( PDF ) Estudo fitoquímico de três espécies de rutaceae e avaliação biológica de produtos naturais em modelos celulares e bioquímicos de tripanosomatídeos

Universidade Federal de São Carlos

Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia

Departamento de Química

Laboratório de Química de Produtos Naturais

Programa de Pós-Graduação em Química

“Estudo Fitoquímico de Três Espécies de Rutaceae e

Avaliação Biológica de Produtos Naturais em Modelos

Celulares e Bioquímicos de Tripanosomatídeos”

Anna Sylvia Ferrari Marques*

Tese apresentada como parte

dos requisitos para a obtenção do

título de Doutor em Ciências

(área de concentração Química Orgânica).

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira

* Bolsista: FAPESP

São Carlos - SP

2006

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Este trabalho foi desenvolvido

sob orientação do

Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira

Dedico este trabalho aos meus pais Gilmar, Regina e ao meu irmão Thadeu,

por estarem sempre ao meu lado me incentivando e aconselhando nas horas

mais difíceis e mostrando que acontecimentos na vida podem ser simplesmente

enfrentados. Também pelo amor incondicional e desprendimento que sempre

me proporcionaram, sem medir esforços para que tudo fosse alcançado, com

responsabilidade e honestidade.

Agradecimentos

Ao Prof. Paulo Cezar Vieira, pela amizade, orientação, ensinamentos e

pela confiança depositada durante todos estes anos para que este trabalho

fosse desenvolvido.

Aos demais professores do Grupo de Produtos Naturais, Dra. Maria

Fátima das G. F. Da Silva, Dr. João Batista Fernandes e Dr. Edson Rodrigues

Filho pelos ensinamentos, amizade e contribuições indispensáveis para a minha

formação.

Aos Prof. Dr. Octávio Henrique Thiemann, Prof. Dr. Glaucius Oliva e

Prof. Dr. Adriano Andricopulo, do IFSC-USP, pela realização dos ensaios

enzimáticos nas enzimas gGAPDH e APRT.

Ao Prof. Dr. Sérgio Albuquerque, pela realização dos ensaios em T.

cruzi na FCFRP-USP.

Ao Prof. Dr. J. R. Pirani, do Instituto de Botânica, USP-SP, pela coleta

e identificação do material botânico.

Ao Prof. Dr. Alan H. Fairlamb, da Universidade de Dundee, Laboratório

de Microbiologia Molecular e Química Biológica, Dundee, Escócia, por permitir

que uma química entrasse no fantástico mundo microscópico dos parasitas.

Aos amigos por lá feitos: Daniel C. Turnock, John L. Richardson, Mark

Ariyanagam, Isabelle Nett, Jeanine König, Neil Craig, John Nunes, sempre

abertos para qualquer dúvida e dispostos a ajudar.

Ao Prof. Rodolfo Marquez e ao Prof. Dr. Dario Alessi, da Universidade

de Dundee, Escócia, da unidade de Fosforilação de Proteínas, por permitir a

realização dos ensaios no painel das enzimas Kinases, e em especial ao aluno

Michael Keane pela realização dos ensaios e ensinamentos.

Ao meus amigos do PN (nomeá-los sem incorrer em falta seria

praticamente impossível) agradeço de coração pela amizade, companheirismo

e pela convivência sempre alegre e animada no ambiente do Laboratório e

ensinamentos que contribuíram de várias formas para que esse trabalho fosse

realizado.

À Turma de Química-98 pelas amizades sólidas, companheirismo e

aquelas cervejas... muitas saudades!

Aos amigos feitos durantes esses anos: Tatiane R. Albarici, Viviane C.

Albarici, Simone Y. Simote, Sebastião C. Silva, Richele P. Severino, André S.

Franceschini, Thiago Veiga, Patrícia Baraldi, Joel Alvim Jr., Djalma A. P. dos

Santos, Patrícia Braga, Emerson F. Marques, Nádia A. Silveira, todos estão no

meu coração!

Aos amigos e professores dos laboratótrios de Síntese, de HPLC, de

RMN e de Inorgânica, agradeço pela amizade e convivência.

Ao corpo técnico do DQ-UFSCar, em especial a Luciana Vizotto pela

obtenção dos espectros de RMN, ao Valdir, Doraí e Mariana pela amizade e

disposição em ajudar. Ao Eli Pimenta e ao Aderson Zotti, pela realização dos

ensaios enzimáticos em gGAPDH e APRT.

À Neusa T. Celere e à Milena Celere, pela amizade, constante

incentivo e por me fornecerem inúmeras das referências usadas neste trabalho.

Muito obrigada!

Especial ao André Luis Sarria Franceschini, pela amizade, ajuda na

formatação deste trabalho e pela força demostrada mesmo nos momentos de

maior dificuldade.

Ao meu irmão Thadeu G. F. Marques, tia Maria Lucia Ferrari Granja e

demais familiares pelo constante incentivo e confiança depositados durante

todos esses anos.

À FAPESP pelo auxílio financeiro.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para que este

trabalho fosse realizado.

Desiderata

“S

“S“S

“Siga tranqüilamente, entre a inquietude e a pressa, lembrando-se que há sempre

paz no silêncio. Tanto quanto possível, sem humilhar-se viva em harmonia com

todos os que o cercam. Fale a sua verdade mansa e claramente, e ouça a dos outros,

mesmo a dos insensatos e ignorantes, eles também tem sua própria história. Evite as

pessoas agressivas e transtornadas, elas afligem o nosso espírito. Se você se comparar

com os outros, você se tornará presunçoso e magoado, pois haverá sempre alguém

inferior e alguém superior a você. Você é filho do universo, irmão das estrelas e

árvores, você merece estar aqui; e mesmo que você não possa perceber, a Terra e o

Universo vão cumprindo o seu destino. Viva intensamente o que já pode realizar,

mantenha-se interessado em seu trabalho, ainda que humilde, ele é o que de real

existe ao longo de todo o tempo. Seja cauteloso nos negócios, porque o mundo está

cheio de astúcia, mas não caia na descrença, a virtude existirá sempre. Muita gente

luta por altos ideais, em toda parte a vida está cheia de heroísmo. Seja você mesmo,

principalmente não simule afeição nem seja descrente do amor, porque mesmo diante

de tanta aridez e desencanto ele é tão perene quanto a relva. Aceite com carinho o

conselho dos mais velhos, mas também seja compreensivo aos impulsos inovadores da

juventude, alimente a força do espírito que o protegerá no infortúnio inesperado; mas

não se desespere com perigos imaginários, muitos temores nascem do cansaço e da

solidão. E a despeito de uma disciplina rigorosa seja gentil consigo mesmo. Você é

filho do universo, irmão das estrelas e árvores, você merece estar aqui; e mesmo que

você não possa perceber a terra e o universo, vão cumprindo o seu destino. Portanto

esteja em paz com Deus, como quer que você o conceba e quaisquer que sejam os seus

trabalhos e aspirações, da fatigante jornada pela vida, mantenha-se em paz com sua

própria alma. Acima da falsidade, do desencanto e agruras, o mundo ainda é bonito.

Seja prudente. FAÇA TUDO PARA SER FELIZ.”

Max Ehrmann (1872-1945)

Poeta alemão

Resumo

ESTUDO FITOQUÍMICO DE TRÊS ESPÉCIES DE

RUTACEAE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE PRODUTOS

NATURAIS EM MODELOS CELULARES E BIOQUÍMICOS DE

TRIPANOSOMATÍDEOS - Este trabalho descreve a busca de metabólitos

secundários bioativos de plantas da família Rutaceae, com o intuito de serem

avaliados contra os parasitas causadores da Tripanosomíase Americana

(Doença de Chagas), Tripanosomíase Humana Africana (Doença do Sono) e

leishmanioses. Para tal, foram selecionadas as enzimas gGAPDH

(Glicerladeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal) de Trypanosoma cruzi,

APRT (Adenina fosforribosiltransferase) de Leishmania tarentolae, TryR

(Tripanotiona redutase) de Trypanosoma cruzi. As enzimas Kinases,

responsáveis por uma série de doenças graves, também foram alvos avaliados

neste estudo. Realizaram-se também ensaios in vitro sob as cepas Y das

formas tripomastigotas (infectante) de T. cruzi e também sobre as formas

tripomastigotas de T. brucei brucei, linhagem 427. O ensaio para avaliação de

T. cruzi mostrou que a espécie Balfourodendron riedelianum foi mais ativa que

as demais plantas avaliadas. Já na avaliação de T. brucei brucei, a espécie

Helietta apiculata foi mais ativa. O estudo fitoquímico das espécies

Balfourodendron riedelianum (Br), Helietta apiculata (Ha) e Galipea carinata

(Gc), levou ao isolamento de trinta e quatro metabólitos secundários, sendo os

alcalóides já conhecidos dictamina (1, Br), evolitrina (2, Br), esquimianina (6,

Br), γ-fagarina (3, Br), N-metil-4-metoxi-2-quinolona (10, Br), N-metil-

flindersina (13, Br), flindersiamina (8, Ha), kokusaginina (4, Br), maculosidina

(5, Br), maculina (7, Ha), rutacarpina (14, Br), N-metil-4,7,8-trimetoxi-2-

quinolona (11, Gc) e os alcalóides inéditos: 1,4,7-metoxi-2-quinolona (12, Ga),

e 5-hidroxiflindersiamina (9, Ha). Foram isoladas e identificadas uma série de

amidas, sendo cinco delas de núcleo N-benzoilamida: (17, Br), (18, Br), (19,

Br) e (20, Br) e duas do tipo N-isobutilamida: (21, Br) e (22, Br). Foi ainda

isolada uma amina quaternária, a N,N,N-trimetil-4-hidróxifeniletilamina

(candicina) (15, Ga), além de dois amináocidos: N-metilprolina (23, Br) e 4-

hidroxi-N-metilprolina (24, Br). Três lignanas foram isoladas: eudesmina (25,

Resumo

Ha) e seu epímero epi-eudesmina (26, Ha) e o seringaresinol (27, Br). Um

derivado do ácido cinâmico, (28, Ha) além de dois derivados do ácido siríngico,

(29, Ha) e (30, Ha), também foram isolados. Os limonóides limonina (31, Ha) e

seu respectivo ácido, o limonéxico (32, Ha) também foram isolados, além de

dois esteróides β-sitosterol (33) e estigmaesterol (34). Ensaios biológicos

foram realizados tanto com as substâncias isoladas bem como com uma

coleção formada por alcalóides, amidas, flavonóides, dibezolimetanos e

análogos sintéticos, triterpenos, limonóides, entre outras classes visando a

busca de inibir a atividade da enzima TryR e tripanocida, contra ao protozoário

T. brucei brucei. As duas substâncias mais promissoras foram a diidrochalcona

31 com IC

50

de 19,6 ± 0,57µM na enzima TryR e o flavonóide 7 com EC

50

3,8

±0,63 µM no T. b. brucei. As substâncias isoladas apresentaram baixa inibição

na enzima gGAPDH e não foram avaliadas na APRT, devido aos problemas

de absorção no ultravioleta. Nos resultados obtidos com relação às enzimas

kinases, o alcalóide hotiacina 81, foi o mais seletivo, com 83% (10mM) de

inibição da kinase chK2, responsável pelo carcinoma mamário. Já o tanino

104, causou a inibição da maior parte das enzimas que compunham o painel,

não sendo seletivo. Durante este trabalho, uma coluna de bio-afinidade

utilizando a enzima TryR como receptor, acoplado sobre uma resina, foi

construída a qual permitiu resultados bastante promissores e avalaliação do

comportamento inibitório de substâncias. Posteriormente, a eficiência desta

coluna pode ser aperfeiçoada com a utilização técnicas mais específicas de

identificação e quantificação.

Abstract

PHYTOCHEMICAL STUDY OF THREE SPECIES OF RUTACEAE AND

BIOLOGICAL EVALUATION OF NATURAL PRODUCTS ON CELULAR AND

BIOCHEMICAL MODELS FROM TRIPANOSOMES- The present work

describes the search of bioactive secondary metabolites isolated from plants

from the Rutaceae family, against the parasites responsible for the American

Trypanosomiasis (Chagas’s disease), African Human Trypanosomiasis

(Sleeping sickness) and leishmaniasis. For that, the selected enzymes were

gGAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase) from Trypanosoma

cruzi, APRT (Adenine phophoribosiltransferase) from Leishmania terentolae,

TryR (Trypanothinone reductase) from Trypanosoma cruzi as well as against the

enzymes from the Kinase panel, which are responsible for serious diseases. The

in vitro assays were also carried out against the tripomastigotes Y strains from

T. cruzi and also against the bloodstream form of T. brucei brucei, 427 strain.

The assays against T. cruzi showed that the Balfourodendron riedelianum (Br)

species were more active compared with the other species studied. As for the

trypanocidal assays against T. brucei brucei, the Helietta apiculata species were

more active. The phytochemical study of Balfourodendron riedelianum, Helietta

apiculata (Ha) and Galipea carinata (Ga), lead to the isolation of thrirty four

secondary metaboilites, as alkaloids already known in the literature: dictamine

(1, Br), evolitrine (2, Br), skimmianine (6, Br), maculosidine (5, Br),

kokusaginine (4, Br), γ-fagarine (3, Br), flindersiamine (8, Ha), maculine (7, Br),

N-methyl-4-methoxy-2-quinolone (10, Ga), N-methy-flindersine (13, Ga),

rutacarpine (14, Br), N-4,7-methoxy-2-quinolone (11, Ga) and also the new

alkaloids: N-methyl-4,7,8-trimethoxy-2-quinolone (12, Ga) and 5-

hidroxyflindersiamine (9, Ha). Several amides were also isolated, whereas five

of them were N-benzoylamides type and two N-isobutylamides type. One

quaternary amine was also isolated, candicine (15, Ga), as well as two known

aminoacids: N-methyproline (23, Br) and 4-hydroxymethylproline (24, Br). Three

lignans were also isolated: eudesmin (25, Ha) and its epimer epi-eudesmin (26,

Ha) and syringaresinol (27, Br). One cinnamic acid derivative (28, Ha) was

isolated and also two syringic acid derivatives, (29, Ha) e (30, Ha). The

Abstract

limonoids limonin (31, Ha) and its respective acid (32, Ha), limonexic acid, were

also isolated, as well as two steroids already known in the literature: β-sitosterol

(33) and stigmasterol (34). Several biologic assays were carried out using the

described isolated metabolits and also a collection of natural products composed

by: alkaloids, amides, flavonoids, dibenzoylmethanes and synthetic analogs,

triterpenes, limonoids as well as some other classes of compounds. This library

was evaluated against the TryR enzyme and bloodstream form T. brucei brucei.

The two most promising compounds were the dihydrochalcone 31, with IC

50

of

19,6 ±0,57 µM against TryR and the flavonoid 7, with EC

50

of 3,8 ±0,63 µM

against the trypanosome. The isolated compounds showed low biological activity

against the gGAPDH enzyme and were not tested against APRT since many

molecules had same wavelength UV absorption as the substrate. As for the

results from the Kinase panel, the alkaloid 81, hortiacine, was the most

selective, bearing 83% (10mM) activity against the protein kinase chK2,

responsible for the mammary carcinoma. As for the tannin 104, it was active

against most of the protein kinase of the panel, so it was considered not

selective. During this work, a bioaffinity column was performed, using TryR as

receptor, with promising results and with the capacity of monitoring the inhibitory

behavior of the compounds evaluated. The performance obtained from this

column could be later improved using specific tools to guide the identification

and quantification.

Principais Abreviações e Símbolos

V

Principais Abreviações a Símbolos

δ

Desolacamento químico

φ

Diâmetro

µM Micro Molar

[α]

D

Rotação ótica específica

Acetona-d

6

Acetona deuterada

AMP Adenosina monofosfato

APRT Adenina Fosforibosiltransferase

CCA Cromatografia em Coluna Abetra (pressão atmosférica)

CG/EM Cromatogotafia gasosa acoplada a espectrometria de massas

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiênica

d

Dubleto

dd

Duplo dubleto

ddd

Duplo duplo dubleto

DMSO Dimetilsulfóxido

DMSO-d

6

Dimetilsulfóxido deuterado

eV Elétrons volts

EC

50

Concentração inibitória de lise parasitária 50%

ES

+

Electrospray Positivo

G3P Gliceraldeído-3- fosfato

GAPDH Gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase

nOe Nuclear Overhauser effect

h Altura

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

Hz Hertz

IC

50

Concentração inibitória enzimática 50%

IE Impacto de elétrons

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento

%LP Porcentagem de lise parasitária

m

Multipleto

m/z

Relação massa carga

MeOD Metanol deuterado

MHz Mega Hertz

NAD

+

Nicotinamida Adenosina dinucleotídeo

PENDANT

Polarization Enhancement Nurtured During Attached

Nucleous Testing

Pi Fósforo inorgânico

PRPP 5-fosforribosil-1-pirofosfato

RMN

1

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

s

Singleto

sl

Singleto largo

t

Tripleto

TryR

Tripanotiona redutase

TOF Time of Flight

UV Ultravioleta

Lista de Tabelas

VI

Lista de Tabelas

p.

Tabela 1.1:Classificação dos alcalóides de Rutaceae segundo os autores.... 11

Tabela 1.2: Substâncias já isoladas e identificadas de espécies de

Balfourodendron, Helietta e Galipea.................................................................

12

Tabela 3.3: Dados de RMN

1

H e

13

C de 1 e comparação com a literatura...... 23

Tabela 3.4: Dados de RMN

1

H e

13

C de 2 e comparação com a literatura...... 27

Tabela 3.5: Dados de RMN

1

H e

13

C de 3 e comparação com a literatura...... 31

Tabela 3.6: Dados de RMN

1

H e

13

C de 4 e comparação com a literatura...... 35

Tabela 3.7: Dados de RMN

1

H e

13

C de 5 e comparação com a literatura...... 39

Tabela 3.8: Dados de RMN

1

H e

13

C de 6 e comparação com a literatura...... 43

Tabela 3.9: Dados de RMN

1

H e

13

C de 7 e comparação com a literatura...... 47

Tabela 3.10: Dados de RMN

1

H e

13

C de 8 e comparação com a literatura.....

51

Tabela 3.11: Dados de RMN

1

H de 9.............................................................. 56

Tabela 3.12: Dados de RMN

1

H e

13

C de 10 e comparação com a literatura.. 59

Tabela 3.13: Dados de RMN

1

H e

13

C de 11....................................................

63

Tabela 3.14: Dados de RMN

1

H e

13

C de 12....................................................

69

Tabela 3.15: Dados de RMN

1

H e

13

C de 13 e comparação com a literatura...

74

Tabela 3.16: Dados de RMN

1

H e

13

C de 14 e comparação com a literatura...

78

Tabela 3.17: Dados de RMN

1

H e

13

C de 15 e comparação com a literatura...

82

Tabela 3.18: Dados de RMN

1

H e

13

C de 16................................................... 85

Tabela 3.19: Dados de RMN

1

H e

13

C de 23 e comparação com a literatura...

102

Tabela 3.20: Dados de RMN

1

H e

13

C de 24 e comparação com a literatura.. 104

Tabela 3.21: Dados de RMN

1

H e

13

C de 25 e comparação com a literatura...

108

Tabela 3.22: Dados de RMN

1

H e

13

C de 26 e comparação com a literatura...

112

Tabela 3.23: Dados de RMN

1

H e

13

C de 27 e comparação com a literatura...

115

Tabela 3.24: Dados de RMN

1

H e

13

C de 28 e comparação com a literatura...

118

Tabela 3.25: Dados de RMN

1

H e

13

C de 29 e comparação com a literatura.. 122

Tabela 3.26: Dados de RMN

1

H e

13

C de 30 e comparação com a literatura.. 126

Tabela 3.27: Dados de RMN

1

H de 31 e comparação com a literatura............

131

Tabela 3.28: Dados de RMN

13

C de 31 e comparação com a literatura.......... 132

Tabela 3.29: Dados de RMN

1

H de 32 e comparação com a literatura........... 138

Tabela 3.30: Dados de RMN

13

C de 33 e comparação com a literatura.......... 139

Tabela 4.31: Avaliação dos Extratos Brutos Hexânicos e Metanólicos na

Atividade na Enzima gGAPDH.........................................................................

148

Tabela 4.32: Avaliação dos Extratos Brutos Hexânicos e Metanólicos na

Atividade na Enzima APRT..............................................................................

149

Tabela 4.33: Avaliação dos Extratos Brutos Hexânicos e Metanólicos na

Atividade na Enzima TryR...............................................................................

150

Tabela 4.34: Avaliação da AtividadeTripanocida nas Formas

Tripomastigotas de T.cruzi.............................................................................

151

Lista de Tabelas

VII

Tabela 4.35: Avaliação dos Extratos Brutos Hexânicos e Metanólicos na

Lise Parasitária de T. brucei brucei...............................................................

152

Tabela 4.36: Avaliação das Frações dos Extratos Brutos Hexânicos e

Metanólicos na Lise Parasitária de T. brucei brucei......................................

153

Tabela 4.37: Avaliação das Frações Obtidas a partir dos Extratos Brutos

Metanólicos na Atividade da Enzima gGAPDH.............................................

154

Tabela 4.38: Avaliação das Frações dos Extratos Brutos Metanólicos na

Atividade da Enzima APRT...........................................................................

155

Tabela 4.39: Atividade das Frações dos Extratos Metanólicos,

Concentração de 2,00 mg/mL, na Enzima TryR..........................................

157

Tabela 4.40: Atividade das Substâncias Puras Avaliadas na Enzima

gGAPDH Lote 03/2006..................................................................................

158

Tabela 4.41:

Estruturas das Flavonas Avaliadas na Enzima TryR e nas

formas Formas Tripomastigotas de

T. brucei brucei.................................................

161

Tabela 4.42:

Estruturas dos Flavanonóis Avaliados na Enzima TryR e nas

Formas Formas Tripomastigotas de

T. brucei brucei................................................

162

Tabela 4.43

Estruturas dos Chalconas Avaliadas na Enzima TryR e nas

Formas Formas Tripomastigotas de

T. brucei brucei................................................

162

Tabela 4.44:

Relação das Atividades das Substâncias (1-31) Avaliadas na

Enzmia na Enzima T

ryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei........

167

Tabela 4.45: Ocorrência dos Flavonóides Avaliados na Enzima TryR e nas

Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei.....................................................

168

Tabela 4.46:

Estrutura dos Dibenzoilmetanos Avaliados na Enzima TryR e

nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei..........................................

169

T abela 4.47: Relação das Atividades das Substâncias (32-40) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei

171

Tabela 4.48: Estrutura das Cumarinas Avaliadas na Enzima TryR e nas

Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei....................................................

172

Tabela 4.49: Relação das Atividades das Substâncias (41-47) Avaliadas

na Enzima

TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei..

173

Tabela 4.50: Estruturas das Amidas Avaliadas na Enzima TryR e nas

Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei.....................................................

174

Tabela 4.51: Relação das Atividades das Substâncias (48-53) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei............

175

Tabela 4.52: Relação das Atividades das Substâncias (54-57) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei............

176

Tabela 4.53: Relação das Estruturas das Substâncias (58-65) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei............

177

Tabela 4.54: Relação das Atividades das Substâncias (58-65) Avaliadas

na Enzima TryR e nas formas Tripomastigotas de T. brucei brucei..............

179

Tabela 4.55: Estrutras dos Alcalóides (66-83) Avaliadas na Enzima TryR

e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei.......................................

180

Tabela 4.56: Relação das Atividades das Substâncias (66-83) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei............

181

Tabela 4.57: Estruturas dos Ácidos e Derivados (84-93) Avaliados............. 182

Tabela 4.58: Relação das Atividades das Substâncias (84-93) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei............

183

Tabela 4.59: Relação das Atividades das Substâncias (94-96) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei............

184

Lista de Tabelas

VIII

Tabela 4.60: Relação das Atividades das Estruturas (97-106) Avaliadas

na Enzima TryR e nas Formas Tripomastigotas de T. brucei brucei............

185

Tabela 4.61: Descrição dos Conjuntos de Experimentos Feitos, de Modo

a se avaliar uma Coluna de Afinidade...........................................................

192

Tabela 4.62: Resultados Obtidos da Avaliação das Substâncias no Painel

das Enzimas Kinases...................................................................................

203

Tabela 4.63: Resultados Obtidos da Avaliação das Substâncias no Painel

das Enzimas Kinases....................................................................................

205

Tabela 5.64: Extratos obtidos, códigos e respectivas massas........................ 209

Tabela 5.65: Frações obtidas, códigos e respectivas massas........................ 210

Lista de Figuras

IX

Lista de Figuras

p.

Figura 1.1: Estrutura da salicina, protótipo natural para a descoberta do

fármaco centenário AAS, empregado atualmente como analgésico................

8

Figura1.2: Quinina, um protótipo natural para o desenvolvimento de fármacos

antimalariais........................................................................................................

8

Figura 1.3: Classificação biogenética dos alcalóides de Rutaceae, segundo

P.G. Waterman...................................................................................................

11

Figura 3.4: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância 1... 24

Figura 3.5: Espectro de massas da substância 1 (IE –70 eV) e fragmentação... 25

Figura 3.6: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância 2... 28

Figura 3.7: Espectro de massas da substância 2 (IE –70 eV) e fragmentação... 29

Figura 3.8: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância 3... 32

Figura 3.9: Espectro de massas da substância 3 (IE –70 eV) e fragmentação... 33

Figura 3.10: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância 4. 36

Figura 3.11: Espectro de massas da substância 4 (IE –70 eV) e

fragmentação......................................................................................................

37

Figura 3.12: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância 5. 40

Figura 3.13: Espectro de massas da substância 5 (IE –70 eV) e

fragmentação.......................................................................................................

41

Figura 3.14: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância 6. 44

Figura 3.15: Espectro de massas da substância 6 (IE –70 eV) e fragmentação. 45

Figura 3.16: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância 7. 48

Figura 3.17: Espectro de massas da substância 7(IE –70 eV) e fragmentação. 49

Figura 3.18: Espectros de RMN

1

H (400 MHZ, acetona-d

6

) e espectro de

RMN

13

C (50 MHz, CDCl

3

), da substância 8........................................................

52

Figura 3.19: Espectros de NOE-diff e correlações, da substância 8

(400 MHz, acetona-d

6

).............................................................................................

53

Figura 3.20: Espectro de massas da substância 8 (IE –70 eV) e fragmentação. 54

Figura 3.21: Espectro de RMN

1

H (400 MHZ, acetona-d

6

)da substância 9........ 56

Figura 3.22: Possíveis isômeros substância 9..................................................... 56

Figura 3.23: Espectro de massas da substância 9 (IE –70 eV) e fragmentação. 57

Figura 3.24: Espectro de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância

10..........................................................................................................................

60

Figura 3.25: Espectro de massas da substância 10 (IE –70 eV) e

fragmentação........................................................................................................

61

Figura 3.26: Espectros de RMN

1

H e

13

C (400/100 MHz, CDCl

3

) da substância

11.........................................................................................................................

64

Figura 3.27: Espectro de COSY

1

H-

1

H 45

0

da substância 11 (400 MHz, CDCl

3

). 65

Figura 3.28: Mapa de contorno das correlações HSQC da substância 11 (400

MHz, CDCl

3

).........................................................................................................

65

Figura 3.29: Mapa de contorno das correlações HMBC da substância 11

(400 MHz, CDCl

3

).................................................................................................

66

Figura 3.30: Espectro de massas da substância 11 (IE –70 eV) e

fragmentação......................................................................................................

67

Lista de Figuras

X

Figura 3.31: Espectros de RMN

1

H e

13

C (400/100 MHz, CDCl

3

) da substância

12.........................................................................................................................

70

Figura 3.32: Mapa de contorno das correlações HSQC da substância 12 (400

MHz, CDCl

3

).........................................................................................................

71

Figura 3.33: Mapa de contorno das correlações HMBC da substância 12 (400

MHz, CDCl

3

).........................................................................................................

71

Figura 3.34: Espectro de massas de alta resolução da substância 12,

equipamento VG Autospec-Impacto de elétrons 70 eV, e fragmentação.............

72

Figura 3.35: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância

13.........................................................................................................................

75

Figura 3.36: Espectro de massas da substância 13 (IE –70 eV) e

fragmentação.......................................................................................................

76

Figura 3.37: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância

14..........................................................................................................................

79

Figura 3.38: Espectro de massas da substância 14 (IE –70 eV)......................... 80

Figura 3.39: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância

15.........................................................................................................................

83

Figura 3.40: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) da substância

16..........................................................................................................................

86

Figura 3.41: Espectro de massas da substância 16 (IE –70 eV) e

fragmentação.......................................................................................................

87

Figura 3.42: Espectro de massas da substância 17 (IE –70 eV) e

fragmentação.......................................................................................................

89

Figura 3.43: Espectro de massas da substância 18 (IE –70 eV) e

fragmentação........................................................................................................

91

Figura 3.44: Espectro de massas da substância 19 (IE –70 eV) e

fragmentação........................................................................................................

93

Figura 3.45: Espectro de massas da substância 20 (IE –70 eV) e

fragmentação.......................................................................................................

95

Figura 3.46: Espectro de RMN

1

H (200 MHz, CDCl

3

), da mistura de amidas do

tipo N-isobutilamidas.............................................................................................

96

Figura 3.47: Cromatograma das amidas presentes na mistura. 97

Figura 3.48: Espectro de massas da substância 21 (IE –70 V) e fragmentação.. 98

Figura 3.49: Espectro de massas da substância 22 (IE –70 eV) e

fragmentação.........................................................................................................

100

Figura 3.50: Espectros de RMN

1

H (400 MHz, D

2

O) das substâncias 23 e 24... 105

Figura 3.51: Espectro de COSY

1

H-

1

H 45º das substâncias 23 e 24.................... 105

Figura 3.52: Projeção mostrando as interações entre os hidrogênios de

uma lignana furofurânica di-pseudoaxial...............................................................

107

Figura 3.53: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) para a

substância 25.........................................................................................................

109

Figura 3.54: Projeção mostrando as interações entre os hidrogênios de

uma lignana furofurânica di-pseudoequatorial.......................................................

111

Figura 3.55: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) para a

substância 26.........................................................................................................

113

Figura 3.56: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) para a

substância 27........................................................................................................

116

Figura 3.57: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, CDCl

3

) para a

substância 28 ........................................................................................................

119

Lista de Figuras

XI

Figura 3.58: Espectro de massas da substância 28 (IE –70 eV) e fragmentação. 120

Figura 3.59: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, MeOD), da substância

29.........................................................................................................................

123

Figura 3.60: Espectro de massas da substância 29 (IE –70 eV) e fragmentação. 124

Figura 3.61: Espectros de RMN

1

H e

13

C (200/50 MHz, acetona-d

6

), da

substância 30........................................................................................................

127

Figura 3.62: Espectro de massas da substância 30 (IE –70 eV) e

fragmentação........................................................................................................

128

Figura 3.63: Espectro de RMN

1

H (400 MHz/CDCl

3

) para a substância 31........... 133

Figura 3.63.1: Ampliação do espectro de RMN

1

H (400 MHz/CDCl

3

), para

a substância 31......................................................................................................

133

Figura 3.63.2: Ampliação do espectro de RMN

1

H (400 MHz/CDCl

3

), para a

substância 31........................................................................................................

134

Figura 3.63.3: Ampliação do espectro de RMN

1

H (400 MHz/CDCl

3

), para a

substância 31........................................................................................................

134

Figura 3.64: Espectro de RMN

13

C (100 MHz/ DMSO-d

6

) para a substância 31.. 135

Figura 3.65: Espectro de COSY

1

H-

1

H 45º da substância 31 (400 MHz, CDCl

3

).. 135

Figura 3.66: Mapa de contorno das correlações HSQC da substância 31, (400

MHz, CDCl

3

)..........................................................................................................

136

Figura 3.67: Mapa de contorno das correlações HMBC da substância 31, (400

MHz, CDCl

3

).........................................................................................................

136

Figura 3.68: Espectro de RMN

1

H (400 MHz/DMSO-d

6

) para a substância 32... 140

Figura 3.68.1: Ampliação do espectro de RMN

1

H (400 MHz/DMSO-d

6

) para

a substância 32......................................................................................................

140

Figura 3.68.2: Ampliação do espectro de RMN

1

H (400 MHz/DMSO-d

6

)

para a substância 32

..........................................................................................................

141

Figura 3.68.3: Ampliação do espectro de RMN

1

H (400 MHz/DMSO-d

6

) para a

substância 32........................................................................................................

141

Figura 3.69: Espectro de RMN

13

C (100 MHz/ DMSO-d

6

) para a substância 32.. 142

Figura 3.70: Espectro de COSY

1

H-

1

H 45

o

(400 MHz/DMSO-d

6

) , para a

substância 32.........................................................................................................

142

Figura 3.71: Mapa de contorno das correlações HSQC

(400 MHz/DMSO-d

6

), para a substância 32............................................................

143

Figura 3.72: Mapa de contorno das correlações HMBC

(400 MHz/DMSO-d

6

) , para a substância 32..........................................................

143

Figura 4.73: Esquema do metabolismo da glicose no interior do glicossomo...... 144

Figura 4.74: Via de recuperação em células de protozoários parasitas............... 145

Figura 4.75: O sistema da tripanotiona peroxidase.............................................. 146

Figura 4.76: Tripanotiona e tripanotiona redutase (GIRALUT, S., et al., 2001).... 147

Figura 4.77: Estrutura do produto natural kukoamina A, ativo na enzima TryR de

T. cruzi..............................................................................................................

175

Figura 4.78: Estruturas dos limonóides avaliados................................................. 176

Figura 4.79: Estrutura do alcalóide lunarina, inibidor irreversível da enzima

tripanotiona redutase (TryR) e sua disposição no sítio ativo de TryR de

T.cruzi..................................................................................................................

186

Figura 4.80: Mecanismo reacional da síntese da cetona de Pummerer............. 187

Figura 4.81: Estruturas do alcalóide lunarina e cetona de Pummerer................ 187

Figura 4.82: Etapas de acoplamento de uma proteína à uma resina de uma

coluna de afinidade.............................................................................................

188

Lista de Figuras

XII

Figura 4.83: Representação esquemática de um experimento de clonagem em

bactéria..........................................................................................................

189

Figura 4.84: Cromatograma de gradiente linear de sal (10-100 mM) de KCl em

tampão B, fluxo 1mL/mim, coluna Hi-Load Q Sepharose HP (Pharmacia)..

190

Figura 4.85: Cromatograma de exclusão utilizando 50mM de HEPES pH 7,4

300mM de NaCl e 0,05% de azida de sódio, fluxo 2mL/mim, coluna Superdex

200 26/60 (Pharmacia)........................................................................................

191

Figura 4.86: Espectro de massas do processo de lavagem de N

o

12,

clomipramina+resina+TryR, ES

+

TOF MS. ........................................................

193

Figura 4.87: Espectro de massas do processo de desnaturação da enzima

TryR, com metanol 100%, clomipramina+resina+TryR, TOF ES

+

Mariner

Applied Biosystems/MDS Sciex..........................................................................

194

Figura 4.88: Espectro de massas do processo de ‘denaturação’, com metanol

100%, clomipramina+resina, TOF ES

+

Mariner Applied Biosystems/MDS

Sciex.....................................................................................................................

195

Figura 4.89: Espectro de massas (Electrospray) da solução de 1mM de

clomipramina usada nos experimentos (clomipramina + 3% metanol + 50mM

acetato de amônio pH 7,4)..................................................................................

196

Figura 4.90: Espectro de massas do processo de lavagem de N

o

12,

quinacrina mostarda+resina+TryR, TOF ES

+

Mariner Applied Biosystems/MDS

Sciex.....................................................................................................................

197

Figura 4.91: Espectro de massas do processo de ‘denaturação’ da enzima

TryR, com metanol 100%, quinacrina mostarda + resina +TryR, ES

+

TOF

Mariner Applied Biosystems/MDS Sciex..............................................................

198

Figura 4.92: Espectro de massas do processo de ‘denaturação’ com metanol

100%, quinacrina mostarda + resina, ES

+

TOF Mariner Applied

Biosystems/MDS Sciex........................................................................................

199

Figura 4.93: Transdução de sinal, cascata sinalizadora e transcrição da

informação realizada por enzima sinalisadoras.................................................

201

Figura 4.94: Alguns dos cânceres provocados em humanos devido a

mutações nas enzimas kinases..........................................................................

202

Figura 5.95: Curva do padrão (Clomipramina) para o ensaio em tripanotiona

redutase (TryR)...................................................................................................

225

Figura 5.96: Equação com quatro parâmetros, responsável pelo cálculo de IC

50

e

EC

50

, onde range significa o eixo y em questão, background; sendo o controle

usado para o ensaio; e S o slope (inclinação da reta), sendo na maioria das

vezes igual a 1, pois considera-se que apenas uma molécula de inibidor se

encontra no sítio ativo da enzima........................................................................

232

Lista de Figuras

XIII

Lista de Esquemas e Gráficos

XIII

Lista de Esquemas

p.

Esquema 5.1: Preparação dos extratos metanólicos do caule de Galipea

carinata, Balfourodendron riedelianum e Helietta apiculata.................................

208

Esquema 5.2: Cromatografia de partição líquido-líquido dos extratos

metanólicos brutos...............................................................................................

210

Esquema 5.3: Fracionamento de HAGMH......................................................... 211

Esquema 5.4: Isolamento das substâncias 8 e 9...............................................

212

Esquema 5.5: Fracionamento de HAFMD e isolamento da substância 28........ 212

Esquema 5.6: Isolamento da substância 7.........................................................

213

Esquema 5.7: Fracionamento de HAFMD5....................................................... 213

Esquema 5.8: Isolamento da substância 25.......................................................

214

Esquema 9: Fracionamento de HAFMD5.5........................................................

214

Esquema 5.10: Isolamento da substância 8.......................................................

214

Esquema 5.11: Isolamento da substância 25.................................................... 215

Esquema 5.12: Isolamento da substância 26.....................................................

215

Esquema 5.13: Isolamento da substância 25.....................................................

215

Esquema 5.14: Isolamento da substância 8.......................................................

216

Esquema 5.15: Isolamento da substância 25.....................................................

216

Esquema 5.16: Fracionamento de HAFMA........................................................

217

Esquema 5.17: Isolamento das substânicas 30 e 28..........................................

217

Esquema 5.18: Fracionamento por RLCC de BRGMD...................................... 218

Esquema 5.19: Fracionamento da fase estacionária de BRGMD e isolamento

das substâncias 2, 4, 5, 8, 23 e 24......................................................................

218

Esquema 5.20: Isolamento das substâncias 23 e 24..........................................

219

Esquema 5.21: Fracionamento de GCCMM.......................................................

220

Esquema 5.22: Fracionamento de GCCMM5.7..................................................

220

Esquema 5.23: Isolamento da substância 15.....................................................

221

Esquema 5.24: Isolamento das substâncias 11 e 12..........................................

222

Esquema 5.25: Isolamento da substância 1.......................................................

223

Esquema 5.26: Isolamento das substâncias 18, 19, 20, 22 e 21........................

224

Esquema 5.27: Isolamento das substâncias 13, 14 e 17....................................

225

Esquema 5.28: Isolamento da substância 4, 5 e 16...........................................

226

Esquema 5.29: Isolamento das substâncias 10 e 27..........................................

226

Esquema 5.30: Isolamento das substâncias: 3, 4, 5 e 6.....................................

227

Esqeuma 5.31: Isolamento da substância 31....................................................

227

Esquema 5.32: Isolamento da substância 32.....................................................

228

Lista de Esquemas e Gráficos

XIV

Lista de Gráficos

Grafico 4.1: Gráfico de EC

50

para a substância 31 [10µM]............................. 166

Sumário

XIV

Sumário

p.

Sumário

XV

3.2.1 Substância 15.......................................................................................... 81

3.2.2 Substância 16.......................................................................................... 84

3.3 Amidas Identificadas por CG/EM............................................................ 88

3.3.1 Substância 17.......................................................................................... 88

3.3.2 Substância 18.......................................................................................... 90

3.3.3 Substância 19.......................................................................................... 92

3.3.4 Substância 20.......................................................................................... 94

3.3.5 Substância 21.......................................................................................... 96

3.3.6 Substância 22.......................................................................................... 99

3.4 Aminoácidos............................................................................................ 101

3.4.1 Substância 23.......................................................................................... 101

3.4.2 Substância 24.......................................................................................... 103

3.5 Liganas Furofurânicas............................................................................. 106

3.5.1 Substância 25.......................................................................................... 106

3.5.2 Substância 26.......................................................................................... 110

3.5.3 Substância 27.......................................................................................... 114

3.6 Derivados do Ácido Cinâmico e Ácido Siríngico..................................... 117

3.6.1 Substância 28.......................................................................................... 117

3.6.2 Substância 29.......................................................................................... 121

3.6.3 Substância 30.......................................................................................... 125

3.7 Limonóides.............................................................................................. 129

3.7.1 Substância 31.......................................................................................... 129

3.7.2 Substância 32.......................................................................................... 137

4. Atividades Biológicas......................................................................................

144

4.1

Avaliação dos Extratos Vegetais............................................................. 144

4.1.1

A Enzima gGAPDH (Gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase glicossomal)

144

4.1.2 A Enzima APRT.........................................................................................

145

4.1.3 A Enzima Tripanptiona redutase (TryR).....................................................

146

4.1

Produtos Naturais e a Enzima Tripanotiona redutase (TryR)....................

147

4.2 Inibição Enzimática de gGAPDH.................................................... 148

4.3

Inibição Enzimática de APRT......................................................... 149

4.4 Inibição Enzimática de TryR........................................................... 150

4.5

Atividade Tripanocida nas Formas Tripomastigotas de T. cruzi............. 151

4.6 Atividade Tripanocida nas Formas Tripomastigotas de T. b. brucei..... 152

4.7 Atividades das Frações Obtidas a Partir dos Extratos Brutos Avaliados 154

4.7.1 Atividades das Frações Obtidas a Partir dos Extratos Brutos Avaliados

na Enzima gGAPDH..........................................................................

154

4.7.2

Atividades das Frações Obtidas a Partir dos Extratos Brutos Avaliados

na Enzima APRT...........................................................................

155

4.7.3 Atividades das Frações Obtidas a Partir dos Extratos Brutos Avaliados

na Enzima TryR.................................................................................

156

4.8 Atividades das Substâncias Puras Isoladas.............................................. 158

4.8.1 Atividades nas Enzimas gGAPDH e APRT....................................... 158

Sumário

XVI

4.8.2 Atividade Inibitória e Tripanocida de Substâncias Puras Provenientes de

Diferentes Espécies Vegetais na Enzima TryR e nas Formas

Tripomastigotas de T. brucei brucei (linhagem 427, tipo selvagem,

forma infectante sangüínea)......................................................................

160

4.8.3 Flavonóides............................................................................................... 160

4.8.4 Flavonas.................................................................................................... 163

4.8.5 Dibenzoilmetanos.......................................................................................

169

4.8.6 Cumarinas................................................................................................. 172

4.8.7 Amidas...................................................................................................... 174

4.8.8 Limonóides................................................................................................ 176

4.8.9 Triterpenos................................................................................................ 177

4.8.10 Alcalóides.................................................................................................. 180

4.8.11 Ácidos e Derivados....................................................................................

182

4.8.12 Lignanas.................................................................................................... 183

4.8.13 Outras Classes de Compostos Avaliados................................................. 184

4.9 Avaliação da Cetona de Pummerer na Enzima TryR.................................

186

4.9.1 Síntese da Cetona de Pummerer....................................................... 186

4.10 Cromatografia de Bio-afinidade Utlizando-se a Enzima TryR de T. cruzi

como Receptor...........................................................................................

188

4.10.1 Expressão e Purificação da Enzima TryR de T. cruzi, já anteriormente

clonada ....................................................................................................

189

4.10.2 Purificação da Enzima TryR de T. cruzi.....................................................

190

4.10.3 Coluna de Bio-afinidade.............................................................................

192

4.11 Enzimas Kinases e Atividade Anticancerígena..........................................

200

4.11.1 As Origens da Fosforilação das Proteínas................................................ 200

4.11.2 Avaliação da Coleção de Produtos Naturais Frente às Enzimas Kinases.

203

5. Procedimento Experimental.............................................................................

205

5.1 Materiais e Métodos...................................................................................

205

5.2 Equipamentos............................................................................................

206

5.3 Coleta e Identificação das Espécies Vegetais...........................................

208

Sumário

XVII

5.3.1 Preparação dos Extratos das Espécies Vegetais..................................... 208

5.3.1.1

Galipea carinata, Balfourodendron riedelianum e Helietta apiculata.........

208

5.3.1.2

Obtenção dos Extratos Hexânicos e Metanólicos.....................................

209

5.3.1.3

Fracionamento dos Extratos......................................................................

209

5.4 Estudo Fitoquímico.................................................................................... 211

5.4.1 Estudo Químico Fração Hexano do Extrato Metanólico dos Galhos de

Helietta apiculata (HAGMH).......................................................................

211

5.4.2

Estudo Químico da Fração Diclorometano do Extrato Metanólico das

Folhas de Helietta apiculata (HAFMD)..................................................

212

5.4.3 Estudo Químico da Fração Acetato de Etila do Extrato Metanólico das

Folhas de Helietta apiculata (HAFMA).......................................................

216

5.4.4 Estudo Químico Diclorometano do Extrato Metanólico dos

Galhos de Balfourodendron riedelianum

(BRGMD)...............................................

218

5.4.5 Estudo Químico da Fração Acetato de Etila do Extrato Metanólico das

Folhas de Balfourodendron riedelianum (BRFMA)....................................

219

5.4.6 Estudo Químico da Fração Metanol do Extrato Metanólico do Caule

de Galipea carinata (GCCMM)..................................................................

220

5.4.7 Estudo Químico da Fração Metanol do Extrato Diclorometano do Caule

de Galipea carinata (GCCMD)...................................................................

222

5.4.8 Estudo Químico da Fração Diclorometano do Extrato Metanólico do

Caule de Balfourodendron riedelianum (BRCMD)......................................

223

5.5 Protocolo do Ensaio com TryR, Utilizando-se o Reagente DTNB 5,5’-

ditiobis-(2-ácido nitrobenzóico), Reagente de Ellman..............................

228

5.5.1 Regentes e Procedimento para o Screening Inicial...................................

228

5.5.2 Regentes e Procedimento para a Determinação do IC

50

............................

229

5.5.3 Método do Ensaio......................................................................................

229

5.5.4 Notas Importantes Consideradas...............................................................

230

5.6 Ensaios in vivo Utilizando células de T. brucei brucei............................... 230

5.6.1 Screening inicial.........................................................................................

230

5.6.2 Contagem das Células...............................................................................

230

5.6.3 Determinação de EC

50

com a Utilização deCélulas de T. brucei brucei

....................

231

5.7 Expressão e Purificação da Enzima Tripanotiona redutase (TryR)...........

232

5.7.1 Cromatografia de Afinidade: Preparação da Resina e Acoplamento

da Enzima TryR..........................................................................................

234

5.8 Síntese da Cetona de Pummerer...............................................................

235

5.9 Ensaio com a Enzima gGAPDH.................................................................

235

5.9.1 Condições do Meio de Reação para Ensaio Enzimático com NAD

+

como Co-fator............................................................................................

235

5.9.2 Condições do Meio de Reação para Ensaio Enzimático com tio-NAD

+

como Co-fator.............................................................................................

235

5.9.3 Considerações com Relação as Condições do Ensaio............................. 236

5.10 Ensaio com a Enzima APRT......................................................................

236

6. Conclusões........................................................................................................

237

7. Referências Bibliográficas............................................................................... 239

1. Introdução

Introdução

1

1. Introdução

“A natureza é o único livro que oferece um conteúdo valioso em todas as suas folhas.”

Johann Wolfgang von Goethe

1.1 Produtos Naturais

Desde a antigüidade, o homem faz uso de materiais vegetais com finalidade

terapêutica. Por vários anos a morfina (1), obtida da papoula, a quinina (2) do tronco de

espécies de Cinchona (Rubiaceae), glicosídeos cardíacos, como a digitoxigenina (3),

extraídos de Digitalis purpura (Scrophulariaceae) além dos alcalóides do tipo ergot,

ergolina (4), isolados de espécies de Claviceps, um fungo que ataca algumas culturas de

gramíneas como o centeio, vêm sendo usados para o tratamento de várias enfermidades.

Os microorganismos também são grande e potencial fonte de compostos com finalidade

farmacêutica, e se tornaram ainda mais evidentes depois do trabalho de Alexander

Fleming (1881-1945), com o advento da penicilina. O uso de corantes químicos (“chemical

dyes”) para o tratamento da malária, introduzido por Paul Ehrlich (1845-1915), deu início à

ciência da química medicinal. A primeira busca de fármacos foi, essencialmente, não

seletiva, com a utilização de organismos, células ou animais com a finalidade de testar a

eficácia de candidatos a fármacos (EISENTHAL, R., DANSON, M. J., 2002).

O

HO

H

NCH

3

H

HO

1

N

HO

H

CH

3

O

2

O

OH

H

HO

H

3

cardenolídeo- digitoxigenin

a

NH

H

N

4

ergolin

a

Introdução

2

Os produtos naturais vêm sendo, por muitos anos, reconhecidos como excelentes

fontes de potenciais compostos protótipos (NEWMAN, D. J., et al., 2003). Atualmente, o

desenvolvimento de um novo fármaco a partir de um produto natural deve possuir: a)

triagem de produtos naturais para a atividade biológica; b) isolamento e purificação do

princípio ativo; c) determinação da estrutura química; d) estudos da relação estrutura-

atividade (SAR); e) síntese de análogos; f) estudos do mecanismo de ação; e g) desenho

estrutural e síntese de novos fármacos (CHIBALE, K., 2005).

Os fármacos de origem sintética predominam no arsenal terapêutico atual, graças

ao avanço da química orgânica sintética a partir do fim do século passado. Muitos deles

são baseados em produtos de origem vegetal. De acordo com um estudo recente, das

1030 “novas entidades químicas” (NCEs), apenas 33% dos novos fármacos aprovados são

puramente sintéticos sem qualquer participação dos produtos naturais, e o restante, 64%,

apresenta influência dos produtos naturais ou são protótipos com algumas derivatizações

sintéticas, grupo farmacofórico ou imitação da natureza (“Natural Product Mimics”),

(NEWMAN, D.J.; et al., 2003).

Entre os produtos naturais de origem vegetal, encontra-se ampla e diversa

arquitetura molecular. A espetacular diversidade molecular de padrões estruturais

observados nas distintas classes de produtos naturais, como flavonóides, isoflavonóides,

lignanas, neolignanas, glicosídeos, cumarinas, cromonas, quinonas, alcalóides, entre

outras, representa fonte inesgotável de modelos originais de arquitetura molecular

enantiopura (BARREIRO, E., 2002). A partir daí, a busca de substâncias naturais ativas

vem crescendo constantemente, e esse é um dos objetivos de estudo da química dos

produtos naturais.

Abordagens padrão que levam ao desenvolvimento de novos fármacos incluem

“screenings” randômicos, isto é, quando não se tem conhecimento de quais são as

moléculas que melhor respondem ao alvo avaliado ou não-randômicos. De início, os alvos

moleculares não eram conhecidos, por exemplo, as enzimas. Apesar de esta proposta

levar à descoberta de inúmeros fármacos, muitos compostos apresentaram sérios efeitos

colaterais e exigiram doses limites para uso. À medida que a disponibilidade dos

compostos aumentou, os avanços tecnológicos também, de modo a acomodar o grande

número de entidades químicas que sugiram. Assim, uma outra proposta científica para a

descoberta de fármacos evoluiu para o termo desenho de fármacos. O alvo molecular, por

exemplo, uma enzima essencial para a sobrevivência de um organismo em particular ou

uma que se acredita ser a responsável pelo desenvolvimento da doença, deve ser

identificado. O uso de computadores, tendo como base informações estruturais

detalhadas, permite o uso de programas computacionais para se obter a interação entre o

candidato a fármaco e o sítio ativo da enzima em questão. Geralmente, o desenho racional

de fármacos se baseia em substratos naturais ou moléculas conhecidas que atuam

naquele sítio ativo, os substratos da enzima (EISENTHAL, R., DANSON, M. J., 2002).

Os fatores mais importantes para que uma interação seja favorável entre o fármaco

e seu alvo biológico específico, mais freqüentemente uma proteína, são: o encaixe

geométrico perfeito entre os ligantes presentes no fármaco e o sítio ativo; baixa energia de

conformação de ambos; formação de ligações de hidrogênio em regiões da proteína onde

estão carregadas e/ou neutras entre os grupos funcionais e interações hidrofóbicas em

superfícies lipofílicas da proteína (KUBINYI, H., 1998 e 1999).

Introdução

3

1.2 Doenças Tropicais

As doenças tropicais são endêmicas nas regiões tropicais e subtropicais. Dentre as

várias doenças presentes na região tropical, a Organização Mundial da Saúde (WHO), não

mede esforços para controlar 8 das maiores, sendo elas: malária, esquistossomose,

tripanossomíase Africana (doença do sono), tripanossomíase Americana (doença de

Chagas), leishmanioses, filaríase, oncocerciaríase e lepra. O impacto provocado pelas

doenças tropicais é extremamente alto. As regiões marginalizadas e os países em

desenvolvimento são as áreas mais afetadas. Causam, além da doença, incapacidade

para o trabalho e de freqüentar a escola, desfiguramento, além de diminuição da

expectativa de vida e à morte.

De acordo com as estatísticas da Organização Mundial da Saúde, no ano de 2002,

por volta de 56.000 mortes na África foram provocadas pelas doenças tropicais. Já nas

Américas, foram 16.000, no Sudeste de Ásia, 36.000, no Oeste Mediterrâneo foram 15.000

e cerca de 5.000 na região Oeste do Oceano Pacífico (WHO, 2004). Metade da

humanidade vive nas regiões tropicais e, conseqüentemente, sob risco, o que remete a

num futuro bastante comprometido, e à redução também das aspirações nacionais para

qualquer avanço econômico.

Os fármacos atualmente utilizados para o tratamento das doenças tropicais

apresentam várias desvantagens, incluindo tóxicos efeitos colaterais, baixa eficácia clínica,

complicados modos de administração e problemas de resistência (KHABNADIDEH, S., et

al., 2005).

Sabendo que o mercado de fármacos contra malária, tuberculose, AIDS e

tripanossomíases é, em sua maioria, destinado aos países do Terceiro Mundo,

descobertas inovadoras e conseqüentemente de baixo-custo para a elaboração de novos

fármacos são urgentes. O ponto-chave da busca de um novo fármaco para essas

enfermidades seria a descoberta e/ou desenvolvimento de um único agente capaz de inibir

os múltiplos estágios das doenças, de modo análogo aos antibióticos de amplo espectro

(CHIBALE, K., 2005).

1.2.1 Doença de Chagas

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, por volta de 18 milhões de

pessoas nas Américas estão infectadas pela doença de Chagas, que é causada pelo

protozoário Trypanosoma cruzi (ESPINOZA-FONSECA, et al., 2005). Os índices de

mortalidade associados à doença na América Latina são bem maiores do que as mortes

causadas pela malária, esquistossomose ou leishmanioses. A doença é endêmica no

continente Americano, distribuída a partir do sul do Estados Unidos até o sul da Argentina

(URBINA, J. A., et al., 2003).

São estimados que ocorram aproximadamente 300.000 novos casos da doença de

Chagas por dia, segundo a Organização Mundial de Saúde (DUTRA, W. O., et al., 2005).

No Brasil, o controle da transmissão vetorial da doença de Chagas foi institucionalizado em

1950, pelo serviço Nacional de Malária, e apenas em 1975 foi comprovada a eficácia do

inseticida hexaclorociclohexano 6,5%, na profilaxia da doença. Mas, até os anos 70,

apenas o Estado de São Paulo mantinha ações regulares de controle, em paralelo com

Minas Gerais (VINHAES, M. C., et al., 2000). A região de Bauru, localizada a Oeste do

Introdução

4

Estado, foi a pioneira no controle do triatomíneo (MARLI, D., et al., 1991.Atualmente, há

mais de 5 milhões de brasileiros infectados (CARVALHO, E. A. B., et al., 2004)

A transmissão da doença de Chagas se dá pela fezes do inseto vetor, conhecido

como “barbeiro” (Triatoma infestans), que as deposita próximo ao local da picada, ou

também pela transfusão de sangue. A forma infectante sangüínea dos protozoários de T.

cruzi, as formas tripomastigotas penetram na células dos mamíferos e sofrem várias

diferenciações até atingirem as formas amastigotas. A ruptura dessas células leva à

liberação dos parasitas e à perpetuação da infecção, que, após vários anos pode levar às

formas crônicas da doença, como deficiências cardíacas e digestivas (CARVALHO, S. A.

et al., 2004).

1.2.2 Leishmanioses

As leishmanioses são grupos de doenças tropicais causadas por diferentes

espécies de parasitas protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. A doença afeta

por volta de 12 milhões de pessoas em 80 países e estima-se que existam de 2 a 3

milhões de novos casos a cada ano. Também se considera que exista uma população de

350 milhões de pessoas sob risco de infecção (CHAN-BACAB, , 2001). A doença se

distribui tanto no Velho Mundo, Mar mediterrâneo, leste e oeste da África, Síria, Arábia

Saudita, Afeganistão, Índia, China e Irã, além do Brasil, Peru, Argentina e Paraguai.

Evidências sugerem que o aumento da incidência da doença se deve a migrações

populacionais, mudanças sazonais/climáticas e co-infecção devida ao HIV (CROFT, S.,

2002).

As leishmanioses são causadas por várias espécies de Leishmania e existem três

formas clínicas distintas de manifestação da doença, às quais são associados vários

sintomas, desde desfiguração cutânea e lesões muco cutâneas que causam ampla

destruição das membranas mucosas e vísceras afetanto os órgãos hematopoiédicos

(KAMINSKY, R., 2002).

Mais de 17 espécies de Leishmania causam leishmaniose cutânea como L. major,

L. braziliensis, L. panamensis entre outras. Parasitas que normalmente causam leishmania

visceral podem também causar leishmania cutânea; algumas linhagens de L. infantum

podem gerar lesões simples, enquanto leishmanioses Calazar são causadas por L.

donovani, geralmente dois anos após a cura da visceral. Identificar o organismo causador

da leishamniose cutânea é tão importante quanto conhecer a variação de sensibilidade de

drogas sobre as diferentes espécies de Leishmania (CROFT, S., 2002).

A doença é transmitida pela picada do inseto fêmea infectado do gênero

Phlebotomus e Lutzomyia (MESQUITA, M. L., et al., 2005). O hospedeiro vertebrado é

infectado com a forma promastigota do parasita como resultado da picada do inseto vetor.

Após isso, os promastigotas são rapidamente fagocitados pelos macrófagos do hospedeiro

e dentro deles mudam para a forma amastigota. As manifestações clínicas da doença se

devem às conseqüentes multiplicações da forma amastigota no interior dos macrófagos

(CHAN-BACAB, , 2001)

Introdução

5

1.2.3 Doença do Sono

A tripanossomíase humana Africana também é conhecida como doença do sono.

Quando ataca o gado, é conhecida como nagana. A doença afeta mais de 60 milhões de

pessoas em 36 países na região do Sub-Saara, na África. Cerca de 45.000 casos da

doença foram registrados em 1999 e, segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO), a

estimativa é de que o número atual de casos esteja entre 300.000 e 500.000 (WHO, 1998).

O parasita causador da doença é transmitido aos hospedeiros vertebrados através

das moscas Tsé-tsé que pertencem ao gênero Glossina. Exitem três subespécies do

Trypanosoma brucei, duas das quais infectam seres humanos. O T. b. gambiense,

encontrado no Oeste no região central da África, responsável pela doença do sono do

oeste Africano. O T. b. rhodesiense ocorre nas regiões leste e sul da África, causando a

doença do sono do Leste Africano. A terceira subespécie, Trypanosoma brucei brucei,

sendo morfologicamente e bioquimicamente homóloga ao T. brucei rhodesiense, não afeta

os seres humanos, devido à alta densidade da fração lipoproteica do soro humano. O T.

brucei gambiense é menos virulento que o T.brucei rhodesiense. O T.brucei brucei não

causa doença em seres humanos, mas causa a doença nagana em alguns animais

domésticos (FRIES, D., et al., 2003).

Quando um mosquito fêmea Tsé-tsé pica um humano, os tripanossomas são

injetados juntamente coma as secreções salivares. Neste momento os tripanossomas

iniciam um processo de multiplicação, causando uma ferida inchada e muito dolorosa. As

formas tripomastigotas penetram na corrente sangüínea, onde se multiplicam

assexuadamente por divisão binária a cada 5 a 10 horas. Diferente da tripanossomíase

Americana e das leishmanioses, não há estágios intracelulares (VIRKERMAN, K., 1985).

1.3 Formas de Tratamento

1.3.1 Doença de Chagas

Introdução

6

1.3.2 Leishmanioses

O tratamento da leishmaniose visceral conta com a terapia diária de injeções de

antimônio pentavalente, que dura entre 20 a 28 dias. Os agentes quimioterápicos

antimoniais disponíveis são: antimonato de meglumina (7) (Glucantime

®

) e o

estibogluconato de sódio (8) (Pentostan

®

). Ainda há tratamentos eficazes que utilizam a

Anfotericina B (9) (Fungizone

®

) (KAMINSKY, R. 2002, ESCOBAR, P., et al., 2001). O

alopurinol (10), um análogo da hipoxantina, que inibe o metabolismo das bases

nitrogenadas purínicas nas células de mamíferos e em organismos de leishmania, também

vem sendo usado como tratamento alternativo para a leishmaniose visceral. Uma vez

nestes organismos, são metabolizados em nucleosídeos tóxicos (MOSKWITZ, P. F., et al.,

1999).

Recentemente, foi reportado o que poderia ser o primeiro tratamento oral contra

leishmaniose visceral. O fármaco em questão, o hexadecilfosfocolina (10) (Miltefosina®).

Este fármaco, que foi inicialmente desenvolvido para o tratamento de câncer e também é

ativo in vitro como in vivo em espécies de Leishmania. Os resultados já estão na fase II,

sendo também bem tolerado nas triagens na Índia. Já se planeja o início da fase III da

triagem clínica, uma vez que apresentou excelentes resultados contra a Leishamania

donovani. O fármaco vem sendo apresentado sob a formulação de 6% de miltefosina em

veículo (Kasacade) de 3-propiloxipropeno glicol, 3-hexapropileno glicol e 3-nonilpropileno

glicol, sendo comercialmente chamado de Miltex

®

e Impavido

®

da Zentaris (GARNIER, T.,

et al., 2002 e WHO, 2004).

O

H

N

S

CH

3

O

2

N

5

N

NO

2

O

H

6

Sb

O

OH

N

H

OH

H

O

HO

N

H

OH

H

7

O SbSb

OOH

O

CH

HC

C

COO

OOC

HOHC

CH

2

OH

CH

2

OH

H

3Na

8

N

OH

H

10

O

OH

NH

2

OH

CH

3

O

HO O OH OH OH

OH

OH O

OH

COOH

O

9

11

O

P

O

N

( )

15

Introdução

7

1.3.3 Doença do Sono

Os fármacos usados no tratamento da tripanossomíase Africana são: suramina (12)

e pentamidina (13), usadas apenas nos primeiros estágios da doença, enquanto que

melarprosol (14) e eflornitina (15) são usados em ambas as fases. Estes fármacos são de

difícil administração, sendo todos injetáveis durante um período relativamente longo. Os

efeitos colaterais destes fármacos são severos (FRIES, D., et al., 2003).

1.4 A Importância dos Produtos Naturais na Busca de Novos Fármacos

Os produtos naturais vêm sendo usados como ferramentas valiosíssimas para

decifrar a lógica das biossínteses e como plataformas para o desenvolvimento de fármacos

de primeira escolha. Por exemplo, no período entre 1981 e 2002, 5% de 1.301 novas

entidades químicas aprovadas como fármacos pelo US Food and Drug Administration

(FDA) foram extraídos de fontes naturais, e outros 23% foram derivados de produtos

naturais. São ainda a maior fonte para a busca de agentes terapêuticos para doenças

infecciosas (tanto por bactérias quanto por fungos), câncer, desordens lipídicas e imunes

(CLARDY, J., & WALSH C., 2004).

Um exemplo clássico da importância dos produtos naturais no desenvolvimento de

fármacos foi a descoberta do AAS (ácido acetil salicílico) a partir da salicina, um glicosídeo

natural (Figura) isolado de Salix sp (Salicaceae), o salgueiro. Este glicosídeo foi o protótipo

natural para o desenvolvimento do AAS, como mostra a Figura 1.1, a seguir (KUBINYI, H.,

1999; BARREIRO, E., 2002).

O O

NH

2

NH

2

NHHN

13

N N

O

H H

NN

OO

SO

3

-

Na

+

Na

+-

O

3

S SO

3

-

Na

+

Na

+-

O

3

S

SO

3

-

Na

+

Na

+-

O

3

S

H

12

N N

As

S

H

2

N

NH

2

H

OH

14

H

2

N F

COOH

H

2

N

F

15

Introdução

8

Figura 1.1: Estrutura da salicina, protótipo natural para a descoberta do fármaco centenário

o AAS, empregado atualmente como analgésico.

A quinina (Figura 1.2), um dos principais componentes da casca de Cinchona

officinalis (Rubiaceae) foi o composto-protótipo para a descoberta de derivados

antimalariais como a cloroquina e a mefloquina (HOSTETTMANN, K. et al., 2003;

BARREIRO, E., et al., 2002).

Figura 1.2: Quinina, um protótipo natural para o desenvolvimento de fármacos

antimalariais.

Vários exemplos poderiam ainda complementar estes fatos e ilustrar a importância

dos produtos naturais como protótipos de diferentes fármacos sintéticos empregados na

terapêutica moderna. Dificilmente as indústrias farmacêuticas investem na síntese de

novos candidatos a fármacos sem antes terem se baseado em compostos protótipos, e

hoje, mais do que nunca, os produtos naturais vêm ganhando grande relevância e atenção

por parte da grande indústria de fármacos.

Os produtos naturais podem ser fontes de compostos-protótipos, permitindo o

desenho racional e planejamento de fármacos, desenvolvimento de síntese biomimética e

descoberta de novas propriedades terapêuticas ainda não atribuídas aos fármacos já

existentes (RATES, S.M. K., 2001). Além desse fato, os produtos naturais são altamente

diversos e geralmente promovem atividades biológicas altamente específicas. Sendo

assim, há a proposição que todo produto natural tem a capacidade de se ligar a um

receptor (FEHER, M. et al., 2003).

Atualmente muitos quimioterápicos são desenvolvidos a partir de informações

estruturais de proteínas envolvidas em vias metabólicas relevantes. Com a abordagem

moderna do desenho racional de fármacos, é possível se desenvolver medicamentos com

alta especificidade e menores efeitos colaterais, uma vez que se exploram as diferenças

metabólicas marcantes entre os agentes etiológicos e hospedeiro humano.

OH

O

OH

Salicina

CO

2

H

O

A

S

N

HO

N

H

CF

3

CF

3

N

MeO

HO

N

Mefloquina

Quinina

Cloroquina

N

Cl

HN

N

Introdução

9

A escolha do alvo constitui o primeiro passo no planejamento racional de fármacos.

Entre os fatores mais importantes na escolha do alvo terapêutico, podem-se destacar: (i)

Ser essencial para a sobrevivência do parasita ou exercer grande controle sobre a via

metabólica; (ii) ter seu mecanismo catalítico e, preferencialmente, sua estrutura

tridimensional conhecidas; (iii) poder ser modulado seletivamente.

Enzimas-chave podem ser exploradas para o desenvolvimento de inibidores da

reação enzimática de forma que o paciente não sofra com os efeitos colaterais do

medicamento. O reconhecimento do ligante pela macromolécula pode ser estimado

qualitativamente pelas interações iônicas, de Van der Walls, hidrofóbicas, ligações de

hidrogênio e ligações covalentes existentes entre eles. Além disso, os diversos fatores

esteroquímicos que possam garantir, ou favorecer, a conformação ativa do ligante devem

ser levados em conta. A busca virtual em bancos de dados por moléculas que apresentem

as características físico-químicas e estruturais para interação com o alvo terapêutico

escolhido é outra estratégia largamente empregada. Esta técnica oferece a vantagem de

identificar moléculas, que, após algumas modificações simples em sua estrutura química,

podem fornecer bons compostos de partida para o desenho racional de fármacos. Com os

progressos na área de cristalografia de proteínas e estudos de ressonância magnética

nuclear (RMN) multidimensional, as estruturas 3D de muitas proteínas importantes,

Introdução

10

“(…) para se validar uma atribuição quimiotaxonômica é necessário ter o conhecimento da distribuição

individual dos compostos dentro da família além do conhecimento das sequências de etapas reacionais por

qual cada composto surge a partir de seu precurssor.”

Gottlieb, O. R. (1972), Phytochemistry, 11, 1537.

2. Posicionamento Taxonômico de Balfourodendron e Helietta na Famíla Rutaceae

O histórico sobre a classificação da família Rutaceae, pertencente à ordem

Sapindales, revela contradições entre antigos botânicos (www.mobot.org/mobot). A famíla

Rutaceae é predominantemente tropical, apresentando árvores e arbustos de grande valor

econômico na horticultura como o Citrus, na silvicultura (Chloroxylon, Flindersia,

Zanthoxylum) e na medicina como o Pilocarpus e Agastoma (WATERMAN, P. G., 1975).

A classificação taxonômica da família Rutaceae teve grande contribuição do

botânico alemão Adolf Engler (1844-1930). Segundo Engler, em publicações no Die

Natürlichen Pflanzenfamilien, a família Rutaceae era subdividida em sete (7) subfamílias,

três (3) das quais (Rutoideae, Toddalioideae e Aurantioideae) compunham a grande

maioria dos gêneros e espécies. Apesar destas três (3) subfamílias estarem sujeitas a

variações morfológicas, a validade de estarem posicionadas juntas em uma só família,

Rutaceae, parece ser universalmente aceita. Rutaceae é conhecida por apresentar um

grande número e uma aparente biodiversidade de metabólitos secundários, sendo eles

principalmente alcalóides derivados do ácido antranílico e tirosina, limonóides e cumarinas.

Há um grande interesse no uso destes compostos como marcadores quimiotaxonômicos

(WATERMAN, P. G., 1973).

As espécies Balfourodendron e Helietta, desde descrições originais, foram sempre

posicionadas juntamente com outros gêneros, segundo Engler, na subtribo Pteleinae. Esta

sub-tribo foi mantida sob as mesmas circunstâncias e na mesma subfamília Toddalioideae

nas várias edições de Engler’s Syllabus der Pflanzenfamilien. Numa proposta mais

recente, de modo a se conseguir “um agrupamento taxonômico de maneira mais natural”

dos gêneros presentes em Rutaceae baseando-se na fitoquímica, SILVA et al., em 1988,

não reconheceram a Toddalioideae, mas mantiveram Helietta, Balfourodendron e Ptelea

na “Tribo Ptelea”, sendo assim um agrupamento informal na subfamília Rutoideae

(PIRANI, J. R., 1998).

2.1 A Biossíntese dos Alcalóides de Rutaceae

J. R. Price reconheceu a ocorrência de dez (10) tipos de alcalóides quimicamente

distintos apesar de ter consciência de que muitos deles poderiam ser considerados como

um grupo biogeneticamente homogêneo derivados do ácido antranílico. Já R. Hagnauer

propôs a classificação dos alcalóides de Rutaceae baseados no seu caminho biogenético.

Entretanto, algumas das classes propostas por Hagnauer, particularmente os alcalóides

quinolínicos e quinazonílicos, falham segundo sua proposta. Estes dados podem ser

observados na Tabela 1.1, a seguir.

Em 1975, P. G. Waterman propôs uma classificação biogenética dos alcalóides de

Rutaceae, que pode ser observada na Figura 1.3.

Introdução

11

Tabela 1.1. Classificação dos alcalóides de Rutaceae segundo os autores.

* Reconhecidos por Price por serem um grupo biogenéticamente homólogo.

†

Desconhecido por Price.

Figura 1.3: Classificação biogenética dos alcalóides de Rutaceae, segundo P.G.

Waterman.

J. R. Price (1963) R. Hagnauer (1973)

Benzilquinolínicos Derivados da fenilalanina

Furoquinolínicos* Derivados do ácido antranílico

Quinolínicos* Furoquinolínicos (inc. furoquinolônicos

e piranoquinolônicos)

Acridônicos* Acridônicos

Quinazolínicos* Quinazolínicos

β-Indol-quinazolínicos

Derivados Indólicos

Cantinônicos

Imidazólicos Imidazólicos

Oxazólicos

Carbazólicos

†

Aminas/Amidas Aminas/Amidas (inc. Oxazólicos)

Introdução

12

2.2 Perfil Químico do Gênero Balfourodendron, Helietta e Galipea

Segundo levantamento bibliográfico, há poucos relatos do estudo fitoquímico dos

gêneros Balfourodendron e Helietta.

Da espécie Balfourodendron riedelianum, foram isolados alcalóides 4-quinolônicos,

diidro-4-quinolônicos, diidropirano-4- quinolônicos, furoquinolínicos, acridônicos, e 2-fenil-

1-metil-4-quinolônicos (CORRAL, R. A., et al., 1968, CORRAL, R. A., et al., 1973,

CORRAL, R. A., et al., 1983 JURD, L. et al., 1983, RAPOPORT, H., et al., 1959,

RAPOPORT, H., et al., 1960, RAPOPORT, H., et al., 1961, BASOMBA, A., et al., 1991).

Já da espécie Helietta apiculata, não há muitos relatos de estudo fitoquímico. Uma

recente publicação descreve o isolamento de alcalóides furoquinolínicos, com atividade

inibitória sob o citocromo P450-dependente (GOLOUBKOVA, T. D., 1998). De outra

espécie, Helietta longifoliata, há relatos do isolamento de uma série de triterpenos

pentacíclicos (Tabela 2), além de alcalóides furoquinolícos já anteriormente descritos

(THEUMANN, D. F., et al., 1969).

Do gênero Galipea Aublet, vários alcalóides quinolínicos foram descritos na

literatura, alguns deles ativos nas Leishmanioses como a chimanina D isolada de Galipea

officinalis planta utilizada pelos índios da Bolívia e Venezuela no tratamento de feridas

causadas pela infecção provocada pelo protozoário (JACQUEMOND-COLLET, I., et al.,

1999, FOURNET, A., et al., 1989, VIEIRA, P.C., et al., 1990, FOURNET, A., et al., 1994).

A diversidade estrutural para os gêneros estudados pode ser observada na Tabela

1.2, a seguir.

Tabela 1.2: Compostos já isolados e identificados de espécies de Balfourodendron,

Helietta e Galipea.

Compostos Fonte Referência

N

O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

N O

O

OH

CH

3

R

1

R

2

R

1

R

2

H

OCH

3

H

OH

H

OCH

3

H

OCOCH

3

H

Balfourodendron

riedelianum

CORRAL, R. A., et al., 1968.

CORRAL, R. A., et al., 1973.

JURD, L., et. al., 1983

.

CORRAL, R. A., et al., 1983.

RAPOPORT, H., et. al., 1959

RAPOPORT, H., et. al., 1960

RAPOPORT, H., et. al., 1961.

Introdução

13

N

O

CH

3

CH

3

OH

R

2

R

1

CH

3

R

1

R

2

OCH

3

H

OH

H

OCOCH

3

H

OCH

3

N

O

H

3

C

CH

3

OH

CH

3

HO

N

O

HO

CH

3

CH

3

OH

N O

OH

CH

3

O

R

1

R

2

R

1

R

2

H

OCH

3

OH

OCH

3

H

Balfourodendron

riedelianun

CORRAL, R. A., et al., 1968.

CORRAL, R. A., et al., 1973.

JURD, L., et. al., 1983).

CORRAL, R. A., et al., 183.

RAPOPORT, H., et. al., 1959.

RAPOPORT, H., et. al., 1960.

RAPOPORT, H., et. al., 1961.

N

O

OCH

3

O

H

OH

Balfourodendron

riedlianum

BASOMBA, A., et al., 1991

N

OO

O

OCH

3

OCH

3

N

O

CH

3

O

CH

3

O

OH

N

O

OH

O

N

O

OH

O

OCH

3

Helietta

apiculata

Helietta

apiculata

GOLOUBKOVA, T. D., et al.,

1998.

GOLOUBKOVA, T. D., et al.,

1998.

Introdução

14

R

2

R

1

R

1

R

2

H

OH

H

OCOCH

3

O

H

Helietta

longifoliata

THEUMANN, D. F., et al.,

1969.

N R

1

R1

OCH

3

OCH

3

O

Galipea

longiflora

Galipea

bracteata

FOURNET, A., et al., 1989

VIEIRA, P. C., et al., 1990.

N R

1

OCH

3

R1

O

Galipea

longiflora

FOURNET, A., et al., 1989

N R

1

R1

OH

OCH

3

OCH

3

OCH

3

Galipea

officinalis

JACQUEMONT-COLLET, I., et

al., 1999

Introdução

15

N

CH

3

CH

3

CH

3

HO

A família Rutaceae apresenta um grande potencial metabólico além de possuir

atividades antiparasitárias tanto de extratos como de compostos isolados destas plantas.

Sendo assim, alguns trabalhos da literatura fundamentam bem a escolha da família

Rutaceae para ser estudada neste trabalho. MAFEZOLI e colaboradores em 2001,

demonstraram a atividade tripanocida de espécies de Rutaceae e Meliaceae. Há ainda

trabalhos realizados por VIEIRA, P.C., et al., 2000 e MORAES, V. R. de S., et al., 2003,

que descrevem as atividades de uma série de cumarinas e flavonóides polimetoxilados,

respectivamente, sobre a enzima gGAPDH.

Galipea

officinalis

JACQUEMONT-COLLET, I., et

al., 2000

Substâncias Isoladas

16

2.3 Substâncias Isoladas

O estudo fitoquímico das plantas Galipea carinata, Balfourodendron

riedelianum e Helietta apiculata possibilitou o isolamento de 32 metabólitos

secundários dentre eles alcalóides furoquinolínicos, indolopiridoquinazolínicos,

2-quinolônicos, piranoquinolônicos e quinolínicos, lignanas furofurânicas,

derivados do ácido cinâmico e siríngico, amidas com anel N-benzoiltiraminas e

isobutilaminas e limonóides do tipo limonina. Vale frizar que muitas dessas s

foram encontradas em outras partes das plantas, como também puderam ser

isoladas tanto no Balfourodendron riedelianum como na Helietta apiculata. No

capítulo Procedimento Experimental (5), estão descritos estes detalhes.

N

O

OCH

3

6

7

8

5

5a

8a

4

2

'

3'

3

Substância:

1

, dictamina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 22

Isolamento: p. 223

N

O

OCH

3

CH

3

O

3'

2'

3

2

4

8a

5a

5

6

7

8

Substância:

2

, evolitrina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 26

Isolamento: p. 218, 224, 225

N

O

OCH

3

OCH

3

4

3'

2'

3

2

5a

8a

8

7

6

5

Substância: 3,

γ

-fagarina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 30

Isolamento: p. 227

N

O

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

3'

2'

3

2

4

5a

8a

5

6

7

8

Substância:

4

, kokusaginina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 34

Isolamento: p. 218, 226,227

8

7

6

5

8a

5a

4

2

3

2'

3'

N

O

OCH

3

CH

3

O

OCH

3

Substância:

5

, maculosidina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 38

Isolamento: p. 218, 226, 227

N

O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

4

3'

2'

3

2

5a

8a

8

7

6

5

Substância:

6

, esquimianina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 42

Isolamento: p. 227

Substâncias Isoladas

17

N

O

OCH

3

O

2'

3'

4

5

6

7

8

8a

5a

2

3

9

Substância:

7

, maculina.

Procedência: folhas de Helietta apiculata

Identificação: p. 46

Isolamento: p.213

8a

5a

7

6

N

O

OMe

O

OMe

5

8

4

2

3

2'

3'

9

Substância:

8

, flindersiamina.

Procedência: folhas de Helietta apiculata

Identificação: p. 50

Isolamento: p.211, 214, 215, 218

N

OO

O

OMe

OH

3'

2'

4

5

8

6

7

5a

8a

2

3

9

Substância:

9

, 5-hidroxifindersiamina.

Procedência: folhas de Helietta apiculata

Identificação: p. 55

Isolamento: p. 211

4

8a

5a

8

7

6

5

3

2

N

OCH

3

O

CH

3

Substância:

10

, N-metil-4-metoxi-2-quinolona.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 58

Isolamento: p. 226

N O

OCH

3

CH

3

OCH

3

OCH

3

2

3

4

5

6

7

8

8a

5a

Substância:

11

, N-metil-4,7,8-trimetoxi-2-quinolona.

Procedência: caule de Galipea carinata

Identificação: p. 62

Isolamento: p. 222, 226

NCH

3

O

OCH

3

O

OCH

3

5

6

8

2

4

5a

7

8a

Substância:

12

, N,4,7-trimetoxi-2-quinolona.

Procedência: caule de Galipea carinata

Identificação: p. 68

Isolamento: p. 222

N

O

CH

3

2

3

1'

2'

3'

4'

5'

5

6

7

8

5a

8a

4

Substância:

13

, N-metil-flindersina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 73

Isolamento: p. 225

N

O

H

9

10

12

11

12a

9a

8a

8

7

13a

14a

1a

1

2

3

4

4a

5

Substância

14

, rutacarpina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 77

Isolamento: p. 225

Substâncias Isoladas

18

CG/EM

N

CH

3

CH

3

CH

3

HO

1'

2'

3'

4'

5'

6'

2

1

Cl

-

Substância:

15

, candicina.

Procedência: caule de Galipea carinata

Identificação: p. 81

Isolamento: p. 221

N

O

H

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7

8

1

2

3

4

5

6

9

Substância:

16,

N-(1’-feniletil)amida.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 84

Isolamento: p. 225, 226

9

8

7

6'

5'

4'

3'

2'

1'

N

O

H

9

1

2

3

4

5

6

Substância:

17

, N-(1’-fenilpropil)amida.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 88

Isolamento: p. 225

N

O

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Substância:

18,

N-(1’-feniltertbutil)amida.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 90

Isolamento: p. 224

N

O

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

11

10

Substância:

19

N-(1’-fenilisopentil)amida.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 92

Isolamento: p. 224

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

N

O

H

11

Substância:

20

N-(1’-fenil-8-metilbutil)amida.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 94

Isolamento: p. 224

N

O

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1'

2'

3'

4'

Substância:

21

N-isobutil-(2E)-tetradecandienamida.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 96

Isolamento: p. 224

N

O

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1'

2'

3'

4'

Substância:

22,

N-isobutil-(2E,4E,)-tetradecandienamida.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 99

Isolamento: p. 224

Substâncias Isoladas

19

N

CH

3

H

COO

-

Hb

Ha

Hb

Ha

Hb

2

3

4

5

Substância:

23

, N-metilprolina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 101

Isolamento: p. 218, 219

N

CH

3

H

COO

-

Hb

Ha

HO

Hb

Ha

Hb

2

3

4

5

Substância:

24

, 4-hiroximetilprolina.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 102

Isolamento: p.218, 219

4

O

HH

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

2

5

1

6

8

1"

2"

3"

4"

5"

6"

1'

2'

3'

4'

5'

6'

Substância:

25

, eudesmina.

Procedência: folhas de Helietta apiculata

Identificação: p. 105

Isolamento: p. 213, 214, 215, 216

4

O

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

HH

OCH

3

2

5

1

6

8

1"

2"

3"

4"

5"

6"

1'

2'

3'

4'

5'

6'

Substância:

26

, epieudesmina.

Procedência: folhas de Helietta apiculata

Identificação: p. 109

Isolamento:p. 215

4

O

HH

OCH

3

CH

3

O

HO

OCH

3

OCH

3

OH

2

5

1

6

8

1"

2"

3"

4"

5"

6"

1'

2'

3'

4'

5'

6'

Substância:

27

, seringaresinol.

Procedência: caule de Balfourodendron riedelianum

Identificação: p. 113

Isolamento: p. 226

OCH

3

O

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

1

2

3

4

5

6

1'

2'

3'

Substância:

28

Procedência: folhas de Helietta apiculata

Identificação: p. 116

Isolamento: p. 212, 217

Substâncias Isoladas

20

OCH

3

O

OCH

3

HO

CH

3

O

1

2

3

4

5

6

1'

Substância:

29

, metilseringato.

Procedência: folhas de Helietta apiculata

Identificação: p. 120

Isolamento: p. 217

OH

O

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

1

2

3

4

2. Objetivos

Universidade Federal de São Carlos

Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia

Departamento de Química

Laboratório de Química de Produtos Naturais

Programa de Pós-Graduação em Química

“Estudo Fitoquímico de Três Espécies de Rutaceae e

Avaliação Biológica de Produtos Naturais em Modelos

Celulares e Bioquímicos de Tripanosomatídeos”

Anna Sylvia Ferrari Marques*

Tese apresentada como parte

dos requisitos para a obtenção do

título de Doutor em Ciências

(área de concentração Química Orgânica).

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira

* Bolsista: FAPESP

São Carlos - SP

2006