( PDF ) Estudo visando a síntese enantiosseletiva da dictiolomida e da 6-metoxidictiolomida. Síntese e avaliação biológica de derivados uinolinônicos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

“ESTUDO VISANDO A SÍNTESE ENANTIOSSELETIVA DA DICTIOLOMIDA E DA

6-METOXIDICTIOLOMIDA. SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE DERIVADOS

QUINOLINÔNICOS”

Patrícia Tambarussi Baraldi*

Tese apresentada como parte dos requisitos

para obtenção do título de DOUTOR EM

CIÊNCIAS, área de concentração: QUÍMICA

ORGÂNICA.

Orientadora: Profa. Dra. Arlene G. Corrêa

* bolsista FAPESP

São Carlos – SP

2006

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Todas as grandes coisas do mundo começam nas pequenas (...) Uma jornada

de mil milhas começa com o pedaço de chão debaixo de pé.

Lao-tsé

Dedico este trabalho a todos que juntamente comigo o construíram

independentemente da participação intelectual, física ou psicológica.

Agradecimentos

À Profa. Arlene G. Corrêa pela orientação e “discussões”.

À Fapesp pela concessão da bolsa.

Ao Departamento de Química pela infra-estrutura, corpo docente e em

especial ao corpo técnico e secretárias.

Aos professores Andreimar M. Soares, Otavio Thiemann, Izabel Ferreira,

Adriano D. Andricopulo, e Blas Lotina-Hennsen, e aos alunos Thiago A. M Veiga

Matheus Pereira Postigo e Fernanda por realizarem os ensaios biológicos.

Ao assessor da Fapesp pelas contribuições e sugestões feitas no decorrer do

projeto.

Ao Prof. “Psicólogo” Paulo César Vieira por toda a ajuda que me deu durante

esse processo.

Aos meus pais e a “pequena” família por terem ajudado a me tornar o que sou

hoje e pela paciência e entendimento nos momentos de ausência.

Às famílias Fortuna e Manginelli pelos anos de convívio, carinho e amizade.

Ao Thiago Veiga por fazer os gráficos, agüentar uma sintética, mas o mais

importante pela paciência nestes anos de namoro.

Aos amigos que fiz no LSPN: a Nádia e a turma do “J”, Jardel, Joel, Junia, e

ao Valdir por perderem horas de trabalho para enviar referências, fazer RMN e IV,

ouvir as lamentações da PT, e pelas coisas boas também, enfim....

Aos ex-alunos e atuais do LSPN, em especial a Patrícia Duarte.

As minhas amigas de longa data Nilce Cristina e Liziane Mangili que sempre

têm uma palavra de consolo, um ombro amigo, um colo, um abraço.

Aos outros amigos que fiz durante essa “passagem” Cristina Daólio,

Sebastião Silva, Marcelo Dezena, Fernando Moraes e Varlete (ops... é prima).

A todos os ex-alunos e atuais alunos dos laboratórios de LSPN, RMN,

Inorgânica e PN.

Aos meus novos “colaboradores” Márcia, Fabiana e Gustavo.

Enfim a todos que participaram e dividiram “algum” momento durante mais

esta etapa da minha vida.

Lista de Abreviaturas

abund. – abundância

CG – cromatografia gasosa

CG/EM – cromatografia gasosa acoplado ao espectrômetro de massas

DCC – diciclohexilcarboiimida

DCM – diclorometano

DMA – dimetil acetamida

DMAP – 4-dimetilaminopiridina

DMAD – acetilenodicarboxilato de dimetila

DMF – Dimetilformamida

DMSO - Dimetilssulfóxido

DFE – Difenil éter

E.M. – espectro de massa

Et – grupo etila

O – éter etílico

EtOAc – Acetato de etila

HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência

IV – infra-vermelho

J – constante de acoplamento

PhH – Tolueno

PLA

s – fosfolipases A

PMB – p-metoxibenzil

PMB-Br – brometo de p-metoxibenzila

PMS – Metosulfato de fenazina (phenazine methosulfate)

PPh

– trifenil fosfina

Ts – grupo tosila

m/z – relação massa carga

RMN

C – ressonância magnética nuclear de carbono 13

RMN

H – ressonância magnética nuclear de hidrogênio

TBAB – brometo de tetrabultilamônio

TEBA – cloreto de benziltrietilamônio

THF – tetraidrofurano

TMF – orto-formato de trimetila

deslocamento químico

[α]

– desvio da rotação específica

Lista de Esquemas

Esquema 1.1: GDP-manose pirofosforilase (GDP-MP) catalisa a reação.

..................................................................................................................................28

Esquema 1.2: Preparação de quinolinonas empregando o procedimento

de Leimbruber-Batcho. ..............................................................................................37

Esquema 1.3: Preparação de 2-aril-3,5,7-trimetoxi-4-quinolinona............38

Esquema 1.4: Preparação da quinolinona natural 28...............................38

Esquema 1.5: Síntese em fase sólida ......................................................39

Esquema 1.6: Síntese da leiokinina B (38)...............................................40

Esquema 1.7: Síntese de quinolina-carboxiguanidinas ............................40

Esquema 1.8: Análise biossintética ..........................................................41

Esquema 1.9: Rota biomimétrica para preparação de 16.........................41

Esquema 3.1: Rota Sintética para obtenção das dictiolomidas 16 e 18. ..46

Esquema 3.2: Obtenção do hidroxi-éster 57. ...........................................46

Esquema 3.3: hidroxi ésteres obtidos através da redução com fermento

de pão. ......................................................................................................................47

Esquema 3.4: Preparação do ceto-éster (58a).........................................47

Esquema 3.5: Redução do cetoéster com fermento de pão. .................48

Esquema 3.6: Preparação do ácido 2-hidroxi-1,5-pentanodióico (62)......49

Esquema 3.7: Preparação do 2-hidroxi-1,5-pentanodioato de dimetila (57).

..................................................................................................................................50

Esquema 3.8: Preparação do (4S)- e (4R)-4,5-diidroxipentanoato de

metila (63)..................................................................................................................51

Esquema 3.9: Preparação do (4S)- e (4R)- [2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il]

propanoato de metila (64)..........................................................................................52

Esquema 3.10: Preparação (4R)- e (4S)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il]

butan-2-ona (52)........................................................................................................52

Esquema 3.11: Estrutura da cetona 66 ....................................................54

Esquema 3.12: Preparação do composto 65............................................54

Esquema 3.13: Preparação do composto 67............................................54

Esquema 3.14: Preparação de 60. ...........................................................55

Esquema 3.15: Preparação de 69. ...........................................................56

Esquema 3.16: Preparação de 66. ...........................................................56

Esquema 3.17: Preparação de 66. ...........................................................57

Esquema 3.18: Mecanismo de formação do sulfóxido 70. .......................58

Esquema 3.19: Preparação do cloreto de ácido 71 e 72..........................59

Esquema 3.20: Preparação das amidas 73 e 74......................................60

Esquema 3.21: Preparação das aminas 75 e 76......................................61

Esquema 3.22: Preparação das iminas 53 e 54. ......................................65

Esquema 3.23: Preparação das iminas 77 e 78. ......................................66

Esquema 3.24: Preparação da imina 79 e 80...........................................69

Esquema 3.25: Preparação de 83 e 84. ...................................................69

Esquema 3.26: Preparação de 81 e 82. ...................................................70

Esquema 3.27: Preparação de 79 e 80. ...................................................70

Esquema 3.28: Preparação das quinolinonas 85 e 86. ............................72

Esquema 3.48: Obtenção de 130 e 131 ...................................................74

Esquema 3.50: Obtenção de 136 .............................................................74

ESQUEMA 3.51: Obtenção de 137..............................................................75

Esquema 3.52: Obtenção de 138 .............................................................75

Esquema 3.53: Obtenção de 139 .............................................................76

Esquema 3.54: Obtenção de 127 .............................................................76

Esquema 3.55: Metodologia empregada para a obtenção dos derivados

O-alquil quinolínicos. .................................................................................................78

Lista de Figuras

Figura 1.1 : Estruturas da quinina (1) e cloroquina (2)..............................22

Figura 1.2: Fármacos empregados no tratamento da leishmaniose.........24

Figura 1.3: Fármacos empregados no tratamento da leishmaniose.........25

Figura 1.4: Sitamaquina (8) e paromomicina (9).......................................26

Figura 1.5: Via de recuperação e interconverção, em células de

mamíferos. APRT- adenina-fosforribosil-transferase; HGPRT- hipoxantina-guanina-

fosforribosil-transferase; PRPP- 5'-fosforribosil-1-pirofosfato; ATP- adenosina

trifosfato; ADP- adenosina difosfato; AMP- adenosina monofosfato; PRPP- 5-

fosforribosil pirofosfato; IMP- inosina monofosfato; XMP- xantosina monofosfato;

GMP- guanosina monofosfato; GDP- guanosina difosfato; GTP- guanosina trifosfato.

..................................................................................................................................30

Figura 1.6: Via de recuperação e interconverção, em células de

Kinetoplastida. APRT- adenina-fosforribosil-transferase; HGPRT- hipoxantina-

guanina-fosforribosil-transferase; PRPP- 5'-fosforribosil-1-pirofosfato. XPRT- xantina

fosforribosil-transferase; HGPRT Hipoxantina Guanina fosforribosil transferase; AAH-

adenina deaminase; AMP- adenosina monofosfato; ATP- adenosina tri fosfato; ADP-

adenosina difosfato; AMP- adenosina monofosfato;, PRPP- 5-fosforribosil

pirofosfato; IMP- inosina monofosfato; XMP- xantosina monofosfato; GMP-

guanosina monofosfato; GDP- guanosina difosfato; GTP- guanosina trifosfato........31

Figura 1.7: Diagrama do monômero da enzima APRT ligada a AMP e

fosfato........................................................................................................................32

Figura 1.8: Estrutura da camptotecina (13) ..............................................33

Figura 1.9: Estrutura do ácido nalidíxico..................................................33

Figura 1.10: Fluoroquinolinonas ensaiadas frente aos parasitas das

doenças tropicais.......................................................................................................34

Figura 1.11: Dictiolomidas A (16), B (17) e 18..........................................35

Figura 1.12: Oblonginina (19) e shimonomenina (20)...............................36

Figura 1.13: conformação pseudo-cadeira da dictiolomida 16. ................37

Figura 2.1: Dictiolomidas 16 e 18 .............................................................43

Figura 3.1: Possível mecanismo da retenção de configuração. ...............50

Figura 3.2: Mecanismo da redução utilizando NaBH

como catalisador. .51

Figura 3.3: Espectro de massas do composto 69.....................................56

Figura 3.4: A) sobreposição dos cromatogramas da cetona 66 e do éster

69; B) espectro de massas da cetona 66. .................................................................57

Figura 3.5: Mecanismo de redução por metais.........................................59

Figura 3.6: Análise do composto 75: A) Ampliação do Espectro de RMN

H à 298K, B) Ampliação do Espectro de RMN

H à 303K, C) Ampliação do Espectro

de RMN

H à 313K. ...................................................................................................62

Figura 3.7: Análise do composto 76: A) Ampliação do Espectro de RMN

H à 298K, B) Ampliação do Espectro de RMN

H à 303K, C) Ampliação do Espectro

de RMN

H à 313K. ...................................................................................................64

Figura 3.8: Massa molecular dos reagentes 76, 66 e imina 78.................67

Figura 3.9: Espectro de massas da reação de formação da imina 78......68

Figura 3.10: Espectro de massas da reação da imina 80.........................71

Figura 3.11: Massa molecular de 82, 66 e 80...........................................71

Figura 3.12: Espectro de massas dos íons filhos do composto 85...........73

Figura 3.15: Quinolinonas 140 e 141........................................................78

Figura 3.16: Derivados quinolínicos sintetizados......................................79

Figura 3.17: Compostos ensaiados frente à L. amazonensis 140 e 142 e

L. brasiliensis 92 e 141..............................................................................................84

Figura 3.18: Atividade leishmanicida ........................................................85

Figura 3.25: Compostos ensaiados frente à atividade fitotóxica...............89

Figura 3.26: Inibição da síntese de ATP em cloroplastos isolados das

folhas de espinafre durante a fase luminosa da fotossíntese dos compostos 94-2, 91-

95. .............................................................................................................................90

Figura 3.27: Inibição da síntese de ATP em cloroplastos isolados das

folhas de espinafre durante a fase luminosa da fotossíntese dos compostos 94-1, 92-

2, 141 e 142...............................................................................................................90

Lista de Tabela

Tabela 3.1: Condições experimentais para a redução microbiológica......48

Tabela 3.2: Resultados obtidos na adição de MeLi a 64. .........................53

Tabela 3.3: Condições experimentais para a preparação das iminas 53 e

54. .............................................................................................................................65

Tabela 3.4: Condições reacionais para preparação das iminas 77 e 78 a

partir da cetona 66.....................................................................................................66

Tabela 3.5: Preparação das iminas 77 e 78 a partir da metodologia de

Keller (2003)..............................................................................................................67

Tabela 3.10: Dados espectroscópicos dos compostos 91-1, 91-2, 92-1,

92-2, 94-1 e 94-2.......................................................................................................80

Tabela 3.11: Porcentagem de inibição frente a formas promastigotas de L.

major com 48h de incubação.....................................................................................82

Tabela 3.12: Porcentagem de inibição frente a formas promastigotas de L.

major com 72h de incubação.....................................................................................83

Tabela 3.13: Valores de inibição frente à PNP .........................................86

Tabela 5.1: Dados experimentais da preparação dos derivados quinolinas

................................................................................................................................118

Resumo

ESTUDO VISANDO A SÍNTESE ENANTIOSSELETIVA DA DICTIOLOMIDA E DA 6-

METOXIDICTIOLOMIDA. SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE DERIVADOS

QUINOLINÔNICOS

A dictiolomida A (13) e a 6-metoxidictiolomida (15) foram isoladas de plantas

do gênero Dictyoloma, no entanto suas estruturas não foram completamente

elucidadas devido a presença de um centro estereogênico em C3’. Estes compostos

apresentaram uma interessante atividade biológica frente a diferentes formas de

Leishmania sp, protozoário causador da leishmaniose. Neste trabalho é descrito o

estudo visando à síntese enantiosseletiva de 13 e 15 a fim de confirmar a

estereoquímica e a atividade biológica dos mesmos. As metodologias sintéticas

testadas foram baseadas em trabalhos descritos na literatura por NAKATSU et al.

(1990) e EDMONT et al. (2000). Paralelamente a este estudo, prepararou-se uma

pequena coleção de derivados quinolinas. Esta coleção e os intermediários

sintéticos obtidos foram avaliados frente a diferentes formas de Leishmania e

também com a enzima APRT de L. tarentolae, a fim de se determinar a atividade

leishmanicida deste tipo de sistema quinolinona. Além disso, uma ampla avaliação

biológica foi feita com estes compostos empregando outros ensaios tais como,

atividade frente a veneno de cobra e a enzima PNP de Schistosoma mansoni, e

atividade fitotóxica, a fim de obter informações para contribuir com estudos de

relação estrutura-atividade.

Abstract

TOWARDS OF ENANTIOSELECTIVE SYNTHESIS OF DICTYOLOMIDE A AND 6-

METHOXIDICTYOLOMIDE. SYNTHESIS AND BIOLOGICAL EVALUATION OF QUINOLINONICS

DERIVATIVES

Dictyolomide A (13) and 6-methoxydictyolomide (15) were isolated from plants of the

Dictyoloma genus, therefore their structures were not yet completely elucidated due

to the C-3’ stereocenter. These compounds showed an interesting biological activity

against different forms of Leishmania sp., protozoa responsible for leishmaniose. In

this work is described the study towards the enantioselective synthesis of 13 e 15 in

order to confirm their stereochemistry and biological activity. The employed

methodologies were based on literature described by NAKATSU et al. (1990) and

EDMONT et al. (2000). In parallel, a small library of quinoline derivatives was

prepared. This library and synthetic intermediates were evaluated against different

forms of Leishmania and APTR enzyme from L. tarentolae, to confirm the

leishmanicidal activity of the quinolinone systems. Furthermore, a wide biological

evaluation was performed with these compounds employing bioassays to measure

activity against snake venoms, PNP enzyme from Schistosoma mansoni, and

phytotoxic activity to obtain information for studies of structure activity relationship.

Sumário

INTRODUÇÃO..........................................................................................21

1. Introdução.........................................................................................22

1.1. A Importância dos produtos naturais............................................22

1.2. Leishmaniose...............................................................................23

1.3. Alvos macromoleculares na descoberta de novos fármacos .......27

1.3.1. GDP-Manose pirofosforilase..................................................28

1.3.2. Glucose-6-fosfato isomerase .................................................28

1.3.3. Adenina-hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase ............29

1.4. Alcalóides e atividade biológica ...................................................32

1.4.1. Dictiolomidas A e B................................................................34

1.5. Metodologias sintéticas para a obtenção de 4-quinolinonas........37

1.6. Rota Biossintética ........................................................................41

2. Objetivos...........................................................................................43

RESULTADOS E DISCUSSÕES..............................................................44

3. Resultados........................................................................................45

Estudos de metodologias sintéticas visando à obtenção das

Dictiolomidas 16 e 18.............................................................................................45

3.1. Estudo da Metodologia Sintética 1...............................................45

3.1.1. Preparação da (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodioato de

dimetila (57) através de redução microbiológica com o emprego de fermento de

pão, S. cerevisiae...............................................................................................46

3.1.2. Preparação do ácido (2S)- ou (2R)-hidroxi-1,5-pentanodióico

(62). 49

3.1.3. Preparação do (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodioato de

dimetila (57). 50

3.1.4. Preparação do (4S)- e (4R)-4,5-diidroxipentanoato de metila

(63). 51

3.1.5. Preparação do (4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il]

propanoato de metila (64). .................................................................................52

3.1.6. Preparação da (4R)- e (4S)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il]

butan-2-ona (52). 52

3.1.7. Preparação do (2S)-2-t-butildimetilsililoxi-pentanodioato de

dimetila (65). 53

Esquema 3.12: Preparação do composto 65.....................................54

3.1.8. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-hidroxipentanoato

de metila (67). 54

3.1.9. Preparação do (4S)-4-hidroxi-5-metoximetoxi-pentanoato de

metila (68). 55

3.1.10. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-metoximetoxi-

pentanoato de metila (69)...................................................................................56

3.1.11. Preparação do (5S)-5-(t-butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi-2-

hexanona (66). 56

3.1.12. Preparação do (5S)-5-(t-butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi-2-

hexanona (66) empregando o intermediário sulfóxido. ......................................57

3.1.13. Preparação do cloreto de 2-nitrobenzoíla (71) e cloreto de 5-

metoxi-2-nitrobenzoíla (72).................................................................................59

3.1.14. Preparação da N,N–dietil-2-nitrobenzamida (73) e N,N–

dietil-5-metoxi-2-nitrobenzamida (74).................................................................60

3.1.15. Preparação da 2-amino-N,N-dietilbenzamida (75) e 2-amino-

N,N– dietil-5-metoxibenzamida (76). ..................................................................61

3.1.16. Estudo para a obtenção de (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-dioxalan-

4-il)-butan-2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (53), (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-

dioxalan-4-il)-butan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxibenzamida (54) ................64

3.1.17. Estudo para a obtenção de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-

metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (77), (E)-2-(5-(t-

butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxi

benzamida (78). 66

3.1.18. Preparação do 2-nitrobenzoato de metila (83) e 2-nitro-5-

metoxibenzoato de metila (84). ..........................................................................69

3.1.19. Preparação de 2-aminobenzoato de metila (81) 2-amino-5-

metoxibenzoato de metila (82). ..........................................................................70

3.1.20. Preparação de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-

(metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino) benzoato de metila (79) e (E)-2-(5-(t-

butildimetilsililoxi)-6-(metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-5-metoxibenzoato de

metila (80). 70

3.1.21. Preparação dos compostos, 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-4-quinolinona (85) e 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-6-metoxi-4-quinolinona (86). ...............................................72

3.2. Modificação da estratégia de acoplamento para a obtenção dos

alcalóides. 74

3.2.1. Preparação do cis-1-bromo-3-hexeno 136............................74

3.2.2. Preparação do (4S)-4-(metoxibenziloximetil)-2,2-dimetil-1,3-

dioxolano (137) 75

3.2.3. Preparação do (2R)-3-(4-metoxibenziloxi)-propano-1,2-diol

(138) 75

3.2.4. Preparação do 1-t-butildimetilsililoxi-3-(4-metoxibenziloxi)-

propan-2-ol (139) 75

3.2.5. Preparação do (1R)-2-t-butildimetilsililoxi-1-(4-

metoxibenziloximetil)-etil metanossulfonato (127)..............................................76

3.3. Preparação dos Derivados O-Alquil Quinolínicos ........................78

3.4. Estudo da atividade leishmanicida ...............................................81

3.5. Estudos frente à enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) de

Schistosoma mansoni............................................................................................85

3.6. Atividade fitotóxica .......................................................................87

4. Conclusões e Perspectivas ..............................................................92

5. Procedimento Experimental..............................................................94

5.1. Aspectos Gerais...........................................................................94

5.2. Parte Experimental.......................................................................96

5.2.1. Preparação do 2-oxopentanoato de dimetila 58a ..................96

5.2.2. Preparação do (2R)- e (2S)-hidroxi-1,5-pentanodioato de

dimetila (57) 96

5.2.3. Preparação do ácido (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodióico

(62). 96

5.2.4. Preparação do (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodioato de

dimetila (57). 97

5.2.5. Preparação do (4S)- e (4R)-4,5-diidroxipentanoato de metila

(63). 97

5.2.6. Preparação do (4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il]

propanoato de metila (64). .................................................................................98

5.2.7. Preparação do (4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il]-

butan-2-ona (52). 98

5.2.8. Preparação do (2S)-2-t-butildimetilsililoxi-pentanodioato de

dimetila (65). 99

5.2.9. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-

hidroxipentanoato de metila (67). .....................................................................100

5.2.10. Preparação do (4S)-4-hidroxi-5-metoximetoxi-pentanoato de

metila (68). 100

5.2.11. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-metoximetoxi-

pentanoato de metila (69).................................................................................101

5.2.12. Preparação do (5S)-5-(t-butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi-2-

hexanona (66). 102

5.2.13. Preparação do cloreto de 2-nitrobenzoíla (71)...................103

5.2.14. Preparação do cloreto de 5-metoxi-2-nitrobenzoíla (72) ....103

5.2.15. Preparação da N,N–dietil-2-nitrobenzamida (73)...............103

5.2.16. Preparação da N,N– dietil-5-metoxi-2-nitrobenzamida (74)

104

5.2.17. Preparação da 2-amino-N,N–dietilbenzamida (75) ............104

5.2.18. Preparação da 2-amino-N,N-dietil-5-metoxibenzamida (76)

105

5.2.19. Preparação a Obtenção de (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-dioxalan-

4-il)-butan-2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (53), (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-

dioxalan-4-il)-butan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxibenzamida (54) ..............106

5.2.20. Estudo para a obtenção de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-

metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (77), (E)-2-(5-(t-

butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxi

benzamida (78). 107

Procedimento 1 ...............................................................................107

5.2.21. Preparação de 2-nitrobenzoato de metila (83)...................108

5.2.22. Preparação de 2-nitro-5-metoxibenzoato de metila (84). ...108

5.2.23. Preparação de 2-aminobenzoato de metila (81). ...............109

5.2.24. Preparação de 2-amino-5-metoxibenzoato de metila (82). 109

5.2.25. Preparação de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-

(metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-5-metoxibenzoato de metila (80)..............109

5.2.26. Preparação dos compostos, 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-4-quinolinona (85) e 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-6-metoxi-4-quinolinona (86). .............................................110

5.2.27. Preparação da 2-anilina-2-butenodioato de dimetila (89) e 2-

(4-metoxianilina)-2-butenodioato de dimetila (90). ...........................................110

5.2.28. Preparação do 4-oxo-1,4-diidro-2-quinolina carboxilato de

metila (91) e 6-metoxi-4-oxo-1,4-diidro-2-quinolina carboxilato de metila (92).111

5.2.29. Preparação do 2-(S)-[2-(2-oxiranil)etil]-4-quinolinona (98).112

5.2.30. Preparação (4-oxo-1,4-diidro-2-quinolinil)-

metilmetanossulfonato (106) ............................................................................113

5.2.31. Preparação do 4-(4-metoxibenziloxi)-2-((4-

metoxibenziloxi)metil)quinolina (119) e 1-(4-metoxibenzil)-2-((4-

metoxibenziloxi)metil)-4-quinolinona (120).......................................................113

Tentativa 1:......................................................................................113

5.2.32. Preparação do ácido 4-metoxibenzil fosfórico 123.............114

5.2.33. Preparação do cis 1-bromo-3-hexeno (136).......................114

5.2.34. Preparação do (4S)-4-(metoxi benziloximetil)-2,2-dimetil-1,3-

dioxolano (137) 115

5.2.35. Preparação do (2R)-3-(4-metoxibenziloxi)-propano-1,2-diol

(138) 115

5.2.36. Preparação do 1- t-butildimetilsililoxi-3-(4-metoxibenziloxi)-

propan-2-ol (139) 116

5.2.37. Preparação do (1R)-2-t-butildimetilsililoxi-1-(4-

metoxibenziloximetil)-etil metanossulfonato (127)............................................116

5.2.38. Preparação do 4-metoxi-2-quinolina carboxilato de metila

(91-1). 117

5.2.39. Preparação do 4-etoxi-2-quinolina carboxilato de metila (91-

2) 117

5.2.40. Preparação do 4,6-dimetoxi-2-quinolina carboxilato de metila

(92-1) 117

5.2.41. Preparação do 4-etoxi-6-metoxi-2-quinolina carboxilato de

metila (92-2) 118

5.2.42. Preparação do 4-etoxi-2-etoximetil-6-metoxiquinolina (142)

118

5.2.43. Ensaios Atividade Antileishmanicida..................................119

5.2.44. Ensaios Leihsmania...........................................................120

5.2.45. APRT .................................................................................120

Procedimento segundo AMBROZIN et al., 2005.................................120

5.2.46. Cultura e Manutenção da Leishmania................................120

Formas promastigotas de L. braziliensis e L. amazonensis,

MHOM/BR1987/M11272 e MHOM/BR/1977/LTB0016 foram cultivadas em meio

Schneider’s (Meio de cultura de células sigma, St. Louis, MO, USA),

suplementado com soro bovino fetal (FCS) 10%(v/v), temperatura de 25°

°°

°C e pH

7.2. ...................................................................................................................120

5.2.47. Enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) de

Schistosoma mansoni ......................................................................................120

5.2.48. Avaliação da fitotoxicidade sobre a síntese de ATP durante a

fase luminosa da fotossíntese..........................................................................121

6. Anexos

INTRODUÇÃO

1. Introdução

1.1. A Importância dos produtos naturais

A busca por medicamentos para diversas enfermidades tem sido descrita

desde as civilizações antigas. Uma fonte amplamente explorada são as plantas e o

seu uso terapêutico tem sido utilizado até os dias atuais (CLARDY & WALSH, 2004 e

NEWMAN et al., 2003).

Apesar disto, somente a partir do século XIX houve um interesse em

determinar quais eram os compostos ativos das plantas medicinais. O marco desta

busca foi a descoberta da quinina (1) (Figura 1.1), um alcalóide obtido de cascas de

Cinchona, uma planta encontrada na Bolívia, que na medicina popular era utilizada

no tratamento de malária e cuja atividade foi atribuída a esse composto (PHILLIPSON,

2001).

Tal como a quinina, alguns produtos naturais bioativos possuem estruturas

complexas, incluindo vários centros estereogênicos, deste modo simplificações

estruturais podem ser feitas. Por exemplo, baseando-se na quinina (1) chegou-se à

cloroquina (nivaquina) (2), que até hoje é um medicamento utilizado para prevenção

da malária em regiões de baixo risco (SILVA et al., 2005 e SILVA, 1998).

MeO

NCl

H N

FIGURA 1.1 : Estruturas da quinina (1) e cloroquina (2)

As doenças tropicais tais como a malária, a leishmaniose e a tripanossomíase

(doença de Chagas) são causadas por infecções de protozoários sendo encontradas

em países sub-tropicais ou tropicais, daí seu nome, causando o sofrimento de

centenas de milhões de pessoas. No entanto os medicamentos disponíveis para o

tratamento destas doenças são extremamente limitados (COST, 2002). Os fármacos

disponíveis estão sendo utilizados desde o início do século passado e sua

administração deve ser feita por pessoas autorizadas, além disso, muitos parasitas

desenvolveram vários graus de resistência agravando o problema da saúde pública,

e limitando os tratamentos.

A busca por novos tratamentos para essas doenças continua sendo realizada

embora o sucesso não seja tão promissor uma vez que, segundo PECOUL et al.

(1999),

de 1233 novos fármacos identificados para chegar ao mercado entre 1975 e

1997, somente 13 foram aprovados para doenças tropicais. O que tem sido algumas

vezes usado são entidades químicas adicionais ou combinações de fármacos. Além

disso, há dificuldade ao acesso desses fármacos em países pobres.

1.2. Leishmaniose

A leishmaniose é encontrada em 22 países no Novo Mundo e em 66 nações

do Velho Mundo, sendo 16 na Europa, incluindo França, Itália, Grécia, Malta,

Espanha e Portugal. A leishmaniose presente em humanos possui duas formas com

ampla faixa de manifestações clínicas. As formas cutâneas de leishmaniose são as

mais comuns, e as lesões são localizadas na pele como úlceras levando a traumas

permanentes. A infecção mais ampla do parasita causa outra forma da doença, a

leishmaniose visceral que é caracterizada por turnos irregulares de febre, perda de

peso significativa, inchaço do baço, fígado e anemia, sendo a forma mais severa da

doença que, sem tratamento, tem uma taxa de mortalidade de quase 100%

(www.who.org).

A leishmaniose é transmitida por um artrópode hematófago, uma pequena

mosca, conhecida como mosquito palha. Dois diferentes gêneros transmitem a

Leishmania: Plebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo).

Os agentes etiológicos da leishmaniose são protozoários do gênero

Leishmania, que chegam a mais de 20 espécies e sub-espécies, sendo que as

encontradas no Brasil são: L. amazonensis, L. guyanensis, L. braziliensis e L.

chagasi (www.tulane.edu).

A Leishmania também é encontrada com diferenças morfológicas: nos insetos

vetores encontram-se as formas promastigotas e no hospedeiro vertebrado as

amastigotas. As formas promastigotas são fagocitadas pelos macrófagos e

normalmente um patógeno seria destruído na associação fago-lisossoma. No

entanto, a Leishmania é resistente a pH ácido e enzimas hidrolíticas presentes no

fagolisossoma, deste modo à forma promastigota, no interior do fagolisossoma,

converte-se em uma forma amastigota perdendo o flagelo e tornando-se mais

esférico.

Estas formas se replicam por fissão binária até infectarem o macrófago por

completo e rompendo a parede celular, deste modo as amastigotas são liberadas da

célula do hospedeiro e atingem outro macrófago levando a nova replicação. A

liberação das amastigotas é geralmente descrita como uma explosão da célula do

hospedeiro (BENENSON, 1997).

A forma de tratamento da leishmaniose pode ser por meio de medicamentos a

base de antimônio pentavalente, menos tóxico que antimônio trivalente que era

utilizado anteriormente, sendo que os antimoniatos orgânicos comercializados são o

pentostam (3) (estibogluconato de sódio) e a glucantime (4) (antimoniato N-metil

glucamina) (Figura 1.2) (SILVA et al., 2005 e SILVA, 1998). Acredita-se que a

atividade do antimônio está relacionada com o potencial redox do tiol da célula, pela

indução do efluxo de tiol intracelular e pela inibição da enzima tripanotiona redutase.

Para ser ativo frente à Leishmania, Sb(V) tem que entrar na célula do hospedeiro,

atravessar a membrana fagolisossomal e agir frente à amastigotas intracelulares

(OUELLETTE et al., 2004).

Sabe-se também que Sb(V) é convertido na forma trivalente para ser mais

ativo, assim levando a definição que Sb(V) é um pró-fármaco. É possível que a

redução de Sb(V) a Sb(III) ocorra tanto no hospedeiro quanto no parasita, sendo que

redução a Sb(III) pode ocorrer tanto no fagolisossoma quanto no citosol. Assim o Sb

é introduzido no parasita como Sb(III) e este interage com alguns alvos celulares

mas também pode formar conjugações com vários tióis incluindo cisteína, glutationa,

e tripanotiona. Acredita-se que os efeitos colaterais causados por esse tipo de

medicamento estejam relacionados a este mecanismo de ação (OUELLETTE et al.,

2004).

3 Na

O O

FIGURA 1.2: Fármacos empregados no tratamento da leishmaniose

Medicamentos mais modernos para o tratamento de leishmaniose já são

conhecidos, no entanto alguns já estão em declínio como é o caso da pentamidina

(5) que possui considerável toxicidade (hipotensão, hipoglicemia, diabetes,

nefrotoxicidade) e acredita-se que esta se deva ao acúmulo nas mitocôndrias, e esta

seja inibidor do complexo da cadeia respiratória mitocondrial, sendo efetivo no

complexo da cadeia II (Figura 1.3) (OUELLETTE et al., 2004 e MEHTA & SHAHA, 2004).

Outros exemplos são a anfotericina B (6), que é disponível como fungicida,

usada no tratamento de infecções sistêmicas. A atividade antileishmanial deste

composto foi mostrada inicialmente nos anos 1960 e foi atribuída a afinidade seletiva

de 24 esteróides substituídos, conhecidos como ergosterol vis-a-vis colesterol.

(SUNDAR & CHATTERJEE, 2006).

Outro medicamento é a miltefosina (7) que é um alquil fosfolipídeo que foi

inicialmente desenvolvido como um agente antitumoral. Em testes clínicos III

mostrou maior atividade frente à leishmaniose visceral, embora o modo de ação seja

desconhecido. No entanto, acredita-se que esteja associado com modulação nos

receptores superficiais das células, metabolismo inositol, ativação de fosfolipases,

entre outros, no entanto possui um efeito teratogênico não podendo ser empregado

em mulheres grávidas (SUNDAR & CHATTERJEE, 2006).

Um dos graves problemas apresentados por esses medicamentos é o

mecanismo de resistência desenvolvido pelos parasitas, que normalmente se deve

ao tempo de meia-vida prolongado no caso de 150-200 h para 7, o que torna a

busca por novos medicamentos sempre necessária (OUELLETTE et al., 2004).

OOHOH

OHOHOHO

COOH

FIGURA 1.3: Fármacos empregados no tratamento da leishmaniose

Atualmente existem alguns fármacos que estão em testes clínicos, além de

estudos de associações com miltefosina (SEIFERT & CROFT, 2006). Dentre alguns

compostos podemos citar a sitamaquina (8), um imunomodulador que é um análogo

ativo da 8-aminoquinoina que pode ser ingerido oralmente. Este composto foi

originalmente desenvolvido pelo Instituto Walter Reed Army em colaboração com

Glaxosmithkline, em resposta a uma necessidade de se encontrar agentes orais

efetivos para Leishmania visceral, e a eficiência do composto foi validada em

modelos animais (SUNDAR & CHATTERJEE, 2006).

Outro medicamento oral é a Paromomicina (9) obtida de culturas de

Streptomyces rimosus, pertencente à classe dos aminociclitolaminoglicosídeos e

possui ambas atividades bactericida e antiprotozoária. Embora tenha sido

desenvolvido nos anos 1960 como agente anti-leishmanial permaneceu esquecido

até os anos 1980 quando a formulação tópica foi encontrada ser efetiva em

leishmaniose cutânea e a formulação parenteral para leishmaniose visceral também

foi desenvolvida (SUNDAR & CHATTERJEE, 2006). Análises preliminares compararam a

eficiência de 9 com outros fármacos licenciados, e a tolerabilidade é excelente.

Tendo um custo aproximado de 10-20 dólares por adulto no decorrer do tratamento,

poderia ser considerado o fármaco anti-leishmanial mais barato (SUNDAR &

CHATTERJEE, 2006) (Figura 1.4).

OCH

FIGURA 1.4: Sitamaquina (8) e paromomicina (9).

Os compostos azóis (cetoconazol, fluconazol, itraconazol) têm se mostrado

ativos frente a uma ampla quantidade de promastigotas e amastigotas, mas

apresentam uma diferença na sensibilidade para as espécies de Leishmania

fazendo com que a atividade antileishmanial seja comprometida não induzindo a

cura clínica (SUNDAR & CHATTERJEE, 2006).

Ainda assim a busca por novas entidades que apresentem atividade frente

aos parasitas causadores das doenças tropicais tem sido amplamente relatada na

literatura (AKENDENGUE et al., 1999, HAMZAH et al., 2000 e FOURNET et al., 2003).

1.3. Alvos macromoleculares na descoberta de novos fármacos

Uma alternativa interessante na busca por novos fármacos é a identificação

de um caminho bioquímico fundamental no parasita e bloqueá-lo através da inibição

de alvos macromoleculares (enzimas).

A escolha dos alvos deve ser de tal modo que esses não sejam essenciais,

não estejam presentes no hospedeiro para que o pró-fármaco seja convertido em

um composto ativo (fármaco) no interior do parasita.

O isolamento, identificação e processamento dessas macromoléculas tiveram

um grande avanço devido aos crescentes estudos para o sequenciamento

genômico.

A busca por compostos ativos pode ser realizada através de ensaios

biológicos em larga escala (“high-throughput screening, HTS”), ensaios virtuais, ou a

descoberta de estruturas baseadas em protótipos.

A abordagem moderna de desenvolvimento racional de fármacos se baseia

na identificação de vias metabólicas indispensáveis à sobrevivência do parasita.

Após a seleção dos alvos biológicos, o objetivo passa a ser a caracterização

detalhada dos componentes da via enzimática envolvida. Enzimas chave podem ser

exploradas para o desenvolvimento de inibidores da reação enzimática, sem afetar o

hospedeiro.

Várias enzimas com diferentes funções têm sido isoladas e o estudo para se

encontrar inibidores está sendo realizado, no caso das proteases que podem ser

interessantes alvos devido seu importante papel nos processos biológicos tais como

a coagulação sanguínea, produção hormonal e invasão celular.

As proteases têm sido recentemente objetivo de um intenso esforço na

descoberta de doenças antiparasitárias (WERBOVETZ, 2000). A cisteína protease tem

sido detectada na maioria dos protozoários parasíticos e tem sido purificada de T.

cruzi, L. major e T. brucei.

Uma grande maioria de células usa glutationa para controlar a redução no

ambiente intracelular. Leishmania e tripanossomos são os únicos que empregam

tripanotiona para fazê-lo. Esta diferença bioquímica entre as células dos parasitas e

do mamífero sugere o metabolismo tripanotiona como um alvo para fármacos

antiparasitas sendo que a enzima responsável por esse mecanismo é conhecida

como Tripanotiona redutase (WERBOVETZ, 2000).

Como se pode observar um grande número de enzimas tem sido isoladas,

clonadas e caracterizadas, no entanto encontram-se na literatura apenas estudos

preliminares que relatam o uso de alcalóides e seus derivados como inibidores

(ALVIM-JR. et al., 2005).

Serão descritos abaixo outros exemplos de estudos com enzimas na

descoberta de fármacos.

1.3.1. GDP-Manose pirofosforilase

Parasitas de Leishmania sintetizam uma variedade de manoses contendo

glicoconjugados que acredita-se ser essencial para a virulência no hospedeiro

mamífero e no mosquito vetor (HANDMAN et al., 2004). Um pré-requisito para a

síntese destes compostos é a disponibilidade da ativação manose doador, GDP-Man

(10), a reação entre a manose-1-fosfato (11) e GTP (glicotrifosfato) (12) catalisada

pela GDP-manose pirofosfato (GDP-MP) fornece a GDP-manose (GDP-MP, 10).

Deste modo, esta enzima poderia ser um alvo para o desenvolvimento de fármacos

anti-leishmaniose (Erro! A origem da referência não foi encontrada.1).

OHP

Pirof osfato

O O

Manos e 1-fosfato (11)

GTP (12)

GDP-manose (10)

GDP-MP

ESQUEMA 1.1: GDP-manose pirofosforilase (GDP-MP) catalisa a reação.

Após a clonagem da enzima e nos ensaios realizados (HANDMAN et al., 2004)

verificou-se que a falta da enzima torna o parasita avirulento, e a disponibilidade da

proteína recombinante torna esta enzima suscetível a ensaios em larga escala para

inibidores e isto facilitaria o processo de descoberta de um fármaco.

1.3.2. Glucose-6-fosfato isomerase

Glucose 6-fosfato isomerase catalisa a isomerização reversível de aldose-

cetose de D-glucose-6-fosfato para D-frutose-6-fosfato no processo de glicólise e

gluconeogenesis, e a reciclagem de hexose-6-fosfato na via da pentose fosfato

(CORDEIRO et al., 2004). Os protozoários unicelulares tais como Leishmania sp. tem

na glicólise um importante caminho metabólico para a produção de ATP, e para este

processo encontram-se 10 enzimas. A dependência do parasita a glicólise, e a

importância do caminho da pentose fosfato frente a defesa no estresse oxidativo,

apontam as enzimas contidas no glicossomo como um alvo potencial para o

planejamento de fármacos.

O isolamento e produção da enzima PGI (fosfoglucose isomerase) foi

realizado, e diferenças significativas entre a enzima do parasita e da homóloga

humana foram observadas. Apesar das enzimas parecerem similares e do resíduo

que o substrato se liga ser conservado, a diferença marcante foi detectada na

posição do pequeno domínio que existe na conformação mais aberta na enzima do

parasita, isto faz com que a cavidade do sítio ativo da enzima seja maior. Este

aumento da cavidade pode ser utilizado para a estratégia de desenhar alvos

racionais, e desenvolver inibidores seletivos na enzima do parasita.

1.3.3. Adenina-hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase

Talvez a diferença metabólica mais marcante entre vários protozoários

parasitas e o hospedeiro mamífero esteja na cadeia de síntese de purino-

nucleotídeos. Em células de mamíferos os purino-nucleotídeos podem ser

sintetizados a partir de duas vias. Uma via, envolvendo dez reações enzimáticas

seqüenciais leva a síntese "de novo" dos purino-nucleotídeos a partir de precursores

não nucleotídeos. Uma segunda cadeia metabólica, constituindo as denominadas

"vias de recuperação" (Erro! A origem da referência não foi encontrada.), utiliza

os purino-nucleotídeos pré-formados (adenina, guanina, xantina e/ou hipoxantina)

derivados da degradação de ácidos nucléicos ou nucleotídeos livres.

FIGURA 1.5: Via de recuperação e interconverção, em células de

mamíferos. APRT- adenina-fosforribosil-transferase; HGPRT- hipoxantina-guanina-

fosforribosil-transferase; PRPP- 5'-fosforribosil-1-pirofosfato; ATP- adenosina

trifosfato; ADP- adenosina difosfato; AMP- adenosina monofosfato; PRPP- 5-

fosforribosil pirofosfato; IMP- inosina monofosfato; XMP- xantosina monofosfato;

GMP- guanosina monofosfato; GDP- guanosina difosfato; GTP- guanosina trifosfato.

A biossíntese de purino, piridina e pirimidina nucleotídeos, bem como de

amino ácidos aromáticos é catalisada pelas enzimas da família

fosforibosiltransferase (PRTase). A maioria dos organismos sintetiza nucleotídeos

adenina por duas vias: "de novo" e "de recuperação". Ao contrário, os protozoários

parasitas são seres auxotróficos de purino-nucleotídeos devido a ausência

biossintética da via “de novo”. Assim, eles são absolutamente dependentes da

captura de nucleotídeos pré-formados do meio do hospedeiro. Protozoários

cinetoplastídeos do gênero Leishmania possuem três PRTases envolvidas na

reciclagem de purino nucleotídeos na via de recuperação: APRT; XPRT, HGPRT

(MONZANI et al., 2002 e THIEMANN et al., 1996) (Figura 1.6).

FIGURA 1.6: Via de recuperação e interconverção, em células de

Kinetoplastida. APRT- adenina-fosforribosil-transferase; HGPRT- hipoxantina-

guanina-fosforribosil-transferase; PRPP- 5'-fosforribosil-1-pirofosfato. XPRT- xantina

fosforribosil-transferase; HGPRT Hipoxantina Guanina fosforribosil transferase; AAH-

adenina deaminase; AMP- adenosina monofosfato; ATP- adenosina tri fosfato; ADP-

adenosina difosfato; AMP- adenosina monofosfato;, PRPP- 5-fosforribosil

pirofosfato; IMP- inosina monofosfato; XMP- xantosina monofosfato; GMP-

guanosina monofosfato; GDP- guanosina difosfato; GTP- guanosina trifosfato.

Várias PRTases têm sido caracterizadas de diferentes organismos, entretanto

somente 3 enzimas APRT foram cristalizadas e suas estruturas determinadas (i)

APRT de L. tarentolae em um complexo com três diferentes ligantes: adenina, AMP

e íons citrato; (ii) APRT de Saccharomyces cerevisiae em duas formas, uma sem

qualquer ligante e uma forma alternativa com íons sulfato no sítio ativo e (iii) APRT

de Giardia lamblia em um complexo tanto com 9-deazeadenine mais sulfato ou com

- fosforibosilpirofosfato.

Uma APRT de L. tarentolae foi relatada por THIEMANN e colaboradores (1996)

representando um tipo I adicional a estrutura de PRTase. As novas informações

fornecidas compreendem: (a) a estrutura da APRT foi resolvida com AMP e íon

fosfato no sítio ativo que imita o fosfato de PRPP; (b) nenhuma evidência foi

observada sobre a posição do íon metálico no sítio ativo; (c) AMP está ligado a uma

conformação anti, com o anel ribose em diferentes conformações (C4´-endo) que é

previamente conhecido da estrutura e o mais importante; (d) uma análise

comparativa e interações moleculares permitiu sugerir uma ordem de entrada de um

substrato, incluindo o íon magnésio.

Acredita-se que o laço (“flexible loop”) seqüestre o substrato do solvente na

conformação aberta e possibilita que a cauda (“hood”) não interaja com o substrato e

esta conformação não havia sido identificada anteriormente (Figura 1.7).

FIGURA 1.7: Diagrama do monômero da enzima APRT ligada a AMP e

fosfato.

Em outro estudo realizado por MONZANI et al. (2002) através do isolamento e

expressão da enzima hipoxantina-guanina fosforiposiltransferase (HGPRT) e por

comparações, tanto estruturais e funcionais entre a enzima do parasita e as

estruturas disponíveis da enzima humana, possibilitaria a investigação desta

importante enzima e a possibilidade de explicar como as diferenças estruturais

contribuem para a atividade catalítica da enzima

As diferenças no metabolismo em purino-nucleotídeos entre hospedeiro

mamífero e o parasita protozoário têm estimulado um interesse considerável na via

de recuperação como um alvo potencial para quimioterápicos. Além disso, o

conhecimento estrutural das enzimas possibilita estudos de relação estrutura –

atividade podendo fornecer compostos mais específicos.

1.4. Alcalóides e atividade biológica

Os candidatos a novos agentes terapêuticos podem ser de diversas fontes

tanto produtos naturais quanto compostos sintéticos (AKENDENGUE et al., 1999,

FOURNET et al., 2003 e HAMZAH et al., 2000), e dentre os diversos compostos

encontrados na literatura, nos deparamos com um seleto grupo de produtos naturais

que são os alcalóides (CORDELL et al., 2001).

O grupo dos alcalóides é amplo, podendo ser encontrado em diversas

famílias de plantas superiores e também pode ser classificado de acordo com seu

esqueleto carbônico. Outra característica é que estes compostos apresentam uma

ampla faixa de atividade biológica (JAEN et al., 1995, JIN et al., 2004, e KO et al.,

2002, LANTER et al., 2004, MICHAEL, 2004, OLIVA et al., 2003), por exemplo, a

camptotecina (13) é um alcalóide indólico isolado de uma planta chinesa,

Camptotheca acuminata Decne, e possui potente atividade antitumoral (Figura 1.8).

FIGURA 1.8: Estrutura da camptotecina (13)

Outro grupo de alcalóides com interessantes atividades biológicas são os

pertencentes ao grupo das quinolinonas. Alguns destes compostos são usados

como fármacos bactericidas e micobactericidas no tratamento de várias doenças

infecciosas (ANQUETIM et al., 2005). A primeira quinolinona que apresentou atividade

bactericida foi o ácido nalidíxico (14) que foi preparado em 1962 (LESCHER et al.,

1962) e ensaiado frente à Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus

(Figura 1.9).

COOH

FIGURA 1.9: Estrutura do ácido nalidíxico

Uma vez descoberta a atividade de 14, mais de 10 milhões de quinolinonas

sintéticas foram patenteadas, e as modificações químicas sucessivas comprovaram

o espectro de atividade, a potência e a resposta parasítica destas. As quinolinonas

são bactericidas devido à interferência nas topoisomerases II e IV do DNA

bacteriano (DNA girase) que são enzimas envolvidas na replicação, recombinação e

reparo do DNA. Esta inibição resulta da formação de um forte complexo ternário

entre a quinolinona e a dupla DNA/DNA girase, que capta a enzima no DNA

(ANDRIOLE, 2005 e ANQUETIN et al., 2005) impossibilitando assim sua replicação e

levando o parasita a morte.

Dentro do grupo das quinolinonas encontramos as fluorquinolinonas, tais

como a enrofloxacina (15), medicamento comercial que é utilizado em infecções

bacterianas. Baseado nestas informações, alguns pesquisadores estão ensaiando

estes compostos frente aos gêneros dos parasitas das doenças tropicais como por

exemplo, Trypanosoma, Leishmania e Plasmodium.

BIANCIARDI e colaboradores (2004) iniciaram um estudo para verificar a

eficiência de 15 frente à leishmaniose em lesões da pele de animais, e o composto

foi avaliado frente a L. infantum in vivo e in vitro, no entanto os resultados

apresentados não aumentaram o efeito terapêutico desejado (Figura 1.10).

15, R = ; R

= H; R

N N

FIGURA 1.10: Fluoroquinolinonas ensaiadas frente aos parasitas das

doenças tropicais.

1.4.1. Dictiolomidas A e B

Outros compostos com interessante atividade frente a Leishmania são as

Dictiolomidas A (16) e B (17), que foram inicialmente isoladas de uma planta

encontrada no Peru, Dictyoloma peruvianum, que é pertencente ao gênero

Dictyoloma.

A taxonomia deste gênero ainda é duvidosa, desde sua primeira descrição em

1825, quando Jussieu classificou-o dentro de Rutaceae, na tribo Zanthoxyleae. De

acordo com o conceito de Bentham e Hoocker, Dictyoloma pertence a

Simaroubaceae "ordo". Engler primeiramente incluiu este gênero em

Simaroubaceae, porém mais tarde colocou-o em Rutaceae, classificando Dictyoloma

como sendo o único gênero da subfamília Dictyolomatoideae, e contém somente

duas espécies: D. vandellianum Adr. Juss. (sin. D. incannescens DC), que ocorre no

Brasil e D. peruvianum, no Peru (VIEIRA et al.,1998).

Em 1995, LAVAUD et al. (1995), baseados no conhecimento de que D.

peruvianum tem sido usada na medicina popular do Peru para tratamento de

leishmaniose, fizeram o estudo fitoquímico desta planta, guiados por bioensaios in

vitro em formas promastigotas de 2 espécies de Leishmania (L. amazonensis e L.

braziliensis) e isolaram da casca dois novos alcalóides do tipo piperidino [1,2-] 4-

quinolinonas, dictiolomida A (16) [

= + 21º (c 0.6; CHCl

)] e dictiolomida B (17) [

= + 32º (c 0.9; CHCl

)], que apresentaram uma boa atividade anti-leishmania 25

g/mL (88 M) e 100 g/mL, respectivamente, sendo a atividade da planta

associada a estes compostos.

Em 2003, SARTOR et al. em um estudo da espécie D. vandellianum isolou

entre alcalóides indólicos e 2-quinolínicos, cromonas preniladas e limonóides, uma

4-quinolinona inédita, a 6-metoxidictiolomida (18) [

= + 22º (c 0.7; CHCl

)], que

também apresentou uma alta atividade em testes realizados com formas

amastigotas de L. amazonensis, sendo 84% e 58% de inibição a 50 e 25 g/mL

respectivamente

(Figura 1.11) (SARTOR et al., 2000).

16, R

= CH

CH=CHCH

(cis),

R = H

17, R = H,

= CHOHCH

18, R = OCH

= CH

CH=CHCH

(cis)

FIGURA 1.11: Dictiolomidas A (16), B (17) e 18.

A atividade biológica dos compostos 16 – 18 foi descrita, no entanto a

elucidação estrutural não está completamente definida. A configuração da dupla

ligação da cadeia alquílica foi deduzida pela constante de acoplamento dos

hidrogênios vinílicos (J 10.6 Hz), confirmando a configuração cis à dupla ligação

(LAVAUD et al., 1995 e SARTOR et al., 2000).

O desafio da correta elucidação estrutural se deve a presença do anel

piperidínico com a cadeia alquilílica em C-3’ que fornece o centro estereogênico 3’.

SARTOR et al. (2003) fazem algumas sugestões sobre a configuração deste centro,

no relato de um modelo em que na porção piperidina, H-3’ não está rigidamente

antiperiplanar em relação a um dos hidrogênios H-4’. No isômero no qual H-3’ está

antiperiplanar a H-4’ (J é grande), a cadeia alquenil está na conformação

pseudoequatorial (). Entretanto, a alta constante de acoplamento dos hidrogênios

metilênicos de C-4’com os hidrogênios H-3’ é também consistente com a situação do

outro isômero no qual H-3’ é antiperiplanar a H-4’J é grande), o que requer a

cadeia alquenil estar na conformação pseudoequatorial ().

Além disso, os autores presumem que o centro estereogênico seja S, devido

ao valor de deslocamento químico de C-3’ no RMN

C de 18 ser  33.7 ppm, por

analogia com a oblonginina (19) e shimonomenina (20) (Figura 1.12) (SARTOR et al.

2003).

32.8 ppm

28.0 ppm

H H

FIGURA 1.12: Oblonginina (19) e shimonomenina (20)

Através de estudo usando o programa MM2, pode-se observar nas estruturas

da Figura 1.13 abaixo é que independentemente da estereoquímica que o centro

possua a conformação mais estável é a pseudocadeira em que a cadeia alquílica

possui posição pseudoequatorial.

FIGURA 1.13: conformação pseudo-cadeira da dictiolomida 16.

1.5. Metodologias sintéticas para a obtenção de 4-quinolinonas

Algumas metodologias sintéticas para a obtenção de 4-quinolinonas são

encontradas na literatura. Tois et al. (2005) publicaram uma série de quinolinonas

sem substituintes nas posições 2- ou 3- empregando o eficiente procedimento de

LEIMGRUBER-BATCHO. As enaminonas 22 foram preparadas pelo aquecimento com o-

nitroacetofenonas 21 em DMF – DMA, em seguida foram ciclizadas fornecendo as

quinolinonas 23 com quantidade catalítica de Pd como catalisador (ESQUEMA 1.2).

21 22

DMF-DMA, DMF

100

C, 90 min.

(78 - 95%)

10% Pd-C,

ciclohexeno, EtOH,

, 60 min.

(52 - 95%)

ESQUEMA 1.2: Preparação de quinolinonas empregando o procedimento

de LEIMBRUBER-BATCHO.

BENEY e colaboradores (2000) relataram a síntese de uma série de 2-aril-

3,5,7-trimetoxi-4-quinolinonas 24. A preparação foi realizada em três etapas

utilizando 3,5-dimetoxianilina (25) como bloco construtor com derivados de cloreto

de benzoíla para fornecer 26. A acilação de Friedel-Crafts com cloreto de

metoxiacetila fornece os correspondentes N-fenilamido metoxiacetofenona 27, e

posterior ciclização na presença de t-BuOK fornece as quinolinonas 24 (Esquema

1.3).

NCH

OCH

Ph-R

OCH

tBuOK/tBuOH

ref., 24h

53 - 80%

OCH

Ph-R

OCH

ArCO-Cl

97 - 100%

NCH

OCH

Ph-R

COCH

CO-Cl,

SnCl

, 1,2-dicloroetano,

t.a.,4h,

26 - 42%

ESQUEMA 1.3: Preparação de 2-aril-3,5,7-trimetoxi-4-quinolinona

A quinolinona 28 foi isolada de um organismo marinho e possui atividade

antibiótica. Várias metodologias sintéticas têm sido descritas, no entanto BACK e

colaboradores (2003) relataram um novo método empregando adição conjugada de

anilinas o-substituídas a sulfonas acetilênicas, seguida pela acilação intramolecular

levando a 31, carbonilação em metanol e dessulfonação redutiva com amálgama

alumínio (Esquema 1.4).

CHO

70%

Pd(OAc)

MeOH,

77%

Al-Hg

(68%)

CHO

ESQUEMA 1.4: Preparação da quinolinona natural 28

Além do emprego da metodologia de síntese clássica, a preparação de

quinolinonas também tem sido descrita empregando fase sólida. Esta utiliza um

procedimento de unir os substratos a uma resina sólida, a vantagem seria a

preparação de um maior número de compostos em um tempo menor se comparado

com a síntese clássica. As indústrias farmacêuticas têm um grande interesse nesta

metodologia, pois pode utilizar a química combinatória o que traz vantagens no

planejamento racional de um fármaco (MARQUARDT & EIFLER-LIMA 2001).

Neste contexto, SRIVASTAVA e colaboradores (1999) relataram a preparação

das quinolinonas 33 e 34 como descrito no Esquema 1.5. O composto 36 foi obtido

através do acoplamento entre o ácido 4-aminobenzóico e a resina Merrifield (35)

empregando carbonato de Césio como base. Este foi tratado com

etoximetilenomalonato de dietila e posterior ciclização com Dowtherm (mistura de

difenil e difenil óxido) rendeu a quinolinona 37 ligada ao polímero. A modificação no

grupo éster poderia gerar a coleção dos derivados, e em cada seqüência reacional a

resina foi clivada com TFA/CH

para fornecer as séries das quinolinonas 33 e 34.

OEtHO

O O

NHRO

O O

NHRHO

O O

Dowtherm

TFA/CH

OEtO

O O

EtO

DEMM

RNH

OEtO

O O

ESQUEMA 1.5: Síntese em fase sólida

NAKATSU e colaboradores (1990) sintetizaram a leiokinina B (38) a partir do

ácido o-nitrobenzóico (39), utilizando a ciclização de Niementowski (Esquema 1.66).

A rota sintética de 6 etapas forneceu em alto rendimento global o produto natural

desejado.

CONEt

1) SOCl

, pir.

2) Et

NH/THF

3) H

/Pt-C

4) TsOH/PhH

COCH(Et)

100%

LDA/THF

78%

MeI/NaH/THF

89%

Leiokinina B (38)

ESQUEMA 1.6: Síntese da leiokinina B (38)

Mais recentemente, CHENAULT et al. (2000) prepararam uma série de

quinolina-carboxiguanidinas (40), para avaliação como possíveis agentes

antidiabetes, utilizando como material de partida arilaminas substituídas (41). A

condensação destas com acetilenodicarboxilato de dimetila (DMAD) forneceram as

correspondentes 4-quinolinonas em bons rendimentos (Esquema 1.7).

4 etapas

∆

DMAD, MeOH

41 R= 4-F; 3-OMe;

3,4-OCH

4-OMe; 6-Me

64-97%

HCl

N CO

MeO

ESQUEMA 1.7: Síntese de quinolina-carboxiguanidinas

1.6. Rota Biossintética

Um importante ponto na escolha de metodologias sintéticas para a

preparação de produtos naturais poderia ser baseado na rota biossintética desses.

A biossíntese das dictiolomidas emprega o ácido antranílico (42), que sofre

sucessivas condensações com malonato para formação do intermediário policetídico

(43) levando ao anel quinolinona, onde a cadeia lateral já está acoplada. Posterior

ciclização e acoplamentos fornecem as dictiolomidas (Esquema 1.8).

CoAS

SCoA

O O O O

COSCoA

O O

SCoA

3 x

acetato/malonato

ESQUEMA 1.8: Análise biossintética

Neste sentido, uma possível rota sintética baseando-se na biossíntese seria

empregando a metodologia descrita por BENEY et al. (2000) partindo-se da anilina 44

fornecendo a amida 46 através da condensação com o cloreto 45 e posterior reação

de Friedel-Crafts para fornecer 47. A partir de 48 as etapas posteriores seriam as

descritas na metodologia baseada por NAKATSU et al. (1990) em que o acoplamento

da cadeia lateral deveria ser estudado a fim de não comprometer o excesso

enantiomérico (Esquema 1.9).

Cl OR

N OR

SnCl

N OR

t-BuO

N OR

H OR

47 48

Esquema 1.9: Rota biomimétrica para preparação de 16

OBJETIVOS

2. Objetivos

O presente projeto tem de modo geral dois objetivos principais:

1) realizar o estudo visando à síntese enantiosseletiva das dictiolomidas 16 e

18, e a preparação de uma pequena coleção de 4-quinolinonas.

S- e R-16 R = H

S- e R-18 R = OCH

FIGURA 2.1: Dictiolomidas 16 e 18

2) avaliar a atividade antileishmania dos intermediários sintéticos, análogos e

se possível das dictiolomidas 16 e 18 a fim de se reunir informações para se

determinar a relação estrutura atividade biológica.

3) avaliar a atividade dos intermediários sintéticos e análogos frente a

diversos alvos biológicos.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

3. Resultados

Estudos de metodologias sintéticas visando à obtenção das Dictiolomidas

16 e 18.

3.1. Estudo da Metodologia Sintética 1.

A rota sintética que se empregou inicialmente baseia-se no procedimento

descrita por NAKATSU e colaboradores (1990) na preparação da leiokinina B (38)

(Esquema 1.5) tendo como material de partida os ácidos 39 e 49 e posterior

ciclização de Niementowski (Esquema 3.1).

Escolheu-se esta metodologia sintética foi devido aos bons rendimentos

químicos, à simplicidade das etapas reacionais e rápida obtenção do anel

quinolinona.

O desafio sintético desta metodologia está relacionado ao fato de que as

dictiolomidas 16 e 18 apresentam estruturas mais complexas, quando comparadas à

leikonina B (38), tais como o anel piperidina e o centro estereogênico, apresentando

assim inovações sintéticas.

A etapa chave é o acoplamento da cadeia lateral em 50 ou 51 via uma reação

do tipo S

2, em que se pode empregar a reação de Mitsunobu ou reagentes de

Grignard. Dessa maneira, a hidroxila deve ser transformada em um bom grupo de

saída (Ms, Ts, Tf ou haleto) e a cadeia lateral deve ser um organometálico (alquil

lítio, Grignard ou cuprato) (BURNS et al., 1997, KRAUSE & GEROLD, 1997 e SATO &

OTERA, 1995). LIPSTHUTZ e col. (1984) descreveram que a reação de cupratos de

baixa e alta ordem com iodetos de alquila secundários opticamente puros ocorre

preferencialmente com racemização, no entanto, quando brometos foram utilizados,

completa inversão foi obtida.

39, R = H

49, R = OCH

1) SOCl

, pir.

2) Et

NH/THF

3) H

/Pt-C

4) TsOH/PhH

CONEt

2) TsCl, pir.

3) NaH, DMF

1) Hidrólise

1) OH -> X

53, R = H

54, R = OCH

55, R = H

56, R = OCH

16, R = H

18, R = OCH

50, R = H

51, R = OCH

LDA/THF

ESQUEMA 3.1: Rota Sintética para obtenção das dictiolomidas 16 e 18.

Por se tratar de uma síntese convergente é necessário preparar a cetona 52

que pode ser obtida empregando como material de partida o hidroxi-éster 57 que

pode ser obtido a partir de método biológico empregando fermento de pão para a

redução do -ceto éster 58. Uma alternativa é a partir do (R)- ou (S)-ácido

glutâmico, disponíveis comercialmente, através da conversão do grupo amino em

hidroxila na presença de NaNO

em meio ácido, e em seguida, os dois grupos

carboxílicos são estereficados para fornecer 57 (Esquema 3.2).

(S)- ou (R)-ácido glutâmico

Fermento

Pão

OMe

MeO

1) NaNO

2) MeOH

OMe

MeO

ESQUEMA 3.2: Obtenção do hidroxi-éster 57.

3.1.1. Preparação da (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodioato de dimetila (57)

através de redução microbiológica com o emprego de fermento de pão, S.

cerevisiae.

É altamente conhecida a redução microbiológica de -cetoésteres (FORNI et

al., 2002, SUTHERLAND & WILLS, 1998 e BARDOT et al., 1996), no entanto a redução

de cetoésteres é pouco descrita, com alguns exemplos encontrados na literatura

(RUSTOY et al., 2004 e DRIOLI et al., 1999). KAYSER et al. (1999) reduziram -ceto-

estéres 59; BLASER e col. (1991) reduziram o 2-oxohexanoato de dietila 60 na

preparação do feromônio Jasminum grandiflorum L. e de Polianthes tuberosa L.; e

SUTHERLAND e col. (1998) utilizaram enzimas isoladas para reduzir cetoácidos 61

empregando lactato desidrogenase de Staphylococcus epidermidis (SE-LDH) e

Bacillus stearothermophilus (BS-LDH) (Esquema 3.3).

Fermento de Pão

= CH

, C

= CH

, CH

, nC

O O

Fermento de Pão

OH O

ee > 90%

ee > 50 - 98%

R CO

SE-LDH BS-LDH

R = CH

, CH

, (CH

)

CH, PhCH

, ciclopropil

ESQUEMA 3.3: hidroxi ésteres obtidos através da redução com fermento

de pão.

Os ceto-ésteres 58a e b empregados na redução microbiológica para fornecer

os hidroxi ésteres 57 foram preparados, empregando inicialmente a metodologia

descrita por BODEN & KECK (1985), partindo do ácido bromoacético e/ou ácido

pirúvico, em DCC e DMAP. No entanto, como os rendimentos reacionais não foram

satisfatórios, optou-se por utilizar a metodologia descrita por LI et al. (2002) em que

se obteve o ceto-éster com 60% de rendimento (Esquema 3.4).

NBS,

AgNO

MeO OMe

58a

BrO

KMnO

NaHCO

MgSO

MeOH

ESQUEMA 3.4: Preparação do ceto-éster (58a)

(S)-57a, R = OCH

Fermento

Pão

e/ ou

58a, R = OCH

58b, R = OCH

(S)-57b, R = OCH

(R)-57a, R = OCH

(R)-57b, R = OCH

ESQUEMA 3.5: Redução do cetoéster com fermento de pão.

A condição microbiológica empregada por BLASER et al. (1991) na redução de

60 forneceu apenas um enantiômero e com alto valor de ee, deste modo utilizou-se

este procedimento como um padrão experimental descrito na linha 3 (Tabela 3.1).

No entanto, outras condições foram utilizadas para tentar obter ambos

enantiômeros.

TABELA 3.1: Condições experimentais para a redução microbiológica.

Fermento

(g)

Substrato

(mg)

58a 58b

(mL)

Inibidor

Quant.

(mL)

(%)

Rend.

(%)

T (h)

1 36 188 178 AA 0.40 70 30 48

2 36 216 178 AA 0.40 75 40 48

3 2.1 216 75

96 50 50

4 2.1 216 75 AA 1.00 80 40 96

5 2.1 216 75 ClA 0.60 75 50 96

6 10 128 48 AA 0.20 85 40 90

7 1 70 30

AA 0.10 85 50 85

fermento de pão marca Mauri;

Material de Partida;

AA – álcool alílico (com 24

horas de pré-incubação), ClA – cloroacetato de etila;

quantidade de inibidor em

relação ao substrato;

excesso enantiomérico (ee) determinado através de CG

usando coluna quiral e configuração absoluta S;

tempo reacional;

2.5 g de glicose.

1 g de glicose.

A utilização de um procedimento já conhecido viabiliza a verificação da

eficiência do fermento que foi utilizado, já que diferentes cepas podem apresentar

resultados diferentes (BARALDI, 2001), e neste caso o ee não foi eficiente. No entanto

nas linhas 4 e 5 em que inibidores foram utilizados o ee não se mostrou melhor.

O enantiômero S, que é o isômero natural se comparado com o amino-ácido

correspondente ácido glutâmico, foi obtido em todas as condições reacionais

utilizadas mesmo quando inibidores foram empregados a fim de obter o isômero não

natural. A configuração absoluta foi determinada através da comparação dos valores

de [

] dos hidroxi ésteres obtidos a partir do ácido glutâmico (IZUMIYA et al., 1979,

MORI & IWASAWA, 1980 e MORI, 1996). O uso de inibidores pode controlar a

estereoquímica do centro a ser formado e também o excesso enantiomérico. As

enzimas podem ser inibidas por íons ou pequenas moléculas e servem como

mecanismos de controle em sistemas biológicos. A inibição pode ser reversível ou

irreversível. Um inibidor irreversível forma uma ligação covalente com a enzima-alvo

ficando fortemente ligada a ela.

A inibição reversível caracteriza-se por uma dissociação rápida do complexo

enzima-inibidor. Dentre esses se encontram os inibidores competitivos que se

assemelham ao substrato e ligam-se ao sítio ativo da enzima e o substrato é

impedido de se ligar ao mesmo. Como por exemplo, pode-se citar a

bromoacetofenona e o bromoacetato de etila, que são inibidores da álcool

desidrogenase, porém não inibem a ação da lactato desidrogenase (BARALDI, 2001).

Os resultados iniciais mostram que o fermento foi eficiente para a obtenção

do isômero S com ee muito bons, embora o procedimento experimental utilizado

para a obtenção do isômero R não foi muito eficiente.

Como a redução com o fermento de pão não foi tão eficiente, pois não

forneceu os dois enantiômeros do hidroxi-éster 57b, uma alternativa é a preparação

destes a partir dos ácidos R- e S-glutâmico.

3.1.2. Preparação do ácido (2S)- ou (2R)-hidroxi-1,5-pentanodióico (62).

ácido glutâmico

NaNO

/ H

ESQUEMA 3.6: Preparação do ácido 2-hidroxi-1,5-pentanodióico (62).

Aminas reagem com nitrito e ácido pela reação chamada diazotação para

formar inicialmente o sal de diazônio que se decompõe espontaneamente pela perda

de nitrogênio formando o carbocátion que reage com água fornecendo o álcool. Esta

reação de deaminação procede com retenção de configuração (MORI & IWASAWA,

1980 e MORI, 1996 e IZUMIYA et al., 1979).

RNH

→ RNH.NO → RN

→ R

→ RX

A etapa de deaminação poderia ter características de uma S

1, pois envolve

um intermediário carbono-catiônico, porém retenção de configuração é observada

durante o ataque nucleofílico (BREWSTER et al., 1950).

No nosso caso específico, acreditamos que a retenção de configuração possa

ocorrer devido a uma dupla inversão. A hidroxila do grupo carboxila assistiria a

deficiência causada pela saída de nitrogênio e assim a água poderia agir como

nucleófilo e formar o hidroxi-diácido com retenção de configuração (Erro! A origem

da referência não foi encontrada.).

FIGURA 3.1: Possível mecanismo da retenção de configuração.

Deste modo realizou-se a substituição do grupo amino pelo grupo hidroxila

através do tratamento do ácido glutâmico com nitrito de sódio em meio ácido. Pela

análise espectroscópica por IV observou-se uma banda em 3534 cm

-1

referente ao

estiramento axial OH e 2 bandas em 1732 e 1779 cm

-1

referente às carboxilas.

Utilizou-se o material bruto para a etapa posterior devido este ser muito polar e

existir dificuldades na purificação.

3.1.3. Preparação do (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodioato de dimetila (57).

MeOH

ESQUEMA 3.7: Preparação do 2-hidroxi-1,5-pentanodioato de dimetila (57).

A esterificação dos diácidos S- e R-62 foi feita em metanol com catálise em

meio ácido. A presença das metoxilas pode ser comprovada através de RMN

com o aparecimento de dois singletos integrando para 3H em 3.80 e 3.67 ppm,

enquanto que no espectro de RMN

C esses grupos aparecem em 51.53 (C2) e

52.42 (C6) ppm. Esta diferença de deslocamento é devida à presença da hidroxila 

à carbonila do éster C7. O carbono carbinólico (C7) aparece em 69.37 ppm, e as

carbonilas aparecem em 174.82 e 173.45 ppm.

O espectro de IV apresentou bandas características em 3448 cm

-1

referente

ao grupamento hidroxila e as carbonilas dos ésteres apresentaram absorções em

1742 e 1649 cm

-1

, hidroxi-éster e éster respectivamente. Obteve-se o produto 57 em

80% de rendimento.

3.1.4. Preparação do (4S)- e (4R)-4,5-diidroxipentanoato de metila (63).

OMe

MeO

S.BH

NaBH

(cat),THF

MeO

ESQUEMA 3.8: Preparação do (4S)- e (4R)-4,5-diidroxipentanoato de

metila (63).

A redução quimiosseletiva de 57 com o complexo borana-dimetilsulfeto na

presença de NaBH

em quantidade catalítica fornece apenas o diol 63, conforme

mecanismo reacional mostrado na Figura 3.2 (BONINI, et al. 2004 e BROWN & YOON,

1968).

OBH

.SMe

- H

- Na

NaBH

FIGURA 3.2: Mecanismo da redução utilizando NaBH

como catalisador.

O boro se complexa com os pares de elétrons livres do oxigênio da hidroxila e

em seguida forma um intermediário cíclico de 5 membros com o oxigênio da

carbonila ocorrendo a redução da mesma pelo hidreto e o NaBH

é reciclado in situ a

fim de fornecer o diol 63 (SAITO et al., 1984 e 1992).

O espectro de IV do produto apresentou uma banda em 3448 cm

-1

referente à

OH, e notou-se o desaparecimento da carbonila do hidroxi-éster, sendo que o éster

absorveu em 1725 cm

-1

Pela análise do espectro de RMN

H notou-se o desaparecimento da metoxila

do hidroxi-éster e metoxila do éster apresentou um deslocamento químico de 3.73

ppm, os hidrogênios carbinólicos estão presentes na região de 4.31 e 3.69 ppm

como multipletos. Após purificação obteve-se o diol 63 em 89% de rendimento.

3.1.5. Preparação do (4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il] propanoato de

metila (64).

MeO

(MeO)

CMe

PPTS, DMF

ESQUEMA 3.9: Preparação do (4S)- e (4R)- [2,2-dimetil-1,3-dioxolan-

4-il] propanoato de metila (64).

A preparação do acetal 64 ocorre pela reação em meio ácido com DMF e

dimetoxipropano, que é um reagente mais reativo que a cetona correspondente. A

reação se mostrou eficaz, já que não ocorreu a formação de sub-produtos, com

rendimento de 90%. Pela análise de RMN

H pode-se comprovar a estrutura do

composto através dos sinais das metilas em 1.40 e 1.34 ppm integrando para 3H;

em 4.16 ppm o multipleto para 3H referentes aos hidrogênios carbinólicos, e o

singleto em 3.60 ppm referente à metoxila.

Os sinais de RMN

C característicos estão em 108.97 ppm referente ao C

quaternário do acetal, os carbonos carbinólicos em 74.86 e 68.99 ppm e a metoxila

em 51.53 ppm. A carbonila apresentou sinal em 173.55 ppm.

Pelas absorções do espectro de IV notou-se que ocorreu o desaparecimento

da banda OH e novamente apenas uma absorção da carbonila em 1740 cm

-1

3.1.6. Preparação da (4R)- e (4S)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il] butan-2-ona

(52).

Me O

MeLi

ESQUEMA 3.10: Preparação (4R)- e (4S)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-

il] butan-2-ona (52).

A preparação da cetona 52 foi realizada inicialmente segundo Mulzer et al.

(2000), no entanto a reação não ocorreu como esperado. Na referência os autores

utilizaram uma temperatura de –100

C, mas a esta temperatura a solução reacional

congelou, impossibilitando a reação. Vários testes foram realizados em relação à

diluição, troca de solvente e variação de temperatura (Tabela 3.2). Deste estudo

concluiu-se então que a temperatura ideal para a reação era 0

C utilizando Et

como solvente.

TABELA 3.2: Resultados obtidos na adição de MeLi a 64.

Temperatura

(

Solvente

Diluição

MeLi

(M)

(%)

1 - 100 Et

O 1:1 0.5 70 -

2 - 100 THF 1:1 0.5 75 -

3 - 100 Et

O 3:1 0.5 80 -

4 - 100 THF 3:1 0.5 70 -

5 - 80 Et

O 1:1 0.6 60 -

6 - 80 Et

O 3:1 0.6 65 -

7 - 40 Et

O 3:1 0.6 70 -

8 0 Et

O 3:1 0.6 10 50

9 0 Et

O 1:1 0.6 - 80

quantidade de solvente: quantidade de solução de MeLi,

ocorre a

solidificação da solução nas reações de - 40 a - 100

3.1.7. Preparação do (2S)-2-t-butildimetilsililoxi-pentanodioato de dimetila

(65).

Com o objetivo de se avaliar a influência do grupo protetor da cetona 52 na

formação da imina e também aumentar o rendimento total da síntese decidiu-se

preparar também a cetona 66. A escolha deste grupo protetor foi devida à facilidade

tanto em termos de proteção quanto de desproteção, considerando que o composto

conterá outros grupos protetores que serão retirados em diferentes momentos na

síntese, ou seja, o t-butildimetil silano permaneceria no composto (KOCIENSKI, 1994).

Esquema 3.11: Estrutura da cetona 66

A utilização de imidazol como base se deve ao fato deste se complexar com o

grupo silil possibilitando o ataque mais efetivo da hidroxila, pois o imidazol se torna

um grupo de saída melhor que o cloreto (BARALDI, 2001).

Esquema 3.12: Preparação do composto 65.

O produto obtido foi analisado por RMN

H sendo que os sinais mais

característicos foram os singletos em – 0.83 e – 0.86 referentes às metilas ligadas

ao silício, e notou-se também a mudança de alguns sinais em relação ao material de

partida, por exemplo, os dois singletos em 3.67 e 3.62 ppm referentes às metoxilas.

No espectro de RMN

C notou-se o aparecimento de sinais em - 5.07 e - 5.49 ppm

referentes às metilas ligadas ao silício. O composto foi obtido com 50% de

rendimento.

3.1.8. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-hidroxipentanoato de metila

(67).

ESQUEMA 3.13: Preparação do composto 67

A redução do composto 65 foi inicialmente proposta já que KISHI e

colaboradores (1992) mostraram uma série de compostos variando a substituição da

hidroxila  sendo que a redução depende muito de um balanço delicado entre

fatores estéricos e eletrônicos. Neste caso como a redução não se mostrou tão

eficiente, acredita-se que o fator estérico estaria tendo uma influência importante, já

S.BH

NaBH

(cat),THF

OMe

OTBS

Me O

OTBS

Me O

OMe

Me O

OMe

OTBS

Me O

TBSCl,

imidazol

OTBS

OMOM

que o tempo reacional foi muito superior ao observado para a obtenção de 67 (30

horas). Após este período, adicionou-se MeOH e evaporou-se o solvente.

O produto foi analisado por RMN

C e observou-se apenas um sinal da

metoxila em 51.75 ppm e apenas uma carbonila em 173.94 ppm, comprovando

assim a formação do produto com 50% de rendimento.

Deste modo, como a redução não se mostrou viável devido ao baixo

rendimento e longo tempo reacional se comparado com a formação do diol 63

decidiu-se modificar a estratégia para a obtenção da cetona 66.

3.1.9. Preparação do (4S)-4-hidroxi-5-metoximetoxi-pentanoato de metila (68).

Como a redução com a borana do composto 65 acima não foi eficiente,

decidiu-se então a partir do diol 63 anteriormente obtido, fazer uma proteção seletiva

na hidroxila primária com MOM (metoxi metil) e em seguida a hidroxila secundária

seria protegida com TBS (t-butil-dimetil silano) para obter a cetona 66 (Esquema

3.14) (KOCIENSKI, 1994).

MeO

MOMCl,

i-Pr

NEt

MeO

O O

ESQUEMA 3.14: Preparação de 60.

O procedimento utilizado para a preparação do composto 68 foi o descrito por

STORK & TAKAHASHI (1977) e emprega N,N-diisopropiletilamina como base e solvente

à 0

C, e o controle para a proteção seletiva da hidroxila primária foi realizado

adicionando-se o diol 63 em excesso com rendimento de 86%. Empegando estas

condições, nós obtivemos um rendimento de 40% do composto 68.

Deste modo, substituiu-se o procedimento utilizando-se o descrito por AZUMA

et al. (2003) que emprega N,N-diisopropiletilamina como base, DCM como solvente

e 0

C como temperatura reacional. O composto foi obtido com 80% de rendimento e

foi analisado por RMN

C sendo que a carbonila (C1) apresentou deslocamento de

174.95 e 96.54 ppm o C6, os carbonos carbinólicos C4, C5, C7 e C8 apresentaram

os respectivos sinais em 69.4, 68.84, 52.49, 51.50 ppm respectivamente.

A análise do espectro de RMN

H apresentou um singleto em δ 4.55 ppm

referente aos hidrogênios do carbono do grupo MOM entre os oxigênios e esse sinal

pode ser observado em 96.54 ppm para o carbono. O produto foi também analisado

por IV no qual se notou a banda da carbonila em 1770 cm

-1

e a banda da hidroxila

em 3458 cm

-1

3.1.10. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-metoximetoxi-pentanoato

de metila (69).

ESQUEMA 3.15: Preparação de 69.

A proteção com o grupo TBS foi feita empregando imidazol como base e o

produto foi obtido com 70% de rendimento. Analisou-se o composto por IV no qual

se notou o desaparecimento da banda referente à hidroxila, e um deslocamento da

banda da carbonila do material de partida (1770) para 1741 cm

-1

No espectro de RMN

C, os sinais referentes às metilas do grupo silil

apresentaram deslocamento de carbono em -4.44 e -4.85 ppm, a carbonila em 174.1

ppm, os hidrogênios ligados ao carbono do grupo silil aparecem em 0.89 ppm

integrando para 9H e 0.06 ppm integrando para 6H.

O espectro de massas (Figura 3.3) do composto apresentou fragmentações

que seriam esperadas para esse composto, tais como em m/z 187 com perda de

[OSi(CH

)

C(CH

)

], ou como em m/z 275 perda de OCH

FIGURA 3.3: Espectro de massas do composto 69.

3.1.11. Preparação do (5S)-5-(t-butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi-2-hexanona

(66).

ESQUEMA 3.16: Preparação de 66.

TBSCl,

imidazol

MeO

OMOM

MeO

OTBS

OMOM

MeLi

MeO

OTBS

OMOM

OTBS

OMOM

A reação para a formação da cetona 66 foi acompanhada através de

cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas. Observou-se o

desaparecimento do material de partida e o aparecimento de um pico com tempo de

retenção menor. Este possui fragmentações com m/z 213, que poderia ser explicado

pela perda simultânea de CH

CO e CHOCH

, e m/z 95 que poderia ser devido a

perda simultânea dos fragmentos anteriores juntamente com o [OSi(CH

)

C(CH

)

]

(Figura 3.4)

FIGURA 3.4: A) sobreposição dos cromatogramas da cetona 66 e do éster

69; B) espectro de massas da cetona 66.

Notou-se que apesar da reação formar a cetona 66, o MeLi, nucleófilo in situ,

atacava a carbonila da cetona formando assim o álcool terciário. O produto foi obtido

em 45% de rendimento. Como o emprego de MeLi não foi tão eficiente decidiu-se

empregar a metodologia descrita por ISHIZUMI et al. (1987).

3.1.12. Preparação do (5S)-5-(t-butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi-2-hexanona

(66) empregando o intermediário sulfóxido.

(S)- ou (R)-66

1) CH

SOCH

;

2) Zn/NaOH

OMOM

MeO

OTBS

ESQUEMA 3.17: Preparação de 66.

A transformação do éster 69 no sulfóxido 70, tendo como reagentes

dimetilsulfóxido e NaH, foi uma alternativa já que este poderia ser reduzido com Zn

na presença de NaOH (ISHIZUMI et al., 1987) para a formação da cetona 66.

Inicialmente ocorre a formação do ânion dimetilsulfóxido que age como

nucleófilo atacando a carbonila e formando o sulfóxido 70 (Esquema 3.18).

SOCH

MeO

OTBS

OMOM

MeO

OTBS

OMOM

SOCH

OTBS

OMOM

ESQUEMA 3.18: Mecanismo de formação do sulfóxido 70.

Os métodos químicos de reduções são de dois tipos: aquele no qual tem lugar

a adição de elétrons de um composto insaturado seguido ou acompanhado pela

transferência de prótons, e aqueles nos quais ocorre a adição do íon hidreto que em

seguida sofre protonação (CARRUTHERS, 1986). Reações que seguem o primeiro

caminho são geralmente efetuadas por um metal, a fonte de elétrons, e um doador

de prótons, que pode ser água ou um ácido. Este processo pode resultar tanto na

adição de átomos de hidrogênios na ligação múltipla ou na fissão de uma ligação

simples entre átomos, usualmente, uma ligação simples entre carbono e um

heteroátomo.

Nestas reações um elétron é transferido através da superfície do metal (ou de

um metal em solução) para a molécula orgânica a ser reduzida, formando, no caso

da adição à dupla ligação, um ânion radical, o qual em muitos casos é

imediatamente protonado. O radical resultante subseqüentemente abstrai outro

elétron do metal para formar o ânion até a finalização da reação. Na ausência de

fonte de prótons a dimerização ou polimerização do ânion-radical pode ter lugar. Em

alguns casos um segundo elétron pode ser adicionado ao ânion-radical para formar

um diânion, ou dois ânions no caso da reação de fissão. Estas transformações

podem ser representadas como mostrado na Figura 3.5.

___

A B

. ___

- ___

A B

+ B

___

ou A

. ___

___

ou A

- ___

FIGURA 3.5: Mecanismo de redução por metais.

A cetona 66, obtida com 65% de rendimento, foi analisada por IV no qual se

notou o aparecimento da banda da carbonila da cetona em 1718 cm

-1

Pela análise de RMN

H pode-se observar o desaparecimento do sinal da

metoxila em 3.67 ppm e o aparecimento de H1 em 2.16 ppm, enquanto que pela

análise de RMN

C pode-se observar o desaparecimento do sinal da metoxila em

51.50 ppm observando-se C1 em 29.84 ppm. A carbonila de cetona foi observada

em 208.56 ppm.

3.1.13. Preparação do cloreto de 2-nitrobenzoíla (71) e cloreto de 5-metoxi-2-

nitrobenzoíla (72).

ESQUEMA 3.19: Preparação do cloreto de ácido 71 e 72.

Os cloretos de ácido 71 e 72 foram obtidos a partir da reação entre o cloreto

de tionila e o ácido benzóico 39 ou 49 (NAKATSU et al., 1990). Ao final da reação, a

mistura foi destilada com hexano seco para que o excesso de cloreto de tionila fosse

eliminado como um azeótropo. O composto obtido foi utilizado bruto para a reação

posterior de preparação da amida.

39, R = H

49, R = OCH

71, R = H

72, R = OCH

SOCl

3.1.14. Preparação da N,N–dietil-2-nitrobenzamida (73) e N,N– dietil-5-metoxi-

2-nitrobenzamida (74).

ESQUEMA 3.20: Preparação das amidas 73 e 74.

A formação da amida 73 ocorreu pela substituição do cloreto pela dietilamina

e o rendimento reacional foi de 95%. Analisou-se o composto obtido e pelo espectro

de IV observaram-se as bandas em 1529 e 1348 cm

-1

referentes ao grupo nitro, em

1637 cm

-1

referente à carbonila da amida, e em 851 cm

-1

à deformação angular da

ligação C-N da amida.

Para o composto 73 a análise do espectro de RMN

H apresentou dois dd

localizados em 8.22 ppm (dd; J = 10.6, 1.0 Hz) referente ao hidrogênio presente em

C3, mostrando acoplamento orto e meta; enquanto que o hidrogênio ligado no C6

aparece em 7.42 ppm (dd; J = 2.0, 8.0 Hz).

Os hidrogênios no C4 aparecem como um td em 7.75 ppm acoplando em orto

e meta com os outros hidrogênios do anel. Os hidrogênios em C5 aparecem como

um multipleto. Os hidrogênios dos metilenos (H8 e H8’) aparecem com

deslocamento e simetria diferentes enquanto um sinal é um quadrupleto perfeito, o

outro é um sl. Isso deve estar acontecendo devido à influência do N que possui um

momento quadrupolar que pode modificar as linhas do espectro. As metilas

aparecem como dois tripletos perfeitos.

O espectro de RMN

C apresentou sinais referentes à carbonila (167.06) e

sinais referentes ao anel aromático (144.96; 134.22; 133.57; 129.43; 127.94; 124.64)

sendo que os outros sinais foram do grupo etila da amida (42.67; 38.86; 13.46;

11.89).

O composto 74 foi obtido com rendimento de 95%. Na análise de IV

observaram-se as bandas em 1462 e 1339 cm

-1

referentes ao grupo nitro, em 1650.1

-1

referente à carbonila da amida, e em 884.3 cm

-1

referente à deformação angular

de C-N.

O espectro de RMN

H apresentou um dubleto em 8.23 ppm (J=9Hz)

referente ao hidrogênio no C3, um dd em 6.99 ppm (J=9.2 e 2.8 Hz) referente ao

THF

73, R = H

74, R = OCH

(C10)

71, R = H

72, R = OCH

hidrogênio em C4 acoplando em orto e meta. A presença de um singleto confirmou a

presença da metoxila C10. Apenas um dos metilenos em C8 ou C8’ apareceu como

um sinal largo integrando para 2H, refletindo novamente a influência do N. Os

hidrogênios das metilas C9 e C9’ aparecem como dois tripletos perfeitos.

O espectro de RMN

C apresentou sinais referentes à carbonila (166.92

ppm), ao anel aromático (164.09; 137.81; 135.94; 127.18; 114.17; 112 ppm) e à

metoxila (56.05 ppm). Embora os hidrogênios do grupo metileno não foram

claramente observados no espectro de RMN

H, aqui os sinais foram intensos

(42.49; 38.76; 13.45; 11.76 ppm).

3.1.15. Preparação da 2-amino-N,N-dietilbenzamida (75) e 2-amino-N,N– dietil-

5-metoxibenzamida (76).

ESQUEMA 3.21: Preparação das aminas 75 e 76.

A transformação do grupo nitro no amino ocorreu sob H

com catálise de Pd/C

e sem a formação de subprodutos, com rendimento de 98% do composto 75.

Inicialmente fez-se um espectro de RMN

H do composto 75 sendo que

hidrogênios aromáticos aparecem como dois multipletos devido à sobreposição de

sinais, sendo um em 7.18 ppm e o outro em 6.71 ppm e cada multipleto integrando

para 2H. Os hidrogênios em C8 e C8’ dos metilenos apareceram como singletos

largos em 3.82 e 3.42 ppm, e os hidrogênios em C9 e C9’ das metilas como um

tripleto em 1.18 ppm.

O alargamento de sinais pode estar ocorrendo devido à presença de

rotâmeros ou à influência da viscosidade do solvente na amostra, por isso optou-se

por realizar experimentos de RMN com elevação da temperatura.

Fez-se inicialmente um espectro de RMN

H (400 MHz) a 298K em DMSO e

observou-se que as linhas referentes às metilas, que em CDCl

encontram-se

separadas, neste solvente houve sobreposição e formação de alargamento, e os

hidrogênios dos metilenos encontram-se sobrepostos e alargados em 3.33 ppm.

Pd/C

75, R = H

76, R = OCH

(C10)

NEt

73, R = H

74, R = OCH

Deste modo, aumentou-se à temperatura para 303K e observou-se que houve

em partes separação das linhas, ou seja, as metilas aparecem como um tripleto em

1.08 ppm integrando para 6H. Os sinais dos metilenos sobrepostos e alargados para

o sinal dos hidrogênios do NH

Em seguida, como não houve total resolução aumentou-se a temperatura

para 313K e observou-se um tripleto em 1.09 ppm para as metilas, em 3.33 ppm um

quadrupleto dos dois metilenos integrando para 4H e um singleto em 3.2 ppm

referente aos hidrogênios do NH

(Figura 3.6).

A B C

FIGURA 3.6: Análise do composto 75: A) Ampliação do Espectro de RMN

H à 298K, B) Ampliação do Espectro de RMN

H à 303K, C) Ampliação do Espectro

de RMN

H à 313K.

Observou-se que o deslocamento químico tanto dos metilenos quanto das

metilas são equivalentes e isto está de acordo com um sistema de spins que

interagem entre si, mas não são influenciados por qualquer outro núcleo fora do

sistema (SILVERSTEIN, 1994). O aumento da temperatura foi importante na separação

e resolução das linhas dos sinais, porque o solvente tornou-se menos viscoso

aumentando o tempo de relaxação da amostra, e este aumento pode ocasionar a

separação das linhas e melhorar o sinal. No entanto, sugere-se também que como a

temperatura influencia na interconversão mais rápida dos rotâmeros, possibilita a

visualização das linhas como um tripleto ou quadrupleto clássico.

No espectro de RMN

C observou-se a carbonila em C10 (170.52 ppm) e os

sinais dos C-aromáticos (144.61; 129.90; 126.74; 121.56; 117.38; 116.41); as

metilas apareceram em 13.43; 13.37 ppm respectivamente, enquanto que os sinais

dos metilenos não aparecem. Em um experimento realizado a 313K observou-se a

carbonila (169.32 ppm), os sinais dos C-aromáticos (144.92; 129.2; 126.36; 121.09;

115.53; 115.37 ppm), as metilas como um sinal em 13.24 ppm e os metilenos em

40.34 ppm sobrepostos ao sinal do DMSO.

No espectro de IV observou-se a banda em 3347 cm

-1

que se refere ao grupo

amino (NH

), e em 1617 cm

-1

a carbonila da amida.

A hidrogenação de 74 forneceu a amina 76 com o rendimento de 98%. No

espectro de RMN

H, um dd em 6.67 ppm referente ao hidrogênio no C4 foi

observado e isto pode ser confirmado devido às duas constantes de acoplamento

observadas 8.2 e 2.6 Hz que equivalem a um acoplamento orto e meta. Enquanto

que os sinais dos outros dois hidrogênios em C3 e C6 se sobrepõem não sendo

possível o cálculo das constantes de acoplamento, sendo que os sinais apresentam-

se como um multipleto em 6.59 – 6.54 ppm. A metoxila (C10) apareceu como um

singleto em 3.6 ppm enquanto que os metilenos novamente apareceram como um

singleto largo em 3.7 ppm e outro como um multipleto largo em 3.34 – 3.32 ppm. As

metilas se mostraram como um tripleto.

Novamente um estudo para os experimentos de RMN

H (400 MHz) em

DMSO com a utilização de temperatura foi realizado. A 298K observou-se para os

hidrogênios aromáticos um duplo dubleto em 6.73 ppm integrando para 1H (H4), um

dubleto em 6.67 ppm para 1H (H6), e outro dubleto em 6.54 ppm para 1H (H3), um

singleto em 3.64 ppm foi observado para a metoxila, um sinal alargado em 3.33 ppm

foi observado para os hidrogênios metilênicos e do NH

, outro sinal alargado foi

observado em 1.08 ppm referente às metilas (Figura 3.7).

Com o aumento da temperatura para 303K observou-se um tripleto em 1.08

ppm referente as metilas, separando e resolvendo as linhas, em 3.30 um singleto foi

observado para os hidrogênios metilênicos e do NH

. Com a elevação da

temperatura para 313K ocorreu a separação dos sinais referentes aos metilenos

aparecendo como um quadrupleto em 3.33 ppm e um singleto em 3.20 ppm

referente aos hidrogênios do NH

O aumento da temperatura faz com que o solvente torne-se menos viscoso,

assim aumenta o tempo de relaxação da amostra e com isso os sinais tornam-se

mais finos ocorrendo uma melhor resolução e a interconversão mais rápida dos

rotâmeros com o aumento possibilita a melhor separação das linhas em tripletos e

quadrupletos clássicos (Figura 3.7).

A B C

FIGURA 3.7: Análise do composto 76: A) Ampliação do Espectro de RMN

H à 298K, B) Ampliação do Espectro de RMN

H à 303K, C) Ampliação do Espectro

de RMN

H à 313K.

No espectro de RMN

C observa-se a carbonila (170.06 ppm), os sinais dos

C-aromáticos (151.78; 137.88; 122.87; 117.79; 116.23; 111.87 ppm), a metoxila

(55.71 ppm) e as metilas aparecem na região 13.46 ppm, enquanto que os sinais

dos metilenos novamente não aparecem.

No espectro de IV observou-se a banda em 3437 cm

-1

que se refere ao grupo

amino (NH

), a banda em 1625 cm

-1

referente à carbonila da amida.

3.1.16. Estudo para a obtenção de (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il)-butan-

2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (53), (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il)-

butan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxibenzamida (54)

Inicialmente as benzamidas 75 e 76 foram reagidas com a S-52 empregando

ácido p-toluenossulfônico como catalisador, segundo procedimento descrito por

NAKATSU et. al. (1990), mas observou-se uma certa instabilidade da S-52 frente ao

meio ácido utilizado, obtendo-se sempre uma mistura complexa de produtos. Deste

modo, outro procedimento foi testado a fim de melhorar os rendimentos desta

reação, com orto-formato de trimetila como solvente e agente desidratante (LOOK et

al., 1995) (Tabela 3.3).

NEt

53, R = H

54, R = OCH

NEt

75, R = H

76, R = OCH

p-TsOH

(S)-52

ESQUEMA 3.22: Preparação das iminas 53 e 54.

Nas reações onde se obteve produtos fez-se coluna flash e separaram-se as

frações, mas em nenhuma das frações analisadas observou-se o produto desejado.

A análise de IV também não foi conclusiva, pois nenhuma banda característica havia

sido detectada.

Acredita-se que obtenção de co-produtos seja devido ao fato da cetona 52 ser

instável em meio ácido podendo sofrer degradação.

TABELA 3.3: Condições experimentais para a preparação das iminas 53 e 54.

M. P. (mg)

75 76

T (h)

1 130

2 189

3 120

4 558

5 645

ácido p-toluenossulfônico (0.15 eq)

e tolueno como solvente;

em todas as reações a S-52 foi utilizada;

TMF: orto-formato de trimetila como solvente e agente

desidratante

3.1.17. Estudo para a obtenção de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-

metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (77), (E)-2-(5-(t-

butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxi

benzamida (78).

77, R = H

78, R = OMe

NEt

75, R = H

76, R = OMe

(S)-66

OTBS

OMOM

NEt

OMOM

OTBS

ESQUEMA 3.23: Preparação das iminas 77 e 78.

Vários testes foram realizados a fim de se obter as iminas 77 e 78 como

mostrado na Tabela 3.4.

TABELA 3.4: Condições reacionais para preparação das iminas 77 e 78 a partir

da cetona 66.

Amina

TsOH

(eq)

TMF

(mL)

Tol.

(mL)

Bz.

(mL)

DCM

d, e

(mL)

1 75 0.05 - 3

- -

2 75 - 3

- - -

2 75 - 3

- - -

1 75 0.05 - 3

- -

3 75 - 2

f,h

- - -

4 76 - - - - 3

2 76 - 3

- - -

3 76 - 2

f,h

- - -

5 76 - -

f,g

- -

6 76 - 3

f,g

7 76 - 3

f,h

- -

Tempo reacional 48 – 72 horas de agitação;

orto formato de trimetila;

tolueno,

benzeno,

diclorometano,

secante: MgSO

anidro,

refluxo,

refluxo

usando sistema Dean Stark,

secante: peneira molecular 4 Å, 8 – 12

mesh

Como em nenhum dos testes realizados foi obtido o produto desejado, testou-

se outra metodologia descrita por KELLER et al. (2003), que emprega sílica flash,

alumina e peneira molecular como secantes e cicloexano como solvente (Tabela

3.5).

TABELA 3.5: Preparação das iminas 77 e 78 a partir da metodologia de Keller

(2003).

Teste

Amina

Cicloexano

(µ

µµ

µL)

Benzeno

(µ

µµ

µL)

1 75 74 -

2 75 - 74

3 76 - 74

secantes: sílica gel Merck 230 – 400 mesh, peneira

molecular 5 Å, 35 – 70 mesh (para cromatografia

gasosa), óxido de alumínio (básico) Brockmann I;

a troca de solvente por benzeno foi devido à baixa

solubilidade dos reagentes em cicloexano.

Novamente em nenhum dos testes foi obtida a imina desejada. O teste

realizado com a amina 76 foi analisado através de espectrometria de massas,

utilizando a técnica de electrospray com carga positiva, assim pode-se fazer um full

scan do material obtido e verificar a formação da imina 78. Neste caso seria obtida a

massa molecular do composto M +1.

222.29

290.48

CONEt

494.75

CONEt

FIGURA 3.8: Massa molecular dos reagentes 76, 66 e imina 78.

090104

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

m/z

100

patPaicOMe 108 (2.416) Scan ES+

1.55e6

223.2

223.1

222.7

149.7

101.5

445.7

286.2

224.6

225.5

353.1

567.8

446.7

495.6

589.8

590.5

FIGURA 3.9: Espectro de massas da reação de formação da imina 78.

Pela análise do espectro de massas pode-se verificar que ocorreu uma

pequena formação da imina 78, entretanto notou-se uma grande quantidade da

amina 68 o que comprova o baixo rendimento.

Todos os cuidados em relação às condições experimentais foram levados em

consideração (vidraria anidra, solventes recentemente tratados e atmosfera inerte).

No entanto, acredita-se que a não formação das iminas pode estar

relacionada com o impedimento estérico causado pela presença dos dois grupos etil

na amida, dificultando a aproximação do grupo cetona na amina e formação da

imina.

Para que esta dúvida fosse sanada decidiu-se preparar materiais de partida

menos impedidos para a preparação das iminas 79 e 80, tendo como reagentes as

aminas 81 e 82 (Esquema 3.24).

OMOM

OTBS

, MeOH

secante, solvente

39, R=H

49, R=OCH

81, R=H

82, R=OCH

79, R=H

80, R=OCH

83, R=H

84, R=OCH

OMOM

OTBS

ESQUEMA 3.24: Preparação da imina 79 e 80.

3.1.18. Preparação do 2-nitrobenzoato de metila (83) e 2-nitro-5-

metoxibenzoato de metila (84).

, MeOH

39, R=H

49, R=OMe

83, R=H

84, R=OMe

ESQUEMA 3.25: Preparação de 83 e 84.

A reação foi realizada através do refluxo dos ácidos 39 e 49 na presença de

metanol em meio ácido (H

). A formação de 83 foi confirmada por IV pelo

desaparecimento da banda da hidroxila e aparecimento da banda de éster em 1737

-1

. O espectro de RMN

H apresentou um singleto em 3.93 ppm integrando para 3

hidrogênios referente a metoxila do éster. A carbonila do éster apresentou

deslocamento em 166.55 ppm no RMN

O composto 84 apresentou a banda do éster em 1737 cm

-1

no IV. O espectro

de RMN

H apresentou um singleto em 3.94 ppm integrando para 3 hidrogênios

referente à metoxila do éster enquanto que a carbonila do éster apresentou

deslocamento em 165.76 no RMN

C com 80% de rendimento.

3.1.19. Preparação de 2-aminobenzoato de metila (81) 2-amino-5-

metoxibenzoato de metila (82).

Pd/C

81, R=H

82, R=OCH

83, R=H

84, R=OCH

ESQUEMA 3.26: Preparação de 81 e 82.

A reação foi realizada através da redução de 83 e 84 sob atmosfera de H

Pd/C para a formação de 81 e 82 respectivamente, com 90% de rendimento. A

preparação de 81 pode ser confirmada através da análise de IV o qual em 3481 e

3371 cm

-1

apresentou a banda característica referente ao NH

e o grupamento éster

foi verificado em 1695 cm

-1

. Enquanto que 82 apresentou bandas em 3479 e 3371

-1

referente ao NH

e o grupamento éster foi verificado em 1695 cm

-1

por IV.

O espectro de RMN

H para o composto 81 apresentou um singleto em 3.87

integrando para 3 hidrogênios referente à metoxila do éster. A carbonila do éster

apresentou deslocamento em  168.50 ppm no RMN

Para o composto 82 o espectro de RMN

H, apresentou um dubleto com

deslocamento entre 6.64 ppm e J = 8.0 Hz correspondente a H

, enquanto que H

apresentou um dd com deslocamento em 6.96 ppm com J = 2.0 e 8.0 Hz, e H

novamente um d com deslocamento em 7.35 ppm com J = 2.0Hz. No RMN

C a

carbonila do éster apresentou deslocamento em 168.21 ppm.

3.1.20. Preparação de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-(metoximetoxi)-hexan-2-

ildeamino) benzoato de metila (79) e (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-

(metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-5-metoxibenzoato de metila (80).

79, R=H

80, R=OCH

OTBS

secante, solvente

OTBS

81, R=H

82, R=OCH

ESQUEMA 3.27: Preparação de 79 e 80.

A metodologia empregada foi a descrita por KELLER et al. (2003) e após 12

horas de reação uma alíquota da reação de 82 e 66 foi analisada por espectrometria

de massas e pode-se obter o seguinte espectro de massas dos íons moleculares +1,

obtidos através da técnica de electrospray (Figura 3.10).

090104

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

m/z

100

patPaIEMe 94 (2.105) Scan ES+

3.14e5

454.5

149.9

102.3

130.0

182.1

396.5385.4

242.4

222.8

343.0

313.3

424.9

FIGURA 3.10: Espectro de massas da reação da imina 80.

181.19

MeO

TBSO

290.48

OTBS

MeO

453.65

FIGURA 3.11: Massa molecular de 82, 66 e 80.

Como se pode verificar neste caso a imina 80 estava sendo formada devido

ao pico do íon molecular m/z 454 (E+) presente no espectro de massas, sendo que

existe pouca quantidade da amina 82. Fez-se uma coluna cromatográfica para

purificação de 80 e notou-se que o material se degradou. Deste modo, repetiu-se a

reação com as duas aminas 81 e 82 e ao final da reação evaporou-se o solvente e

utilizou-se os materiais brutos para a etapa seguinte com o LDA.

Após um longo período de estudos para a obtenção das iminas a metodologia

descrita por KELLER et al. (2003) foi a que se mostrou mais eficiente, podendo-se

verificar que a obtenção das iminas 81 e 82 só foi possível sem purificação através

de métodos convencionais, que causava a degradação do material. Deste modo, a

solução reacional foi filtrada através de algodão para a retirada da sílica e da peneira

molecular e o solvente evaporado e a amostra era mantida sob atmosfera de N

até

a utilização na reação posterior.

A caracterização do produto seria realizada apenas na etapa seguinte devido

à instabilidade da imina. Deste modo, aumentou-se a escala reacional a fim de se

obter maiores quantidades das iminas para a realização da etapa posterior de

ciclização intramolecular utilizando LDA como base para a obtenção dos compostos

quinolinonas 85 e 86.

3.1.21. Preparação dos compostos, 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-4-quinolinona (85) e 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-6-metoxi-4-quinolinona (86).

LDA

81, R = H

82, R = OMe

NEt

OMOM

OTBS

OMOM

OTBS

85, R = H

86, R = OMe

ESQUEMA 3.28: Preparação das quinolinonas 85 e 86.

Inicialmente preparou-se o LDA e em seguida adicionou-se as iminas 81 ou

82 dissolvidas em THF. Após o término da reação retirou-se uma alíquota do

material bruto e fez-se uma análise de espectrometria de massas e obteve-se um

pico com m/z 392 referente ao composto 85. Para verificar se este pico realmente

era a quinolinona desejada fez-se uma análise dos íons filhos variando-se a

intensidade de energia fornecida a molécula e pode-se verificar que com 10 eV

houve uma pequena fragmentação, com m/z 260 e m/z 360. Entretanto com a

energia de 20 eV esses picos se intensificaram e com 30 eV houve fragmentação

total da amostra para o pico em m/z 260. Esta fragmentação é referente à perda de

uma metoxila, presente no grupo protetor MOM (Figura 3.12).

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

m/z

100

LDA_2101_DI_pos 18 (1.016) 3: Daughters of 392ES+

2.22e3

260.4

254.5

330.8

274.4

360.9

LDA_2101_DI_pos 19 (1.052) 2: Daughters of 392ES+

8.07e3

260.5

360.8

392.8

LDA_2101_DI_pos 24 (1.309) 1: Daughters of 392ES+

2.28e4

392.7

FIGURA 3.12: Espectro de massas dos íons filhos do composto 85.

Como observado na análise inicial a quinolinona 85 pode ser obtida

empregando a metodologia descrita por NAKATSU et al. (1990), no entanto a barreira

que se encontrava neste momento era referente à etapa de purificação. A reação

realizada com LDA formou vários sub-produtos o que impossibilitava tanto o

isolamento quanto um rendimento interessante. Este fato deve ser levado em

consideração, pois etapas importantes ainda seriam estudadas o que poderia

diminuir ainda mais o rendimento global da síntese tornando-a inviável

sinteticamente.

O emprego da metodologia descrita por NAKATSU et al. (1990) demandou um

estudo mais aprimorado para a formação das iminas 81 – 82, mesmo tendo obtido o

85 a metodologia não se mostrou interessante em um estudo de síntese total dos

alcalóides 16 e 18.

Deste modo, embora todos os obstáculos até a obtenção do composto 85

tivessem sido vencidos, optou-se pela modificação da metodologia sintética, devido

a essas dificuldades encontradas até então. A nova proposta para a obtenção dos

compostos 16 e/ou 18 foi baseada na simplificação da formação do anel 4-

quinolinona, o que além de ser mais interessante também forneceria intermediários

sintéticos para iniciar os testes enzimáticos de modo mais rápido que a metodologia

anterior, já que não se trata de uma síntese convergente.

3.2. Modificação da estratégia de acoplamento para a obtenção dos

alcalóides.

Como a proteção do nitrogênio das quinolinonas 117 e 118 não ocorreu com

sucesso, decidiu-se fazer uma pequena modificação da síntese empregando o

produto O-alquilado, já que se sabe da facilidade com que as quinolinonas

favorecem a O-alquilação e neste momento resolveu-se trabalhar apenas com o

produto metoxilado, a fim possibilitar a preparação do alcalóide 18, para confirmar a

estrutura e a configuração absoluta.

A rota sintética baseou-se na preparação de 130 e/ou 131 como apresentado

no Esquema 3.48, sendo que se variar a posição do Organometálico entre R

ou R

tem-se a possibilidade de obter os dois enantiômeros (Esquema 3.49) partindo do

mesmo material de partida S-126 do Esquema 3.48.

1) PMB-Br, NaH

2) H

3) TBSCl, imi.

4) MsCl, py

S-126

127

TBSO OPMB

OMs

128

1) Br

, PPh

2) e/ou cupratos

MgBr

129

130, R

= MgBr

, R

= OPMB

131, R

= OTBS

, R

= MgBr

e/ou

cupratos

127 + 129

OPMB

OTBS

125

TBAF - 130

ou CAN - 131

ESQUEMA 3.29: Obtenção de 130 e 131

3.2.1. Preparação do cis-1-bromo-3-hexeno 136

128

136

, PPh

ESQUEMA 3.30: Obtenção de 136

O brometo 136 foi preparado com 70% de rendimento. A metodologia

empregada baseia-se na substituição do grupo hidroxila por um haleto na presença

de duplas ligações, empregando-se Br

e PPh

(CAREY & SUNDERBERG, 1990) como

descrito anteriormente no Esquema 3.35. A caracterização de 136 foi realizada

através de RMN

H e

C. O sinal em 3.36 ppm no espectro de hidrogênio refere-se

ao metileno ligado ao heteroátomo, enquanto que este carbono apresentou

deslocamento em 20.68 ppm.

3.2.2. Preparação do (4S)-4-(metoxibenziloximetil)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano

(137)

S-126

PMB-Br, NaH

OPMB

S-137

ESQUEMA 3.31: Obtenção de 137

O composto 137 pode ser obtido através da reação de proteção da hidroxila

primária com PMB-Br e NaH, obtendo-se o produto bruto em 50% de rendimento.

Como este apresentou certa volatilidade decidiu-se empregá-lo na reação posterior

sem outras purificações.

3.2.3. Preparação do (2R)-3-(4-metoxibenziloxi)-propano-1,2-diol (138)

OPMB

S-137

R-138

OPMB

ESQUEMA 3.32: Obtenção de 138

O material bruto 137 foi desprotegido utilizando HCl 10 % em THF. Pode-se

comprovar a desproteção do grupo isopropilideno através de RMN

H já que os

sinais referentes às metilas do grupo não foram observadas. Observou-se os sinais

referentes aos H-aromáticos em 7.25 – 7.23 e 6.88 – 6.86 ppm como multipletos, o

singleto da metoxila em 3.79 e os 5H ligados aos carbonos carbinólicos apareceram

na região ~3 ppm. Obteve-se o composto 138 com rendimento de 50%.

3.2.4. Preparação do 1-t-butildimetilsililoxi-3-(4-metoxibenziloxi)-propan-2-ol

(139)

S-138

OPMB

TBSCl,

imidazol

S-139

OPMB

TBSO

ESQUEMA 3.33: Obtenção de 139

Para a escolha do grupo protetor levou-se em consideração a facilidade tanto

em termos de proteção como de desproteção, devido a outros grupos protetores que

estarão presentes no composto. Deste modo, optou-se por utilizar o cloreto de t-

butildimetilsilil, que é um grupo volumoso e de certo modo poderia também

influenciar na etapa de acoplamento da cadeia lateral. Ele é ainda um grupo que

pode ser facilmente retirado em condições brandas, sem prejudicar o grupo PMB.

A base escolhida neste caso foi imidazol, pois esta se complexa com o grupo

silil possibilitando o ataque mais efetivo da hidroxila. Obteve-se 139 com 70% de

rendimento.

No espectro de RMN

H notou-se o aparecimento de dois singletos em 0.069

e 0.88 ppm referentes aos hidrogênios das metilas ligadas ao silício e ao t-butil do

grupo protetor. O baixo valor de deslocamento químico é devido a menor

eletronegatividade do silício que desprotege os átomos diretamente ligados a ele.

3.2.5. Preparação do (1R)-2-t-butildimetilsililoxi-1-(4-metoxibenziloximetil)-etil

metanossulfonato (127)

MsCl

S-139

OPMB

TBSO

S-127

OPMB

MsO

TBSO

ESQUEMA 3.34: Obtenção de 127

Para a escolha do grupo mesilato como grupo abandonador levou-se em

consideração dois fatores: o estérico e a estabilidade do grupo abandonador.

A preparação do mesilato foi comprovada através da análise de RMN

H, que

mostrou os hidrogênios da metila no grupo sulfonato em 2.98 ppm, além dos

hidrogênios do grupo silil (0.88 e 0.069 ppm) e o grupo PMB (7.24 e 6.89 ppm). O

espectro de RMN

C apresentou deslocamento em 38.33 ppm referente a metila do

grupo metanossulfonato. O composto 127 foi obtido com rendimento de 70%.

Embora o mesilato 127 tenha sido obtido, o rendimento global não se mostrou

muito satisfatório, além disso, algumas etapas subseqüentes são necessárias para a

obtenção de 130 e 131. Uma alternativa na tentativa de aumentar o rendimento

reacional seria a modificação dos grupos protetores, já que como observado o PMB-

Br formou muitos produtos indesejáveis.

Apesar das dificuldades terem sido de certo modo contornadas, o estudo da

rota sintética proposta acima não pode ser concluído. A aluna foi contratada em

outro instituto pesquisa, o que impossibilitou além da conclusão da síntese a

completa caracterização dos intermediários 138 e 139.

Observou-se que no estudo empregando a metodologia descrita por EDMONT

et al. (2000) os intermediários puderam ser obtidos com maior facilidade, no entanto

reações que a princípio não seriam trabalhosas mostraram comportamentos

diferenciados, tal como na preparação do reagente de Grignard do composto 95 e a

formação do mesilato 106. Acredita-se que este comportamento seja devido a

posição alílica na estrutura base dos compostos 93 – 94.

3.3. Preparação dos Derivados O-Alquil Quinolínicos

A fim de aumentar as informações sobre a relação estrutura-atividade dos

derivados quinolínicos frente a diversas atividades biológicas preparou-se os

compostos 91 – 94 (Esquema 3.35).

R = H e/ou OMe

= COOMe,

R = H e/ou OMe

= COOMe

= Me, Et

DMF, K

MeI e/ou EtBr

91 - 94

91 - 94 derivados

ESQUEMA 3.35: Metodologia empregada para a obtenção dos derivados O-

alquil quinolínicos.

Foram avaliadas nos ensaios biológicos também duas quinolinonas

comerciais, 140 (ácido 4-metoxi-2-quinolinacarboxílico) e a ciprofloxacina (ácido 1-

ciclopropil-6-fluoro-1,4-diidro-4-oxo-7-(1-piperazinil)-3-quinolinacarboxílico) (141),

uma fluoroquinolinona cuja atividade antibiótica tem sido muito descrita (Figura 3.15)

(BIANCIARDI et al., 2004).

OCH

140

141

FIGURA 3.13: Quinolinonas 140 e 141.

A preparação dos derivados quinolinícos 91 – 94 (Figura 3.16) foi simples

ocorrendo através de uma reação rápida e limpa, utilizando como solvente DMF e

como base e dependendo do produto desejado utilizou-se os agentes

alquilantes BrEt ou MeI (EDMONT et al., 2000). O equilíbrio é deslocado para formar o

produto O-alquilado, sendo que a regiosseletividade depende de fatores tais como

estrutura do haleto de alquila, substituintes do anel e o solvente (COMINS & JIANHUA,

1994). Todos os compostos foram obtidos empregando-se a mesma condição

reacional e os rendimentos foram de moderados a bons (60 – 80%).

OCH

91-1

91-2

92-1

92-2

FIGURA 3.14: Derivados quinolínicos sintetizados.

A caracterização dos compostos foi realizada através de RMN

H e

C e IV.

TABELA 3.6: Dados espectroscópicos dos compostos 91-1, 91-2, 92-1, 92-

2, 94-1 e 94-2.

Composto H e C RMN

H (ppm) RMN

C (ppm)

3 7.60 100.14

5 7.81 – 7.77 121.73

7 7.84 – 7.58 149.11

8 8.26 – 8.21 163.32

1 91-1

11 4.14 56.08

3 7.56 100.66

5 7.62 – 7.54 121.85

7 7.64 – 7.58 149.08

8 8.28 – 8.19 162.61

2 91-2

11 4.07 64.83

3 7.58 99.44

5 7.46 – 7.45 123.21

7 7.41 – 7.38 159.03

8 8.13 – 8.11 162.03

3 92-1

11 4.12 55.99

3 7.55 99.61

5 7.46 – 7.46 123.02

7 7.40 – 7.37 158.91

8 8.13 – 8.10 161.29

4 92-2

11 4.06 64.53

5 94-1 3 7.13 99.45

5 7.48 – 7.47 123.83

7 7.37 – 7.31 159.22

8 7.83 – 7.78 164.35

11 4.11 56.89

6 94-2 3 7.06 99.72

5 7.43 – 7.42 122.52

7 7.35 – 7.30 157.41

8 7.80 – 7.75 162.11

11 4.37 – 4.26 64.91

Com os compostos em mãos iniciou-se o estudo da atividade biológica.

3.4. Estudo da atividade leishmanicida

Os dados de literatura revelam que o composto 16 apresentou uma boa

atividade frente a formas promatisgotas de L. amazonensis e L. braziliensis (25

g/mL, 88 M) (LAVAUD et al., 1995). O composto 18 também apresentou uma alta

atividade em testes realizados com formas amastigotas de L. amazonensis, sendo

84% e 58% de inibição a 50 e 25 g/mL respectivamente (SARTOR et al., 2000).

Deste modo, o estudo para se determinar a atividade leishmanicida da

coleção preparada foi feito com diferentes tipos de ensaios. Os compostos foram

avaliados frente à enzima APRT (adenina-fosforribosil-transferase) de L. tarentolae

(AMBROZIN et al., 2005), em seguida tiveram sua atividade medida frente a formas

promastigotas de L. major, L. amazonensis e L. braziliensis.

Os compostos selecionados para serem ensaiados frente à enzima APRT de

L. tarentolae foram 91 – 94 e seus derivados. Os testes foram realizados no Instituto

de Física de São Carlos – USP em colaboração com o Prof. Dr. Otávio H. Thiemann.

Apenas os compostos 85, 86 e 85-2 apresentaram interessantes atividades de

inibição (82%, 93% e 69% respectivamente) a 100 M; em outras concentrações (25

e 50 M) os compostos não foram ativos.

Os compostos avaliados frente a formas promastigotas de L. major são

descritos na Tabela 3.7 e Tabela 3.12. O teste é um indicativo da potencialidade dos

compostos por ser simples, já que não emprega o uso dos macrófagos. No entanto,

se algum composto apresentar uma atividade interessante poderá ser ensaiado com

macrófagos.

Atualmente, culturas de promastigotos de Leishmania têm sido quantificadas

in vitro por um método enzimático que envolve a conversão do sal de tetrazolium, o

MTT [3 -(brometo de 4,5-dimetiltiazol-2-il) tetrazolium] em um complexo colorido, que

é medido espectrofotometricamente. O método é baseado no MTT, um composto

hidrossolúvel com coloração amarelo pálido, que é rapidamente incorporado pelas

células viáveis que reduzem o composto em suas mitocôndrias pela ação de

desidrogenases, formando um composto, o formazan, de coloração azul escuro,

insolúvel em água que permanece no citoplasma. Desta forma a quantidade de

formazan é diretamente proporcional ao número de células viáveis. Para medir a

quantidade de formazan os parasitas devem ser lisados com DMSO ou álcool, o que

torna impossível medições repetidas da mesma cultura (BERNHARD et al., 2003).

O método pode ser baseado em um novo substrato, o MTS [3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetonifenol)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium], que é

convertido em um complexo colorido solúvel, similar ao formazan, pela

desidrogenase da mitocôndria do parasita. Com isso não se faz necessário a lise da

célula para que o produto colorido esteja livre no meio. O método com MTS tem se

mostrado preciso e simples de se efetuar. Uma vantagem adicional desse método é

o curto período de incubação com resultados a partir da adição de um agente

acoplador de elétrons, o PMS, para acelerar a redução do substrato.

Este ensaio, que pode ser analisado espectrofotometricamente em leitor de

microplacas, apresenta-se vantajoso na avaliação de citotoxidade, proliferação ou

ativação celular, uma vez que o mesmo pode ser executado de forma semi-

automatizada.

Os ensaios foram analisados em 48 e 72h de incubação das formas

promastigotas de L. major. Cada composto foi ensaiado em quadruplicata e em 3

diferentes concentrações 50, 25, 10 g/mL. Os experimentos foram realizados em

uma placa de 12 poços, divididos em Controle que é apenas o meio de cultivo com

as células, e um controle com o solvente utilizado para a diluição das amostras,

neste caso o DMSO. Sabendo-se da toxicidade deste solvente determinou-se em

testes anteriores que 10 L de DMSO não interferiria na medida.

Após os dados coletados iniciaram-se os cálculos a fim de se determinar a

inibição de cada composto. No entanto, observou-se, diferentemente do esperado,

que o DMSO inibiu em torno de 14% a 25%. A explicação para esta observação

ainda não é muito clara já que o DMSO pode estar competindo com o inibidor no

interior da célula, ou nos testes anteriores não foi possível detectar esta inibição, ou

algum outro fator ainda desconhecido.

Por esse motivo para realizar os cálculos de inibição teve-se que assumir o

DMSO como sendo o controle.

O que se observou foi que embora para alguns inibidores a atividade não foi a

mínima esperada (a apresentada pelo DMSO), outros apresentaram boas atividades

inibitórias como pode ser visto nas Tabelas 3.11 a 3.12.

TABELA 3.7: Porcentagem de inibição frente a formas promastigotas de L. major com

48h de incubação.

Compostos % de inibição com 48h

g/mL

91 4 32 22

91-1 -11 8 3

91-2 27 12 27

92 45 58 46

92-1 11 -13 -19

92-2 28 -20 -15

93 -19 -10 -28

94 40 8 13

94-2 33 10 -2

140 -14 1 25

Tabela 3.8: Porcentagem de inibição frente a formas promastigotas de L.

major com 72h de incubação

Composto % de inibição com 72h

g/mL

91 8 28 -15

91-1 11 12 -2

91 57 2 5

92 40 54 20

92-1 50 -14 -9

92-2 27 -54 -52

93 -16 -31 3

94 30 36 10

94-2 60 41 6

140 -3 13 4

Neste primeiro experimento considerou-se que uma inibição superior a 40%

seria um valor interessante, já que o DMSO influenciou nas medidas. Assim pode-se

dizer que os melhores resultados foram para 94, 92, 95, 91-2, 92-1 e 94-2.

Tendo em mãos essas informações sobre os compostos mais ativos neste

ensaio, enviou-se os mesmos e outros compostos para a Profa. Izabel Ferreira da

Universidade de Maringá em um trabalho de colaboração. Os compostos foram

avaliados frente a formas promastigotas de L. amazonensis. Os compostos que

puderam ser estudados até o momento são os descritos na Figura 3.15 abaixo.

OCH

142

OCH

140

141

FIGURA 3.15: Compostos ensaiados frente à L. amazonensis 140 e 142 e

L. brasiliensis 92 e 141.

O composto 92 possui ED

/24h > 320 g/mL, portanto apresentou baixo

potencial leishmanicida. No entanto, o composto 142 apresentou DL

157g/mL

demonstrando uma atividade significativa. O composto 141 apresentou um DL

320g/mL inibindo apenas 12,8 % o crescimento das formas promastigotas (Figura

3.18).

O composto 140 inibiu 33,6 % o crescimento das formas promastigotas com

> 320g/mL. Este composto teve uma atividade melhor que 141, porém inferior

ao 142

-50

100

0 20 40 80 160 320

[

µµ

g/mL]

(%)Inibicao

92 142 141 140

FIGURA 3.16: Atividade leishmanicida

O que se pode notar em termos estruturais é que os compostos metoxilados

no anel aromático 92 e 142 foram mais ativos, no entanto a quinolina contendo dois

grupos etoxilas foi a mais ativa 142 frente a L. Amazonensis.

Tendo-se em mãos os compostos iniciou-se o estudo frente a outros alvos

biológicos.

3.5. Estudos frente à enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) de

Schistosoma mansoni

A esquissotomose é um grande problema de saúde pública no mundo

desenvolvido. É endêmica em 76 países e está na escala das doenças parasíticas

depois da malária em termos de impactos econômicos e sociais e de importância

para a saúde pública. A enzima PNP catalisa a clivagem da ligação glicosídica de

ribonucleosideos e deoxiribonucleosideos de guanina, hipoxantina e um número de

nucleotídeos relatados serem congêneres, na presença de fosfato inorgânico como

um segundo substrato para gerar base purina e ribose(deoxiribose)-1-fosfato, sendo

que esta participa no caminho de recuperação de purina em S. mansoni.

É conhecido que os parasitas diferentemente dos hospedeiros mamíferos,

não tem a capacidade de sintetizar purino nucleotídeos de novo e dependem

exclusivamente do caminho de recuperação, sugerindo que um componente nesta

enzima possa representar um potencial alvo para novos quimioterápicos. Deste

modo, a enzima PNP foi isolada (PEREIRA et al., 2005) tornando possível a busca por

ligantes.

Em colaboração com o Prof. Dr. Adriano D. Andricopulo do Instituto de Física

de São Carlos da Universidade de São Paulo, alguns compostos foram ensaiados e

suas atividades são mostradas na Tabela 3.9.

TABELA 3.9: Valores de inibição frente à PNP

Amostra Inibição (%) 200M

1 91 39

2 92 43

3 93 42

4 94 --

5 140 42

Os ensaios cinéticos são baseadas na reação catalisada pela PNP:

Inosina + P

Hipoxantina + ribose-1-fosfato

PNP

A medida da atividade da PNP requer o uso de um ensaio combinado, onde

numa reação subseqüente, a hipoxantina é convertida pela ação da enzima xantina

oxidase (X.O.) em ácido úrico, que absorve a radiação ultravioleta em 293 nm.

Portanto, pela medida da taxa de formação de ácido úrico, é possível medir a

atividade da PNP.

Hipoxantina Ácido Úrico (293 nm)

Xantina

Oxidase

O meio reacional para a realização do ensaio consiste de 50 mM tampão

fosfato composto por soluções de fosfato mono e dibásico; 10 µM inosina; 100 mM

tampão TRIS-HCl; 0,04 U xantina oxidase; DMSO (solvente); e uma concentração

padrão da substância química candidata a inibidor. Conforme descrito anteriormente,

a reação é monitorada através de medidas de velocidade inicial a um comprimento

de onda de 293 nm em um espectrofotômetro UV-Visível em um tempo ideal de 2

minutos.

Neste ensaio os compostos apresentaram atividade moderada sendo que não

foi possível medir a atividade do composto 94 já que este apresentou absorção no

mesmo comprimento de onda.

3.6. Atividade fitotóxica

As plantas daninhas sempre foram conhecidas como um dos mais

sérios limitantes à produção agrícola. O controle destas espécies é geralmente

realizado através de métodos mecânicos ou químicos, muitas vezes com

conseqüências deletérias para o meio ambiente, à saúde humana e animal (ROBBS,

1999).

As plantas daninhas interferem sobre as plantas cultivadas por competição

com luz, água, nutrientes, parasitismo e como hospedeiros de pragas e doenças.

Em 1942, Zimmerman & Hitchock, nos EUA, descobriram o 2,4-D (ácido 2,4-

diclorofenoxiacético). Este herbicida é a base de muitos outros produtos sintetizados

em laboratório e marcou o início do controle químico de plantas daninhas em escala

comercial.

Quanto ao mecanismo de ação, os herbicidas podem ser classificados em:

reguladores de crescimento; inibidores do crescimento; inibidores da fotossíntese,

formadores de radicais livres, etc.

Dentre esses, os herbicidas inibidores da fotossíntese são um dos mais

importantes em todo o mundo, sendo amplamente empregados na agricultura

brasileira nas culturas de milho, cana-de-açúcar, soja, fruteiras, hortaliças, entre

outras. Pode-se citar como características principais destes produtos quando atuam

sobre as espécies alvo: a taxa de fixação de CO

declina poucas horas após o

tratamento; não apresentam problemas de deriva por volatilização, pois possuem

pressão de vapor baixa; todos estes herbicidas apresentam baixa toxicidade para

mamíferos, etc (SILVA et al., 2001).

A fotossíntese é essencial para o desenvolvimento autotrófico das plantas.

Consequentemente, as funções fotossintéticas são sítios atrativos para o ataque de

herbicidas. Tradicionalmente, a fotossíntese é convencionalemte dividida em 2

processos: o não dependente de luz para assimilação de carbonos, que ocorre nas

fases solúveis da célula, e o de transdução de energia dependente de luz que está

associado com as membranas de tilacóide responsáveis pelo fornecimento de ATP e

redutores para assimilação de carbono (PERCIVAL & BAKER, 1991).

O metabolismo assimilatório fotossíntético é dependente da transdução de

energia química luminosa (ATP) e a liberação de elétrons para a redução química

pelas membranas de tilacóide. Foi provado que a inibição dos sistemas de

transporte de elétrons fotossintético e de transporte de prótons são o modo de ação

de mais de 50 % dos herbicidas conhecidos. Os tilacóides de plantas superiores

contêm 5 complexos intrínsecos supramoleculares (FSII, FSI, o complexo clorofila

a/b associado com FSII, o complexo citocromo b

f e o componente CF

do fator de

acoplamento) e são associados com um número extrínseco de proteínas, tais como

a plastocianina, ferridoxina e o complexo CF

do fator de acoplamento. A luz é

capturada pelas antenas dos 2 fotossistemas, e transferida aos respectivos centros

de reação de FSI e FSII (P

700

e P

680

), onde se produz uma separação de carga

primária, que resulta na redução de aceptores de elétrons secundários e

consequentemente oxidação de água e redução do terminal de aceptores de

elétrons (ferridoxina, NADP e O

). A transferência do FSII ao complexo citocromo b

é mediada pela plastoquinona. A plastoquinona é reduzida através de um processo

de transferência de 2 elétrons resultante de 2 fotoatos sequênciais dentro do FSII.

A captura de 2 prótons a partir do estroma é também requerida para a formação

do plastoquinol. A difusão do platoquinol ocorre através da camada lipídica da

membrana do tilacóide ao complexo citocromo b

f, onde 2 elétrons são transferidos

ao complexo e 2 prótons são liberados ao espaço intra-tilacóide.

Consequentemente, a transferência de elétrons de água ao b

f é associado com a

geração de próton através da membrana devido a uma diferença de potencial

eletroquímico, resultante da oxidação de água pelo FSII no lado lumen da

membrana de tilacóide e a ciclo redução-oxidação da plastoquinona. A captura de

prótons envolvida na redução de NADP no estroma também contribuirá para a

criação de uma diferença de potencial de prótons transmembrana que pode ser

usada para guiar a síntese de ATP através do fator acoplamento.

O processo do complexo físico-químico dos tilacóides específico para trandução

de energia luminosa pelas plantas foram objetivos atrativos para a ação direta de

herbicidas (PERCIVAL & BAKER, 1991). Os principais sítios perturbativos da

fotoquímica de tilacóide acessível aos inibidores enquadram-se em 3 categorias: (i)

inibição do transporte dentro da membrana; (ii) desvio do transporte de elétrons por

aceptores biológicos naturais aos aceptores de elétrons artificiais; (iii) interrupção da

síntese de ATP.

Em colaboração com o aluno Thiago A. M. Veiga (UFSCar) e o Prof. Dr. Blas

Lotina-Hennsen do Departamento de Bioquímica, Faculdade de Química da

Universidade Nacional Autônoma do México, alguns compostos preparados neste

trabalho foram submetidos à avaliação da sua fitotoxicidade sobre a síntese de ATP

em cloroplastos isolados das folhas de espinafre (Spinacea oleracea) (Figura 3.17).

OCH

94-2

OCH

141

OCH

140

OCH

92-2

OCH

94-1

OCH

FIGURA 3.17: Compostos ensaiados frente à atividade fitotóxica.

100

0 25 50 75 100 125 150

[

µµ

síntese de ATP (%)

94-2 92 94 91 95 93

FIGURA 3.18: Inibição da síntese de ATP em cloroplastos isolados das folhas de

espinafre durante a fase luminosa da fotossíntese dos compostos 94-2, 91-95.

100

0 50 100 150 200 250 300

[

µµ

síntese ATP (%)

142 141 92-2 94-1

FIGURA 3.19: Inibição da síntese de ATP em cloroplastos isolados das

folhas de espinafre durante a fase luminosa da fotossíntese dos compostos 94-1, 92-

2, 141 e 142.

A inibição da síntese de ATP é feita através do experimento utilizando

cloroplastos de espinafre (CALERA et al., 1996 e BERNARDO-GONZÁLEZ et al., 2003). O

ensaio é realizado na presença de controle contendo uma solução dos cloroplastos

(100% de clorofila) e a atividade dos compostos é medida através da determinação

da concentração de clorofila. Deste modo, quanto menor a concentração de clorofila

mais eficiente o inibidor. Os experimentos são baseados em dois tipos de controle,

um positivo e outro negativo. O positivo envolve todos os reagentes empregados na

reação exceto os compostos que visa medir a inibição (branco) e o controle negativo

emprega uma solução de NH

Cl 250 M, pois este reagente inibe 100% da

atividade.

O composto que apresentou uma melhor inibição foi a amostra 94-2, com um

de 70 M. Todos os outros valores foram estimados em função do IC

(concentração mínima necessária para reduzir em 50% a atividade) (Figura 3.26).

Devido a pouca quantidade de amostra não foi possível esclarecer o

mecanismo de ação de 94-2 frente à síntese de ATP, portanto outros ensaios serão

realizados, visto que o composto na avaliação preliminar apresentou IC

de inibição

satisfatória.

Na Figura 3.27 a amostra 92-2 apresentou atividade interessante (52%)

embora não tenha sido possível determinar o IC

De acordo com as estruturas estudadas podemos observar que a atividade

dos compostos que apresentam metoxilas no anel aromático e o substituinte etoxila

nos compostos O-alquilados foram os mais ativos, proporcionado indícios para a

estrutura de análogos.

4. Conclusões e Perspectivas

O emprego do fermento de pão se mostrou uma ferramenta eficaz na redução

enantiosseletiva do ceto-éster 58 se tornando uma alternativa à reação de

diazotaçao do ácido glutâmico, já que esta emprega reagentes agressivos ao meio

ambiente.

Os estudos para a obtenção das cetonas 52 e 66 inicialmente empregando

MeLi não tiveram muito sucesso, no entanto a preparação do sulfóxido 70 e sua

redução utilizando Zn/NaOH se mostrou interessante, fornecendo assim a cetona 66

em bons rendimentos.

Um dos grandes problemas encontrados na síntese enantiosseletiva das

dictiolomidas foram os baixos rendimentos e dificuldades para a obtenção das

iminas 77 – 80, tendo-se que modificar os materiais de partida para facilitar sua

preparação. Diferentemente de NAKATSU et al. (1990) na preparação da leiokinina B

(38), a ciclização de Niementowski para a formação das quinolinonas 55 – 56 e 85 –

86 não foi conseguida com sucesso.

No entanto, com o emprego da metodologia descrita por EDMONT et al. (2000)

obteve-se de um modo rápido e eficaz uma variedade de 4-quinolinonas, podendo-

se assim preparar a pequena coleção, fornecendo uma maior quantidade de

compostos para serem avaliados biologicamente.

A diversidade dos ensaios realizados contribuiu para mostrar a ampla faixa de

atividade biológica que as 4-quinolinonas e derivados apresentam, fornecendo

informações relevantes sobre a relação estrutura-atividade biológica.

Deste modo, pode-se notar nos compostos estudados que 4-quinolinonas que

apresentaram metoxilas no anel aromático foram mais ativas além da presença do

substituinte etoxila dos compostos O-alquilados também serem interessantes.

Embora as dictiolomidas 16 e 18 não tenham sido obtidas, este estudo inicial

foi uma importante contribuição para as próximas tentativas de obtenção dos

alcalóides naturais, comprovação da atividade biológica e correta determinação

estrutural desses.

Sendo assim, sugere-se que na próxima tentativa de obtenção de 16 e 18,

modifique-se a estrutura base dos compostos 93 e 94, em termos do álcool alílico.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

5. Procedimento Experimental

5.1.Aspectos Gerais

Os espectros de absorção no infravermelho foram registrados em um

espectrômetro Bomem modelo M 102. As amostras foram preparadas na forma de

pastilhas de KBr e as absorções estão expressas em número de onda (cm

-1

Os espectros de RMN

H a 200 e 400 MHz e RMN

C a 50 e 100 MHz foram

registrados em um espectrômetro da marca Bruker AC-200 e Bruker Avance DRX-

400, respectivamente. Os deslocamentos químicos (δ) estão expressos em ppm e as

constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). Para indicar a multiplicidade dos

sinais foram realizadas as seguintes abreviações: s (singleto), sl (singleto largo), d

(dubleto), t (tripleto), q (quadrupleto), m (multipleto), dd (duplo dubleto), ddd (duplo

duplo dupleto), quin (quintupleto).

Os espectros de massas foram efetuados em um equipamento Shimadzu

modelo GCMS-QP5000, equipado com coluna capilar HP-5 de 30 m x 0,25 mm

revestida com filme de 0,11µm, utilizando um detector de massas, gás de arraste

He.

Nas separações feitas por cromatografia em coluna utilizou-se sílica gel 60

70-230 mesh ASTM Merck. Nas placas de vidro de 2 cm x 5 cm para CCD utilizou-se

sílica gel 60 G Merck Darmstadt e revelou-se sobre luz ultra-violeta, iodo molecular

ou utilizando-se um borrifador contendo uma solução de 1g de vanilina, 1 mL de

ácido sulfúrico concentrado e 100 mL de ácido acético.

Os solventes utilizados foram todos de grau técnico e destilados antes de

serem utilizados. Os solventes anidros foram obtidos por tratamento convencional

(PERRIN e ARMAREGO, 1988). Os demais reagentes foram obtidos da Aldrich Co. e

utilizados sem purificação prévia.

Os pontos de fusão foram medidos através do equipamento FISATOM

modelo 430.

Os ângulos de rotação []

foram medidos em um polarímetro Perkin-Elmer

modelo 241, lâmpada Na 589, cela 1dm.

Os cromatógrafos a gás utilizados foram Shimadzu GC 17A com coluna

capilar HP-5 de 30 m x 0,25 mm revestida com filme de 0,11µm, e HP 5890 série II

com coluna capilar quiral do tipo Heptakis (2,6-di-3-O-metil-3-pentil)-ß4-ciclodextrina

(20% em OV 1701, w/w), 25 m (0,25mm d.i.).

As análises elementares foram feitas no aparelho EA 1108 CHNS-O, Fisions

Instruments

O fermento de pão utilizado foi da marca Mauri.

5.2. Parte Experimental

Preparação da (4R)- e (4S)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il]-butan-2-ona (52)

através da redução microbiológica empregando Fermento de Pão.

5.2.1. Preparação do 2-oxopentanoato de dimetila 58a

Em um balão sob atmosfera de N

adicionou-se o 4-pentin-1-ol (5g, 60 mmol)

em acetona (17 mL) e em seguida AgNO

(3.1g, 18 mmol) e N-bromo succinimida

(16g, 90 mmol). a mistura foi agitada por 4 horas. Em seguida o álcool (2g - bruto) foi

dissolvido MeOH-H

O (1:1) (10 mL) e adicionou-se uma solução de saturada

NaHCO

(0.5g, 6 mmol) e MgSO

(2.9g, 24 mmol) em H

O (25 mL). A mistura foi

agitada vigorosamente a t.a. e KmnO

(3.8g, 24 mmol) foi adicionado. A extração foi

feita adicionando H

O (10 mL) e extraindo com EtOAc (3 x 10 mL). O rendimento da

reação foi de 60% (1.5g). O éster contendo grupos metoxila foi obtido utilizando

solução MeOH-H

O (1:1)

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 3.88 (s, 3H); 3.68 (s, 3H); 3.16 (t, J = 6.4 Hz, 3H); 2.68

(t, J = 6.5 Hz, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 192.16; 172.31; 160.88; 52.99; 51.95; 34.17; 27.38.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2958; 1733; 1700; 1436; 1081.

5.2.2. Preparação do (2R)- e (2S)-hidroxi-1,5-pentanodioato de dimetila (57)

Procedimento 1: A uma suspensão contendo de fermento de pão (2.1 g),

O bidestilada (75 mL) e de açúcar (2.5 g) foi agitado por 30 minutos então o ceto-

éster 58b (216 mg, 1 mmol) foi adicionado e o consumo do material de partida se

deu após 4 dias.

A extração foi realizada filtrando-se a solução utilizando funil de Büchner e

Celite, a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 20 mL) e lavada com solução

saturada de NaCl (3 x 10 mL), secou-se a fase orgânica com MgSO

anidro,

evaporou-se o solvente e obteve-se 40% de rendimento (82 mg) de material bruto.

5.2.3. Preparação do ácido (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodióico (62).

Uma solução de NaNO

(2.41 g, 35 mmol) em água (7.65 mL) foi adicionada

gota a gota a um balão resfriado com gelo e agitação contendo ácido glutâmico (3 g,

20.4 mmol) em uma solução aquosa de H

(1,5 N, 35 mL). A mistura foi agitada

por 2 horas à 0

C e deixada a t.a. durante toda à noite. O resíduo semi-sólido foi

extraído com éter (3 x 10 mL) e a solução seca com Na

e concentrada a vácuo.

A fase aquosa foi extraída novamente com acetato de etila (3 x 10 mL) a fim de se

aumentar o rendimento da reação. O solvente foi evaporado e o resíduo foi

purificado utilizando-se cromatografia em coluna flash com gradiente de eluente

(hexano, 7:3 hexano:AcOEt, 1:1 hexano:AcOEt e 3:7 AcOEt:hexano). Deste modo

obteve-se 50% do material bruto.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3534; 1779; 1732; 1463; 1181; 1067.

(S)-62 [α]

= + 9.67 (c= 2.48, CHCl

)

(R)-62 [α]

= - 9.69 (c= 3.3, CHCl

)

5.2.4. Preparação do (2S)- e (2R)-hidroxi-1,5-pentanodioato de dimetila (57).

Em um balão com agitação magnética contendo o ácido (S)- ou (R)-2-

hidroxipentanodióico (62) (2.37 g, 16.45 mmol) adicionou-se metanol (17.8 mL) e em

seguida H

concentrado (237 µL). Após 3 horas de reação adicionou-se solução

saturada de NaHCO

(500 µL). Lavou-se a fase orgânica com H

O (3 x 10 mL),

secou-se a mistura com Na

e concentrou-se o produto. A purificação foi feita

utilizando cromatografia em coluna utilizando como eluente 9:1 hexano:AcOEt.

Obteve-se 80% do produto desejado (2.26 g).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.28 – 4.22 (m, 1H); 3.80 (s, 3H); 3.69 (s, 3H); 3.00 (sl,

1H); 2.59 – 2.45 (m, 2H); 2.26 – 2.10 (m, 1H); 2.04 – 1.85 (m, 1H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 174.88; 173.45; 69.37; 52.42; 51.53; 29.29; 29.15.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3563; 2956; 1742; 1649; 1442; 1108.

(S)-57 

= + 3.48 (c= 3.56, CHCl

)

(R)-57 

= - 3.47 (c= 8.06, CHCl

)

5.2.5. Preparação do (4S)- e (4R)-4,5-diidroxipentanoato de metila (63).

Para uma solução de (S)- ou (R)-2-hidroxipentanodioato de dimetila (57) (800

mg, 4.54 mmol) em THF (9.5 mL) sob N

foi adicionada gota a gota uma solução de

S.BH

em THF (10M, 450 µL, 454 mmol) à 20

C por 30 minutos e a mistura foi

agitada por 30 minutos à 20

C. Adicionou-se NaBH

(8.4 mg, 222 mmol) e agitou-se

a solução por mais 30 minutos à 20

C. Em seguida deixou-se a t.a. por 1 hora. À

mistura foi adicionado metanol seco (3 mL) e agitou-se por mais 30 minutos à t.a.. O

solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado utilizando-se cromatografia em

coluna flash com gradiente de eluente (hexano, 7:3 hexano:AcOEt, 1:1

hexano:AcOEt e 3:7 AcOEt:hexano), rendendo 89% de (S)-63 (596 mg)

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.31 – 4.25 (m, 1H); 3.73 (s, 3H); 3.69 – 3.65 (m, 2H);

1.73 – 1.65 (m, 4H).

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3448; 2995; 1725; 1440; 1173.

5.2.6. Preparação do (4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il] propanoato de

metila (64).

Dissolveu-se o (4S)- ou (4R)-4,5-diidroxipentanoato de metila (63) (700 mg,

4.93 mmol) em DMF (7.9 mL) em seguida adicionou-se o 2,2-dimetoxipropano (24

mL) e PPTS (59 mg, 0.24 mmol). A mistura foi agitada por 24 horas à t.a., após este

período adicionou-se NaHCO

(15 mL) e extraiu-se com CH

(3 x 10 mL). Lavou-

se a fase orgânica com H

O (3 x 20 mL), secou-se a fase orgânica com MgSO

evaporou-se o solvente e purificou-se a amostra em cromatografia em coluna

usando com eluente 9:1 hexano:AcOEt, obtendo-se 64 com 90% (850 mg) de

rendimento.

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.15-4.02 (m, 3H); 3.68 (s, 3H); 3.59-3.52 (m, 1H); 2.49

- 2.40 (m, 2H); 1.93-1.82 (m, 2H); 1.40 (s, 3H); 1.34 (s, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 173.54; 108.96; 74.85; 68.98; 51.53; 30.12; 28.74;

26.81; 25.51.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2998; 2880; 1740; 1211.

(S)-64 []

= + 3.9 (c= 4.11, CHCl

)

(R)-64 []

= - 3.91(c= 6.65, CHCl

)

5.2.7. Preparação do (4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il]-butan-2-ona (52).

Preparação do MeLi.

Tentativa 1:

Lítio metálico (6.6 g, 0.95 mmol) cortado em pequenos pedaços foi colocado

em um balão de fundo redondo sob agitação mecânica e sob atmosfera de N

Lavou-se inicialmente o lítio com hexano seco (3 x 10 mL). Em seguida, adicionou-

se hexano seco (45 mL) e resfriou-se a reação a – 20

C, e lentamente uma solução

de iodo metano (30 mL, 0.475 mmol) foi adicionado. Deixou-se a reação atingir 0

e manteve-se por 16 horas. Após este tempo não se observou o consumo do lítio e a

solução era límpida. Deste modo concluiu-se que o MeLi não havia sido formado.

Tentativa 2: (SCHÖLLKOPT et al. 1973)

Inicialmente lavou-se o lítio metálico (2.0 g, 0.29 mmol) cortado em pequenos

pedaços com hexano tratado (20 mL) contido em um balão com agitação magnética

e sob atmosfera de N

em seguida adicionou-se Et

O anidro (100 mL) e 1% de sódio

(20 mg). Então iodo metano (8 mL, 0.12 mmol) foi adicionado lentamente. Após 24

horas a solução de MeLi foi decantada, filtrada e titulada para se conhecer a

concentração desta (0.5 M).

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de N

adicionou-se o éster (S)-

ou (R)-64 (500mg, 2.9 mmol) em Et

O anidro (2 mL). Em seguida resfriou-se a

solução a 0

C e adicionou-se uma solução de MeLi em Et

O lentamente (0.5M, 2.9

mL, 4.35 mmol) e a reação foi mantida a esta temperatura até seu término.

Acompanhou-se a reação através de cromatografia gasosa já que os compostos

apresentam fatores de retenção muito similares em CCD. Após 10 horas de reação

notou-se o desaparecimento do material de partida. Adicionou-se água destilada (5

mL) e em seguida extraiu-se a reação com acetato de etila (3 x 10 mL), secou-se a

fase orgânica com Na

anidro, evaporou-se o solvente, e purificou-se o

composto utilizando cromatografia em coluna utilizando 9:1 de hexano:acetato de

etila com eluente. Obteve-se 52 com 80% de rendimento (400 mg).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.11-4.02 (m, 2H); 3.57 – 3.48 (m, 1H); 1.69-1.6 (m,

4H); 1.42 (s, 3H); 1.23 (s, 6H).

RMN

C pendant (50 MHz, CDCl

) δ: 201.43; 108.82; 76.33; 69.37; 39.57; 29.22,

28.24; 26.82; 25.62.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2965; 2940; 1645; 1472; 1254; 836.

5.2.8. Preparação do (2S)-2-t-butildimetilsililoxi-pentanodioato de dimetila

(65).

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de N

, contendo o S-57 (1.08

g, 6.12 mmol) e DMF anidro (12 mL) adicionou-se imidazol (840 mg, 12.34 mmol). A

mistura reacional foi agitada por 15 minutos e a seguir adicionou-se o cloreto de t-

butildimetilsilano (1.4 g, 9.2 mmol). Agitou-se a mistura reacional a t.a. durante 18

hs. Ao final reação, cessou-se a reação com adição de H

O (5 mL) seguido de

AcOEt (10 mL). Separou-se as fases lavando-se a fase orgânica com H

O (3 x 5 mL)

para a remoção do DMF, secou-se a fase orgânica com Na

anidro e o solvente

foi evaporado a pressão reduzida. Obteve-se 65 com 50% (887 mg) de rendimento.

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.27 – 4.21 (m, 1H); 3.67 (s, 3 H); 3.62 (s, 3H); 2.44 –

2.35 (m, 2H); 2.06 – 1.91 (m, 2H); 0.85 (s, 9H) e 0.03 (s, 6H).

100

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 173.58; 173.43; 70.84; 51.81; 51.55; 30.00; 29.24;

25.65; - 5.07; - 5.49.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2954; 2931.5; 1741.4; 1472.9; 1438.3; 1132.7.

5.2.9. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-hidroxipentanoato de metila

(67).

Para uma solução de (S)-2-hidroxipentanodioato de dimetila (65) (700 mg, 2.4

mmol) em THF (3.5 mL) sob N

foi adicionada gota a gota uma solução de Me

S.BH

em THF (10M, 240 µL, 2.4 mmol) à 24

C por 30 minutos e a mistura foi agitada por

cerca de 2 horas. Adicionou-se NaBH

(1.8 mg, 0.048 mmol) e agitou-se a solução

por mais 2 horas. Acompanhou-se a reação por CG e mesmo após 30 horas de

reação uma pequena quantidade de material de partida estava presente, mas assim

mesmo adicionou-se metanol seco (3 mL) e agitou-se por mais 30 minutos à t.a.. O

solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado utilizando-se cromatografia em

coluna flash com gradiente de eluente (hexano, 7:3 hexano:AcOEt, 1:1

hexano:AcOEt e 3:7 AcOEt:hexano). O composto 67 foi obtido em 50% de

rendimento (313 mg).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 3.72 – 3.60 (m, 6H); 1.89 – 1.60 (m, 5H); 0.88 (s, 9H) e

0.03 (s, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 173.94; 71.92; 62.40; 51.75; 31.65; 28.32; 25.64;

-5.08; -5.46.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3464.6; 32950.4; 1773.9; 1464.7.

5.2.10. Preparação do (4S)-4-hidroxi-5-metoximetoxi-pentanoato de metila

(68).

Procedimento 1:

Em um balão de fundo redondo adicionou-se o diol 67 (2.1 g, 14 mmol) e N,N-

diisopropiletilamina (5 mL, 29 mmol). A solução foi agitada à 0

C e então cloro

metilmetil éter (1.0 mL, 13 mmol) foi adicionado gota a gota. Acompanhou-se a

reação por CCD e após término da reação adicionou-se água (90 mL) e separaram-

se as fases. A fase orgânica foi lavada com água (3 x 20 mL) e seca com MgSO

anidro, em seguida evaporou-se o solvente à pressão reduzida. O produto foi

purificado através de coluna cromatográfica utilizando como eluente 6:4 hexano:

AcOEt. Obteve-se 68 com rendimento de 40% (1.07 g).

Procedimento 2:

101

Em um balão de fundo redondo adicionou-se o diol 67 (6.0 g, 40.5 mmol) e

N,N-diisopropiletilamina (35 mL, 205 mmol) e CH

anidro (80 mL). A solução foi

agitada à 0

C e então cloro metilmetil éter (3.2 g, 40 mmol) foi adicionado gota a

gota. Acompanhou-se a reação por CCD e após término da reação adicionou-se

água (90 mL) e separaram-se as fases. A fase orgânica foi lavada com água (3 x 20

mL) e seca com MgSO

anidro, em seguida evaporou-se o solvente à pressão

reduzida. O produto foi purificado através de coluna cromatográfica utilizando como

eluente 6:4 hexano: AcOEt. Obteve-se 68 com rendimento de 80% (6.2 g).



= 9,14

(c = 1.4, CHCl

)

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.55 (s, 2H); 3.77 (q, J = 8 Hz, 1H); 3.61 (s, 3H); 3.36

(d, J = 6 Hz, 2H); 3.29 (s, 3H); 2.34 (t; J = 6 Hz, 2H); 1.88-1.69 (m, 2H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 174.95; 96.54; 69.40; 68.84; 52.49; 51.50; 29.21;

29.27.

IV (ν

max

, filme) cm

-1

: 3458; 2950; 2827; 1770; 1442; 1149; 1035.

5.2.11. Preparação do (4S)-4-(t-butildimetilsililoxi)-5-metoximetoxi-

pentanoato de metila (69).

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de N

, contendo S-68 (2.0 g,

10 mmol) e DMF anidro (10 mL) adicionou-se imidazol (1.36 g, 20 mmol) e DMAP

(74 mg, 0.6 mmol). A mistura reacional foi agitada por 15 minutos e a seguir

adicionou-se o cloreto de t-butildimetilsilano (2.2 g, 15 mmol). Agitou-se a mistura

reacional a t.a. durante 18 h. Ao final reação, cessou-se a reação com adição de

O (5 mL) seguido de AcOEt (10 mL). Separou-se as fases lavando-se a fase

orgânica com H

O (3 x 5 mL) para a remoção do DMF, secou-se a fase orgânica

com Na

anidro e o solvente foi evaporado a pressão reduzida. O material obtido

foi purificado através de coluna cromatográfica utilizando como eluente 9:1 hexano:

AcOEt. Obteve-se o produto desejado em 70% de rendimento (2.2 g).



= 23

(c = 0.7, CHCl

)

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.61 (s, 2H); 3.88-3.82 (m, 1H); 3.67 (s, 3H); 3.43 (d, J

= 4.0 Hz, 2H); 3.36 (s, 3H); 2.41 (t, J = 8 Hz, 2H); 1.94-1.74 (m, 2H); 0.89 (s, 9H);

0.06 (s, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 174.10; 96.72; 71.65; 70.25; 55.25; 51.50; 29.65;

29.59; 25.85; 18.13; -4.44; -4.85.

IV (ν

max

, filme) cm

-1

: 2954; 2929; 1741; 1473; 1255; 837.

102

5.2.12. Preparação do (5S)-5-(t-butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi-2-

hexanona (66).

– via adição de MeLi

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de N

adicionou-se o éster (S)-

69 (400 mg, 1.70 mmol) em Et

O anidro (1 mL). Em seguida resfriou-se a solução a -

C e adicionou-se uma solução de MeLi em Et

O (0.5M, 9 mL, 5.1 mmol)

lentamente e a reação foi mantida a esta temperatura até seu término. Acompanhou-

se a reação através de cromatografia gasosa já que os compostos apresentam fator

de retenção muito similares em CCD. Após 10 horas de reação notou-se o

desaparecimento do material de partida. Adicionou-se água destilada (5 mL) e em

seguida extraiu-se a reação com acetato de etila (3 x 10 mL), secou-se a fase

orgânica com Na

anidro, evaporou-se o solvente, e purificou-se o composto

utilizando cromatografia em coluna utilizando 9:1 de hexano:acetato de etila com

eluente. Obteve-se 45% de rendimento (180 mg).

– via reação com DMSO/Zn

Em um balão de duas bocas acoplada a um sistema de refluxo sob atmosfera

de N

uma dispersão de NaH 60% em óleo mineral (2.9 g, 120 mmol) foi lavada com

hexano tratado para a retirada do óleo. Em seguida adicionou-se DMSO (16 mL) e

THF anidro (22 mL), sob agitação magnética, a solução foi mantida á 65

C por 2

horas.

A mistura foi resfriada de 5 – 10

C e a esta solução adicionou-se uma solução

1M do éster 69 (6.3 g, 28 mmol) em THF anidro (28 mL). Agitou-se a solução por

cerca de 3 horas acompanhando-se a reação por CCD. Após término da reação

adicionou-se água (30 mL) e o pH foi ajustado a 2.5 com solução1M de HCl. Em

seguida separou-se as fases e à fase orgânica foi adicionada uma solução 30% de

NaOH (10 mL), e extraiu com AcOEt (3 x 20 mL), os extratos foram combinados e

lavados com solução saturada de NaCl saturado (3 x 10 mL), seco e evaporado.

Obteve-se o sulfóxido 70 com 80% de rendimento bruto (7.8 g).

Em outro balão de fundo redondo uma solução 30% de NaOH (60 mL) foi

adicionada a uma mistura de Zn em pó (11 g, 168 mmol) e água (110 mL) à 65

C e a

mistura foi agitada por 4 horas. Nesta mistura resultante foi adicionado o sulfóxido

obtido anteriormente (5 g) em tolueno (90 mL). A solução foi agitada à 65

C por 4

horas em seguida foi filtrada e o filtrado foi ajustado o pH a 9.0 com solução 1M de

HCl. A fase do tolueno foi separada e a fase aquosa extraída com AcOEt (3 x 10

103

mL), os extratos combinados foram secos e evaporados. O material obtido foi

submetido à purificação cromatográfica utilizando 9:1 de hexano:AcOEt como

eluente. Obteve-se a cetona desejada 66 (5,0 g) com 65% de rendimento a partir do

éster 69.



= 13

(c = 1.5, CHCl

)

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 4.62 (s, 2H); 3.84 – 3.79 (m, 1H); 3.43 (d, J = 2 Hz,

2H); 3.36 (s, 3H); 2.53 (t, J = 6 Hz, 2H); 2.16 (s, 3H); 0.90 (s, 9H); 0.07 (s, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 208.56; 96.68; 71.66; 70.22; 55.21; 39.03; 29.84;

28.35, 25.81; 18.10; -4.48; -4.84.

IV (ν

max

, filme) cm

-1

: 2954; 2929; 2858; 1718; 1473; 1253; 837.

5.2.13. Preparação do cloreto de 2-nitrobenzoíla (71)

Em um balão de fundo redondo e sistema de refluxo contendo o ácido 2-

nitrobenzóico (39) (5 g, 30 mmol), adicionou-se gota a gota o SOCl

(10.9 mL, 150

mmol) em banho de gelo. Após a adição retirou-se o banho e deixou-se o sistema

em refluxo brando (T= 20

C) por 4 horas. Em seguida adicionou-se hexano tratado

e destilou-se o SOCl

como azeotrópo em hexano. Este composto foi utilizado para a

preparação da amina 73 sem purificações subseqüentes (4 g).

5.2.14. Preparação do cloreto de 5-metoxi-2-nitrobenzoíla (72)

Em um balão de fundo redondo e sistema de refluxo contendo o ácido 5-

metoxi-2-nitrobenzóico (49) (5 g, 25 mmol), adicionou-se gota a gota o SOCl

(9.09

mL, 125 mmol) em banho de gelo após a adição retirou-se este e deixou-se o

sistema em refluxo brando por 4 horas. Em seguida adicionou-se hexano tratado e

destilou-se o SOCl

como azeotrópo em hexano (3.8 g).

Este composto foi utilizado para a preparação da amina 74.

5.2.15. Preparação da N,N–dietil-2-nitrobenzamida (73)

Em um balão com banho de gelo contendo o cloreto de 2-nitro-1-

benzenocarbonila (71) (5.5 g, 30 mmol) em THF (30 mL), dietilamina (4.04 mL, 39

mmol) foi adicionada gota a gota. Acompanhou-se a reação por CCD utilizando

como eluente 9:1 Hexano: AcOEt. Após término da reação adicionou-se solução

saturada de NaHCO

(10 mL) e extraiu a fase aquosa com AcOEt (3 x 15 mL). Após

evaporação do solvente obteve-se um óleo, que foi purificado através de coluna

cromatográfica. Obteve-se 73 com rendimento de 95% (6.37 g).

104

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 8.19 (dd, J = 10.6, 1.0 Hz, 1H); 7.71 (td, J = 1.4, 7.4

Hz, 1H); 7.56 – 7.52 (m, 1H); 7.39 (dd, J = 2.0, 8.0, 1H); 3.60 (sl, 2H); 3.13 (q, J = 7.2

Hz, 2H); 1.31 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 1.07 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 167.06; 144.96; 134.22; 133.57; 129.43; 127.94;

124.64; 42.67; 38.86; 13.46; 11.89.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2978; 2936; 1637; 1529; 1433; 1348; 1107; 851; 765.

5.2.16. Preparação da N,N– dietil-5-metoxi-2-nitrobenzamida (74)

Em um balão com banho de gelo contendo o cloreto de 2-nitro-5-metoxi-1-

benzenocarbonil (72) (5.4 g, 25 mmol) em THF (25 mL), dietilamina (3.62 mL, 32

mmol) foi adicionada gota a gota. Acompanhou-se a reação por CCD utilizando

como eluente 9:1 hexano: AcOEt. Após término da reação adicionou-se solução

saturada de NaHCO

(3 x 20 mL) e extraiu a fase aquosa como AcOEt (3 x 20 mL).

O solvente foi evaporado, obtendo-se um sólido que foi purificado através de

cristalização utilizando ciclohexano. Obteve-se 74 com 95% de rendimento (6.04 g).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 8.2 (d, J = 9 Hz, 1H); 6.9 (dd, J = 2.8, 9.2 Hz, 1H); 6.7

(d, J = 2.6 Hz, 1H); 3.9 (s, 3H); 3.14-3.07 (m, 2H); 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 1.10 (t, 7

Hz, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 166.92; 164.09; 137.81; 135.94; 127.18; 114.17;

112.75; 56.05; 42.49; 38.76; 13.45; 11.76.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3054; 2981; 1650; 1593; 1518; 1462; 1249; 1065; 867; 836; 620.

5.2.17. Preparação da 2-amino-N,N–dietilbenzamida (75)

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de H

, contendo a N

–

dietil-2-nitro-1-benzamida (73) (4.0 g, 18 mmol) adicionou-se MeOH (18 mL) e Pd/C

(5%, 200 mg). Acompanhou-se a reação por CG e após o material de partida ter sido

consumido, filtrou-se a solução utilizando funil de placa sinterizada e sílica comum,

lavando–se com AcOEt como solvente. Evaporou-se o solvente e obteve-se um óleo

com rendimento de 98% (3.39 g).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 7.18 – 7.05 (m, 2H); 6.75 – 6.67 (m, 2H); 3.82 (sl, 2H);

3.42 (sl, 2H); 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 170.52; 144.61; 129.90; 126.74; 121.56; 117.38;

116.41; 13.43; 13.37.

105

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3450; 3347; 2974; 2934; 1617; 1590; 1430; 1288; 1097; 880;

752.

RMN

H (400 MHz, DMSO), 298K, δ: 7.05 (ddd, J = 8.6, 8.0, 1.5 Hz, 1H); 6.93 (dd, J

= 7.5, 1.5 Hz, 1H); 6.71 (d, J = 8 Hz, 1H); 6.56 (ddd, J = 8.6, 8.0, 1.5 Hz, 1H); 3.38 (s,

2H); 3.33 (sl, 4H); 1.18 (sl, 6H).

RMN

H (400 MHz, DMSO), 303K, δ: 7.07 (ddd, J = 8.9, 8.0, 1.6 Hz, 1H); 6.94 (dd, J

= 7.5, 1.5 Hz, 1H); 6.72 (d, J = 7.4 Hz, 1H); 6.94 (ddd, J = 9.3, 7.3, 1.1 Hz, 1H); 3.32

(sl, 6H); 1.08 (t, J = 7.0 Hz, 6H).

RMN

H (400 MHz, DMSO), 313K, δ: 7.07 (ddd, J = 8.9, 8.0, 1.6 Hz, 1H); 6.94 (dd, J

= 7.5, 1.5 Hz, 1H); 6.72 (d, J = 7.4 Hz, 1H); 6.94 (ddd, J = 9.3, 7.3, 1.1 Hz, 1H); 3.32

(q, J = 7.0 Hz, 6H); 1.09 (t, J = 7.0 Hz, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 170.52; 144.61; 129.90; 126.74; 121.56; 117.38;

116.41; 13.43; 13.37.

RMN

C (100 MHz, CDCl

), 313K, δ: 169.32; 144.92; 129.2; 126.36; 121.09; 115.53;

115.37; 40.34; 13.24.

5.2.18. Preparação da 2-amino-N,N-dietil-5-metoxibenzamida (76)

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de H

, contendo a N

–

dietil-2-nitro-5-metoxi-1-benzamida (74) (3.7 g, 15 mmol) adicionou-se MeOH (15

mL) e Pd/C (5%, 200 mg). Acompanhou-se a reação por CG e após o material de

partida ter sido consumido, filtrou-se a solução utilizando funil de placa sinterizada e

sílica comum, lavando-se com AcOEt (3 x 3 mL). Evaporou-se o solvente e obteve-

se um óleo com rendimento de 98% (3.27 g).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 6.67 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H); 6.59 – 6.55 (m, 2 H);

3.7(sl, 2H); 3.6 (s, 3H); 3.34 – 3.32 (m, 2H); 1.1 (t, J = 6.4 Hz, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 170.06; 151.78; 137.88; 122.87; 117.79; 116.23;

111.87; 55.71; 13.46.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3437; 3348; 2976; 2936; 1735; 1625; 1594; 1460; 1282; 1041;

735.

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 6.67 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H); 6.59 – 6.55 (m, 2 H); 3.7

(sl, 2H); 3.6 (s, 3H); 3.34 – 3.32 (m, 2H); 1.1 (t, J = 6.4 Hz, 6H).

RMN

H (400 MHz, DMSO), 298K, δ: 6.73 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 1H); 6.68 (d, J = 8.7

Hz, 1H); 6.54 (d, J = 2.8 Hz, 1H); 3.6 (s, 3H); 3.34 (sl, 6H); 1.08 (sl, 6H).

106

RMN

H (400 MHz, DMSO), 303K, δ: 6.73 (dd, J = 8.7, 2.8 Hz, 1H); 6.68 (d, J = 8.7

Hz, 1H); 6.54 (d, J = 2.8 Hz, 1H); 3.6 (s, 3H); 3.30 (s, 6H); 1.09 (t, J = 7 Hz, 6H).

RMN

H (400 MHz, DMSO), 313K, δ: 6.73 (dd, J = 8.7, 2.8 Hz, 1H); 6.68 (d, J = 8.7

Hz, 1H); 6.54 (d, J = 2.8 Hz, 1H); 3.6 (s, 3H); 3.33 (q, J = 7 Hz, 4H); 3.2 (sl, 2H); 1.10

(t, J = 7 Hz, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 170.06; 151.78; 137.88; 122.87; 117.79; 116.23;

111.87; 55.71; 13.46.

5.2.19. Preparação a Obtenção de (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il)-

butan-2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (53), (E)-2-(4-(2,2-dimetil-1,3-dioxalan-

4-il)-butan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxibenzamida (54)

Procedimento 1: (Adaptação do método descrito por NAKATSU, 1990)

Preparação da imina 53.

Uma mistura da amina 75 (130 mg, 0.67 mmol), S-52 (128 mg, 0.74 mmol),

ácido p-toluenossulfônico monohidrato (18 mg, 0.1 mmol) e tolueno (5 mL) foi

refluxada usando Dean-Stark. Após 30 horas de reação, a mistura foi lavada com

solução saturada de NaHCO

(3 x 5 mL) seguido por secagem da fase orgânica com

anidro e evaporação do solvente. Uma mistura complexa de compostos foi

observada através de CCD usando como eluente AcOEt e esta foi separada usando

cromatografia flash utilizando (7:3 hexano: acetato de etila) como solvente, e as

frações obtidas foram submetidas à análise de RMN

H porém em nenhuma delas

encontrou-se o produto desejado.

Preparação da imina 54.

Uma mistura da amina 76 (120 mg, 0.54 mmol), S-52 (102 mg, 0.60 mmol),

ácido p-toluenossulfônico (monohidrato) (14 mg, 0.08 mmol) e tolueno (5 mL) foi

refluxada usando Dean – Stark. Após 30 horas de reação, a mistura foi lavada com

solução saturada de NaHCO

(3 x 5 mL) seguido por secagem da fase orgânica

anidro e evaporação do solvente. Uma mistura complexa de compostos foi

observada através de CCD usando como eluente AcOEt e esta foi separada usando

cromatografia flash utilizando (7:3 hexano: acetato de etila) como solvente, e as

frações obtidas foram submetidas à análise de RMN

H, porém em nenhuma delas

encontrou-se o composto desejado.

Procedimento 2: (LOOK, 1995)

Preparação da imina 53.

107

À amina 67 (558 mg, 2.9 mmol) foi adicionado sob agitação orto-formato de

trimetila (7 mL) por cerca de 10 minutos, então a S-52 (500 mg, 2.9 mmol) foi

adicionada e a mistura foi agitada por cerca de 12 horas, como não se observou o

aparecimento de produto, esta solução foi refluxada. Após 24 horas de agitação foi

adicionado AcOEt (3 x 5 mL) e lavou-se com H

O (3 x 3mL). Uma mistura de

compostos foi obtida e esta foi separada usando cromatografia flash utilizando (7:3

hexano: acetato de etila) como solvente, e as prováveis frações contendo alguns

produtos foram submetidas à análise de RMN

H e nenhuma fração teve importância

do produto.

Preparação da imina 54.

Uma solução da amina 76 (645 mg, 2.9 mmol) em orto-formato de trimetila (7

mL) foi agitada por cerca de 10 minutos, em seguida adicionou-se a S-52 (500 mg,

2.9 mmol) foi adicionada e a mistura foi agitada por cerca de 12 horas, como não se

observou o aparecimento de produto, esta solução foi refluxada. Após 50 horas de

agitação foi adicionado AcOEt (3 x 5 mL) e lavou-se com H

O (3 x 3mL) e

novamente o produto não foi obtido.

5.2.20. Estudo para a obtenção de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-

metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietilbenzamida (77), (E)-2-(5-(t-

butildimetilsililoxi)-6-metoximetoxi)-hexan-2-ildeamino)-N,N-dietil-5-metoxi

benzamida (78).

Procedimento 1

Em um balão de fundo redondo acoplado a um sistema Dean-Stark, as

aminas 75 ou 76, a cetona S-66, o solvente (tolueno ou benzeno), secantes (peneira

molecular, ortoformato de trimetila) e ácido p-toluenossulfônico monohidrato foram

agitados de 48 – 72 horas (Tabela 3.4). Nos casos em que apenas existe solvente

na mistura reacional, este é evaporado sob pressão reduzida. Nos testes em que

catalisador é empregado, a mistura foi lavada com solução saturada de NaHCO

(3 x

5 mL), seguido por secagem da fase orgânica com Na

anidro e evaporação do

solvente.

Em todos os casos uma mistura complexa de compostos foi observada

através de CCD usando como eluente AcOEt (100%) e o produto desejado não foi

obtido.

Procedimento 2 (KELLER (2003):

108

Uma mistura de peneira molecular 5Å (44 mg), óxido de alumínio básico

Brockmann I (10 mg) e sílica gel Merck 230 – 400 mesh (5 mg) foi seca sob vácuo e

aquecimento por 10 minutos, resfriou-se a t.a. e suspendeu-se em ciclohexano

anidro. A cetona 66 (50 mg, 0.18 mmol) e as aminas 75 (92 mg, 0.198 mmol) ou 76

(44 mg 0.198 mmol), foram adicionadas à suspensão e a mistura resultante foi

agitada a 20

C de 12 – 50 horas sob atmosfera de N

A reação foi monitorada por CCD, ao final do tempo reacional o catalisador foi

filtrado, lavado com THF anidro e solvente removido sob vácuo. As iminas 77 ou 78

não foram obtidas.

5.2.21. Preparação de 2-nitrobenzoato de metila (83).

Em um balão de fundo redondo sob agitação magnética, aquecimento, e

acoplado a um sistema de refluxo adicionou-se o composto 39 (500 mg, 3 mmol),

metanol (5 mL) e ácido sulfúrico como catalisador (50 µL). Acompanhou-se a reação

através de CCD e após o término da reação adicionou-se NaHCO

saturado (5 mL)

e AcOEt (15 mL) separou-se as fases, a fase orgânica foi seca com MgSO

anidro e

evaporado sob pressão reduzida. Utilizou-se uma dry flash para purificar o material

obtido utilizando hexano:AcOEt, 9:1 como eluente. Obteve-se 83 com 80% de

rendimento (560 mg).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 7.96 – 7.90 (m, 1H); 7.78 – 7.59 (m, 3H); 3.93 (s, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 166.55; 163.39; 131.19; 126.67; 115.78; 114.11; 56.22;

53.34.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2956; 2983; 1737; 1537; 1296; 858; 736.

5.2.22. Preparação de 2-nitro-5-metoxibenzoato de metila (84).

Em um balão de fundo redondo sob agitação magnética, aquecimento, e

acoplado a um sistema de refluxo adicionou-se o composto 49 (500 mg, 2.3 mmol),

metanol (5 mL) e ácido sulfúrico (50 µL). Acompanhou-se a reação através de CCD

e após o término da reação adicionou-se NaHCO

saturado (5 mL) e AcOEt (15 mL)

separou-se as fases, a fase orgânica foi seca com MgSO

anidro e evaporado sob

pressão reduzida. Utilizou-se uma dry flash para purificar o material obtido utilizando

hexano:AcOEt, 9:1 como eluente. Obteve-se 84 com 80% de rendimento (470 mg).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 8.06 – 8.01 (m, 1H); 7.06 – 7.00 (m, 2H); 3.94 (s, 3H);

3.92 (s, 3H).

109

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 165.76; 132.81; 131.70; 129.80; 123.84; 53.18.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2954; 2844; 1737; 1585; 1344; 1068; 842.

5.2.23. Preparação de 2-aminobenzoato de metila (81).

Em um balão de fundo redondo sob agitação magnética e mantido sob

atmosfera de H

adicionou-se o composto 83 (400 mg, 2.2 mmol) e Pd/C (0.5 g)

como catalisador e metanol como solvente (5 mL). Após 14 horas filtrou-se a

solução e evaporou-se o solvente através de pressão reduzida. O material obtido foi

purificado utilizando coluna cromatográfica com 8:2 hexano:AcOEt como eluente

fornecendo 81 em 90% de rendimento (300 mg).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 7.85 (dd, J = 2 e 8 Hz, 1H); 7.30 – 7.22 (m, 1H); 6.68 –

6.61 (m, 2H); 5.71 (sgl, 2H); 3.87 (s, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 168.50; 150.36; 134; 131.15; 116.59; 116.19; 51.41.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3481; 3371; 2950; 1695; 1616; 1434; 1296; 752.

5.2.24. Preparação de 2-amino-5-metoxibenzoato de metila (82).

Em um balão de fundo redondo sob agitação magnética e mantido sob

atmosfera de H

adicionou-se o composto 84 (400 mg, 1.6 mmol), e Pd/C (0.5 g)

como catalisador e metanol como solvente (5 mL). Após 14 horas filtrou-se a

solução e evaporou-se o solvente através de pressão reduzida. O material obtido foi

purificado utilizando coluna cromatográfica com 8:2 hexano:AcOEt como eluente

fornecendo 82 em 90% de rendimento (260 mg).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 7.35 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 6.96 (dd, J = 2.0 e 8.0 Hz ,

2H); 6.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 3.89 (s, 3H); 3.77 (s, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 168.21; 150.55; 145.07; 123.22; 118.22; 113.21;

110.73; 55.86; 51.53.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3479; 3371; 2950; 2908; 1695; 1593; 1496; 1290; 1041; 823.

5.2.25. Preparação de (E)-2-(5-(t-butildimetilsililoxi)-6-(metoximetoxi)-

hexan-2-ildeamino)-5-metoxibenzoato de metila (80).

Uma mistura de peneira molecular 5Å (95 mg), óxido de alumínio básico

Brockmann I (25 mg) e sílica gel Merck 230 – 400 mesh (13 mg) foi seca sob vácuo

e aquecimento por 10 minutos, resfriou-se a t.a. e suspendeu-se em ciclohexano

anidro. A cetona 66 (38 mg, 0.13 mmol) e a amina 82 (20 mg, 0.13 mmol) foram

110

adicionadas. A mistura resultante foi agitada à 20

C de 12 – 50 horas sob atmosfera

de N

A reação foi monitorada por CCD, ao final do tempo reacional o solvente foi

removido sob vácuo. A amostra foi submetida à análise de massas, a qual indicou a

formação da imina 80.

EM (intensidade relativa %) m/z: 454.5 (100); 385.4 (10); 242.4 (5); 182.1

(20); 149.9 (25).

5.2.26. Preparação dos compostos, 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-4-quinolinona (85) e 2-(3S)-(3-(t-butildimetilsililoxi-4-

metoximetoxi)butil)-6-metoxi-4-quinolinona (86).

Em um balão de fundo redondo sob agitação magnética e N

à 0

adicionou-se diisopropilamina (0.72 mL, 5.2 mmol) e diluiu-se com THF seco (6 mL).

A seguir adicionou-se uma solução de n-BuLi 2.5M em THF (2.08 mL, 5.2 mmol) e

agitou-se por cerca de 20 minutos.

Uma solução da imina 81 (0.074 mmol) em THF anidro (10 mL) foi adicionada

à solução 1M de LDA em THF previamente preparada (0.015 mmol) à 0

C por 25

minutos. A temperatura reacional foi gradualmente retornada à t.a. e agitada por

mais 5 horas, então se aqueceu a solução 55

C e agitou-se por 12 horas. Após o

término da reação adicionou-se metanol e o solvente foi retirado sob pressão

reduzida. O material foi submetido à análise de massas que indicou a formação do

alcalóide 85. No entanto, a purificação da amostra seria muito difícil devido a enorme

quantidade de sub-produtos.

5.2.27. Preparação da 2-anilina-2-butenodioato de dimetila (89) e 2-(4-

metoxianilina)-2-butenodioato de dimetila (90).

Em um balão de fundo redondo contendo anilina 87 (5.0 g, 0.054 mol) em

MeOH seco (54 mL), adicionou-se acetilenodicarboxilato de dimetila (7.7 g , 0.054

mol) sob N

à 55

C. Acompanhou-se a reação através de CCD utilizando como

eluente hexano. Após término da reação evaporou-se o MeOH e em seguida

adicionou-se CH

(30 mL) para extração e a fase orgânica foi lavada com solução

saturada de NH

Cl (3 x 10 mL) e em seguida com água (3 x 10 mL). A fase orgânica

foi seca e evaporada. Obteve-se 89 com rendimento de 50% (6.3 g).

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 9.67 (sl, 1H); 7.32 – 7.25 (m, 2H); 7.13 – 7.05 (m, 1H);

6.92 – 6.88 (m, 2H); 5.39 (s, 1H); 3.74 (s; 3H); 3.70 (s, 3H).

111

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 169.75; 164.72; 147.91; 140.18; 129.03; 124.13;

120.60; 116.56; 93.46; 52.62; 51.07.

EM (intensidade relativa %) m/z: 235.25 (6.9); 144.15 (93); 77.10 (100).

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3457; 3380; 2953; 1739; 1668; 1282; 1031.

Em um balão de fundo redondo contendo anisilina 88 (5.0 g, 0.041 mol) em

MeOH seco (41 mL), adicionou-se DMAD (5.8 g, 0.041 mol) sob N

à 55

Acompanhou-se a reação através de CCD utilizando como eluente hexano Após

término da reação evaporou-se o MeOH e em seguida adicionou-se CH

(30 mL)

para extração e a fase orgânica foi lavada com solução saturada de NH

Cl (3 x 10

mL) e em seguida com de água (3 x 10 mL). A fase orgânica foi seca e evaporada e

obteve-se rendimento de 50% (5.5 g) de 90.

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 9.57 (sl, 1H); 6.91 – 679 (m, 4H); 5.30 (s, 1H); 3.78 (s,

3H); 3.73 (s, 3H); 3.67 (s, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 182.44; 170.0; 164.76; 156.87; 148.99; 133.39; 122.96;

114.34; 91.66; 55.40; 52.61; 21.01.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3284; 3210; 2952; 2836; 1742; 1637; 1033.

EM (intensidade relativa %) m/z: 265.50 (13); 146.15 (75); 77.15 (95).

5.2.28. Preparação do 4-oxo-1,4-diidro-2-quinolina carboxilato de metila

(91) e 6-metoxi-4-oxo-1,4-diidro-2-quinolina carboxilato de metila (92).

A um balão de fundo redondo contendo um condensador de refluxo

adicionou-se difenil éter (8 mL). Este foi aquecido com a ajuda de um banho de areia

por cerca de 30 minutos até atingir a temperatura de refluxo, então se adicionou a

enanima 89 (1 g, 4.25 mmol) e após 10 minutos de refluxo retirou-se este sistema do

banho de areia e colocou-o em banho de gelo, notando-se a precipitação dos

substratos. Fez-se uma pré-purificação utilizando uma separação dry-flash, com

eluição gradiente de hexano a metanol. O composto 91 foi obtido em 70% de

rendimento (600 mg) após recristalização.

P.F.= 215 – 225

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 12.03 (s, 1H); 8.13 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 7.95 (d, J = 10

Hz, 1H); 7.66 – 7.63 (m, 1H); 7.35 – 7.32 (m, 1H); 6.73 (s; 1H); 3.99 (s; 3H).

RMN

C (100 MHz, CDCl

) δ: 176.39; 161.09; 138.44; 135.75; 130.55; 124.37;

123.04; 122.09; 117.89; 108.77; 51.53.

112

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3436; 2925; 2886; 1733; 1639; 1538; 1033.

EM (intensidade relativa %) m/z: 203 (30); 143 (100); 115.15 (73); 89.15 (66).

Em um balão de fundo redondo e condensador de refluxo adicionou-se difenil

éter (8 mL), com a ajuda de um banho de areia este foi refluxado por cerca de 30

minutos até atingir o refluxo, neste momento adicionou-se a enanima 90 (1.0 g , 3.8

mmol) e após 10 minutos de refluxo retirou-se este sistema do banho de areia e

colocou-o em banho de gelo, notando-se a precipitação dos substratos. Fez-se uma

pré-purificação utilizando uma separação dry-flash, com eluição gradiente de hexano

a metanol. O composto 92 foi submetido à recristalização obtendo-se 60 % de

rendimento (530 mg).

P.F.= 250 – 260

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 12.14 (s, 1H); 7.91 (d, J = 9.1 Hz, 1H); 7.46 (d, J = 2.8

Hz, 1H); 7.66 (dd, J = 9.0 e 2.8 Hz, 1H); 6.67 (s, 1H); 3.96 (s, 3H); 3.85 (s, 3H).

RMN

C (100 MHz, CDCl

) δ: 176.30; 162.28; 155.78; 136.18; 134.16; 126.73;

122.84; 120.91; 108.34; 103.19; 54.94; 52.90.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3440; 2935; 2865; 1729; 1639; 1552; 1024.

EM (intensidade relativa %) m/z: 207.50 (54); 173.2 (91); 73.2 (100).

5.2.29. Preparação do 2-(S)-[2-(2-oxiranil)etil]-4-quinolinona (98).

Tentativa 1:

Em um balão de fundo redondo preparou-se o reagente de Grignard utilizando

o brometo 95 (100 mg, 0.42 mmol) e Mg (37 mg, 1.5 mmol) em Et

O seco (2 mL) sob

atmosfera de N

. Após 24 h. de agitação com a ajuda de cânula transferiu-se esta

mistura para uma solução do tosilato 97 (186 mg, 0.82 mmol) em Et

O seco (2 mL)

Após 12 h. adicionou-se solução saturada NH

Cl (3 mL), extraiu-se a fase aquosa

com acetato de etila (3 x 10 mL) a fase orgânica foi seca com MgSO

anidro e

solvente evaporada recuperando-se o brometo 95.

Tentantiva 2:

Em um balão de fundo redondo preparou-se o reagente de Grignard utilizando

o brometo 95 (445 mg, 1.87 mmol) e Mg (50 mg, 2.0 mmol) em Et

O seco (5 mL) sob

atmosfera de N

. Após 6 h. de agitação sob refluxo brando adicionou-se uma

solução do tosilato 97 (186 mg, 0.88 mmol) em Et

O seco (4 mL) e em seguida uma

solução do tetracuprato de lítio (1 mL, 0.14 mmol) em Et

O seco (7mL). Após 12 h.

113

adicionou-se solução saturada NH

Cl (3 mL), extraiu-se a fase aquosa com acetato

de etila (3 x 10 mL) a fase orgânica foi seca com MgSO

anidro e solvente

evaporada recuperando-se o brometo 95.

5.2.30. Preparação (4-oxo-1,4-diidro-2-quinolinil)-metilmetanossulfonato

(106)

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de N

a 0

C dissolveu-se o

álcool 93 (100 mg, 0.57 mmol) em CH

anidro (2 mL), em seguida adicionou-se

piridina (46 L, 0.57 mmol) e o MsCl (31 L, 0.57 mmol) gota a gota. Acompanhou-

se a reação por CCD e após 1h todo o material de partida havia sido consumido.

Lavou-se a fase orgânica com CuSO

(3 x 10 mL), secou-se com Na

anidro, o

solvente foi evaporado e a purificação do material foi feita utilizando coluna

cromatográfica e DCM:AcOEt (1:1) como eluente. Obteve-se 80% (115 mg) do

mesilato 106.

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 8.11 – 8.02 (m, 2H); 7.82 – 7.78 (m, 1H); 7.65 – 7.61

(m, 1H); 7.41 (m, 1H); 4.94 (s, 2H); 3.32 (s, 3H).

RMN

H -

N (400 MHz, CDC l

) δ: 8.11 – 8.02 (m, 2H); 7.41 (s, 1H); 4.94 (s, 2H)

acoplam com N em 272.6 ppm (N de 12 = 129.4 ppm).

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3463; 3448; 2900; 1619; 1602; 1328; 1172; 1049.

5.2.31. Preparação do 4-(4-metoxibenziloxi)-2-((4-

metoxibenziloxi)metil)quinolina (119) e 1-(4-metoxibenzil)-2-((4-

metoxibenziloxi)metil)-4-quinolinona (120)

Tentativa 1:

Em um balão de fundo sob atmosfera de N

contendo o álcool 93 (10 mg, 0.06

mmol) dissolvido em DMSO anidro (1 mL), adicionou-se NaH 60% em óleo mineral

(4.8 mg, 0.126 mmol). Após 15 min. adicionou-se o brometo de 4-metoxi benzila (25

mg, 0.12 mmol). Acompanhou-se a reação por CCD utilizando DCM:AcOEt 9:1 como

eluente e após 12 h. a reação foi interrompida com adição de H

O (3 x mL). A fase

orgânica foi seca com Na

anidro e o solvente evaporado em rotaevaporador

rotativo. Obteve-se 70% do material bruto (11 mg) que foi analisado por RMN

onde se pode observar a formação da mistura de produtos N- e O-alquilados.

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 8.21 (dddd, J= 0.5, 1.5, 8.5 Hz, 1H); 7.97 (ddd, J= 0.6,

1.1, 9.1 Hz, 1H); 7.67 (ddd, J= 1.5, 6.8, 8.4 Hz, 1H); 7.48 – 7.41 (m, 3H); 7.31 (d, J=

114

8.7 Hz, 2H); 7.10 (s, 1H); 6.95 (d, J= 8.7 Hz, 2H); 6.89 (d, J= 8.7 Hz, 2H); 5.22 (s,

2H); 4.79 (s, 2H); 4.58 (s, 2H); 3.83 (s, 3H), 3.83 (s, 3H).

Obs.: Para se determinar a proporção dos produtos fez-se um experimento de

RMN

H do material bruto levando-se em conta apenas a ausência ou não dos sinais

referentes à H3.

5.2.32. Preparação do ácido 4-metoxibenzil fosfórico 123

Uma solução de álcool 4-metoxibenzílico (124) (1.0 g, 0.725 mol) em THF (5

mL) e trietilamina (4.2 mL) foi resfriada a –5

C e POCl

(2.1 mL) foi adicionado. A

mistura resultante foi mantida à t.a. por 10 min., resfriou-se a solução em N

liq. para

solidificar e H

O (30 mL) foi adicionada. Ajustou-se o pH para 5 pela adição gradual

de uma solução aquosa 3M de KHCO

(20 mL) e o THF foi removido por

evaporação, as impurezas foram separadas por extração com CHCl

(2 x 20 mL). A

fase aquosa contendo o fosfato 122 foi acidificado com uma solução de HCl 10 M (2

mL) e extraído com AcOEt (3 x 80 mL). As fases orgânicas foram re-extraídas com

O (20 mL) e uma solução de NaHCO

0.5 M (3 mL) foi lentamente adicionado

para ajustar o pH da fase aquosa a pH 4-5. A fase aquosa contendo 123 foi

concentrada (a um volume de 3 mL) e foi usada sem purificação para fazer as N-

alquilações.

Tentativa 2:

Em um balão de fundo redondo contendo um sistema de refluxo adicionou-se

o álcool 124 (14.5 mg, 0.083 mmol), o fosfato 123 (50 mg, 0.25 mmol) e MeOH (3 x

3 mL). Aqueceu-se o meio reacional e após 4 dias observou-se o consumo do álcool

124.

5.2.33. Preparação do cis 1-bromo-3-hexeno (136)

Em um balão de fundo redondo sob agitação magnética e atmosfera N

adicionou-se PPh

(2.62g, 9.98 mmol) em CH

anidro (20 mL) à 0

C. Gotejou-se

(511 L, 9.98 mmol) lentamente até que a coloração amarela se mantivesse por

apenas 10 segundos de agitação. Então PPh

foi adicionado aos poucos até que a

coloração amarela variasse imediatamente. Adicionou-se o álcool 128 (1.18 mL,

9.98 mmol) gota a gota, removeu-se o banho de gelo e agitou-se a t.a. e após 3 h.

observou-se que todo o material de partida havia sido consumido. Adicionou-se

solução saturada de NaHCO

(30 mL) e extraiu-se a fase aquosa utilizando CH

(3 x 20 mL), a fase orgânica foi seca com Na

anidro e o solvente evaporado em

115

rotaevaporador. Precipitou-se o fosfinóxido formado com hexano. O material foi

então purificado utilizando coluna cromatográfica com hexano como eluente, e

obteve-se 1.1 g de 136 (70% de rendimento).

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 5.60 – 5.47 (m, 1H); 5.38 – 5.26 (m, 2H); 3.36 (t, J =

7.1 Hz, 2H); 2.61 (q, J = 7.0 Hz, 2H); 2.05 (quint, J = 7.0 Hz, 2H); 0.97 (t, J = 7.0 Hz,

2H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 134.69; 125.14; 32.51; 30.69; 20.68; 14.10.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3012; 2966; 2935; 2873; 1457; 1265; 1207.

5.2.34. Preparação do (4S)-4-(metoxi benziloximetil)-2,2-dimetil-1,3-

dioxolano (137)

Em um balão de fundo redondo, à 0

C sob atmosfera de N

contendo NaH

60% em óleo mineral (43.6 mg, 1.13 mmol) adicionou-se THF anidro (2 mL) e

adicionou-se gota a gota uma solução do álcool 126 (150 mg, 1.13 mmol) em THF

anidro (1mL). Após 30 min. adicionou-se o PMB-Br (229.1 mg, 1.13 mmol).

Acompanhou-se a reação por CCD e após 3 h. adicionou-se H

O (3 x 3 mL) e

extraiu-se a reação. A fase orgânica foi seca com Na

anidro e o solvente

evaporado em rotaevaporador. Obteve-se um rendimento de 50% (142 mg) de 134

como material bruto. Devido à sua volatilidade, este foi utilizado na preparação de

137 sem purificação.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2931; 2908; 2861; 1612; 1511; 1249; 1033; 817.

5.2.35. Preparação do (2R)-3-(4-metoxibenziloxi)-propano-1,2-diol (138)

Em um balão de fundo redondo contendo 137 (142 mg, 0.56 mmol) adicionou-

se THF (5 mL) e adicionou-se gota a gota uma solução de HCl 10% (5 mL).

Acompanhou-se a reação por CCD e após 6 h. adicionou-se solução saturada de

NaHCO

(3 mL) e extraiu-se a reação com DCM (3 x 5 mL). A fase orgânica foi seca

com Na

anidro e o solvente evaporado em rotaevaporador rotativo. A

purificação do composto 138 foi feita utilizando coluna cromatográfica com

hexano:AcOEt (9:1) como eluente, obtendo-se 50% de rendimento (60 mg).

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3413; 2931; 2912; 2838; 1612; 1511; 1249; 1033; 817.

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 7.25 – 7.23 (m, 2H); 6.88 – 6.86 (m, 2H); 4.46 (s, 2H);

3.79 (s; 3H); 3.67 – 3.63 (m, 1H); 3.59 – 3.52 (m, 2H); 3.50 – 3.46 (m, 2H).

116

5.2.36. Preparação do 1- t-butildimetilsililoxi-3-(4-metoxibenziloxi)-propan-2-ol

(139)

Em um balão de fundo redondo sob atmosfera de N

contendo o diol 130 (50

mg, 0.235 mmol) dissolvido em DMF anidro (1 mL) adicionou-se imidazol (32 mg,

0.47 mmol). Agitou-se a solução por 5 min. e adicionou-se o TBSCl (32 mg, 0.21

mmol) e DMAP (1 mg, 0.008 mmol). Acompanhou-se a reação por CCD utilizando

Hexano:AcOEt 9:1 como eluente e após 12 h. adicionou-se H

O (5 mL) e extraiu-se

a reação utilizando DCM (3 x 5 mL). A fase orgânica foi seca com Na

anidro e o

solvente evaporado em rotaevaporador. A purificação foi feita utilizando coluna

cromatográfica utilizando como eluente 9:1, hexano: AcOEt, obtendo-se 70% de

rendimento de 139 (48 mg ).

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3448; 2954; 2931; 2858; 1612; 1511; 1249; 1091; 836; 779.

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 7.26 – 7.24 (m, 2H); 6.89 – 6.86 (m, 2H); 4.48 (s, 2H);

3.80 (s; 3H); 3.64 (dddd, J = 4.9, 10, 14 Hz, 2H); 3.52 – 3.43 (m, 3H); 0.88 (s, 9H);

0.06 (s, 6H).

5.2.37. Preparação do (1R)-2-t-butildimetilsililoxi-1-(4-metoxibenziloximetil)-etil

metanossulfonato (127)

Em um balão de fundo sob atmosfera de N

contendo o álcool 139 (113 mg,

0.35 mmol) dissolvido em CH

anidro (500 L) adicionou-se piridina (85 L, 1.05

mmol). Agitou-se a solução por 5 min. e adicionou-se o MsCl (30 L, 0.52 mmol)

acompanhou-se a reação por CCD utilizando hexano:AcOEt 9:1 como eluente e

após 6 h. a reação foi extraída com CH

(3 x 5 mL), lavada com solução saturada

de CuSO

(2 x 3 mL). A fase orgânica foi seca com Na

anidro e o solvente

evaporado em rotaevaporador rotativo. A purificação da amostra foi feita através de

coluna cromatográfica utilizando 9:1 hexano:AcOEt como eluente obtendo-se 98 mg

de 127 (70% de rendimento).

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 3012; 2954; 2931; 2858; 1612; 1361; 1103; 836; 779.

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 7.24 (d, J = 8.5 Hz, 2H); 6.89 (d, J = 9 Hz, 2H); 4.78

(quint, J = 5.3 Hz, 1H); 4.85 (s; 2H); 3.81 – 3-79 (m, 4H); 3.66 (s, 3H); 2.98 (s, 3H);

0.88 (s, 9H); 0.069 (s, 6H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 159.33; 129.53; 113.81; 81.90; 73.09; 68.79; 62.62;

55.19; 38.33; 25.72; -5.57.

117

5.2.38. Preparação do 4-metoxi-2-quinolina carboxilato de metila (91-1).

Em um frasco contendo o alcalóide 91 (20 mg, 0.1 mmol) e K

(20.7 mg ,

0.15 mmol) adicionou-se DMF (50 L) anidro e MeI (9.5 L, 0.15 mmol). Agitou-se

por 12 horas à t.a. A solução foi filtrada utilizando-se sílica para a retirada do

precipitado, o solvente concentrado e o material resultante foi purificado

empregando-se cromatografia de coluna utilizando gradiente de hexano – metanol

como eluente. Obteve-se 17 mg do produto 91-1 (80%).

P.F.: 150 –152

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 8.23 (dd, J = 8 e 2 Hz, 2H); 7.81 – 7.72 (m, 1H); 7.64 –

7.56 (m, 2H); 4.14 (s, 3H); 4.09 (s, 3H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 166.26; 163.32; 149.11; 148.43; 130.43; 130.19;

127.57; 122.22, 121.73; 100.14; 56.08; 53.22.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2927; 2821; 1733; 1637; 1465; 1033.

EM (intensidade relativa %) m/z: 217 (12.6); 159 (100); 130 (25).

5.2.39. Preparação do 4-etoxi-2-quinolina carboxilato de metila (91-2)

Idem procedimento 5.2.36.

P.F.: 112 –115

RMN

H (200 MHz, CDCl

) δ: 8.28 – 8.19 (m, 2H); 7.79 – 7.71 (m, 1H); 7.62 – 7.54

(m, 2H); 4.35 (q, J = 6 Hz, 2H); 4.07 (s, 3H); 1.58 (q, J = 6 Hz, 2H).

RMN

C (50 MHz, CDCl

) δ: 166.33; 162.61; 149.08; 148.49; 130.37; 130.16;

127.42; 122.30, 121.85; 100.66; 64.63; 53.19; 14.41.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2923; 2852; 1735; 1654; 1376; 1025.

EM (intensidade relativa %) m/z: 231 (15); 173 (100); 145 (85); 89 (75).

5.2.40. Preparação do 4,6-dimetoxi-2-quinolina carboxilato de metila (92-

Idem procedimento 5.2.36.

P.F.: 95 – 98

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 8.12 (d, J = 9.2 Hz, 1H); 7.58 (s, 1H); 7.45 (d, J = 2.8

Hz, 1H); 7.39 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 1); 4.12 (s, 3H); 4.06 (s, 3H), 3.96 (s, 3H).

RMN

C (100 MHz, CDCl

) δ: 166.41; 162.03; 159.03; 146.60; 144.34; 131.81;

123.33; 123.21; 100.49; 99.44; 55.99; 55.65; 53.10.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2937; 2852; 1729; 1623; 1483; 1230; 1097.

118

5.2.41. Preparação do 4-etoxi-6-metoxi-2-quinolina carboxilato de metila

(92-2)

Idem procedimento 5.2.36.

P.F.: 105 – 107

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 8.11 (d, J = 9.2 Hz, 1H); 7.55 (s, 1H); 7.46 (d, J = 2.8

Hz, 1H); 7.48 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 2H); 4.36 (q, J = 7Hz, 2H); 4.06 (s, 3H); 3.96 (s,

3H); 1.60 (t, J = 7 Hz, 3H).

RMN

C (100 MHz, CDCl

) δ: 166.46; 161.29; 158.91; 146.60; 144.42; 131.82;

123.42; 123.02; 101.01; 99.61; 64.53; 55.64; 53.08; 14.48.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2933; 2856; 1730; 1639; 1483; 1236; 1024.

TABELA 5.1: DADOS EXPERIMENTAIS DA PREPARAÇÃO DOS DERIVADOS QUINOLINAS

Material de

partida

(mg, mmol)

Haleto

(L, mmol).

Composto

1 (20, 0.1) (20.7, 0.15l) (7.5, 0.10). 91-2 (18mg, 80%)

2 (10, 0.043) (6, 0.065) (5, 0.065). 92-1 (7 mg, 70%).

3 (13, 0.06) (8, 0.09) (7, 0.09). 92-2 (12 mg, 80%).

4 (30, 0.14) (30.7, 0.15) (14, 0.22). 94-1 (19 mg, 60%)

5 (30, 0.14) (32.8, 0.16) (16, 0.21). 94-2 (22 mg, 60%)

5.2.42. Preparação do 4-etoxi-2-etoximetil-6-metoxiquinolina (142)

A uma suspensão de NaH 60% (3 mg, 0.077 mmol) em DMF anidro (100 L)

e DME (500 L) foi adicionada uma solução da quinolona 94 (15 mg, 0.064 mmol) e

DME (100 L) à 0

C. Depois de 10 minutos a mistura reacional foi tratada com LiBr

(12 mg, 0.128 mmol) e agitada por 15 minutos. Em seguida o brometo de etila (8.3

mg, 0.077 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura reacional foi agitada a t.a. por

1-6 h. e então gelo foi adicionado. A mistura foi extraída utilizando AcOEt (3 x 10

mL) e as fases orgânicas foram combinadas e lavadas com NaCl saturado (3 x 5

mL), seco com sulfato de sódio anidro e concentrado a vácuo. O resíduo foi

purificado por coluna cromatográfica usando 6:4 hexano:acetato de etila. Obteve– se

o composto 142 com 80% de rendimento (13.3 mg).

P.F.: 69 – 72

119

1 2 3 4

RMN

H (400 MHz, CDCl

) δ: 7.88 (d, J = 9.1 Hz, 1H); 7.44 (d, J = 2.8 Hz, 1H); 7.32

(dd, J = 9.1, 2.8 Hz, 1H); 6.94 (s, 1H); 4.71 (s, 2H); 4.30 (q, J = 7.0 Hz, 2H); 3.93 (s,

3H); 3.64 (q, J = 7 Hz, 2H), 1.57 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.29 (t, J = 7 Hz, 3H).

RMN

C (100 MHz, CDCl

) δ: 161.27; 158.11; 157.12; 144.39; 129.92; 121.97;

99.98; 98.82; 74.39; 66.35; 64.09; 55.56; 15.28; 14.55.

IV (ν

max

, KBr) cm

-1

: 2975; 2931; 2886; 1704; 1596; 1224; 1093; 831.

5.2.43. Ensaios Atividade Antileishmanicida

Inicialmente preparou-se a cultura de células L. major, que foi transferida para

um meio contendo M199, até se obter uma concentração ideal (cultura 1 x 10

cel/m).

Após realizar a diluição das células adicionou-se 2 mL dessa solução em

cada poço de uma placa de 12 poços.

FIGURA 5.1: PLACA DE ACRÍLICO COM 12 POÇOS

Nos poços da linha 1 foi colocada apenas a solução de cultura, denominada

de Controle, na linha 2 foi adicionado ao meio de cultura DMSO (10 L). Nos poços

da linha 3 e 4 adicionou-se as soluções dos inibidores nas concentrações de 50, 25

e 10 mg/mL a um volume total de 10 L de DMSO.

Após 48 e 72 h transferiu-se essas

soluções da placa 12 em quadruplicata para uma

placa de 96 poços, em seguida adicionou-se

uma solução MTS e PMS (20 L).

Pode-se verificar os resultados obtidos

através da leitura da placa de 96 poços, esta foi

realizada após 2 h em um aparelho SPECTRAmax® PLUS

384

, Microplate

Spectrophotometer.

120

5.2.44. Ensaios Leihsmania

Procedimento segundo FERREIRA et al., 2004.

5.2.45. APRT

Procedimento segundo AMBROZIN et al., 2005.

5.2.46. Cultura e Manutenção da Leishmania

Formas promastigotas de L. braziliensis e L. amazonensis,

MHOM/BR1987/M11272 e MHOM/BR/1977/LTB0016 foram cultivadas em meio

Schneider’s (Meio de cultura de células sigma, St. Louis, MO, USA), suplementado

com soro bovino fetal (FCS) 10%(v/v), temperatura de 25°C e pH 7.2.

Concentrações dos extratos ou metabólitos secundários e formas

extracelulares

Os compostos utilizados foram adicionados na cultura de parasitas com 4X10

células promastigotas /mL nas concentrações de 320 até 10 µg/mL em

dimetilsulfóxido (DMSO) (a concentração mais alta utilizada foi de 1.6%, v/v) e

incubadas a 25°C.

Após 24 horas de incubação os parasitas remanescentes foram contados em

câmara de Neubauer e o percentual de inibição foi calculado por comparação com

os controles. O valor da LD

/24h foi determinado pela regressão linear do

percentual de inibição usando um limite de erro estatístico de 10%. Todos os testes

serão feitos em triplicata e usando isotiocianato de pentamidina como fármaco de

referência.

5.2.47. Enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) de Schistosoma

mansoni

Os protocolos de expressão e purificação da PNP são bem estabelecidos e

executados de maneira rotineira no Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural

(CBME) do Instituto de Física de São Carlos (PEREIRA et al., 2005). Resumidamente,

a enzima é expressada e purificada em fusão com a Maltose Binding Protein (MBP)

com o uso de bactérias E. coli geneticamente modificadas, e purificada em duas

colunas. A primeira purificação é realizada em coluna de amilose, por afinidade.

Segue-se então a clivagem, para a separação da PNP e MBP, feita com o auxílio de

fator Xa. Após o término da clivagem (cerca de 96 horas) a PNP pura é obtida por

121

HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) na coluna de troca catiônica POROS

20 HS. A enzima pura é coletada e armazenada em condições padrões

desenvolvidas nos laboratórios no CBME.

5.2.48. Avaliação da fitotoxicidade sobre a síntese de ATP durante a fase

luminosa da fotossíntese.

Os ensaios foram realizados com soluções das amostras em variadas

concentrações em DMSO. Para a avaliação da inibição da síntese de ATP foram

utilizados cloroplastos isolados das folhas de espinafre (S. oleracea L.), com

posterior determinação da concentração de clorofila.

Para extração dos cloroplastos de espinafre (S. oleracea L.), as folhas livres

da nervura central e das extremidades basal e apical (25 g) foram trituradas em

liquidificador e submetidas à extração com 100 mL do seguinte meio: sacarose (400

mmol L

-1

), MgCl

(5 mmol L

-1

), KCl (10 mmol L

-1

) e K

-tricina (30 mmol L

-1

) em pH 8,0

(1 mol L

-1

KOH). O meio foi homogeneizado e filtrado com o auxílio de quatro

camadas de gaze. O filtrado depois de centrifugado (3500 x g) foi retirado o

sobrenadante e o sólido contendo os cloroplastos foi dissolvido em 1 mL de um meio

constituído por: sorbitol (100 mmol L

-1

), KCl (10 mmol L

-1

), MgCl

(5 mmol L

-1

) e K

tricina (1 mmol L

-1

) em pH 8,0 (1 mol L

-1

KOH) (LOTINA-HENNSEN, 1999).

Para determinar a concentração da clorofila uma alíquota de 50 µL da

suspensão de cloroplastos foi transferida para um tubo de centrífuga contendo 3 mL

de acetona, onde foi agitada. A amostra permaneceu no escuro por cinco minutos e

depois foi submetida à centrifugação clínica. As medidas de absorbâncias do

sobrenadante foram medidas nos comprimentos de onda de 645 e 663 nm de

acordo com a equação abaixo (ROMAGNI, 2002).

Clorofila (µg mL

-1

) = 20,2 (A

645

) + 8,02 (A

663

)

A síntese de ATP em fotofosforilação foi determinada titrimetricamente

utilizando-se a combinação de um microeletrodo tipo Clark, conectado a um

potenciômetro de escala expandida, com pH ajustado em aproximadamente 8,0. Foi

utilizado o seguinte meio reacional: clorofila (20 µg mL

-1

), sacarose (100 mmol L

-1

MgCl

.6H

O (5 mmol L

-1

), KCl (10 mmol L

-1

) e K

[Fé(CN)

] (K

-tricina) 1 mmol L

-(1)

pH 8 (1 mmol L

-1

KOH) na presença de ADP (1 mmol L

-1

) e KH

(3 mmol L

-1

). A

reação teve início com iluminação saturante de 350 Watts (lâmpada comum). Como

aceptor de elétrons para a síntese de ATP utilizou-se 100 ppm de dicloreto de 1,1’-

122

dimetil-4,4’-bipiridínio (dicloreto de paraquat). Para avaliar a ação das amostras na

inibição da síntese de ATP foram adicionados ao meio reacional as soluções em

concentrações de 10, 20, 25, 30, 40, 50 e 100 µmol L

-1

e as medidas foram

comparadas com o controle (1200 µmol L

-1

ATP mg Chl h

-1

) (LOTINA-HENNSEN, 1999).

123

2-oxopentanoato de dimetila 58a

(2R)- e (2S)-hidroxi-1,5-pentanodioato de dimetila (57)

124

(4S)- e (4R)-4,5-diidroxipentanoato de metila (63).

(4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il] propanoato de metila 64).

125

(4S)- e (4R)-[2,2-dimetil-1,3-dioxalan-4-il]-butan-2-ona (52).

(2S)-2-t-butildimetilsililoxi-pentanodioato de dimetila (65).

126

(4S)-4-hidroxi-5-metoximetoxi-pentanoato de metila (68).

127

N,N–dietil-2-nitrobenzamida (73)

N,N– dietil-5-metoxi-2-nitrobenzamida (74)

128

2-amino-N,N–dietilbenzamida (75)

2-amino-N,N-dietil-5-metoxibenzamida (76)

129

2-nitrobenzoato de metila (83).

2-nitro-5-metoxibenzoato de metila (84).

130

2-aminobenzoato de metila (81).

2-amino-5-metoxibenzoato de metila (82).

131

2-anilina-2-butenodioato de dimetila (89)

132

2-(4-metoxianilina)-2-butenodioato de dimetila (90).

133

4-oxo-1,4-diidro-2-quinolina carboxilato de metila (91)

134

6-metoxi-4-oxo-1,4-diidro-2-quinolina carboxilato de metila (92).

135

2-hidroximetil-4-quinolinona (93)

2-hidroximetil-6-metoxi-4-quinolinona (94).

136

2-bromometil-4-quinolinona (95)

cis 1-bromo-3-hexeno (136)

137

(2R)-3-(4-metoxibenziloxi)-propano-1,2-diol (138)

1- t-butildimetilsililoxi-3-(4-metoxibenziloxi)-propan-2-ol (139)

138

(1R)-2-t-butildimetilsililoxi-1-(4-metoxibenziloximetil)-etil metanossulfonato

(127)

(1R)-2-t-butildimetilsililoxi-1-(4-metoxibenziloximetil)-etil metanossulfonato

(127)

139

4-metoxi-2-quinolina carboxilato de metila (91-1).

4-etoxi-2-quinolina carboxilato de metila (91-2)

140

4,6-dimetoxi-2-quinolina carboxilato de metila (92-1)

4-etoxi-6-metoxi-2-quinolina carboxilato de metila (92-2)

141

4,6 -dimetoxi-2-quinolilmetanol (94-1)

142

4-etoxi-6-metoxi-2-quinolilmetanol (94-2)

143

4-etoxi-2-etoximetil-6-metoxiquinolina (142)

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