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CARACTERIZAÇÃO ÓPTICA E ELETROFISIOLÓGICA DA TRANSIÇÃO
ENTRE OS ESTADOS EPILEPSIA E DEPRESSÃO ALASTRANTE
Juliana Perpétua de Carvalho
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FÍSICA, QUÍMICA E NEUROCIÊNCIA DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI COMO PARTE DOS
REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
CIÊNCIAS EM NEUROFÍSICA.
Aprovada por:
________________________________________________
Prof. Dr. Antônio-Carlos Guimarães de Almeida
(Presidente)
________________________________________________
Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa
________________________________________________
Prof. Dr. José Paulo Mendonça
SÃO JOÃO DEL-REI, MG - BRASIL
JUNHO DE 2005
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CARVALHO, JULIANA PERPÉTUA DE
Caracterização Óptica e Eletrofisiológica
da Transição entre os Estados Epilepsia e
Depressão Alastrante
[MG] 2005
VII, 95 p. 29,7 cm ( FIQUINE /UFSJ,
M. Sc., Neurofísica, 2000)
Dissertação – Universidade Federal de
São João del Rei, FIQUINE
1. Modelagem de Fenômenos Biológicos
I. FIQUINE/UFSJ II. Título (série)
ii
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Aos meus pais, Roberto e Aparecida, por todo carinho, cuidado e apoio
incondicionais em todos os momentos da vida. Que a concretização desse trabalho seja
um motivo de orgulho em suas vidas.
Aos meus irmãos, Bruno, Rosana
e Viviane, cuja simples existência é o
motivo maior da minha busca incansável
de crescimento.
iii
Agradecimentos
Ao professor Antônio-Carlos Guimarães de Almeida por ter acreditado em mim
e ter me dado a oportunidade de concretizar esse trabalho.
Aos professores Mário Antônio Duarte e João Domingos Scalon, pelo carinho,
amizade, respeito e aprendizado durante toda a caminhada.
À Lucélia e Pauliani, minhas parceiras de mestrado, pelo companheirismo e total
cumplicidade em todos os momentos. Espero que nossa amizade não se perca com o
tempo e a distância.
Um agradecimento especial ao aluno Antônio Márcio Rodrigues, pelo apoio,
incentivo e colaboração, indispensáveis para o desenvolvimento desse trabalho.
Aos alunos Rodrigo Seixas de Carvalho e Hewerson Zansávio Teixeira pela
ajuda e paciência em todas as horas.
Aos amigos do LANEC, Maristela, Mariana, Bete, Elaine, Maísa, Laila, Telma,
Simone, D. Helena, Celso, Ricardo, Hugo, Ramon, Douglas e Marcelo, pelos muitos
momentos que deixarão saudades.
À Dona Lia que me recebeu de braços abertos e, em muitos momentos, foi mãe e
amiga.
Aos meus companheiros de pensão, Davidson e Éder, pelo carinho, compreensão
e pela família que formamos enquanto estivemos juntos.
Às minhas amigas do coração, Elizabete e Renata, por me emprestarem o ombro,
compartilharem comigo dias de sol e simplesmente por existirem na minha vida.
Ao meu querido Eudes e aos seus pais, que apesar da distância, se mantiveram
perto de mim em todos os momentos.
iv
À secretária Maria Inês Charbel, pelo carinho, dedicação e por ser a responsável
direta pelo meu ingresso nesse curso.
À cidade de São João del-Rei que me acolheu calorosamente, e fez com que eu
me sentisse em casa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pelo indispensável auxílio financeiro.
... e a Deus, simplesmente por tudo.
v
Resumo da Dissertação apresentada à FIQUINE/UFSJ como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau em Mestre em Ciências (M. Sc.)
CARACTERIZAÇÃO ÓPTICA E ELETROFISIOLÓGICA ENTRE OS ESTADOS
EPILEPSIA E DEPRESSÃO ALASTRANTE
Juliana Perpétua de Carvalho
Junho/2005
Orientador: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida
Co-orientadores: Mário Antônio Duarte
João Domingos Scalon
Programa: FIQUINE
Departamento: Engenharia Biomédica
As atividades epileptiformes (AE’s) não-sinápticas do giro denteado (GD),
registradas através do potencial extracelular, são caracterizadas por eventos de longa
duração, constituídos de duas componentes: uma em nível DC e outra em freqüências
mais altas. Os potenciais extracelulares desses eventos apresentam morfologias que
podem ser distribuídas em quatro grupos distintos. Um deles, denominado grupo D,
pode ser confundido como um evento de Depressão Alastrante (DA). No presente
trabalho foram combinados métodos experimentais eletrofisiológicos e ópticos, e
simulações computacionais, para a caracterização de AE’s não-sinápticas espontâneas,
ao longo de suas transições para a DA. Os experimentos consistiram da indução de
AE’s em fatias do hipocampo de rato, utilizando o protocolo experimental zero-Ca
2+
e
alto-K
+
extracelular (8,2 mM), e DA´s por hipóxia ou espontâneas. Os resultados
permitiram identificar a camada granular (CG) do GD como a camada que concentra a
maior variação do sinal óptico intrínseco (IOS) durante a ocorrência de AE’s não-
sinápticas, justificando a construção de imagens do IOS dessa camada. A interpretação
das imagens, comparativamente a simulações computacionais, permitiu associar a
amplitude da componente DC do potencial extracelular à alterações do IOS. Os
resultados indicaram que enquanto eventos de DA apresentam uma dinâmica de
propagação bem definida, os eventos de AE’s espontâneas não-sinápticas não são
caracterizados por uma dinâmica espacial do tipo onda de propagação.
vi
Abstract of Dissertation presented to FIQUINE/UFSJ as a partial fulfillment of the
requirements for the degree of Master of Science (M. Sc.)
OPTICAL AND ELETROPHISIOLOGICAL CHARACTERIZATION BETWEEN
EPILEPTIC STATES AND SPREADING DEPRESSION
Juliana Perpétua de Carvalho
June/2005
Advisor: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida
Co-Advisor: Mário Antônio Duarte
João Domingos Scalon
Program: FIQUINE
Departament: Biomedical Engineering
The non-synaptic epileptiform activities (EA) of the dentate gyrus (DG),
registered through the extracellular potential, are characterized by long-term events,
composed by two components: one in DC level and another in higher frequencies. The
extracellular potentials of these events show morphologies that can be classified in four
distinct groups. One of them, called D group, can be confound with an event of
Spreading Depression (SD). In the present work electrophysiological and optical
experimental methods and computational simulations were combined to characterize
spontaneous non-synaptic EA, during their transitions to SD. The experiments consisted
of the induction on EA on hippocampal slices using extracellular zero-Ca
2+
and high-K
+
(8.2 mM) protocol, and SD induced by hipoxy or spontaneously. The results allowed to
identify the granulate layer (GL) of DG as the one that concentrate the greater intrinsic
optical signal (IOS) variation during the occurrence of the non-synaptic EA, justifying
the construction of IOS images of this layer. The interpretation of the images,
comparatively to the computational simulations, allowed associating the amplitude of
the DC component of the extracellular potential to the IOS alterations. The results
indicated that while the SD events present a well-defined propagation dynamic, the
spontaneous non-synaptic EA events are not characterized by a spatial dynamic like
propagation wave.
vii
SUMÁRIO
I – INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
II - REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................. 3
.......................................................................................................................................... 3
II.1 - Atividades epileptiformes sustentadas por mecanismos não-sinápticos ....... 3
II.2 - Participação de mecanismos não sinápticos durante as AE’s ....................... 5
II.2.1 - Acoplamento eletrotônico via gap-junctions ................................................ 5
II.2.2 - Efeito efáptico ............................................................................................... 9
II.2.3 - Efeito de campo elétrico .............................................................................. 10
II.2.4 - Flutuações iônicas ....................................................................................... 12
II.3 - A Depressão Alastrante ................................................................................... 14
II.4 - Velocidade de propagação de eventos de AE e de DA ................................. 17
II.5 - Registro do Sinal óptico intrínseco durante as AE’s ................................... 18
III – MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 22
III.1 - Registro do potencial extracelular sobre a CG do GD ................................ 22
III.2 - Registro simultâneo do potencial extracelular e do IOS ............................. 22
III.3 - Procedimento para obtenção das fatias ........................................................ 22
III.4 - Equipamentos necessários para os experimentos ........................................ 26
III.4.1 - Câmara de perfusão .................................................................................... 26
III.4.2 - Câmara de interface .................................................................................... 27
III.4.3 - Sistema de aquisição .................................................................................. 29
III.4.4 - Sistema de visualização ............................................................................. 30
III.5 - Cálculo da velocidade dos eventos ................................................................ 31
III.6 - Registro das imagens do IOS ......................................................................... 32
III.6.1 - Procedimento de captura das imagens ....................................................... 32
III.6.2 - IOS em um sítio da fatia ............................................................................. 33
III.6.3 - Imagens das Variações do IOS durante as AE’s e DA .............................. 34
III.6.4 - Imagem da variação espaço-temporal do IOS ........................................... 34
III.6.5 - Fluxograma para os procedimentos adotados para o processamento das
imagens .................................................................................................................... 36
III.7 - Simulação computacional ............................................................................. 37
III.7.1 - Estrutura geral ............................................................................................ 37
III.7.2 - Eletrodifusão para o meio extracelular. ...................................................... 39
III.7.3 - Eletrodifusão intercelular (gap-junction) ................................................... 40
III.7.4 - Correntes iônicas transmembrânicas .......................................................... 41
III.7.5 - Co-transporte K+- Cl- (KCC) .................................................................... 41
III.7.6 - Co-transporte Na+- K+- Cl- (NKCC) ........................................................ 42
III.7.7 - Bombas de Na/K. ....................................................................................... 42
III.7.8 - Cálculo do potencial transmembrânico. ..................................................... 43
III.7.9 - Cálculo da variação de volume .................................................................. 44
viii
III.7.10 - Simulação do IOS das AE’s .................................................................... 44
IV - RESULTADOS EXPERIMENTAIS ..................................................................... 47
IV.1 - Estimativa da velocidade de propagação dos eventos ................................ 47
IV.2 - Registro simultâneo do potencial extracelular e do IOS ............................. 52
IV.2.1 - Perfil do IOS para as camadas do GD ........................................................ 52
IV.2.2 - Relação entre o IOS e o potencial extracelular característico das AE’s ... 53
IV.2.2.1 - IOS característico de bursts do grupo A ................................................. 54
IV.2.2.2 - IOS característico de bursts do grupo B .................................................. 55
IV.2.2.3 - IOS característico de bursts do grupo C .................................................. 56
IV.2.2.4 - IOS característico de bursts do grupo D ................................................ 57
IV.2.3 - IOS característico da onda de DA ............................................................. 58
IV.2.4 - Identificação de um novo grupo morfológico de burst ............................. 60
IV.2.5 - Ocorrência de AE’s nas regiões do GD .................................................... 60
V - RESULTADOS DA SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL ..................................... 62
VI - DISCUSSÕES ......................................................................................................... 70
VII - CONCLUSÃO ........................................................................................................ 75
VIII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 77
ix
LISTA DE SÍMBOLOS E NOMEMCLATURA
Símbolo Descrição
∇
Operador Gradiente
gj
j
D
Constante de difusão do íon j nas gap-junctions
i
PADP
K
,
Constantes de dissociação de ADP e fósforo
i
ATP
K
Constantes de dissociação de ATP
i
Na
K
e
i
K
K
Constantes de dissociação intracelulares de Na
+
e K
+
o
Na
K
e
o
K
K
Constantes de dissociação extracelulares de Na
+
e K
+
λ
Tortuosidade
φ
Fluxo iônico (mM/s)
∇
2
Operador Laplaciano
[X]
y
Concentração do íon X no meio y (y = o, extracelular; y = i,
intracelular). ex: [K
+
]
o
A Área (m
2
)
A
gj
Área da gap-junctions
A
m
Área da membrana
C Concentração iônica (mM)
DA Depressão alastrante
D
j
Constante de difusão iônica do íon j (cm
2
/s)
d
n
Distância entre o centro do corpo celular neuronal
F Constante de Faraday (96,487 C/mMol)
GD Giro denteado
IP
Infrapiramidal
SP
Suprapiramidal
CA
Corno Ammon
x
Símbolo Descrição
IOS
Sinal Óptico Intrínseco
AE
Atividade epileptiforme
A Apex
CG Camada granular
imagem VET Imagem da variação espaço-temporal
I
n
m
Corrente total de membrana no neurônio
P
j
Permeabilidade transmembrânica do íon j
PS População de espículas, do inglês, population spike
Q
KCC
Constante de proporcionalidade do co-transporte KCC
Q
NKCC
Constante de proporcionalidade do co-transporte NKCC
t Instante de tempo
V Potencial extracelular
V
g
. Volume glial
V
m
Potencial de membrana
V
n
Volume neuronal
V
PA
Potencial elétrico no compartimento (x,y,z)
z
j
Valência do íon j
xi
I – INTRODUÇÃO
A epilepsia é o distúrbio neurológico mais comum atingindo cerca de 2% da
população mundial. Estudos revelam que aproximadamente 30% das epilepsias são
refratárias ao tratamento, embora muito conhecimento tenha sido acumulado desde a
identificação das epilepsias como patologias. Há previsões de que o tratamento e
prevenção das epilepsias devam alcançar maiores avanços com a identificação e síntese
de novas drogas capazes de agir de forma mais seletiva sobre a atividade neuronal. Os
chamados modelos experimentais para epilepsias assumem papel fundamental tanto na
fase de testes, quanto de estudos dos mecanismos geradores das crises.
As atividades epilépticas induzidas em modelos experimentais, chamadas
atividades epileptiformes, têm muitas características comuns à epilepsia humana. Por
isso, é possível, através de manobras experimentais criteriosas com estes modelos,
estudar as bases fisiológicas, bioquímicas e anatômicas das atividades epilépticas
(ENGEL, 1989). As AE’s são caracterizadas por descargas espontâneas e hiper-
síncronas de populações de neurônios.
Estudos revelam que, durante a indução de AE’s não-sinápticas no GD, há
ocorrência de grupos distintos de eventos epileptiformes os quais são agrupados devido
a suas morfologias (bursts dos grupos A, B e C segundo CARVALHO, 2003). Em
trabalhos posteriores, ainda não publicados (CARVALHO), também foi identificada a
ocorrência de um grupo morfológico o qual foi denominado burst do grupo D. A
ocorrência desse tipo de burst parece ser um indicativo da transição entre estados de
AE’s e de DA. Entretanto, a não ocorrência dos mesmos não implica na não ocorrência
de DA. Em alguns casos, quando há a ocorrência predominantemente de bursts do
grupo C, a alteração da excitabilidade do tecido pode ser suficiente para propiciar uma
transição direta para a DA, sem a ocorrência de eventos do grupo D.
Como a ocorrência de bursts do grupo D antecede a deflagração da onda de DA e
eventos desse grupo apresentam semelhança morfológica com o fenômeno descoberto
por LEÃO, são necessários maiores estudos, tais como a sua caracterização
eletrofisiológica, para comprovar se esses são eventos de AE ou de DA. Sendo assim, o
objetivo desse trabalho foi caracterizar as diferenças ópticas e eletrofisiológicas entre os
eventos de AE e de DA, durante a perfusão de fatias de hipocampo com solução a zero-
Ca
2+
e alto-K
+
. A caracterização foi feita através do estudo espaço-temporal do potencial
1
extracelular, medido com pares de eletrodos, e do IOS, capturado em imagens que, após
processamento, permitem estudar o comportamento dos eventos de AE e de DA.
Concomitantes aos estudos experimentais, foram feitas simulações computacionais que
reproduziram os eventos epileptiformes (bursts) e a transição para a DA no GD.
No capítulo II fez-se uma revisão da literatura onde AE’s no GD foram definidas
e caracterizadas. A seguir, descrevem-se os mecanismos não-sinápticos de conexão
neuronal, que sustentam as AE’s com protocolo de zero-Ca
2+
adicionado, e passa-se a
uma breve revisão sobre o fenômeno descoberto por LEÃO (1944), a DA. Nesse mesmo
capítulo, relatam-se os valores característicos da velocidade de propagação dos eventos
epileptiformes e de DA, descritos na literatura. Mostra-se que a velocidade pode ser
utilizada como possível indicador discriminador entre eventos de AE e DA. Finalmente,
é feita uma abordagem conceitual do registro do IOS durante as AE’s.
No capítulo III, descrevem-se, com detalhes, os materiais e métodos utilizados no
desenvolvimento do trabalho.
Os resultados experimentais são apresentados no capítulo IV e os resultados
relativos a simulação computacional no capítulo V .
No capítulo VI, analisam-se e discutem-se os resultados e, sempre que possível,
comparando-se os oriundos de experimentos com os de simulações computacionais. O
objetivo é fazer inferências sobre os possíveis mecanismos inter e intracelulares
envolvidos.
Finalmente, no capítulo VII, apresentam-se as conclusões gerais do trabalho e
propõem-se novas investigações.
2
II - REVISÃO DA LITERATURA
II.1 - Atividades epileptiformes sustentadas por mecanismos não-sinápticos
Durante décadas, a comunicação neuronal gerou intensas discussões quanto a
sua forma. Ainda não se sabia como os neurônios se comunicavam. No início do século
XX, C. Sherrington introduziu o termo sinapse para descrever os possíveis pontos de
comunicação entre os neurônios, envolvendo um pequeno espaçamento entre
membranas celulares adjacentes, por onde, de alguma forma, a comunicação seria
transmitida entre as células, estabelecendo a conexão neuronal. Algumas hipóteses
foram levantadas à cerca do tipo de transmissão, podendo ser concentradas em dois
tipos básicos: transmissão elétrica e química. Ficaram, então, cunhados os termos
sinapse química e sinapse elétrica. J.C. ECCLES et al. (1930) acreditavam na existência
das sinapses elétricas, enquanto H. H. DALE, juntamente com G.L. BROWN, W. S.
FELDBERG, J. H. GADDUM e M. VOGHT, acreditavam nas sinapses químicas.
Atualmente, as constatações experimentais apontam a existência de ambas, apesar das
sinapses químicas figurarem de forma dominante no Sistema Nervoso Central,
principalmente de mamíferos, consistindo o mais importante mecanismo de
transmissão de sinais neuronais sob condições normais (DUDEK et al., 1998). Embora
a literatura, principalmente os livros texto de neurociência, considerem as sinapses
segundo dois tipos (as sinapses químicas e as sinapses elétricas) JEFFERYS (1995),
revisando a modulação das atividades neuronais através de conexões neuronais
diferentes das sinapses químicas, denominou esse tipo de conexão de conexão não-
sináptica. Dentre as conexões não-sinápticas consideradas no presente trabalho estão: i)
acoplamento eletrotônico ou gap-junctions; ii) acoplamento efáptico; iii) efeito de
campo elétrico e iv) flutuações iônicas extracelulares.
As atividades epilépticas induzidas em modelos experimentais, chamadas AE’s,
têm muitas características comuns à epilepsia humana. É possível, através de manobras
experimentais criteriosas com estes modelos, estudar as bases fisiológicas, bioquímicas
e anatômicas das atividades epilépticas (ENGEL, 1989). As AE’s são caracterizadas por
hiper-sincronismo e hiper-excitabilidade de populações de neurônios, podendo ser
induzidas em modelos experimentais através da alteração das correntes iônicas
celulares, como efeito de drogas aplicadas, em experimentos in vivo, ou perfundidas, em
3
experimentos in vitro. Como esses modelos envolvem a manipulação das correntes
iônicas transmembrânicas, acreditava-se que essas atividades somente poderiam ser
induzidas mediante a presença de conexões sinápticas. Porém, graças a trabalhos
publicados em 1982, com fatias de hipocampo de rato (TAYLOR e DUDEK, 1982;
HAAS e JEFFERYS, 1984), o estudo do papel das comunicações não-sinápticas na
epilepsia ganhou importância. Esses trabalhos mostraram a possibilidade de induzir as
AE’s durante o bloqueio das conexões sinápticas. Isso indicava, portanto, que deveriam
existir outros meios de comunicação neuronal capazes de sustentar as atividades
neuronais de grande intensidade e síncronas: as conexões não-sinápticas. Sua
composição estratificada, com densos empacotamentos de células neuronais,
característicos de suas diferentes regiões: CA1, CA2, CA3, CA4 e GD do hipocampo
propicia à ocorrência de AE’s, em especial aos eventos denominados bursts
epileptiformes (salva de potenciais ação síncronos, formando os chamados population
spikes (PS), envolvendo importantes alterações iônicas extracelulares). Dentre essas
regiões, o GD é a que apresenta AE’s de maiores durações e amplitudes, sustentadas por
conexões não-sinápticas, tendo sido considerada como responsável pela propagação e
sustentação das crises dentro do hipocampo, razão pela qual vem sendo bastante
estudada nas últimas décadas (figura II.1).
Figura II.1 – Esquema representativo de um corte transversal do hipocampo de rato. Os círculos
pequenos formando a curva menor com formato de C invertido representam os corpos celulares
do GD. Os triângulos que formam a curva maior, também em formato de C, constituem a
camada de corpos celulares de células piramidais, as quais caracterizam o Corno Ammon (CA)
(retirado de ENGEL, 1989).
4
O GD, sob as condições de alto nível de concentração extracelular de K
+
e baixa
concentração de Ca
2+
, exibe AE’s espontâneas e prolongadas de grande amplitude (PAN
e STRINGER, 1996; XION e STRINGER, 2000; CARVALHO, 2003). A reduzida
concentração de Ca
2+
bloqueia as atividades sinápticas, incluindo as sinapses inibitórias,
favorecendo a excitabilidade, que associada ao alto nível de K
+
extracelular, aumenta
ainda mais a excitabilidade do tecido celular, permitindo, assim, o surgimento de
descargas neuronais espontâneas (figura II.2)
Figura II.2 – Registro de bursts característicos das regiões do hipocampo com protocolo experimental
zero-Ca
2+
e alto-K
+
. Na região CA1 os bursts apresentam PS´s com grandes amplitudes, na região
CA3, os PS´s ocorrem de forma mais estável e com menor intervalo de tempo entre os eventos. E
no GD, há atividade neuronal intensa, com bursts prolongados e apresentando variação negativa
do potencial extracelular, juntamente com a ocorrência de PS´s de grandes amplitudes (retirado
de DUDEK et al., 1998).
II.2 - Participação de mecanismos não sinápticos durante as AE’s
II.2.1 - Acoplamento eletrotônico via gap-junctions
O acoplamento entre neurônios ou grupo de neurônios pode ser mediado por
pequenas estruturas que interligam os meios intracelulares, conhecidas como junções
eletrotônicas ou gap-junctions (MACVIVAR e DUDEK, 1982; JEFFERYS, 1995;
CARLEN et al., 2000). Essas estruturas são constituídas por proteínas
transmembrânicas que formam arranjos chamados de conexões. Quando as conexões na
membrana plasmática de duas células em contato são alinhadas, elas formam um canal
aquoso que conecta o interior de duas células adjacentes, mantendo-as a uma distância
de 3,5nm, enquanto que em uma sinapse química típica, a distância entre as membranas
é de 30 a 50nm. A conexão é composta por um anel de seis proteínas idênticas
5
chamadas conexinas, formando um canal de aproximadamente 1,5 nm de diâmetro, que
promove a comunicação direta entre os citoplasmas das duas células envolvidas (figura
II.3).
Figura II.3 – A figura representa de forma esquemática o modelo de interação entre duas células
adjacentes via gap- junctions. As bicamadas lipídicas são atravessadas por proteínas chamadas
conexinas. Cada conexão é formada de anéis com seis conexinas. As conexões formam canais
por onde atravessam substâncias entre os dois meios citoplasmáticos (retirado de ALBERTS et
al.,1994).
Possivelmente, as mais intrigantes das comunicações entre células adjacentes
sejam as gap-junctions. Elas são encontradas na maioria dos tecidos animais e em
praticamente todas as espécies animais. Inúmeros estudos têm comprovado a existência
desse acoplamento nos sistemas nervosos de vertebrados e invertebrados, onde são mais
comumente encontrados (BENNETT e SPRAY, 1985). Contudo, em vertebrados, tal
acoplamento é menos proeminente em neurônios adultos do que as transmissões
químicas (BENNETT, et al., 1996) e, mesmo em células jovens, somente um pequeno
percentual dessas estruturas deve atuar sobre condições normais. Existem algumas
técnicas de se verificar a existência das gap-junctions. Uma delas, na qual as conexões
sinápticas são bloqueadas, proposta por MACVICAR e DUDEK (1982), utiliza um
corante denominado Amarelo de Lúcifer. Os resultados mostram que o corante injetado
6
no meio intracelular de células adjacentes se difunde entre elas, sem evadir para o meio
extracelular.
Outra evidência do acoplamento eletrônico entre pares de células é obtida
usando medidas intracelulares simultâneas. MACVICAR e DUDEK (1982), empalando
duas células, na camada de células granulares, numa distância inferior a 100 µm,
demonstraram a existência do acoplamento eletrotônico usando injeções de pulsos de
correntes de despolarização e hiperpolarização nas duas células (figura II.4-A). Nesse
experimento, as sinapses químicas foram bloqueadas. Quando um pulso de corrente
despolarizante foi usado para evocar potenciais de ação em uma célula, foram obtidos
spikes no potencial intracelular da outra célula (figuras II.4-A, II.4-B e II.4-C).
Nenhuma evidência de acoplamento entre os eletrodos foi verificada depois de
terminado o empalamento (figura II.4-D), sendo as medidas dos potenciais
intracelulares relativas a eletrodos remotos. Assim, este resultado apresenta forte
evidência de que células granulares são eletrotonicamente acopladas.
Figura II.4 – Medidas simultâneas de duas células granulares acopladas eletrotonicamente. A, B: a
injeção de pulso de corrente recíproco demonstra o acoplamento eletrotônico. Os traços
superiores são medidas de uma célula e os inferiores são da outra célula. Pulsos de correntes
despolarizantes e hiperpolarizantes injetados em uma célula (traços superiores de A e inferiores
de B) geraram espículas no potencial intracelular da outra célula (traços inferiores de A e
superiores de B). C: potenciais de ação em uma célula evocaram espículas no potencial
intracelular da outra. D: depois que um eletrodo foi retirado do meio intracelular, foi injetada
uma corrente no meio extracelular, com alta intensidade. Contudo, não foram detectadas
alterações no potencial intracelular da outra célula. A barra de calibração vertical representa
25 mV para os traços superiores e 5 mV para os inferiores e a horizontal corresponde a 2,5 ms
7
em C. Para D, estas barras de calibração representam 7 mV e 20 ms (retirado de MACVICAR e
DUDEK, 1982).
O hipocampo é, como se sabe, bastante propenso a uma grande variedade de
hiper-sincronismo e descargas epileptiformes. Estudos realizados nas regiões CA1
(TAYLOR e DUDEK, 1980), CA3 (MACVICAR e DUDEK, 1980) e em particular no
GD (MACVICAR e DUDEK, 1982) evidenciam fortes indícios da ação do acoplamento
via gap-junctions sobre a estrutura hipocampal. Em princípio, a sincronização das AE’s
poderia ser modulada pelas gap-junctions. No entanto, o número de conexões neuronais
através de gap-junctions nessa região parece ser pequeno, levantando suspeita quanto à
função de sustentarem de forma extensiva a sincronização.
O octanol é uma droga bloqueadora das gap-junctions. Com o objetivo de
verificar a atuação das gap-junctions sobre as AE’s, XION e STRINGER (2000)
perfundiram fatias do hipocampo com octanol, durante a indução de AE’s sustentadas
por mecanismos não-sinápticos. Na figura II.5-A, tem-se um evento epileptiforme antes
da perfusão da fatia com a droga. O evento é de longa duração com PS´s de grandes
amplitudes. Na parte inferior dessa figura também pode ser observado o aumento do
acúmulo extracelular do K
+
. Em B, após 5min de perfusão com octanol, observa-se
redução na duração do evento acompanhada de respectiva redução do acúmulo na
concentração extracelular do K
+
. O mesmo efeito é observado após a perfusão, por
10min, com octanol (figura II.5-C).
Figura II.5 – Efeito do octanol sobre as AE’s não-sinápticas no GD. A: evento epileptiforme antes da
perfusão com o octanol. Após 5min (B) e 10min (C) de perfusão com o octanol observam-se
reduções na duração do evento epileptiforme acompanhadas de diminuições na concentração
extracelular do K
+
(retirado de XION e STRINGER, 2000).
RODRIGUES (2003), através de simulação computacional, verificou que a
redução da atuação das gap-junctions reduz a amplitude de PS´s registrados no meio
8
o
o
o
extracelular e também o acúmulo de K
+
. Dessa forma, esses resultados mostram que a
diminuição da eficiência da atuação das gap-junctions diminui o nível de sincronismo,
indicando que esse mecanismo acoplador tem papel fundamental na geração de PS´s no
meio extracelular.
II.2.2 - Efeito efáptico
O termo acoplamento efáptico foi utilizado inicialmente por Arvanitaki em 1940
para descrever a interação de membranas neuronais muito próximas (JEFFERYS,
1995). A primeira demonstração desse tipo de comunicação neuronal utilizou pares de
axônios, não mielinizados de lula, colocados em contato e submersos em óleo (figura
II.6).
O efeito efáptico ocorre devido a grandes potencias extracelulares que
promovem despolarizações transmembrânicas de neurônios adjacentes. Embora muitos
autores usem o termo transmissão efáptica e efeito de campo elétrico como diferentes, o
que se observa é que, em ambos os casos, há interações neuronais mediadas por corrente
elétrica fluindo através do espaço extracelular (JEFFERYS, 1995). Dessa forma, pode-
se dizer que a distinção entre os dois mecanismos é inconsistente e a fronteira entre eles
é mal definida (DUDEK et al., 1986). Na realidade, o termo interação efáptica é
utilizado, por alguns autores, para designar um tipo específico de comunicação elétrica
entre neurônios vizinhos de grande proximidade.
Figura II.6 – Diagrama esquemático da interação efáptica entre axônios gigantes de lula que foram
aproximados e submersos em óleo para reduzir o espaço extracelular (mostrado ao centro). A: O
fluxo iônico durante um potencial de ação produz um potencial extracelular (V
o
), neste caso
maior que o potencial intracelular (V
i
). B: a geração de um potencial de ação em um axônio
induz um potencial “pós-efáptico” na célula vizinha. (retirado de RAMON e MOORE, 1978).
9
Uma vez que o efeito efáptico e o efeito de campo elétrico se fundem e
distinguí-los é complicado, uma análise mais detalhada da interação efáptica será tratada
no item seguinte em conjunto com o efeito de campo de elétrico.
II.2.3 - Efeito de campo elétrico
A maior evidência, da ação do efeito de campo elétrico, durante atividades
neuronais não-sinápticas provém de medidas de potenciais transmembrânicos durante
descargas neuronais (HAAS e JEFFERYS, 1984; TAYLOR e DUDEK, 1982;
TAYLOR e DUDEK, 1984). Essas medidas mostram uma despolarização que antecede
os potenciais de ação na maioria dos registros celulares.
Quando as medidas de registros intracelulares são realizadas em relação a uma
referência remota, não é possível identificar o efeito de campo elétrico. Para se observar
a atuação do efeito de campo elétrico, podem ser feitos experimentos (figura II.7-A) e
ou simulações computacionais (figura II.7-B), nos quais o potencial intracelular (figura
II.7-A- traço 1) é medida com referência a um eletrodo posicionado no meio
extracelular vizinho à célula. Pequenas despolarizações podem ser observadas (figura
II.7-A e B - traço 1-2) durante medidas do potencial transmembrânico na presença de
PS´s. Essas despolarizações transmembrânicas são similares à forma de onda dos PS´s
(figura II.7-A e B - traço 2) medidos simultaneamente e parecem estar relacionadas com
eles em amplitude (TAYLOR e DUDEK, 1984), podendo alterar a despolarização da
célula, precipitando a ocorrência de um potencial de ação. Esse efeito mútuo entre
células vizinhas constitui um importante mecanismo de acoplamento mútuo entre
células fisicamente desacopladas.
Diz-se que há interação através do efeito de campo elétrico quando fluxos
iônicos produzidos por atividades neuronais alteram a excitabilidade de outros
neurônios que não se encontram acoplados. Nesse caso, esse acoplamento pode
contribuir para a sincronização dos neurônios durante as descargas epileptiformes
(DUDEK et al., 1986; TAYLOR e DUDEK, 1982; JEFFERYS e HAAS, 1982). A
excitabilidade neuronal é modulada por potenciais de campo, no entanto, esses campos
não são suficientes para provocar a despolarização de uma célula de modo que ela saia
do seu potencial de repouso e alcance o limiar de disparo para o potencial de ação
(BINDMAN et al., 1964). Mas, esse efeito se torna significativo quando conjuntos de
10
neurônios estão próximos do seu limiar de disparo e funcionam como gatilho para a
ocorrência de um PS.
Figura II.7 - Contribuição do efeito de campo elétrico durante descargas epileptiformes. Em (A) tem-se o
efeito produzido pela interação de campo elétrico entre neurônios observado através da medida
do potencial transmembrânico (traço 1-2), de células do hipocampo de rato, da qual se subtraiu o
potencial intracelular (traço 1) do potencial extracelular vizinho (traço 2) (Retirada de TAYLOR
e DUDEK, 1984). Em (B) observa-se efeito similar resultante de simulação computacional
(retirado de TRAUB et al., 1985).
Estudos revelam que o efeito de campo elétrico é mais proeminente em regiões
cerebrais com alta organização laminar. A região CA1 e o neocórtex são locais,
especialmente, susceptíveis ao efeito de campo elétrico, isso se deve a orientação bem
definida e aos densos pacotes de células neuronais encontrados nessas regiões
(GARDNER-MEDWIN, 1976).
Por muitos anos acreditou-se que o GD não participasse da geração e
sustentação das crises epilépticas. Com base em estudos in vitro e in vivo tem-se
considerado que o GD atue como uma “barreira” que restringe o fluxo de AE’s dentro
de hipocampo, sob condições normais (WALTER et al., 1986; JONES e LAMBERT,
1990; LOTHMAN et. al., 1992). Além disso, células granulares do GD não participam
de epileptogênesis espontâneas ou evocadas, na presença de penicilina, picrotoxina e
baixo Cl
-
, de acordo com alguns registros intracelulares (FRICKE e PRINCE, 1984).
Esse estudo parece indicar que o GD não apresenta burstings endógenos e é muito
resistente às AE’s sincronizadas.
No entanto, em experimentos in vitro e in vivo, o GD mostrou-se capaz de
produzir AE’s, consistindo de burstings com PS´s de grande amplitude, quando trens de
pulso são administrados em feixes de fibras do caminho perfurante (SOMJEN et al.,
1985; JEFFERYS et al., 1992), ou na região CA3 (STRINGER et al., 1991).
11
Esse mesmo comportamento pode ser observado quando se utiliza protocolo
experimental com zero-Ca
2+
e alto-K
+
na solução salina que banha fatias de hipocampo
(PAN e STRINGER, 1996; XION e STRINGER, 2000; CARVALHO, 2003). Como os
experimentos são realizados na ausência de transmissão sináptica, a sincronização dos
burstings deve ser, neste caso, sustentada por conexões não sinápticas. O trabalho de
XION e STRINGER (2000) que relata o bloqueio das gap-junctions durante a indução
de AE’s não sinápticas sugere que a interação por efeito de campo elétrico possa ser
suficiente para a sustentação das AE’s. RODRIGUES (2003), através de simulação
computacional do bloqueio da interação de campo elétrico, quando na ausência das
gap-junctions, verificou uma redução da duração das descargas epileptiformes e
supressão de PS´s no meio extracelular. Esses estudos sugerem que o efeito de campo
elétrico contribui para a sincronização de neurônios hipocampais durante AE’s não
sinápticas. Contudo, para que isso ocorra, são necessários disparos síncronos de
potenciais de ação, o que leva a crer que o efeito de campo ajuda a sustentar a
sincronização, mas não a inicia.
II.2.4 - Flutuações iônicas
Vários ions encontrados no meio extracelular têm participação na atividade
neuronal, principalmente K
+
, Ca
2+
e Mg
2+
(KONNERTH et al., 1984; JEFFERYS e
HAAS, 1982; PAN e STRINGER, 1996; XION e STRINGER, 2000; CARVALHO,
2003). A concentração extracelular do K
+
tem efeitos marcantes na excitabilidade
neuronal, uma vez que afeta o potencial de membrana e reduz o gradiente do Cl
-
que
tende a reduzir o pós-potencial de hiperpolarização. Tanto através de resultados
experimentais (KONNERTH et al., 1984; PAN e STRINGER, 1996; XION e
STRINGER, 2000; CARVALHO, 2003), quanto por meio de simulações
computacionais (TUCKWEL e MIURA, 1978; TEIXEIRA et al., 2001; ALMEIDA et
al., 2003), observa-se que alterações na concentração extracelular do K
+
causam
profundas modificações na excitabilidade neuronal. Com o aumento da concentração
extracelular do K
+
ocorre uma despolarização de células vizinhas, o que eleva a
excitabilidade do tecido, provocando descargas neuronais espontâneas.
A dinâmica típica do K
+
no espaço extracelular está apresentada na figura II.8.
Esse registro experimental foi feito na CG do GD, por XION e STRINGER (2000),
12
durante a indução de AE’s através do protocolo experimental zero-Ca
2+
e alto-K
+
(8mM).
A concentração extracelular dos ions Ca
2+
e Mg
2+
afetam a excitabilidade
neuronal pela blindagem eletrostática, onde cátions atraídos por cargas negativas na
membrana neuronal tendem a aumentar a atuação do campo elétrico que é sentida pelos
canais iônicos da membrana. A redução da concentração de cátions divalentes reduz a
blindagem eletrostática e o campo elétrico atuante através da membrana. Esse efeito é
semelhante à despolarização transmembrânica (JEFFERYS, 1995). As concentrações
extracelulares de Ca
2+
e Mg
2+
tem efeitos opostos em relação às transmissões sinápticas.
Com uma redução da concentração extracelular de Mg
2+
há um respectivo aumento das
transmissões sinápticas, já com a redução da concentração de Ca
2+
há uma redução
dessas transmissões (JEFFERYS e HAAS, 1982).
Além disso, observa-se que os íons Mg
2+
, durante o repouso, estão ligados a um
sítio do receptor NMDA (N-Metil-D-Aspartato), ou seja, esses íons bloqueiam o influxo
de Na
+
e Ca
2+
o qual provocaria uma despolarização da membrana neuronal.
Figura II.8 – Variação típica da concentração extracelular do K
+
medida experimentalmente durante um
burst epileptiforme (retirado de XION e STRINGER, 2000).
A geração de potenciais de ação está diretamente ligada às flutuações do íon
Na
+
. É o seu influxo, através dos canais iônicos, que causa a despolarização do potencial
transmembrânico. Mesmo não tendo o poder despolarizador do íon K
+
, o íon Na
+
potencializa o efeito de campo elétrico e o acoplamento eletrotônico (LUX et al., 1986).
13
Observa-se, portanto, que as flutuações iônicas possuem um papel importante na
sincronização de AE’s não sinápticas, apesar delas não se mostrarem capazes de
sincronizar descargas neuronais a ponto de surgirem PS´s no meio extracelular
(CARVALHO, 2003).
II.3 - A Depressão Alastrante
Em 1944, quando estudava epilepsia experimental, o Prof. Aristides Pacheco
Leão identificou um fenômeno, o qual denominou Depressão Alastrante (DA). LEÃO
(1944) observou uma queda acentuada na amplitude da atividade elétrica espontânea e
evocada do córtex cerebral quando estimulado artificialmente. Essa depressão da
atividade elétrica se propagava a áreas vizinhas e, após certo período de tempo,
apresentava reversibilidade.
Com o desenvolvimento das pesquisas, Leão e outros pesquisadores verificaram
que o fenômeno não se restringia à estrutura cortical, e que poderia ser identificada em
outras estruturas neurais. Dessas outras estruturas, pode-se destacar a retina de
vertebrados, que permite associar as alterações em suas propriedades óticas intrínsecas
à eletrofisiologia do fenômeno, de forma bastante favorável ao estudo de sua dinâmica
espacial (GOURAS, 1958; DO CARMO e MARTINS-FERREIRA, 1984). Algumas
regiões corticais, como a área CA1 do hipocampo e o neocórtex, são, contudo, mais
propensas a essas atividades identificadas por LEÃO (1944).
Processos distintos são utilizados para propiciar a deflagração da onda de DA:
pulsos de alta freqüência (através de estimulação tetânica ou corrente contínua);
estímulo mecânico da região cortical; pH alcalino e uma diversidade de agentes
químicos (CHEBABO et al. 1995; BALESTRINO, 1995; BALESTRINO et al., 1999).
No hipocampo, o fenômeno da DA é bastante estudado durante manobras experimentais
de hipóxia. A hipóxia consiste da suspensão do fornecimento de oxigênio ao tecido, que
provoca uma seqüência bem definida de alterações intra e extracelulares. No trabalho de
CARVALHO (2003), após o bloqueio da oxigenação, que reduziu a atividade da bomba
da Na
+
/K
+
, pôde ser observada a transição do estado de AE’s para o de DA. O mesmo
tipo de transição foi observado em simulações computacionais (figura II.9).
CARVALHO (2003), ao observar a evolução de experimentos com a ocorrência
de DA, pôde verificar uma redução do intervalo entre eventos (inter-burst) anterior à
deflagração do fenômeno. Esses resultados foram semelhantes àqueles mostrados por
14
XIONG e STRINGER (1999) que utilizaram ouabaína para bloquear a bomba de
Na
+
/K
+
e observaram a deflagração espontânea de ondas de DA no GD.
Através de simulações computacionais com um modelo eletroquímico
(CARVALHO, 2003; RODRIGUES, 2003), que retrata a região do GD do hipocampo,
o mesmo comportamento foi reproduzido antecedendo às ondas de DA. Segundo
CARVALHO (2003), as interpretações através das simulações mostraram que a redução
do intervalo entre eventos deve estar associada à dificuldade do tecido em restabelecer,
de forma eficaz, o gradiente iônico inicial, o que promove acúmulos do K
+
no meio
extracelular e conseqüentemente aumenta a excitabilidade do tecido, favorecendo a
transição para DA.
Figura II.9 – Registros de simulação computacional (A) e experimento com protocolo zero-Ca
2+
e alto-K
+
(B) durante a transição de bursts epileptiformes para DA, no GD do hipocampo de rato. A seta
representa o momento da supressão do fornecimento de oxigênio (retirado de CARVALHO,
2003).
Através de experimentos com a utilização do protocolo experimental zero-Ca
2+
e
alto-K
+
e simulação computacional, CARVALHO (2003) observou transições de
estados funcionais que, com freqüência, antecedem as ondas de DA no GD (figura
II.10). Essas transições de estados foram denominadas burst do grupo A, burst do grupo
B e burst do grupo C.
15
Sinais típicos de cada grupo são mostrados na figura II.10. No grupo A, os bursts
são caracterizados exclusivamente pelo deslocamento negativo da linha de base,
acompanhado por pequenas despolarizações que são observadas durante o evento. No
traçado B, o deslocamento da linha de base é seguido por um gradual aumento da
amplitude e do número de PS´s e, em C, a amplitude dos PS´s é alta desde o início se
prolongando durante todo o evento. Experimentos, em que se observam esse último
grupo de bursts, são marcados, geralmente, pela ocorrência de ondas de DA.
Figura II.10 – Morfologia dos diferentes grupos de bursts característicos do GD. Em (A) tem-se o
denominado burst do grupo A, em (B) burst do grupo B e em (C) morfologia característica do
burst do grupo C (retirado de CARVALHO, 2003).
Figura II.11 – Potencial elétrico típico de eventos do grupo D com protocolo zero-Ca
2+
e alto-K
+
no GD
do hipocampo de rato.
Em trabalhos posteriores, ainda não publicados (CARVALHO), também foi
identificada a ocorrência de um grupo morfológico o qual foi denominado burst do
grupo D. A ocorrência desse tipo de burst pareceu ser um indicativo da transição entre
estados de AE’s e de DA. Entretanto, a não ocorrência do burst do grupo D não
16
20s
5mV
implicou na ausência da ocorrência de DA. Em alguns casos, quando houve a
ocorrência predominantemente de bursts do grupo C, a alteração da excitabilidade do
tecido foi suficiente para propiciar uma transição direta para a DA, sem a ocorrência de
eventos do grupo D. O registro do potencial elétrico extracelular (figura II.11) ainda
revelou que eventos do grupo D apresentam semelhança morfológica com eventos de
AE e eventos de DA. Além disso, CARVALHO percebeu que a ocorrência de eventos
do grupo D, por antecederem à deflagração da onda de DA, estabelecem uma região
limite de transição entre eventos de AE e de DA.
II.4 - Velocidade de propagação de eventos de AE e de DA
Já foi observado que, na indução, por longo tempo de bursts epileptiformes,
pode ocorrer transição espontânea de eventos epileptiformes para eventos de DA
(CARVALHO, 2003). Essa mudança de estado funcional acontece após cerca de 4
horas de AE’s. O evento que caracteriza o fenômeno da DA no GD, como em outras
regiões, possui aspectos morfológicos e dinâmicos distintos dos eventos epileptiformes.
A DA apresenta duração de cerca de 3 min, bem mais longa que a dos eventos
epileptiformes, que é da ordem de 50 s, e, ainda, com um período refratário da ordem de
10 min (CARVALHO, 2003).
De acordo com SNOW et al. (1983), a velocidade de propagação da onda de
DA, em fatias do hipocampo de rato, utilizando protocolo baixo Ca
2+
na solução salina
que banha o tecido, é da ordem de 6 mm/min. MARTINS-FERREIRA (1993),
utilizando estimulação mecânica em retina de ave banhada por solução nutriente
contendo cálcio, observou a deflagração de ondas individuais de DA com as
velocidades que estão entre 6 e 10 mm/min, enquanto que as ondas circulantes
possuíam velocidades de propagação de 3,71 ± 0,21 mm/min. DUARTE (2000) através
de estímulos mecânicos e elétricos, também em retina de ave, encontrou o valor de 4,85
± 0,8 mm/min para a velocidade de propagação da onda de DA.
Já ALBOWITSZ e KUHNT (1993), induzindo AE’s em fatias de tecido da
região neocortical, através da adição de 10-20µM de bicuculina à solução que banhava
o tecido e por estimulação elétrica, investigaram a propagação das AE’s. Com o auxílio
de uma técnica de vídeo microscopia e eletrodos de registro do potencial elétrico foi
possível monitorar regiões da fatia, o que lhes permitiu encontrarem o valor de 3,8 ±
17
1,6 mm/s para a velocidade de propagação dos bursts. ALEFELD et al. (1998), também
utilizando um protocolo experimental com fatias de tecido do córtex cerebral, induzindo
AE’s através da adição de bicuculina (20µM) à solução que banhava o tecido e
estimulação elétrica, encontraram um valor de cerca de 80 mm/s para a velocidade dos
bursts. Nesse trabalho os eventos epileptiformes foram registrados em 12 posições
distintas do córtex cerebral por eletrodos separados à distância de aproximadamente 0,5
mm. MEIERKORD et al. (1997), durante a indução de AE’s em fatias de tecido de
cérebro de rato, através da alteração de Mg
2+
da solução salina e estimulação elétrica,
determinaram o valor da velocidade de propagação de eventos epileptiformes. As
velocidades de propagações encontradas para os eventos epileptiformes ocorridos na
formação hipocampal de animais com a idade de 4 a 6 semanas, foi de 0,18 ±
0,01 mm/s, no córtex temporal 0,3 ± 0,02 mm/s e no córtex entorrinal 0,20 ± 0,01 mm/s.
Reduzindo a concentração de Mg
2+
da solução salina que banhava as fatias de
tecido e através de estimulação elétrica, HOLTKAMP et al. (2003) também
investigaram a propagação de AE’s em cérebro de rato. Através do estudo do IOS (luz
transmitida) foi possível observar a região de começo das atividades epileptiformes bem
como a direção, o sentido e a extensão de propagação. Além, de ter permitido a
determinação do valor da velocidade de propagação dos eventos epileptiformes em
algumas regiões do córtex e do hipocampo. No subiculum, a velocidade encontrada foi
de 1,34 ± 0,1mm/s, no córtex entorrinal foi de 0,81 ± 0,04 mm/s, no córtex perirrinal de
0,6 ± 0,06 mm/s e de 0,95 ± 0,08 mm/s no córtex temporal.
Dessa forma, com os dados registrados na literatura, observa-se que a velocidade
de propagação de eventos epileptiformes é da ordem de mm/s, enquanto que da onda de
DA é mm/min. Assim sendo, acredita-se que, através da determinação do valor da
velocidade, seja possível se identificar se um evento é de AE ou DA.
II.5 - Registro do Sinal óptico intrínseco durante as AE’s
O termo Sinal Óptico Intrínseco é utilizado para designar alterações sofridas pela
luz transmitida ou espalhada em tecidos biológicos (ANDREW et al., 1999). As bases
neurobiológicas do IOS ainda não são claras, ou seja, pouco se sabe de que maneira as
estruturas celulares neuronais se alteram durante o registro do IOS. Existem alguns
mecanismos que podem contribuir para a alteração na luz transmitida ou espalhada
18
durante atividades neuronais. Mudanças no citoplasma, tais como alteração de sua
viscosidade (HILL e KEYNES, 1949), parecem desempenhar papel importante na
alteração do espalhamento da luz. Alterações no espaço extracelular também parecem
contribuir para mudança no sinal, apesar de não haver uma relação evidente entre
inchaço ou contração do volume do espaço extracelular e o sentido da alteração do IOS,
sob condições de interface (BUCHHEIM et al., 1999, BUCHHEIM et al., 2002,
MULLER e SOMJEN, 1999). Mudanças na osmolaridade dos meios intra e
extracelulares parecem alterar os valores dos índices de refração que acabam por
modular o espalhamento de luz pelo tecido (DUARTE, 2000).
Apesar da reduzida compreensão relacionada aos mecanismos básicos do IOS,
essa técnica se tornou uma ferramenta importante em pesquisas de neurociência, onde a
sua utilização, em combinação com métodos eletrofisiológicos, permite, entre outras
coisas, analisar a dinâmica espaço-temporal de AE’s.
O primeiro trabalho, no qual são identificadas variações de luz espalhada, tratou
do fenômeno da onda de DA em retina de rã (GOURAS, 1958). Porém, a primeira
descrição completa das alterações ópticas durante a DA, observadas em retina de
galinha, foi realizada por MARTINS-FERREIRA e OLIVEIRA-CASTRO (1966).
MEIERKORD et al. (1997) observaram um aumento reproduzível na
transmissão da luz infravermelha, durante a indução de AE’s em fatias de cérebro de
rato, induzidas com solução salina contendo baixo Mg
+2
e estimulação elétrica. Na
figura II.12-B estão registrados o potencial elétrico, a alteração na [K
+
]
o
e alteração da
luz transmitida durante um evento epileptiforme. Pode-se observar uma variação na
intensidade de luz transmitida pelo tecido de cerca de 2% para a região CA1 e de 3%
para o córtex entorrinal lateral. Nesse trabalho, a combinação do método
eletrofisiológico e do IOS permitiu também estudar o padrão espaço-temporal do início
e propagação das AE’s (figura II.12-C).
A alteração do IOS também pode ser observada em outros trabalhos na qual se
reduziu a concentração de Mg
2+
da solução salina que banhava as fatias de tecido
(WEISSINGER et al., 2000; BUCHHEIM et al., 2000, HOLTKAMP et al., 2003).
19
Figura II.12 – (A) Diagrama esquemático de uma fatia utilizada no experimento. Nela estão identificadas
as estruturas anatômicas relevantes para o a indução, registro e estudo do IOS das AE’s: Stratum
piramidal (SP) do Corno Armon (CA), córtex entorrinal lateral (IEC), córtex entorrinal medial
(mEC), giro denteado (DG), córtex temporal (TE), subiculum (Sb) e córtex perirrinal (PC). Em
(B) é apresentado o registro do potencial elétrico (f.p.), a variação da concentração extracelular
de K
+
e a alteração da luz transmitida (∆t/t) durante um evento epileptiforme. Os eventos são
registrados no IEC e na camada CA1 do hipocampo. A evolução espaço-temporal do IOS está
apresentada em (C). A posição dos eletrodos pode ser identificada na imagem controle, onde os
eletrodos de registro estão no IEC e na camada CA1 e os eletrodos de estimulação no Stratum
radiatum. Enquanto existe apenas um ruído na imagem controle alterações ópticas podem ser
vistas no IEC na próxima imagem (0s). Após 8s de começo da atividade existe uma propagação
bidirecional (em direção ao córtex temporal e ao Sb) da área de origem. Doze segundos após o
início da AE observa-se a alteração do IOS ao longo do caminho perfurante e da camada CA3 do
hipocampo. Uma segunda rota de propagação é observada ao longo do Sb e camada CA1.
Posteriormente, todo o hipocampo exibe alterações do IOS (21s). A alteração máxima na luz
transmitida é observada cerca de 68 s após o começo da atividade na região hiliar. Após 101s de
começo há uma redução lenta do IOS que atinge o seu valor máximo cerca de 69s antes do
retorno da linha de base (retirado de MEIERKORD et al., 1997).
20
Figura II.13 – Registro do potencial elétrico e do IOS em fatias de tecido do cérebro de rato. Em (A),
tem-se o registro do potencial elétrico de um evento epileptiforme induzido por solução salina
contendo zero-Ca
2+
e alto-K
+
. Em (B) observa-se um aumento da transmitância da luz de cerca
de 3% durante a ocorrência do evento (registro de PEREIRA).
21
III – MATERIAIS E MÉTODOS
III.1 - Registro do potencial extracelular sobre a CG do GD
Os experimentos consistiram da indução de AE’s em fatias do hipocampo de
rato utilizando o protocolo experimental zero-Ca
2+
e alto-K
+
extracelular (8,2mM), além
da indução de DA por hipóxia e eventuais DA´s espontâneas. Medidas simultâneas do
potencial extracelular, na CG, foram realizadas em duas posições distintas, separadas
por distâncias compreendidas entre 80 a 300 micrômetros. Através do potencial
extracelular e do cálculo da velocidade de propagação, os eventos foram identificados
quanto a eventos de AE ou de DA. No caso de eventos epileptiformes, foram
identificados os grupos A, B, C ou D a que pertencem, em acordo à classificação
proposta por CARVALHO (2003).
III.2 - Registro simultâneo do potencial extracelular e do IOS
Não houve alteração do protocolo experimental anterior durante o registro
simultâneo do potencial extracelular e do IOS. Os experimentos consistiram da indução
de AE’s em fatias do hipocampo de rato utilizando o protocolo experimental zero-Ca
2+
e
alto-K
+
extracelular (8,2 mM). Nesse caso, porém, utilizou-se outro setup experimental,
onde foi possível registrar, além do potencial elétrico, as alterações na luz transmitida.
O processamento das imagens foi feito off line. Dessa forma distinguiram-se as
diferenças entre a dinâmica espaço-temporal de eventos de AE (grupos A, B, C ou D) e
aqueles de DA.
III.3 - Procedimento para obtenção das fatias
Tanto no registro simultâneo do potencial extracelular, em duas posições
distintas, sobre a CG do GD, quanto no registro simultâneo do potencial elétrico e do
IOS, foi utilizada a mesma preparação experimental para a obtenção de fatias do tecido.
Neste trabalho foram utilizados, com algumas alterações, os procedimentos propostos
por TEYLER (1980), envolvendo ratos da raça Wistar, com idade entre 4 a 6 semanas.
A figura III.1 ilustra uma vista do hipocampo de rato no encéfalo e uma fatia obtida de
um corte de seu terço médio. Como o hipocampo é organizado de forma lamelar
22
(LOPES et al., 1990), através de seções transversais do terço médio, suas principais
estruturas são preservadas nas fatias.
(A) (B)·
Figura III.1– Em (A) vista em perspectiva do encéfalo de rato onde pode ser observada a estrutura
hipocampal com a indicação do ângulo de corte para obtenção das fatias. No desenho da fatia
(B), podem ser identificadas as regiões CA1, CA3 e o DG.
Figura III.2 – Procedimento para abertura e retirada do cérebro: 1) as setas indicam o sentido de corte
para a abertura do crânio; 2) as pinças foram utilizadas para ruptura da calota craniana; 3) uma
espátula foi usada para separar e retirar o cérebro da caixa craniana; 4) O cérebro foi transferido
para um Béquer contendo solução nutriente (retirado de CARVALHO, 2003).
Após anestesia (éter), os animais foram decapitados. Com o auxílio de um
bisturi cirúrgico, o escalpo foi aberto, de modo a observar a calota craniana. O osso
occipital, acima do cerebelo, foi cortado. Esse corte foi estendido pelas partes mediana e
lateral do crânio. Utilizando uma pinça, os ossos occipitais foram levantados e
arrancados. Logo em seguida, separou-se o cérebro do sistema medular espinal com o
auxílio de uma espátula (figura III.2). Após esse procedimento, o cérebro foi colocado
23
dentro de um béquer contendo uma solução nutriente, denominada solução de perfusão,
consistindo de (em mM) 127,0 NaCl, 2,0 KCl, 1,5 MgSO
4
, 26,0 NaHCO
3
, 1,1 KH
2
PO
4
,
10,0 glicose e 2,0 CaCl
2
, constantemente oxigenada e resfriada entre 0
o
C e 2C
o
.
Figura III.3 – Preparação de fatias de hipocampo em cérebro de rato. Os quadros 1, 2, 3, 4 e 5 mostram
os cortes realizados para facilitar a dissecação. No quadro 6, é mostrado um detalhe da separação
do tálamo feita com a ajuda de micro-espátulas. Em 7, 8 e 9 o hipocampo foi isolado do restante
do córtex (retirado de CARVALHO, 2003).
Num segundo momento, o cérebro foi colocado dentro de uma placa de petri
com filtro de papel onde foi constantemente banhado por solução de perfusão gelada.
Iniciou-se, então, a dissecação do cérebro. Primeiramente, o cerebelo foi retirado com
um bisturi cirúrgico, itens 1 e 2 da figura III.3. Logo em seguida, com um corte, parte
do córtex frontal foi separado, item 3 da figura III.3. Foram separados, também, os dois
hemisférios cerebrais, itens 4 e 5 da figura III.3. Enquanto um dos hemisférios foi
dissecado, o outro foi mantido em solução de perfusão gelada. O hemisfério a ser
dissecado foi, então, posicionado, item 6 da figura III.3, de modo a iniciar a retirada do
24
1 2 3
4 5 6
7 8 9
3
6
9
tálamo, que encobre o hipocampo. Micro-espátulas foram introduzidas por baixo e nas
laterais do tecido de forma suave. Movimentos laterais ajudaram a separar o hipocampo
do resto do córtex, figura III.3 itens 7, 8, 9. O mesmo procedimento foi realizado para o
outro hemisfério.
Imediatamente, após seu isolamento, o hipocampo foi levado ao fatiador, de
onde foram retiradas fatias do seu terço médio com a espessura de 400µm. Esta
espessura foi escolhida em acordo com as constatações de NICHOLSON e
HOUNSGAARD (1983), que apontaram a espessura como fator limitante na
oxigenação das fatias mantidas em uma câmara de interface. De acordo com os cálculos
de difusão de O
2
sobre o tecido, o valor máximo para a espessura das fatias é de 400 µm
(NICHOLSON e HOUNSGAARD 1983). Cada hipocampo foi posicionado de modo a
estabelecer um ângulo de 70
o
em relação ao eixo da fímbria (figura III.4-A). Dessa
forma, as conexões intrínsecas, tais como as fibras mossy das células granulares do GD,
Schaffer colateral de axônios da região CA3 e axônios da região CA1 (figura III.4-B),
foram preservadas (TEYLER, 1980).
Figura III.4 - Representação esquemática do hipocampo com o respectivo ângulo de corte e suas
conexões intrínsecas. Em (A) tem-se a representação esquemática do hipocampo onde se
identifica a formação do ângulo de 70
o
em relação ao eixo da fimbria para o fatiamento,
de modo a preservar suas conexões intrínsecas, como observado na ampliação da lamela
representada em (B).
Após cada corte, a fatia obtida ficou aderida a uma das faces da lâmina do
fatiador. Com o auxílio de pincel de cerdas finas, cada fatia foi removida e colocada
cuidadosamente na câmara de perfusão. A câmara de perfusão, descrita no item III.4.1,
foi mantida a 32
o
C e armazena as fatias por cerca de 50 minutos, submersas em solução
25
GD
Fibras mossy
CA3
Schaffer
colateral
CA1
de perfusão constantemente oxigenada (5% CO
2
- 95% O
2
). Após esse intervalo de
tempo, as fatias foram transferidas, com o auxílio de um conta-gotas, para a câmara de
interface (item III.4.2). As fatias foram mantidas sob perfusão com solução normal por
cerca de 1 hora. Durante esse tempo, a temperatura foi gradativamente elevada até 34
o
C. Depois do repouso, passou-se à perfusão com solução de indução das AE’s (127,0
NaCl, 7,0 KCl, 1,5 MgSO
4
, 26,0 NaHCO
3
, 1,1 KH
2
PO
4
, 10,0 glicose e 0 CaCl
2
quantidades em mM). Por volta de uma hora de perfusão com essa solução, iniciaram-se
as AE’s, neste momento, os eletrodos foram posicionados para registro dos potenciais
extracelulares.
III.4 - Equipamentos necessários para os experimentos
III.4.1 - Câmara de perfusão
A câmara de perfusão, utilizada neste trabalho, foi desenvolvida no Laboratório
de Neurociência Experimental e Computacional da Universidade Federal de São João
del-Rei (LANEC-UFSJ). Ela consiste de conexões e tubos em PVC, que foram
arranjados de modo a formar uma estrutura em U, com ramos de diferentes diâmetros
(figura III.5). O ramo de maior diâmetro foi constituído por um compartimento
subdivido por uma rede de nylon onde as fatias foram colocadas. A parte interna do
conjunto foi totalmente preenchida com solução de perfusão a temperatura de cerca de
32
o
C, que foi continuamente oxigenada. Devido ao borbulhamento com carbogênio, o
pH da solução foi mantido constante em torno de 7,4. As fatias foram mantidas
submersas nessa câmara por cerca de 50 minutos.
Figura III.5 – Diagrama esquemático da câmara de perfusão montada com tubos e conexões em PVC. A
câmara foi preenchida com solução de perfusão, mantida a temperatura e oxigenação constantes.
As fatias foram depositadas no ramo de maior diâmetro sobre uma rede de nylon.
26
Entrada de
carbogênio
solução
Rede de
nylon
Banho-maria
III.4.2 - Câmara de interface
Os registros e a indução de AE’s e de ondas de DA foram feitos em uma câmara
de interface. A câmara utilizada, durante a realização de experimentos com dois
eletrodos de registro sobre a CG, foi desenvolvida no Laboratório de Neurociência
Experimental e Computacional da Universidade Federal de São João del-Rei (LANEC-
UFSJ) que é a mesma utilizada por CARVALHO (2003). Já nos experimentos
realizados utilizando a técnica do registro simultâneo do potencial extracelular e do
IOS, foi utilizada uma câmara de interface que é uma variante da utilizada por
CARVALHO (2003), diferindo no processo de iluminação, neste caso, por luz
transmitida, e na substituição da rede de nylon por uma membrana (0.4 µm Millicell
culture plate inserts; Millipore, Bedford, MA, USA). Na figura III.6, são apresentadas
fotos da câmara.
Em ambos os casos, as câmaras de interface foram constituídas de dois
compartimentos: a cuba, que é a parte superior (mostrada à esquerda, figura III.6), e o
banho-maria, que consiste da parte inferior (apresentada com detalhes à direita, figura
III.6). Para se evitar vibração mecânica a câmara de interface foi posicionada sobre uma
mesa inercial.
O tanque do banho-maria, compartimento inferior da câmara, contém 4
resistências (5Ω), ligadas em paralelo, que se encontram dentro de invólucros de vidro.
Dois deles podem ser vistos na figura III.6 (detalhe 5). Foram utilizados dois
borbulhadores que dispersam carbogênio no interior do recipiente (detalhe 8, figura
III.6). O aquecimento da água foi feito por resistores que foram submetidos a tensões
contínuas de até 12V. As tensões foram controladas via software desenvolvido em
plataforma LABVIEW 6.1 (NATIONAL INSTRUMENTS), através de um programa
desenvolvido especialmente para esse tipo de controle. De acordo com a temperatura
desejada, calculou-se a intensidade da tensão. O tubo (detalhe 6, figura III.6), que
conduz a solução de perfusão para a cuba e se encontra enrolado ao cilindro central, foi
aquecido devido à água contida no banho-maria. Dessa forma, as fatias foram
perfundidas com a temperatura da solução devidamente controlada. O oxigênio foi
conduzido ao interior do banho-maria, através de tubos de silicone. O carbogênio, que
foi umidificado e aquecido devido ao seu borbulhamento dentro da água, foi, então,
direcionado sobre a face superior das fatias mantidas na cuba.
27
Figura III.6 - Fotografia da câmara de interface. Sendo, à direita, vista superior mostrando em
detalhe a constituição da cuba. Em 1, está o local onde as fatias foram depositadas; em 2, o
recipiente por onde é controlado o nível da solução de banho das fatias; em 3, o termômetro
responsável pelo controle da temperatura da solução de banho das fatias; e, em 4, os orifícios por
onde chega o oxigênio na câmara. E, à direita, a vista lateral mostrando o banho-maria. Em 5,
são mostradas duas das quatro resistências envolvidas em invólucros de vidro; em 6, o tubo
enrolado no cilindro central, por onde passa a solução de banho aquecida a ser aquecida; em 7, o
local por onde o carbogênio chega na câmara; e, em 8, um dos dois borbulhadores de oxigênio
existentes na câmara.
A cuba, composta de 3 cilindros de PVC com uma base em acrílico, foi acoplada
superiormente ao banho-maria. Um compartimento intermediário foi formado com o
cilindro central. Esse compartimento foi preenchido com a solução de perfusão/indução
até que fosse atingido o nível da rede de nylon (detalhe 1, figura III.6), ou membrana
milipore. Essa rede é colocada sobre o cilindro central, sobre a qual as fatias repousam.
A altura da solução de banho foi controlada em dois níveis opcionais: um mais alto e
outro mais baixo. Esse controle foi feito através de recipiente isolado e vaso
comunicante (detalhe 2, figura III.6). O oxigênio chega à cuba através de perfurações
(detalhe 4, figura III.6) que se encontraram entre o cilindro de acrílico mais externo e o
cilindro de PVC intermediário.
Para uma melhor oxigenação e homogeneização da temperatura no interior da
cuba, uma tampa em forma de disco foi utilizada para encobrir o ambiente em torno das
fatias. Essa tampa continha um orifício central, através do qual eletrodos de medida
tinham acesso às fatias. Por esse mesmo orifício foi feita a exaustão do carbogênio.
28
Foram comuns problemas de condensação, tanto na superfície interna da tampa
quanto na ponta dos eletrodos de medição. Para evitar que gotas de água alterassem a
osmolaridade do meio, a manutenção das fatias e aquisição dos sinais, filtros de papel
foram colocados sob a tampa e enrolados nos eletrodos de aquisição de modo a conter a
condensação.
III.4.3 - Sistema de aquisição
Foram utilizados eletrodos formados por um fio de prata e uma micropipeta de
vidro (modelo THINWALL, TW150F-3 – WPI). As pipetas foram preparadas com
ajuda de um puxador de pipetas (modelo DMZ UNIVERSAL PULLER – ZEITZ-
INSTRUMENTS) e preenchidas com solução de NaCl 1,0 M. Para se evitar o efeito de
bateria, provocado pela acumulação de cargas na interface líquido-metal, o fio de prata
foi cloretado. A cloretagem foi feita utilizando-se solução de 1,0 M de HCl, onde dois
eletrodos de prata foram mergulhados. Com uma fonte de corrente contínua, foi
aplicada, durante cerca de 15minutos, uma tensão de aproximadamente 1,0V entre os
filamentos dos eletrodos. Um filme escuro de AgCl foi formado sobre a superfície do
eletrodo ligado ao terminal positivo, que atraiu ions Cl
-
, enquanto o outro fio de prata
atraiu os ions H
+
.
Após cloretados, os microeletrodos foram conectados a headstages (modelo AI
402 ×50, ULTRALOW NOISE AMPLIFIER – AXON INSTRUMENTS) interligadas a
amplificadores (modelo CYBERAMP 380 – AXON INSTRUMENTS). O programa
SAE (Sistema Auxiliar de Experimentos), desenvolvido no LANEC (SILVA, 2000), foi
utilizado para controle dos amplificadores, digitalização, exibição em tempo real e
armazenamento em arquivos. O processamento dos sinais foi feito off-line. Para saída
gráfica, foi utilizado o programa MATLAB 6.0 (MATHWORKS). A análise do sinal foi
realizada através do pCLAMP 8.0 (AXON INSTRUMENTS). Na aquisição e
processamento dos sinais, foi empregado um computador Pentium III de 1 GHz e 512
MB de memória RAM.
Foi utilizada uma mesa, suspensa por câmaras de ar, que evitam distúrbios
devido a vibrações durante experimentos. O ajuste do nível da mesa foi feito através
dessas câmaras de ar. Para se evitar interferências eletromagnéticas sobre os
equipamentos foi utilizada uma gaiola de Faraday envolvendo a mesa (figura III.7).
29
Figura III.7 – Diagrama esquemático da montagem experimental para indução de AE’s e registro do
potencial extracelular, em duas posições distintas, sobre a CG do GD. O potencial elétrico foi
registrado a partir do posicionamento dos eletrodos. Os eletrodos são conectados a headstages
por meio de holders. As headstages são interligadas a um amplificador. Os sinais são
armazenados em um computador. Uma câmara de CCD (charge-coupled device), acoplada a
uma binocular, captura as imagens da fatia, utilizadas para a determinação dos valores da
distância entre os eletrodos.
III.4.4 - Sistema de visualização
Para a visualização das fatias, em experimentos utilizando dois eletrodos, foi
utilizado um microscópio (modelo PZMTII-L – WPI) que permite uma ampliação de
225x. Sua distância focal e o campo de visão máximo são de 314 mm e diâmetro 110
mm, respectivamente.
Para iluminação das fatias, foi utilizado um iluminador de fibra óptica com
hastes flexíveis e de intensidade ajustável (modelo FIBER LITE, SÉRIE 180 –
DOLAN-JENNER). Com o auxílio de micro-manipuladores mecânicos (modelo MC-
35A – NARISHIGE INTERNATÍONAL), os eletrodos foram posicionados sobre o
tecido. O ajuste fino de posicionamento foi feito com o auxílio de micro-manipuladores
hidráulicos (modelo MHW-3 – NARISHIGE INTERNATÍONAL), a partir do instante
em que os eletrodos estavam próximos da camada de interesse.
30
Nos experimentos de registro simultâneo do potencial extracelular e do IOS (luz
transmitida) utilizou-se um microscópio estereoscópico (modelo NIKON – SMZ 1500)
com capacidade de ampliação de 112,5 vezes. Para a iluminação das fatias foi utilizada
uma lâmpada (PHILIPS – Projection Lamp, 6 V e 20 ou 30 W), com ajuste de
intensidade, presa na parte inferior do microscópio. No posicionamento do eletrodo de
registro sobre o tecido foram utilizados os mesmos modelos de micro-manipuladores
hidráulicos utilizados nos experimentos com dois eletrodos.
Ambos os microscópios foram montados de forma que suas objetivas
apresentavam-se perpendicular à mesa XY, permitindo, assim, uma vista superior das
fatias e uma melhor visualização de suas camadas.
III.5 - Cálculo da velocidade dos eventos
Para o cálculo da velocidade dos eventos de AE e de DA foi necessário
determinar a distância (d) entre os dois eletrodos, que fazem medidas simultâneas do
potencial extracelular, (figura III.8), e o intervalo de tempo (∆t) de defasagem entre os
eventos. Existem diferentes formas para se determinar a distância entre a posição dos
dois eletrodos na CG. Neste trabalho, utilizou-se uma lente graduada em micrômetros,
colocada na ocular do microscópio, justaposta a uma imagem de referência.
Inicialmente, adotou-se um valor de ampliação adequado do microscópio para a captura
da imagem da lente. Essa ampliação foi utilizada como padrão para a captura das
demais imagens durante o trabalho. Em seguida, determinou-se a relação existente entre
o número de pixels e a menor unidade de comprimento da lente (50µm). Dessa forma,
as distâncias foram obtidas através da densidade de pixels/µm encontrada.
O intervalo de tempo (∆t) entre eventos dos eletrodos distintos foi determinado
utilizando-se o programa SAE. Considerando que a velocidade de propagação dos
eventos é constante ao longo das regiões do GD, utilizou-se a equação III.1 para a
obtenção do seu valor.
t
d
v
∆
=
, (III.1)
onde d é a distância entre os eletrodos na CG do GD e ∆t é o intervalo de tempo de
defasagem entre os eventos de AE e de DA, medidos por cada eletrodo.
31
Figura III.8 – Esquema da posição de dois eletrodos, a uma distância (d) em micrômetros, sobre a CG do
GD do hipocampo de rato.
III.6 - Registro das imagens do IOS
No registro de imagens do IOS foi utilizada a técnica de luz transmitida. A luz
branca de uma lâmpada (PHILIPS – Projection Lamp, 6 V e 20 ou 30 W), posicionada
na base do microscópico, passava por dentro da câmara de interface, atravessando a
membrana milipore, para, então, iluminar a fatia. Uma binocular acoplada a câmara
CCD de alta sensibilidade (COOLSNAP PROcf) foi utilizada para a captura da imagem
por luz transmitida. As imagens foram capturadas pela câmera CCD, visualizadas por
um monitor (SHARP – modelo C-1457) e gravadas em fitas de vídeo, através de um
vídeo cassete (ZENITH – modelo VR 4236 HZ), com uma taxa de amostragem de 30
quadros por segundo.
III.6.1 - Procedimento de captura das imagens
As imagens foram capturadas numa taxa de amostragem de 30 Hz, a uma
resolução de 640 x 480 pixels. Durante as medidas, as imagens são gravadas através de
um videocassete, registradas em fitas VHS. O processo de digitalização envolveu uma
placa digitalizadora de vídeo, DC10 Plus, gerenciada pelo programa Pinnacle Studio -
versão 8.10. Esse programa salva a seqüência de quadros em formato AVI.
Posteriormente, os quadros foram extraídos no formato JPEG, com o auxílio do
32
programa Fast Movie Processor, versão 1.41. No formato JPEG, essas imagens foram
gravadas em CD’s, para posterior processamento.
III.6.2 - IOS em um sítio da fatia
Uma vez determinada a seqüência de quadros correspondentes às AE’s e a
propagação da onda de DA, foi extraído o IOS de um determinado sítio da fatia. O IOS
é extraído a partir do cálculo das intensidades de luz de cada pixel do sítio, referente a
um determinado quadro, a partir das médias das três componentes correspondentes ao
padrão RGB do pixel. Calculadas as intensidades de cada pixel do sítio, para cada
quadro da seqüência, obtém-se um sinal do tipo
)(
,
tI
ji
, que corresponde à intensidade de
luz do pixel de coordenadas (i,j), para cada instante de tempo, t, da seqüência de
quadros. A intensidade média de luz do sítio considerado é dada por:
∑ ∑
= =
×
=
n
j
m
i
ji
tI
nm
tI
1 1
,
)(
1
)(
, (III.2)
considerando que cada sítio selecionado corresponde a um retângulo com m x n pixels.
A variação da intensidade média dos pixels desse sítio, durante as AE’s e a onda
de DA, pode ser calculada tendo como referência a intensidade de luz, medida no
mesmo sítio, chamada de intensidade controle,
cont
I
, que é uma média das intensidades
dos sítios dos quadros que antecedem o evento. Assim, a variação da intensidade média
dos pixels do sítio,
)(
tI
∆
, é obtida da diferença:
)()(
tIItI
cont
−=∆
, (III.3)
que normalizada pela própria intensidade controle, fica:
cont
N
I
tI
tI
)(
)(
∆
=∆
. (III.4)
Para determinação do IOS em um sítio da fatia, no presente trabalho, foi adotada
como dimensão padrão do sítio uma região quadrada com 21 × 21 pixels. Isso
33
corresponde, de acordo com a ampliação utilizada no microscópio, a um retângulo de
109 × 129 µm em relação às dimensões reais da fatia do hipocampo.
III.6.3 - Imagens das Variações do IOS durante as AE’s e DA
As imagens das variações normalizadas do IOS, que permitem identificar os
locais de ocorrência das AE’s e a dinâmica da onda de DA na fatia, foram calculadas
também com base nos métodos utilizados por HOLTKAMP et al. (2003) e ANDREW
et al. (1996). Assim, o procedimento de cálculo das seqüências de imagens das
variações do IOS,
)(
tIMAG
N
∆
, é análogo ao descrito para cálculo do
)(
tI
N
∆
, porém, o
cálculo que é feito para um sítio, será feito para cada pixel de cada quadro. O resultado,
portanto, será uma seqüência de imagens que correspondem ao IOS do GD, ao longo do
tempo. Essas imagens, apresentadas de forma seqüencial, como um filme, permitiram
acompanhar a evolução temporal dos eventos de AE e a dinâmica de propagação da
onda de DA no GD da fatia de hipocampo.
III.6.4 - Imagem da variação espaço-temporal do IOS
Com o objetivo de condensar as informações contidas numa seqüência de
imagens, referentes às AE’s e à propagação da DA, foi desenvolvido um procedimento
que sintetiza todas essas informações numa imagem única, denominada imagem da
variação espaço-temporal do IOS, imagem VET do IOS. O procedimento de cálculo da
imagem VET inicia com o traçado de uma poligonal ao longo das camadas de
ocorrência de AE’s e DA, como exemplifica o realce mostrado na imagem da figura
III.10-A. Uma vez levantada a poligonal, para cada imagem da seqüência foram
calculadas as médias das intensidades de luz dos pixels dos sítios (quadros com 21 x 21
pixels), centrados em cada pixel da poligonal (figura III.10-B – sítios quadrados em
cinza escuro).
Para construir a imagem VET, os valores médios de intensidade, encontrados
para cada pixel da poligonal de uma das imagens da seqüência, são dispostos em uma
coluna vertical, que, portanto, corresponderá à retificação da poligonal, preservando a
mesma métrica. Cada pixel da coluna receberá uma cor, referente a uma escala de cores
falsas associadas à intensidade normalizada de luz (normalização em relação à
intensidade de luz do pixel correspondente à imagem controle). As colunas, calculadas
34
como descrito, para cada imagem da seqüência, serão dispostas lado a lado, respeitando
a ordenação temporal das imagens. Como resultado, será formada uma matriz de pixels
coloridos que corresponderá à variação espaço-temporal do IOS, durante a ocorrência
das AE’s e DA, ao longo das camadas do GD da fatia. Assim sendo, para representar o
GD, com o método descrito, é construída uma imagem VET, correspondente à poligonal
da CG do GD.
Figura III.10 – (A) Imagem de uma fatia do hipocampo onde é mostrada uma poligonal (curva branca)
traçada sobre a CG do GD. O GD é constituído pelas regiões Suprapiramidal (SP),
Infrapiramidal (IP) e o Apex (A). (B) Diagrama esquemático da ampliação do giro denteado que
representa o conjunto de pixels (quadrados pequenos) que formam a imagem. Os pixels em
branco correspondem aos pixels da poligonal da parte A. Os pixels em cinza escuro constituem a
região quadrada que foi utilizada para calcular as intensidades médias dos pixels varrendo toda a
poligonal. Essa região quadrada é sempre centrada em cada pixels da poligonal (por exemplo,
pixel em preto). A partir de cada imagem correspondente a cada instante de tempo, foi construída
uma coluna, utilizada para a construção da imagem VET, possuindo as intensidades médias de
luz ao longo de toda a CG.
Para construir a imagem VET, foi necessário saber quais posições das camadas
apresentavam maior variação do IOS durante as AE’s. Esse problema foi contornado
aplicando o método da poligonal, descrito nos parágrafos anteriores, agora, na direção
perpendicular às camadas do GD da fatia (figura III.11). Porém, nesse caso, foram
extraídos os valores de intensidade de luz para o valor máximo do IOS, normalizado em
relação à mesma posição da imagem controle. Esses valores foram dispostos num
gráfico, demarcados nas coordenadas horizontais, associados a coordenadas verticais
35
referentes à posição do pixel na poligonal, constituindo, assim, o que foi denominado
perfil do IOS para as camadas do GD.
Figura III.11 – Fotografia do GD do hipocampo de rato, onde estão identificadas as camadas molecular
(CM) e granular (CG). As retas contínuas exemplificam poligonais que foram usadas
para extração das intensidades de luz dos pixels e as linhas tracejadas delimitam as regiões de
estudo.
III.6.5 - Fluxograma para os procedimentos adotados para o processamento das
imagens
No fluxograma apresentado na figura III.11, é apresentada de forma resumida a
ordem com que foram aplicados os procedimentos para processamento de imagens.
Esses procedimentos foram aplicados aos eventos de AE’s e às ondas de DA. Como
mencionado anteriormente, os eventos de AE e de DA foram gravados em fitas de
vídeo. Posteriormente, cada um dos eventos foi extraído e armazenado em disco
compacto no formato de imagem (JPEG). A partir dessas imagens, foram construídas as
imagens das variações percentuais do IOS, como ferramenta para identificação da
dinâmica espaço-temporal de eventos de AE e de DA (item III.7.1). Depois, com o
objetivo de verificar o comportamento temporal do IOS nas proximidades do eletrodo
para registro do potencial elétrico extracelular, foi construída a variação do IOS nessa
região (item III.7.2). Foi analisado também o perfil do IOS para as camadas do GD
(item III.7.3). Após identificar a camada que houve maior variação do IOS, durante a
ocorrência de AE, foi construída, para essa camada, a imagem espaço-temporal da
variação do IOS, a qual possibilita identificar a dinâmica espaço-temporal de eventos de
AE e de DA (item III.7.4). Após gravação das imagens em disco compacto, todos os
36
cálculos e reconstruções das imagens foram realizados utilizando o programa
desenvolvido em MATLAB, versão 6.5, e um computador PENTIUM IV, com
velocidade de 2,4 GHz e 256 Mbytes de memória RAM.
Figura III.11 – Fluxograma que indica a ordem em que foram aplicados os procedimentos para o
processamento de imagens.
III.7 - Simulação computacional
III.7.1 - Estrutura geral
Simultaneamente aos estudos experimentais foram realizadas simulações
computacionais. O modelo computacional utilizado (RODRIGUES et al., 2002) além de
retratar os bursts epileptiformes no GD, mostrou ser capaz de reproduzir, também, as
ondas de DA, tal como é verificado experimentalmente. Dessa forma, os resultados
obtidos com esse modelo foram utilizados como ferramentas importantes de auxílio na
interpretação dos mecanismos eletrofisiológicos envolvidos durante os eventos
epileptiformes e o fenômeno da DA.
O modelo computacional foi estruturado a partir da modelagem de mecanismos
de geração de bursts no GD. Essa região foi composta por densos pacotes de células
neuronais que foram interpretados computacionalmente como aglomerados de esferas.
37
Imagem da variação espaço-
temporal do IOS
Perfil do IOS nas camadas do GD
Imagens das variações do IOS
durante as AE e DA
IOS em um sítio da fatia
Disco compacto (cd)
AE e onda de DA
Fita de vídeo
Cada aglomerado foi constituído de pares de compartimentos celulares neurônio-glia
(figura III.12 – B), que se comunicam com o espaço extracelular. O espaço extracelular
foi representado por uma rede de compartimentos justapostos e comunicantes entre si.
Foram acrescentados conjuntos de compartimentos extracelulares (em cinza claro na
figura III.12 – A), à base e às laterais, para representar outras regiões do GD, como
arborizações dendríticas. Também foram acrescentados conjuntos de compartimentos
(em cinza claro na figura III.12 – A) para representar o efeito da perfusão do tecido
pelas soluções nutrientes. Todos esses mecanismos formaram uma estrutura
tridimensional como mostrado na figura III.12 – A. O modelo considera movimentações
iônicas por eletrodifusão (TEIXEIRA et al., 2001) ao longo do meio extracelular, entre
os meios intra e extracelulares e intercelulares. A eletrodifusão iônica neuronal é
descrita por canais iônicos de K
+
, Cl
-
e Na
+
, bombas de Na
+
/K
+
e co-transporte Cátion-
Cl
-
. Já a eletrodifusão intercelular é descrita por gap-junctions (figura III.13-A). Para o
caso das glias (figura III.13-B), foram implementados os mecanismos de co-transporte
Na
+
- K
+
- Cl
-
, bombas de Na
+
/K
+
e canais iônicos.
(A) (B)
Figura III.12 – (A) Estrutura tridimensional do modelo computacional para a camada de corpos celulares
do giro denteado. Os compartimentos em cinza escuro representam a camada de corpos
celulares, sendo que cada um deles corresponde à estrutura elementar da figura (B). Os
compartimentos em cinza claro, formados apenas de meios extracelulares, dos planos da base e
laterais têm suas concentrações mantidas constantes, nos valores fisiológicos normais do meio
extracelular, para representar a solução de perfusão que banha as fatias de hipocampo durante
experimentos. Os demais compartimentos em cinza claro são, também, apenas meios
38
extracelulares e representam as regiões do giro denteado que contém terminais axônicos e
árvores dendríticas.
(A)
(B)
Figura III.13 – (A) Representação esquemática dos mecanismos de transporte iônico para corpos
celulares de neurônios. (B) Representação esquemática dos mecanismos transmembrânicos de
transporte iônico para as glias.
III.7.2 - Eletrodifusão para o meio extracelular.
A equação da eletrodifusão (equação III.5) descreve a movimentação iônica ao
longo do meio extracelular (TEIXEIRA et al. 2001). Nesta equação, a variação
temporal da concentração iônica,
tC
j
∂∂
, da espécie iônica j em um dado
compartimento, é dada pela combinação da 2ª lei de Fick para a difusão (equação III.6)
com o efeito produzido pelo campo elétrico (equação III.7).
VC
RT
FDz
VC
RT
FDz
C
D
t
C
j
jj
j
jj
j
jj
2
22
2
2
∇+∇∇+∇=
∂
∂
λλλ
(III.5)
j
jj
C
D
t
C
2
2
∇=
∂
∂
λ
(III.6)
VC
RT
FDz
VC
RT
FDz
t
C
j
jj
j
jjj
2
22
∇+∇∇=
∂
∂
λλ
rr
, (III.7)
onde C
j
representa a concentração do íon j, onde j = Na
+
, K
+
ou Cl
-
, no compartimento
de coordenadas (x,y,z), no instante t.
j
C
2
∇
e
j
C
∇
são o laplaciano e o gradiente de
39
concentração do íon j, respectivamente.
V
2
∇
e
V
∇
são o laplaciano e o gradiente de
potencial, respectivamente. D
j
e z
j
são, respectivamente, a constante de difusão e
valência do íon j. λ é a tortuosidade no meio extracelular, R, T e F são, respectivamente,
a constante universal dos gases, a temperatura e a constante de Faraday.
O campo elétrico no meio extracelular é calculado através da equação III.8, onde
se admite que os ions estão mutuamente acoplados e que a soma vetorial das correntes
iônicas é nula em todos os pontos.
ClClClKKKNaNaNa
ClClClKKKNaNaNa
CDzCDzCDz
CDzCDzCDz
F
RT
V
++
∇+∇+∇
−=∇
(III.8)
A partir dessa equação, obtém-se o potencial ao longo do meio extracelular.
Porém, este campo elétrico permite determinar apenas variações lentas em nível DC do
potencial extracelular. Para determinar as variações em alta freqüência, os PS’s, leva-se
em consideração o efeito de campo das correntes iônicas transmembrânicas sobre o
meio extracelular (equação III.9).
∑
=
⋅
=
N
n
n
j
n
PA
d
Ik
V
1
, (III.9)
onde V
PA
é o potencial elétrico no compartimento (x,y,z), provocado pelas correntes
transmembrânicas. d
n
é a distância entre o centro do corpo celular neuronal n e o ponto
onde está sendo calculado o potencial. I
n
m
é a corrente total de membrana no neurônio n
e k é uma constante que descreve as propriedades dielétricas do meio extracelular. O
gradiente de potencial total no meio extracelular é dado pela equação III.10:
),,,(),,,(),,,(
tzyxVtzyxVtzyxV
PAtotal
∇+∇=∇
(III.10)
III.7.3 - Eletrodifusão intercelular (gap-junction)
40
Considerando-se um modelo unidimensional para o tecido neuronal, a corrente
iônica
gj
j
I
, para cada espécie iônica j, através das gap-junctions, é calculada pela
equação de corrente de Nernst Planck na forma discreta apresentada na equação III.11.
−
+
−
−≈
+
+
d
VV
C
RT
FDz
d
CC
FDzI
i
m
i
m
i
j
jj
i
j
i
j
gj
jj
igj
j
)1()(
)(
)1()(
)(
, (III.11)
onde
gj
j
D
é a constante de difusão do íon j nas gap-junctions, C
j
(i)
e C
j
(i+1)
são as
concentrações do íon j nos corpos celulares dos dois neurônios vizinhos considerados, d
é a distância entre os centros destes corpos celulares, V
m
(i)
e V
m
(i+1)
são os respectivos
potenciais de membrana.
III.7.4 - Correntes iônicas transmembrânicas
A corrente para cada espécie iônica através dos canais de membrana é calculada
pela equação III.12, que corresponde à equação Goldman-Hodgkin-Katz para corrente,
ou GHK (HILLE, 1992):
1
2
−
−
=
RT
FVZ
o
j
RT
FVZ
i
j
m
jjj
mj
mj
e
CeC
RT
FV
zPI
, (III.12)
onde P
j
é a permeabilidade transmembrânica do íon j, V
m
é o potencial de membrana,
C
j
o
e C
j
i
são as concentrações extra e intracelulares do íon j, respectivamente.
III.7.5 - Co-transporte K
+
- Cl
-
(KCC)
Para o co-transporte KCC, ocorre o fluxo simultâneo dos K
+
e Cl
–
na razão 1:1.
Este fluxo é determinado analisando-se as possíveis reações dos K
+
e Cl
–
com a enzima
transmembrânica responsável pelo transporte. Esse fluxo foi representado pela equação
III.13.
41
))((
o
Cl
i
ClCl
o
K
i
Kk
o
Cl
o
K
i
Cl
i
K
KCCKCC
CCKCCK
CCCC
Q
++++
−
=
φ
, (III.13)
onde Q
KCC
é a constante de proporcionalidade que também descreve a densidade de
enzimas na membrana. K
K
e K
Cl
são, respectivamente, as constantes de dissociação do
K
+
e do Cl
–
.
III.7.6 - Co-transporte Na
+
- K
+
- Cl
-
(NKCC)
Para o co-transporte NKCC, ocorre o fluxo simultâneo de K
+
, Na
+
e Cl
–
, na razão
1:1:2. Este fluxo é determinado analisando as possíveis reações de K
+
, Na
+
e Cl
–
com a
enzima transmembrânica responsável pelo transporte. Esse fluxo foi representado pela
equação III.14.
2
22
))()((
)()(
o
Cl
i
ClCl
o
K
i
Kk
o
Na
i
NaNa
o
Cl
o
K
o
Na
i
Cl
i
K
i
Na
NKCCNKCC
CCKCCKCCK
CCCCCC
Q
++++++
−
=
φ
(III.14)
onde Q
NKCC
é a constante de proporcionalidade que também descreve a densidade de
enzimas na membrana. K
K
, K
Cl
e K
Na
são, respectivamente, as constantes de dissociação
do K
+
, do Cl
–
e do Na
+
.
III.7.7 - Bombas de Na/K.
A bomba de Na
+
e K
+
promove o fluxo de Na
+
e K
+
em sentidos opostos na razão
de 3:2, respectivamente. O efluxo de 3 Na
+
para o meio extracelular e o influxo 2 K
+
para o meio intracelular foram interpretados como o deslocamento efetivo de uma carga
positiva. Essa carga foi admitida como sendo um íon fictício p, monovalente e positivo,
cuja corrente é calculada pela equação III.15, similar àquela da corrente de GHK.
1
−
−
=
RT
FV
o
p
RT
FV
i
p
m
pp
m
m
e
CeC
RT
FV
PI
, (III.15)
42
onde P
p
descreve a permeabilidade desse íon, C
p
o
e C
p
i
são as concentrações extra e
intracelulares do íon p, respectivamente. Essas concentrações são determinadas
analisando as reações de Na
+
, K
+
, ATP, ADP e fósforo com a enzima (Na
+
/K
+
)-ATPase
segundo as equações III.16 e III.17 para os meios extra e intracelular, respectivamente.
2
3
,
111
++
++
++
=
i
Na
i
Na
i
K
i
K
i
K
o
K
o
K
o
Na
o
Na
o
Na
i
ATP
i
ATP
i
PADP
i
P
i
ADP
i
P
i
ADP
o
p
o
p
K
C
KC
C
K
C
KC
C
K
C
KCC
CC
KC
,
(III.16)
2
3
,
1
1
1
++
++
++
=
o
Na
o
Na
o
K
o
K
o
K
i
K
i
K
i
Na
i
Na
i
Na
i
PADP
i
P
i
ADP
i
ATP
i
ATP
i
ATP
i
p
i
p
K
C
KC
C
K
C
KC
C
K
CC
KC
C
KC
,
(III.17)
onde
i
PADP
K
,
e
i
ATP
K
, são as constantes de dissociação de ADP e fósforo e ATP,
respectivamente.
i
Na
K
e
i
K
K
, são as constantes de dissociação intracelulares de Na
+
e K
+
e
o
Na
K
e
o
K
K
, são as respectivas constantes de dissociação extracelulares.
III.7.8 - Cálculo do potencial transmembrânico.
Para calcular o potencial de membrana foi utilizada a equação de GHK de
potencial, no equilíbrio dinâmico (Σ I = 0), dada pela equação III.18. Nessa equação,
também foram incorporados o efeito eletrogênico da bomba de Na
+
/ K
+
e ainda das
correntes iônicas através das gap-junctions:
++++
++++
=
1
ln
i
pp
o
ClCl
i
KK
i
NaNa
o
pp
i
ClCl
o
KK
o
NaNa
m
CPCPCPCP
fCPCPCPCP
F
RT
V
, (III.18)
onde
43
RT
FV
m
RT
FV
m
gj
jgj
mm
e
VF
RT
e
A
IA
f
+⋅
−⋅−=
∑
2
1
,
sendo, A
m
e A
gj
as áreas da membrana e das gap-junctions respectivamente e f uma
função que depende da corrente iônica através das gap-junctions (artifício de cálculo).
III.7.9 - Cálculo da variação de volume
No modelo, o volume das células neuronais e gliais foi calculado em cada
instante de tempo, e para cada posição da rede, utilizando-se a equação III.19. A qual é
a mesma para a estimativa do volume intracelular neuronal (V
n
) ou glial (V
g
), para
ambos os casos indicado por V
i
.
( )
∑ ∑
∑
+++
+
=
i
s
i
j
o
s
o
j
i
s
i
jtotal
i
nnnn
nnV
V
. (III.19)
O cálculo da variação de volume extracelular (V
o
) considerou que a soma V
i
mais V
o
fosse constante (V
total
). Desta forma, a equação III.20 permitiu o cálculo da
variação de volume extracelular:
( )
gno
VVV
∆+∆−=∆
(III.20)
III.7.10 - Simulação do IOS das AE’s
Durante AE’s induzidas em tecidos cerebrais, observa-se intensa movimentação
iônica entre os meios extra e intracelulares. Essa movimentação explica as alterações
significativas nos volumes extra e intracelulares, ocasionadas por variações da
osmolaridade desses meios, implicando em alterações na geometria do tecido, como
demonstrado por LUX et al., em 1986. Mudanças ocorridas no citoplasma tais como,
alteração de sua viscosidade (HILL e KEYNES, 1949), variações do espaço extracelular
(HOLTHOFF, 1998) bem como, as macromoléculas do citosol e as organelas celulares,
são considerados prováveis mecanismos responsáveis pelo espalhamento da luz gerador
do sinal óptico (MULLER e SOMJEM, 1999).
44
Por outro lado, DUARTE (2000) considerou a hipótese na qual o espalhamento
da luz era decorrente de variações do índice de refração, ocasionadas por mudanças nas
osmolaridades dos meios extra e intracelulares. Simulações computacionais de
estruturas ópticas, semelhantes às camadas dos processos dendríticos, mostraram que
pequenas variações no índice de refração relativo entre os meios intra e extracelulares,
na ordem de 10
-2
, foram suficientes para reduzir a transmitância em 10%. Essa alta
sensibilidade às alterações dos índices de refração se deve às múltiplas reflexões nas
várias interfaces de membranas dos terminais sinápticos, separando os meios extra e
intracelulares.
Considerando a hipótese de que a variação da razão dos índices de refração extra
e intracelulares poderia modular o espalhamento de luz em tecidos neuronais, e que
esses índices são modulados pelas osmolaridades dos meios, as quais são alteradas pelas
variações iônicas intra e extracelulares, fez-se o cálculo do espalhamento de luz. Esse
cálculo envolveu a estimativa do espalhamento em função das razões dos índices de
refração, calculada computacionalmente, por DUARTE (2000), cujo gráfico é
apresentado na figura III.14.
Admitindo que a osmolaridade dos meios possa ser representada pelo somatório
de suas concentrações iônicas, tem-se as equações III.21 e III.22:
oooo
ClKNaO
][][][
−++
++=
, (III.21)
iiii
ClKNaO
][][][
−++
++=
, (III.22)
onde O
o
e
O
i
, representam, respectivamente, as osmolaridades extra e intracelulares.
Normalizando-se as osmolaridades em função das concentrações iônicas no
estado de repouso, foram obtidas as equações III.23 e III.24.
ororor
ooo
N
o
ClKNa
ClKNa
O
][][][
][][][
−++
−++
++
++
=
, (III.23)
iririr
iii
N
i
ClKNa
ClKNa
O
][][][
][][][
−++
−++
++
++
=
, (III.24)
45
onde
N
o
O
e
N
i
O
são as osmolaridades normalizadas dos meios extra e intracelulares
respectivamente. Portanto, a estimativa da osmolaridade relativa (O
r
) entre os meios
extra e intracelulares foi obtida através da equação III.25.
N
o
N
i
r
O
O
O
=
, (III.25)
Considerando que as variações do índice de refração relativo entre os meios
extra e intracelulares, n
r
, devam ser muito pequenas, e que no repouso o equilíbrio
osmótico justifique a transparência do tecido, como é o caso da retina (DUARTE,
2000), pode-se estimar n
r
em função de O
r
por uma relação linear:
nrnr
KOKn
−+⋅=
1
, (III.26)
onde K
n
= 0,1. O coeficiente K
n
foi propositalmente ajustado para que n
r
, durante as
AE’s e DA, varie no entorno de 1,0 numa faixa de ± 0,02. Essa variação foi estimada a
partir de comunicação pessoal do Prof. Oscar Nassif Mesquita do Departamento de
Física da UFMG.
46
Figura III.14 – Simulação da luz refratada numa camada de processos dendríticos em função do índice
de refração relativo (Modificado de DUARTE, 2000). Observa-se que desvios do índice relativo
na ordem de 0,02 resultam em redução de 10% da transmitância.
IV - RESULTADOS EXPERIMENTAIS
As medidas experimentais foram divididas em duas séries de experimentos: a
primeira se refere aos registros simultâneos de eventos epileptiformes e DA’s, em duas
posições distintas da CG do GD e a segunda aos registros simultâneos do potencial
extracelular e do IOS durante os eventos. As simulações foram realizadas reproduzindo
AE’s em uma rede de neurônios, glias e espaço extracelular, buscando representar a
estrutura do GD, com as devidas inter-conexões não-sinápticas. A simulação do
potencial extracelular e do espalhamento de luz pelo tecido, foram utilizados para
comparação com as medidas experimentais.
IV.1 - Estimativa da velocidade de propagação dos eventos
Foram realizados 10 experimentos de registro simultâneo do potencial
extracelular em duas posições distintas da CG do GD. Na figura IV.1, é apresentado um
47
exemplo típico do posicionamento dos eletrodos. Imagens como essas foram capturadas
para determinação da distância entre os eletrodos, utilizada no cálculo da velocidade dos
eventos.
Figura IV.1 – Fotografia de uma fatia do hipocampo de rato, onde podem ser identificados dois eletrodos
(indicados por setas), em duas posições distintas (separados por 120µm) no Apex da CG do GD.
Na figura IV.2, mostra-se um exemplo dos registros dos potenciais
extracelulares medidos em duas posições distintas, sobre a CG do GD, sob condições de
alto-K
+
e zero-Ca
2+
no meio extracelular. Uma análise visual permite verificar que,
apesar da ligeira diferença morfológica, existe um alto sincronismo entre os eventos.
48
Figura IV.2 – Registro do potencial extracelular, em duas posições distintas, sobre a camada de corpos
celulares do GD do hipocampo de rato sob condições de zero-Ca
+2
e alto-K
+
no meio
extracelular.
A fim de evitar a estimativa de velocidade de propagação de eventos não
associados, ou seja, eventos independentes que não estão relacionados à mesma
propagação de atividades epileptiformes, somente foram considerados os eventos com
correlação máxima acima de 80%. Essas medidas de correlação permitiram, ainda,
levantar a relação entre a correlação máxima de eventos e a distância dos eletrodos,
figura IV.3. O que se observa é que, apesar do aumento da distância entre os eletrodos,
os eventos ainda continuam altamente correlacionados, com ligeira redução da
correlação em função do aumento da distância.
Após agrupar os eventos de acordo com os grupos A, B, C, D ou DA, calculou-
se a velocidade de propagação média de cada grupo. Entretanto, para esse cálculo, foi
necessário desconsiderar os casos em que a defasagem entre os sinais medidos era nula.
Na tabela IV.1 consta o levantamento de todos os casos analisados. Pode-se observar
que, em 42% dos casos, os sinais apresentaram defasagem nula. As velocidades
estimadas para os eventos epileptiformes apresentaram grande variabilidade, estando os
desvios padrão na ordem de grandeza das médias
49
0,91
0,92
0,93
0,94
0,95
0,96
0,97
0,98
0,99
1
até 100 100-200 200-300
correlação máxima
Figura IV.3 – Correlação máxima entre os eventos de AE em função da distância entre os eletrodos,
posicionados sobre a CG do GD. Até 100 µm (0,993 ± 0,0008, 228 eventos), 100-200µm (0,977
± 0,001, 195 eventos) e 200-300µm (0,948 ± 0,0096, 146 eventos). Os resultados são expressos
com a média ± SEM (erro quadrático médio).
Tabela IV.1: Ocorrência de bursts com defasagem nula (DN) e aqueles utilizados para
o cálculo da velocidade de propagação (UCVP) dos eventos dos diferentes
grupos. São apresentados também os valores médios e respectivos desvios
padrão das velocidades de propagação dos eventos (VP), desconsiderando-se os
eventos com DN.
Grupo de
bursts
Número de eventos
Total DN UCVP
VP
(mm/s)
A 118 18 100
6,15 ± 6,23
B 235 123 112
12,71 ± 33,14
C 204 97 107
23,1 ± 50,3
D 11 3 8
44,08 ± 60,6
Através da análise do diagrama de Box (figura IV.4), foi possível observar que
esses valores, para cada um dos grupos, não seguem as características de uma
distribuição normal. Os diagramas revelam uma assimetria nos conjuntos de
velocidades. Também pode ser observado que os grupos B e C apresentam valores
aberrantes de velocidade de propagação, bem mais altos que a média.
50
Distância entre os eletrodos (µm)
Figura IV.4 – Diagrama de Box da velocidade de propagação de eventos de AE. Os conjuntos de dados
de bursts dos grupos A, B, C e D são assimétricos. Bursts dos grupos A e D não apresentam
valores aberrantes de velocidade de propagação. Bursts grupos B e C apresentam valores
aberrantes de velocidade de propagação. Todos os grupos de bursts não apresentam uma
distribuição normal. A linha em vermelho indica o valor da mediana de cada grupo, a cruz se
refere a valores aberrantes e o ponto indica ausência de pontos aberrantes.
O valor da velocidade de propagação da onda de DA foi de 1,31 ± 0,13mm/min.
A análise do diagrama de Box revelou que o conjunto de dados apresenta uma
distribuição normal evidenciada pela simetria registrada (figura IV.5).
Figura IV.5 – Diagrama de Box da velocidade de propagação da onda de DA. O conjunto de dados é
simétrico e não apresenta valores aberrantes para a velocidade de propagação dos eventos. O
conjunto apresenta uma distribuição normal. A linha em vermelho indica o valor da mediana de
cada grupo e o ponto indica ausência de pontos aberrantes.
51
IV.2 - Registro simultâneo do potencial extracelular e do IOS
A variabilidade das medidas das velocidades de propagação dos eventos
epileptiformes e a predominante ausência de defasagem entre os sinais mereceram um
estudo sobre suas causas. A estratégia encontrada foi procurar um tipo de medida que
fornecesse informações sobre a dinâmica espaço-temporal dos eventos. A suspeita de
que o IOS seria a melhor forma de monitorar a dinâmica foi reforçada pelos achados de
HOLTKAMP et al., (2002), MEIERKORD et al., (1997) e WEISSINGER et al.,
(2000). Assim, foram realizados 20 experimentos, onde foram registrados,
simultaneamente, o potencial extracelular em um determinado ponto da CG e o IOS de
todo o GD. Para análise do IOS, utilizou-se a técnica descrita no item III.6.4 que
permitiu construir as imagens VET.
IV.2.1 - Perfil do IOS para as camadas do GD
Durante as AE’s, os perfis da variação média da intensidade de luz, das camadas
granular e molecular do GD, nas regiões do A, SP e IP, revelaram que a maior variação
é observada na CG (figura IV.7). Na figura IV.7-A, apresenta-se o gráfico referente ao
estudo de 26 eventos epileptiformes ocorridos na região do A. Como se pode observar,
o pico de maior amplitude está localizado na CG, com valor médio normalizado igual a
0,84. Comportamento semelhante é observado na região IP, conforme figura IV.7-B,
onde o estudo demonstrou a amplitude máxima na CG, com valor médio normalizado
igual a 0,90. Da mesma forma, para a região SP, a amplitude máxima do IOS está
centrada na CG, com valor médio normalizado igual a 0,87.
Como o IOS tem suas variações máximas na CG, isso justificou que o estudo das
AE’s, a partir dos IOS, pudesse estar centrado nesta camada, o que levou à construção
das imagens VET a partir dessa camada.
52
(A)
(B)
(C)
Figura IV.7 – Perfis da variação média normalizada dos valores máximos do IOS durante eventos
epileptiformes, das camadas molecular e granular do GD. Em cada imagem, à esquerda, está
representado, de forma esquemática, um neurônio granular com seu corpo celular e ramificações
dendríticas, caracterizando cada uma das três camadas do GD: CG (camada granular), CMI
(camada molecular interna) e CME (camada molecular externa). À direita, o respectivo perfil do
IOS é apresentado em associação com as camadas. Em (A), o perfil do IOS para a região do A
demonstra que o IOS é mais intenso em CG. O mesmo comportamento pode se observado em
(B), para a região IP e em (C), para a região SP. As barras ao longo das curvas indicam o valor
do SEM.
IV.2.2 - Relação entre o IOS e o potencial extracelular característico das AE’s
Durante o estudo do IOS, foram analisados 140 eventos de AE’s. Desse total,
observou-se que 103 foram caracterizados, através das imagens VET, por um aumento
da transmitância de luz. O potencial elétrico extracelular simultâneo desses eventos foi
caracterizado pela componente DC, superposta por PS´s. Já as imagens VET típicas dos
demais eventos (37) revelaram uma redução da transmitância de luz pelo tecido e,
analisados os respectivos potenciais elétricos extracelulares, observou-se que os
mesmos foram caracterizados exclusivamente pela componente DC, sem a presença de
PS de grande amplitude. Essa relação entre o IOS e o potencial elétrico extracelular foi
53
observada independentemente do grupo de burst analisado. Para um melhor
detalhamento, uma vez que a componente DC está sempre presente em cada evento
epileptiforme, fez-se a medida dessa componente para cada evento. Na tabela IV.2,
estão sintetizadas as médias e respectivos desvios. Observa-se que os eventos cujo sinal
óptico é caracterizado por um aumento da transmitância de luz, bursts dos grupos B e C,
apresentam componentes DC no entorno de 5 mV. Já para bursts do grupo A, cujo sinal
óptico apresentou consistentemente redução da transmitância de luz, verificam-se
componentes DC no entorno de 11 mV. Confirmando essas observações, os bursts do
grupo D analisados, cuja componente DC apresenta os dois níveis, um entorno de 5 mV
e outro de 11 mV, mostraram, respectivamente, aumento e redução da transmitância.
Tabela IV.2 : Amplitude da componente DC do potencial elétrico dos grupos de AE’s.
Grupos de bursts
Amplitude da
componente DC
(mV)
A B C D
- 11,3 ± 0,31
(N=37)
- 5,1 ± 0,17
(N=61)
- 5,0 ± 0,17
(N=36)
- 5,4 ± 0,55 (*)
- 11,6 ± 1,09 (**)
(N=6)
N indica o número de eventos analisados
(*) amplitude da componente DC com a presença de PS´s
(**) amplitude da componente DC sem a presença de PS´s
Como base nessas observações relativas ao IOS e que permitem associá-lo ao
potencial extracelular, foi feita uma caracterização de cada grupo de burst segundo o
IOS, processado para a reconstrução das imagens VET, permitindo verificar as
características espaço temporais de cada evento.
IV.2.2.1 - IOS característico de bursts do grupo A
Nos estudos, foi verificada a ocorrência de 37 eventos do grupo A. Através da
análise das imagens VET, cujo exemplo típico é apresentado na figura IV.8-A,
observou-se consistentemente, para todos os casos, uma redução na transmitância de luz
em faixas da CG (região verde do exemplo), durante a atividade, cujo registro do
potencial é caracterizado por uma componente DC, sem a presença de PS’s de grande
amplitude. Observa-se que não há uma dinâmica de propagação bem definida, a
transmitância ocorre de forma lenta e sem a característica de uma frente de onda de
54
propagação. Como exemplificado na figura IV.8-A, o IOS, e por conseguinte a AE,
surge em pontos distintos da CG e, lentamente, invade as porções vizinhas, como se
num processo fickniano de difusão da atividade, até que as regiões recrutadas se
encontram perfazendo um largo sítio contínuo da AE. Esse processo espaço temporal
aparece na imagem como uma frente sinuosa de redução da transmitância de luz.
Figura IV.8 - Imagem VET e registro do potencial elétrico extracelular típico de bursts do grupo A. Em
(A) é apresentada a imagem VET e em (B) o registro do potencial extracelular. O eletrodo de
registro do potencial extracelular está posicionado na camada CG (posição indicada nas imagens
VET pela letra ‘e’). As regiões da CG são indicadas: Apex (A), Infrapiramidal (IP) e
Suprapiramdial (SP).
IV.2.2.2 - IOS característico de bursts do grupo B
Nos estudos, foi verificada a ocorrência de 61 eventos do grupo B, para os quais
foram construídas as correspondentes imagens VET. Uma imagem típica desse grupo é
mostrada na figura IV.9-A. Através dela, observa-se claramente que os eventos do
grupo B não apresentam uma dinâmica de propagação. Como exemplificado na figura
IV.9-A, o IOS, e por conseguinte a AE, surge simultaneamente numa faixa que envolve
um largo sítio do GD, atingindo as regiões do A, IP e parte da SP. A dinâmica espaço-
55
temporal aparece na imagem como uma frente retilínea de aumento de transmitância de
luz indicando um alto sincronismo. Essa frente está localizada, nesse caso, no instante
de tempo de cerca de 10s.
Figura IV.9 - Imagem VET e registro do potencial elétrico extracelular típico de bursts do grupo B. Em
(A) tem-se a imagem VET do evento e, em (B), o registro do potencial extracelular. O eletrodo
de registro do potencial extracelular está posicionado na camada CG (posição indicada nas
imagens VET pela letra ‘e’). As regiões da CG são indicadas: Apex (A), Infrapiramidal (IP) e
Suprapiramdial (SP).
IV.2.2.3 - IOS característico de bursts do grupo C
A análise da imagem VET típica de eventos do grupo C revelou, para todos os
casos analisados (36 eventos), como já observado para os grupos A e B, que não é
possível se identificar uma dinâmica de propagação. Considerando-se o instante inicial
de registro do evento observa-se que uma extensa região do GD entra em AE
simultaneamente. Isso pode ser visto na figura IV.10, onde a AE está presente nas
regiões IP, A e borda de SP. De forma análoga aos eventos do grupo B, a dinâmica
espaço-temporal das AE’s aparece na imagem como uma frente retilínea de aumento da
transmitância de luz (instante de tempo de cerca de 20s).
56
Figura IV.10 - Imagem VET e registro do potencial elétrico extracelular típicos de bursts do grupo C.
Para cada parte da figura, é apresentado a imagem VET (A) e o registro do potencial extracelular
(B). O eletrodo de registro do potencial extracelular está posicionado na camada CG (posição
indicada nas imagens VET pela letra ‘e’). As regiões da CG são indicadas: Apex (A),
Infrapiramidal (IP) e Suprapiramdial (SP).
IV.2.2.4 - IOS característico de bursts do grupo D
Foram analisados 6 eventos do grupo D induzidos experimentalmente, através da
supressão do fornecimento de carbogênio, durante a atividade epileptiforme. O registro
do potencial extracelular (figura IV.11-B) exibe, durante o início do evento, a
componente DC acompanhada de PS que se reduzem e desaparecem ao término do
evento. A imagem VET típica de eventos do grupo D está apresentada na figura IV.11-
A. Através da escala de cores adotada, verificou-se que existem instantes de tempo onde
pode-se observar aumento (região azul escura) e redução da transmitância de luz pelo
tecido (região verde e vermelha). Como no caso dos bursts do grupo B e C, observou-
se, durante o início do evento (instante de tempo de cerca de 25s), um aumento
simultâneo da transmitância de luz pelo tecido (observado nos 6 eventos) em um
57
extenso sítio do GD. Esse aumento da transmitância foi observado (faixa de tempo entre
25s e 150s) até que, provocado pela supressão do fornecimento de carbogênio durante o
evento, observou-se a redução da transmitância de luz (faixa de tempo entre 150s e
300s), que se deu de forma lenta, sem característica de uma frente de onda, onde as
razões de incremento e decremento foram igualmente suaves. A transmitância surge em
pontos distintos da CG e, semelhante ao fenômeno da difusão, invade lentamente as
porções vizinhas (constatado nos 6 eventos).
Figura IV.11 - Imagem VET e registro do potencial elétrico extracelular típicos de bursts do tipo D. Para
cada parte da figura, é apresentado a imagem VET (A) e o registro do potencial extracelular (B).
O eletrodo de registro do potencial extracelular está posicionado na camada CG (posição
indicada na imagem VET pela letra ‘e’). As regiões da CG são indicadas: Apex (A),
Infrapiramidal (IP) e Suprapiramdial (SP). A barra horizontal em (B), referente ao potencial
elétrico, indica o período de hipóxia (1min 30s).
IV.2.3 - IOS característico da onda de DA
Durante o estudo, foram analisadas 20 ondas de DA, onde 7 foram induzidas por
hipóxia e 13 espontâneas. Em todos os casos, a imagem VET típica das ondas de DA
revelou redução da transmitância de luz pelo tecido, durante a ocorrência do evento, e
uma dinâmica de propagação bem definida. Na figura IV.12, observa-se que o registro
58
do potencial extracelular apresentam alguns PS, nem sempre presentes nas frentes de
onda de DA. A imagem VET de eventos de DA espontânea (figura IV.12-A) e induzidas
por hipóxia (figura IV.12-B) indicam que, durante a deflagração da onda (instante de
tempo de cerca de 60s), há uma redução da transmitância de luz pelo tecido de forma
rápida. A onda de DA apresenta uma característica de propagação bem definida. A
transmitância de luz apresenta uma redução de intensidade, à frente de onda, seguida de
incremento mais suave. Essa dinâmica pode ser vista pela escala de cores na figura
IV.12-A e B (faixa de tempo compreendida entre 60s e 250s, para onda de DA
espontânea, e entre 60s e 200s, para DA induzida por hipóxia).
Figura IV.12 - Imagem VET e registro do potencial elétrico extracelular típico de DA. Em (A) é
apresentada uma imagem VET típica de DA espontânea. Em (B) uma imagem VET típica para
ondas induzidas por hipóxia. Para cada parte da figura, é apresentada a imagem VET (acima) e o
registro do potencial extracelular correspondente (abaixo). O eletrodo de registro do potencial
extracelular está posicionado na camada CG (posição indicada nas imagens VET pela letra ‘e’).
As regiões da CG são indicadas: Apex (A), Infrapiramidal (IP) e Suprapiramdial (SP). A barra
horizontal em (B), referente ao potencial elétrico, indica o período de hipóxia (40s).
59
IV.2.4 - Identificação de um novo grupo morfológico de burst
Durante o registro do potencial extracelular das AE’s e do estudo do IOS, foi
observado um determinado tipo de atividade, que já tinha sido registrada por
CARVALHO (2003) e identificada como burst do grupo B. Esse tipo de atividade foi
registrada em 2 experimentos, onde ocorreram 22 eventos. Durante o estudo do IOS
dessas atividades, percebeu-se que não se enquadravam em nenhum dos padrões de
imagens VET característicos dos grupos de bursts mostrados anteriormente. A imagem
VET desses eventos (figura IV.13-A) apresentou algumas características distintas das
demais analisadas para os grupos de bursts dos grupos B e C. Como pode ser
observado, o eletrodo foi posicionado sobre uma região que exibe oscilação da luz
transmitida ao longo do tempo. O registro do potencial elétrico extracelular, como visto
de forma comprimida, como na figura IV.13-B, sugeriu uma semelhança com bursts do
grupo B. Entretanto se visualizado numa escala de tempo menor (figura IV.13-C),
foram observadas oscilações repetidas que não correspondem a PS como em bursts dos
grupos B e C.
IV.2.5 - Ocorrência de AE’s nas regiões do GD
Através da imagem VET foi possível contabilizar o número de experimentos
onde se registrou AE’s nas regiões SP, IP ou A do GD. Os números mostram que as
regiões IP e A são aquelas com maior número de ocorrência de AE’s. De um total de 20
experimentos analisados, 16 (80% dos casos) apresentaram bursts nessas camadas. Em
apenas 6 foram registradas AE’s na região SP (tabela IV.3).
Contabilizando-se os números de AE’s registradas em cada uma das regiões do
GD, verifica-se , ainda, uma predominância em IP e A (tabela IV.4).
Tabela IV.3 : Número de experimentos com ocorrência de AE’s nas regiões do GD, de
um total de 20 experimentos.
Regiões do GD
Número de
experimentos com
ocorrência de AE’s
IP A SP
14 14 6
60
Tabela IV.4 : Número de eventos epileptiformes registrados nas regiões do GD
Regiões do GD
Número de eventos
epileptiformes
IP A SP
123 101 42
Figura IV.13 - Imagem VET e registro do potencial elétrico extracelular do novo tipo morfológico de
burst. Em (A) é apresentada a imagem VET (acima), o registro do potencial extracelular (meio) e
detalhes da região de ocorrência de PS de um dos eventos (abaixo). O eletrodo de registro do
potencial extracelular está posicionado na camada CG (posição indicada nas imagens VET pela
letra ‘e’). As regiões da CG são indicadas: Apex (A), Infrapiramidal (IP) e Suprapiramdial (SP).
61
V - RESULTADOS DA SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL
Neste item, são descritos os procedimentos utilizados para as simulações das
AE’s e ondas de DA, as quais serão utilizadas para auxiliar nas interpretações dos dados
experimentais. A estrutura da rede utilizada e o ajuste dos parâmetros do modelo,
conforme serão descritos, foram definidos a partir de uma série de simulações realizadas
com o objetivo de verificar sob que circunstâncias as características espaço temporais
das AE’s e ondas de DA medidas experimentalmente poderiam ser reproduzidas
computacionalmente. Não há um procedimento padrão para definição da estrutura e dos
ajustes, nem muito menos o procedimento é heurístico. As teorias e conjecturas que
propõem os prováveis mecanismos envolvidos nas atividades são previamente
levantados e orientam a série de simulações, até que se chegue a uma AE e onda de DA
simulada que corresponda às características espaço temporais observadas no IOS e no
potencial extracelular.
As simulações computacionais das AE’s foram feitas em uma rede
tridimensional contendo 625 unidades funcionais, cada uma delas composta de um
compartimento neuronal, um glial e um de espaço extracelular (figura V.1). Foram
consideradas as seguintes dimensões para a camada de corpos celulares do GD: 500µm
de comprimento (representando a região do A até parte da IP), 100µm de espessura e
100µm de largura. Nessa rede, o plano de compartimento em cinza escuro, na base, não
inclui neurônios e, para representar a solução de perfusão, têm suas concentrações
iônicas mantidas constantes. Para induzir as AE’s, a concentração de K
+
desse plano de
compartimentos foi aumentada de 4 para 8 mM. Sob 8 mM, somente os neurônios dos
planos 3 a 7 foram ajustados para apresentarem bursts. A fim de reproduzir as
características assimétricas da distribuição de excitabilidade neuronal ao longo da CG
de GD, como descrito por SCHARFMAN et al. (2002), para AE’s induzidas com os
modelos de pilocarpina e ácido cainico, e comprovadas no presente estudo, para o caso
das AE’s não-sinápticas (item IV.2.5), as permeabilidades máximas de K
+
desses planos
foram mantidas iguais a 36,0 cm/s e as dos outros planos foram aumentadas: planos 1,
2, 8 e 9 - P
K
max
= 68,0 cm/s; planos 10 e 11 - P
K
max
= 75,0 cm/s; planos 12 e 13 - P
K
max
=
80,0 cm/s; planos 25 - P
K
max
= 85,0 cm/s. Para reproduzir o efeito de acúmulo de K
+
extracelular, quando um grande grupo de neurônios entram em atividade
simultaneamente, para os planos 1-2 e 10-15, o parâmetro η
o
s
, que simula o número de
62
mols de substâncias impermeantes, foi reduzido de 9,31×10
-10
para 2,79 ×10
-10
mmol,
permitindo uma maior sensibilidade da variação do volume celular em relação às
variações de osmolaridade intra e extracelulares. Além disso, foram consideradas gap-
junctions somente entre os neurônios que apresentam bursts sob 8 mM de K
+
.
Figura V.1 – Estrutura do modelo usada na simulação de bursts epiletiformes. Os compartimentos
extracelulares representados por cinza reproduzem a solução de perfusão usada durante os
experimentos de AE’s. Os compartimentos em branco correspondem às unidades funcionais,
formadas por um par de corpos celulares neurônio-glia e um espaço extracelular circundante.
Para as ondas de DA e burst D, foram usadas 49 unidades funcionais (neurônio,
glia e espaço extracelular) dispostas em uma única direção (figura V.2). O modelo teve
que ser reduzido para uma dimensão devido ao grande esforço computacional exigido,
uma vez que era necessário representar uma região maior da CG do GD para observar a
dinâmica de propagação das ondas de DA. Para simular a solução de perfusão, os
compartimentos em cinza escuro, nas bordas, não incluem neurônios e têm suas
concentrações iônicas mantidas constantes. Como na simulação de AE’s, para induzir as
ondas de DA, a concentração de K
+
desses compartimentos de borda foi aumentada de 4
para 8 mM com o objetivo de aumentar a excitabilidade do tecido. A fim de reproduzir
as características assimétricas da distribuição de excitabilidade neuronal ao longo da CG
de GD, de forma análoga ao caso das simulações das AE’s, as permeabilidades
máximas de K
+
dos neurônios 3 a 9 foram mantidas iguais a 36,0 cm/s e as dos outros
neurônios foram aumentadas: neurônios 1, 2, 10 e 11 - P
K
max
= 68,0 cm/s; neurônios 12 e
63
1
2
3
4
5
6
7
8
10
9
13
12
14 15 24 25
...
13 - P
K
max
= 75,0 cm/s; neurônios 14 e 15 - P
K
max
= 80,0 cm/s; neurônios 16 a 49 - P
K
max
= 85,0 cm/s. Novamente para reproduzir o efeito de acúmulo de K
+
extracelular, quando
um grande grupo de neurônios entram em atividade simultaneamente, para os neurônios
1-2 e 10-15, o parâmetro η
o
s
, foi reduzido de 9,31×10
-10
para 2,79 ×10
-10
mmol, e foram
consideradas gap-junctions somente entre os compartimentos que apresentam bursts sob
8 mM de K
+
.
Figura V.2 – Estrutura do modelo usada na simulação de AE’s e DA. Os compartimentos extracelulares
representados por cinza-escuro reproduzem a solução de perfusão usada durante os
experimentos de AE’s. Os compartimentos em cinza-claro correspondem às unidades
funcionais, formadas por um par de corpos celulares neurônio-glia e um espaço extracelular
circundante.
Na figura V.3, é mostrado o IOS e o potencial extracelular durante um evento
epileptiforme espontâneo simulado. Durante o evento epileptiforme, observa-se um
aumento da transmitância de luz pelo tecido, simultânea à variação do potencial
extracelular, que é caracterizada por um deslocamento da linha de base do potencial
sobreposta por PS. Esse mesmo comportamento é observado experimentalmente.
O modelo também foi utilizado para simular um evento de AE induzido por
estimulação. Neste caso, a concentração extracelular do K
+
da rede também foi
aumentada de 4 para 8 mM, mas, antes da ocorrência do evento epileptiforme
espontâneo, aplicou-se um pulso de corrente de 6 nA/cm
2
, durante um intervalo de 20
segundos, no sexto neurônio localizado no centro da região mais excitável (neurônios 3
a 9). Uma vez induzido, o evento de AE propagou pela rede com uma velocidade de 23
mm/s. Durante o evento, observa-se novamente um aumento da transmitância de luz
pelo tecido, simultânea à variação do potencial extracelular (figura V.4).
64
...
1
2
3
4
47
48
49
Figura V.3 – IOS (acima) e potencial extracelular (abaixo) durante a simulação de um evento
epileptiforme espontâneo.
Comparando-se as duas simulações (figura V.5), confirma-se o que foi
observado experimentalmente. A simulação computacional de eventos epileptiformes
induzidos pelo aumento da concentração extracelular de K
+
, revelou que estes não
apresentam propriamente uma dinâmica de propagação. No início do evento, as regiões
do GD envolvidas na AE exibem um aumento simultâneo da transmitância de luz,
indicando que todo o sítio iniciou a AE de forma síncrona (figura V.5-A). Já no caso de
eventos epileptiformes induzidos pela estimulação elétrica, é evidente uma frente de
onda caracterizando uma dinâmica de propagação a partir do ponto de estimulação
(figura V.5-B)
A simulação de eventos do grupo D revela (figura V.6-A), como observado
experimentalmente, regiões de aumento e redução da transmitância de luz. Durante o
início do evento, é observada uma frente retilínea de aumento da transmitância de luz,
até que a redução progressiva de ATP (4 a 0,8 mM) faz corresponder a uma redução da
transmitância de luz. Observa-se que essas alterações no IOS simulado, da mesma
forma que nas imagens experimentais, se dão de forma lenta e sem característica de
frente de onda. Analisando os registros de concentrações iônicas intracelulares (figura
V.6-B), juntamente com os potenciais intra e extracelulares, observa-se que durante a
ocorrência dos PS, quando o nível DC é da ordem de 5 mV, é também quando ocorre o
aumento da transmitância de luz. Simultaneamente, os gradientes iônicos de Na
+
e de K
+
se mantêm em nível tal que sustentam a deflagração de potenciais de ação. Quando a
65
transmitância de luz diminui, observa-se uma redução desses gradientes, provocando a
supressão dos potenciais de ação e concomitante acúmulo de K
+
extracelular.
Figura V.4 – IOS (acima) e potencial extracelular (abaixo), durante a simulação de um evento
epileptiforme induzido por estimulação elétrica (pulso de corrente de 6 nA/cm
2
, durante um
intervalo de 20 segundos).
.
Figura V.5 – Detalhamento do início de evento epileptiforme. (A) IOS de um evento epileptiforme
espontâneo resultante do aumento da concentração extracelular de K
+
. (B) IOS de um evento
epileptiforme provocado pela aplicação de um pulso de corrente (6n A/cm
2
), no centro das escala
vertical.
66
(A)
(B)
Figura V.6 – (A) IOS (acima) e potencial extracelular (abaixo) resultantes de simulação de um evento
epileptiforme espontâneo, característico do grupo D. (B) Para a mesma simulação, são mostrados
os comportamentos do potencial transmembrânico (V), das concentrações intracelular neuronal e
extracelular de Na
+
e K
+
e dos seus respectivos potenciais de equilíbrio de Nernst.
O modelo também foi utilizado para simular ondas de DA dos tipos espontânea e
provocada por estimulação local. A onda de DA espontânea (figura V.7) foi simulada a
partir da redução da concentração de ATP de 4 para 0,1mM, progressiva e
67
simultaneamente, em todos os neurônios da rede. Uma vez deflagrada, a DA propagou
por toda a rede com uma velocidade de 0,53 mm/min. Através da simulação do IOS,
pôde ser observado, como já identificado experimentalmente, que eventos de DA
apresentam uma dinâmica de onda de propagação bem definida. Também pôde ser
observado, como é característico em experimentos, que durante a propagação da onda
de DA, tem-se uma redução da transmitância de luz no tecido e uma variação lenta e
negativa do potencial extracelular, com amplitude de aproximadamente 15 mV.
Figura V.7 – IOS (acima) e potencial extracelular (abaixo), durante a simulação de uma onda de DA
espontânea.
A onda de DA gerada por estimulação local foi simulada com a aplicação de um
pulso de K
+
, com 60 mM de amplitude, em um grupo de 3 compartimentos
extracelulares (correspondentes aos neurônios 5, 6 e 7), no centro da região mais
excitável da rede (neurônios 3 a 9). Como no caso da onda induzida pela redução de
ATP, uma vez deflagrada, a DA propagou por toda a rede com uma velocidade de 0,37
mm/min apresentando uma dinâmica de onda de propagação bem definida. Também
pôde ser observado o redução da transmitância de luz pelo tecido e uma variação lenta e
negativa do potencial extracelular, com amplitude de aproximadamente 15 mV (figura
V.8).
68
Figura V.8 – IOS (acima) e potencial extracelular (abaixo), durante a simulação de uma onda de DA
induzida pela aplicação de um pulso do K
+
de 60 mM.
69
VI - DISCUSSÕES
Trabalhos encontrados na literatura indicam que eventos de AE’s apresentam
uma dinâmica de propagação bem definida. Nestes trabalhos, é possível identificar a
região de começo das atividades induzidas, bem como a direção, o sentido e a extensão
de propagação (ALBOWITSZ e KUHNT, 1993; MEIERKORD et al., 1997, ALEFELD
et al., 1998; HOLTKAMP et al., 2002), além de fornecerem valores da velocidade de
propagação dos eventos epileptiformes ao longo do tecido cerebral. O trabalho de
HOLTKAMP et al., 2002), em especial, utilizou para o estudo a combinação de
métodos eletrofisiológicos e ópticos, com o IOS, permitindo uma melhor
caracterização da dinâmica espacial dos eventos. Todos esses estudos se referem
exclusivamente à indução de AE’s sinápticas, através de estimulação elétrica. Não há,
contudo, de acordo com nossas revisões, estudos sobre AE’s não-sinápticas
espontâneas.
No presente estudo, foram combinados os métodos eletrofisiológicos e ópticos,
analisados a partir de simulações computacionais, para caracterização de AE’s não-
sinápticas espontâneas ao longo de suas transições para DA. Durante o
desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados, inicialmente, eletrodos de registro do
potencial extracelular para a determinação da velocidade de propagação dos eventos.
Num segundo momento, utilizou-se a técnica de combinação de métodos
eletrofisiológicos com o estudo do IOS para se identificar a dinâmica espaço-temporal
de eventos epileptiformes. Em ambos os casos, as AE’s foram induzidas em fatias do
hipocampo de rato, com solução salina contendo zero-Ca
2+
e alto-K
+
.
Os resultados referentes ao uso de pares de eletrodos de registro do potencial
elétrico extracelular mostraram que os valores encontrados para a velocidade de
propagação dos eventos de AE’s não-sinápticas apresentam grande variabilidade.
Também pôde ser observado que a defasagem de tempo entre um grande número desses
eventos foi nula. Para a onda de DA, no entanto, os valores obtidos para a velocidade de
propagação estavam de acordo com os encontrados na literatura. Esses achados
puderam ser compreendidos a partir do estudo do registro simultâneo do potencial
elétrico e do IOS, interpretados a partir das simulações computacionais.
A análise conjunta das medidas de velocidades de propagação dos eventos com
as imagens do IOS mostram que dependendo da posição dos dois eletrodos, para um
70
mesmo evento, pode-se avaliar diferentes velocidades. Considerando uma representação
esquemática de um evento de AE mostrado num diagrama do tipo imagem VET, como
esquematizado na figura VI.1, é possível verificar que se os eletrodos envolvidos na
determinação da velocidade de propagação das AE’s forem os eletrodos 3 e 4, a
velocidade não poderá ser calculada, uma vez que a defasagem temporal entre os
registros será nula. Por outro lado, se para o mesmo evento, os eletrodos ocuparem as
posições 1 e 2 ou 2 e 3, nestes casos, a velocidade poderá ser calculada, mas, mesmo
assim, valores diferentes serão encontrados, já que as defasagens temporais medidas
serão distintas. Isso explica os diferentes valores medidos experimentalmente, pelo
método de dois eletrodos, os quais apresentaram baixa significância estatística no
entorno de um valor que fosse característico da velocidade de propagação da AE.
Figura VI.1 – Representação esquemática da evolução espaço-temporal da atividade neuronal para
a CG do GD. À região em cinza, com morfologia observada em imagens VET para eventos de
AE, deverá corresponder a um mesmo conjunto de pontos onde compreenderão eventos
epileptiformes característico do espaço extracelular. Assim, eletrodos nas posições 1, 2, 3 e 4
perceberão o início dessas atividades nos instantes projetados sobre o eixo Tempo. A diferença
entre esses instantes determina a defasagem entre os eventos medidos.
Verificando os relatos constantes na literatura, os quais comunicam que a
velocidade de propagação das AE’s medidas está na ordem de mm/s, como nos
trabalhos de ALBOWITSZ e KUHNT (1993), MEIERKORD et al. (1997), ALEFELD
71
et al. (1998) e HOLTKAMP et al. (2003), observa-se que os estudos foram realizados
para AE’s sinápticas, tendo-se medido velocidade de propagação de eventos induzidos
por estimulação local. As AE’s induzidas por estimulação local são deflagradas no
ponto de estimulação. Os efeitos locais produzidos pelo estímulo, tais como o aumento
da concentração extracelular de K
+
e a liberação de neurotransmissores, alteram as
regiões vizinhas ao ponto de estimulação, tornando-as excitáveis, fazendo com que o
efeito se propague como numa reação em cadeia. Esse tipo de mecanismo é confirmado
pelas simulações computacionais. As simulações das AE’s não-sinápticas, deflagradas
por estimulo local, demonstraram claramente uma frente de propagação das atividades,
podendo-se determinar a velocidade de propagação, estimada na mesma ordem de
grandeza (mm/s) das medidas experimentais. Já os eventos simulados de AE’s não-
sinápticas espontâneas confirmam as medidas experimentais feitas neste trabalho,
demonstrando que esses eventos apresentam uma frente de despolarização síncrona,
portanto sem uma frente de propagação, que se inicia de forma simultânea em uma área
do GD, normalmente mais próxima do Apex, se prolonga por umas dezenas de segundos
e reduz paulatinamente, em direção ao centro da área despolarizada. Esses eventos
ocorrem de forma repetitiva, se assemelhando a uma flutuação da excitabilidade
neuronal, a intervalos mais ou menos regulares, também na ordem de dezenas de
segundos. Assim, AE’s não-sinápticas não são caracterizadas por eventos com dinâmica
do tipo onda de propagação. Os eventos são atividades de sítios de neurônios
sincronizados por acoplamento mútuo, não podendo ser identificado um ponto
específico de origem da atividade. Sob o ponto de vista da teoria de sistemas
complexos, o sítio de neurônios entra em atividade de forma auto-organizada.
No caso da AE não-sináptica, a auto-organização se dá entre os corpos celulares
de neurônios, portanto, na camada CG. Isso pode ser comprovado pelo perfil do IOS,
que indica o máximo do sinal óptico centrado na camada CG. Essa constatação permitiu
concentrar a monitorização do IOS ao longo da camada CG, a partir da qual foram
construídas as imagens VET. Essas imagens foram uma ferramenta importante para a
caracterização espaço-temporal dos eventos de AE e DA.
As simulações levaram em conta que os fluxos iônicos emanavam
exclusivamente da camada CG. Assim, as variações iônicas se concentraram nas
vizinhanças dos corpos neuronais, onde foram calculadas as despolarizações e fluxos
iônicos. As simulações do IOS comparáveis aos registros experimentais, reforçam a
72
hipótese de que esse sinal deva ter como uma de suas principais componentes as
alterações dos índices de refração intra e extracelulares. No modelo computacional, são
as variações iônicas extracelulares, as quais modificam a distribuição espacial iônica,
que permitem calcular a componente DC do potencial extracelular. Isso permite
entender que às alterações do IOS devam corresponder à alterações da componente DC
do potencial extracelular. Esse fato foi mostrado com o levantamento das relações entre
as medidas do IOS com os correspondentes níveis da componente DC do potencial
extracelular. O estudo dessas relações, a partir das simulações, mostrou que para
despolarizações neuronais em que figuram gradientes iônicos há deflagração de
potenciais de ação, uma vez que os potenciais de Nernst de Na
+
e de K
+
são suficientes
para essas deflagrações. Entretanto, quando as despolarizações envolvem grandes
acumulações iônicas intra e extracelulares, reduzindo de forma dramática os gradientes
iônicos desses dois ions, com conseqüente redução dos respectivos potenciais de
Nernst, os potenciais de ação são suprimidos. Nos dois casos, as alterações da
distribuição iônica extracelular resultam na componente DC do potencial extracelular,
contudo, em níveis diferentes. No primeiro caso, esse nível está no entorno de 5mV e,
no segundo, no entorno de 11 mV, aos quais, portanto, se associam, respectivamente, à
aumento e redução da transmitância de luz. O aumento da transmitância, segundo as
simulações, se deve a um deslocamento da relação dos índices de refração extra e
intracelulares no sentido da máxima transmitância do tecido. Quando ocorre redução da
transmitância, o deslocamento da relação dos índices de refração é de tal ordem, em
razão das grandes variações iônicas intra e extracelulares, que o ponto de máxima
transmitância é ultrapassado até uma posição em que a transmitância é menor que a do
tecido em repouso.
As imagens a partir do IOS permitem distinguir bursts do grupo D de um evento
de DA, os quais, na maioria dos registros podem ser confundidos se vistos através dos
registros do potencial extracelular. A diferença básica desses dois eventos está
justamente no comportamento espacial. Bursts do grupo D demonstram redução da
transmitância simultâneo à componente DC de maior amplitude, tal qual a DA, porém
com um comportamento espacial diferente. Enquanto na DA as regiões de transmitância
configuram uma clara frente de propagação que se alastra para as regiões vizinhas, com
uma velocidade definida, nos bursts D observa-se apenas redução local de transmitância
de luz. Vistos a partir das simulações, os bursts D apresentam um acúmulo de K
+
73
extracelular associado à transmitância de luz, o qual, diferentemente de um evento de
DA, não é suficiente para provocar despolarizações de neurônios vizinhos capazes de
gerar uma frente de onda de propagação. Com essa interpretação, os bursts D podem ser
vistos como depressões locais de atividade elétrica neuronal, ou aproveitando a
terminologia da DA, “depressões não alastrantes” da atividade elétrica neuronal.
74
VII - CONCLUSÃO
A utilização de métodos eletrofisiológicos em conjunto com o estudo do IOS
permitiu identificar que a CG do GD, sob condições de zero-Ca
2+
e alto-K
+
,
é a camada
que concentra a maior variação do IOS, durante a ocorrência de AE não-sináptica.
Também foi possível associar variações da luz transmitida pelo tecido com a amplitude
da componente DC do potencial elétrico extracelular. Os resultados revelaram que DC’s
com valor de cerca de 5 mV estão associados a aumento da transmitância de luz.
Enquanto que, para valores de 11 mV, é observada uma redução da transmitância. O
estudo do IOS permitiu distinguir eventos do grupo D de eventos de DA, o que não era
possível exclusivamente pelo potencial elétrico extracelular. As imagens VET típicas
das ondas de DA demonstram um redução da transmitância de luz de forma rápida e
com a característica de uma frente de onda. As imagens VET de eventos do grupo D
revelam inicialmente um aumento e, posteriormente, um redução da transmitância de
luz. O início do evento, que coincide com o aumento da transmitância, é observado,
como no caso de bursts dos grupos B e C, simultaneamente numa larga faixa do GD,
indicando que o surgimento de eventos de AE’s não-sináptica se dá de forma auto-
organizada, sem a definição de um ponto específico a partir do qual o evento se inicia.
A redução da transmitância, no entanto, ocorre de forma lenta surgindo em pontos
distintos do GD, sem a característica de uma frente de onda, indicando uma região onde
as distribuições das concentrações iônicas extracelulares se alteram. Adicionalmente, os
resultados também indicam que a região IP é a de maior excitabilidade do GD, durante
a indução de AE não-sináptica.
75
Propostas para continuação do trabalho:
• Investigação da dependência dos mecanismos subcelulares neuronais sobre o
processo de recrutamento espacial de neurônios durante as AE’s não-sinápticas;
• Estudo da influência etária sobre a distribuição da excitabilidade neuronal, ao longo
do GD, envolvendo exclusivamente conexões não-sinápticas.
76
VIII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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