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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
AVALIAÇÃO DA LAPAROSCOPIA NA ASPIRAÇÃO
FOLICULAR EM FÊMEAS CAPRINAS PRÉ-PÚBERES E
ADULTAS COM OU SEM ESTIMULAÇÃO OVARIANA
HORMONAL
Mabel Freitas Cordeiro
Orientador: Prof. Dr. Wilter Ricardo Russiano Vicente
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias do Campus de
Jaboticabal – UNESP, como parte das
exigências para obtenção do título de Doutor
em Cirurgia Veterinária – área de
concentração: Cirurgia Veterinária.
Jaboticabal – SP
Dezembro de 2006
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DADOS CURRICULARES DO AUTOR
MABEL FREITAS CORDEIRO – nascida em 05 de julho de 1973, em Salvador –
BA. Médica Veterinária formada pela Universidade Federal da Bahia – UFBA,
Salvador, Bahia, em 06 de fevereiro de 1998. Em março de 1999, iniciou curso de
Especialização em Produção Animal pela Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia – UESB, Vitória da Conquista, Bahia. No ano seguinte, ingressou no
Mestrado pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da
Universidade Estadual do Ceará – UECE – Área de concentração: Reprodução
Animal, concluindo-o em dezembro de 2001. Em março de 2003, iniciou o curso
de Doutorado junto ao Programa de Pós-graduação em Cirurgia Veterinária da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV – UNESP – Campus de
Jaboticabal – SP, área de concentração: Cirurgia Veterinária.
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Dedico,
Aos meus pais e irmãos que sempre
me esperam de braços abertos,
ouvidos atentos e sorriso no rosto.
“Confia, segue, trabalha e constrói para o bem. E
guarda a certeza de que, para alcançar a
felicidade, se fazes teu dever, Deus faz o resto.
Pelos Espíritos Emmanuel e André Luiz, psicografada
por Franscisco Cândido Xavier e Waldo Vieira.
Livro “Estude e Viva”
AGRADECIMENTOS
A Deus.
À minha família que sempre me apoiou em tudo que pretendi fazer na minha vida.
Ao meu pai, Clovis Benedito Santos Cordeiro que sempre me esperou com os
braços abertos e sorriso largo e, que sempre disse ter orgulho de mim, mesmo
que eu tenha feito, até hoje, nada mais do que a minha obrigação de filha. À
minha dedicada mãe Maria José Freitas Cordeiro que, pra mim, é um exemplo de
força e tolerância. Aos meus irmãos, Patrícia Freitas Cordeiro e Marco Aurélio
Freitas Cordeiro pela cumplicidade, dedicação e amor incondicional.
Às cabras, animais maravilhosos, dóceis, inteligentes, curiosos. Aos quais
pretendo dedicar a minha vida de estudos e todo meu carinho.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – através da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias e ao programa de Pós-graduação
em Cirurgia Veterinária pela oportunidade de realizar um doutorado de nível
reconhecido em todo o país.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pela
concessão da bolsa de doutorado e do auxílio-pesquisa, sem os quais este
trabalho não poderia ser realizado.
Ao Professor Wilter Ricardo Russiano Vicente que, além de ser um orientador
maravilhoso, é um amigo sincero e atencioso. Não tenho palavras para descrever
a grandeza desta pessoa e de como seu coração é grande. Pessoas assim são
como um presente na nossa vida. Obrigada por existir!
A Ana Karina da Silva Cavalcante pela amizade, companheirismo, conselhos e
orientação. Kari para mim é um exemplo de pessoa inteligente, competente,
perseverante, e espirituosa e a quem tenho orgulho de ser amiga e maior fã.
A Tânia Vasconcelos Cavalcante, a quem considero uma irmã. Sou muito grata
pela amizade, pelo companheirismo, pelos conselhos, apoio psicológico,
ensinamentos e todos os cuidados dispensados a mim durante todo o tempo em
que estivemos juntas. Mesmo distante somos unidas. Amigas para sempre!
Ao amigo Gerson Azeredo, que me apresentou à Unesp e à Jaboticabal. Pelos
momentos de alegria e pelo apoio.
Ao amigo e irmão Alex Altair Costa Machado, uma pessoa com um coração
enorme e de caráter e simplicidade ímpares, e que, mesmo de longe, sempre me
deu força e me apoiou em todos os momentos. Sou muito grata pelo seu carinho,
sua amizade e seu exemplo.
Ao amigo Paulo Sérgio da Silva que muito colaborou neste trabalho, se dedicando
às cabrinhas como se fossem dele. Agradeço muito pelos conselhos e sugestões
durante toda a fase experimental e pela amizade sincera.
À amiga querida Christina Ramires Ferreira que conheço desde 1997 quando do
estágio curricular na EMBRAPA Caprinos. Chris para mim é, com toda certeza, e
também para todos que tiveram o prazer de conhecê-la, um anjo na Terra que
veio para enriquecer as nossas vidas e preencher nossos corações. Sua bondade
e sua delicadeza são imensas! Deus a abençoe.
Ao casal de amigos Marcelo Barbosa Bezerra e Michelly Fernandes de Macedo
que apesar do pouco tempo que nos conhecemos, dedicaram muito de sua
atenção para comigo, além do enorme carinho e consideração que fizeram de
nossa amizade recente algo verdadeiro e sincero. Deu-me a impressão de
conhecê-los há muito tempo. Quem sabe de outras vidas!
À amiga Maria Emília Franco Oliveira que me mostrou que a vida é um eterno
aprendizado. Elegância, bom gosto e diplomacia são características desta pessoa
a quem admiro muito. Obrigada pela sua amizade e sua alegria.
A Roberta Machado Ferreira pela amizade, apoio e atenção na fase final deste
trabalho. Agradeço pelo jeito meigo, sincero e carinhoso como sempre me tratou.
Ao Sr. Rodrigo Grassano, proprietário da Fazenda Onça e Capril Onça,
localizados em Monte Santo de Minas – MG, pelo fornecimento de praticamente
todos os animais utilizados no experimento e pela atenção e acolhida com que
fomos tratados quando visitamos sua propriedade.
Ao “Quarteto Fantástico”, responsável pela anestesia, sem o qual não seria
possível a realização deste experimento: Paula Alessandra Di Filippo, Renata
Gebara Sampaio Dória, Deborah Penteado Martins Dias e Gesiane Ribeiro que
mais tarde foi substituída por Erica Cristina Bueno do Prado Guirro. Agradeço de
coração o cuidado e dedicação dispensados a mim e às “bitas”. Agradeço também
pela amizade e consideração.
À amiga Amélia Lizziane Leite Duarte que, desde o começo me ajudou e aprendeu
junto comigo a arte da laparoscopia. Pela sua amizade, alegria e consideração:
muito obrigada!
À Carla Andrade Grillo Beretta pela dedicação, preocupação e empenho com os
quais se dedicou a este trabalho e pela sua amizade e simpatia.
Aos amigos do Departamento de Reprodução Animal: Roberta Vantini, Ivo Luiz de
Almeida, Isabel Aparecida Penharol Natarelli, Felipe Perecin, Max Vitoria
Resende, Simone Cristina Niciura, Andréa Cristina Basso, Giovana D’Andréa
Pavão, Felipe Perecin, Naiara Zoccal, Clara Slade, Rubia Bueno da Silva, Tatiane
Almeida Drummond Tetzner, Juliana Corrêa Borges, Márcio Ribeiro Silva, Ana
Paula Perini, Eliana Cristina Gazoto, Lourival Paz Landim, Júnior, Danilas Salinet
de Melo, Edson Lo Turco, Letícia Siqueira de Sá Barreto, Viviane Sgobbi Dias,
Eric Laurentz Caiado Castro, Kleber Ancioto, Aline Costa de Lúcio, Kellen de
Sousa Oliveira, Clara Slade Oliveira, Erlon Gomes de Oliveira Júnior, Frederico
Ozanam Barros Monteiro, Cassiana Ometo de Abreu, Antonio Martinez, Sandra
Gabaldi, Alexandre Wolf, Karina Beloti Avelino, Gabriel Ferreira Soria, Eveline
Zanetti, Gláucia Guerra Alonso, Sara Tomita, Walt Yamazaki, Erica da Silva
Carvalho Morani e Marcelo Roncoletta pela amizade, alegria, colaboração,
simpatia, coleguismo e principalmente pela experiência de conhecê-los. Sou muito
grata pelo tempo de convivência pois todos no DRA foram, de uma certa forma,
como uma segunda família para mim.
Aos Professores do Departamento de Reprodução Animal: César Roberto Esper,
Francisco Guilherme Leite, Joaquim Mansano Garcia, Vera Fernanda Martins
Houssepiam de Lima e Gilson Hélio Toniollo que sempre me atenderam e me
auxiliaram desde a minha chegada nesta universidade e pela acolhida neste
departamento, onde sempre fui tratada com muito respeito, profissionalismo e
simpatia.
Ao Professor Paulo Henrique Franceschini, nosso querido “Cocão”, em especial, e
através dele às obras do Prof. Augusto Cury por me terem feito pensar de modo
diferente e melhor.
Aos amigos do Nordeste pela amizade, atenção, apoio e solidariedade: Katyane
de Sousa Almeida, Fagner Luiz da Costa Freitas, Wagner Freitas, Maria de Jesus
Veloso Soares, Hebelys Ibiapina, Isolda Márcia, Gilvaneide Azeredo e Auriclécia
Lopes de Oliveira.
À amiga Valéria Queiroz pela amizade sincera, pela alegria e pelo apoio. Sempre
vou lembrar do seu sorriso iluminado e sua voz carinhosa.
Aos queridos amigos, funcionários do Hospital Veterinário “Governador Laudo
Natel” pela ajuda, carinho, amizade e dedicação: Roberto Bertanha, Carlos
Roberto Januário, José Raimundo dos Santos, Arildo Pereira dos Santos, Laerte
Sant’anna de Oliveira, José Eduardo Miguel, Isaías Pereira, Maria Luisa Alves de
Oliveira, Flavia Regina de Souza Soldi, Roberto Aparecido Pereira, Narciso Batista
Tel, Edson Giangrecco, Jose Carlos Busoli, Arnildo César de Faria, Anésia Alves
de Oliveira, Lauro Cesar Alves, Celina Cavichiolli Laroza, Sonia Fernandes Brito,
Tarciso Philadelpho Carneiro, Eugênio de Campos Filho, Aloisio Miranda Castro,
Matheus Yamazaki Andrade, Izabel Gerbasi Beraldo, Dalva Aparecida Pedro
Barbosa, Cirlene Cristina Ferraresi, Lidiane Cristina Cardoso, Izilda Maria P. de
Oliveira, Sonia Fernandes Britto. Sou muito grata a todos!
Aos residentes Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”: Rodrigo Norberto
Pereira, Paulo Alescio Canola, Larissa Gabriela Ávila, João Henrique Perotta,
Luciane Maria Laskovski, Armando Carvalho, André Escobar, Roberto Thiesen e
Tathiana Ferguson Motheo, que sempre estiveram dispostos a ajudar
demonstrando muita dedicação, paciência e profissionalismo.
Aos alunos do Colégio Técnico Agrícola “José Bonifácio”: Ricardo de Jesus
Queiroz, Edivan Alex Ulian e em especial a Edilson Gabriel da Silva Júnior, que
considero um amigo verdadeiro.
A todos os estagiários que passaram pelo DRA e que auxiliaram em muito no meu
trabalho, em especial a Maisa Fernada Campos Minosso, Lourival Souza Silva
Júnior, Rodrigo Faria Sousa Pereira, Ricardo Watzel, Danilo Bacelar, Rosiara
Maziero, Gisele de Brito Lima, Juliana Cassiano, Patrícia Massuda, Monique
Guardieiro, Fabiana Lucena, Ana Augusta Pagnano Derussi, Clarissa Mascaro,
Camila Bonagamba, Denise Tavares, Lívia Vasconcelos, Dina Souza e Danilo
Pereira.
Aos amigos da Obstetrícia pela simpatia, amizade e auxílio durante este trabalho:
Aracélle Elisane Alves, Maricy Apparicio Ferreira, Ana Paula Coelho Ribeiro,
Valeska Rodrigues, Eliandra Antonia Pires, Carla Renata Figueiredo Gadelha,
Giuliano Queiroz Mostachio, Karen Vicente Diagone, Diogo Jose Cardilli e
Gabriela Covizzi.
Aos professores José Wanderley Catelan, Áureo Evangelista Santana, Carlos
Augusto Valadão, José Jurandir Fagliari, Luis Fernando de Oliveira Silva Carvalho,
Júlio Carlos Canola, João Guilherme Padilha Filho, Cíntia Lucia Maniscalco, Adjair
Antonio do Nascimento, Sandra Aidar de Queiróz, Kleber Tomas de Resende,
Izabelle Auxiliadora Molina de Almeida Teixeira, Américo Garcia da Silva
Sobrinho, Gener Tadeu Pereira, Carlos Roberto Daleck, Gisele Zoccal Mingoti,
Márcia Rita Pacheco e José Luiz Laus pela cordialidade, simpatia e atenção.
Agradeço pelo apoio e pelo auxílio durante a realização deste trabalho.
À Profa. Lia de Alencar Coelho pela atenção, cordialidade e pela concessão do
equipamento de videolaparoscopia, sem o qual este trabalho sequer teria
começado.
À Profa. Luciana Keiko Hatamoto pela colaboração, amizade e consideração.
Aos amigos da Associação de Pós-graduandos da UNESP–FCAV, Ariel David
Freitas Al Gazi, Maria Andréia Nunes, Denise Lachat, Márcio Aquio Hoshiba,
Marcelo Laia, Fernanda da Silva Gonçalves, Camila Castro Neves, Caramo Có
Júnior, Eduardo Deberaldini e Eduardo Rossini pela amizade e pelos momentos
de alegria.
Aos amigos Patrícia Tholon, Nadia Ferreira Dibiase, Letícia Ribeiro, Carolina
Buzzulini, Expedita Maria de Oliveira Pereira, Flora de Freitas D’Angelis, Carla
Braga Martins, Raquel Mincarelli Albernaz, Leonardo de Oliveira Seno, André
Gustavo Leão, Samuel Figueiredo de Souza e Rodrigo Vidal Oliveira pela
amizade, simpatia e pelos momentos de alegria e de aprendizado que vivemos
durante este período.
A todos os amigos do Centro Espírita Universal – CEU pela amizade e pelo apoio
moral e espiritual, além dos bons momentos. Em especial a Nercy Regina Voltarel
Ferroni, Luiz Carlos Ferroni, Rosa Melo, Clorivaldo de Oliveira Júnior, Luís
Lacerda, Apparecido José Merlino Júnior, Angela Coelho da Silva, Alessandra
Steckelberg, Lúcia Helena Sipaúba Tavares, Fernando A. Arrobas Martins, Maria
Áurea Garcia, Flávia Carvalho e Felipe Ferroni.
Aos amigos da academia Cardiofísico aqui representados pelo professor Paulo
Faccini e aos seus funcionários pelo carinho e atenção. A atividade física foi uma
das coisas que me motivou e por muitas vezes ajudou a manter além da saúde do
corpo, a saúde mental.
Aos funcionários da Biblioteca, nas pessoas de Mabel Custódio, Fábio Pinho,
Tieko Takamiya Sugahara, Ana Silvia Mariana, Adriana Damato pela atenção e
presteza.
Tatiane Pirani e família pela acolhida na sua casa em Orindiuva e pelos bons
momentos na ocasião do seu estágio no Hospital Veterinário.
Aos colegas de faculdade e de pós Arianne Pontes Oriá e Franscisco de Assis
Dória Neto pela amizade.
Ao amigo Rodrigo Mantovani, da empresa Pratice Gases, por sua presteza e
cordialidade.
A Antonio Geraldo Zampola, da empresa AZ Labor pela atenção, simpatia e
eficiência em nos atender sempre que precisamos.
A Celso Galatti, da empresa Rações Nutremax pela simpatia e consideração.
A Alexandre Mazzei, da empresa Nacional Hospitalar pela atenção e pelo
profissionalismo.
E a todos que eu esqueci de mencionar (me perdoem!) e que participaram de
forma direta ou indiretamente deste trabalho e que também ajudaram a construir a
minha história em Jaboticabal. SOU MUITO GRATA! DEUS OS ABENÇOE.
i
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS........................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS........................................................................................... iv
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... vi
RESUMO............................................................................................................ viii
SUMMARY......................................................................................................... ix
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 2
2.1. Técnicas para a colheita de oócitos em animais domésticos................ 2
2.2. A videolaparoscopia na Medicina Veterinária. Histórico..................... 4
2.3. A estimulação ovariana para a obtenção de oócitos in vivo................... 6
2.4. Fatores que interferem na qualidade do oócito obtido por LAF............. 7
2.5. O uso da LAF em animais jovens.......................................................... 8
3. OBJETIVOS................................................................................................... 10
3.1. Geral...................................................................................................... 10
3.2. Específicos........................................................................................... 10
4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 11
4.1. Local do experimento........................................................................... 11
4.2. Animais e tratamento........................................................................... 11
4.3. Pesagem dos animais........................................................................ 13
4.4. Protocolo anestésico........................... .............................................. 13
4.5. Laparoscopia para aspiração folicular (LAF)...................................... 14
4.6. Exame clínico e avaliação da analgesia.............................................. 19
4.7. Avaliação das funções hepática e renal.............................................. 19
4.8. Maturação invitro................................................................................ 20
4.9. Avaliação da capacidade reprodutiva.................................................. 21
4.10. Análise estatística.............................................................................. 21
5. RESULTADOS............................................................................................ 22
5.1. Avaliação da técnica de laparoscopia para aspiração folicular........... 22
ii
Página
5.2. Efeito da anestesia sobre os parâmetros fisiológicos......................... 23
5.3. Resposta ovariana e colheita de oócitos.......................................... 25
5.4. Acompanhamento do peso corporal.................................................. 30
5.5. Efeito sobre a capacidade reprodutiva das fêmeas........................... 31
6. DISCUSSÃO............................................................................................... 31
7. CONCLUSÕES........................................................................................... 42
8. REFERÊNCIAS.......................................................................................... 43
9. ANEXOS..................................................................................................... 57
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Classificação dos complexos cumulus-oócitos obtidos por
laparoscopia..................................................................................
21
Tabela 2.
Média desvio-padrão e valores máximo e mínimo da
freqüência cardíaca e freqüência respiratória antes (T
0
) e
durante a aplicação da anestesia (T
10-50
) para a realização das
laparoscopias em fêmeas caprinas jovens e adultas.
Jaboticabal/SP – 2006...................................................................
23
Tabela 3.
Média e erro-padrão das variáveis aspartato aminotransferase
(AST), fosfatase alcalina (ALP) e gama glutamiltransferase
(GGT) de fêmeas caprinas jovens e adultas submetidas à
laparoscopia para aspiração folicular. Jaboticabal/SP – 2006 .....
24
Tabela 4.
Media e erro-padrão das variáveis uréia e creatinina de fêmeas
caprinas submetidas laparoscopia para aspiração folicular.
Jaboticabal/SP – 2006...................................................................
24
Tabela 5.
Taxa de aproveitamento e taxa de colheita de oócitos de
fêmeas caprinas adultas e pré-púberes, com ou sem estímulo
hormonal. Jaboticabal/SP – 2006..................................................
25
Tabela 6.
Média e erro-padrão de folículos visualizados e puncionados
nos ovários esquerdo e direito e de oócitos encontrados.
Jaboticabal/SP – 2006...................................................................
27
Tabela 7.
Número de oócitos encontrados, percentual de oócitos viáveis e
taxa de maturação de fêmeas caprinas adultas e pré-púberes,
com ou sem estímulo hormonal. Jaboticabal/SP – 2006 .............
28
Tabela 8.
Média e erro-padrão de oócitos encontrados, viáveis e
maturados nos quatro grupos experimentais, bem como a média
geral dentro dos grupos. Jaboticabal/SP - 2006...........................
29
Tabela 9.
Percentual de cabras prenhes aos 45 dias, após serem
submetidas a seis sessões de laparoscopia para aspiração
folicular. Jaboticabal/SP – 2006....................................................
31
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Tratamento hormonal destinado às fêmeas caprinas dos grupos
G1 (adultas estimuladas) e G3 (jovens estimuladas), durante o
período experimental.....................................................................
12
Figura 2.
Campo cirúrgico. a – úbere (círculo). b – pontos de inserção da
agulha de aspiração. c – linha alba. d – ponto de inserção do
trocarte para introdução da pinça de manipulação atraumática. e
- ponto de inserção do trocarte para introdução do laparoscópio.
f – umbigo......................................................................................
16
Figura 3.
Posicionamento em Trendelenburg da fêmea caprina
(cefalodeclive em 30 graus) .........................................................
16
Figura 4. Instalação do pneumoperitônio com CO
2
. 1 –agulha de Veress.
2
–
cabo para a passa
g
em do
g
ás................................................
16
Figura 5.
Inserção do trocarte de 7 mm para introdução do laparoscópio...
16
Figura 6.
Bainha inserida no abdome para introdução do laparoscópio. 1
– bainha de 7 mm com entrada para o CO
2
. 2 – cabo para a
passagem do gás..........................................................................
17
Figura 7.
Montagem do laparoscópio. A – laparoscópio. B – cabo da
câmera (imagem). C – cabo de fibra ótica (luz)............................
17
Figura 8.
Inserção do trocarte para introdução da pinça de manipulação
atraumática. a - trocarte de 10 mm com bainha rosquiável. b
– bainha de 7 mm com endoscópio inserido e iluminando a
região da punção de “a”................................................................
17
Figura 9.
Posicionamento dos instrumentais cirúrgicos utilizados na
laparoscopia para aspiração folicular. A – agulha de aspiração.
B – pinça de manipulação atraumática. C – bainha rosquiável de
10 mm. D – bainha de 7 mm com laparoscópio inserido..............
17
Figura 10.
Sistema de aspiração folicular. 1 – mangueira do vácuo. 2 –
linha de aspiração. 3 – rolha de silicone. 4 – tubo de colheita. 5
– agulha de aspiração com bainha plástica. 6 – campo cirúrgico.
18
v
Figura 11.
Apreensão do ovário. a – pinça de manipulação atraumática. b
– ovário esquerdo. c – tuba uterina esquerda. d – ligamento
ovariano. e – pedículo...................................................................
18
Figura 12.
Punção do folículo com agulha envolta em bainha plástica. a –
bainha plástica. b – ponta da agulha de aspiração. c – ovário
esquerdo........................................................................................
18
Figura 13.
Lavagem dos ovários, ao final da sessão de aspiração, com
solução de PBS heparinizado. a – sugador-irrigador. b – bexiga.
c – ovário. d – corno uterino esquerdo. e – corno uterino direito..
18
Figura 14.
Gráfico ilustrando o número total de folículos visualizados em
cada grupo ao longo de seis sessões de laparoscopia para
aspiração folicular (LAF). Jaboticabal/SP – 2006..........................
26
Figura 15.
Valores médios dos pesos corporais de fêmeas caprinas adultas
estimuladas (G1) e não estimuladas (G2) hormonalmente ao
longo de seis sessões de laparoscopia para aspiração folicular...
30
Figura 16.
Valores médios dos pesos corporais de fêmeas caprinas pré-
púberes estimuladas (G3) e não estimuladas (G4)
hormonalmente ao longo de seis sessões de laparoscopia para
aspiração folicular..........................................................................
30
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
L
Microlitro
ANOVA Análise de variância
ALT
AST
Fosfatase alcalina
Aspartato aminotransferase
cm Centímetros
CO
2
Dióxido de carbono
COC Complexo cumulus-oócito
eCG Gonadotrofina coriônica equina
EGG Éter gliceril guaiacol ou Guaifenesina
FC Freqüência cardíaca
FPOD Folículos puncionados no ovário direito
FPOE Folículos puncionados no ovário esquerdo
FR Freqüência respiratória
FSHp Hormônio folículo-estimulante de origem suína
FVOD Folículos visualizados no ovário direito
FVOE Folículos visualizados no ovário esquerdo
G Gauge (medida de diâmetro de uma agulha)
GGT Gama glutamiltransferase
H Hora
Kg Quilograma
L Litro
LAF Laparoscopia para aspiração folicular
MAP Acetato de medroxiprogesterona
Mg miligramas
mg/dL Miligrama por decilítro
Min Minuto
ML Mililitros
vii
Mm milímetros
mmHg Milímetros de mercúrio (medida de pressão)
MOTE Múltipla ovulação e transferência de embriões
N
nm
Número
Nanômetros
OPU Ovum pick-up (colheita de oócitos in vivo)
PIA Pressão intra-abdominal
PIV Produção in vitro de embriões
Rpm
SAS
Rotações por minuto
Statistical Analyses System
T Tempo (momento)
TIVA Total intravenous anaesthesia (Anestesia total intravenosa)
U/L Unidade por litro
UI Unidade internacional
viii
AVALIAÇÃO DA LAPAROSCOPIA NA ASPIRAÇÃO FOLICULAR EM FÊMEAS
CAPRINAS PRÉ-PÚBERES E ADULTAS COM OU SEM ESTIMULAÇÃO
OVARIANA HORMONAL
RESUMO – O uso repetido da laparoscopia para aspiração folicular (LAF)
associado ou não à estimulação hormonal foi avaliado. Para tanto foram utilizadas
40 fêmeas caprinas sem-raça-definida, divididas aleatoriamente em 4 grupos com
10 animais cada, sendo: Grupo 1 – adultas estimuladas com 80 mg de FSHp e
300 UI de eCG; Grupo 2 – adultas não estimuladas (controle); Grupo 3 – pré-
púberes estimuladas com metade das doses preconizadas para o G1 e Grupo 4 –
pré-púberes não estimuladas. Cada fêmea foi submetida a seis sessões de
colheita com intervalo de uma semana entre as intervenções. A estimulação
hormonal foi feita em dose única, 36 horas antes do ato operatório. A técnica
consistiu do uso de duas punções para a introdução do endoscópio e da pinça de
manipulação atraumática. Após a visualização dos ovários, os folículos visíveis na
sua superfície foram puncionados com auxílio de agulha de aspiração acoplada a
um sistema de vácuo. Os oócitos encontrados foram classificados de acordo com
a qualidade, submetidos à maturação in vitro por 27 horas, e posteriormente
fixados e corados para avaliação do estádio de maturação. A técnica utilizada,
embora tenha apresentado redução da qualidade dos oócitos, não interferiu na
taxa de maturação ao longo das seis intervenções. A resposta ovariana diminuiu
com o uso repetido da estimulação com FSH exógeno. Não houve
comprometimento da condição corporal e da fertilidade dos animais. A avaliação
das funções hepática e renal e da analgesia, indica que o protocolo anestésico
utilizado é seguro e eficiente para este tipo de procedimento cirúrgico. Diante dos
resultados obtidos pode-se concluir que a técnica de laparoscopia para aspiração
folicular é adequada para a obtenção de oócitos de fêmeas caprinas pré-púberes
e adultas.
Palavras-chave: laparoscopia, aspiração folicular, caprino, oócito, folículo, FSH.
ix
EVALUATION OF THE LAPAROSCOPY TO FOLLICULAR ASPIRATION IN
GOAT FEMALES PREPUBERTAL AND ADULTS WITH OR WITHOUT
HORMONAL OVARIAN STIMULATION
SUMMARY - The repeated use of the laparoscopy to follicular aspiration (LFA)
associated or not the hormonal stimulation was evaluated. Forty crossbred goat
females were used, divided randomly in 4 groups with 10 animals each, being:
Group 1 - adult stimulated with 80 mg of FSHp and 300 UI of eCG; Group 2 - adult
not stimulated (control); Group 3 - pre-pubertal stimulated with half of the dose
praised for the G1 and Group 4 - prepubertal not stimulated. Each female was
submitted the six sessions of harvest with interval of one week between the
interventions. The hormonal stimulation was made in only dose, 36 hours before
the surgery. The technique consisted of the use of two punctions for the
introduction of the endoscopy and the clamp atraumatic manipulation. After the
visualization of the ovaries, the visible follicles in its surface were punched with aid
of needle of aspiration connected to a vacuum system. The recovery oocytes were
classified in accordance with the quality, submitted to in vitro maturation for 27
hours, and later fixed and stained for evaluation of maturation state. The used
technique does not interfered in the maturation rate although oocytes quality has
reduced. However the ovulatory response diminished with the repeated use of
exogenous FSH stimulation. Damage was not observed in corporal condition nor
fertility. The evaluation of the hepatic function, renal and pain analysis, showed that
the anaesthetic protocol used is safe and efficient for this type of surgery. In
conclusion, the technique of laparoscopy to follicular aspiration is adjusted for the
attainment of oocytes in goat females adult and prepubertal.
Keywords: laparoscopy, follicular aspiration, goat, oocyte, follicle, FSH.
1
1. INTRODUÇÃO
Notáveis progressos foram realizados nas últimas décadas no refinamento e
inovação de técnicas cirúrgicas aplicadas em diversos propósitos de pesquisa, fins
terapêuticos, ou mesmo para uso em locais equipados ou a campo. Estas técnicas
têm contribuído de forma significativa na reprodução de animais domésticos,
principalmente aqueles de interesse zootécnico, sendo utilizadas em inúmeros
procedimentos, tais como inseminação artificial intra-uterina, recuperação e
transferência de embriões em diversos estádios de desenvolvimento e verificação
da taxa de ovulação em fêmeas doadoras e receptoras (ARMSTRONG & EVANS,
1983; BARIL et al., 1993).
Em pequenos ruminantes, onde não é possível, ou fácil, manipular o trato
reprodutivo pelo reto como ocorre em bovinos e eqüinos (TERVIT, 1996), opta-se
por intervenções cirúrgicas para facilitar o diagnóstico e manejo da reprodução. Na
laparotomia, a exteriorização do trato reprodutivo inevitavelmente leva a algum
grau de trauma cirúrgico e quase sempre à formação de aderências pós-
operatórias envolvendo útero, tubas e ovários (ISHWAR & MEMON, 1996). Esta
situação torna a laparotomia imprópria como método de obtenção de oócitos, a
médio e longo prazo, em especial em fêmeas de alto valor genético (FREITAS &
SIMPLÍCIO, 2002). A laparoscopia se destaca por ser menos invasiva,
proporcionando recuperação mais rápida e podendo ser realizada diversas vezes
na mesma fêmea. Mais recentemente esta técnica tem sido utilizada para a
obtenção de oócitos in vivo para uso na pesquisa fundamental e na produção in
vitro de embriões (PIV) em caprinos (GRAFF et al., 1999; BALDASSARRE et al.,
2002).
Por ser pouco realizada em caprinos, ainda não é possível predizer o efeito
de repetidas colheitas de oócitos através da laparoscopia para aspiração folicular
(LAF), bem como o efeito da estimulação hormonal na fertilidade de doadoras
caprinas adultas e pré-púberes.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Técnicas para a colheita de oócitos em animais domésticos
É sabido que a maioria dos oócitos presentes nos ovários ao nascimento não
atingem a ovulação (HAFEZ, 1995). Portanto, técnicas de reprodução assistida
como a múltipla ovulação e transferência de embriões (MOTE) e a PIV vêm sendo
constantemente desenvolvidas e aperfeiçoadas com o objetivo de maximimizar o
potencial reprodutivo de animais ou mesmo de preservar espécies e raças
ameaçadas de extinção.
A obtenção dos oócitos é etapa fundamental para a realização da biotécnica
de PIV em animais domésticos e estes podem ser colhidos in vitro de ovários
obtidos em abatedouros ou por ovariectomia, ou in vivo por aspiração de folículos
utilizando-se métodos de laparotomia, laparoscopia ou via transvaginal guiada por
ultra-som (ARMSTRONG et al., 1997).
Ovários de abatedouros são uma fonte de oócitos de menor custo e mais
abundante para a produção de embriões em larga escala (MARTINO et al., 1994b;
WANI, 2002). Além disso, oócitos de animais abatidos têm sido importante na
obtenção de embriões para uma variedade de propósitos de pesquisa, mas são de
limitado valor em programas de melhoramento genético visto que o histórico e
estado sanitário são, na maioria das vezes, desconhecidos (ARMSTRONG et al.,
1997). Vale ressaltar ainda que, em caprinos, a disponibilidade de ovários é
escassa, visto que o abate de fêmeas é limitado. Estas possuem apenas a função
de reprodução para manter ou aumentar o número de animais que compõe o
rebanho e somente são descartadas quando já apresentam idade avançada.
A recuperação de oócitos de fêmeas vivas, “ovum pick-up” (OPU), é
largamente realizada em diversas espécies, com maior destaque para bovinos,
contudo sua exploração em pequenos ruminantes é ainda bastante limitada
(BALDASSARRE et al., 1994 e 1996; GRAFF et al., 1999). O uso desta técnica
3
depende do número de embriões produzidos por doadora, o qual está relacionado
em parte com a quantidade de oócitos obtidos por colheita (ANEL et al., 1997).
A maturação, fecundação e cultivo in vitro de oócitos possuem maior
potencial para elevar a produção de animais geneticamente superiores em relação
aos métodos tradicionais de MOTE (TERVIT, 1996). No entanto, técnicas para a
obtenção destes oócitos não têm se desenvolvido com a mesma velocidade que a
PIV e constitui-se de extrema importância para a maximização desta biotécnica
(GRAFF et al., 1999).
Em caprinos e ovinos, a laparotomia ainda é bastante utilizada para a
colheita de embriões (CORDEIRO, 2001) e oócitos (PTAK et al., 1999). A
princípio, é uma das técnicas que oferece maior taxa de colheita, 10 a 15%, se
comparada às outras, no entanto com o uso freqüente, o rendimento cai devido à
formação de aderências no trato reprodutivo da doadora e deste com tecidos e
órgãos circunvizinhos (VALLET et al., 1987).
A “ovum pick-up” via transvaginal guiada por ultra-som é feita
predominantemente em bovinos, cujo uso repetido a intervalos curtos de tempo,
não apresenta efeitos colaterais sobre a vida reprodutiva das doadoras (GALLI et
al., 2001). Em fêmeas caprinas, esta técnica foi desenvolvida por GRAFF et al.
(1995), porém com algumas limitações. Os autores verificaram que nas fêmeas
acima de 30 kg de peso corpóreo, este procedimento torna-se de difícil execução,
além de exigir muita habilidade do operador (GRAFF et al., 1999). O rendimento
da colheita de oócitos em cabras pela ultra-sonografia não é maior que outras
técnicas de OPU. Além disto, é importante notar que a LAF é menos traumática ao
ovário porque apenas o córtex é perfurado durante a aspiração, enquanto que
durante a colheita por ultra-som, a agulha usualmente alcança o folículo mediante
perfuração do estroma ovariano (PIERSON et al., 2004).
Por ser procedimento menos invasivo que a laparotomia, a LAF pode ser
repetida diversas vezes na mesma fêmea, reduzindo o estresse sofrido pelo
animal, em virtude do reduzido tempo de execução, (KÜHHOLZER et al., 1997).
Além disso, possui rendimento maior em comparação à colheita de oócitos
4
realizada por ultra-som. Na medicina humana, esta técnica tem substituído a
laparotomia em pequenas intervenções, reduzindo o tempo cirúrgico, propiciando
recuperação mais rápida do paciente, redução dos custos e menor incidência de
formação de aderências (MUZII et al., 2002). O uso da LAF aliada a biotécnica de
PIV, pode ser alternativa interessante para a superação de problemas de
regressão precoce de corpo lúteo, que é a causa da falha de aproximadamente
30% das doadoras caprinas submetidas a MOTE (COGNIÉ, 1999). Devido à
crescente importância da caprinocultura, esta técnica poderá ainda contribuir para
o melhoramento da produção de embriões nesta espécie, maximizando o seu uso
repetido em doadoras de alto valor genético. Os caprinos estão entre as espécies
de interesse zootécnico, e certamente, entre os ruminantes mais versáteis em
adaptabilidade aos diversos ambientes de produção (KEISLER, 1999). A demanda
por produtos e subprodutos desta espécie é bastante alta, porém a oferta
insuficiente (SILVA, 2002).
Por ser menos invasiva e provocar o mínimo trauma cirúrgico, a LAF pode vir
a substituir a laparotomia, tradicionalmente usada para a colheita de embriões em
pequenos ruminantes (COGNIÉ, 1999; STANGL et al., 1999). A possibilidade de
realizar colheitas repetidas de oócitos em intervalos reduzidos compensa a
produção relativamente baixa a cada sessão de aspiração (ARMSTRONG et al.,
1997). Além disso, permite estabelecer a possibilidade da produção de
descendentes em situações onde a MOTE não é aplicável, tais como em animais
pré-púberes, gestantes, púberes e com idade avançada (BALDASSARRE et al.,
2002).
2.2. A videolaparoscopia na Medicina Veterinária. Histórico
O termo laparoscopia origina-se do grego láparo e scopia que significam
abdome e examinar, respectivamente.
Na Medicina, procedimentos minimamente invasivos, como a laparoscopia,
são empregados na rotina com intuito de diminuir alguns inconvenientes causados
5
pela cirurgia convencional (WICKHAN, 1994), como permitir melhor aparência
estética, reduzir custos hospitalares, abrandar dor pós-operatória, reduzir o tempo
de recuperação pós-operatória e de internação hospitalar (AZZIZ et al., 1989;
FILMAR et al., 1987).
Ainda no século XIX, surgiu o precursor do endoscópio moderno. O título de
“pai da endoscopia”, segundo HARRINSON (1976), citado por BRUN & BECK
(1999), foi atribuído a Philipp Bozzini, que desenvolveu seu primeiro endoscópio
no início deste século. No entanto, relatava-se, entre as dificuldades encontradas,
a impossibilidade de transmitir iluminação suficiente para o local a ser examinado
e o restrito campo de visão. Estas foram minimizadas com a criação do citoscópio
de Nitze que possuía lentes ópticas e luz na extremidade distal.
Em 1860, Friedrich Trendelenburg popularizou o posicionamento que levaria
seu nome. Empregado para procedimentos pélvicos (ginecológico, urológico, entre
outros), é obtido pela colocação do paciente em cefalodeclive de 10 a 30° (LEME
et al., 2002).
Em 1901, George Kelling, usou uma agulha para insuflar a cavidade
peritoneal de um cão vivo com ar filtrado, possibilitando a primeira exploração da
cavidade abdominal. Em 1924 surgiu a agulha de Veress que reduziu o risco de
lesão visceral no momento da realização do pneumoperitônio, anterior à
introdução dos trocartes (WILDT & LAWLER, 1985).
A Medicina vem desenvolvendo em diversas espécies animais novas
técnicas de cirurgia laparoscópica a serem aplicadas posteriormente em pacientes
humanos. Na Medicina Veterinária, a videolaparoscopia vem sendo cada vez mais
empregada como opção para diagnóstico e tratamento cirúrgico das afecções
abdominais (LEMOS et al., 2003).
O campo da cirurgia ginecológica foi uns dos pioneiros a por em prática as
técnicas terapêuticas laparoscópicas. A espécie canina é uma das mais estudadas
(BRUN & BECK, 1999). Em grandes animais, a videolaparoscopia é bastante
utilizada na espécie eqüina, na reprodução assistida, apresentando excelentes
resultados (FIALHO et al., 2001). Em porcas e cadelas, a laparoscopia também é
6
aplicada com sucesso e mínimo trauma (BESENFELDER et al., 1997; SILVA et
al., 1995). HAZELEGER & KEMP (2001) apontaram como vantagens da
laparoscopia na reprodução de suínos, o fato de ser minimamente invasiva,
necessitando de poucas e pequenas incisões para a realização do procedimento e
como desvantagens, as mesmas para qualquer outra técnica cirúrgica.
Em pequenos ruminantes, a espécie ovina é a mais usada na pesquisa
científica, tanto no campo da Medicina, como modelo animal (HUNTER et al.,
1995; CURET et al., 1996; DREYFUS et al., 1996), quanto na Veterinária. A
laparoscopia vem sendo aplicada nesta espécie em diversos trabalhos como:
inseminação artificial (IA) intrauterina (MCKELVEY et al., 1985b; NEVES & LUZ,
1994), colheita (MCKELVEY & ROBINSON, 1984; MCKELVEY et al., 1986) e
transferência de embriões (SCHIEWE et al., 1984; MCKELVEY et al., 1985a;
BESENFELDER et al., 1994). A LAF, no entanto, desde a primeira colheita de
oócitos em ovelhas (SNYDER & DUKELOW, 1974), não foi completamente
desenvolvida até os anos recentes, em conjunto com a biotécnica de PIV
(BALDASSARRE et al., 1994 e 1996; ANEL et al., 1997; KÜHHOLZER et al.,
1997; ALVAREZ et al., 1999; STANGL et al., 1999; ALBERIO et al., 2002;
RODRÍGUEZ et al., 2006). Em caprinos, os relatos são mais limitados, uma vez
que a IA e a TE são feitas predominantemente pela via transcervical. Porém, com
o advento da transgenia, os caprinos têm participado bastante desta área da
pesquisa tornando a laparoscopia uma ferramenta essencial (BALDASSARRE et
al., 2002; 2003; 2003a e 2004a). Atualmente, o principal foco desta biotécnica está
em produzir cabras transgênicas que sintetizem e secretem em larga escala no
leite, proteínas recombinantes de interesse na indústria farmacêutica (WANG et
al., 2002; BALDASSARRE et al., 2004, MAGA et al., 2006).
2.3. A estimulação ovariana para a obtenção de oócitos in vivo
Para a colheita de oócitos in vivo, apenas folículos antrais são acessíveis
(dois a oito milímetros de diâmetro), e sua eficiência é maior pela estimulação
7
ovariana com hormônios gonadotróficos com objetivo de aumentar o tamanho do
antro (ARMSTRONG et al., 1997).
O hormônio folículo-estimulante (FSH), quando usado para a indução de
múltiplas ovulações em cabras, é geralmente administrado em doses fracionadas,
duas vezes ao dia, durante os últimos três ou quatro dias do tratamento
progestágeno, que é em torno de 9 a 11 dias (BARIL et al., 1993). Isto é
necessário por causa da meia-vida curta do FSH. Os protocolos superovulatórios
que combinam alta dose (80-140 mg) de FSH acompanhada por baixa dose (200-
300 UI) de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG), administradas num mesmo
momento, proporcionam desenvolvimento folicular e quantidade de oócitos
colhidos similar àqueles obtidos em resposta a múltiplas injeções de FSH
isoladamente (BATT et al., 1993; ARMSTRONG et al., 1994). A alta dose de FSH
é hábil para recrutar, mas não para sustentar o desenvolvimento de um grupo de
folículos FSH-responsivos (STUBBINGS et al., 1993). A longa meia-vida do eCG
(HAFEZ, 1995) possibilita a continuação do crescimento folicular iniciado pela alta
dose de FSH. A aplicação única ao invés de múltiplas é preferível pela praticidade
uma vez que o resultado final é semelhante.
Doadoras jovens, em geral, precisam de uma dose de hormônios menor que
as fêmeas adultas, devido, em parte, ao seu menor peso corporal mas, talvez
também por causa da responsividade folicular ser alta antes de serem
estabelecidos os mecanismos regulatórios intraovarianos designados para limitar
a taxa de ovulação (ARMSTRONG et al., 1997).
2.4. Fatores que interferem na qualidade do oócito obtido por LAF
O número de oócitos colhidos de alta qualidade é uma importante meta na
produção de embriões in vitro (WANI, 2002).
A qualidade do oócito recuperado é determinada, entre outras características,
pela presença ou ausência de células do cumulus. O papel destas células no
desenvolvimento completo da competência dos oócitos é investigado há bastante
8
tempo (LEIBFRIED & FIRST, 1979). Os estudos mostram que não há maturação
ou esta ocorre em menor escala, quando as células do cumulus são removidas
antes dos oócitos serem maturados in vitro (GONÇALVES et al., 2002).
Para realizar a aspiração com sucesso é preciso também verificar o tipo de
agulha e a pressão de vácuo a serem empregados, pois disto depende a
qualidade do oócito a ser obtido. Como observado no homem, agulhas finas
podem dificultar a passagem da massa pré-ovulatória de células do cumulus
(LENZ & LAURITSEN, 1982), diminuindo assim a taxa de obtenção. O mesmo
acontece com agulhas mais largas, devido à redução da velocidade de trânsito e a
maior turbulência entre as conexões do sistema de aspiração (RENOU et al.,
1981). Com relação à pressão do vácuo, esta não só afeta a quantidade, mas
também a qualidade dos oócitos obtidos. FRY et al. (1997) verificaram que o
aumento da pressão pode levar à maior taxa de obtenção, porém há redução no
número de oócitos viáveis. A perda de células do cumulus (desnudamento) pode
ocorrer durante o trânsito dos oócitos do folículo ao tubo de colheita. Segundo
BALDASSARRE et al. (1994), estas podem ser preservadas ajustando-se
adequadamente a pressão do vácuo ou trabalhando com estádios foliculares mais
precoces para a obtenção de um cumulus mais compacto.
2.5. O uso da LAF em animais jovens
Do ponto de vista econômico, o maior atrativo desta técnica deve ser a PIV a
partir de oócitos recuperados em caprinos pré-púberes. Um alto número de
oócitos obtidos de animais jovens, aliada a capacidade de desenvolvimento
aceitável, tem o potencial de encurtar significativamente o intervalo entre
gerações, acelerando, portanto o ganho genético (PTAK et al., 1999). Visto que a
OPU nestes animais permite ter acesso mais precocemente a um grande número
de oócitos presentes em cada doadora, técnicas adequadamente repetíveis
poderiam beneficiar programas para multiplicar rapidamente raças ou animais
valiosos e maximizar o número de embriões produzidos in vitro (TERVIT, 1996).
9
ARMSTRONG et al. (1994) comentaram que as respostas foliculares de
ovários de novilhas à estimulação com FSH aumentaram progressivamente de
três a nove semanas de idade. Os oócitos obtidos por laparoscopia destes
folículos são capazes, após serem submetidos a FIV, de desenvolverem-se, em
cultivo, até o estádio de blastocisto, apresentando taxas similares àqueles
oriundos de ovários de vacas adultas colhidos em abatedouro. Estudos com
bovinos comprovaram que novilhas podem ser estimuladas com FSH para
repetidas aspirações foliculares por laparoscopia a intervalos curtos sem danos
evidentes aos ovários ou interferência com a subseqüente capacidade de procriar
(STUBBINGS et al., 1993). Foram observados ainda, em outros relatos, que a
freqüência da aspiração folicular não afeta a posterior resposta superovulatória em
vacas (BROADBENT et al., 1997) e a fertilidade em ovelhas (STANGL et al.,
1999).
Em programas tradicionais de criação, apenas reprodutores e matrizes de
mérito genético provado são selecionados para procriar. Contudo, esta informação
não é comumente disponível em animais pré-púberes. A técnica de LAF, aliada à
PIV, pode acelerar o processo de expansão de um limitado número de animais
geneticamente valiosos quando introduzidos em nova região. Por reduzir muito o
intervalo entre gerações, constitui-se forma mais eficaz que o tradicional teste de
progênie para a avaliação da condição genética da fêmea (BALDASSARE et al.,
2002).
A cabra possui uma população folicular estimada ao nascimento de
aproximadamente 37.000 por ovário (BEZERRA et al., 1998) e um padrão
predominante de quatro ondas foliculares com ovulação na quarta onda
(GINTHER & KOT, 1994). Todavia, durante a vida útil de uma fêmea altamente
produtiva, menos de 0,05% dos oócitos irão se desenvolver até gerar um
descendente vivo (KEISLER, 1999). Isto significa que este animal, através do uso
de técnicas para a máxima obtenção de oócitos e de embriões, pode produzir um
número muito maior de descendentes, durante a sua vida reprodutiva, do que de
forma natural.
10
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
¾ Avaliar a viabilidade da laparoscopia na aspiração folicular (LAF), com
sete dias de intervalo entre as intervenções, em fêmeas caprinas pré-
púberes e adultas.
3.2. Específicos
¾ Verificar se a estimulação hormonal ovariana melhora a colheita de
oócitos por LAF;
¾ Pesquisar se a quantidade e qualidade dos oócitos obtidos, e o número
de maturados sofrem alguma influência do uso da LAF semanalmente;
¾ Investigar se a utilização semanal da LAF interfere na capacidade
gestacional destes animais;
¾ Analisar se a repetibilidade deste procedimento operatório, no período
próprio de observação, causa complicações para a obtenção de oócitos.
11
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Local do experimento
Os animais foram mantidos no setor de Reprodução Animal da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP - Campus de Jaboticabal, em sistema
intensivo de criação, onde tiveram acesso a água, sal mineral e feno de Tifton e
silagem de milho ad libitum, além de ração balanceada no cocho fornecida uma
vez ao dia (250g/animal). Neste mesmo local, em um galpão anexo, foram
realizadas as intervenções cirúrgicas. A avaliação e a maturação dos oócitos
foram realizadas no Laboratório de Fecundação In Vitro pertencente ao mesmo
setor. A análise das amostras de sangue para avaliação dos parâmetros
bioquímicos foi realizada no Laboratório de Patologia Clínica “Prof. Dr. Joaquim
Martins Ferreira Neto” do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”, ambos
pertencentes à referida instituição.
4.2. Animais e tratamentos
Foram utilizadas 40 fêmeas caprinas mestiças consideradas hígidas com
base nas avaliações clínica e parasitológica, sendo 20 pré-púberes e 20 adultas
pluríparas, com idades variando, ao início do experimento, de três a cinco e de 12
a 36 meses, respectivamente. Os animais foram randomicamente distribuídos nos
seguintes grupos experimentais:
¾ G1 – adultas estimuladas hormonalmente, n=10;
¾ G2 – adultas não estimuladas (controle), n=10;
¾ G3 – pré-púberes estimuladas hormonalmente, n=10;
¾ G4 – pré-púberes não estimuladas (controle), n=10.
12
As fêmeas adultas (G1) foram sincronizadas com o uso de esponjas
intravaginais impregnadas com 60 mg de acetato de medroxiprogesterona
1
por um
período de 11 dias, sendo que no nono dia foi administrado pela via intramuscular,
75 g de d-cloprostenol
2
. A estimulação ovariana consistiu na administração de
80 mg de FSHp
3
e 300 UI de eCG
4
, ambas em aplicação única, pela via
intramuscular, feita 36 horas anterior às intervenções (Figura 1). As fêmeas pré-
púberes (G3) receberam metade das doses preconizadas para a estimulação
ovariana nas adultas (G1). A retirada das esponjas foi feita imediatamente antes
da primeira laparoscopia. Em cada animal, as colheitas de oócitos foram
realizadas uma vez por semana, durante seis semanas consecutivas.
1
MAP, Progespon, Tecnopec, Syntex S.A., Argentina
2
Prolise, Tecnopec, ARSA S.R.L., Argentina
3
Folltropin, Tecnopec, Vetrepharm Inc., Canadá
4
Novormon, Tecnopec, Syntex S.A., Argentina
Figura 1 – Esquema do tratamento hormonal destinado às fêmeas caprinas adultas (G1) e
pré-púberes (G3), durante o período experimental.
Legenda:
D0 - dia zero (início do tratamento progestágeno)
CE - colocação das esponjas
D9 - nono dia do tratamento progestágeno
PGF2 - aplicação de 75 g de cloprostenol, um análogo da prostaglandina F2 , via intramuscular
FSHp + eCG - aplicação de 80 mg de FSHp e de 300 UI de eCG, correspondente à estimulação ovariana, realizada
36 horas antes das laparoscopias (LAF)
D11 - décimo primeiro dia (final do tratamento progestágeno)
RE - retirada das esponjas
13
4.3. Pesagem dos animais
Antes de cada intervenção cirúrgica, as fêmeas tiveram seus pesos
corpóreos aferidos em balança digital para permitir o cálculo da dosagem
anestésica e avaliação da condição corporal ao longo do experimento.
4.4. Protocolo anestésico
Após jejum alimentar de 36 h e líquido de 24 h, os animais receberam, como
medicação pré-anestésica, 0,05mg/Kg/IM de cloridrato de xilazina a 2%
5
e,
transcorridos 10 minutos, foi aplicado cloridrato de cetamina a 10%
6
, para indução,
na dose de 2mg/Kg/IV. Em seguida a fêmea foi colocada em maca cirúrgica
apropriada, onde foi realizada a canulação de uma das veias jugulares com auxílio
de um catéter 20G para administração da Anestesia Total Intravenosa (TIVA),
necessária para manutenção anestésica dos animais durante o procedimento
cirúrgico (RIEBOLD, 1996). A TIVA era composta de éter gliceril guaiacol (EGG)
7
na dose de 50mg/mL (5%), 0,1mg/mL de cloridrato de xilazina a 2% e 1mg/mL
de cloridrato de cetamina a 10%, diluídos em 500 mL de solução glicofisiológica e
infundidos a 2 mL/Kg/h, cerca de 10 a 15 gotas/min, de acordo com o plano
anestésico. Ato contínuo ao início da TIVA procedeu-se a intubação endotraqueal,
com o auxílio de um laringoscópio de lâmina reta, evitando a aspiração do
conteúdo ruminal, em caso de regurgitação, e permitindo o fornecimento de
oxigênio medicinal umidificado, sob ventilação assistida, facilitando a troca
gasosa. No campo cirúrgico, região do abdome cranial ao úbere (Figura 2), foi
feita a tricotomia e anti-sepsia com tintura de iodo, e em seguida, a anestesia local
infiltrativa com 2 mL de cloridrato de lidocaína
8
, em cada ponto onde foram
introduzidos os trocartes.
5
Dorcipec, Vallée – Montes Claros-MG
6
Dopalen, Vetbrands – Jacareí-SP
7
Guaifenesina, Henrifarma – São Paulo-SP.
8
Lidovet
, Bravet, Brasil.
14
4.5. Laparoscopia para aspiração folicular (LAF)
Depois de executadas a TIVA e analgesia local, a fêmea foi posicionada em
Trendelenburg (Figura 3), e a agulha de Veress
9
introduzida cerca de 10 a 15 cm
cranial ao úbere e cinco centímetros à direita da linha média, para o
estabelecimento do pneumoperitônio com CO
2
(Figura 4), utilizando pressão intra-
abdominal (PIA) calculada de acordo com o peso da fêmea, variando de 5 a 8
mmHg, e velocidade de insuflação de 2,5 L/min. No mesmo local, com o auxílio de
um bisturi, o orifício de introdução da agulha foi ampliado até o máximo um
centímetro e em seguida inserido o trocarte de 7 mm (Figura 5) para a colocação
de uma bainha pela qual seria introduzido o laparoscópio. Esta bainha era munida
de entrada para o CO
2
, o qual manteve a PIA estabelecida a princípio (Figura 6).
O endoscópio foi conectado a uma câmera e a um cabo de fibra ótica
10
(Figura 7),
fornecendo assim luz para o interior da cavidade e a imagem resultante foi vista
em um monitor. A manipulação do laparoscópio ficou a cargo de um assistente.
Uma vez obtida a visão interna da cavidade, foi feita, lateralmente a primeira
punção, uma pequena incisão na pele para a introdução do trocarte de 10 mm
com bainha rosqueável (Figura 8), para a passagem da pinça atraumática modelo
Babcock
9
. Com o auxílio deste instrumento, útero, tubas e bursas ováricas foram
manipulados para permitir a visualização dos ovários. Antes de iniciar a aspiração,
os ovários foram examinados e o número de folículos visíveis (três a oito mm) na
superfície de cada um foi registrado. O ovário foi imobilizado pela apreensão
próxima ao seu ligamento (Figura 11), evitando ao máximo danificar as estruturas
das tubas e do pedículo. Em seguida, a agulha de aspiração foi introduzida na
cavidade, com sua ponta protegida por uma bainha plástica, próximo ao local onde
se encontrava o ovário (Figura 9). Os folículos foram puncionados pela
movimentação dos ovários em diferentes posições com a pinça de manipulação
atraumática. A agulha era inicialmente colocada em posição paralela à base do
9
EDLO, Canoas-RS, Brasil
10
Karl Storz, Alemanha
15
folículo de modo a penetrá-lo lateralmente (Figura 12). Não sendo possível realizar
esta manobra, a punção era perpendicular. Uma vez inserida no folículo, a agulha
era cuidadosamente movida para garantir que todo o seu conteúdo fosse
aspirado. A pressão do vácuo foi ajustada para no máximo 50 mmHg.
Neste trabalho utilizou-se um sistema de aspiração com lume simples
(mesmo diâmetro interno, desde a agulha até a saída no tubo de colheita)
composto de uma agulha de 17G envolta em uma bainha plástica
11
, com bisel
curto, conectada a uma cânula de teflon de 50 cm de comprimento
12
, a qual
terminava no tubo de colheita (50 mL) presa a uma rolha de silicone (Figura 10). O
vácuo era produzido por uma bomba de aspiração
13
, através de outra cânula
também presa à rolha, que ia do tubo de colheita. No interior do sistema de
aspiração por onde passaram os oócitos foi feita uma lavagem prévia com o meio
de colheita deixando aproximadamente 2 mL deste líquido, no fundo do tubo, para
receber os oócitos.
A fim de minimizar a formação de possíveis aderências, os ovários, ao final
da laparoscopia, foram banhados (Figura 13) com 20 mL do meio de colheita
aquecido a 37ºC e, logo após, o líquido da lavagem foi aspirado da cavidade.
Ao final da laparoscopia, foi colocado antibiótico tópico “spray”
14
sobre cada
incisão na pele e em seguida estas foram fechadas com o auxílio de agrafes. Ao
redor das feridas cirúrgicas foi utilizada pomada repelente/cicatrizante
15
. Nas
intervenções subseqüentes, as incisões foram feitas lateralmente a um centímetro,
cranial ou caudal à incisão anterior. Após serem retiradas da maca cirúrgica as
fêmeas foram colocadas em local limpo e tranqüilo e observadas até o seu
completo restabelecimento.
11
Angiocath, 16G, BD
12
Handle Cook, Ribeirão Preto-SP, Brasil
13
Nevoni
14
Terra Cortril Spray, Pfizer Ltda.
15
Ungüento Pearson, Pearson Saúde Animal Ltda.
16
Figura 4 – Fotografia ilustrando a agulha de
Veress (1) para instalação do
pneumoperitônio com CO
2
. 2 –
cabo para a passagem do gás.
DIREITA
ESQUERDA
CAUDAL
CRANIAL
1
2
3
Figura 3 – Fotografia ilustrando o
posicionamento em
Trendelenburg de fêmea
caprina (cefalodeclive em
30 graus).
DIREITA
ESQUERDA
CAUDAL
CRANIAL
Figura 5 – Fotografia ilustrando a inserção do
trocarte de 7 mm para introdução do
laparoscópio.
a
b b
c
d
f
e
CAUDAL
CRANIAL
DIREITA
Figura 2 – Fotografia ilustrando o campo cirúrgico
de fêmeas caprinas para a LAF. a –
úbere (círculo). b – pontos de inserção
da agulha de aspiração. c – linha alba.
d – ponto de inserção do trocarte para
introdução da pinça de manipulação
atraumática. e - ponto de inserção do
trocarte para introdução do
laparoscópio. f – umbigo.
ESQUERDA
2
4
5
17
A
B
C
Figura 7 – Fotografia ilustrando a montagem do
laparoscópio. A – laparoscópio. B –
cabo da câmera (imagem). C – cabo
de fibra ótica (luz).
CAUDAL
CRANIAL
ES
Q
UERDA DIREITA
1
2
Figura 6 – Fotografia ilustrando a bainha
inserida no abdome para
introdução do laparoscópio. 1 –
bainha de 7 mm com entrada
para o CO
2
. 2 – cabo para a
passagem do gás.
Figura 8 – Fotografia ilustrando a inserção do
trocarte para introdução da pinça de
manipulação atraumática. a - trocarte
de 10 mm com bainha rosquiável. b –
bainha de 7 mm com endoscópio
inserido e iluminando a região da
punção de “a”.
a
b
CRANIAL CAUDAL
ESQUERDA
DIREITA
Figura 9 – Fotografia ilustrando o posicionamento
dos instrumentais cirúrgicos utilizados
na laparoscopia para aspiração
folicular. A – agulha de aspiração. B –
pinça de manipulação atraumática. C –
bainha rosquiável de 10 mm. D –
bainha de 7 mm com laparoscópio
inserido.
CAUDAL
CRANIAL
DIREITA
A
B
D
C
ESQUERDA
7
6
9
8
18
Figura 12 – Fotografia ilustrando a punção do
folículo com agulha envolta em
bainha plástica. a – bainha plástica.
b – ponta da agulha de aspiração. c
– ovário esquerdo.
a
b
c
Figura 11 – Fotografia ilustrando a apreensão do
ovário. a – pinça de manipulação
atraumática. b – ovário esquerdo. c –
tuba uterina esquerda. d – ligamento
ovariano. e – pedículo.
a
b
c
e
d
Figura 10 – Fotografia ilustrando o sistema de
aspiração folicular. 1 – mangueira
do vácuo. 2 – linha de aspiração. 3
– rolha de silicone. 4 – tubo de
colheita. 5 – agulha de aspiração
com bainha plástica. 6 – campo
cirúrgico.
1
2
3
4
5
6
CAUDAL
CRANIAL
DIREITA ESQUERDA
Figura 13 – Fotografia ilustrando o procedimento
de lavagem dos ovários, ao final da
sessão de aspiração, com solução
de PBS heparinizado. a – sugador-
irrigador. b – bexiga. c – ovário. d –
corno uterino esquerdo. e – corno
uterino direito.
a
c
e
d
ESQUERDA
b
CRANIAL
CAUDAL
DIREITA
11
10
13 12
19
4.6. Exame clínico e avaliação da analgesia
Foram avaliadas as freqüências cardíaca (FC) e respiratória (FR), bem como
a analgesia nos tempos 0 (antes da medicação anestésica), 10, 20, 30, 40 e 50
minutos durante a administração da TIVA. Os parâmetros FC e FR foram aferidos
com estetoscópio colocado na região costal e para a avaliação da analgesia levou-
se em consideração os estímulos dolorosos decorrentes da LAF e, os resultados,
foram colocados na seguinte escala: 1 – sensação normal ao estímulo doloroso;
2 – analgesia leve; 3 – analgesia moderada; 4 – analgesia completa.
4.7. Avaliação das funções hepática e renal
Com intuito de avaliar e monitorar as funções hepática e renal, 35% dos
animais (n=14), tiveram amostras de sangue (3 mL) colhidas através de
venipunção da jugular externa, as quais foram acondicionadas em tubos de ensaio
sem anticoagulante, levadas ao laboratório e centrifugadas a 2000 rpm por 5 min,
após sinérese, o soro obtido foi acondicionado em tubos próprios, identificados e
armazenados (-20
o
C) adequadamente até o momento das determinações.
As colheitas de sangue foram realizadas antes da cada procedimento
cirúrgico, previamente à administração da anestesia. A primeira colheita (T
0
)
representou os valores basais, uma vez que os animais ainda não haviam sido
submetidos a qualquer procedimento experimental, e foi executada na ocasião da
primeira laparoscopia. A última colheita (T
6
) foi feita uma semana após a sexta e
última laparoscopia, totalizando sete avaliações.
Os parâmetros bioquímicos avaliados foram: aspartato aminotransferase
(AST), fosfatase alcalina (ALP) e gama-glutamiltransferase (GGT), para avaliação
da função hepática e uréia e creatinina para avaliação da função renal (Anexo 2).
20
4.8. Maturação in vitro
Em laboratório, o líquido aspirado foi cuidadosamente depositado em placas
de Petri e levado à observação em estereomicroscópio em aumento de 40X. Uma
vez localizados, os oócitos foram transferidos para outra placa contendo 300 a 500
L de meio de lavagem (Anexo 1), e então classificados de acordo com sua
qualidade (Tabela 1). Em seguida, foram passados em três gotas de 100 a 200 L
de meio de lavagem e levados para cultivo em placas contendo gotas de 100 L
de meio de maturação (Anexo 1) sob óleo mineral, onde permaneceram durante
27 horas, em estufa a 39C, com 5,0% de CO
2
em ar e atmosfera úmida. Ao final
do cultivo, todos os oócitos foram desnudados sob estereomicroscópio (50-80X),
em meio de lavagem, com pipeta automática de 100 L, à temperatura ambiente
(28
o
C). Posteriormente, foram fixados por 5 min com formamida a 4% em PBS e
permeabilizados com Triton a 1% em PBS por 10 min. Posteriormente foram
corados com gel Mowiol incluído com corante Hoechst 33342, fixados entre lâmina
e lamínula, vedados com esmalte, e levados ao microscópio de epifluorescência
16
,
após o tempo mínimo de 24 horas, para observação do estádio de maturação
nuclear.
Os oócitos examinados foram classificados da seguinte forma (WANG et al.,
1998): (1) oócitos maturados, onde é possível observar a formação de um eixo em
metáfase com expulsão do primeiro corpúsculo polar; e (2) oócitos imaturos, nos
quais a placa metafásica não é observada.
16
Microscópio Olympus IX70; comprimento de onda 460 a 490 nm
21
Grau Aspecto Classificação
I
Complexo cumulus completo
Excelente
II
Mais que duas camadas de
células do cumulus
Bom
III
Uma camada de células do
cumulus ou cumulus incompleto
Regular
IV
Oócito desnudo e/ou
degenerado
Ruim
Foram classificados como viáveis, os oócitos de graus I a III e, em todos eles
o citoplasma deveria apresentar-se com coloração brilhante e aspecto uniforme.
4.9. Avaliação da capacidade gestacional
Cerca de uma semana após a última laparoscopia, as fêmeas adultas tiveram
o estro sincronizado e, logo após a retirada das esponjas, foram deixadas com um
macho caprino, de fertilidade comprovada por descendentes, até que não
manifestassem mais sinais de estro, garantindo-se pelo menos duas coberturas
por fêmea. O diagnóstico de gestação foi realizado 45 dias após a cobertura por
ultra-sonografia transretal.
As fêmeas pré-púberes precisaram aguardar até que atingissem 10 a 12
meses de idade antes de serem colocadas para reprodução.
4.10. Análise estatística
Os dados obtidos sobre a quantidade e a qualidade dos oócitos colhidos,
bem como o número de maturados nos grupos experimentais foram submetidos à
análise de variância (ANOVA), de medidas repetidas, com quatro níveis entre os
LEIBFRIED & FIRST (1979) adaptado por CORDEIRO (2006).
Tabela 1 – Classificação dos complexos cumulus-oócitos obtidos por
laparoscopia.
22
animais (grupos) e um fator (tratamento hormonal) com dois níveis dentro dos
animais com 6 repetições em cada grupo. Os dados foram analisados pelo
programa estatístico SAS (User's Guide: Statistics, 1985). Na comparação das
médias, inclusive aquelas relacionadas às funções hepática e renal, utilizou-se o
Teste de Tukey (P<0,05).
A avaliação da fertilidade foi feita pelo teste de Qui-quadrado.
A transformação utilizada nas variáveis foi a raiz quadrada da observação +
1 com o intuito de diminuir o coeficiente de variação. Isto indica que a variação
individual é muito alta.
5. RESULTADOS
5.1. Avaliação da LAF
O tempo médio das intervenções cirúrgicas foi de 35 minutos.
O sangramento no ovário, causado pela punção, foi mínimo. A imagem
observada no monitor foi pelo menos 10 vezes maior que a real, por isto, parecia
que o sangramento causado pela perfuração da agulha na superfície ovariana era
muito grande. Além da lavagem dos ovários, a remoção de coágulos grandes foi
feita, com o auxílio da pinça atraumática, ao final das aspirações a fim de prevenir
aderências. Apenas 15% das fêmeas (n=6) apresentaram algum grau de aderência
entre o ovário e estruturas adjacentes, predominantemente a partir da quarta
intervenção e, somente 10% (n=4) desenvolveram aderências entre o omento e o
local da inserção dos trocartes.
Já no terceiro dia pós-cirúrgico, as feridas de pele, na maioria das fêmeas,
apresentavam um bom grau de cicatrização. Em apenas 10% dos casos (n=4)
houve inflamação local.
23
5.2. Efeito da anestesia sobre parâmetros fisiológicos
Os dados das freqüências cardíaca (FC) e respiratória (FR) encontram-se
na Tabela 2.
Tempo (minutos)
Parâmetros T
0
T
10
T
20
T
30
T
40
T
50
médiad.p.
6113 6818 7324 7519 7119 7318
Freqüência
cardíaca
(batimentos/
minuto)
máximo – mínimo
92 – 44 100 – 34 154 – 40 120 – 36 104 – 40 120 – 48
médiad.p.
2111 4024 5023 5925 6026 5523
Freqüência
respiratória
(movimentos/
minuto)
máximo – mínimo
60 – 6 96 – 12 100 – 8 100 – 16 120 – 14 112 – 12
Observou-se aumento das freqüências cardíaca (FC) e respiratória (FR) ao
longo da intervenção cirúrgica. O aumento da FR foi acompanhado da diminuição
da amplitude respiratória. Algumas fêmeas apresentaram apnéia transitória,
observada geralmente nos primeiros minutos da TIVA, necessitando assim de
respiração controlada. A velocidade de infusão do anestésico administrado foi
suficiente para a manutenção do plano cirúrgico, contudo, baseado na
monitoração dos reflexos oculares e das FC e FR, em alguns animais, o volume
infundido foi reajustado. Apesar do rigoroso jejum, alguns animais apresentaram
refluxo gástrico durante o procedimento.
Todos os animais receberam o conceito 4, considerado analgesia completa,
isto é, possibilidade de realização do procedimento cirúrgico.
Na avaliação dos parâmetros relacionadas à função hepática (Tabela 3)
não foram observadas diferenças (P>0,05) em relação ao T
0
(valores basais).
Tabela 2 – Média desvio-padrão e valores máximo e mínimo das freqüências cardíaca e
respiratória antes (T
0
) e durante a aplicação da anestesia (T
10-50
) para a
realização das laparoscopias em fêmeas caprinas pré-púberes e adultas.
Jaboticabal/SP – 2006.
24
Quanto à função renal (Tabela 4), pôde-se observar que os valores médios
obtidos para a variável creatinina diferiram (P<0,05) do controle (T
0
). Já os valores
médios obtidos para a variável uréia não diferiram do controle.
VARIÁVEIS DETERMINADAS
MOMENTO
AST
(U/L)
ALP
(U/L)
GGT
(U/L)
T
0
75,614,76 240,4537,63 44,782,84
T
1
81,494,76 177,9037,63 52,572,84
T
2
60,344,76 132,0537,63 47,712,84
T
3
71,854,76 100,7137,63 51,642,84
T
4
67,494,76 216,9137,63 53,972,84
T
5
62,544,76 171,9937,63 53,422,84
T
6
60,704,76 312,3437,63 48,212,84
VARIÁVEIS DETERMINADAS
MOMENTO
Uréia
(mg/dL)
Creatinina
(mg/dL)
T
0
48,885,29 1,160,04
T
1
41,235,29 1,250,04
T
2
32,105,29 1,040,04
T
3
49,065,29 1,070,04
T
4
60,495,29 1,150,04
T
5
56,585,29 1,050,04
T
6
45,385,29 0,930,04*
Tabela 3 – Média e erro-padrão dos valores da aspartato aminotransferase (AST),
fosfatase alcalina (ALP) e gama-glutamiltransferase (GGT) de
fêmeas caprinas jovens e adultas submetidas a seis sessões de
la
p
arosco
p
ia
p
ara as
p
i
r
a
ç
ão folicular. Jaboticabal/SP
–
2006.
Tabela 4 – Média e erro-padrão dos valores de uréia e creatinina de fêmeas
caprinas submetidas a seis sessões de laparoscopia para
aspiração folicular. Jaboticabal/SP – 2006.
T
0
=basal ou controle; T
1
a T
6
=1
a
a 6
a
semana.
* Diferem do controle (T
0
) pelo Teste de Tukey (P<0,05).
T
0
=basal ou controle; T
1
a T
6
=1
a
a 6
a
semana.
25
5.3. Resposta ovariana e colheita de oócitos
O número total de folículos visualizados e puncionados de cada grupo, e as
taxas de aproveitamento e de colheita, ao longo das seis semanas, estão
ilustrados na Tabela 5.
LAF
Grupo
n
Folículos
visualizados
(n)
Folículos
puncionados
(n)
Taxa de
aproveitamento
(%)
Taxa de
colheita
(%)
1 10
220
150 68,18 52,00
1ª
2 10
154
116 75,32 93,94
3 10
196
137 69,89 38,68
4 10
137
105 76,64 40,00
1 10
194
147 75,77 86,48
2ª
2 10
144
93 64,58 53,76
3 10
178
116 65,16 42,24
4 10
123
86 69,91 32,55
1 10
174
141 81,03 48,93
3ª
2 10
127
90 70,86 64,44
3 10
141
101 71,63 54,45
4 10
89
60 67,41 50,00
1 10
174
116 66,66 47,41
4ª
2 9
107
73 68,22 58,90
3 10
139
98 70,50 56,12
4 9
110
82 74,54 31,70
1 10
135
97 71,85 61,85
5ª
2 9
116
83 71,55 46,98
3 10
114
85 74,56 48,23
4 8
94
64 68,08 42,18
1 10
108
70 64,81 51,42
6ª
2 9
117
80 68,37 47,50
3 10
123
83 67,47 55,42
4 8
95
69 72,63 46,37
Legenda:
Grupos: 1 = adultas com estimulação hormonal; 2 = adultas sem estimulação hormonal;
3 = pré-púberes com estimulação hormonal; 4 = pré-púberes sem estimulação hormonal.
Taxa de aproveitamento = n° de folículos puncionados / n° folículos visualizados
Taxa de colheita = n° de oócitos obtidos / n° folículos puncionados
Tabela 5 – Taxa de aproveitamento e de colheita de oócitos de fêmeas caprinas adultas e pré-
púberes, com ou sem estímulo hormonal. Jaboticabal/SP – 2006.
26
0
50
100
150
200
250
123456
LAF
Nº folículos visualizados
G1
G2
G3
G4
O número de folículos visualizados diminuiu em todos os grupos ao longo das
semanas como ilustrado na Figura 14, destacando-se uma redução mais
acentuada entre as fêmeas submetidas à estimulação ovariana hormonal (G1 e
G3).
Os valores médios de folículos visualizados (FVOE e FVOD) e puncionados
(FPOE e FPOD) em ambos os ovários, bem como no número de oócitos
encontrados (Tabela 6) apresentaram diferença (P<0,05) entre a primeira e última
semana apenas no grupo de fêmeas adultas com estimulação hormonal (G1). Nos
demais grupos, os valores não diferiram entre a primeira e última semana e entre
si com relação às variáveis avaliadas.
Figura 14 – Gráfico ilustrando o número total de folículos visualizados em
cada grupo ao longo de seis sessões de laparoscopia para
aspiração folicular (LAF). Jaboticabal/SP – 2006.
27
‘
Variáveis
Grupos
Laparoscopias
1 2 3 4 5 6
1
11,200,73
a
n=10
9,900,73
n=10
8,900,73
n=10
8,700,73
n=10
6,500,73
n=10
5,400,73
b
n=10
FVOE
2
6,900,73
n=10
7,600,73
n=10
6,800,73
n=10
5,650,78
n=9
6,210,78
n=9
6,210,78
n=9
3
10,200,73
n=10
9,500,73
n=10
7,700,73
n=10
7,800,73
n=10
5,400,73
n=10
6,400,73
n=10
4
6,900,73
n=10
6,800,73
n=10
5,100,73
n=10
5,480,78
n=9
6,630,84
n=8
5,250,84
n=8
1
10,800,74
a
n=10
9,500,74
n=10
8,500,74
n=10
8,700,74
n=10
7,000,74
n=10
5,400,74
b
n=10
FVOD
2
8,500,74
n=10
6,800,74
n=10
5,900,74
n=10
5,620,79
n=9
6,060,79
n=9
6,170,79
n=9
3
9,400,74
n=10
8,300,74
n=10
6,400,74
n=10
6,100,74
n=10
6,000,74
n=10
5,900,74
n=10
4
6,800,74
n=10
5,500,74
n=10
3,800,74
n=10
6,660,79
n=9
5,310,85
n=8
6,810,85
n=8
1
8,200,60
a
n=10
7,300,60
n=10
7,400,60
n=10
5,800,60
n=10
4,800,60
n=10
3,600,60
b
n=10
FPOE
2
5,000,60
n=10
4,700,60
n=10
4,700,60
n=10
3,570,64
n=9
4,350,64
n=9
4,130,64
n=9
3
6,900,60
n=10
6,300,60
n=10
5,700,60
n=10
5,500,60
n=10
4,100,60
n=10
4,200,60
n=10
4
5,500,60
n=10
5,200,60
n=10
3,100,60
n=10
4,370,64
n=9
3,910,69
n=8
3,660,69
n=8
1
6,800,58
a
n=10
7,400,58
n=10
6,700,58
n=10
5,800,58
n=10
4,900,58
n=10
3,400,58
b
n=10
FPOD
2
6,600,58
n=10
4,600,58
n=10
4,300,58
n=10
4,240,62
n=9
4,570,62
n=9
4,460,62
n=9
3
6,800,58
n=10
5,300,58
n=10
4,400,58
n=10
4,300,58
n=10
4,400,58
n=10
4,100,58
n=10
4
5,000,58
n=10
3,400,58
n=10
2,900,58
n=10
4,580,62
n=9
4,150,67
n=8
5,030,67
n=8
1
7,800,83
a
n=10
6,400,83
n=10
6,900,83
n=10
5,500,83
n=10
6,000,83
n=10
3,600,83
b
n=10
Oócitos
encontrados
2
6,200,83
n=10
5,000,83
n=10
5,800,83
n=10
4,370,89
n=9
3,920,89
n=9
3,810,89
n=9
3
5,300,83
n=10
4,900,83
n=10
5,500,83
n=10
5,500,83
n=10
4,100,83
n=10
4,600,83
n=10
4
4,200,83
n=10
2,800,83
n=10
3,000,83
n=10
2,660,89
n=9
3,070,96
n=8
3,690,96
n=8
Tabela 6 – Média e erro-padrão de folículos visualizados e puncionados nos ovários esquerdo e
direito e de oócitos encontrados. Jaboticabal/SP – 2006.
Legenda:
a, b: valores significativamente diferentes pelo Teste de Tukey (P<0,05).
Grupos: 1 = adultas com estimulação hormonal; 2 = adultas sem estimulação hormonal:
3 = pré-púberes com estimulação hormonal; 4 = pré-púberes sem estimulação hormonal.
FVOE: folículos visualizados no ovário esquerdo
FVOD: folículos visualizados no ovário direito
FPOE: folículos puncionados no ovário esquerdo
FPOD: folículos puncionados no ovário direito
28
LAF
Grupo
n
Oócitos
(n)
Viáveis
(%)
Taxa de maturação
(%)
1 10 78 94,87 63,51
1ª 2 10 62 70,97 68,18
3 10 53 86,79 60,86
4 10 42 59,52 64,00
1 10 64 90,62 63,79
2ª
2 10 50 62,00 74,19
3 10 49 71,42 60,00
4 10 28 75,00 52,38
1 10 69 89,85 69,35
3ª
2 10 58 81,03 78,72
3 10 55 72,72 75,00
4 10 30 66,66 70,00
1 10 55 72,72 62,50
4ª
2 9 43 81,39 74,28
3 10 55 89,09 65,30
4 9 26 69,23 77,77
1 10 60 75,00 77,77
5ª
2 9 39 79,48 64,51
3 10 41 78,04 87,50
4 8 27 88,88 62,50
1 10 36 72,22 73,07
6ª
2 9 38 57,89 86,36
3 10 46 82,60 71,05
4 8 32 71,87 52,17
Na Tabela 7 mostra o número total de oócitos colhidos por semana e a taxa
de maturação em cada grupo, bem como o percentual de oócitos viáveis (Graus I,
II e III) .
Devido a não ocorrência de interação entre os grupos, as médias relativas ao
número de oócitos encontrados, viáveis e maturados foram agrupadas dentro dos
grupos e das semanas (Tabela 8). A qualidade dos oócitos apresentou redução
Tabela 7 – Número de oócitos encontrados, percentual de oócitos viáveis e taxa de
maturação de fêmeas caprinas adultas e pré-púberes, com ou sem estímulo
hormonal. Jaboticabal/SP – 2006.
Legenda:
Grupos: 1 = adultas com estimulação hormonal; 2 = adultas sem estimulação hormonal;
3 = pré-púberes com estimulação hormonal; 4 = pré-púberes sem estimulação hormonal.
Viáveis = oócitos de Graus I, II e III
Taxa de maturação = n° de oócitos maturados / n° oócitos viáveis
29
significativa entre a primeira e a última semana. As fêmeas jovens não
estimuladas tiveram um rendimento significativamente menor comparado às
adultas estimuladas.
Variáveis
Grupos
Laparoscopias
1 2 3 4 5 6 Média
geral
1
7,800,83
n=10
6,400,83
n=10
6,900,83
n=10
5,500,83
n=10
6,000,83
n=10
3,600,83
n=10
6,030,54
a
Oócitos
encontrados
2
6,200,83
n=10
5,000,83
n=10
5,800,83
n=10
4,370,89
n=9
3,920,89
n=9
3,810,89
n=9
4,850,57
ab
3
5,300,83
n=10
4,900,83
n=10
5,500,83
n=10
5,500,83
n=10
4,100,83
n=10
4,600,83
n=10
4,980,54
ab
4
4,200,83
n=10
2,800,83
n=10
3,000,83
n=10
2,660,89
n=9
3,070,96
n=8
3,690,96
n=8
3,230,59
b
Média
geral
5,870,41
A
4,770,41
A
5,300,41
A
4,500,43
A
4,270,44
A
3,920,44
A
1
7,400,72
n=10
5,800,72
n=10
6,200,72
n=10
4,000,72
n=10
4,500,72
n=10
2,600,72
n=10
5,080,44
a
Oócitos
viáveis
2
4,400,72
n=10
3,100,72
n=10
4,700,72
n=10
3,580,77
n=9
3,140,77
n=9
2,140,77
n=9
3,510,46
ab
3
4,600,72
n=10
3,500,72
n=10
4,000,72
n=10
4,900,72
n=10
3,200,72
n=10
3,800,72
n=10
4,000,44
a
4
2,500,72
n=10
2,100,72
n=10
2,000,72
n=10
1,900,77
n=9
2,870,83
n=8
2,750,83
n=8
2,350,48
b
Média
geral
4,720,36
A
3,620,36
AB
4,220,36
AB
3,590,37
AB
3,420,38
AB
2,820,38
B
1
4,700,54
n=10
3,700,54
n=10
4,300,54
n=10
2,500,54
n=10
3,500,54
n=10
1,900,54
n=10
3,430,34
a
Oócitos
maturados
2
3,000,54
n=10
2,300,54
n=10
3,700,54
n=10
2,620,58
n=9
1,960,58
n=9
1,850,58
n=9
2,570,36
a
3
2,800,54
n=10
2,100,54
n=10
3,000,54
n=10
3,200,54
n=10
2,800,54
n=10
2,700,54
n=10
2,760,34
a
4
1,600,54
n=10
1,100,54
n=10
1,400,54
n=10
1,550,58
n=9
1,850,62
n=8
1,470,62
n=8
1,490,37
b
Média
geral
3,020,27
A
2,300,27
A
3,100,27
A
2,470,28
A
2,520,28
A
1,980,28
A
Tabela 8 – Média e erro-padrão de oócitos encontrados, viáveis e maturados nos grupos
experimentais, bem como a média geral dentro os grupos e das semanas.
Jaboticabal/SP – 2006.
Legenda:
Grupos: 1 = adultas com estimulação hormonal; 2 = adultas sem estimulação hormonal;
3 = pré-púberes com estimulação hormonal; 4 = pré-púberes sem estimulação hormonal.
30
5.4. Acompanhamento do peso corporal
Apesar do intervalo de uma semana entre as intervenções e do período
destinado ao jejum sólido (36 horas), as fêmeas não apresentaram redução no
peso corporal ao longo das seis sessões (Figuras 15 e 16). Pelo contrário, houve
aumento destes valores em ambos os grupos ao final do experimento.
Figura 15 – Valores médios dos pesos corporais de fêmeas
caprinas adultas estimuladas (Grupo 1) e não
estimuladas (Grupo 2) hormonalmente ao longo de
seis sessões de laparoscopia para aspiração
folicular. Jaboticabal/SP
–
2006.
Figura 16 – Valores médios dos pesos corporais de fêmeas
caprinas pré-púberes estimuladas (Grupo 3) e não
estimuladas (Grupo 4) hormonalmente ao longo de
seis sessões de laparoscopia para aspiração
folicular. Jaboticabal/SP – 2006.
31
5.5. Efeito sobre a capacidade gestacional das fêmeas
A Tabela 9 reúne o percentual de cabras prenhes nos quatro grupos
experimentais.
Grupos n % prenhez
1 9 44,44 (4/9)
2 9 66,66 (6/9)
3 10 60,00 (6/10)
4 7 71,42 (5/7)
Total 35 60,00 (21/35)
Do total de fêmeas expostas à cobertura por monta natural nos quatro grupos
experimentais, 60% encontravam-se prenhes aos 45 dias após exame por ultra-
sonografia transretal. A diferença no número de animais expostos à cobertura foi
decorrente de óbito ou da impossibilidade de realização da cobertura.
6. DISCUSSÃO
As técnicas utilizadas para a obtenção de oócitos em fêmeas caprinas não
têm sido desenvolvidas na mesma proporção que a biotécnica de PIV. O
aperfeiçoamento destas técnicas é, portanto, de fundamental importância,
principalmente ao tratar-se de fêmeas geneticamente superiores, que podem ser
utilizadas como doadoras por período de tempo prolongado.
Foi verificado que com o avanço do experimento, o tempo gasto com cada
intervenção foi diminuído. Isto provavelmente deveu-se à prática e ao
Tabela 9 – Percentual de cabras prenhes aos 45 dias, após serem submetidas
a seis sessões de laparoscopia para aspiração folicular.
Jaboticabal/SP – 2006.
n = número de animais expostos à cobertura por monta natural.
32
entrosamento da equipe. Assim como no trabalho realizado por GINTHER & KOT
(1994) onde foram feitas ultra-sonografias diárias para avaliar a dinâmica folicular
em cabras, a habilidade do operador e, no nosso caso, também da equipe,
melhorou com a experiência.
As fêmeas apresentaram boa cicatrização nos locais de punção dos
trocartes, uma vez que as feridas cirúrgicas apresentavam-se, já no terceiro dia
pós-cirúrgico, sem sinais de inflamação nem de deiscência de sutura.
O estabelecimento do pneumoperitônio, na Medicina Humana, é considerado
a manobra mais crítica da videolaparoscopia e a técnica fechada mediante punção
com agulha de Veress é a mais freqüentemente utilizada (WILDT & LAWLER,
1985). Apesar de possuir uma ponta protegida, pois há o recolhimento do bisel ao
atingir o interior da cavidade, sempre existe o risco de lesão de órgãos ou de
insuflação equivocada (AZEVEDO
et al., 2004). Contudo, o posicionamento em
Trendelenburg (LEME et al., 2002) permitiu a introdução da agulha de Veress sem
causar qualquer lesão. É sabido que o peritônio, apesar de muito delgado,
também é bastante resistente e um dos meios de saber se a ponta da agulha
estava dentro da cavidade era ouvindo dois “cliques” ao final, ou seja, o cirurgião
deve sentir a resistência de duas camadas e então irá entrar na cavidade
abdominal (SAVARIS, 2005).
A técnica utilizada neste trabalho consistiu em se fazer duas punções com
auxílio de trocartes para a introdução do endoscópio e da pinça de manipulação. A
agulha de aspiração foi inserida na cavidade diretamente através da pele, sem a
necessidade de um terceiro trocarte. ALVAREZ
et al. (1999) avaliaram o uso de
duas (apenas um operador usando laparoscópio com visão direta e canal para a
agulha mais a pinça de manipulação), três (operador com a pinça e a agulha,
assistente com o laparoscópio mais a câmera) e quatro punções (operador com a
pinça e a agulha, assistente com outra pinça mais o laparoscópio com a câmera).
A máxima eficiência (nº oócitos colhidos x nº folículos observados) foi conseguida
com a técnica de três punções. Os autores sugerem ainda considerar o uso de
duas punções por ser menos onerosa (não necessita da câmera nem do monitor)
33
e por causar menos injúrias. Neste trabalho uniu-se as vantagens das duas
técnicas citadas acima: menor tempo de execução e melhor resultado daquela de
três punções, com a segurança da de duas, uma vez que dispensa a colocação do
terceiro trocarte.
O risco da laparoscopia está, como em muitas outras técnicas cirúrgicas, na
anestesia, a qual é imprescindível para a realização da intervenção e deve ser a
mais prática e eficiente possível. Os princípios gerais para sua escolha na cirurgia
tradicional são aplicáveis à laparoscopia (MARCELINO & PENICHE, 2002). O
protocolo anestésico usado neste trabalho foi resultado de uma série de tentativas
a fim de se conseguir algo que fosse seguro, não causasse dor visceral e não
fosse danosa à saúde dos animais. O uso do oxigênio contribuiu para melhorar o
trabalho respiratório dos animais. O aumento das FC e FR foram atribuídos ao
posicionamento (
Trendelenburg) e à distensão abdominal causada pelo gás
(pneumoperitônio) os quais causam entre outros efeitos, grande compressão
diafragmática. Esta foi compensada pela diminuição da amplitude respiratória.
Estes achados, associado ao bom grau de analgesia sugerem que o protocolo
anestésico aplicado neste trabalho é adequado e eficiente para este tipo de
procedimento cirúrgico em caprinos.
O período de 36 horas destinado ao jejum foi estabelecido pela observação
dos animais sob efeito anestésico, uma vez que um tempo menor de restrição
alimentar, principalmente de alimentos sólidos, predispunha o animal com mais
34
ovários. Segundo PUGH (2005), o cloridrato de xilazina pode causar o aumento da
produção de urina em caprinos, sendo comum notar-se o aumento de até seis
vezes no volume de urina excretado.
Foi observado que quanto maior a PIA, maior o efeito sobre a freqüência
respiratória dos animais experimentais, em virtude do desconforto gerado tanto
pela posição na maca, quanto pela instalação do pneumoperitônio. No entanto,
quando o valor deste se encontrava menor que o estabelecido à princípio,
prejudicava bastante a visualização das estruturas na cavidade pélvica. Um
pneumoperitônio acima do indicado pode levar a complicações cardíacas e
respiratórias, principalmente se o paciente exprimir algum tipo de injúria
diafragmática (WIEDEMAN
et al., 1998). A velocidade de insuflação utilizada foi
baixa porque, à medida que o pneumoperitônio ia sendo estabelecido, o
anestesista verificava as freqüências cardíaca e respiratória. Em alguns momentos
foi necessário diminuir a PIA pois algumas fêmeas apresentaram redução na
freqüência respiratória. No entanto, apesar de baixa, a PIA empregada foi
suficiente para a realização das manobras cirúrgicas.
A ausência de alterações dos parâmetros AST, FA e GGT, usados para
avaliar a função hepática, deve-se ao fato de que o fígado, diferentemente dos
rins, ser órgão com reconhecida habilidade compensatória e regenerativa, e esta
pode retardar o aparecimento de alterações clinicas e laboratoriais até que 80 a
90% do parênquima hepático esteja comprometido (COLES, 1984).
A função renal dos animais experimentais também não foi afetada pelo uso
repetido da TIVA, nem pelo período de jejum a que foram submetidos. Os valores
de uréia não apresentaram diferença (P>0,05) quando comparados ao controle
(T
0
) estando dentro do limite normal para a espécie caprina que é de 21 a 60
mg/dL
.
(PUGH, 2005). Já a creatinina apresentou diferença (P<0,05) na última
semana quando comparada com o valor basal. Esta é produzida no organismo a
partir da metabolização da creatina em um processo não enzimático e irreversível
que ocorre na musculatura esquelética, sendo excretada pela filtração glomerular,
e qualquer anormalidade que diminua a velocidade do fluxo urinário resultará na
35
elevação da concentração sérica deste metabólito (COLES, 1984), ou seja, a
elevação no nível de creatinina no sangue indica distúrbio renal. Neste caso,
pode-se inferir que não houve dano renal uma vez que os valores de cretinina não
aumentaram ao longo do experimento, pelo contrário, ocorreu uma redução
significativa destes. Apesar deste resultado, os valores médios desta variável
também encontravam-se dentro dos parâmetros normais (0,9 a 1,8 mg/dL) para a
espécie (PUGH, 2005).
As taxas de colheitas apresentadas neste trabalho, considerando o período
de apenas uma semana entre as laparoscopias, podem ser consideradas
aceitáveis. Certamente um intervalo mais longo poderia proporcionar melhores
resultados. Em programas de produção onde um grande número de animais está
disponível, pode-se aplicar um tempo maior entre as LAFS, porém, em situações
onde as fontes doadoras são limitadas, um período mais curto entre as colheitas
pode ser vantajoso (PIERSON
et al., 2004).
Particularmente, o grupo de fêmeas adultas estimuladas apresentou
diminuição significativa, entre a primeira e a última laparoscopia, no número de
folículos visualizados e puncionados em ambos os ovários, bem como no número
de oócitos colhidos após repetidas LAFs. Contudo, embora os demais resultados
não tenham sido significativos, houve redução destes valores ao longo das seis
semanas de laparoscopias (Tabela 6), independente do grupo experimental, o que
coincide com os resultados obtidos por outros autores (ANEL
et al, 1998 e PTAK
et al., 1998, citados por MORTON et al.,2005b). KÜHHOLZER et al. (1997)
observaram que o número de oócitos e folículos manteve-se constante depois de
repetidas LAFs, com intervalo de uma semana, em ovelhas sem tratamento
hormonal. Neste trabalho, as taxas de colheita foram superiores aos resultados do
nosso estudo, mesmo em relação às fêmeas estimuladas. Porém, essa diferença
de resultados provavelmente deve ser relativa ao uso de técnicas e equipamentos
distintos, não sendo possível, portanto, se fazer uma comparação fiel entre as
taxas obtidas em ambos os experimentos.
36
Uma das hipóteses que explicariam a redução dos índices avaliados ao longo
das sucessivas LAFs seria o uso freqüente de hormônio exógeno, o qual poderia
estar induzindo a formação de anticorpos anti-FSH (BODIN,
et al., 1997; DE
RUIGH
et al., 2000). Em caprinos tratados com FSH de origem porcina, existe a
possibilidade de indução da formação de anticorpos para esse hormônio,
diminuindo assim a resposta ovariana após a terceira aplicação (REMY
et al.,
1991), o que causaria, desta forma, a refratariedade das fêmeas ao tratamento.
Outra hipótese seria o fato de cerca de 10% das fêmeas caprinas não serem
responsivas ao tratamento de superovulação (BREBION
et al., 1992). Embora
técnicas alternativas existam, tais como a “ovum pick-up” combinada com a
produção
in vitro de embriões, a superovulação ainda é um procedimento eficiente
e barato na maximização do número de descendentes oriundos de fêmeas
geneticamente superiores (DRIANCOURT, 2001).
Quando gonadotrofinas exógenas são administradas, o recrutamento de
folículos pode ser aumentado ou prolongado, além da seleção ser bloqueada. O
número médio de folículos geralmente aumenta proporcionalmente à quantidade
de gonadotrofina injetada, até alcançar um máximo, o qual está intimamente
relacionado ao número de folículos gonadotrofina-responsivos presentes nos
ovários das fêmeas tratadas (MONNIAUX
et al., 1983). Como a resposta ovariana
às gonadotrofinas é dose-dependente e altamente variável, é difícil predizer se um
tratamento é superior a outro (DRIANCOURT, 2001).
Em um experimento com ovelhas adultas, foi avaliado o efeito de repetidas
aspirações foliculares com e sem o uso de FSH (neste caso, foram realizadas três
LAFs, com intervalo de duas semanas entre as intervenções) sobre a resposta
ovariana, número e qualidade dos oócitos, bem como sobre o desenvolvimento
in
vitro
(MORTON et al., 2005b). Assim como no presente trabalho, foi verificado um
número maior de folículos e de oócitos recuperados nas fêmeas tratadas, no
entanto, as taxas de colheita foram similares (P>0,05) entre as fêmeas pré-
púberes e adultas de ambos os tratamentos. Resultados similares foram
observados em outros estudos (STANGL
et al., 1999; MORTON et al., 2005). A
37
colheita de oócitos
in vivo e a produção de embriões in vitro poderá aumentar o
número de embriões produzidos em um tempo disponível se puderem ser
realizadas freqüentemente e de forma bem-sucedida (BROADBENT
et al., 1997).
O número de folículos visualizados denota a atividade ovariana (MORTON
et
al
., 2005). Como pode ser visto na Figura 14, houve redução da resposta folicular
em todos os grupos avaliados. Pode-se inferir a este achado a possibilidade das
lesões causadas ao ovário, decorrentes das sucessivas aspirações, terem
provocado uma inflamação local que, por sua vez, tenha comprometido o
processo de recrutamento folicular. Outros fatores como o estresse causado pelo
jejum ou pela manipulação e contenção dos animais no momento da aplicação
dos hormônios e da anestesia, além da própria técnica operatória e seus
elementos, também podem estar envolvidos. É pertinente considerar que estes
fatores, separados ou agregados, agindo de forma direta ou indireta, podem ter
colaborado para estes resultados.
Dois aspectos importantes a serem considerados na variabilidade da taxa de
ovulação, induzida por gonadotrofinas, são a diversidade entre fêmeas de uma
mesma espécie ou raça e em cada fêmea individualmente. Enquanto o primeiro
pode ser detectado assim que a estimulação hormonal é feita, o segundo requer
sucessivas tentativas em superestimular o mesmo animal, na maioria dos casos,
de elite (DRIANCOURT, 2001). No presente trabalho, as fêmeas adultas tiveram o
estro sincronizado então, acredita-se que a maioria delas deveria possuir um
padrão folicular semelhante ao início das LAFs. Com relação às pré-púberes, a
informação é menos precisa. Sabe-se que a estimulação ovariana por
gonadotrofinas exógenas pode afetar profundamente o ambiente fisiológico interno
do folículo (O’CALLAGHAN
et al., 2000). Oócitos de animais superovulados
freqüentemente exibem reduzida capacidade de desenvolvimento comparados
aos daqueles não estimulados. O uso de hormônios aumenta a taxa de
crescimento folicular a qual resulta em uma assincronia na maturação entre o
folículo e o oócito (FOOTE & ELLINGTON, 1988; COMBELLES & ALBERTINI,
2003).
38
Em estudos realizados com cabritas verificou-se que o número total de
folículos aumenta aos dois e diminui aos cinco meses de idade (RAWLINGS
et al.,
2003). Em fêmeas ovinas pré-púberes foi encontrado que a PIV aumentada com a
estimulação hormonal e com a idade, contudo, observou-se que uma resposta alta
à estimulação não afeta a produção de embriões em fêmeas de três a quatro
meses e de seis a sete meses de idade (MORTON
et al., 2005a).
As laparoscopias concentraram-se entre os anos de 2004 e 2005 e foram
realizadas durante todo o ano. Nesta pesquisa, provavelmente não houve
influência das estações do ano sobre a resposta ovariana, visto que não foram
observadas discrepâncias entre as colheitas ao longo do ano. Estes dados estão
de acordo com outros autores onde não foram observadas diferenças no número
de folículos entre estes períodos, em estudos conduzidos em ambientes de
médias latitudes (40-45ºN) tanto em caprinos (PINTADO
et al., 1998) quanto em
ovinos (GONZALES-BULNES
et al., 2003; PIERSON et al., 2004). No presente
estudo, a localização geográfica, 21º15'17"S, propiciou uma influência ainda
menor do fotoperíodo.
A taxa de aproveitamento (n° de folículos puncionados / n° folículos
visualizados) foi satisfatória pois, embora a visualização de mais folículos tenha
sido feita no momento da colheita, não foi possível realizar a aspiração de todos
em decorrência do sangramento de alguns folículos, principalmente os maiores,
sobre os menores, impedindo a sua localização posterior. Além disto, dependendo
da posição em que o folículo se encontrava, o acesso a este ficava bastante difícil,
já que a pinça atraumática usada para segurar ovário encobria parte deste. Ainda,
a luz do endoscópio, por vezes, refletia na superfície ovariana camuflando a
presença de alguns folículos, especialmente os menores.
Há suspeita de que, caso a agulha utilizada fosse mais fina, as taxas de
aproveitamento e de colheita poderiam ter sido melhores, principalmente devido à
punção de folículos menores (3-5 mm). Estudos com aspiração de oócitos
humanos mostraram que o uso de agulhas mais finas gerou um marcado aumento
na taxa de colheita (RENOU
et al., 1981). Este aumento foi atribuído ao aumento
39
na velocidade do fluxo do líquido, um menor “espaço morto” no interior da linha de
aspiração e menor turbulência nos encaixes dos instrumentos. No entanto, estas
tendem a obstruir mais facilmente com coágulos de sangue e para a desobstrução
destas faz-se necessário aumentar o vácuo, o que traria, portanto, prejuízo à
qualidade dos oócitos colhidos.
Foi observado que a agulha utilizada no presente trabalho possuía calibre
adequado para a aspiração de folículos maiores. No entanto, quando se tratava de
folículos menores (abaixo de 5 mm) a aspiração tornava-se um pouco prejudicada.
FRY
et al. (1997) observaram que agulhas maiores que 17G não são práticas para
o uso em pequenos folículos, os quais correspondem a mais de 90% dos folículos
aspirados na superfície dos ovários.
O uso da bainha plástica nos permitiu trabalhar com mais segurança
permitindo a proteção da ponta da agulha de aspiração ao atingir o interior da
cavidade abdominal, expondo-a somente ao aproximar-se do folículo a ser
puncionado.
Neste estudo, o sistema de aspiração foi composto de uma agulha curta com
bisel também curto e uma linha de menor comprimento. Verificou-se que, apesar
dos esforços para diminuir as perdas durante a aspiração, como o desnudamento
e o rompimento de oócitos, através da redução da pressão do vácuo e o
encurtamento da linha de aspiração, a maioria dos oócitos viáveis foi classificada
como de grau III e, os de grau IV, foram em grande parte de oócitos desnudos.
A qualidade dos oócitos (percentual de oócitos viáveis) apresentou
diminuição significativa da média geral entre os grupos na última semana
comparada a primeira, estando de acordo com os achados de outros autores
(KÜHHOLZER
et al., 1997; PTAK et al., 1998 citado por MORTON et al., 2005).
Sabe-se que a maioria dos oócitos perde parte das células do
cumulus no trânsito
do folículo até o tubo de colheita. Estas podem ser preservadas por meio do
refinamento do vácuo trabalhando com folículos em estádio mais precoce que por
sua vez têm complexos
cumulus-oócito mais compactos (BALDASSARRE et al.,
1994). O oócito caprino pareceu demonstrar uma certa fragilidade à pressão do
40
vácuo. Um leve aumento na pressão no momento da desobstrução das agulhas
com coágulos de sangue, levava ao aparecimento de oócitos desnudos. O fato de
o vácuo não afetar apenas a taxa de colheita de oócitos, mas também à sua
qualidade, também foi demonstrado por FRY
et al. (1997). Esses autores
verificaram que, aumentando a pressão do vácuo, o número de oócitos colhidos
podia ser maior, no entanto, quando esta era superior a 50 mmHg, havia redução
no número de oócitos viáveis, provavelmente devido à remoção da cobertura de
células do
cumulus em torno do oócito.
Estudos de oócitos em cultivo indicaram que a cooperação das células da
granulosa associadas a estes é essencial para o seu crescimento (KESKINTEPE
et al., 1994). Estas células participam da nutrição, do metabolismo e da regulação
da maturação oocitária (EPPIG, 1992). O aumento no número total de oócitos com
o aumento da pressão do vácuo não compensa a diminuição na qualidade dos
oócitos pela perda de células do
cumulus. Apenas 44% dos oócitos desnudos
maturam
in vitro, comparados aos 71% dos oócitos com revestimento de cumulus
(LEIBFRIED & FIRST, 1979).
A taxa de maturação não apresentou alterações significativas nos grupos
estudados ao longo das semanas. No entanto, quando os dados foram agrupados,
houve uma diminuição na taxa de maturação das fêmeas pré-púberes não
estimuladas (G4). Além da redução no número de oócitos colhidos, houve queda
também na qualidade destes, o que reflete necessariamente no número de oócitos
maturados.
Visto que todos os oócitos viáveis colhidos foram submetidos à maturação
in
vitro
, não foi possível determinar se parte deles já havia maturado in vivo, devido
ao uso da eCG na estimulação ovariana. Para tanto, seria necessário fazer a
fixação imediata destes oócitos, o que prejudicaria a realização da MIV.
Aliado ao aumento no tamanho do folículo para permitir maior eficiência na
colheita, os protocolos de estimulação ovariana são projetados para elevar a
competência de desenvolvimento dos oócitos, através do realce da maturação
citoplasmática, bem como permitir o controle do sincronismo da maturação
41
meiótica (ARMSTRONG
et al., 1997). Estudos têm mostrado uma relação positiva
do diâmetro do folículo com o do oócito e a sua competência para se desenvolver.
Oócitos de folículos maiores (>5 mm) apresentam taxa de maturação maior que
aqueles de folículos menores (CROZET
et al., 1995). Em bovinos e ovinos, oócitos
de animais pré-púberes têm apresentado diâmetro menor que em fêmeas adultas
(GANDOLFI
et al., 1998; LEDDA et al., 1999). Em cabras, estudos têm mostrado
que o diâmetro médio dos oócitos aumenta com o tamanho do folículo (CROZET
et al., 2000) e também que tanto em fêmeas adultas (DE SMEDT et al., 1994)
quanto em pré-púberes (MARTINO et al., 1994a), oócitos menores (110
42
em ruminantes é complexa e as respostas são freqüentemente variáveis e
inconsistentes (O’CALLAGHAN
et al., 2000).
Os dados de diagnóstico de gestação corroboram outros estudos, os quais
mostraram não haver prejuízo na fertilidade (nº de fêmeas prenhes x nº de fêmeas
submetidas à cobertura) das doadoras após passarem por repetidas sessões de
LAF (STANGL
et al., 1999; BERLINGUER et al., 2004).
7. CONCLUSÕES
1. O protocolo anestésico utilizado foi seguro e eficiente, não tendo
causado comprometimento das funções hepática e renal.
2. Não houve diminuição do escore corporal das fêmeas,
observando-se, inclusive, ganho de peso corpóreo nos animais
não estimulados.
3. Verificou-se ao longo do experimento, em todos os animais,
redução do número de oócitos obtidos, particularmente nas
fêmeas estimuladas, ainda que não tenha ocorrido diferença
estatística.
4. Durante o experimento foi constatada diminuição do número de
oócitos de boa qualidade, contudo sem alterar as taxas de
maturação.
5. Averiguou-se que este procedimento cirúrgico causou aderências
de significado irrelevante.
6. A seqüência de laparoscopias para obtenção de oócitos nesta
experimentação não comprometeu o desenvolvimento da
gestação na maioria dos animais acasalados.
7. Nesta espécie, a laparoscopia para aspiração folicular, utilizada a
intervalos tão curtos quanto de uma semana, na mesma fêmea,
jovem ou adulta, é uma biotécnica segura e eficiente que otimiza
a reprodução animal.
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Altos, v.39, n.1, p.321, 1993, Abstract.
56
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p.60, Abstract.
WANG, B.; BALDASSARRE, H.; TAO, T.; GAUTHIER, , M.; NEVEU, N.; ZHOU,
J.F.; LEDUC, M.; DUGUAY, F.; BILODEAU, A.S.; LAZARIS, A.; KEEFER, C.;
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GOMELLA, L.G.; KOZMINSKI, M.; WINFIELD, H.N. Laparoscopic urologic
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threat in trauma laparoscopy? J. Trauma-injury Infec. Crit. Care, v.45, n.4, p.677-
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uterine horn oclusion. Am. J. Vet. Res., v.46, n.4, p.864-869, 1985.
57
ANEXO 1
Meios para colheita, lavagem e maturação dos oócitos.
Meio de Colheita
Solução PBS (Phosphate Buffered Saline) completo:
Água Milli-Q q.s.p. 1 L
NaCl 08 g
KCl 0,2 g
Na
2
HPO
4
-Anidro 1,15 g
KH
2
PO
4
0,2 g
CaCl
2
-2H
2
O 0,1 g
MgCl
2
-6H
2
O 0,1 g
DL-Glucose 1,0 g
Antibiótico (50
L/10mL) 5,0 mL
Acrescentar 0,25 mg de heparina sódica.
Meio de Lavagem
Solução Mãe TCM 199 Hepes:
Água Milli-Q 10 mL
TCM 199 0,095 g
Bicarbonato 0,0042 g
Hepes Sódico 0,026 g
Hepes Ácido 0,024 g
Meio de Lavagem
Solução Mãe TCM 199 Hepes 9 mL
Soro de cabra em estro (inativado a 56°C por 30 min) 1 mL
Piruvato 20
L
Antibiótico (50
L/10mL) 50 L
Meio de maturação
Solução Mãe TCM 199 Bicarbonato
Água Milli-Q 10 mL
TCM 199 0,095 g
Bicarbonato 0,022 g
Meio de maturação
Solução Mãe TCM 199 Bicarbonato 9 mL
Soro de cabra em estro (inativado a 56°C por 30 min) 1 mL
Piruvato 20
L
Antibiótico (50
L/10mL) 50 L
FSH 10
L
LH 100
L
Estradiol 10
L
58
ANEXO 2
Métodos de análise dos parâmetros bioquímico-séricos:
9 Aspartato aminotransferase método cinético UV;
9 Fosfatase alcalina PNP cinética método de Roy modificado, 1970;
9 Gama-glutamiltransferase método de Szasz modificado, 1969;
9 Uréia UV cinética método do Diacetil monoxiona;
9 Creatinina colorimétrica método de Lustosa–Basques.
Estes parâmetros foram analisados com o auxílio de um conjunto de reagentes
para diagnósticos (Labtest
17
) e posterior leitura espectrofotométrica (Labquest
18
).
17
Labtest – Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santana – MG.
18
CELM, modelo E-225-D.
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