pessoal do Laboratório de Mutagênese in vitro e in vivo, que fizeram com
que esses 2 anos fossem os mais agradáveis e marcantes possíveis, em especial agradeço
ao amigo Gustavo por ter me ajudado sempre que precisei mesmo que a ajuda oferecida
fosse em cerveja! Agradeço a Juliana Mara por ter agüentado minhas reclamações e
dores de cotovelo e horas intermináveis de conversas na Internet... o que dificultou
muito o termino desse trabalho! A Mariana também por esta paciência inesgotável,
sempre pronta a ouvir as reclamações independente do horário e do dia! A Hellen pelas
muitas conversas em Inglês durante os churrascos, onde aprendi que o Álcool ajuda e
muito na fluência! A Iara pelos momentos divertidos proporcionados em todas as festas
que fomos. Ao Fernando “Trovão” pelas poucas e boas dicas tanto a nível profissional
como pessoal, e pelos momentos únicos proporcionados por este durante as aulas, e por
ultimo a Marcela por ter agüentado minhas neuras, bagunças e qualquer tipo de
transtorno, durante os quase dois anos em que moramos juntos em Viena!
6
Aos amigos que trago desde criança e outros mais recentes, Humberto, Gustavo,
Luis Henrique, Diogo, Fellipe, Vinicius “Blequi” e Marcelo pelos ótimos, churrascos,
cervejadas, formaturas fazendo com que todos os anos que ficaram para trás tivessem
um sabor um significado que permearão comigo para sempre!
Ao meu irmão José Lourenço, pelos mais de 20 anos de brigas,
desentendimentos mas que de alguma forma ajudaram a estreitar o nosso laço de
amizade nos últimos anos.
Aos meus familiares, tios, tias, primos, primas, avôs e avós por cada um ter uma
parcela na minha formação pessoal, e também por me fazerem entender que não a nada
mais forte e importante que a Família.
7
Sumario
1)Introdução......................................................................................................................1
1.1) Nutrição e Carcinogênese..............................................................................1
1.2)Quimioprevenção............................................................................................3
1.2.1) Classificação dos mecanismos de quimioprevenção......................3
1.3) Beta-glucanas (BG).......................................................................................7
1.4) Ensaios de mutagênese e cultura celular........................................................8
1.4.1) Teste de aberrações cromossômicas...............................................9
1.4.2) Teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese.......................11
1.4.3) Ensaio do cometa..........................................................................12
2) Objetivos.....................................................................................................................14
2.1) Objetivos específicos ..................................................................................14
ARTIGO 01 – Anticlastogenic effect of β-glucan from barley towards chemicaly
induced DNA damage in rodent cells.............................................................................15
ARTIGO 02 – Protective effect of β-glucan from Agaricus brasiliensis against
chemically induced DNA damage in human lymphocytes.............................................17
ARTIGO 03 – Redução do efeito genotóxico do benzo[a]pireno em células hepáticas
(HepG2) tratadas com -glucana extraída de cevada.......................................................19
ARTIGO 04 - β-glucana extraída do cogumelo medicinal Agaricus blazei previne
efeitos genotóxicos e mutagênicos causados pelo Benzo[a]pireno em linhagem celular
hepática humana..............................................................................................................40
ARTIGO 05 - Avaliação do efeito genotóxico e/ou antigenotóxico de polissacarídeos
extraídos de diferentes fases do desenvolvimento do cogumelo medicinal Agaricus
brasiliensis......................................................................................................................63
Considerações finais.......................................................................................................81
Referencias bibliográficas...............................................................................................82
Anexo1............................................................................................................................89
Anexo2............................................................................................................................96
8
RESUMO
As β-glucanas são polissacarídeos extraídos da parede celular de diversos organismos.
Composto este que atraiu a atenção devido a suas propriedades medicinais. O objetivo
do presente estudo foi de testar o efeito genotóxico e ou antigenotóxico de BG extraídas
de Agaricus blazei e cevada, contra agentes genotóxicos diretos (Metil metanosulfonato
-MMS, Ara-C, BPDE, H
2
O
2
, Bleomicina, Doxorubicina) e indiretos (Trp-p-2,
Benzo[a]pireno – B[a]P, 2-aminoantraceno - 2AA), através do ensaio do cometa,
micronúcleo (somente a BG de Agaricus blazei) e aberrações cromossômicas (somente
cevada). Também foram realizados diferentes tipos de tratamento para obtermos
informações sobre os possíveis mecanismos de ação da BG. Os resultados
demonstrados no primeiro trabalho mostraram que a BG de cevada apresentou eficiente
redução dos danos causados pelo MMS, 2-AA e Ara-C nas linhagens HTC e CHO-k1
avaliadas pelo teste de aberrações cromossômicas. No segundo trabalho, mostrou-se
através do teste do cometa que a BG de Agaricus blazei reduziu os danos causados pelo
Trp-p-2, H
2
0
2
porem não do BPDE em linfócitos humanos. O terceiro trabalho avaliou
pelo teste do cometa que a BG de cevada reduziu na linhagem HepG2 os danos
causados pelo B[a]P em diferentes fases de tratamento. No quarto trabalho, ficou
demonstrado pelo teste do cometa e do micronúcleo que a BG de Agaricus reduziu
eficientemente a migração de DNA e a formação de micronúcleos induzidos pelo B[a]P
em diferentes protocolos de tratamento na linhagem HepG2, por ultimo no quinto
trabalho foi evidenciado que polissacarídeos de parede de Agaricus e BG extraídas dos
mesmos apresentaram efeito protetor contra os danos induzidos pela bleomicina,
doxorubicina, e H
2
O
2
, efeito protetor que aumenta conforme a maturação do cogumelo.
9
Desta maneira, sugere-se que a BG é um eficiente protetor do material genético,
protegendo o DNA de células tratadas com diversos compostos mutagenicos,
protegendo principalmente por um mecanismo de desmutagênese, entretanto resultados
obtidos nos nossos estudos não permitam a exclusão de um mecanismo de bio-
antimutagenese. Isso tudo possibilita em um futuro próximo a adição de BG na
alimentação para o seu uso como um agente quimiopreventivo, entretanto para isso mais
estudos precisam ser realizados.
10
Abstract
ß-glucans are polussacharides extracted of the cellular wall of several organisms.
Composed this that attracted the attention due to their medicinal properties. The
objective of the present study was to test the genotoxic and/or antigenotoxic effect of
BG extracted of Agaricus blazei and barley, against agents direct genotóxicos (Methyl
methanesulfonate -MMS, Ara-C, BPDE, H2O2, Bleomycin, Doxorubycin) and indirect
(Trp-p-2, Benzo[a]pireno - B[a]P, 2-aminoanthracen - 2AA), through the comet assay,
micronuclei (only the BG of Agaricus blazei) and chromossomal aberration (only
barley). Also different treatment types were accomplished for us to obtain information
on the possible mechanisms of action of BG. The results demonstrated in the first work
showed that barley BG presented efficient reduction of the damages caused by MMS, 2-
AA and Ara-C in the lineages HTC and CHO-k1 for the chromossomal aberrations. In
the second work, it was shown through the comet assay that BG of Agaricus blazei
reduced the damages caused by Trp-p-2, H202 but not of BPDE in human lymphocytes.
The third work evaluated by the comet assay that barley BG reduced in the lineage
HepG2 the damages caused by B[a]P in different treatment phases. In the fourth work, it
was demonstrated by the comet and micronucleus assay that BG of Agaricus reduced
the migration of DNA and the micronúcleos formation efficiently induced by B[a]P in
different treatment protocols in the lineage HepG2, for last, in the fifth work was
evidenced that polissacharides of wall of Agaricus and BG extracted of the same ones
presented protecting effect against the damages induced by the bleomicina,
doxorubicina, and H2O2, protecting effect that it increases according to the maturation
of the mushroom.
11
Of this it sorts things out, he/she suggests himself that BG is an efficient protector of the
genetic material, protecting DNA of cells treated with composed several mutagenicos,
protecting mainly for a desmutagênese mechanism, however results obtained in our
studies don't allow the exclusion of a bio-antimutagenese mechanism. That everything
makes possible in a close future the addition of BG in the feeding for his/her use as an
agent quimiopreventivo, meantime for that more studies need to be accomplished.
12
1. Introdução
O Século XX e início do século XXI têm sido caracterizados por um significante
aumento na expectativa de vida e por uma revolução nas principais causas de morte de
sua população (DE FLORA et al., 2005). Durante séculos a população humana fora
dizimadas nos primeiros anos de vida por infeções virais, bacterianas ou outros
organismos patogênicos. Devido ao avanço da medicina preventiva e curativa, nos
últimos 100 anos houve um grande aumento na expectativa de vida da população,
proporcionando um aumento na taxa de mortes por doenças degenerativas, como o
câncer, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. O controle destas doenças é
complicado devido às suas naturezas multifatoriais, entretanto, no caso do câncer,
estudos demonstraram um aumento na expectativa de vida de 15 à 20 anos em
indivíduos portadores de cânceres (CIMMONS et al., 1995; LEVI et al., 2002; DE
FLORA et al., 2005). Essas características demonstram que é possível prevenir o
câncer não apenas em uma escala individual, mas também em uma escala global. Para
isso, são necessárias medidas que possibilitem cada vez mais entender como se
desenvolve o processo neoplásico, e também mecanismos pelo qual freá-lo ou
desacelerá-lo, possibilitando assim, otimizar estratégias de prevenções para as
populações.
1.1 Nutrição e Carcinogênese
Diversos estudos epidemiológicos têm relacionado o surgimento de neoplasias
em diversos órgãos, como estômago, cólon, próstata e mama a uma dieta inapropriada
(WCFR/AICR, 1997). Muitos estudos tentam esclarecer o processo de carcinogênese
nestes órgãos e o principal fator causador tem sido atribuído a compostos químicos ou
13
processos celulares que alteram a molécula de DNA, resultando em mutação,
possibilitando a ativação de oncogenes e também a perda de heterozigosidade de genes
supressores tumorais (FERGUSON et al., 2003).
Ao longo dos anos tem sido demonstrado que, vários compostos presentes na
dieta, têm capacidade de induzir danos ao material genético. Entre os mutágenos
presentes nos alimentos mais comuns e mais estudados encontram-se: compostos N-
nitrosos (ex: alimentos embutidos e cervejas); várias toxinas fúngicas (ex: Aflatoxinas e
as Fumonisinas); compostos mutagênicos formados durante o preparo de carnes (ex:
aminas aromáticas heterocíclicas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos) e alimentos
ricos em carboidratos (ex: acrilamida) (GELDERBLOM et al., 2001; LAYTON et al.,
1995; JAGERSTAD e SKOG, 2005). A exposição a estes fatores está relacionada a uma
maior probabilidade de desenvolvimento de neoplasias em alguns órgãos,
principalmente do trato gastrintestinal (FERGUSON et al., 2003).
A presença de alguns micronutrientes (ex: Vitamina B12, Folato, Niacina,
Magnésio, Zinco entre outros) é outro fator importante, que tem recebido muita atenção,
uma vez que, são necessários em concentrações ótimas na dieta para a manutenção da
estabilidade genômica. A ausência destes compostos em concentrações ótimas no
organismo pode produzir efeitos similares aos obtidos na exposição a carcinógenos
(FENECH e FERGUSSON, 2001).
Entretanto, existem também compostos da dieta que têm a capacidade de
diminuir a freqüência de mutação, compostos esses denominados antimutagênicos. A
comunidade científica tem levantado a hipótese de que uma diminuição na taxa de
mutação de um organismo poderia levar a um atraso no surgimento de neoplasias, o que
poderia resultar no não surgimento das mesmas durante o período de vida do organismo
(LOEB et al., 2003). Várias substâncias obtidas a partir de fontes naturais têm sido
14
isoladas, identificadas e alguns dos mecanismos de sua atividade estão sendo
esclarecidos. A N-acetil-l-cisteína, o ácido p-aminobenzóico (PABA), os isotiocianetos
aromáticos, as clorofilas e derivados, a glutationa, a vitamina C, a vitamina E, a
vitamina A, os flavonóides, alguns ácidos graxos e as fibras dietéticas são algumas das
substâncias antimutagênicas conhecidas encontradas na dieta (GEBHART, 1974;
AMES, 1983; AMES, 1986; HARTMAN e SHANKEL, 1990; ODIN, 1997; LOHMAN
et al., 2001).
1.2 Quimioprevenção
De forma arbitrária, o tratamento do câncer pode ser dividido em 3 níveis de
prevenção: I ) prevenção primária (voltada a indivíduos saudáveis), II) prevenção
secundária (voltada a pacientes em estados iniciais ou pré-clínicos) e III) prevenção
terciária (voltada a pacientes após a terapia) (LAST, 1986; DE FLORA et al., 2001).
A quimioprevenção pode ser classificada em primária ou secundária. Por
definição, quimioprevenção é a administração de agentes farmacológicos (KELLOFF,
1994, 2004) ou compostos da dieta (na forma de macronutrientes, micronutrientes ou
fitoquímicos não nutritivos) (FERGUSON, 1994; FERGUSON et al., 2004; SUHR,
2003) que previnem a indução, inibem ou atrasam a progressão do câncer (SPORN,
1979) ou inibição ou reversão da carcinogênese em estágios pré-malignos (KELLOFF,
2000).
1.2.1 Classificação dos mecanismos de quimioprevenção
Virtualmente, todos os caminhos que levem a causar dano ao DNA e mais tarde
dão início ao processo de carcinogênese são passíveis de modulação. A primeira
15
classificação utilizada para os quimiopreventivos foi a de Watenberg (1981) que os
divide em dois grupos: a) agentes bloqueadores, que impedem que carcinógenos atuem
no DNA e b) agentes supressores, os quais impossibilitam a evolução do processo
neoplásico. De acordo com Morse e Stoner (1993), agentes bloqueadores são melhores
classificados como inibidores de iniciação tumoral e agentes supressores como
inibidores de promoção e progressão.
Kada et al. (1982), dividiu compostos antimutagênicos em: a) desmutágenos,
compostos que inativam o mutágeno antes que este reaja com o DNA e b)
bioantimutágenos, que interferem na fixação do dano na molécula de DNA. Mais tarde
o ICPEMC (grupo de especialistas em antimutágenos e desmutágenos) classificou
compostos antimutagênicos em fases: a) inibidores de fase I, aqueles que atuam
extracelularmente e b) inibidores de fase II, que atuam intracelularmente (RAMELs2.80892( )-120]TJ-330.6 -29(A)9.23319(M)-4.64466(xt)1.0421(.)-8.31915( )-69, KM N eEul al e e las enielsão ais77.61789( )-271.27 ashora ano 0M gênte2-2.80762(s)16.654( )-58.5J-330.6 55m( 2 Td[(i)-9.23384(ni)1.40446(bi)1.40381(dor)3.21279(e)-13.4472(s)16.667( )-228.73(de)-2.80762( )-122.33(de)-20381(u)10.60381(i)1.480892(g)10.6383(ê)-13.4492(nos)6.80892(s)6.0217( )-22.4472( )-111.7303. )-2.4472( )-111.7303. lsc
16
a.1.5) Estimulação de captura e detoxificação em células não
alvo.
a.2) Inibição de mutação e iniciação em células alvo
a.2.1) Modificação de transportadores de membrana.
a.2.2) Modulação do metabolismo.
a.2.3) Bloqueio ou competição.
a.2.4) Inibição de replicação celular.
a.2.5) Manutenção da estrutura do DNA e modulação de reparo.
a.2.6) Controle da expressão gênica.
a.3) Inibição de promoção tumoral.
a.3.1) Inibição de efeitos genotóxicos.
a.3.2) Atividade antioxidante e captura de radicais livres.
a.3.3) Atividade antiinflamatória.
a.3.4) Inibição de protease.
a.3.5) Inibição da proliferação celular.
a.3.6) Indução de diferenciação celular.
a.3.7) Modulação de apoptose.
a.3.8) Modulação da tradução de sinais
a.3.9) Proteção da comunicação celular.
b. Prevenção secundária:
b.1) Inibição de progressão tumoral
b.1.1) Inibição de efeito genotóxico.
b.1.2) Inibição de protease.
b.1.3) Atividade antioxidante e captura de radicais livres.
b.1.4) Modulação da tradução de sinais
17
b.1.5) Efeito no padrão hormonal.
b.1.6) Modulação do sistema imune.
b.1.7) Inibição de angiogênese.
b.1.8) Atividade antineoplásica.
c. Prevenção terciária:
c.1) Inibição de invasão e metástase
c.1.1) Atividade antioxidante e captura de radicais livres.
c.1.2) Modulação da tradução de sinais.
c.1.3) Inibição da proliferação celular.
c.1.4) Modulação da Apoptose.
c.1.5) Indução de diferenciação celular.
c.1.6) Inibição de Angiogênese.
c.1.7) Efeito em moléculas de adesão celular.
c.1.8) Inibição de proteases.
c.1.9) Ativação de genes anti-metástases.
Na prevenção terciária, é importante ressaltar que apesar dela não se encaixar
muito bem na definição de agentes quimiopreventivos (no stricto sensu da palavra), ela
é demonstrada no esquema proposto, pois há uma sobreposição de efeitos, devido à
coincidência com mecanismos de prevenção primária e secundária (DE FLORA, 2005).
Vale ressaltar também que compostos que atuam inibindo uma dessas vias de
carcinogênese e/ou mutagênese podem também atuar estimulando uma dessas vias (ex:
Beta-caroteno, que atua como um antioxidante, porem em concentrações elevadas este
pode atuar como pró-oxidante e estimulador de enzimas de fase I) (PALOZZA et al.,
2006).
18
1.3 Beta Glucanas (BG)
Glucanas são polissacarídeos constituídos de unidades D-glucopiranosil que
podem ser encontradas nas paredes celulares de uma variedade de organismos tais como
cereais, plantas, algas, bactérias, fungos e leveduras. A estrutura macromolecular das
glucanas depende tanto da fonte como do método de isolamento. As glucanas consistem
de um esqueleto central linear formado por unidades D-glucopiranosil unidos por
ligações β (13), com ramificações que podem ser do tipo (16) ou (14) (Fig. 1),
estas ligações podem variar tanto em comprimento como em distribuição, o que resulta
em uma estrutura terciária estabilizada por pontes de hidrogênio intracadeia (ZEKOVIC
et al, 2005).
Figura 1: Molécula de BG de fungo, apresentando ligações β(16), ß(13) (retirado de Zekovic et al., 2005)
Este grupo heterogêneo de poliglucoses com ligações beta, tem atraído o
interesse das indústrias farmacêuticas e de pesquisas com alimentos funcionais devido
ao seu efeito benéfico na saúde humana. Exemplos de seus efeitos benéficos incluem:
estimulação do sistema imune, anti-inflamatório, antimicrobiano, antitumoral,
hepatoprotetor, redução do colesterol, antifibrótico, antidiabético e atividade
hipoglicêmica (BROWN et al., 2003; KOJIMA et al., 1986; ROBINS e SEELEY, 1977;
SUTHERLAND, 1998; TREPEL, 2004).
19
Devido a esta heterogeneidade de efeitos biológicos relevantes para a saúde
humana tem havido um grande interesse por parte de pesquisadores na identificação e
caracterização de BG de diversas origens. Da mesma maneira que há interesse na
caracterização química, existe também o interesse na modificação da estrutura destes
compostos através da adição de grupamentos químicos (principalmente grupos sulfatos),
especialmente com o intuito de aumentar a solubilidade do mesmo.
1.4 Ensaios de Mutagênese e cultura celular
O potencial mutagênico de xenobióticos pode ser avaliado através de ensaios in
vitro desde que obedeçam a critérios básicos como: sensibilidade para revelar com
facilidade e precisão estatística mesmo um pequeno defeito mutagênico;
reprodutibilidade e capacidade para avaliar eventos genéticos que possam estar
diretamente relacionados ao homem, fornecendo uma estimativa de risco ou nível de
segurança para a população exposta (RODRIGUES, 1991).
Vários métodos para detecção de mutações são utilizados, assim, dependendo da
finalidade do estudo, do tipo de material a ser avaliado, do nível de informação que se
deseja obter e das condições laboratoriais existentes, determina-se qual o sistema-teste e
parâmetro a ser avaliado são os mais adequados. Entretanto, as diferenças na
organização do material genético da célula, quando se comparam sistemas em
microrganismos, vegetais e animais, fazem dos sistemas de mamíferos os mais
aceitáveis para se tentar fazer uma extrapolação dos resultados obtidos para os possíveis
efeitos causados ao homem (RABELLO-GAY, 1991).
Sistemas de células de mamíferos em cultura são amplamente utilizados na
detecção de agentes mutagênicos e antimutagênicos ambientais em testes de curta
duração (KURODA et al., 1992). Estes procedimentos estão sendo cada vez mais
20
empregados para identificar não só agentes mutagênicos/antimutagênicos como também
o potencial carcinogênico/anticarcinogênico de compostos químicos (BROCKMAN et
al., 1992) e são muito indicados devido às facilidades de administração das doses e
manutenção (HEDDLE, 1982).
Testes com células de mamíferos em cultura apresentam várias vantagens:
facilidade para padronizar as condições experimentais (temperatura, pH, composição do
meio de cultura, densidade populacional) devido ao material ser relativamente uniforme
em seus requisitos metabólicos e em seu comportamento; possibilidade de tratamento
das células em várias fases do ciclo celular; economia, rapidez e boa reprodutibilidade;
organização dos cromossomos e do seu DNA igual às células in vivo (RABELLO-GAY,
1991), além de eficiência estatística, uma vez que o número de células analisadas é
maior em relação a outros testes.
A maior desvantagem de ensaios em células de cultura in vitro é que a maioria
das linhagens celulares não tem capacidade de metabolização de drogas, necessitando
da adição de um sistema endógeno de metabolização como o S9 (PRESTON, 1997a).
No entanto, esta dificuldade vem sendo contornada com a utilização de linhagens
celulares proficientes em metabolização como, por exemplo, as linhagens hepáticas
HepG2 e HTC (KNASMULLER et al., 2004).
1.4.1 Teste de aberrações cromossômicas (AC)
Alterações na estrutura cromossômica têm sido estudadas há quase um século e
relacionadas com efeitos prejudiciais (BOVERI, 1902 apud TUCKER e PRESTON,
1996). Anomalias citogenéticas são hoje conhecidas em seus vários tipos e sabidamente
são induzidas pelos mais diferentes agentes através de muitos mecanismos, dos quais
21
grande parte é bastante conhecida, mas muitos ainda não foram elucidados (PRESTON,
1995). Em mamíferos, anomalias cromossômicas têm sido observadas em virtualmente
todos os tipos celulares e tecidos examinados, tanto em estudos in vitro como in vivo
(TUCKER e PRESTON, 1996).
O teste de aberrações cromossômicas in vitro tem se tornado muito importante
como parte do controle de produção de medicamentos na fase I (ANVISA), frente ao
potencial protetor de produtos farmacêuticos e de plantas, sendo exigido que estas
substâncias se submetam a um estudo para indução de AC in vitro (MOSESSO, 1994),
além de gerar muitas informações sobre os mecanismos de mutagenicidade induzida por
agentes químicos e físicos, sendo muito empregado também na indicação a exposição
humana a tais agentes (GALLOWAY et al., 1998).
A análise de AC é restrita às células mitóticas em metáfase pois, somente nessa
fase do ciclo celular, o DNA está suficientemente condensado para ser observado na
forma de cromossomo em microscópio ótico (BOEI, 1996). Para isto é necessário o
tratamento das células com inibidores de polimerização do fuso mitótico, como
colchicina e colcemide.
As ACs podem ser classificadas como estruturais e numéricas. As aberrações
numéricas podem ser originadas pela ação de agentes aneugênicos, responsáveis por
uma segregação incorreta dos cromossomos durante a anáfase, observando perda ou
ganho de cromossomos inteiros (SWIERENGA et al., 1991). As ACs estruturais são
alterações na estrutura cromossômica, visíveis microscopicamente, que envolvem
quebra(s) de fita(s) do DNA, seguida(s) ou não de rearranjo anormal dos fragmentos do
(s) cromossomo(s) quebrado(s). A quebra pode ser completa em uma única cromátide
(quebra cromatídica) ou em ambas as cromátides (quebra isocromatídica), resultando na
perda ou deleção de parte do material cromossômico, translocação ou outros rearranjos.
22
São consideradas quebras quando a falta do material no cromossomo é maior do que a
largura da cromátide ou quando há um deslocamento de uma ou ambas as cromátides
em relação ao resto do cromossomo (SWIERENGA et al., 1991). Também é possível
observar outras aberrações como anéis, cromossomos dicêntricos, fragmentos acêntricos
e outros rearranjos mais complexos que geralmente levam à morte celular, pois
promovem uma disfunção na distribuição do material genético durante um novo ciclo de
divisão celular.
A contagem das ACs é realizada pela medida direta das lesões o que oferece
uma avaliação precisa da atividade clastogênica. O tipo de AC produzida depende do
agente genotóxico, da fase do ciclo celular e do tempo de tratamento (DARROUDI,
1990).
1.4.2 Teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese
Os Micronúcleos (MN) são pequenos corpos contendo DNA, localizados no
citoplasma. Aparecem na telófase e são resultado de fragmentos acêntricos (originados
de quebra isocromatídica ou cromatídica) ou de disfunções no fuso mitótico. Desta
forma, podem ser gerados por agentes clastogênicos e aneugênicos. Pode haver um ou
mais MN por célula e tais corpúsculos não devem apresentar qualquer conexão
estrutural com o núcleo principal, birrefringência ou ter mais do que 1/3 do tamanho do
núcleo principal. (MERSCH et al., 1996; KIRSCH-VOLDERS e FENECH, 2001).
A aplicação do bloqueio da citocinese, com a citocalasina-B (Cyt-B) permite
identificar células que tenham passado por um ciclo de mitose após o tratamento in
vitro. Esta variação técnica tem transformado o teste do MN em uma ferramenta útil na
triagem de danos genéticos (FENECH e MORLEY, 1985). A Cyt-B é um potente
23
inibidor dos microfilamentos de actina, impedindo a polimerização dos mesmos na
placa equatorial formada no final da telófase desta forma, observa-se uma cariocinese
com ausência de citocinese. A análise é feita contabilizando as células binucleadas que
apresentam micronúcleos, uma vez que, somente estas realmente apresentam danos
causados pelo tratamento induzido.
É interessante ressaltar que estudos recentes demonstraram que um aumento de
micronúcleos em linfócitos periféricos está diretamente relacionado ao surgimento de
neoplasias (Bonassi et al., in press).
1.4.3 Ensaio do Cometa
O ensaio do cometa (Single Cell Gel Electrophoresis) é um método sensível para
quantificar quebras de fita no DNA (OSTLING e JOHANSON, 1984). Este tem atraído
atenção na última década devido à sua simplicidade, sensibilidade, versatilidade,
velocidade e economia, visto a quantidade crescente de publicações que têm utilizado o
mesmo (COLLINS, 2004).
Após embeber células em agarose e depositá-las em uma lâmina, estas são
lisadas com Triton X-100 e 2,5M NaCl para remoção do citoplasma e a maior parte das
proteínas nucleares, deixando apenas DNA super-enovelado, na forma de nucleóides.
Durante a eletroforese, o DNA é atraído ao ânodo, porém, movimentos significativos
tomam lugar apenas onde há a presença de quebras, onde uma cauda que se estende do
nucleóide pode ser evidenciada. Cometas podem ser formados sob condições de
eletroforese neutras ou básicas, entretanto, a variável mais utilizada apresenta um
tratamento prévio a eletroforese com NaOH/EDTA a um pH superior a 13, desta forma
permitindo o relaxamento da dupla hélice (SINGH et al., 1988). Após a eletroforese as
24
lâminas são coradas com corantes fluorescentes que se intercalam ao DNA (brometo de
etídeo, laranja de acridina, entre outros) e podem então ser analisadas visualmente ou
através da ajuda de softwares.
O ensaio do cometa tem sido utilizado em diversas áreas como a genética
toxicológica, ecotoxicologia, reparo de DNA, apoptose, entre outras. Tendo em vista
essa maleabilidade do teste, o mesmo tem tido uma crescente importância nos estudos
de mutagênese e carcinogênese, conseqüentemente para antimutagênese e
anticarcinogênese.
25
3) Objetivo Geral
Avaliar o possível efeito genotóxico e ou antigenotóxico de BGs de origem
vegetal e fúngica.
3.1) Objetivo Especifico
Avaliar o efeito protetor de BG de cevada frente a diferentes agentes indutores
de danos e inibidor de reparo, em linhagem proficiente em metabolização, através do
teste de AC (Artigo 1).
Avaliar o efeito protetor e possível mecanismo de ação de BG de origem fúngica
em linfócitos humanos frente ao Trp-p-2, H
2
0
2
e BPDE através do teste do cometa
(Artigo 2).
Avaliar o efeito protetor da BG de cevada frente aos danos induzidos pelo B[a]P
em linhagem hepática humana utilizando o teste do cometa e diferentes protocolos de
tratamento (Artigo 3).
Avaliar o efeito protetor da BG de Agaricus blazei frente aos danos induzidos
pelo B[a]P em linhagem hepática humana utilizando o teste do micronúcleo e cometa
em diferentes tipos de tratamento (Artigo 4).
Avaliar o efeito protetor de polissacarídeos de parede e BGs extraídas em
diferentes fases do desenvolvimento do cogumelo Agaricus blazei contra os danos
induzidos por agentes formadores de ROS (Artigo 5).
26
Artigo 1
Artigo publicado no periódico “Human and Experimental Toxicology”
Volume 25; pp 319-324, 2006 (Anexo 1)
27
Anticlastogenic effect of β
ββ
β-glucan extracted from barley towards chemicaly
induced DNA damage in rodent cells
José Pedro F. Angeli, Lúcia Regina Ribeiro, Marilanda Ferreira Bellini, Mário Sérgio
Mantovani
Abstract:
β-Glucan (BG) was tested in vitro to determine its potential clastogenic and/or
anticlastogenic activity, and attempts were made to elucidate its possible mechanism of
action by using combinations with an inhibitor of DNA polymerase. The study was
carried out in a cells deficient (CHO-k1) and cells proficient (HTC) in phase I and phase
II enzymes, and the DNA damage was assessed by the chromosomal aberration assay.
BG did not show a clastogenic effect, but rather was anticlastogenic in both cell lines
used, and at all concentrations tested (2.5, 5 and 10µg/ml) in combination with damage
inducing agents (methylmethane sulfonate in cell line CHO-k1 and methylmethane
sulfonate or 2-aminoanthracene in cell line HTC). BG also showed a protective effect in
the presence of a DNA polymerase β inhibitor (cytosine arabinoside-3-phosphate, Ara-
C), demonstrating that BG does not act through an antimutagenic mechanism of action
involving DNA polymerase β.
Key words: β-glucans, chromosomal aberrations, antimutagenesis, drug-metabolizing
cells.
28
Artigo 2
Artigo publicado no periodico “Cell Biology and Toxicology”
Volume 22; pp 285-291, 2006 (Anexo 2)
29
Protective effects of β
ββ
β-glucan extracted from Agaricus brasiliensis against
chemically induced DNA damage in human lymphocytes
Angeli, J.P.F; Ribeiro, L.R; Gonzaga M.L.C; Soares S. de A; Ricardo, M.P.S.N;
Tsuboy M.S; Stidl, R; Knasmueller, S; Linhares, R.E ;Mantovani, M.S
Abstract
β-Glucans (BG) are polysaccharides that are found in the cell walls of
organisms such as bacteria, fungi and some cereals. The objective of the present study
was to investigate the genotoxic and antigenotoxic effects of BG extracted from the
mushroom Agaricus brasiliensis (=Agaricus blazei Murrill ss. Heinemann). The
mutagenic activity of BG was tested in single cell gel electrophoresis assays with
human peripheral lymphocytes. In addition, the protective effects against the cooked
food mutagen 3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole (Trp-P-2) and (+/-)-anti-
B[a]P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide (BPDE) which is the main metabolite of B(a)P,
and against ROS (H
2
O
2
)-induced DNA damage were studied. The results showed that
the compound itself was devoid of mutagenic activity, and that a significant dose-
dependent protective effect against damage induced by hydrogen peroxide and Trp-P-2
occurred in the dose range of 20-80 µg/ml. In order to explain the prevention of Trp-P-
2-induced DNA damage, a binding assay was carried out to determine if BG inactivates
the amine via direct binding. Since no such interactions were observed, it is likely that
BG interacts with enzymes involved in the metabolism of the amine.
Key Words: Agaricus brasiliensis, BPDE, comet assay, β-glucan, hydrogen peroxide,
Trp-P-2.
30
Artigo 3
Artigo a ser submetido ao periódico “Toxicology In Vitro”
31
Redução do efeito genotóxico do benzo[a]pireno em células de hepatoma
humano (HepG2) tratadas com β
ββ
β-glucana extraída de cevada
J.P.F. Angeli
a
; L.R. Ribeiro
b
; M. F. Bellini
c
; J.L.F. Angeli
a
; M.S. Mantovani
a*
a) Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR,
Brazil; b) Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Depto. de
Biologia, UNESP Rio Claro, SP, Brazil e Programa de Pós-Graduação em Patologia,
Faculdade de Medicina, UNESP, Botucatu, SP, Brazil; c) Programa de Pós-Graduação
Genética, Depto. de Biologia, UNESP São José do Rio Preto, SP, Brazil
Resumo
Beta-glucanas (BG) são componentes de parede celular, e são encontradas em grandes
quantidades em alguns organismos tais como fungos, bactérias e cereais. O objetivo do
presente estudo foi avaliar o efeito protetor da BG extraída de cevada contra os danos
induzidos pelo carcinógeno B[a]P. O teste do cometa foi utilizado para avaliar tanto a
genotoxicidade como a antigenotoxicidade da BG. Com a finalidade de esclarecer de
que maneira a BG poderia estar expressando o seu efeito protetor (desmutagênese ou
bio-antimutagênese) foram utilizados 4 protocolos de tratamentos (pré-tratamento,
simultâneo simples, simultâneo com pré-incubação e pós-tratamento). Os resultados
mostraram que a BG não apresentou efeito genotóxico nas concentrações de 1, 5 e 25
µg/ml porem foi genotóxica na concentração de 100µg/ml e citotoxica na concentração
de 200µg/ml. Para a antigenotoxicidade foram utilizadas as 3 menores concentrações.
Nestas a BG foi efetiva na redução do efeito genotóxico do B[a]P em todos os
32
protocolos testados sendo que uma maior eficiência foi encontrada nos protocolos
simultâneo simples e simultâneo com pré-incubação. Assim, os dados do presente
estudo sugerem que a BG pode estar atuando por se ligar diretamente ao composto
genotóxico ou pela captura dos radicais livres produzidos durante a sua ativação
podendo ser considerado um agente protetor desmutagênico. No entanto, o efeito
protetor observado no pré-tratamento sugere a possibilidade da BG estar modulando o
metabolismo celular (ex: inibição de enzimas de fase I), diminuindo, assim, a formação
de compostos reativos. Já os resultados obtidos no pós-tratamento poderiam indicar
uma possível modulação do reparo de DNA ou apoptose. Esses dois resultados sugerem
atividade protetora do tipo bio-antimutagênese.
1. Introdução
O desenvolvimento do câncer é um processo longo precedido por uma série de
eventos, culminando, nos seus estágios finais na migração das células neoplásicas para
outras partes do organismo. Apesar dos avanços científicos, a terapia clínica para o
câncer, que incluem cirurgia, quimioterapia e radioterapia, particularmente durante a
fase terminal de metástase, são muito limitadas. Entretanto, existem evidencias de
estudos epidemiológicos e patológicos, que muitos cânceres humanos podem ser
prevenidos ou ter o seu crescimento retardado (Weinstein., 1991). Desta forma, existe a
possibilidade de interferir ou mesmo prevenir a progressão de cânceres nas etapas
inicias da carcinogênese, estratégias estas que ainda não são levadas em conta pela
comunidade médica (Chen., 2005). Este tipo de abordagem é designada de
quimioprevenção. Hoje em dia diversos estudos sugerem que o consumo de frutas,
33
vegetais e grãos apresentam em geral um efeito inverso ao surgimento de doenças
degenerativas, como é o caso do câncer (Potter et al., 1997; Ferguson and Harris 2003).
Desta forma, a comunidade científica tem tido o seu interesse atraído para o
estudo de compostos da dieta que podem atuar de forma a proteger o material genético,
uma vez que eventos mutacionais estão envolvidos nas primeiras etapas da
carcinogênese. Entre os componentes da dieta que vem chamando a atenção, estão as β-
glucanas (BG). BG são polissacarídeos constituídos de unidades D-glucopiranosil, que
podem ser encontradas em uma variedade de organismos como cereais, plantas, algas,
bactérias, fungos e leveduras. A estrutura macromolecular das glucanas depende tanto
da fonte como do método de isolamento e purificação. As glucanas consistem de um
esqueleto central linear formado por unidades D-glucopiranosil unidos por ligações β
(13), com ramificações que podem ser do tipo (16) ou (14). Estas ligações
podem variar tanto em comprimento como em distribuição, o que resulta em uma
estrutura terciária estabilizada por pontes de hidrogênio intracadeia. As BG (13), com
ramificações (14), parecem estar restritas a família das Gramineae, sendo o principal
componente da parede do endosperma de cereais comercialmente importantes, como é o
caso da cevada, sorgo, arroz, aveia e trigo (Zekovic et al., 2005).
Dentre os efeitos benéficos das BG podemos destacar a estimulação do sistema

34
O presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito genotóxico e/ou
antigenotóxico de BG extraída de cevada na linhagem celular hepática humana HepG2.
Foram empregados no estudo diferentes protocolos de tratamento, buscando elucidar o
possível mecanismo pelo qual a BG estaria expressando o seu efeito protetor.
2. Materiais e Métodos
2.1. Agentes químicos
O dano ao DNA foi induzido pelo benzo[a]pireno (Fluka) na concentração de
20µg/mL de meio de cultura. Para isto o agente foi diluído em DMSO (JT Baker) não
ultrapassando a concentração de 1% em cultura.
A BG utilizada neste experimento foi adquirida da empresa Sigma (99% de
pureza) e diluída em PBS. Esta BG apresenta ligações do tipo β(13) (14). Foram
utilizadas 5 concentrações para o experimento ( B1 – 1µg/ml; B2 – 5µg/ml; B3 –
25µg/ml; B4 – 100µg/ml; B5 – 200µg/ml de meio de cultura) e estas estipuladas de
acordo com o trabalho prévio de Oliveira et al (2006).
2.2. Linhagem celular
A linhagem celular hepática humana, HepG2, foi gentilmente cedido pelo Dr.
Sigfried Knasmuller do Instituto de Pesquisa do Câncer, Universidade de Viena,
Áustria. Os estoques celulares foram mantidos em freezer –80
o
C, em soro bovino fetal +
10% DMSO.
35
As culturas foram mantidas de acordo com o protocolo proposto por Uhl et al
(1999). As células foram cultivadas em frascos de cultura (TPP) de 75cm2, em meio
MEM suplementado com 15% de soro bovino fetal, em estufa de CO
2
(5%) a 37
o
C, até
atingirem confluência. Após esse período, as culturas foram tripsinizadas (0,1%) e
semeadas 2x10
5
células/poços em placas de 24 poços, e incubadas por mais 24 horas
quando, então, foram realizados os tratamentos.
2.3. Single cell gel electrophoresis (Ensaio do Cometa)
Para o ensaio do cometa foi utilizado o protocolo proposto por Uhl et al., (1999,
2000) de acordo com as premissas propostas por Tice et al., (2000). As cultura foram
divididas em dois grupos experimentais: a) na genotoxicidade foram testadas 5
concentrações de BG (1µg/mL – BG1; 5µg/mL – BG2; 25µg/mL – BG3; 100µg/mL –
BG4; 200µg/mL – BG5). b) na antigenotoxicidade as 3 concentrações menores de BG
foram associadas ao B[a]P, uma vez que estas foram as únicas a não apresentarem efeito
genotóxico ou citotóxico. Nos protocolos de antigenotoxicidade utilizamos pré-
tratamento, tratamento simultâneo (simples e com pré-incubação) e pós-tratamento
como descrito abaixo. Como controle negativo foi utilizado DMSO a 1%.
Os protocolos utilizados foram:
a) Pré-tratamento: As células HepG2 foram cultivadas por 24 horas antes do
tratamento. Após este período o meio de cultura foi descartado e as células
foram lavadas com PBS. Então era adicionado meio livre de soro e as
diferentes concentrações de BG por 24 horas. Após essas 24 horas foi
realizada a lavagem das células com PBS e adicionado meio sem soro
juntamente com o B[a]P, por mais 24 horas.
36
b) Tratamento simultâneo simples: As células foram cultivadas inicialmente por
24 horas e então foi retirado o meio de cultura e as células lavadas com PBS.
Após isso, foi adicionado meio livre de soro juntamente com as diferentes
concentrações de BG e o B[a]P, por mais 24 horas.
c) Tratamento simultâneo com pré-incubação: Idêntico ao tratamento
simultâneo descrito acima, entretanto a BG e o B[a]P a ser adicionado a
cultura foram incubados antes do tratamento em uma única solução por 1h
em estufa do tipo BOD a 37
o
C.
d) Pós-tratamento: As células foram cultivadas por 24 horas, lavadas com PBS
e adicionado meio sem soro junto com o B[a]P, por 24 horas. Após isto as
células foram lavadas novamente com PBS e adicionado meio completo
contendo BG nas diferentes concentrações, por mais 24 horas.
Ao final dos tratamentos as células foram coletadas, e uma pequena amostra
utilizada para a análise de citotoxicidade pelo método do Azul de Trypan. O restante das
células foi, então, embebido em agarose de baixo ponto de fusão e adicionadas a uma
lâmina previamente recoberta com agarose, seguido de lise onde permanecia overnight,
sendo então realizada a eletroforese (25V a 300mA).
2.4. Análise das lâminas e estatística
Para cada tratamento foram realizadas 3 repetições independentes. Para o ensaio
do cometa foram analisadas 100 células, visualmente (Kobayashi et al., 1995), e
classificadas de acordo com o seguinte critério: (classe 0) células com dano
indetectável, que não apresentavam cauda; (classe 1) células com cauda menor que o
diâmetro do núcleo; (classe 2) células com cauda entre 1 a duas vezes o diâmetro do
núcleo; (classe 3) células com cauda maior que duas vezes o diâmetro do núcleo. Após
37
isto o valor de cada célula era somado para obter o score (variável de 0 a 300), após isto
era calculado a media e os desvios de cada tratamento. Células apoptóticas que
apresentaram o núcleo totalmente fragmentado não foram levadas em consideração na
análise (Speit and Hartmann, 2005). O ensaio do cometa foi realizado somente para
tratamentos que apresentaram viabilidade superior a 80%, como mostrado pelo teste do
Azul de Trypan.
Os resultados obtidos foram analisados no programa estatístico Prism 4.0
realizando o teste de Mann-Whytney (p>0.05), para verificar diferenças entre os
tratamentos.
3. Resultados
Os resultados obtidos para a genotoxicidade estão representados na Figura 1. As
38
concentrações de 5 e 25µg/mL apresentaram efeito protetor, sendo que somente a menor
concentração (1µg/mL) não diferiu do controle B[a]P. Já no tratamento simultâneo com
pré-incubação (Figura 4) ocorreu efeito protetor das concentrações de 5 e 25µg/mL.
Semelhantemente, o pós-tratamento (Figura 5) apresentou efeito protetor para as doses
de 5 e 25µg/mL. No entanto, pode-se observar, que neste protocolo ocorreram os
menores níveis de viabilidade celular, quando comparado aos outros protocolos
utilizados.
4. Discussão
Nos últimos anos têm havido um crescente interesse por substâncias que possam
proteger ou minimizar os danos causados ao material genético humano por diversos
contaminantes ao qual o homem está exposto. Desta forma o presente trabalho
investigou o efeito genotóxico e antigenotóxico da BG extraída de cevada contra os
danos induzidos pelo B[a]P. Este foi escolhido por ser um contaminante comumente
encontrado no meio em que o homem se expõe, tanto em alimentos como no ar que ele
respira. Além disso, diferentes protocolos de tratamentos foram utilizados para
esclarecer o possível tipo de mecanismo de ação pelo qual a BG estaria causando ao seu
efeito protetor. Este efeito seria desmutagênico quando apresenta efeito protetor no
protocolo do tipo simultâneo com pré-incubação, ou bio-antimutagênico quando
apresenta um efeito protetor no pré e no pós-tratamento (Kada & Shimoi 1987). No
presente estudo, foi demonstrado que a BG extraída de cevada apresentou um efeito
genotóxico na concentração de 100µg/mL na linhagem celular HepG2. Oliveira et al.,
2006, utilizando a mesma BG, demonstrou que a concentração de 20µg/mL apresentou
aumento na formação de micronúcleos nas linhagens CHO-K1 e HTC, esta diferença de
resposta pode se explicar pela diferença na linhagem celular utilizada. Fatos estes não
39
estranhos, uma vez que é sabido que alguns compostos com potencial antigenotóxico
podem vir a apresentar também efeitos genotóxicos em determinadas concentrações
(Zeiger 2003). Este resultado nos mostra que BGs que apresentam ligações do tipo
β(13)(14), apresentam um efeito tóxico mais elevado do que as que apresentam
ligações do tipo β(13)(16), uma vez que trabalhos utilizando BG com este último
tipo de ligação não demonstraram efeito deletério, mesmo em concentrações superiores
(Angeli et al., 2006a; Oliveira et al. 2007).
O protocolo de pré-tratamento provou ser o menos eficaz contra os danos
causados pelo B[a]P, uma vez que somente a maior concentração testada mostrou-se
protetora. Estes dados indicam que a BG poderia estar atuando, possivelmente,
modulando enzimas de fase I e II. Resultados anteriores nos levam a crer que a BG
seria mais eficaz sobre enzimas de fase I, talvez inibindo-as, uma vez que no trabalho de
Angeli et al (2006b), uma BG de origem fúngica não apresentou efeito protetor contra
os danos causados pelo BPDE, produto final da ativação do B[a]P, alvo das enzimas de
fase II. Estudos recentes demonstraram que a BG de origem fúngica atuou em ratos de
forma a reduzir a expressão de enzimas CYPs (Okamoto et al., 2004). Contudo, a
presença da BG no interior da célula parece ser ainda uma especulação. Isso implica
que o efeito protetor em pré-tratamento pode ser devido a estímulos na superfície
celular, em receptores ativando vias de sinalização, até o processo de controle da
própria expressão gênica, podendo ser considerado uma modulação do metabolismo
celular de uma forma indireta.
Os protocolos de tratamento simultâneo foram os que apresentaram o maior
efeito protetor. Isto poderia estar ligado ao fato de que, neste tipo de protocolo, todos os
tipos de defesa celular estariam passíveis de modulação pelas BG. Desta forma, as BG
poderiam estar atuando de modo a capturar o B[a]P e inibindo a sua ativação, uma vez
40
que esta se mostrou capaz de se ligar a diferentes tipos de compostos como ofloxacina e
diversas micotoxinas (Devegowda et al., 1998; Krizkova et al., 2006). Isto pode ser
reforçado pelo fato de que o tratamento simultâneo com pré-incubação demonstrou
maior redução de danos, quando comparado ao tratamento simultâneo simples. Esses
dados corroboram os de Oliveira et al (2006), onde os autores constataram que a pré-
incubação da BG com os agentes metilmetanosulfonato e 2-aminoantraceno aumentava
o efeito protetor, quando comparado a o tratamento simultâneo sem pré-incubação. No
entanto, não se pode descartar a hipótese de que a BG poderia estar atuando como
capturador de radicais livres formados durante a ativação do B[a]P pelas enzimas CYPs,
visto que BG apresentam efeito antioxidante (Chovartovicova et al., 1999; Krizkova et
al., 2006; Angeli et al., 2006a).
Para os protocolos de pós-tratamento as concentrações de 5 e 25ug/mL também
apresentaram efeito protetor. Entretanto, a redução de dano foi menos eficiente quando
comparada ao dos tratamentos simultâneo simples e simultâneo com pré-incubação.
Oliveira et al (2006) também encontraram efeito protetor no protocolo de pós-
tratamento, quando induziram dano com 2-aminoantraceno e metilmetanosulfonato
sugerindo atividade do tipo bio-antimutagênese. Angeli et al (2006b), em outro trabalho
quando utilizamos um inibidor de DNA polimerase, em associação com o
metilmetanosulfonato, observamos que a BG continuou apresentando eficácia na
redução de danos, o que indica que a mesma não estaria atuando no estímulo da DNA
polimerase. Este fato sugere possível modulação de outros tipos de proteínas associadas
ao reparo, ou mesmo indução de apoptose, uma vez que nos protocolos de pós-
tratamento foram observados os menores níveis de viabilidade celular.
41
42
Em conclusão, os resultados deste estudo demonstram que a BG β(13)(14)
extraída de cevada, apresentou efeito protetor contra os danos genotóxicos induzidos
pelo pró-carcinógeno B[a]P. Desta forma pode-se considerar que este composto seria
um quimiopreventivo efetivo, diminuindo a taxa de lesões ao DNA, protegendo células
humanas contra compostos como o B[a]P ao qual o homem esta exposto e que pode
interagir de forma nociva com o material genético e assim levar ao surgimento de
diferentes doenças degenerativas como é caso do câncer. Os resultados mostram, ainda,
que esta molécula possui características antimutagênicas tanto do tipo desmutagênica,
como sugerido pelos protocolos simultâneo simples e com pré-incubação), bem como
bio-antimutagênica, como sugerido pelos protocolos pré e pós-tratamento.
Agradecimento:
Agradecemos o apoio financeiro das instituições financeiras: CAPES, CNPq e
Fundação Araucária
5. Referencias
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*
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Cont
r
ol
B
[
a
]
P
B
1
B2
B3
B
4
B5
Mean of comet score
0
20
40
60
80
100
% of viable cells
Figura 1: Barras representando o escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de cevada. Linha representando a viabilidade celular
(determinada pelo azul de trypan). Control (DMSO-1%); B[a]P - 20µg/mL; B1 - BG 1µg/mL; B2 – BG
49
5µg/mL; B3 – BG 25µg/mL; B4 – BG 100µg/mL; B5 – BG 200µg/mL. (*) estatisticamente significante
do controle (p>0.05)
*
*
0
20
40
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120
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160
Co
nt
rol
B
[
a]
P
B
[
a
]
P+B
1
B[
a
]
P
+B2
B[a]
P
+B3
Mean of comet score
0
20
40
60
80
100
% of viable cells
Figura 2: Barras representando escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de cevada associada ao B[a]P, em pré-tratamento.
Linha representando a viabilidade celular (determinada pelo azul de trypan). B[a]P – Benzo[a]pireno
20µg/mL; B1 - BG 1µg/mL; B2 – BG 5µg/mL; B3 – BG 25µg/mL. (*) estatisticamente significante do
B[a]P (p>0.05).
*
*
*
0
20
40
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160
C
o
n
t
r
o
l
B
[
a
]
P
B
[
a
]
P
+
B
1
B
[
a
]
P
+
B
2
B
[
a
]
P
+
B
3
Mean of comet score
0
20
40
60
80
100
% of viable cells
Figura 3: Barras representando escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de cevada associada ao B[a]P, em tratamento
simultâneo simples. Linha representando a viabilidade celular (determinada pelo azul de trypan). B[a]P –
Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 1µg/mL; B2 – BG 5µg/mL; B3 – BG 25µg/mL. (*) estatisticamente
significante do B[a]P (p>0.05).
50
*
*
*
0
20
40
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100
120
140
160
180
Co
nt
rol
B
[
a]
P
B
[
a
]
P+B
1
B[
a
]
P
+B2
B[a]
P
+B3
Mean of comet scores
0
20
40
60
80
100
% of viable cells
Figura 4: Barras representando escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de cevada associada ao B[a]P, em tratamento
simultâneo com pré-incubação. Linha representando a viabilidade celular (determinada pelo azul de
trypan). B[a]P – Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 1µg/mL; B2 – BG 5µg/mL; B3 – BG 25µg/mL. (*)
estatisticamente significante do B[a]P (p>0.05).
*
*
*
0
20
40
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180
Co
n
trol
B
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a]P
B[a
]
P+B1
B
[
a]
P
+B
2
B
[
a]
P
+B
3
Mean of comet score
0
20
40
60
80
100
% of viable cells
Figura 5: Barras representando escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de cevada associada ao B[a]P, em pós-tratamento.
Linha representando a viabilidade celular (determinada pelo azul de trypan). B[a]P – Benzo[a]pireno
20µg/mL; B1 - BG 1µg/mL; B2 – BG 5µg/mL; B3 – BG 25µg/mL. (*) estatisticamente significante do
B[a]P (p>0.05).
51
Artigo 4
Artigo a ser submetido ao periódico “Food and Chemical Toxicology”
52
β-glucana extraída do cogumelo medicinal Agaricus blazei previne efeitos
genotóxicos e mutagênicos causados pelo Benzo[a]pireno em linhagem de
hepatoma humano
J.P.F. Angeli
a
; L.R. Ribeiro
b
; M. F. Bellini
c
; S. de A. Soares
d
; M.S. Mantovani
a*
a)Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR,
Brazil; b)Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular,Depto. de
Biologia, UNESP Rio Claro, SP, Brazil;c) Programa de Pós-Graduação
Genética,Depto. de Biologia, UNESP São José do Rio Preto, SP, Brazil e Programa de
Pós-Graduação em Patologia, Faculdade de Medicina, UNESP, Botucatu, SP,
Brazil;d)Departamento de Química Orgânica e Inorgânica,Universidade Federal do
Ceará, Fortaleza, Brazil;
Resumo
As Betas-glucanas (BG) podem ser encontradas em diferentes organismos como
componentes da parede celular. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito
protetor da BG extraída de Agaricus blazei contra os danos induzidos pelo carcinógeno
B[a]P. Para isto utilizamos os ensaios do cometa (genotoxicidade) e do micronúcleo
com bloqueio de citocinese (mutagenicidade) na linhagem de hepatoma humano
(HepG2). Três protocolos de tratamento foram testados (simultâneo, pré-tratamento e o
pré+simultâneo) afim de esclarecer o possível mecanismo de ação (desmutagênese ou
bio-antimutagênese) pelo qual esta molécula estaria protegendo o DNA. Os resultados
mostraram que a BG protegeu contra os danos no DNA em todos os protocolos testados,
sendo que a maior eficiência foi encontrada nos protocolo simultâneo e pré+simultâneo.
Assim, nossos dados sugerem que a BG pode estar atuando por se ligar ao composto,
ou pela captura dos radicais livres produzidos durante a sua ativação. Por outro lado, os
resultados no pré-tratamento também sugerem a possibilidade de que a BG estaria
53
modulando o metabolismo celular, como por exemplo atuando na inibição de enzimas
de fase I, diminuindo, assim, a formação de compostos reativos.
Introdução
Nos últimos anos vem sendo sugerido que a utilização diária, de produtos com
atividades antimutagênica e anticarcinogênica, pode ser um meio eficaz na prevenção
do câncer. Este tipo de abordagem é conhecida como quimioprevenção (Kassie et al.,
2002, Majer et al., 2005).
Na dieta, diversos produtos ou compostos de diferentes origens (ex: cereais,
fungos) têm sido encontrados contendo propriedades quimiopreventivas. Dentre estes,
destaca-se o cogumelo medicinal Agaricus blazei (Ab). Este cogumelo, nativo do Brasil,
é popularmente consumido na forma de chá. O Ab é utilizado na medicina popular para
combater o estresse, estimular o sistema imune, melhorar a qualidade de vida de
diabéticos, reduzir colesterol, combater a osteoporose e diversos outros benefícios.
Devido as suas atividades biológicas, ele vem sendo muito estudado quanto ao seu
potencial nutracêutico e também como suplemento medicinal. Os constituintes de seu
corpo de frutificação consistem em esteróides (Kawagishi et al, 1988), lipídios (Takaku
et al, 2001), complexos protéicos (Ito et al, 1997; Fujymia et al, 1998) e polissacarídeos
(Kawagishi et al, 1988; 1989; Mizuno et al, 1990). Dos compostos isolados, os
polissacarídeos do tipo β-glucana (BG) vem atraindo a atenção, devido a sua atividade
antitumoral (Mizuno et al, 1990), antiproliferativa (Kobayashi et al, 2005)
antigenotóxica e antioxidante (Angeli et al, 2006; Chovartovicova et al, 1999),
antimutagênica (Chovartovicova et al, 1999; Krizkova et al, 2001; Oliveira et al, 2006),
antiviral (Liu et al, 1997), capacidade de aumentar a expressão de c-Jun/AP1 (fatores de
transcrição) em células de câncer de mama (Talorete et al, 2002), entre outras.
54
Estas BG são polissacarídeos compostos por unidades D-glucopyranosyl e são
encontradas em diversos organismos (liquens, bactérias, fungos, leveduras, cereais entre
outros). A macroestrutura da BG depende tanto da fonte como do método de extração
(Zekovic et al., 2005). A BG extraída do cogumelo Agaricus blazei apresenta uma
estrutura constituída de uma cadeia principal de D-glucose com ligações β(1-3) e β(1-6)
(Fig. 1).
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito antigenotóxico e
antimutagênico da molécula de BG extraída de Agaricus blazei contra os danos
induzidos pelo pró-carcinógeno Benzo[a]pireno O B[a]P é um representante do grupo
dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, sendo encontrado no ar e na alimentação
humana (formado no preparo de carnes). Utilizamos a linhagem hepática humana
HepG2 e os parâmetros utilizados para avaliação foram o teste do micronúcleo com
bloqueio de citocinese e o teste do cometa.
2. Material e Métodos
2.1. Extração da BG de Agaricus blazei
Os polissacarídeos foram preparados de um solução aquosa do cogumelo a 5%
(m/v), a qual foi aquecida por 5 horas, resultando na acidificação do meio (pH 5). O
material foi isolado da solução apos neutralização com 0,1 mol/L NaOH, seguido de
adição de 1% (m/v) NaCl (aonde, m é a massa de NaCl e v o volume do extrato) e
precipitado em etanol (1:5 v/v extrato–etanol). O precipitado foi separado por
centrifugação com solução de etanol-peróxido de hidrogênio (1:1 v/v). Devido a
solubilização parcial do material, este foi submetido a uma segunda extração usando
55
etanol (4:1 v/v etanol–meio clareador). A porção solúvel em água, foi liofilizada.
Caracterização estrutural foi feita por FTIR, 13C NMR e 1H NMR espectroscopia,
demonstrando um complexo de β-glucana – proteína (Gonzaga et al., 2005a ). Desta
fração, a β –glucana foi isolada baseando-se no procedimento descrito por Yoshioka et
al. (1985). A suspensão foi colocada em um shaker (15h) e centrifugado (6000 rpm/60
min). O precipitado foi lavado com solução de thymol em NaCl e dializado em água. O
precipitado foi secado com banho de areia (45
o
C). A estrutura purificada da β-glucana
foi confirmada por 1H, 2D-COSY, HMQC and 13C NMR espectroscopia (Gonzaga et
al., 2005 b).
2.2. Indutor de dano
O carcinógeno de ação indireta benzo[a]pyrene (Fluka) foi diluído em
DMSO (JT Baker), e utilizado na concentração de 20µM, para indução de dano
(concentração estabelecida em experimentos piloto). A concentração final em cultura do
DMSO não ultrapassou 1%.
2.3. Linhagem HepG2 e protocolos experimentais
A linhagem HepG2 foi gentilmente cedido pelo Dr. Sigfried Knasmuller do
Instituto de Pesquisa do Câncer, Universidade de Viena, Áustria. Os estoques celulares
foram mantidos em freezer –80
o
C, em soro bovino fetal + 10% DMSO.
56
As culturas foram mantidas de acordo com o protocolo proposto por Uhl et al
(1999). As células foram cultivadas em frascos de cultura (TPP) de 75cm2, em meio
MEM suplementado com 15% de soro bovino fetal, em estufa de CO
2
(5%) a 37
o
C, até
atingirem confluência. Após esse período, as culturas foram tripsinizadas (0,1%) e
semeadas 2x10
5
células/poços em placas de 24 poços, e incubadas por mais 24 horas
quando, então, foram realizados os tratamentos.
No tratamento simultâneo as células foram expostas a 3 diferentes concentrações
de BG (7, 21 e 63µg/mL de meio de cultura (definidas por experimentos piloto) para os
testes de antigenotoxicidade e antimutagenicidade.Para o tratamento simultâneo, as
células foram expostas a BG e ao B[a]P simultaneamente por 24 horas.No pré-
tratamento as células foram expostas por 24 horas a BG, seguido de troca de meio de
cultura e adição de B[a]P por mais 24 horas.
No pré-tratamento+simultâneo as células foram expostas por 24 horas à BG,
seguido de troca do meio e adição às células de meio com B[a]P. Diferente do pré–
tratamento, juntamente com o B[a]P foi adicionado novamente BG a cultura..
2.5. Ensaio do Cometa (SCGE)
Para o ensaio do cometa foi utilizado o protocolo proposto por Uhl et al.,
(1999,2000) de acordo com as premissas propostas por Tice et al. Resumidamente, ao
final dos tratamentos as células foram tripsinizadas (0,1% por 5min), transferidas para
lâminas previamente gelatinizadas e lisadas. Após eletroforese (25V, 300mA) as células
foram coradas com brometo de etidio (10µg/mL – Sigma) e analisadas em microscópio
ótico de fluorescência (Nikon, modelo 027012).
Para cada tratamento foram realizadas 3 repetições independentes. Para o ensaio
do cometa foram analisadas 100 células visualmente (Kobayashi et al., 1995), e
57
classificadas de acordo com o seguinte critério: (classe 0) células com dano
indetectável, que não apresentavam cauda; (classe 1) células com cauda menor que o
diâmetro do núcleo; (classe 2) células com cauda entre 1 a duas vezes o diâmetro do
núcleo; (classe 3) células com cauda maior que duas vezes o diâmetro do núcleo. Após
isto era realizado a somatória dos escores, somando os valores de cada uma das 100
células, de cada tratamento. Células apoptóticas que apresentaram o núcleo totalmente
fragmentado não foram levadas em consideração na análise (Speit and Hartmann,
2005).
2.5.1. Viabilidade celular
Paralelamente ao teste do cometa, eram retirados 20µL da suspensão celular e
estes eram então adicionados a 20ul de Azul de Trypan (Gibco) e homogeneizados.
Após isto a solução era levada para câmara de Neubauer e era feita a contagem das
células. Desta forma as células eram classificadas em células vivas (sem coloração e
células mortas (coloração azul). Células com coloração intermediária eram
contabilizadas e dividas por 2 e então esses valores eram adicionados ao número de
células vivas e células mortas.Para o cálculo da viabilidade celular era feita a razão de
células vivas pelo total de células analisadas.
2.6. Teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese
O teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese foi realizado de acordo com
o protocolo de Darroudi and Natarajan (1991). Assim, 2.5 x 10
5
células foram
cultivadas em frascos de 25cm
2
por dois dias em estufa a 5% CO
2
a 37,5ºC e humidade
relativa de 96%. Após dois dias de crescimento, o meio foi removido e as células foram
58
expostas aos compostos ou ao solvente (DMSO – controle negativo) e a diferentes
protocolos de tratamento. Em todos os casos as células foram expostas por 24 horas aos
compostos testados. Para a obtenção de células binucleadas, as células tratadas eram
lavadas e citocalasina-B (3µg/mL - Sigma) era adicionada. As células eram então
colhidas após 28 horas de exposição a citocalasina-B, tratadas com citrato de sódio
gelado (1%) e centrifugadas (800 rpm por 8 min). Fixador metanol/ácido acético (3/1)
juntamente com 1 gota de formol era adicionado ao pellet. Este processo de fixação era
então realizado 3x. Para a detecção dos micronúcleos as células foram coradas com
Giemsa (5%). Para cada citotóxicos na determinação de micronúcleos, o índice de
divisão nuclear (NDI) foi calculado, contabilizando o numero de células binucleadas em
1000 células, e dividindo estas por 100 (Eastmond and Tucker, 1989)
2.7. Analise estatística
Os resultados obtidos foram analisados no programa estatístico Prism 4.0. Para o
teste do cometa foi realizada o teste de Mann-Whytney, para verificar diferenças entre
os tratamentos. Para o teste do micronúcleo, foi realizada ANOVA seguida do teste de
múltiplas comparações de Dunnetts (todos com um limite de 5%).
3. Resultados
Os resultados dos experimentos do cometa e micronúcleo para a investigação da
ação genotóxica e mutagênica da BG, estão apresentados nas Figuras 2 e 3,
respectivamente. Não foi observado aumento na migração de fragmentos de DNA e tão
pouco alteração na viabilidade celular (Fig. 2) no ensaio do cometa. No caso do teste do
micronúcleo também não houve aumento na formação de micronúcleos, e nem atraso no
ciclo celular como demonstrado pelo índice de divisão nuclear (Fig. 3).
59
As Figuras 4 e 5 representam a associação das 3 concentrações de BG com o
agente indutor de dano B[a]P, no tratamento do tipo simultâneo, no ensaio do cometa e
micronúcleo, respectivamente. Em ambos os testes, as 3 concentrações testadas de BG
demonstraram um efeito protetor efetivo, com uma relação de dose resposta. Isto fica
bem evidenciado uma vez que o escore médio do teste do cometa para o B[a]P foi de
aproximadamente 120 unidades arbitrárias e na maior concentração utilizada de BG
associada ao B[a]P esse valor caiu para aproximadamente 65 unidades arbitrárias.
Resultados semelhantes foram obtidos no teste do micronúcleo, onde o B[a]P sozinho
induziu uma freqüência de micronúcleos superior a 50 e, quando associado a maior
concentração de BG, essa freqüência caiu para aproximadamente 35.
No caso do pré-tratamento (Fig. 6 e 7), resultados um pouco diferentes foram
obtidos, uma vez que em ambos os testes apenas a maior concentração de BG foi efetiva
para a redução de danos. No teste do cometa o escore do controle positivo foi de
aproximadamente 150 unidades arbitrárias e, quando associado a maior concentração de
BG esse caiu para um escore de aproximadamente 120 (as outras duas concentrações
não diferiram do controle positivo). Resultados semelhantes foram obtidos no teste do
micronúcleo, onde somente a maior concentração protegeu contra os danos induzidos
pelo B[a]P (Fig. 7). No controle positivo obteve-se uma freqüência média de
micronúcleos aproximadamente de 47 contra 35 na associação com BG.
Por último, e de modo que se pudesse avaliar a ocorrência de um efeito aditivo
do tratamento simultâneo e o pré-tratamento, foi realizado um tratamento onde as
células foram pré-tratadas com as BG, porém este tratamento continuou no meio quando
o B[a]P foi adicionado. Pode-se observar que houve uma diminuição tanto na migração
do DNA (Fig. 8) como na formação de micronúcleos (Fig. 9), uma vez que o escore do
cometa no B[a]P foi aproximadamente 115 unidades arbitrárias e, quando associado a
60
maior concentração, este caiu para aproximadamente 55. O mesmo ocorreu para o teste
do micronúcleo, onde no controle positivo obteve-se uma média de micronúcleos de
aproximadamente 55 e, quando associado a maior concentração de BG, este caiu para
25, aproximadamente. Nesta nota-se que houve um decréscimo nas freqüências de
micronúcleos, e estas foram inferiores ao controle negativo).
4. Discussão
Diversos compostos da dieta têm demonstrado potencial anticarcinogênico e
antimutagênico atuando através de diferentes mecanismos, como inibição de enzimas de
fase I (família das CYP 450), ativação de enzimas de fase II (família das GSTs),
indução de apoptose e proteção contra radicais livres, sendo estes os principais
mecanismos. Estimulação do reparo de DNA, efeitos imunoestimulantes, inibição de
ciclooxigenase, restrição calórica e diminuição do trânsito de mutágenos no trato
gastrintestinal, também são alguns dos mecanismos pelos quais alguns alimentos podem
exercer seu efeito protetor (Ferrari and Torres, 2003).
Os dados obtidos no presente estudo mostram que BG não induziu nenhum
efeito danoso ao material genético, e que esta apresentou um importante efeito protetor
contra um agente mutagênico que pode estar presente na dieta do homem, dependendo
do seu hábito alimentar. Observou-se também que a BG revelou um maior efeito
protetor quando em tratamento simultâneo, o que poderia estar indicando que esta
estaria se ligando diretamente ao B[a]P, uma vez que é sabido que certas fibras
alimentares tem a capacidade de se ligar a compostos aromáticos (Ferguson et al, 1993;
Williams et al, 1999). Entretanto, não se pode excluir o fato de que as BG podem atuar
61
como um “scavenger” de radicais livres (Angeli et al, 2006; Chovartovicova et al,
1999), podendo se ligar aos radicais livres produzidos pela ativação do B[a]P, uma vez
que a ativação destes compostos, pelas enzimas da família das P450, gera radicais livres
que podem interagir de forma nociva com o DNA (Briede et al, 2004).
Outro fato que nos chama a atenção é que a BG apresentou um efeito protetor
quando em pré-tratamento, o que nos indica que estas poderiam estar atuando através da
modulação de enzimas, como já sugerido por outro trabalho do nosso grupo (Angeli et
al., 2006). Assim, estes dados reforçam essa hipótese, uma vez que este tipo de
protocolo de tratamento nos indica a possibilidade de alteração na expressão e ou
atividade de algumas enzimas. Essa atuação poderia ser através de receptores na
membrana da célula ativando vias de sinalização, expressão de fatores de transcrição e,
consequentemente, modulando a expressão gênica. Isto é corroborado com o fato de
outros trabalhos demonstrarem que polissacarídeos extraídos dos cogumelos Lentinulas
edodes e Agaricus blazei apresentaram um efeito inibitório in vivo, na expressão de
isoenzimas da família P450 1A (Hashimoto et al, 2002; Okamoto et al, 2004), que
catalisam a primeira etapa na formação do metabólito reativo do B[a]P.
Quando comparados, os protocolos pré+simultâneo com o simultâneo, observa-
se que existe diferença estatística significativa entre eles, comprovando um maior efeito
protetor quando as células foram expostas por 24 horas sem a presença do B[a]P,
evidenciando um efeito aditivo. Desta maneira, o maior efeito protetor observado no
tratamento pré+simultâneo poderia ser explicado, uma vez que a molécula de BG
poderia estar tanto inibindo enzimas da família P450 como também seqüestrando
espécies reativas de oxigênio que estariam sendo formadas na ativação do B[a]P, ou
mesmo se ligando diretamente à este impedindo que o mesmo entrasse dentro da célula
e sofresse metabolização.
62
Tomados como um todo, os resultados deste estudo permitem constatar que o
polissacarídeo BG extraído do cogumelo Agaricus blazei protegeu células hepáticas
derivadas de humanos dos efeitos genotóxicos e mutagênicos do B[a]P, um composto
carcinogênico encontrado comumente no meio ambiente (IARC 1983). Este fato, nos
indicam que as BGs poderiam estar amenizando os efeitos deletérios deste composto,
em situações reais de exposição do ser humano, funcionando, desta maneira, como um
agente quimiopreventivo, as quais poderiam ser incluídas na dieta de seres humanos.
Outro dado interessante do presente estudo é a possibilidade da modulação de enzimas
de fase I pela BG, tornando-a um interessante agente coadjuvante na quimioterapia. De
acordo com Walter-Sack and Klotz (1996) a inibição de enzimas CYP 450 torna a
quimioterapia mais eficaz, uma vez que o quimioterápico demorara mais tempo para ser
excretado.
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Figura 1: Estrutura de β-glucana extraída de Agaricus blazei, mostrando ligações β
(13. 16)
69
*
0
20
40
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100
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140
160
C
o
ntrol
B
[
a]P
B
1
B2
B3
Mean of comet score
Figura 2: Barras representando o escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis .Control (DMSO-1%); B[a]P -
20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 – BG 63µg/mL)(*) estatisticamente significante do
controle (p>0.05)
*
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Co
nt
rol
B
[
a]
P
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B2
B3
MN per 1000BNC
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Nuclear division index
Figura 3: Barras representando numero de micronúcleo em 1000 células binucleadas, no tratamento da
linhagem HepG2 com diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis, em
tratamento simultâneo simples. Linha representando o índice de divisão nuclear. B[a]P – Benzo[a]pireno
20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 – BG 63µg/mL. (*) estatisticamente significante do
B[a]P (p>0.05).
70
*
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*
*
0
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C
on
t
r
ol
e
B[a]
P
B[a]
P
+B1
B[
a
]
P+
B2
B
[
a]P+B
3
Mean of comet score
Figura 4: Barras representando escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis associada ao B[a]P, em
tratamento simultâneo. B[a]P – Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 –
BG 63µg/mL. (*) estatisticamente significante do B[a]P (p>0.05).
*
*
*
*
0
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Control
B[a]P
B[a]
P
+B1
B[
a
]
P
+B2
B
[
a
]
P+B
3
MNper 1000BNC
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Nuclear division index
Figura 5: Barras representando numero de micronúcleos em 1000 células binucleadas, no tratamento
da linhagem HepG2 com diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis
associada ao B[a]P, em tratamento simultâneo. Linha representando o índice de divisão nuclear. B[a]P –
Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 – BG 63µg/mL. (*) estatisticamente
significante do B[a]P (p>0.05).
71
*
*
0
20
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C
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t
r
ol
e
B[a]
P
B[a]
P
+B1
B[
a
]
P+
B2
B
[
a]P+B
3
Mean of comet score
Figura 6: Barras representando escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis associada ao B[a]P, em pré-
tratamento. B[a]P – Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 – BG 63µg/mL.
(*) estatisticamente significante do B[a]P (p>0.05).
*
*
0
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Control
B[a]P
B[a]
P
+B1
B[
a
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P
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B
[
a
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P+B
3
MN per 1000BNC
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Nuclear division index
Figura 7: Barras representando numero de micronúcleos em 1000 células binucleadas, no tratamento
da linhagem HepG2 com diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis
associada ao B[a]P, em pré-tratamento. Linha representando o índice de divisão nuclear. B[a]P –
Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 – BG 63µg/mL. (*) estatisticamente
significante do B[a]P (p>0.05).
72
*
*
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ont
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B[a]
P
B[a]
P
+B1
B[
a
]
P+
B2
B
[
a]P+B
3
Mean of comet score
Figura 8: Barras representando escore médio dos cometas, no tratamento da linhagem HepG2 com
diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis associada ao B[a]P, em pré-
tratamento+simultaneo. B[a]P – Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 –
BG 63µg/mL. (*) estatisticamente significante do B[a]P (p>0.05).
*
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Control
B[a]P
B[a]
P
+B1
B[
a
]
P
+B2
B
[
a
]
P+B
3
MN per 1000BNC
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Nuclear division index
Figura 9 : Barras representando numero de micronúcleos em 1000 células binucleadas, no tratamento
da linhagem HepG2 com diferentes concentrações de Beta-glucana extraída de Agaricus brasiliensis
associada ao B[a]P, em pré-tratamento+simultaneo. Linha representando o índice de divisão nuclear.
B[a]P – Benzo[a]pireno 20µg/mL; B1 - BG 7µg/mL; B2 – BG 21µg/mL; B3 – BG 63µg/mL. (*)
estatisticamente significante do B[a]P (p>0.05).
73
Artigo 5
Artigo a ser submetido ao periódico “Food and Chemical Toxicology”
74
Avaliação do efeito genotóxico e/ou antigenotóxico de polissacarídeos extraídos
de diferentes fases de maturação do cogumelo medicinal Agaricus brasiliensis
J.P.F. Angeli
a
; L.R. Ribeiro
b
; C. M. Camelini
c
; M.S. Mantovani
a*
a) Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Estadual de Londrina, Londrina, PR, Brazil; b) Programa de Pós-Graduação em
Biologia Celular e Molecular,Depto. de Biologia, UNESP Rio Claro, SP, Brazil e
Programa de Pós-Graduação em Patologia, Faculdade de Medicina, UNESP, Botucatu,
SP, Brazil; c) Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Ciências
Biologicas, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianopolis, SC, Brazil.
Resumo
O cogumelo Agaricus brasiliensis (= Agaricus blazei) tem recebido muita atenção
devido a sua propriedades medicinais. Entre os compostos isolados deste, destacam-se
as β-glucanas (BG) que são polissacarídeos de parede celular. O objetivo do presente
estudo foi de estudar, o efeito genotóxico e/ou antigenotóxico de polissacarídeos totais
do cogumelo e de BGs, ambos extraídos em diferentes fases de maturação (imaturo,
maduro não esporulado e maduro esporulado). Para testar a genotoxicidade da BG, foi
utilizado o teste do cometa na linhagem HepG2, . Adicionalmente, para testar o efeito
protetor, foi associado à BG ao H
2
O
2
, bleomicina e doxorubicina. Os resultados
demonstraram que os polissacarídeos e as BGs não demonstraram efeito genotóxico,
pelo contrário, protegeram contra os danos causados pelos 3 indutores. Somente o
75
polissacarídeo total não apresentou efeito protetor contra a doxorubicina. De forma
interessante o maior efeito protetor foi evidenciado nos estágios mais maduros e na
substância BG isolada.
1. Introdução
Estudos epidemiológicos têm apresentado evidências que o surgimento de
cânceres em diversos órgãos como estômago, cólon, próstata, mama, estão relacionados
a dietas inapropriadas (WCFR/IARC, 1997). O principal fator, envolvido nesses
processos, esta relacionado ao aumento da taxa de mutação. Assim, sugere-se que uma
diminuição na taxa de mutações em um organismo estaria diretamente relacionada ao
retardo no surgimento destas neoplasias (Loeb et al., 2003). Desta forma, torna-se
desejável a introdução de compostos antimutagênicos na dieta do ser humano.
Entre os alimentos que vem recebendo atenção quanto a suas propriedades
antimutagênicas, encontram-se diversos cogumelos medicinais, destacando-se entre ele
o cogumelo Agaricus brasiliensis Wasser (= Agaricus blazei). Este é um cogumelo
nativo do Brasil, sendo bastante estudado devido, as suas propriedades medicinais como
estimulante do sistema imune, propriedade anticancerígena, antimutagênica e
antioxidante (Kawagishi et al., 1989; Mizuno et al., 1990, Ohno et al., 2001, Dong et al.,
2002,).
Dentre os compostos isolados do cogumelo Agaricus brasiliensis, destacam-se
alguns polissacarídeos com atividade antitumoral, entre esses polissacarídeos muita
atenção tem sido dada as β-Glucanas (BGs), sendo essas as principais responsáveis
pelos efeitos antitumorais do cogumelo (Kawagishi et al., 1989; Mizuno et al., 1990,
Ohno et al., 2001). Recentemente alguns trabalhos nossos e de outros grupos têm
76
relatado efeito antimutagênico para BG extraídas de Agaricus brasiliensis (Angeli et al.,
2006) e também para BGs de diferentes origens, porém de mesma estrutura química
(Chovartovicova et al., 1993; Lazarova et al., 2004; Krizkova et al, 2006; Oliveira et al.,
2007). Grande parte deste efeito protetor deve-se em parte a sua função antioxidante,
assim acredita-se que este composto possa ser utilizado como quimiopreventivo,
inibindo a ação genotóxica de alguns compostos.
Vale ressaltar, ao se extrair a BG do cogumelo, que a fase de desenvolvimento
do corpo de frutificação cogumelo pode influenciar no conteúdo e tipo de BG
encontradas, fazendo com que possa haver uma grande diferença nas respostas
biológicas encontradas (Camelini et al., 2005).
Desta forma o presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
genotóxicos e ou antigenotóxicos dos polissacarídeos totais extraídos em três diferentes
fases de desenvolvimento do cogumelo (imaturo – SIa; maduro não esporulado – SIIa; e
maduro esporulado - SIIIa), sendo também avaliado as BGs totais extraídas nas 3
diferentes fases (imaturo – SIb; maduro não esporulado – SIIb; e maduro esporulado –
SIIIb), desta forma permitindo dizer qual a melhor forma de suplementação com
finalidade antioxidante. Também podem auxiliar na indicação de qual a melhor fase
para a colheita do cogumelo para fins nutracêuticos.
2. Materiais e Métodos
2.1. Extração da fração polissacarídica
Polissacarídeos da parede celular foram extraídos e purificados de acordo com o
protocolo proposto por Mizuno et al. (1990). Amostras secas do corpo de frutificação do
77
A. brasiliensis (20 g) foram depositados, lavados com 120 ml 85% (v/v) etanol e
filtrado. Os resíduos foram lavados com 350 ml 85% (v/v) etanol aquecido a 80
o
C por
3 h (3 vezes). Os polissacarídeos foram em seqüência extraídos com 350 mL água
aquecida a 100
o
C por 3 h (3 vezes). Estas frações aquosas foram coletadas por filtração
, seguido de adição de 4 vol. 95% (v/v) etanol. A mistura, foi então deixada overnight
de forma a obter a fração de polissacarídeos, que foi concentrada e dializada em água
destilada. Essa fração foi então secada a frio, pesada e analisada. Nestas frações então
foram observadas polissacarídeos com ligações do tipo α (14) e (16) e também β
(12),(13) e (16), sendo que os polissacarideo de ligações β constituiam
aproximadamente 70% do total de polissacarideos.
2.2 Purificação dos polissacarídeos
Cada amostra (1 g) foi dissolvida em água destilada e passada através de uma
coluna cromatográfica de DEAE-celulose (2 cm largura X 35 cm comprimento). A
fração neutra eluída com água (105 mL) foi descartada, as frações selecionadas de 0,25,
0,5 e 0,75 M NaCl (105 mL cada) foram concentradas e dializadas extensivamente. O
polissacarídeo foi fracionado de acordo com o maior peso molecular, em uma coluna
Toyopear HW-65F (Tosoh) (2 cm largura X 35 cm comprimento) selecionando os
primeiros 35 mL eluídos. As BGs (não absorvidas) foram separadas usando uma coluna
Con A-Sepharose 4B (Fluka Biochemika) (1,5 cm largura X 10 cm comprimento),
secadas a seco, pesadas e analisadas. Nestas frações então foram observadas
polissacarídeos com ligações somente do tipo β (12),(13) e (16). Resultados mais
detalhados da análise dos polissacarídeos podem ser encontrados em maiores detalhes
no trabalho previamente publicado por Camelini et al (2005).
78
2.3. Indutor de dano
Para a indução de danos ao DNA foram utilizados 3 compostos; H
2
O
2
(100µM -
Nova Química), Bleomicina (0,5µg/mL - Sigma) e Doxorubicina (1µg/mL - Fluka),
todos os compostos foram diluídos em PBS livre de Ca e Mg.
2.5. Linhagem HepG2 e protocolos experimentais
A linhagem celular HepG2 foi gentilmente cedida pelo Dr Sigfried Knasmuller
(Institute of Cancer Research - Medical University of Vienna). As células foram
estocadas em nitrogênio líquido e cultivadas com meio Minimal essential medium
(MEM), suplementado com 15% de soro bovino fetal, ambos da Gibco (Paisely -
Scotland), e 1% penicilina/estreptomicina em frascos de 75cm
2
(TPP). Nessas
condições, o ciclo celular é de aproximadamente de 24 horas.
No protocolo de genotoxicidade as células foram expostas a 3 diferentes
concentrações (5, 15 e 45µg/mL de meio de cultura) do polissacarídeo em suas
diferentes fases de maturação por 24 horas (concentrações definidas por experimentos
piloto).
Para os tratamentos de antigenotoxicidade, as células foram expostas
simultaneamente aos polissacarídeos e a um dos diferentes indutores de dano, por 3
horas no caso da bleomicina e doxorubicina e 5 minutos no gelo para o H
2
O
2
.
79
2.6. Single cell gel electrophoresis (SCGE)
Para o ensaio do cometa foi utilizado o protocolo proposto por Uhl et al.,
(1999,2000) de acordo com as premissas propostas por Tice et al (2003).
Resumidamente, ao final dos tratamentos as células foram tripsinizadas (0,1% por
5min), transferidas para lâminas previamente gelatinizadas e lisadas. Após eletroforese
(25V, 300mA) as células foram coradas com brometo de etidio (10µg/mL – Sigma) e
analisadas em microscópio ótico de fluorescência (Nikon, modelo 027012).
Para cada tratamento foram realizadas três repetições independentes. Para o
ensaio do cometa foram analisadas 100 células, visualmente (Kobayashi et al., 1995), e
classificadas de acordo com o seguinte critério: (classe 0) células com dano
indetectável, que não apresentavam cauda; (classe 1) células com cauda menor que o
diâmetro do núcleo; (classe 2) células com cauda entre 1 a duas vezes o diâmetro do
núcleo; (classe 3) células com cauda maior que duas vezes o diâmetro do núcleo. Após
isto o valor de cada célula era somado para obter o score (variável de 0 a 300), após isto
era calculado a media e os desvios de cada tratamento.Células apoptóticas que
apresentaram o núcleo totalmente fragmentado não foram levadas em consideração na
análise (Speit and Hartmann, 2005). Os resultados obtidos foram analisados no
programa estatístico Prism 4.0 realizando o teste de Mann-Whytney, para verificar
diferenças entre os tratamentos.
2. Resultados
Para os protocolos de genotoxicidade, demonstra-se na figura 1 o resultado dos
polissacarídeos totais extraídos nas diferentes fases de maturação do cogumelo. Não
houve alteração na viabilidade celular (resultados não apresentados – considerando
viabilidade ótima acima de 80%), e tão pouco na migração de fragmentos de DNA
80
como observado pelo teste do cometa. O mesmo pode ser observado na Figura 2, onde
apresentam-se os resultados apenas das BGs. De forma semelhante, variações na
viabilidade celular (não apresentados) e migração de DNA não foram evidenciadas.
Para os protocolos de antigenotoxicidade, associou-se as BGs a 3 indutores de
dano. Primeiro, na Figura 3, estão apresentados os resultados das associações com o
H
2
O
2
. Neste caso observa-se que houve um efeito protetor em praticamente todas as
concentrações, sendo que os menores efeitos protetores são observados no
polissacarídeo bruto na fase jovem (SIa), e os maiores efeitos são evidenciados na
fração contendo apenas BG na fase madura esporulada (SIIb e SIIIb). Padrão de
resposta semelhante é visto no tratamento com bleomicina (Figura 4), havendo efeito
protetor em quase todas as concentrações testadas e da mesma forma, reduzido efeito
protetor é encontrado no polissacarídeo bruto na fase jovem e um efeito pronunciado na
fração contendo apenas BG na fase madura.
Diferente dos tratamentos com H
2
O
2
e bleomicina, a associação das diferentes
frações do cogumelo com a doxorubicina apresentou efeito protetor somente nas frações
purificadas (SIb, SIIb e SIIIb), sendo que a fração de polissacarídeos totais demonstrou
apenas um fraco efeito protetor na maior concentração da fase madura esporulada
(SIIIa).
3. Discussão
Nos últimos anos tem havido um crescente interesse na descoberta de alimentos
e compostos alimentares que tenha a capacidade de prevenir danos ao material genético,
desta forma atuando como compostos quimioprotetores. O uso racional de
81
quimioprotetores baseia-se na identificação do mesmo como eficiente, e também no
entendimento do seu mecanismo de ação (Miadokova et al., 2006). Diversos
mecanismos como inibição de efeitos genotóxicos, captura de radicais livres, inibição
de crescimento tumoral e modulação da tradução de sinais podem estar envolvidas (De
Flora et al., 2005; Miadokova et al., 2004). Desta forma foi realizado neste trabalho a
associação dos polissacarídeos totais e as BGs isoladas do cogumelo A. Brasiliensis,
contra três agentes sabidamente formadores de ROS (espécies reativas de oxigênio), de
forma a reforçar a hipótese de antioxidante e também verificar se as fases de colheita do
cogumelo que afetam a seus compostos bioativos, uma vez que não existem trabalhos
na literatura relacionando estágios de maturação, presença de BG e efeito protetor no
material genético.
No presente trabalho observou-se a ausência de efeito genotóxico dos
polissacarídeos totais (aonde há presença de ligações do tipo α e β) da parede do
cogumelo e também das BG. Desta forma pode-se supor que estes não apresentam
efeito genotóxico se consumidos pelo homem, resultado este também demonstrado por
vários trabalhos utilizando extratos do cogumelo Agaricus brasiliensis e isolados de
BGs (Luiz et al., 2003; Bellini et al., 2003, 2006; Guterrez et al., 2004; Angeli et al.,
2006; Oliveira et al., 2007).
No estudo da antigenotoxicidade, associou-se os polissacarídeos totais e as BG
com o H
2
O
2
, bleomicina e doxorubicina. Pode-se observar uma elevada redução dos
danos causados pelo peróxido e pela bleomicina. Ao compará-los evidencia-se uma
maior proteção contra o peróxido de hidrogênio, visto que a bleomicina não causa danos
apenas pela formação de radicais livres, e sim também pela quebra de fita e inibição de
síntese de DNA (referencia).
82
No caso da doxorubicina, observa-se uma fraca proteção pelos polissacarídeos
totais, apenas as BG apresentaram efeito protetor. Isto pode ser explicado pelo
mecanismo de ação da droga, uma vez que é sabido que a doxorubicina não causa danos
apenas pela formação de radicais livres, mas também por se intercalar no DNA e inibir a
topoisomerase II (referencia).
Assim, fica claro que os polissacarídeos totais apresentaram efeitos protetores
menores quando comparado com as BGs purificadas, onde apenas polissacarídeos com
ligações do tipo β estão presentes. Podendo-se justificar isso pela menor quantidade de
BG nos extratos totais, uma vez que é sabido que esta apresenta uma importante
propriedade antioxidante (Slamenova et al., 2003; Krizkova et al., 2003; Angeli et al.,
2006). Entre os polissacarídeos totais, observa-se que conforme a extração é feita em
fases mais maduras do cogumelo, este apresenta efeito protetor maior, isto podeser
devido a uma maior presença de ligações β (13) e α (14) nas BGs purificadas de
estágio maduro (Camelini et al., 2005). O mesmo padrão é observado para as BG
purificadas, onde uma maior quantidade de ligações β (13) é observada conforme o
estagio de maturidade do cogumelo aumenta.
Estes resultados possibilitam indicar, que apesar do cogumelo ser colhido na
fase imatura para fins culinários, pois é nessa fase que este apresenta o seu maior valor
83
dieta, na forma de cápsulas, ou mesmo na fortificação de alimentos como pães e cereais,
com o intuito de disponibilizar alimentos mais saudáveis, e possivelmente protegendo a
população de doenças desencadeadas por eventos mutacionais, como é o caso do câncer,
deve ser o próximo objetivo de estudo nesse campo. Uma outra possibilidade seria a
introdução das BG na dieta através da produção de alimentos transgênicos.
4. Bibliografia
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0
20
40
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Mean of comet score
Figura 1: Efeito dos polissacarideos totais extraídas do cogumelo Agaricus brasiliensis na
migração de DNA na linhagem HepG2.. Barras representam a média dos escores ± desvio
padrão de três repetições independentes. (Controle DMSO – 1%; B[a]P – 5ug/ml; SIa –
polisacarideos extraídos fase imatura; SIIa – polissacarideos extraídos na fase matura não
esporulada; SIIIa – polissacarideos extraídos na fase matura esporulada)
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Mean of comet socres
Figura 2: Efeito das β-glucanas extraidas do cogumelo Agaricus brasiliensis na migração de
DNA na linhagem HepG2.. Barras representam a média dos escores ± desvio padrão de três
repetições independentes. (Controle DMSO – 1%; B[a]P – 5ug/ml; SIb – BG extraída na fase
imatura; SIIb – BG extraída na fase matura não esporulada; SIIIb – BG extraída na fase matura
esporulada).
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Mean of Comet scores
Figura 3: Efeito das fações do cogumelo Agaricus brasiliensis na migração de DNA induzido por H
2
O
2
na linhagem
HepG2.. Barras representam a média dos escores ± desvio padrão de três repetições independentes. (Controle DMSO
– 1%; H
2
O
2
–100µM; SIa – polisacarideos extraídos fase imatura; SIIa – polissacarideos extraídos na fase matura não
esporulada; SIIIa – polissacarideos extraídos na fase matura esporulada; SIb – BG extraída na fase imatura; SIIb – BG
extraída na fase matura não esporulada; SIIIb – BG extraída na fase matura esporulada). (*) significativamente
diferente do H
2
O
2
(p>0,05).
89
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SIIIb 45ug/ml
Mean of Comet scores
Figura 4: Efeito das frações do cogumelo Agaricus brasiliensis na migração de DNA induzido pela bleomicina na
linhagem HepG2.. Barras representam a média dos escores ± desvio padrão de três repetições independentes.
(Controle DMSO – 1%; bleomicina
– 0,5µg/ml; SIa – polisacarideos extraídos fase imatura; SIIa – polissacarideos
extraídos na fase matura não esporulada; SIIIa – polissacarideos extraídos na fase matura esporulada; SIb – BG
extraída na fase imatura; SIIb – BG extraída na fase matura não esporulada; SIIIb – BG extraída na fase matura
esporulada). (*) significativamente diferente da bleomicina (p>0,05).
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S
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g
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Mean of Comet scores
Figura 5: Efeito das frações do cogumelo Agaricus brasiliensis na migração de DNA induzido pela doxorubicina na
linhagem HepG2.. Barras representam a média dos escores ± desvio padrão de três repetições independentes.
(Controle DMSO – 1%; doxorubicina
– 1µg/ml; SIa – polisacarideos extraídos fase imatura; SIIa – polissacarideos
extraídos na fase matura não esporulada; SIIIa – polissacarideos extraídos na fase matura esporulada; SIb – BG
extraída na fase imatura; SIIb – BG extraída na fase matura não esporulada; SIIIb – BG extraída na fase matura
esporulada). (*) significativamente diferente da doxorubicina (p>0,05).
90
Considerações finais
Os trabalhos realizados, utilizando a BG demonstraram em todos os casos
eficiência na prevenção de dano genético, contra uma variedade de agentes químico,
desde quimioterapicos até contaminantes alimentares.
Como demonstrado, a BG de cevada apresentou efeito protetor contra o B[a]P,
2AA, o MMS e o Ara-C em linhagens celulares de roedores e humanas, sendo
importante ressaltar que a mesma foi a única a apresentar efeito genotóxico. A BG
extraída de cogumelo apresentou efeito protetor contra B[a]P, Trp-p-2, bleomicina,
doxorubicina e H
2
0
2
em células humanas. Mostrando assim uma eficiência de proteção
contra diversos tipos de agentes indutores de dano.
Acredita-se que as mesmas possam estar atuando se ligando aos diferentes
compostos ou mesmo se ligando a radicais livres produzidos durante as sua ativações,
porem não é descartada a hipótese deste modularem enzimas do metabolismo de
xenobióticos e mecanismos de reparo ou apoptose.
Embora seja muito cedo para afirmar que a molécula de BG estaria atuando
como um quimiopreventivo efetivo no ser humano, os resultados obtidos, encorajam
futuros estudos de forma a comprovar se essa proteção estaria ocorrendo no homem,
sugerindo assim a possibilidade de inclusão desse composto na dieta, na forma de
cápsulas, ou mesmo na fortificação de alimentos como pães e cereais, com o intuito de
disponibilizar alimentos mais saudáveis, e possivelmente protegendo a população de
doenças desencadeadas por eventos mutacionais como é o caso do câncer. Uma outra
possibilidade de introdução das BGs na dieta seria na produção de alimentos
trangênicos.
91
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