( PDF ) Fatores genéticos de risco na doença hipertensiva da gestação

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

Caroline Abrão Dalmáz

Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Genética e Biologia Molecular da UFRGS

como requisito parcial para a obtenção do grau de

Doutor em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Israel Roisenberg

Porto Alegre, agosto de 2006

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Este trabalho foi realizado no Laboratório de Hemostasia do Departamento de

Genética do Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e no

Grupo Hospitalar Conceição, em Porto Alegre, sob o apoio financeiro do CNPq, FINEP e

PRONEX.

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iii

“Um pouco de ciência nos afasta de Deus, muito nos aproxima”.

(Louis Pasteur)

...e então, um dia, já no final da fase de escrever a tese, me vi, como desde o início,

completamente emocionada e apaixonada pelo meu tema de escolha no doutorado e senti

que tudo valeu a pena, ao escutar da minha querida vizinha, até então uma história

desconhecida da vida dela para mim, que ela havia perdido a mãe na ocasião de seu

nascimento, em decorrência de eclâmpsia. Ela, por sua vez, nem imaginava, que contava

sua história pessoal a uma doutorando no tema, mas provocou em mim o sentimento de ter

contribuído, de alguma maneira, para auxiliar na elucidação deste tema, e, principalmente,

de que há muito ainda por se fazer.

Dedico esta tese a todas às mulheres que bravamente tem filhos e que, mesmo diante de

tantas dificuldades, dão o melhor de si.

A vida de todos nós é movida a desafios, e aqui lhes apresento o meu mais novo

trabalho que só foi possível com a ajuda de várias pessoas. Fica o meu carinho e

agradecimento a todos que me auxiliaram nesta tarefa, nos mais variados graus, e minha

sincera gratidão. Saibam que foi um grande prazer trabalhar com todos vocês.

Agradecimentos mais do que especiais:

A todas às pacientes e familiares que me confiaram suas angústias e esperanças, em

um momento tão importante de suas vidas que é a maternidade e que, apesar de todas as

dificuldades, compreenderam a dimensão do objetivo proposto, incentivando e acreditando

na realização deste trabalho. Sem elas, nada disso seria possível.

Ao meu incansável orientador:

Prof. Israel Roisenberg, por ter me recebido de braços abertos em seu laboratório,

pela confiança depositada em mim ao longo de todo o trabalho, por me conduzir na

carreira científica e ensinar o lado humano da ciência. Um exemplo.

À Dr

. Citânia Tedoldi, pelo dinamismo, por extrema competência, pela energia

contagiante, por ter sido responsável pela minha iniciação no mundo da obstetrícia e,

especialmente, pela colaboração indispensável ao longo dos últimos quatro anos.

À Dr

. Kátia Santos, por ter auxiliado para a realização do mesmo, pelo apoio e

disposição.

À Mariana Rodrigues Botton, pela adorável convivência no laboratório, parceria e

companheirismo.

À Ana Maria C. B. Pereira, pelo companheirismo, pelo apoio constante, por

compartilhar as alegrias e as pequenas decepções, por auxiliar a encontrar soluções para os

obstáculos cotidianos, e pela amizade desde o início.

À Prof

Eliane Bandinelli, pelos questionamentos, sugestões e esclarecimentos,

pelo apoio e pelo delicioso café.

Aos colegas Alexandre Gard Reimer e Daisy Crispim, pelo apoio e colaboração.

À Kátia Gerloff, Ângela Kalil e profissionais do laboratório de análises clínicas do

Hospital Nossa Senhora da Conceição, por terem nos recebido de forma alegre, simpática e

com disposição para auxiliar no que fosse preciso. A cabeça pensa onde os pés pisam, já

dizia Paulo Freire, e é impossível continuar com a mesma após pisar no Hospital Nossa

Senhora da Conceição e poder conhecer o serviço prestado por estas profissionais tão

capazes e comprometidas.

Ao Elmo J. A. Cardoso e a Ellén Oliveira, por demonstrar que é possível

descomplicar o que pode ser simplificado, pelo atendimento sempre atencioso.

Aos professores do PPGGBM, aos colegas em geral e a todos que contribuíram de

alguma forma para a realização deste trabalho.

Aos examinadores desta tese de doutorado pela disposição em abdicar de seus

compromissos para compartilhar a realização de um sonho que se constitui em uma etapa

fundamental da minha carreira científica.

À minha família, maravilhosa, pelo cólo e a quem sou eternamente grata. A eles

meu amor e meu carinho.

Ao Marcelo, por acreditar nos meus sonhos e neles embarcar, por compartilhar uma

longa jornada de desafios, de crescimento pessoal e profissional, por seu amor, paciência e

dedicação e por ter feito com que eu me tornasse uma pessoa melhor e mais feliz.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... ix

RESUMO ........................................................................................................................... xi

ABSTRACT ...................................................................................................................... xv

CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO .......................................................................................19

1.1. Aspectos epidemiológicos...................................................................................... 20

1.2. Classificação dos distúrbios hipertensivos da gestação..........................................22

1.3. Patogênese...............................................................................................................24

1.4. Fatores de predisposição.........................................................................................26

1.5. Fatores genéticos de risco........................................................................................29

1.5.1. Genes candidatos ligados à hemostasia……………………………......... ..30

1.5.2. Gene candidato ligado ao estresse oxidativo................................................40

CAPÍTULO II: OBJETIVOS ........................................................................................ 44

CAPÍTULO III: “Risk factors for hypertensive disorders in pregnancy in Southern

Brazil”…………………………………….............................……….…….......……..…47

CAPÍTULO IV: “Relationship between polymorphisms in thrombophilic genes and

preeclampsia in a Brazilian women” ………………………………………….........…..65

CAPÍTULO V: “Genotypes and Haplotypes of Endothelial Nitric Oxide Synthase

Gene Polymorphisms (Glu298Asp, intron-4, and -786T→C) and Risk of Preeclampsia

in a Brazilian population”…......................................................................................……82

CAPÍTULO VI: DISCUSSÃO ........…....……………………………………….......... 106

CAPÍTULO VII: CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ……..................116

viii

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………............................. 120

ANEXO ............................................................................................................................ 135

ANEXO – Ficha clínica de avaliação da paciente e termo de consentimento

informado.......................................................................................................................... 136

LISTA DE ABREVIATURAS

ACOG American College of Obstetricians and Gynecologists

C677T substituição do nucleotídeo citosina por timina no nucleotídeo 677 do gene

da metilenotetrahidrofolato redutase

DAC doença arterial coronariana

DHG distúrbios hipertensivos da gravidez

DPP descolamento prematuro de placenta

eNOS óxido nítrico sintetase

FVL fator V Leiden

F II protrombina

G20210A polimorfismo G20210A do gene da Protrombina

Glu298Asp polimorfismo Glu298Asp do gene da óxido nítrico sintase

HNSC Hospital Nossa Senhora da Conceição

HG Hipertensão Gestacional

HAS hipertensão arterial sistêmica

IAM infarto agudo do miocárdio

IC intervalo de confiança

IMC índice de massa corporal

E eclâmpsia

MTHFR metilenotetrahidrofolatoredutase

PA pressão arterial

PAI-1 inibidor da ativação do plasminogênio tipo 1

PE pré-eclâmpsia

LDH lactato desidrogenase

ON óxido nítrico

OR “odds ratio”

RC razão de chances

RFLP polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição

SNP “single nucleotide polymorphisms”

TGO transaminase oxalacética

TGP transaminase pirúvica

RESUMO

Introdução: Os distúrbios hipertensivos da gestação (DHG) abrangem um amplo

espectro de doenças, desde hipertensão gestacional até pré-eclâmpsia (PE) severa. A PE é

uma doença específica da gestação e é caracterizada pela elevação da pressão arterial e

proteinúria, em mulheres previamente normotensas. Há diversos fatores de risco

identificados para o desenvolvimento dos DHG - o que é primordial para a detecção

precoce, bem como para o tratamento dos DHG. A gestação por si representa um fator de

risco ao estado de hipercoagulabilidade associada à mudanças nos fatores hemostáticos e

esta condição tem sido descrita como participante da patogênese de algumas doenças

obstétricas, incluindo a PE. Ainda, o óxido nítrico que auxilia na regulação da pressão

arterial, agregação plaquetária, durante a gestação e parto, tem sido sugerido envolvido na

patogênese da PE. A patofisiologia da PE, no entanto, permanece não completamente

esclarecida; há evidências da predisposição genética que tem sido bem documentadas e

genes envolvidos com trombofilias e polimorfismos do gene do óxido nítrico sintetase

(eNOS) têm sido sugeridos como possíveis fatores de risco para o desenvolvimento da PE.

Objetivo: O objetivo deste estudo foi identificar a freqüência dos fatores de risco nos DHG

e analisar a relação entre 7 variantes moleculares de DNA distribuídos em 5 genes

relacionados à hemostasia [o polimorfismo C677T do gene da metilenotetrahidrofolato

redutase (MTHFR), a mutação G20210A do gene da protrombina (F II), a mutação

G1691A do gene do fator V (FV Leiden) e o polimorfismo de inserção e deleção (4G/5G)

no gene do inibidor tipo 1 ativador do plasminogênio (PAI-1)] e ao estresse oxidativo

(polimorfismos Glu298Asp, intron-4, –786T→C) do gene da eNOS e a ocorrência e/ou a

severidade da PE, independentemente ou em combinações.

xii

Materiais e Métodos: A população de estudo foi composta por 330 participantes (161

pacientes com DHG e 169 controles) pareadas por idade e etnia, oriundas do Hospital

Nossa Senhora da Conceição. Todos as pacientes foram submetidas a exame físico,

entrevista por meio de questionário padronizado e exames específicos para o diagnóstico

dos DHG. A PE foi definida como a presença de hipertensão arterial em mulheres

previamente normotensas e proteinúria. A análise dos polimorfismos foi realizada por meio

das técnicas de PCR e PCR-RFLP para os produtos de PCR que foram submetidos à

digestão enzimática com a enzima HinfI para o polimorfismo da MTHFR, HindIII para as

mutações da F II e FV e com BanII para o polimorfismo Glu298Asp e MspI para o

polimorfismo –786T→C do gene da eNOS. Para a identificação dos fatores de risco foram

utilizados teste t de student, teste exato de Fisher e Qui-quadrado. A análise de regressão

multivariada foi realizada para estimar as variáveis clínicas, sociais e demográficas que

foram associadas com a ocorrência de DHG na análise univariada.

Resultados: O grupo das pacientes foi composto de 73% de mulheres caucasianas e a

média de idade foi de 29,1 anos (13-48 anos). Na análise multivariada as variáveis

significantemente associadas com os DHG foram: a presença de história familiar de

preeclampsia [p=0,02; razão de chances (RC)=7,05; 95% intervalo de confiança (IC)=1,99-

24,92], a presença de diabetes (p<0,01; RC=3,87; 95% IC=1,22-12,27) e ocorrência de

hipertensão crônica (p=0,02; RC=1,70; 95% IC=0,54-5,32). Dos 7 polimorfismos

analisados, observou-se que as distribuições genotípicas e as freqüências alélicas dos

polimorfismos C677T do gene da MTHFR (RC=2,07; 95% IC=0,99-4,30), G20210A do

gene da F II (RC=8,11; 95% IC=0,89-73,92), G1691A do gene do FV (RC=3,94; 95%

IC=0,35-44,23), 4G/5G do gene do PAI-1 (RC=1,63; 95% IC=0,87-3,05) não parecem

estar associadas isoladamente à ocorrência da PE em gestantes com essa complicação

xiii

quando comparadas à gestantes normotensas, nem mesmo na forma severa. Entretanto,

quando investigada uma possível interação entre os genótipos de risco e a PE, a RC para

um genótipo de risco, de um ou dois genótipos de risco e dois genótipos de risco

comparado com grupo sem genótipos de risco foi [1,97 (95% IC=1,08-3,59), 2,21 (95%

IC=1,25-3,92) e 4,27 (95% IC=1,3-13,9)], respectivamente. Em relação aos polimorfismos

do gene da eNOS, a distribuição genotípica do polimorfismo Glu298Asp foi

significativamente diferente entre as pacientes com PE e as mulheres normotensas

caucasóides (p=0.040; Asp/Asp versus Glu/Glu + Glu/Asp: RC=2,65; 95% IC=1,045-

6,69), no entanto não foi diferente nas pacientes afro-brasileiras (p>0,05). Ainda, as

distribuições genotípicas e as freqüências alélicas dos polimorfismos intron-4 e –786T→C

do gene da eNOS não estão associadas à ocorrência e/ou severidade da PE em gestantes

com essa complicação quando comparadas à gestantes normotensas, seja no grupo das

caucasóides ou das afro-brasileiras. As freqüências dos haplótipos Glu298Asp, intron-4 e –

786T→C foram diferentes nas mulheres com PE quando comparadas à gestantes

normotensas no grupo de mulheres afro-brasileiras (<0,001). O haplótipo Asp298-786T-4b

foi mais freqüente nos casos do que nos controles. A análise com o grupo das caucasianas

não foi significativamente diferente (p=0,14).

Conclusões e perspectivas futuras: Os fatores de risco associados aos DHG são

similares aos reportados em outros países e o conhecimento dos fatores de risco de nossa

população pode auxiliar nas condutas do pré-natal. Na população analisada, a presença dos

genótipos de risco nos genes ligados à trombofilias não estiveram associados ao

desenvolvimento da PE nem na PE grave, quando analisados independentemente.

Entretanto, uma possível interação entre os polimorfismos dos genes MTHFR, F II, FV e

PAI-1 e o desenvolvimento de PE foi sugerido. Em relação aos polimorfismos do gene da

xiv

eNOS, uma associação entre o polimorfismo Glu298Asp e o desenvolvimento da PE em

pacientes caucasóides foi encontrado. O haplótipo Asp298-786T-4b pode estar relacionado

com PE em mulheres afro-brasileiras.

ABSTRACT

Background: Hypertensive disorders of pregnancy (HDP) cover a broad spectrum of

diseases ranging from gestacional hypertension to severe preeclampsia. Preeclampsia (PE),

a pregnancy-specific syndrome is characterized by clinically defined as elevated blood

pressure and proteinuria, in women previously normotensive. There are several risk factors

identified to the development to HDP - this is very important to early defection and

treatment of HDP. Pregnancy itself represents a risk factor for a hypercoagulable state

associated with acquired changes in hemostatic factors, and a condition of

hypercoagulation has been described as a major factor in the pathogenesis of some

obstetric pathologies, including PE. In addition, the nitric oxide regulates blood pressure,

platelet aggregation, myometrial quiescence during pregnancy and parturition, and may be

involved in the pathogenesis of PE. Although the pathophysiology of PE remains unclear,

genetic evidences for an inherited predisposition to PE are well known and trombophilic

genes and polymorphisms in the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) have been

suggested as a risk factor to the development of PE.

Aim: The aim of this study was to identify the frequency of risk factors for

hypertensive disorders in pregnancy in Southern Brazil and analyze the relationship

between 7 DNA polymorphisms distributed in 5 genes related to the haemostasis (the

C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, the

G20210A mutation of prothrombin gene (F II), the G1691A mutation of factor V (FV

Leiden) and an insertion/deletion polymorphism (4G/5G) in the promoter of the

plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) gene and to endothelial dysfunction (–

Glu298Asp, intron-4 and 786T→C in the eNOS gene) and the occurrence and/or the

severity of the preeclampsia, independently or in combination.

xvi

Materials and Methods: The study population was composed of 330 individuals (161

patients with HDP and 169 controls) matched by age and ethnicity from Hospital Nossa

Senhora da Conceição. All patients underwent a standardized clinical evaluation that

consisted of a questionnaire. Preeclampsia was defined as the presence of hypertension

associated with proteinuria in women known to be normotensive beforehand. Genotype

analysis was performed using the PCR methods and PCR-RFLP method for the PCR

products were subjected to digestion with the restriction enzymes HinfI for the

polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, the HindIII for

polymorphisms in the prothrombin mutation (F II), and factor V Leiden (FV) genes, the

BanII for the Glu298Asp polymorphism and MspI for –786T→C polymorphism in the

eNOS gene. The frequencies of the risk factors were compared between the groups by

Fisher’s exact test, Chi-square and Student t tests. A multivariate logistic regression was

performed to assess the independent role of the clinical, social and demographic variables,

which were significantly associated with occurrence of the hypertensive disease in

pregnancy in the univariate analysis. Student t test was employed for comparison of the

quantitative variables between the groups. Differences in proportions were tested by

Student’s t test, Fisher’s exact test or χ

test. Relative risks were estimated by the odds

ratio and P – values of < 0.05 were considered to be significant.

Results: We found 73% of Caucasians and the mean age was 29.1 years (13–48 years). In

the multivariate analysis, the variables significantly associated with hypertensive disease in

pregnancy were the following: family history of preeclampsia [p=0.02; odds ratio (OR) =

7.05; 95% confidence interval (CI)=1.99-24.92], diabetes (p<0.01; OR=3.87; 95%

CI=1.22–12.27) and chronic hypertension (p=0.02; OR=1.70; 95% CI=0.54-5.32). When

we analyzed the polymorphisms independently and the development of preeclampsia no

xvii

association was observed [methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) 677TT

genotype, OR 2.07, 95% CI=0.99-4.30; prothrombin mutation (F II) (GA or AA

genotypes) OR 8.11, 95% CI=0.89-73.92; factor V Leiden (FV Leiden) OR 3.94, 95%

CI=0.35-44.23; plasminogen activator inhibitor (PAI-1) 4G/4G genotype, OR 1.63, 95%

CI=0.87-3.05] not even with severe preeclampsia subgroup analysis. However, when we

investigated a possible interaction among these polymorphisms on the development of the

preeclampsia, the OR for having one risk genotype, one or two genotype risk factors and

two genotype risk factors compared to those without genotype risk factors were 1.97 (95%

CI=1.08-3.59), 2.21 (95% CI=1.25-3.92) and 4.27 (95% CI=1.3-13.9), respectively.

Regarding to the polymorphisms in the eNOS gene the genotype distribution was

significantly different between preeclamptic and normotensive women for the Glu298Asp

polymorphism in Caucasians (p=0.040; Asp/Asp versus Glu/Glu + Glu/Asp: OR=2.65;

95% CI=1.045-6.69) but it was not different in African-Brazilians (p>0.05). The genotype

frequencies for the intron-4 and –786T→C polymorphisms did not differ in Caucasians

and African-Brazilians (p>0.05). The estimated haplotype frequencies considering the

eNOS Glu298Asp, the intron-4, and the –786T→C polymorphisms were different between

women with preeclampsia and control women in African-Brazilians (p<0.001). The

Asp298-786T-4b haplotype was more frequent in cases than in controls. The analysis with

the Caucasian group did not demonstrate significant differences (p=0.14).

Conclusions and future perspectives: In conclusion, the risk factors associated with

hypertensive disorders in pregnancy appear to be similar to those reported in other

countries and our results reflect behavioral factors whereby women may be predisposed to

an increased risk of preeclampsia, thus the knowledge of the risk factors could be helpful

in a prenatal care. In the population analyzed, the presence of the genotype risk factors in

xviii

the trombophilic genes alone does not seem to be associated with the development of

preeclampsia even in the severe presentation form. Nevertheless, a possible interaction

among the MTHFR, F II, FV and PAI-1 gene polymorphisms on the development of the

preeclampsia was suggested. Regarding to the polymorphisms in the eNOS gene, a

possible association between the Glu298Asp polymorphism on the development of the

preeclampsia in the Caucasian group was suggested. It was also indicated that the Asp298-

786T-4b haplotype may be related to occurrence of preeclampsia in African-Brazilian

women.

INTRODUÇÃO

CAPÍTULO I

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos Epidemiológicos

A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma complicação comum na gravidez

(Brown e Budlle, 1997) e, entre todas as complicações da gestação, é responsável por 15%

das internações hospitalares antes do nascimento (Scott et al., 1997). Apesar de ter havido

redução na mortalidade materna em gestações (UK, 1999 e Lain e Roberts, 2002), os

distúrbios hipertensivos da gravidez (DHG) continuam sendo uma causa freqüente de

morte durante a gestação (Duley, 1992; de Swiet, 2000; Sibai et al., 2005). As mulheres

que desenvolvem DHG têm risco aumentado de desenvolver descolamento prematuro de

placenta (DPP), insuficiência renal, complicações cerebrovasculares, cardiovasculares,

hepáticas, coagulopatias e morte materna e/ou perinatal (Abdella et al., 1984; Cuningham

et al., 1997; Sibai et al., 2005). Ainda, estudos recentes, têm evidenciado que, no futuro,

essas mulheres têm risco de desenvolver doença cardiovascular e doenças metabólicas

aumentado se comparado com pacientes que tiveram gestações normais (Ness et al., 2003;

Kaaja e Greer, 2005).

Dentre os DHG, a pré-eclâmpsia (PE) é uma forma específica que constitui um

problema de saúde em todo o mundo (Lain e Roberts, 2002). Cerca de 5 a 8% das

gestações possuem esta complicação e a PE está associada com significativo aumento de

morbidade e mortalidade materna e perinatal (Sibai et al., 1997; ACOG, 2002; Walker,

2000). Em países em que o pré-natal não é adequado, a hipertensão gestacional (HG) é

responsável por 40 à 80% das mortes maternas. Estima-se que cerca de 50.000 mulheres

morrem de PE por ano no mundo (Pipkin, 2001; Lain e Roberts, 2002).

Avanços no entendimento dessa complicação, cujas causas ainda são desconhecidas,

são fundamentais para estratégias preventivas e terapêuticas, visando reduzir o impacto

dessa doença em todo o mundo.

1.2. Classificação dos Distúrbios Hipertensivos da Gestação

Doenças hipertensivas podem ocorrer antes da gestação e serem específicas da

gravidez (Lain e Roberts, 2002). De acordo com o American College of Obstetricians and

Gynecologists (ACOG, 2002), podemos sub-dividí-las em: Pré-eclâmpsia, Hipertensão

gestacional, Hipertensão crônica com pré-eclâmsia superposta.

Pré-eclâmpsia

A PE é uma síndrome manifestada por HAS e proteinúria (Report, 2000; ACOG,

2002) – (excreção de proteína urinária ≥ 300mg/24h), evidências de disfunção de múltiplos

órgãos (rins, fígado, cérebro e coração) e, geralmente, com início após a 20

semana de

gestação em pacientes que tinham pressão arterial (PA) normal (Sibai et al; 2005). É

recomendado que gestantes, mesmo nas quais não foram identificadas alterações nos níveis

pressóricos de aumento na PA em 140mmHg (sistólica) ou 90mmHg (diastólica), sejam

monitoradas com especial atenção (Report, 2000). Igualmente, pacientes com HAS

gestacional sem proteinúria, mas com outras evidências de desordens orgânicas devem ser

tratadas como se tivessem PE (Lain e Roberts, 2002). Mesmo com a HAS bem controlada

no início, a sobreposicão da PE é de 15 a 25%, com aumento do risco materno e fetal

(Sibai et al., 1983; Caritis et al., 1998). Complicações da PE incluem falência renal e

hepática, eclâmpsia (E), coagulação intravascular disseminada e crescimento intra-uterino

restrito (Morrison et al., 2002). É dividida em PE Leve ou Grave. O diagnóstico de PE

Grave se dá quando um ou mais dos fatores descritos abaixo estão presentes, segundo

ACOG, 2002:

 PA sistólica ≥160mmHg ou PA diastólica ≥110mmHg confirmados em duas

tomadas com intervalo de 6h com a paciente em repouso;

 Proteinúria ≥ 5g em 24h ou = 0,3 + em duas amostras de urina coletada em até 4h;

 Oligúria < 500mL em 24h;

 Distúrbios cerebrais ou visuais;

 Edema pulmonar ou cianose;

 Dor epigástrica;

 Trombocitopenia (plaquetas < 100.0000 /μL);

 Crescimento fetal restrito.

A PE é considerada Leve quando não preencher os critérios de PE Grave em relação à

pressão e à proteinúria. Eclâmpsia é a presença de convulsões numa paciente com PE.

Devem ser excluídas epilepsia e outras doenças convulsivas.

A chamada síndrome HELLP, um acrônimo de PE grave com hemólise, elevação das

enzimas hepáticas e baixa contagem de plaquetas - é uma síndrome definida por três

critérios (Sibai et al., 1990):

 Hemólise – manchas periféricas anormais, bilirrubina ≥1,2mg/dL, ou lactato

desidrogenase (LDH) ≥600IU/L ou 2X o valor máximo normal para o método de aferição;

 Elevação das enzimas hepáticas (TGO, TGP ≥2x normal);

 Trombocitopenia (plaquetas < 100x 10

/μL).

A proteinúria pode ou não estar presente em pacientes com síndrome HELLP.

Hipertensão crônica ocorre em cerca de 3 a 5% das gestações e é a presença de HAS

antes da gravidez, antes da 20

semana de gestação ou persistente após 12 semanas pós-

parto (ACOG, 2001).

Hipertensão Gestacional (HG)

É definida pelo aumento da PA sem proteinúra. Aumento da pressão arterial na

gestação é PA maior do que 140mmHg (sistólica) ou 90mmHg (diastólica) em mulheres

que eram normotensas antes da 20

semana de gestação. Este é um grupo heterogêneo:

pacientes com hipertensão crônica que não conheciam esta situação, HAS transitória da

gestação que se normaliza no pós-parto e pacientes que desenvolvem PE (Report, 2000).

HG com mínima elevação de PA e sem proteinúria não é um indicador de confiança de

morbi-mortalidade materna e fetal mas requer atenção à mãe e ao feto (Brown et al., 1994).

Hipertensão crônica com PE superposta

É diagnosticada pela presença de um aumento da PA acima dos valores basais da

paciente, mudança na proteína urinária basal ou alguma evidência de disfunção orgânica.

Hipertensão crônica com PE superposta ocorre em aproximadamente 20 a 25% das

mulheres com HAS crônica (Caritis et al., 1998; Sibai et al., 1983).

Embora estas definições sejam importantes para pesquisas e estudos

epidemiológicos, são menos importantes na clínica, pois todas as mulheres com aumento

na pressão arterial devem ser cuidadosamente monitoradas pelo caráter associativo que

possam ter com a PE.

1.3. Patogênese

A patogenêse dos DHG permanece não elucidada, mas predisposição genética, mal

adaptação imunológica resultante em isquemia placentária e conseqüente distúrbio materno

vascular endotelial, além de falha na placentação, são aceitos unanimimente (Roberts e

Cooper, 2001). Há décadas, inúmeras teorias vêm sendo propostas para explicar a gênese

da PE, mas até o momento nenhuma foi aceita de forma definitiva.

A PE não pode ser atribuída somente à redução de perfusão placentária. Atualmente,

dois fatores são considerados importantes no mecanismo fisiopatológico da doença: o

quadro de peroxidação lipídica e o da resposta inflamatória sistêmica exacerbada (Redman

et al., 1999; Kim et al., 2001a; 2001b). Sob vários aspectos, estas duas hipóteses se

confundem em uma só, visto que podem ser entendidas como processos complementares,

em que a primeira é capaz de desencadear a segunda situação clínica (Kim et al., 2001a;

2001b). Parece que gestações com invasão trofoblástica deficiente tendem a desenvolver

hipóxia tissular, levando à produção aumentada de peróxido lipídico no tecido placentário

e elevação dessa substância na circulação fetoplacentária (Kim et al., 2001a; 2001b). A

capacidade de peróxidos lipídicos de lesar células endoteliais é conhecida de longa data,

sendo este o ponto de contato entre as duas teorias, já que a resposta inflamatória

sistêmica, na maior parte das vezes, se inicia com a lesão endotelial (Redman et al., 1999).

Alguns trabalhos experimentais demonstram que a PE constitui uma síndrome típica da

exacerbação da resposta inflamatória sistêmica. A lesão endotelial com elevação das

endotelinas, o aumento da agregação plaquetária e o depósito de fibrinogênio em diversos

orgãos são componentes de um processo inflamatório sistêmico típico (Faas et al., 1997;

Faas et al., 2000). Observa-se na gravidez normal a elevação da atividade de granulócitos,

monócitos e linfócitos, caracterizando a presença de atividade inflamatória (Faas et al.,

1997; Faas et al., 2000). No entanto, na PE a exacerbação desta atividade, caracterizada

laboratorialmente pela elevação destes marcadores, constitui achado bastante sugestivo da

participação do processo inflamatório na patogenia da doença (Redman et al., 1999).

Contudo, o mecanismo que desencadeia a resposta inflamatória sistêmica exacerbada

nas pacientes portadoras de PE não está bem estabelecido, embora se saiba que o quadro de

deportação trofoblástica sistêmica seja capaz de ativar esta resposta (Gervasi et al., 2001).

Vários fatores de predisposição têm sido referidos na patogênese dessa complicação.

A prevenção de eclâmpsia pode ser possível a partir de pré-natal muito bem conduzido em

que haja identificação das pacientes com maior risco e da intervenção precoce naquelas

cujos fatores de predisposição estejam presentes (Ogunyemi et al., 2004). A possível

prevenção da PE também tem merecido especial atenção de pesquidores em todo o mundo,

especialmente em estratégias preventivas não farmacológicas (dieta restritiva de sódio, uso

suplementar de vitaminas C e E, repouso) e de estratégias preventivas farmacológicas (uso

do ácido acetilsalicílico em doses de 100mg, suplementação de cálcio, diuréticos,

medicações anti-HAS, uso de heparina) (Norwitz et al., 1999; Roberts et al., 2001;

Wallenburg, 2001), entretanto, os resultados são dicordantes e novos estudos

multicêntricos seriam necessários para auxiliar na elucidação do papel destes possíveis

coadjuvantes na prevenção/tratamento da PE. Portanto, até o presente momento a

identificação de fatores de predisposição é essencial para que os obstetras monitorem suas

pacientes cuidadosamente.

1.4. Fatores de Predisposição

Os fatores de risco para a PE podem ser divididos em Fatores de risco associados à

gravidez (tabela 1) e Pré-concepcionais e/ou fatores de risco crônicos (tabela 2) (Dekker,

1999)

Tabela 1. Fatores de risco para a PE associados à gravidez

Fatores de risco para a PE associados à gravidez

Infecção do trato urinário

Anormalidades cromossômicas

(trissomia 13, triploidia)

Anormalidades estruturais congênitas

Hidropsia fetal

Mola hidatiforme

Tabela 2. Fatores de risco para a PE pré-concepcionais

Fatores de risco para PE pré-concepcionais

Fatores de risco relacionados ao parceiro: Primeira gestação, limitada

exposição ao esperma, inseminação por doador, parceiro que teve, com

outra parceira, história de PE

Fatores de risco maternos: PE prévia, idade materna avançada ou precoce,

intervalo entre as gestações, história familiar, paciente que recebeu doação

de oócitos, raça negra, gestações múltiplas assistidas, Hormônio da

Gonadotrofina Coriônica (HCG) elevado

Presença de doenças específicas: Doença renal e HAS prévia, HAS antes

de 20 semanas, obesidade, resistência à insulina, Diabetes Melito (DM)

gestacional e DM tipo 1, peso materno baixo ao nascer, testosterona

elevada, hiperlipidemia. Alterações da hemostasia: mutação Fator V

Leiden, deficiência de proteína S, presença de anticorpos anti-fosfolipídeos,

hiperhomocisteínemia, aumento do inibidor da ativação do plasminogênio

(PAI –1) PAI-2

Fatores exógenos: Fumo, stress oxidativo, sazonalidade, depressão,

ansiedade, stress, dieta calórica, rica em ácidos graxos polinsaturados e

sucrose

Na população brasileira, somente um estudo sobre a freqüência e os fatores de risco

dos DHG foi publicado, até o momento (Gaio et al., 2001). Os autores concluíram que os

DHG são complicações da gravidez comuns nas mulheres brasileiras e que na região da

Amazônia é onde se encontram as menores freqüências de todo o país. Além disso, as

freqüências dos fatores de risco encontrados nessa população foram similares aos

encontrados em mulheres com DHG de outros países (Sibai et al., 2005): idade avançada,

estado nutricional (obesidade) e paridade (número de gestações).

1.5. Fatores genéticos de risco

A investigação dos fatores genéticos associados com doenças humanas freqüentes e

complexas alcança, atualmente, alta prioridade em pesquisas na área de Genética Humana

e Médica. Parece haver uma suceptibilidade para que esta doença ocorra, pois têm sido

evidenciado que a PE ocorre nas famílias com história desta complicação e que a

influência se dá tanto pelos genes maternos quanto pelos genes paternos (Chesley e

Coooper, 1986; Arngrimsson et al., 1990; Arngrimsson et al., 1995; Cincotta e Brennecke,

1998; Mogren et al., 1999; Treolar AS et al., 2001; Esplin et al., 2001). O modelo de

herança genética que melhor se ajusta à PE tem sido extensivamente discutido,

permanecendo controversos os modelos de heraça baseados em genes maternos, genes

fetais ou a sua interação (Skjaerven et al., 2005). Chesley e Coooper (1986) e Argrimsson

et al. (1990) preconizaram o modelo do gene materno recessivo, com penetrância

incompleta ou herança multifatorial. Cincotta e Brennecke (1998), de acordo com o

modelo do gene materno, relataram que, em primigrávidas, a história familiar (mães, irmãs

ou ambas) de PE está associada a um aumento de 4 vezes o risco de PE severa. É sugerido,

portanto, por esses pesquisadores que o questionamento sobre história familiar seja

incluído na história clínica da paciente. Outros investigadores questionaram o modelo do

gene materno e apontaram envolvimento dos genes fetais (Thornton e Onwude, 1991;

Thornton e Macdonald, 1999; Treolar et al., 2001), interação entre os genes maternos e

fetais (Cooper e Liston, 1979; Liston e Kilpatrick, 1991) ou influência dos genes paternos

(Esplin et al., 2001). Ainda, em recente estudo, em que a recorrência de PE entre as

gerações foi investigada, confirmou-se que tanto os fatores maternos quanto paternos

contribuem para o risco de PE. Além disso, o estudo acrescentou que o risco é maior pelos

genes maternos, presumivelmente porque as mães carreiam a suscetibilidade e também por

transimitirem fatores de risco genéticos independentes para seus fetos. O risco paterno é

menor porque os pais trasmitem apenas fatores genéticos de risco ao feto (Skjaerven et al.,

2005). A elucidação genética da PE a nível molecular e o encontro de genes candidatos ao

desenvolvimento desta doença tem se mostrado um desafio. A maioria das investigações

tem sido de polimorfismos e mutações de genes de suscetibilidade materna em estudos de

associação casos e controles. Os genes candidatos são muitos e os estudos mostram

resultados conflitantes (Lachmeijer et al., 2002, Morrison et al., 2002, GOPEC

Consortium, 2005). Ainda, esses estudos estão restritos às populações dos Estados Unidos

da América, Europa e Ásia. Até o presente momento, não encontramos publicações

completas relacionadas à população brasileira, referentes aos polimorfismos que

estudamos. Para desenvolver o presente estudo foram selecionados, por estarem

relacionados com a fisiopatologia da PE, alguns sistemas, tais como: genes envolvidos com

a hemostasia e estresse oxidativo. Será desenvolvido, a seguir, as razões pelas quais estes

sistemas foram escolhidos, bem como a descrição dos polimorfismos.

1.5.1. Genes Candidatos Ligados a Hemostasia

Polimorfismos em vários genes pró-trombóticos têm sido associados com trombose

venosa e/ou com a doença arterial: polimorfismo do gene da

metilenotetrahidrofolatoredutase (MTHFR C677T), polimorfismo do gene do Fator V

Leiden (FVL), mutação do gene da Protrombina G20210A, polimorfismo do gene do

Inibidor da Ativação do Plasminogênio –1 4G/5G.

A gestação por si é um estado de hipercoagulabilidade (Lockwood, 1999;

Kupferminc, 2005) e complicações obstétricas, incluindo a PE, podem envolver perfusão

placentária diminuída. Doenças trombofílicas aumentam o risco de trombose venosa

durante a gestação e podem predispor a complicações vasculares neste período (Kujovich,

2004). Além disso, é descrito que a PE e a E são estados que apresentam alterações na

coagulação, evidenciado por se ter um aumento na formação de fibrina, na ativação do

sistema fibrinolítico e plaquetário e, ainda, de diminuição da contagem de plaquetas (Perry

e Martin, 1992).

A ação da trombofilia, a tendência à trombose tem sido estudadas e essas têm sido

ligadas a muitos aspectos da gestação. Recentemente, tem sido determinado que

complicações graves, como a PE, podem estar associadas com trombofilias. Por isto, é

possível que estes polimorfismos pró-trombóticos possam predispor ao desenvolvimento

de PE. Além disso, também é possível que a progressão da gravidade da PE possa ser, em

parte, determinada pela presença desses polimorfismos citados (Kupferminc, 2005;

Kujovich, 2004).

Polimorfismo do gene do MTHFR C677T

O gene da MTHFR tem 77 kb com 11 éxons e 10 íntrons, e está localizado no braço

curto do cromossoma 1 região 36 (1p36) (Frosst et al., 1995). A mutação do tipo missense

no gene da metilenotetrahidrofolato redutase promove a subistituição do nucleotídeo

citosina por timina (C →T no nucleotídeo 677, exon 4) e resulta em redução da síntese de

5, metilenotetrahidrofolato, doador de metil na conversão de homocisteína para metionina,

levando ao aumento dos níveis de homocisteína que, por sua vez, está relacionado com

dano vascular (McCully, 1996) e é fator de risco para trombose venosa e arterial (Frosst et

al.,1995; Kluijtmans et al., 1996). Hiperhomocisteínemia tem sido descrita em pacientes

com PE (Dekker et al., 1995; Raikovic et al., 1997). Estudo realizado em Los Angeles

(EUA) refere que o genótipo TT foi mais freqüente em hispânicos (15,2%), quando

comparados a brancos (10,2%), asiáticos (8,2%) e negros (2,4%) (Levine et al., 2000) em

pacientes com adenoma de colo-retal. Estudos feitos em Israel (Kupferminc et al., 1999;

Kupferminc et al., 2000a), no Japão (Sohda et al., 1997) e na Itália (Grandone et al., 1997)

mostraram associação dos genótipo TT com aumento significativo de risco de PE. Em

contraste, estudos realizados nos EUA (Powers et al., 1999; Livingston et al., 2001; Kim et

al., 2001b), Austrália (Kaiser et al., 2000), Grã-Bretanha (O’Shaughnessy et al., 1999),

Finlândia (O’Shaughnessy et al., 1999; Laivuori et al., 2000), Países Baixos (Lachmeijer et

al., 2001) não mostraram uma associação entre a mutação C677T com PE em amostras

maternas (Powers et al., 1999, Kaiser et al., 2000, Kim et al., 2001b) ou fetais (Livingston

et al., 2001).

Polimorfismo do gene do Fator V Leiden – FVL e o Polimorfismo do gene da

Protrombina G20210A

O fator V (fV) é uma glicoproteína de 330 kDa, sintetizada nos hepatócitos e

megacariócitos, podendo ser encontrado no plasma e grânulos plaquetários. O gene do FV

localiza-se no cromossomo 1, apresenta 80 kb de comprimento e está organizado em 25

éxons. O FV é ativado pela trombina e atua como cofator na ativação da protrombina pelo

fator X (Tuddenham e Cooper, 1994).

A proteína C ativada (APC) é uma glicoproteína que inibe fisiologicamente o FV

através da clivagem específica dos resíduos Arg 306, Arg 506 e Arg 679; além disso, a

APC age sobre o sistema fibrinolítico, inativando os inibidores desse sistema. Uma

mutação no gene do FV (conhecida como fator V Leiden - FVL), uma troca de base G/A

no nucleotídeo 1691 (G1691A), causa a substituição de uma arginina por uma glutamina

na posição 506 da proteína. Essa mutação faz com que o FV seja resistente à ação da

proteína C ativada, não sendo apropriadamente inativado (Bertina et al., 1994). Até 1993,

somente 5 a 20% dos pacientes com trombose idiopática apresentavam trombofilias

hereditárias. A partir dessa data, com a descoberta do controle genético da resistência do

fator V à APC, essa situação mudou consideravelmente.

O FVL é a causa genética mais comum para trombose venosa entre causasóides

(Burick et al., 1997). A prevalência da mutação varia de 2 a 15% em diferentes populações

mundiais (Jeffery et al., 1996; Lee et al., 1996; Gregg et al.,1997; Tamim et al., 2002). A

mutação FVL em brasileiros causasóides apresentou uma distribuição similar a de outros

trabalhos, ocorrendo em cerca de 20% de pacientes com trombose venosa e em cerca de 3-

5% de indivíduos da população em geral (Arruda et al; 1995).

Diversos trabalhos demonstraram uma associação significativa entre a mutação FVL

e a incidência de trombose venosa e tromboembolismo (Beauchamp et al., 1994; Svensson

et al., 1997; Simioni et al., 1997; Boundel et al., 2002). A presença da mutação fV Leiden

tem sido associada com a ocorrência de trombose venosa nas gestações (Hellgren et al.,

1995; Hallak et al., 1997; Murphy et al., 2000). Segundo Dahlback et al., (1994) a mutação

FVL está associada com mais de 60% das complicações tromboembólicas ocorridas

durante a gestação.

A protrombina (F II) é uma glicoproteína de 72 kDa sintetizada no sangue em sua

fora inativa. O gene da protrombina localiza–se no cromossomo 11, apresenta 21 kb e está

organizado em 14 éxons. A protrombina é o precursor da trombina, a enzima responsável

pela etapa final da cascata da coagulação. A protrombina é ativada pelo fator X, na

presença do fator V. A ativação da protrombina se dá através da clivagem dos resíduos Arg

271 e Arg 320 (Tuddenham e Cooper, 1994).

A trombina é uma enzima extremamente importante nos processos de hemostasia e

trombose, exibindo atividade procoagulantes, anticoagulantes e antifibrinolíticas. A

trombina também ativa diversas respostas celulares, que são essenciais no processo atero-

trombótico (Maraganore, 1993).

O polimorfismo G20210A, localizado na região 3’ não-traduzida do gene da

protrombina, foi descrito associado à trombose venosa (Poort et al., 1996). Indivíduos

portadores do alelo 20210A apresentariam níveis de protrombina cerca de 20% mais

elevados. Diversos estudos têm confirmado a associação do alelo 20210A com trombose

venosa (Arruda et al., 1997; Brown et al., 1997; Corral et al., 1997; Cumming et al., 1997;

Ferraresi et al., 1997; Hillarp et al., 1997; Howard et al., 1997; Kapur et al., 1997; Bloem

et al., 1998; Bucciarelli et al., 1998), entretanto, em relação a trombose arterial, os

resultados permanecem controversos.

A freqüência da mutação da protrombina em caucasóides é de aproximadamente

2%, elevações na prevalência dessa variante foram descritas no sul da Europa em

comparação ao norte europeu (Rosendaal et al., 1998). Aparentemente, a freqüência da

variante G20210A é muito rara em populações não-caucasóides (Dilley et al., 1998;

Rosendaal et al., 1998; Mathonnet et al., 2002), não podendo portanto ser considerada com

um fator de risco cardiovascular preditivo nessas populações. Franco et al (1998)

verificaram que a freqüência do alelo 20210A é extremamente baixa em populações

brasileiras não-caucasóides.

As placentas infartadas com tromboses são características comuns em placentas de

mulheres com PE (Morgan et al., 1999), por isto a mutação do fator V Leiden e da

protrombina são genes candidatos à susceptibilidade à PE. Entretanto os resultados dos

estudos são contraditórios, provavelmente pela diferença entre as populações estudadas,

tipo de estudo e, também, pela diferença na classificação dos DHGs (Morrisson et al.,

2002; Ament, 2003; Kupferminc, 2005). Dados da literatura sugerem que principalmente a

forma grave de PE pode estar associada à mutação do fV Leiden (Kupferminc, 2005).

Polimorfismo do gene do Inibidor da ativação do plasminogênio –1 4G/5G

O inibidor tipo 1 ativador do plasminogênio (PAI-1) é uma glicoproteína de 50 kDa,

sintetizada no fígado e células endoteliais, que circula no sangue na sua forma inativa. O

gene que codifica o PAI-1 localiza-se no cromossomo 7 e apresenta 9 éxons. O PAI-1 é

uma proteína de fase aguda e o principal inibidor do t-PA (ativador tissular do

plasminogênio) e u-PA (ativador do plasminogênio tipo uroquinase) do sistema

fibrinolítico. Os níveis plasmáticos de PAI-1 são de arpoximadamente 0,05 mg/L

(Tuddenham e Cooper, 1994).

Os níveis de PAI-1 são regulados por citocinas, lipopolissacarídeos, hormônios,

VLDL-colesterol e insulina (Green e Humphries, 1994). Idade, tabagismo, ingestão de

álcool e dieta também podem aumentar os níveis de PAI-1 (de Maat et al., 1996). Como o

PAI-1 é o principal inibidor do sistema fibrinolítico, elevados níveis plasmáticos poderiam

ter um efeito protrombótico. Hamsten et al. (1985) e Hamsten et al. (1987) observaram

uma associação positiva entre altos níveis de PAI-1 e o risco de infarto, inclusive

recorrente. No entanto, Folsom et al. (1998) não observaram diferenças significativas nas

concentrações de PAI-1 em um estudo de famílias com alta incidência de doença

aterosclerótica coronariana, quando comparadas às famílias em geral.

Já foram descritos diversos polimorfismos de DNA no gene do PAI-1, que parecem

estar associados às concentrações plasmáticas desse inibidor; o polimorfismo de

inserção/deleção (4G/5G), localizado na posição –675 da região promotora do gene, é o

mais investigado. O alelo de deleção (4G) estaria associado aos níveis mais elevados de

PAI-1 (Margaglione et al., 1997; Margaglione et al., 1998)

O polimorfismo de inserção/deleção (4G ou 5G) na região promotora do gene do

PAI-1 está envolvido na regulação da síntese deste inibidor (alelo 4G), estando associado

com aumento da expressão do gene e de níveis plasmáticos de PAI-1. Glueck et al. (2001)

investigaram este polimorfismo como um possível fator de contribuição para complicações

obstétricas, incluíndo pacientes com PE grave, e verificaram que mulheres com

complicações obstétricas apresentaram maior freqüência do genótipo 4G/4G. Yamada et

al. (2000) e Fabbro et al. (2003), encontraram associação entre o polimorfismo 4G/5G do

gene do PAI-1 e PE. Entretanto, este resultado não foi encontrado em outros estudos

(Morrisson et al., 2002, Pegoraro et al., 2003, de Maat et al., 2004).

Vários grupos têm estudado as possíveis relações entre os genes referidos

anteriormente e os DHG, entretanto os resultados são conflitantes. A Tabela 3 apresenta

resultados obtidos por diferentes autores das relações entre 3 mutações pró-coagulantes

(FVL, MTHFR, Protrombina) e DHG. É importante observar que:

(1) Vários destes estudos estão restritos a somente 1 ou dois polimorfismos

pró-trombóticos (Dizon-Townson et al., 1996; Grandone et al., 1997;

Lindoff et al., 1997; Mimuro et al., 1998., Nagy et al., 1998; van Pampus

et al., 1999; Murphy et al., 2000; Higgins et al., 2000; Zusterzeel et al.,

2000; Rigo et al., 2000) e a investigação do possível efeito sinérgico destes

polimorfismos não pode ser, portanto, investigada.

(2) A definição de PE e a seleção dos controles também têm sido variada entre

estes estudos (Dizon-Townson et al., 1996; Grandone et al., 1997; Lindoff

et al., 1997; Nagy et al.,1998; Mimuro et al., 1998; Kupferminc et al.,

1999; Grandone et al., 1999; Higgins et al., 2000; Murphy et al., 2000;

Zusterzeel et al., 2000; Rigo et al., 2000; Kupferminc et al., 2000a).

(3) Alguns estudos têm um pequeno número de casos estudados e controles

(Lindoff et al., 1997; Shoda et al., 1997; Mimuro et al., 1998, Nagy et al.,

1998.,Von Templehoff et al., 2000., Kupferminc et al., 2000a., Dávalos et

al., 2005), além de outros que não constam na Tabela 3 (D’Elia et al.,

2002, Fabbro et al., 2003).

As razões acima descritas, além das diferentes populações estudadas, podem

explicar, pelo menos em parte, os resultados controversos. A ausência de estudos na

população brasileira sobre este tema nos levou a propor este trabalho a fim de auxiliar e

contribuir para a elucidação do papel destes polimorfismos acima citados e a PE.

Tabela 3. Estudos caso-controle de fatores de risco genéticos pró-trombóticos em

hipertensões gestacionais com ou sem proteinúria

Autor

N (casos)

FVL*

RC (95%IC)**

MTHFR

C677T*

RC (95%IC)**

Protrombina

G2021A*

RC (95%IC)**

Van Pampus et al., 1999 345 (284 PE) 4,2

(0,55-32,15)

- -

Kupferminc et al., 1999 110 (34 PEG) 5,3

(1,8-15,60)

2,9

(1,0-8,5)

2,2

(0,4-13,9)

Kupferminc et al., 2000a 63 4,61

(1,83-11,58)

2,97

(1,29-6,81)

2,63

(0,68-10,16)

Nagy et al., 1998 69 4,26

(1,15-15,76)

- -

Grandone et al., 1997 96 4,9

(1,3-18,3)

1,8

(1,0-3,5)

Grandone et al., 1999 70 PE + 70DHG PE 3,2

(0,78-13,14)

DHG 5,96

(1,69-21,0)

PE 2,0

(1,06-3,76)

DHG 1,27

(0,64-2,53)

PE 3,83

(1,49-9,87)

DHG 2,16

(0,74-6,29)

Lindoff et al.,1997 50 1,98

(0,61-6,38)

- -

Von Templehoff et al.,

2000

61 PE 5,0

(1,4-18,5)

PE + HELLP

4,73

(1,26-17,74)

- -

Livingston et al., 2001 110 1,8

(0,44-7,43)

1,3

(0,46-3,44)

Mimuro et al.,1998 50 12,96

(1,41-118,84)

Powers et al., 1999 99 PE + 24HG PE 1,28 (0,58-

2,79)

DHG 1,43

(0,43-4,79)

Kaiser et al., 2001 40E + 116PE 0,71

(0,39-1,90)

Kobashi et al., 2000 101 DHG (73

PE)

PE 0,68 (0,30-

1,55)

DHG 0,71

(0,37-1,51)

Sohda et al., 1997 67 2,5

(1,3-48,00)

Kupferminc et al., 2000b 55 PEG + 25

PEL

PEG 3,02

(0,84-10,9)

PEL 2,9

(0,48-14,3)

O’Saughnessy et al., 1999 283 0,88

(0,33-2,33)

0,90

(0,44-1,83)

De Groot et al., 1999 163 1,07

(0,51-2,25)

0,83 (0,25-

2,77)

Rigo et al., 2000 120 7,33

(2,13-25,30)

1,13

(0,38-3,37)

Dizon–Townson et al.,

1996

158 2,21

(1,06-4,59)

Kim et al., 2001b 281 1,28

(0,59-2,80)

1,03

(0,64-1,69)

Zusterzeel et al., 2000 95 HELLP+ 85

sem HELLP

1,38

(0,78-2,44)

Lachmeijer et al., 2001 47 PE + 127 PE

familiar

0,92

(0,28-3,1) 0,85

(0,35-2,1)

Laivouri et al., 2000 113 0,5

(0,14-1,77)

Kaiser et al., 2000 33 E + 114 PE 0,71

(0,33-1,57)

Higgins et al., 2000 44 E +145 PE 1,53

(0,33-7,01)

Dávalos et al., 2005 33 PE + E 0.98

(0,94-1,03)

0.97

(0,75-1,24)

* FVL= Mutação Fator V Leiden do gene do Fator V, MTHFR = Polimorfismo C677T

do gene do MTHFR, Mutação G20210A do gene da Protrombina.

E = Eclâmpsia, PE = pré-eclâmpsia, PEG = pré-eclâmpsia grave, PEL = pré-eclâmpsia

leve.

** Razão de chances (RC) 95% Intervalo de confiança (95%IC).

1.5.2 Gene candidato para o DHG ligado ao estresse oxidativo

Polimorfismos envolvendo gene do Óxido Nítrico Sintetase (eNOS)

O óxido nítrico (ON) é um metabólito da L-arginina, sintetizado pela ação da enzima

óxido nítrico sintase (NOS, do inglês: nitric oxide synthase) (Moncada e Higgs, 1993). A

NOS tem três isoformas (Lowestein, 1994): endotelial (eNOS ou NOS3), induzível (iNOS

ou NOS2) e neuronal (nNOS ou NOS1). É um vasodilatador com propriedades

antitrombóticas e ateroprotetoras (Hogg et al., 1993; Garg et al., 1989; Kubes et al., 1991;

Sarkar et al., 1996; Radomski et al., 1987) e atua inibindo a contração do músculo liso e a

agregação plaquetária.

O ON aumentado no tecido placentário durante a gestação normal, contribui para a

vasodilatação, remodelamento vascular e inibição da agregação plaquetária (Forstermann,

1994; Sladek et al; 1997). Além disso, contribui para o sistema de vasodilatação materna,

regula o fluxo uterino e feto-placentário (Sladek et al., 1997). Entretanto, a atividade da

NOS parece estar diminuída em placenta de mulheres com PE (Brennecke et al., 1997).

Sua deficiência têm sido implicada na patogênese da HAS, aterosclerose e PE (Celermajer

et al., 1992, Cayatte et al., 1994; Celermajer et al., 1994; Seligman et al., 1994; Cockell et

al., 1997; Forte et al., 1997).

O gene da eNOS tem 21kb com 26 éxons e 25 íntrons, localizados no braço longo do

cromossoma 7 região 35-36 (7q35-36) (Nadaud et al., 1994) e codifica uma proteína

altamente conservada entre várias espécies de mamíferos (Li et al., 2002). Foi sugerido que

polimorfismos no gene da eNOS podem alterar os níveis ou a atividade desta enzima,

levando à redução ou ao excesso de produção de ON, podendo contribuir para vários

processos patológicos (Förstermann et al., 1998; Hingorani, 2000; Wang e Wang, 2000).

Entre os diversos polimorfismos descritos no gene da eNOS, três se destacam: uma

substituição de base no exon 7 (Glu298Asp), que leva a uma troca de aminoácido na

posição 298 da proteína (E298D) (Hingorani, 2000; Wang e Wang, 2000), uma repetição

de 27pb no intron 4 (intron-4) e uma substituição de base na região promotora (–

786T→C). Estes polimorfismos têm sido investigados em diversas populações em relação

à DAC, à hipertensão e ao IAM, mas os resultados obtidos são inconsistentes (Wang e

Wang, 2000). Estudos funcionais têm demonstrado que o alelo –786C reduz a atividade do

promotor da eNOS em até 50% (Nakayama et al., 1999; Miyamoto et al., 2000).

Polimorfismos Glu298Asp , intron-4 e –786T→C no DHG

Polimorfismo Glu298Asp

Este polimorfismo tem sido associado com o desenvolvimento de desordens nas

quais a vasodilatação do endotélio e a bioatividade do ON estão prejudicadas (Miyamoto et

al., 1998; Shimasaki et al., 1998; Yoshimura et al., 2000; Savvidou et al., 2001). Em

estudos realizados na população japonesa, a presença do alelo T foi mais freqüente entre

gestantes com DHG (Kobashi et al., 2001) e em pacientes com PE grave (Yoshimira et al.,

2000) quando comparado com gestantes normotensas. Além disso, foi também associado,

com DPP (Yoshimira et al., 2001). Hakli et al. (2003) observaram, em pacientes da

população do oeste da Finlândia, significância marginal, sugerindo que outro(s)

polimorfismo(s) devam estar associados à PE. Entretanto, estes resultados não foram

confirmados em outras populações (Yoshimira et al., 2003; Landau et al., 2004; Tempfer

et al., 2004).

Polimorfismo intron-4

Caracteriza-se pela repetição de uma seqüência consenso de 27 bp. Essa variante

genética está relacionada com as diferenças nos níveis plasmáticos de ON (Wang et al.,

1997; Tsukada et al., 1998). Tanto a incidência quanto a severidade da PE foram

associadas à presença do alelo A em pacientes estudadas por Tempfer et al. (2001). Em

estudo que comparou a freqüência dos alelos entre gestantes nos EUA com PE e gestantes

sem esta complicação, constatou-se que as pacientes com alelo A apresentavam níveis

pressóricos maiores no começo da gestação do que as gestantes controles (Bashford et al.,

2001). Por outro lado, em estudo realizado na população chinesa, Zhou et al. (2003) não

encontrou associação quando investigou pacientes com PE comparando-as com gestantes

normais.

Polimorfismo –786T→C

A variação T/C na posição 786 suprime a transcrição do gene eNOS, mostrando uma

redução maior que 50% na atividade do promotor (Nakayama et al., 1999; Miyamoto et

al., 2000). Somente dois estudos avaliaram possível associação entre PE e este

polimorfismo: Serrano et al. (2004) observaram através de estudo, na população

Colombiana, com análise de haplótipos (destes três polimorfismos citados) que há

associação com a amostra de pacientes com PE quando comparadas a gestantes com níveis

pressóricos normais. Além disso, Tempfer et al. (2004) encontraram que os níveis de

eNOS estão associados com o desenvolvimento e o curso clínico da PE.

Considerando esses dados, é de fundamental importância a identificação dos fatores

de risco relacionados ao desenvolvimento da hipertensão na gravidez, já que a intervenção

precoce nas pacientes em risco poderia contribuir para evitar o surgimento e a progressão

da patologia, diminuindo, assim, o risco de morbi-mortalidade materna e perinatal. O

estudo de genes candidatos poderá permitir que a identificação de pacientes em risco possa

ser realizada, tornando viável abordagens preventivas com detecção e tratamento precoces,

fatores esses importantes para o sucesso do tratamento de DHG. O presente trabalho

estudou as relações entre essas variantes moleculares e à PE na população brasileira.

OBJETIVOS

CAPÍTULO II

2. OBJETIVOS

Os DHG, especialmente a PE e suas complicações, representam uma questão de

saúde pública de grande impacto ao nível mundial, sobretudo nos países em

desenvolvimento por representarem a principal causa de morte materna e fetal.

Os objetivos do presente estudo de caso-controle podem ser resumidos como segue:

ª Objetivo geral: investigar o papel de polimorfismos de DNA relacionados à hemostasia

e ao estresse oxidativo na patogênese da PE.

ª Objetivos específicos:

(1) Identificar os fatores de risco maternos nas pacientes com DHG em nossa

população.

(2) Analisar a associação entre os polimorfismos C677T do gene da MTHFR,

FVL do gene do FV, G20210A do gene da protrombina, 4G/5G do gene do PAI-1 e a

ocorrência e/ou severidade da PE em gestantes com essa complicação quando

comparadas à gestantes normotensas.

(3) Analisar a associação dos polimorfismos Glu298Asp, intron-4 e –786T→C

do gene da óxido nítrico sintetase endotelial e a ocorrência e/ou severidade da PE em

gestantes com essa complicação quando comparadas à gestantes normotensas.

(4) Analisar a associação através dos haplótipos dos polimorfismos Glu298Asp,

intron-4 e –786T→C do gene da óxido nítrico sintetase endotelial e a ocorrência e/ou

severidade da PE em gestantes com essa complicação quando comparadas à gestantes

normotensas.

“

”

CAPÍTULO III

Manuscrito a ser submetido ao periódico Revista

Brasileira de Saúde Pública (2006)

Risk factors for hypertensive disorders in pregnancy in Southern Brazil

Fatores de risco para os distúrbios hipertensivos da gestação no Sul do

Brasil

Caroline Abrão Dalmáz

a,b

, Kátia Gonçalves dos Santos

, Citânia Lúcia

Tedoldi

, Israel Roisenberg

Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,

Centro

Universitário La Salle,

Hospital Nossa Senhora da Conceição, Porto Alegre, RS,

Brasil

Correspondence to: I. Roisenberg, Departamento de Genética, Instituto de

Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Caixa Postal 15053,

91.501-970 Porto Alegre, RS, Brazil. Tel: + 55 51 3316 6728; fax + 55 51 3316

7311; e-mail: [email protected]

Risk factors for hypertensive disorders in pregnancy

ABSTRACT

OBJECTIVE: The aim of this study was to identify the frequency of risk factors for

hypertensive disorders in pregnancy in Southern Brazil.

METHODS: A prospective study was designed and 330 women were included.

They were divided in two groups: 161 patients with hypertensive disorders and

169 control subjects matched by age and ethnicity. The frequencies of the risk

factors were compared between groups by Fisher’s exact test, Chi-square and

Student t tests. A multivariate logistic regression was performed to assess the

independent role of clinical, social and demographic variables, which were

significantly associated with occurrence of the hypertensive disease in pregnancy

in the univariate analysis.

RESULTS: We found 73% of Caucasians and the mean age was 29.1 years (13–

48 years). In the multivariate analysis, the variables significantly associated with

hypertensive disease in pregnancy were the following: presence of family history

of preeclampsia (p=0.02;OR=7.05;95%CI=1.99-24.92), presence of diabetes

p<0.01;OR=3.87;95%CI=1.22–12.27) and occurrence of chronic hypertension

(p=0.02; OR=1.70;95%CI=0.54-5.32).

CONCLUSIONS: The risk factors associated with hypertensive disorders in

pregnancy appear to be similar to those reported in other countries and our results

reflect behavioral factors whereby women may be predisposed to an increased

risk of preeclampsia, thus the knowledge of the risk factors could be helpful in a

prenatal care.

KEYWORDS: Hypertensive disorders in pregnancy. Risk factors. Brazil.

RESUMO

OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi identificar a freqüência dos fatores de

risco nas distúrbios hipertensivos da gestação no Sul do Brasil.

MÉTODOS: Estudo prospectivo em que 330 mulheres foram incluídas. Elas foram

divididas em dois grupos: 161 pacientes com distúrbios hipertensivos da gestação

e 169 controles pareadas por idade e etnia. A freqüência dos fatores de risco foi

comparada entre os dois grupos através dos testes estatísticos: teste exato de

Fisher, Qui-quadrado e teste t Student. A análise de regressão multivariada foi

realizada para estimar as variáveis clínicas, sociais e demográficas que foram

associadas com a ocorrência de distúrbios hipertensivos da gestação na análise

univariada.

RESULTADOS: O grupo das pacientes foi composto de 73% de mulheres

Caucasianas e a média de idade foi de 29,1 anos (13-48 anos). Na análise

multivariada, as variáveis significantemente associadas com as distúrbios

hipertensivos da gestação foram: história familiar de preeclampsia

(p=0,02;OR=7,05;95%IC=1,99-24,92), diabetes (p<0,01;OR=3,87;95%IC=1,22-

12,27) e hipertensão crônica (p=0,02;OR=1,70;95%IC=0,54-5,32).

CONCLUSÕES: Em conclusão, os fatores de risco associados aos distúrbios

hipertensivos da gestação são similares aos descritos em outros países e o

conhecimento desses fatores de risco de nossa população pode auxiliar nas

condutas do pré-natal.

DESCRITORES: Distúrbios hipertensivos da gestação. Fatores de risco.

Brasil.

INTRODUCTION

The hypertensive disorders of pregnancy affect up to 8% of all gestations and are

the second leading cause, after embolism, of maternal mortality in United States,

accounting for almost 15% of such deaths.

20,2

Expectant mothers with

hypertension are predisposed toward the development of potentially lethal

complications, mainly abruptio placentae, disseminated intravascular coagulation,

cerebral hemorrhage, hepatic failure, and acute renal failure.

The causes of most cases of hypertension during pregnancy, particularly

preeclampsia, remains unknown and is one of the major obstetrical problems in

less-developed countries.

The obstetricians are attempting to recognize and

diagnose early this complication. However, biophysical and biochemical tests have

been suggested to identify women who are at increased risk future development of

this complication. Unfortunately, some of these tests are invasive whereas others

require expensive techniques or special expertise that preclude their utility in

routine screening.

8,9

In addition, the results of the pooled data for the various tests

studied suggest that many of them have poor sensitivity and poor predictive

value.

8,9

Several risk factors have been described as predisponent to hypertensive

disorders in pregnancy worldwide, such as: family history of preeclampsia,

preeclampsia in a previous pregnancy,

4,15

multifetal gestation,

4,23,25

obesity,

nulliparity,

diabetes,

chronic hypertension,

and extremes of maternal age.

The knowledge of the most important risk factors in our population could be useful

to identify the patients who have higher chances to develop the hypertensive

disorders, and, subsequently, adequate prenatal care could contribute to decrease

this mortality ratio.

Reports designed to identify risk factors for hypertensive disorders of pregnancy in

our country are scarce.

Therefore, the aim of the present study was to identify

the frequency of risk factors for hypertensive disorders in Southern Brazil.

METHODS

A prospective study was developed considering 161 patients with hypertensive

disorders and 169 control subjects matched by age and ethnicity. Subjects were

recruited in the Maternity of a tertiary public hospital in Southern Brazil (Hospital

Nossa Senhora Conceição) and we classified the hypertensive disorders in

pregnancy accordinig to the proposal of the ACOG.

At enrollment, a standardized

questionnaire provided informations on age, weight, height, schooling (divided by

levels and if completed or not), ethnicity, smoking habits, and known risk factors

for hypertension in pregnancy. Body mass index (BMI) was calculated considering

the values of weight and height obtained at the first appointment, and results were

described as mean BMI. All subjects gave their written informed consent to be

included in the study, and protocol was approved by the ethics committee of

Grupo Hospitalar Conceição and by the National Research Committee of Ethics.

The frequencies of risk factors were compared between groups by Fisher’s exact

test, Chi-square and Student t tests. A multivariate logistic regression analysis was

performed by a backward procedure to assess the independent role of clinical,

social and demographic variables, which were significantly associated with

hypertensive disease in pregnancy in the univariate analysis, using the SPSS

package. The variables tested in the univariate analysis included the family and

the previous history of preeclampsia, obesity, nulliparity, diabetes, chronic

hypertension, smoking habits, schooling, multifetal gestation and extremes of

maternal age. The continuous variable (BMI) was entered as linear factor after

being tested for nonlinearity, using the SPSS package. The P–values <0.05 were

considered statistically significant.

RESULTS

We found 73% of Caucasians and the mean age was 29.1 years (13–48

years). The frequency of hypertensive disorders complicating pregnancy was 58

mild preeclampsia (36.02%), 51 severe preeclampsia (31.68%), 3 eclampsia

(1.86%), 7 gestational hypertension (4.34%), and 42 chronic hypertension with

preeclampsia superimposed (26.10%).

Table 1 shows demographic and studied risk factors for hypertensive disorders:

the family history of PE, previous PE history, high BMI (overweight and obesity),

diabetes, and chronic hypertension were demonstrated to be more frequent in

hypertensive disorders in pregnancy when compared to normotensive women;

also, schooling and prenatal presented marginal significance. Regarding

nulliparity, multifetal gestation (even so higher in the patients group), extremes of

maternal age and smoking habits, there were no significant differences between

patients and controls.

Table 2 provides the characteristics of women with hypertensive disorders in

pregnancy compared to normotensive women (univariate analysis). The family and

previous history of preeclampsia, high BMI, diabetes, chronic hypertension,

schooling and prenatal were significantly associated with hypertensive disease in

pregnancy while multifetal gestation, nulliparity, extremes of maternal age and

smoking habits were not associated with this disorder.

In the multivariate analysis, the following variables remained statistically

significant: family history of preeclampsia, diabetes, and chronic hypertension

(Table 3).

DISCUSSION

The causes of hypertensive diseases in pregnancy are still uncertain, thus the

effective primary prevention is not available in this stage.

However, several risk

factors have been identified and modification of some of these risk factors might

result in the decreasing of its frequency.

The frequency of eclampsia and chronic hypertension with superimposed

preeclampsia are according to other reports that investigated women with

hypertensive diseases in pregnancy in a Brazilian population.

12,16

In our data, family history of preeclampsia, previous preeclampsia history, high

BMI, nulliparity, diabetes, and chronic hypertension were significantly more

frequent in patients when compared to the control group. In addition, schooling

was less frequent in cases than in controls. Our results are similar to other studies

in different populations analyzed.

13,19,22

Results of multivariate analysis showed that family history of preeclampsia,

diabetes and chronic hypertension are independent risk factors for hypertensive

diseases in pregnancy.

The family and the previous history of preeclampsia increased the risk for this

complication in our patients. These data have been reported in other studies.

Indeed, the genetic component in pathophysiological abnormalities of

preeclampsia has been suggested,

3,5

preeclampsia was reported to be more

common in daughters of preeclamptic women

and in pregnancies fathered by

sons of preeclamptic women;

this data suggest the involvement of both maternal

and fetal genes in the syndrome. Pregnant women with this history should be

carefully monitored in the prenatal care and postpartum.

To our knowledge, this is

the first study which reported this association in Brazil, and is in agreement with

other reports that investigated this risk factor in a different populations in the

world.

19,22

High BMI was prevalent in both groups being even more frequent in hypertensive

women, and is a definite risk factor for developing pregnancy-induced

hypertensive disorders, including preeclampsia.

Risk increases with greater body

mass index,

8,18

and the possible explanation is the increased shear stress due to

hyperdynamic circulation associated with obesity.

The worldwide increase in

obesity is likely to raise the frequency of preeclampsia.

Our result is in agreement

with other Brazilian reports published: Nucci et al (2001) who showed that

overweight nutritional status (obesity and pre-obesity) was associated with an

increased risk for preeclampsia

and Gaio et al (2001) who identified obesity as a

risk factor for preeclampsia/eclampsia and chronic hypertension.

Actions in

public health could prevent and/or treat obesity and, consequently, could prevent

hypertensive disorders.

In regard to diabetes, Schmidt et al (2001) confirmed that gestational diabetes

mellitus is independently associated with preeclampsia in Brazilian women

and,

preexisting diabetes mellitus, is also a risk factor for preeclampsia.

Women with

preexisting chronic hypertension also have an increased risk of preeclampsia.

23,25

In the present study, we found that diabetes and preexisting chronic hypertension

were risk factors for preeclampsia in our population, thus actions in the public

health to prevent these diseases is so important to also prevent preeclampsia.

On the other hand, there were no significant differences in multifetal gestation,

nulliparity, extremes of maternal age and smoking habits described in some

reports as risk factors.

10,14,19,22

Multiple pregnancy doubles the risk of

preeclampsia

; however, in our findings this association was not established.

Frequency of preeclampsia ranges between 2% and 7% in healthy nulliparous

women. Generally, preeclampsia is regarded as a disease of first pregnancy. Our

results are not in agreement with other reports even so the frequency is higher in

patients than in controls and this is well established as a risk factor.

Extremes of

maternal age were not demonstrated as a risk factor in our subjects, nevertheless

thus is established risk factor for preeclampsia.

A curious but consistent finding

is that women who smoke cigarettes have a lower risk of preeclampsia

than

women who do not smoke

, however, this benefit is cancelled out by the

substantial negative effect of smoking on fetal growth, risk of placental abruption,

and general health. In our findings we did not observe this “protective” effect.

Regardless of the indicator of social deprivation, we found that low educational

level was more frequent in group of patients, but the difference was not statistically

significant. Haelterman et al (2003) showed that the burden of preeclampsia is

concentrated in socially disadvantaged women, thus health services should be

more responsive to the specific needs of these women.

In our study, we found the protective effect of the prenatal care and its importance

cannot be refuted.

In conclusion, the present study confirmed that family and previous history of

preeclampsia, high BMI, diabetes and chronic hypertension are more frequent in

hypertensive disorders in pregnancy. Their frequencies appear to be similar to

those reported in North American

and European

women, and our results reflect

behavioral factors whereby women may be predisposed to increased risk of

preeclampsia.

The knowledge of important risk factors in our population could be useful to help

the clinician to detect pregnant women who will develop preeclampsia. Prevention

of hypertensive diseases in pregnancy would mean a huge step forward in

prenatal care and, assuming that effective prenatal is available, it may have

greater potential in the treatment of these diseases.

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Table 1 – The studied risk factors for hypertensive disorders in pregnancy

Characteristic

Hypertensive

disorders

n = 161

Control

n = 169

Family history of PE 41% 18% 0.004

Previous PE history 57% 7% <0.001

Multifetal gestation 6% 3% 0.53

BMI*

31.4±3.9 27.9±4.6 <0.001

Nulliparity 27% 22% 0.30

Diabetes 26% 6%

<0.001

Chronic hypertension 31% 5%

<0.001

Extremes of maternal age** 41% 33% 0.15

Smoking habit 19% 24% 0.39

Schooling 34% 55% 0.03

Prenatal 97% 89% 0.05

Data are presented as mean ± SD or %.

* Overweight, defined by BMI > Kg/m

and obesity, defined by BMI > 30 Kg/m

after adjustment for age.

** (<18 yo or >35 yo)

Table 2 - Characteristics of women with hypertensive disorders in pregnancy

compared to normotensive women (univariate analysis)

Characteristic

Odds ratio (95%CI)

Family history of PE 1.62 (1.07-2.47) 0.02

Previous PE history 1.16 (1.07-1.25) <0.001

Multifetal gestation 1.67 (0.54-5.32) 0.37

BMI* 1.19 (1.12-1.27)

<0.001

Nulliparity 1.35 (0.81-2.25) 0.25

Diabetes 5.55 (2.39-12.89)

<0.001

Chronic hypertension 8.17(3.69-18.06)

<0.001

Extremes of maternal age** 1.49 (0.91-2.44) 0.12

Smoking habit 0.76 (0.44-1.31) 0.32

Schooling 0.43 (0.21-0.87) 0.02

Prenatal 0.25 (0.09-.070) 0.008

* Overweight, defined by BMI > Kg/m

and obesity, defined by BMI > 30 Kg/m

after adjustment for age.

** (<18 yo or >35 yo)

Table 3 - Characteristics of women with hypertensive disorders in pregnancy

compared to normotensive women (multivariate analysis)

Characteristic

Odds ratio (95%CI)

Family history of PE 7.05 (1.99-24.92) 0.02

Diabetes 3.87 (1.22 –12.27) <0.001

Chronic hypertension 1.70 (0.54-5.31) 0.02

“

“RELATIONSHIP BETWEEN POLYMORPHISMS

IN THROMBOPHILIC GENES AND

PREECLAMPSIA IN A BRAZILIAN

POPULATION”

CAPÍTULO IV

Manuscrito aceito para publicação no periódico

Blood Cells, Molecules, and Diseases (2006)

Relationship between polymorphisms in thrombophilic genes and

preeclampsia in a Brazilian population

C.A. Dalmáz

a,b

, K.G. Santos

, M.R. Botton

, C.L.Tedoldi

, I. Roisenberg

Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

RS, Brasil

Centro Universitário La Salle, Canoas, RS, Brasil

Hospital Nossa Senhora da Conceição, Porto Alegre, RS, Brasil

* Corresponding author: Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Caixa Postal 15053, 91.501-970 Porto Alegre, RS, Brasil.

Tel: + 55 51 3316 6728; fax + 55 51 3316 7311; e-mail addresses: [email protected] (I.

Roisenberg), [email protected] (C.A. Dalmáz).

Relationship between polymorphisms in thrombophilic genes and preeclampsia

in a Brazilian population

The purpose of this study was to evaluate the thrombophilic genes in pregnant

women with and without preeclampsia independently or in combination. In a prospective

case-control study we investigated four polymorphisms in thrombophilic genes in 75

women with mild or severe preeclampsia and 145 women with normal pregnancy. The

genotype frequencies were assessed and the odds ratio (OR) calculated. When we analyzed

the polymorphisms independently and the development of preeclampsia no association was

observed [methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) 677TT genotype, OR 2.07, 95%

confidence interval (CI) 0.99-4.30; prothrombin mutation (F II) (GA or AA genotypes) OR

8.11, 95% CI 0.89-73.92; factor V Leiden (FV Leiden) OR 3.94, 95% CI 0.35-44.23;

plasminogen activator inhibitor (PAI-1) 4G/4G genotype, OR 1.63, 95% CI 0.87-3.05] not

even with severe preeclampsia subgroup analysis. However, when we investigated a

possible interaction among these polymorphisms on the development of the preeclampsia,

the OR for having one risk genotype, one or two genotype risk factors and two genotype

risk factors compared to those without genotype risk factors were 1.97 (95% CI 1.08-3.59),

2.21 (95% CI 1.25-3.92) and 4.27 (95% CI 1.3-13.9), respectively. In conclusion, in the

population analyzed, the presence of the genotype risk factors alone does not seem to be

associated with the development of preeclampsia even in the severe presentation form.

Nevertheless, a possible interaction among the MTHFR, F II, FV and PAI-1 gene

polymorphisms on the development of the preeclampsia was suggested.

Keywords: methylenetetrahydrofolate reductase, prothrombin, factor V Leiden,

plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1), preeclampsia.

Introduction

Preeclampsia, a pregnancy-specific syndrome clinically defined as elevated blood

pressure and proteinuria, remains an important cause of maternal and fetal morbidity and

mortality despite a intensive research [1,2].

Pregnancy itself represents a risk factor for a hypercoagulable state associated with

acquired changes in hemostatic factors [3], and a condition of hypercoagulation has been

described as a major factor in the pathogenesis of some obstetric pathologies, including

preeclampsia. The C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase

(MTHFR) gene, the G20210A mutation of prothrombin gene (F II), the G1691A mutation

of factor V (FV Leiden) and an insertion/deletion polymorphism (4G/5G) in the promoter

of the plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) gene, have been proposed as possible

risk factors for preeclampsia [4-6]. The genetic factors related to the thrombophilias above

mentioned appear to have different prevalences in the general population and several

studies are contradictory or failed to confirm a significant association with preeclampsia

underlying significant differences mainly in the ethnic background of studied patients [3-

6].

Furthermore, combinations of several thrombophilic polymorphisms confer a

higher risk of thrombosis when compared to the carriage of a single polymorphism. These

synergic effects might further increase the risk of preeclampsia, but most studies have

evaluated only one or two prothrombotic polymorphisms [4].

Therefore, the aim of this study was to investigate the existence of an association of

the homozygosity for C677T polymorphism of the MTHFR gene, expressed as the TT

genotype, the F II 20210A allele, FV Leiden and the polymorphism 4G/5G in the PAI-1

gene, expressed as the 4G/4G genotype, with preeclampsia in a group of women from

Southern Brazil independently or in combination.

Materials and methods

Preeclampsia population

The subjects were recruited in the reference Maternity of a tertiary public hospital

in Southern Brazil (Hospital Nossa Senhora Conceição) and we identified 75 cases of

preeclampsia in the High Risk Obstetrical Cardiology Clinic according to the criteria

proposed by American College of Obstetricians and Gynecologists [7]. Preeclampsia was

defined as the presence of hypertension associated with proteinuria after the 20

week of

gestation in women known to be normotensive beforehand. Hypertension was defined as a

blood pressure of at least 140 mmHg (systolic) and / or 90 mmHg (diastolic) on two

occasions of up to 4-6 h apart. The blood pressure was measured on the right arm, and with

the patient always in the seated position. Proteinuria was defined as urinary excretion of

300 mg or more of protein in 24 h. The preeclampsia was classified as severe when there

was a blood pressure ≥ 160/110 mmHg; or urinary protein excretion ≥5g per 24h; a platelet

count of <100 000mm

-3

in at least two samples; the combination of haemolysis, abnormal

liver enzymes associated with persistent epigastric or upper right quadrant pain; persistent

and severe symptoms as altered mental status, headaches, blurred vision or blindness;

presence of multiorgan involvement such as pulmonary edema, oliguria (<500mL per day)

according to previously published classifications [7]. The body mass index (BMI) was

calculated considering the values of weight and height obtained at the first appointment.

Control group

The 145 control subjects with uncomplicated pregnancies among in and out patients

of the same hospital were enrolled during the same period of the study and the inclusion

criteria of the controls were: no rise in blood pressure, no hypertension or proteinuria,

similar age (± 2 years), no biological relationship, and a delivery date as close as possible

to the delivery date(s) of the patient group and with a follow up for at least three months

after delivery.

All women who had chronic hypertension, renal disease, diabetes, collagen

vascular diseases, cancer or thrombosis were not included in the study.

All subjects participating in this study gave their written informed consent, and the

protocol was approved by the ethics committee of the Grupo Hospitalar Conceição and by

the National Research Committee of Ethics.

Genotype determination

DNA was isolated from whole blood using a non-enzymatic technique [8]. DNA

samples were genotyped by PCR using specific primers and conditions as those previously

described for the C677T polymorphism in the MTHFR gene [9], the G20210A

polymorphism in the F II gene [10], the G1691A polymorphism in the factor V gene [11],

and the 4G/5G polymorphism in the PAI-1 gene [12]. As previously reported, the PCR

products were subjected to digestion with the restriction enzymes HinfI for the

polymorphism in the MTHFR gene [9] and HindIII for polymorphisms in the F II [10], and

FV genes [11]. The digested fragments were subjected to polyacrylamide gel

electrophoresis containing ethidium bromide, and visualized under ultraviolet light. For the

PAI-1 polymorphism, the products of PCR were directly subjected to agarose gel

electrophoresis containing ethidium bromide, and visualized under ultraviolet light.

Statistical analysis

Student t test was employed for comparison of the quantitative variables between

the groups. Differences in proportions were tested by Fisher’s exact test or χ

test. Relative

risks were estimated by the odds ratio and P – values of < 0.05 were considered to be

significant. All confidence intervals were calculated at the 95% level and all statistical

analyses were performed with SPSS software (version 10.0).

Results

Table 1 shows the demographic and clinical characteristics of the cases and the

controls. As expected, the mean gestational age at delivery was lower in cases than in

controls, and the family history of preeclampsia was more frequent in patients. Obesity,

defined by BMI > 30 Kg/m

after adjustment for age, was prevalent in both groups

being even more frequent in preeclamptic women. There were no significant differences

in the parity and the smoking habits between patients and controls.

Risk association with preeclampsia using a case-control design

Table 2 shows the frequency of thrombophilia genotypes and alleles in women with

preeclampsia and controls. When the analysis for the FV Leiden and F II mutations was

restricted to Caucasian group (excluding African-Brazilian women), the results were not

significant (FV Leiden p = 0.66 and F II p = 0.05).

The observed genotype distribution was in agreement with the Hardy-Weinberg

proportion for almost cases and controls in all polymorphisms, except the G20210A

mutation in the F II gene (patients and controls), the 4G/5G polymorphism in the PAI-1

gene and the C677T polymorphism in the MTHFR gene (patients group).

The cases had a marginally significant higher genotype and allele frequencies when

they were compared to the controls for the F II and MTHFR gene polymorphisms.

However, the relative risks estimated by the odds ratio did not confirm the relationship

between these polymorphisms and the occurrence of preeclampsia.

Risk association with severe preeclampsia using a case-control design

There were no significant differences in the prevalence of the MTHFR C677T, the

G20210A prothrombin gene mutation, FV Leiden, and the PAI-1 4G/5G

polymorphisms (in any genotype combination) among women with severe preeclampsia

compared to control women (MTHFR 677TT genotype, OR 1.45, 95% CI 0.56,3.76; F

II mutation (GA or AA genotypes) OR 0.37, 95% CI 0.11,1.24; FV Leiden OR 7.39,

95% CI 0.65,83.58; PAI-1 4G/4G genotype, OR 1.27, 95% CI 0.57,2.82). Furthermore,

when we compared severe preeclampsia (n=41) with mild preeclampsia (n=34) no

association was observed with the four genetic systems (data not shown).

Risk association of the interaction among the polymorphisms with preeclampsia

When we investigated a possible interaction among these polymorphisms on the

development of the preeclampsia, the OR for having one risk genotype, one or two

genotype risk factors and two genotype risk factors compared to those without genotype

risk factors were 1.97 (95% CI 1.08-3.59), 2.21 (95% CI 1.25-3.92) and 4.27 (95% CI 1.3-

13.9), respectively.

Discussion

It has been suggested that several functional genes in the coagulation system

contribute to an increased risk of thrombotic events that may eventually result in

preeclampsia. A number of case-control studies of affected and unaffected mothers

indicate such associations [4], but this relationship is still conflicting [4-6,13,14].

Our findings showed that in this Brazilian population, there was no significant

association between preeclampsia and the MTHFR, F II, FV Leiden and PAI-1

polymorphisms; when the genotype and the allele frequencies were isolated compared

between cases and controls.

The discrepant results observed in different studies could be due to the differences

in the genetic background of the populations. The prevalence of F II 20210A, FV Leiden

and T allele in the MTHFR gene is extremely variable in various Mexicans, European,

American and Asian populations [13,15-17]. Therefore, those discrepant results may be

related to the different genetic backgrounds of the study subjects.

In addition, the frequency of the PAI-1 4G allele in our control group is similar to

that has previously been described in European and American populations [18-22]. In

contrast to our data, a marginally higher frequency of the 4G allele has been found in some

studies [21,22]. It may be partly explained by differences in the study population since

Yamada and colleagues [21] included women with a history of thrombosis and women

with chronic hypertension.

Moreover, besides the different populations studied, the definition of preeclampsia,

the selection of controls and the inclusion criteria varied among the studies. We included

almost two controls for each case, matched by age and ethnicity, and the differences in the

frequency of polymorphisms between the groups did not reach statistical significance.

An interesting point in our study is that the synergic association of more than one

polymorphism and preeclampsia was suggested and an exaggerated effect of the disorder

on the haemostatic system can be hypothesized. Moreover, considering that preeclampsia

is a multifactor disease and in an attempt to build a polygenetic model of preeclampsia, the

combined defects are important to be identified. It is worthwhile to note that the

association between preeclampsia and thrombophilias, including MTHFR, F II and FV

Leiden polymorphisms by combined defects, was described as established risk association

[3]. However, these results were not observed in another report [23].

In conclusion, in the population analyzed, the studied thrombophilic genes do not

seem to be associated with the development of preeclampsia even in the severe

presentation form. Nevertheless, a possible interaction among the MTHFR, F II, FV and

PAI-1 gene polymorphisms on the development of the preeclampsia was suggested.

Acknowledgements

We are grateful to the patients and the individuals for participating in the study and

we thank Nurse Katia Gerloff, from Nossa Senhora Conceição Hospital.

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methylenetetrahydrofolate reductase, 68-basepair insertion at nucleotide 844 of the gene

for cystathione β-synthase, and factor V Leiden mutation, Am. J. Obstet. Gynecol. 184

(2001) 1211-1217.

Table 1

Demographic and clinical characteristics of patients with preeclampsia and the

control group

Preeclampsia group

n = 75

Control

n = 145

Value

Maternal age at delivery (years)

27.8±7.5 27.3±7.2

0.68

Ethnicity (Caucasians) 68.0% 74.5% 0.18

Gestational age at delivery

(weeks)

35.6±3.4 38.3±3.4 <0.001

Family history of PE 37.7% 20.8% 0.03

BMI (Kg/m²)

31.4±3.9 27.9±4.6 <0.001

Smoking 18.6% 23.9% 0.48

Parity

2.4±1.7 2.8±1.8

0.18

Data are presented as mean ± SD or %.

Table 2

Frequency of thrombophilia genotypes and alleles in women with preeclampsia and

controls

Genotype/

Allele

Preeclamptic group

n=75

Controls

n=145

P Odds ratio (95% CI)

MTHFR (%)

31 (41.3%)

27 (36.0%)

17 (22.7%)

0.594

0.406

76 (52.4%)

51 (35.2%)

18 (12.4%)

0.70

0.30

0.104

0.032

2.07 (0.99-4.30)

F II (%)

71 (94.7%)

3 (4.0%)

1 (1.3%)

0.97

0.03

144 (99.3%)

1 (0.7%)

---

0.997

0.003

0.047

0.019

8.11 (0.89 – 73.92)

FV Leiden (%)

73 (97.3%)

2 (2.7%)

---

0.987

0.013

144 (99.3%)

1 (0.7%)

---

0.997

0.003

0.268

0.269

3.94 (0.35 – 44.23)

PAI-1

4G/4G

4G/5G

5G/5G

24 (32.0%)

26 (34.7%)

25 (33.3%)

0.49

0.51

32 (22.4%)

63 (44.0%)

48 (33.6%)

0.44

0.56

0.242

0.379

1.63 (0.87-3.05)

MTHFR, methylenetetrahydrofolate reductase; F II, prothrombin; FVL, Factor V Leiden

and PAI-1, plasminogen activator inhibitor type 1 polymorphisms.

Odds ratio (95% CI) for high-risk allele. The genotype risk factors are in the bold type.

Data missing from two controls who could not be unambigously genotyped.

Table 3

Analysis of the interaction among the polymorphisms with preeclampsia

Genotype

combinations

Preeclampsia group

n=75

Controls

n=143

P Odds ratio (95% CI)

With one risk

genotype

31 (41.3%) 42 (29.4%) 0.027 1.97

(1.08-3.59)

With one or two risk

genotypes

c,d

39 (52.0%) 47 (32.9%) 0.006 2.21

(1.25-3.92)

With two risk

genotypes

8 (10.7%) 5 (3.5%) 0.016 4.27

(1.31-13.90)

Without any risk

genotype (s)

36 (48.0%) 96 (67.1%)

Data missing from two controls who could not be unambigously genotyped for PAI-1

polymorphism.

OR for each comparison with subjects without genotype risk factors as the reference

group.

MTHFR (TT) or F II (GA or AA) or FV Leiden or PAI-1 (4G/4G).

MTHFR (TT) + PAI-1 (4G/4G), F II (GA or AA) + PAI-1 (4G/4G), FV Leiden + PAI-1

(4G/4G).

“Genotypes and Haplotypes of Endothelial

Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphisms

(Glu298Asp, intron-4, and -786T/C) and Risk of

Preeclampsia in a Brazilian population

“

Manuscrito a ser submetido ao periódico Acta

Obstetrícia et Gynecologica Scandinavica

CAPÍTULO V

Genotypes and haplotypes of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms

(Glu298Asp, intron-4, and -786T→C) and risk of preeclampsia in a Brazilian

population

Caroline A. Dalmáz

1,2

, Mariana R. Botton

, Kátia G. dos Santos

, Citânia L. Tedoldi

and Israel Roisenberg

From the Department of Genetics, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul and

Centro Universitário La Salle, Canoas, RS, Brazil, and the

Hospital

Nossa Senhora da Conceição,

Porto Alegre, RS, Brazil

Corresponding author:

Israel Roisenberg

Departamento de Genética

Instituto de Biociências

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Caixa Postal 15053

91.501-970 Porto Alegre, RS

Brazil

FAX n° + 55 51 3316 7311

Phone n° + 55 51 3316 6728

e-mail: [email protected]

This first Brazilian prospective study tested the association between the polymorphisms

Glu298Asp, intron-4 and –786T→C in the endothelial nitric oxide synthase gene and

preeclampsia because different populations could explain the controversial results

published worldwide.

Abbreviations:

NO: Nitric oxide; eNOS: endothelial nitric oxide synthase; OR: odds ratio; CI:

confidence interval

Genotypes and haplotypes of endothelial nitric oxide synthase gene

polymorphisms (Glu298Asp, intron-4, and -786T→C) and risk of preeclampsia in a

Brazilian population

Background. Preeclampsia, a common serious complication of pregnancy, is

characterized by vasoconstriction, dysfunction of the vascular endothelium, and

hypertension. Unidentified genetic factors and impaired nitric oxide (NO)-mediated

vasodilation are thought to contribute to development of the syndrome. The Glu298Asp,

intron-4 and -786T→C polymorphisms in the endothelial nitric oxide synthase (eNOS)

gene have been studied as possible markers to the development of this complication. In the

present study we investigated these polymorphisms in the development of preeclampsia in

a Brazilian population.

Methods. In a prospective case-control study we investigated the Glu298Asp, intron-

4 and -786T→C polymorphisms in the endothelial nitric oxide synthase gene in 75 women

with mild or severe preeclampsia and 145 women with normal pregnancy. The genotype

frequencies were assessed, the odds ratio (OR) calculated and the haplotype frequencies

were estimated.

Results. The genotype distribution was significantly different between preeclamptic

and normotensive women for the Glu298Asp polymorphism in Caucasians (Asp/Asp

versus Glu/Glu + Glu/Asp: OR=2.65; 95% CI: 1.045-6.69; p=0.040) but it was not

different in African-Brazilians (p>0.05). The genotype frequencies for the intron-4 and –

786T→C polymorphisms did not differ in Caucasians and African-Brazilians (p>0.05).

The estimated haplotype frequencies considering the eNOS Glu298Asp, the intron-4, and

the –786T→C polymorphisms were different between women with preeclampsia and

control women in African-Brazilians (p<0.001). The Asp298-786T-4b haplotype was more

frequent in cases than in controls. The analysis with the Caucasian group did not

demonstrate significant differences (p=0.138).

Conclusions. In the population analyzed, a possible association between the

Glu298Asp polymorphism on the development of the preeclampsia in the Caucasian group

was suggested. It was also indicated that the Asp298-786T-4b haplotype may be related to

occurrence of preeclampsia in African-Brazilian women.

Key words: endothelial nitric oxide synthase; preeclampsia; Glu298Asp, intron-4 and

–786T→C polymorphisms

Introduction

Preeclampsia is characterized by high blood pressure associated with proteinuria that

usually develops after the 20

gestational week, in the otherwise previously normotensive

women (1) and it remains an important cause of maternal and fetal morbidity and mortality

worlwide (2). Although the pathophysiology of preeclampsia remains unclear, genetic

factors and impairment of nitric oxide (NO)-mediated vasodilation appear to play

important roles in the development of this condition (3-5).

It is unlikely that a single gene causes preeclampsia. Several maternal genetic

variations, in conjunction with environmental factors and paternal component, may

predispose to the development of the disease. The endothelial-derived NO, involved in

vascular dilation and reduced vascular reactivity, is synthesized from L-arginine by

endothelial nitric oxide synthase (eNOS) (6, 7). Nitric oxide regulates blood pressure,

platelet aggregation, myometrial quiescence during pregnancy and parturition, and may be

involved in the pathogenesis of preeclampsia (8). The eNOS gene is located at

chromosome 7q35-36 and has several polymorphisms, some of which have been related to

the variation in the NO plasma levels (9, 10).

A single nucleotide polymorphism in exon 7 (G894T), which leads to an amino acid

substitution (Glu298Asp), and a variable number of tandem repeats in intron-4 have been

evaluated in preeclampsia (11-15). Other expressive eNOS gene polymorphisms consist of

three mutations: -786T→C, -922A→G e 1468T→A, better represented by the first one,

whereas the others are not expressive at functional analysis.

The role of eNOS as a candidate gene for the development of preeclampsia has been

investigated in several studies; however, the results have been inconsistent (11,12,15,17-

19). Furthermore, it is not clear whether genotypic risks reported for Glu298Asp, intron-4

and –786T→C polymorphisms are independent or reflect carriage of common risk

haplotypes.

In this study, the relation between the polymorphisms Glu298Asp, intron-4 and –

786T→C in the endothelial nitric oxide synthase gene and preeclampsia was investigated

in a Brazilian population, independently or in haplotype combination.

Materials and Methods

Patients and Controls

The subjects were recruited in the reference Maternity of a tertiary public hospital

in Southern Brazil (Hospital Nossa Senhora Conceição) and we identified 75 cases of

preeclampsia in the High Risk Obstetrical Cardiology Clinic according to the criteria

proposed by American College of Obstetricians and Gynecologists (20). Preeclampsia was

defined as the presence of hypertension associated with proteinuria after the 20

week of

gestation in women known to be normotensive beforehand. Hypertension was defined as a

blood pressure of ≥ 140/90 mmHg (diastolic) on two occasions of up to 4-6 h apart. The

blood pressure was measured on the right arm, and with the patient always in the seated

position. Proteinuria was defined as urinary excretion of 300 mg or more of protein in 24 h.

The preeclampsia was classified as severe when there was a blood pressure ≥ 160/110

mmHg; or urinary protein excretion ≥5g per 24h; a platelet count of <100 000mm

-3

in at

least two samples; the combination of hemolysis, abnormal liver enzymes associated with

persistent epigastric or upper right quadrant pain; persistent and severe symptoms as

altered mental status, headaches, blurred vision or blindness; presence of multiorgan

involvement such as pulmonary edema and oliguria (<500mL per day) according to

previously published classifications (20). Body mass index (BMI) was calculated

considering the values of weight and height obtained at the first appointment.

The 145 control subjects with uncomplicated pregnancies among in and out patients

of the same hospital were enrolled during the same period of the study and the inclusion

criteria of the controls were: no rise in blood pressure, no hypertension or proteinuria,

similar age (± 2 years), no biological relationship, and a delivery date as close as possible

to the delivery date(s) of the patient group and with a follow up for at least three months

after delivery.

All women who had chronic hypertension, renal disease, diabetes, collagen

vascular diseases, cancer or thrombosis were not included in the study.

All subjects participating in this study gave their written informed consent, and the

protocol was approved by the ethics committee of Grupo Hospitalar Conceição and by the

National Research Committee of Ethics.

Blood sampling and Test procedures

DNA was isolated from whole blood using a non-enzymatic technique (23). DNA samples

were genotyped by PCR using specific primers and conditions as those previously

described for the Glu298Asp (11), the intron-4 (10) and the –786T→C polymorphisms in

the eNOS gene (16). As previously reported, the PCR products were subjected to digestion

with the restriction enzymes BanII for the Glu298Asp polymorphism (11) and MspI for –

786T→C polymorphism in the eNOS gene (16). The digested fragments were subjected to

polyacrylamide gel electrophoresis containing ethidium bromide, and visualized under

ultraviolet light.

Statistical methods

Because the polymorphisms above mentioned have shown different prevalences in

the general population from diverse ethnic groups (21,22), we analyzed the Caucasian

group separated from the African-Brazilian group.

Student t test was employed for comparison of the quantitative variables between

groups. Differences in proportions were tested by Fisher’s exact test or χ

test. Relative

risks were estimated by the odds ratio and P – values of < 0.05 were considered to be

significant. All confidence intervals were calculated at the 95% level and all statistical

analyses were performed with SPSS software (version 10.0). Haplotypes were estimated

using the Arlequin software (version 2.001).

Results

Study patients

Table I shows the demographic and clinical characteristics of the cases and the

controls. As expected, the mean gestational age at delivery was lower in cases than in

controls, and the family history of preeclampsia was more frequent in patients. Obesity,

defined by BMI > 30 Kg/m

after adjustment for age, was prevalent in both groups

being even more frequent in preeclamptic women. There were no significant differences

in the parity and the smoking habits between patients and controls.

Risk association with preeclampsia using a case-control design

Table II shows the genotype and allele frequencies for eNOS polymorphisms

evaluated in the study according to ethnic background. In addition, Table III estimates the

effects of the eNOS polymorphisms on preeclampsia risk modeled with logistic regression.

The genotype distributions were significantly different between preeclamptic and

normotensive women for the Glu298Asp in Caucasians in a recessive model, but they were

not different for the intron-4 and –786T→C polymorphisms in a dominant model

(Caucasians and African-Brazilians).

The observed genotype distribution was in agreement with the Hardy-Weinberg

proportion for almost all cases and controls for all polymorphisms, except the Glu298Asp

and –786T→C in the African-Brazilian controls.

Risk association with severe preeclampsia using a case-control design

There were no significant differences in the prevalence of the eNOS Glu298Asp, the

intron-4, and the –786T→C polymorphisms (in any genotype combination) among women

with severe preeclampsia (in the Caucasian and African-Brazilian women) compared to

controls (P >0.05 for all comparisons).

Risk association with preeclampsia using a haplotype design

The estimated haplotype frequencies considering the eNOS Glu298Asp, the intron-4,

and the –786T→C polymorphisms were different between women with preeclampsia and

control women in African-Brazilians (P<0.001). The Asp298-786T-4b haplotype was more

frequent in cases than in controls. The analysis with the Caucasian group did not

demonstrate significant differences (P=0.138). Table IV show the frequencies of the eNOS

haplotypes and risk of preeclampsia.

Discussion

It is described that in a normal pregnancy, NO metabolic route is activated, leading

to an increased NO efficacy (24). It is believed that this increase is because of maternal

vasodilatation necessary to accommodate the increased circulating volume during gestation

without an elevation in blood pressure. In preeclampsia, this adaptation mechanism fails,

endothelial dysfunction occurs, blood pressure elevates and proteinuria develops (25).

Moreover, maternal endothelial dysfunction persists after an episode of preeclampsia (24).

This is of interest because endothelial dysfunction is a key feature of a number of

cardiovascular disorders, with women who experienced preeclampsia exhibiting an up to

2-fold excess risk of cardiovascular disease in later life (26).

In our study we investigated the possible relationship between the Glu298Asp,

intron-4 and -786T→C eNOS gene polymorphisms and preeclampsia independently and in

haplotype analysis.

Our finding regarding the Glu298Asp eNOS polymorphism is consistent with

previous findings in the Colombian (27) and Japanese populations (11,12). In the Japanese

population severe preeclampsia susceptibility was linked to the eNOS gene (11), directing

the study of this candidate gene in our patients. It has also been shown that eNOS

Glu298Asp polymorphism is associated with differences in endothelium dependent

dilation early in pregnancy (25). Moreover, Hillermann et al. (28) suggested that the

presence of the 298Asp eNOS variant may predispose a preeclamptic woman to develop

abruptio placentae or that it is a marker for predisposition to develope this complication.

However, Landau et al. (29), Kim et al. (30), Tempfer et al. (31) and Yoshimura et al. (32),

in the American, Korean, Austrian and Bangladeshi populations, respectively, did not find

this association when they investigated this relation to preeclampsia or severe

preeclampsia. Contrasting results were obtained in affected women from Eastern Finland

in whom the Asp allele was less common (13), having a protective role against the

development of preeclampsia.

Regarding the results we found for the intron-4 eNOS gene polymorphism is in

aggrement to findings of Zhou et al. (33), Serrano et al.

(27), and Grandone et al. (34), but

they are not in accordance to findings of Bashford et al. (14) and Tempfer et al. (15). As

far as we know, only two studies investigated the relationship between the –786T→C

polymorphism and preeclampsia and our finding is consistent with this previous studies

(27,34). In other words, no association was found.

The different results may differ for several reasons: there may exist ethnic

differences in the phenotypic expression of the eNOS polymorphisms, so the carrier of the

aspartate variant will likely develop more hypertensive symptoms than non carriers. The

ethnicity, socioeconomic status, differences in the incidence, the manifestations and the

classification of preeclampsia are different in these studies (11-15,27,34). Therefore, those

discrepant results may be related to the different genetic backgrounds of the studied

subjects. Moreover, the selection of controls and the inclusion criteria varied among the

studies.

Up to date, just one study analyzed simultaneously the possible association of these

three polymorphisms with the development of preeclampsia. They found that the Asp298-

786C-4b haplotype was considered as a marker of risk to preeclampsia in the Colombian

population (27). In our study, we found that the Asp298-786T-4b haplotype can be a risk

factor for preeclampsia in African-Brazilians.

One important limitation of the current study relates to the ethnic mixture of the

population studied (Caucasians and African-Brazilians). This raises the issue of whether

the positive association observed with eNOS reflects a confusing by ethnicity attributable

to the population stratification (35). We carefully matched the patients and the controls by

age and ethnicity and we analyzed Caucasian and African- Brazilians separately (we

included almost two controls for each case). Again, it is possible that marked differences in

results may be due to the heterogeneity of the preeclampsia syndrome and the differences

in definitions among the studies. The adoption of clear definitions of phenotype and

inclusion criteria will facilitate the development of meta-analysis of diverse studies. It is

conceivable that ethnicity may also be accountable for diverse results.

In conclusion, in the population analyzed, a possible association between the

Glu298Asp polymorphism on the development of the preeclampsia in the Caucasian group

was suggested. It was also indicated that the Asp298-786T-4b haplotype may be related to

occurrence of preeclampsia in African-Brazilian women.

Acknowledgments

We are grateful to the patients and the individuals for participating in the study, and

we thank to Nurse Katia Gerloff, from Nossa Senhora Conceição Hospital.

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Address for correspondence:

Israel Roisenberg, PhD

Departamento de Genética

Instituto de Biociências

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Caixa Postal 15053

91.501-970 Porto Alegre, RS, Brazil

FAX n° + 55 51 3316 7311

Phone n° + 55 51 3316 6728

e-mail: israberg@ufrgs.br

100

Table I. Demographic and clinical characteristics of patients with preeclampsia and

the control group

Preeclampsia group

n = 75

Control

n = 145

p-values

Maternal age at delivery (years)

27.8±7.5 27.3±7.2

0.68

Ethnicity (Caucasians) 68.0% 74.5% 0.18

Gestational age at delivery

(weeks)

35.6±3.4 38.3±3.4 <0.001

Family history of PE 37.7% 20.8% 0.03

BMI (Kg/m²)

31.4±3.9 27.9±4.6 <0.001

Smoking 18.6% 23.9% 0.48

Parity

2.4±1.7 2.8±1.8

0.18

Data are presented as mean ± SD or %.

101

Table II. Genotype and allele frequencies for eNOS polymorphisms evaluated in the study

according to ethnic background

Ethnic Background

All ethnic groups Caucasian African-Brazilian

Gene Variant Cases

(n = 75)

Controls

(n = 144)

Cases

(n = 53)

Controls

(n = 111)

Cases

(n = 22)

Controls

(n = 33)

Glu298Asp

Glu/Glu 33 (44.0%) 69 (47.9%) 23 (43.4%) 53 (47.7%) 10 (45.5%) 16 (48.5%)

Glu/Asp 31 (41.3%) 65 (45.1%) 19 (35.8%) 48 (43.2%) 12 (55.5%) 17 (51.5%)

Asp/Asp 11 (14.7%) 10 (7.0%) 11 (20.8%)† 10 (9.1%)† 0 (0%) 0 (0%)

Allele Frequency

Glu 97 (64.7%) 203 (70.5%) 65 (61.3%) 154 (69.4%) 32 (72.7%) 49 (74.2%)

Asp 53 (35.3%) 85 (29.5%) 41 (38.7%) 68 (30.6%) 12 (27.3%) 17 (25.8%)

Intron-4

b/b 54* (73.0%) 101* (70.6%) 39* (75.0%) 80* (72.7%) 15 (68.2%) 21 (63.6%)

b/a 19 (25.7%) 41 (28.7%) 12 (23.1%) 29 (26.4%) 7 (31.8%) 12 (36.4%)

b/c 0 (0%) 1 (0.7%) 0 (0%) 1 (0.9%) 0 (0%) 0 (0%)

a/a 1 (1.3%) 0 (0%) 1 (1.9%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

a/c 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

c/c 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

Allele frequency

A 21 (14.2%) 41 (14.3%) 14 (13.5%) 29 (13.2%) 7 (15.9%) 12 (18.2%)

B 127 (85.8%) 244 (85.3%) 90 (86.5%) 190 (86.4%) 37 (84.1%) 54 (81.8%)

102

C 0 (0%) 1 (0.4%) 0 (0%) 1 (0.4%) 0 (0%) 0 (0%)

–786T→C

T/T 34 (45.3%) 63 (43.7%) 22 (41.5%) 47 (42.3%) 12 (54.5%) 16 (48.5%)

T/C 34 (45.3%) 72 (50.0%) 24 (45.3%) 55 (49.6%) 10 (45.5%) 17 (51.5%)

C/C 7 (9.3%) 9 (6.3%) 7 (13.2%) 9 (8.1%) 0 (0%) 0 (0%)

Allele frequency

T 102 (68.0%) 198 (68.8%) 68 (64.2%) 149 (67.1%) 34 (77.3%) 49 (74.2%)

C 48 (32.0%) 90 (31.2%) 38 (35.8%) 73 (32.9%) 10 (22.7%) 17 (25.8%)

*Data missing from one patient and one control who could not be unambiguously

genotyped.

† p = 0.040

103

Table III. Estimate of the effects of the eNOS polymorphisms on preeclampsia risk

modeled with logistic regression

Polymorphism

Caucasians

OR (95% CI)

p-values

African-Brazilian

OR (95% CI)

p-values

Recessive model

Glu298Asp 2.645 (1.045-6.697) 0.040 __

†

–786T→C

1.725 (0.605-4.915) 0.308 __

†

Dominant model

Glu298Asp 1.192 (0.617-2.303) 0.601 1.129 (0.383-3.332) 0.826

Intron – 4 0.889 (0.418-1.891) 0.760 0.817 (0.260-2.563) 0.729

–786T→C

1.035 (0.533-2.009) 0.920 0.784 (0.266-2.314) 0.660

*OR: odds ratios; CI: confidence intervals.

† none homozigote was detected.

104

Table IV. Frequency of the eNOS haplotypes and risk of preeclampsia

Caucasian

African-Brazilian

Glu298Asp

Intron-4

–786T→C

Frequency

in controls

(n =218)

†

Frequency

in cases

(n =104)

†

Frequency

in controls

(n =66)

†

Frequency

in cases

(n = 44)

†

Glu b T 0.497 0.435 0.583 0.408

Glu a T 0.045 0.052 0.062 0.092

Glu b C 0.076 0.074 __

‡

0.160

Glu a C 0.076 0.045 0.098 0.067

Asp b T 0.128 0.157 0.075 0.273

Asp b C 0.166 0.199 0.160 __

‡

Asp a T __

‡

0.022 __

‡

Asp a C 0.012 0.038 __

‡

* p=0.621 for Caucasian; p<0.001 for African-Brazilian.

† number of haplotypes.

‡ none was detected.

105

Manuscrito submetido ao periódico

CAPÍTULO VI

DISCUSSÃO

106

8. DISCUSSÃO

A discussão dos aspectos mais específicos do presente trabalho já foi realizada nas

discussões dos capítulos III a V. Portanto, no presente capítulo serão discutidos aspectos

mais gerais, bem como as perspectivas para a continuidade deste trabalho.

Fatores de risco para os distúrbios hipertensivos da gestação no Sul do Brasil

Os DHG são importantes causas de morte materna e perinatal em todo o mundo,

principalmente em países em desenvolvimento. A identificação dos fatores de risco ligados

aos DHG são muito importantes para que se possa identificar pacientes em maior risco e,

em nosso país, poucos estudos abordaram este tema (Gaio et al., 2001; Kahhale e Zugaib,

1995).

Alguns fatores de risco parecem definidos para os DHG, como é o exemplo de

história familiar e PE prévia, diabetes, hipertensão crônica pré-existente e primiparidade.

Porém, outros como a idade materna nos extremos do período procriativo, tem apresentado

resultados contraditórios.

Em nosso estudo, os extremos de idade, considerados entre < 18 e > 35 anos, não

foram encontrados associados aos DHG. A gestação tardia está ocorrendo como

conseqüência de uma série de fatores, tais como: a busca pela independência financeira, ao

maior tempo de formação requerido pelo mercado de trabalho atual, às separações e às

novas uniões, aliados às possibilidades oferecidas pelos métodos anticoncepcionais, além

da fertilização assistida, que contribuem para este fenômeno universal (Mathews e

Hamilton, 2002; Astolfi e Zonta, 2002). Por outro lado, a falta de perspectivas e a

107

desinformação das jovens também é uma realidade, principalmente em pacientes de um

hospital público, pois todas as participantes do estudo são oriundas de baixo nível social

[Hospital Nossa Senhora da Conceição (HNSC)].

Estudo multicêntrico norte-americano não encontrou variação na incidência dos

DHG nas diversas faixas etárias (Sibai et al., 1997), ao passo que outros estudos apontam

maior incidência em gestantes com idade materna avançada (Ziadeh e Yahaya, 2001;

Gregory e Korst, 2003). A maior incidência dos DHG na idade avançada foi atribuída pela

elevada ocorrência, nesta faixa etária, de hipertensão crônica e diabete, questionando o

papel da idade materna avançada como fator de risco independente para o surgimento dos

DHG (van Katwijk e Peeters, 1998). Portanto, esta questão merece maior atenção, sendo

necessário maior número de estudos que abordem este tema a fim de esclarecer possíveis

vieses.

O nosso estudo mostra alguns dos principais fatores de risco independentes (história

familiar, diabetes e hipertensão crônica) para o desenvolvimento dos DHG em nossa

população, que deverão ser levados em consideração como marcadores clínicos para a

detecção precoce das pacientes com maior risco e, desta maneira, poderá se oferecer

medidas que possam reduzir a incidência de DHG ou a severidade dos mesmos. Ainda, há

a necessidade de outros estudos epidemiológicos para se investigar outros fatores de risco

em nosso meio.

Os polimorfismos e a pré-eclâmpsia:

A investigação dos fatores genéticos associados com doenças humanas freqüentes e

complexas alcança, atualmente, alta prioridade em pesquisas na área de Genética Humana

108

e Médica. O presente trabalho procurou identificar variantes genéticas associada à PE na

população brasileira, além da prevalência de fatores de risco associados aos DHG. Devido

a aspectos fisiopatológicos da PE, elegemos para este estudo genes envolvidos com a

trombofilia e o estresse oxidativo, no intuito de verificar possível associação independente

e/ou ação sinérgica dos polimorfismos e o desenvolvimento e/ou progressão à PE leve ou

grave e procuramos estudar, ainda, polimorfismos de um mesmo gene ou de efeito aditivo.

Polimorfismos pró-trombóticos

Alguns autores e recente metanálise têm sugerido que se há associação dos polimorfismos

dos genes ligados às trombofilias, neste trabalho mencionados, e a PE, esta se dá com

os casos de pacientes que desenvolvem a forma severa de PE (Morrisson et al.,

2002). Entretanto, esta sugestão deve ser cuidadosamente avaliada, pois muitos

estudos, conforme já abordamos no Capítulo I:

 avaliaram apenas um polimorfismo,

 incluíram diferentes DHG,

 incluíram multíparas,

 apresentaram pequeno número de pacientes,

 apresentaram diferentes desenhos de estudo e definições de PE,

 foram desenvolvidos em diferentes populações.

Estas limitações podem auxiliar a explicar os diferentes resultados encontrados

(Kupferminc, 2005).

109

Em nosso estudo, nenhum dos genótipos apresentou ocorrência maior significativa nas

gestantes com PE quando analisados isoladamente, entretanto, quando os

polimorfismos dos genes ligados às trombofilias foram avaliados em conjunto,

observou-se a associação com PE, conforme foi discutido no Capítulo IV.

É interessante observar que conforme o aumento do número de mutações presentes nas

mulheres com PE, a razão de chances também aumentou: este fato sugere que estas

alterações quando combinadas podem levar a maior risco. Poucos estudos realizaram

análise de efeito sinérgico desses polimorfismos: Kim et al. (2001b), não encontrou

associação dos polimorfismos C677T do gene da MTHFR e FVL, entretanto, dentre

os critérios de inclusão dos controles, neste estudo, mulheres com duas ou mais

gestações sem PE, foram incluídas, o que em nosso entendimento, pode ter sido viés

de seleção. Recente estudo de revisão sobre a análise da associação da PE com

trombofilias, sugere que os defeitos combinados são fatores de risco estabelecidos

em mulheres com PE severa (Kupferminc, 2005).

Os resultados dos estudos sobre a PE e os polimorfismos aqui analisados são

controversos e fatores como os já mencionados, além de estudos com mulheres que já

haviam apresentado PE prévia, estudo que avaliou os polimorfismos no feto e na mãe

(Livingston et al., 2001) e, também, as diferenças populacionais podem ser as explicações

para os diferentes resultados encontrados, conforme relatado nos capítulos IV e V desta

tese.

Polimorfismos envolvendo gene do eNOS

No ano 2000, um estudo publicado em um periódico científico de grande impacto

demonstrou que o polimorfismo Glu298Asp estava associado aos níveis de eNOS, pois a

110

proteína com o resíduo Asp na posição 298 era susceptível à clivagem por proteases

endógenas (Tesauro et al., 2000). Desde então, diversos autores sentiram-se impelidos a

analisar a relação deste polimorfismo com as doenças cardiovasculares. Posteriormente,

vários estudos independentes demonstraram que o polimorfismo Glu298Asp não exerce

nenhum efeito sobre a atividade da eNOS, tanto in vitro (Fairchild et al., 2001; Golser et

al., 2003) como in vivo (McDonald et al., 2004), e que a associação descrita por Tesauro et

al. (2000) pode ser atribuída a um artefato metodológico ocorrido durante a preparação das

amostras. Com isso, os resultados positivos encontrados nos estudos com o polimorfismo

Glu298Asp foram atribuídos ao desequilíbrio de ligação entre este polimorfismo e as

outras variantes funcionais no gene da eNOS, como o polimorfismo –786T→C na região

promotora, para o qual existem evidências consistentes de que se trata de uma variante

funcional (Nakayama et al., 1999; Miyamoto et al., 2000).

As definições diferentes para DGH (critérios diagnósticos distintos)

Uma das grandes dificuldades para discutirmos os resultados, conforme referido

anteriormente, em relação aos demais estudos, é a diversidade de classificações e

definições dos DHG. Várias definições e classificações são propostas por diferentes grupos

de especialistas:

International Society for the Study of Hypertension (ISSH), 1986;

Organização Mundial da Saúde (OMS), 1987;

Canadian Hypertensive Society (CHS), 1997;

Report of the National High Blood Pressure Education Program Working Group, 2000;

Australasian Society for the Study of Hypertension (ASSH), 2000;

111

American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG), 2002.

No presente trabalho utilizamos as recomendações do ACOG 2002 foram empregadas,

além do critério de acompanhamento até o puerpério tardio, conforme já descrito.

A seleção dos casos e controles

O delineamento de qualquer estudo de caso-controle envolve dois pontos cruciais: a

seleção dos indivíduos (principalmente os controles) e a seleção das variantes genéticas

(Cardon e Bell, 2001).

Para evitar os vieses de seleção, os indivíduos devem ser selecionados a partir de

uma mesma população de origem, a fim de obter a homogeneidade dos casos e controles

em relação à ancestralidade genética e aos fatores de risco ambientais (Zondervan e

Cardon, 2004). É pouco provável que tenham ocorrido vieses de seleção no presente

estudo. Tanto os casos quanto os controles foram selecionados na Maternidade e no

Ambulatório do Serviço de Alto Risco do Hospital de referência do Estado do RS, a saber:

HNSC do Grupo Hospitalar Conceição (Porto Alegre).

Da mesma forma, é improvável que tenham ocorrido vieses de aferição. Todos os

pacientes passavam por um exame clínico, por uma entrevista por meio de protocolo

padronizado (anexo) e realizavam exames diagnósticos dos distúrbios hipertensivos da

gestação. Os controles realizavam entrevista e eram acompanhadas através de suas

consultas rotineiras de pré-natal (exames clínicos e laboratoriais). Todas as pacientes e os

controles foram acompanhadas até 90 dias de pós-parto (puerpério tardio), pois é

conhecido que mesmo após o parto pode ocorrer PE. Portanto, possível viés de

classificação também foi cuidadosamente monitorado.

112

Os exames e os critérios diagnósticos dos distúrbios hipertensivos da gestação

Em relação aos exames e critérios diagnósticos dos distúrbios hipertensivos da

gestação, o método tradicionalmente recomendado para o diagnóstico da PE é a proteinúria

de 24 horas e aferições da pressão arterial. No entanto, é importante observar que alguns

fatores podem levar a confusão nestas medidas: a presença de infecção do trato urinário,

comum em pacientes gestantes, pode levar a um exame qualitativo de urina alterado, com

presença de proteinúria, para tanto foi observado por nós, todos os exames e descartado

este possível fator de confusão.

Além desses métodos, outras medidas laboratoriais foram valorizadas, como medida

de ácido úrico (quando superior a 3,6 mg/dL é indicativo de início de PE) (Report, 2000).

Quanto aos demais tipos de DHG, foram observadas as aferições da pressão arterial e

também os exames laboratorias solicitados na rotina do Serviço de Alto Risco do HNSC.

Uma característica da PE é o estado de hipercoagulabilidade e a coagulação

intravscular, que é evidenciada pelo consumo plaquetário, com redução de seu tempo de

vida (Estelles et al., 1994). Em todas as nossas pacientes que apresentaram plaquetopenia,

que é um dos critérios de gravidade para a definição da forma de PE Grave, foi

cuidadosamente observado, em pelo menos duas medidas, o número de plaquetas

circulantes, pois oscilações da rede elétrica podem influenciar o equipamento de contagem

de parâmetros hematológicos. Desta maneira, procuramos evitar classificação errônea de

nossas pacientes entre as formas de PE Leve e PE Grave. Além disso, a análise dos

polimorfismos era realizada sem a identificação prévia dos pacientes quanto à PE.

113

A seleção dos genes candidatos

A seleção dos genes candidatos e dos polimorfismos a serem analisados deve ser

cuidadosa, principalmente para as variantes recentemente descritas, como ilustrado pelos

exemplos descritos a seguir.

Como já descrevemos, a gestação por si é um estado de hipercoagulabilidade. No

campo das trombofilias, a tendência à trombose tem sido estudada e ligada a muitos

aspectos gestacionais. Recentemente, as complicações graves da gestação como PE,

restrição de crescimento intra-uterino, DPP, morte fetal intra-uterina estão sendo

associadas com trombofilias. Trombofilias são herdadas ou adquiridas por condições que

predispõe o indivíduo à hipercoagulabilidade. As variantes moleculares ligadas à

hemostasia, por nós estudadas e descritas ao longo desta tese (C677T do gene da MTHFR,

FVL, G20210A do gene da F II e 4G/5G do gene do PAI-1), e suas possíveis associações

com PE e ou PE grave, têm sido extensivamente investigadas em todo o mundo. Também

os polimorfismos Glu298Asp, intron-4, –786T→C do gene da eNOS tem sido reportados

como possíveis fatores de risco ao desenvolvimento e/ou gravidade da PE.

Assim, a seleção dos genes candidatos analisados na presente tese foi baseada nos

seguintes critérios:

(1) Genes que codificam produtos essenciais para a homeostasia vascular e estresse

oxidativo e que exercem diversas funções fisiológicas;

(2) Polimorfismos recentemente identificados e/ou com evidências experimentais

quanto ao seu impacto nos níveis e/ou a atividade da proteína em questão;

(3) Variantes localizadas na região promotora ou codificadora dos genes;

(4) Evidências de que os mesmos poderiam estar associados com os DHG.

114

Outros fatores

A maior parte dos estudos, inclusive o nosso, se concentraram na genética materna e

não avaliam a influência paterna e do feto. Encontramos dificuldades de acompanhamento

das pacientes e dos controles, pois o HNSC atende a um público extremamente carente,

conforme pode ser evidenciado no Capítulo II desta tese, através da descrição dos níveis de

escolaridade – um índice que retrata nível sócio-econômico. Portanto, as gestantes

apresentam dificuldades financeiras até mesmo de comparecer às consultas do pré-natal e o

contato telefônico muitas vezes torna-se inviável pelos mais diversos fatores. Por isso,

apesar das limitações destacadas conseguimos obter um tamanho amostral expressivo,

equivalente ou mesmo superior aos estudos realizados em outras populações mundiais

(Lindoff et al., 1997; Shoda et al., 1997; Fabbro et al., 2003; D’Elia et al., 2002; Dávalos

et al., 2005).

Ao iniciarmos o estudo em 2002, as publicações com relação a este tema eram

restritas às populações dos Estados Unidos da América, Europa e Ásia. Até o presente

momento, não encontramos nenhuma outra publicação completa relacionadas à população

brasileira.

115

CAPÍTULO VII

CONCLUSÕES E

PERSPECTIVAS FUTURAS

116

9. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

A análise realizada a partir dos dados obtidos nos permitiu formular as seguintes

conclusões do estudo nesta população:

(1) Foram estudadas 11 fatores de risco conhecidos como predisponentes aos DHG.

Entretanto, apenas história familiar de PE, DM e HAS prévia mostraram-se como

fatores de risco independentes.

(2) As distribuições genotípicas e freqüências alélicas dos polimorfismos C677T do

gene da MTHFR, G1691A do gene do FV, G20210A do gene da F II e 4G/5G do

gene do PAI-1 não parecem estar associadas isoladamente à ocorrência e/ou

severidade da PE em gestantes com essa complicação quando comparadas à

gestantes normotensas. Entretanto, a interação entre os genótipos de risco mostrou-

se significativamente associada à PE, com valores crescentes com o número de

genótipos envolvidos.

(3) A distribuição genotípica do polimorfismo Glu298Asp do gene da eNOS foi

significativamente diferente entre as pacientes com PE e as mulheres normotensas

caucasóides, no entanto não foi diferente nas pacientes afro-brasileiras.

(4) A distribuição genotípica e freqüência alélica dos polimorfismos intron-4 e –

786T→C do gene da eNOS não estão associadas à ocorrência e/ou severidade da

117

PE em gestantes com essa complicação quando comparadas à gestantes

normotensas, seja no grupo das caucasóides ou das afro-brasileiras.

(5) As freqüências dos haplótipos Glu298Asp , intron-4 e –786T→C foram diferentes

nas mulheres com PE quando comparadas à gestantes normotensas no grupo de

mulheres afro-brasileiras, onde o haplótipoAsp298-786T-4b foi mais frequente nos

casos do que nos controles.

Assim, as perspectivas do presente estudo podem ser resumidas em:

(1) Estudos que visem a identificação de fatores de risco ligadas aos DHG em

nossa população são necessários para que auxilie no manejo destas

complicações.

(2) Os polimorfismos relacionados ao estresse oxidativo, embora constituam

um campo de pesquisa promissor na identificação de variantes genéticas

associadas aos DHG, têm sido pouco explorados, até o momento, o que

justifica uma maior ênfase nesta linha de investigação.

(3) Devido ao grande número de SNPs (“single nucleotide polymorphisms”)

identificados e caracterizados e à variabilidade intra-genômica e inter-

populacional no padrão de desequilíbrio de ligação, os estudos de

associação deveriam focar na investigação de haplótipos, e não em alguns

SNPs isoladamente.

(4) Como existe uma grande variabilidade genética entre os diversos grupos

étnicos, a identificação de variantes genéticas associadas às DHG requer

118

que os estudos de associação investiguem populações etnicamente

diferenciadas, especialmente no Brasil.

(5) Devido ao grande número de comparações realizadas e ao limitado

tamanho amostral, quando comparado com outros estudos realizados por

consórcios internacionais, os nossos resultados devem ser confirmados em

outras populações.

119

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120

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134

ANEXO

135

ANEXO

Programa De Pós - Graduação Em Genética E Biologia Molecular E Grupo

Hospitalar Conceição – Setor Gestação De Alto Risco

Questionário Distúrbios Hipertensivos Na Gestação

1- Nº __ __ __ __ Data internação __ __/__ __/__ __ Leito_______

2- Nome _____________________________ 3- Registro_ _ _ _ _ _ _ _

3- End _____________________________________________________

4- Fone1_________________________ Fone2______________________________

5- Cor ( )1-Branca ( )2-Mista ou negra

6- Data Nascimento __ __/__ __/__ __ 7- Idade __ __

7- Gesta __ __ Para __ __

8- Cesária __ __intervalo gest:___

9- Aborto __ __ ( ) espontâneo ( ) provocado

10- DUM __ __/__ __/__ __ IG __ __

11- ECO _______________ IG __ __

12- Pré natal ( )0-não ( )1- sim HNSC ( )2-sim outro

13- ACO ( )0- não ( ) 1- sim

14- Fumante ( )0- não ( ) __ __nº cigarros/dia

15- Drogas ( ) 0-não ( ) Qual?_________________________________________

16- Peso __ __ __ Altura __ __ __ IMC __ __

17- Diagnóstico da internação________________________________________

Outros diagnósticos_____________________________________________

20- HAS ( ) 0-não ( ) 1- sim primária ( ) 2- sim secundária

21- Tempo de diagnóstico __ __ anos

22 - Medicações prévias _____________________________________________

23- Medicações na gestação _____________________________________________

24- Complicações ( ) 1- Cardiopatia hipertensiva

( ) 2- AVC 0-Não

( ) 3- IAM 1-Sim

( ) 4- Ins. Renal

25- DHEG ( ) 0-não ( ) 1- sim leve ( ) 2-sim grave

26- Idade gestacional do diagnóstico __ __

27- História familiar ( ) 0-não ( ) 1-sim materna ( )2-sim paterna ( ) 8- NSA28- História

prévia ( ) 0-não ( )1- sim ( )-8 NSA

29- Novo parceiro ( ) 0-não ( )1- sim ( )8-NSA

30- Complicações maternas ( ) 1- DPP

( ) 2- EAP

136

( ) 3- Insuf. Renal

( ) 4- Hellp 0-Não

( ) 5-Eclâmpsia 1-Sim

( ) 6- coagulopatia

TA internação:_____________

Medicação na gestação______________________

31- Hipertensão transitória ( ) 0-não ( )1-sim

32-Hipertensão não classificada ( ) 0-não ( ) 1-sim

33- Data do parto __ __/__ __ /__ __

34- Idade gestacional __ __

35- Parto ( )1- único ( )2-multiplo

Via de parto ( ) 0 vag ( ) 1 forp ( )2 ces mat_______ ( ) 3 ces fetal_______

Sexo RN ( ) 1 masculino ( )2 feminino

36- Peso________ Capurro ______ ( ) 1 AIG ( )2 PIG ( )3GIG

37- ( )0-FM ( )1- MBP ( ) 2-BP

Prematuridade ( )0-não ( )1-sim

Local RN:________ Apgar:____________

Usou sulfato de magnésio:

TA pós parto_____________________

Revisão 45 dias Data __ __/__ __/__ __

Observações:______________________________________________________________

_________________________________________________________________________

MAC sugerido___________________________

Entervistadora:___________________________

Data

Peso

Ecos

EXAMES - RESULTADOS

DATA:

___/___/__

___/___/___

___/___/__

___/___/

___

HT:

Hgb:

Plaq

TS: HbsAg:

VDRL: Toxo IgG:

Anti-HIV: Toxo IgM:

Glicemia:

137

KTTP

Fibri

Ureia

Creat

TGO

TGP

Ac.urico

DHL

Prot 24

Ca 24h

DCE

ECG: DATA:

_________________________________________________________________

RX TX: DATA:

__________________________________________________________________

ECOCARDIOGRAMA: DATA:

__________________________________________________________________

CINTILO DATA:

138

DADOS DE USO DE ÁLCOOL

1. Com que frequência a Sra toma bebidas de álcool?

(0)nunca (1)1x mês ou menos (2)2-4x por mês (3)2-3x por semana (4)4 ou + vezes por

semana

2. Nas ocasiões em que bebe, quantas doses, copos ou garrafas a Sra costuma tomar?

(0)1 ou 2 doses (1) 3 ou 4 doses (2) 451 ou 6 doses (3) 7 ou 9 doses (4) 10 ou mais doses

3. Com que frequência a Sra toma “seis ou mais doses” em uma ocasão?