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PAULA CRISTINA DE SOUSA FARIA-TISCHER
ESTRUTURA QUÍMICA, PROPRIEDADES REOLÓGICAS E
ATIVIDADE ANTIVIRAL DAS GALACTANAS SULFATADAS
DAS ALGAS VERMELHAS Meristiella gelidium e
Gymnogongrus griffithsiae (GIGARTINALES)
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Bioquímica e Biologia
Molecular, Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná, como
requisito parcial para a obtenção do título
de Doutor em Ciências.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Maria Eugênia
Duarte Noseda
Co-orientador: Prof. Dr. Miguel Daniel
Noseda
CURITIBA
2006
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PAULA CRISTINA DE SOUSA FARIA-TISCHER
ESTRUTURA QUÍMICA, PROPRIEDADES REOLÓGICAS E
ATIVIDADE ANTIVIRAL DAS GALACTANAS SULFATADAS
DAS ALGAS VERMELHAS Meristiella gelidium e
Gymnogongrus griffithsiae (GIGARTINALES)
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Bioquímica e Biologia
Molecular, Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná, como
requisito parcial para a obtenção do título
de Doutor em Ciências.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Maria Eugênia
Duarte Noseda
Co-orientador: Prof. Dr. Miguel Daniel
Noseda
CURITIBA
2006
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Dedico esta tese à minha família,
ao meu marido e aos amigos que
conquistei nesta jornada.
Quando achamos que sabemos as respostas
a vida muda as perguntas.
Esse é o desafio da vida e da pesquisa.
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela oportunidade de estudar, me graduar e ainda estar no seleto
grupo de pessoas que têm uma pós-graduação. Mas acima de tudo pela
saúde física e mental para saber aproveitar todas as boas oportunidades que
a vida gentilmente me oferece.
À Prof
a
. Maria Eugênia D. Noseda que acompanhou a minha caminhada no
mestrado e no doutorado, me apresentou a Química de Carboidratos das
Algas Vermelhas, me orientou e me ajudou a crescer muito em todos esses
anos. Muito Obrigada!
Ao Prof. Miguel D. Noseda, que me apresentou as carragenanas e me
despertou para as propriedades e peculiaridades desses polissacarídeos.
Obrigada pela orientação!
À Prof
a
Maria Rita Sierakowski que tornou possível a minha iniciação no
estudo das propriedades reológicas de biopolímeros. Obrigada pela
orientação, disposição e por acreditar em mim e no trabalho.
Ao Prof. Phillip Gorin e Prof
a
Carmem Petkowicz pela disponibilidade e
correção da tese na banca interna.
Às Prof
as
Tânia Bresolin, Sandra Barreira, Maria de Lurdes da Silva e
Carmem Petkowicz, pela presença na banca e pela valiosa avaliação da tese.
Aos meus maiores e melhores orientadores na vida, meu pai Arnaldo Faria e
a minha mãe Ana Paula F. S. e Sousa Faria, pelo amor incondicional, pelo
apoio quando eu me sentia perdida e acima de tudo pela formação do meu
caráter. Vocês iluminam meu caminho. Muito Obrigada!!!!!!!
À minha querida irmã Raquel de Sousa Faria Pavan, sua força, alegria,
energia, carinho e amizade são indispensáveis. Muito Obrigada!! Você é
muito especial!! E a você, Flávio, por sempre torcer muito por mim.
Obrigada!
Ao meu marido e companheiro, Cesar Augusto Tischer, melhor presente que
a vida poderia me dar. Obrigada por ser persistente. Você trouxe para a
minha vida, serenidade, aconchego, otimismo e paz. Te amo!!
À Caroline G. Mellinger, exemplo de força, garra e humanidade. Obrigada
pelo estimulo e carinho sempre que precisei. Tínhamos que fazer pós-
graduação para nos tornarmos amigas.
À Rosiane G. M. Zibetti, pelo companheirismo, carinho, troca de experiências
e principalmente pela amizade.
Ao Adriano (Dridri), sua alegria e entusiasmo eu não vou esquecer.
Aos colegas de turma de mestrado, Alan e Sérgio, pelos bons momentos de
convívio e conversas.
À Juliana (Juju), Diogo (Dioguito), Luciana (Lulu), Marco (Marquito), obrigada
pelo companheirismo, amizade, por fecharem a coluna, e por me esperarem
para ir almoçar quando eu só tinha que colocar uma diálise. Sinto saudade!!!
Marquito, obrigada por colocar Enya no final do dia de trabalho!
À Ana Helena, obrigada pelas ótimas conversas, risos e acima de tudo pela
amizade. Gosto muito de você!
À Elaine que não me cumprimentava, mas que no final do doutorado até me
deu um abraço. Que bom que você deixou eu te conhecer. Obrigada pela
ajuda e conversas científicas. Gosto muito de você e saiba que sou sua
amiga!!
À Fernanda (Fefer), Ricardo W., ao Thales, obrigada pelo carinho que vocês
sempre me deram. Fefer, obrigada pela sua amizade demonstrada de várias
formas, entre elas por ter ido ao meu chá de panela.
Ao Renato e Mariana, pela amizade, pelos ótimos passeios e por me
ajudarem de maneira muito especial antes do seminário de tese. Vocês são
grandes amigos!
À Cris, Fran, Charles, Tati, Neoli, do laboratório de Biopolímeros, obrigada
por me adotarem e me receberem com tanto carinho. Sempre lembrarei de
vocês.
De maneira muito especial, agradeço a grande amiga Lucy Ono, que me
acompanhou desde qualificação. Sua amizade é especial!! Obrigada pela
força!!
À Andréia, Rosane e Lauro pelas análises de GPC, GC e GC-MS. Obrigada!
Andréia obrigada pelas conversas e leitura das cartas, lembra?!
À D. Marilza, aos funcionários do departamento, as bibliotecárias pela
colaboração. Obrigada!
A todas as pessoas que direta ou indiretamente participaram e participam da
minha vida e contribuíram para a conclusão desta tese e desta etapa na
minha vida. Obrigada!!!!!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................
LISTA DE TABELAS ..............................................................................
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ............................................
RESUMO ....................................................................................................
ABSTRACT ...............................................................................................
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................
1
1.1. ALGAS VERMELHAS ........................................................................... 1
1.2. GALACTANAS: ESTRUTURA GERAL ................................................ 2
1.2.1. CARRAGENANAS ............................................................................. 4
1.2.2. AGARANAS ....................................................................................... 7
1.2.3. GALACTANAS DL-HÍBRIDAS ...........................................................
8
1.3. CICLO DE VIDA E REPRODUÇÃO DAS ALGAS VERMELHAS ........ 10
1.4. ORDEM GIGARTINALES: VARIABILIDADE ESTRUTURAL DAS
GALACTANAS E SIGNIFICADO QUIMIOTAXONÔMICO ..........................
11
1.4.1. FAMÍLIA PHYLLOPHORACEAE ....................................................... 16
1.4.2. FAMÍLIA SOLIERIACEAE ................................................................. 20
1.5. APLICAÇÃO INDUSTRIAL DAS GALACTANAS SULFATADAS ...... 23
1.5.1. FORMAÇÃO DE GEL, FONTES E PROCESSAMENTO DAS
CARRAGENANAS .......................................................................................
27
1.5.2. INFLUÊNCIA DOS SAIS NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO E
INTERAÇÃO COM AMIDO ..........................................................................
34
1.6. REOLOGIA: HISTÓRICO E ASPECTOS TEÓRICOS ........................ 40
1.7. GALACTANAS SULFATADAS COMO COMPOSTOS
BIOLOGICAMENTE ATIVOS: ATIVIDADE ANTIVIRAL .............................
48
2.0. OBJETIVOS .....................................................................................
56
2.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................... 56
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................. 56
3.0. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................
57
3.1. ESPÉCIES ESTUDADAS E SEUS POSICIONAMENTOS
SISTEMÁTICOS ...........................................................................................
57
3.2. COLETA E PROCESSAMENTO .......................................................... 57
3.3. EXTRAÇÃO DAS GALACTANAS DE Meristiella gelidium E
Gymnogongrus griffithsiae ........................................................................
58
3.4. FRACIONAMENTO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL ............... 59
3.4.1. MÉTODOS ANALÍTICOS GERAIS .................................................... 59
3.4.2. PRECIPITAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS COM KCl .................. 60
3.4.3. PURIFICAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DE M. gelidium POR
CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA ....................................................
60
3.4.4. HIDRÓLISE ÁCIDA TOTAL DO TIPO HIDRÓLISE REDUTIVA ....... 61
3.4.5. HIDRÓLISE ÁCIDA TOTAL ............................................................... 61
3.4.6. METILAÇÃO ...................................................................................... 62
3.4.7. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS .................................................. 62
3.4.7.1. CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-GASOSA (GLC) ............................ 62
3.4.7.2.CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-GASOSA ACOPLADA À
ESPECTROMETRIA DE MASSA (GC-MS) ................................................
63
3.4.7.3. CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAÇÃO (HPSEC-MALLS) –
ANÁLISE DE HOMOGENEIDADE E MASSA MOLECULAR .....................
63
3.4.8. DESSULFATAÇÃO POR TRATAMENTO SOLVOLÍTICO ............... 64
3.4.8.1. PREPARO DO SAL DE PIRIDÔNIO .............................................. 64
3.4.8.2. SOLVÓLISE .................................................................................... 65
3.4.9. TRATAMENTO ALCALINO ............................................................... 65
3.4.10. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS ................................................ 66
3.4.10.1. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR ................................... 66
3.4.10.2. ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO POR
TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR) ....................................................
66
3.5. ANÁLISES REOLÓGICAS .................................................................... 66
3.5.1. PREPARO DAS GALACTANAS SULFATADAS .............................. 67
3.5.2. PREPARO DOS AMIDOS .................................................................. 67
3.5.3. PREPARO DAS MISTURAS DE POLISSACARÍDEOS .................... 67
3.5.4. ANÁLISES EM SISTEMA DINÂMICO ............................................... 68
3.5.5. DETERMINAÇÃO DO COMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO
LINEAR .........................................................................................................
68
3.5.6. VARREDURA DE FREQÜÊNCIA EM SISTEMA VISCOELÁSTICO
LINEAR .........................................................................................................
69
3.5.7. VARREDURA DE TEMPERATURA ...................................................
69
3.5.8. TESTE DE INCHAMENTO DO GEL – SWEELLING ......................... 69
3.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA E
ANTIDENGUE DAS GALACTANAS DE M. gelidium e G. griffithsiae ......
70
3.6.1. CÉLULAS UTILIZADAS ..................................................................... 70
3.6.2. VÍRUS UTILIZADOS ...........................................................................
71
3.6.3. POLISSACARÍDEOS DE M. gelidium E G. griffithsiae
UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO ANTIVIRAL ................................................
71
3.6.4. ENSAIO CITOTÓXICO ....................................................................... 72
3.6.5. FORMAÇÃO DE PLACAS EM CÉLULAS Vero ................................ 72
3.6.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL in vitro ................... 73
3.6.7. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE VIRUCIDA in vitro ..................... 74
3.6.8. DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE ADIÇÃO DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS ...................................................................................
75
3.6.9. ENSAIO DE ADSORÇÃO VIRAL .......................................................
75
3.6.10. ENSAIO DE INTERNALIZAÇÃO VIRAL ..........................................
75
4.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................
77
4.1.1. ANÁLISES ESTRUTURAIS DOS POLISSACARÍDEOS DA ALGA
Meristiella gelidium (J. Agardh) .................................................................
77
4.1.2. ANÁLISES REOLÓGICAS DAS GALACTANAS DE Meristiella
gelidium .......................................................................................................
112
4.1.3. ANÁLISES REOLÓGICAS DOS AMIDOS E DAS MISTURAS COM
ι
ιι
ι-CAR ............................................................................................................
117
4.1.4. ATIVIDADE ANTIVIRAL DAS GALACTANAS SULFATADAS ........ 146
4.1.5. ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA E ANTIDENGUE DAS
GALACTANAS DE G. griffithsiae ..............................................................
146
4.1.6. ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA E ANTIDENGUE DAS
GALACTANAS DE M. gelidium E COMPARAÇÃO COM AS
GALACTANAS DE G. griffithsiae. .,............................................................
160
5.0. CONCLUSÕES ................................................................................
163
6.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………...
166
ANEXOS …………………………………………………………………………
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. ESTRUTURA BÁSICA REPETITIVA DE CARRAGENANAS,
(UNIDADES D- ALTERNANTES)......................................................................
4
FIGURA 2. ESTRUTURA BÁSICA REPETITIVA DE AGARANAS
(UNIDADES D- E L- ALTERNANTES) .........................................................
7
FIGURA 3. ESTRUTURAS IDEAIS REPETITIVAS DA (A) (NU-
CARRAGENANA), CONFORMAÇÃO
4
C
1
E DA (B) (IOTA-
CARRAGENANA), CONFORMAÇÃO
1
C
4
...................................................
28
FIGURA 4. FORMAÇÃO DE GEL EM CARRAGENANAS ..........................
35
FIGURA 5: ESCOAMENTO DE FLUÍDO EM REGIME LAMINAR .............. 42
FIGURA 6. FOTO DA ALGA Meristiella gelidium (J. Agardh) ..................
77
FIGURA 7. FLUXOGRAMA DE EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS
DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium ..............................................
78
FIGURA 8. ESPECTRO DE RMN DE
13
C DA FRAÇÃO M5 DE M.
gelidium ........................................................................................................
81
FIGURA 9. ESPECTROS DE RMN DE
13
C DAS FRAÇÕES BRUTAS M1
(A), M2 (B) E M3 (C) DE M. gelidium ..........................................................
83
FIGURA 10. ESPECTROS DE INFRAVERMELHO DAS FRAÇÕES
BRUTAS (M1-M5) EXTRAÍDAS DE ALGA VERMELHA M. gelidium ........
84
FIGURA 11. ANÁLISES DE HOMOGENEIDADE DAS FRAÇÕES M1 (A)
e M3 (B) POR CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAÇÃO (HPSEC-
MALLS) .........................................................................................................
85
FIGURA 12. FLUXOGRAMA (A) FRACIONAMENTO COM KCl; (B)
PURIFICAÇÃO POR CROMOTOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DAS
FRAÇÕES DE M. gelidium ..........................................................................
86
FIGURA 13. ANÁLISE DE HOMOGENEIDADE DA SUBFRAÇÃO M3a
HPSEC-MALLS ............................................................................................
90
FIGURA 14. ANÁLISE DE HOMOGENEIDADE DA SUBFRAÇÃO M3S
POR CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAÇÃO (HPSEC) .......................
96
FIGURA 15. ESPECTRO DE RMN DE
13
C DA FRAÇÃO M3S SOLÚVEL
EM KCl 2M DE M. gelidium ........................................................................
97
FIGURA 16. ESPECTRO DE RMN DE
13
C (A) FRAÇÃO NATIVA M3S-3 E
(B) FRAÇÃO DESSULFATADA M3S-3D ....................................................
103
FIGURA 17. ESPECTROS DE RMN DE
13
C (A) FRAÇÃO NATIVA M3S-4
E (B) FRAÇÃO DESSULFATADA M3S-4D E ANÁLISE DE DEPT ............
107
FIGURA 18. PRINCIPAIS UNIDADES MONOSSACARÍDICAS
PRESENTES NAS AGARANAS M3S-3 E M3S-4 ........................................
111
FIGURA 19. ESTRUTURA REPETITIVA DA IOTA-CARRAGENANA ........
112
FIGURA 20. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO
DECOMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO LINEAR PARA A FRAÇÃO
M1 (10 g/L) EM PRESENÇA DE 120Mm de KCl. (A) FREQUÊNCIA DE
0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C .........
113
FIGURA 21. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA (A) FRAÇÃO M1 (10g/L) EM PRESENÇA
DE KCl 120 mM; (B) FRAÇÃO M3a (10g/L) EM PRESENÇA DE KCl 120
mM. SENSOR C60/2°
°°
°C, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25°
°°
°C ..........................
114
FIGURA 22. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA TEMPERATURA (→
→→
→ AQUECIMENTO DE 5 - 85 °
°°
°C E
RESFRIAMENTO DE 85 - 5 °
°°
°C). (A) FRAÇÃO M1 (10 g/L) EM
PRESENÇA DE KCl 120 mM; (B) FRAÇÃO M3a (10 g/L) EM
PRESENÇA DE KCl 120mM. SENSOR C-60/2°
°°
°, EM FREQUÊNCIA DE 1
Hz E DEFORMAÇÃO DE 1% .......................................................................
116
FIGURA 23. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO
DECOMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE
MILHO COMUM (CS) (25 g/L). (A) FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B)
FREQUÊNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C .................................
119
FIGURA 24. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE
COMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE
MILHO COM ALTOS TEORES DE AMILOSE (MS) (25 g/L). (A)
FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz,
TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C ...........................................................................
119
FIGURA 25. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE
COMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE
MILHO COM ALTOS TEORES DE AMILOPECTINA (WS) (25 g/L). (A)
FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz,
TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C ..........................................................................
120
FIGURA 26. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE
COMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE
CARÁ (YS) (25 g/L). (A) FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA
DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C .........................................................
120
FIGURA 27.REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE
COMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO LINEAR PARA A MISTURA
AMIDO DE CARÁ (20 g/L) −
−−
− ι
ιι
ι-CAR (5 g/L). (A) FREQUÊNCIA DE 0,01
Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE
25 °
°°
°C .............................................................................................................
121
FIGURA 28. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G’’) EM
FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA PARA (A) CS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-
CAR (5 g/L)-CS (20 g/L), SENSOR , pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A
25 °
°°
°C .............................................................................................................
122
FIGURA 29. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G’’) EM
FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA PARA (A) MS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-
CAR (5 g/L)-MS (20 g/L), SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A
25 °
°°
°C .............................................................................................................
122
FIGURA 30. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA PARA (A) WS (25g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-
CAR (5 g/L)-WS (20 g/L), SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A
25 °
°°
°C .............................................................................................................
123
FIGURA 31. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-
CAR (5 g/L)-YS (20 g/L), SENSOR C60/2
o
Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A
25 °
°°
°C .............................................................................................................
124
FIGURA 32. GRÁFICO DE Tan δ
δδ
δ EM FUNÇÃO DA FREQUENCIA PARA
(A) YS (25 g/L) e (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) – YS (20 g/L) ......................
125
FIGURA 33. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA TEMPERATURA PARA (A) MS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-
CAR (5 g/L) – MS (20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUÊNCIA DE 1 Hz E
DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→ AQUECIMENTO DE 5-85 °
°°
°C E
RESFRIAMENTO DE 85-5 °
°°
°C) .....................................................................
126
FIGURA 34. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA TEMPERATURA PARA (A) CS (25 g/L) E (B) ι
ιι
ι-CAR (5 g/L)
– CS (20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUÊNCIA DE 1 Hz E
DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→ AQUECIMENTO DE 5-85 °
°°
°C E
RESFRIAMENTO DE 85-5 °
°°
°C) .....................................................................
127
FIGURA 35. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA TEMPERATURA PARA (A) WS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-
CAR (5g/L) – WS (20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUÊNCIA DE 1 Hz E
DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→ AQUECIMENTO DE 5-85°
°°
°C E
RESFRIAMENTO DE 85-5°
°°
°C) ......................................................................
128
FIGURA 36. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G´´) EM
FUNÇÃO DA TEMPERATURA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-
CAR (5 g/L) −
−−
− YS (20 g/L). SENSOR C60/2
o
Ti, EM FREQUÊNCIA DE 1
Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→ AQUECIMENTO DE 5-85 °
°°
°C E
RESFRIAMENTO DE 85-5°
°°
°C) ......................................................................
130
FIGURA 37. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA PARA (A) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
− YS
(20 g.L
1
), ι
ιι
ι-CAR NÃO AUTOCLAVADA E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
−
YS (20 g.L
1
), ι
ιι
ι-CAR AUTOCLAVADA SEPARADO. SENSOR pp35/Ti,
DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C .................................................................
133
FIGURA 38. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM
FUNÇÃO DA TEMPERATURA PARA (A) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
− YS
(20 g/L), ι
ιι
ι-CAR NÃO AUTOCLAVADA E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
−
YS (20 g/L), ι
ιι
ι-CAR AUTOCLAVADA SEPARADO. SENSOR pp35/Ti,
DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25°
°°
°C ..................................................................
134
FIGURA 39. SISTEMAS PRÉ-AQUECIDOS A 85°
°°
°C. MÓDULO
ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L
) −
−−
− YS
(20 g/L) COM PRÉ-AQUECIMENTO. SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO
DE 1%, A 25 °
°°
°C ............................................................................................
135
FIGURA 40. SISTEMAS PRÉ-AQUECIDOS A 85°
°°
°C. MÓDULO
ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
−
YS (20 g/L) COM PRÉ-AQUECIMENTO. SENSOR pp35/Ti, EM
FREQUÊNCIA DE 1 Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→ AQUECIMENTO
DE 5-85 °
°°
°C E RESFRIAMENTO DE 85-5 °
°°
°C) ..............................................
137
FIGURA 41. VISCOSIDADE DINÂMICA DAS AMOSTRAS DE (A)
MISTURA ι
ιι
ι
FIGURA 48. FLUXOGRAMA (A) EXTRAÇÃO; (B) FRACIONAMENTO
COM KCl E (C) PURIFICAÇÃO POR CROMATOGRAFIA DE TROCA
IÔNICA DAS GALACTANAS DE G. griffithisiae .......................................
147
FIGURA 49. (A) ESTRUTURA DA MÍNIMA SEQÜÊNCIA DE LIGAÇÃO
DO HEPARAN SULFATO. (B) MÍNIMA ESTRUTURA DE LIGAÇÃO DA
AGARANA DE A. spicifera .........................................................................
153
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. CLASSIFICAÇÃO DAS CARRAGENANAS DE ACORDO
COM ESTRUTURAS IDEAIS DE UNIDADES A E B ...................................
6
TABELA 2. PROPRIEDADES IMPORTANTES E APLICAÇÕES DAS
AGARANAS ..................................................................................................
24
TABELA 3. APLICAÇÃO, FUNÇÃO E CONCENTRAÇÃO DAS
CARRAGENANAS EM DIFERENTES PREPARAÇÕES ............................
26
TABELA 4. ALGAS, LOCALIZAÇÃO E COMPOSIÇÃO EM
CARRAGENANAS .......................................................................................
31
TABELA 5. PROCESSAMENTO DE CARRAGENANAS. CAPACIDADE
EM TONELADAS, DADOS DE 2001 ............................................................
33
TABELA 6. SOLUBILIDADE E CAPACIDADE DE GELEIFICAÇÃO DE
DIFERENTES CARRAGENANAS ................................................................
36
TABELA 7. ATIVIDADE ANTIVIRAL DE POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS OBTIDOS DE ALGAS VERMELHAS .................................
53
TABELA 8. RENDIMENTO E ANÁLISE QUÍMICA DAS FRAÇÕES
BRUTAS EXTRAÍDAS DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium .........
79
TABELA 9. COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS FRAÇÕES
BRUTAS OBTIDAS DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium .............
80
TABELA 10. FAIXA DE FRACIONAMENTO, RENDIMENTO E
ANÁLISES QUÍMICAS DAS SUBFRAÇÕES DE M1, M2 E M3 OBTIDAS
APÓS FRACIONAMENTO COM KCl ..........................................................
87
TABELA 11. COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS SUBFRAÇÕES
OBTIDAS APÓS FRACIONAMENTO COM KCl E TRATAMENTO
ALCALINO ....................................................................................................
91
TABELA 12. ASSINALAMENTOS DAS PRINCIPAIS DÍADES
PRESENTES NAS FRAÇÕES M1a, M2b e M3a OBTIDAS ATRAVÉS
FRACIONAMENTO COM KCl DE M. gelidium ..........................................
92
TABELA 13. ANÁLISES DE METILAÇÃO DAS FRAÇÕES M1a E M3a
DE M. gelidium ............................................................................................
95
TABELA 14. RENDIMENTO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES
OBTIDAS DA COLUNA DE TROCA IÔNICA DEAE-SEPHACEL A
PARTIR DA FRAÇÃO M3S ..........................................................................
98
TABELA 15. COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS FRAÇÕES
OBTIDAS POR CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA DEAE-
SEPHACEL E DAS FRAÇÕES DESSULFATADAS M3S-3D E M3S-4D ....
99
TABELA 16. ANÁLISE DE METILAÇÃO DAS FRAÇÕES M3S-3 E
M3S-D ...........................................................................................................
101
TABELA 17. ANÁLISE DE METILAÇÃO DA FRAÇÃO M3S-4 .................. 106
TABELA 18. ASSINALAMENTOS QUÍMICOS DE RMN DE
13
C
OBSERVADOS NA FRAÇÃO M3S-4D de M. gelidium ..............................
109
TABELA 19. COMPOSIÇÃO QUÍMICA (g%) DAS AMOSTRAS DE
AMIDO ..........................................................................................................
118
TABELA 20. ATIVIDADE ANTI-HSV-1 E ENSAIO CITOTÓXICO DE
GALACTANAS ISOLADAS DE G. griffithsiae ...........................................
150
TABELA 21. ATIVIDADE ANTI-HSV-1 E HSV-2 DE GALACTANAS
ISOLADAS DE G. griffithsiae .....................................................................
154
TABELA 22. INFLUÊNCIA DOS DIFERENTES PERIODOS DE
TRATAMENTO NA ATIVIDADE DAS GALACTANAS DE G. griffithsiae
CONTRA HSV-1 ...........................................................................................
155
TABELA 23. ESPECTRO DE ATIVIDADE ANTI-DENGUE DA
GALACTANA G3d EM CÉLULAS VERO ....................................................
157
TABELA 24. ATIVIDADE ANTI-DENGUE DA GALACTANA G3d EM
CÉLULAS VERO, HEPG2, PH E C6/36 HT .................................................
158
TABELA 25. ATIVIDADE ANTIVIRAL CONTRA VÍRUS HERPES
SIMPLEX E VÍRUS DA DENGUE DAS FRAÇÕES DE M. gelidium ..........
161
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
13
C – carbono 13
GLC – cromatografia líquida-gasosa
GC-MS – cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
D
2
O – água deuterada
DEAE – dietilaminoetil
DMSO – dimetil sulfóxido
FT-IR –
espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier
HPSEC- MALLS – cromatografia de exclusão estérica de alta pressão (HPSEC)
acoplada a detector de índice de refração diferencial e espalhamento de luz em
multiângulos (MALLS)
Hz – hertz
ppm – partes por milhão
RMN – ressonância magnética nuclear
TFA – ácido trifluoracético
Galp – unidade de galactose na forma piranosídica
NaNO
2
– nitrito de sódio
NaNO
3
– nitrato de sódio
NaN
3
– azida de sódio
G’ – modulo elástico
G’’ – modulo viscoso
Tan δ
δδ
δ – relação G’’/G’
mPa – mili pascal
HS – heparan sulfato
PFU – unidades formadoras de placas
CC
50
– concentração citotóxica, ou concentração necessária para reduzir em 50%
a viabilidade das células Vero após 48 horas de incubação com cada fração.
IC
50
– concentração inibitória, ou concentração que inibe em 50% o número de
placas em células Vero
SI - índice de seletividade ou CC
50
/IC
50
VC
50
– concentração virucida, ou concentração necessária para inativar os vírus
em 50%.
p.i – pós infecção
MM – meio de manutenção
MEM – meio essencial de Eagle
HPLC – cromatografia líquido-gasosa
DEAE – dietilaminoetil
HPSEC-MALLS – cromatografia de exclusão estérica de alta pressão (hpsec)
acoplada a detector de índice de refração diferencial e espalhamento de luz em
multiângulos (malls)
M – extrato polissacarídico obtido por extração aquosa da alga Meristiela gellidum
M1 – fração obtida a partir da primeira extração aquosa a 25°C
M2 – fração obtida a partir da segunda extração aquosa a 25°C
M3 – fração obtida a partir da primeira extração aquosa a 100°C
M4 – fração obtida a partir da segunda extração aquosa a 100°C
M5 – fração obtida a partir da terceira extração aquosa a 100°C
M1a – fração precipitada entre 1,4 – 1,5 M de KCl obtida a partir de M1
M1a-T – fração M1a após tratamento alcalino
M2a – fração precipitada entre 0,1 – 0,2 M de KCl obtida a partir de M2
M2b – fração precipitada entre 1,0 – 1,2 M de KCl obtida a partir de M2
M3a – fração precipitada entre 0,75 – 1,0 M de KCl obtida a partir de M3
M3a-T – fração M3a após tratamento alcalino
M1S – fração solúvel em KCl 2,0 M obtida da fração M1
M2S – fração solúvel em KCl 2,0 M obtida da fração M2
M3S – fração solúvel em KCl 2,0 M obtida da fração M3
M3S-1 – fração eluída com água mediante cromatografia em DEAE-Sephacel da
fração M3S
M3S-2 – fração eluída com NaCl 0,4 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel fração M3S
M3S-3 – fração eluída com NaCl 0,6 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel fração M3S
M3S-4 – fração eluída com NaCl 0,8 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel fração M3S
M3S-5 – fração eluída com NaCl 1,0 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel fração M3S
M3S-6 – fração eluída com NaCl 2,0 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel fração M3S
G – extrato polissacarídico obtido por extração aquosa da alga Gymnogongrus
griffithsiae
G1 – fração obtida a partir da primeira extração aquosa a 25°C
G2 – fração obtida a partir da segunda extração aquosa a 25°C
G3 – fração obtida a partir da primeira extração aquosa a 100°C
G3a – fração precipitada entre 0,0 -0,1 M de KCl obtida a partir de G3
G3b – fração precipitada entre 0,2 – 0,3 M de KCl obtida a partir de G3
G3c – fração precipitada entre 0,75 – 1,0 M de KCl obtida a partir de G3
G3d – fração precipitada entre 1,0 – 1,2 M de KCl obtida a partir de G3
G3S – fração solúvel em KCl 2,0 M obtida a partir de G3
G3S-1 – fração eluída com água mediante cromatografia em DEAE-Sephacel da
fração G3S
G3S-2 – fração eluída com NaCl 0,25 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel da fração G3S
G3S-3 – fração eluída com NaCl 0,5 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel da fração G3S
G3S-4 – fração eluída com NaCl 0,75M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel da fração G3S
G3S-5 – fração eluída com NaCl 1,0 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel da fração G3S
G3S-6 – fração eluída com NaCl 2,0 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel da fração G3S
G3S-7 – fração eluída com NaCl 4,0 M mediante cromatografia em DEAE-
Sephacel da fração G3S
YS – amido de Cará
MS – amido de milho com altos teores de amilose
CS – amido de milho comum
WS – amido de milho com altos teores de amilopectina
ι
ιι
ι-CAR – iota-carragenana (extrato bruto M1)
RESUMO
Da alga vermelha Meristiella gelidium (Solieriaceae, Gigartinales) foram
obtidas as carragenanas homogêneas M1a (Mw = 425.600 g/mol), M2b (Mw =
950.800 g/mol) e M3a (Mw = 956.700 g/mol) por extração aquosa a 25
o
C e a
100
o
C e fracionamento com KCl. Essas carragenanas sulfatadas (24,0; 25,0;
29,0%, respectivamente) são constituídas majoritariamente por unidades
dissacarídicas repetitivas de iota-carragenana (β-D-galactose 4-O-sulfato e 3,6-
anidro-α-D-galactose 2-sulfato), correspondendo a 84,0% do polímero. Díades de
kappa- (β-D-galactose 4-O-sulfato e 3,6-anidro-α-D-galactose) e nu-carragenana
(β-D-galactose 4-O-sulfato e α-D-galactose 2,6-sulfato), estão presentes em baixa
percentagem 4,0 % e 6,0-8,0%, respectivamente. Além das carragenanas
majoritárias essa espécie biossintetiza agaranas com características estruturais
semelhantes, em relação ao padrão de sulfatação. A agarana M3S-3 (Mw =
187.000 g/mol) possui 40,0% das unidades A 2-O-sulfatadas e as unidades B são
~75,0% substituídas por grupos sulfato no C-3, as quais estão em parte
substituídas em C-2 por unidades simples de xilose (~30,0%) ou grupos sulfato
(~18,0%). Na agarana M3S-4 (Mw = 61.430 g/mol) as unidades A, ~60,0% são
representadas por β-D-galactose 2-sulfato e ~75,0% das unidades B por α-L-
galactose 3-sulfato. Nessa galactana as unidades simples de xilose glicosilam o C-
6 de parte das unidades A. A iota-carragenana presente no extrato bruto M1
(1,0%, 120 mM de KCl), forma gel sem histerese com temperatura de transição
fita-hélice acima de 45 °C, característico dos géis de iota-carragenana. As
misturas formadas pela iota-carragenana (0,5% p/p) e amidos (20,0% p/p) quando,
autoclavadas juntas sem pré-aquecimento e sem sal, originam soluções
viscoelásticas com os amidos de milho comum, amido de milho rico em amilose e
amido de milho rico em amilopectina. De maneira distinta a iota-carragenana com
o amido de cará forma um gel forte. Efeito sinérgico demonstrado pela maior
diferença entre os módulos elástico (G’) e viscoso (G’’) ocorre em função da
temperatura, entre 45 − 85°C, nas pastas iota-carragenana e amido de milho
comum, amido de milho rico em amilose e amido de milho rico em amilopectina.
Na pasta formada com o amido de milho rico em amilose, a iota-carragenana
evitou a histerese térmica. A presença do ficocolóide não alterou o comportamento
do amido de milho comum e na pasta formada com o amido de cará a histerese
não foi evitada. O processo de autoclavação dos polímeros juntos é importante no
que diz respeito à solubilização do amido, alterando a formação de gel. A pasta
pré-aquecida (85°C) e sem sal, formada pela iota-carragenana e amido de cará
origina um gel mais forte, porém com intensa histerese térmica. A presença de sal
(KCl 120 mM) no sistema, estabiliza as hélices da carragenana formando uma
rede mais estável e um gel sem histerese térmica. O sal evita a histerese,
enquanto que o pré-aquecimento permite a formação de um gel mais forte, porém
com intensa histerese térmica. Os extratos brutos M1 e M3 e a carragenana M3a
de M. gelidium, assim como as frações obtidas de Gymnogongrus griffithsiae
(Phyllophoraceae, Gigartinales) (G3, G3d, G3S, G3S-1, G3S-3, G3S-4, G3S-5 e
G3S-6) possuem atividade antiviral contra o vírus da herpes simplex e/ou o vírus
da dengue. Esses polissacarídeos apresentam atividade antiherpética frente a
diferentes cepas de HSV-1 e HSV-2, são desprovidas de citotoxicidade contra
células Vero e atuam inibindo a etapa de adsorção do vírus à célula hospedeira. O
extrato bruto G3 e a carragenana G3d de G. griffithsiae apresentam potente
atividade antiherpética (IC
50
~1 µg/ml). A carragenana M3a de M. gelidium
apresentou maior atividade contra HSV-2 e DENV-2 (frente à células Vero) do que
a carragenana G3d de G. griffithsiae. As galactanas M1, M3 e M3a apresentam
potente atividade contra HSV-2 (IC
50
0,04 – 0,06 µg/mL) e são desprovidas de
atividade citotóxica (CC
50
> 1000 µg/mL). A carragenana M3a é o composto que
apresenta maior IS relatado na literatura (IS 25000). Assim as galactanas de M.
gelidum são promissores compostos antiherpéticos e apresentam propriedades
reológicas com potencial utilização industrial.
ABSTRACT
The carrageenans M1a (Mw = 425,600), M2b (Mw = 950,800) e M3a (Mw =
956,700) were obtained from the red seaweed Meristiella gelidium (Solieriaceae,
Gigartinales) by successive aqueous extraction at 25
o
C and 100
o
C followed by KCl
precipitation. These sulfated carrageenans (24.0; 25.0; 29.0%, respectively) are
mainly constituted (84,0%) by repeating units of iota-carrageenan (β-D-galactose 4-
O-sulfate and 3,6-anidro-α-D-galactose 2-sulfate). Kappa- (β-D-galactose 4-O-
sulfate and 3,6-anidro-α-D-galactose) and nu-carrageenan (β-D-galactose 4-O-
sulfate and α-D-galactose 2,6-sulfate) are present in low amounts of 4.0 % and 6.0-
8.0%, respectively. In addition to carrageenans, this species biosynthesizes
agarans, with similar structural characteristics of sulfatation distribution. The units
A (3-O-substituted β-D-galactose) in the agaran M3S-3 (Mw = 187.000) are 40.0%
2-O-sulfated and the units B (4-O-substituted α-L-galactose) are ~75.0% 3-O-
sulfated. The B units are ~30.0% substituted at C-2 by xylose or sulfate (~18.0%).
In the agaran M3S-4 (Mw = 61.430) the A units are ~60.0% β-D-galactose 2-sulfate
and ~75.0% of it´s B units are α-L-galactose 3-sulfato. A part of the A units are,
substituted by xylose at C-6. The gel formed by iota-carrageenan present in the
crude extract M1 (1.0%, 120 mM of KCl), did not showed hysteresis and its
conformational coil-helix transition is upper 45 °C, characteristic of an iota-
carrageenans’s gel. Iota-carrageenan (0.5% w/w) and starch (2.0% w/w) mixtures,
when autoclaved together without pre-heating and salt, gave rase to viscoelastic
solutions in systems with common corn starch, corn starch rich in amylose, and
waxy corn starch components. In contrast the iota-carrageenan with yam starch
formed a strong gel. In the range of temperature 45 − 85°C, a strong interaction
between biopolymers was observed, reflected by a difference between the moduli
elastic (G’) and viscous (G’’) in the mixtures with common corn starch, corn starch
rich in amylose and waxy corn starch. In the paste formed by corn starch rich in
amylose, did not occur thermal hysteresis. The rheological characteristics of the
paste formed with common corn starch were not modified by the presence of iota-
carrageenan. A strong interaction between iota-carrageenan yam starch was
observed when they were autoclaved together, as a gel was formed. When this
system was pre-heated (85°C) without salt a stronger gel was formed but
hysteresis was present. In contrast, when salt (KCl 120 mM) was present, the
carrageenan helices were more stable and the water was retained. The salt in the
system did not allow hysteresis and the pre-heating gave rase to a stronger gel,
but with intense thermal hysteresis. The crude extracts M1, M3 and the
carrageenan M3a from M. gelidium as with the fractions obtained from
Gymnogongrus griffithsiae (Phyllophoraceae, Gigartinales) (G3, G3d, G3S, G3S-1,
G3S-3, G3S-4, G3S-5 e G3S-6) had antiviral activity against herpes simplex and
dengue viruses. These polysaccharides are effective against HSV-1 and HSV-2,
were not cytotoxicy to Vero cells, and influence virion binding to the host cell. The
crude extract G3 and the carrageenan G3d from G. griffithsiae had potent antiviral
activity (IC
50
~1 µg/mL). The effectiveness of carrageenan M3a from M. gelidium
was greater against HSV-2 and DENV-2 (in Vero cells) than the corresponding
carrageenan G3d from G. griffithsiae. The galactans M1, M3 and M3a are the most
potent polysaccharides against HSV-2 (IC
50
0,04 – 0,06 µg/mL), without any
cytotoxicity (CC
50
> 1000 µg/mL). The selectivity index of carrageenan M3a (IS =
25.000) is the highest found in the literature. In this way, the galactans from M.
gelidium showed potential as antiherpectic compounds and had rheological
properties possible industrial utilization.
1. INTRODUÇÃO
1.1. ALGAS VERMELHAS
Entre as macroalgas, as algas vermelhas (Rhodophyta), representam o
grupo com maior diversidade de espécies (USOV, 1992) incluindo
aproximadamente 6.000 espécies, sendo 100 de água doce (RAVEN et al., 2001).
Elas são comuns ao longo da costa brasileira, sendo mais abundantes e
diversificadas na costa nordeste do país. Outras áreas de alta biodiversidade são
encontradas nos costões rochosos desde o norte do estado do Espírito Santo até
a Ilha de Santa Catarina (SAITO; OLIVEIRA, 1990).
As algas pertencentes à divisão Rhodophyta são, do ponto de vista
econômico as mais exploradas, pois, biossintetizam uma grande variedade de
galactanas sulfatadas como principais componentes da matriz intercelular (USOV,
1998). Esses polissacarídeos são utilizados em setores economicamente
importantes, como nas indústrias alimentícias e farmacêuticas apresentando alto
potencial biotecnológico, despertando interesse mundial, devido ao seu alto valor
econômico (DE RUITER; RUDOLPH, 1997).
Além da importância industrial as galactanas têm despertado interesses na
área biomédica, pois são promissoras como compostos biologicamente ativos
desempenhando atividade antiviral (DUARTE et al., 2001, 2004; TALARICO et al.,
2004, 2005; DAMONTE et al., 1996; CÁCERES et al., 2000,) anticoagulante
(CARLUCCI et al., 1997; FARIAS et al., 2000), antitrombótica (SEN et al., 2002),
antiangiogênica (SATORU et al., 2003) e antitumoral (FERNANDEZ et al., 1989;
ZHOU et al., 2004).
Segundo KLOAREG; QUATRANO (1988) os polissacarídeos da matriz das
algas marinhas, estão correlacionados com a regulação osmótica ou iônica,
adaptando-as ao ambiente marinho. Ainda com função de osmorregulação, as
algas biossintetizam carboidratos de baixo peso molecular e/ou polióis
(KARSTEN; BARROW; KING, 1993).
2
Como polissacarídeo de reserva elas sintetizam um polímero constituído
por α-D-glucose, denominado “amido das florídeas”, com ligações glicosídicas do
tipo α-(1→4) e pontos de ramificação no carbono-6 similar a amilopectina
(PAINTER, 1983), porém possui uma proporção maior de ramificações
assemelhando-se ao glicogênio animal.
A determinação estrutural das galactanas sulfatadas contribui para a
prospecção de novas aplicações industriais e biológicas além de ser útil como
ferramenta para posicionamento taxonômico das algas vermelhas.
1.2. GALACTANAS: ESTRUTURA GERAL
As galactanas sulfatadas de algas marinhas são polímeros lineares,
constituídos por unidades de β-galactopiranose substituídas glicosidicamente na
posição 3 (unidade A) e α-galactopiranose substituídas glicosidicamente através
da posição 4 (unidade B) (PERCIVAL; McDOWELL, 1967). A unidade A sempre
pertence à série estereoquímica D e a estereoquímica da unidade B é a base para
a classificação geral das galactanas, sendo classificadas como agaranas (série L)
ou carragenanas (série D) (PAINTER, 1983). Deste modo formam um arranjo
alternado entre as unidades A e B (AB)
n
.
[ (→
→→
→3)-β
ββ
β-D-galactopiranose - (1→
→→
→4)-α
αα
α-galactopiranose-(1→
→→
→) ]
unidade A unidade B
Uma característica estrutural particular dos polissacarídeos sintetizados
pelas algas vermelhas é a presença da unidade B total ou parcialmente ciclizada
na forma de 3,6-anidrogalactose. As galactanas sulfatadas que apresentam este
anidro-açúcar na sua estrutura, podem apresentar propriedades geleificantes ou
viscosantes (RENN, 1997) e são denominadas de ficocolóides ou hidrocolóides,
n
3
pela elevada capacidade que apresentam de formar géis em meios aquosos
(GLICKSMAN, 1987).
Estudos estruturais detalhados têm demonstrado que uma importante
característica de vários polissacarídeos de algas vermelhas é a presença de
grupos estruturais dissacarídicas de carragenanas e agaranas na mesma
molécula. Esse tipo estrutural foi denominado de carrágar por CHOPIN; KERIN;
MAZEROLLE (1999) e posteriormente STORZ; CEREZO (2000) adotaram o termo
galactana DL-híbrida. Foi definido então um terceiro grupo de polissacarídeos,
onde as unidades de α-galactose ou 3,6-anidro-α-galactose podem apresentar
tanto a configuração D (D ou DA) como L (L ou LA).
Essa estrutura alternante de unidades (13) β-galactopiranose e (14)
α-galactopiranose das galactanas, pode apresentar variações estruturais como a
presença de grupos metil, éster sulfato, acetal de ácido pirúvico, cadeias laterais
de β-D-xilopiranose, entre outros.
A unidade B, α-galactopiranose, pode apresentar cadeias laterais de β-D-
xilopiranose no C-3 e/ou no C-6, grupos metil, assim como grupos sulfato podem
estar presentes nos C-2, C-3 e/ou C-6 ou ainda esta unidade pode apresentar-se
total ou parcialmente ciclizada como 3,6-anidro-α-galactopiranose, com ou sem
grupo metil ou sulfato no C-2 (PAINTER, 1983).
Por sua vez a unidade A, β-galactopiranose pode apresentar acetal de
ácido pirúvico nas posições C-4 e C-6 e grupos metil, sulfato assim como cadeias
laterais de xilose em C-2, C-4 e C-6.
Esta variabilidade estrutural das galactanas biossintetizadas pelas algas
vermelhas é normalmente explicada em decorrência de modificações incompletas
ou irregulares que ocorrem a partir do esqueleto das unidades de galactose pré-
formado. A biossíntese das galactanas de algas vermelhas envolveria os
seguintes passos: i) formação da cadeia regular de unidades de galactose a partir
de açucares-UDP (GOULARD et al., 1999); ii) sulfatação de vários grupos
hidroxilas e/ou substituição com outros grupos constituintes (xilose, ácido pirúvico,
metil) e por fim iii) eliminação enzimática dos grupos sulfato do C-6 de algumas
4
unidades de 4)- α-galactose 6-sulfato-(1, originando as unidades 4)- 3,6-
anidro-α-galactose (1 e seu derivado sulfatado em C-2 (REES, 1961a e b).
Desse modo, as galactanas sulfatadas apresentam ampla diversidade
estrutural dependendo da espécie, e em decorrência, diferentes propriedades
físico-químicas e biológicas.
1.2.1. CARRAGENANAS
As carragenanas são conhecidas desde o século XVIII quando eram
utilizadas pela população de Carrageen (cidade costeira da Irlanda), como
agentes espessantes e geleificante em alimentos caseiros. Estes polissacarídeos
normalmente apresentam mais grupos sulfato que as agaranas, e a capacidade de
formar gel depende, da interação de determinados cátions, especialmente K
+
/Ca
2+
e a presença das unidades 3,6-anidro-α-D-galactopiranose na díade repetitiva.
Basicamente, as carragenanas apresentam uma estrutura linear repetitiva
unidade A (β-D-galactopiranose) e unidade B (α-D-galactopiranose) (Figura 1).
FIGURA 1. ESTRUTURA BÁSICA REPETITIVA DE CARRAGENANAS, (UNIDADES D-
ALTERNANTES).
R = H, SO
-
3
ou CH
3
O
OR
OR
O
O
OR
O
OR
OR
OR
n
5
As carragenanas são agrupadas em quatro famílias de acordo com a
posição dos grupos sulfato na unidade β-D-galactose, sendo nominadas com
letras do alfabeto grego.
I - Família Kappa (κ): grupos sulfato em C-4.
II - Família Lambda (λ): grupos sulfato em C-2.
III - Família Ômega (ω): grupos sulfato em C-6.
IV - Família Beta (β): não possui grupos sulfato na unidade A.
Na Tabela 1 está demonstrada a classificação das carragenanas baseada
nas díades ideais repetitivas. É importante ressaltar que as algas sintetizam
polissacarídeos com uma ou mais díades repetitivas na mesma molécula em
diferentes proporções, as quais recebem a denominação de carragenanas
híbridas (carragenana kappa / iota).
Na família Kappa estão presentes as carragenanas com maior valor
econômico, as geleificantes kappa e iota e a não geleificante lambda. A diferença
na capacidade de geleificação das carragenanas foi explorada como um processo
de separação das mesmas. O primeiro exemplo de separação de carragenanas
estruturalmente diferentes foi realizado a partir da alga vermelha Chondrus crispus
com base na capacidade diferencial de geleificação em solução de cloreto de
potássio, a partir de exemplares que pertenciam a diferentes estados reprodutivos
(McCANDLESS et al., 1973).
Observou-se que as plantas esporofíticas das algas do gênero Chondrus
produzem lambda-carragenana, enquanto plantas gametofíticas (ver item 1.3)
produzem carragenanas híbridas kappa/iota (McCANDLESS et al., 1982), o que
demonstra que as variações quanto ao tipo de estrutura não ocorrem somente
entre diferentes espécies, mas que de acordo com os estágios de vida, uma
mesma espécie pode produzir diferentes tipos de carragenanas.
Variações estruturais foram observadas, como as carragenanas com alto
teor de piruvatação (43-49%) sintetizadas pelas algas do gênero Callophycus
(CHIOVITTI et al.,1997) e carragenanas altamente metiladas (6-O-metil-β-D-
6
galactose) biossintetizadas por espécies do gênero Rhabdonia (17-31%)
(CHIOVITTI et al., 1996) e do gênero Claviclonium (45%) (CHIOVITTI et al., 2004).
TABELA 1. CLASSIFICAÇÃO DAS CARRAGENANAS DE ACORDO COM
ESTRUTURAS IDEAIS DE UNIDADES A E B.
Família (→
→→
→3)-β
ββ
β-D-Galp – (1→
→→
→4) -α
αα
α-D-Galp -(1→
→→
→)
(Unidade A) ( Unidade B)
Nomenclatura de
KNUTSEN et al. (1994)
KAPPA
κ (kappa)
4-sulfato – 3,6-anidrogalactose G4S – DA
ι (iota)
4-sulfato – 3,6-anidrogalactose 2-sulfato G4S – DA2S
µ (mu)
4-sulfato – 6-sulfato G4S – D6S
ν (nu)
4-sulfato – 2,6-dissulfato G4S – D2,6S
LAMBDA
λ (lambda)
2-sulfato – 2,6-dissulfato G2S – D2,6S
ξ (xi)
2-sulfato – 2-sulfato G2S – D2S
π (pi)
2-sulfato; 4,6-O-(1’-carboxietilideno) – 2-sulfato GP,2S – D2S
θ (theta)
2-sulfato – 3,6-anidrogalactose 2-sulfato
*
G2S – DA2S
OMEGA
ω (omega)
6-sulfato – 3,6-anidrogalactose G6S – DA
ψ (psi)
6-sulfato – 6-sulfato G6S – D6S
BETA
β (beta)
não-sulfatada – 3,6-anidrogalactose G – DA
α (alpha)
não sulfatada – 3,6-anidrogalactose 2-sulfato G – DA2S
γ (gamma)
não sulfatada – 6-sulfato G – D6S
δ (delta)
não sulfatada – 2,6-dissulfato G – D2,6S
*A θ-carragenana não é biossintetizada naturalmente pelas algas, para sua obtenção é necessário o
tratamento alcalino da λ-carragenana.Tabela modificada de: KNUTSEN et al. (1994).
7
1.2.2. AGARANAS
As galactanas deste grupo apresentam a estrutura repetitiva formada por
unidades de (13)-β
8
por ter sido isolada pela primeira vez de algas do gênero Porphyra (REES, 1961b)
e posteriormente em algas do gênero Bangia (ASPINALL, 1970).
Na fração que foi denominada agaropectina estão presentes agaranas com
grupos sulfato em várias posições com percentagens que variam de 3% a 10%,
grupos metil nas unidades β-D-galactose 4-metil, α-L-galactose 4-metil e α-L-
galactose 2-metil e pequenas quantidades de ácido pirúvico na unidade β-D-
galactose (DUCKWORTH e YAPHE, 1970).
A variabilidade estrutural nas agaranas está relacionada, como nas
carragenanas, com presença dos grupos sulfato, metil e ácido pirúvico. As
unidades β-D-galactose podem estar piruvatadas, metiladas (6-O-metil-L-
galactose) e apresentar cadeias laterais de 4-O-metil-α-L-galactose, α-L-galactose
e ou β-D-xilose (STORTZ e CEREZO 2000).
As agaranas são principalmente biossintetizadas pelas algas vermelhas
pertencentes às ordens Gelidiales e Gracilariales, sendo que agaranas com
diversas modificações estruturais podem ainda ser sintetizadas por algas das
ordens Bangiales, Ceramiales, Corallinales e Nemaliales (MILLER 1997; CHOPIN
et al., 1999; STORZ e CEREZO, 2000).
As agaranas são amplamente utilizadas nas indústrias farmacêuticas,
alimentícias, assim como meio de cultura para análise microbiológica. A agarose
possui alto valor econômico devido à sua elevada capacidade de geleificação,
porém a presença de substituintes e de unidades precursoras diminui este poder
geleificante (FALSHAW et al., 1998).
1.2.3. GALACTANAS DL-HÍBRIDAS
Este terceiro grupo de galactanas não apresenta uma estrutura regular,
mas sim características de carragenanas e de agaranas na mesma molécula. Com
o uso de técnicas de fracionamento e caracterização mais apuradas este grupo de
galactanas está sendo encontrado em algas pertencentes a diferentes ordens,
entre elas em maior proporção nas ordens Rhodymeniales, Plocamiales e
Halymeniales (STORTZ e CEREZO, 2000). CHOPIN et al. em 1999 denominaram
9
este tipo estrutural de carrágar e posteriormente STORTZ e CEREZO (2000)
adotaram o termo galactana DL-híbrida, para diferenciá-las do termo híbrido
utilizado para as carragenanas.
[→
→→
→3)-β
ββ
β-D-galactopiranose-(1→
→→
→4)-α
αα
α-D/L-galactopiranose-(1→
→→
→]n
unidade A unidade B
Ainda não está claro se estas estruturas se encontram na forma de blocos
na mesma molécula ou se estão em um mesmo sistema, porém em moléculas
separadas. Até o momento a definição das galactanas DL-híbridas é realizada de
acordo com a proporção da configuração presente na unidade B, se maior
configuração L-, denomina-se: DL-híbrida com predomínio da estrutura de
agarana, e se predomina configuração D-: DL-híbrida com predomínio da estrutura
de carragenana.
Uma ferramenta estrutural muito importante na caracterização dessas
galactanas é a determinação das unidades enantioméricas, que em conjunto com
técnicas de fracionamento mais minuciosas têm permitido o isolamento e a
caracterização desses polissacarídeos em extratos de algas que anteriormente
eram consideradas somente produtoras de carragenanas (carragenófitas)
(CIANCIA et al., 1993; STORTZ et al., 1997), por exemplo, ordem Gigartinales, ou
produtoras de agaranas (agarófitas) (TAKANO et al., 1999; TAKANO et al., 2003)
como foi observado em espécies pertencentes à ordem Ceramiales.
Avanços nas pesquisas voltadas à determinação estrutural de
polissacarídeos provavelmente levará à caracterização de novas galactanas DL-
híbridas. Estas descobertas podem ter um impacto quimiotaxômico, visto que a
reanálise de polissacarídeos de algas, anteriormente consideradas produtoras
somente de carragenanas ou agaranas, são na realidade produtoras de mais de
um tipo de galactana (STORTZ e CEREZO, 2000).
10
1.3. CICLO DE VIDA E REPRODUÇÃO DAS ALGAS VERMELHAS
O tipo de ciclo de vida, em conjunto com outros caracteres, também é uma
ferramenta importante utilizada na classificação das algas vermelhas. A
reprodução das Rhodophyta ocorre pela fusão de um pequeno gameta masculino,
denominado espermácio, com o gameta feminino denominado carpogônio. O
carpogônio se desenvolve no interior do oogônio (gametângio feminino) e os
espermácios são células esféricas, sem parede celular que se desenvolvem
dentro dos espermatângios (gametângio masculino) (MASUDA et al., 1996).
Na maioria das algas vermelhas, o carpogônio se forma no ápice de um
conjunto de células especializadas denominadas de ramo carpogonial. O número
de células de cada ramo, a presença ou não de células acessórias e o número de
carpogônios por cada ramo carpogonial são características de cada grupo
taxonômico. Geralmente, cada espermatângio produz somente um espermácio
que é liberado e levado pela água passivamente até o carpogônio, e como
resultado da fertilização do carpogônio, se desenvolve uma fase diplóide, in situ,
sobre o gametófito feminino, denominada carposporófito (HOMMERSAND e
FREDERICQ, 1990).
O carposporófito quando maduro produz carpósporos, que são esporos de
origem mitótica, os quais são liberados e, se em condições adequadas, germinam
e originam a outra fase diplóide de vida livre, denominada tetrasporófito. Nessa
fase serão formados os tetrasporângios (que dão origem a esporos por meiose)
nos quais se originam os tetrásporos. Ao ser liberado, o tetrásporo de natureza
haplóide, quando encontra um habitat adequado, por divisões mitóticas originará
os gametófitos (masculino ou feminino), completando o ciclo de vida trifásico
característico e único das algas vermelhas (HOMMERSAND e FREDERICQ,
1990).
Baseando-se no ciclo de vida constituído pelas fases gametófiticas
(haplóide-n), carposporofítica (diplóide-2n) e tetrasporofítica (diplóide-2n), o tipo
Polysiphonia é denominado quando tanto o gametófito quanto o tetrasporófito são
morfologicamente idênticos, tendo o ciclo de vida uma alternância isomórfica. Em
11
contraste quando há alternância heteromórfica das gerações, o ciclo de vida é
denominado, Bonnemaisonia (MASUDA et al., 1996).
As fases gametofíticas, masculina e feminina se desenvolvem em plantas
independentes e macroscópicas na grande maioria das famílias pertencentes à
ordem Gigartinales. No entanto o ciclo de vida trifásico das algas vermelhas pode
apresentar modificações ou reduções em algumas de suas fases.
Na família Phyllophoraceae, a literatura relata uma notável diversidade no
tipo de ciclo de vida, como por exemplo, quando as algas não possuem
carposporófitos, mas sim tetrasporófitos, que são parasitados e se desenvolvem
sobre os gametófitos femininos. Este ciclo é bifásico e se denomina
tetrasporoblástico, ou tipo Gymnogongrus griffitsiae, ou seja, em uma mesma
planta se desenvolve a fase gametofítica (masculina e feminina) e a fase
tetrasporofítica. Algas pertencentes a esta família podem apresentam, além do
tipo tetrasporoblástico, os outros dois tipos já citados Polysiphonia e
Bonnemaisonia e ainda o ciclo de vida direto no qual só estão presentes os
gametófitos femininos (KAPRAUM et al., 1993).
Em muitas famílias pertencentes à ordem Gigartinales há produção de
diferentes polissacarídeos de acordo com a fase do ciclo de vida que a alga se
encontra. Nas famílias Gigartinaceae e Phyllophoraceae, as algas na fase
gametofítica (n) produzem carragenanas da família kappa, enquanto que os
esporofitos (2n) biossintetizam carragenanas da família lambda (McCANDLESS et
al., 1982).
1.4. ORDEM GIGARTINALES: VARIABILIDADE ESTRUTURAL DAS
GALACTANAS E SIGNIFICADO QUIMIOTAXONÔMICO
A estrutura química dos polissacarídeos solúveis em água biossintetizados
pelas algas vermelhas até pouco tempo atrás era utilizada como base para
classificação das algas dentro da ordem Gigartinales. Um exemplo é a afirmação
que as carragenófitas eram exclusivas desta ordem, assim como as agarófitas
12
estavam compreendidas nas ordens Bangiales, Ceramiales, Gelidiales e
Gracilariales.
A ordem Gigartinales é a mais numerosa dentro da divisão Rhodophyta e
com a criação das ordens Gracilariales (FREDERICQ e HOMMERSAND, 1989),
Plocamiales (SAUNDERS e KRAFT, 1996), Ahnfeltiales (MAGGS e PUESCHEL,
1989) e Halymeniales (SAUNDERS e KRAFT, 1996), aproximadamente 10
gêneros e 172 espécies foram removidas da ordem Gigartinales, que atualmente é
composta por 41 famílias, 100 gêneros e 700 espécies (CHOPIN et al., 1999).
A necessidade destas alterações taxonômicas e criações de novas ordens
é uma resposta não somente dos avanços nas análises estruturais dos
polissacarídeos biossintetizados pelas Rhodophyta, mas também das análises
seqüenciais do gene rbcL (subunidade maior da rubisco) (FRESHWATER et al.,
1994) que demonstram que este é um grupo heterogêneo e polifilético.
Em 1996, FREDERICQ et al. apresentaram a hipótese de relação
filogenética entre 57 espécies pertencentes a 37 famílias de algas vermelhas
produtoras de carragenanas, agaranas ou que apresentam ambas as estruturas,
dentro da ordem Gigartinales, baseado nas seqüências de rbcL.
De acordo com os trabalhos de CRAIGIE em 1990 e MILLER em 1997,
espera-se que as galactanas produzidas pelas algas da ordem Gigartinales sejam
carragenófitas, porém tem-se observado e destacado nesta ordem a presença de
algas produtoras de agaranas e galactanas DL-híbridas (USOV e KLOCHKOVA,
1992; CHOPIN et al., 1999; TAKANO et al.,1995; ESTEVEZ et al., 2001;
ESTEVEZ et al., 2004).
De acordo com STORTZ; CEREZO (2000) as famílias dentro da ordem
Gigartinales poderiam ser divididas em três grupos: (i) famílias que apresentam
alternância biossintética de carragenanas (Gigartinaceae, Petrocilidaceae e
Phyllophoraceae), (ii) famílias que não apresentam uma característica estrutural
dos seus biopolímeros de acordo com a fase do ciclo de vida da alga
(Sarcodiaceae, Solieriaceae, entre outras) e (iii) famílias pertencentes à antiga
ordem Cryptonemiales (Tichocarpaceae, Endocladiaceae, Kallymenaceae e
13
Dumontiaceae). As algas pertencentes às famílias Phyllophoraceae e Solieriaceae
serão discutidas em um item à parte.
A presença de carragenanas com “díades desviantes” como, por exemplo,
ricas em grupos metil e com estruturas mais complexas é um exemplo da
influência dos polissacarídeos biossintetizados pelas algas na classificação
taxonômica das mesmas. Essas variações estruturais fizeram com que alguns
gêneros pertencentes à família Solieriaceae e Cystocloniaceae fossem agrupados
na família Areschougiaceae.
CHIOVITTI et al., em 1996 observaram que algas da família Solieriacea
(Rhabdonia coccinea e Rhabdonia verticillata) eram uma rica fonte de
polissacarídeos de parede celular do tipo iota-carragenana altamente metilada, e
devido ao alto grau de grupos O-metil (31% e 17% respectivamente) estes
polissacarídeos foram considerados distintos dos demais da família Solieriaceae.
Dois anos depois CHIOVITTI et al. (1998b) analisando os polissacarídeos
de três espécies do gênero Erythroclonium (Solieriaceae) por análise de
infravermelho, RMN de
13
C e análise de metilação constatou grande semelhança
estrutural dos seus polissacarídeos constituídos por iota- e alfa-carragenana 6-O-
metiladas, podendo estar ainda substituídas por ácido pirúvico e as unidades B (α-
D-galactopiranosil) presentes principalmente não substituídas ou em menores
proporções 3-O-metiladas e com terminal glicosil.
Fazendo parte da família Cystocloniaceae (Gigartinales, Rhodophyta),
CHIOVITTI et al., (1998c) analisaram os polissacarídeos biossintetizados pelas
algas dos gêneros Austroclonium, Gloiophyllis, Erythronaema e Stictosporum.
Todas as espécies analisadas produziam tipicamente iota-carragenana com
exceção da alga do gênero Austroclonium que biossintetizava uma galactana
sulfatada contendo predominantemente estrutura repetitiva de iota- e alfa-
carragenanas 6-O-metiladas. A produção destas carragenanas se assemelha aos
polissacarídeos sintetizados pelas algas Rhabdonia e Erythroclonium
(Solieriaceae), mas que também produzem carragenanas significativamente
diferentes de outros gêneros dentro desta família.
14
Em 2001 CHIOVITTI et al avaliaram as estruturas químicas e as
implicações filogenéticas das carragenanas parcialmente metiladas,
biossintetizadas pelas algas do gênero Areschougia. As análises estruturais
demonstraram que há predominância de variações sobre a estrutura repetitiva da
iota-carragenana, como a presença de 6-O-metil (G4S,6M-DA2S e G6M-DA2S),
ácido pirúvico (GP - DA2S) e ainda menores proporções de grupos metil, sulfato
e/ou glicosil substituindo o C-3 das unidades α-D-galactopiranose. Foi
demonstrado que essas galactanas sulfatadas são ricas em mono-O-metil
galactose, o que as assemelha com as algas dos gêneros Rhabdonia,
Erythroclonium e Austroclonium, constituindo desse modo a família
Areschougiaceae.
Na família Sarcodiaceae, inicialmente foi demonstrado que algas do gênero
Sarcodia biossintetizam em ambos os estágios gametofíticos e tetrasporofitico,
polissacarídeos equivalentes à lambda-carragenana (LIAO et al., 1993). Porém,
Em 2003, MILLER, realizou a análise estrutural por RMN de
13
C dos
polissacarídeos de Sarcodia montagneana e Sarcodia flabellata e demonstrou que
as unidades β-D-galactopiranosil estão principalmente substituídas por grupos
sulfato no C-2 e acetal de ácido pirúvico. As unidades 4-O-ligadas (α-
galactopiranosil) estão quase exclusivamente na configuração L, sulfatadas
principalmente no C-3 e C-2 e ainda estão presentes quantidades significativas
destas unidades sulfatadas nos carbonos 2, 3 e 6. Estes polissacarídeos de
Sarcodia apresentam muita similaridade com os polissacarídeos biossintetizados
por algas do gênero Trematocarpus (MILLER, 2002).
As famílias pertencentes à antiga ordem Cryptonemiales (Tichocarpaceae,
Endocladiaceae, Kallymenaceae e Dumontiaceae) estão agora incluídas na ordem
Gigartinales (SAUNDERS e KRAFT, 1996).
Os polissacarídeos sintetizados pelas algas pertencentes a estas famílias
apresentam grande variedade estrutural, como observado nas algas do gênero
Kallymenia (K. reniformis e K. westii) (Kallymenaceae) (DESLANDES et al., 1990;
CHOPIN et al., 1994) que sintetizam galactanas denominadas genericamente de
aeodanas. Estes polímeros apresentam uma estrutura majoritária de carragenana,
15
porém grupos sulfato apenas nas unidades A, principalmente em C-2 e C-4,
grupos metoxil geralmente localizados em C-6 das unidades A e em C-2 das
unidades B e pequena percentagem de α-L-galactose (USOV et al., 1980).
Uma galactana com estrutura muito mais complexa foi isolada da alga K.
berggrenii (MILLER e FURNEAUX, 1996). Esta alga biossintetiza uma galactana
DL-híbrida, cuja estrutura não foi completamente elucidada, mas que apresenta
relativamente altas percentagens de 3,6-anidrogalactose e seu derivado 2-O-metil
galactose, possuindo ainda galactose, 2-O-metilgalactose, 6-O-metilgalactose,
xilose e acetal de ácido pirúvico. Este polissacarídeo possui ainda grupos sulfato
substituindo os carbonos 2 e 6 em ambas as unidades, demonstrado pelas
análises de metilação realizadas antes e após o processo de dessulfatação.
Na família Endocladiaceae, WHYTE et al. (1984), observaram que a alga
Endocladia muricata, biossintetiza um polissacarídeo constituído principalmente
por carrabiose [β-D-galactose-(1→4)-3,6-anidro-α-D-galactose], mas também com
6% de agarobiose [β-D-galactose-(1→4)-3,6-anidro-α-L-galactose]. Nesta mesma
família, algas do gênero Gloiopeltis, foram classificadas como agarófitas, devido à
caracterização dos seus polissacarídeos como agaranas sulfatadas, como por
exemplo, em G. cervicornis (PENMAN e REES, 1973).
Pórem, TAKANO et al. em 1995 isolaram de G. complanata um
polissacarídeo com estrutura híbrida de carragenana e agarana e em 1998 o
mesmo grupo (TAKANO et al., 1998) caracterizou da alga Gloiopeltis complanata
um polissacarídeo que por hidrólise parcial, originou oligossacarídeos com
estrutura de carragenana, e outros com estrutura de agarana. Resultados
diferentes foram observados dentro do mesmo gênero com as espécies G.
coliformis e G. tenax, caracterizadas como produtoras de carragenanas (CHOPIN
et al., 1999).
CHOPIN et al. (1999), classificaram as espécies: Constantinea rosa-marina,
C. subulifera, Cryptosiphonia woodii, Neodilsea borealis, N. natashae e N.
yendoana pertencentes à família Dumontiaceae como produtoras de galactanas
do tipo DL-híbrida uma vez que apresentavam no seu espectro de infravermelho,
bandas de absorção características de agarana e de carragenana.
16
As algas pertencentes às famílias Gigartinaceae, Phyllphoraceae e
Petrocilidaceae, dentro da ordem Gigartinales, apresentam alternância das
carragenanas produzidas durante o ciclo de vida. Os gametófitos produzem
carragenanas da família kappa e a fase tetraspórica (esporófitos) biossintetizam
carragenanas da família lambda (McCANDLESS et al., 1982, 1983). Estas famílias
constituem um grupo dentro da ordem Gigartinales e a alternância biossintética de
carragenanas kappa/lambda é exclusiva destas famílias na ordem Gigartinales
(CRAIGIE 1990; CHOPIN et al., 1999).
Porém, gametófitos das algas Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae),
Mastocarpus stellatus (Petrocilidaceae), Chondracanthus canaliculatus
(Gigartinaceae), Chondrus crispus (Gigartinaceae), e Mazzaella leptorhynchos
(Gigartinaceae) que eram consideradas carragenófitas biossintetizam pequenas
quantidades de agaranas (CIANCIA et al., 1993, 1997).
Assim como foi observado na alga Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae), a
alga Iridaea undulosa (= Sarcothalia crispata), também pertencente à família
Gigartinaceae, biossintetiza quantidades significativas de polissacarídeos com
unidades na configuração L (α-L-galactose e 3,6-anidro-α-L-galactose) presente
tanto em plantas cistocárpicas (gametofíticas) quanto em tetraspóricas (STORTZ e
CEREZO, 1993; STORTZ et al., 1997).
Esses resultados demonstram que as algas da ordem Gigartinales podem
biossintetizar agaranas, carragenanas e galactanas DL-híbridas, quando são
analisados os polissacarídeos produzidos em menor proporção, e sendo esta
ordem a mais numerosa, pesquisadores têm avaliado a relevância
quimiotaxonômica dessas diferenças estruturais.
1.4.1. FAMÍLIA PHYLLOPHORACEAE
Até pouco tempo atrás na família Phyllophoraceae estavam agrupados 8
gêneros: Gymnogongrus Martius, Phyllophora Greville, Stenogramme Harvey,
Ozophora J. Agardh, Petroglossum Hollenberg, Schottera Guiry et Hollenberg,
17
Ceratocolax Rosenvinge e Besa Setchell (FREDERICQ e LOPEZ-BATISTA,
2003).
Como já citado, as algas pertencentes a esta família apresentam grande
diversidade em relação ao ciclo de vida, podendo apresentar:
- Alternância trifásica isomórfica: com gametófitos e tetrasporófitos
morfologicamente similares e bem desenvolvidos (Ex. Phyllophora).
- Alternância trifásica heteromórfica: nos quais os gametófitos são eretos
com dimensões macroscópicas e os tetrasporófitos são de vida livre, com
morfologia crustosa e microscópica (Ex. Ahnfeltiopsis).
- Alternância bifásica: com a presença de gametófitos e tetrasporófitos,
porém ausência de carposporófitos. Sobre o gametófito feminino se desenvolve
uma fase denominada “tetrasporoblástica” (Ex. Gymnogongrus griffithsiae)
(NEWROTH, 1971; KAPRAUN et al., 1993; MASUDA et al., 1996).
- Ciclo de vida direto: no qual só se encontram presentes gametófitos
femininos macroscópicos que produzem carposporos. Estes carposporos voltam a
dar lugar à fase gametofítica (Ex. Gymnogongrus devoniensis).
Essas variações fizeram com que algumas espécies de Gymnogongrus
(espécie tipo G. griffithsiae) que não apresentavam “tetrasporoblastos”, mas sim
cistocarpos internos e um ciclo de vida heteromórfico fossem transferidas para um
novo gênero Ahnfeltiopsis (SILVA e De CREW, 1992; MASUDA e KOGAME,
1998). A espécie heteromórfica Phyllophora trailli foi transferida para o gênero
Erythrodermis (GUIRY e GARBARY, 1990) e no gênero Phyllophora
permaneceram somente as algas que apresentavam alternância isomórfica das
gerações.
Por este motivo nessa família o ciclo de vida é muito importante, como em
nenhuma outra família dentro das algas vermelhas, pois é utilizado como um dos
caracteres mais significativos para se definir os gêneros dentro da família
Phyllophoraceae (Gigartinales).
Com base em evidências morfológicas e por análises filogenéticas de
seqüenciais de rbcL (FRESHWATER et al., 1994; FREDERICQ et al., 1996) a
família Phyllophoraceae apresenta maior proximidade com a família
18
Gigartinaceae. E em relação à produção de galactanas sulfatadas McCANDLESS
et al. (1982, 1983) estudaram o padrão de carragenanas biossintetizado pelas
algas da família Phyllopharaceae e Gigartinaceae, respectivamente.
Na família Phyllophoraceae (McCANDLESS et al., 1982) observaram que
plantas gemetofíticas produzem iota- ou iota/kappa- carragenanas híbridas,
enquanto que na família Gigartinaceae (McCANDLESS et al., 1983) há produção
de kappa- ou kappa/iota-carragenanas híbridas. Em ambas as famílias, os
tetrasporófitos produzem lambda-carragenana.
Nessa família já foram realizados vários estudos das galactanas sulfatadas
produzidas por gêneros muito semelhantes como Gymnogongrus (6 espécies) e
Ahnfeltiopsis (7 espécies).
Estruturas referentes à iota-carragenana foram encontradas em gametófitos
de Ahnfeltiopsis leptophylla (McCANDLESS et al., 1982) determinadas por análise
espectroscópica de infravermelho. Carragenanas híbridas kappa/iota foram
determinadas em Ahnfeltiopsis concinna, A. devoniensis, A. flabeliformis, A.
furcellata (McCANDLESS et al., 1982), A. gigartinoides (BELLION et al., 1983), A.
linearis, Gymnogongrus crustiforme, G. crenulatus, G. vermicularis e G. griffithsiae
(McCANDLESS et al., 1982). FURNEAUX e MILLER, (1985) também
determinaram carragenanas kappa/iota por RMN de
13
C em diferentes espécies de
Gymnogongrus, Ahnfeltia e Stenogramme.
Nas espécies estudadas do gênero Phyllophora (3 espécies) foi
demonstrado a presença de iota- e lambda-carragenanas (McCANDLESS et al.,
1982; USOV e SHASHKOV, 1985). Algas dos gêneros Schottera (1 espécie), e
Sternogramme (1 espécie) (McCANDLESS et al., 1982; WHYTE et al., 1984)
parecem sintetizar polissacarídeos muito homogêneos quanto a sua estrutura,
produzindo típicas carragenanas kappa/iota na fase citoscárpica e lambda-
carragenana na fase tetraspórica.
Algas da família Phyllophoraceae descritas na literatura (McCANDLESS et
al., 1982) (FURNEAUX e MILLER, 1985), (SAITO e OLIVEIRA, 1990), têm sido
relatadas como produtoras apenas de carragenanas, em concordância com a
clássica denominação destas como carragenófitas. Porém trabalhos mais recentes
19
realizados por MILLER et al. (1998) e ESTEVEZ et al. (2001), demonstraram que
algas pertencentes a esta família também sintetizam polissacarídeos com
diferentes características estruturais e variável percentagem de monossacarídeos
pertencentes à série L-, seja agaranas ou galactanas D/L-híbridas.
MILLER (1998) detectou por RMN de
13
C a presença do acetal de ácido
pirúvico na galactana isolada de Stenogramme interrupta, sendo este considerado
como critério quimiotaxonômico para classificação de algas da família
Phyllophoraceae.
Em 2001, MILLER analisou também por RMN de
13
C, os polissacarídeos da
fase tetraspórica dessa alga e observou em maior percentagem a unidade B (α-D-
galactose) 6-O-sulfatada ligada à unidade A (β-D-galactose), também 6-O
sulfatada (G6S-D6S) que corresponde à díade da psi-carragenana, precursora da
ômega-carragenana (G6S-DA). Alternadamente em menores proporções, a
unidade B (D6S) também estava ligada a β-D-galactose 2,6-dissulfato (G2,6S-
D6S). Esses resultados foram semelhantes aos encontrados com algas do gênero
Phyllophora e demonstram que os polissacarídeos produzidos pela fase
tetraspórica diferem dos da fase gametofítica (kappa/iota), como relatado para
outros membros das famílias Phyllophoraceae (FURNEAUX e MILLER, 1985),
mas estes polímeros não correspondem à lambda-carragenana como esperado.
FURNEAUX e MILLER, em 1985 analisaram por RMN de
13
C os
polissacarídeos da alga Gymnogongrus torulosus da Nova Zelândia (= Ahnfeltia
torulosa) e observaram que além da presença de kappa-carragenana (32%) e
estruturas de iota-carragenana (46%) esta alga biossintetiza também estruturas
precursoras mu/nu-carragenanas (22%). Resultados semelhantes foram
encontrados por ESTEVEZ et al., 2001 e por MILLER em 2003, apesar da maior
percentagem de unidades precursoras mu/nu-carragenanas (31%), 32% de
kappa- e 37% de iota-carragenana.
Esses resultados foram obtidos quando somente foi analisado o extrato
majoritário, porém ESTEVEZ et al., 2001 observaram a presença minoritária de
agaranas e galactanas DL-híbridas biossintetizadas pela alga G. torulosus. Os
polissacarídeos encontrados são formados principalmente por um esqueleto
20
básico de unidades alternantes de β-D-galactose 3-O-ligadas e α-L-galactose 4-O-
ligadas com: (i) substituição parcial no C-4 da unidade A (β-D-galactose), e em C-2
e C-3, ou somente em C-3 ou C-6 da unidade B (α-galactose) e (ii) presença de
unidades 3,6-anidro-α-L-galactose, parcialmente sulfatada no C-2. A galactana
D/L-híbrida apresentou aproximadamente 70% de estrutura similar a de
carragenanas (dados de metilação, análise enantiomérica e RMN de
13
C) e
apresentou as unidades B, principalmente sulfatadas em C-3 (27,4%) (α-L-
galactose-3-sulfato) com baixas percentagens de grupo O-metil (4,2%)
esterificando este carbono das unidades de α-D-galactose.
Este é o único relato na literatura de uma alga produtora de galactana DL-
híbrida dentro da família Phyllophoraceae.
1.4.2. FAMÍLIA SOLIERIACEAE
As algas pertencentes à família Solieriaceae são, do ponto de vista
econômico, as mais importantes, pois nesta família estão presentes os gêneros
Kappaphycus e Eucheuma, principais fontes para extração comercial de kappa- e
iota-carragenana, respectivamente. A família Solieriaceae (incluindo a
Areschougiaceae) contém aproximadamente 20 gêneros, que são amplamente
distribuídos em águas de regiões de clima tropical e temperado (STORTZ e
CEREZO, 2000).
Evidências morfológicas e resultados da similaridade das seqüências
cloroplásticas de rbcL auxiliaram no estudo filogenético e biogeográfico das algas
pertencentes a esta família. FREDERICQ et al., em 1999 sugerem que as algas
poderiam ser divididas em sete grupos (1) Sarconema, (2) Eucheuma, (3) Solieria
– grupo do Atlântico, (4) Solieria – grupo do Pacífico, (5) Meristiella/Meristotheca,
(6) Agardhiella e (7) Sarcodiotheca que incluiria Eucheuma uncinatum do Golfo da
Califórnia. Quatro grupos de espécies são reconhecidos no grupo Eucheuma que
correspondem à Eucheuma, Gelatiformia (= Betaphycus), Anaxiferae e
Cottoniformia (= Kappaphycus) proposto por Maxwell Doty.
21
Com base no tipo das galactanas sulfatadas as principais mudanças
taxonômicas ocorreram no gênero Eucheuma (DOTY, 1988). As espécies de
Eucheuma que produziam carragenanas do tipo beta (E, gelatinae, E.
especiosum), passaram para o novo gênero Betaphycus (DOTY, 1995), as
espécies produtoras de carragenanas kappa/iota foram transferidas para o novo
gênero Kappaphycus e as espécies restantes que biossintetizavam carragenanas
do tipo iota permaneceriam no antigo gênero Eucheuma.
Esta separação deve ser considerada como uma conveniência taxonômica,
muito mais útil comercialmente do que com real significado taxonômico-
filogenético, pois a cada dia está mais aceita a idéia de que não existem famílias
“puras” de carragenanas, mas sim uma dispersão de estruturas ao redor de uma
ou várias estruturas predominantes (CHOPIN et al., 1999).
O primeiro relato da existência de galactanas DL-híbridas fora da extinta
ordem Cryptonemiales foi na família Solieriaceae, onde por hidrólise parcial da
galactana de Anatheca dentata (NUNN et al.-192(p)6(6-4(t)-2.001(t)-2.001)-4(t)-2()-172(-4( )-162(d)-4(e)6(n)-4(t)-2(a)2(a)-4(ct)-o12(g)6(a)-1( )-2( )],-4(l)2(.)-23(a)-4( )-162(d)-(C)2(r)3(y)5-4( )-1b5(a)6( )277.9984(l)2.0019d)-192998]TJ-118.56 -20.76 8.524O p3(a)-4enaaqo rerams adaqes4xe45232(á)-4( )-62(m)ura
22
(aproximadamente 74%). No entanto, significativas quantidades destas galactanas
(pelo menos 14%) representam agaranas sulfatadas e, possivelmente, galactanas
DL-híbrida (ESTEVEZ et al., 2004).
No gênero Callophycus CHIOVITTI et al., (1997) observaram em 6 espécies
a presença de alfa-carragenana com altas percentagens de ácido pirúvico (8,0% -
10,5%). A presença destes substituintes parece ser constante em todas as
espécies estudadas desse gênero, assim como na alga Sarconema filiforme
(CHIOVITTI et al., 1998a). Os conteúdos de acetal de ácido pirúvico encontrados
em Callophycus superam os encontrados em agarófitas e é possível que a
presença deste substituinte nas unidades B possa ter algum valor
quimiotaxonômico neste gênero.
Da alga Solieria robusta também foram isoladas carragenanas piruvatadas
(CHIOVITTI et al., 1999) determinadas por análise de composição
monossacarídica, análises de metilação, espectroscopia de infravermelho e RMN
de
13
C.
Como já citado anteriormente o alto grau de metilação presente nas
galactanas isoladas das algas dos gêneros Erythroclonium (CHIOVITTI et al.,
1998b) e Rhabdonia (CHIOVITTI et al., 1996), que pertenciam à família
Solieriaceae, foi o fator estrutural responsável pela transferência destas algas para
a família Areschougiaceae.
A família Solieriaceae, juntamente com as famílias Gigartinaceae,
Phyllophoraceae e Hypneaceae são as principais fontes de extração de
carragenanas e além dos principais gêneros Kappaphycus e Eucheuma, algas dos
gêneros Gymnogongrus, Ahnfeltia e Iridaea estão recentemente sendo utilizadas
como matéria prima para obtenção desses polissacarídeos (WEST e MILLER,
2001).
23
1.5. APLICAÇÃO INDUSTRIAL DAS GALACTANAS SULFATADAS
Novas fontes e aplicações dos polissacarídeos produzidos por algas
marinhas têm despertado o interesse de vários setores industriais nos últimos
anos. Atualmente os campos de maior aplicação dos polímeros das algas
marinhas estão nas indústrias alimentícias, nutracêuticas, farmacêuticas e
odontológicas. Esses polímeros também são utilizados como matéria prima para o
desenvolvimento de novos excipientes, por exemplo, para utilização em sistema
de liberação controlada em biotecnologia enzimática e e.s2.002(e)-2(e)]J-347.04 -276 TLT*A-18(A)24gemio utiliicaçã d412(o)-4s policarídes ds nhs á-4(çã)-4one8( )-1( )-547]TJ289.4(s )-412((l)2(o)42(i)12(m)-7(e8(t)-2(o)-4(o)42a)-4( )3(a)-6( )-22)-142(sr9805(e)6(m)2.(g)6(a)-4(s)10( )27547]8]TJ-324 -24(s )-442(p)-4)-4( )-22(p)-eizm
24
TABELA 2. PROPRIEDADES IMPORTANTES E APLICAÇÕES DAS AGARANAS.
Galactana sulfatada Propriedades importantes Aplicações
Gel em soluções aquosas Pastelaria/ Glacê;
a baixas concentrações; . Geléias;
Forma géis termoestáveis; Carnes enlatadas;
Agaranas Relativamente inerte; Laxantes;
Retém umidade; Meio de Cultura.
Resiste a hidrólise por
microorganismos.
Gel em soluções aquosas Matrizes para:
a baixas concentrações; eletroforese,
Agarose Forma géis termoreversíveis imunoensaios,
independente de íons; cultura de células
Mínima reatividade não e microorganismos,
específica com proteína. cromatografia e
sistemas
imobilizados.
Tabela reproduzida de: RENN, (1997).
Entre as carragenanas, as geleificantes (kappa- e iota-) e a não geleificante
(lambda-carragenana), são amplamente utilizadas em diferentes setores da
indústria. As carragenanas geleificantes diferem nas propriedades dos seus
hidrogéis (PICULELL 1995).
A diferença na textura dos géis de kappa- e iota-carragenana é reflexo das
diferenças nas suas estruturas: os géis de iota-carragenana consistem da união
das duplas hélices com pouca ou nenhuma agregação, o que proporciona
flexibilidade e suavidade aos géis. Em contraste, géis de kappa-carragenana são
originados de hélices agregadas, uma vez que estas moléculas não geleificam sob
condições onde não há agregação, o que faz com que eles sejam relativamente
duros e quebradiços (STANLEY, 1987).
No entanto, a textura dos géis pode ser controlada pela concentração dos
polímeros na preparação, pela mistura de diferentes tipos de carragenanas, assim
como pela mistura dessas com outros polissacarídeos como amidos,
25
galactomanas, xantanas, gomas de exudatos entre outros (VILLANUEVA et al.,
2003).
As carragenanas podem ser usadas como géis, espessantes ou em
suspensão, elas estabilizam emulsões e controlam a sinerese, proporcionando
dispersão, ligação, e corpo ao produto final. O principal uso das carragenanas, em
particular na indústria alimentícia é em produtos derivados do leite (GUISELEY et
al., 1980).
Ambas kappa- e iota-carragenanas formam géis com sais de potássio e
cálcio. A kappa-carragenana é a que origina géis mais fortes, porém são os mais
sujeitos a sinerese (perda de água) (PICULELL,1995). A Tabela 3 demonstra
algumas das várias aplicações das carragenanas, sua função e concentração nas
preparações.
26
TABELA 3. APLICAÇÃO, FUNÇÃO E CONCENTRAÇÃO DAS CARRAGENANAS EM
DIFERENTES PREPARAÇÕES.
Aplicação Função Tipo de
carragenana
Concentração
aproximada (%)
Sobremesas
congeladas: sorvetes
Prevenção da formação
do soro e do
descongelamento
kappa- 0,010 – 0,030
Produtos pasteurizados
de leite:
Flans cozidos e cremes
Géis de leite prontos
para consumo
Corpo
Geleificação
Controle de sinerese e
corpo (consistência)
kappa- , iota-
kappa- , kappa- +
iota-
iota-
0,025 – 0,035
0,20 – 0,30
0,10 – 0,20
Sobremesas (Géis) Geleificação kappa- + iota-
kappa- + iota- +
galactomanana
0,5 – 1,0
0,5 – 1,0
Geléias de baixa caloria Geleificação kappa- + iota- 0,5 – 1,0
Comidas para animais Estabilização dos
lipídeos e espessante
kappa- +
galactomanana
0,2 – 1,0
Bebidas: Frutas em pós
e concentrados
congelados
Corpo
Efeito “pulping” (efeito
de polpa)
kappa-, lambda-
(sódio)
kappa- (potássio e
cálcio)
0,1 – 0,2
0,1 – 0,2
Imitação de leite Corpo e estabilização
dos lipídeos
Iota- , lambda- 0,03 – 0,06
Pasta de dente Ligante kappa- (sódio),
lambda- , iota-
0,8 – 1,2
Loções Corpo e emoliente kappa- (sódio),
lambda-, iota-
0,2 – 1,0
Suspensões Suspensão Iota- 0,2 – 1,0
Tintas à base de água Suspensão, controle do
fluxo e estabilização da
emulsão
kappa- +
galactomanana,
iota-
0,15 – 0,5
Tabela modificada de MOIRANO (1977) e GUISELEY et al. (1980).
27
1.5.1. FORMAÇÃO DE GEL, FONTES E PROCESSAMENTO DAS
CARRAGENANAS
O mecanismo proposto por Rees para explicar a formação de gel das
carragenanas, é basicamente o mesmo dos polissacarídeos que apresentam
“cadeias com seqüência interrompida”. Rees inclui nesse grupo os polissacarídeos
com mais de um tipo de unidade monossacarídica, e/ou mais de um tipo de união
glicosídica, que apresentam estruturas com seqüências repetitivas, interrompidas
por outras sem nenhum tipo de regularidade, como por exemplo, as carragenanas,
agarose, alginatos, pectinas e glicosaminoglicanas (com exceção do ácido
hialurônico) (REES, 1977).
Em condições favoráveis, geralmente por resfriamento, as cadeias
polissacarídicas de kappa- e iota-carragenanas passam do estado “random coil
(ao acaso) ” ao de hélice formando hélices duplas entre as regiões repetitivas da
molécula. Estas estruturas terciárias se encontram limitadas à região da molécula
que apresenta regularidade. Na zona com seqüência irregular a dupla hélice se
interrompe, permitindo a formação de dupla hélice com outra cadeia (REES,
1977).
REES (1977) denominou essas interações entre as cadeias
polissacarídicas de zonas de união ou domínios. Um exemplo da importância das
seqüências irregulares é observada nas carragenanas kappa- e iota-, onde a
estrutura repetitiva destes polissacarídeos é interrompida em alguns pontos pela
presença de unidades de 3,6-anidro-α-galactose 6-sulfato (mu-carragenana) e α-
galactose 2,6-disulfato (nu-carragenana), precursores da kappa- e iota-
carragenanas, respectivamente. É importante ressaltar que embora as duas
primeiras apresentem a conformação
4
C
1
sendo unidas por meio de duas ligações
axiais (C-4 e C-1); as unidades de 3,6-anidrogalactose (presentes na kappa- e
iota-carragenanas) se encontram na conformação
1
C
4
, unidas por duas ligações
equatoriais (C-4 e C-1). Portanto a substituição de uma única unidade na
seqüência repetitiva das carragenanas kappa- e/ou iota- é responsável por um
28
desvio na direção da cadeia, produzindo uma importante alteração na forma da
molécula como um todo. Na Figura 3 estão demonstradas as conformações
4
C
1
da nu-carragenana e
1
C
4
da iota-carragenana.
FIGURA 3. ESTRUTURAS IDEAIS REPETITIVAS DA (A) (NU-CARRAGENANA),
CONFORMAÇÃO
4
C
1
E DA (B) (IOTA-CARRAGENANA), CONFORMAÇÃO
1
C
4
.
Por essa razão as unidades precursoras mencionadas anteriormente foram
denominadas de “unidades de dobramento” ou “kinks”; estas “unidades de
dobramento” são necessárias para a formação do gel (REES, 1977).
As unidades precursoras são importantes para a formação de gel, pois
possibilitam a formação dessas zonas de união ou domínios. Porém, se presentes
em elevadas concentrações essas unidades, mu-carragenana e nu-carragenana,
as quais são carragenanas não geleificantes, dificultam a formação das hélices e
por conseqüência podem prejudicar o processo de geleificação (VAN DE VELDE
et al., 2002a., 2002b).
Neste contexto é importante deixar claro que para a formação do gel é
necessário um balanço entre o número de ligações cruzadas entre as cadeias
polissacarídicas (ocasionado pela presença das unidades precursoras) e o
OH
OH
O
O
O
O
O
OSO
3
-
OSO
3
-
OH
OH
O
OSO
3
-
O
OSO
3
-
OH
O
O
O
-O
3
S
A
B
29
conteúdo de unidades capazes de formar hélices, devido a presença de kappa- e
iota-carragenanas.
A indústria, no início dos anos 90, com o intuito de minimizar os custos de
extração e processamento das carragenanas alterou o método de extração e
disponibilizou no mercado as carragenanas semi-refinadas (veja adiante). Nesse
processo a alga é submetida à extração alcalina, método químico que permite a
ciclização das unidades precursoras, aumentando assim o poder geleificante do
polímero. Em escala laboratorial, este método é denominado tratamento alcalino
(NOSEDA e CEREZO, 1995).
As carragenanas são listadas pelo FDA (Food and Drug Admi
30
Hawaii, Filipinas, Indonésia, Malásia, China e Tailândia. Outra importante fonte de
carragenanas é a alga Chondrus crispus obtida de populações naturais na
província litorânia do Canadá, onde aproximadamente 50.000 toneladas de alga
(peso úmido) são coletadas por ano. Como já citado anteriormente as algas não
sintetizam famílias “puras” de carragenanas, mas sim misturas delas (CHOPIN et
al., 1999).
Devido aos 9.198 km de extensão do litoral brasileiro ele apresenta
condições favoráveis para implantação do cultivo de algas e, em 1996, PAULA et
al. (2002) iniciaram um trabalho para introdução do cultivo da alga Kappaphycus
alvarezii no litoral de São Paulo, em Ubatuba. Os resultados demonstraram que o
cultivo comercial desta alga é viável nesta região utilizando o sistema de flutuação.
A Tabela 4 fornece dados das principais fontes, sua localização e
composição em carragenanas extraídas industrialmente de algumas algas
vermelhas.
31
TABELA 4. ALGAS, LOCALIZAÇÃO E COMPOSIÇÃO EM CARRAGENANAS.
Algas Carragenanas Localização
Chondrus crispus / C.
ocellatus
Mistura de kappa- e lambda-
carragenana
Províncias marinhas do
Canadá e
Massachusetts (USA)
Kappaphycus alvarezii Principalmente kappa-
carragenana
Filipinas, Indonésia,
Hawaii, Malásia, China
e Tailândia
Eucheuma denticulatum Principalmente iota-
carragenana
Filipinas, Indonésia,
Hawaii, Malásia, China
e Tailândia
Gigartina skottsbergii Principalmente kappa- e
pouco lambda-carragenana
Chile
Gigartina acicularis / G.
pistillata / G. radula
Principalmente kappa- e xi-
carragenana
México e sul da França,
Espanha, Portugal e
Marrocos
Gymnogongrus furcellatus Principalmente iota-
carragenana
Peru
Sarcothalia crispata Mistura de kappa- e lambda-
carragenana
Chile
Hypnea musciformes Principalmente kappa-
carragenana
Brasil
Fonte: STANLEY, (1987).
Atualmente, no mercado estão disponíveis dois tipos de produtos: (i)
carragenanas refinadas ou filtradas e (ii) carragenanas semi-refinadas. Essa
denominação é decorrente do método de extração empregado para a obtenção do
polímero.
32
No método original, utilizado até os anos 80, as carragenanas eram
extraídas em solução aquosa, os resíduos da alga eram removidos por filtração e,
então, as carragenanas recuperadas da solução ou por precipitação com solução
de cloreto de potássio (processo geleificante) ou por precipitação com etanol.
Esse método origina as carragenanas refinadas ou filtradas, porém, são
trabalhosos e têm custo elevado para serem empregados industrialmente
(STANLEY, 1987).
A obtenção das carragenanas semi-refinadas começou por volta dos anos
90. Nesse processo a alga é tratada com álcali o que ocasiona a ciclização das
unidades precursoras e consequentemente o aumento da força do gel. A formação
do gel impede que a carragenana fique dissolvida na solução, enquanto proteínas
solúveis, carboidratos e sais são dissolvidos e removidos. O resíduo (com
aparência da alga) é lavado várias vezes para a remoção do álcali e
posteriormente seco. Além da ciclização das unidades precursoras e aumento do
poder geleificante das carragenanas extraídas (item 4.1), a simplicidade deste
método proporciona a redução dos custos do processo (BIXLER, 1996).
Os produtos obtidos por esse método de extração foram originalmente
denominados PNG (Philippine Natural Grade carrageenan) e, apesar de sofrer
forte oposição dos produtores das carragenanas refinadas, na Europa e no Brasil,
as refinadas e as PNG são permitidas na alimentação humana. Elas recebem a
seguinte rotulagem.
Na Europa:
- Carragenana refinada: é rotulada “carrageenan” e E - 407.
- Philippine Natural Grade (PNG) é rotulada: “Processed Eucheuma
seaweed” ou “PES” e E- 407a.
No Brasil:
- Carragenina / Carragena – E - 407. Comercialmente disponível sob
diversas denominações Eucheuman (do gênero Eucheuma), Hypnean (do gênero
Hypnea), Carragenina / Carragena (dos gêneros Chondrus e Gigartina).
33
- Algas Eucheuma transformadas - “PES” e E- 407a. (Ministério da
Agricultura, do desenvolvimento Rural e das Pescas - Decreto-Lei n.º 38/2000 de
14/03/2000).
Apesar do custo menor na produção de carragenanas semi-refinadas (PNG
ou PES) essas contêm celulose originando soluções turvas, já as carragenanas
refinadas originam soluções límpidas, uma vez que a celulose é removida durante
o processo de filtração. A Tabela 5 demonstra a capacidade dos produtores de
carragenanas de acordo com a localização geográfica.
TABELA 5. PROCESSAMENTO DE CARRAGENANAS. CAPACIDADE EM
TONELADAS, DADOS DE 2001.
Processo
Alcoólico
Processo
Geleificante
PES Total %
ATC
1
Europa 8.100
5.000
500
13.600
32
Américas 4.700
3.350
1.100
9.150
21
Ásia-Pacifíco 2.000
8.280
9.900
20.180
47
16.000
Total 14.800
16.630
11.500
42.930
16.000
Fonte FAO – Food and Agriculture Organization. ATC = Tratamento alcalino da alga E. cottonii.
1
ATC: alga E. cottonii tratada com álcali.
Entre os principais produtores e distribuidores das carragenanas refinadas
estão: (i) Filipinas: Shemberg Marketing Corporation, Marcel Carrageenan
Corporation, (ii) Dinamarca: CP Kelco, Danisco Cultor, (iii) EUA: Ingredients
Solutions Inc, FMC Biopolymer, (iv) Espanha: CEAMSA, Hispanagar, S.A. (v)
Japão: Chuo Food Materials Co.Ltd., Ina Food Industry Co., Ltd., (vi) Alemanha:
Degussa Texturant Systems, (vii) França: Rhodia Food, (viii) Chile: Gelymar S.A.,
(ix) Coréia: Myeong Shin Chemical Ind. Co., Ltd., (x) Argentina: Soriano S.A.,
(FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations).
34
As PNG e PES são produzidas e distribuídas principalmente por indústrias
nas (i) Filipinas: Marcel Carrageenan Corporation, Shemberg Marketing
Corporation, Quest International Philippines Corp., FMC Corporation, Geltech
Hayco, Inc., TBK Manufacturing Corp. (ii) Indonésia: P.T. Surya Indoalgas Jln
Kedungdoro – 60, C.V. Cahaya Cemerlang, P.T. Gumindo Perkasa Industri e P.T.
Asia Sumber Laut, (iii) Portugal: Iberagar S.A. e (iv) EUA Ingredients Solutions
Inc. (FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations).
Uma inovação na aplicação das carragenanas em alimentos é o advento da
kappa-2’carragenana (sinônimos: kappa fraca, kappa geleificante fraca, kappa/iota
híbrido). A kappa-2 carragenana foi recentemente introduzida comercialmente
pela Shemberg Corporation (Cebu, Filipinas) e foi especialmente desenvolvida
para uso como geleificante e agente ligante utilizado em vários produtos lácteos.
Quimicamente, a kappa-2 difere da kappa-carragenana por apresentar também
unidades de iota-carragenana, contendo 20-50% de unidades de 3,6-anidro-α-
galactose 2-O-sulfatadas (VILLANUEVA et al., 2004).
1.5.2. INFLUÊNCIA DOS SAIS NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO E
INTERAÇÃO COM AMIDO
Uma das mais notáveis características das carragenanas geleificantes está
na sua pronunciada sensibilidade ao ambiente iônico que se reflete em quase
todas as suas propriedades geleificantes. Não somente a quantidade ou a
valência dos íons, mas também a identidade dos íons presentes pode ser
importante (PICULELL, et al., 1997). Em geral, a adição de sal aumenta a
estabilidade das hélices ordenadas e promove a geleificação (FIGURA 4).
35
FIGURA 4. FORMAÇÃO DE GEL EM CARRAGENANAS.
Fonte: www.fao.org (FAO – Food and Agriculture Organization).
O efeito de vários cátions na transição conformacional (fita para hélice) da
kappa-carragenana tem sido amplamente estudado. A interação dos cátions com
as duas conformações da kappa-carragenana têm sido estudada por uma
variedade de métodos termodinâmicos e espectroscópicos; a maioria desses
estudos emprega técnicas como medidas de condutividade e medidas de
coeficientes de atividade iônica.
A dependência de sal na transição conformacional da iota-carragenana tem
sido muito estudada e para esse tipo de carragenana efeitos de cátions
específicos também foram relatados. Esta especificidade relata o efeito muito forte
na estabilização da hélice dos íons divalentes, como o Ca
++
. No entanto, a
sensibilidade à presença de íons monovalentes específicos também foi
identificada de maneira similar à da kappa-carragenana (PICULELL et al., 1987).
Porém, foi observado que estes efeitos eram decorrentes da presença de
impurezas de kappa-carragenana em amostras de iota-carragenana nativa,
estando a primeira, presente em blocos e/ou em polímeros separados com
solução
calor
frio
calor
frio
Gel 1
Gel 2
Adição
de cátions
36
comprimento suficiente que dão origem a um passo de transição distinto em um
intervalo de temperatura típico para kappa-carragenana (PICULELL et al., 1987).
Nas amostras nativas mais puras, como a iota-carragenana de Eucheuma
spinosum, a amplitude deste passo de transição separado é freqüentemente tão
pequena que pode não ser detectável nos experimentos de rotação óptica. Devido
a pequena variação nas temperaturas de transição de diferentes formas de íons
(possivelmente resultado das diferenças nos tamanhos dos íons hidratados), não
há nenhuma indicação de qualquer especificidade de cátion na transição
conformacional da iota-carragenana pura (PICULELL et al., 1987). A TABELA 6
mostra a solubilidade e capacidade de geleificação dessas carragenanas com
diferentes íons.
TABELA 6. SOLUBILIDADE E CAPACIDADE DE GELEIFICAÇÃO DE DIFERENTES
CARRAGENANAS.
Tipo
Sais
Solubilidade em
água
Tipo de gel
Estabilidade
Congelamento/
Descongelamento
Sódio (Na
+
)
Kappa (κ
κκ
κ) Cálcio (Ca++)
Potássio (K+)
Solúvel fria e
quente
Solúvel acima
60°C
Solúvel acima
60°C
Quebradiço, sinerese
Quebradiço, sinerese
Gel mais forte,
quebradiço, sinerese
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Iota (ι
ιι
ι)
Sódio (Na+)
Cálcio (Ca++)
Potássio (K+)
Solúvel fria e
quente
Dispersão
tixotrópica abaixo
60°C
Solúvel acima
60°C
Elástico, coesivo e
sem sinerese
Gel mais forte,
elástico, coesivo,
sem sinerese
Elástico, coesivo,
sem sinerese
Estável
Estável
Estável
Lambda (λ
λλ
λ)
Todos
Solúvel fria e
quente
Não geleificante
Nenhuma
* Tabela segundo: CLARKE, M. T., in Rheological Properties of Cosmetics and Toiletries (1993).
37
Além das carragenanas que, apesar do seu elevado custo, são muito
utilizadas na indústria alimentícia, os amidos estão entre os polímeros mais
empregados em diferentes setores industriais, devido às suas capacidades de
adesão, ligação, formação de filme, geleificante e espessante (AUTIO et al.,
2002). Carragenanas, gomas arábica, guar, xantanas, carboximetilcelulose e
galactomananas são algumas das macromoléculas normalmente combinadas com
amidos de trigo ou de milho (TECANTE e DOUBLIER, 1999).
A utilização do amido em preparação de produtos alimentícios é superior a
soma de todos os hidrocolóides combinados, sem levar em conta a indústria de
panificação (GUILBOT; MERCIER, 1985; ZOBEL; STEPHEN, 1995; WHISTLER;
BeMILLER, 1997)
O amido é uma mistura de polissacarídeos sendo a maioria composta por
dois polímeros, um altamente ramificado, chamado amilopectina e o outro
essencialmente linear (menor teor de substituição) chamado amilose (SCHOCH,
1945, WHISTLER; BeMILLER, 1997).
Em termos estruturais a amilopectina é o componente altamente ramificado
do amido, formado por cadeias de unidades α-D-glucopiranose unidas por ligação
(1→4), mas com 5-6% de ligações α-(1→6) nos pontos de ramificação. A
amilopectina apresenta alta capacidade de ligação à água e um lento processo de
retrogradação, formando misturas claras com textura macia e com bom fluxo, com
baixa tendência a formação de géis (ZOBEL; STEPHEN, 1995).
Já amilose é uma molécula essencialmente linear, apresentando uma
cadeia constituída por unidades de α-D-glucopiranose unidas por ligações (1→4),
com baixo teor de ligações α-(1→6), apresentando em torno de 0,3 a 0,5% do
total de ligações (GUILBOT; MERCIER, 1985; WHISTLER; BeMILLER, 1997).
Comercialmente os amidos podem ser obtidos de sementes, em particular
de milho comum, de milho com altos teores de amilopectina “waxy” e de milho
com altos teores de amilose, de trigo e de vários genótipos de arroz. Outras fontes
fontes como cará possuem baixa aplicação industrial até o momento, e
publicações científicas relacionadas a este amido são incipientes quando
comparadas ao de milho (Zea mays L.), cuja produção mundial é próxima a
38
20.000 t/ano e aumenta rapidamente (ZOBEL;STEPHEN, 1995), sendo que nos
Estados Unidos 95% do amido consumido provêm da soma das diferentes
variedades de milho (WURZBURG, 1986).
HOOVER; VASANTHAN (1994) observaram que o nível aparente de
amilose no amido de cará foi de 27,1%, teor muito semelhante ao do amido de
trigo e acima do amido de ervilha e batata. MCPHERSON; JANE (1999)
compararam o amido de batata “waxy” com outros amidos de tubérculos e raízes
como cará, amido de batata normal e batata doce. Nesse trabalho foi observado
um teor de amilose aparente de 29,2% para o amido de cará. Os autores também
observaram que a amilopectina de amido de cará e batata doce apresentam altas
porções de cadeias laterais curtas (dp 6-12) de 19,09 e 17,05%, respectivamente,
quando comparadas a amilopectina de amido de batata normal e “waxy”(13,07 e
14,75%, respectivamente).
Em amidos nativos, as moléculas de amilose, amilopectina e uma limitada
quantidade de água estão organizadas em micelas, com uma durável e
morfologicamente esclarecida estrutura microscópica chamada de grânulo. A
fusão ou rompimento de tal estrutura organizada é um pré-requisito para utilização
de seus polímeros. A presença de regiões cristalinas nos grânulos de amido,
devem-se principalmente às moléculas de amilopectina de alta massa molar
interconectadas. Já nas regiões amorfas estão localizadas predominantemente
moléculas de amilose (ZOBEL; STEPHEN, 1995).
Sem processamento, os grânulos de amidos são parcialmente cristalinos;
durante o aquecimento em presença de água se hidratam, gerando um aumento
temporário da viscosidade, devido à fusão das regiões cristalinas e a hidratação
das macromoléculas. Após resfriamento, a gelatinização é acompanhada pelo
aumento da turbidez e da firmeza da pasta formada (WURZURG, 1986). Assim a
gelatinização é acompanhada por dois fenômenos principais, o primeiro refere-se
à perda da cristalinidade, refletindo a redução das interações intra e
intermoleculares em ordem respectivas, e o segundo ao inchamento do grânulo de
amido (MARCHANT; BLANSHARD, 1978). Tecnologicamente, amido apresenta
alguns incovenientes, entre eles, altos picos de viscosidade durante seu
39
aquecimento, sinerese, retrogradação e consistência indesejável da pasta fria
(ZOBEL; STEPHEN, 1995).
As moléculas de amilose nativas sofrem rápido processo de retrogradação,
isto é, formam géis opacos e parcialmente cristalinos. A retrogradação ocorre
quando moléculas que se desordenam pelo aquecimento dos grânulos em água,
formam dispersões moleculares que, rapidamente, precipitam ou formam géis.
Isso ocorre quando cadeiais longas e flexíveis de amilose que apresentam
movimento aleatório (Browniano) colidem e formam ligações intermoleculares
formando zonas de junção. Tal interação temporária é fortalecida por segmentos
de outras cadeiais que colidem com esse núcleo e ligam-se a ele, formando uma
rede tridimensional compacta, aumentando a ordem do sistema, gerando uma
rede elástica e cristalina (WHISTLER; BeMILLER, 1997; WURZBURG, 1986).
Em géis ricos em amilose, a formação de uma rede compacta gera
exclusão de água do sistema, o que é indesejável, e o fenômeno é chamado de
sinerese (WHISTLER ; BeMILLER, 1998; WURZBURG, 1986).
Sabe-se que as características de polímeros em solução podem ser
alteradas por certas misturas que podem gerar propriedades diferentes do sistema
puro, possibilitando, por exemplo, evitar problemas de processamento e
estocagem (MARCOTTE et al., 2001).
As carragenanas são frequentemente combinadas com amidos, como
amido de milho, em sobremesas geleificadas contendo leite (TYE, 1988). O amido
fornece corpo e boa impressão sensorial ao produto, enquanto a carragenana
proporciona a textura apropriada, normalmente firme e quebradiça com a kappa-,
suave e elástica com a iota-carragenana (ZOBEL e STEPHEN, 1995).
Em geral, a adição do hidrocolóide acelera a geleificação do amido de milho
nativo. Isto ocorre com a kappa-carragenana, embora a iota-carragenana retarde
essa geleificação (EIDAM et al., 1995). Similarmente, foi observado que a adição
de amido acelera a geleificação da kappa-carragenana, possivelmente devido ao
efeito da interação entre o ficocolóide e as moléculas solúveis de amido. A
geleificação da iota-carragenana pode ser retardada pela adição de moléculas de
40
amidos rígidos, ou acelerada, quando grânulos solúveis são adicionados (LAI et
al., 1999).
Um dos aspectos enfocados nas misturas de amido-hidrocolóide é que essa
combinação pode ampliar as propriedades reológicas e originar modificações na
textura dos géis. Quando amido contendo amilose é ligado com outras
macromoléculas, efeitos sinérgicos podem ser obtidos, aumentando a viscosidade
das pastas como resultado da concentração do polímero adicionado.
Na aplicação prática, sistemas misturados são utilizados para aperfeiçoar
as propriedades reológicas, buscando não só, o aumento da habilidade do
biopolímero como agente geleificante, pela adição de outra macromolécula, mas
também devido as propriedades que os hidrocolóides desempenham na
aceitabilidade total dos produtos alimentícios, aumentando a estabilidade física e
atuando nas propriedades sensoriais (textura) dos mesmos (MARCOTTE et al.,
2001).
1.6. REOLOGIA: HISTÓRICO E ASPECTOS TEÓRICOS
O termo reologia criado por M. Reiner e E.C. Bingham, provém da palavra
Grega “rheos “ e significa o estudo da deformação e fluxo da matéria, sendo que
tal definição foi aceita pela Sociedade Americana de Reologia quando esta foi
fundada em 1929 (BARNES et al., 1989, LAPASIN; PRICIL, 1995).
A reologia é a ciência que estuda as propriedades mecânicas dos materiais
que determinam seu escoamento quando solicitados por forças externas. O
campo da reologia estende-se desde a mecânica de fluidos newtonianos até a
elasticidade de Hooke (BIRD et al., 1960).
Fluidos reais (ideais) deformam-se irreversivelmente, ou seja, quando
tensões são aplicadas sobre esses materiais, eles escoam. A energia da
deformação é dissipada dentro dos fluidos em forma de calor e não pode ser
recuperada se a tensão aplicada for cessada. Aqui é importante ressaltar que
devido ao escoamento, esses materiais são estudados na reologia, pela relação
entre sua taxa de cisalhamento e tensão de cisalhamento (BARNES et al., 1989).
41
Para um fluido newtoniano ideal, a tensão de cisalhamento é uma função
linear da taxa de cisalhamento, e a constante de proporcionalidade para esta
relação µ é chamada de viscosidade newtoniana (SHARMA et al., 2000).
Dessa forma o líquido seria a substância que muda continuamente de forma
(flui), independente da magnitude da tensão aplicada, ou seja, sua viscosidade
permanece a mesma, independente da tensão. Muitos alimentos, como leite, suco
de maçã, suco de laranja, vinho e cerveja exibem um comportamento newtoniano
(BARNES et al., 1989).
O postulado de Newton introduziu o conceito de viscosidade em que a
tensão de cisalhamento (σ) ou “shear stress” foi relacionada à taxa de
cisalhamento (γ) ou “shear rate”, através da equação:
σ = ηγ (1)
No sistema corrente (SI), é utilizado Pascal-segundo, cujo símbolo é Pa.s,
sendo anteriormente utilizado no sistema CGS o poise (BARNES et al., 1989).
Então a viscosidade (η) é dada por:
η = σ / γ (2)
Onde σ = força aplicada sobre uma área = N/ m
2
ou Pa
γ = velocidade relativa das camadas líquidas dividida pela distância entre
elas = s
-1
(Figura 5).
Uma vez que a medida da viscosidade de um material está relacionada com
a tensão (σ) e taxa de cisalhamento (γ) a figura 5 facilita a compreensão dos
conceitos de tensão e taxa de cisalhamento.
42
FIGURA 5: ESCOAMENTO DE FLUÍDO EM REGIME LAMINAR
X = espessura
(i) Tensão de cisalhamento (
σ
) relaciona a força F aplicada sobre a área A,
sendo que a interface entre a camada superior e inferior do líquido, leva a um fluxo
na camada líquida. A velocidade de fluxo que pode ser mantida por uma dada
força é controlada pela resistência interna do líquido, ou seja, pela sua
viscosidade.
A tensão de cisalhamento faz com que o líquido flua num determinado
padrão. A velocidade máxima é observada nas camadas superiores do líquido. A
velocidade diminui das camadas superiores para as inferiores, apresentando uma
velocidade mínima na camada mais inferior que está em contato com a superfície
estacionária. Esse gradiente de velocidade é definido como (ii) taxa de
cisalhamento (γ). A velocidade de cisalhamento pode variar de acordo com a
espessura do material.
Os fluidos viscosos não-newtonianos não apresentam proporcionalidade
entre a taxa de cisalhamento e a tensão cisalhamento (IBARZ e BARBOSA-
CÁNOVAS, 1999). Os fluidos não-newtonianos podem ser dependentes ou
independentes do tempo. Para os fluidos não-newtonianos independentes do
tempo, à temperatura e composição constantes, a viscosidade aparente depende
da taxa de cisalhamento ou da tensão de cisalhamento (RAO & RIZVI, 1986).
Para fluidos não-newtonianos o termo viscosidade é substituído por ηap que
é a viscosidade aparente e é função do gradiente de velocidade. Entre os líquidos
não Newtonianos podem ser citados os seguintes exemplos:
43
Fluídos pseudoplásticos (Shear Thinning): Este tipo de fluido demonstra
um decréscimo na viscosidade com um aumento na tensão de cisalhamento
(MCCLEMENTS, 2005), sendo que a taxa de cisalhamento versus a tensão de
cisalhamento forma uma linha convexa (SHARMA et al., 2000). Esses fluidos em
repouso apresentam um estado desordenado, e quando submetidos a uma tensão
de cisalhamento, suas moléculas tendem a se orientar na direção da força
aplicada. Quanto maior a tensão aplicada, maior será a ordenação.
Consequentemente, a viscosidade aparente será menor (HOLDSWORTH, 1971).
Alguns exemplos de fluidos pseudoplásticos são: sucos de frutas
concentrados, purê de maçã, pasta de amido e proteínas (RHA, 1978). Em geral,
os purês de frutas e vegetais são fluidos pseudoplásticos. A consistência desses
produtos é um importante parâmetro de qualidade industrial (IBARZ e BARBOSA-
CÁNOVAS, 1999). Suspensões, emulsões e dispersões também apresentam
comportamento pseudoplástico.
Fluídos Dilatantes: Os fluidos dilatantes apresentam o comportamento
inverso ao fenômeno da pseudoplasticidade, ou seja, a viscosidade do fluido
aumenta à medida que aumenta a taxa de cisalhamento. Esse tipo de fluxo
somente é encontrado em líquidos que contém uma alta proporção de partículas
rígidas insolúveis em suspensão (BOURNE, 1982). Alguns tipos de mel e
suspensões de amido se enquadram nessa categoria (SHARMA et al., 2000).
Fluídos Plástico ou de Bingham: O fluído de Bingham é aquele em que é
necessária a aplicação de uma tensão inicial mínima, o ponto de ruptura ou “yield
stress” para que o material comece a fluir. Ou seja, o sistema apresenta em
repouso altas forças de interações intermoleculares, dando a substância um
caráter sólido, que o impede de fluir, até que a força externa seja superior à força
da rede, onde possamos observar o ponto de ruptura. Alguns exemplos de fluidos
alimentícios que representam esse comportamento são: molhos de tomate,
maionese, clara de ovo batida e margarina (BOURNE, 1982).
Fluidos tixotrópicos: Os fluidos desse grupo apresentam um
comportamento reológico dependente do tempo. Um fluido tixotrópico é aquele no
qual a viscosidade aparente diminui com o tempo quando o fluido é submetido a
44
uma taxa de cisalhamento constante. Fluidos desse tipo são conhecidos por
conter pequenas partículas (cristais ou biopolímeros) que são mantidos juntos por
forças fracas. O cisalhamento do material separa as partículas agregadas e então
ocorre uma menor resistência ao escoamento e a viscosidade decresce com o
tempo até um valor constante ser alcançado (MCCLEMENTS, 2005). Exemplos
desse fluido são gelatinas, cremes, manteigas, molhos para saladas, entre outros
(SHARMA et al., 2000).
Fluidos reopéticos: Em alguns alimentos, a viscosidade aparente do fluido
aumenta com o tempo quando sujeito a uma taxa constante de cisalhamento. Há
diferentes razões para este comportamento. A mais importante é que o
cisalhamento aumenta a freqüência das colisões entre as moléculas ou partículas
dos fluidos, que pode levar para um aumento de agregados e consequentemente
um aumento na viscosidade aparente (MCCLEMENTS, 2005). Este tipo de
comportamento não é comum em alimentos, mas pode ocorrer em soluções de
amido altamente concentradas (SHARMA et al., 2000).
Soluções de carragenanas que apresentam viscosidade inferior à 100
mPa.s apresentam comportamento próximo ao Newtoniano e em maiores
viscosidades as soluções exibem comportamento pseudoplástico (Shear-Thinning)
(STANLEY, 1987). As carragenanas comerciais estão disponíveis em
viscosidades que variam de 5 mPa.s à 800 mPa.s, quando medida à concentração
de 1,5% e 75°C.
As carragenanas formam soluções aquosas altamente viscosas. Essa
característica é decorrente da sua linearidade estrutural e natureza polieletrólica. A
repulsão mútua decorrente dos vários grupos sulfatos carregados negativamente
ao longo da cadeia, faz com que a molécula fique altamente estendida, enquanto
que a sua natureza hidrofílica permite que a estrutura esteja cercada por
moléculas de água imobilizadas (GUISELEY et al., 1980).
A viscosidade depende da concentração, temperatura, presença de outros
polímeros, tipo e massa molar da carragenana. A baixa temperatura e
concentrações ideais de sais, as carragenanas geleificam, com o aumento da
viscosidade aparente. Este comportamento é particularmente verdadeiro para
45
cátions considerados fortes indutores de gel, como sódio e cálcio (PICULELL,
1995).
A viscosidade diminui com o aumento da temperatura, novamente em uma
mudança exponencial. Esse processo é reversível, contanto que, o aquecimento
não seja prolongado até um ponto onde significativa degradação térmica ocorra.
No resfriamento, no entanto, a viscosidade aparente dessas carragenanas
aumenta abr65.04 -s2(r)3(a)-4 oo 472 tssaindudn nI0433334(r)2.99805(2(r)3(e)-4(v)10(4( )-472(-( )í4( )-47221 12 Tf1]TJ335K)667(I)-.92 384(g) Tm7595 5.5299805(+))2(1d)6(ca)-8(I)-.92 38.4 Tm(,)8 -5.5299805((p)-4(o)-4[( )-11556(I)-.92 384(g) Tm252.005.5299805(+))2(1d)6(+)584(I)-.92 38.4 Tm913(a-5.5299805(4(,)7(o)-4[)]TJ340.44 0 2(n-20.76 Td[(n)-4(m[(n)-4(4(sso)-4( -4(e)-4(1TJ-340.44 )99854(d)-4(u)-(d)-4d[(6( )-122(o)-4(n)6ç(ssoã(r)3(a)-0.76 s)2(d)6(e)-8]TJ-6 -4(e)-4(1TJ.76 Td[(805( )277.(a)-4(,)-2( )-52 12 Tf1]TJ335( )-2A)75.04)3(m)-7(A04)3(m)-7(S(e)-4(r2.i)2(f)-12Ia)6( )-12N[(u)619)-3(I)-2430,)8 -(e)-4.00391)6(i)2(n)9.04 0R]TJ Td[( )-L-472(r)3(e)84(E)-2.962.9980535.04 -204(,)7.99805( )]T/R1738.4 Tm(r)2.99LT*(o)-4(67805( )]T/R2 38.4 Tm8.763(m)-7(o)-4(4S04 0335.04 54(d)-4-( )0(p)-4(o)724[)]TJ340.4464(o)724[a464(o)724[ca)-4(t)-2(i)04 -s2(4464(o)724[m(t)-2(i)-4(l)2(,)-299.16 -20.(o)724[2(v)10(a)(s )-232724[su35.04 -20s(a)-â2(i)04 -s(n)-4(ç)10(s )-232724[(e)-4(n6 )-4)-2( )-423271-472(v)106 Td[(805(J335.0s4( )-4686.5290.00195(e)-4( )-122(a)a464(o(I)-2425228 -(e)-4.00391)-4(d)-4(e)pm6 )-4724(si)2(d)(m)3(e)-4(n)-4(t)8(a 472 )-122(434[(e)-4-4(u)6)7(o)44)2(a)-.4 -20.76 Td44)-232)-4(u)-92 Tm[(4(n)-4-344)-(t)8(o)-4e(v)10(a))8(a)-344)-J335H4(l)2()-2( )-44(n)-ke4(r)3(66.99707(p)-4(,)7-4(o)6( )427(u)-4(d)6)6o4464(o)442sl( )-4663.2-4(p)6(a)í(n)9en6 n6 aa
46
Para a melhor compreensão desses módulos é importante entender alguns
conceitos, entre eles o módulo de cisalhamento complexo (G
*
) que representa a
resistência total a deformação do sistema, o qual é definido como:
G
*
= σ
0
/ γ
0
(5)
Onde σ
0
e γ
0
representam a tensão total e deformação total do sistema.
O módulo complexo pode ser subdividido em dois componentes:
G
*
= G’+ G” (6)
Onde G’ é o módulo elástico e o G” o módulo viscoso (NAÉ, 1993).
Geometricamente os componentes do módulo complexo (G
*
), módulo
elástico (G’) e módulo viscoso (G”) são obtidos pelo triângulo:
fora de fase
δ
em fase
Então o ângulo de fase pode ser calculado matematicamente por:
Tan δ = G”/ G’ (7)
Ou seja, a tangente de δ é uma forma de relacionar o teor de energia
perdida e armazenada.
G
*
G
”
G
’
47
Para um sólido puramente elástico, o G
’’
é igual a zero, e o módulo de
armazenamento (G’) é igual ao módulo de cisalhamento complexo (G*), o ângulo
de fase é igual a zero, ou seja, toda a energia aplicada ao sistema é armazenada
a cada ciclo.
G* = G’ (8)
Já, para um fluído Newtoniano, a viscosidade dinâmica (η*) é igual ao
módulo de perda (G”) e ao módulo de cisalhamento complexo (G*), o ângulo de
fase é igual a 90 °, ou seja, toda energia aplicada ao sistema é dissipada na forma
de calor.
G*=G”= η* (9)
A viscosidade dinâmica é uma análoga da viscosidade absoluta, porém a
taxa de cisalhamento é substituída pela velocidade angular, assim:
η* = σ
0
/ ω (10)
As propriedades reológicas podem ser caracterizadas em dois tipos de
sistemas não oscilatórios (a viscosidade absoluta é uma relação entre a tensão e
taxa de cisalhamento) e oscilatórios (a viscosidade é dependente do módulo
elástico e viscoso), denominada então de viscosidade complexa (LAPASIN e
PRICIL, 1995a).
Quando se fala em análises em sistemas oscilatórios uma das técnicas
mais importantes é a análise em sistemas viscoelásticos lineares, onde uma
tensão oscilatória é aplicada à amostra e a resistência à deformação é medida, e
mostra-se independente da tensão. Há uma independência do módulo de
cisalhamento complexo (G*), da tensão aplicada ou da deformação. Geralmente,
assumem-se como ideais deformações abaixo de 10%. A interação entre as
partículas na solução determina se o sistema é elástico ou viscoso. Medidas dos
48
módulos (G’e G’’) em função da freqüência oscilatória sob uma tensão constante
na faixa viscoelástica linear, fornecem um entendimento destas interações.
Para géis verdadeiros não basta o G’ ser superior ao G” é importante
observar a relação destes dois módulos onde a relação G’/G” possua relação
1:2 e ambos mostrem pequena dependência da frequência (LAPASIN e PRICL,
1995a).
1.7. GALACTANAS SULFATADAS COMO COMPOSTOS BIOLOGICAMENTE
ATIVOS: ATIVIDADE ANTIVIRAL
Entre as principais atividades biológicas desempenhadas pelas galactanas
sulfatadas estão as anticoagulante e antiviral. A atividade anticoagulante para
esses compostos foi inicialmente descrita por CHARGAFF et al., (1936), e,
atualmente, vários trabalhos relatam este tipo de atividade (CARLUCCI et al.,
1997; CACERES et al., 2000; FARIAS et al., 2000; PEREIRA et al., 2002).
Atividades antioxidante (ZHANG et al., 2003), antitumoral, e anti-angiogênica
(SATORU et al., 2003) também têm sido relatadas.
Esses polissacarídeos naturalmente sulfatados obtidos de algas marinhas,
especialmente os que são extraídos de algas vermelhas (carragenanas, agaranas
e xilomananas sulfatadas) são reconhecidos como inibidores seletivos de vários
tipos de vírus envelopados. Entre eles, estão incluídos os retrovírus (HIV tipo 1 e
2), herpes simplex vírus (HSV-1 e 2) também denominados herpes vírus hominis,
citomegalovírus humano (HCMV), flavivírus (vírus da dengue tipo 2), hepadnavírus
(vírus da hepatite B (HBV), orthomyxovírus (vírus da influenza A (InfA), entre
outros (BABA et al., 1988).
Pertencente à família Herpesviridae foram, até o momento, isolados oito
herpes-vírus em humanos: herpes simplex vírus 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2), o vírus
varicela-zoster (VZV), o citomegalovírus humano (HCMV), o vírus Epstein-Barr
(EBV) e os herpesvírus humanos 6, 7 e 8 (HHV6, HHV7 e HHV8). Todos são
formados por DNA e sua principal propriedade é a capacidade típica de se
tornarem latente no organismo, provocando infecções repetidas. Ambos HSV-1 e
49
2 associam-se geralmente a lesões cutâneas faciais, oftálmicas ou genitais. O
homem é o hospedeiro natural do herpes simplex vírus (WITVROUW et al., 1994).
Este vírus possui quatro componentes estruturais (i) um “core” interior onde
está a estrutura helicoidal de DNA, (ii) o capsídeo icosaédrico envolvendo o
“core”, que é envolvido pelo (iii) tegumento ou matriz amorfa e (iv) a membrana,
constituída pela bicamada lipídica que contém as glicoproteínas (SHIEH et al.,
1992).
O ciclo de replicação viral da família Herpesviridae pode ser dividido em
várias etapas (ROIZMAN e SEARS 1993), ainda que algumas características
sejam comuns a todos os vírus envelopados.
Tem sido demonstrado que as glicoproteínas gC ou gB presentes no
envelope viral estão envolvidas na fase inicial da ligação do vírus, interagindo com
o heparan sulfato da superfície da célula alvo (HEROLD et al., 1994). Esta
interação facilita a ligação da glicoproteína gD do envelope viral aos receptores
HVEM (herpes vírus entry mediators). Este processo de ligação permite a
penetração do vírus na célula por fusão do envelope viral com a membrana
plasmática celular, permitindo a entrada do DNA viral.
O efeito inibitório das substâncias polianiônicas na replicação do herpes
simplex vírus (HSV) e outros vírus envelopados vêm sendo relatados há quase 50
anos. Em 1958, GERBER et al relataram que polissacarídeos de algas exibiram
atividade antiviral contra o vírus da caxumba e vírus influenza B. Em 1977,
EHRESMANN et al. associaram a inibição do herpes simplex e outras viroses com
frações polissacarídicas extraídas de dez espécies de algas vermelhas;
observações semelhantes foram feitas por RICHARDS et al. (1978). Na década de
80 NAKASHIMA et al. (1987 a e b) relataram inibição da transcriptase reversa do
HIV por polissacarídeos sulfatados da alga vermelha Schizymenia pacifica.
Entre vários trabalhos, em 1997 CARLUCCI et al demonstraram que as
lambda-carragenanas e as parcialmente ciclizadas mu/nu-carragenanas de
Gigartina skottsbergii foram os mais potentes inibidores do HSV, mesmo contra
cepas variantes resistentes ao aciclovir (cepa TK
-
), apresentando valores de IC
50
menores que 1,0 µg/mL contra ambos os sorotipos. Foi observada uma relação
50
direta entre a atividade antiherpética e a quantidade de unidades α-D-galactose
2,6-disulfato nas carragenanas nativas, uma vez que a ciclização dessas
unidades, realizada por tratamento alcalino, diminuiu a atividade antiherpética em
relação aos polissacarídeos nativos.
A estrutura química da lambda-carragenana parece ser a responsável pelo
seu comportamento diferencial em relação à kappa/iota- e mu/nu-carragenanas,
provavelmente permitindo uma ligação mais estável ao HSV, levando a sua
inativação. Estas galactanas interferem na interação das glicoproteínas virais (gB
e/ou gC) com os receptores na membrana da célula inibindo a interação vírus-
célula (CARLUCCI et al., 1999).
Em colaboração com o grupo de Virologia do Departamento de Química
Biológica da Universidade de Buenos Aires, o laboratório de Química de
Carboidratos de Algas Marinhas da UFPR tem avaliado a atividade antiherpética
de galactanas sulfatadas.
As agaranas de Acanthophora spicifera (DUARTE et al., 2004) apresentam
suas unidades A principalmente sulfatadas em C-2, enquanto as unidades B estão
na forma precursora (α-L-galactose 6-sulfato) ou na forma de 3,6-anidro-α-L-
galactose. Estas agaranas apresentam seletiva e potente atividade contra as
cepas HSV-1 e HSV-2, sendo desprovidas de atividade citotóxica contra células
Vero (células de rim de macaco verde Africano) até a concentração de 1000
µg/mL. Assim como em outras galactanas sulfatadas, o efeito inibitório das
agaranas de Acanthophora spicifera deve-se à inibição da adesão do vírus a
célula hospedeira, impedindo a entrada do mesmo. A etapa inicial de adesão
inicia-se pela interação de glicoproteínas do envelope viral (gC ou gB) com o
heparan sulfato (HS) da célula do hospedeiro (WUDUNN e SPEAR, 1989; LYCKE
et al., 1991; SHIEH et al., 1992).
A família Flaviviridae é formada por vários gêneros: flavivirus, hepacivirus e
pestivirus e um grupo de vírus não classificados. Dentro desta família estão
compreendidos os vírus da febre amarela (YF) e o vírus da dengue (DENV) entre
outros (HEINZ e ALISSON, 2001). Essas enfermidades são transmitidas por
mosquitos e são infecções consideradas reemergentes, pelo aumento da
51
incidência observado nos últimos anos. No Brasil, a mais importante infecção foi
no Rio de Janeiro (1986/1987), na qual foi estimado que 1 milhão de pessoas
foram infectadas pela dengue sorotipo 1 (BRASIL, 2002).
O vírus da dengue apresenta uma forma esférica, com um diâmetro
aproximado de 50 nm. O genoma viral, dentro do nucleocapsídeo, consiste de
uma cadeia de RNA. Esse vírus apresenta a proteína do nucleocapsídeo V2/C
associada ao RNA viral. O nucleocapsídeo está envolvido por uma bicamada
lipídica que interage com uma proteína glicosilada transmembranal denominada
V3/E. Essa proteína é considerada a responsável pelas principais atividades
biológicas do vírus como: hemoaglutinação, neutralização e união a receptores
celulares. A localização da proteína V1/M não está clara, mas acredita-se que seja
uma proteína integral de membrana que interage com a proteína V3/E, assim
como o complexo RNA-proteína V2/C (HEINZ e ALISSON, 2001).
Dependendo das características moleculares quatro sorotipos de vírus da
dengue estão descritos (DENV 1 − 4) (GUBLER, 1998). Esse flavivirus também se
liga ao heparan sulfato presente na célula do hospedeiro para iniciar o processo
de infecção (CHEN et al., 1997).
A dengue é uma enfermidade associada a regiões tropicais e subtropicais
em todo o mundo. A enfermidade apresenta um ciclo de transmissão que tem
início no homem infectado pelo mosquito (fêmea) Aedes aegypti. Após a ingestão
de sangue infectado, transcorre, no inseto, um período de incubação intrínseca
que pode variar de 8 a 12 dias. Após esse período, o mosquito torna-se apto para
transmitir o vírus e assim permanece durante toda sua vida. No homem, o período
entre a picada infectante e o aparecimento de sintomas (período de incubação)
pode variar de 3 a 15 dias, sendo, em média, de 5 a 6 dias. Posteriormente ocorre
o período de transmissibilidade quando houver vírus no sangue (período de
viremia). Este período começa um dia antes do aparecimento dos sintomas e vai
até o 6º dia da doença (HENCHAL e PUNTNAK, 1990).
A maioria das infecções por dengue é relativamente amena, caracterizada
por um rápido início de febre e sintomas não específicos, incluindo dor de cabeça
frontal, dor retro-orbital, dores no corpo, náusea e vômito, dores nas articulações,
52
fraqueza e erupções na pele (GUBLER, 1998). Com o aumento da co-circulação
de diferentes sorotipos da dengue febre hemorrágica (DFH) e síndrome do choque
da dengue (SCD) a incidência de epidemias com taxas de mortalidade em torno
de 1-5% tem sido muito maior (HOLMES e BURCH, 2000).
Na febre hemorrágica da dengue (FHD) os sintomas iniciais são
semelhantes aos do dengue clássico, porém rapidamente evoluem para
manifestações hemorrágicas. A definição de caso de FHD, de acordo com a
Organização Mundial da Saúde (OMS), consiste nos seguintes critérios: febre,
manifestações hemorrágicas e hemoconcentração: hemotócríto aumentado em
20% ou mais, ou evidência objetiva de aumento da permeabilidade capilar.
Até o momento não existe nenhuma terapia antiviral para o tratamento de
dengue e muitos aspectos dos mecanismos de ação envolvidos com a atividade
antiviral dos polissacarídeos sulfatados ainda não foram explorados
(FIGUEIREDO, 2000).
A Tabela 7 demonstra algumas algas cujos polissacarídeos naturalmente
sulfatados apresentam atividade antiviral.
53
TABELA 7. ATIVIDADE ANTIVIRAL DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS OBTIDOS
DE ALGAS VERMELHAS.
Algas Polissacarídeos Vírus Referência
Aghardiella tenera
Agaranas sulfatadas
HIV-1, HIV-2, HSV-
1, HSV-2, HCMV,
VSV,
Vacinia, Togavirus,
Parainfluenza
WITVROUW et al.,
1994
Asparagopsis
armata
Agaranas sulfatadas HIV-1 HASLIN et al., 2001
Acanthophora
spicifera
Agaranas sulfatadas HSV-1 e HSV-2
DUARTE et al.,
2004
Bostrychia
montagnei
Agaranas sulfatadas HSV-1, HSV-2
DUARTE et al.,
2001
Cryptopleura
ramosa
Agaranas sulfatadas
HSV
-1, HSV-2
CARLUCCI et al.,
1997
Gigartina
skottsbergii
carragenanas
lambda, κ-/ι- e ν-/µ
HSV-1, HSV-2
CARLUCCI et al.,
1997; 1999
Gracilaria corticata
Agaranas sulfatadas HSV-1, HSV-2
MAZUMDER et al.,
2002
Gymnogongrus
torulosus
DL-galactanas
híbridas
HSV-2 e DEN-2 PUJOL et al., 2002
Nothogenia
fastigiata
xilomananas e
xilogalactanas
HIV-1, HIV-2, SIV,
HSV-1, HSV-2,
HCMV, InfA, RSV,
KOLENDER et al.,
1995
Pterocladiella
capilaceae
Agaranas sulfatadas HSV-1, HSV-2 PUJOL et al., 1996
Schizymenia
pacifica
carragenanas lambda
HIV-1, AMV
NAKASHIMA et al.,
1987a
Schizymenia dubai
galactanas sulfatadas
com ácidos urônicos
HIV-1, HSV-1,
HSV-2, VSV
BOURGOUGNON
et al., 1993
Stenograme
interrupta
Carragenanas HSV-1, HSV-2
CÁCERES et al.,
2000
54
Para que uma substância seja considerada um agente antiviral, ela deve
possuir seletividade e ser capaz de inibir a replicação viral sem alterar as funções
da célula do hospedeiro. Neste contexto, é desejável encontrar uma droga que
tenha um perfil aceitável de efeitos secundários. Até o momento os melhores
resultados de atividade antiviral foram obtidos com compostos análogos de
nucleosídeos. Estes compostos, porém, não podiam ser utilizados em tratamentos
sistêmicos devido a sua baixa seletividade, pois exerciam seu efeito tanto na DNA
polimerase viral quanto na celular.
Em 1977, foi descoberto o aciclovir (9-[2-(hidroxietoxi)-metil] guanina), que
é um análogo da guanosina, porém com uma cadeia acíclica no lugar do ciclo
completo de ribose, muito utilizado como composto antiherpético (FURMAN et al.,
1980).
O aciclovir difundi-se livremente através das células e apresenta potente
atividade seletiva sobre as células infectadas, pois só é ativado para sua forma
fosforilada pela timidinaquinase e DNA-polimerase viral, o que lhe confere alto
índice de segurança no uso clínico. Durante a replicação do DNA, o aciclovir
trifosfato compete com o substrato natural dGTP pela DNA polimerase e é
incorporado ao DNA em formação, uma vez que ele apresenta maior afinidade
pela enzima. A forma trifosfato ativa se encontra em concentrações 40 a 100
vezes maiores nas células infectadas que nas células sadias, inibindo a replicação
do DNA viral e produzindo poucos efeitos colaterais (O’BRIEN, e CAMPOLI-
RICHARDS, 1989).
Apesar desta droga ser efetiva na redução da severidade das infecções por
HSV, o aparecimento de mutantes resistentes durante os tratamentos prolongados
é uma das razões que justifica a busca contínua de novos agentes antivirais.
Atualmente estão disponíveis três derivados do aciclovir aprovados para uso
clínico: ganciclovir, famciclovir e valaciclovir (BALFOUR et al., 1999).
Para o vírus da dengue, até o momento, nenhuma terapia antiviral está
estabelecida. ONO et al (2003) demonstraram que galactomananas submetidas à
sulfatação apresentaram atividade in vitro e in vivo contra o vírus da dengue e
febre amarela. O interesse na atividade antiviral dos polissacarídeos naturalmente
55
sulfatados de algas marinhas aumenta, pois eles podem ser obtidos em altas
quantidades, baixo custo, baixa toxicidade e em alguns casos há perda do seu
efeito anticoagulante (DAMONTE et al., 2004).
Todos esses dados demonstram que o desenvolvimento de pesquisas
voltadas para determinação da estrutura química fina destes polímeros naturais é
muito importante tanto para a correta aplicação industrial nos diferentes setores,
quanto, para a avaliação das potenciais ações biológicas. Essas pesquisas podem
contribuir para identificação de novas e promissoras fontes desses polímeros,
cada vez mais importantes economicamente.
56
2.0. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como objetivo geral determinar a estrutura química fina
de galactanas sulfatadas isoladas das algas marinhas Meristiella gelidium
(Solieriaceae) e Gymnogongrus griffthisae (Phyllophoraceae), avaliar suas
propriedades reológicas e atividade antiviral.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Extrair e purificar os polissacarídeos solúveis em meio aquoso (a 25 °C e
a 100 °C).
2. Determinar a massa molecular média dos principais polissacarídeos
homogêneos por cromatografia de gel permeação (HPSEC-MALLS).
3. Determinar a estrutura química fina dos principais polissacarídeos por
métodos químicos e espectroscópicos.
4. Avaliar as propriedades reológicas das carragenanas de M. gelidium
isoladamente e em combinação com diferentes amidos frente a distintos modos de
preparo variando temperatura e sal.
5. Correlacionar a atividade antiherpética e antidengue com a estrutura
química das galactanas de M. gelidium e G. griffithsiae.
57
3.0. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. ESPÉCIES ESTUDADAS E SEUS POSICIONAMENTOS SISTEMÁTICOS
As espécies estudadas neste trabalho foram as algas Meristiella gelidium e
Gymnogongrus griffithsiae.
Divisão: Rhodophyta
Classe: Rhodophyceae
Ordem: Gigartinales
Família: Solieriaceae
Gênero: Meristiella
Espécie: Meristiella gelidium (J. Agardh)
Divisão: Rhodophyta
Classe: Rhodophyceae
Ordem: Gigartinales
Família: Phyllophoraceae
Gênero: Gymnogongrus
Espécie: Gymnogongrus griffithsiae (Turner) Martius
3.2. COLETA E PROCESSAMENTO
A alga Meristiella gelidium foi coletada na praia de Pitimbu, no estado da
Paraíba em março de 2002 e a alga Gymnogongrus griffithsiae, na ilha do Farol na
praia de Caiobá – Paraná, em 2004. As algas foram classificadas pela Dr
a
Silvia
Maria Pita de Beuclair Guimarães do Instituto de Botânica/SP.
Exemplares da espécie M. gellidium e G. griffithsiae estão depositados no
Herbário da UFPR, Departamento de Botânica, sob o número UPCB- 46434 e
46433, respectivamente.
58
Os exemplares das duas espécies foram lavados com água corrente, secos
a temperatura ambiente (à sombra) e moídos em moinho de faca (WILEY MILL).
As algas secas e moídas foram submetidas ao processo de extração descrito a
seguir.
3.3. EXTRAÇÃO DAS GALACTANAS DE Meristiella gelidium E
Gymnogongrus griffithsiae
As algas Meristiella gelidium e Gymnogongrus griffithsiae secas e moídas
foram submetidas à extração aquosa (1,0% p/v) sob agitação mecânica à 25°C,
por 15 horas. Os extratos foram centrifugados (10.000 xg por 5 minutos), obtendo-
se um resíduo e um sobrenadante. Ao sobrenadante foi adicionado etanol (3
volumes). Os resíduos foram novamente submetidos à extração aquosa a 25
o
C,
como descrito anteriormente. Os precipitados etanólicos das duas extrações
aquosas a 25
o
C foram separadamente ressolubilizados em água destilada,
dialisados contra água destilada e liofilizados. As frações polissacarídicas obtidas
de M. gelidium e G. griffithsiae foram denominadas de M1-M2 e G1-G2,
respectivamente.
Os respectivos resíduos da última extração aquosa a 25
o
C foram
suspensos em água sob agitação mecânica, a 100
o
C por 3 horas. Após
centrifugação (10.000 xg por 10 minutos), aos sobrenadantes foi adicionado etanol
(3 volumes). O precipitado obtido, após centrifugação, foi ressolubilizado em água,
dialisado e liofilizado originando os extratos G3 para G. griffthsiae e M3 para M.
gelidium. O processo de extração a 100
o
C foi repetido por mais duas vezes para
a alga M. gelidum, originando as frações M4 eM5.
59
3.4. FRACIONAMENTO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL
3.4.1. MÉTODOS ANALÍTICOS GERAIS
3.4.1.1 A dosagem de açúcar total foi realizada pelo método do fenol-ácido
sulfúrico (DUBOIS et al. 1956), com sensibilidade entre 10-100 µg/ml, utilizando-se
como padrão galactose na concentração de 70 µg/mL. A leitura foi realizada no
comprimento de onda de 490 nm.
3.4.1.2 As dosagens de proteínas foram realizadas pelo método de LOWRY
et al. (1951), utilizando-se o reativo de Folin-Ciocalteau e solução de soro-
albumina bovina cristalina como padrão na concentração de 40 mg%. A leitura foi
realizada no comprimento de onda de 660 nm. A sensibilidade do método é de 5-
100 µg.
3.4.1.3 O teor de sulfato foi determinado pelo método de DODGSON
(1961). Após hidrólise das amostras com HCl 1 M, 5 horas, 105
o
C, foi adicionado
o reativo gelatina-bário (neste reativo o cloreto de bário foi solubilizado na
gelatina), formando posteriormente o sulfato de bário, que permanece suspenso.
Como padrão foi utilizado solução de sulfato de sódio na concentração de 1
mg/mL, diluído em HCl 1M. A leitura foi realizada no comprimento de onda de 360
nm. A sensibilidade do método está na faixa de 20-200 µg de sulfato.
3.4.1.4 O conteúdo de 3,6-anidrogalactose foi determinado pelo método
fotocolorimétrico do resorcinol (YAPHE, 1960).
3.4.1.5 A determinação da rotação óptica específica ([α]
D
) foi realizada em
polarímetro RUDOLPH RESEARCH, modelo Autoplol III, a 20
o
C, com as amostras
na concentração de 0,2 g% em água.
60
3.4.2. PRECIPITAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS COM KCl
As frações M1-M3 de M. gelidium e G3 de G. griffithsiae foram
solubilizadas em água destilada 0,20% p/v), (0,25% p/v), respectivamente e
submetidas a fracionamento com KCl utilizando concentrações crescentes (0 – 2,0
M), com adição de 0,1 em 0,1 M até concentração final de 2,0 M. Após cada
adição as amostras foram mantidas em repouso durante 16 horas a 4°C. Os
extratos polissacarídicos foram centrifugados, e os sobrenadantes e precipitados
dialisados contra água destilada e liofilizados. Os polissacarídeos insolúveis de M.
gelidium foram denominados M1a (1,0–1,2 M); M2a (0–0,1 M); M2b (1,0–1,2 M) e
M3a (1,0–1,2 M). O fluoxograma de precipitação da fração G3 e obtenção da
fração G3d (utilizada para avaliação antiviral) está descrito na Figura 48 (B) (pág.
145). Os polissacarídeos solúveis em KCl 2,0 M obtidos a partir das frações M1,
M2, M3 e G3 foram denominados de M1S, M2S, M3S e G3S, respectivamente.
3.4.3. PURIFICAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DE M. gelidium POR
CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA.
A fração polissacarídica M3S, solúvel em KCl 2,0 M, foi submetida à
fracionamento por meio de cromatografia de troca-iônica em coluna contendo
DEAE-Sephacel utilizando como eluentes água e soluções de NaCl de molaridade
crescente. A eluição foi monitorada pelo teste de fenol-ácido sulfúrico (DUBOIS et
al., 1956).
Foram obtidas de M. gelidum as frações denominadas M3S-1, M3S-2,
M3S-3, M3S-4, M3S-5 e M3S-6, as quais foram eluídas com água e com NaCl 0,4,
0,6, 0,8, 1,0 e 2,0 M respectivamente (Figura 12, pág.85).
61
3.4.4. HIDRÓLISE ÁCIDA TOTAL DO TIPO HIDRÓLISE REDUTIVA
A composição monossacarídica foi determinada de acordo com o método
de FALSHAW e FURNEAUX (1994), o qual é uma modificação do método original
descrito por STEVENSON e FURNEAUX (1991), que se processa em duas
etapas:
- Na primeira etapa, é realizada uma pré-hidrólise: 1-2 mg de
polissacarídeo foi tratada com ácido trifluoroacético (TFA) na concentração de 3,0
M, e o complexo 4-metil-morfolina borano, agente redutor, o qual possui
estabilidade em meio reacional ácido, à temperatura de 90
o
C por 15 minutos, com
a finalidade de reduzir as unidades de 3,6-anidrogalactopiranose, protegendo-as
da degradação em meio ácido.
- Na segunda etapa, a concentração do TFA é ajustada para 2,0 M pela
adição da solução do complexo 4-metil-morfolina borano, à temperatura de 120
o
C
por 90 minutos. Nesta condição há hidrólise das ligações glicosídicas envolvendo
as demais unidades constituintes do polissacarídeo, as quais por sua vez serão
também reduzidas.
Os correspondentes alditóis foram acetilados (anidrido acético/TFA
concentrado na proporção de 2:1) e analisados na forma de acetatos de alditóis
por cromatografia líquido-gasosa (CG) e/ou CG-EM (cromatografia líquido-gasosa
- espectrometria de massa).
3.4.5. HIDRÓLISE ÁCIDA TOTAL
Com o objetivo de diferenciar os derivados naturais 3- e 4-O-metil-
galactose, 1-2 mg de polissacarídeo foi submetido seqüencialmente a hidrólise
ácida total (ácido fórmico 45 %, 100 °C, 16 h), redução com NaBD
4
(12 h) e
acetilação (anidrido acético 0,4 g %, 120 °C, 1,5 h), seguida por análise por CG-
EM.
62
3.4.6. METILAÇÃO
O processo de metilação dos polissacarídeos na forma de sal de
trietilamônio foi conduzido de acordo com o método de CIUCANU e KEREK
(1984). Após solubilização em DMSO (1 mL para cada 15 mg de polissacarídeo)
foi adicionado NaOH pulverizado (30 mg) e após agitação mecânica vigorosa (30
minutos), foi adicionado iodometano (0,1 mL) sob agitação mecânica vigorosa (30
minutos). Este processo (adição de NaOH e iodometano) foi repetido por mais 2
vezes completando-se assim uma etapa de metilação. A cada etapa as frações
foram dialisadas e liofilizadas. Após cada etapa de metilação as frações
polissacarídicas foram hidrolisadas de acordo com o método de FALSHAW e
FURNEAUX (1994), acetiladas (anidrido acético/TFA concentrado, a 50
o
C por 15
minutos) e analisadas por CG e/ou CG-EM, na forma de acetatos de alditóis
parcialmente metilados.
3.4.7. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
3.4.7.1. CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-GASOSA (GLC)
As análises por cromatografia gasosa foram realizadas em Cromatógrafo
HEWLETT PACKARD 5890, com detector de ionização de chama (300 °C) e
injetor (250 °C), utilizando nitrogênio como gás de arraste e coluna capilar de sílica
fundida (30 m X 0,25 mm d.i.), DB-225 (0,25 µm), em diferentes temperaturas:
análises cromatográficas para acetatos de alditóis foram realizadas à 220 °C, e as
amostras de acetatos de alditóis parcialmente O-metilados foram realizadas à
210 °C.
63
3.4.7.2.CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-GASOSA ACOPLADA À
ESPECTROMETRIA DE MASSA (GC-MS)
As análises cromatográficas em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massa foram realizadas em cromatógrafo a gás “VARIAN”, modelo 3.300,
acoplado a um espectrômetro de massa de marca FINNIGAN MAT, modelo ITD
800 e/ou VARIAN – SATURN 2000R, equipado com coluna capilar de sílica
fundida (30 m X 0,25 d.i.) DB-225, marca J.W. As injeções nas colunas foram
feitas mantendo-se a temperatura inicial em 50
o
C/min, seguido de aumento de
acordo com a programação de temperatura em um gradiente de 40
o
C/min, até
230
o
C, mantendo-se constante a partir deste valor. Foi utilizado gás hélio como
gás de arraste, com fluxo de 1 mL/min. As áreas dos picos de interesse foram
determinadas por integração em software. Os espectros de massa foram obtidos
por impacto de elétrons a 70 eV, repetidamente a cada 1/8 de segundo, de m/e
(relação carga/massa) 80 a 220. Este método foi utilizado para quantificação de
acetatos de alditóis (SLONEKER, 1972).
3.4.7.3. CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAÇÃO (HPSEC-MALLS) –
ANÁLISE DE HOMOGENEIDADE E MASSA MOLECULAR
Para a análise de homogeneidade e determinação da massa molecular
ponderal média (Mw) foi preparada uma solução de 1 mg de amostra em 1mL de
solução de nitrito de sódio (NaNO
2
0,1 M) contendo azida de sódio (NaN
3
, 200
ppm). As soluções obtidas foram filtradas em membranas MILLIPORE (acetato de
celulose) de 0,45 e 0,22 µm. As análises foram realizadas em HPLC acoplado a
detectores de espalhamento de luz e índice de refração, com fluxo de 0,6 mL/min.
Para determinação da massa molecular ponderal média utilizou-se o valor de
dn/dc (variação do índice de refração com relação à concentração) o qual foi
previamente determinado.
64
As análises de homogeneidade e de determinação do valor de Mw foram
realizadas em cromatógrafo de exclusão estérica de alta pressão (HPSEC)
WATERS, equipado com um detector de índice de refração diferencial WATERS
modelo 2410 e com detector de espalhamento de luz em multiângulos (MALLS)
WYATT TECHNOLOGY modelo DAWN DSP com 18 detectores dispostos ao
redor da fotocélula em diferentes ângulos. Foram utilizadas 4 colunas de gel
permeação WATERS, com limites de exclusão de 1.10
6
, 4.10
5
, 8.10
4
e 5.10
3
, em
série. O eluente utilizado foi uma solução de (NaNO
3
0,1 M) contendo NaN
3
(200
ppm), pressão de 920 psi a 20
o
C. Foi utilizado o programa ASTRA (WYATT
TECHNOLOGY), para analisar os dados obtidos.
Para determinação do dn/dc soluções 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mg foram
preparadas a partir de uma solução mãe 1,0 mg da amostra em 1 mL de NaNO
3
0,1 M e azida de sódio (NaN
3
) 200 ppm, previamente filtradas em membrana
Millipore 0,45 µm. As análises foram realizadas utilizando índice de refração, com
fluxo de 0,6 mL/min e pressão de 67 psi a 20
o
C.
3.4.8. DESSULFATAÇÃO POR TRATAMENTO SOLVOLÍTICO
3.4.8.1. PREPARO DO SAL DE PIRIDÔNIO
O processo de solvólise foi conduzido com os polissacarídeos (M3S-3 e
M3S-4) na forma de sal de piridônio. Este sal foi formado por meio da
solubilização das frações em água e então foi adicionada resina catiônica DOWEX
50x8 na forma H
+
, sob agitação magnética a 25 °C por 30 minutos. O pH do
sobrenadante ficou entre 1-2. O filtrado (obtido por filtração à pressão reduzida) foi
neutralizado (em capela) com piridina, até pH 7,0 e liofilizado (NAGASAWA et al.,
1979).
65
3.4.8.2. SOLVÓLISE
O polissacarídeo, na forma de sal de piridônio, foi solubilizado em uma
mistura de dimetilsulfóxido, metanol e piridina, cuja proporção foi de 89:10:1 v/v/v,
respectivamente, respeitando-se a relação de 10 mg de polissacarídeo para 3 mL
de mistura (NAGASAWA et al., 1979).
A solução resultante foi mantida a 100ºC durante 4 horas. Após o
resfriamento, a fração solvolisada foi submetida à diálise exaustiva contra água
destilada e liofilizada. O polissacarídeo dessulfatado foi submetido à metilação
conforme descrito no item 3.4.8.
3.4.9. TRATAMENTO ALCALINO
Aos polissacarídeos M1a e M3a (50 mg) previamente solubilizados em
água destilada (0,2 g%), foi adicionado borohidreto de sódio (10 % em relação à
massa do polissacarídeo). Após repouso de 17 horas a 4ºC, adicionou-se
hidróxido de sódio 3,0 M (concentração final 1,0 M) e a mistura foi mantida em
banho termostatizado a 80ºC por 2 horas (NOSEDA e CEREZO, 1995).
A reação foi monitorada pela determinação do teor de 3,6-anidrogalactose,
até alcançar valor constante, pelo método do resorcinol (YAPHE, 1960).
Após resfriamento, diálise e liofilização, as amostras foram submetidas à
hidrólise redutiva segundo FALSHAW e FURNEAUX (1994), e analisadas por CG
e/ou CG-EM na forma de acetatos de alditóis.
66
3.4.10. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
3.4.10.1. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
X
As análises de ressonância magnética nuclear (RMN) monodimensionais
foram realizadas em espectroscópio da marca BRUKER, modelo DRX 400, série
Avance, em probe de diâmetro externo de 5 mm, com as amostras dissolvidas em
água deuterada (D
2
O), a temperatura de 50 ou 70
o
C. Os deslocamentos químicos,
expressos em δ (ppm), foram determinados utilizando acetona como padrão
interno para as análises de
13
C (δ = 30,2 ppm).
Os espectros de RMN -
13
C foram obtidos na freqüência base de 100,61
MHz, com intervalo de aquisição de sinal de 0,6 segundos, sendo feitas de 4.000 –
100.000 aquisições, utilizando-se um intervalo de 0,1 segundo entre os pulsos.
3.4.10.2. ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO POR
TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR)
Os espectros FT-IR foram obtidos pelo uso de espectrômetro BOMMEN,
modelo MB-100, incorporado a Transformada de Fourier. As amostras (2 mg)
foram homogeneizadas com brometo de potássio (KBr) e analisadas sob a forma
de pastilhas.
As análises de FT-IR foram realizadas no Departamento de Química da
UFPR.
3.5. ANÁLISES REOLÓGICAS
As análises reológicas foram realizadas em colaboração com a Prof
a
. Dr
a
.
Maria Rita Sierakowski do Laboratório de Biopolímeros, Departamento de Química
da Universidade Federal do Paraná.
67
3.5.1. PREPARO DAS GALACTANAS SULFATADAS
Para as análises reológicas oscilatórias, as galactanas sulfatadas M1 e M3a
de M. gelidium foram solubilizadas na concentração de 10 g/L
na presença de
120 mM de KCl. As amostras foram mantidas sob agitação mecânica a 25°C
durante 4 horas.
3.5.2. PREPARO DOS AMIDOS
Os amidos de milho comum (CS), amilose (MS), amilopectina (WS) e amido
de Cará (YS) na concentração de 25 g/L foram transformados em pasta por
dispersão em água destilada durante 1 hora e 30 minutos a 25°C, seguida de
autoclavação (120°C) por 30 minutos e refrigeração por 18 horas, exceto para a
amostra de amido de Cará que também foi dispersa em água, 1 hora e meia a
85°C, na ausência e presença de 120 mM de KCl. O cloreto de sódio foi escolhido
por ser o sal utilizado para obtenção das carragenanas pelo método original
(processo geleificante).
3.5.3. PREPARO DAS MISTURAS DE POLISSACARÍDEOS
Em todas as análises as concentrações utilizadas foram: galactana (5 g/L) e
amidos (20g/L). As amostras foram preparadas em volume final de 10 ml, para as
concentrações desejadas foram adicionadas 50 mg da galactana e 200 mg do
amido. A galactana foi solubilizada em água (10 ml) sob dispersão mecânica a
25°C durante 30 minutos. Posteriormente o amido foi dissolvido na solução de
galactana e o sistema mantido sob agitação (dispersão mecânica) a 25°C durante
1 hora. Em seguida, as misturas foram autoclavadas durante 30 minutos. As
misturas obtidas após refrigeração a 4°C por 18 horas foram analisadas.
Somente com o amido de cará foi avaliada a influência da galactana em
função da (i) presença de sal (KCl) e (ii) da temperatura (pré-aquecimento =
dispersão mecânica a 85 °C).
68
Dispersão mecânica a 25°C sem KCl 120 mM: já citado anteriormente.
(i) Dispersão mecânica a 25°C com KCl 120 mM: o modo de preparo é o
mesmo com a exceção de que a galactana foi solubilizada em solução de KCl 120
mM sob dispersão mecânica a 25°C durante 30 minutos. Posteriormente o amido
foi adicionado e o sistema mantido sob agitação a mesma temperatura durante 1
hora. Em seguida as misturas foram autoclavadas durante 30 minutos. A mistura
obtida após refrigeração a 4°C por 18 horas foi analisada
(ii) Dispersão mecânica a 85°C sem KCl 120 mM: o amido de cará foi
adicionado à galactana, previamente dissolvida em solução aquosa por 30
minutos. A mistura foi mantida sob dispersão mecânica em banho maria a 85°C
por 1 hora seguido de autoclavação por 30 minutos e refrigeração durante 14
horas.
(ii e i) Dispersão a 85°C com KCl 120 mM: o processo é o mesmo descrito
acima, porém a galactana foi previamente dissolvida em solução de KCl 120 mM
por 30 minutos.
3.5.4. ANÁLISES EM SISTEMA DINÂMICO
As amostras foram preparadas conforme descrito no item 3.5.1 e as
medidas em sistema dinâmico foram realizadas em reômetro oscilatório HAAKE,
modelo RS 75, utilizando sistema peltier para controle de temperatura. Os
sensores coneplaca C60/2° Ti e pp 35/Ti foram utilizados nas análises.
3.5.5. DETERMINAÇÃO DO COMPORTAMENTO VISCOELÁSTICO
LINEAR
O comportamento viscoelástico linear foi determinado utilizando-se tensões
de 0,01
a 10 Pa, em freqüências fixas de 0,01 e 10 Hz. O comportamento
viscoelástico foi determinado onde o módulo elástico (G’) foi constante em função
da tensão fornecida, e com baixos valores de deformação (+/- 10%).
69
3.5.6. VARREDURA DE FREQÜÊNCIA EM SISTEMA VISCOELÁSTICO
LINEAR
Foram realizados experimentos utilizando-se deformação constante de 1%,
referente à região de comportamento viscoelástico linear, e freqüências variáveis
de 0,05 a 10 Hz. Nessas condições a resposta elástica (G’) e viscosa (G”), assim
como a viscosidade dinâmica (η
*
) foram avaliadas.
3.5.7. VARREDURA DE TEMPERATURA
Nas análises de variação de temperatura foi utilizado o sistema “Peltier”.
Sobre a placa foi utilizada também uma camada de óleo para minimizar o efeito da
evaporação do solvente, durante os ciclos de temperatura.
Foram realizadas duas rampas de temperatura (aquecimento e
resfriamento). A variação de temperatura foi de 5°C a 85°C com variação de
0,066°C por segundo, em frequência de 1 Hz e deformação de 1%. Foi avaliada a
temperatura de fusão da galactana, influência da variação de temperatura no
processo de histerese e estabilidade térmica das pastas.
3.5.8. TESTE DE INCHAMENTO DO GEL – SWEELLING
As pastas de (YS 25g/L) e ι-CAR (5g/L) – YS (20 g/L) foram secas (em
forma de disco), devidamente pesadas e transferidas para um banho a 25°C. O
peso das amostras hidratadas foi determinado após 15 min. Depois desse tempo
nenhuma diferença no peso foi observada. O peso dos géis hidratados foi
calculado subtraindo o peso do material seco do peso total (POLNOK et al., 2004).
O experimento foi repetido três vezes. A taxa de inchamento (Q) foi definida como:
Q = W
s
- W
d
W
d
70
Onde:
W
s
é o peso do material hidratado
W
d
é o peso do material seco
3.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA E ANTIDENGUE DAS
GALACTANAS DE M. gelidium e G. griffithsiae
Os experimentos de atividade antiviral apresentados neste trabalho foram
realizados no laboratório de Virologia do Departamento de Química Biológica da
Universidade de Buenos Aires (Argentina) pelo grupo da Dr
a
. Elsa B. Damonte. O
grupo de Química de Carboidratos de algas marinhas da UFPR mantém
colaboração científica com o grupo da Dr
a
. Elsa B. Damonte fornecendo amostras
de carboidratos sulfatados com o intuito de associar os resultados de atividade
antiviral com os dados estruturais.
3.6.1. CÉLULAS UTILIZADAS
As células utilizadas para os ensaios antivirais foram as células Vero [(linha
de células de rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops)], crescidas
em meio essencial mínimo de Eagle (MEM) suplementado com 5% (v/v) de soro
bovino fetal e para o meio de manutenção (MM) a concentração de soro bovino
fetal foi reduzida para 1,5%. A linha celular C6/36 HT do mosquito Aedes
albopictus (adaptada para crescimento a 33 °C) foi fornecida pelo Instituto
Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH) Dr. J. Maiztegui
(Pergamino, Argentina), crescida em meio L-15 (Leibovitz) suplementado com
0,3% de triptose fosfato, 0,02% de glutamina, 1% de MEM (solução de
aminoácidos não-essenciais) e 5% de soro bovino fetal. A linhagem de células de
fibroblastos humano (PH) foi fornecida pelo (CEMIC, Buenos Aires, Argentina) e
propagada em meio MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal. A linha de
71
células de hepatoma HepG2 foi fornecida pela Cátedra de Virologıa, Facultad de
Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires (Buenos Aires, Argentina) e
propagada em meio MEM contendo 0,03% de glutamina, 0,01% de piruvato de
sódio e 10% de soro bovino fetal.
3.6.2. VÍRUS UTILIZADOS
Os vírus HSV-1 cepa F e HSV-2 cepa G foram obtidos da American Type
Culture Collection (Rockiville, USA) e utilizados como cepas de referência. A cepa
B2006 é um HSV-1 TK
-
resistente a aciclovir obtida pelo Professor Dr. E. De
Clercq (Intituto Rega, Bélgica). O vírus HSV-2 cepa MS foi fornecido pelo Dr. F.
Benencia (Laboratório de Imunoquímica, UBA, Argentina). As variantes (1C3-syn
13-8) e (1C3-syn 14-1) de HSV-1 foram obtidas por passagens seriadas na
presença de mu/nu-carragenana 1C3 como descrito por CARLUCCI et al. (2002).
Os estoques virais foram propagados e titulados pela formação de placas virais
em células Vero.
Os vírus DENV-1 cepa Hawaii (obtido de INEVH), DENV-2 cepa NGC,
DENV-3 cepa H87 e DENV-4 cepa 8124 foram fornecidos pelo Dr. A.S.
Mistchenko (Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez, Buenos Aires, Argentina).
3.6.3. POLISSACARÍDEOS DE M. gelidium E G. griffithsiae UTILIZADOS
NA AVALIAÇÃO ANTIVIRAL
Da alga M. gelidium foi avaliada a atividade antiviral das frações
polissacarídicas M1, M3 e M3a e da alga G. griffithsiae foram avaliadas as frações
G3, G3S, G3d, G3S-1, G3S-2, G3S-3, G3S-4, G3S-5, G3S-6 e G3S-7. A fração
G3d foi obtida conforme Figura 48 (pág.145/146). As demais frações analisadas
foram obtidas previamente por FARIA (2002).
72
3.6.4. ENSAIO CITOTÓXICO
A viabilidade das células Vero frente às galactanas de M. gellidium e G.
griffthsiae foi medida pelo método do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazolio]. As culturas, em placas de 96 poços, foram expostas a
diferentes concentrações dos polissacarídeos (com três poços para cada
concentração) e incubadas a 37°C por 1 h. Após este período, 10 µl de MM
contendo MTT (concentração final 5 µg/mL) foi adicionado em cada poço, sendo
as placas virais incubadas a 37°C. Após 2 h de incubação o sobrenadante foi
removido e 200 µL de etanol foi adicionado a cada poço, para solubilizar os
cristais de formazan. Após agitação vigorosa, a absorbância foi medida em leitor
de microplacas a 595 nm. A concentração citotóxica 50% (CC
50
) foi calculada
como a concentração do polissacarídeo necessária para reduzir a viabilidade
celular em 50% quando comparada ao controle.
3.6.5. FORMAÇÃO DE PLACAS EM CÉLULAS Vero
Células Vero crescidas em monocamada foram infectadas com diluições
seriadas da amostra de vírus e mantidas a 37°C por 1 h com agitação a cada 20
minutos. Após adsorção, os inóculos foram retirados, e as monocamadas cobertas
com meio foram incubadas por 48 h a 37°C, em estufa com ambiente de CO
2
.
Após este período o meio foi removido, as células fixadas com formol 10% durante
15 minutos e as monocamadas foram coradas com cristal violeta 1%, o que
permite contar as placas de lise produzidas pelo vírus.
Título (UFP/mL) = n/ v.d
UFP: unidades formadoras de placas
n: número médio de placas
v: volume do inóculo
73
d: diluição na qual é possível contar corretamente as placas
Neste ensaio foram também determinados os números de placas de lise
produzidos pelo vírus nas células Vero na ausência de qualquer composto,
funcionando como controle negativo. O resultado é dado como unidades
formadoras de placas (UFP). Este resultado é importante uma vez que a atividade
antiviral (determinada posteriormente) expressará a percentagem (em relação ao
controle) em que o composto (no caso as galactanas sulfatadas), em uma
determinada concentração, reduz o número de placas virais.
3.6.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL in vitro
A atividade antiviral das frações polissacarídicas foi avaliada in vitro pelo
método de redução do número de placas virais.
Monocamadas confluentes de células Vero crescidas sobre multiplacas de
24 poços, foram infectadas com aproximadamente 50 UFP (unidades formadoras
de placas) de vírus por poço, na ausência ou presença de diferentes
concentrações das frações polissacarídicas. Após 1h de incubação (37
o
C), os
inóculos residuais foram removidos e adicionou-se o MM contendo metilcelulose
(0,7% e 1% para HSV e DENV, respectivamente) e a correspondente dose de
cada polissacarídeo. As placas foram incubadas a 37
o
C por 2 dias (HSV) e por 6 -
12 dias (DENV) de acordo com o sorotipo do vírus, em estufa com ambiente de
CO
2
. Após este período o meio foi removido e o número de placas virais formadas
foi contado como descrito no item 3.6.5. A concentração inibitória 50% (IC
50
) foi
calculada como a concentração do polissacarídeo necessária para reduzir 50% da
citopatogenicidade viral quando comparada ao controle. Cada determinação foi
executada duas vezes em duplicada.
A atividade contra o vírus da dengue também foi avaliada pelo ensaio de
redução do rendimento viral. Células Vero, HepG2, PH e C6/36 HT crescidas em
placas de 24 poços foram infectadas com DENV-2 ou DENV-3 a uma
multiplicidade de infecção (m o i) de 0,1 na presença de diferentes concentrações
74
das frações polissacarídicas, dois poços/concentração. Após 48 h de incubação a
37
o
C (Vero, HepG2 e PH) ou 33
o
C (C6/36HT) o meio foi removido e o rendimento
dos vírus foi determinado pela formação de placas em células Vero. Os valores de
IC
50
foram calculados como descrito acima.
Para a determinação do efeito do tempo de incubação na atividade antiviral
das galactanas sulfatadas, as células Vero crescidas sobre multiplacas de 24
poços foram infectadas com 50 UFP de HSV-1 cepa F, em meio MM na presença
ou na ausência de diferentes concentrações de polissacarídeo. Após incubação de
1 h a 4
o
C, o meio contendo os vírus não adsorvidos foram removidos e as culturas
celulares foram lavadas (duas vezes) com PBS. Após adição de 0,5 mL de MM
contendo 0,7% de metilcelulose, com ou sem o polissacarídeo, as placas foram
incubadas por 48 h a 37
o
C. Após este período foi realizada a contagem do número
de placas virais como descrito no item 3.6.5.
3.6.7. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE VIRUCIDA in vitro
Uma suspensão viral contendo 4 x 10
5
UFP de HSV-1 cepa F foi incubada
(90 min a 37
o
C) com igual volume de MM na presença de diferentes
concentrações das frações polissacarídicas. Como controle foi incubada, nas
mesmas condições, a suspensão viral com igual volume de meio MM, porém sem
a presença das frações polissacarídicas. As amostras foram então diluídas em
MM para determinar a infectividade residual pelo método de formação de placas.
A concentração virucida 50% (VC
50
) expressa a concentração de galactana
requerida para inativar em 50% a carga viral total em relação ao controle.
75
3.6.8. DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE ADIÇÃO DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS
Para avaliar o efeito do tempo de adição das frações polissacarídicas na
sua atividade contra o vírus DENV-2, células Vero crescidas em placas de 24
poços foram infectadas com 100 UFP de DENV-2 em meio MM contendo 20µg/mL
de cada fração polissacarídica (tempo zero) ou MM sem fração polissacarídica.
Após 1 h de adsorção a 4°C, o meio contendo o vírus não adsorvido foi removido
e as culturas de células lavadas duas vezes com PBS. Posteriormente o meio MM
com a fração polissacarídica (20µg/mL) foi adicionado imediatamente (tempo zero
e 1 hora após infecção (pi) ou em vários tempos após a infecção (de 2 a 10h p i) e
incubado a 37°C até 11 h pi. Neste momento os sobrenadantes foram
descartados, as monocamadas de células foram lavadas com PBS e recobertas
com meio MM contendo 1% de metilcelulose. As placas foram contadas 6 dias
após a infecção como descrito no item 3.6.5.
3.6.9. ENSAIO DE ADSORÇÃO VIRAL
As células Vero crescidas em placas de 6 poços foram infectadas com 500
UFP de DENV-2 na presença ou ausência de 20µg/mL das frações
polissacarídicas e incubadas durante 0, 15, 30 ou 60 minutos a 4°C. O meio
contendo o vírus não adsorvido foi removido, as células lavadas com PBS e
recobertas com meio MM contendo 1% de metilcelulose. As placas virais foram
contadas como descrito no ensaio do tempo de adição.
3.6.10. ENSAIO DE INTERNALIZAÇÃO VIRAL
As células Vero crescidas em placas de 6 poços foram infectadas com 500
UFP de DENV-2 a 4°C. Após 1 h de adsorção viral, os vírus não adsorvidos foram
removidos, as células lavadas com PBS e incubadas a 37°C na presença ou
76
ausência de 20µg/mL das frações polissacarídicas. Em diferentes tempos após a
adsorção (0, 30, 60 e 120 minutos), as células foram lavadas com PBS e tratadas
com 0,1 mL de tampão citrato por 1 min para inativar adsorção mas não a
internalização do vírus. As células foram então lavadas com PBS e recobertas
com meio MM contento 1% de metilcelulose. As placas foram contadas como
descrito no item 3.6.5.
77
4.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1.1. ANÁLISES ESTRUTURAIS DOS POLISSACARÍDEOS DA ALGA
Meristiella gelidium (J. Agardh)
Como citado anteriormente, da alga M. gelidium (M) (FIGURA 6) foram
obtidas as frações polissacarídicas M1 e M2, (extratos a 25 °C) e M3 – M5
(extratos a 100 °C). O fluxograma de extração está ilustrado na FIGURA 7.
FIGURA 6. FOTO DA ALGA Meristiella gelidium (J. Agardh)
30 cm
78
FIGURA 7. FLUXOGRAMA DE EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA
ALGA VERMELHA Meristiella gelidium.
Sobrenandante 2
Fração M2
Resíduo 1
Sobrenandante 4
Fração M4
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
Resíduo 2
Fração M1
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
Sobrenandante 3
Fração M3
Extração aquosa 100°C
Centrifugação
Resíduo 3
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
ALGA SECA E MOÍDA
Extração aquosa 25°C
Centrifugação
Sobrenandante 1
Fração M1
Resíduo 4
Sobrenandante 5
Fração M5
Resíduo 5
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
Extração aquosa 100
°
C
Centrifugação
Extração aquosa 100
°
C
Centrifugação
Extração aquosa 25 °C
Centrifugação
79
Os polissacarídeos solúveis em meio aquoso de M. gelidium (M1–M5)
representaram aproximadamente 50% do material inicial. Esquema de extração
semelhante foi utilizado para outras algas da família Solieriaceae ricas em
carragenanas Eucheuma spinosum, E. cottonii, e para as algas da família
Gigartinaceae, Chondrus crispus e Gigartina stellata (BELLION e BRIGAND,
1983). CHIOVITTI et al. (1997) utilizaram somente extração a quente (120°C, 2h)
para extrair os polissacarídeos de algas do gênero Callophycus (Solieriaceae),
porém nessas condições o rendimento permaneceu entre 11–26%.
As análises químicas demonstram que todas as frações brutas M1–M5 são
sulfatadas, e os primeiros três extratos obtidos apresentaram semelhante e alta
percentagem deste substituinte (29,5–33,1%). Proteína também foi encontrada em
todos os extratos, em menor percentagem na fração M3 (TABELA 8).
TABELA 8. RENDIMENTO E ANÁLISE QUÍMICA DAS FRAÇÕES BRUTAS
EXTRAÍDAS DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium.
Fração Rendimento
(%)
a
Proteína
(%)
Carboidrato
(%)
Sulfato
(Na SO
3
)
(%)
[α]
D
(°)
M1
b
12,0 16,6 23,3 29,5 +48
M2
b
6,2 14,9 25,3 32,3 +36
M3
c
25,3 8,3 40,0 33,1 +25
M4
c
3,0 19,1 46,8 20,0 +50
M5
c
1,0 19,7 66,1 11,3 +61
a
= rendimento em percentagem relativo a alga seca e moída.
b
= M1 e M2, frações obtidas por extração aquosa à temperatura de 25°C.
c
= M3, M4 e M5, frações obtidas por extração aquosa à temperatura de 100°C.
80
A grande maioria das espécies de algas pertencentes à ordem Gigartinales
são conhecidas como produtoras de carragenanas, em particular as algas da
família Solieriaceae que são ricas fontes desses polímeros, como a alga
Kappaphycus alvarezii, da qual é obtida a kappa-carragenana e a alga Eucheuma
denticulatum, que produz majoritariamente iota-carragenana (DOTY, 1988). Como
demonstrado na TABELA 8 todas as frações polissacarídicas brutas apresentaram
rotação óptica positiva (+25° a +61°), sugerindo a presença predominante de
carragenanas, uma vez que rotação óptica positiva é indicativo de unidades
pertencentes a série estereoquímica D.
Utilizando hidrólise redutiva descrita por STEVENSON e FURNEAUX
(1991), essas frações foram analisadas quanto à sua composição
monossacarídica sendo possível quantificar conjuntamente por análise de CG as
unidades de anidrogalactose (3,6-anidrogalactose e 2-O-metil-3,6-
anidrogalactose) além das outras unidades monossacarídicas (TABELA 9). As três
primeiras frações brutas (M1, M2 e M3) foram muito semelhantes quanto à sua
composição monossacarídica. Elas apresentaram galactose (Gal) (46,0–57,0%),
como principal monossacarídeo além de 3,6-anidrogalactose (AG) (24,0–37,0%) e
menores quantidades de 6-O-metilgalactose (6Gal) (3,0–4,0%) e xilose (Xyl) (3,0–
1,0%).
TABELA 9. COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS FRAÇÕES BRUTAS OBTIDAS
DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium.
Fração Composição monossacarídica (mol%)
*
Gal
AG 6Gal Xyl Glc
M1 57,0 26,0 4,0 3,0 10,0
M2 66,0 24,0 3,0 1,0 6,0
M3 46,0 37,0 4,0 1,0 11,0
M4 35,0 9,0 3,0 2,0 51,0
M5 13,0 2,0 - 1,0 84,0
*
Monossocarídeos quantificados em mols%, na forma de acetados de alditóis, por CG-EM
(STEVENSON & FURNEAUX, 1991).
81
Os extratos brutos de M. gelidium, M4 e M5 apresentaram significativo teor
de glucose (TABELA 9). A presença deste monossacarídeo é geralmente
proveniente da contaminação do polissacarídeo de reserva das algas vermelhas
(amido das florídeas) (USOV, 1992).
O espectro de RMN de
13
C da fração M5 demonstrado na Figura 8,
apresentou sinais em 100,1; 71,4; 73,4; 78,0; 71,7 e 60,7 ppm, característicos
desta glucana de reserva das algas vermelhas, o que está de acordo com a sua
composição monossacarídica (TABELA 9). Apesar dos valores mais elevados de
glucose (10,0 e 11,0%) nas frações M1 e M3, comparada à M2, o espectro de
RMN de carbono 13 dessas frações (FIGURA 9) não apresentaram os sinais
correspondentes aos C1 – C6 das unidades de α-D-glucose (1→4)-O-substituídas
(CHIOVITTI et al., 1998a).
FIGURA 8. ESPECTRO DE RMN DE
13
C DA FRAÇÃO M5 DE M. gelidium.
Análise realizada a 50 °C em D
2
O, concentração da amostra 25 mg./mL.
Apesar dos baixos conteúdos de galactose mono-O-metilada, a presença
deste monossacarídeo já foi utilizada como critério quimiotaxonômico para
classificação das algas dentro da família Solieriaceae.
ppm 100 90 80 70 60 50
100,1
78,0
73,4
71,7
71,4
60,7
82
Os primeiros relatos de unidades de galactose monometilada foram
descritos nas algas vermelhas E. spinosum (BELLION et al., 1983) e em algas do
gênero Erythroclonium, (6-O-metilgalactose; 16,0–24,0 mol%). Em três espécies
do gênero Erythroclonium, foram isoladas frações polissacarídicas de
carragenanas com características estruturais complexas: uma alfa/iota-
carragenana híbrida com altos conteúdos de metilação em C-6, menores
proporções de piruvatação e metilação em C-3 (CHIOVITTI et al., 1998b).
O espectro de RMN de
13
C das primeiras três frações obtidas é muito
semelhante. Na Figura 9 estão demonstrados os espectros de RMN de
13
C das
frações brutas M1–M3. Baseado em diversos trabalhos anteriores, (USOV e
SHASHKOV, 1985; FURNEAUX e MILLER, 1986; ESTEVEZ et al., 2000;
ESTEVEZ et al., 2001), foi possível identificar que os deslocamentos específicos
dos carbonos anoméricos correspondem à díade β-D-galactose 4-O-sulfatada
ligada à 3,6-anidro-α-D-galactose 2-O-sulfatada. A espectroscopia de RMN de
13
C,
em conjunto com a análise de rotação óptica e composição monossacarídica,
demonstraram que os extratos M1, M2 e M3 são constituídos principalmente por
iota-carragenana.
83
FIGURA 9. ESPECTROS DE RMN DE
13
C DAS FRAÇÕES BRUTAS M1 (A), M2 (B) E
M3 (C) DE M. gelidium.
ppm 100 90 80 70 60 50
Análises realizadas a 50 °C em D
2
O, concentração das amostras 40, 45 e 30 mg/mL,
respectivamente.
A
B
C
101,7
91,6
102,0
91,9
101,8
91,7
84
As frações brutas (M1–M5) também foram submetidas à análise de FT-IR.
Os espectros obtidos apresentaram bandas de absorção que confirmam os dados
de RMN de
13
C. Os espectros de FT-IR apresentaram bandas em 1260 cm
-1
(S=O
de grupos sulfato) e na região diagnóstico (940–800 cm
-1
) em
931 cm
-1
(C-O-C de
3,6-anidrogalactose), 847 cm
-1
(C-O-S de sulfato axial no C-4 das unidades de β-
D-galactose) e 805 cm
-1
(sulfato em C-2 nas unidades de 3,6-anidrogalactose)
(STANCIOFF e STANLEY, 1969; CRAIGIE e LEIGH, 1978; BELLION et al., 1983)
(FIGURA 10). Essas bandas estão presentes com maior intensidade nas frações
M1, M2 e M3, haja vista que M4 e M5 são constituídas principalmente por glucose.
FIGURA 10. ESPECTROS DE INFRAVERMELHO DAS FRAÇÕES BRUTAS (M1-M5)
EXTRAÍDAS DE ALGA VERMELHA M. gelidium.
2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
comprimento de onda cm
-1
M1 / M2
M3
M4
M5
1260 cm
-
1
931 cm
-
1
847 cm
-
1
805 cm
-
1
85
Para verificar a homogeneidade, as frações M1, M2 e M3 foram analisados
por cromatografia de gel permeação utilizando como detectores o espalhamento
de luz e o índice de refração. A análise de HPSEC-MALLS (FIGURA 11) mostra os
perfis de eluição das frações M1 e M3. A fração M2 apresentou um perfil de
eluição muito semelhante ao da fração M3. Por meio dessa análise foi possível
constatar que nenhuma das frações estava homogênea. Dentre as frações
analisadas M1 apresentou perfil de eluição menos heterogêneo.
FIGURA 11. ANÁLISES DE HOMOGENEIDADE DAS FRAÇÕES M1 (A) e M3 (B) POR
CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAÇÃO (HPSEC-MALLS).
Visando purificar as frações M1 – M3, elas foram submetidas à precipitação
fracionada com KCl. Este processo baseia-se na propriedade apresentada pelas
carragenanas de geleificarem na presença de cátions, como o íon potássio. Esta
geleificação é dependente do teor de unidades 3,6-anidrogalactose e de grupos
0 20 40 60 80
Espalhamento de luz
Índice de refração
Tempo (min)
Espalhamento de luz
Indice de refração
A
B
86
sulfato presentes na molécula (CEREZO, 1967; NOSEDA, 1994; USOV, 1998).
Carragenanas com maiores teores de 3,6-anidrogalactose e menores teores de
grupos sulfato tendem a geleificar em menores concentrações de potássio. Após o
tratamento das frações M1 – M3 foram obtidas as subfrações precipitadas M1a,
M2a, M2b e M3a e as respectivas subfrações solúveis em KCl 2,0M: M1S, M2S e
M3S (FIGURA 12).
FIGURA 12. FLUXOGRAMA (A) FRACIONAMENTO COM KCl; (B)
PURIFICAÇÃO POR CROMOTOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DAS FRAÇÕES
DE M. gelidium.
Frações M1, M2 e M3
Precipitação com KCl (M)
Frações: M1a (1,4 – 1,5 M)
M2a (0,1 – 0,2 M)
M2b (1,0 – 1,2 M)
M3a (0,75
–
1,0 M)
Frações M1S, M2S e M3S
Solúveis em KCl
(A)
Frações: M3S-1; M3S-2; M3S-3; M3S-4; M3S-5; M3S-6
Eluentes: água NaCl 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 2,0 M
(B)
Fração M3S
87
Os extratos brutos M1, M2 e M3 foram solubilizados em água destilada na
concentração 0,25 g% 0,20 g% e 0,25 g%, respectivamente e submetidos a
fracionamento com KCl, com aumento gradual de sal até a concentração de 2,0M.
Esta metodologia foi inicialmente descrita por CEREZO (1967) onde da alga
vermelha Gigartina skottsbergii (ordem Gigartinales), foi possível realizar o
fracionamento de um sistema de galactanas isolando diversas frações
precipitadas em diferentes concentrações de KCl.
Na Tabela 10 estão demonstradas as faixas de fracionamento, teores de
grupos sulfato, proteínas e carboidratos, rendimentos e rotação óptica específica
das subfrações obtidas após este fracionamento.
TABELA 10. FAIXA DE FRACIONAMENTO, RENDIMENTO E ANÁLISES QUÍMICAS
DAS SUBFRAÇÕES DE M1, M2 E M3 OBTIDAS APÓS FRACIONAMENTO COM KCl.
Fração Faixa de
Fracionamento
KCl (M)
Rendimento
(%)
a
Sulfato
NaSO
3
(%)
Carboidrato
(%)
Proteína
(%)
[α]
D
(°)
M1a 1,4–1,5 76,0 24,0 58,0 4,0 +64
M1S 2,0
b
14,0 13,0 46,0 2,0 +22
M2a 0,1–0,2 7,0 nd 64,0 3,0 nd
M2b 1,0–1,2 79,0 25,0 54,0 6,0 +56
M2S 2,0
b
8,0 18,0 47,0 7,0 -38
M3a 0,75–1,0 62,0 29,0 43,0 9,0 +51
M3S 2,0
b
11,0 13,0 70,0 10,0 +47
a
= em relação ao material inicial (M1, M2 e M3).
b
= frações solúveis em KCl 2,0 M.
nd = não determinado.
É possível observar que os extratos brutos M1, M2 e M3 são constituídos
na sua maioria por galactanas geleificantes, uma vez que as frações precipitadas
correspondem a 76,0, 86,0, 62,0% do material inicial, respectivamente. As frações
88
solúveis apresentaram menores conteúdos de grupos sulfato (13,0–18,0%)
quando comparadas com as frações precipitadas. O elevado teor de grupos
sulfato (24,0–29,0%) encontrado nas frações precipitadas está de acordo com
teores relatados (28,0–32,0%) para polissacarídeos do gênero
89
KCl ou podem permanecer solúveis em KCl. De acordo com a definição de SMITH
e COOK (1953) as lambda-carragenanas foram consideradas polissacarídeos que
não apresentavam a propriedade de formar géis, permanecendo solúveis em
solução de KCl.
STORTZ e CEREZO (1988) isolaram da alga Iridaea undulosa uma
fração, precipitada com altas molaridades de KCl, constituída de lambda- (~80%) e
mu/nu-carragenana (~20%) que coprecipitaram com a mesma concentração de
KCl.
Posteriormente em um estudo mais detalhado esta metodologia foi
novamente aplicada por STORZ e CEREZO, (1993) para fracionar o sistema de
carragenanas dos estágios cistocárpicos e tetraspóricos da alga Iridaea undulosa.
Foi demonstrado que o sistema cistocárpico é composto de quantidades similares
das geleificantes kappa/iota-carragenanas, e da solúvel, parcialmente ciclizada
mu/nu-carragenana. O sistema tetraspórico é composto principalmente pela
lambda-carragenana, mas também apresenta pequenas proporções de galactana
sulfatada contendo L-galactose.
Frações contendo L-galactose também foram isoladas de amostras
cistocárpicas da alga Gigartina skottsbergii, após a realização de tratamento
alcalino e posterior fracionamento com KCl de ambas a kappa/iota-carragenana e
a parcilamente ciclizada mu/nu-carragenanas (CIANCIA et al., 1997).
Com relação aos polissacarídeos de M. gelidium, o fracionamento com KCl
foi muito eficiente no que diz respeito à separação de subfrações homogêneas,
confirmando sua eficácia na separação de carragenanas. A homogeneidade das
principais subfrações precipitadas (M1a, M2b e M3a) foi avaliada por HPSEC-
MALLS e observou-se um único pico nos seus cromatogramas, confirmando a
homogeneidade das mesmas. Com base no dn/dc, essas frações apresentaram
massa molar média M1a (425.600 g/mol), M2b (950.800 g/mol) e M3a (956.700
g/mol). Na Figura 13 está demonstrado o cromatograma da subfração M3a.
90
FIGURA 13. ANÁLISE DE HOMOGENEIDADE DA SUBFRAÇÃO M3a HPSEC-MALLS.
As análises de composição monossacarídica (TABELA 11) demonstraram
que as subfrações precipitadas, foram muito semelhantes, com exceção da
subfração M2a. Galactose e 3,6-anidrogalactose foram os monossacarídeos
dominantes, representando 92,0-98,0% do total dos monossacarídeos presentes
nestas frações. Menores teores de 6-O-metilgalactose (5,0–6,0%) e glucose (2,0–
3,0%) estavam presentes não em todas as frações.
Embora o amido das florídeas seja solúvel em água, segundo VAN DE
VELDE et al. (2002), este polímero pode acompanhar as galactanas do tipo
carragenana tanto no processo de extração como nos passos de precipitação. A
subfração M2a é constituída majoritariamente por glucose (47,0%)
correspondendo ao polissacarídeo de reserva das algas vermelhas (amido das
florídeas). Em alguns estudos (FARIA, 2002; ZIBETTI, 2001) este polissacarídeo
também foi precipitado em baixas molaridades de KCl. A análise de RMN de
13
C
desta fração (dado não mostrado) demonstrou a presença dos sinais
característicos da α-D-glucopiranose C1-C6: 100,2; 72,2; 73,9; 78,0; 71,9 e 61,3
ppm (CHIOVITTI et al, 1998).
Em relação as frações solúveis, estas apresentaram composição
monossacarídica distinta das precipitadas (TABELA 11), apresentando
significativamente menores quantidades do derivado 3,6-anidrogalactose (AG)
Espalhamento de luz
Índice de Refração
Tempo (min)
91
(3,0–7,0%) e baixa percentagem (2,0%) de unidades de galactose naturalmente 4-
O-metiladas (frações M1S e M3S). Destaca-se a grande quantidade de glucose
presente na fração M3S, a qual pode ser proveniente do amido das florídeas.
TABELA 11. COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS SUBFRAÇÕES OBTIDAS
APÓS FRACIONAMENTO COM KCl E TRATAMENTO ALCALINO.
Fração Composição monossacarídica (mol%)
*
Gal
AG 4Gal 6Gal Xyl Glc
M1a 51,0 41,0 - 5,0 - 3,0
M1a-T 47,0 45,0 - 4,0 - 3,0
M1S 73,0 7,0 2,0 2,0 5,0 11,0
M2a 28,0 15,0 - 8,0 2,0 47,0
M2b 55,0 37,0 - 6,0 - 2,0
M2S 86,0 3,0 - 2,0 3,0 6,0
M3a 53,0 41,0 - 6,0 - -
M3a-T 50,0 44,0 - 6,0 - -
M3S 45,0 3,0 2,0 - 7,0 43,0
*
Monossocarídeos quantificados em mols%, na forma de acetados de alditóis, por CG-EM
(STEVENSON e FURNEAUX, 1991).
Os espectros de RMN de
13
C das frações M1a, M2b e M3a foram muito
semelhantes e apresentaram os sinais anoméricos em 101,8 e 91,6 ppm
correspondentes as unidades G4S ligadas à DA2S (iota-carragenana) (USOV e
SHASHKOV, 1985). Os espectros dessas frações também apresentaram com
menor intensidade os sinais 104,6 e 97,7 e 95,0 ppm, atribuídos as díades da nu-
carragenana (G4S-D2S,6S) (STORTZ et al., 1994) e kappa-carragenana (G4S-
DA) (USOV e SHASHKOV, 1985). Na Tabela 12 estão descritos os
assinalamentos das principais díades presentes nas frações M1a, M2b e M3a.
92
TABELA 12. ASSINALAMENTOS DAS PRINCIPAIS DÍADES PRESENTES NAS FRAÇÕES M1a, M2b e M3a OBTIDAS ATRAVÉS
FRACIONAMENTO COM KCl DE M. gelidium.
Fração
Carrageenana
3-O-ligadas 4-O-ligadas
Unidade A
Unidade B
C-1
C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6
M1a iota
a
G4S D2S 101,8
69,0 76,7 71,8 74,4 60,9 91,6 74,6 77,5 77,9 76,4 69,0
kappa
a
G4S DA 101,8
69,0 73,5 60,9 95,1 79,1 76,7 69,4
nu
b
G4S D2S,6S 104,6
79,9 74,6 60,9 97,9 67,8 67,6
M2b Iota G4S D2S 101,8
69,0 76,6 71,7 74,5 60,9 91,7 74,5 77,4 77,8 76,7 69,0
Kappa G4S DA 101,8
68,8 78,3 74,3 60,9 95,0 79,2 76,7 69,7
nu G4S D2S,6S 104,6
69,9 74,3 60,9 97,7 67,6 78,2 67,6
M3a Iota G4S D2S 101,8
69,0 76,6 71,7 74,5 60,9 91,7 74,5 77,5 77,8 76,6 69,0
Kappa G4S DA 101,8
68,8 78,3 74,3 60,6 95,3 79,2 76,7 69,7
Nu G4S D2S,6S 104,6
69,9 79,9 74,3 60,9 97,7 75,1 67,6 78,2 67,6
a
De acordo com USOV e SHASHKOV, (1985)
b
De acordo com STORTZ et al. (1994).
93
Os espectros de FT-IR das frações (M1a, M2b e M3a) foram muito similares
entre si e com os das frações brutas que as originou (M1, M2 e M3) (FIGURA 10,
pág. 83). Apresentaram intensa banda de absorção em 1260 cm
-1
indicativa da
presença de éster sulfato, o que está de acordo com o teor destes grupos
determinado fotocolorimetricamente (TABELA 10). Também estão presentes
bandas diagnóstico em 848–847 cm
-1
características de éster sulfato axial
localizados em O-4 das unidades β-D-galactopiranosil, 805 cm
-1
correspondentes a
éster sulfato axial localizados em O-2 das unidades 3,6-anidrogalactopiranosil e a
banda em 931 cm
-1
, devido à presença deste anidroaçúcar (STANCIOFF e
STANLEY, 1969; CRAIGIE e LEIGH, 1978).
Com o objetivo de determinar a percentagem de unidades precursoras
presentes, (α-D-galactose 2,6-sulfato e/ou α-D-galactose 6-sulfato), as frações
M1a e M3a foram submetidas ao tratamento alcalino (CIANCIA et al., 1993)
originando as frações M1a-T e M3a-T, respectivamente. A análise de composição
monossacarídica demonstrou que estes polissacarídeos modificados
apresentaram aumento das unidades 3,6-anidro-α-D-galactose (~ 5% e ~ 3%,
respectivamente) com a concomitante diminuição da quantidade de galactose
(TABELA 11).
Os espectros das frações modificadas M1a-T e M3a-T apresentaram
somente sinais de iota-carragenana com os deslocamentos químicos C1–C6 de
G4S: 101,8, 69,0, 76,7, 71,8, 74,4, 60,9 ppm e C1–C6 de DA2S: 91,6; 74,6; 77,5;
77,9; 76,4; 69,0 ppm (USOV e SHASHKOV, 1985).
Para determinar a percentagem das unidades correspondentes à iota-
kappa- e nu-carragenanas, as frações M1a e M3a foram submetidas à análise de
metilação conforme o método descrito por CIUCANU e KEREK (1984).
Previamente as galactanas foram tratadas com trietilamina (STEVENSON e
FURNEAUX, 1991), com a finalidade de se obter os respectivos polissacarídeos
na forma de sal de trietilamônio, os quais são solúveis no solvente (DMSO)
utilizado no processo de metilação.
94
Os resultados das análises de metilação estão mostrados na Tabela 13. Os
principais derivados metilados obtidos foram 2,6-di-O-metil-galactose e o derivado
3,6-anidrogalactose. Eles indicam que as unidades 3-O-ligadas β-D-
galactopiranosil estão principalmente 4-O-sulfatadas e as unidades 4-O-ligadas
anidrogalactopiranosil estão principalmente 2-O-sulfatadas. Estes resultados estão
de acordo com os dados obtidos de FT-IR e RMN de
13
C, confirmando que as
díades de iota-carragenana são as principais estruturas dissacarídicas repetitivas
presentes nessas frações. A presença do derivado 3-mono-O-metilgalactitol (4 e 3
mol%, respectivamente) demonstrou que estas frações também contém as
unidades precursoras da iota-carragenana (D2S,6S). Estas percentagens estão de
acordo com o aumento das unidades de 3,6-anidrogalactose após tratamento
alcalino (TABELA 11). Este resultado demonstra também que a condição alcalina
utilizada durante o processo de metilação não ocasionou a ciclização das
unidades precursoras.
95
TABELA 13. ANÁLISES DE METILAÇÃO DAS FRAÇÕES M1a E M3a DE M. gelidium.
Derivado metilado
a
Fração (mol%)
Padrão de substituição
c
M1a M3a
3-O-ligados
2,4,6-Gal 2,0 (0,51)
b
2,0 (0,51)
b
2,6-Gal 47,0 (0,60) 46,0 (0,60)
4-O-ligados
2,3,6-Gal 2,0 (0,52) 1,0 (0,52)
3-Gal 4,0 (0,95) 3,0 (0,95)
2-AGal 2,0 (0,47) 2,0 (0,47)
AGal 42,0 (0,61) 42,0 (0,61)
3 e/ou 4-O-ligados
2-Gal 1,0 (0,83) 3,0 (0,83)
6-Gal - 1,0 (0,76)
G e/ou G6M
G4S + G6M,4S
D
D2S,6S
DA
DA2S
G4S,6S e/ou D3S,6S
G2S,4S (6M) e/ou
D2S,3S (6M)
a
= Mol % dos monossacarídeos contendo grupos metil nas posições indicadas.
b
= Retenção relativa à galactose.
c
= Nomenclatura segundo KNUTSEN et al. (1994).
As carragenanas M1a e M3a, contém ainda menores quantidades de 2,4,6-
Gal e 2,3,6-Gal correspondente as unidades 3-O- e 4-O-ligadas não sulfatadas,
respectivamente. Adicionalmente, os derivados 2-Gal e 6-Gal foram detectados
(TABELA 13) e poderiam ser originados da presença de unidades desviantes no
polímero, ou alternativamente poderiam ser provenientes de submetilação.
Resultados semelhantes foram descritos recentemente por VIANA et al. em
2004 para a iota/nu-carragenana isolada da alga vermelha Eucheuma
denticulatum. Além da iota-carragenana e dos seus precursores biológicos, a
96
análise de metilação demonstrou que estas frações contêm pequenas
percentagens (~ 2 mol%) de 2AGal que poderia ser proveniente da presença de
estruturas de kappa-carragenana. Esses resultados demonstram a presença de
unidades desviantes comumente encontradas em carragenanas, uma vez que
estruturas “ideais repetitivas” de carragenanas não existem.
Portanto, o conjunto de análises químicas, cromatográficas e espectroscópicas
demonstraram que as carragenanas precipitadas com KCl da alga vermelha M.
gelidium são constituídas por unidades dissacarídicas repetitivas de iota- (80–
90%), nu- (6–8%) e kappa- (4%).
Com relação às frações que permaneceram solúveis em KCl 2M a fração M3S
foi selecionada para ser estudada neste trabalho. Esta fração foi avaliada quanto a
sua homogeneidade. O cromatograma (FIGURA 14) demonstrou seu caráter
heterogêneo, apresentando-se como uma mistura de componentes com diferentes
massas molares, observado pelo perfil no detector de índice de refração.
FIGURA 14. ANÁLISE DE HOMOGENEIDADE DA SUBFRAÇÃO M3S POR
CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAÇÃO (HPSEC).
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 20 40 60 80
Detector: AUX1
Time (min)
97
indicativo de unidades β-D-galactose 2-O-sulfatadas (G2S) (MILLER et al., 1996).
Este espectro ainda apresenta um sinal largo em 100,0 ppm, referente à
sobreposição de C-1 de α-L-galactose (LAHAYE et al., 1989) e C-1 de unidades α-
D-glucopiranose (4-O-ligadas), correspondente ao amido das florídeas (FALSHAW
et al., 1998), o que está de acordo com a alta percentagem de glucose (43,0
mol%) na composição monossacarídica dessa fração (TABELA 11, pág. 90).
FIGURA 15. ESPECTRO DE RMN DE
13
C DA FRAÇÃO M3S SOLÚVEL EM KCl 2M DE
M. gelidium.
Análise realizada a 70 °C em D
2
O, concentração da amostra 40 mg/mL.
Com a finalidade de fracionar os polissacarídeos presentes na fração M3S
foi utilizada cromatografia de troca-iônica em DEAE-Sephacel. Desse
fracionamento foram obtidas as frações M3S-1, M3S-2, M3S-3, M3S-4, M3S-5 e
M3S-6, as quais foram eluídas com água e soluções de NaCl 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 e
2,0M, respectivamente conforme descrito na Figura 12B (pág. 85).
A Tabela 14 demonstra que este processo de purificação permitiu a
separação de diferentes frações, com rotação óptica específica negativa,
indicativo da presença de agaranas.
103,7
102,6
101,7
100,0
99,1
ppm
100
90
80
70
60
50
98
TABELA 14. RENDIMENTO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES OBTIDAS DA
COLUNA DE TROCA IÔNICA DEAE-SEPHACEL A PARTIR DA FRAÇÃO M3S.
Fração Rendimento
a
(%)
Proteína
(%)
Carboidrato
(%)
Sulfato
NaSO
3
(%)
[α]
D
(°)
M3S-1 6,8 0,4 78,9 nd nd
M3S-2
8,5
5,3 34,5 3,2
-69°
M3S-3
13,7
2,2 69,1 16,5
-42°
M3S-4
12,5
2,4 48,2 20,6
-61°
M3S-5 10,7 0,2 29,7 11,4
-22°
M3S-6
5,6
1,9 10,3 6,1 n.d
a
= rendimento em percentagem relativo a fração M3S submetida a cromatografia de troca iônica.
n.d = não determinado
Observa-se que na fração M3S-1 (eluída com água), grande parte da
contaminação pela glucana de reserva presente na fração original (M3S) (TABELA
11), foi removida. As demais frações são constituídas principalmente por galactose
(58,7 – 88,3 mol%), e em menores proporções estão presentes galactose mono-
O-metilada, xilose, manose, glucose e 3,6-anidrogalactose (TABELA 15).
99
TABELA 15. COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS FRAÇÕES OBTIDAS POR
CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA DEAE-SEPHACEL E DAS FRAÇÕES
DESSULFATADAS M3S-3D E M3S-4D.
Fração Composição monossacarídica (mol%)
*
Gal
AG
4Gal
6Gal
Man
Xil
Glc
M3S-1
2,4
-
-
4,9
2,6
2,2
87,9
M3S-2 63,2 1,7 18,1 - - 9,1 5,4
M3S-3 78,8 - 2,9 - - 16,4 1,9
M3S-3D
a
76,6 - 3,1 - - 18,0 2,3
M3S-4 88,3 1,6 - - - 7,9 2,2
M3S-4D
a
87,4 1,7 - - - 8,2 2,7
M3S-5 83,7 4,3 - 4,3 1,6 5,1 2,4
M3S-6 58,7 13,1 - 4,9 3,0 5,4 4,9
*
Monossocarídeos quantificados em moles%, na forma de acetados de alditóis, por CG-EM
(STEVENSON e FURNEAUX, 1991).
a = Frações dessulfatadas por solvólise (NAGASAWA et al., 1979).
A análise por HPSEC-MALLS das frações de maior rendimento (M3S-3 e
M3S-4) demonstra o caráter homogêneo dessas frações (dado não mostrado) e a
massa molar das frações M3S-3 e M3S-4 foi determinada com base no dn/dc =
0,125 e 0,164, respectivamente, apresentando massa molar média 187.100 g/mol
(M3S-3) e 61.430 g/mol (M3S-4).
Com a finalidade de determinar a estrutura química fina e o posicionamento
dos grupos substituintes no polissacarídeo, a galactana M3S-3 foi submetida à
análise de metilação antes e após dessulfatação solvolítica, conduzidos de acordo
com CIUCANU e KEREK (1984) e NAGASAWA et al. (1979) respectivamente.
A determinação do posicionamento dos grupos sulfato foi realizada por
meio da análise comparativa dos produtos de metilação da galactana nativa e
dessulfatada. Adicionalmente, este processo solvolítico possibilita uma
100
simplificação do espectro de RMN de
13
C, uma vez que os espectros de
galactanas com altos teores de substituintes são geralmente complexos e de difícil
interpretação.
De acordo com a metodologia de solvólise de NAGASAWA et al. (1979),
primeiramente o polissacarídeo é transformado em sal de piridônio, para então ser
solubilizado na mistura reativa (DMSO: metanol: piridina) e aquecida a 100 °C.
A fração M3S-3 (16,5% de Na
2
SO
3
) foi submetida a tratamento solvolítico,
por 4 horas originando a fração modificada M3S-3D. Devido à pequena
quantidade de amostra, o teor de grupos sulfato não foi determinado neste
polissacarídeo modificado, mas o seu espectro de RMN de
13
C (FIGURA 16),
assim como a análise de metilação (TABELA 16) demonstraram que este
processo foi eficiente na remoção dos grupos sulfato.
Uma possível dificuldade encontrada na remoção dos grupos sulfato é que
este processo pode levar a uma hidrólise dos polissacarídeos. Podemos observar
na Tabela 15, que o tratamento solvolítico não modificou significativamente a
composição monossacarídica desta fração, o que é favorecido pela ausência do
anel anidrogalactose, uma vez que as ligações anidrogalactosídicas são mais
lábeis e consequentemente mais vulneráveis à hidrólise.
Os resultados das análises de metilação dos polissacarídeos nativo (M3S-3) e
dessulfatado (M3S-3D) estão apresentados na Tabela 16.
101
TABELA 16. ANÁLISE DE METILAÇÃO DAS FRAÇÕES M3S-3 E M3S-D.
Derivado Metilado
a
Fração (mol %)
Padrão de
Substituição
c
Unidades 3-O-ligadas
M3S-3 M3S-3D
2,4,6-Gal
16,2 (0,51)
b
46,0 (0,51)
b
G
2,4-Gal 3,0 (0,74) - G6S
4,6-Gal 18,8 (0,61) - G2S
4-Gal 6,0 (0,95) - G2S,6S
Unidades 4-O-ligadas
2,3,6-Gal
4,6 (0,52) 24,3 (0,52) L
6-Gal 23,2 (0,70) -
L2S,3S + LGal 3S,2X
2-Gal 1,5 (0,83) - L3S,6S
2,6-Gal 14,6 (0,60) 2,7 (0,60) L3S
3,6-Gal - 14,4 L2X
3-Gal 1,0 (0,95) - L2S,6S
Unidades 3- e/ou 4-O-ligadas
2,3,4-Xil
11,1 (0,37) 12,6 (0,37) X
a
= Mol % dos monossacarídeos contendo grupos metil nas posições indicadas.
b
= Rentenção relativa à galactose.
c
= Nomenclatura segundo KNUTSEN et al., 1994.
A análise dos produtos de metilação da galactana M3S-3 nativa
demonstraram que as unidades A (β-galactose-3-O-substituída) estão
principalmente sulfatadas em C-2 (18,8 mol%) e não sulfatada neste carbono
(16,2 mol%) (TABELA 16). Em menores proporções a unidade A é constituída por
G6S e G2S,6S (9,0 mol %).
102
Após dessulfatação e análise de metilação podemos comprovar que o
derivado 6-O-metilgalactose (23,2 mol%) presente entre os produtos de metilação
da galactana nativa corresponde a unidades de α-L-galactose 2,3-substituída
(L2S,3S e L3S,2X). Unidades mono sulfatadas em C-3 juntamente com as
anteriores perfazem 37,8 mol% das unidades B deste polissacarídeo.
Podemos observar ainda que, após dessulfatação solvolítica a presença de
46,0 mol% de 2,4,6-Gal é condizente com a remoção dos grupos sulfato em C-2
e/ou C-6 das unidades β-galactose. O aparecimento do derivado 3,6-Gal entre os
produtos de metilação do polímero dessulfatado comprova que parte (14,4 mol%)
da galactana é glicosilada em C-2 por unidades simples de xilose. Esta
percentagem está de acordo com a percentagem de 2,3,4-Xil (12,6 mol%)
(TABELA 16).
Os resultados das análises de metilação foram confirmados pelas análises
de RMN de
13
C do polímero nativo e dessulfatado (FIGURA 16).
103
FIGURA 16. ESPECTRO DE RMN DE
13
C (A) FRAÇÃO NATIVA M3S-3 E (B) FRAÇÃO
DESSULFATADA M3S-3D.
100,50
3,3
ppm 100 90 80 70 60
Análise realizada a 50 °C em D
2
O, concentração da amostra 40 e 35 mg./mL, respectivamente.
Podemos observar no espectro da galactana nativa (FIGURA 16A) os sinais
anoméricos na região 103,5 – 103,2 ppm, referente às unidades β-D-galactose
(LAHAYE et al., 1985), em 101,5 ppm unidades β-D-galactose sulfatadas em C-2
(MILLER et al., 1996), em 100,4 ppm α-L-galactose 3-sulfato (CONTRERAS et al.,
1988; ESTEVEZ et al., 2001; DUARTE et al., 2002) e 98,9 ppm está unidade (α-L-
galactose) substituída no C-2 (USOV et al., 1997). É possível observar também a
presença do sinal em 66,8 ppm (correspondente a C-6 sulfatado) e os sinais
referentes aos C-6 livres de β-D-galactose (61,3 ppm) e α-L-galactose (60,5 ppm)
(DUARTE et al., 2002).
103,5
103,2
101,5
100,4
98,9
108,7
103,3
100,5
99,6
65,1
65,1
61,3
60,5
60,6
61,0
A
B
108,7
66,8
104
O espectro de RMN de
13
C da galactana dessulfatada (M3S-3D) (FIGURA
16B) apresentou os sinais anoméricos em 103,3 ppm referente às unidades β-D-
galactose (USOV et al., 1980; LAHAYE et al., 1985). Na região 100,5 – 100,4 ppm
estão os sinais referentes ao C-1 de α-L-galactose (USOV et al., 1980; DUARTE
et al., 2002) e também ao C-1 de xilose substituindo o C-2 dessas unidades.
Nesse espectro ainda foi possível observar o sinal em 99,6 ppm correspondente
às unidades α-L-galactose 2-O-substituídas (USOV et al., 1997). É importante
destacar o desaparecimento do sinal referente ao C-6 substituído (66,8 ppm) no
polímero dessulfatado. Esses assinalamentos estão de acordo com os dados
obtidos nas análises de metilação.
A ausência de sinais correspondentes a unidades de 3,6-anidro-α-L-
galactose, na região 98,3 – 97,8 ppm (LAHAYE et al., 1989) está de acordo com a
composição monossacarídica desta fração (TABELA 15). Galactanas com baixa
percentagem deste derivado foram isoladas da alga Georgiella confluens
(KOLENDER e MATULEWICZ, 2002) e de espécies de Sarcodia (LAHAYE et
al.,1989).
Trabalhos recentes relataram a presença de unidades B 3-O-sulfatadas
como nos polímeros da alga Bostrychia montagnei (DUARTE et al., 2002), nas
galactanas de Sarcodia montagneana e S. flabellata (MILLER 2003), nos
polissacarídeos isolados de Pterocladiella capillacea (ERREA e MATULEWICZ,
2003) e nos polímeros isolados de Georgiella confluens (KOLENDER e
MATULEWICZ, 2002). A galactana (M3S-3) de Meristiella gelidium apresentou
semelhança estrutural com o polissacarídeo da alga Champia nova-zealandiae
(MILLER et al., 1996) no que diz respeito à presença da díade G2S – L2S,3S.
Unidades simples de xilose foram detectadas substituindo o C-6 das
unidades β-D-galactose por FURNEAUX et al. (1990), USOV et al. (1997), MILLER
e BLUNT (2000) e ERREA e MATULEWICZ (2003), substituindo o C-3 das
unidades α-L-galactose no polissacarídeo isolado da alga Chondria macrocarpa
(FURNEAUX e STEVENSON, 1990) e na galactana de Laurencia nipponica
105
(USOV e ELASHVILI, 1991). Substituição por xilose no C-4 foi detectada na
galactana da alga Georgiella confluens (KOLENDER e MATULEWICZ, 2002).
Além desses sinais principais, na fração M3S-3 ainda está presente o sinal
em 108,7 ppm que pode corresponder a unidades β-galactose furanosídica. O
espectro de RMN de
13
C da fração polissacarídica obtida de Kappaphycus
alvarezii (ESTEVEZ et al., 2004) apresentou um sinal em 109,6 ppm, que poderia
ser correspondente a presença de uma única unidade de β-D-galactofuranose. A
presença deste tipo de unidade na fração M3S-3 de M. gelidium não pôde ser
confirmada, pois o espectro de massa dessa fração metilada, hidrolisada e
acetilada, não apresentou fragmentação correspondente a 2,3,5,6-tetra-O-metil-
galactitol. Fato similar foi observado para a fração polissacarídica de K. alvarezii,
possivelmente a presença de β-galactose furanosídica é decorrente de
contaminação fúngica nessas algas.
A segunda fração de maior rendimento (M3S-4) também foi submetida a
análise de metilação para caracterização da sua estrutura fina. Ambas as frações
(M3S-3 e M3S-4) foram semelhantes quanto a sua composição monossacarídica
e com base na análise de metilação da fração M3S-4 (TABELA 17) podemos
observar algumas semelhanças estruturais no que diz respeito a substituição por
grupos sulfato.
106
TABELA 17. ANÁLISE DE METILAÇÃO DA FRAÇÃO M3S-4.
Derivado Metilado
a
Mol%
b
Padrão de Substituição
c
Unidades 3-O-ligadas
2,4,6-Gal
12,3 (0,51)
G
2,4-Gal 2,4 (0,74) G6X
4,6-Gal 28,2 (0,61) G2S
4-Gal 3,6 (0,95) G2S,6X
Unidades 4-O-ligadas
2,3,6-Gal
5,3 (0,52) L
2,6-Gal 37,2 (0,60) L3S
Unidades 3- e/ou 4-O-ligadas
2-Gal
1,6 (0,83) G4S,6S/ L3S,6S
2,3,4-Xyl
9,4 (0,37) X
a
= Mol % dos monossacarídeos contendo grupos metil nas posições indicadas.
b
= Retenção relativa à galactose.
c
= Nomenclatura segundo KNUTSEN et al. (1994).
Os resultados da análise de metilação demonstraram que
aproximadamente 60,0% das unidades A desta galactana estão 2-O-sulfatadas e
26,0% não substituídas. As unidades B estão aproximadamente 87,0% 3-O-
sulfatadas e unidades simples de xilose glicosilam o C-6 das unidades β-D-
galactose.
A fração M3S-4 foi submetida à dessulfatação solvolítica e posteriormente
metilada pelo método de CIUCANU e KEREK (1984) para confirmar o
posicionamento dos grupos sulfato. Apesar do processo de dessulfatação ter sido
efetivo na remoção dos grupos sulfato, observado pela comparação dos espectros
107
de RMN de
13
C, FIGURA 17, devido a pequena quantidade de material não foi
possível analisar os derivados metilados desta fração modificada.
FIGURA 17. ESPECTROS DE RMN DE
13
C (A) FRAÇÃO NATIVA M3S-4 E (B) FRAÇÃO
DESSULFATADA M3S-4D E ANÁLISE DE DEPT.
Análises realizadas a 50 °C em D
2
O, concentração das amostras 50 mg./mL.
Os deslocamentos químicos observados nas frações antes e após o
processo solvolítico (FIGURA 17), confirmam os resultados obtidos na análise de
metilação do polímero nativo. O espectro de RMN de
13
C da fração nativa
apresenta os sinais anoméricos na região de 103,4 – 103,1 ppm de β-D-
ppm
100 90 80 70
60 50
103,1
101,5
60,4
103,4
103,2
100,5
101,6
99,5
65,1
60,9
60,6
60,9
65,1
60,6
A
B
108
galactopiranose (LAHAYE et al., 1985) e de β-D-xilose glicosilando o C-6 dessas
unidades (ERREA e MATULEWICZ, 2003), em 101,5 ppm o sinal referente as
unidades β-D-galactopiranose 2-O-sulfatadas (MILLER et al., 1996) e em 100,5
ppm referente as unidades α-L-galactose 3-O-sulfatada (CONTRERAS et al.,
1988; DUARTE et al., 2002; ESTEVEZ et al., 2001).
Na região de 81,2 – 76,2 ppm estão os sinais de C-2 de β-D-galactose 2-
sulfato e C-3 de α-L-galactose 3-sulfato, que desaparecem após o processo
solvolítico. O sinal em 68,8 ppm presente no espectro da fração M3S-4D
corresponde ao C-2 de unidades de α-L-galactose, condizente com o efeito β
(1,9 ppm) da sulfatação em C-3, como observado no polímero original M3S-4 (C-2
em 66,9 ppm) (CONTRERAS et al., 1988; MILLER e BLUNT, 2000).
O espectro da fração dessulfatada (FIGURA 17B) demonstra claramente
que este processo solvolítico foi eficiente na remoção dos grupos sulfato, pois
podemos observar os sinais majoritários correspondentes as unidades β-D-
galactose ligada à α-L-galactose, assim como os sinais de xilose glicosilando o
C-6 das unidades A (TABELA 18). Sinal de baixa intensidade como em 101,6 ppm
podem corresponder a poucas unidades β-D-galactose ainda 2-O-sulfatadas.
A presença de CH
2
não substituído foi confirmada pela análise de DEPT
135, observada pela inversão dos sinais 60,9 e 60,6 ppm, C-6 de β-D-galactose e
α-L-galactose, respectivamente, assim como do sinal 65,1 ppm (C-5 da xilose).
109
TABELA 18. ASSINALAMENTOS QUÍMICOS DE RMN DE
13
C OBSERVADOS NA FRAÇÃO
M3S-4D de M. gelidium.
Unidade
Assinalamentos (ppm)
C-1
C-2
C-3
C-4
C-5
C-6
103,2
69,3
80,4
68,3
75,1
60,9
100,5 68,8 70,5 78,7 71,7 60,6
3)-β-D-Galp-(1
4)- α-L-Galp-(1
β-D-Xilp-(1
103,4 73,0 75,6 69,3 65,1
Estas análises demonstram a semelhança estrutural das duas principais
galactanas solúveis em KCl 2M sintetizadas pela alga M. gelidium . Em ambas, as
unidades A são estão principalmente 2-O-sulfatadas e não substituída e as
unidades B (α-L-galactose) estão 3-O-sulfatadas (FIGURA 18).
As unidades B da galactana M3S-3, adicionalmente possuem substituição
no C-2 por sulfato ou xilose. O posicionamento da xilose também é distinto em
cada galactana, glicosilando o C-6 das unidades de β-galactose na galactana
M3S-4 e o C-2 das unidades α-L-galactose na galactana M3S-3 (FIGURA 18).
Xilose é um substituinte frequente em galactanas de alga marinhas. Em
Chondria macrocarpa e Laurencia nipponica as unidades de xilose glicosilam o
C-3 das unidades de L-galactose-6-sulfato (FURNEAUX e STEVENSON, 1990) e
USOV e ELASHIVILI (1991), respectivamente. Em Laingia pacifica parte das
unidades de 3,6-anidro-α-L-galactose e de β-D-galactose estão substituídas por
xilose em C-2 e em C-6, respectivamente, (KOCHETKOV et al., 1973). Em
Laurencia undulata foi isolado um dissacarídeo constituído por β-D-galactose e 2-
O-metil 3,6-anidrogalactose onde C-4 (da unidade A) apresentava xilose (HIRASE
110
et al., 1982). As galactanas de B. montagnei também apresentaram unidades de
β-D-xilopiranose (C-1–C-5 em 103,9 ppm, 72,8 ppm, 75,7 ppm, 69,4 ppm e 65,2
ppm) glicosilando o C-6 de algumas unidades de β-D-galactopiranose (DUARTE et
al., 2002).
Embora a presença de xilose tenha sido relatada em diversas galactanas
de algas, são poucas as que tiveram o posicionamento desta unidade
definitivamente determinado e até o momento não há relatos na literatura de xilose
substituindo o C-2 das unidades α-L-galactose, como foi observado na galactana
de M. gelidium.
É importante destacar também que unidades α-L-galactose 3-O-sulfatadas
já foram relatadas (ESTEVEZ et al., 2001; DUARTE et al., 2002; ERREA e
MATULEWICZ 2002, 2003; MILLER 2003). Ressalta-se que a díade G2S − L3S
presente nas agaranas de M. gelidium não haviam sido descritas em nenhum
polissacarídeo estudado até o momento.
111
FIGURA 18. PRINCIPAIS UNIDADES MONOSSACARÍDICAS PRESENTES NAS
AGARANAS M3S-3 E M3S-4.
O
O
OH
O
-
O
-
OH
SO
3
β-D-galactopiranose-2-sulfato
O
O
-
OH
O
O
-
OH
SO
3
α-L-galactopiranose-3-sulfato
O
O
-
O
O
O
-
OH
SO
3
O
OH
OH
OH
α-L-galactopiranose-2-xilose 3-sulfato
O
OH
OH
O
-
O
-
O
O
O
OH
OH
H
β-D-galactopiranose-6-xilose
O
O
-
O
O
O
-
OH
SO
3
SO
3
α-L-galactopiranose-2,3-sulfato
112
4.1.2. ANÁLISES REOLÓGICAS DAS GALACTANAS DE Meristiella gelidium
No que diz respeito à composição em carragenanas os resultados obtidos
demonstraram que a alga vermelha Meristiella gelidium é uma rica fonte de iota-
carragenana (FIGURA 19). Esta carragenana geleificante é amplamente utilizada
principalmente na indústria alimentícia, devido as suas particulares propriedades
reológicas. Como a alga M. gelidium é uma fonte desse polímero de grande
interesse industrial e elevado custo, as características reológicas das
carragenanas de M. gelidium foram avaliadas.
FIGURA 19. ESTRUTURA REPETITIVA DA IOTA-CARRAGENANA.
Para selecionar qual fração obtida seria utilizada nas análises reológicas,
inicialmente foi determinado o comportamento viscoelástico linear para a amostra
contendo iota-carragenana, denominada ι-CAR nesta parte do trabalho, que está
presente no extrato bruto M1 e na fração M3a precipitada com KCl.
Vários estudos são encontrados na literatura, acerca do efeito de alguns
cátions sobre a capacidade geleificante das carragenanas (NILSSON et al., 1989;
PICULLEL et al., 1992; MEUNIER et al., 1999; MICHEL et al., 1997;
HERMANSSON et al., 1991). Como a presença de íons afeta a transição
conformacional e a geleificação das carragenanas, inicialmente foi avaliada por
espectroscopia de absorção atômica a razão molar dos íons naturalmente
presentes nessas frações. A análise de cátions demonstrou que a ι-CAR presente
em ambas às frações contêm íons potássio (K
+
, 57,0 mol%) além de Na
+
(30,0
Eucheuma denticulatum
O
OH
O
O
O
OH
O
O
O
O
O
OH
O
O
OH
O
O
O
O
S
O
O
O
-
S
O
O
O
-
S
O
O
O
-
S
O
O
O
-
Eucheuma denticulatum
O
OH
O
O
O
OH
O
O
O
O
O
OH
O
O
OH
O
O
O
O
S
O
O
O
-
S
O
O
O
-
S
O
O
O
-
S
O
O
O
-
n
113
mol%), Ca
2+
(6,2 mol%) e Mg
2+
(6,8 mol%). A principal forma iônica encontrada
(K
+
) também foi detectada em amostras de iota-carragenana obtidas de
Eucheuma denticulatum, em kappa-carragenana de Kappaphycus. alvarezii, e em
114
Com o comportamento acima o valor de tensão escolhido para os testes de
varredura de freqüência nas análises da galactana foi de 0,5 Pa, onde a
deformação nessa tensão foi inferior a 10% para ambas as amostras. Nessas
condições, as carragenanas apresentaram comportamento viscoelástico linear, ou
seja, a tensão ou a deformação aplicadas não alteram a estrutura física do
sistema em estudo.
Em condições geleificantes (concentração da amostra e presença de sal)
pôde-se determinar a força do sistema gelatinizado, avaliando o módulo de perda
ou viscoso (G’’) e o módulo de armazenamento ou dinâmico (G’). O perfil reológico
das duas frações foi praticamente o mesmo, o módulo dinâmico (G’) foi superior
ao viscoso (G’’) em toda a faixa de frequência analisada, e ambos foram
independentes da variação de frequência, indicando, portanto, um caráter de gel
rígido para as duas amostras (FIGURA 21).
FIGURA 21. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA (A) FRAÇÃO M1 (10g/L) EM PRESENÇA DE KCl 120 mM; (B)
FRAÇÃO M3a (10g/L) EM PRESENÇA DE KCl 120 mM. SENSOR C60/2°
°°
°C,
DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25°
°°
°C.
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
10000
100000
G' (Pa)
G" (Pa)
n* (mPas)
G
'
[Pa], G
''
[Pa]
n
*
[mPas]
Frequência (Hz)
A B
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
10000
100000
G' (Pa)
G" (Pa)
n* (mPas)
G
'
[Pa], G
''
[Pa]
n
*
[mPas]
Frequência (Hz)
115
Posteriormente, foi avaliado o efeito da temperatura sobre o comportamento
viscoelástico dos géis das carragenanas solubilizadas em 120mM de KCl. O
reograma demonstrou que o gel sofre fusão, pois há inversão dos módulos em
temperaturas acima de 40°C; todavia após o resfriamento ele recupera o caráter
de sólido (FIGURA 22). A transição fita-hélice para kappa- e iota-carragenana
ocorre em distintas temperaturas, ~25°C para kappa- e 57°C para iota-
carragenana (VAN DE VELDE et al., 2005). A temperatura de transição observada
para a iota-carragenana de M. gelidium está de acordo com dados de literatura
observados para géis de iota-carragenana (STEPHEN, 1995). Outra observação
importante é a ausência de histerese na fração M1, uma vez que, após o
aquecimento, os módulos retornam praticamente sobre os mesmos valores e a
fração M3a apresenta uma leve histerese. Isso demonstra que na transição fita
para hélice da ι-CAR não ocorre agregação das hélices formadas, uma
característica particular dos géis de iota-carragenana (PICULLEL et al., 1987).
Recentemente VAN DE VELDE et al. (2005) demonstraram que a força do
gel, expressa em termos do módulo elástico (G’), de carragenanas híbridas
kappa/iota- diminui com a diminuição do conteúdo de kappa-carragenana. Por
outro lado, a temperatura de geleificação de carragenanas kappa/iota-híbridas é
independente da proporção de kappa-carragenana.
116
FIGURA 22. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA (→
→→
→ AQUECIMENTO DE 5 - 85 °
°°
°C E RESFRIAMENTO DE 85 - 5 °
°°
°C).
(A) FRAÇÃO M1 (10 g/L) EM PRESENÇA DE KCl 120 mM; (B) FRAÇÃO M3a (10 g/L)
EM PRESENÇA DE KCl 120mM. SENSOR C-60/2°
°°
°, EM FREQUÊNCIA DE 1 Hz E
DEFORMAÇÃO DE 1%.
0 20 40 60 80 100
0,01
0,1
1
10
100
G' (Pa)
G'' (Pa)
G
'
[Pa], G
''
[Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
1000
G
'
(Pa)
G
''
(Pa)
G
'
[Pa], G
''
[Pa]
Temperatura (
o
C)
PICULELL et al., (1997) demonstraram que segmentos de iota-carragenana
na presença do contra íon potássio, apresentaram somente uma transição
conformacional (fita para hélice) sem nenhuma histerese térmica, como foi
observado para ι-CAR de M. gelidium (FIGURA 22) e que a adição de kappa-
carragenana ao sistema acrescentou uma segunda transição conformacional que
apresentou histerese. A transição no resfriamento geralmente reflete o equilíbrio
entre as fitas e as hélices presentes na solução, enquanto que a transição no
aquecimento reflete maior estabilidade das hélices associadas (PICULELL, 1995).
Com base nessas observações as análises reológicas podem determinar a
pureza de amostras de kappa- e iota-carragenana, onde a presença de dois
passos de transição em modelos de iota-carragenanana ocorre devido a presença
de kappa-carragenana nessas amostras (PARKER et al., 1993). É importante
lembrar que modelos ideais de kappa- e iota-carragenana não existem, mas sim
híbridos dessas estruturas com maior ou menor percentagem de uma delas, então
A B
117
a observação de uma nova etapa de transição conformacional depende da
concentração de kappa-carragenana na amostra.
A ausência de histerese é particular dos géis de iota-carragenana,
comportamento diferente é observado nos géis de kappa-carragenana onde a
geleificação termoreversível envolve a mudança conformacional fita para hélice,
seguida de agregação das hélices formadas, o que leva a histerese térmica
(REES et al., 1982).
Visto que as duas frações de M. gelidium apresentaram perfis reológicos
muito semelhantes, o que está de acordo com a similaridade composicional
dessas frações, constituídas majoritariamente por iota-carragenana, a fração M1
foi selecionada para dar continuidade às análises reológicas.
4.1.3. ANÁLISES REOLÓGICAS DOS AMIDOS E DAS MISTURAS COM
ι
ιι
ι-CAR.
Uma vez que os amidos estão entre os principais polímeros utilizados na
indústria alimentícia, devido não somente às suas propriedades reológicas como
também ao baixo custo, e que ambos, amidos e carragenanas são hidrosolúveis,
foi então analisado o comportamento reológico das misturas de ι-CAR com quatro
diferentes tipos de amido (CS = amido de milho comum; MS = amido de milho com
altos teores de amilose; WS = amido de milho com altos teores de amilopectina e
YS = amido de Cará). Foram analisadas as características reológicas dos
polímeros frente às variações no modo de preparo do material e a presença de sal
no sistema.
Inicialmente, o material foi preparado como descrito abaixo para avaliar as
diferenças no comportamento reológico dos amidos (25 g/L) e das misturas ι-CAR
(5 g/L) − Amidos (20 g/L), determinando assim com que amido a ι-CAR poderia
apresentar melhor interação e melhores características reológicas.
118
(i) Preparo dos amidos: os amidos foram solubilizados a 25°C durante
90 min, posteriormente foram autoclavados durante 30 minutos e mantidos sob
refrigeração por aproximadamente por 18 h.
(i) Preparo das misturas: os amidos foram solubilizados a 25°C durante
meia hora, a ι-CAR foi adicionada, e o sistema ficou sob agitação mecânica
durante 1h. Posteriormente as misturas foram autoclavadas durante 30 minutos,
mantidas sob refrigeração aproximadamente por 18 h.
As análises químicas dos amidos demonstraram diferentes graus de
amilose, variando de 27,6 – 66,0% (TABELA 19). Essas diferenças são
significativas, uma vez que a avaliação da real capacidade dos modelos de
amidos interagirem com a carragenana está baseada na proporção de amilose /
amilopectina dos mesmos, o que influencia na capacidade de solubilização das
amostras.
TABELA 19. COMPOSIÇÃO QUÍMICA (g%) DAS AMOSTRAS DE AMIDO.
Amostra
Carboidrato
Proteína
Umidade
Cinzas
Amilose
MS
a
91,5 0,19 8,5 0,045 66,0
WS
a
89,0 0,26 9,0 0,04 0
YS
b
88,0 0,1 12,9 0,09 36,0
CS
a
88,0 0,2 10,7 tr 27,5
a
Descrito por FREITAS, et al. (2003).
b
Descrito por FREITAS, et al. (2004).
Primeiramente foi determinado o comportamento viscoelástico linear para
as amostras de amido na concentração 25 g/L (FIGURA 23). As determinações
foram realizadas nos extremos de varredura de freqüência (0,01 e 10 Hz).
119
FIGURA 23. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE COMPORTAMENTO
VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE MILHO COMUM (CS) (25 g/L). (A)
FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
G ' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
FIGURA 24. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE COMPORTAMENTO
VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE MILHO COM ALTOS TEORES DE
AMILOSE (MS) (25 g/L). (A) FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz,
TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
A B
A B
120
FIGURA 25. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE COMPORTAMENTO
VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE MILHO COM ALTOS TEORES DE
AMILOPECTINA (WS) (25 g/L). (A) FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE
10 Hz, TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C.
0,1 1
0,1
1
10
100
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
0,1 1
0,01
0,1
1
10
100
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
FIGURA 26. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE COMPORTAMENTO
VISCOELÁSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE CARÁ (YS) (25 g/L). (A) FREQUÊNCIA
DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 °
°°
°C.
0,1 1
0,01
0,1
1
10
100
1000
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
Foi determinada também a região viscoelástica linear para as misturas
amidos (20 g/L) − ι-CAR (5 g/L), cujo comportamento viscoelástico linear foi muito
semelhante para os todos os sistemas. Na FIGURA 27 está demonstrado o
comportamento da mistura amido de Cará (20 g/L) − ι-CAR (5 g/L).
A B
A B
121
FIGURA 27. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA REGIÃO DE COMPORTAMENTO
VISCOELÁSTICO LINEAR PARA A MISTURA AMIDO DE CARÁ (20 g/L) −
−−
− ι
ιι
ι-CAR (5
g/L). (A) FREQUÊNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUÊNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE
25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G' (Pa)
Deformação (%)
Tensão (Pa)
G' (Pa)
Deformação (%)
Com os resultados acima foi definido o valor de tensão escolhida para os
testes de varredura de freqüência, que foi de 0,1 Pa, tanto para as amostras de
amido quanto para as misturas com o hidrocolóide, onde a deformação nessa
tensão foi inferior a 10%, ou seja, a tensão ou a deformação aplicada não altera a
estrutura física do sistema em estudo.
Na Figura 28 está demonstrado a variação dos módulos G’ e G’’ em função
da freqüência para o amido de milho comum (CS) (25 g/L) e para a mistura ι-CAR
(5 g/L) − CS (20 g/L). O espectro mecânico de CS demonstrou que o módulo de
armazenamento (G’) foi aproximadamente três vezes superior ao módulo de perda
(G’’), em toda a faixa de freqüência analisada, entretanto os módulos
demonstraram dependência da freqüência acima de 1 Hz (FIGURA 28A). A
presença de ι-CAR (5 g/L) na mistura alterou a estrutura de gel formada pelo
amido sozinho, uma vez que originou uma solução viscoelástica, demonstrada
pelo cruzamento dos módulos (G’ e G’’) acima de 0,2 Hz (FIGURA 28B).
A B
122
FIGURA 28. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G’’) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA (A) CS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L)-CS (20 g/L),
SENSOR , pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
G'
G''
G'[Pa], G'' [Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G'
G''
G' [Pa], G''[Pa]
Frequência (Hz)
Comportamento semelhante foi observado para o amido de milho com altos
teores de amilose (MS) sozinho, e para a mistura desse amido com ι-CAR. A
diferença entre os módulos na pasta formada por MS (25 g/L) caracteriza o
sistema como um gel fraco, e após a adição da carragenana as propriedades
físicas foram modificadas, originando uma solução viscoelástica (FIGURA 29B).
FIGURA 29. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G’’) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA (A) MS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L)-MS (20 g/L),
SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G'
G"
G'[Pa], G''[Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G
'
[Pa],G
''
[Pa]
Frequência (Hz)
A B
G'
G''
A B
123
O próximo amido analisado foi o de amido de milho com altos teores de
amilopectina (WS) e o sistema binário (amido e carragenana). Para o WS (25g/L)
e para a mistura ι-CAR (5 g/L) – WS (20 g/L), ambos os módulos foram
dependentes da freqüência. Nesse caso a presença da iota-carragenanan não
alterou o sistema com o WS sozinho, uma vez que o mesmo já apresentava
comportamento típico de solução viscoelástica (FIGURA 30).
FIGURA 30. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA (A) WS (25g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L)-WS (20 g/L),
SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G'
G''
G'[Pa], G'' [Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G'
G''
G' [Pa], G''[Pa]
Frequência (Hz)
Nas misturas CS ou MS a presença de ι-CAR (5 g/L) alterou a
viscoelasticidade quando comparada com os amidos sozinhos, e com WS a
mistura originou uma solução com maior caráter viscoelástico. Em todos os
reogramas das misturas, os módulos foram dependentes da freqüência e o
cruzamento do módulo de armazenamento G’ ocorreu em freqüências superiores
a 0,2 Hz.
Quando foi avaliado o amido de Cará (YS) sozinho e na presença de ι-
CAR, os reogramas do YS (25 g/L) e da mistura ι-CAR (5 g/L) – YS (20 g/L)
demonstraram comportamento diferente em relação aos outros amidos
analisados. O espectro mecânico do YS sozinho demonstrou típico
A B
124
comportamento de gel, com G’ superior ao G’’ e o módulo elástico com menor
dependência da freqüência (FIGURA 31A). Comportamento praticamente idêntico,
apesar do valor maior dos módulos, foi observado com a mistura ι-CAR – YS.
FIGURA 31. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L)-YS (20 g/L),
SENSOR C60/2
o
Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G
´
G
´´
G
´
[Pa], G
´´
[Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
G
'
G
''
G
'
[Pa], G
''
[Pa]
Frequência (Hz)
Para se determinar a força de um sistema gelatinizado, deve-se avaliar não
apenas módulo de armazenamento ou dinâmico (G’), mas a relação apresentada
entre o módulo de perda ou viscoso (G’’) e o módulo de armazenamento ou
dinâmico (G’), obtendo-se assim o Tan δ. Quanto menor for o valor dessa
tangente, menor será o valor de G’’ e maior o de G’, indicando assim uma
estrutura mais rígida ou um gel mais forte. Na Figura 32 pôde-se observar
claramente que os valores de Tan δ foram maiores para o YS sozinho (0,21 em 1
Hz), caracterizando esta pasta como um gel forte. Na mistura o valor de Tan δ foi
menor comparado com o amido sozinho, o que caracteriza o gel formado pela
mistura mais forte que o gel formado pelo amido sozinho, resultado proveniente da
presença de ι-CAR no sistema.
A B
125
FIGURA 32. GRÁFICO DE Tan δ
δδ
δ EM FUNÇÃO DA FREQUENCIA PARA (A) YS
(25 g/L) e (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) – YS (20 g/L).
0,1 1 10
0,01
0,1
1
Tan δ
A
B
Frequência (Hz)
Esses resultados demonstraram que a ι-CAR não apresentou o mesmo
grau de interação com os diferentes amidos. A presença do ficocolóide
enfraqueceu a rede formada com CS, MS e WS, mas com YS na mesma
concentração, a presença de ι-CAR proporcionou aumento da rigidez do gel.
Enquanto as descrições sobre a geleificação de amilose têm sido relatadas
na literatura (CLARK et al., 1989; DOUBLIER e CHOPLIN, 1989; DOUBLIER et
al., 1990) existem poucos estudos que discutem as propriedades reológicas de
misturas amidos-hidrocolóides, e principalmente, no caso das carragenanas a
grande maioria dos trabalhos foram realizados com a kappa-carragenana
(TECANTE e DOUBLIER, 2002; TESTER e SOMMERVILLE, 2003; VERBEKEN et
al., 2004; SHI e BeMILLER, 2002; LAI et al., 1999; TYE, 1988).
Em relação a geleificação das carragenanas esta ocorre em função da
formação da hélice, embora nem sempre esse processo leve a geleificação
(PICULELL et al., 1997). Considerando que as condições de geleificação de
ambas (kappa- e iota-carragenanas) estão diretamente relacionadas com as
condições necessárias para que ocorra a transição conformacional de fita para
hélice e, uma vez que essa transição ocorre em função da temperatura (REES et
126
al., 1982) ou pela adição de sal (ROCHAS e RINAUDO, 1984), posteriormente foi
avaliado o efeito da temperatura no comportamento reológico dessas misturas,
pois essas variações podem melhorar a interação entre os polímeros.
O comportamento do amido de milho com altos teores de amilose (MS 25
g/L) demonstrou que o gel formado não fundiu na faixa de temperatura analisada
(5 − 85°C), porém no resfriamento, em temperaturas inferiores a 50°C, houve uma
diminuição proporcional de ambos os módulos (G´ e G´´), o que demonstra que
essa pasta de amido sozinho apresenta histerese térmica (FIGURA 33A). No
entanto, a substituição de 20% de MS pela ι-CAR possibilitou a melhora de
algumas características, demonstrado pela ausência de histerese (FIGURA 33B).
FIGURA 33. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA (A) MS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) – MS
(20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUÊNCIA DE 1 Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→
AQUECIMENTO DE 5-85 °
°°
°C E RESFRIAMENTO DE 85-5 °
°°
°C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G'
G''
G'[Pa], G''[Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G
'
[Pa],G
''
[Pa]
Temperatura (
o
C)
Foi possível observar que a variação de temperatura influenciou no
comportamento reológico dos biopolímeros, uma vez que efeito sinérgico mais
intenso ocorreu na faixa de temperatura entre 45
127
o que confere maior resistência da mistura à variação térmica. Esses resultados
demonstraram que a pasta de amido sozinho é altamente susceptível à variação
de temperatura e na presença da ι-CAR, houve uma pronunciada interação, o que
resultou em uma melhora na estabilidade do gel quando comparado com o gel de
MS sozinho.
Comportamento muito semelhante foi observado com o amido de milho
comum sozinho (CS) assim como para a mistura (ι-CAR − CS) (FIGURA 34) com
a diferença que a pasta de CS não apresentou histerese. Neste contexto a
presença de ι-CAR não alterou essa característica, porém géis mais macios foram
obtidos entre 45 − 85°C (FIGURA 34B).
FIGURA 34. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA (A) CS (25 g/L) E (B) ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) – CS (20 g/L). SENSOR
pp35/Ti, FREQUÊNCIA DE 1 Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→ AQUECIMENTO DE 5-
85 °
°°
°C E RESFRIAMENTO DE 85-5 °
°°
°C).
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G' [Pa]
G" [Pa]
G' [Pa], G'' [Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G'(Pa)
G'' (Pa)
G'(Pa), G'' (Pa)
Temperatura (
o
C)
Quando foi avaliado o efeito da temperatura na pasta formada pelo amido
de milho com altos teores de amilopectina sozinho (WS) a pasta não fundiu em
toda a faixa de temperatura analisada (5 − 85°C) e não apresentou histerese
A B
128
(FIGURA 35). O reograma da pasta formada pela mistura ι-CAR (5 g/L) − WS (20
g/L) apresentou comportamento diferente do observado na interação entre WS e
xiloglucana (FREITAS et al., 2003), pois com a ι-CAR houve aumento dos
módulos no resfriamento (FIGURA 35B). Adicionalmente, a presença de ι-CAR (5
g/L) não modificou a estabilidade térmica da mistura, ausência de fusão, e maior
diferença entre os módulos foi observada em temperaturas superiores a 50°C.
Aparentemente, nesse caso, o aquecimento no reômetro foi necessário e
importante, proporcionando maior estabilidade e rigidez ao sistema, pois valores
mais elevados de ambos os módulos (G´e G´´) foram obtidos durante o
aquecimento de 5 − 85°C e seqüencialmente no resfriamento a 5°C.
FIGURA 35. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA (A) WS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) – WS
(20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUÊNCIA DE 1 Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→
AQUECIMENTO DE 5-85°
°°
°C E RESFRIAMENTO DE 85-5°
°°
°C).
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
G' (Pa)
G'' (Pa)
G'[Pa], G''[Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
G' (Pa)
G'' (Pa)
G'[Pa], G'' [Pa]
Temperatura (
o
C)
Dependendo da razão dos biopolímeros e da técnica de geleificação, um
dos polímeros forma uma fase contínua na qual o outro está disperso ou pode ser
A B
129
formado um sistema bi-contínuo, duas redes contínuas (AUTIO et al., 2002).
Embora, a presença da ι
130
FIGURA 36. MÓDULO ELÁSTICO (G´), MÓDULO VISCOSO (G´´) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
− YS (20 g/L).
SENSOR C60/2
o
Ti, EM FREQUÊNCIA DE 1 Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→
AQUECIMENTO DE 5-85 °
°°
°C E RESFRIAMENTO DE 85-5°
°°
°C).
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G' (Pa)
G'' (Pa)
G
´
[Pa], G
´´
[Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G' (Pa)
G" (Pa)
G'[Pa], G"[Pa]
Temperatura (
o
C)
Outro aspecto avaliado foi grau de inchamento dos géis formados pelo YS
(25 g/L) e pela mistura ι-CAR (5g/L) – YS (20 g/L), determinado pelo teste de
inchamento (sweelling) (POLNOK et al., 2004). Esse experimento demonstrou que
a presença da ι-CAR alterou o taxa de inchamento (Q) do gel. Foi observado que
os valores para YS (25 g/L) e para a mistura ι-CAR (5g/L) – YS (20 g/L) foram 0,8
(± 0,12) e 2,4 (± 0,11), respectivamente. Este comportamento demonstra que a
capacidade de captação de água da mistura foi três vezes superior em relação ao
gel formado somente pela YS (25 g/L). A ι-CAR origina um gel com maior
capacidade de absorção de água resultando na melhora no inchamento do gel.
Não foi avaliada, no entanto, a capacidade de retenção de água nesse sistema. A
intensa histerese observada no reograma pode indicar que há perda de água do
sistema.
Os experimentos demonstraram que as características de todas as misturas
foram dependentes do processo aquecimento-resfriamento. No sistema CS e MS
géis mais macios e estáveis foram obtidos em faixas de temperaturas variando
A B
131
entre 45 − 85°C e o módulo elástico foi menos dependente da temperatura nessa
região.
Com WS melhores características foram obtidas durante o resfriamento,
após o aquecimento no reômetro. Essa melhor interação pode ser decorrente da
formação de um sistema mais homogêneo obtido após o aquecimento, o qual
permitiu a presença de maior concentração da carragenana na fase contínua
intensificando a interação entre os polímeros.
A presença de histerese térmica observada na mistura ι-CAR (5 g/L) − YS
(20 g/L) (FIGURA 35) poderia ser reflexo da incompatibilidade termodinâmica dos
polímeros (ALLONCLE e DOUBLIER, 1991), mas como o gel de YS sozinho
também apresentou histerese, a presença dessa característica não representa
incompatibilidade dos polissacarídeos, mas sim poderia ser reflexo da agregação
das hélices do amido após sua formação, semelhante ao que acontece com os
géis de kappa-carragenana.
Nos sistemas com CS e YS, os quais apresentam conteúdo de amilose
mais próximo (27,5 e 36,0%, respectivamente), maior aumento na força do gel foi
observado no sistema formado pela mistura ι-CAR − YS. Uma possível explicação
para a melhor interação entre ι-CAR − YS são as distintas características da
amilopectina presente no amido de cará (YS), onde menos pontos de ramificação
estão presentes e as cadeias de amilopectina nesse amido apresentam menor
massa molar (MALI et al., 2004) quando comparada com a amilopectina presente
no amido de milho comum (CS). Desse modo, os poucos pontos de ramificações
no amido de Cará lhes conferem uma estrutura mais linear, o que pode
proporcionar uma melhor interação com ι-CAR.
Considerando o conteúdo de amilose, outra possibilidade desse
comportamento, segundo ALLONCLE et al., 1989,; quando amidos contendo
amilose são misturados com outras macromoléculas, efeitos sinérgicos podem
surgir proporcionando aumento da viscosidade das pastas, como resultado da
concentração do polímero adicionado na fase contínua. ALLONCLE e DOUBLIER
(1991) sugerem que esse comportamento seja devido à separação de fases, e
132
que ocorra como conseqüência da incompatibilidade termodinâmica entre a
amilose e o hidrocolóide adicionado, o qual torna-se predominante na fase
contínua. Porém nesse caso, comportamento semelhante seria esperado para a
mistura ι-CAR com amido de milho comum (que apresenta valor próximo de
amilose, pág. 118) o que não foi observado.
Como géis de amido geralmente compreendem um sistema complexo de
grânulos parcialmente gelatinizados em uma matriz de amilose, as características
reológicas observadas são dependentes da origem do amido, características do
granulo degradado, e a proporções de interação dos componentes no sistema
(TECANTE e DOUBLIER, 2002).
Uma vez que o gel mais forte foi obtido no sistema formado pela mistura ι-
CAR (5 g/L) - YS (20 g/L) e como o nível de interação entre os biopolímeros está
relacionado à concentração dos componentes na fase contínua, posteriormente foi
avaliada a influencia da autoclavação nas propriedades reológicas do YS sozinho
e na sua interação com a ι-CAR (5 g/L).
O comportamento reológico da mistura ι-CAR − YS foi avaliado quando a
carragenana não foi autoclavada e quando foi autoclavada separadamente.
(iii) Preparo da mistura (ι-CAR não autoclavada): o amido (20 g/L) e a ι-
CAR (5 g/L) separadamente foram solubilizados a 25 °C durante 1 h e meia sob
agitação mecânica, o amido foi autoclavado e após autoclavação a ι-CAR foi
adicionada. A mistura foi refrigerada por aproximadamente 18 h e mantida a
temperatura ambiente antes de iniciar as análises.
(iv) Preparo da mistura (ι-CAR autoclavada separado): o amido e a ι-CAR
foram separadamente solubilizados a 25 °C durante 1 h e meia sob agitação
mecânica. Posteriormente o amido e a ι-CAR foram autoclavados separadamente
durante 30 minutos. Após autoclavação os polímeros foram misturados e mantidos
sob refrigeração por aproximadamente 18 h para posterior análise.
O comportamento das misturas foi muito semelhante em ambos os modos
de preparo, originando soluções viscoelásticas (FIGURA 37). Isso demonstrou que
133
a autoclavação da ι-CAR junto com o amido foi importante, uma vez que originou
um gel forte (FIGURA 31, pág. 124).
FIGURA 37. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA (A) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
− YS (20 g.L
1
), ι
ιι
ι-CAR NÃO
AUTOCLAVADA E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
− YS (20 g.L
1
), ι
ιι
ι-CAR AUTOCLAVADA
SEPARADO. SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G' [Pa]
G" [Pa]
G' [Pa], G'' [Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
1000
G' [Pa]
G" [Pa]
G' [Pa], G'' [Pa]
Frequência (Hz)
Quando foi avaliada a influencia da temperatura no comportamento das
misturas, os sistemas apresentaram comportamentos semelhantes. O
comportamento reológico confirmou que a autoclavação da ι-CAR junto com o YS
é necessária, para a interação entre os biopolímeros, pois como pode ser
observado na Figura 38 o aquecimento no reômetro proporcionou um aumento
dos valores dos módulos, possivelmente, devido a maior interação dos
polissacarídeos obtida após esse processo. Comportamento semelhante ao
observado na mistura ι-CAR – WS (FIGURA 35, pág. 128).
A B
134
FIGURA 38. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA (A) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
− YS (20 g/L), ι
ιι
ι-CAR NÃO
AUTOCLAVADA E (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
− YS (20 g/L), ι
ιι
ι-CAR AUTOCLAVADA
SEPARADO. SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25°
°°
°C.
135
durante 30 minutos, mantido sob refrigeração aproximadamente 18 h e deixado à
temperatura ambiente antes de iniciar as análises.
(v) Preparo da mistura com pré-aquecimento: o amido foi solubilizado com
a ι-CAR a 85°C durante 1 h e meia, sob agitação mecânica durante 1 h.
Posteriormente a mistura foi autoclavada durante 30 minutos, mantida sob
refrigeração aproximadamente 18 h e deixada à temperatura ambiente antes de
iniciar as análises.
Os reogramas do YS e da mistura ι-CAR-YS, pré-aquecidos (85°C) foram
muito similares entre si (FIGURA 39) e com aqueles observados sem o pré-
aquecimento. A análise da variação dos módulos em função da freqüência
demonstrou que o sistema pré-aquecido resultou em um aumento dos módulos,
tanto do YS sozinho como da mistura, quando comparado com os mesmos sem o
pré-aquecimento (FIGURA 31, pág. 124).
FIGURA 39. SISTEMAS PRÉ-AQUECIDOS A 85°
°°
°C. MÓDULO ELÁSTICO (G’),
MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA PARA (A) YS (25 g/L) E (B)
MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L
) −
−−
− YS (20 g/L) COM PRÉ-AQUECIMENTO. SENSOR pp35/Ti,
DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
G' (Pa)
G'' (Pa)
G
´
[Pa], G
´´
[Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
1
10
100
1000
G' (Pa)
G'' (Pa)
G
´
[Pa], G
´´
[Pa]
Frequência (Hz)
TECANTE e DOUBLIER, (2002) demonstraram que o módulo de
armazenamento (G’) dependente fortemente da concentração da kappa-
carragenana nas misturas realizadas com amilose. Os resultados desses autores
A B
136
sugerem a existência de pelo menos duas diferentes condições sob as quais
forma-se uma fase contínua e uma dispersa, dependendo da concentração de
ambos os polímeros.
A mistura pré-aquecida apresentou maior valor do módulo elástico (G’)
possivelmente porque o pré-aquecimento permitiu a maior solubilidade do amido,
aumentando a concentração de amido solúvel e carragenana presentes na fase
contínua.
Os perfis das pastas frente à variação de temperatura também foram muito
semelhantes, como foi observado para a variação dos módulos em função da
freqüência. Assim como para a YS e mistura ι-CAR-YS sem pré-aquecimento
(FIGURA 36, pág. 130), os reogramas das pastas pré-aquecidas (FIGURA 40)
apresentaram o módulo de armazenamento (G’) superior ao módulo de perda
(G’’), porém a histerese térmica continuou presente em ambos os sistemas, mais
intensamente na mistura.
De acordo com ROCHAS e RINAUDO (1980) a concentração de 0,5% de
κ-carragenana e a presença de íons é suficiente para promover a geleificação e
sob esta condição em um sistema binário (mistura de dois componentes) o
comportamento reológico da carragenana é predominante. Neste contexto a
mistura ι-CAR − YS apresentou maior histerese térmica possivelmente porque a
condição de geleificação utilizada para a ι-CAR (concentração de 0,5%), não foi
suficiente para possibilitar a transição fita para hélice. Sendo assim nesse sistema
nessas condições há predomínio do comportamento do amido na fase contínua.
Foi possível observar que, após o aquecimento, houve dissociação das zonas de
junção dentro da rede do gel em ambos os sistemas (amido sozinho e mistura),
devido à presença de histerese térmica, essa histerese possivelmente ocorreu
devido à agregação das hélices do amido depois de formadas.
137
FIGURA 40. SISTEMAS PRÉ-AQUECIDOS A 85°
°°
°C. MÓDULO ELÁSTICO (G´),
MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA PARA (A) YS (25 g/L) E
(B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
− YS (20 g/L) COM PRÉ-AQUECIMENTO. SENSOR
pp35/Ti, EM FREQUÊNCIA DE 1 Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%. (→
→→
→ AQUECIMENTO DE
5-85 °
°°
°C E RESFRIAMENTO DE 85-5 °
°°
°C).
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
1000
G'' (Pa)
G'' (Pa)
G'[Pa],G''[Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
1
10
100
1000
138
FIGURA 41. VISCOSIDADE DINÂMICA DAS AMOSTRAS DE (A) MISTURA ι
ιι
ι-CAR-YS,
SEM PRÉ-AQUECIMENTO (B) MISTURA ι
ιι
ι-CAR-YS, PRÉ-AQUECIDA (C) YS, SEM
PRÉ-AQUECIMENTO E (D) YS, PRÉ-AQUECIDO. SENSOR pp 35.Ti, EM
FREQUÊNCIA DE 1 Hz E DEFORMAÇÃO DE 1%.
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
10000
139
de uma estrutura de gel verdadeiro no sistema (HAN et al., 2002; BOT et al., 2001;
MARTIN et al., 2003).
Para ambos os sistemas (amido sozinho e mistura) a viscosidade complexa
foi maior do que a viscosidade aparente (FIGURA 42), confirmando a formação de
um gel forte. Adicionalmente esses gráficos demonstraram que a natureza elástica
observada como a razão entre a viscosidade complexa e a aparente foi muito
maior na mistura demonstrando, então, um caráter mais sólido nesse sistema.
FIGURA 42. COX-MERZ DO (A) YS (25 g/L) E (B) ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) −
−−
− YS (20 g/L) (
)
VISCOSIDADE COMPLEXA, (
) VISCOSIDADE APARENTE.
1 10
0,1
1
10
100
1000
Frequencia (rad/s),
Taxa de cisalhamento (1/s)
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
10000
n*, n [Pas]
Frequencia (rad/s),
Taxa de cisalhamento (1/s)
A transição do estágio desordenado (fita) para ordenado (hélice) é
frequentemente o primeiro passo na geleificação das carragenanas. A
conformação de hélice é promovida pela adição de sal ou pela diminuição da
temperatura. Pôde-se observar que a condição de geleificação utilizada,
concentração (0,5%) de ι-CAR, aparentemente não foi suficiente para permitir a
geleificação (transição fita para hélice) e, principalmente, a estabilização da hélice
formada. Outra característica importante observada no sistema ι-CAR − YS foi a
intensa histerese, que é um fenômeno indesejável encontrado em várias
aplicações na indústria de alimentos contendo biopolímeros misturados.
η
*,
η
[Pas]
A B
140
Apesar da formação de um gel mais forte com o pré-aquecimento tanto
para YS como para a mistura ι-CAR − YS, ambos os sistemas apresentaram
elevada histerese. Como a influência dos sais na formação de hélices das
carragenanas já foi relatada (ROCHAS e RINAUDO, 1980; PICULELL et al., 1987)
apesar de ainda não ter sido determinada a especificidade deste sal para a iota-
carragenana, sequencialmente foi avaliada a influencia do KCl (120 mM), nas
misturas ι-CAR (5 g/L) − YS (20 g/L) preparadas com e sem o pré-aquecimento.
Para facilitar a compreensão dos resultados foram realizadas as seguintes
comparações.
- Mistura ι-CAR − YS: sem pré-aquecimento sem sal;
- Mistura ι-CAR − YS: sem pré-aquecimento com sal;
- Mistura ι-CAR − YS: com pré-aquecimento sem sal;
- Mistura ι-CAR − YS: com pré-aquecimento com sal.
Os resultados das misturas sem sal já foram descritos, serão aqui repetidos
para facilitar a compreensão. O preparo das misturas com sal foi realizado da
seguinte maneira.
(vi) Preparo da mistura sem pré-aquecimento com sal: o YS foi solubilizado
com a ι-CAR a 25°C em uma solução de KCl 120 mM, sob agitação mecânica
durante 1 hora e 30 minutos. Posteriormente, a mistura foi autoclavada durante 30
minutos, mantida sob refrigeração por aproximadamente 18 h e deixada a 25
o
C
antes de iniciar as análises.
(vi) Preparo da mistura com pré-aquecimento com sal: o YS foi solubilizado
com a ι-CAR a 85°C em uma solução de KCl 120 mM sob agitação mecânica
durante 1 hora e 30 minutos. Posteriormente, a mistura foi autoclavada durante 30
minutos, mantida sob refrigeração por aproximadamente 18 h e deixada a 25
o
C
antes de iniciar as análises.
Quando foi avaliada a influência do sal no sistema ι-CAR (5 g/L) − YS (20
g/L) sem pré-aquecimento os valores dos módulos: elástico (G’) e do viscoso (G’’)
141
foram inferiores no sistema preparado na presença de sal (FIGURA 43). O que foi
confirmado pelos valores de Tan δ, valores inferiores foram obtidos para a mistura
sem aquecimento e sem sal indicando a formação de um gel mais forte nesse
sistema (FIGURA 44).
FIGURA 43. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
− YS (20 g.L
1
) SEM PRÉ-
AQUECIMENTO (A) SEM SAL (KCl 120 mM) (B) COM SAL (KCl 120 mM) SENSOR
pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
0,1
1
10
100
1000
G
'
G
''
G
'
[Pa], G
''
[Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
0,01
0,1
1
10
100
G' (Pa)
G'' (Pa)
G' [Pa], G'' [Pa]
Frequência (Hz)
FIGURA 44. GRÁFICO DE Tan δ
δδ
δ EM FUNÇÃO DA FREQUÊNCIA PARA (A) MISTURA
ι
ιι
ι-CAR (5 g/L) – YS (20 g/L), (A) SEM SAL, (B) COM SAL (KCl 120mM).
0,1 1 10
0,01
0,1
1
A
B
Tan δ
Frequência (Hz)
A B
142
Aparentemente o sal diminuiu a força do gel, porém quando foi avaliada a
influência da temperatura, o sal permitiu maior estabilidade no que diz respeito à
diminuição da histerese, que foi significativamente diminuída no sistema com sal,
uma vez que a diferença nos módulos elástico e viscoso (G’ e G’’,
respectivamente) foi semelhante após o resfriamento (FIGURA 45).
FIGURA 45. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
− YS (20 g.L
1
) SEM PRÉ-AQUECIMENTO (A)
SEM SAL (KCl 120 mM) (B) COM SAL (KCl 120 mM) SENSOR pp35/Ti,
DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G'
G"
G'[Pa], G"[Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G'
G''
G'[Pa], G'' [Pa]
Temperatura (
o
C)
A intensa redução na histerese térmica para a mistura preparada com sal,
possivelmente ocorre porque a presença de 120 mM de KCl permitiu a transição
conformacional fita para hélice, originando estruturas estáveis durante o
resfriamento formando uma rede (FIGURA 45). A presença de sal permite a
transição conformacional e faz com que haja predomínio do comportamento da ι-
CAR no sistema.
A presença de sal na mistura pré-aquecida, apesar de proporcionar uma
redução na histerese, diminuiu a força do gel, observada pelo comportamento
reológico demonstrado na Figura 46B.
A B
143
FIGURA 46. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
FREQUÊNCIA PARA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
− YS (20 g.L
1
) COM PRÉ-AQUECIMENTO (A) SEM
SAL (KCl 120 mM) (B) COM SAL (KCl 120 mM) SENSOR pp35/Ti, DEFORMAÇÃO DE
1%, A 25 °
°°
°C.
0,1 1 10
1
10
100
1000
G' (Pa)
G'' (Pa)
G
´
[Pa], G
´´
[Pa]
Frequência (Hz)
0,1 1 10
0,1
1
10
100
G' (Pa)
G'' (Pa)
G'[Pa], G'' [Pa]
Frequência (Hz)
Quando foi avaliada a influência da temperatura no sistema formado,
considerando que a diminuição da temperatura e a adição de sal são condições
para geleificação da carragenana, a adição do sal permitiu a completa ausência de
histerese, no resfriamento, demonstrando a importância do sal (condição
geleificante) que permite a transição (fita-hélices) da ι-CAR e a formação de uma
rede estável formada pelas hélices do amido e da carragenana (FIGURA 47).
Nessas condições um sistema termoestável sem nenhuma histerese foi formado,
pois não houve agregação das hélices do amido após sua formação.
A B
144
FIGURA 47. MÓDULO ELÁSTICO (G’), MÓDULO VISCOSO (G”) EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA PARA A MISTURA ι
ιι
ι-CAR (5 g.L
1
) −
−−
− YS (20 g.L
1
) COM PRÉ-
AQUECIMENTO (A) SEM SAL, (B) COM SAL (KCl 120 mM) SENSOR pp35/Ti,
DEFORMAÇÃO DE 1%, A 25 °
°°
°C.
0 20 40 60 80 100
1
10
100
1000
G' (Pa)
G'' (Pa)
G' [Pa], G'' [Pa]
Temperatura (
o
C)
0 20 40 60 80 100
0,1
1
10
100
G' (Pa)
G'' (Pa)
G'[Pa], G'' [Pa]
Temperatura (
0
C)
Correlacionando a estrutura química fina da ι-CAR obtida da alga M.
gelidium com as propriedades reológicas observadas é importante considerar a
presença de unidades precursoras nu-carragenana neste polímero. O hidrocolóide
iota-carragenana utilizado industrialmente extraído da alga vermelha Eucheuma
denticulatum pode conter quantidades de nu-carragenana variando de 0-23 mol%.
A nu-carragenana é o precursor biológico da iota-carragenana e a capacidade de
formação de hélice da iota-carragenana tende a diminuir proporcionalmente com o
aumento da quantidade de unidades nu-carragenana (VAN DE VELDE et al.,
2001).
Para avaliar o efeito da presença deste precursor nas propriedades
reológicas de iota-carragenana extraída de E. denticulatum (VAN DE VELDE et
al., 2002b) preparou amostras com variáveis quantidades de nu-carragenana, por
tratamento alcalino durante diferentes tempos.
Em contraste à formação de hélices, as propriedades reológicas da iota-
carragenana são efetivamente melhoradas pela presença de pequenas
quantidades de nu-carragenana. VAN DE VELDE et al (2002b) obtiveram um valor
A B
145
máximo de G’ com as amostras de iota-carragenana que apresentaram até 3% de
unidades nu-carragenana.
Considerando que a estrutura química fina da ι-CAR de M. gelidium é
constituída por iota/nu-carragenana (84,0 e 8,0%, respectivamente) quando se
avalia a transição conformacional de fita para hélice da iota-carragenana em
função da regularidade da sua cadeia, a pequena quantidade de nu-carragenana,
presente sem a necessidade de ciclização por tratamento alcalino, possivelmente,
influenciou positivamente nas propriedades reológicas.
Foi demonstrado que a capacidade da iota-carragenana de formar uma
estrutura ordenada (rede), contendo pequena quantidade de nu-carragenana, é
significativamente maior do que de amostras de iota-carragenana puras obtidas
por tratamento alcalino (VAN DE VELDE et al., 2002b).
Esse fenômeno pode ser explicado em termos do balanço entre o conteúdo
de unidades com capacidade de formação de hélice (iota-carragenana) e o
número de ligações cruzadas entre as cadeias. Levando em consideração o fato
que unidades de nu-carragenana introduzem na molécula “kinks”, pontos de
junção na conformação da cadeia permitindo o contato com cadeias vizinhas.
Aumentando a quantidade de nu-carragenana há aumento no número de ligações
cruzadas na rede, resultando em um aumento na força do gel.
As características estruturais naturalmente encontradas na iota-caragenana
de M. gelidium lhe conferem importantes características para formação de gel,
tanto em sistema isolado, como em associação com diferentes tipos de amido,
que apresentam baixo custo e ampla utilização. As associações entre
macromoléculas são importantes, pois normalmente determinam a textura e as
propriedades dos géis formados conferindo-lhes propriedades funcionais mais
atraentes, como por exemplo, a ausência de histerese.
146
4.1.4. ATIVIDADE ANTIVIRAL DAS GALACTANAS SULFATADAS
O amplo espectro de atividades biológicas que os polissacarídeos
sulfatados apresentam como ação anticoagulante (CARLUCCI et al, 1997,
FARIAS et al., 2000), antiviral (DUARTE et al., 2001, 2004; TALARICO et al.,
2004, 2005; DAMONTE et al., 1996; CÁCERES et al., 2000), antitumoral
(FERNANDEZ et al., 1989; ZHOU et al., 2004) entre outras, motivou a avaliação
da atividade antiviral dos polissacarídeos biossintetizados pelas algas
Gymnogongrus griffithsiae e Meristiella gelidium.
O aparecimento de cepas virais resistentes após tratamento prolongado em
pacientes imunocomprometidos são as principais razões para se continuar a
busca de novos agentes antiherpéticos e avaliar a capacidade que os
polissacarídeos sulfatados de algas marinhas apresentam como compostos
promissores na terapia antiviral.
4.1.5. ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA E ANTIDENGUE DAS GALACTANAS DE
G. griffithsiae
Estudos prévios demonstraram que a alga Gymnogongrus griffithsiae
(Phylophoraceae) sintetiza majoritariamente carragenana kappa/iota/nu- e
agaranas metiladas (FARIA 2002). Com a finalidade de avaliar a atividade
antiherpética e antidengue desses polissacarídeos e compará-la com a atividade
desempenhada pelos políssacarídeos de Meristiella gelidium, a alga G. griffithsiae
foi submetida ao esquema de extração e purificação para obtenção da fração G3d,
conforme descrito na Figura 48. A fração G3d foi submetida a análise de metilação
e demonstrou proporção 5:1:1 de iota/nu/kappa -. As demais frações analisadas
foram obtidas previamente por Faria (2002).
147
FIGURA 48. FLUXOGRAMA (A) EXTRAÇÃO; (B) FRACIONAMENTO COM KCl
E (C) PURIFICAÇÃO POR CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DAS
GALACTANAS DE G. griffithisiae.
(A)
Resíduo 1
Resíduo 2
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
Sobrenandante 3
Fração G3
Extração aquosa 100 °C
Centrifugação
Resíduo 3
Etanol (3 vol.)
Centrifugação
Fração G1
ALGA SECA E MOÍDA
Extração aquosa 25 °C
Centrifugação
Sobrenandante 1
Extração aquosa 25 °C
Centrifugação
Sobrenadante 2
Fração G2
148
(B)
(C)
Fração G3
Precipitada com KCl
Frações: G3a (0,0 – 0,1M)
G3b (0,2 – 0,3M)
G3c (0,75 – 1,0M)
G3d (1,0 -1,2M)
Fração G3S
Solúveis em KCl
Frações: G3S-1; G3S-2; G3S-3; G3S-4; G3S-5; G3S-6, G3S-7
Eluentes: água NaCl 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,0, 4,0M
Fração G3S
149
As análises de atividade antiviral que serão mostradas a seguir foram
realizadas pelo grupo de Virologia da Universidade de Buenos Aires, sob
orientação da Dr
a
. Elsa B. Damonte. A análise dos resultados foi feita em
colaboração com o nosso Laboratório de Algas Marinhas e publicados por
TALARICO et al. (2004, 2005) onde a metodologia encontra-se descrita. Serão
discutidos inicialmente os resultados obtidos contra o vírus herpes simplex.
As frações de G. griffithsiae foram avaliadas quanto a sua citotoxicidade. O
ensaio de viabilidade celular foi realizado através do método do MTT, onde as
culturas de células Vero foram expostas a diferentes concentrações de cada
fração, para se determinar a concentração citotóxica 50% (CC
50
concentração que
reduz em 50% o número de placas em células Vero) (Tabela 20). Nenhum efeito
citotóxico às células Vero foi observado, mesmo em concentrações de 1000 µg/Ml.
Deste modo o valor de CC
50
foi > 1000 µg/mL.
Inicialmente foi realizada a avaliação antiherpética das frações
polissacarídicas, através de um screening antiviral, pelo ensaio de redução de
placas virais (HSV-1 estirpe F) em células Vero. Os resultados são demonstrados
na Tabela 20, representados na forma de IC
50
.
O extrato bruto G3 e a fração G3d correspondente a iota/kappa/nu-
carragenana (70/14/16 %, respectivamente) obtida a partir do extrato G3 por
precipitação fracionada com KCl apresentaram ação antiviral mais efetiva e
maiores índices de seletividade inclusive em relação aos compostos de referência
(heparina e dextran sulfato) (TABELA 20).
150
TABELA 20. ATIVIDADE ANTI-HSV-1 E ENSAIO CITOTÓXICO DE GALACTANAS
ISOLADAS DE G. griffithsiae
a
.
Frações
CC
50
b
(µg/mL)
IC
50
c
(µg/mL)
SI
d
VC
50
e
(µg/mL)
Sulfato
f
NaSO
3
(%)
G3 >1000 1,1 >909 8,5
33,1
G3d >1000 1,0 >1000 >20
29,4
G3S >1000 4,3 >233 >20
9,1
G3S-1 >1000 4,1 >244 n.d.
7,0
G3S-2 >1000 >200 Inativo n.d.
4,2
G3S-3 >1000 100 >10 n.d.
12,1
G3S-4 >1000 2,4 >417 n.d.
10,5
G3S-5 >1000 5,6 >179 n.d.
21,0
G3S-6 >1000 2,2 >455 >20
35,0
G3S-7 >1000 >200 Inativo n.d.
20,6
Heparina >1000 3,0 >333 >20
Nd
DS8000 >1000 2,8 >357 n.d
Nd
a
Tabela de TALARICO et al. (2004).
b
Concentração citotóxica, ou concentração necessária para reduzir em 50% a viabilidade celular
de células Vero após 48 horas de incubação com cada fração.
c
Concentração inibitória, ou concentração que reduz em 50% o número de placas virais em células
Vero.
d
Indice de seletividade ou (CC
50
/IC
50
).
e
Concentração virucida, ou concentração necessária para inativar os vírus em 50%, após 1 h e 30
min de incubação com as frações
Dados obtidos de 3 ensaio em duplicata.
f
Expresso como NaSO
3
nd não determinado
151
Os extratos mais ativos contra o HSV-1 foram as frações G3, G3d, G3S-4 e
G3S-6 com valores de IC
50
1,1; 1,0; 2,4; 2,2 µg/mL. O aumento da atividade
antiviral de polímeros sulfatados está correlacionado, entre outros fatores, com o
grau de sulfatação dessas moléculas. Esta correlação está de acordo com os
dados de FARIA (2002) e pôde-se observar que essas galactanas mais ativas
estão entre as frações que apresentam maior teor de grupos sulfatado (TABELA
20).
Porém outros fatores estruturais, como o grau de polimerização e a posição
de grupos sulfato na estrutura polissacarídica, também podem estar
correlacionados com a atividade antiviral.
São cinco glicoproteínas virais (gB, gC, gD, gH e gL) que medeiam a
interação e entrada do vírus na célula hospedeira. O passo inicial é a união de gC
(HEROLD et al., 1991) e também de gB (HEROLD et al., 1994), com a superfície
celular de glicosaminoglicanas, particularmente com o heparan sulfato (SHIEH et
al., 1992). Uma vez que o mecanismo de união e entrada do vírus na célula é
bastante conhecido, FREYZI et al. (1997), demonstraram que a mínima seqüência
na interação do heparan sulfato (HS) da célula hospedeira com a glicoproteína gC
do HSV-1 é a seqüência [→4)-β-L-(
1
C
4
)-IdoA2-OSO
3
-(1→4)-α-D-(
4
C
1
)-GlcNR6’-
OSO
3
-(1→] com no mínimo 10-12 unidades repetitivas (FIGURA 49A).
DUARTE et al. (2004), de maneira comparativa, determinaram que as
agaranas de Acanthophora spicifera, constituídas por unidades de β-
galactopiranose 2-sulfato ligadas a α-galactose 6-sulfato [→3)-β-L-(
4
C
1
)-Galp2-
OSO
3
–(1→4)-α-L-(
1
C
4
)-Galp6’-OSO
3
-(1→] (FIGURA 49B), apresentam uma
conformação de unidades sulfatadas similar à mínima seqüência do heparan
sulfato, e estas unidades podem ser responsáveis pela formação do complexo
polissacarídeo-gC e assim pela atividade antiherpética destas galactanas.
Da mesma forma as galactanas de C. crenulata, apresentaram a díade β-D-
galactose 2-sulfato ligada a α-L/D-galactose 6-sulfato, o que, por analogia, poderia
justificar a atividade antihérpetica desempenhada pelas mesmas (ZIBETTI et al.,
2005).
152
Entre os estudos que têm demonstrado a correlação da atividade antiviral,
não somente com o grau de sulfatação, mas também com o posicionamento dos
grupos sulfato nas galactanas, CARLUCCI et al., (1997) observaram que as
carragenanas de Gigartina skottsbergii, submetidas a tratamento alcalino,
apresentaram uma atividade antiherpética menor que os polímeros originais. De
modo similar a agarana de Acanthophora spicifera também apresentou menor
atividade antiherpética da galactana tratada com álcali (IC
50
> 5 µg/mL) que a
respectiva fração original (IC
50
> 1,4 µ g/mL) (DUARTE et al., 2004). Estes
resultados demonstram a importância do posicionamento dos grupos sulfato em
C-6 das unidades α-galactose no desempenho da atividade antiviral.
De maneira distinta, a agarana metilada obtida da alga Georgiella confluens
não apresentou nenhuma atividade antiviral (KOLENDER et al., 2002). Esta
galactana possui baixo conteúdo de 3,6-anidrogalactose e ramificação por unidade
de xilose ligada no C-4 de β-D-galactose, baixo teor de grupos sulfato (12,8%), os
quais estão principalmente (~8 – 9%) ligados na posição C-3 de α-L-galactose,
com menores quantidades de sulfatação no C-4 de β-D-galactose (~3 – 4%).
A interação entre as galactanas sulfatadas e a glicoproteína externa do
vírus pode levar à inativação viral e/ou bloquear a ligação do vírus ao receptor da
célula hospedeira durante a adsorção viral. Para elucidar estas duas
possibilidades foi realizado o ensaio de atividade virucida contra o vírus HSV-1.
Com exceção da galactana G3 as demais frações avaliadas foram incapazes de
inativar o vírus HSV-1 até a concentração de 20 µg/mL. A fração G3 demonstrou
fraco efeito virucida com concentração VC
50
(8,5 µg/mL) excedendo muito a
correspondente concentração antiviral IC
50
1,1 µg/mL (TABELA 20). A lambda-
carragenana de G. skottsbergii, além da atividade antiviral, é a única relatada que
apresenta atividade virucida (CARLUCCI et al., 1997).
153
FIGURA 49. (A) ESTRUTURA DA MÍNIMA SEQÜÊNCIA DE LIGAÇÃO DO HEPARAN
SULFATO. (B) MÍNIMA ESTRUTURA DE LIGAÇÃO DA AGARANA DE A. spicifera
a
a
Figura de DUARTE et al. (2004).
As frações G3, G3S, G3d e G3S-6 foram avaliadas através do ensaio de
redução de número de placas virais em células Vero, frente a diferentes cepas de
HSV, inclusive a uma cepa resistente a aciclovir (B-2006), bem como cepas de
HSV-2 (G e MS), sendo determinado a IC
50
destes polímeros.
De acordo com os valores observados na Tabela 21, todas as frações
polissacarídicas de G. griffithsiae foram efetivas contra todos os diferentes tipos de
herpes vírus ensaiados. Especificamente todos os compostos foram eficientes
inibidores contra cepas B-2006, uma cepa resistente ao aciclovir. Quando
avaliada a atividade antiviral contra HSV-2 cepa MS, os valores obtidos
O
-
O
3
SO H
2
C
OR’
H
H
H
H
NHR
O
H
O
H
H
H
-
O
3
S
O
H
H
O
O
H
O
2
C
O
O
O
H
H
H
H
H
O
O
O
O
R
O
H
R’’
H
H
H
HOCH
R’O
C
H
2
2
H
H
H
OH
R’ = SO3
–
R’’ = SO3 -
(A)
(B)
154
demonstraram que esta cepa foi significativamente mais susceptível a ação
inibitória das galactanas (IC
50
de 0,1 –
0,4 µg/mL).
TABELA 21. ATIVIDADE ANTI-HSV-1 E HSV-2 DE GALACTANAS ISOLADAS DE G.
griffithsiae
a
.
Fração
IC
50
b
(µg/mL)
HSV-1
B 2006
HSV-1
1C3-syn 13-8
HSV-1
1C3-syn 14-1
HSV-2
G
HSV-2
MS
G3 0,7 3,1 2,7 1,2 0,1
G3S 2,8 3,4 4,1 3,3 0,4
G3d 0,4 0,3 3,4 1,0 0,1
G3S-6 0,8 2,3 16,7 3,2 0,1
Heparin 1,6 1,1 12,3 1,8 0,6
DS8000 2,1 0,9 15 2,5 0,6
a
.Tabela de TALARICO et al. (2004).
b
Concentração inibitória, ou concentração que reduz em 50% o número de placas em células
Vero.
Como estas galactanas não apresentaram ou apresentaram baixa atividade
virucida (fração G3, TABELA 21), para confirmar o efeito inibitório na etapa de
adsorção viral foi realizado um ensaio de redução de placas, adicionando as
galactanas em diferentes etapas da replicação viral. Quando a galactana foi
omitida na etapa de adsorção viral e foi adicionada somente após a adsorção,
nenhuma redução significativa foi observada no número de placas, mesmo em
altas concentrações. Por outro lado, quando as galactanas estavam presentes
somente na etapa de adsorção viral, ocorreu uma redução de placas significativa e
eficaz, bem como na presença das galactanas durante e após adsorção viral.
Estes dados indicam que a adsorção viral é o principal alvo antiviral destes
polissacarídeos (TABELA 22).
155
TABELA 22. INFLUÊNCIA DOS DIFERENTES PERIODOS DE TRATAMENTO NA
ATIVIDADE DAS GALACTANAS DE G. griffithsiae CONTRA HSV-1
a
.
Fração
IC
50
b
(µg/mL)
Durante adsorção viral Após adsorção viral
156
4-sulfato) e as unidades B na forma do derivado 3,6-anidro-α-D-galactose, estão
70% 2-O-sulfatadas e 13,0% não substituídas e as unidades de galactose 17,0%
são sulfatadas no C-2 e C-6 (α-D-galactose 2,6-sulfato). A galactana G3S-6
possivelmente devido a sua massa molar apresentou menor atividade antiviral
quando comparada com a galactana G3d.
Assim como as carragenanas de G. griffithsiae outras carragenanas têm
apresentado potente atividade antiviral, como as kappa/iota de G. skottsbergii,
(IC
50
entre 1,6 - 4,1 µg/mL, CARLUCCI et al., 1997), as kappa/iota de G. torulosus
(IC
50
entre 2,1 – 0,6 µg/mL) (ESTEVEZ, 2003) e as iota/alpha de Stenogramme
interrupta (Phyllophoraceae) (IC
50
entre 1,9 – 9,3 µg/mL) (CÁCERES et al., 2000).
Outro ponto que merece destaque é que essas galactanas foram efetivas
contra todas as cepas testadas, inclusive contra as variantes sinciciais de HSV-1,
isolados após várias passagens nas células Vero da cepa F de HSV-1 na
presença da carragenana antiviral 1C3 (mu/nu-carragenana) (CARLUCCI et al.,
2002) e a cepa resistente a aciclovir (B-2006).
A galactana sulfatada G3d de G. griffithsiae foi selecionada para a
avaliação da atividade antiviral contra quatro sorotipos do vírus da dengue
(TALARICO et al., 2005).
Inicialmente foi realizado um screening para verificar contra qual sorotipo
viral a galactana apresentaria mais atividade (TABELA 23). Heparina e DS8000
(dextran sulfato), dois polissacarídeos comerciais conhecidos pelas suas
propriedades antivirais contra vários vírus envelopados, foram utilizados como
controles positivos.
157
TABELA 23. ESPECTRO DE ATIVIDADE ANTI-DENGUE DA GALACTANA G3d EM
CÉLULAS VERO
a
.
Composto
IC
50
(µg/mL)
b
DENV-1 HW DENV-2 NGC
DENV-3 H87 DENV-4- 8124
158
podendo ser atribuído o crescimento diferencial à diferença na susceptibilidade a
galactana (TALARICO et al., 2005).
Já é conhecido que o vírus da dengue pode infectar diferentes tipos de
células e este tropismo celular parece estar diretamente relacionado à patogênese
viral (McBRIDE e BIELEFELDT-OHMANN, 2000). Desse modo o efeito inibitório
da galactana G3d foi avaliado utilizando duas linhagens de células humanas, PH
(fibroblastos) e HepG2 (hepatoma) e em uma linhagem de célula do mosquito
C6/36 HT (TABELA 24). Os vírus utilizados neste ensaio foram os mais
susceptíveis, os sorotipos 2 e 3.
TABELA 24. ATIVIDADE ANTI-DENGUE DA GALACTANA G3d EM CÉLULAS VERO,
HEPG2, PH E C6/36 HT
a
.
Composto
IC
50
(ug/mL)
b
Vero
HepG2
PH
C6/36 HT
DENV-2
G3d
1,0 ± 0,1 1,8 ± 0,3 0,31 ± 0,01
>50
Heparina
1,6 ± 0,6 6,0 ± 0,4 2,1 ± 0,1
>50
DS8000
1,8 ± 0,2 3,6 ± 0,2 2,4 ± 0,2
>50
DENV-3
G3d
5,2 ± 0,1 10,4 ± 1,2 9,5 ± 0,7
>50
Heparina
9,7 ± 1,2 6,2 ± 0,3 3,2 ± 0,5
>50
DS8000
4,1 ± 0,5 13,9 ± 1,2 6,3 ± 0,5
>50
a
Tabela de TALARICO et al. (2005).
b
Concentração inibitória 50%, ou concentração necessária para inibir o rendimento viral em 50%
até 48 h pós infecção (pi). Cada valor representa a média dos ensaios em duplicata ± o desvio
padrão.
159
A galactana G3d foi um efetivo inibidor do DENV-2 e DENV-3 em células
humanas HepG2 e PH. No ensaio com as células HepG2 o efeito antiviral foi
semelhante ao observado em células Vero. Nenhuma toxicidade foi detectada em
ambas as linhagens de células humanas após a exposição à galactana até
concentração de 1000 µg/mL. O valor de SI determinado para G3d nas células
humanas contra DENV-2 e DENV-3 foi entre >555 e 6250. Estes dados indicaram
que a galactana G3d de G. griffithsiae apresentou inibição seletiva para ambos os
sorotipos em células humanas, apresentando maior efetividade contra o sorotipo
2, do mesmo modo como descrito para células Vero. Em contraste, nenhum efeito
foi observado na multiplicidade de ambos os sorotipos nas células do mosquito
C6/36 HT, até a concentração de 50 µg/mL (TABELA 24).
O modo de ação desta galactana foi avaliado utilizando células Vero e
DENV-2. Para localizar o alvo da atividade antiviral durante o ciclo de
multiplicação do vírus, foi determinada a influência do tempo de adição do
polissacarídeo na formação de placas em células Vero. O polissacarídeo foi
adicionado simultaneamente com o vírus ou em intervalos de 1 h após a
exposição das células ao vírus. Maior efeito inibitório foi observado quando o
polissacarídeo foi adicionado às células junto com o vírus (tempo zero) (95,0% de
inibição). Quando adicionado imediatamente após a adsorção (1 h pi), a galactana
também inibiu efetivamente, reduzindo aproximadamente 75,0% as placas virais.
Porém nenhum efeito foi observado em tempos superiores.
Estes resultados sugerem que a etapa de adsorção viral é o principal alvo
da galactana contra DENV-2 em células Vero, e a etapa do ciclo viral ocorrendo
imediatamente após a adsorção, durante a primeira hora de infecção;
provavelmente a internalização viral também parece ser afetada.
Para certificar a ação antiviral nos primeiros estágios do ciclo de
multiplicação viral do DENV-2, posteriormente foi avaliada a cinética de adsorção
do vírus na presença da galactana.
Os resultados obtidos confirmaram que a galactana G3d inibiu a adsorção
do vírus, uma vez que a quantidade de vírus ligados às células foi intensivamente
160
diminuída nas células tratadas com G3d em comparação com as células
infectadas não tratadas (controle) (25 UFP e 100 UFP em 30 minutos de
adsorção, respectivamente) (TALARICO et al., 2005). Quando analisada a ação
inibitória da galactana na etapa subseqüente do ciclo viral pós-adsorção, pôde-se
observar que a determinação do número de placas formadas após a inativação do
vírus extracelular, mas não do vírus internalizado, foi significativamente reduzida
na presença da galactana, aproximadamente 50 UFP contra 150 UFP em 60
minutos pós-adsorção (TALARICO et al., 2005).
Estes resultados demonstraram que a galactana iota/kappa/nu- de G.
griffithsiae possui efetiva e seletiva atividade contra os vírus da dengue sorotipos 2
e 3. É importante ressaltar que devido ao comportamento diferencial desta
galactana na internalização do vírus na célula, este composto pode ser uma
ferramenta útil na elucidação do mecanismo de ligação e internalização dos
sorotipos da dengue em células de vertebrados e invertebrados.
Foi importante avaliar a resposta contra diferentes sorotipos, uma vez que
os quatro sorotipos analisados co-circulam em regiões epidêmicas e já é bem
estabelecido que a reinfecção com diferentes sorotipos representa uma
significativa ameaça para a saúde humana devido ao desenvolvimento de formas
severas da doença hemorrágica da dengue e síndrome de choque da dengue. É
interessante ressaltar este ponto, pois esta seletividade também pode ser
observada com outras substâncias antivirais.
4.1.6. ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA E ANTIDENGUE DAS GALACTANAS DE
M. gelidium E COMPARAÇÃO COM AS GALACTANAS DE G. griffithsiae.
Os extratos brutos M1 (extração a 25 °C), M3 (extração a 100 °C) e a
carragenana iota/kappa- homogênea (M3a), Mw: 956.700 g/mol, obtidos da alga
M. gelidium foram selecionados para avaliação da sua atividade antiviral contra os
vírus HSV-2 e DENV-2. Heparina e dextran sulfato (DS 8000) foram utilizados
como polissacarídeos antivirais de referência.
161
Nenhuma toxicidade foi observada com qualquer dos polissacarídeos
avaliados até a concentração de 1000 µg/mL (TABELA 25).
TABELA 25. ATIVIDADE ANTIVIRAL CONTRA VÍRUS HERPES SIMPLEX E VÍRUS DA
DENGUE DAS FRAÇÕES DE M. gelidium.
Fração
CC
50
a
(µg/mL) IC
50
b
(µg/mL)
HSV-2 (MS) DENV-2 (NGC)
M1 > 1000 0,06 ± 0,01 0,79 ± 0,04
M3 > 1000 0,05 ± 0,02 0,14 ± 0,01
M3a > 1000 0,04 ± 0,01 0,21 ± 0,04
Heparin > 1000 0,6 ± 0,1
c
1,9 ± 0,2
d
DS 8000 > 1000 0,6 ± 0,1
c
0,9 ± 0,1
d
a
Concentração citotóxica 50%: concentração do composto necessária para reduzir
viabilidade das
células Vero em 50% após 48 h de incubação.
b
Concentração inibitória 50%: concentração do composto necessária para reduzir o número de
placas virais nas células Vero em 50%.
Estes compostos apresentaram elevada atividade antiherpética com IC
50
de
0,04 − 0,06 µg/mL. A efetividade dos extratos brutos de M. gelidium foi superior ao
correspondentes extratos de G. griffithsiae (TABELA 20). O valor de IC
50
do
extrato bruto G3 (1,1 µg/mL) foi duas vezes maior que os valores obtidos para M1
e M3. No entanto, quando consideramos as galactanas obtidas após precipitação
com KCl, as carragenanas G3d e M3a das duas algas apresentaram o mesmo
nível de atividade (TABELA 25 e 20). O índice de seletividade (SI) foi muito maior
(25000) para M3a, do que para G3d (SI = >1000).
162
A atividade antiviral das galactanas de M. gelidium contra o vírus da
dengue, sorotipo 2 (DENV-2) foi menor do que a detectada contra o vírus herpes
simplex (HSV-2) (TABELA 25). Estas galactanas apresentam valores de IC
50
entre
0,14 – 0,16 µg/mL. Os extratos brutos e a fração homogênea de M. gelidium foram
inibidores mais efetivos do DENV-2 do que os polissacarídeos de G. griffithsiae
(TABELA 23).
Os resultados demonstraram que a carragenana M3a da alga M. gelidium
foi, entre os polissacarídos sulfatados obtidos de algas vermelhas, o mais potente,
considerando o seu efeito inibitório contra o herpes vírus (HSV-2) (DAMONTE et
al., 2004).
As carragenanas G3d (Mw = 845.000 g/mol) e M3a (Mw: 956.700 g/mol)
constituídas por iota/kappa/nu- 70/14/16 % e 84/4/6 %, respectivamente,
apresentam sulfatação no C-4 das unidades β-D-galactopiranose é responsável
pela atividade antiviral das carragenanas do tipo kappa- (CARLUCCI et al., 1997,
1999; DAMONTE et al., 2004). Nas carragenanas do tipo iota- a presença de
grupos carregados no C-2 das unidades 3,6-anidrogalactose podem contribuir
para atividade antiviral.
Como ambas galactanas apresentam similar massa molar, estrutura
química e grau de sulfatação (G3d = 29,4% e M3a = 29,0%), fatores
conformacionais decorrentes da distribuição das díades de iota/kappa- e nu-
carragenana ao longo destes polímeros podem ser responsáveis pela atividade
diferencial destas carragenanas. A maior percentagem de iota- e menor
percentagem de kappa- e nu-carragenana podem conferir à galactana M3a
conformação mais efetiva para interação com a glicoproteína gC, responsável pela
inibição da adsorção viral.
Em resumo, as carragenanas de G. griffithsiae e M. gelidium são potentes
inibidores da adsorção do vírus da herpes simplex à célula hospedeira,
apresentam alto índice de seletividade e por estas razões são promissores
agentes profiláticos para uso tópico contra infecções genitais pelo HSV-2.
163
5.0. CONCLUSÕES
1- A partir da alga vermelha Meristiella gelidium (Solieriaceae, Gigartinales)
mediante extração aquosa a 25
o
C e a 100
o
C e tratamento com KCl, foram obtidas
as carragenanas M1a, M2b e M3a com massa molar média (Mw) 425.600 ;
950.800 e 956.700 g/mol, respectivamente.
Análises espectroscópicas (RMN de
13
C e FT-IR) e as análises de metilação
confirmaram que estas carragenanas são constituídas: 84% das díades em M1a e
M3a são de iota-carragenana e díades de kappa- e nu-carragenana, estão
presentes em baixa percentagem 4 % e 6-8%, respectivamente.
Além das carragenanas a alga M. gelidium sintetiza agaranas solúveis em
KCl 2M que foram purificadas mediante cromatografia DEAE-Sephacel originando
as agaranas M3S-3 e M3S-4.
A agarana M3S-3 (Mw = 187.000 g/mol) apresenta ~40% das unidades A 2-
O-sulfatadas enquanto as unidades B são ~87% substituídas em C-3 por grupos
sulfato, as quais estão em parte substituídas em C-2 por unidades simples de
xilose (~30%) ou grupos sulfato (~18%).
Características estruturais semelhantes, em relação ao padrão de
sulfatação foram determinadas para agarana M3S-4 (Mw = 61.430 g/mol). Nesta,
~60% das unidades A estão representadas por β-D-galactose 2-sulfato e, ~ 75%
das unidades B por α-L-galactose 3-sulfato. De modo diferente, unidades simples
de xilose glicosilam o C-6 de parte das unidades A. Ressalta-se que estas
características estruturais (β-D-galactose 2-sulfato ligada à α-L-galactose 3-sulfato)
são descritas pela primeira vez.
2- O extrato bruto M1 obtido da alga M. gelidium, constituído majoritariamente por
iota-carragenana (1,0%; 120mM de KCl) forma gel, com temperatura de transição
acima de 45
o
C e sem histerese.
As misturas iota-carragenana (5 g/L) e amidos (20 g/L), quando os
biopolímeros foram autoclavados juntos sem pré-aquecimento e sem sal, soluções
viscoelásticas foram obtidas com os amidos de milho comum, amido de milho rico
164
em amilose e amido de milho rico em amilopectina. De modo distinto com o amido
de cará um gel foi formado.
Nos sistemas iota-carragenana e amido de milho comum, amido de milho
rico em amilose e amido de milho rico em amilopectina, efeito sinérgico mais
intenso ocorreu em função da temperatura, entre 45 − 85°C, nesta faixa a
diferença entre os módulos foi maior.
A iota-carragenana evitou a histerese térmica na mistura com o amido de
milho rico em amilose Com o amido de milho comum não ocorreu alteração do
comportamento e com o amido de cará a histerese não foi evitada na pasta
formada.
O processo de autoclavação dos polissacarídeos juntos (amido de cará e
iota-carragenana) é importante, pois permite maior solubilização do amido
originando um gel e não solução viscoelástica.
O pré-aquecimento dos biopolímeros influência aumentando a força do gel,
possivelmente ocasionado pela maior solubilidade do amido originando um gel
mais forte, porém com intensa histerese térmica.
Já a presença de sal (KCl 120 mM) no sitema estabiliza a hélice da
carragenana e a rede formada entre os biopolímeros é melhor, forma-se uma rede
mais estável e um gel sem histerese térmica.
Nos sistemas avaliados destacam-se as pastas formadas entre a iota-
carragenana e amido de milho rico em amilose e amido de Cará que apresentam
propriedades reológicas mais interessantes para fins industriais (ausência de
histerese e aumento da força do gel, respectivamente).
3- Atividade antiviral contra o vírus da herpes simplex e vírus da dengue foi
avaliada utilizando as carragenanas e/ou agaranas de Meristiella gelidium e
Gymnogongrus griffithsiae.
Diversas frações obtidas de G. griffithsiae apresentaram atividade
antiherpética frente a diferentes cepas de HSV-1 e HSV-2 e são desprovidas de
citotoxicidade contra células Vero (CC
50
>1000 µg/mL). O extrato bruto G3 e a
165
carragenana G3d (iota/kappa/nu-carragenana 70/14/16%, respectivamente)
apresentaram potente atividade antiherpética (IC
50
~1 µg/mL). Estes compostos
atuam inibindo a etapa de adsorção do vírus à células hospedeira.
As carragenanas M1, M3 e M3a isoladas de M. gelidium apresentam
potente atividade contra HSV-2 (IC
50
0,04 – 0,06 µg/mL) e são desprovidas de
atividade citotóxica (CC
50
> 1000 µg/mL).
A carragenana M3a de M. gelidium apresentou maior atividade contra HSV-
2 e DENV-2 (frente à células Vero) que a carragenana G3d de G. griffithsiae.
Ambas galactanas apresentam similar grau de sulfatação, massa molar e estrutura
química. Fatores conformacionais decorrentes da proporção e distribuição das
díades de iota/kappa- e nu-carragenana ao longo destes polímeros podem ser
responsáveis pela atividade diferencial destas carragenanas.
A carragenana M3a isolada de M. gelidium é o composto que apresenta
maior índice de seletividade relatado na literatura (IS 25000) sendo, portanto um
composto promissor na profilaxia contra o herpes genital HSV-2.
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