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MARCELO CONSTANTINO ASSUMPÇÃO
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA NtrX DE Azospirillum brasilense
Tese apresentada à Coordenação do curso de
Pós-Graduação em Ciências – Bioquímica,
como requisito parcial para a obtenção do
grau de Doutor em Ciências – Bioquímica.
Orientadora: Profª. Elaine Machado Benelli
Co-orientador: Prof. Fábio de Oliveira Pedorsa
CURITIBA
2007
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MARCELO CONSTANTINO ASSUMPÇÃO
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA NtrX DE Azospirillum brasilense
CURITIBA
2007
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Dedicado à memória de
Hamilton Constantino e
Antônio Assumpção.
AGRADECIMENTOS
Auxílio financeiro: CNPq, CAPES, PRONEX, Fundação Araucária e Paraná
Tecnologia;
Aos orientadores professora Elaine Machado Benelli e professor Fábio de
Oliveira Pedrosa;
Ao professor Emanuel Maltempi de Souza pela leitura e sugestões da tese e
do artigo;
Ao professor M. Geoffrey Yates pela leitura crítica do artigo;
Às professoras Rose Adele Monteiro e Maria Berenice R. Steffens pela leitura
crítica da tese na banca interna;
Aos professores membros da banca de defesa de tese: Professora Luciane
Passaglia, professor Hernán Terenzi, professora Cyntia M. Fadel Pichet e professora
Rose Adele Monteiro, pela leitura da tese e participação na banca de defesa;
Aos demais professores do grupo de Fixação Biológica de Nitrogênio;
Ao apoio técnico: Valter A. de Baura, Roseli Prado e Julieta Pie;
Aos demais professores do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular;
Ao professor Marco F. M. Corrêa pela ajuda nas análises estatísticas;
À Coordenação do curso de Pós-Graduação em Bioquímica;
Aos amigos do laboratório 275: Ana C, Magda, Ju Inaba e Gus;
Aos demais colegas de laboratório;
Aos meus pais, irmãos e familiares;
À minha namorada querida Gisele!
SUMÁRIO
Lista de Tabelas.......................................................................................... vii
Lista de Figuras........................................................................................... vii
Resumo....................................................................................................... ix
Abstract....................................................................................................... x
1
INTRODUÇÃO............................................................................................ 1
1.1 Transdução de sinal em bactérias.............................................................. 1
1.2 Sistemas de dois-componentes.................................................................. 1
1.3 Ativação da transcrição via proteínas reguladoras de resposta (RR)......... 4
1.3.1 Características estruturais das EBPs.......................................................... 5
1.3.2 Domínio regulatório..................................................................................... 7
1.3.3 Domínio central: AAA+................................................................................ 8
1.3.4 Domínio C-terminal: HTH............................................................................ 10
1.4 Sistema de dois-componentes em microrganismos fixadores de
nitrogênio.................................................................................................... 12
1.5 O sistema NTR............................................................................................ 13
1.6 O operon ntrYX........................................................................................... 16
1.7 Justificativa.................................................................................................. 19
2
OBJETIVO.................................................................................................. 20
2.1 Objetivos específicos.................................................................................. 20
3
MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 21
3.1 Microrganismos e plasmídeos.................................................................... 21
3.2 Meios de cultivo.......................................................................................... 22
3.3 Antibióticos.................................................................................................. 23
3.4 Condições de cultivo e estoques de bactérias............................................ 23
3.5 Manipulação do DNA.................................................................................. 23
3.5.1 Mini-preparação de plasmídeos.................................................................. 23
3.5.2 Preparação rápida de plasmídeos.............................................................. 24
3.5.3 Clivagem do DNA por endonucleases de restrição.................................... 24
3.5.4 Purificação de DNA em gel de agarose de baixo ponto de fusão............... 25
3.5.5 Ligação........................................................................................................ 25
3.5.6 Transformação bacteriana.......................................................................... 26
a. Preparo de células eletrocompetentes................................................. 26
b. Eletroporação....................................................................................... 26
3.5.7 Eletroforese de DNA em gel de ágar e agarose......................................... 26
a. Eletroforese analítica........................................................................... 26
b. Eletroforese preparativa....................................................................... 27
3.6 Obtenção da proteína NtrX S.Tag N-truncada de A. brasilense................. 27
3.6.1 Clonagem do gene ntrX N-truncado no vetor de expressão pET29a+....... 27
3.6.2 Indução da superexpressão da proteína NtrX S.Tag N-truncada............... 28
3.6.3 Dosagem de proteínas totais...................................................................... 29
3.6.4 Eletroforese de proteína em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)................ 29
3.6.5 Solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada........................................ 30
3.6.6 Purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada.......................................... 31
3.6.7 Purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada por ligação específica
à agarose – S.Tag....................................................................................... 32
3.7 Caracterização da proteína NtrX S.Tag N-truncada................................... 33
3.7.1 Análise estrutural dos domínios da proteína NtrX de A. brasilense............ 33
3.7.2 Análise da proteína NtrX S.Tag N-truncada por espectrometria de massa
tipo MALDI-ToF/MS.................................................................................... 33
3.7.3 Determinação da atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag
N-truncada.................................................................................................. 34
3.8 Análises estatísticas.................................................................................... 35
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 36
4.1 Análise estrutural dos domínios da proteína NtrX de A. brasilense............ 36
4.2 Clonagem do gene ntrX N-truncado no vetor de expressão pET29a+....... 50
4.3 Indução da superexpressão da proteína NtrX S.tag N-truncada................ 50
4.4 Purificação da proteína NtrX S.tag N-truncada........................................... 55
4.5 Análise da proteína por espectrometria de massa tipo MALDI-ToF/MS..... 57
4.6 Determinação da atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag
N-truncada.................................................................................................. 59
5
CONCLUSÕES........................................................................................... 65
6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Bactérias e plasmídeos......................................................................... 21
Tabela 2
Passos de purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada expressa
em E. coli estirpe BL21AI...................................................................... 56
Tabela 3
Valores das massas moleculares dos peptídeos detectados pelo
espectrômetro de massa tipo MALDI-ToF/MS...................................... 58
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Ativação da transcrição de genes dependentes de proteínas
EBPs-RRs.......................................................................................... 6
Figura 2
Estrutura e organização dos domínios AAA+..................................... 11
Figura 3
Esquema da regulação da fixação de nitrogênio e da utilização de
fontes alternativas de nitrogênio pelo sistema NTR em A.brasilense 15
Figura 4
Representação esquemática dos domínios funcionais das
proteínas NtrY de A. brasilense......................................................... 18
Figura 5
Representação esquemática dos domínios funcionais das
proteínas NtrX de A. brasilense......................................................... 18
Figura 6
Esquema de clonagem do gene ntrX N-truncado no vetor de
expressão pET29a+........................................................................... 28
Figura 7
Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio
N-terminal da proteína NtrX de A. brasilense..................................... 40
Figura 8
Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio
central da proteína NtrX de A. brasilense.......................................... 42
Figura 9
Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio
C-terminal da proteína NtrX de A. brasilense..................................... 44
Figura 10
Alinhamento da seqüência de aminoácidos da proteína NtrX de
A. brasilense com outras proteínas NtrX............................................ 45
Figura 11
Alinhamento da seqüência de aminoácidos da proteína NtrX de
A. brasilense com proteínas NtrC de A. brasilense, E. coli e S.
typhimurium........................................................................................
46
Figura 12
Alinhamento da seqüência de aminoácidos da proteína NtrX de
A. brasilense com as proteínas NtrC1 de A. aeolicus e DctD de
S. meliloti............................................................................................
47
Figura 13
Modelo estrutural calculado para os domínios funcionais da
proteína NtrX de A. brasilense........................................................... 48
Figura 14
Árvore filogenética das proteínas que apresentam similaridade de
seqüência de aminoácidos com a proteína NtrX de A. brasilense..... 49
Figura 15
Solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada de A. brasilense
superexpressa em diferentes estirpes de E. coli................................ 52
Figura 16
Solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada superexpressa em
E. coli BL21AI..................................................................................... 53
Figura 17
Efeito do DTT na solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada... 54
Figura 18
Perfil da proteína NtrX S.Tag N-truncada após as diferentes etapas
cromatográficas.................................................................................. 57
Figura 19
Cromatograma dos peptídeos produzidos por digestão tríptica da
proteína NtrX S.Tag N-truncada identificados pelo MALDI-ToF/MS.. 58
Figura 20
Gráficos da atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag
N-truncada.......................................................................................... 62
Figura 21
Seqüência de nucleotídeos da região promotora do gene glnB
de A. brasilense.................................................................................. 63
Figura 22
Seqüência de nucleotídeos da região promotora do operon ntrYX
de A. brasilense.................................................................................. 64
RESUMO
A proteína NtrX foi identificada como uma possível proteína ativadora de
transcrição de genes envolvidos no controle metabólico de fontes alternativas de
nitrogênio, atuando como um membro de um sistema de dois componentes NtrYX.
Análises in silico da seqüência de aminoácidos da proteína NtrX mostram que esta
proteína contém um domínio N-terminal regulador, um domínio central pertencente a
família AAA+ e um domínio C-terminal de ligação ao DNA. Para superexpressar e
purificar a proteína NtrX, o gene ntrX, tendo deletados os oito primeiros codons, foi
clonado no vetor pET29a+. A proteína NtrX foi superexpressa com uma fusão S.Tag,
na estirpe de E. coli BL21AI, usando L-arabinose como indutor e purificada por
cromatografia de troca iônica e afinidade. A atividade de ATPase foi medida pelo
acoplamento da conversão de ATP a ADP com a oxidação do NADH. A atividade de
ATPase de NtrX foi estimulada na presença do promotor dependente do fator σ
54
- e
NtrC-dependente dos genes glnBA de A. brasilense. A fosforilação por carbamil-
fosfato também estimulou a atividade de ATPase, de maneira semelhante à proteína
NtrC. Estes resultados sugerem que a proteína NtrX é ativa na forma fosforilada e
que pode haver uma interligação entre os sistemas regulatórios NtrYX e NtrBC em
A. brasilense.
ABSTRACT
The NtrX protein has been identified as a transcriptional activator of genes
involved in the metabolic control of alternative nitrogen sources, acting as a member
of a two-component regulatory system NtrYX. The in silico analysis of the NtrX amino
acid sequence shows that this protein contains an N-terminal receiver domain, a
central AAA+ superfamily domain and a C-terminal DNA-binding domain. To over-
express and purify this protein, the ntrX gene, lacking the first eight codons, was
cloned into the vector pET29a+. The NtrX protein was over-expressed as an S.Tag
fusion protein induced by L-arabinose in the E. coli strain BL21AI and purified by ion
exchange and affinity chromatography. The ATPase activity of NtrX was measured
by coupling the ATP conversion to ADP with NADH oxidation. The ATPase activity of
NtrX was stimulated in the presence of the A. brasilense σ
54
- and NtrC-dependent
promoter of the glnBA gene. Phophorylation by carbamyl-phosphate also stimulated
ATPase, in a manner similar to the NtrC protein. Our results suggest that NtrX is
active in the phosphorylated form and that there may be a cross-talk between the
NtrYX and NtrBC regulatory systems in A. brasilense.
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – Transdução de sinal em bactérias
Bactérias alteram o seu metabolismo, comportamento, a transcrição de genes
e sua morfologia em resposta a flutuações ambientais tais como: a disponibilidade
de aceitadores de elétrons da respiração, suprimento de carbono, nitrogênio, fosfato
ou mudanças na osmolaridade e temperatura do meio. As bactérias detectam estas
variações do meio e as transmitem a alvos intracelulares específicos, como a
maquinaria transcricional, enzimas ou um componente celular, como o sistema
motor flagelar e conseqüentemente adaptam-se às variações do ambiente (WHITE,
1995).
Essas variações ambientais são detectadas por proteínas sinalizadoras
transmembrana, que possuem um domínio detector. Essas proteínas sofrem uma
modificação estrutural quando estimuladas por um sinal externo e transmitem esse
sinal para uma proteína reguladora modificando sua estrutura. A proteína modificada
é a responsável pela resposta ao estímulo externo (WHITE, 1995; STOCK et al,
2000).
A transmissão do sinal extracelular para o meio intracelular pode ocorrer via
um sistema de dois componentes ou por um circuito de fosforilação. No sistema de
dois componentes o domínio sensor de uma proteína quinase (HK), ao reconhecer o
sinal, sofre uma alteração conformacional que resulta na autofosforilação de um
resíduo de histidina. Posteriormente, este fosfato é transferido para um resíduo de
aspartato no domínio regulador da proteína reguladora de resposta (RR). A proteína
reguladora na forma fosforilada é capaz de ativar a transcrição de vários genes
(HOCK, 2000).
No circuito de fosforilação, a transdução do sinal difere do sistema de dois
componentes, pois este circuito participa de vias com várias proteínas de domínios
reguladores e de fosfotransferência. Estes componentes adicionais oferecem mais
alvos para regulação destas vias (HOCK, 2000).
1.2 – Sistemas de dois-componentes
Os sistemas de dois componentes acoplam os mecanismos de estímulo-
resposta e permitem ao organismo sentir e responder a muitas mudanças das
condições ambientais (STOCK, 2000; NIXON et al, 1986; PARKINSON e KOFOID,
1992). Este sistema de sinalização é encontrado em bactérias, archeas e alguns
eucariotos (STOCK et al, 2000).
Os eventos bioquímicos básicos da transdução de sinal nesse sistema foram
primeiro descritos por Ninfa e Magasanik (1986) para o sistema NTR, um sistema
que controla a expressão de genes em resposta à disponibilidade de nitrogênio.
Os sistemas de dois-componentes são constituídos por uma proteína
sensora: uma quinase ou histidina quinase (HPK) e por uma proteína reguladora de
resposta (RR). As HPK são auto-fosforiladas, utilizando o ATP como doador do
grupamento fosfato, em resposta a um sinal específico. Essa fosforilação regula a
atividade da proteína RR (STOCK et al, 2000). Nos sistemas de dois-componentes a
proteína quinase sensora possui um domínio de reconhecimento do sinal com
função de autoquinase. O sinal causa a ativação da autoquinase, hidrólise do ATP e
fosforilação de um resíduo de histidina localizado no sub-domínio de
fosfotransferência. Em seguida, este sub-domínio transfere o grupo fosforil para o
resíduo de aspartato localizado no domínio de fosforilação da proteína reguladora de
resposta.
As sensoras HPK podem estar localizadas na membrana celular contendo um
sensor extracelular ou no citoplasma contendo um sensor intracelular (BOURRET et
al, 1991). Essas proteínas operam como dímeros que se autofosforilam após
perceber o estímulo externo. As HPK interagem com as proteínas RR e transferem o
seu grupamento fosfato, geralmente de um resíduo de histidina para um resíduo de
aspartato da proteína RR, em uma reação catalisada pela própria proteína RR. Os
efetores RR operam como oligômeros que catalisam a formação do complexo aberto
de transcrição utilizando ATP e interagindo com a RNA polimerase holoenzima
ativando a transcrição de genes em resposta ao estímulo detectado pela proteína
HPK (CHANG e STEWART, 1998).
Algumas HPK possuem atividade de fosfatase, podendo catalisar a
defosforilação da proteína reguladora de resposta (RR). Essa defosforilação parece
envolver um mecanismo que é distinto do reverso da reação de fosfotransferência
HPK-RR (CHANG e STEWART, 1998; STOCK et al, 2000). Esse processo envolve
três reações de fosfotransferência e a formação de dois intermediários:
1. Autofosforilação: HPK-His + ATP HPK-His~P + ADP
2. Fosfotransferência: HPK-His~P + RR-Asp HPK-His + RR-Asp~P
3. Defosforilação: RR-Asp~P + H
2
O RR-Asp + Pi
Estas três reações requerem íons metálicos divalentes, sendo Mg
+2
o
provável cátion utilizado in vivo (STOCK et al, 2000).
As histidinas-quinase (HK) são cataliticamente semelhantes às
serina/treonina/tirosinas-quinase. Entretanto, nas serina/treonina/tirosinas-quinase,
um fosfoester é formado, enquanto que nas histidinas-quinase forma-se uma
fosfoamida. A hidrólise de uma fosfoamida tem uma variação de energia livre (ΔG)
mais negativa que a hidrólise do fosfoester (STOCK et al, 1990).
A fosforilação das proteínas reguladoras em um resíduo de aspartato produz
um acilfosfato de alta energia (STOCK et al, 2000). A formação deste acilfosfato
provavelmente direciona as mudanças conformacionais desta proteína. Assim, o
fosfato ligado ao aspartato difere dos fosfatos ligados a serina e treonina, os quais
alteram a atividade da proteína pelo efeito eletrostático local (HURLEY et al, 1990;
JOHNSON e O’REILLY, 1996).
O alinhamento das seqüências de aminoácidos das HPK mostra que esta
classe de proteínas contém um domínio de 250 aminoácidos responsável pela
transferência do grupamento fosfato. Este domínio apresenta atividade de
autoquinase e fosfatase e contém o resíduo de histidina que é fosforilado
(BOURRET et al, 1991).
Análises de seqüências de aminoácidos das proteínas RR mostram que estas
proteínas têm um domínio de aproximadamente 110 aminoácidos que contém um
resíduo aspartato que é fosforilado pelas HPK. Em algumas proteínas RR, esse
domínio está fundido com outro domínio de atividade efetora (PARKINSON e
KOFOID, 1992). Esse domínio efetor é responsável pela ligação ao DNA e ativação
da transcrição, bem como a interação com os outros componentes da maquinaria de
transcrição, enquanto o domínio de fosforilação é responsável pela interação com a
proteína HPK (HAKENBECK e STOCK, 1996).
Em bactérias, a transdução de sinal em resposta a uma grande variedade de
estímulos do ambiente é mediada por pares de proteínas que se comunicam uma
com a outra por um mecanismo conservado envolvendo fosforilação de proteínas.
Alguns desses sistemas foram identificados e caracterizados em diferentes
microrganismos, como o sistema de osmoregulação EnvZ/OmpR (MIZUNO et al,
1982), quimiotaxia CheA/CheY-CheB (SANDERS et al, 1989), controle da
esporulação Spo0F-Spo0B-Spo0A (PEREGO et al, 1989), regulação da expressão
do regulon fosfato PhoR/PhoB (MAKINO et al, 1986), controle da fixação de
nitrogênio FixL/FixJ (TUCKERMAN et al, 2001) e metabolismo de fontes alternativas
de nitrogênio em Azospirillum brasilense NtrB/NtrC (MACHADO et al, 1995) e
NtrY/NtrX (PAWLOWSKI et al, 1991; ISHIDA et al, 2002).
1.3 – Ativação da transcrição via proteínas reguladoras de resposta (RR)
Na transdução de sinal via sistemas de dois componentes, o sinal extracelular
é recebido pela proteína quinase (HK) e transmitido por fosforilação para a proteína
reguladora de resposta (RR), que ativará a expressão de vários genes que codificam
proteínas envolvidas na resposta ao estímulo externo. Assim, o controle da
transcrição de genes estabelece uma resposta coordenada as modificações
ambientais (SCHUMACHER et al, 2006).
O principal ponto de controle da transcrição ocorre ao nível da iniciação,
processo no qual a RNA polimerase é isomerizada para promover a formação do
complexo aberto na região promotora do gene. A RNA polimerase holoenzima é
formada pelas subunidades α
2
ββ’ω, que formam o núcleo do complexo e associa-se
a uma das subunidades sigma, como: σ
70
, σ
28
, σ
32
e σ
54
, que apresentam
especificidade por seqüências de nucleotídeos diferentes, direcionando a RNA
polimerase holoenzima para diferentes tipos de promotores (STUDHOLME e DIXON,
2003).
As RNA polimerase σ
70
ligam-se a seqüências nas regiões promotoras,
posicionadas a –35 e –10 pares de base do início de transcrição. Em geral, estes
promotores não requerem proteínas ativadoras de transcrição e a regulação da
transcrição, neste caso, ocorre via proteínas reguladoras que bloqueiam a ligação da
RNA polimerase σ
70
ao promotor ou a recrutam (revisado por SCHUMACHER et al,
2006).
Já as RNA polimerase σ
54
ligam-se a promotores nas posições –24 (GG) e
–12 (GC) do início de transcrição e o complexo formado com o DNA permanece na
forma fechada até que oligômeros da proteína ativadora de transcrição liguem-se ao
DNA + 100 pares de base a montante do início de transcrição, na região
denominada UAS (upstream activator sequence). O dobramento do DNA possibilita
que a proteína ativadora toque o complexo fechado. Quando isso ocorre, a proteína
ativadora catalisa a hidrólise de nucleotídeos trifosfato e o complexo aberto é
formado (BUCK et al, 2000; Figura 1). Como as proteínas ativadoras assemelham-se
as “enhancer-binding proteins” de eucariotos (EBPs), elas foram denominadas de
EBPs de procariotos (revisado por STUDHOLME e DIXON, 2003).
1.3.1 – Características estruturais das EBPs
Estruturalmente as EBPs apresentam domínios semelhantes. Na região N-
terminal, elas apresentam um domínio regulatório, que é o mais variável entre as
EBPs pode estar presente; na região central, as EBPs apresentam um domínio
AAA+ (chaperone-like ATPase), responsável pela ligação ao fator σ
54
da RNA
polimerase e pela hidrólise do ATP; e na região C-terminal possuem um domínio de
ligação ao DNA que apresenta um motivo hélice-volta-hélice (HTH), que possibilita a
interação da proteína com o DNA (UAS).
Figura 1: Ativação da transcrição de genes dependentes de proteínas EBPs-RRs
A
B
C
D
E
F
A
B
C
A
B
C
D
E
F
Esquema da ativação da transcrição de genes dependentes de proteínas EBPs-RRs. (A):
isomerização da RNA polimerase, (B): Formação do complexo RNA polimerase holoenzima, (C):
ligação da proteína no sítio UAS, (D): dobramento do DNA e interação da proteína ativadora com a
RNA polimerase holoenzima e formação do complexo fechado, (E): formação do complexo aberto,
com a hidrólise de um ATP e (F): desligamento da proteína ativadora e do fator sigma e início da
transcrição. Adaptado de DIXON e KAHN, 2004.
1.3.2 – Domínio regulatório
De acordo com o tipo de domínio regulatório presente nas EBPs, Studholme e
Dixon (2003) dividem estas proteínas nas seguintes classes:
a) EBPs que não apresentam domínio regulatório ou sensor. A proteína PspF
(phage shock protein F) de enterobactérias, juntamente com as proteínas
HrpR/HrpS reguladoras de genes envolvidos na patogenicidade de
Pseudomonas syringae não apresentam domínio regulatório, e a atividade
destas proteínas é controlada por outra proteína, PspA e HrpV,
respectivamente;
b) EBPs que são proteínas reguladoras da resposta de sistemas de dois
componentes. Os exemplos melhor descritos desta classe são as proteínas
NtrC (proteína reguladora da assimilação de nitrogênio) e a DctA (proteína
reguladora do transporte de ácidos dicarboxílicos). Ambas são ativadas por
fosforilação de um resíduo de aspartato deste domínio. A fosforilação de NtrC
causa oligomerização e ativação da transcrição, enquanto que a fosforilação
de DctA alivia a inibição que o domínio N-terminal exerce sobre o domínio
AAA+;
c) EBPs que contém componentes do sistema PTS (sistema de
fosfotransferência). As proteínas desta classe apresentam um domínio PRD
(PTS regulation domain);
d) EBPs que contém domínios: GAF, PAS e ACT.
O domínio GAF foi primeiramente identificado na proteína FhlA de E. coli que
é uma fosfodiesterase-adenilato ciclase que liga o cGMP neste domínio que é o não
catalítico. Este domínio também é encontrado na EBP NifA, que é a ativadora
transcricional dos genes nif envolvidos na síntese do complexo da nitrogenase de
bactérias diazotróficas.
O domínio PAS (Per, ARNT e Sim) apesar da baixa similaridade de seqüência
é estruturalmente semelhante ao domínio GAF. Este domínio detecta sinais através
da ligação com cofatores: heme, flavina e 4-hidroxicinamoil.
O domínio ACT (aspartato-quinase e corismato mutase) é encontrado em
uma ampla faixa de enzimas metabólicas que são reguladas pela concentração de
aminoácidos. Um par deste domínio liga-se especificamente a um aminoácido
regulando a atividade das enzimas relacionandas.
1.3.3 – Domínio central: AAA+
Proteínas que apresentam o domínio AAA+ estão presentes em todos os
reinos (HANSON e WHITEHEART, 2005). Este domínio é formado por dois
subdomínios: N-terminal (α/β Rossman) e um C-terminal (α−hélices) (Figura 2). O
subdomínio α/β Rossman é formado por cinco fitas β, formando uma folha β-
paralela, e conectadas por cinco α−hélices. O subdomínio α−hélices é formado por
várias α−hélices, que distingue as proteínas da família AAA+ das demais proteínas
que ligam nucleotídeos.
Na região N-terminal do domínio α/β Rossman encontra-se um motivo
denominado de N-linker que pode ser de dois tipos: um contendo a seqüência
glicina-glicina e outro com resíduos hidrofóbicos seguidos por glicina. Esta região é
flexível e, provavelmente, está envolvida na propagação das mudanças
conformacionais dependentes de nucleotídeos para outros domínios da proteína
(revisado por HANSON e WHITEHEART, 2005).
O subdomínio α/β Rossman contém os motivos Walker A (P-loop) e Walker B
e uma seqüência característica, denominada mínimo consenso de AAA+, que
distingue esta classe de proteínas de outras P-loop ATPases (NEUWALD et al,
1999). Outra característica que as diferenciam das P-loop ATPases é a presença de
pelo menos uma α-hélice adicional entre os motivos Walker A e B (Figura 2), que é
responsável pela interação com a subunidade sigma-54 da RNA polimerase. Este
motivo é chamado GAFTGA.
Na região C-terminal do motivo Walker B, existe um motivo denominado de
região de homologia secundária (SRH). Nesta região a seqüência primária é pouco
conservada, entretanto, há características estruturais conservadas entre as EBPs:
região sensora I e dedos de arginina (Figura 2). Os resíduos da região sensora I,
especialmente um resíduo polar conservado posiciona-se entre os motivos Walker A
e B e interage com Walker B e γ-fosfato do ATP. Mutações neste resíduo bloqueiam
a hidrólise do ATP. Dois resíduos de arginina podem ser encontrados nos dedos de
arginina das proteínas da família AAA+, mas somente um deles aparece em todas
as proteínas desta família. Na estrutura oligomérica, os dedos de arginina de uma
subunidade fazem parte do sítio de ligação de nucleotídeos da subunidade
adjacente. Estes resíduos estão envolvidos na hidrólise de nucleotídeos e/ou
propagação de mudanças conformacionais para a forma de hexâmero (revisado por
HANSON e WHITEHEART, 2005).
Um resíduo de lisina do motivo Walker A (P-loop GxxxxGKLT/S) é
responsável pela interação com o γ-fosfato do ATP. No motivo Walker B (hhhhDE), o
resíduo de aspartato é responsável pela interação com o magnésio e o resíduo de
glutamato é responsável pela interação com a água, fatores essenciais para a
hidrólise do ATP (HANSON e WHITEHEART, 2005; revisado por SCHUMACHER et
al, 2006). Aminoácidos essenciais para a atividade de ATPase estão presentes no
motivo GAFTGA das proteínas da família AAA+. Esta característica do motivo
GAFTGA explica o controle de ligação ao fator sigma pela interação com o ATP.
Mutações em resíduos de aminoácidos das regiões de mínimo consenso de AAA+
mostram a perda da atividade de ATPase, mas não da interação com o ATP,
mostrando que a oligomerização é essencial para a atividade de ATPase (HANSON
e WHITEHEART, 2005). As proteínas da família AAA+ formam uma estrutura
geralmente hexamérica, que confere características únicas de sua atividade
biológica. Uma delas é o posicionamento do sítio de ligação do ATP na interface das
subunidades com a holoenzima (HANSON e WHITEHEART, 2005). De acordo com
este arranjo estrutural, uma cavidade central é formada, expondo aminoácidos da
região entre os motivos Walker A e B na superfície do poro, que são responsáveis
pela ligação do substrato. Mutações nestes aminoácidos afetam a ligação e
processamento do substrato, sem afetar a oligomerização ou a atividade de ATPase
(YAMADA-INAGAWA et al, 2003).
Mutações no motivo GAFTGA mostram a incapacidade de formar o complexo
aberto, mas não na hidrólise do ATP, que é semelhante ao da proteína selvagem
(CHANEY et al, 1999; SCHUMACHER et al, 2004). Experimentos com a formação
de oligômeros estáveis e interação com fator sigma mostram a preferência de
interação do fator sigma 54 com proteínas oligomerizadas (CHANEY et al, 1999).
Mutação no aminoácido chave do motivo Walker A mostra a perda da capacidade de
ligação do ATP (MATVEEVA et al, 1997; BABST et al, 1998). Mutação no
aminoácido chave do motivo Walker B mostra a perda da capacidade de hidrólise do
ATP, causando a ligação, mas não a liberação do substrato (KARATA et al, 1999;
STEEL et al, 2000; HATTENDORF e LINDQUEST, 2002).
Na região C-terminal do subdomínio α−hélices, encontra-se a região sensora
II (Figura 2). Um resíduo de arginina deste motivo participa diretamente da interação
com o γ-fosfato do ATP.
1.3.4 – Domínio C-terminal: HTH
O domínio C-terminal é responsável pelo reconhecimento da UAS. Os
domínios hélice-volta-hélice (HTH) das proteínas ZraR e NtrC formam dímeros por
interações entre α−hélices de forma semelhante a Fis (PELTON et al, 1999; SALLAI
e TUCKER, 2005).
Figura 2: Estrutura e organização dos domínios AAA+
A
Sub-domínio α-hélices
Sub-domínio
α/β Rossman
A
Sub-domínio α-hélices
Sub-domínio
α/β Rossman
Mudança conformacional
fosfato
Mg e H
2
O
sigma-54
Walker B
fosfato
Hidrólise de ATP
Hexâmero
fosfato
GAFTGA
B
Mudança conformacional
fosfato
Mg e H
2
O
sigma-54
Walker B
fosfato
Hidrólise de ATP
Hexâmero
fosfato
Mudança conformacional
fosfato
Mg e H
2
O
sigma-54
Walker B
fosfato
Hidrólise de ATP
Hexâmero
fosfato
GAFTGA
B
strutura esquemática do domínio AAA+. (A): Topologia de um domínio AAA+ e seus sub-
domín
*
*
*
*
C
*
*
*
*
C
DD
E
ios; (B): Estrutura secundária e motivos funcionais de um domínio AAA+, mostrando a posição
de cada motivo sobreposto às α-hélices (retângulos) e folhas β (flechas). Os aminoácidos importantes
dentro de cada motivo estão destacados; (C): Estrutura tridimensional do domínio AAA+, mostrando a
disposição dos motivos funcionais e o sítio catalítico (*); (D): Estrutura oligomérica do domínio AAA+.
Adaptado: HANSON e WHITEHEART, 2005.
1.4 – Sistema de dois-componentes em microrganismos fixadores de
ção biológica de nitrogênio consiste na conversão do N
2
atmosférico em
amônia
o catalítico responsável pela redução do
dinitrog
NITROGENASE
3
+ H
2
+ 16MgADP + 16Pi
Em Azospirillum brasilense, um mínimo de dois MgATP são hidrolisados por
elétron
proteína NifA,
que é
e dois-componentes NtrB/NtrC
respon
nitrogênio
A fixa
. Este processo não é realizado por eucariotos, mas é amplamente
distribuído entre bactérias e archeas. Os organismos diazotrofos (fixadores de
nitrogênio) são encontrados em uma ampla variedade de habitats, na forma de vida
livre no solo e água, em simbioses associativas com gramíneas, simbioses de
cianobactérias com várias plantas e nódulos simbióticos nas raízes de leguminosas
(revisado por DIXON e KAHN, 2004).
A nitrogenase é o complex
ênio a amônia, de acordo com a seguinte equação:
N
2
+ 8e
-
+ 8H
+
+ 16MgATP 2NH
transferido para cada passo de catálise. Assim, a síntese do complexo da
nitrogenase (proteína Fe e proteína Fe-Mo) é rigidamente controlada a nível
transcricional em resposta a disponibilidade de nitrogênio fixado. Além disso, a
nitrogenase é sensível ao oxigênio e suscetível a regulação pós-traducional mediada
pela ADP ribosilação da proteína Fe pela DraT (dinitrogenase redutase ADP-
ribosiltransferase). Esta modificação covalente é revertida pela DraG (dinitrogenase
redutase ativando glicohidrolase; revisado por DIXON e KAHN, 2004).
Em proteobactérias, a expressão dos genes nif é ativada pela
um membro das EBPs e juntamente com a RNA polimerase σ
54
é capaz de
ligar-se a UAS dos genes nif e iniciar a transcrição. A expressão de NifA é
controlada pelo sistema NTR (ARSENE et al, 1996).
Presente em vários procariotos, o sistema d
de aos níveis extracelulares de nitrogênio (HANKENBECK e STOCK, 1996;
XU e HOOVER, 2001; PIOSZAK e NINFA, 2004). A proteína NtrB é a proteína
sensora citoplasmática e a sua percepção dos níveis de nitrogênio envolve a
participação de proteínas do tipo PII. Em Azorhizobium caulinodans, os níveis de
amônia são detectados pelos sistemas NtrB-NtrC e NtrY-NtrX, onde NtrY é a
proteína sensora transmembrana que fosforila ou defosforila a proteína NtrX
dependendo dos níveis de amônia extracelular (PAWLOWSKI et al, 1991).
Em A. caulinodans, os níveis de oxigênio são detectados pelo sistema FixL-
FixJ,
.5 – O sistema NTR
itrogênio por microrganismos diazotrofos é um processo
depen
ma NTR é constituído pelas proteínas GlnB (PII), NtrB, NtrC, GS
(glutam
erobactérias, quando a concentração de amônia intracelular é
limitan
onde FixL é a proteína sensora que, fosforila a proteína FixJ. Estes sistemas
atuam em genes diferentes em diferentes microrganismos. Em Azorhizobium
caulinodans, os sistemas NtrBC, FixLJ e NtrYX regulam a expressão do gene nifA.
Em Sinorhizobium meliloti, o sistema FixLJ regula a expressão dos genes nifA e fixK
(TON-HOANG et al, 2001). Em Klebsiella pneumoniae, o sistema NtrBC regula a
expressão dos genes envolvidos no metabolismo de fontes alternativas de
nitrogênio, a expressão do operon nifLA e sua própria expressão.
1
A fixação de n
dente de fatores ambientais, tais como baixas tensões de oxigênio e
nitrogênio fixado, molibdênio, ferro, enxofre e temperatura adequada, que são
detectados por proteínas que fazem parte de sistemas de transdução de sinal
(POSTGATE, 1982), chamado sistema NTR. O sistema NTR está envolvido também
na regulação do metabolismo de outras fontes de nitrogênio, como nitrito, nitrato e
aminoácidos, justificando sua presença também em bactérias não diazotróficas,
como E. coli.
O siste
ina sintetase), GlnD (uridilil transferase e removedora de uridilil), GlnE
(adenilil transferase e removedora de adenilil) e GlnK ou, em A. brasilense GlnZ.
Estas proteínas agem em cascata em reações dependentes da razão intracelular de
2-oxoglutarato e glutamina. O par de proteínas quinase e reguladora NtrB/NtrC,
constituem o sistema de dois-componentes neste caso (revisado por DIXON e
KAHN, 2004).
Em ent
te, a relação glutamina/2-oxoglutarato é baixa, a proteína GlnD tem atividade
de uridililtransferase (UTase) e promove a uridililação do resíduo de tirosina 51 da
proteína GlnB (ATKINSON et al, 1994). A proteína GlnB uridililada (GlnB-UMP) não
interage com a proteína NtrB que sofre autofosforilação no resíduo de histidina 139
(WEISS e MAGASANIK, 1988). Este grupamento fosforil é então transferido da
proteína NtrB (histidina quinase) para o resíduo de aspartato 54 do domínio N-
terminal da proteína NtrC (RR), ativando-a (SANDERS et al, 1992; KLOSE et al,
1993). Assim, NtrC-P ativa a transcrição dos promotores dependentes de σ
54
(rpoN
ou NtrA)
e dos genes envolvidos no metabolismo de fontes alternativas de
nitrogênio. GlnB-UMP é capaz de interagir com GlnE e catalisa a desadenililação da
GS, ativando-a e a bactéria passa a sintetizar glutamina (de ZAMAROCZY et al,
1993).
Quando os níveis de amônia aumentam, a concentração de glutamina é alta e
proteín
e o sistema NTR possui proteínas tipo PII (GlnB e GlnZ) e
dois si
sistem
níveis
de nitr
K de
entero
a GlnD tem atividade de enzima removedora de uridilil e desuridilila a proteína
GlnB. Na forma desuridililada, GlnB interage com a proteína NtrB, estimulando a
atividade de fosfatase desta proteína, a qual catalisa a remoção do grupamento
fosforil da proteína NtrC-P, inativando-a (NINFA e ATKINSON, 2000;
ARCONDÉGUY et al, 2001). NtrC é incapaz de ativar a transcrição dos genes
envolvidos no metabolismo de fontes alternativas de nitrogênio e dos genes
dependentes do fator σ
54
da RNA polimerase. A proteína GlnB livre interage com
GlnE, que catalisa a adenililação do resíduo de tirosina 397 da GS, inativando-a
(MAGAZANIK, 1988).
Em A. brasilens
stemas de transdução de sinal (NtrBC e NtrYX) (Figura 3).
Um gene semelhante ao glnD foi isolado neste organismo, sugerindo que o
a NTR de A. brasilense responde aos níveis de glutamina e 2-oxoglutarato de
forma semelhante a enterobactérias (VAN DOMMELEN et al, 2002; Figura 3).
Em A. brasilense a expressão da proteína NifA sofre regulação pelos
ogênio e oxigênio no meio (LIANG et al, 1991; FADEL-PICHETH et al, 1999).
A atividade de NifA requer a proteína GlnB (ARSENE et al, 1996) e provavelmente o
domínio N-terminal de NifA está envolvido na interação com GlnB (Figura 3). Esta
proteína, ainda, é regulada pelos altos níveis de amônia e oxigênio. Mutação do
resíduo (Tyr18→Phe) do domínio N-terminal de NifA torna a atividade desta proteína
independente de GlnB, mas ainda regulada por amônia (ARSENE et al, 1999).
A proteína GlnZ é uma paráloga da GlnB em A. brasilense, similar a Gln
bactérias (de ZAMAROCZY, 1996). GlnZ é expressa em condições de baixa
concentração de amônia (de ZAMAROCZY, 1998). A análise da seqüência a
montante do gene glnZ revelou a presença de um sítio de ligação para NtrC e uma
seqüência consenso para promotor σ
54
, sugerindo que a expressão de glnZ é
dependente de NtrC, e expressa somente em concentrações de amônia limitantes.
A expressão do gene glnB de A. brasilense é ativada pela proteína NtrC em
condiç
igura 3: Esquema da regulação da fixação de nitrogênio e da utilização de fontes
o esquema original do Prof. Fábio de Oliveira Pedrosa.
ões de amônia limitantes (HUERGO et al, 2003; Figura 3). A proteína GlnB
livre é capaz de interagir com NtrB em condições de excesso de amônia,
favorecendo a defosforilação de NtrC (Figura 3). Entretanto, em baixas
concentrações de amônia no meio, a proteína GlnB-UMP é essencial para a
atividade da proteína NifA, a proteína ativadora dos genes estruturais da nitrogenase
(de ZAMAROCZY, et al, 1993; STEENHOUD e VANDERLEYDEN, 2000; Figura 3).
F
alternativas de nitrogênio pelo sistema NTR em Azospirillum brasilense
σ
70
nifR3 ntrB ntrC
σ
70
ntrY ntrX
σ
70
nifR3 ntrB ntrC
σ
70
ntrY ntrX
Adaptado d
+N
-N
GlnD
UR/UT
NtrB
NtrC
NtrC-P
NtrB-P
-N
+N
NtrY
NtrX
NtrX-P
NtrY-P
-N
+N
σ
54
pNAS
σ
54
pNAR
?
?
?
GlnB
GlnB-UMP
+N
nifA nifB
NifA
NifA – ativa
NifA - inativa
+N/O
2
σ
54
nifHDK
GlnD
UR/UT
NtrB
NtrC
NtrC-P
NtrB-P
-N
+N
NtrY
NtrX
NtrX-P
NtrY-P
-N
+N
σ
54
pNAS
σ
54
pNAR
?
?
?
GlnB
GlnB-UMP
+N
nifA nifB
NifA
NifA – ativa
NifA - inativa
+N/O
2
σ
54
nifHDK
σ
70
nifR3 ntrB ntrC
σ
70
ntrY ntrX
σ
70
nifR3 ntrB ntrC
σ
70
ntrY ntrX
?
?
?
+N/O
2
σ
54
glnB glnA
σ
54
glnB glnA
σ
54
glnZ
Nitrogenase
N
2
+ 8e
-
+ 8H
+
+ 16MgATP
2NH
3
+ H
2
+ 16MgADP + 16Pi
σ
70
+N
-N
+N
-N
GlnD
UR/UT
NtrB
NtrC
NtrC-P
NtrB-P
-N
+N
NtrY
NtrX
NtrX-P
NtrY-P
-N
+N
σ
54
pNAS
σ
54
pNAR
?
?
?
GlnB
GlnB-UMP
+N
nifA nifB
NifA
NifA – ativa
NifA - inativa
+N/O
2
σ
54
nifHDK
GlnD
UR/UT
NtrB
NtrC
NtrC-P
NtrB-P
NtrY
NtrX
NtrX-P
NtrY-P
-N
+N
-N
+N
σ
54
pNAS
σ
54
pNAR
?
?
?
GlnB
GlnB-UMP
+N
nifA nifB
NifA
NifA – ativa
NifA - inativa
+N/O
2
σ
54
nifHDK
? ?
?
+N/O
2
σ
54
glnB glnA
σ
54
glnB glnA
σ
54
glnZ
Nitrogenase
N
2
+ 8e
-
+ 8H
+
+ 16MgATP
2NH
3
+ H
2
+ 16MgADP + 16Pi
σ
70
1.6 – O operon ntrYX
m o sistema regulatório de
ois componentes ntrBC, e em Azorhizobium caulinodans aparenta ser ntr-
LOWSKI et al, 1991). Com o seqüenciamento de diferentes
genom
sos de mutação nos genes ntrX ou ntrC, a
fixação
promotor tipo
σ
70
da
O operon bicistrônico ntrYX possui homologia co
d
controlado (NtrC) (PAW
as bacterianos, genes homológos a ntrYX foram encontrados em diferentes
organismos: Azorhizobium caulinodans (PAWLOWSKI et al, 1991), Zimomonas
mobilis (NCBI, AF176314), Caulobacter crescentus (NIERMAN et al, 2001),
Mesorhizobium loti (NCBI, NC002678), Rickettsia prowazekii (NCBI, AJ235272),
Agrobacterium tumefaciens (NCBI, NC003062), Sinorhizobium meliloti (CAPELA et
al, 2001), Neisseria meningitidis (NCBI, NC003112), Gluconoacetobacter
diazotrophicus (NCBI, AF494454), Rodobacter capsulatus (DREPPER et al, 2006) e
Herbaspirillum seropedicae (Genopar: www.genopar.org).
A proteína NtrX é homologa a proteína NtrC e provavelmente recebe o
grupamento fosforil da proteína NtrY, num sistema semelhante ao das proteínas
NtrB/NtrC (PAWLOWSKI et al, 1991).
Em Azorhizobium caulinodans, NtrY e NtrX são responsáveis pelo controle da
fixação de nitrogênio, na presença de amônia, por regulação da expressão de nifA,
juntamente com NtrB e NtrC. Em ca
de nitrogênio em simbiose e vida livre pode ser mediada pelo produto do
outro gene (PAWLOWSKI et al, 1991). Uma típica seqüência canônica -24 / -12,
dependente de σ
54
, está presente a montante do gene nifA e é importante para a
expressão de nifA (de BRUIJN et al, 1990), sugerindo que tanto NtrC quanto NtrX
possam funcionar como ativadoras de transcrição de NifA em A. caulinodans.
Recentemente, Drepper et al (2006) mostraram que a proteína NtrC de R.
Capsulatus pode ser fosforilada tanto pela proteína NtrB quanto pela proteína NtrY.
Entretanto, ainda não está claro se a proteína NtrY percebe os sinais de nitrogênio
ou se este mecanismo é mediado por GlnB como acontece para NtrB.
O operon ntrYX foi também encontrado em Azospirillum brasilense
(MACHADO, 1995a) e seqüenciado (ISHIDA et al, 2002; ASSUMPÇÃO, 2002). Este
operon está localizado a jusante do operon nifR3ntrBntrC e possui um
RNA polimerase a montante do gene ntrY. O produto do gene ntrY é uma
proteína transmembrana provável sensora de amônia que possui domínios
funcionais que conferem atividade de quinase e fosfatase a esta proteína, e o
produto do gene ntrX é uma proteína reguladora de resposta, homóloga a NtrC, que
possui domínios estruturais que conferem atividade de ATPase, oligomerização e
ativação de transcrição (ASSUMPÇÃO, 2002). A proteína NtrY provavelmente é a
responsável pela ativação da proteína NtrX. Os domínios histidina quinase A (HisKA)
e histidina quinase-like ATPase (H ATPase C) localizados nas regiões central e C-
terminal da proteína NtrY (Figura 4) podem interagir com o ATP, recebendo um
grupamento fosfato que se liga ao resíduo de histidina no domínio His KA. O
domínio H ATPase C possui também a função de transferência deste grupamento
fosfato para o resíduo de aspartato localizado na região N-terminal da proteína NtrX,
que pode sofrer uma mudança conformacional expondo seus domínios AAA+ e
hélice-volta-hélice de interação com o DNA (Figura 5). Com esses domínios
expostos, a proteína poderá ligar-se ao DNA e ativar a transcrição, formando o
complexo aberto de início de transcrição utilizando a energia do ATP e interagindo
com o fator sigma 54 da RNA polimerase (ASSUMPÇÃO, 2002).
A proteína NtrX de A. brasilense é necessária para a expressão de genes
envolvidos no metabolismo de fontes alternativas de nitrogênio, como o nitrato
(VITORINO et al, 2001; ISHIDA et al, 2002). O mutante espontâneo de A. brasilense
HM14, que fixa nitrogênio constitutivamente, é complementado para crescimento em
nitrato e atividade controlada da nitrogenase pelos genes ntrYX. Como neste
mutante o gene glnB é expresso constitutivamente, parece que a proteína NtrX é
necessária para a regulação da síntese da proteína GlnB (VITORINO et al, 2001).
Figura 4: Representação esquemática dos domínios funcionais da proteína NtrY de
. brasilense
2 3 4 5
A
1
Representação dos domínios funcionais da proteína NtrY. Em (1): as regiões transmembrana,
): o domínio de sinalização transmembrana, (3): o domínio de ligação de fatores de sinalização, (4):
domínio de fosforilação e (5): o domínio de fosfotransferência com atividade de ATPase. A região
ho no início da figura representa o peptídeo sinal de ancoragem na membrana (programa
(2
o
em vermel
SMART,
http://smart.embl-hendenberg.de/).
Figura 5: Representação esquemática dos domínios funcionais da proteína NtrX de
. brasilense
1 2 3
A
Representação dos domínios funcionais da proteína NtrX. Em (1): o domínio regulatório de
sforilação, (2): o domínio de interação com fator sigma 54 da RNA polimerase com atividade de
TPase e oligomerização e (3): motivo hélice-volta-hélice de ligação ao DNA (programa SMART,
mart.embl-hendenberg.de/
fo
A
http://s ).
1.7 – Justificativa
Azospirillum brasilense é uma bactéria gram-negativa, diazotrófica aeróbica,
apaz de associar-se às raízes de diversas gramíneas, como milho, trigo, arroz e
orgo (TARRAND et al, 1978).
ias são capazes de utilizar N
2
como fonte única de nitrogênio,
reduzi
sp. em associação às raízes de gramíneas indicam
contrib
(OKON
químicos nitrogenados tem sido uma preocupação cada vez maior
pela p
rorganismos,
c
s
Estas bactér
ndo o N
2
atmosférico a NH
3
sob baixas tensões de O
2
. O nitrato é também
utilizado como fonte única de nitrogênio para crescimento, sendo convertido a NH
3
.
Estudos com Azospirillum
uições significativas de nitrogênio para as plantas associadas (BODDEY et al,
1986), proporcionando um significativo aumento no rendimento da produção de
grãos e aumento do peso seco, fósforo, potássio e nitrogênio total nessas plantas
, 1985). Este aumento na produção e crescimento após inoculação com
Azospirillum tem sido atribuído a um efeito geral no crescimento das raízes e uma
conseqüente melhora na capacidade de assimilação de nutrientes pela planta
(KAPULNIK et al, 1985; OKON et al, 1988). Este efeito parece ser devido à
capacidade destas bactérias de produzir fitormônios (TIEN et al, 1979; de
FRANCESCO et al, 1985; HORNEMANS e VLASSAK, 1985; MORGENSTERN e
OKON, 1987).
A disponibilidade de nitrogênio fixado é um fator limitante freqüente na
produção agrícola, principalmente com o aumento da população mundial e a
necessidade de produção de alimento seguro para as pessoas. O aumento no uso
de fertilizantes
oluição do ar, solo e das águas causado por eles. A utilização de Azospirillum
como inoculante pode promover um melhor aproveitamento de nutrientes pelas
plantas, diminuindo custos de produção em relação ao uso de fertilizantes
nitrogenados, e redução da poluição ambiental causada pelo nitrato e seus
metabólitos de redução (ISHAC, 1989; IACOPINI e CAPPELINI, 1991).
Estudos do mecanismo de transdução de sinal envolvidos na fixação biológica de
nitrogênio em Azospirillum brasilense podem contribuir para o desenvolvimento de
estirpes geneticamente modificadas que disponibilizem mais amônia para a planta
associada. Como o operon ntrYX foi identificado em vários mic
incluindo alguns diazotrofos, onde este par regulatório parece estar envolvido
no controle da fixação biológica de nitrogênio e no metabolismo nitrogenado,
assim, este trabalho visa contribuir para o entendimento da função da proteína NtrX
de Azospirillum brasilense.
2 – OBJETIVO GERAL
Caracterização funcional da proteína NtrX S.Tag N-truncada de Azospirillum
brasilense.
2.1 – Objetivos específicos
•
terizar a atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-truncada de A.
brasilense;
funcionais da proteína NtrX e comparar com os
Superexpressar e purificar a proteína NtrX S.Tag N-truncada de A. brasilense;
• Carac
• Analisar os domínios
domínios funcionais de outras EBPs.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
.1 – Microrganismos e plasmídeos
Os microrganismos e plasmídeos ut
3.2 – Meios de cultivo
As estirpes de E. co ltura de s abaixo
(SAMB l, 1989 a
121°C, a uma atmosfera d
5
10
O pH do meio a 7,5 com NaOH 1 mol/L. O meio sólido, Lúria-
Ágar (LA), foi pre de 12 g/L de ág o meio liquido.
• Terrific-Bro
onentes g
4 mL/L
KH
12,
• SOB e SO
Cl 0,5
KC 0,
O pH foi ajustado para 7,0 com NaOH 1 mol/L. O meio SOC é acrescido de 20
mmol/L de glucos
• Ágar MacConkey (OXOID Ltd)
Componentes g/L onentes g/L
3 Vermelho neutro 3 x 10
-2
10 Cristal violeta 1 x 10
-3
Sais biliares 1,5 Ágar 3,5
li foram cultivadas nos meios de cu scrito
ROOK et a ). Estes meios foram esterilizados
e pressão por 20 minutos.
por autoclavação
• Lúria-Bertani (LB)
Componentes g/L
Triptona 10
Extrato de levedura
NaCl
foi ajustado par
parado pela adição ar a
th (TB)
Comp /L
Triptona 12
Extrato de levedura 24
Glicerol
2
PO
4
2,3
K
2
HPO
4
54
C
Componentes g/L
Triptona 20
Extrato de levedura 5
Na
l 186
e.
Comp
Peptona 17 NaCl 5
Polipeptona
Lactose
3.3 – A
ue de antibiótic utiliz nos meios de cultura foram
prepar scrit por Sambroo et a ões es
tetraciclina (Tc) e cloranfenicol (Cm) foram preparadas em etanol 50% e 95%, nas
concentrações de 10 e 30 mg/mL, respectivamente, e as concentrações de uso de
ções de ácido nalidíxico (Nal),
7°C estaticamente na presença dos mesmos antibióticos.
ratura de –20°C em glicerol
3.5.1 –
de E. coli em pequena escala foi feita baseada no
étodo de lise alcalina baseado em Sambrook et al (1989) modificado conforme
Cerca de 1,5 mL de cultura de E. coli, em fase logarítmica de crescimento,
00 rpm por 1 minuto. As células foram
aOH e 1% de SDS). A mistura foi neutralizada pela adição de 150
ntibióticos
As soluções estoq os ados
adas como de o k l, 1989. As soluç toque de
10 μg/mL e 30 μg/mL, respectivamente. As solu
estreptomicina (Sm), canamicina (Km) e ampicilina (Amp) foram preparadas nas
concentrações de 20 mg/mL, 80 mg/mL, 100 mg/mL e 250 mg/mL, respectivamente,
em água ultrapura e esterilizados por filtração em filtro Millipore 0,45 μm. A solução
estoque de ácido nalidíxico (Nal) foi neutralizada com NaOH 1mmol/L e então
esterilizada por filtração em filtro Millipore 0,45 μm. Todos os antibióticos foram
estocados a –20°C e adicionados aos meios de cultura imediatamente antes do uso.
3.4 – Condições de cultivo e estoques de bactérias
As estirpes de E. coli foram cultivadas nos meios LB, TB ou SOB a 37°C. As
culturas em meio líquido foram incubadas sob agitação a 200 rpm na presença do
antibiótico apropriado para cada estirpe. As placas de meio sólido foram incubadas a
3
As estirpes de E. coli foram estocadas a tempe
50% (SAMBROOK et al, 1989).
3.5 – Manipulação do DNA
Mini-preparação de plasmídeos
A extração de plasmídeos
m
descrito abaixo.
foram coletadas por centrifugação a 130
ressuspensas em 150μL de tampão GET (50 mmol/L de glucose, 10 mmol/L de
EDTA, 25 mmol/L de Tris HCl pH 8,0) e lisadas pela adição de 150 μL de solução de
lise (2 mol/L de N
μL KacF (3 mol/L de acetato de potássio e 1,8 mol/L de ácido fórmico),
homogeneizada por inversão e mantida em gelo por 5 minutos para a precipitação
do DNA genômico, proteínas e SDS. Em seguida, 80 μL de mistura de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) foram adicionados. O material foi
homogeneizado e separado por centrifugação a 13000 rpm por 15 minutos. A fase
aquosa foi coletada e o DNA plasmidial foi precipitado pela adição de dois volumes
de etanol 96% e coletado por centrifugação a 13000 rpm por 10 minutos. O DNA foi
lavado com etanol 80%, seco a vácuo e ressuspenso em 20 μL de água ultrapura.
3.5.2 – Preparação rápida de plasmídeos
Cerca de 100 μL de cultura de E. coli em fase logarítmica foram coletadas e
homogeneizadas com uma solução contendo 40 μL de FSUDS (65 mmol/L de Tris
HCl pH 8,0, 1,75 mmol/L de EDTA, 10% de ficoll, 1% de SDS e 0,02% de azul d
de
e
romofenol) e 14 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Esta mistura foi
por 10 minutos e aproximadamente 20
L do
do para a atividade da enzima indicado pelo fabricante. Uma
líquota de 10% do volume final do sistema foi misturada com FSUDS e aplicada em
avaliar a eficiência de
b
agitada em vórtex, centrifugada a 13000 rpm
μ sobrenadante foi aplicado em um gel de agarose e submetido a corrida
eletroforética. O DNA foi corado com brometo de etídio e visualizado em
transluminador U.V.
3.5.3 – Clivagem do DNA por endonucleases de restrição
Amostras de DNA foram usualmente clivadas com 1 ou 2 unidades de enzima
de restrição em um volume final de 20 a 100 μL, por 3 horas a 37°C e utilizando o
tampão mais adequa
a
ágar 1,2% ou agarose 0,8% e submetida a eletroforese para
clivagem. As enzimas de restrição foram inativadas conforme as instruções do
fabricante e o DNA do sistema de reação foi precipitado pela adição de dois volumes
de etanol 96%, coletado por centrifugação a 13000 rpm por 10 minutos, lavado com
etanol 80%, seco a vácuo e ressuspenso em água ultrapura.
3.5.4 – Purificação de DNA em gel de agarose de baixo ponto de fusão
Os plasmídeos usados nas sub-clonagens foram digeridos com enzimas de
strição apropriadas e os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese
reparativa em gel de agarose de baixo ponto de fusão 0,8%, preparada em tampão
AE 1x (40 mmol/L de Tris base, 1 mmol/L de ácido acético, 2 mmol/L de EDTA em
0 μL de
DNA inserto e vetor de 4:1. Estas
oncentrações foram estimadas por visualização de uma alíquota do material em
gel de ágar 1,2% ou agarose 0,8%. Inicialmente, o DNA inserto,
re
p
T
pH 8,0). Os géis foram montados utilizando pentes com capacidade para 3
amostra. As amostras foram também misturadas com 0,3 a 0,5 volume de FSUDS
antes da aplicação no gel. A corrida eletroforética foi realizada em uma voltagem de
20 a 40 V por aproximadamente 4 horas. Após a corrida eletroforética, o gel foi
corado com uma solução de azul de metileno a 0,025% por 5 minutos e o excesso
de corante retirado com repetidas lavagens com água ultrapura autoclavada, e um
pedaço do gel contendo o fragmento de interesse foi removido. O pedaço de gel foi
fundido completamente por incubação a 65°C. Em seguida, o volume de agarose
fundida foi dobrado com água ultrapura e um volume de uma solução contendo 10
mmol/L de Tris HCl, 0,25 mol/L de NaCl e 1 mmol/L de EDTA e um volume de fenol
equilibrado foram adicionados. A mistura foi agitada vigorosamente e centrifugada a
13000 rpm por 15 minutos. A fase aquosa foi coletada e tratada com 0,25 volume de
clorofórmio:álcool isoamílico (1:1) e separado por centrifugação a 13000 rpm por 15
minutos. O DNA contido na fase aquosa foi precipitado pela adição de um volume de
isopropanol e mantido em gelo por 15 minutos. O precipitado foi coletado por
centrifugação a 13000 rpm por 15 minutos, lavado com etanol 80%, seco a vácuo e
ressuspenso em 12 μL de água ultrapura.
3.5.5 – Ligação
Fragmentos de DNA com pontas coesivas ou pontas cegas foram ligados a
vetores linearizados com pontas coesivas compatíveis ou pontas cegas. As misturas
de ligação continham uma proporção
c
eletroforese em
vetor e água ultrapura foram homogeneizados para um volume final de 10 a 15 μL
de reação e aquecidos a 65°C por 5 minutos. A ligação dos fragmentos de DNA foi
iniciada pela adição de tampão de ligação (50 mmol/L de Tris HCl pH 7,8, 10 mmol/L
de MgCl
2,
10 mmol/L de DDT, 1 mmol/L de ATP e 50 μg/mL de soroalbumina bovina)
e 1 unidade de T
4
DNA Ligase. As reações foram incubadas a 18°C por 18 horas.
3.5.6 – Transformação bacteriana
a. Preparo de células eletrocompetentes
As células de E. coli foram cultivadas em meio SOB, sob agitação a 37°C até
tingir uma DO
600
de 0,5 a 0,7. As células foram mantidas em gelo e coletadas por
utos a 4°C. As células foram lavadas uma vez
com á ul icerol 10% estéril gelado. As
System (Life Technologies). Uma alíquota de 1 ou 2 μL do
sistem a 20 μL de células de E. coli eletrocompetentes e
manho de fragmentos de DNA ou
lasmídeos intactos foi realizada por eletroforese em gel de ágar 1,2% ou agarose
base, 89 mmol/L de ácido
bórico omo descrito em Sambrook et al, 1989. O
a
centrifugação a 5000 rpm por 5 min
gua trapura estéril gelada e uma vez com gl
células foram ressuspensas em glicerol 15% e estocadas em alíquotas de 40 μL a
temperatura de – 70
o
C.
b. Eletroporação
Os plasmídeos íntegros ou provenientes de sistemas de ligação foram
introduzidos em estirpes de E. coli por eletroporação, usando um eletroporador Cell-
Porator
®
Electroporation
a de ligação foi misturado
transferidos para uma câmara de eletroporação mantida no gelo. Esta mistura foi
submetida a um pulso elétrico (4 kV, 200 Ω, 300 μF), coletada, diluída em 1mL de
meio SOC e incubada a 37°C por uma hora para a recuperação das células. Em
seguida, uma porção das células foi inoculada sobre o meio de cultura sólido com
antibióticos apropriados. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. As
colônias obtidas foram coletadas e analisadas para verificar a presença de
plasmídeos, conforme os itens 2.5.2 e 2.6.1.
3.5.7 – Eletroforese de DNA em gel de ágar e agarose
a. Eletroforese analítica
A separação e a estimativa de ta
p
0,8% submerso em tampão TBE 1x (89 mmol/L de Tris
, 2 mmol/L de EDTA em pH 8,3) c
gel foi preparado em tampão TBE 1x. As amostras de DNA foram misturadas em 0,3
a 0,5 volume de FSUDS. A corrida
60 V por aproximadamente 3 horas. O gel foi corado em solução de brometo de
etídio a 0,5 μg/mL por 30 minutos e as bandas foram visualizadas em transluminador
de luz ultravioleta.
A massa molecular de fragmentos foi calculada por comparação com padrões
de fragmentos de DNA de tamanho molecular conhecido, 1 kb Ladder (Fermentas)
ou plasmídeo controle digerido. A massa molecular de plasmídeos intactos foi
estimada por comparação com plasmídeos de massa molecular conhecida.
gene ntrX N-truncado no vetor de expressão pET29a+
O plasmídeo pMCA1 foi digerido com a enzima de restrição SalI e tratado com
i
igerido com a enzima de restrição EcoRI, gerando um fragmento de
foi
digerid
b. Eletroforese preparativa
A separação e purificação de fragmentos de DNA para sub-clonagens foram
feitas por eletroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão 0,7%, conforme
descrito no item 3.5.4.
3.6 – Obtenção da proteína NtrX S.Tag N-truncada de Azospirillum brasilense
3.6.1 -– Clonagem do
a enzima T4 DNA polimerase para formação de pontas cegas. Em seguida, fo
d
aproximadamente 1,4 kb, contendo o gene ntrX N-truncado. O vetor pET29a+
o com a enzima de restrição BglII e tratado com a enzima T4 DNA polimerase
para formação de pontas cegas. Em seguida, foi digerido com a enzima de restrição
EcoRI (Figura 6). O fragmento do gene ntrX e o vetor foram misturados num sistema
de ligação (item 3.5.5). Esta mistura de ligação foi transformada em E. coli DH10B e
os transformantes foram selecionados em meio LA contendo canamicina e
estreptomicina. Os plasmídeos destas colônias foram extraídos por rápida
preparação de plasmídeos e analisados por eletroforese em gel de ágar 1,2%
utilizando o vetor pET29a+ como controle.
Figura 6: Esquema de clonagem do gene ntrX N-truncado no vetor de expressão
ET29a+
oito
e N-terminal do gene ntrX. Em azul e vermelho, os sítios de ligação
ento do gene no vetor pET29a+.
proteína NtrX S.Tag N-truncada
ntrX de A. brasilense N-truncado,
E3), C43 (DE3) e BL21AI. As culturas foram
duzidas em meio LB contendo o antibiótico canamicina na concentração de 50
pela adição de
0,5%
p
SphI SalI EcoRI
Clonagem do gene ntrX N-truncado no vetor de expressão pET29a+. Indicados os
códons deletado
s da extremidad
do fragm
3.6.2 – Indução da expressão da
O plasmídeo pETM-x1, que contém o gene
foi introduzido por eletroporação em E. coli estirpes BL21λ (DE3) codonplus,
RosettaBlue (DE3) pLysS, C41 (D
in
μg/mL. A expressão da proteína NtrX S.Tag N-truncada foi induzida
de lactose ou 0,5 mmol/L de IPTG, a 30°C por 3 horas, e pela adição de
pTZ18R ntrY ntrX pTZ18R
SphI SalI EcoRI
pET29a+ pET29a+
BglII EcoRI
Transcrição
ATG GCG CAT GAC ATT CTG ATC GTC GAC GAC GAA GCG GAC
M A H D I L I V D D E A D
Aminoácidos deletados
NtrX
SalI
BglII
EcoRI
pTZ18R ntrY ntrX pTZ18R
pET29a+ pET29a+
BglII EcoRI
Transcrição
ATG GCG CAT GAC ATT CTG ATC GTC GAC GAC GAA GCG GAC
M A H D I L I V D D E A D
Aminoácidos deletados
NtrX
SalI
BglII
EcoRI
pMCA1
pETM-x1
SphI SalI EcoRI
pTZ18R ntrY ntrX pTZ18R
SphI SalI EcoRI
pET29a+ pET29a+
BglII EcoRI
pTZ18R ntrY ntrX pTZ18R
Transcrição
ATG GCG CAT GAC ATT CTG ATC GTC GAC GAC GAA GCG GAC
M A H D I L I V D D E A D
Aminoácidos deletados
NtrX
SalI
BglII EcoRI
pET29a+ pET29a+
BglII
EcoRI
Transcrição
ATG GCG CAT GAC ATT CTG ATC GTC GAC GAC GAA GCG GAC
M A H D I L I V D D E A D
Aminoácidos deletados
NtrX
SalI
BglII
EcoRI
pMCA1
pETM-x1
concentrações de 0,02%, 0,2% ou 2% de L-arabinose, a 30°C por 4 horas para a
estirpe BL21AI.
As estirpes de E. coli BL21λ (DE3) codonplus e RosettaBlue (DE3) pLysS
possuem códons raros para E. coli, que podem auxiliar a expressão de genes que
possuem a relação GC/AT maior, como o caso de genes de A. brasilense.
As estirpes de E. coli C41 (DE3) e C43 (DE3) possuem mutações não
caract
no sistema de indução. Conseqüentemente, a
expres
76, utilizando soro albumina bovina para a construção da curva de
alibração. A determinação da concentração de proteínas em suspensões de células
mol/L de NaOH e incubação a temperatura
amostras foram diluídas em tampão de amostra (12 mmol/L de
ris-HCl pH 6,8, 5% de glicerol, 0,4% de SDS, 2 mmol/L de 2-mercaptoetanol e
95
°
C por
erizadas em genes que codificam para proteases. Desta forma, estas estirpes
podem ser úteis para expressão de proteínas que não fazem parte do proteoma de
E. coli, como a proteína NtrX.
A estirpe de E. coli BL21AI contém o gene da T7 RNA Polimerase clonado no
locus araB do operon araBAD. Desta forma, esse gene está sob regulação do
promotor araBAD e seu nível de expressão pode ser regulado variando a
concentração de L-arabinose
são dos genes regulados pelo promotor do fago T7 também será regulada
(Invitrogen).
3.6.3 – Dosagem de proteínas totais
As concentrações de proteínas totais foram determinadas pelo método de
Bradford, 19
c
foi realizada pela adição prévia de 0,5
ambiente por 1 hora para lise das células. A leitura da absorbância dos padrões e
das amostras foi feita a 595 nm em leitor de placas de 96 poços ELx800 (Bio-Tek
Instruments, Inc.).
3.6.4 – Eletroforese de proteína em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
As condições de eletroforese desnaturante foram aquelas descritas por
Laemmli, 1970. As
T
0,02% de azul de bromofenol). Em seguida, amostras foram aquecidas a
10 minutos com tampão de amostra e aplicadas em gel de poliacrilamida. A
concentração do gel separador foi de 12%, preparado com a solução estoque de
acrilamida (29,2% de acrilamida e 0,8% de N’-N’-Bis metileno acrilamida em água
ultrapura), Tris HCl pH 8,8 e SDS. A polimerização é catalisada com a adição de
persulfato de amônio e TEMED. A eletroforese foi corrida por 1 hora e 15 minutos a
180 V em tampão contendo 25 mmol/L de Tris base, 192 mmol/L de glicina e 0,1%
de SDS em pH 8,3. Este tampão foi preparado 10 vezes concentrado, mantido a
temperatura ambiente e diluído no momento do uso. O gel foi corado com Comassie
Blue (0,1% de azul de coomassie R250, 45% de metanol e 10% de ácido acético)
por 2 horas e descorado em 40% de metanol e 10% de ácido acético. O gel foi
fotodocumentado e empacotado em folhas de celofane.
3.6.5 – Solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada
A expressão da proteína NtrX S.Tag N-truncada (pETM-x1) nas estirpes de E.
coli BL21λ (DE3) codonplus, RosettaBlue (DE3) pLysS, C41(DE3) e C43(DE3) foi
duzida por 0,5 mmol/L de IPTG a 30°C por 4 horas. Em seguida, as células foram
4°C e ressuspensas nos
pH8,0 pH8,0 pH8,0
NaCl 500 mmol/L NaCl 200 mmol/L NaCl 200 mmol/L NaCl 200 mmol/L NaCl
1 mmol/L DTT 1 mmol/L DTT 1 mmol/L DTT 1 mmol/L DTT 1 mmol/L DTT
0,1 mmol/L EDTA 0,1 mmol/L EDTA 0, 0,1 mmol/L EDTA 0,1 mmol/L EDTA
10 ol 50 ol 50 ol
so ciclo gund s lu
celular i centrifugado p r 25 minuto rpm a
obrenadante (fração solúvel) e precipitado (fração insolúvel) foram aplicadas em gel
de ele
avaliada apenas nos tampões 1 e 2.
in
coletadas por centrifugação a 5000 rpm por 5 minutos a
seguintes tampões de sonicação:
Tampão 1 Tampão 2 Tampão 3 Tampão 4 Tampão 5
50mmol/L Tris HCl
pH8,0
50mmol/L Tris HCl
pH8,0
50mmol/L Tris HCl 50mmol/L Tris HCl 50mmol/L Tris HCl
200 mmol/L
1 mmol/L EDTA
50% glicerol
50% glicerol
10% PEG 8000
% glicer
0,1% Triton X-100
% glicer
0,5% sarcosina
% glicer
As amostras foram incubadas com 100 μg/mL de lisozima por 30 minutos e
nicadas em s de 30 se os por 6 veze para lisar as cé las. O extrato
fo o s a 14000 4°C. Concentrações iguais de
s
troforese desnaturante (SDS-PAGE 12%) para determinar a solubilidade da
proteína NtrX S.Tag N-truncada produzida.
Quando a proteína NtrX S.Tag N-truncada foi expressa na estirpe BL21AI, a
lise das células foi realizada por sonicação, como descrito acima, e a solubilidade foi
Para avaliar o efeito do ditiotreitol (DTT) na solubilidade da proteína NtrX
S.Tag N-truncada, as células foram coletadas por centrifugação a 5000 rpm por 5
minuto
-
0,1 mmol/L EDTA 0,1 mmol/L EDTA
5
As amostras foram incubadas com 100 μg/mL 0 minutos e
sonicadas até a as células entrifugado por 20
minutos a 14000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e o
precipitado foi com o m smo tampão para o volume inicial.
s iguais de sobrenadante (fração solúvel) e precipitado (fração
insolúv
0 minutos a 14000 rpm a 4°C. O
obrenadante foi diluído 10 vezes com tampão A (50 mmol/L Tris HCl pH 8,0, 50
minuir a concentração de
s a 4°C após a indução da proteína NtrX S.Tag N-truncada em E. coli BL21AI
e ressuspensas nos seguintes tampões de sonicação:
Tampão 2 Tampão 2A
50 mmol/L Tris HCl pH 8,0 50 mmol/L Tris HCl pH 8,0
500 mmol/L NaCl 500 mmol/L NaCl
1 mmol/L DTT
0% glicerol 50% glicerol
de lisozima por 3
lise completa d . O extrato celular foi c
ressuspenso e
Concentraçõe
el) foram aplicadas em gel de eletroforese (SDS-PAGE) 12% para verificar a
solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada.
3.6.6 – Purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada
As células ressuspensas em tampão 2 de lise (item 3.6.5) foram incubadas
com 100 μg/mL de lisozima por 30 minutos e sonicadas até a lise completa das
células. O extrato celular foi centrifugado por 2
s
mmol/L NaCl, 0,1 mmol/L EDTA, 10% glicerol) para di
glicerol do tampão de sonicação e aplicado em uma coluna de troca aniônica Q-
Sepharose de 30 mL (Amersham Biosciences) pré-equilibrada com tampão A e
conectada a um sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography,
Pharmacia). A amostra foi injetada na coluna com um fluxo de 1 mL/minuto. A coluna
foi lavada com tampão A (1 mL/minuto) até a estabilização da linha de base,
seguindo de uma segunda lavagem com uma mistura de 25% de tampão B (50
mmol/L Tris HCl pH 8,0, 1 mol/L NaCl, 0,1 mmol/L EDTA, 10% glicerol) e 75% de
tampão A. A proteína foi eluída com um gradiente de NaCl que variou de 250 mmol/L
a 1 mol/L. Durante a eluição foram coletadas 30 alíquotas de 5 mL em um fluxo de 1
mL/minuto. As amostras foram analisadas por eletroforese (SDS-PAGE) e
agrupadas em diferentes frações de acordo com o grau de pureza da proteína.
As amostras obtidas da cromatografia de troca aniônica foram agrupadas
conforme o grau de pureza. As amostras foram concentradas em membrana de
polietersulfona Vivaspin 6 (Vivascience) e o tampão das amostras foi trocado para o
tampão A ou tratadas com sulfato de amônio 75% (1 hora sob agitação a 4°C) e
centrifugadas a 18000 rpm por 30 minutos. O precipitado foi dissolvido em 5 mL de
N-terminal uma seqüência de aminoácidos,
enominada S.Tag (Novagen). Estas proteínas podem ser purificadas por afinidade
anticorpos anti-S.Tag que interage com a seqüência da S.Tag
tampão A e dialisado em tampão A (12 horas a 4°C sob agitação). As amostras
foram aplicadas em coluna de afinidade Agarose-Heparina de 5 mL pré-equilibrada
com tampão A e conectada a um sistema FPLC. O sistema foi operado a um fluxo
de 1 mL/minuto. A coluna foi lavada com tampão A (1 mL/minuto) até a estabilização
da linha de base, seguindo de uma segunda lavagem com uma mistura de 25% de
tampão B (50 mmol/L Tris HCl pH 8,0, 1 mol/L NaCl, 0,1 mmol/L EDTA, 10% glicerol)
e 75% de tampão A. A proteína foi eluída com um gradiente de NaCl que variou de
250 mmol/L a 1 mol/L. Durante a eluição foram coletadas 30 alíquotas de 1 mL em
um fluxo de 1 mL/minuto. As amostras foram analisadas por eletroforese (SDS-
PAGE) e agrupadas em diferentes frações de acordo com o grau de pureza da
proteína e dialisadas em tampão A.
3.6.7 – Purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada por ligação específica à
agarose – S.Tag
A proteína NtrX S.Tag N-truncada, expressa a partir do plasmídeo pETM-x1
(item 3.6.1), contém na região
d
através do kit de purificação S.Tag rEK (Novagen). Este kit possui uma solução de
agarose ligada a
permitindo sua purificação. As frações eluidas da coluna Agarose-Heparina que
continham a proteína NtrX S.Tag N-truncada, foram adicionadas à agarose S.Tag
em uma proporção de 1 μg de proteína para cada 1 μL de agarose. A ligação foi
realizada a temperatura ambiente por 30 minutos sob agitação leve e constante e
centrifugada a 500 x g por 5 minutos para a separação da agarose do sobrenadante,
que foi reservado para a verificação da eficiência de ligação da proteína à agarose
S.Tag. Em seguida, a agarose foi lavada 3 vezes com o tampão de lavagem (20
mmol/L Tris HCl pH 7,5, 150 mmol/L NaCl e 0,1% triton X-100) e centrifugada a 500
x g por 5 minutos. A eluição da proteína foi feita com a adição de 1,5 volume de
cloreto de magnésio 3 mol/L, incubado a temperatura ambiente por 10 minutos sob
constante agitação leve e centrifugado a 500 x g por 5 minutos seguido da lavagem
da agarose com 1,25 mL de tampão de lavagem.
3.7 – Caracterização da proteína NtrX S.Tag N-truncada
3.7.1 – Análises estruturais dos domínios da proteína NtrX de A. brasilense
O programa 3DJigsaw (http://www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw) foi utilizado
ara obtenção de modelos estruturais para os domínios da proteína NtrX de A.
nios da proteína NtrX de
. brasilense com domínios de outras proteínas estruturalmente semelhantes foi
ST/
N-truncada.
A banda que possui a massa molecular esperada para a proteína NtrX N-
mol/L de bicarbonato de amônio pH 8,0 até a descoloração do
°C por 16
p
brasilense. O alinhamento estrutural dos modelos dos domí
A
realizado utilizando o programa VAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VA
vastsearch.html). As figuras do modelo estrutural dos domínios da proteína NtrX de
A. brasilense foram realizadas pelo programa Rasmol (SAYLE e MILNER-WHITE,
1995). O programa Coils (LUPAS, VanDYKE e STOCK, 1991) foi utilizado para
verificar as regiões da proteína NtrX de A. brasilense que formariam coiled-coil. O
programa CLUSTAL W (THOMPSON et al, 1994) foi utilizado para alinhar as
seqüências de aminoácidos da proteína NtrX de A. brasilense com outras
seqüências para analisar a similaridade entre as proteínas.
3.7.2 – Análise da proteína NtrX S.Tag N-truncada por espectrometria de massa
tipo MALDI-ToF/MS
A identificação de peptídeos por espectrometria de massa foi realizada para
confirmar se a proteína purificada correspondia a NtrX S.Tag
truncada foi retirada do gel SDS-PAGE, pelo tratamento com uma solução de 50%
de acetonitrila e 25 m
Coomassie-blue e digerida com 10 μg/mL de tripsina na presença de tampão
40mmol/L de bicarbonato de amônio e 10% de acetonitrila, incubado a 37
ho O sobrenadante foi coletado, concentrado e a amostra seca a vácuo foi
resuspendida em 10% de acetonitrila. Uma alíquota de 2 μL desta amostra foi
dissolvida em 2 μL da matriz HCCA (α-Cyano-4-hydroxy cinaminic acids) e aplicada
sobre um suporte metálico e colocada no espectrômetro MALDI-ToF após a
secagem da amostra no suporte.
Os espectros foram gerados pelo programa Flex Control (Bruker Daltonics)
utilizando o método RP1-3 (refrator positivo de 1 a 3 kDa). A identificação dos picos
monoisotópicos no espectro foi realizada pelo programa Flex Analysis (Bruker
Daltonics). O padrão para comparação do espectro e identificação dos peptídeos foi
feito pela digestão in silico de u
ras.
ma seqüência de aminoácidos da proteína NtrX,
ADH
ela enzima lactato desidrogenase e piruvato quinase (D’AUTRÉAUX et al, 2005). A
0 minutos. As misturas de reação continham 30 mmol/L de ATP (Sigma),
1 mm
contendo a cauda S.Tag e tendo os primeiros 8 aminoácidos deletados usando o
programa MS-Digest (Protein Prospector) selecionando a opção de digestão com
tripsina. O aparelho foi previamente calibrado utilizando um calibrador externo.
3.7.3 – Determinação da atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-
truncada
A atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-truncada foi medida
utilizando um ensaio na qual a produção de ADP é acoplada a oxidação do N
p
oxidação do NADH foi monitorada pela absorbância a 340 nm (Varian Cary 3E) a
37°C por 2
ol/L de fosfoenolpiruvato (Sigma), 0,25 mmol/L de NADH (Sigma), 7 U de
piruvato quinase (Sigma), 23 U de lactato desidrogenase (Sigma) e concentrações
de proteína NtrX S.Tag N-truncada de 200, 500 e 1000 nmol/L em tampão 50
mmol/L de Tris HCl pH8,0, 100 mmol/L de cloreto de potássio e 2 mmol/L de cloreto
de magnésio, conforme esquema abaixo:
A primeira etapa da reação, contendo a proteína NtrX S.Tag N-truncada, ATP,
fosfoenolpiruvato e piruvato quinase foi pré-incubada a 37°C por 5 minutos. Em
seguida, a enzima lactato desidrogenase foi adicionada ao sistema de reação e o
espectrofotômetro foi zerado. Após a adição de NADH, os valores de absorbância do
istema foram registrados até 20 minutos. A proteína NtrC de E. coli, gentilmente
cedida
. O nível de significância foi de 5%.
NtrX S.Tag N-truncada
ATP ADP
Fosfoenolpiruvato + ADP Piruvato +ATP
Piruvato + NADH + H Lactato + NAD
+
Mg
2+
K
+
Piruvato quinase
Lactato Desidrogenase
s
pela Prof
a
Dr
a
Roseli Wassem foi usada como controle positivo e a reação na
ausência de proteína NtrX S.Tag N-truncada ou NtrC foi usada como controle
negativo do sistema. A atividade de ATPase foi testada também na presença de
DNA plasmidial (10 nmol/L), contendo o promotor σ
54
dos genes glnBA e a região de
ligação da proteína NtrC (UAS-NtrC) de A. brasilense ou o promotor σ
70
dos genes
ntrYX de A. brasilense. O efeito da fosforilação de NtrX S.Tag N-truncada na sua
atividade de ATPase foi avaliada pela adição de 10 mmol/L de carbamil-fosfato aos
sistemas. A atividade de ATPase foi definida como a quantidade de ATP (mol/L)
hidrolisados por minuto.
3.8 – Análises estatísticas
As análises estatísticas dos resultados de ATPase foi realizado no software
STATISTICA, utilizando valores de atividade de ATPase em triplicata comparados
pelo teste Tukey post-hoc
+
1ª ETAPA
2ª ETAPA
NtrX S.Tag N-truncada
ATP ADP
Fosfoenolpiruvato + ADP Piruvato +ATP
Piruvato + NADH + H Lactato + NAD
+
Mg
2+
K
+
Piruvato quinase
Lactato Desidrogenase
1ª ETAPA
2ª ETAPA
+
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
-terminal, central e C-
rminal da proteína NtrX de A. brasilense foram obtidos modelos estruturais teóricos
através do programa 3DJigsaw
ttp://www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw/). Os alinhamentos estruturais destes
eínas
, como observado para a proteína NtrC
S.
4.1 – Análises estruturais dos domínios da proteína NtrX de A. brasilense
A partir da seqüência de aminoácidos dos domínios N
te
para estes domínios
(h
modelos com as proteínas presentes no banco de dados de estrutura de prot
(RCSB Protein Data Bank: http://www.rcsb.org) foram realizados através do software
VAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html). Este programa
compara os modelos estruturais teóricos entre as proteínas do banco de dados e
alinha os motivos funcionais dos domínios.
O modelo estrutural teórico do domínio N-terminal da proteína NtrX de A.
brasilense é formado por um motivo β5/α5 (Figura 7 e 13A). O resíduo Asp53 que é
provavelmente fosforilado na proteína NtrX encontra-se no final da fita β3. Os
resíduos envolvidos na fosforilação: Asp 9, Asp 10, Asp 53, Lys 105 e Ser 83 estão
próximos formando o sítio ativo da proteína
de typhimurium (PELTON et al, 1999; Figura 13B). Entre o domínio N-terminal e
central existe uma seqüência de ligação (linker, L1) que no modelo estrutural
calculado para NtrX aparece organizado de maneira semelhante ao observado para
as proteínas NtrC1 de A. aeolicus e DctD de S. meliloti (Figura 7 e 13B). Nestas
proteínas, este linker (L1) forma uma estrutura do tipo coiled-coil entre dois
monômeros e mantém as proteínas como dímeros inativos no estado desfosforilado
(DOUCLEFF et al, 2005). A análise de seqüência da proteína NtrX de A. brasilense
no programa Coil (LUPAS, VanDYKE e STOCK, 1991) revelou que na região do
linker (L1) há uma grande possibilidade de estrutura do tipo coiled-coil para NtrX,
sugerindo que esta proteína pode formar dímeros devido as interações de
aminoácidos presentes na região do linker (L1). A interface entre os homodímeros é
criada por uma bolsa hidrofóbica, que apresenta o motivo: T/SGxGxhxxxhxxh, onde
“h” representa aminoácidos hidrofóbicos (DOUCLEFF et al, 2005; Figura 7). Este
motivo é conservado entre as proteínas NtrX, incluindo a de A. brasilense. Nas
proteínas NtrC1 e DctD, o linker (L1) funciona como um regulador negativo, por
manter o dímero desfosforilado estável (LEE et al, 2003; PARK et al, 2002; Figura
12). Na regulação negativa, o domínio N-terminal das EBPs-RRs interagem
formando dímeros que estabilizam a forma não oligomérica. A fosforilação deste
domínio estabiliza uma outra conformação do dímero que permite a oligomerização.
Já na proteína NtrC de S. typhimurium não há dimerização na região do domínio N-
terminal e quando este é fosforilado, muda de conformação expondo o domínio
central para a interação com o fator sigma (Figura 11). Desta forma, este domínio
exerce a função de regulação positiva na proteína NtrC de S. typhimurium
(DOUCLEFF et al, 2005). Na regulação positiva, a fosforilação do domínio N-terminal
das EBPs-RRs promove uma mudança conformacional que expõe uma região
hidrofóbica deste domínio da proteína que favorece a interação entre as
subunidades, facilitando a formação do hexâmero. Os dados estruturais teóricos
obtidos para a proteína NtrX de A. brasilense sugerem que o domínio N-terminal de
NtrX também apresenta efeito regulador negativo sobre o domínio central como
observado para as proteínas NtrC1 e DctD. Os motivos estruturais encontrados para
a proteína NtrX de A. brasilense também foram observados em outras proteínas
NtrX (Figura 10).
O modelo estrutural teórico do domínio central da proteína NtrX de A.
brasilense mostra que NtrX, como as demais proteínas da classe das EBPs
apresenta um domínio central AAA+ formado por dois subdomínios: o α/β Rossman
e o α−hélice (Figura 13C). Os motivos deste domínio são estruturalmente
semelhantes aos das proteínas: NtrC1 de Aquifex aeolicus, PspF de E. coli e ZraR
Sade lmonella typhimurium (Figura 8 e 13C). Os motivos: Walker A envolvido na
ligação a nucleotídeos (revisado por SCHUMACHER et al, 2006); Walker B (hhhDE)
onde “h” corresponde a aminoácidos hidrofóbicos e o resíduo de aspartato é
importante para hidrólise de ATP, podendo estar envolvido na coordenação do Mg
+2
;
o motivo GAFTGA localizado na alça 1 que é responsável pela ligação ao fator σ
54
,
provavelmente interagindo com a região 1 deste fator (BORDES et al, 2003); a
região Sensora I localizado na alça 2 que contém um resíduo de treonina cuja
cadeia lateral está posicionada entre os motivos Walker A e B; a região Sensora II
que apresenta uma arginina envolvida no ligação a nucleotídeos na proteína NtrC
(ROMBEL et al, 1998), sendo que na PspF é responsável pelo posicionamento do
γ−fosfato do ATP e pode estar envolvida na hidrólise e coordenação do Mg
+2
e a
região SHR (região de homologia secundária) que contém os dois dedos de arginina
presentes na maioria das proteínas da família AAA+ (Figura 8). Estas argininas
parecem estar envolvidas na catálise intersubunidades já que mutações nesta região
afetam atividade de ATPase mas não impedem a ligação a nucleotídeos (ROMBEL
et al, 1998; SCHUMACHER et al, 2004). Os resultados destas análises estruturais
sugerem que o domínio AAA+ da proteína NtrX de A. brasilense pode interagir com
σ
54
e ter função catalítica semelhante as proteínas PspF de E. coli e NtrC1 de A.
aeolicus. Proteínas da família AAA+ que não apresentam o motivo GAFTGA, como a
proteína NtrC de R. capsulatus e TyrR de E. coli, são incapazes de ativar a
transcrição de promotores dependentes de σ
54
mas regulam a atividade de
promotores dependentes de σ
70
(PITTARD e DAVIDSON, 1991).
Na região C-terminal de NtrX de A. brasilense, o modelo estrutural teórico
calculado contém dois motivos do tipo hélice-volta-hélice (HTH) e alinha-se
estruturalmente com as proteínas FiS e ZraR (Figura 9). Uma segunda região de
ligação entre domínios é observada nesta região (L2). Este linker na proteína NtrX
A. de brasilense é mais longo que o linker (L2) das proteínas NtrC1 e DctD (Figura
12). Na estrutura calculada para NtrX, esta região forma uma hélice (Figura 13D),
semelhante as estruturas obtidas para as proteínas FiS e NtrC (Figura 11). Nestas
proteínas, esta região é responsável pelo contato entre os dímeros no sítio de
ligação ao DNA. As proteínas DctD e NtrC1 não apresentam região de homologia
com a hélice de dimerização. Estes resultados sugerem que o domínio C-terminal da
proteína NtrX de A. brasilense dimeriza como as proteínas FiS e NtrC. O
alinhamento das seqüências de aminoácidos das proteínas NtrX de A. brasilense
com as proteínas NtrC de A. brasilense, S. typhimurium e E. coli mostram que a
região envolvida na ligação de NtrC ao DNA é a região que corresponde ao
segmento mais conservado deste domínio (Figura 11). Além disso, os resíduos R e
K envolvidos na interação com o DNA são praticamente idênticos nestas proteínas,
sugerindo que a proteína NtrX é capaz de reconhecer o sítio de ligação de NtrC ao
DNA (Figura 11).
As análises de alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína NtrX
mostrou similaridade com outras proteínas da família AAA+, sugerindo uma
interação com o fator sigma 54 e atividade catalítica semelhante às proteínas PspF
de E. coli e NtrC1 de A. aeoculis, podendo sugerir que a proteína NtrX de A.
brasile
Ps, EBPs-RRs e RRs. A proteína NtrX de A.
brasile
nse pode ter atividade de ativadora transcricional de genes dependentes do
fator sigma 54 da RNA polimerase.
Como a proteína NtrX de A. brasilense possui características híbridas entre as
proteínas NtrC e DctD, uma árvore filogenética foi construída, utilizando o programa
Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) comparando a proteína NtrX de A.
brasilense com outras proteínas EB
nse está próxima das proteínas EBPs-RRs NtrX e NtrC de A. caulinodans,
NtrX de G. diazotrophicus e S. meliloti e das RRs NarL de E. coli, FixJ de A.
caulinodans e S. meliloti e NtrX de H. seropedicae, devido a alta similaridade dos
domínios N-terminal e C-terminal destas proteínas com a proteína NtrX. A proteína
DctD de S. meliloti está relativamente próxima e as proteínas NtrC estão em outro
ramo. (Figura 14).
Figura 7: Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio N-
rminal da proteína NtrX de A. brasilense
te
A
B
10 20 30 40 50 60
....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|
VS12 1 HDILIVDDEADIRMLIAGILNDEGMKTREAADADQAFAQVSARRPSLVVLDIWLQGsRLD 60
5_B
1NY 1 MNVLVIEDDKVFRGLLEEYLSMKGIKVESAERGKEAYKLLSEKHFNVVLLDLLLP--DVN 58
2_A
1ZY 1 MNVLVIEDDKVFRGLLEEYLSMKGIKVESAERGKEAYKLLSEKHFNVVLLXLLLp--DVN 58
DCK_B
1 4 YTVHIVDDEEPVRKSLAFMLTMNGFAVKMHQSAEAFLAFAPDVRnGVLVTDLRMP--DMS 61
ZIT_A
1 2 KRVLVVDDEEsiTSSLSAILEEEGYHPDTAKTLREAEKKIKELFFPVIVLDVwmpd--gd 59
56_A
1J 4 GIVWV 61 VDDDSSIRWVLERALAGAGLTCTTFENGNEVLAALASKTPDVLLSDIRMPGm--d
70 80 90 100 110 120
....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|
VS12 61 GLQILEQLMRDHRNLRVIMI SGHGNIETAVSAIKIG----AYDFIEKPFKADRLLLMVDR 116
1NY5_B 59 GLEILKWIKERSPETEVIVITGHGTIKTAVEAMKMG----AYDFLTKPCMLEEIELTINK 114
Y2_A
1Z 59 GLEILKWIKERSPETEVIVITGHgTIKTAVEAMKMG----AYDFLTKPCMLEEIELTINK 114
1DCK_B 62 GVELLRNLGDLKiNIPSIVITGHGDVPMAVEAMKAG----AVDFIEKPFEDTVIIEAIER 117
IT_A
1Z 60 gVNFIDFIKEnsPDSVVIVITGHGSVDTAVKAIKKG----AYEFLEKPFSVERFLLTIKH 115
1J56_A 62 GLALLKQIKQRHPMLPVIIMTahs----dlDAAVSAyqqgAFDYLPKPFDIDEAVALVER 117
Bolsa Hidrofóbica Linker L1
T/SGxGxhxxxhxxh
130 140
VS12
....*....|....*....|..
117 AIEAARLKRENEELKLRAGGEV 138
Y5_B1N 115 AIEHRKLRKENELLRREKDLKE 136
1ZY2_A 115 AIEHR
CK_B
KLRkenellrrekdlke 136
D
1 118 ASEHL le-----
IT_A
va -------- 126
1Z 116 AFEEYS---------------- 121
1J56_A 118 AISHYQe--------------- 124
rico do domínio N-terminal da proteína NtrX de A. brasilense. (A)
linhamento do modelo teórico do domínio N-terminal das proteínas NtrX de A. brasilense (amarelo)
com os odelos estruturais da proteínas: NtrC1 de Aquifex aeolicus (1NY5) e NtrC1 domínio N-
terminal e Aquifex aeolicus (1ZY2), FixJ de S. meliloti (1DCK). (B) Alinhamentos das seqüências de
aminoá os das proteínas NtrX de A. brasilense (VS12), NtrC1 de Aquifex aeolicus (1NY5), NtrC1
domínio
Linker L1
Alinhamento estrutural teó
A
m
d
cid
N-terminal de
Aquifex aeolicus (1ZY2), FixJ de S. meliloti (1DCK) e NtrC4 de Aquifex
aeolicus (1ZIT) e NtrC de S. typhimurium (1J56). Os aminoácidos em vermelho são idênticos entre as
seqüências. Indicado a presença da bolsa hidrofóbica e a hélice do linker 1 (de K108 até G140).
Figura 8: Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio central
proteína NtrX de A. brasilense
da
A
B
10 20 30 40 50 60
S12
....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|
V 1 LIGRSTPSTTIYRVLARL--MG--TDLTITGESGTGKELVARALHDYGKRRNGPFVAINM 56
1NY5_B 139 YVFESPKMKEILEKIKKIsc--aeCPVLITGESGVGKEVVARLIHKLSDRSKEPFVALNV 196
OJL_D
1 4 MIGSSPAMQHLLNEIAMV--APsdATVLIHGDSGTGKELVARALHACSARSDRPLVTLNC 61
2C98_A 8 LLGEANSFLEVLEQVSHLapLD--KPVLIIGERGTGKELIASRLHYLSSRWQGPFISLNC 65
WALKER A
70 80 90 100 110 120
....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|
VS12 57 AAIPRELIESELFGHEKGAFTGATNRSTGRFEQAQGGTLFLDEIGDMPLEAQTRLLRVLQ 116
1NY5_B 197 ASIPRDIFEAELFGYEKGAFTGAVSSKEGFFELADGGTLFLDEIGELSLEAQAKLLRVIE 256
1OJL_D 62 AALNESLLESELFGHEKGAFTGADKRREGRFVEADGGTLFLDEIGDISPLMQVRLLRAIQ 121
2C98_A 66 AALNENLLDSELFGHEAgaftgaQKRHPGRFERADGGTLFLDELATAPMMVQEKLLRVIE 125
ALÇA 1 WALKER B
130 140 150
160 170 180
....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|
VS12 117 EGEYTTVGGRTPIKTDVRIVAATHRDLQAEIDQGRFRQDLFYRLAVVPIRVPSl-RRRED 175
1NY5_B 257 SGKFYRLGGRKEIEVNVRILAATNRNIKELVKEGKFREDLYYRLGVIEIEIPPlrERKED 316
1OJL_D 122 EREVQRVGSNQTISVDVRLIAATHRDLAEEVSAGRFRQDLYYRLNVVAIEMPSlrQRRED 181
2C98_A 126 YGELErvggSQPLQVNVRLVCATNADLPAMVNEGTFRADLLDRLAFDVVQLPPlrERESD 185
ALÇA 2 SI
__
__________ SRH______________
190 200 210 220 230 240
....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|
VS12 176 IPLLARHFITLGEAPVC---RPGVGEDAMAALQAYDWPGNVRQLRNVVDWLLIMAQGDPK 232
1NY5_B 317 IIPLANHFLKKFSRKYAk-eVEGFTKSAQELLLSYPWYGNVRELKNVIERAVLFSEG--- 372
1OJL_D 182 IPLLADHFLRRFAERNRk-vVKGFTPQAMDLLIHYDWPGNIRELENAIERAVVLLTG--- 237
98_A
2C 1 LMAEYFAIQMCREIk GFTERARET86 IM lplfp LLNYRWPGNIRELKNVVERSVYRHGTSDY 245
SII
250
....*....|..
VS12 233 EPIRADQLPPEI 244
1NY5_B 373 KFIDRGELSCLV 384
1OJL_D 238 EYISERELPLAi 249
2C98_A 246 ---PLDDIIidp 254
Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio central da proteína NtrX
do modelo teórico do domínio central das proteínas NtrX de A.
elos estruturais da proteínas: NtrC1 de Aquifex aeolicus, ZraR de
lmonella typhimurium e PspF de E. coli. (B) Alinhamentos das seqüências de aminoácidos das
oteínas NtrX de A. brasilense (VS12), NtrC1 de Aquifex aeolicus (1NY5), ZraR de Salmonella
typhimu um (1OJL) e PspF de E. coli (2C98). Os aminoácidos em vermelho são idênticos entre as
seqüên
de A. brasilense. (A) Alinhamento
brasilense (amarelo) com os mod
Sa
pr
ri
cias.Indicados os motivos funcionais do domínio AAA+.
Figura 9: Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio C-
terminal da proteína NtrX de A. brasilense
A
B
....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|
S12
10 20 30 40 50 60
V 1 PEIGAITPTVLKWD--KGGEIMGLPLREAREVFEREYLLAQVTRFGGNISRTASFVGMER 58
ETO_B
1 26 PLRDSVKQALKNYFaqLNGQDVNDLYELVLAEVEQPLLDMVMQYtlgnQTRAALMMGINR 85
L_D
1OJ 236 tgeyiserelplaiaatpikteysgeiQPLVDVEKEVILAALEKTGGNKTEAARQLGITR 295
Linker 2
70
....*....|...
VS12 59 SALHRKLKSLGVH 71
1ETO_B 86 GTLRKKLKKYGMN 98
1OJL_D 296 KTLLAKLSr---- 03 4
Alinhamento estrutural das seqüências de aminoácidos do domínio C-terminal da proteína
mento do modelo estrutural teórico do domínio C-terminal das
arelo) com os modelos estruturais da proteínas: FiS de E. coli e
aR de Salmonella typhimurium. (B) Alinhamentos das seqüências de aminoácidos das proteínas
trX de A. brasilense (VS12) com os modelos estruturais das proteínas FiS de E. coli (1ETO) e ZraR
de Sal
NtrX de A. brasilense. (A) Alinha
proteínas NtrX de A. brasilense (am
Zr
N
monella typhimurium (1OJL). Indicado a presença do linker 2 na proteína NtrX e os
aminoácidos envolvidos na interação com o DNA estão em vermelho.
Figura 10: Alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína NtrX de A.
brasilense com outras proteínas NtrX (Clustal W - THOMPSON et al, 1994).
10 20 30 40 50 60 70
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..*.|....|....|....|
A.brasilen MAHDILIVDDEADIRMLIAGILNDEGMKTREAADADQAFAQVSARRPSLVVL
A.caulinod MAHDILIVDDEPDISGLVAGILEDEGYSARTARDADGALAEIAAR
DIWLQGSRLDGLQILEQL
RPNLIFLDIWLQGSRLDGLELLDII
* :*: :
140
G.diazotro MGHEILIVDDEPDIRLLVEGILRDEGYETRLAGDSDSAISAFRARRPSLVILDVWLQGSRLDGLGILQAI
S.meliloti MAADILVVDDEEDIREIVSGILSDEGHETRTAFDSESALAAINDRVPRLIFLDIWMQGSKLDGLALLDEI
Consensus *. :**:**** ** :: *** *** .:* * *:: *:: . *:* *:.**:*:***:***
80 90 100 110 120 130
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.brasilen MRDHRNLRVIMISGHGNIETAVSAIKIGAYDFIEKPFKADRLLLMVDRAIEAARLKRENEELKLRAGGEV
A.caulinod KREHPEVPVVMISGHGNIETAVAAIKRGAYDFIEKPFNADRLVVITERALETLRLRREVRELKQLT-QPH
G.diazotro QGEEPVVPTIMISGHGNIETAVAALQHGAYDFIEKPFQSDRLLLVVRRALEASRLARENAELRLRAGPEA
S.meliloti KNRHPDLPVVMISGHGNIETAVSAIKRGAYDFIEKPFKADRLILIAERALENSKLKRENSELRRKSGDPV
Consensus . : .: **************:*: **********::***:::. **:* :* ** **: :
SGxGxhxxxhxxh (Bolsa Hidrofóbica) Linker 1
150 160 170 180 190 200 210
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.brasilen ELIGRSTAVNHIYRVLARLMGTD--LTITGESGTGKELVARALHDYGKRRNGPFVAINMAAIPRELIESE
A.caulinod TMVGRSSVIQQLRATVDRVGPTNSRILIVGPSGSGKELTARMIHAASARAQGPFVVINAAAITPERLEYE
G.diazotro MLYGDSPVIAGVRNQIERVAPSGSRVLISGAAGAGKEVAARMIHARSPGPK-AFIALNCATLAPGRFEEE
S.meliloti ELIGTSVAVSQLRQMIEKVAPTNSRIMIQGPSGSGKELVARMIHRKSARANGPFVALNAAAITPDRMEIA
Consensus : * * .:: : :: :. : * * :*:***:.** :* . : .*:.:* *::. :*
IxGxxGxGK (Walker A)
220 230 240 250 260 270 280
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.brasilen LFGHEKGAFTGATNRSTGRFEQAQGGTLFLDEIGDMPLEAQTRLLRVLQEGEYTTVGGRTPIKTDVRIVA
A.caulinod LFGVEE---GEGRERHRGALEEAHGGTLFLDEIADMPRETQNRVLRVLVEQTFSRIGSSEKVRVDVRIIS
G.diazotro LFGIEG--APDGTGRRTGVLERAHGGTLLLDEVSDMPIETQGKIVRALQDQSFERVGGASRVKVDVRVLA
S.meliloti LFGTEG---TTGQPRRTGALEEAHGGILYLDEVGEMPRETQNKILRVLVDQQFERVGGSKRVKVDVRIIS
Consensus *** * . : * * :*.*:** * ***:.:** *:* :::*.*: : :*:. .:::***:.:
Alça 2 Alça 1 (GAFTGA) DExx (Walker B)
290 300 310 320 330 340 350
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.brasilen ATHRDLQAEIDQGRFRQDLFYRLAVVPIRVPSLR-RREDIPLLARHFITLG--EAPVCRPGVGEDAMAAL
A.caulinod STGRHLEEEIAAGRFREDLYHRLSVVPIRVPPLAERREDIPDLVDFFIDLISQTTGLQRRKVGEDAMAVL
G.diazotro ATNRDLQEAIAAGRFREDLYYRLAVVPLRVPSLRERREDIPGLARLFLRRAAENAGLPLRDLSGDAVAAL
S.meliloti STAYNLENMITEGLFREDLYHRLAVIPVRVPALAERREDIPFLVDMFMRQVSEQAGIRPRKIGEDALAVL
Consensus :* .*: * * **:**::**:*:*:***.* ****** *. *: : : :.**:*.*
Sensor I
360 370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.brasilen QAYDWPGNVRQLRNVVDWLLIMAQGD-PKEPIRADQLPPEIGAITPTVLKWDKGGEIMGLPLREAREVFE
A.caulinod QSHDWPGNVRQLRNNVERLLILAGGD-PDAEVTASMLPPDVGALVPTLPNGNGGEHLMGLPLREAREVFE
G.diazotro QSYDWPGNARELRNLMERLLIMMPGN-GSDLIRAEMLPPSVGQGAPALLKFDPAADVMGLPLREARDLFE
S.meliloti QAHDWPGNIRQLRNNIERLMILARSDGPDTPITADMLPNEVGDTLPKIS-AQGDQHIMTLPLREAREMFE
Consensus *::***** *:*** :: *:*: .: . : *. ** .:* * :: .:*********::**
Linker 2 Sensor II
430 440 450 460
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....
A.brasilen REYLLAQVTRFGGNISRTASFVG
MERSALHRKLKSLGVHGSEKGKLFVE
A.caulinod REYLAAQINRFGGNISRTAEFVGMERSALHRKLKALGVG----------
G.diazotro TQYLQAQLLRFGGNISRTAGFVGMERSALHRKLKQLGVTSEERGAG---
S.meliloti RDYLIAQINRFGGNISRTAEFVGMERSALHRKLKSLGV-----------
Consensus ::** **: ****************************
Int ração com DN e A
Os números em azul mostram a região N-terminal, em verde a região central e em vermelho a
região C-terminal. Indicados os motivos funcionais e os linker na região N-terminal e C-terminal. O
resíduo D em vermelho mostra o sítio de fosforilação. A similaridade entre as proteínas NtrX é de
70% e a identidade é de 42%.
F igura 11: Alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína NtrX de A.
brasilense com as proteínas NtrC de A. brasilense, E. coli e S. typhimurium (Clustal
W - THOMPSON et al, 1994).
10 20 30 40 50 60 70
....|....|...
NtrX A.b. -MAHDILIVDDEA
.|....|....|....|....|....|....|....|...*|....|....|....|
DIRMLIAGILNDEGMKTREAADADQAFAQVSARRPSLVVLDIWLQGSRLDGLQILEQ
90 100 110 120 130 140
.|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
rX A . RDHRN
NtrC A.b. MSAATILVADDDRAIRTVLTQALARLGHEVRTTGNASTLWRWVADGQGDLIITDVVMPDE--NGLDLIPR
NtrC E.c. MQRGIVWVVDDDSSIRWVLERALAGAGLTCTTFENGAEVLEALASKTPDVLLSDIRMPGM--DGLALLKQ
NtrC S.t. MQRGIVWVVDDDSSIRWVLERALAGAGLTCTTFENGNEVLAALASKTPDVLLSDIRMPGM--DGLALLKQ
Consensus : :.**: ** :: * * :. :: .::: *: : . :** :: :
80
....|....|....|...
Nt .b LM LRVIMISGHGNIETAVSAIKIGAYDFIEKPFKADRLLLMVDRAIEAARLKRENEELKLRAGGE
NtrC A.b. IKKIRPDLRIIVMSAQNTLITAVKAAERGAFEYLPKPFDLKELVSVVERALNSNTPPAALPADAGEADEQ
NtrC E.c. IKQRHPMLPVIIMTAHSDLDAAVSAYQQGAFDYLPKPFDIDEAVALVERAISHYQEQQQ-PRNVQLNGPT
NtrC S.t. IKQRHPMLPVIIMTAHSDLDAAVSAYQQGAFDYLPKPFDIDEAVALVERAISHYQEQQQ-PRNIEVNGPT
Consensus : : : * :*:::.:. : :**.* : **:::: ***. .. : :*:**:. .
T/SGxGxhxxxhxxh (Bolsa Hidrofóbica) Linker 1
150 160 170 180 190 200 210
..|..
.. ..|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NtrX A.b. VELIGRSTAVNHIYRVLARLMGTDL--TITGESGTGKELVARALHDYGKRRNGPFVAINMAAIPRELIES
NtrC A.b. LPLIGRSPAMQEIYRVLARLMGTDLTVTITGESGTGKELVARALHDYGKRRNGPFVAINMAAIPRELIES
NtrC E.c. TDIIGEAPAMQDVFRIIGRLSRSSISVLINGESGTGKELVAHALHRHSPRAKAPFIALNMAAIPKDLIES
NtrC S.t. TDMIGEAPAMQDLFRIIGRLSRSSISVLINGESGTGKELVAHALHRHSPRAKAPFIALNMAAIPKDLIES
Consensus :**.:.*::.::*::.** :.: *.***********:*** :. * :.**:*:******::****
IxGxxGxGK (Walker A)
60 280
220 230 240 250 2 270
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NtrX A.b. ELFGHEKGAFTGATNRSTGRFEQAQGGTLFLDEIGDMPLEAQTRLLRVLQEGEYTTVGGRTPIKTDVRIV
NtrC A.b. ELFGHEKGAFTGATNRSTGRFEQAQGGTLFLDEIGDMPLEAQTRLLRVLQEGEYTTVGGRTPIKTDVRIV
NtrC E.c. ELFGHEKGAFTGANTIRQGRFEQADGGTLFLDEIGDMPLDVQTRLLRVLADGQFYRVGGYAPVKVDVRII
NtrC S.t. ELFGHEKGAFTGANTIRQGRFEQADGGTLFLDEIGDMPLDVQTRLLRVLADGQFYRVGGYAPVKVDVRII
Consensus *************.. ******:**************:.******** :*:: *** :*:*.****:
Alça 1 (GAFTGA) DExx (Walker B) Alça 2
340 350
290 300 310 320 330
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NtrX A.b. AATHRDLQAEIDQGRFRQDLFYRLAVVPIRVPSLRRR-EDIPLLARHFITLGEAP--VCRPGVGEDAMAA
NtrC A.b. AATHRDLRTLIRQGLFREDLFYRLCVVPIRLPPLRERTEDVPLLVRHFLNQCSAQG-LPVKSIDQPAMDR
NtrC E.c. AATHQNLEQRVQEGKFREDLFHRLNVIRVHLPPLRERREDIPRLARHFLQVAARELGVEAKLLHPETEAA
NtrC S.t. AATHQNLERRVQEGKFREDLFHRLNVIRIHLPPLRERREDIPRLARHFLQVAARELGVEAKLLHPETETA
Consensus ****::*. : :* **:***:** *: :::*.**.* **:* *.***: : : :
Sensor I
00 420
360 370 380 390 4 410
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NtrX A.b. LQAYDWPGNVRQLRNVVDWLLIMAQGDPKEPIRADQLPPEIGAITPTVLKWD--KGGEIMGLPLREAREV
NtrC A.b. LKRYRWPGNVRELENLVRRLAALYS---QEVIGLDVVEAELADTTPAAQPVEEPQGEGLSAAVERHLKDY
NtrC E.c. LTRLAWPGNVRQLENTCRWLTVMAAG---QEVLIQDLPGELFESTVAESTSQMQPDSWATLLAQWADRAL
NtrC S.t. LTRLAWPGNVRQLENTCRWLTVMAAG---QEVLIQDLPGELFEASTPDSPSHLPPDSWATLLAQWADRAL
Consensus * ******:*.* * : : : : : *: : . . . :
Sensor II Linker 2
440 450 460 470 480 490
430
....|....|....|....|....|....|....|....|....|..*.|...*|....|....|....|.
NtrX A.b.
FER-----------EYLLAQVTR---------FGGNISRTASFVGMERSALHRKLKSLGVHGSEKGKLFVE
NtrC A.b. FAAHKDGMPSNGLYDRVLREVERPLISLSLSATRGNQIKAAQLLGLNRNTLRKKIRDLDIQVVRGLK----
NtrC E.c. RSGHQN------LLSEAQPELERTLLTTALRHTQGHKQEAARLLGWGRNTLTRKLKELGME----------
NtrC S.t. RSGHQN------LLSEAQPELERTLLTTALRHTQGHKQEAARLLGWGRNTLTRKLKELGME----------
Consensus . : :* : *: .:* ::* *.:* :*::.*.:.
Interação ao DNA
rmelho a Os números em azul mostram a região N-terminal, em verde a região central e em ve
re al. Indicados os motivos funcionais e os linker na regi N-te inal e C-terminal. O gião C-termin ão rm
m vermelho mostra o sítio de fosforilação. Os resíduos R e K em vermelho são os
resíduo D e
resíduos que provavelmente interagem com o DNA. A similaridade entre as proteínas NtrX é de 61%
e a identidade é de 33%.
Figura 12: Alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína NtrX de A.
brasilense com as proteínas NtrC1 de A. aeolicus e DctD de S. meliloti (Clustal W -
THOM
90 100 110 120 130 140
|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
rX A . DHRNL SAIK FI
.|... .... ...|. .|....|....|
rX A . IVAATHRDLQAEIDQGRFRQDLFYRLAVVPIRVPSLR-RREDIPLLARHFITLGEAPVCR--PGVGEDAM
rX A .
PSON et al, 1994).
10 20 30 40 50 60 70
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NtrX A.b. MAHDILIVDDEADIRMLIAGILNDEGMKTREAADADQAFAQVSARRPSLVVLDIWLQGSRLDGLQILEQL
NtrC1 A.a. --MNVLVIEDDKVFRGLLEEYLSMKGIKVESAERGKEAYKLLSEKHFNVVLLDLLLPD--VNGLEILKWI
DctD S.m. -----------------MQQTLELAGFTVSSFASATEALAELSADFAGIVISDIRMPG--MDGLALFGKV
Consensus : *. *:.. . . :* :* .:* : *: :. ::** :: :
80
....|....|....
Nt .b MR RVIMISGHGNIETAV IGAYD EKPFKADRLLLMVDRAIEAARLKRENEELKLRAGGEV
NtrC1 A.a. KERSPETEVIVITGHGTIKTAVEAMKMGAYDFLTKPCMLEEIELTINKAIEHRKLRKENELLRREKDLKE
DctD S.m. LALDPDLPMILVTGHGDIPMAVQAIQDGAYDFIAKPFAADRLVQSARRAEEKRRLVMENRSLRRAAEAAS
Consensus : :* :::**** **.*::*****: ** :.: :** :* **. *::
Bolsa hidrofóbica Linker 1
150 160 170 180 190 200 210
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NtrX A.b. E---LIGRSTAVNHIYRVLARLMGT--DLTITGESGTGKELVARALHDYGKRRNGPFVAINMAAIPRELI
NtrC1 A.a. E--EYVFESPKMKEILEKIKKISCAECPVLITGESGVGKEVVARLIHKLSDRSKEPFVALNVASIPRDIF
DctD S.m. EGLPLIGQTPAMERLRQTLKHIADTDVDVLVAGETGSGKEVVATLLHQWSRRRTGNFVALNCGALPETVI
Consensus * : .:. ::.: . : :: : : ::**:* ***:** :*. . * . ***:* .::*. ::
40 25 270 280
220 230 2 0 260
..|....|....|....|... .| |. ...|....|...
....|..
trX A. . ELFGH
N b ES EKGAFTGATNRSTGRFEQAQGGTLFLDEIGDMPLEAQTRLLRVLQEGEYTTVGGRTPIKTDVR
NtrC1 A.a. EAELFGYEKGAFTGAVSSKEGFFELADGGTLFLDEIGELSLEAQAKLLRVIESGKFYRLGGRKEIEVNVR
DctD S.m. ESELFGHEPGAFTGAVKKRIGRIEHASGGTLFLDEIEAMPPATQVKMLRVLEAREITPLGTNLTRPVDIR
Consensus *:****:* ******.. * :* *.********* :. :*.::*** :: : :* . .::*
290 300 310 320 330 340 350
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Nt .b
NtrC1 A.a. ILAATNRNIKELVKEGKFREDLYYRLGVIEIEIPPLRERKEDIIPLANHFLKKFSRKYAKEVEGFTKSAQ
DctD S.m. VVAAAKVDLGDPAARGDFREDLYYRLNVVTLSIPPLRERRDDIPLLFSHFLARASERFGREVPAISAAMR
Consensus ::**:: :: .* **:**:*** *: : :*.** *: :** * ** : . : ..
360 370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Nt .b AALQAYDWPGNVRQLRNVVDWLLIMAQGDPKEPIRADQLPPEIGAITPTVLKWDKGGEIMGLPLREAREV
NtrC1 A.a. ELLLSYPWYGNVRELKNVIERAVLFSEGKFIDRGELSCLVNSKG----------------IKNKHKSIKE
DctD S.m. AYLATHSWPGNVRELSHFAERVALGVEGNLGVPAAAPASS--------------------GATLPERLER
Consensus * :: * ****:* :. : : :*. : :
Linker 2
430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NtrX A.b. FEREYLLAQVTRFGGNISRTASFVGMERSALHRKLKSLGVH--------GSEKGKLFVE-
NtrC1 A.a. IEKEEIIKVLKEVNFNKKLASEILGIPLRTLYRRLKEYGIE-------------------
DctD S.m. YEADILKQALTAHCGDVKETLQALGIPRKTFYDKLQRHGINRADYVERAGPGRPNAISKT
Consensus * : : :. : . : . :*: ::: :*: *:.
Em azul estacada a região da bolsa hidrofóbica e do linker 1, apreseestá d ntando alta
Figura 13: Modelo estrutural calculado para os domínios funcionais da proteína NtrX
de Azospirillum brasilense
Asp10
Modelo estrutural teórico dos domínios funcionais da proteína NtrX. (A): região N-terminal da
proteína NtrX, domínio regulatório, contendo o linker 1; (B): estrutura do sítios de fosforilação do
domínio regulatório da proteína NtrX de A. brasilense; (C): região central da proteína NtrX, domínio
AAA+ , a) subdomínio α/β Rossman e b) subdomínio α-hélice; e (D): domínio C-terminal, contendo o
linker 2 e o motivo hélice-volta-hélice.
Asp9
Asp53
Lys105
Ser83
A
B
CD
Linker1
a
b
Asp10
Asp9
Asp53
Lys105
Ser83
Asp10
Asp9
Asp53
Lys105
Ser83
A
B
CD
Linker1
a
b
Asp10
Linker2
Asp9
Asp53
Lys105
Ser83
A
B
CD
Linker1
a
b
Asp10
Asp9
Asp53
Lys105
Ser83
Asp10
Asp9
Asp53
Lys105
Ser83
A
B
CD
Linker1
a
b
Linker2
Figura 14: Árvore filogenética das proteínas que apresentam similaridade de
seqüência de aminoácidos com a proteína NtrX de A. brasilense
Programa: Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).
4.2 – Clonagem do gene ntrX N-truncado no vetor de expressão pET29a+
Os plasmídeos pMCA1 e pET29a+ foram digeridos como descrito no item
.6.1. Os fragmentos de 1,4 kb do plasmídeo pMCA1 e o fragmento de 5,3 kb do
ET29a+ foram ligados e transformados em E. coli DH10B (Figura 6). O DNA
lasmidial das colônias originadas da transformação foi extraído e o plasmídeo que
dos e
analiza
iciais e uma S.Tag foi fusionada a região N-terminal da proteína
(Figura
4.3 – I
L21λ (DE3) codonplus, RosettaBlue (DE3)
pLysS, C41 (DE3) e C43 (DE3) por eletroporação. As células foram cultivadas para
m média 10% em
todos
3
p
p
continham um tamanho molecular maior que o controle pET29a+ foram separa
dos por restrição e seqüenciamento de DNA para confirmação da eficiência
da clonagem.
O plasmídeo, contendo o inserto de 1,4kb, foi denominado pETM-x1 e foi
utilizado para obtenção da proteína NtrX N-truncada fusionada com a cauda S.Tag
na extremidade N-terminal.
Nesta construção foi deletada a seqüência codificadora para oito resíduos de
aminoácidos in
6). Esta região não possui aminoácidos de motivos funcionais importantes
para a função da proteína (Figura 10).
ndução da superexpressão da proteína NtrX S.Tag N-truncada
O plasmídeo pETM-x1, que contém o gene ntrX N-truncado de A. brasilense
expresso a partir do promotor do fago T7 e sob o controle do operon lac, foi
introduzido nas estirpes de E. coli B
indução da proteína NtrX N-truncada como descrito no item 3.6.2.
As células foram coletadas por centrifugação e lisadas na presença de
diferentes tampões (item 3.6.5). O perfil eletroforético mostrou a expressão de uma
proteína com aproximadamente 54 kDa, que corresponde ao tamanho estimado
para a proteína NtrX S.Tag N-truncada de A. brasilense com a fusão da cauda S.Tag
na região N-terminal. Entretanto, a solubilidade desta proteína foi e
os sistemas testados (Figura 15). Quando a proteína NtrX S.Tag N-truncada
foi expressa na estirpe de E. coli BL21AI, utilizando L-arabinose como indutor, em
média 50% da proteína NtrX S.Tag N-truncada estava na fração solúvel. Assim, o
sistema de expressão em BL21AI foi escolhido para expressar a proteína NtrX S.Tag
N-truncada (Figura 16). A indução em larga escala foi realizada em 0,2% de L-
arabinose para evitar a agregação da proteína NtrX superexpressa em maiores
concentrações de L-arabinose.
O aumento da solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada, expressa a
partir da estirpe de E. coli BL21AI, pode estar relacionada com a baixa taxa de
indução ou menor velocidade de expressão da proteína durante as fases iniciais de
crescimento da bactéria, diminuindo a agregação entre as proteínas ou diminuindo a
possib
élulas foram lisadas na presença dos
tampõ
emais tampões utilizados para as etapas de purificação
ilidade de ocorrerem erros no enovelamento da proteína. Considerando que
esta estirpe contém uma inserção cromossomal do gene que codifica a T7 RNA
polimerase (T7 RNA-P) interrompendo o gene araB no operon araBAD, a expressão
de T7 RNA-P está sob controle do promotor do operon araBAD. Usando um vetor de
expressão do tipo promotor T7, como, por exemplo, o vetor pET29a+, a expressão
da proteína pode ser controlada pela variação da concentração de L-arabinose no
meio. Esta estirpe de E. coli é descrita como útil na expressão de proteínas tóxicas
para esta bactéria, devido ao eficiente controle dos níveis de expressão de proteínas
a partir do promotor T7. Os resultados obtidos com a expressão da proteína NtrX
S.Tag N-truncada sugerem que esta estirpe pode ser usada como uma alternativa
para expressar proteínas pouco solúveis.
Para avaliar o efeito do ditiotreitol (DTT) na solubilidade da proteína NtrX
S.Tag N-truncada, as células de E. coli BL21AI, contendo o plasmídeo pETM-x1,
foram cultivadas em meio LB sob condições de indução da proteína NtrX S.Tag N-
truncada, previamente descrito. Estas c
es 2 e 2A (item 3.6.5).
As amostras foram aplicadas em um gel de SDS-PAGE 12% (Figura 17), e
observou-se que a presença de DTT no tampão de lise não interfere na solubilidade
da proteína NtrX S.Tag N-truncada. Desta forma, o tampão de escolha para a lise
celular foi o tampão 2
A. Os d
da proteína também foram preparados sem o DTT. O DTT é usado para reduzir
ligações dissulfeto e manter os monotióis no estado reduzido, estabilizando a
proteína. A presença deste composto no tampão da proteína poderia exercer um
efeito inibitório das propriedades de oligomerização da proteína, influenciando
negativamente os ensaios de caracterização desta proteína.
Figura 15: Solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada de A. brasilense
superexpressa em diferentes estirpes de E. coli
E.coli
BL21λ roteína
NtrX N uncada em tampão 2. Indicadas as frações solúveis e insolúveis de cada sistema de
indução, bem como o agente indutor e a temperatura utilizada.
Perfil eletroforético em SDS-PAGE 12% dos extratos celulares das estirpes de
(DE3) codonplus, RosettaBlue (DE3) pLysS, C41 (DE3) e C43 (DE3) expressando a p
-tr
S I S I S I S I
S I S I S I S I
IPTG
IPTG
Lactose
Lactose
37°C
30°C
IPTG
IPTG
Lactose
Lactose
S I S I S I S I
S I S I S I S I
IPTG
IPTG
Lactose
LactoseIPTG
IPTG
Lactose
Lactose
IPTG
IPTG
Lactose
LactoseIPTG
IPTG
Lactose
Lactose
37°C
30°C
37°C
30°C
37°C
30°C
37°C
30°C
37°C
30°C
S I S I S I S I
I S I S I S I S
IPTG
IPTGLactose
Lactose
37°C
30°C
IPTG
IPTG
Lactose
Lactose
I S I S I S I S
S I S I S I S I
IPTG
IPTG
Lactose
Lactose
IPTG
IPTGLactose
Lactose
37°C
30°C
37°C
30°C
37°C
30°C
Figura 16: Solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada superexpressa em E. coli
BL21AI
erfil eletroforético em SDS-PAGE 12% dos extratos celulares das estirpes de E.coli BL21AI
expressando a proteína NtrX S.Tag N-truncada induzida com diferentes concentrações de L-
arabinose em tampão 2. Indicadas as frações solúveis e insolúveis de cada sistema de indução.
S I S I S I
0,02% 0,2% 2%
S I S I S I
0,02% 0,2% 2%
P
Figura 17: Efeito do DTT na solubilidade da proteína NtrX S.Tag N-truncada
rético em SDS-PAGE 12% dos extratos celulares das estirpes de E.coli BL21AI
expressando a proteína NtrX S.Tag N-truncada. As células foram lisadas em tampão com e sem DTT
(item 3.6.5). Linhas (P): frações insolúveis e linhas (S): frações solúveis, contendo ou não DTT nos
tampõe de sonicação, como indicado abaixo da figura. Linhas (M): marcador de massa molecular,
(CI): extrato bruto da indução e (CpET): controle negativo, indução apenas com o vetor pET29a+.
Perfil eletrofo
s
Com DTT Sem DTT
P S P S M CI CpET
Com DTT Sem DTT
P S P S M CI CpET
67
43
54
Com DTT Sem DTT
P S P S M CI CpET
Com DTT Sem DTT
P S P S M CI CpET
67
43
54
4.4 – Purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada
Após a indução de 2 L de meio de cultura, as células foram coletadas,
ssuspensas em aproximadamente 10 mL de tampão de lise 2A e sonicadas. O
xtrato foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado e diluído com 40 mL de
0%) e NaCl (500 mmol/L)
presen
e polietersulfona Vivaspin 6 (Vivascience) e dialisadas
na pre
ína, e outras proteínas, que dificultam a remoção
de con
re
e
tampão A para diminuir a quantidade de glicerol (5
tes no tampão de lise. A presença de 50% de glicerol e alta concentração de
NaCl no tampão de lise foram essenciais para aumentar a solubilidade da proteína.
Em seguida, a proteína foi purificada por cromatografia de troca aniônica em Q-
Sepharose, e uma alíquota de cada fração foi aplicada em gel de SDS-PAGE 12%
para a visualização do perfil de eluição da proteína NtrX S.Tag N-truncada. Nesta
etapa cormatográfica houve redução da quantidade de contaminantes, com uma
pureza de 28,7% (Tabela 2).
As frações com perfil semelhante foram agrupadas, dialisadas na presença de
tampão A e aplicadas na coluna Agarose-Heparina. Após esta etapa cromatográfica,
as frações que continham a proteína NtrX S.Tag N-truncada mais pura foram
concentradas por membrana d
sença de tampão A. A pureza obtida nestas frações foi de 75,8% (Tabela 2) e
a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade em Agarose-S.Tag, utilizando
o kit de purificação de proteínas fusionadas com cauda S.Tag (Novagen). Após esta
etapa cromatográfica, a proteína NtrX S.tag N-truncada apresentou 90% de pureza
(Tabela 2). Em seguida, a proteína foi dializada em tampão A contendo 50% de
glicerol (Figura 18) e estocada a –20°C. Esta fração foi utilizada nos experimentos
de caracterização desta proteína.
O baixo rendimento da purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada (Tabela
2) pode ser explicado pela baixa solubilidade da proteína ou pela própria
característica estrutural da proteína, de interação com o DNA, oligomerização, que
diminuem a concentração de prote
taminantes. Além disso, a proteína NtrX S.Tag N-truncada apresentou baixa
eficiência de ligação da cauda S.Tag da proteína à S.Tag Agarose, mesmo seguindo
as orientações do fabricante, resultando em grande perda da proteína na fração de
ligação e lavagens.
A proteína NtrC de
E. coli expressa a partir de seu próprio promotor foi
purificada usando colunas de fosfocelulose e DNA-agarose (REITZER e
MAGASANIK, 1983). A proteína NtrC de E. coli, Klebsiella pneumoniae e Salmonella
typhimurium superexpressas a partir de um promotor T7 promoter foram purificadas
na for
Fração Proteínas Totais (mg) Pureza (%) Rendimento (%)
ma solúvel usando colunas de afinidade ou heparina (MOORE et al, 1993;
HAWKES et al, 1985; KLOSE et al 1994). Ainda, a proteína NtrC de
S. typhimurium
fusionada a uma proteína ligadora de maltose (MBP-NtrC) foi purificada com alto
rendimento e tendo atividade de ATPase e fosforilação similar aquelas proteínas
NtrC nativas (REITZER e MAGASANIK, 1983). A proteína NtrC1 de
Aquifex aeolicus
foi também purificada na forma solúvel (LEE et al, 2003). Em contraste com esses
resultados, a proteína NtrC de
Herbaspirillum seropedicae fusionada a uma cauda
His não era solúvel quando superexpressa em
E. coli a partir de um promotor T7.
Para a purificação, esta proteína foi solubilizada com N-lauril-sarcosina e a atividade
de ligação ao DNA foi recuperada após a remoção deste detergente
(TWERDOCHLIB et al, 2003). Como a proteína NtrX superexpressa estava
parcialmente solúvel, nós escolhemos purificar esta proteína na sua forma nativa, ao
invés de usar condições de solubilização mais severos, mesmo com um baixo
rendimento final.
Tabela 2: Passos de purificação da proteína NtrX S.Tag N-truncada expressa em E.
coli estirpe BL21AI
Fração Solúvel 77,5 - 100
Q-Sepharose 21,4 28,7 27,61
Heparina 2,04 75,8 2,63
S.Tag Kit 0,72 90 0,93
Figura 18: Perfil da proteína NtrX S.Tag N-truncada após as diferentes etapas
romatográficas
erifl eletroforético em s os passos de purificação da proteína NtrX
S.Tag N-truncada. Linha 1: marcador de massa molecular, linha 2: a proteína NtrX S.Tag N-truncada
após a ltima etapa de purificação. A amostra de proteína foi concentrada 10x em membrana de
polietersulfona (Vivascience) e dialisada em tampão contendo 50% de glicerol.
4.5 – Análise da proteína NtrX S.Tag N-truncada p
ixação no suporte
etálico do espectrômetro, foi obtido um espectro dos peptídeos da proteína NtrX
parados com o perfil espectrométrico teórico da proteína NtrX
N-trun
c
1 2
67
43
54
1 2
67
43
54
P SDS-PAGE 12% após todo
ú
or espectrometria de massa
tipo MALDI-ToF/MS
Após a preparação da amostra com a matriz HCCA e f
m
S.Tag N-truncada pelos programas Flex Control e Flex Analysis (Bruker Daltonics).
Estes picos foram com
cada, produzido pelo programa MS-Digest (Protein Prospector) a partir da
seqüência de aminoácidos da proteína desta proteína.
O resultado da comparação entre o espectro teórico e o experimental mostrou
homologia entre 7 picos de identificação de peptídeos, expressos em valores de
massas moleculares (Da) (Tabela 3). Desta forma, podemos afirmar que a banda
que está sendo purificada corresponde à proteína NtrX S.Tag N-truncada. O
cromatograma obtido na análise está representado na figura 19.
Tabela 3: Valores das massas moleculares dos peptídeos detectados pelo
espectrômetro de massa tipo MALDI-ToF/MS
Valores Valores Valores Valores
Experimentais (Da) Teóricos (Da) Experimentais (Da) Teóricos (Da)
1000.558 1000.5422 1537.836 -
1082.695 1082.6317 1539.959 -
1119.636 - 1549.810 1549.7241
1130.671 - 1624.315 -
1144.694 - 1718.115 -
1279.756 - 1739.075 1738.9963
1367.843 - 1753.042 1752.9279
1427.880 1427 569 1769.9221 .7 1770.052
1520.009 - 1886.089 -
A identificação de experimenta ão conf os
peptídeos teóricos deve-se ao fato de que a digestão tríptica pode não ter sido total
ou a identificação de peptídeos da própria tripsina ou de contaminantes externos a
amost
elo espectrômetro de massa tipo
MALDI-ToF/MS
peptídeos is que n erem com
ra, como a queratina proveniente da pele.
Figura 19: Cromatograma dos peptídeos produzidos por digestão tríptica da
proteína NtrX S.Tag N-truncada identificados p
4.6 – Determinação da atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-truncada
A reação de hidrólise de ATP mediada pela proteína NtrX S.Tag N-truncada é
visualizada pela oxidação do NADH acompanhada pela diminuição do valor de
absorbância do sistema de reação a 340nm, comprimento de onda referente ao pico
máximo de absorção de luz pelo NADH.
A proteína NtrC de
E. coli foi usada como controle positivo da reação por
apresentar uma atividade de ATPase bem caracterizada (WEISS et al, 1991;
AUSTIN e DIXON, 1992; WIDDICK et al, 1998). O controle negativo da reação foi
feito com ausência da proteína NtrX N-truncada.
A atividade de ATPase da proteína NtrX foi testada na presença de
plasmídeos contendo regiões promotoras tipo sigma 54, incluindo a seqüência de
ligação da proteína NtrC (UAS-NtrC) (Figura 21) e sigma 70 (Figura 22), e na
presença de carbamil-fosfato.
Os resultados da atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-truncada
estão representados na figura 20, expressa em número de mol/L de ATP
hidrolisados por minuto.
A proteína NtrX S.Tag N-truncada foi capaz de hidrolisar o ATP a ADP de
maneira dependente da concentração de proteína (Figura 20), sugerindo que a
estirpe de
E. coli BL21AI expressou a proteína NtrX S.Tag N-truncada na forma
solúvel e ativa. Além disso, a atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-
truncada de
A. brasilense foi similar a NtrC de E. coli (WIDDICK et al, 1998).
A proteína NtrC ativa o promotor dos genes
glnBA de A. brasilense,
provavelmente por ligação à região NtrC-UAS localizada a montante do promotor do
tipo
σ-54 (HUERGO et al, 2003). A ligação da proteína NtrC à seqüência UAS
estimula a atividade de ATPase, um efeito realçado pela fosforilação (WIDDICK et al,
1998). Considerando os indícios de que a proteína NtrX pode substituir a proteína
NtrC (VITORINO et al, 2001; DREPPER et al, 2006), a atividade de ATPase da
proteína NtrX S.Tag N-truncada foi avaliada na presença do plasmídeo pLHglnBTZ,
que contém a região promotora dos genes
glnBA (Figura 21) e na presença de
carbamil-fosfato, doador de fosfato para a proteína.
Adicionando o plasmídeo contendo o promotor de
glnBA (σ-54 dependente
incluindo a região NtrC UAS; Figura 21), a atividade de ATPase das proteínas NtrX
S.Tag N-truncada e NtrC aumentaram significativamente (
p < 0,05), no entanto, a
adição do plasmídeo contendo o promotor do operon ntrYX (σ-70 dependente) não
alterou a atividade de ATPase (
p < 0,05). A adição de carbamil-fosfato no sistema
também aumentou a atividade de ATPase das proteínas NtrX S.Tag N-truncada e
NtrC significativamente (
p < 0,05). Além disso, quando foram adicionados carbamil-
fosfato e DNA plasmidial contendo o promotor
σ-54 dependente e NtrC-UAS, a
atividade de ATPase aumentou significativamente (
p < 0,05). O perfil de atividade de
ATPase foi similar àquelas da proteína NtrC de
E. coli e K. pneumoniae, onde a
fosforilação e adição de DNA contendo a região NtrC-UAS apresentam um efeito
sinérgico (WIDDICK et al, 1998; YANG et al, 2004). Esses resultados sugerem que a
seqüência presente na região promotora dos genes
glnBA é capaz de realçar a
atividade de NtrX S.Tag N-truncada, um efeito similar àquele observado para a
proteína NtrC de
E. coli (WIDDICK et al, 1998; YANG et al, 2004). Os resultados in
vitro da atividade de ATPase mostram que a proteína NtrX de A. brasilense
apresenta atividade semelhante a NtrC de
E. coli, sugerindo que a resposta
biológica produzida via sistema NtrBC e NtrYX também podem ser semelhantes.
Possivelmente, a presença de carbamil-fosfato e do promotor tipo sigma 54
possam estar favorecendo a formação do oligômero da proteína NtrX S.Tag,
causando o aumento da atividade de ATPase desta proteína, bem como da proteína
NtrC de
E. coli.
As análises
in silico das proteínas NtrY e NtrX sugerem que elas constituem
um sistema de dois componentes similar a NtrBC, também envolvido no
metabolismo de fontes alternativas de nitrogênio.
A proteína NtrY é o componente sensor, e análises usando o programa
SMART (SCHULTZ et al, 1998) mostram que o domínio N-terminal contém quatro
regiões transmembrana. A região central contém dois domínios: o domínio HAMP,
presente em várias proteínas sensoras transmembrana histidina quinase e fosfatase
e PFAM-PAS, um domínio de interação com fatores de sinalização; o domínio
HisKA, que é o domínio fosforeceptor. A região C-terminal contém um domínio
HATPaseC, responsável pela ligação ao ATP. Em contraste, a proteína NtrB não
possui região transmembrana, mas contém um domínio sensor PAS seguido dos
domínios HisKA e HATPaseC.
A estrutura dos domínios da proteína NtrX é bastante similar à proteína NtrC.
Ambas são “enhancer binding proteins” reguladoras de resposta (EBPs-RRs), que
contém um domínio sensor N-terminal (REC), um domínio central catalítico (AAA+) e
um domínio de ligação ao DNA C-terminal (HTH).
O fato de que a grande diferença entre os sistemas NtrBC e NtrYX está na
proteína sensora, sendo NtrB é uma sinalizadora intracelular e NtrY uma provável
sinalizadora extracelular, sugere que possa existir uma intercomunicação entre
esses sistemas. Em
Rhodobacter capsulatus a proteína NtrY é capaz de fosforilar a
proteína NtrC, revelando uma intercomunicação entre os dois sistemas regulatórios
(DREPPER et al, 2006).
Análises estruturais dos domínios sugerem que as maiores diferenças entre
esses sistemas estão na proteína sensora, onde a proteína NtrY é transmembrana e
provavelmente está envolvida na sinalização extracelular de níveis de nitrogênio,
enquanto que a proteína NtrB é sensora de níveis intracelulares, interagindo com a
proteína GlnB. Juntos esses resultados sugerem que pode haver uma
intercomunicação entre os sistemas NtrBC e NtrYX em
A. brasilense como
observado em
R. capsulatus.
Figura 20: Gráfico da atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-truncada
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 200 400 600 800 1000 1200
[protein] (nmol/L)
ATPase activity (mol/L ATP . min
-1
)
*
*
*
*
*
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 200 400 600 800 1000 1200
[protein] (nmol/L)
ATPase activity (mol/L ATP . min
-1
)
*
*
*
*
*
Atividade de ATPase da proteína NtrX N-truncada. Os símbolos são: (losango aberto)
somente a proteína NtrC; (losango fechado) somente a proteína NtrX N-truncada; (cruz com linha
tracejada) proteína NtrC com adição de 10 nmol/L de DNA plasmídeo contendo o promotor σ
70
dos
genes ntrYX; (cruzes) proteína NtrX N-truncada com adição de 10 nmol/L de DNA plasmídeo
contendo o promotor σ
70
dos genes ntrYX; (círculos abertos) proteína NtrC com adição de 10 nmol/L
de DNA plasmídeo contendo o promotor σ
54
dos genes glnBA e a região de ligação da proteína NtrC;
(círculos fechados) proteína NtrX N-truncada com adição de 10 nmol/L de DNA plasmídeo contendo o
promotor σ
54
dos genes glnBA e a região de ligação da proteína NtrC; (quadrados abertos) proteína
NtrC com adição de 10 mmol/L de carbamil-fosfato; (quadrados fechados) proteína NtrX N-truncada
com adição de 10 mmol/L de carbamil-fosfato; (triângulos abertos) proteína NtrC com adição de 10
mmol/L de carbamil-fosfato e 10 nmol/L de DNA plasmídeo contendo o promotor σ
54
dos genes glnBA
e a região de ligação da proteína NtrC; (triângulos fechados) proteína NtrX N-truncada com adição de
10 mmol/L de carbamil-fosfato e 10 nmol/L de DNA plasmídeo contendo o promotor σ
54
dos genes
glnBA e a região de ligação da proteína NtrC. (*) indicam os valores de atividade de ATPase
significativamente aumentados (p < 0,05).
Figura 21: Seqüência de nucleotídeos da região promotora do gene glnB de A.
brasilense
-288 CACCTTGTCCATCAATGTGAAAAGCCGGGTGGAAAGCCGGCGCTACCCCATCCAA
NtrC UAS-2 NtrC UAS-1
-233 CGGACAAGGCTGCGGGATTGCTTGCAGCATGTGCACAAATATTGTTCACTTCGCC
glnBp1
σ
70
RNA 1
NtrC UAS-3
-178 CTATCCGTTGGCAGTCGCGTGCCGCCCACGGTGGCATCGGCCCGCTGCGGCCCGG
-123 CATCCCACGCAGCCGATCGCAACCGCTCCGATTGGCACG
CAACGTGCTTTACATC
glnBp2
σ
54
-68 GGACCGTCGGCAGAGGCCTGGACGGTGCCTGCCGACGTTGGCACCTCGTACACGA
RNA 2
-7 GAGACCCATG
Início de Transcrição
-288 CACCTTGTCCATCAATGTGAAAAGCCGGGTGGAAAGCCGGCGCTACCCCATCCAA
NtrC UAS-2 NtrC UAS-1
-233 CGGACAAGGCTGCGGGATTGCTTGCAGCATGTGCACAAATATTGTTCACTTCGCC
glnBp1
σ
70
RNA 1
NtrC UAS-3
-178 CTATCCGTTGGCAGTCGCGTGCCGCCCACGGTGGCATCGGCCCGCTGCGGCCCGG
-123 CATCCCACGCAGCCGATCGCAACCGCTCCGATTGGCACG
CAACGTGCTTTACATC
glnBp2
σ
54
-68 GGACCGTCGGCAGAGGCCTGGACGGTGCCTGCCGACGTTGGCACCTCGTACACGA
RNA 2
-7 GAGACCCATG
Início de Transcrição
Seqüência de nucleotídeos da região promotora do gene glnB de A. brasilense contida no
plasmídeo pLHglnBTZ, utilizado nos ensaios de ATPase. Identificados os sítios de ligação para a
proteína NtrC e o sítio de ligação para o fator sigma 54.
Figura 22: Seqüência de nucleotídeos da região promotora do operon ntrYX de A.
brasilense
-188 TGATCCGGCGCCGGGCGGTTCGGCCCGGCGTCGCTACCAGCCCACAGCGTGTTGT
-133 TTTTGCGACAGGCTTTTGGCACCTCTGCCGTTCGCGATGCTCCTTAGGGACTGTG
-78 CGAAAGGCAGAGGGGTTGCCGCTTGGCAGGACGGCAACAGCTCGTGTATCATTCT
ntrYXp
σ
70
-23 GGCAACAGACTGGTTGCCGGATTGATG
RBS
Seqüência de nucleotídeos da região promotora do operon ntrYX de A. brasilense contida no
plasmídeo pSPL46, utilizado nos ensaios de ATPase. Promotor ainda não caracterizado. O plasmídeo
pSPL46 contém toda a região intergênica entre os genes ntrC e ntrY.
5. CONCLUSÕES
As análises da estrutura da proteína NtrX de
A. brasilense sugerem que é
uma proteína EBP regulada negativamente pela presença do
linker (L1) entre os
domínios N-terminal e central.
O sistema de indução utilizando a estirpe de
E. coli BL21AI e L-arabinose
como indutor foi mais eficiente para aumentar a solubilidade da proteína NtrX S.Tag
N-truncada.
A atividade de ATPase da proteína NtrX S.Tag N-truncada é dependente de
promotor sigma-54 e fosforilação, semelhante a proteína NtrC de
E. coli.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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