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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
Aspectos morfológicos e imunoistoquímicos da medula óssea e
sangue periférico: correlação com sub-tipo clínico e fatores
prognósticos na leucemia/linfoma de células T do adulto.
MARIA DAS GRAÇAS SILVA VIEIRA
Salvador – Bahia
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
Aspectos morfológicos e imunoistoquímicos da medula óssea e
sangue periférico: correlação com sub-tipo clínico e fatores
prognósticos na leucemia/linfoma de células T do adulto.
MARIA DAS GRAÇAS SILVA VIEIRA
Professor-orientador: Dra Helenemarie Schaer Barbosa
Salvador – Bahia
2006
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em
Imunologia da Universidade
Federal da Bahia como
requisito parcial para obtenção de Título de Doutor em
Imunologia.
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FICHA CATALOGRÁFICA
V657
Vieira, Maria das Graças Silva,
Aspectos morfológicos e imunoistoquímicos da medula óssea e sangue
periférico:correlação com sub-tipo clínico e fatores prognósticos na leucemia/
linfoma de células T do adulto/ Maria das Graças Silva Vieira.- Salvador: [s.n.]
, 2006.
xi, 109 f.
Orientador: Professor Dra Helenemarie Schaer Barbosa.
Tese (Doutorado em Imunologia) Instituto de Ciências da Saúde..
Universidade Federal da Bahia.
I. Leucemia-Linfoma. 2. HTLV-I. 3. Linfócitos atípicos. 4. Medula óssea.
5. Imunoistoquímica. I. Universidade Federal da Bahia. II. Título.
CDU: 616.155.392
A minha família
meus pais, minha irmã e minha sobrinha Larissa
pelo apoio e carinho
obrigada!
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Dra Helenemarie Schaer Barbosa pelo incentivo, disponibilidade
constante e agradável convívio.
À Dra Achiléa Bittencourt pela colaboração e pela sua dedicação a pesquisa,
importante na realização deste trabalho.
Ao Prof. Moysés Sadigursky pela sua amizade e generosidade.
Ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Imunologia (PPGIm), Prof.
Roberto Meyer.
Ao Dr Eduardo Netto pela orientação na realização da avaliação estatistica.
Ao chefe do Serviço de Anatomia Patológica-HUPES/UFBA, Dr. Luciano Espinheira,
por me liberar sempre que necessário durante a realização deste trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Imunopatologia, Juçara Andrade, Katerine Gómez e
Rodrigo Oliveira, pela cooperação e excelente ambiente de trabalho.
Aos técnicos do Laboratório de Histopatologia do Serviço de Anatomia Patológica,
em especial as Sras Raimunda Santos e Verônica Sales, pela realização das
colorações e cortes histológicos.
Aos funcionários administrativos do Serviço de Anatomia Patológica - HUPES/UFBA.
Ao Hospital Aristides Maltes (HAM/LLBC) por me liberar sempre que necessário
durante a realização deste trabalho.
Aos funcionários do Serviço de Anatomia Patológica – HAM/LBCC
Aos colegas do PPGIm, especialmente Marcondes Queiroz, Miguel Setúbal,
Jaqueline Braga e Cassiane Portela.
A secretária do PPGIm, Sra Dilcéia Oliveira.
Aos professores e residentes do Serviço de Hematologia – HUPES/UFBA.
Ao Laboratório de Retrovirus pela realização da sorologia.
Aos pacientes que participaram deste estudo.
A todos que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.
Obrigada!
SUMÁRIO
Abreviaturas e Siglas
Índice de tabelas
Índice de figuras
Resumo
Abstract
1.0 Introdução ................................................................................................
13
Revisão de literatura....................................................................... ................
1.1 Epidemiologia.............................................................................................
1.2 Estrutura da partícula e do genôma viral...................................................
1.3 Ciclo de replicação viral.............................................................................
1.4 Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HTLV........................................
1.4.1 Diagnóstico sorológico........................................................................................
1.4.2 Diagnóstico molecular........................................................................................
1.4.3 Isolamento viral..................................................................................................
16
16
20
21
22
22
24
25
1.5 Leucemia/linfoma de células T do adulto...................................................
1.5.1 Patogênese e desenvolvimento da ATL......................................................
1.5.2 Características clínicas da ATL...................................................................
1.5.3 Diagnóstico de ATL............................................................................................
1.5.3.1 Diagnóstico sorológico e molecular da ATL.......................................
1.5.3.2 Diagnóstico morfológico......................................................................
1.5.3.3 Marcadores bioquímicos e imunológicos............................................
1.5.3.4 Características histopatológicas e imunofenotípicas da ATL............
26
27
30
35
35
36
37
38
1.6 Tratamento de ATL................................................................................... 39
1.7 Outras doenças associadas ao HTLV-I..................................................... 40
2.0 Objetivos................................................................................................... 41
3.0 Material e Métodos................................................................................... 42
3.1 Pacientes...................................................................................................
3.1.1 Estudo prospectivo.............................................................................................
3.1.2 Estudo retrospectivo...........................................................................................
3.1.3 Dados clínicos e epidemiológicos.......................................................................
42
42
43
43
1
3.2 Critérios para diagnóstico de ATL..............................................................
44
3.3 Diagnóstico sorológico............................................................................... 44
3.4 Pesquisa de integração viral...................................................................... 45
3.5 Análise do sangue periférico......................................................................
45
3.6 Análise do aspirado de medula óssea....................................................... 46
3.7 Histopatologia............................................................................................ 47
3.8 Imunoistoquímica....................................................................................... 48
3.9 Análise estatística...................................................................................... 49
4.0 Resultados................................................................................................
50
4.1 Análise da medula óssea........................................................................... 51
4.1.1 Estudo histológico da medula óssea...................................................................
53
4.1.2 Relação entre a infiltração da medula óssea e as formas clínicas e achados
laboratoriais na ATL.....................................................................................................
4.1.3 Características da medula óssea nos casos sem infiltração neoplásica............
56
58
4.2 Estudo imunoistoquímico........................................................................... 58
4.3 Análise do sangue periférico......................................................................
4.3.1 Critérios usados na caracterização do tipo morfológico das células linfóides....
4.3.2 Morfologia das células linfóides e as formas clínicas de ATL............................
4.3.3 Morfologia das células linfóides e os fatores prognóstico de ATL......................
4.3.4 Morfologia das células linfóides e presença da infiltração de medula óssea......
61
61
63
65
67
5.0 Discussão................................................................................................. 69
5.1 Características histológicas e citológicas..................................................
5.2 Infiltração da medula óssea.......................................................................
5.3 Estudo do sangue periférico......................................................................
5.4 Estudo imunoistoquímico...........................................................................
72
73
77
79
6.0 Conclusões...............................................................................................
84
7.0 Bibliografia...............................................................................................
Anexo A.......................................................................................................................
Anexo B.......................................................................................................................
Anexo C.......................................................................................................................
Anexo D........................................................................................................................
86
105
106
107
108
ABREVIATURAS E SIGLAS
ATL Leucemia/linfoma de células T do adulto;
CCR4 Receptor de quimiocinas 4;
CD
Cluster of diferentiation (marcador de membrana celular);
DAB Diaminobenzidina;
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay (imuno-ensaio enzimático);
Fas Molécula de superfície sinalizadora de apoptose;
GM-CSF Fator estimulador de colônia-granulócito e macrófago;
HAM/TSP
Mielopatia/Paraparesia Espática Tropical Associada ao HTLV-I;
HE Hematoxilina e eosina;
HLA Antígeno leucocitário humano;
HTLV Vírus linfotrópico de células T humanas;
IFN-γ
Interferon-gama;
IL Interleucina;
IL-2Rα
Receptor da cadeia alfa da lL-2;
IPCR Reação em cadeia da polimerase invertido;
LDH Desidrogenase lática;
LLC Leucemia linfocitica crônica;
LNH Linfoma não Hodgkin;
LTR
Long terminal repeats;
MO Medula óssea;
NF-kB
Nuclear factor kappa B (fator nuclear kappa B);
OMS Organização Mundial da Saúde;
PBS Salina tamponada com fosfato;
PCR Reação em cadeia da polimerase;
TGF-β
Fator transformador de crescimento beta;
TIA-1 Antígeno intracelular de célula T;
TPNE Linfoma T periférico não especificado.
INDICE DE TABELAS
Tabela
Titulo Página
1 Critérios para diagnóstico de ATL
44
2 Painel de anticorpos utilizado no estudo imunoistoquímico.
48
3 Presença de linfocitose e de infiltração da medula óssea, de
acordo com a forma clínica.
52
4 Características clínico-
laboratoriais e envolvimento de medula
óssea nos casos agudos de ATL.
56
5 Características clínico-laboratoriais e envolvimento de medula
óssea nos casos crônicos de ATL.
57
6 Características clínico-laboratoriais e envolvimento de medula
óssea nos casos do tipo linfoma da ATL
57
7 Características clínico-laboratoriais e envolvimento de medula
óssea nos casos tipo indolente de ATL.
57
8
Imu
Imunofenotipo dos casos com infiltração na biópsia de medula
óssea.
59
9 Critérios usados para caracterização da morfologia celular em
sangue periférico em casos com linfocitose e/ou atipia.
63
10 Relação entre presença de morfologia linfoblastóide, sobrevida e
níveis de LDH, cálcio e forma clínica.
64
11 Relação entre presença de morfologia clássica, sobrevida, níveis
de LDH, cálcio e forma clínica.
64
12 Relação entre predominância da morfologia semelhante a LLC,
sobrevida, níveis de LDH, cálcio e forma clínica.
65
INDICE DE FIGURAS
Figura Titulo Página
1 Relação entre a presença de infiltração de medula óssea e o
tempo de sobrevida.
53
2 - 7 Padrão de infiltração na medula óssea.
55
8 - 11 Imunoistoquímica na infiltração de medula óssea. 60
12 Comparação entre a especificidade dos três marcadores
usados para identificar infiltração da medula óssea por
linfócitos T.
60
13 - 18 Morfologia de linfócitos atípicos em sangue periférico.
62
19 Relação entre o tipo celular e o tempo de sobrevida.
66
20 Relação entre a morfologia celular e os níveis séricos de
desidrogenase lática.
67
21 Relação entre os casos com predominância do tipo morfológico
clássico e a presença de infiltração de medula óssea.
68
RESUMO
A leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) é uma doença linfoproliferativa
agressiva associada ao HTLV-I. Foi a primeira neoplasia maligna humana
considerada como causada por um retrovirus e ocorre em regiões onde o HTLV-I é
endêmico, como Japão, Caribe, África e Brasil. ATL apresenta um espectro de
formas clinico-patológicas sendo classificada em subtipos de acordo com critérios
clínicos e laboratoriais. Apesar da freqüência elevada de casos com linfocitose a
infiltração da medula óssea é variável ocorrendo em até 50% dos casos, mais
frequentemente na forma clínica aguda. Poucos estudos descrevem o envolvimento
e o padrão de infiltração da medula óssea em ATL, sua importância no estadiamento
da doença, bem como a correlação com fatores prognósticos. Neste estudo foram
avaliadas características histológicas e imunofenotipicas da medula óssea e as
alterações do sangue periférico, comparando com as formas clínicas e com fatores
prognósticos da ATL como tempo de sobrevida e níveis séricos de LDH e cálcio.
Vinte e nove casos com diagnóstico de ATL foram estudados e 15 (51,7%)
apresentavam infiltração ao aspirado e/ou biópsia de medula óssea. Destes, 13
casos apresentaram infiltração na biópsia de medula óssea sendo quatro do tipo
intersticial, quatro do tipo focal e cinco do tipo difuso; mesmo nos casos leucêmicos,
o padrão intersticial com infiltração discreta e a ausência de infiltração foram
freqüentes. Dois casos apresentaram infiltração apenas ao mielograma.
O perfil imunoistoquímico das células linfóides neoplásicas nas medulas ósseas
infiltradas foi similar ao perfil encontrado na imunofenotipagem no tecido tumoral. Em
três casos foi encontrado imunofenótipo pouco freqüente em ATL, dois casos CD4-
CD8+ e um caso CD4+ CD8+. Foi demonstrada variação na expressão de CD25 (IL-
2Rα) entre as formas clínicas, observando-se expressão mais freqüente nas formas
aguda e linfoma
Na análise do sangue periférico observou-se que os pacientes com predominância
da morfologia celular clássica nos linfócitos atípicos apresentaram menor tempo de
sobrevida e nível sérico de LDH mais elevado enquanto que os pacientes com
células linfóides atípicas semelhantes á leucemia linfocítica crônica (LLC)
apresentaram maior tempo de sobrevida. Os achados deste estudo sugerem que a
proliferação das células leucêmicas pode estar ocorrendo em outros órgãos que não
a medula óssea e que o status da medula óssea em ATL pode não refletir a
progressão da doença e ter relevância inferior à observada em outros
linfomas/leucemias. A expressão de marcadores de superfície celular como CD25
pode ser importante para auxiliar na conduta terapêutica e pode ser útil como fator
prognóstico em ATL. A monitorização da morfologia de células atípicas em sangue
periférico pode permitir a determinação precoce do advento de crisis ou agudização
nas formas indolente, crônica ou linfomatosa.
1
ABSTRACT
Adult T-cell leukemia/lymphoma is a lymphoproliferative aggressive disease
associated with HTLV-I infection. It was the first human malignant neoplasia to be
accepted as caused by a retrovirus and it occurs in regions where HTLV-I infection is
endemic like Japan, the Caribbean Islands, Africa and Brazil. ATL presents a wide
spectrum of clinical–pathological forms and is classified in subtypes according to
clinical and laboratorial criteria. In spite of the high frequency of cases which present
with lymphocytosis, bone marrow (BM) infiltration is variable occurring in up to 50% of
the cases, most frequently in the acute form. Few studies have described the
involvement and pattern of infiltration of the BM in ATL and its relevance and
correlation with prognostic factors. In this study histological and immunophenotypic
characteristics of the BM and peripheral blood alterations were studied and compared
with the clinical form and prognostic factors for ATL, such as survival and lactate
dehydrogenase and calcium levels in the serum. Twenty nine cases with the
diagnosis of ATL were studied and 15 (51.7%) showed BM infiltration in the BM
biopsy: 4 of interstitial pattern, 4 focal or nodular and 5 diffuse. Even in the leukemic
cases, the interstitial pattern with slight infiltration and absence of infiltration were
frequent. In two cases neoplastic infiltration in the BM was demonstrated exclusively
in the aspirate. The phenotypic profile of the neoplastic cells was similar in the
tumoral tissue and in the BM infiltration. In 3 cases an infrequent phenotype was
observed: 2 cases were CD4-,CD8+ and one was CD4+, CD8+. There was a varied
expression of CD25 among the clinical forms, positivity being more frequent in the
acute and lymphoma subtypes. Peripheral blood analysis showed that the cases with
predominance of the classical ATL morphology in the atypical lymphocytes had a
shorter survival and higher LDH serum levels whereas the patients with lymphocyte
morphology similar to lymphocytic leukemia (LLC) showed longer survival. The
findings of the present study suggest that the proliferation of neoplastic cells may be
occurring in other organs instead of the BM and that BM status in ATL may not reflect
disease progression and be less relevant than in other leukemias/lymphomas. The
expression of CD25 and other surface markers may be useful as prognostic factors
and to suggest therapy. Monitoring of neoplastic cell morphology in the peripheral
blood may predict the advent of crisis in the indolent, chronic and lymphoma clinical
forms.
13
1.0 INTRODUÇÃO
A leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) é uma doença linfo-
proliferativa relacionada com o vírus linfotrópico T humano tipo 1 (HTLV-I), que
apresenta um curso agressivo e que frequentemente inclui leucemia, lesões
cutâneas e hipercalcemia e que não responde à quimioterapia (TAKATSUKI et al.,
1985, KAWANO et al., 1985). Foi descrita pela primeira vez em japoneses
(UCHIYAMA et al., 1977) e a seguir em descendentes de africanos na região do
Caribe (BLATTNER et al., 1982). Em 1980 foi identificado o primeiro retrovirus
humano, o HTLV-I, em um paciente com linfoma T cutâneo (POIESZ et al., 1980) e
depois este mesmo vírus foi isolado em células de pacientes com ATL (HINUMA et
al., 1981). Subsequentemente, estudos soroepidemiológicos demonstraram a
associação entre HTLV-I e ATL (BLATTNER et al., 1982; HINUMA et al., 1982).
O HTLV-I é endêmico em várias regiões do mundo e a área de mais elevada
endemicidade encontra-se no sul do Japão; é deste país que provem o maior volume
de dados sobre aspectos epidemiológicos e clínicos associados à infecção pelo
HTLV-I (TAJIMA et al., 1990; ARISAWA et al., 2000).
No Brasil, o primeiro estudo de soroprevalência do HTLV-I foi publicado em
1986, quando os autores identificaram uma população de imigrantes japoneses com
índice de positividade de 13% (KITAGAWA et al., 1986). A ATL foi descrita no Brasil
em 1990 (POMBO DE OLIVEIRA et al., 1990) e a partir desta data vários estudos
foram realizados na tentativa de definir o padrão epidemiológico em nosso país. Na
14
Bahia, a ATL foi descrita inicialmente em um caso em Salvador
(BITTENCOURT et al., 1994) e a seguir em 1997 e 1999 uma série de casos foram
descritos (BITTENCOURT et al., 1997; SCHAER-BARBOSA et al., 1999).
A ATL desenvolve-se, após um longo período de latência, em cerca de 2-5%
dos indivíduos infectados. A doença ocorre, geralmente, na idade adulta entre 20 e
70 anos, com média de 58 anos em japoneses e de 43 anos no Caribe (TAJIMA et
al., 1990; HANCHARD et al., 1996). No Brasil a idade média é de 40 anos, entretanto
casos raros foram descritos em crianças e adolescentes (POMBO DE OLIVEIRA et
al., 2002; BITTENCOURT et al., 2006).
Quando a doença se desenvolve, apresenta um espectro variado de formas
clinico-patológicas, sendo classificada em subtipos de acordo com critérios clínicos e
laboratoriais (SHIMOYAMA et al., 1991). O paciente pode apresentar quadro clínico
indolente ou desenvolver forma agressiva da doença, caracterizada por envolvimento
de sangue periférico, linfonodos, pele e medula óssea. É também característica
desta leucemia/linfoma, o surgimento em qualquer uma das formas clínicas de
agudização súbita do quadro clínico chamado crisis (KAWANO et al., 1985), com
leucemização brusca que muitas vezes leva ao óbito do paciente.
O diagnóstico da ATL requer integração do quadro clínico, com a análise do
sangue periférico e estudo histopatológico da medula óssea ou de lesão tecidual. A
medula óssea esta envolvida em muitos, mas não em todos os casos de ATL. Alguns
apresentam extensa e difusa infiltração, entretanto, freqüentemente o infiltrado é
discreto e pode não ser detectável em exames de rotina, em aspirado e biópsia de
medula óssea (JAFFE et al., 1984).
15
A pesquisa de envolvimento da medula óssea é um procedimento utilizado
no estadiamento de linfomas não Hodgkin (LNH) e pode contribuir para determinar o
estágio da doença e a estratégia de tratamento. Muitos estudos foram realizados
demostrando a utilidade do estudo da medula óssea em LNH (FINEBERG et al.,
1993; WOO-IN et al., 1994; COHEN et al., 1998; HANSON et al., 1999; DUGGAN et
al., 2000; KROBER et al., 2000; BUHR et al., 2002; COSTES et al., 2002; SAH et al.,
2003; DUROSINMI et al., 2003; CANIONI et al., 2004). Entretanto, são raros os
estudos realizados em casos de ATL (JAFFE et al., 1984) e a correlação entre o
envolvimento da medula óssea com prognóstico e formas clínicas não tem sido
objeto de estudos.
Em estudo realizado em pacientes de Salvador e outras regiões da Bahia,
25% dos casos apresentavam infiltração de medula óssea (SCHAER-BARBOSA,
1997). No entanto, neste estudo foi feito apenas o mielograma, raramente sendo
realizada a biópsia da medula, muito importante para avaliação em linfomas T que
podem apresentar uma infiltração intersticial discreta da medula óssea, difícil de ser
detectada ao mielograma. Ainda, como ATL manifesta-se muitas vezes sob a forma
leucêmica, muitos estudos, tanto no Brasil como em outros países não descrevem as
alterações histológicas da medula óssea, sendo avaliado apenas o mielograma. Um
estudo comparativo entre as formas clínicas da doença, as alterações do sangue
periférico e as características da medula óssea ao mielograma e estudo histológico
deverá contribuir para o entendimento do significado da infiltração medular na
evolução clínica e na patogenia da doença, uma vez que são raros os trabalhos
publicados que investigaram estes aspectos.
16
REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Epidemiologia
Existe muita controvérsia sobre a origem do HTLV-I. Vários estudos têm sido
feitos tentando explicar sua origem pelo estudo da heterogeneidade molecular entre
os isolados virais de várias regiões. Houve tentativas de isolar o HTLV de primatas,
na África e Ásia, sugerindo-se a possibilidade de transmissão enzoótica para o
homem (VANDAMME et al., 1994). Estudos mais precisos indicam que o vírus
originou-se na África e foi levado ao Caribe através do tráfico de escravos e
possivelmente, para o Japão pela tripulação dos navios portugueses durante os
séculos XVI e XVII (HINO et al., 1984; VANDAMME et al., 1994). Entretanto, outros
relatos sugerem que o HTLV-I já estaria presente na população do Japão, desde a
pré-história (GALLO et al, 1991; YANAGIHARA et al, 1990).
Atualmente estima-se que cerca de 10 a 20 milhões de indivíduos estão
infectados pelo HTLV-I no mundo (EDLICH et al., 2000). O vírus é endêmico em
muitas regiões, incluindo Japão (TAJIMA et al., 1990; ARISAWA et al., 2000), África
Central (WILLIANS et al., 1993), Caribe (COTOVSKY et al., 1982; BARTHOLOMEW
et al., 1989) e América do Sul (DUQUE et al., 1985; FUJIYOSHI et al., 1999;
CARNEIRO-PROIETTI et al., 2002). A infecção pelo HTLV-I apresenta padrão
epidemiológico caracterizado por: agrupamentos em áreas geográficas no mundo,
aumento da prevalência com a idade, soroprevalência elevada no sexo feminino e
17
agregação familiar da infecção (TAJIMA et al, 1987; MURPHY et al., 1997; MANNS
et al, 1991; YAMAGUCHI & WATANABE et al., 2002).
A região com mais alta prevalência da infecção é o sudoeste do Japão,
estando a soro-prevalência na população geral desta região, em torno de 5 a 6%
(GALLO et al, 1991; TAJIMA et al., 1990; ARISAWA et al., 2000), mas com áreas em
que alcança cerca de 40% no sudeste e nordeste do país (TOKUDOME et al., 1989;
YAMAGUCHI et al., 1994). Na Europa, a infecção aparenta ser rara e restrita a
determinados grupos, como os de imigrantes de áreas endêmicas (LEE et al., 1990).
Existe pouco estudo de prevalência baseado em população na América do Norte. Os
relatos publicados são baseados em triagem sorológica em banco de sangue e
indicam uma prevalência baixa, em torno de 0,03% (LEE et al., 1990; HARRINTON
et al., 1995; MURPHY et al., 1999). O Caribe é também uma importante zona
endêmica de infecção pelo HTLV-I. Nesta área a soro-prevalência chega a 5% da
população da Jamaica e Panamá (HANCHARD et al., 1996; MURPHY et al., 1991).
O HTLV-I esta presente em todos os paises da América do Sul, mas com variação da
prevalência (0,1% a 5,0%) entre os paises e grupos populacionais. A maior
proporção da infecção entre a população geral (1% a 5%) foi descrita no Brasil,
Colômbia e Peru (FUJIYOSHI et al., 1999; CARNEIRO-PROIETTI et al., 2002). Na
Venezuela, em regiões próximas ao Caribe, a soroprevalência foi de 6,9% na
população geral (MERINO et al., 1984). Na Colômbia a soroprevalência foi de 4,5%
(MALONEY et al., 1989).
18
No Brasil, o HTLV-I está presente em todas as regiões em que foi
pesquisado (GABBAI et al., 1993; MOREIRA et al., 1992; POMBO DE OLIVEIRA et
al., 1995; DE CARVALHO et al., 1996; POMBO DE OLIVEIRA et al., 1999). As
regiões com maior número de casos diagnosticados são Rio de Janeiro, Salvador,
Recife e São Paulo (POMBO DE OLIVEIRA et al., 1999) e São Luiz (Maranhão)
(CATALAN-SOARES et al., 2005). A triagem em bancos de sangue tornou-se
obrigatória no Brasil, desde 1993, com o intuito de evitar a transmissão transfusional
do HTLV-I em procedimentos hemoterápicos. Assim, por este procedimento
laboratorial de rotina, têm-se identificado parcelas significativas de portadores
assintomáticos deste retrovirus em nosso meio (SEGURADO, 1997). Cerca 0,5% dos
doadores de sangue no país apresentam sorologia positiva (POMBO DE OLIVEIRA
et al., 2002). Estudos conduzidos entre doadores de sangue mostraram que a
prevalência da infecção pelo HTLV-I variou de 0,08%, nas regiões sul e norte; 0,33%
na região sudeste a 1,35% na região nordeste (GALVÃO-CASTRO et al., 1997). Uma
soroprevalência elevada foi observada em Salvador (Bahia), onde há uma grande
população de descendentes de africanos, com prevalência de 1,35% a 1,8% em
doadores de sangue (GALVÃO-CASTRO et al., 1995; MOREIRA et al., 1992) e 0,9%
em gestantes (BITTENCOURT et al., 2001). A freqüência elevada desta infecção em
pacientes pardos e negros, dá suporte ao conceito de origem africana do HTLV-I do
Brasil e América do Sul (SCHAER-BARBOSA, 1997). Na infância, a soropositividade
para o HTLV-I é muito baixa, aumentando com a idade adulta, principalmente em
mulheres, como observado em outras áreas endêmicas (CARNEIRO-PROIETTI et
al., 2002).
19
A transmissão do vírus ocorre através de transfusão sanguínea,
compartilhamento de agulhas e seringas contaminadas, contato sexual e
verticalmente de mãe para filho. A transmissão sexual ocorre principalmente de
homens para mulheres. O raio de transmissão de homens infectados para mulheres
foi considerado de 60,8%, enquanto que a transmissão de mulheres infectadas para
homens ocorre raramente, cerca de 0,4% (MURPHY et al., 1989; LARSEN et al.,
2000). A transmissão vertical, principalmente através do aleitamento materno,
constitui o principal meio de contaminação (WILKS, 1996). Células mononucleares
positivas para o HTLV-I foram identificadas no leite de mães portadoras. A presença
de linfócitos infectados no sangue do cordão umbilical e a detecção do vírus no
trofoblasto de placentas humanas indicam que a via transplacentária pode ser uma
outra alternativa, embora menos freqüente, de transmissão vertical (KINOSHITA et
al., 1984; BITTENCOURT, 1998). Contaminação no canal de parto constitui outra
possível via de transmissão vertical.
Em 1982, Kalynaraman et al, identificaram um segundo retrovírus da mesma
subfamília do HTLV-I, o HTLV-II. Apesar da grande homologia com HTLV-I, o HTLV
tipo II não está consistentemente associado a nenhuma doença humana
(CARNEIRO-PROIETTI et al., 2002), embora haja trabalhos, inclusive nacionais,
demonstrando a sua relação com doença neurológica (ARAUJO et al.,2004).
20
1.2 Estrutura da partícula e do genoma viral
O HTLV-I é um deltavirus tipo-C da família
retroviridae. Constitui-se de partículas
esféricas, compostas de core central e um
envelope externo glicoprotéico. O core
abriga, em seu interior, o genoma viral
constituído de duas cópias do ácido
ribonucléico (RNA) de fita única, as
proteínas da matriz viral e outras proteínas
como a enzima transcriptase reversa e a integrase, essenciais no processo de
integração do DNA proviral no genoma da célula hospedeira (CANN & CHEN, 1996).
A estrutura genética é composta por três genes estruturais gag, pol e env, dois genes
regulatórios, Tax e Rex, situados na região X. As extremidades do genoma são
flanqueadas por duas regiões repetidas chamadas LTR (long terminal repeat) cujas
seqüências são essenciais na integração do DNA proviral dentro do DNA
cromossômico do hospedeiro e também na regulação transcricional do genoma do
HTLV (FRANCHINI, 1995; CANN & CHEN, 1996). A região Gag codifica as proteínas
do core (p15, p19, p24). A região Pol codifica as proteases e transcriptase reversa e
a região env codifica as proteínas do envelope viral: a glicoproteína de superfície de
46 kDa (gp46) e a proteína transmembrana de 21 kDa (p21). A região pX codifica
as, proteínas regulatórias Tax e Rex. A proteína Tax é uma transativadora da
transcrição viral e a proteína Rex é uma reguladora pós-transcricional da síntese de
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21
proteínas estruturais do vírus. As duas proteínas têm papel fundamental na
regulação da expressão viral (CANN & CHEN, 1996).
1.3 Ciclo de replicação viral
O HTLV-I é um vírus de baixa infectividade, que infecta principalmente
linfócitos T. Entretanto, outros tipos de células também podem ser infectadas, como
os linfócitos B, monócitos e fibroblastos. A adesão viral e a entrada nas células
susceptíveis envolvem a interação entre a glicoproteina de superfície, gp46, e
receptores na superfície da célula hospedeira. Embora o receptor para HTLV-I seja
expresso em várias linhagens celulares (TREJO & RATNER, 2000), não foram ainda
definitivamente identificados. Recentemente identificaram um transportador de
glucose I como receptor para o HTLV-I, explicando assim, como este vírus pode
infectar diferentes tipos de células (MANEL et al., 2003, 2004).
Após penetrar na célula, o vírus libera o RNA do envelope e ocorre, no
citoplasma da célula, a transcrição do RNA viral em DNA proviral pela ação da
transcriptase reversa. O DNA proviral é então transportado para o núcleo onde se
integra ao genoma da célula hospedeira na forma de provírus, através da ação de
uma enzima, a integrase viral. (GALLO et al., 1991). A integração do DNA proviral do
HTLV-I no genoma da célula hospedeira não é feita em sítios específicos e sim ao
acaso. No processo de integração, o provírus fica estável e passa a fazer parte do
cromossoma no qual se instalou, sendo passado de uma célula a outra pela divisão
celular. O ciclo de vida viral prossegue, com replicação genômica, transcrição dos
22
genes virais, translação das proteínas virais, utilizando sistemas da célula
hospedeira. A montagem do virion prossegue com a encapsulação do genoma pelas
proteínas codificadas pelos genes gag e pol, associação do nucleocapsídeo com a
membrana da célula e liberação da nova partícula viral por brotamento (COFFIN,
1996).
1.4 Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HTLV
1.4.1 Diagnóstico sorológico
O diagnóstico sorológico baseia-se na detecção de anticorpos circulantes,
específicos para os constituintes antigênicos das diferentes porções do vírus. Os
primeiros anticorpos produzidos são contra as proteínas do Gag, anti-p24 e anti-p19,
seguidos pelos da proteína do envelope, gp21 e gp46. Os ensaios sorológicos para
detecção de anticorpos anti-HTLV dividem-se em dois grupos: os de triagem e os
confirmatórios (CONSTATINE, 1993). As reações de triagem mais conhecidas são as
de ELISA e a aglutinação em partículas de látex ou gelatina. As reações de
aglutinação utilizam partículas de látex ou gelatina sensibilizadas com vírus inativado
que aglutinam na presença de anticorpos anti-HTLV encontrados no soro do
paciente; por ser um procedimento de baixo custo e rápida execução é utilizado na
realização de estudos epidemiológicos (FUJINO et al., 1991). O ELISA, que utiliza
como antígeno o lisado viral e proteínas virais obtidas por tecnologia recombinante, é
o principal método usado na triagem sorológica, com sensibilidade de 99 a 100% e
especificidade de 95,2 a 99,9% (KAROPOULOS et al., 1993; KLINE et al., 1991;
23
KLINE et al., 1994; POIESZ et al., 2000). Entretanto, os testes de triagem não são
capazes de distinguir entre HTLV-I e HTLV-II devido a homologia genômica entre os
vírus. Amostras que apresentam resultados positivos necessitam ser submetidas a
um teste confirmatório como o western blot (LAL et al., 1992). Este método utiliza,
como antígeno, o lisado viral total acrescido de epitopos recombinantes
correspondentes à porção terminal da proteína transmembrana (gp21) do HTLV-I/II
(peptídeos r21 e GD21-I). No entanto, os indivíduos infectados por qualquer dos tipos
de vírus HTLV apresentam anticorpos circulantes, que exibem reatividade cruzada
com o tipo heterólogo, e após confirmação da soropositividade, é preciso discriminar
entre os dois tipos de vírus obedecendo-se os critérios descritos a seguir (LILLEHOJ
et al., 1990; WIKTOR et al., 1990; LAL et al., 1992).
Soropositivos para HTLV-I: reatividade com moléculas pelo gene GAG (p19 e p24),
juntamente com duas codificadas pelo envelope (GD21, rgp46-I).
Soropositivos para HTLV-II: reatividade com moléculas pelo gene GAG (p19 e
p24), juntamente com duas codificadas pelo envelope (GD21, rgp46-II).
Soropositivos para HTLV: reatividade com moléculas pelo gene GAG (p19 e p24),
e pelo envelope (GD21).
Indeterminados: reatividade com os antígenos do HTLV-I/II, porém com padrão
diferente do acima descrito para soropositivos.
Negativos: Sem reatividade com antígenos específicos do HTLV.
24
1.4.2. Diagnóstico molecular
O diagnóstico molecular de infecção pelo HTLV é indicado nos casos com
reações indeterminadas ao western blot e para o esclarecimento de casos
inconclusivos aos testes sorológicos. As provas moleculares baseiam-se na pesquisa
de seqüências genômicas virais e, portanto, não dependem da formação de
anticorpos. Assim, apresentam maior sensibilidade e especificidade para a detecção
e discriminação da infecção pelo HTLV-I/II. Para tal, empregam-se as técnicas de
amplificação de segmentos genômicos, capazes de multiplicar uma seqüência
especifica de DNA a partir de uma única cópia. A principal técnica de amplificação de
ácidos nucléicos é a reação em cadeia da polimerase (PCR) (ERLICH et al., 1989). A
PCR é utilizada para amplificar as regiões mais conservadas do genoma viral,
habitualmente utilizando primers consensuais, capazes de amplificar tanto
seqüências de HTLV–I como de HTLV-II, ou utilizar primers específicos, para as
regiões do genoma viral em que não há homologia entre os dois virus, permitindo
com isso, a amplificação exclusiva de HTLV-I ou HTLV-II.
Nos casos de ATL é importante a demostração da integração monoclonal do
provirus presente nas células mononucleares do sangue periférico ou em células de
biópsia ou aspirado da lesão neoplásica. Entretanto, a PCR não pode identificar se a
integração é monoclonal ou policlonal e para esta finalidade as técnicas usadas são
Southern blot ou PCR invertido (IPCR) (TAKEMOTO et al., 1994).
25
1.4.3. Isolamento viral
Técnicas de isolamento viral, a partir de células mononucleares periféricas,
embora com sensibilidade inferior aos métodos moleculares, constituem outro modo
de confirmar-se o diagnóstico de infecção pelo HTLV e caracterizar as diversas
cepas virais, permitindo maior conhecimento sobre a epidemiologia molecular do
vírus e contribuindo para esclarecer a origem do HTLV-I (GOUBAU et al., 1996;
YAMASHITA et al., 1996, 2001). As técnicas que apresentam melhores resultados
envolvem a cultura de células mononucleares do paciente em estudo com linfócitos
de indivíduos não infectados, estimulados por mitógenos, na presença de fatores de
crescimento como a IL-2 (KITAMURA et al., 1993). A aferição do isolamento viral
pode dar-se através da análise por microscopia eletrônica para identificação ultra-
estrutural das partículas virais, detecção da presença do DNA viral por PCR e/ou
pesquisa das proteínas virais em sobrenadante de cultura, através de ensaios
imunoenzimáticos .Tendo em vista que o isolamento viral exige condições rigorosas
de biossegurança, sua utilização tem sido restrita a laboratórios de pesquisa, não se
aplicando na rotina diagnóstica.
26
1.5 Leucemia/linfoma de células T do adulto
A leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) é uma proliferação linfóide
agressiva associada ao HTLV-I. Foi a primeira neoplasia humana associada a
infecção por um retrovirus, e ocorre em regiões onde o HTLV-I é endêmico, como
Japão, Caribe, África e Brasil (TAJIMA et al., 1990; BLATTNER et al., 1990).
As características clínicas e epidemiológicas da ATL no Brasil são
semelhantes aos casos descritos em outras áreas endêmicas, com idade média de
44 anos, incidência igual quanto ao sexo masculino e feminino (1:1), havendo
variações apenas no estado da Bahia (3:1) e em Pernambuco, onde a relação é
invertida (1:2). Diferença entre os grupos étnicos foi relatada apenas nos estados de
São Paulo e Bahia com predominância de pacientes da raça branca e negra,
respectivamente. A ATL aguda foi a forma clínica predominante (60%), seguida por
linfoma (22%), crônica (10%) e indolente (8%) (POMBO DE OLIVEIRA et al., 1999).
Em estudo anterior, as formas clinicas linfoma e indolente foram predominantes,
provavelmente devido a pesquisa sistemática da infecção por HTLV-I em todos os
pacientes com linfoma de células T no Brasil (SCHAER-BARBOSA et al., 1999;
POMBO DE OLIVEIRA et al., 1999).
Infecção no inicio da vida, provavelmente pela amamentação, é o principal
fator de risco para o desenvolvimento da ATL. Em recente estudo de pacientes com
ATL, 100% das mães eram portadoras assintomáticas, enquanto que apenas 30%
das mães de pacientes com HAM/TSP apresentavam testes sorológicos positivos
para o HTLV-I (CATALAN-SOARES et al., 2004). Outros fatores são considerados de
27
risco para o desenvolvimento da ATL, como idade avançada, história familiar de ATL,
história de dermatite infecciosa associada ao HTLV-I e fatores genéticos, como o
perfil dos antígenos leucocitários humanos (HLA) que podem conferir proteção ou
predisposição para o desenvolvimento da ATL (HANCHARD et al., 1991; YASHIKI et
al., 2001). Entretanto, as explicações sobre o mecanismo patogênico que determina
o aparecimento da leucemia/linfoma nos pacientes infectados são controversas. Os
principais estudos estão relacionados com a proteína viral Tax, que é considerada
como fortemente associada a gênese da ATL (FRANCHINI et al., 1995; FURUKAWA
et al., 2001).
1.5.1 Patogênese e desenvolvimento da ATL
Apesar do grande número de portadores do HTLV-I no mundo apenas uma
minoria desenvolve a doença. Eventos oncogênicos adicionais como mutações e/ou
rearranjo de genes da proliferação celular, estão provavelmente implicados nesta
patogênese (SAKASHITA et al., 1992; CERESETO et al., 1996; MAO et al., 2001). O
mecanismo desencadeador da leucemogênese induzida pelo HTLV-I parece estar
relacionado a ciclos de ativação e proliferação de células T infectadas, mediados por
uma desregulação da proteína Tax, que tornariam essas células susceptíveis à
transformação maligna (GALLO, 1991).
A partir da integração, o provírus pode: permanecer latente na célula-alvo;
iniciar um ciclo de replicação e causar a morte da célula infectada; ou desenvolver
interação fisiopatológica com a célula, iniciando a transformação tumoral das células
28
infectadas. Nos portadores assintomáticos da infecção ocorre integração policlonal
do vírus no genoma da célula, enquanto que nas células neoplásicas de ATL a
integração é monoclonal (YOSHIDA et al., 1984). No entanto, há relatos de
portadores e de pacientes com HAM/TSP com integração monoclonal. Acredita-se
que estes indivíduos vão desenvolver posteriormente ATL. O tumor contêm cópias
do pro-vírus integrado na mesma localização cromossômica em cada célula. Isto
significa que o tumor originou-se de uma célula transformada e que a infecção viral
ocorreu antes da transformação e expansão clonal.
A proteína Tax aumenta a expressão de muitas citocinas e receptores
envolvidos no crescimento e proliferação das células T como, interleucina (IL) -2,
receptor da IL-2, IL-15 e fatores estimuladores de colônias de macrófagos e
granulócitos. Mutações nos genes supressores de tumor como, p53, p15, p16, e na
molécula de superfície sinalizadora da apoptose (Fas), e ativação da família tirosina-
kinase são freqüentes na ATL (FUJII et al., 1991; CERESETO et al., 1996). A
interferência de Tax na regulação das células T contribui para a manutenção da
proliferação dos linfócitos, síntese de citocinas e prevenção da apoptose (TENDLER
et al., 1991; AZIMI et al., 1998; WALDMANN et al., 2001), demostrando que Tax
desempenha papel importante na transformação dos linfócitos infectados por HTLV-I
em células com fenótipo maligno promovendo, assim, o desenvolvimento da doença
(LEMOINE et al., 2001; ZUCKER-FRANKLIN, 2001). As células aparentemente
produzem e respondem ao fator de crescimento, a IL -2. Esta é provavelmente a
primeira etapa na leucemogênese e acarreta a proliferação de células T policlonais.
No entanto, as células malignas continuam a expressar o receptor de IL-2 em grande
29
quantidade. As células T normais não expressam receptores de IL-2, a menos que
sejam ativadas e, então, apenas transitoriamente. Assim, a expressão continuada
desses receptores do fator de crescimento é, provavelmente, uma anormalidade
importante na origem dessa leucemia/linfoma.
Entretanto, os mecanismos patogenéticos que determinam a evolução da
infecção pelo HTLV-I, do estado de portador assintomático para doenças
hematológicas linfoproliferativas ainda não estão suficientemente esclarecidos (
FUJIWARA et al., 2001).
Pacientes infectados pelo HTLV-I desenvolvem uma forte resposta
imunológica, caracterizada pela presença de linfócitos T citotóxicos específicos para
o vírus. A maioria destas células reconhece o mesmo antígeno viral, a proteína Tax
(JACOBSON et al., 1990; KANNAGI et al., 1991; PARKER et al., 1992). Entretanto,
em uma pequena percentagem destes pacientes o vírus escapa da resposta imune e
o paciente desenvolve a doença.
Estudos utilizando modelo experimental em ratos, demonstraram que ratos
infectados oralmente apresentavam aumento significante da carga proviral e
deficiência na resposta imune celular especifica para o HTLV-I, quando comparados
com ratos infectados intraperitonealmente (KATO et al., 1998; HASEGAWA et al.,
2003).
Em outros relatos, pacientes recuperados após transplante de medula
óssea, apresentaram altos níveis de resposta imune celular especifica para proteína
Tax do HTLV-I. Em geral, estes resultados indicam que o contato do vírus via
30
mucosa leva a uma ausência de resposta imune celular, resultando em ausência de
atividade citolítica especifica para células infectadas pelo HTLV-I, incluindo os
linfócitos T CD4
+
. Isto poderia resultar em sobrevivência e eventual transformação
desta população de linfócitos infectados, gerando o quadro leucêmico observado em
ATL. Por outro lado, a indução de forte resposta imune, como a observada em ratos
inoculados por via sanguínea, poderia engatilhar a destruição de muitas células T
CD4
+
e do sistema nervoso central, infectadas pelo HTLV-I, resultando no quadro de
destruição celular e processo inflamatório, característico das doenças
neurodegenerativas induzidas por HTLV-I (KANNAGI et al., 2004). Estes achados
sugerem que a rota inicial da infecção viral contribui significantemente para a
patogênese associada à infecção pelo HTLV-I e que a transmissão via amamentação
pode ser um fator de risco em potencial para o desenvolvimento de ATL
(HASEGAWA et al., 2003).
1.5.2 Características clínicas da ATL
ATL manifesta-se clinicamente de forma variada, podendo apresentar
leucemia, linfadenopatia, lesões viscerais múltiplas (hepatoesplenomegalia e
infiltração pulmonar), lesões de pele, sob a forma de eritrodermia, pápulas, nódulos e
tumores e lesões ósseas. Hipercalcemia, causada pelo aumento da reabsorção
óssea pelos osteoclastos, é complicação freqüente e ocorre em 28% dos pacientes
na ocasião do diagnóstico, e, em 50% dos casos, durante a evolução, acompanhada
de lesões osteoliticas (KIYOKAWA et al., 1987). A elevação dos níveis de cálcio no
sangue é extremamente rara em outros tipos de linfoma (LERNER et al., 1994).
31
Fatores como a IL-1, fator transformador de crescimento beta (TGF-β),
paratohormônio e fator nuclear kappa B (NFkB) estão diretamente implicados na
patogênese da hipercalcemia (NIITSU et al., 1988; WATANABE et al., 1990;
NOSAKA et al., 2002).
A desidrogenase lática (LDH) encontra-se elevada na maioria dos pacientes
e constitui-se em indicador de agressividade desta patologia. Os níveis séricos de
cálcio e LDH refletem a extensão da doença e correlacionam-se diretamente com o
grau de agressividade clinica (TAKATSUKI et al., 1992). O leucograma pode ser
normal ou apresentar desde discreta linfocitose a um quadro francamente leucêmico.
Os pacientes com ATL têm geralmente uma desregulação do sistema imune, com
susceptibilidade constante à infecções bacterianas, fúngicas, virais e a infestações
(TAKATSUKI et al., 1992). Relatos indicam que a coinfecção com Strongyloides
stercoralis resulta no desenvolvimento de formas disseminadas da estrongiloidíase
(NEVA et al., 1998; PORTO et al., 2001; PORTO et al., 2005). Outros estudos,
entretanto, demonstram que coinfecção com o Schistosoma mansoni pode diminuir a
produção de interferon-gama (IFN-γ) e proteger o portador do vírus de desenvolver
doenças associadas ao HTLV-I (SANTOS et al., 2004).
A diversidade das manifestações clinicas da ATL determinou a divisão da
doença em quatro formas clínicas: aguda, crônica, linfomatosa e indolente
(SHIMOYAMA et al., 1991). Esta classificação foi baseada no número de células
linfóides atípicas do sangue periférico, no envolvimento de linfonodos, no curso
clínico, nos níveis séricos de LDH e do cálcio, como descrito abaixo:
32
Tipo agudo: é a forma mais agressiva apresentando linfadenopatia, hepato-
esplenomegalia e freqüentes lesões cutâneas. Observa-se, geralmente, leucemia
com numerosos linfócitos atípicos no sangue periférico, massas tumorais e
hipercalcemia. Pode apresentar infiltração do trato gastro-intestinal e do sistema
nervoso central, com sobrevida média de 6 meses (SHIMOYAMA et al., 1991).
Tipo crônico: Presença de linfocitose absoluta com mais de 4 x 10
9
linfócitos/litro,
presença de mais de 3,5 x 10
9
/litro de linfócitos T, inclusive atípicos e tipo flower cell,
nível sérico de LDH até duas vezes o valor normal, ausência de hipercalcemia ou
envolvimento do sistema nervoso central, tecido ósseo ou trato gastro-intestinal .
Pode haver linfadenopatia com demonstração histológica de infiltração por células
atípicas. Pode ocorrer infiltração de fígado, baço, pele e pulmão, com sobrevida
média em torno de 24 meses (SHIMOYAMA et al., 1991).
Tipo linfoma: ausência de linfocitose, 1% ou menos de linfócitos atípicos no sangue
periférico, comprovação histológica de infiltração neoplásica de linfonodos, com ou
sem infiltração extra-nodal. A sobrevida média é de 10 meses (SHIMOYAMA et al.,
1991).
Tipo indolente: Presença de 5% ou mais de linfócitos atípicos em sangue periférico,
ausência de linfocitose e de hipercalcemia e niveis séricos de LDH até 1,5 vezes o
valor normal. Ausência de linfadenopatia e de envolvimento de fígado, baço, sistema
nervoso central, tecido ósseo ou trato gastro-intestinal. Podem existir lesões em pele
e/ou pulmão (SHIMOYAMA et al., 1991).
33
O tipo agudo corresponde a forma clássica da doença e é predominante no
Japão e Caribe. Qualquer um dos tipos de ATL pode evoluir para a forma aguda ou
leucêmica durante o curso da doença. O padrão precário de desempenho clínico,
presença de hipercalcemia, elevação dos níveis séricos de LDH, idade superior a 40
anos e lesões múltiplas são considerados indicadores de mau prognóstico
independentemente da forma clínica inicial (LYMPHOMA STUDY GROUP, 1991).
Outros fatores como alta taxa proliferativa dos linfócitos avaliada pelo anticorpo ki-67
em células mononucleares do sangue periférico (PBMC), integração proviral
defectiva, fenótipo aberrante, aumento da expressão do receptor de IL-2,
hiperbilirrubinemia e hipoalbuminemia também têm sido identificados como
indicadores de mau prognóstico (KAMIHIRA et al., 1994; TSUKASAKI et al., 1997).
Uma nova variedade clinica, a forma tumoral primária de pele, foi proposta
inicialmente por Johno et al, (1987), posteriormente em outro estudo o mesmo autor
relatou casos com lesões cutâneas tumorais com prognóstico e tempo de sobrevida
semelhante à forma aguda (JOHNO et al., 1992). Integração monoclonal do HTLV-I
foi demonstrada no tumor da pele, mas não no sangue periférico indicando que as
células malignas proliferam apenas nas lesões de pele (DOSAKA et al., 1991). Em
estudo com 124 casos Setoyama et al, (1999) observaram que a forma indolente
com lesões de pele apresentava pior prognóstico que a que não exibiam estas
manifestações e sugere que estes casos poderiam pertencer a uma classificação
diferente. Outro trabalho classifica como forma tumoral primária de pele os casos que
apresentam apenas lesões de pele, com aspecto tumoral (BITTENCOURT et al.,
2005).
34
Estes estudos indicam que forma tumoral primária de pele é um subtipo
distinto de ATL e deve ser diferenciada da forma indolente, é caracterizada por
lesões cutâneas tumorais com ausência de linfocitose, envolvimento de linfonodos,
de outros órgãos internos, hipercalcemia e niveis de LDH normais ou levemente
elevado, apresentando um curso mais agressivo que a forma indolente (JOHNO et
al., 1991; DOSAKA et al., 1991; BITTENCOURT, 2005).
A freqüente expressão do receptor de quimiocina 4 (CCR4) na superfície das
células tumorais pode em parte explicar o envolvimento da pele (ARAI et al., 1998;
YOSHIE et al., 2002). A liberação de citocinas quimioatraentes para linfócitos e os
mediadores liberados durante a resposta inflamatória podem levar à atração
quimiotática dos linfócitos infectados e contribuir para infiltração de células ATL na
pele (BERTINI et al., 1999). As células infectadas pelo vírus podem permanecer na
pele por muitos anos antes de disseminar para o sangue periférico e outros órgãos.
35
1.5.3 Diagnóstico de ATL
O diagnostico de ATL é baseado em critérios clínicos e laboratóriais,
exigindo-se diagnóstico histológico e/ou citológico de leucemia ou linfoma de células
T e sorologia positiva para o HTLV-I (SHIMOYAMA et al., 1991). A demonstração da
integração monoclonal do vírus no tecido neoplásico ou em células linfóides do
sangue periférico pelo Southern blot ou IPCR deve ser feita sempre que possível,
embora o conjunto do quadro clínico e diagnóstico laboratorial, com estudo
histológico e/ou citológico e imunofenotipagem, sejam muitas vezes suficientes para
o diagnóstico de ATL. Nos últimos anos, vários foram os critérios estabelecidos para
o diagnóstico de ATL, levando em consideração características clínicas e
laboratoriais, como representado na tabela 1. Entre os critérios mais utilizados está o
de Levine et al, (1994). Após o diagnóstico de ATL, a classificação da forma clínica
da doença é imprescindível para seleção da terapia apropriada.
1.5.3.1 Diagnóstico molecular da ATL
O diagnostico molecular para demonstrar o padrão de integração monoclonal do
provirus nas células de ATL é realizado através das técnicas de Southern blot ou da
IPCR. Na técnica de Southern blot, o material genômico é digerido por enzimas de
restrição e os fragmentos obtidos são separados por eletroforese em gel de agarose,
com transferência destes para uma membrana de nitrocelulose ou nylon e posterior
hibridização com sondas especificas. O padrão de monoclonalidade, através do
IPCR, é estabelecido por digestão do DNA com endonucleases especificas e pela
36
visualização de bandas que representam os fragmentos do HTLV-I inserido no
genoma humano. A demonstração da integração monoclonal do provirus presente
nas células mononucleares do sangue periférico ou em células de biópsia ou
aspirado da lesão neoplásica é importante para o diagnóstico da ATL, principalmente
na forma clínica indolente, quando as lesões são geralmente cutâneas e o
diagnóstico diferencial com outras doenças, como a micose fungóide, pode ser difícil
(TAKEMOTO et al., 1994).
1.5.3.2 Diagnóstico morfológico
As alterações da morfologia das células linfóides no sangue periférico é ,às
vezes, o primeiro sinal indicativo de ATL. Linfócitos atípicos são usualmente
detectados no sangue periférico, exceto na forma clínica linfomatosa. Estes linfócitos
são caracterizados por um acentuado pleomorfismo celular, com núcleos irregulares,
apresentando chanfraduras, aspectos cerebriformes ou convolutos, e variável
condensação de cromatina. Células grandes com aspecto blástico e citoplasma
basofilico também são ocasionalmente observadas. As células características da
ATL são os linfócitos com núcleos hiperlobulados denominados, “flower-cells” ou
células de ATL (UCHIYAMA et al., 1977; BENNETT et al., 1989).
Neutrofilia e eosinofilia também são observados na ATL, com maior
freqüência que em outros linfomas não Hodgkin. O aumento destes leucócitos
provavelmente está relacionado com a liberação de citocinas como GM-CSF e IL-5
pelas células malignas (TSUKASAKI et al., 2000).
37
As células neoplásicas da medula óssea apresentam aspecto pleomórfico com
tamanho que varia entre pequeno e grande. Eosinofilia e proliferação de osteoclastos
também são observados (JAFFE et al., 1984). A infiltração é mais freqüente nas
formas leucêmicas, principalmente na aguda (90%) e menos freqüente na crônica.
Nas formas linfomatosa e indolente a infiltração é menos freqüente (JAFFE et al.,
1984).
1.5.3.3 Marcadores bioquímicos e imunológicos
Alguns marcadores são essenciais para avaliação clínica e classificação da
ATL. As dosagens de cálcio sérico e LDH são indispensáveis na avaliação dos
pacientes, pois hipercalcemia pode ser uma complicação fatal em pacientes com
ATL aguda. A LDH é importante para distinguir os casos crônicos e incipientes e
como indicador da extensão da doença. Os critérios diagnóstico de diferenciação
levam em consideração a relação do valor encontrado da LDH com o valor de
referência (TAKATSUKI et al., 1992). Dentre outros marcadores de atividade da
doença destacam-se os níveis séricos da β2-microglobulina, que é expresso com
antígenos da classe I do HLA e a dosagem sérica da IL-2 que vem demonstrando ser
um excelente indicador do status clínico, apresentando-se elevada nas formas aguda
e linfomatosa (YAMADA et al., 1996).
38
1.5.3.4 Características histopatológicas e imunofenotípicas da ATL
A ATL apresenta histologia variável, mas a maioria mostra características
semelhantes ao linfoma T periférico não especificado (OMS) anteriormente
denominado de linfoma T pleomórfico. Pode ser constituído por células, pequenas,
médias ou grandes. Parece haver relação entre a forma clínica e o tamanho das
células (SCHAER-BARBOSA, 1997). As células grandes têm núcleo ovóide e
vesicular, nucléolo proeminente e citoplasma amplo e abundante. As células médias
mostram núcleos redondos ou cerebriformes e células pequenas com núcleos
irregulares, escuros e picnóticos. A presença de células multinucleadas, gigantes,
semelhantes a células de Reed-Sternberg, também pode ocorrer. Estas
características dão ao quadro histológico aspecto pleomórfico.
A variedade de manifestações clínicas e de padrão histológico, dificultam,
por vezes, o diagnóstico diferencial com outros linfomas T cutâneos como micose
fungóide, síndrome de Sézary e outras formas de linfomas T (TAKATSUKI et al.,
1985; KAWANO et al., 1994), inclusive o linfoma anaplásico de grandes células
(SCHAER-BARBOSA, 1997), enfatizando a importância da realização de sorologia
para HTLV-I nas áreas endêmicas, em pacientes com linfomas T, especialmente na
presença de lesões cutâneas (SCHAER-BARBOSA et al., 1999).
As células tumorais da ATL apresentam características imunofenotípicas que
podem ser demonstradas por citometria de fluxo em sangue periférico ou por
imunoistoquímica nas células tumorais do tecido. O perfil fenotípico mais observado
é: CD2
+
, CD3
+
, CD5
+
, CD7
-
, CD4
+
, CD25
+
(NAGATANI et al., 1992). Cerca de 90%
39
dos casos são CD4
+
/CD8
-
, raros casos são CD4
-
/CD8
+
, CD4
+
/CD8
+
ou CD4
-
/CD8
-
(KAMIHIRA et al., 1992). A maioria dos casos expressa CD25, que corresponde a
cadeia α do receptor de IL-2 (TAKATSUKI et al., 1994). As células grandes,
semelhantes as do linfoma anaplásico de grandes células, expressam CD30.
1.6 Tratamento de ATL
A quimioterapia convencional oferece poucos benefícios, principalmente em
pacientes com a fase aguda da doença, pois induz deficiência da resposta imune e
aumento das infecções oportunistas. A forma linfomatosa, embora também
apresente resistência ao tratamento, tem melhor prognóstico. A terapia de escolha é
a combinação de anti-retrovirais como, a zidovudine e o interferon-alfa, cujos
mecanismos de ação ainda não estão claros, mas estudos in vitro e em animais
sugerem um efeito inibidor da replicação do HTLV-I (ISONO et al., 1990;
BAZARBACHI et al., 2000). Pacientes com as formas crônica e indolente, são
geralmente acompanhados e tratados apenas se houver agudização.
Nova terapia com anticorpos monoclonais como anti-CD52, anti-CD2 e anti-
CD25 (IL-2Rα), este último presente na maioria das células malignas, mas não em
linfócitos em repouso de indivíduos saudáveis (WALDMANN et al., 1995), estão
sendo desenvolvidas para o tratamento da ATL. Alguns estudos indicam o
transplante de medula óssea como uma terapia promissora, evitando a recidiva e
aumentando o tempo de sobrevida dos pacientes com ATL agressiva (BAZARBACHI
et al., 2004)
40
1.7 Outras doenças associadas ao HTLV-I
O HTLV-I também tem sido associado a outras doenças como:
Paraparesia espastica tropical/Mielopatia associada ao HTLV-I
(HAM/TPS), uma forma de mielopatia crônica, lentamente
progressiva, que provoca paraparesia espástica principalmente
em membros inferiores (CRUIKSHANN
et
al., 1956; GESSAIN et al., 1985; OSAME et al., 1986). A
HAM/TPS é geralmente acompanhada de distúrbios
esfincterianos (retenção urinária e/ou fecal) e discretos
distúrbios sensoriais (SEGURADO, 1998).
A uveíte, também foi associada ao HTLV-I devido a presença de células T infectadas
na câmara anterior do olho (MOCHIZUKI et al., 1992; YOSHIMURA et al., 1993).
A dermatite infecciosa associada ao HTLV-I (LA GRENADE et al, 1990,
1998) acomete crianças que apresentam lesões eritêmato-descamativas e crostosas
em couro cabeludo, principalmente pavilhões auriculares e ósteos nasais
(BITTENCOURT et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2005). Apresenta sempre associação
com infecção por Staphylococcus aureus e/ou Streptococcus B-hemolyticus
(OLIVEIRA et al., 2004, 2005). Recentemente foram demonstrados casos de
dermatite infecciosa com inicio tardio, no adulto (BITTENCOURT et al., 2006). Dados
epidemiológicos sugerem que esta doença é um fator de risco para o
desenvolvimento de HAM/TSP e ATL (HANCHARD et al., 1991; PRIMO et al., 2005;
BITTENCOURT et al, 2006).
41
2.0 OBJETIVOS
Geral
Estabelecer e comparar as características morfológicas da medula óssea e do
sangue periférico nas diversas formas clínicas de ATL.
Específicos
Investigar o padrão de infiltração da medula óssea e sua correlação com as
formas clínicas;
Determinar o imunofenótipo da infiltração medular e comparar com aquele do
tecido tumoral;
Correlacionar os padrões de infiltração medular com a progressão da doença
linfo-proliferativa;
Caracterizar morfologicamente as células linfóides neoplásicas no sangue
periférico;
Analisar a relação entre a morfologia dos linfócitos em sangue periférico e os
fatores prognósticos de ATL;
Investigar o perfil fenotípico das células tumorais na MO pela
imunoistoquímica e identificar as variações na expressão dos marcadores
entre as formas clínicas;
Pesquisar a presença de granulações citotóxicas nos casos CD8 positivos.
42
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Pacientes
Foram estudados 29 pacientes diagnosticados como ATL, obtidos através de
estudo prospectivo e retrospectivo como discriminado a seguir. Os critérios de
inclusão neste estudo foram biópsia e aspirado de medula óssea e biópsias das
lesões teciduais (pele ou linfonodo) disponíveis para revisão histológica e
imunoistoquímica, sorologia positiva para HTLV-I por ELISA e Western-blot,
preenchimento da ficha epidemiológica com assinatura do termo de consentimento
livre e esclarecido.
3.1.1 Estudo prospectivo
48 pacientes foram diagnosticados com linfoma T no Serviço de Anatomia
Patológica do Hospital Universitário Profº Edgar Santos no período de 2002 a 2005.
Esses pacientes foram investigados sorologicamente para infecção pelo vírus HTLV-
I, sendo que 26 apresentaram sorologia positiva e foram selecionados para a
realização de aspirado e biópsia de medula óssea, esfregaços sanguíneos para
pesquisa dos linfócitos atípicos, exames laboratoriais e complementares. Foi também
coletado sangue destes pacientes para pesquisa de integração viral por PCR
invertido no Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz – FIOCRUZ. Dos pacientes com
sorologia positiva para HTLV-I, 17 foram incluídos neste estudo; nove foram
excluídos porque o aspirado e biópsia de medula óssea foram insuficientes para
diagnóstico.
43
3.1.2 Estudo retrospectivo
Foram revisados retrospectivamente, todos os casos com diagnóstico de ATL
e sorologia positiva para HTLV-I do arquivo do Serviço de Anatomia patológica do
HUPES no período de 1996 a 2001. Doze casos que preenchiam os critérios de
inclusão foram inseridos neste estudo. Os dados clínicos-laboratoriais e exames
adicionais foram obtidos através da análise de prontuários. Nos pacientes vivos
também foi realizada coleta sanguínea para pesquisa de integração viral e confecção
de esfregaços sanguíneos para caracterização dos linfócitos atípicos.
3.1.3 Dados clínicos e epidemiológicos
Em todos os casos incluídos no estudo foram obtidas informações sobre
idade, sexo, grupo racial, se foram amamentados e por quanto tempo, uso de drogas
injetáveis, transfusão sanguínea ou hemoderivados e antecedentes de DST, através
do preenchimento de fichas epidemiológicas (anexo D) ou em revisão de prontuários.
A sobrevida foi calculada a partir da data do diagnóstico de ATL até o óbito ou até o
ultimo seguimento em 09/2006.
Destaque-se que os pacientes analisados retrospectivamente já haviam sido
estudados de acordo com protocolo específico para pacientes com ATL que é
rotineiramente aplicado neste serviço. Os dados clínicos, laboratoriais e exames
complementares incluem: exame físico, hemograma, dosagem sérica de cálcio e
LDH, radiografias de tórax e ultra-sonografia e/ou tomografia computadorizada de
abdômen.
44
3.2 Critérios para diagnóstico de ATL
Utilizaram-se os seguintes critérios para diagnóstico de ATL: sorologia positiva
para HTLV-I, exame anatomopatológico ou citológico conclusivo para linfoma T
periférico com características morfológicas e imunofenotipicas compatíveis com ATL.
Estes critérios (tabela1) foram sugeridos por um Estudo do Grupo Internacional para
Critérios Diagnósticos de ATL (LEVINE et al.,1994). O estudo da integração
monoclonal do vírus foi também realizado obtendo-se material adequado para
realização de IPCR em cerca de 40% dos casos.
Tabela.1 Critérios para diagnóstico de ATL, segundo Levine e col, 1994.
Critério clínico e laboratorial Número de
pontos
Hipercalcemia 1
Lesões de pele 1
Fase leucêmica 1
Leucemia ou linfoma de células T 2
Anticorpos anti-HTLV-I 2
Receptor para IL-2 (CD25+) 1
Inserção monoclonal do segmento
proviral HTLV-I em células tumorais
2
Classificação da ATL
baseada no número de pontos
Clássica
> ou = 7 pontos
Provável 5 ou 6 pontos
Possível 3 ou 4 pontos
Inconsistente
< 3 pontos
3.3 Diagnóstico sorológico
O diagnóstico sorológico foi realizado no laboratório de Retrovirologia –
HUPES. A pesquisa de anticorpos circulantes específicos para os constituintes
antigênicos anti-HTLV-I/II foi feita pelo método de ELISA (Enzime Linked
45
Immunosorbent assay) indireto (kit VIRONOSTIKA). As amostras repetidamente
positivas foram confirmadas pelo teste de Western blot (GENELABS
DIAGNOSTICS), que também possibilita a discriminação entre o HTLV-I e HTLV-II.
Esse teste emprega como antígenos o lisado viral total acrescido de proteínas
recombinantes tipo-especifica, como os peptídeos derivados da glicoproteina externa
do envelope viral (gp46): o rgp46-I (especifico para HTLV-I) e rgp46-II (especifico
para HTLV-II). A presença de reatividade para os produtos do gag, p19 e/ou p24 e
para os dois produtos do envelope, rgp21 e rgp46-I é o perfil considerado com
positivo para o vírus HTLV-I.
3.4 Pesquisa de integração viral
A pesquisa da integração viral foi realizada no laboratório de Imunoregulação
e Microbiologia do Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz – FIOCRUZ, com o apoio do
laboratório de Virologia Clinica e Epidemiologica do Instituto Rega – Belgica, usando
a técnica da IPCR. A técnica está descrita no anexo A.
3.5 Análise do sangue periférico
O sangue periférico foi analisado pelo leucograma. A coleta sanguínea por
punção venosa foi realizada na época da biópsia e punção da medula óssea. A
contagem global e diferencial dos leucócitos foi inicialmente realizada por método
automatizado no aparelho eletronic coulter SPKS. Para revisão, confirmação da
contagem diferencial e identificação dos linfócitos atípicos, foram confeccionados
46
esfregaços sanguíneos em lâminas e corados pelo método de Wright. A contagem
diferencial dos leucócitos foi realizada em microscópio óptico em objetiva de imersão
(100x), sendo contado um total de 100 células, seguindo o método de Shiliing.
Quantidade acima de 4.000 linfócitos/mm
3
até 10.000/mm
3
foi considerada linfocitose
moderada e quantidade de linfócitos superior a 10.000/mm
3
, linfocitose elevada. Os
linfócitos atípicos foram contados e analisados seguindo os critérios morfológicos
descritos na tabela 9.
3.6 Analise do aspirado de medula óssea
O aspirado de medula óssea foi obtido através de perfuração percutânea da
crista ilíaca posterior usando agulha apropriada; após a punção do aspirado foi
retirado um fragmento de medula óssea usando a agulha de Yamshidi especifica
para execução de biópsia. Gotas da medula óssea aspirada foram colocadas em
lâminas de vidro para preparo dos esfregaços, que então foram corados pelo método
de Wright, para realização do mielograma. A análise celular foi feita em microscópio
óptico em objetiva de imersão (100x), realizando-se uma contagem diferencial no
total de 500 células. O critério para considerar um envolvimento positivo de linfócitos
foi o seguinte: a presença de mais do que 30% de linfócitos e/ou a presença de
linfócitos atípicos mesmo em percentual inferior (SAH et al., 2003).
O aspirado e a biopsia de medula óssea foram realizados pelo Serviço de
Hematologia do HUPES e o material encaminhado para o Serviço de Anatomia
Patológica.
47
3.7 Histopatologia
Em todos os casos do estudo prospectivo e os selecionados
retrospectivamente, as biópsias de medula óssea e as das lesões teciduais (pele ou
linfonodo) foram submetidas a estudo histológico e imunoistoquímico e revisados por
dois patologistas e pela pós-graduanda. As biópsias de medula óssea, realizadas em
seguida ao aspirado, foram fixadas em solução de Bouin por no máximo 4 horas,
sendo então colocadas em solução de álcool a 50%. Após este procedimento as
biópsias foram descalcificadas em acido nítrico a 10%, por aproximadamente 40
minutos. Após a descalcificação, foram lavadas em água corrente, processadas e
emblocadas em parafina. Foram feitos cortes histológicos de 3 micrômetros de
espessura. As secções foram coradas pela hematoxilina e eosina. Para identificação
de fibras reticulares as secções também foram coradas pela reticulina segundo
método de Gomori.
Ao exame histológico foram avaliados os seguintes critérios: celularidade,
presença ou ausência de infiltração por linfócitos; padrão da infiltração, que foi
classificado como: intersticial, focal (paratrabecular ou não) e difuso; o tamanho e a
morfologia dos linfócitos presentes no infiltrado. Foram ainda analisadas a
celularidade, a neoformação vascular, fibrose, necrose, eosinofilia, atividade
osteoclástica e outras alterações patológicas. As características morfológicas do
infiltrado da medula óssea foram comparadas com o aspirado de medula óssea,
sangue periférico e com a biópsia de pele ou linfonodo.
48
3.8 Imunoistoquímica
O estudo imunoistoquímico foi realizado em cortes histológicos com 3
micrômetros de espessura, montados em lâminas previamente limpas e recobertas
com solução adesiva (cola cascorez a 5%). Foi utilizado o método padronizado da
estreptoavidina biotina peroxidase (BOENISH, 1989), empregando-se o kit LSAB
plus system-HRP da DAKOCYTOMATION. A técnica encontra-se descrita no anexo
B. O painel de anticorpos empregado está descrito na tabela 2. Considerou-se
infiltração por células T, quando as células linfóides atípicas foram positivas para
mais de um marcador T e negativas para marcadores pan-B.
Tabela 2: Painel de anticorpos utilizado no estudo imunoistoquímico.
ANTICORPO
CLONE
FONTE
DILUIÇÃO
REATIVIDADE
PRINCIPAL
Anti-CD45RB LCA Mouse 1/50 Antígeno leucocitário
comum
Anti-CD3 Policlonal Rabbit 1/200 Linfócitos T
Anti-CD45RO UCHL-1 Mouse 1/200 Linfócito T
Anti-CD45RO OPD4 Mouse 1/200 Linfócito T
Anti-CD4* 1F6 Mouse 1/25 Linfócito T auxiliar
Anti-CD8 C8/144B Mouse 1/25 Linfócito T citotóxico
Anti-CD5* 4C7 Mouse 1/50 Linfócitos T
Anti-CD7* CD7-272 Mouse 1/50 Linfócitos T
Anti-CD20 L26 Mouse 1/100 Linfócitos B
Anti-CD79 JCB117 Mouse 1/50 Linfócitos B
Anti-CD25* 4C9 Mouse 1/50 Receptor de IL-2
Anti-HLA-DR TAL-1B5 Mouse 1/50 MHC classe II
* NOVOCASTRA, os demais são da DAKOCYTOMATION
49
3.9 Análise estatística
Foi usado o Teste t de Student para avaliar a relação entre a infiltração de
medula óssea e o tempo de sobrevida. O mesmo teste foi usado para avaliar a
relação entre os tipos morfológicos de linfócitos atípicos e o tempo de sobrevida, os
níveis séricos de LDH e cálcio. Foi usado o teste exato de Fisher para avaliar a
relação entre os tipos morfológicos de linfócitos atípicos e a presença de infiltração de
medula óssea. O resultado p<0,05 foi considerado significativo.
50
4.0 RESULTADOS
Vinte e nove pacientes com diagnóstico de ATL e sorologia positiva para
HTLV-I foram incluídos neste estudo. Treze eram do sexo masculino e 16 do sexo
feminino. A média de idade foi de 49,9 anos (variação de 26 a 78 anos). Onze
apresentavam a forma clínica aguda, cinco a forma crônica, seis a forma linfomatosa,
e seis a forma indolente (smoldering); um paciente foi classificado como portador da
forma tumoral primária de pele.
Todos os casos foram classificados segundo os Critérios de Diagnóstico de
ATL (tabela 1), que definiu um conjunto de critérios clínicos e laboratoriais, que
podem fazer o diagnóstico desta doença, na ausência da determinação da
integração monoclonal do vírus (LEVINE et al.,1994). Vinte casos apresentavam
portanto critérios clássicos para o diagnóstico de ATL e nove enquadravam-se como
provável ATL. Daqueles clássicos nove eram da forma aguda, cinco da crônica , três
linfoma e três indolente. Dos classificados como prováveis dois eram da forma
aguda, três da forma linfoma, três da indolente e um tumoral primária de pele. Destes
prováveis apenas três mostravam infiltração da medula óssea e somente dois eram
leucêmicos. A distribuição da pontuação dos 29 casos encontra-se no anexo C.
A presença de integração monoclonal do vírus por IPCR foi demonstrada em
células do sangue periférico ou tecido neoplásico em quatro casos agudos
(#2,#19,#22,#28), um da forma linfomatosa (#21), dois da forma crônica (#1,#24) e
51
três da forma indolente (#13,#25,#26), em um total de dez casos. Em um caso da
forma linfomatosa (#15), a integração viral foi demonstrada por Southern blot.
Foram comparados os aspectos morfológicos das células linfóides no sangue
periférico, no aspirado e na biópsia de medula óssea. Estes aspectos foram
correlacionados com a forma clínica da doença ao diagnóstico para verificar
possíveis diferenças e relevância na patogenia.
4.1 Análise da medula óssea
Dos 29 casos de ATL estudados, 15 (51,7%) apresentavam infiltração no
aspirado e/ou biópsia de medula óssea (MO). A biópsia de MO foi positiva em 13
casos (44,8%) e o aspirado em onze casos (37,9%); houve discrepância entre a
biópsia e o aspirado em dois casos em que o aspirado foi positivo e a biópsia
negativa e em três casos que foram negativos ao aspirado e positivos à biopsia. Um
paciente da forma indolente (#13) apresentou linfocitose discretamente acima de
4000 linfócitos/mm
3
, em uma avaliação, mas foi considerado indolente por apresentar
quadro clínico-laboratorial típico desta forma clínica e por ter vários leucogramas
anteriores e posteriores àquele apresentando menos de 4.000 linfócitos/mm
3
. Na
tabela 3 estão resumidos os achados de linfocitose e infiltração medular de acordo
com a forma clínica.
52
Tabela 3: Presença de linfocitose e de infiltração da medula óssea, de acordo com a
forma clínica em 29 casos de ATL.
Forma Clínica
nº / %
Linfocitose em
sangue periférico
(>4000/mm
3
)
nº/%
Infiltração
Aspirado
MO
nº/%
Infiltração
biópsia MO
nº/%
Aguda 11(38%) 11( 100% ) 9 (81,8%) 8 (72,7%)
Crônica 5 (17%) 5 (100%) 1(20%) 2 (40%)
Linfoma 6 (21%) 2 (33,3%) 1(16,6%) 3 (50%)
Indolente 6 (21%) 1(16,6%)* 0 0
Tumoral primária
de pele
1(3%) 0 0 0
Total 29 (100%) 19 (65,5%) 11(38%) 13 (44,8%)
*Apenas um dos leucogramas ligeiramente acima de 4.000 linfócitos/mm
3
. MO: medula óssea
A sobrevida média nos casos com infiltração de medula óssea foi de 11,4±
17,1(DP) meses e sem infiltração 31,1±32,0(DP) meses, havendo relação significante
entre a presença de infiltração de medula óssea e menor tempo de sobrevida (figura
1). Considerando todos os 29 casos, a sobrevida média na forma clínica aguda foi de
4,7 meses, mediana de três meses; na forma crônica foi de 28,4 meses com mediana
de 18 meses; na forma linfomatosa, a sobrevida média foi de 29,5 meses, mediana
de 21,5 meses; e 39,6 meses na forma indolente com mediana de 30 meses.
53
1415N =
Infiltração de Medula Óssea
NãoSim
Sobrevida em meses
120
100
80
60
40
20
0
4.1.1 Estudo histológico da medula óssea
O tamanho e a morfologia das células linfóides atípicas presentes no tecido
das lesões foram semelhantes aos das células neoplásicas linfóides que infiltravam a
medula óssea. Na forma aguda oito casos apresentavam aspecto morfológico de
linfoma T periférico não especificado (TPNE) com células pequenas ou pequenas e
médias (72,7%); três casos eram do tipo TPNE de células grandes (27,3%); na forma
clínica crônica houve um linfoma TPNE de células pequenas (20%), dois linfomas
TPNE de células grandes (40%) e dois com quadro histológico de micose fungóide
Figura 1: Relação entre a presença de infiltração de medula óssea e o tempo de
sobrevida nos 29 casos estudados de portadores de ATL (p=0,029).
54
(40%). Na forma linfomatosa, três casos eram TPNE de células pequenas e médias
(50%), três TPNE de células grandes (50%). Na forma indolente não havia infiltração
medular e na biópsia do tecido neoplásico dois casos eram TPNE de células
pequenas e médias (33,3%), dois eram TPNE de células grandes (33,3%) e dois
tinham quadro histológico semelhante à micose fungóide (33,3%).
Nos 13 casos com infiltração na biópsia de medula óssea, quatro eram do tipo
intersticial, quatro do tipo focal e em cinco a infiltração era do tipo difusa. Infiltração
focal de localização unicamente paratrabecular foi observada em um caso; dois
outros apresentavam infiltração em foco paratrabecular, mas com outros focos em
áreas não paratrabeculares (figura 2-7). Nas quatro biópsias com infiltração
intersticial a imunoistoquímica foi indispensável para demonstrar a infiltração; três
destes casos apresentavam linfocitose elevada e um linfocitose moderada. Seis
casos com linfocitose não apresentavam infiltração de medula óssea e, destes, cinco
tinham lesões cutâneas, sem infiltração de outros orgãos (tabelas 4, 5, 6 e 7). A
hematopoiese medular estava preservada em todos os casos de infiltração focal e
intersticial e, apenas nos casos com infiltração difusa estava muito diminuída ou
ausente. Apenas cinco tinham celularidade normal e as demais eram hipercelulares
(>70%). Não se observou neoformação vascular ou fibrose com espessamento da
trama reticular, necrose ou eosinofilia. Havia discreta plasmocitose em dois casos.
Quanto ao tamanho das células linfóides, houve correspondência entre o tamanho
das células neoplásicas na lesão linfonodal ou de pele e as células que infiltravam a
medula óssea, com exceção de um caso de linfoma periférico não especificado de
células grandes, em que as células na medula óssea eram de tamanho médio (#19).
55
Figura 2 Figura 3
Caso nº 21. MO com infiltração
difusa HE x40
Caso nº 21. MO com infiltração
difusa HE x400
Figura 4
Figura 5
Caso nº 16. MO com infiltração
focal paratrabecular HE x400
Caso nº 16. MO com infiltração
focal não paratrabecular HE x400
Caso nº 18. MO com infiltração
difusa de grandes células HE
x400
Caso nº 18. MO com espessamento
das fibras reticulares (Gomore) x400
Figura 6
Figura 7
56
4.1.2 Relação entre a presença de infiltração da medula óssea e as formas
clínicas e achados laboratoriais na ATL.
O envolvimento de orgãos, achados laboratoriais e tipo de infiltração da
medula óssea nas diversas formas clínicas de ATL estão resumidas nas tabelas 4, 5,
6 e 7. O único caso de forma tumoral primária de pele (#14) não apresentava
infiltração de medula óssea ou linfocitose (2192/mm
3
) e os níveis de cálcio (8,7mg/dl)
e LDH (206UI/dl) eram normais. O paciente apresentava lesões cutâneas
disseminadas e teve sobrevida de 27 meses.
Tabela 4: Características clínico-laboratoriais e envolvimento de medula óssea nos 11
casos agudos de ATL.
Caso
nº
Órgãos/tecidos
envolvidos
Sobrevida
(meses)
Linfócitos
(mm
3
)
Linfócitos
atípicos
Infiltração
aspirado
Infiltração
biópsia
MO
Cálcio
(mg/dl)
LDH
(UI/dl)
2†
Medula
01
85.045
+
+
Interst
10,0
1200
3†
HE,LN,SNC,ossos,
massa mama
02 36.820 + + Difusa 12,5 850
4†
HE,LN,massa
intestinal
12 12.098 +
-
ausente 12,7 1314
6†
Pele (disseminada),
HE
06 45.000 +
+
ausente 12,5 785
7†
LN 03 65.800 + + Interst 9,0 1833
9†
HE,LN, SNC 01 75.700 + + Difusa 8,0 471
12†
Pele (disseminada)
HE,LN
06 39.237 + + ausente 9,7 478
16†
HE, LN 11 14.400 +
- Focal
15,1 486
19†
Pele (disseminada)
HE,LN
02 24.500
+ +
Difusa 15,2 1641
22†
Medula 02 148.260 + + Interst 14,2 4185
28†
LN 05 27.600 + + Focal 12,6 1720
Linfócitos: n
o
absoluto de linfócitos em sangue periférico ao diagnóstico; (+): presente; (-): ausente;
MO: medula óssea HE: hepatoesplenomegalia; LN: linfadenomegalia; Interst: infiltação intersticial; SNC:
sistema nervoso central; (†): óbito; valor de referência: cálcio: 8,5 a 10,5 mg/dl; LDH: 100 a 220 UI/dl.
57
Tabela 5: Características clínico-laboratoriais e envolvimento de medula óssea nos 5
casos crônicos de ATL.
Caso
nº
Órgãos/tecidos
envolvidos
Sobrevida
(meses)
Linfócitos
(mm
3
)
Linfócitos
atípicos
Infiltração
aspirado
Infiltração
biópsia
MO
Cálcio
(mg/dl)
LDH
(UI/dl)
1†
Pele (disseminada)
48
20.223
+
-
ausente
10
323
5 Pele (localizada) 56* 7.160 +
-
Interst 9,0 162
17†
Pele (localizada) 18 17.220 + + Focal 9,7 385
24†
Pele (localizada) 09 10.100 +
-
ausente 9,0 389
29†
Pele (localizada) 11 8.742 +
-
ausente 7,7 195
Linfócitos: n
o
absoluto de linfócitos em sangue periférico ao diagnóstico; (+): presente; (-): ausente; MO:
medula óssea; localizada: restrito a um segmento corporal; Interst: infiltação intersticial; (†): óbito; valor
de referência: cálcio: 8,5 a 10,5 mg/dl; LDH: 100 a 220 UI/dl, * vivo, tempo de seguimento.
Tabela 6: Características clínico-laboratoriais e envolvimento de medula óssea nos 6
casos do tipo linfoma da ATL.
Caso
nº
Órgãos/tecidos
envolvidos
Sobrevida
(meses)
Linfócitos
(mm
3
)
Linfócitos
atípicos
Infiltração
aspirado
Infiltração
biópsia
MO
Cálcio
(mg/dl)
LDH
(UI/dl)
10†
Pele (localizada),
LN, massa pulmão
07
5.500
+
-
Focal
9,5
130
11†
Pele (localizada)
LN
02 1.728
+ -
ausente 8,4 324
15†
LN 108 1.520
- -
ausente 9,0 220
18†
LN 03 1.760
- -
Difusa 7,2 407
21† LN 48 1200 + + Difusa 9,3 981
23†
LN 09 3.150
- -
ausente 8,0 470
Linfócitos: n
o
absoluto de linfócitos em sangue periférico ao diagnóstico; (+): presente; (-): ausente; MO:
medula óssea; LN: linfadenomegalia; localizada: restrito a um segmento corporal; (†): óbito; valor de
referência: cálcio: 8,5 a 10,5 mg/dl; LDH: 100 a 220 UI/dl.
Tabela 7: Características clínico-laboratoriais e envolvimento de medula óssea nos 6
casos tipo indolente de ATL.
Caso
nº
Órgãos/tecidos
envolvidos
Sobrevida
(meses)
Linfócitos
(mm
3
)
Linfócitos
atípicos
Infiltração
aspirado
Infiltração
biópsia
MO
Cálcio
(mg/dl)
LDH
(UI/dl)
8 Pele (localizada) 36* 1.440
- -
ausente 9,6 202
13 Pele (localizada) 24*
4.200**
+
-
ausente 10,6 197
20†
Pele (localizada) 48 2.490 +
-
ausente 10,3 512
25†
Pele (localizada) 24 1.400
- -
ausente 8,9 295
26 Pele (localizada) 93* 1.680
+ -
ausente 8,4 230
27 Pele (localizada) 13* 1.340
- -
ausente 10,3 190
Linfócitos: n
o
absoluto de linfócitos em sangue periférico ao diagnóstico; (+): presente; (-): ausente; MO:
medula óssea; Localizada: restrito a um segmento corporal; (†): óbito; valor de referência: cálcio: 8,5 a
10,5 mg/dl; LDH: 100 a 220 UI/dl. *Vivo, tempo de seguimento. **Considerado indolente por apresentar
geralmente linfocitose abaixo de 4.000l e quadro clínico-laboratorial típico da forma indolente.
58
4.1.3 Características da medula óssea nos casos sem infiltração neoplásica
Dos 14 casos de ATL sem infiltração neoplásica da medula óssea quatro
apresentavam medula hipercelular (acima de 60%), quatro eram hipocelulares
(abaixo de 40%) e seis eram normocelulares. Um dos casos apresentava uma lesão
granulomatosa e fibrose, sem evidência de bacilos álcool-ácido resistentes (Ziehl-
Neelsen) ou fungos (Grocott).
4.2 Estudo imunoistoquímico
As biópsias de medula óssea com infiltração neoplásica e as das lesões
teciduais (pele ou linfonodo) foram submetidas a estudo imunoistoquímico. O perfil
imunoistoquimico das células linfóides neoplásicas nas medulas ósseas infiltradas
(tabela 8), foi similar ao perfil encontrado na imunofenotipagem dos tumores ou da
infiltração tecidual. Em três casos observou-se imunofenótipo pouco freqüente em
ATL, dois casos CD4- CD8+ e um caso CD4+ CD8+ (figura 11). Nestes casos foi
realizada pesquisa de granulações citotóxicas: antígeno intracelular de célula T (TIA-
1), granzime-B e perfurina que resultaram negativas. Os marcadores pan-T, CD3,
CD45RO (OPD4+) e CD45RO (UCHL-1), foram utilizados na pesquisa dos linfócitos
T (figura 12).
A análise do perfil imunoistoquimico das lesões de pele e linfonodo demonstrou
variação na expressão de CD25 (IL-2Rα) e HLA-DR entre as formas clínicas. Os
casos com maior percentagem de células positivas para CD25 (figura 9)
59
correspondiam as formas clínicas aguda e linfoma enquanto que o HLA-DR foi
positivo principalmente entre os casos da forma clínica indolente (66%).
A imunofenotipagem das células neoplásicas em sangue periférico foi realizada em
oito pacientes evidenciando população celular expressando antígenos de linhagem T
madura: CD2, CD3, CD4 e CD25.
Tabela 08: Imunofenótipo dos 13 casos com infiltração na biópsia de medula óssea.
Caso
nº
LCA
CD3
UCHL-1
OPD4
CD8
CD4
CD5
CD20
CD79
CD25
CD7
HLA-DR
02
+ + + +
-
+ +
-/+ - - - -
03
+ + + +
-
+ +
- -
+
- -
05
-/+
+ + + + + +
-/+ -/+
+
- -
07
+ + + + +
-
+
- -
+
- -
09
+ +
- - -/+
+ +
- -
+
- -
10
+ + + +
-
+ NR
- -
+
-
+
16
+ + + +
-/+
+ +
-/+ -
+
- -
17
-
+
- - -/+
+ +
- -
+
-
+
18
+ + + +
-/+
+ +
- -
+
- -
19
+ + + + +
-
NR
- -
+
- -
21
+ + + +
-/+
+ +
- -
+
- -
22
+ + + +
-
+ NR
- - - - -
28
+ + + +
-
+ +
- -
+
- -
positivo (+); negativo (-
--
-); (-
--
-/+) presença de raras células positivas; NR: não realizado. Obs: dois caso
com infiltração medular mostraram linfócitos T atípicos apenas no aspirado.
60
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Comparação entre a especificidade dos três marcadores usados para identificar
infiltração da medula óssea por linfócitos T.
CD3 CD45RO (OPD4)
CD45RO (UCHL-1)
Caso nº 5. MO com infiltração
intersticial CD3+
Caso nº 18. MO com infiltração
difusa CD25+
Caso nº 21. MO com infiltração
difusa CD4+
Caso nº7. MO com infiltração
intersticial CD8+
61
4.3 Análise do sangue periférico
4.3.1 Critérios usados na caracterização do tipo morfológico das células
linfóides.
Foram estudadas as características morfológicas das células linfóides
neoplásicas no sangue periférico em 22 casos. Os linfócitos foram caracterizados
morfologicamente segundo os seguintes critérios: foi considerada como morfologia
clássica a presença de linfócitos de tamanho médio ou grande com núcleo convoluto,
cromatina grosseira, nucléolos pouco evidentes e basofilia variável; foram incluídos
nesta forma as células em flor (flower cells), características de ATL. Como morfologia
semelhante aos linfócitos da leucemia linfocítica crônica (LLC) foram caracterizados
os linfócitos de tamanho pequeno que apresentavam núcleos arredondados,
cromatina condensada e basofilia variável. As células rotuladas como morfologia
linfoblastóide eram linfócitos de tamanho médio ou grande, com núcleo arredondado,
cromatina dispersa, nucléolos geralmente evidente e basofilia variável (figura 13-18).
Os critérios usados para caracterização da morfologia celular estão descritos na
tabela 9.
Os casos foram classificados de acordo com a predominância do tipo celular
clássico ou LLC e também foi determinado a presença/ausência e percentual das
células com aspecto linfoblastóide nestes casos.
62
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura
18
Caso nº 2. linfócitos com morfologia
clássica. Wright x640
Caso nº 2. linfócitos com morfologia
clássica. Wright x1000
Caso nº 22. linfócitos com
morfologia linfoblastóide. Wright
x640
Caso nº 22. linfócitos com morfologia
linfoblastóide. Wright x640
Caso nº 2. linfócitos com
morfologia LLC. Wrig
ht x400
Caso nº 2. linfócito com morfologia
LLC. Wright x640
63
Tabela 9: Critérios usados para caracterização da morfologia celular em sangue
periférico em casos com linfocitose e/ou atipia.
Tipo celular
Tamanho
da célula
Cromatina
Núcleo
Nucléolo
Citoplasma
basofilico
Forma clássica
Méd/grand
granulosa,
grosseira
convolutos
geralmente
não evidente
1-3+
Linfócitos
semelhantes
ao da LLC
pequeno
condensada
Hipercromática
arredondados
geralmente
ausente
1-2+
Linfoblastóide
Méd/grand
dispersa
arredondados
usualmente
evidente
1-2+
LLC: leucemia linfocitica crônica; méd/grand: médio ou grande; Adaptado de Tsukasaki et al,1999.
4.3.2. Morfologia das células linfóides e as formas clínicas de ATL.
Linfócitos predominantemente com morfologia clássica foram observados em
oito casos da forma clínica aguda (73%); em um caso desta forma clínica observou-
se infiltrado de linfócitos com morfologia clássica embora em percentual inferior a
50%. Células com morfologia clássica sem ser predominante foram também
observadas, em dois casos da forma crônica. Células com morfologia linfoblastóide
foram encontradas apenas na forma aguda, em cinco casos, mas não eram as
células predominantes e o percentual era variado (05 – 10%). Houve predominância
das células com morfologia semelhante a LLC em 14 casos: três da forma aguda,
cinco da forma crônica, três da forma linfoma e três da indolente. No entanto um
percentual variável destas células com morfologia de LLC foi observado em todos os
casos (tabelas 10, 11 e 12).
64
Dois casos (#1, #21) que tinham uma predominância de células do tipo LLC
passaram a apresentar predominância da morfologia clássica e linfocitose acima de
20.000 durante a leucemização (crisis), poucos meses antes do óbito.
Tabela10: Relação entre presença de morfologia linfoblastóide, sobrevida e níveis
de LDH, cálcio e forma clínica em pacientes com ATL.
Caso com
morfologia
linfoblastóide nº
Forma
clínica
Sobrevida
(meses)
Linfocitose
> 20.000
LDH
(UI/dl)
Cálcio
(mg/dl)
2 Ag 01 + 1200 10,0
7 Ag 03 + 1833 9,0
19 Ag 02 + 1641 15,2
22 Ag 02 + 4185 14,2
28 Ag 05 + 1720 12,6
Tabela 11: Relação entre predominância de morfologia clássica, sobrevida e
níveis de LDH, cálcio e forma clínica em pacientes com ATL.
Caso com
morfologia
clássica nº
Forma
clínica
Sobrevida
(meses)
Linfocitose
> 20.000
LDH
(UI/dl)
Cálcio
(mg/dl)
2 Ag 01 + 1200 10,0
3 Ag 03 + 850 12,5
7 Ag 03 + 1833 9,0
9 Ag 01 + 471 8,0
12 Ag 06 + 478 9,7
19 Ag 02 + 1641 15,2
22 Ag 02 + 4185 14,2
28 Ag 05 + 1720 12,6
65
Tabela 12: Relação entre predominância da morfologia semelhante a LLC,
sobrevida, níveis de LDH, cálcio e forma clínica em pacientes com ATL.
Caso com
morfologia
LLC nº
Forma
clínica
Sobrevida
(meses)
Linfocitose
variável
LDH
(UI/dl)
Cálcio
(mg/dl)
1 Cr 48 5.383 323 10,0
4 Ag 12 12.000 1314 12,7
5 Cr 56* 7.000 162 9,0
6 Ag 06 45.000 785 12,5
10 Ln 07 5.500 130 9,5
11 Ln 02 1.728 324 8,4
13 Ind 24* 4.200 197 9,6
16 Ag 11 14.400 486 15,1
17 Cr 18 17.220 385 9,7
20 Ind 48 2.490 512 10,3
21 Ln 48 1.200 981 9,3
24 Cr 09 10.100 389 9,0
26 Ind 93* 1.780 230 8,4
29 Cr 11 8.742 195 7,7
*paciente vivo, em acompanhamento.
4.3.3. Morfologia das células linfóides e os fatores prognóstico de ATL.
Foi analisada a relação entre a morfologia dos linfócitos e os fatores prognósticos de
ATL descritos pelo grupo de estudo de linfoma (1984-1987).
A média de sobrevida foi de 2,8 ± 1,8(DP) meses para os pacientes com
predominância da forma clássica e de 28,1 ± 26,5(DP) meses para os pacientes com
células semelhante a LLC (figura 19), havendo relação positiva significante entre a
morfologia clássica/linfoblastóide com sobrevida curta (p=0,003). Estes resultados
estão resumidos nas Tabelas 10,11,12.
66
148N =
Morfologia Cel. em Sangue Periférico
Leu. Linfoc. CrônicaClássico
Sobrevida em Meses
100
80
60
40
20
0
Houve correlação entre a morfologia clássica predominante e a presença de
morfologia linfoblastóide com níveis elevados de LDH (p=0,04), (figura 20). Também
nos casos com predominância da morfologia LLC, mas com percentual elevado,
quase igual, de células com morfologia clássica observou-se que havia uma
tendência a níveis mais elevados de LDH. Os pacientes com hipercalcemia
apresentaram predominância das formas clássica e linfoblastóide, entretanto não
houve relação significante (p= 0,22). Todos os pacientes com predominância de
morfologia clássica eram portadores de lesões cutâneas disseminadas e
envolvimento de outros orgãos (8/8). Dos 14 pacientes com predominância de
linfócitos apresentando morfologia semelhante a LLC, sete mostravam quadro clínico
Figura 19: Relação entre o tipo celular e o tempo de sobrevida nos
22 pacientes
portadores de ATL estudados.
67
com lesões cutâneas localizadas, sendo três da forma indolente e quatro da forma
crônica.
148N =
Morfologia Cel. em Sangue Periférico
Leu. Linfoc. CrônicaClássico
Desidrogenase Lática (UI/dL)
5000
4000
3000
2000
1000
0
4.3.4. Morfologia das células linfóides em sangue periférico e presença da
infiltração de medula óssea.
Foi analisada a relação entre o tipo morfológico celular predominante e a
presença infiltração de medula óssea (figura 21) sendo demonstrada associação
significante entre o tipo morfológico clássico e a presença de infiltração da medula
óssea (p=0,009).
Figura 20: Relação entre a morfologia celular e os níveis séricos de desidrogenase
lática (LDH) em pacientes com ATL.
68
Infiltração de Medula Óssea
NãoSim
Número de Casos
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Morfologia Celular
Clássico
Leu. Linfoc. Crônica
Cinco pacientes sorologicamente positivos para HTLV-I e assintomáticos, sem
qualquer evidência clínica de leucemia/linfoma foram estudados observando-se que
dois apresentavam na medula óssea infiltração discreta intersticial e focal por
linfócitos atípicos, cerebriformes, CD4+. Um terceiro apresentava discreta linfocitose,
sem atipia (4.578/mm
3
) e os outros dois não apresentavam qualquer alteração em
sangue periférico ou medula óssea. O LDH e cálcio eram normais nos cinco casos.
Figura 21: Relação positiva entre os casos com predominância do tipo morfológico
clássico em sangue periférico e a presença de infiltração de medula óssea (p=0,009).
69
5.0 DISCUSSÃO
A leucemia/linfoma de células T do adulto é uma doença linfo-proliferativa,
causada pelo HTLV-I e que tem características singulares, compreendendo diversas
formas clínicas, com e sem leucemia, com evolução variável, sendo o prognóstico
sombrio nas formas aguda e linfomatosa com desfeche rapidamente fatal e
observando-se nas formas indolente e crônica, evolução mais lenta que pode
prolongar-se por muitos anos (SHIMOYAMA et al., 1991).
O diagnóstico de ATL depende da conjunção de achados laboratoriais e
clínicos. Baseia-se na presença de leucemia com células linfóides T atípicas em
sangue periférico, ou de massa tumoral e/ou ou infiltração de órgãos,
frequentemente da pele, constituídas por linfócitos T atípicos; estes achados devem
estar acompanhados por sorologia positiva para HTLV-I. Além disso, particularmente,
em áreas de elevada endemicidade, para excluir tratar-se de associação fortuita da
infecção viral, e, como a morfologia e o imunofenótipo das células T, na ATL, são
sugestivos mas não específicos, propõe-se que se determine a presença de
integração monoclonal de DNA do vírus nas células linfóides neoplásicas para
confirmação diagnóstica.
Os métodos mais utilizados para essa demonstração são o IPCR e o Southern
blot, técnicas de biologia molecular, não disponíveis na maioria dos laboratórios e
que funcionam bem quando existe linfocitose, permitindo a coleta de maior número
de células com vírus no sangue periferico. Nas formas clínicas sem linfocitose, a
comprovação de monoclonalidade pode não ser alcançada devido a dificuldade em
70
conseguir DNA suficiente para analisar a integração monoclonal do vírus (KATAGIRI
et al., 2001). Essas técnicas exigem, ainda, para um funcionamento adequado, a
coleta de maior quantidade de sangue ─ o que não é sempre possível ─ e/ou tecido
fresco, não fixado. Por outro lado, há raros relatos sugerindo que múltiplos clones
neoplásicos podem ocorrer no mesmo paciente, que neste caso não irá apresentar
integração monoclonal do vírus, observando-se integração oligoclonal (SHIBATA et
al., 1995; SHIMAMOTO et al., 1996; KATAGIRI et al, 2001; MENIN et al., 2003).
Ainda, alguns portadores assintomáticos ou com HAM/TSP podem apresentar
integração oligoclonal. Ainda há casos com integração monoclonal no sangue e
policlonal nos outros tecidos e vice-versa (SHIMAMOTO et al., 1996).
Por estas dificuldades técnicas, foram sugeridos outros parâmetros,
reconhecidos pelo Grupo Internacional para Critérios de Diagnóstico de ATL, que
definiu um conjunto de critérios clínicos e laboratoriais, que podem fazer o
diagnóstico desta doença, na ausência da investigação da integração monoclonal do
vírus (LEVINE et al.,1994). Em nosso estudo, todos os casos de ATL cumpriam
esses critérios e, em onze, foi possível também demonstrar integração monoclonal
do vírus.
As principais características citológicas e histológicas de ATL, embora não
específicas, são sugestivas desta doença, e estão representadas pela presença de
linfócitos T pleomórficos e com núcleo intensamente lobulado, frequentemente com
formas em flor (flower cells). Manifesta-se geralmente por leucemia, linfadenopatia e
lesões cutâneas; envolvimento do fígado, baço, sistema nervoso central e trato
71
gastro-intestinal são também comuns e a hipercalcemia é freqüente. A evolução
clínica é de uma doença linfo-proliferativa agressiva com sobrevida inferior a seis
meses na maioria dos pacientes. Quatro formas clinicas são classicamente
reconhecidas a aguda, crônica, linfomatosa e indolente (SHIMAYOMA et al., 1991);
mais recentemente foi descrita a forma tumoral primária de pele (JOHNO et al.,
1992). A média de sobrevida difere nas diversas formas e, em nosso estudo, a média
de sobrevida na forma aguda foi de 4,7 meses ligeiramente inferior a da literatura, na
forma crônica foi ligeiramente superior e na forma linfoma foi bastante mais
prolongada, 29,5 meses versus 9,3 meses relatada na literatura (POMBO DE
OLIVEIRA, et al., 1999). Esta sobrevida média mais prolongada, na forma
linfomatosa, do que a comumente descrita, resultou em parte da excepcional
sobrevida de um paciente (#15), que teve diagnóstico precoce e sobrevida de 108
meses. Excluindo-se este paciente, a sobrevida média na forma linfoma diminui para
11.5 meses e fica semelhante a descrita em outros trabalhos. A forma indolente não
tem sobrevida média determinada e quatro pacientes deste estudo estavam vivos na
ultima revisão de prontuário, com sobrevida variando entre 13 e 93 meses.
No presente estudo, o envolvimento mais freqüente foi de linfonodos (72,7%),
seguido por infiltração de pele (55,2%) e infiltração hepato-esplênica (54,5%). A
infiltração de pele ocorreu em todos os casos das formas crônica e indolente. A
infiltração da medula óssea (MO) é variável, nos trabalhos publicados, tendo sido
observada em cerca de 25% dos casos, em estudo anterior realizado em Salvador
(SCHAER-BARBOSA, 1997) enquanto que outro relato refere infiltração em mais de
72
50% dos casos (JAFFE et al., 1984). No presente estudo 51,7% das MO estavam
infiltradas.
5.1 Características histológicas e citológicas
Apesar de todos linfomas/leucemias associados ao HTLV-I terem sido
classificados sob a designação de leucemia/linfoma de células T associado ao HTLV-
I na classificação da OMS, as características morfológicas da ATL são bastante
variáveis, dificultando o diagnóstico exclusivamente morfológico ou histológico desta
patologia. O quadro clássico mais comum no tecido tumoral é de um linfoma
constituído por células T com imunofenótipo de células maduras, periféricas, que
expressam pelo menos um marcador pan-T, geralmente CD3 e/ou CD45RO e que
são CD4+. Estas células têm aspecto pleomórfico com variação do tamanho,
inclusive dentro da mesma neoplasia, podendo ser pequenas, médias e grandes,
mostrando núcleos irregulares, clivados, com muitas indentações ou lobulados. O
aspecto de célula em flor é melhor observado na citologia, em imprints ou no sangue
periférico. Contudo, alguns casos apresentam-se com características histológicas
diferentes e há relatos de casos com morfologia indistinguível da micose fungóide e
outros semelhantes ao linfoma anaplásico CD30+ (SCHAER-BARBOSA et al., 1999).
Também no sangue periférico, o aspecto clássico de linfócitos atípicos com núcleos
indentados ou em flor não é sempre encontrado observando-se, às vezes, linfocitose
com células pequenas de núcleos predominantemente ovóides, semelhantes à
leucemia/linfoma linfocítica crônica.
73
Neste estudo, predominaram, ao estudo histológico, os linfomas de células T
pequenas e médias, observando-se que o tamanho celular não guarda relação com a
forma clínica, encontrando-se linfomas de células grandes em qualquer dos subtipos
desde o indolente ao agudo e de células pequenas e médias também em qualquer
apresentação clínica. Foram observados dois casos da forma indolente em que a
morfologia era compatível com micose fungóide sendo a neoplasia constituída por
células pequenas, monótonas, com núcleos cerebriformes.
5.2 Infiltração da medula óssea
Nos linfomas/leucemias o estudo da medula óssea é considerado
indispensável para avaliar a extensão da doença (estadiamento) sendo algumas
vezes, o exame que faz o primeiro diagnóstico de linfoma/leucemia ou pode ser
utilizado para monitorar a resposta terapêutica. O estudo da MO pode ser feito pelo
aspirado ou biópsia, geralmente utilizando-se ambos; recentemente tem sido
empregada também a imunofenotipagem por citometria de fluxo do material aspirado
(SAH et al., 2003). Na ATL a importância da presença de infiltração da medula óssea
no estadiamento e a correlação entre tipo e grau de infiltração, com as diversas
formas clínicas e outras alterações laboratoriais foram pouco estudadas,
encontrando-se esparsas referências na literatura. Ressalte-se, que em recente
estudo de revisão sobre histopatologia da medula óssea em linfomas T periféricos
(DOGAN & MORICE, 2004) os dados sobre ATL remontam ao trabalho de Jaffé et al.
(1984).
74
No presente estudo, observou-se infiltração medular em cerca de 50% dos
casos e constatou-se que a biópsia, quando combinada com a imunoistoquímica foi
ligeiramente mais eficaz que o aspirado na determinação da presença/ausência de
infiltração medular. A associação dos dois métodos permitiu o melhor resultado,
diagnosticando maior número de casos com infiltração. Na literatura, a biópsia de
MO tem sido relatada como superior ao aspirado na detecção de infiltração
neoplásica em linfomas não Hodgkin (WOO-IN et al., 1994; SAH et al., 2003). Em
nosso estudo, nos casos leucêmicos, principalmente na forma aguda, a infiltração
medular foi mais freqüente, como era esperado, ocorrendo em 72% dos casos, mas
na forma crônica, também leucêmica apenas 40% tinham infiltração medular. A
metade dos casos da forma linfomatosa apresentava infiltração. Na literatura, cerca
de 60 a 70% dos casos leucêmicos mostram infiltração (KIKUCHI et al., 2001).
Chamou a atenção o fato da maioria dos casos mostrar infiltração focal ou intersticial
discretas, observando-se um padrão de infiltração mais extenso e difuso em apenas
três casos da forma aguda (3/11) e em dois da forma linfomatosa (2/6). Em 37% dos
casos leucêmicos a medula não mostrou infiltração e, em 25% destes casos, a
infiltração era intersticial e bastante discreta, diagnosticável apenas com a ajuda da
imunoistoquímica. Estes achados mostram pouca correlação entre o grau de
infiltração da MO e a linfocitose, sugerindo que a proliferação das células leucêmicas
pode estar ocorrendo em outros órgãos, sendo a pele, pela frequência de seu
comprometimento, uma fonte provável de crescimento neoplásico. Reforça esta
possibilidade a observação, neste estudo, de cinco casos leucêmicos com MO livre
75
de infiltração, que apresentavam apenas lesões cutâneas e, ainda, a alta freqüência
de lesões cutâneas no grupo estudado.
Por outro lado, em cinco pacientes HTLV-I positivos, em que não se encontrou
doença clínica, observou-se discreta infiltração intersticial ou focal por linfócitos
atípicos cerebriformes, CD4+ na MO. Estes pacientes estão sendo acompanhados e
até esta data não demostraram evidência clínica de doença.
Qual seria, portanto, a relevância do estudo da MO na ATL? Atualmente os
métodos de estadiamento de linfomas tornaram-se menos invasivos, baseando-se
principalmente em métodos de imagem. Persiste, contudo, a indicação de biópsia de
MO por considerar-se que o status de infiltração medular é determinante de
prognóstico e orientador de conduta terapêutica. Nos casos de leucemia a medula
óssea é muitas vezes o único ou mais precoce sítio com infiltração neoplásica e a
biópsia pode contribuir ou ser decisiva para a classificação da leucemia/linfoma pela
classificação da OMS (BURH et al., 2002). Considerando-se os achados deste
estudo, em que vários casos leucêmicos não apresentavam infiltração medular, o
valor da biópsia da MO para estadiamento e mesmo diagnóstico de ATL seria
relativo, inferior àquele observado em outros linfomas/leucemias. (BURH et al., 2002;
CANIONI et al., 2004). Houve, contudo, uma relação significativa (p= 0,029) entre a
sobrevida dos pacientes e a presença de infiltração medular, o que era de se
esperar, considerando que a forma clínica mais agressiva da ATL é a forma aguda,
que cursa com leucemia e com linfocitose elevada e, na qual, é mais freqüente a
infiltração medular.
76
Com referência aos padrões de infiltração estavam distribuídos equitativamente em
intersticial, focal e difuso. O padrão focal paratrabecular ocorreu em três casos, e em
apenas um deles foi exclusivamente para-trabecular. Não houve infiltração do tipo
intra-sinusoidal (COSTES et al., 2002). Não houve correlação entre o padrão de
infiltração e o sub-tipo clínico, observando-se, contudo, que o padrão difuso é mais
freqüente nas formas clínicas graves, aguda e linfomatosa.
Outras alterações histológicas que, às vezes, acompanham a infiltração
medular de linfomas T periféricos, como neoformação vascular, fibrose, necrose e
eosinofilia não foram observadas; aumento de atividade osteoclástica foi visto em
apenas um caso (#28). Não foram observadas, portanto as características
histológicas sugestivas de infiltração medular por um linfoma T (KIKUCHI et al.,
2001).
Com relação aos casos de ATL que apresentavam medula óssea sem
infiltração neoplásica, a maioria era normo ou hipercelular; observou-se um único
caso com fibrose extensa e um granuloma epitelióide (#4) sem evidência de
microorganismos. Havia discreta plasmocitose em dois casos e não foram vistas
outras alterações comumente relatadas em linfomas T. Estes pacientes foram
investigados devido à suspeita de ATL por apresentarem linfocitose discreta e
soropositividade e estão sendo acompanhados para avaliar o significado deste
achado.
77
5.3 Estudo do sangue periférico
Na ATL podem aparecer células linfóides atípicas no sangue periférico mesmo
quando não existe ainda linfocitose como, por exemplo, na forma indolente
(SHIMOYAMA et al., 1991) Sabe-se que uma das características da ATL é a
passagem brusca de uma forma mais lenta, indolente ou crônica, para a forma
aguda, evento rotulado como crisis. Seria importante, portanto, identificar se ocorrem
modificações morfológicas nas células linfóides do sangue periférico, que possam
ser indicativas da progressão da doença para um episódio de agudização. Seria
possível pelo acompanhamento do sangue periférico detectar alterações
morfológicas que indicassem esta transformação?
Em estudo sobre aspectos morfológicos das células leucêmicas, realizado por
Tsukasaki et al. (1999) em pacientes com as formas crônicas e agudas de ATL,
observou-se que a morfologia semelhante a LLC predominou na forma crônica e foi
associada à sobrevida elevada e níveis baixos de LDH e cálcio, sendo considerado
um bom fator prognóstico para esta forma clínica.
No presente estudo, foram correlacionados os aspectos morfológicos dos
linfócitos do sangue periférico das diversas formas clínicas de ATL com fatores
prognóstico de ATL como a sobrevida e os níveis de LDH e de cálcio sérico.
Constatou-se que a presença de células com morfologia linfoblastóide ou clássica
(com núcleos pleomórficos) estava associada a menor sobrevida. Já os pacientes
que apresentavam linfocitose com a presença de linfócitos menos atípicos, mais
uniformes, semelhantes aos da leucemia linfocítica crônica (LLC) apresentavam
78
maior sobrevida (p=0,003). Houve uma relação significante entre a morfologia dos
linfócitos atípicos e os níveis de LDH (p=0,04), observando-se a elevação dos níveis
de LDH nos casos com predominância da forma clássica/linfoblastóide e níveis
baixos de LDH nos casos com predominância da forma semelhante a LLC. Não foi
encontrada diferença significante comparando-se os níveis de cálcio sérico com a
morfologia dos linfócitos atípicos.
Nos poucos casos em que predominou a morfologia de leucemia linfocítica crônica e
o LDH estava elevado, havia associadamente um percentual quase igual de linfócitos
com morfologia clássica no sangue periférico. Ainda, observou-se que dois pacientes
que tinham um a forma clínica linfomatosa, sem leucemia e o outro a forma crônica,
com linfocitose não muito elevada, ambos com células do tipo LLC e que entraram,
subitamente, em agudização ou crisis, indo a óbito, a morfologia das células no
sangue periférico mudou, passando ao tipo linfoblastóide ou pleomórfico da
morfologia clássica. Outro paciente portador da forma indolente e com linfocitose
baixa, de cerca de 4.000 linfócitos, com morfologia de LLC, apresentou recentemente
crisis e apareceram linfócitos muito atípicos, do tipo clássico, em sangue periférico.
Foi também observado que, nos pacientes com leucemia acompanhada somente por
lesões cutâneas, os linfócitos eram do tipo LLC. A presença da infiltração de MO foi
significantemente associada a predominância de células com morfologia clássica
(p=0,009). Houve, portanto, relação entre a presença de células com atipia mais
pronunciada tanto do tipo clássico como linfoblastóide com a sobrevida e com o
surgimento de agudização ou crisis e com a elevação dos níveis de LDH. Estes
resultados indicam que a monitorização da morfologia das células atípicas em
79
sangue periférico pode ser importante para determinação precoce do advento de
crisis ou agudização nas formas indolente, linfomatosa ou crônica.
Estudos realizados em portadores assintomáticos examinaram a possibilidade
do surgimento de linfócitos com atipia característica de ATL em sangue periférico ser
fator de risco para desenvolvimento de ATL e relataram correlação entre a presença
de linfócitos atípicos e o aumento da carga de DNA proviral e de títulos elevados de
anticorpos anti-HTLV-I (HISADA et al., 1998; KAMIHIRA et al., 2003; IMAIZUMI et al.,
2005). Estes resultados sinalizam também a relevância da morfologia dos linfócitos
no sangue periférico na evolução da doença linfoproliferativa.
5.4 Estudo imunoistoquímico
Os linfomas/leucemias associados ao HTLV-I têm um perfil imunoistoquímico, que
embora não seja específico, apresenta características comuns e que ajudam a
confirmar o diagnóstico. São geralmente positivos para CD3, CD4, CD5 e CD25 e, às
vezes, para outros marcadores pan-T como CD45R0 e são geralmente negativos
para CD7 e CD8. Em nosso estudo, dois casos apresentaram perfil incomum, CD4-
CD8+ e um terceiro caso foi CD4+ CD8+. Os dois casos CD4- CD8+ apresentavam
forma clínica aguda e tiveram sobrevida curta (até três meses). Já o caso
CD4+CD8+ tem a forma crônica da doença e está vivo após cinco anos de doença. A
ausência de proteínas citotóxicas como a granzime B, perforina e TIA-1, indicam que
estes linfócitos CD8+ não têm função citotóxica, sendo apenas um fenótipo
aberrante. De acordo com algumas observações da literatura (KAMIHIRA et al.,
1992; OHSHIMA et al., 1999), os casos CD8+ têm geralmente um prognóstico pior,
80
mas o pequeno número de casos com este perfil em nossa série não permite
conclusões embora reforce esta possibilidade.
A imunoistoquímica representou uma importante ferramenta auxiliar para
determinar a presença de infiltração quando esta era do tipo intersticial, permitindo
um diagnóstico conclusivo, que dificilmente poderia ser estabelecido apenas com a
histologia. Assim, mesmo em casos de leucemia/linfoma, já com perfil
imunoistoquímico estabelecido em biópsia de tecido ou em citometria de fluxo de
células do sangue periférico, é recomendável o estudo imunoistoquímico da biópsia
da medula óssea em ATL.
Utilizamos como marcadores pan-T os anticorpos CD3 e CD45RO com dois
diferentes clones, UCHL-1 e OPD4. A pesquisa de infiltração da medula óssea por
linfócitos T foi melhor demonstrada pelos marcadores pan-T, CD3 e OPD4+, pois o
CD45RO (UCHL-1) foi positivo também em células da linhagem mielóide.
Principalmente na infiltração com padrão intersticial a utilização do CD3 e OPD4, que
tiveram expressão semelhante demonstra com mais precisão a infiltração medular
(figura 12).
Os nossos casos apresentaram um mesmo perfil fenotípico na medula óssea,
sangue periférico e em outros órgãos envolvidos, como pele e linfonodo. A
diversidade do fenótipo das células ATL em diferentes orgãos foi descrita em alguns
estudos (SHIBATA et al., 1995; NICOT, 2005) indicando que as células ATL podem
ter origem a partir de clones distintos ou que estas poderiam estar ativadas na
81
infiltração de determinado orgão, como linfonodo e em outros não terem sofrido
ativação.
Neste estudo foi realizada a pesquisa do perfil fenotípico das células
leucêmicas na medula óssea e em tecido tumoral. Foi pesquisado também a
presença dos marcadores de ativação celular, CD25 (IL-2Rα) e o antígeno
leucocitário humano (HLA)-DR avaliando diferenças na expressão destes
marcadores entre as formas clínicas de ATL.
O vírus HTLV-I apresenta tropismo pela população de células T periféricas
predominantemente os linfócitos T CD4
+
. O HTLV-I, através da proteína tax, induz o
aumento da expressão de varias citocinas e receptores envolvidos no crescimento e
proliferação das células T. Assim, o HTLV-I altera o ciclo celular, aumenta a
expressão do receptor de IL-2 promovendo mutação, estimulação autócrina das
células infectadas e modulação das moléculas apoptóticas (BANGHAM et al., 1999),
determinando proliferação das células infectadas. Estas células passam a apresentar
um fenótipo de linfócitos T ativados, com expressão aumentada de marcadores de
ativação celular, como o IL-2Rα e o HLA-DR, que fornecem evidência direta desta
ativação persistente (SHIRONO et al., 1989; HOLLSBERG & HAFLER, 1993).
Alguns estudos relatam que em algumas doenças inflamatórias a expressão
de marcadores de ativação celular reflete o grau da infecção (SHIRONO et al., 1989;
CHOI et al., 2002; WENSEL et al., 2005; NAGASAKI et al., 2005). Em HAM/TSP a
presença de linfócitos T ativados (HLA-DR+) pode ser o evento que inicia e propaga
a resposta inflamatória engatilhada pelo HTLV-I (BRITO-MELLO et al, 2002).
82
Em ATL foi observada variação na expressão destes marcadores entre as
forma clínicas, refletindo, talvez, as alterações na expressão de alguns genes devido
a infecção pelo HTLV-I, nas formas mais agressivas. A maior frequencia de casos
positivos para células HLA-DR, foi observada em nosso estudo, na forma clínica
indolente (66%) e houve apenas um caso positivo nas formas aguda, crônica e
linfoma, refletindo o status de ativação destas células na fase inicial da doença e
alteração fenotípica nas formas mais agressivas. Outros estudos também relatam a
declínio na expressão de HLA-DR em células ATL nos casos agudos e
correlacionaram este achado com a expressão defeituosa no gene para HLA-DR
(SHIRONO et al., 1989; NAGASAKI et al., 2005)
O IL-2Rα, detectado pelo anticorpo CD25, tem expressão elevada na
superfície das células ATL. Em ATL as células não secretam grandes quantidades de
IL-2 para induzir proliferação autócrina, entretanto exibem expressão elevada e
constitutiva deste receptor. É possível que outros fatores interajam com as cadeias
do IL-2R mimetizando a ativação promovida pela ligação de IL-2 ao receptor,
induzindo proliferação celular (MULLOY et al., 1996). Foi sugerido que o nível de IL-
2Rα no soro, ao diagnóstico, pode estar relacionado com a massa tumoral e
comportamento agressivo e que esta correlação é mais constante do que a
observada com LDH, sendo considerado por alguns como melhor indicador de
prognóstico em ATL (ARAKI et al., 2000).
No presente estudo foi encontrada percentagem mais elevada de células CD25
+
nas
formas aguda e linfoma do que nas formas crônica e indolente. Estes resultados
83
estão de acordo com aqueles observados no nível sérico de IL-2Rα, nas diversas
formas clínicas de ATL por Araki et al. (2000). Um caso crônico (#1) apresentou
percentagem elevada de células positivas para CD25 e é interessante notar que este
caso agudizou, indo a óbito seis meses depois.
A variação observada na expressão dos marcadores de superfície nos
linfócitos T CD4+ nos casos de ATL pode estar relacionada à expressão defeituosa
ou aumentada de alguns genes nas diversas fases da doença ou à heterogenicidade
das células leucêmicas nos diversos órgãos envolvidos. Devido a evolução pouco
previsível das formas indolente e crônica de ATL a pesquisa de marcadores de
superfície celular como CD25 pode ser importante para auxiliar na conduta
terapêutica e mesmo na prevenção da agudização. Ainda, a pesquisa de outros
marcadores como moléculas de adesão, quimiocinas e receptores de quimiocinas,
também através da imunoistoquímica, poderia ser importante no esclarecimento do
homing dos linfócitos para os diversos órgãos, especialmente a pele.
84
6.0 CONCLUSÕES
O status da MO na ATL pode não refletir a progressão da doença e,
consequentemente, ter valor relativo, inferior àquele observado em outras
leucemias/linfomas .
Como vários casos leucêmicos não apresentaram infiltração medular, ou
mostraram infiltração discreta, é provável que a proliferação das células
leucêmicas esteja ocorrendo em outros órgãos, sendo a pele uma fonte
possível de crescimento neoplásico.
O padrão de infiltração medular foi variável, sem evidente correlação com as
formas clínicas, predominando, contudo, o padrão difuso nas formas mais
graves, aguda e linfomatosa.
A morfologia e o fenótipo das células linfóides neoplásicas foram semelhantes
no tecido tumoral e na infiltração de outros orgãos e na biópsia de MO.
A infiltração medular não mostrou outras características histológicas comuns à
infiltração da medula por linfoma T.
A biópsia da MO foi ligeiramente mais eficaz que o aspirado na determinação
de presença de infiltração neoplásica.
A imunoistoquímica representou uma importante ferramenta auxiliar para
determinar a presença de infiltração quando esta era do tipo intersticial,
85
permitindo um diagnóstico conclusivo, que dificilmente poderia ser
estabelecido apenas com a histologia.
A percentagem mais elevada de células CD25
+
nas formas aguda e linfoma
indica que a expressão de IL-2Rα pode ser um marcador de prognóstico em
ATL.
Existe correlação positiva significante entre a presença da morfologia clássica
nas células atípicas do sangue periférico e infiltração da MO.
A presença da morfologia do tipo clássico nas células linfóides neoplásicas do
sangue periférico apresentou correlação com menor tempo de sobrevida e
nível sérico elevado de LDH.
A monitorização da morfologia das células atípicas em sangue periférico pode
ser importante para determinação precoce do advento de crisis ou agudização
nas formas indolente, linfomatosa ou crônica.
86
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105
ANEXO A
TÉCNICA DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE INVERTIDA (IPCR).
Inicialmente, far-se-á separação das células mononucleares do sangue periférico que
serão guardadas a -70ºC para realização da IPCR. As células mononucleares serão
separadas por gradiente de densidade (Ficoll hipaque 1077, SIGMA – USA) a partir
do sangue venoso heparinizado.
Após extração do DNA, um micrograma do DNA genômico será digerido com Alu I
(New England Biolabs) e depois ligado com T4 DNA ligase (New England Biolabs) de
forma diluída (4νg/ml) para causar self ligation a 16ºC, durante a noite. O DNA ligado
será então digerido com Sst II para eliminar a circular DNA originada do 5’ proviral
DNA. Este DNA será usado como template para PCR. Na primeira etapa do PCR
primers LTR-1: 5’-AAGCCGGCAGTCAGTCGTGA-3’ (resíduos 8946-8927) e LTR-2:
5’-AAGTACCGGCAACTCTGCTG-3’ (resíduos 8958-8977) serão usados. Cinco
microlitros do primeiro ciclo de PCR serão então amplificados na mesma condição
com os primers aninhados LTR-3: 5’-GAAAGGGAAAGGGGTGGAAC-3’ (resíduos
8924-8905) e LTR-4: 5’-CCAGCGACAGCCCATTCTAT-3’ (resíduos 8986-9005).
Cada reação de PCR será feita no termociclador (MJ Research) usando 50 ciclos
para a primeira reação e 35 ciclos para a segunda a 94ºC por 20 segundos, 55ºC por
20 segundos e 72ºC por 30 segundos. Os produtos de PCR serão analisados em
agarose gel a 2% e transferidos para uma membrana de nylon, uma oligoprobe (5’-
CTCCAGGAGAGAAATTTAGTACA-3’) usada para confirmar a banda especifica e
marcada em 5’-end COMγ
32
P_ATP.
106
ANEXO B
IMUNOISTOQUÍMICA
Método da estreptoavidina biotina peroxidase (Boenish, 1989)
1º Desparafinizar as secções histológicas em xilol por 10 minutos (2x), desidratar em álcool
absoluto por 5 minutos (2x) e hidratar em água destilada.
2º Recuperação antigênica em tampão citrato pH-6,0 em banho-maria por 30 mim a 90ºC
3º Bloqueio da peroxidase endógena com H
2
O
2
por 25 minutos a T.A.
4º Lavar as secções em água destilada.
5º Lavar as secções em PBS+Tween a 0,001% por 5 minutos (2x).
6º Incubar as secções com anticorpo primário a 4ºC overnight. (tabela 2)
7º Lavar as secções em PBS+Tween a 0,001% por 10 minutos (2x).
8º Incubar as secções em anticorpo secundário biotinilado por 25 minutos a 30ºC.
Kit LSAB plus system-HRP (DAKOCYTOMATION).
9º Lavar com PBS+Tween a 0,001% por 10 minutos (2x).
10º Incubar as secções com o complexo streptoavidina-biotina/peroxidade por 25 minutos a
30ºC.
Kit LSAB plus system-HRP (DAKOCYTOMATION).
11º Lavar as secções com PBS+Tween a 0,001% por 10 minutos (2x).
12º Aplicar o cromógeno Diaminobenzidina (DAB) sobre as secções até a mudança de
coloração (±5 minutos).
13º Lavar em água corrente.
14º Contracorar com hematoxilina de Harris por 30 segundos, lavar em água corrente,
desidratação em álcool absoluto (2x), clarificar em xilol (2x).
15º Montagem das lâminas com bálsamo do Canadá.
107
ANEXO C
Distribuição da pontuação dos casos estudados de acordo com os critérios de
diagnósticos de ATL (LEVINE et al., 1994)
Caso
Forma
Clínica
Cálcio
Lesão
pele
Leucemia
Linfoma
T
HTLV-I +
CD25+
Integração
monoclonal
Total de
pontos
1 Cr 0 1 1 2 2 1 2 9
2 Ag 0 0 1 2 2 0 2 7
3 Ag 1 0 1 2 2 1 0 7
4 Ag 1 0 1 2 2 1 0 7
5 Cr 0 1 1 2 2 1 0 7
6 Ag 1 1 1 2 2 1 0 8
7 Ag 0 0 1 2 2 1 0 6
8 IND 0 1 0 2 2 1 0 6
9 Ag 0 0 1 2 2 1 0 6
10 LN 0 1 1 2 2 1 0 7
11 LN 0 1 0 2 2 1 0 6
12 Ag 0 1 1 2 2 1 0 7
13 IND 1 1 0 2 2 1 2 9
14 TC 0 1 0 2 2 1 0 6
15 LN 0 0 0 2 2 1 2 7
16 Ag 1 0 1 2 2 1 0 7
17 Cr 0 1 1 2 2 1 0 7
18 LN 0 0 0 2 2 1 0 5
19 Ag 1 1 1 2 2 1 2 10
20 IND 0 1 0 2 2 0 0 5
21 LN 0 0 0 2 2 1 2 7
22 Ag 1 0 1 2 2 0 2 8
23 LN 0 0 0 2 2 1 0 5
24 Cr 0 1 1 2 2 0 2 8
25 IND 0 1 0 2 2 1 2 8
26 IND 0 1 0 2 2 1 2 8
27 IND 0 1 0 2 2 1 0 6
28 Ag 1 0 1 2 2 1 2 9
29 Cr 0 1 1 2 2 1 0 7
Ag: aguda, Cr: crônica, LN: linfoma, IND: indolente, TC: Tumoral cutânea.
108
ANEXO D
109
Livros Grátis
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