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RENATA CASELLATO MAZON
“Papilomavírus Humano (HPV) e a carcinogênese de
mucosa oral: avaliação imunohistoquímica das
proteínas p27, mdm2 e catepsina B”
ARARAQUARA
2007
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1
RENATA CASELLATO MAZON
“PAPILOMAVÍRUS HUMANO E A CARCINOGÊNSE DE
MUCOSA ORAL: AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DAS
PROTEÍNAS p27, mdm2 E catepsina B”
Dissertação apresentada ao curso de
Pós - graduação em Análises Clínicas
da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas – UNESP –
Araraquara como pré-requisito para
obtenção do título de mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Christiane Pienna Soares
Araraquara
2007
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2
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Christiane Pienna Soares (orientadora e presidente)
Profa. Dra. Sophie Françoise Mauricette Derchain (membro titular)
Profa. Dra. Maria Regina Sposto (membro titular)
Prof. Dr. Rui Celso Martins Mamede (membro suplente)
Prof. Dr. Sandro Roberto Valentini (membro suplente)
Araraquara, 01 de Junho de 2007
3
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, Profa. Dra. Christiane Pienna Soares, pela confiança,
apoio, incentivo e por contribuir em minha formação científica e pessoal.
Aos meus colegas de laboratório, pelo apoio e auxílio na realização deste
trabalho.
Aos meus pais, Dulce e Antônio, que com muito amor, não mediram esforços
para que eu pudesse alcançar meus objetivos e que estão sempre presentes em
todos os momentos da minha vida.
Ao meu noivo Fábio, pelo seu carinho e incentivo que me foram dados para
seguir em frente e por completar a minha vida, me fazendo muito feliz.
4
SUMÁRIO
Abreviaturas.........................................................................................................................05
Lista de figuras.....................................................................................................................06
Lista de tabelas.....................................................................................................................07
Resumo................................................................................................................................08
Abstrac-5.32175(.A.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)-5.31915(05)500]TJ/R16 9.3624 Tf1 0 0 1 530.88 663 Tm( )Tj-425.04 -19.44 Td[( )-6.34447( )-6.34447( )-6.34447( )6.47276( )-6.34447( )250]TJ/R16 11.2.)-5.31915(.)5.31915(.)-5..31915(.)-5..31915(.)-5..31915(.)-5..31915(.)-5..31915(.)oR16 11.28 Tf1 0 .31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)]TJ143.76 0 Td[(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.65.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31175(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915.)-5.31915(.)]TJ143.76 0 Td[(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.32175(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31916(.)5.31915(.)-5.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)55.31915(.)5.31915(.)-5.31915(.)]TJ143.76 0 Td[(.)-5.31916(.)5.31915(.)-5.319 -19.56 0915(.)5.285.319500]TJ/R16 1.[( )-6.34357( )-6.3448.52cm BT/ . AA Resumo................................................................................. .................
5
ABREVIATURAS
HPV – Papiloma vírus humano
RB - Retinoblastona
OFR – Open reading frames
LCR – Long control region
MAPK – Mitogen activated protein kinase
VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular
CDK – Kinase dependente de ciclina
PCNA – Antígeno de proliferação celular
MDM2 – Murino duplo minuto
MMP – Metaloproteinase
HCl – Ácido clorídrico
PBS – Solução salina tamponada
PBS/BSA - Solução salina tamponada com solução de albumina bovina
PCR – Reação de polimerase em cadeia
IP – Índice de positividade
IM - Imagem
IO – Interobservador
RPA – Replication protein A
CBP – CREB binding protein
TAF – TBP, associated factors
TBP – TATA – box binding protein
XRCC1 – NER, nucleotide excision repair
KU70/80 – NHEJ, nonhomologous end-joinning
hMSH2 e hMSH1 - MMR mismatch repair
6
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Representação esquemática do genoma circular do HPV 16. Os genes precoces
(E), tardios (L) e a região regulatória (LCR) estão indicados...................................................14
FIGURA 2. Representação esquemática do complexo ciclina/CDK nas diferentes fases do
ciclo celular e checkpoints nas fases G1, G2 e M.....................................................................20
FIGURA 3. Representação esquemática da inativação do complexo ciclina/CDK pela p27..20
FIGURA 4. Representação esquemática da função da proteína mdm2 de ubiquitina ligase
encaminhando p53 para a degradação proteassômica no citoplasma.......................................22
FIGURA 5. Representação esquemática da função da catepsina B.........................................23
FIGURA 6. Reação de polimerização em cadeia (PCR) em gel de poliacrilamida 10%........37
FIGURA 7. Imunoperoxidase para p27 em lesões orais..........................................................41
FIGURA 8. Imunoperoxidase para mdm2 em lesões orais......................................................42
FIGURA 9. Imunoperoxidase para catepsina B em lesões orais.............................................43
7
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Tipificação do Papilomavírus humano (HPV) em 55 lesões de cavidade oral,
estratificadas de acordo com o diagnóstico histológico............................................................36
TABELA 2. Expressão quantitativa de p27, mdm2 e catepsina B
lesões orais infectadas por
HPV..........................................................................................................................................38
TABELA 3. Média e Erro Padrão (M ± EP) da a expressão imunohistoquímica quantitativa
de p27, mdm2 e catepsina B por análise de imagem (IM) e análise interobservador (IO)......39
TABELA 4. Índice de positividade (IP) de p27, mdm2 e catepsina B: imunopositividade
quantitativa em lesões orais, de acordo com o diagnóstico histológico....................................40
8
RESUMO
O mdm2 parece controlar o tráfego da proteína p53 do núcleo-citoplasma enquanto a
proteína p27 é um inibidor de CDK que controla a fase G1 para S do ciclo celular. Em
contraste, a catepsina B parece induzir um sinal de apoptose independente de caspase na
presença do HPV. Entretanto, a influência da infecção pelo HPV na carcinogênese oral e o
envolvimento na desregulação das proteínas do ciclo celular não são claras. Assim, o objetivo
deste estudo foi avaliar a associação entre a expressão de proteínas do ciclo celular, p27,
mdm2 e catepsina B e câncer oral na presença do HPV. Cinqüenta e cinco biópsias orais
representando lesões benignas (LB), lesões potencialmente malignas (LPM) e lesões malignas
(LM). A detecção e tipagem do HPV (6/11,16,18, 31 e 33) foi realizada pela reação da
polimerase em cadeia (PCR). A expressão quantitativa de p27, mdm2 e catepsina B foi
analisada pela reação imunohistoquímica. Vinte e uma (38%) de 55 lesões orais foram
positivas para HPV. O DNA do HPV 6/11 foi encontrado em 6 (33%), HPV 16 em 1(5%) e o
HPV 18 em 14 (72%). Não foi encontrado HPV 31 e 33. De 55 biópsias, foi encontrada alta
expressão de todas as proteínas: o p27 foi encontrado em 37 (67,2%) lesões, mdm2 em 17
(30,9%) e a catepsina B em 37 (67,2%). Entre lesões orais de HPV positivo, uma
superexpressão de p27, mdm2 e catepsina B foi encontrada, respectivamente, em 6 (33%) de
18 lesões benignas, 4 (22%) de 18 lesões potencialmente malignas e 11 (57,9%) de 19 lesões
malignas. Adicionalmente, o HPV16/18 (11/58%) foi detectado em lesões malignas com alta
expressão de todas as proteínas. Nós concluímos que os tipos de HPVs de alto risco devem
estar associados com carcinoma oral, bem como, com a superexpressão de p27, mdm2 e
catepsina B. Estes resultados sugerem que os tipos de HPVs de alto risco podem desregular o
controle do ciclo celular, contribuindo para a carcinogênese oral.
9
ABSTRACT
Mdm2 seems to control p53 nucleus-cytoplasm traffic while p27 is a CDK inhibitor
which control G1 to S phase of the cell-cycle. In contrast, cathepsin B is reported in HPV-
induced apoptotic signalling caspase-independent. However, the influence of HPV infection
in oral carcinogenesis and its involvement to this cell-cycle proteins dysfunction remain still
unclear. The purpose of this study was to clarify the association between the expression of
cell-cycle proteins, p27, mdm2 and cathepsin B and oral cancer HPV-related. Fifty-five oral
biopsies presenting benign oral lesions (BL), potentially malignant lesions (PML) and
malignant oral lesions (ML). HPV detection and typing (6/11, 16, 18, 31 and 33) was
performed using polymerase chain reaction. p27, mdm2 and cathepsin B quantitative
expression were performed by immunohistochemistry. Twenty one (38%) of the 55 oral
lesions were positive for HPV, of which HPV6/11 DNA was found in 6 (33%), HPV 16 in
1(5%) e o HPV 18 in 14 (72%). No HPV positivity was found to HPV31 and 33. Of the 55
biopsies, a high expression of all proteins was found: to p27 in 37 (67,2%), mdm2 was
observed in 17 (30,9%) slides, and cathepsin B in 37 (67,2%). Among HPV-positive oral
lesions, an overexpression for mdm2, p27 and cathepsin B was found, respectively, in 6
(33%) out of 18 BL, 4 (22%) out of 18 PML and 11 (57,9%) out of 19 ML. In addition,
HPV16/18 (11/58%) was detected in OSSC with high expression of all proteins. We conclude
that high-risk HPV types might be associated with oral carcinoma, as well as, with the
overexpression of mdm2, p27 and cathepsin B. These results suggest that high-risk HPV types
might deregulate cell-cycle control, contribuiting to oral carcinogenesis.
10
1. INTRODUÇÃO
11
1.1. CÂNCER ORAL
Anualmente, aproximadamente 620.000 pacientes são diagnosticados com câncer da
cavidade oral, naso-faringe, oro-faringe e laringe (SYRJÄNEN, 2005). O câncer oral é o sexto
tipo de câncer mais prevalente do mundo (ST JOHN et al., 2006), o terceiro em países em
desenvolvimento e o oitavo em países desenvolvidos. Mais de 80% dessas lesões são
carcinomas de células escamosas. De acordo com a estatística mundial, aproximadamente
267.000 novos casos foram diagnosticados e cerca de 128.000 pacientes morreram desse tipo
de câncer no ano de 2000 (FERLAY et al., 2001). As áreas de alto risco incluem França,
Hungria, Índia, Brasil, China e Filipinas (SYRJÄNEN, 2005); nos Estados Unidos, os
cânceres da cavidade oral e de orofaringe são o nono mais comum (JEMAL et al., 2005) e
cerca de 29.000 casos por ano são diagnosticados (WALKER et al., 2003).
O carcinoma oral é a neoplasia mais comum na mucosa oral, representando 90% dos
tumores malignos dessa região (SCULLY et al., 2000; BIRNER et al., 2001; KUFFER e
LOMBARDI, 2002; WALKER et al., 2003; GONÇALVES etal., 2007).
Esses tumores
contribuíram com em média 2,7% e 0,7% do total de mortes causadas por câncer entres
homens e mulheres, respectivamente, no período compreendido entre 1980-1995 (WÜNSCH-
FILHO, 2002). Recentes dados epidemiológicos do Ministério da Saúde do Brasil
demonstram que as taxas anuais de incidência do câncer de boca, ajustadas por idade, são
maiores entre a população masculina do estado de São Paulo (7,6/100.000 habitantes) e, na
população feminina (3,3/100.000 habitantes) em Natal. (GUERRA et al, 2005). Em
contrapartida, a mortalidade populacional associada ao câncer de boca no estado de São Paulo
permaneceu estacionada em níveis elevados entre os anos de 1980 a 1998.
Como o câncer oral é mais freqüente em pessoas idosas, essas taxas aumentam
dramaticamente quando ajustadas de acordo com a faixa etária. Para indivíduos entre 35-64
anos, a taxa de incidência aumenta de 3,0 para 7,0 em mulheres e de 9,5 para 34,0 nos
homens, por 100 mil habitantes. Na faixa etária igual ou superior a 65 anos essa incidência
aumenta ainda mais, atingindo 36,8 para as mulheres e 97,3 nos homens, por 100 mil
habitantes (ANTUNES et al., 2001). O diagnóstico do câncer oral é simples e deve ser
precoce, pois sua evolução natural é rápida e num estágio avançado não é possível o
tratamento, culminando com a morte do indivíduo (KOWALSKI e CARVALHO, 2001).
Adicionalmente, a média de vida de um paciente com câncer oral é de aproximadamente 5
anos em 40 a 50% dos casos e algumas vezes essa mortalidade tem sido atribuída ao acesso de
determinados pacientes a serviços especializados (BROUHA H., 2005).
12
Dentre os tumores de cabeça e pescoço, o carcinoma oral é o tumor maligno mais
freqüentemente encontrado na mucosa oral (KUFFER; LOMBARDI, 2002), podendo ou não
ser precedido por lesões potencialmente malignas, que podem apresentar-se clinicamente
como leucoplasias, eritroplasias, leucoeritroplasia (NEVILLE; DAY, 2002). O câncer oral
pode ser encontrado na língua, lábio e assoalho bucal, entre outros, correspondendo cerca de
95% dos tumores malignos da cavidade oral (GERVÁSIO et al., 2001; COLETTA et al.,
2002; SYRJÄNEN, 2005). Durante a última década, um maior interesse tem ocorrido em
relação às alterações celulares que precedem o carcinoma oral. Essas alterações podem se
desenvolver a partir de vários tipos de lesões, como por exemplo as leucoplasias (KUFFER;
LOMBARDI, 2002). A leucoplasia oral é conceituada como uma lesão predominantemente
branca que clinicamente não pode ser caracterizada como qualquer outro tipo de lesão
(AXÉLL et al., 1996; SYRJÄNEN, 2005), sendo considerada uma lesão potencialmente
maligna (VAN DER WAAL et al., 1997; ONOFRE et al., 2001; VAN DER WAAL; AXÉLL,
2002; GONÇALVES et al., 2007). As leucoplasias apresentam padrões e aspectos
semelhantes, porém, microscopicamente, são muito heterogêneas, variando da hiperqueratose
benigna ao carcinoma invasor de células escamosas. As características histológicas das
leucoplasias podem eventualmente estar associadas a um maior risco de transformação
maligna, podendo ser classificadas segundo o grau de displasia (REGEZI et al., 2000; VAN
DER WALL, 2000). Assim, o entendimento dos eventos molecular que modulam o ciclo
celular, tem trazido importantes informações para a compreensão da carcinogênese oral.
1.2. FATORES DE RISCO
Nas regiões geográficas de maior prevalência de câncer oral, o hábito de fumar e a
ingestão regular de álcool parecem estar diretamente relacionados ao desenvolvimento desse
tipo de carcinoma, totalizando 90% dos cânceres orais; o risco de câncer aumenta com o
consumo de álcool (IBRAHIM et al., 1999; REIBEL, 2003; COGLIANO, 2004). Assim, o
hábito de fumar e a ingestão regular de álcool são os principais fatores de risco para o câncer
oral e de orofaringe (WEINBERG e ESTEFAN, 2002).
Em relação ao fumo, um estudo no Rio de Janeiro revelou que 76,5% dos pacientes
com câncer oral eram fumantes, enquanto outro estudo realizado nas cidades de São Paulo,
Curitiba e Goiânia também apontaram uma forte associação entre o fumo e o aumento da
incidência de câncer oral. Esse e outros estudos também indicam o consumo de álcool,
13
especialmente destilados, como contundente fator de risco para o desenvolvimento de
neoplasias orais (FRANCO et al., 1989; LEITE; KOIFMAN, 1998; WUNSCH FILHO,
2002). Existe uma clara evidência de que pacientes com câncer oral apresentam maior dano
no DNA do que pessoas com hábitos similares de consumo de álcool e fumo, mas sem
neoplasia (ARTRUP, 2000; SCULLY; PORTER, 2000).
O desenvolvimento do carcinoma oral em diferentes sítios anatômicos está associado à
cofatores distintos. No carcinoma de lábio inferior, a participação da radiação solar como
fator de risco está bem estabelecida. Em contrapartida, a etiologia dos carcinomas intra-
bucais, principalmente de língua, é atribuída ao fumo e ao álcool (BUNDGAARD et al.,
1994; COLETTA et al., 2002), e além desses, vários estudos apontam a infecção do vírus
HPV no desenvolvimento desse tipo de câncer (NAGPAL; DAS, 2003; XAVIER et al., 2005;
TRAN, 2007; RAGIN et al., 2007)).
1.3. PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)
O HPV é um vírus de DNA, da família Papovaviridae, identificado primeiramente por
STRAUSS, em 1949, e, desde então, vem sendo isolado em inúmeras espécies animais. As
partículas virais completas não são envelopadas e o capsídeo protéico tem padrão icosaédrico,
possuindo 55 nm de diâmetro. No interior do capsídeo, o DNA é circular e dupla fita,
medindo de 7500 a 8000 pares de bases (pb) (HOWLEY, 1994; MAJEWSKI, 1997; ZUR
HAUSEN, 2002).
O ciclo de vida dos papilomavírus humanos está ligado ao processo de diferenciação
celular do epitélio (STUBENRAUCH; LAIMINS, 1999; ZUR HAUSEN, 2000; HEBNER;
LAIMINS, 2006). Os genomas virais contêm duas regiões principais compostas por ORFs
(open reading frames) que codificam as proteínas virais (Figura 1). A região E (early) é
constituída por 8 genes (E1-E8, sendo que E3 e E8 não têm função conhecida) e codifica para
proteínas envolvidas na replicação viral, e, para os HPVs de alto risco, no processo de
imortalização. A região L (late) codifica para as proteínas estruturais necessárias para a
produção do capsídeo, onde L1 é altamente conservado entre os diferentes tipos de
papilomavírus, enquanto o gene L2 é menos conservado, apresentando mais seqüências
variáveis (MOTOYAMA, 2004; DOORBAR, 2005). Além dessas, ainda existe uma região
regulatória que contém a origem para a replicação viral e controla a transcrição de alguns
genes da região E (HEISE, 2003). Algumas das proteínas codificadas pela região early são
14
capazes de interagir com várias proteínas da célula hospedeira, interferindo com processos
como controle do ciclo celular, resposta apoptótica, sinalização celular e expressão gênica
(ZUR HAUSEN, 2000).
Figura 1 - Representação esquemática do genoma circular do HPV 16. Os genes precoces (E),
tardios (L) e a região regulatória (LCR) estão indicados. Fonte: Extraída de Villa, 1997.
Por exemplo, E1 possui atividade helicase e ATPase e interage com várias proteínas
da maquinaria de replicação, como DNA pol α e RPA (replication protein A), chaperonas
(HSP40 e 70), as quais devem auxiliar a união de E1 ao DNA, e histona H1, o que implica E1
em processos de remodelamento da cromatina (WILSON et al., 2002). O produto do
transcrito viral mais abundante, E1-E4, é capaz de unir-se a rede de citoqueratina,
desestabilizando-a, de impedir a progressão das células para a mitose, causando parada na
fase G2, e de se unir à mitocôndria e reduzir seu potencial de membrana induzindo apoptose
(DAVY et al., 2002; HEISE, 2003). A proteína E5 interfere com a regulação de receptores de
fatores de crescimento celular, atuando de modo importante sobre EGFR (McMURRAY et
al., 2001; TSAI e CHEN, 2003), influenciando a ativação da via de sinalização das MAP
quinases (MAPK, mitogen activated protein kinases), como ERK1/2 e p38MAPK, ativando
HPV 16
E4
E2
E1
E7
E6
p97
LCR
L1
L2
E5
15
oncogenes como c-jun, junB e c-fos (CRUSIUS et al., 2000; TSAI; CHEN, 2003), e inibindo
a apoptose mediada por TRAIL e FasL, além de reprimir a expressão de CDKN1/p21,
interferindo com o controle negativo do ciclo celular (TSAO et al., 1996; KABSCH;
ALONSO, 2002; KABSCH et al., 2004).
O HPV tem tropismo por células epiteliais de pele e mucosa, causando proliferação
benigna ou maligna, na dependência do tipo viral, decorrente do modo de interação,
epissomal ou integrada, entre o vírus e a célula. Portanto, esta interação determina o potencial
oncogênico de determinados tipos virais em sítios anatômicos prevalentes. Alguns tipos são
encontrados com maior freqüência em lesões malignas de pele (HPV 5 e 8) e os tipos 16, 18,
31, 33 e 45 nas mucosas. Outros tipos são encontrados mais comumente em lesões benignas,
como o HPV1 e 2 (pele) e 6, 11 e 42 (mucosas). A infecção de pele e mucosas pelo HPV
ocorre através de microlesões existentes na camada basal do tecido (ZUR HAUSEN, 1996;
2002) .
Os HPVs podem ser classificados de baixo risco ou alto risco baseado no potencial
para indução de transformação maligna. Os vírus de baixo risco (6 e 11), tipicamente causam
lesões benignas e são raramente associados com malignidade (ZUR HAUSEN, 2002). Em
contraste, infecções com vírus de alto risco (16, 18, 31 e 45), tem sido associado ao
desenvolvimento de carcinoma cervical bem como outros genitais malignos (ZUR HAUSEN,
2002; MONSONEGO et al., 2004) e cânceres de cabeça e pescoço (CHEN et al., 2005).
1.4. HPV E CÂNCER ORAL
Dessa forma, o papilomavírus humano (HPV) vem sendo considerado como um dos
agentes etiológicos relevantes e associados ao descontrole de ciclo celular no
desenvolvimento das lesões bucais. A possível relação do HPV como agente etiológico do
câncer oral foi primeiramente relatado por (SYRJANEN et al, 1993). Muitos trabalhos desde
então se seguiram e essa associação vem se tornando cada vez mais consistente
(MCGLENNEN, 2000; SAND et al., 2000; SCULLY et al., 2000). Uma metanálise realizada
entre 1982 à 1997 mostrou que a probabilidade de detecção do HPV em mucosa oral normal
foi menos significativa do que em leucoplasias (10%), neoplasia intraepitelial (22,2%),
carcinoma verrucoso (26,2%) e carcinoma oral de células escamosas (46,5%), ou seja, a
16
probabilidade de detecção do HPV em carcinoma oral foi aproximadamente 4.7 vezes maior
que em mucosa oral normal (MILLER et al., 2001).
Estudos realizados no Brasil demonstram a presença de HPV em lesões benignas e
malignas de mucosa oral com positividade variando de 15 a 60%, sendo que a infecção com
HPV oncogênicos, tais como 16 e 18, tem sido descrita em cerca de 20 a 30 % das lesões
orais potencialmente malignas e neoplásicas (MIGUEL et al., 1998; SOARES et al., 2002
a
;
SOARES et al., 2002
b
, SOARES et al., 2002
c
; GIOVANNELLI et al., 2002; OSTWALD et
al., 2003; SUGIYAMA et al., 2003). Lesões malignas ou potencialmente malignas
apresentam maior risco de associação com o vírus, o que sugere que o HPV pode estar
envolvido no estágio inicial da doença (GIOVANNELLI et al., 2002; RITCHIE et al., 2003;
SUGIYAMA et al., 2003).
As proteínas E6 e E7 são capazes de imortalizar células humanas, em grande parte
graças à sua capacidade de inativar funcionalmente células supressoras de tumor p53 pela
degradação mediada por ubiquitina e proteína reguladora do ciclo celular pRb,
respectivamente (ZUR HAUSEN, 2002; HOFFMANN et al., 2004), embora existam
evidências de que a atuação de ambas não seja suficiente para os processos de imortalização
ou malignização (ZUR HAUSEN, 2000). Estudos com HPVs de alto risco permitiram definir
a importância do modo de replicação (integrado ou epissomal) e a função dos genes precoces
E6 e E7 nos eventos de proliferação celular (ZUR HAUSEN, 2000). Os produtos dos genes de
E6 e E7 dos HPVs de alto risco codificam proteínas multifuncionais que interferem com o
crescimento celular, estando diretamente envolvidos nos eventos de transformação celular
(ZUR HAUSEN, 2002).
A proteína E6 interage com diversos alvos celulares, interferindo com os processos de
proliferação celular, apoptose e transcrição gênica, entre outros. Existem evidências de que E6
ativa a telomerase, a enzima responsável por manter a estrutura telomérica na extremidade
dos cromossomos, possivelmente através da ativação do promotor de hTERT por E6 e c-Myc
(CHAKRABARTI; KRISHNA, 2003; MCMURRAY; MCCANCE, 2003; VELDMAN et al.,
2003). E6 é capaz de associar-se e estimular a degradação com o produto do gene supressor
tumoral TP53, uma proteína que exerce papéis fundamentais para a manutenção da
estabilidade celular, como controle do ciclo celular e apoptose (LEVINE, 1997; OLIVIER., et
al., 2002), mediada por ubiquitinização (CHAKRABARTI; KRISHNA, 2003; TOMMASINO
et al., 2003). O gene TP53 contém um polimorfismo nucleotídeo que se liga à Arginina (Arg)
ou Prolina (Pro) no códon 72 da proteína p53. Esse polimorfismo parece conferir uma
17
proteção no desenvolvimento de carcinoma oral de células escamosas (CORTEZZI et al.,
2004).
A ligação da proteína de E6 de HPVs de alto risco resulta na degradação da p53, uma
proteína supressora de tumor que determina a parada do ciclo celular para o reparo de danos
no DNA genômico (HEBNER; LAIMINS et al., 2006). Dessa forma, o complexo gerado por
E6/p53 remove o controle p53-dependente do ciclo celular, provocando o aumento de divisão
celular, com instabilidade cromossômica e acúmulo de várias mutações na célula infectada
(ZUR HAUSEN, 1996). Por outro lado, a ligação da proteína de E6 de HPVs de baixo risco à
p53 não resulta em sua degradação e portanto não colabora para os eventos de carcinogênese
(LI; COFFINO, 1996; MANTOVANI; BANKS, 2001; SCHEFFNER; WHITAKER, 2003.).
E6 ainda é capaz de alterar a transcrição de genes, tanto positiva quanto negativamente.
Existem evidências de que E6 inativa CBP (CREB binding protein), um regulador
transcricional que controla várias respostas celulares, entre elas a ativação do TP53
(ZIMMERMANN et al., 1999; ZIMMERMANN et al., 2000); por outro lado, E6 pode
aumentar a expressão de VEGF (vascular endothelial growth factor), contribuindo assim para
a angiogênese (LOPEZ OCEJO et al., 2000) em células cancerígenas orais (CHEN et al.,
2002). E6 ainda interage com inúmeras outras proteínas celulares, envolvidas com processos
de adesão celular (paxilina), contacto celular (PDZ) e sinalização (JAK-STAT), entre outros
processos (CHAKRABARTI; KRISHNA, 2003).
A proteína viral E7 tem habilidade de unir-se e inativar os membros da família pRb
(pRb, p107 e p130), os quais controlam a progressão do ciclo celular da fase G1 para S
através da sua união, na forma hipofosforilada, com membros da família E2F de fatores de
transcrição. A degradação da proteína Rb libera E2F para ativar vários genes envolvidos com
a síntese de DNA e progressão pelo ciclo celular, sendo que a inibição de pRb por E7 pode
induzir uma entrada prematura na fase S do ciclo celular (CHAKRABARTI; KRISHNA,
2003). E7 também se associa com proteínas de complexos de desacetilação de histonas, como
Mi2β e HDAC-1, o que pode levar ao aumento de expressão de proteínas oncogênicas, como
cdc25A (uma fosfatase envolvida na ativação de complexos CDK/ciclina) (AVVAKUMOV
et al., 2003; BERNAT et al., 2003; HUANG et al., 2002; BREHM et al., 1999; NGUYEN et
al., 2002). E7 interage ainda com inúmeros outros alvos dentro da célula hospedeira, como,
por exemplo, com fatores de transcrição, entre os quais AP1 (c-jun, JunB, JunD e c-Fos), os
quais são essenciais em mediar EFEITOS MITOGÊNICOS E DE DIFERENCIAÇÃO
(ANTINORE et al., 1996; CHAKRABARTI; KRISHNA, 2003); com proteínas da maquinaria
basal de transcrição, como TAF (TBP-associated factors) e TBP (TATA-box binding protein),
18
neste caso inibindo sua ligação ao DNA (ENZENAUER et al., 1998; MALDONADO et al.,
2002).
Como exposto acima, as proteínas codificadas pelo vírus HPV oncogênicos induzem a
transformação celular através da interação com inúmeras moléculas dentro da célula
hospedeira, inclusive alterando a expressão de genes. Possivelmente, os tumores infectados
com HPV apresentam um background molecular diferente do não infectados, o que pode ser
ilustrado pelo fato de que o prognóstico de pacientes com tumores infectados com HPV pode
ser diferente dos não-infectados (RITCHIE et al., 2003) e estão relacionadas com
características avançadas da doença (SMITH et al., 2004). Já foi demonstrado, por exemplo,
que tumores HPV positivos apresentam expressão aumentada dos genes p16/INK4a e PCNA
(GONZALEZ MOLES et al., 1996; FREGONESI et al., 2003; SMITH et al 2007), enquanto
mutação do gene TP53 é mais freqüente em neoplasias não infectadas pelo vírus
(PENHALLOW et al., 1998).
Além da ação das proteínas oncogênicas E6 e E7, as quais inativam proteínas
importantes para o controle do ciclo celular e apoptose, entre outros processos
(CHAKRABARTI; KRISHNA, 2003; DUENSING; MÜNGER, 2004; HENER; LAIMINS,
2006), a própria inserção do DNA viral na célula hospedeira pode lesar genes fundamentais
para a manutenção da estabilidade celular. Existem evidências de que a integração do HPV
ocorre em diferentes cromossomos humanos, mas em regiões que contêm genes com alto
nível de expressão, as quais, sendo mais descondensadas, seriam mais acessíveis para inserção
do DNA viral (CHOO et al., 1996; KLIMOV et al., 2002; THORLAND et al., 2003). Embora
a integração possa ocorrer em vários cromossomos, esse processo já foi relacionado com a
progressão do estado policlonal para monoclonal em câncer cervical (UEDA et al., 2003). Isto
sugere que, durante o processo de integração, genes importantes para a progressão neoplásica
podem ser lesados em alguma das células infectadas, conferindo-lhe vantagem de
crescimento.
A forma de associação entre o HPV à célula hospedeira determina o potencial
oncogênico viral, classificado em baixo risco freqüentes nas lesões benignas e de alto risco
nas lesões precursoras, no câncer de colo uterino e de mucosa oral (SAND et al., 2000;
HUDELIST et al., 2004). Quando integrado ao genoma da célula hospedeira, a replicação
viral ocorre nas células da camada basal, o vírus é distribuído de forma homogênea às células
filhas, aumentando do risco de malignização celular. Nas camadas mais diferenciadas do
epitélio ocorre a replicação epissomal, na qual o DNA viral não se integra, produzindo
múltiplas cópias de partículas virais completas. (VILLA, 1997; ZUR HAUSEN, 2000).
19
Geralmente, o aumento da proliferação está relacionado a lesões mais avançadas e a
distribuição das células em proliferação no tecido pode oferecer informações sobre o
descontrole do mecanismo regulatório que resulta no processo da carcinogênese (LIU e
KLEIN-SZANTO, 2000). Estudos moleculares demonstram que as lesões pré-malignas
podem apresentar alterações nos genes RB1, CDKN2A/p16 e TP53 relacionadas com o
potencial maligno destas lesões (PANDE et al., 1998; QIN et al., 1999; OGMUNDSDOTTIR
et al., 2002; KOVESI e SZENDE, 2003). Ainda, em neoplasias orais, já serão descritas
alterações em genes envolvidos no reparo do DNA, como XRCC1 (NER, nucleotide excision
repair), KU 70/80 (NHEJ, nonhomologous end-joinning) e hMSH2 e hMLH1 (MMR,
mismatch repair) (LO MUZIO et al., 2000; STURGIS et al., 2000; KORABIOWSKA et al.,
2002; HSIEH et al., 2003).
Os danos produzidos no material genético devem ser sinalizados e corrigidos, e por
isso são ativados mecanismos de controle da progressão pelo ciclo celular – os checkpoints –
quando as condições internas são desfavoráveis à divisão celular (Figura 2). Esses checkpoints
atuam sobre as ciclinas e as CDKs (cyclin-dependent kinases), as moléculas que coordenam a
sucessão de eventos que ocorrem em cada fase do ciclo celular, controlando a progressão pelo
ciclo celular (YOO et al., 2002). Além de controlar o bloqueio ou retardo no ciclo celular, os
checkpoints fazem parte de uma ampla rede de resposta ao dano, que pode incluir a ativação
de mecanismos de reparo, ativação transcricional e apoptose, esta última nos casos onde a
extensão do dano impossibilitar a sua correção (ZHOU; ELLEDGE, 2000).
20
Figura 2- Representação esquemática do complexo ciclina/CDK nas diferentes fases do ciclo
celular e checkpoints nas fases G1, G2 e M. Fonte: Extraído de Cooper, 2000.
As proteínas inibitórias de ciclinas dependentes de kinase (CKI) auxiliam a modulação
do ciclo celular permitindo a interrupção de determinada fase do ciclo e garantindo que
eventuais danos genéticos sejam corrigidos. Dentre as proteínas do grupo das CKI, a p27
(Figura 3) pertence à família CIP/KIP, cuja função é inibir principalmente CDK4 e CDK 2
(COQUERET, 2000). A proteína p27, cuja função é interagir com o complexo ciclina/CDK,
inibindo CDK4 e CDK2, interrompendo a progressão do ciclo celular exerce papel de
supressora de tumor (BLOOM e PAGANO, 2003; CHETTY 2002).
Figura 3 - Representação esquemática da inativação do complexo ciclina/CDK pela p27.
Fonte: Extraído de Alberts et al. 2002.
M
M
S
S
G1
G1
G2
G2
CdK4,6/
ciclina
D
CdK2/
ciclina
E
CdK2/ ciclina A
Cdc2/ciclina B
PARE
E
E
PARE
RE
PARE
RE
21
Nas neoplasias o complexo protéico ciclina/CDK e as proteínas inibidoras de CDK
(CKI) têm suas funções desreguladas ou perdidas, e por isso o controle do ciclo celular fica
prejudicado. A desregulação desses eventos celulares, tanto os responsáveis pela ativação dos
checkpoints quanto os envolvidos no mecanismo de apoptose, podem favorecer a perpetuação
de alterações que podem contribuir para a transformação maligna. Alterações em genes de
mecanismos de reparo do DNA também podem contribuir para o processo de malignização.
Altos níveis de p27 são encontrados em tecidos normais e lesões benignas e a alta expressão
relacionada à indução da apoptose (PATAH et al., 2004; COQUERET, 2003). Entretanto, sua
expressão está diminuída em alguns tumores, incluindo os de mucosa oral (HWANG et al.,
2003; KUROPKAT et al., 2002). Nos carcinomas cervicais a baixa expressão de p27 tem sido
relacionada com infecção por HPV (KIM et al., 2000), embora essa associação na mucosa
bucal seja pouco estudada.
Há dois tipos de atividade da proteína p53 dependendo de seu nível: quando o nível
está baixo, a p53 ativa a transcrição de genes de reparo do ciclo celular “checkpoints”
induzido por um dano no DNA; quando o nível de p53 está alto, esta proteína ativa
transcrição de genes para apoptose (MIHALAS et al., 2006).
Existe uma relação recíproca entre p53 e mdm2: p53 estimula transcrição de gene
mdm2 promovendo a síntese desta proteína; por outro lado, através do domínio RING na
porção C-terminal, a proteína mdm2 ubiquitinisa p53 e estimula sua degradação (MIHALAS
et al., 2006).
A proteína mdm2 (Figura 4) tem função de ubiquitina ligase encaminhando p53 para a
degradação proteassômica no citoplasma (LEVAV-COHEN et al., 2005; SOUZA et al., 2000;
FREEDMAN; LEVINE, 1998).
22
Figura 4 – Representação esquemática da função da proteína mdm2 de ubiquitina ligase
encaminhando p53 para a degradação proteassômica no citoplasma. Fonte: Modificado de
Alberts et al. 2002.
O mdm2 é um oncogene que se apresenta alta expressão uma variedade de tumores.
Recentes estudos têm demonstrado que mdm2 possui capacidade de se ligar diretamente a p53
e direcionar essa proteína para a degradação proteassômica, funcionando como uma
ubiquitina ligase (HONDA et al., 1997; NAKAMURA et al., 2002; CAMUS et al., 2003). A
ligação mdm2/p53 expõe um sinal de localização nuclear (NLS) existente na proteína mdm2,
permitindo o reconhecimento deste complexo protéico para exportação do núcleo para o
citoplasma. No citoplasma o complexo mdm2/p53 é encaminhado para um complexo
proteassômico, onde a proteína p53 é degradada e mdm2 fica livre para ser importada
novamente para o núcleo (FREEDMAN; LEVINE, 1998; LI et al., 2003). Assim, o controle
de função de p53 é dependente dos estoques de mdm2 e, portanto, a superexpressão desta
proteína poderá acarretar a perda de controle de ciclo celular na G1/S, contribuindo para a
transformação maligna celular (MENDHELSON et al., 2001).
A catepsina B é uma cisteíno-proteinase lisossomal, produto do gene 8p22a, com
atividade endopeptidásica, na sua forma pré-pró-enzima.(NÄGLER et al., 1997;
PODGORSKI; SLOANE, 2003; YAN; SLOANE, 2003). Tem função nos processos
CDK
PCNA
Inibição Ciclo
Inibição
Replicação
DNA
23
fisiopatológicos (Figura 5) de turnover da matriz extracelular e na tumorigênese, a catepsina
B ativa metaloproteinase (MMPs), e com isso, há um aumento da transdução de sinal e
liberação de fator de crescimento de vasos (VEGF) resultando em angiogênese. Além disso,
aumenta liberação de fatores de crescimento tumoral β e de moléculas de adesão, favorecendo
à metástase (MIGNATTI; RIFKIN, 1996; RAO, 2003).
Figura 5 – Representação esquemática da função da catepsina B. Fonte: Extraído de Rao,
2003.
A elevação de sua atividade é observada em alguns tumores, localizada na membrana
plasmática das células tumorais para garantir a degradação da matriz extracelular e lâmina
basal nos processos de invasão (TALIERI et al., 2004; MOIN et al., 1998; GUINEC et al.,
1992). Além disso, a catepsina B é freqüentemente superexpressa em vários tumores,
incluindo carcinoma oral de células escamosas comparado em tumores benignos ou tecidos
normais (VIGNESWARAN et al., 2000).
Investigações clínicas têm mostrado que a catepsina B é um indicador altamente
confiável para o diagnóstico e prognóstico, estando relacionado às lesões altamente invasivas
e com capacidade metastática no câncer oral. (VIGNESWARAN et al., 2000). Por outro lado,
o aumento da expressão de catepsina B em lesões pré-malignas sugere que essa enzima
participe no processo de transformação maligna das lesões precursoras em tumores
24
(SKRZYDLEWSKA et al., 2005). A catepsina B parece possuir atividade de protease
ativadora de morte celular dependente e independente de caspases, disparando sinal
alternativo de apoptose em células tumorais. (KAZNELSON et al., 2004; FU et al., 1998).
Assim, é possível que o HPV possa interferir na sua ativação, impedindo a apoptose e
garantindo a transformação maligna celular. Entretanto, apenas um único estudo encontrado
na literatura avalia o envolvimento do HPV na função da catepsina B (KAZNELSON et al.,
2004), e nem este ou os demais estudos com catepsina B foram realizados em lesões orais
associadas à infecção pelo HPV. De fato, o HPV parece atuar no descontrole destas proteínas,
embora, segundo nosso conhecimento, nenhum estudo tenha avaliado a expressão das
proteínas mdm2, p27 e catepsina B com a infecção por HPV em lesões orais.
25
2. OBJETIVOS
26
2.1. OBJETIVO GERAL
O presente estudo teve por objetivo avaliar a associação entre a presença do HPV, o
câncer oral e o descontrole eventual de proteínas relacionadas com o controle do ciclo celular.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a freqüência de HPV 6, 11, 16, 18, 31 e 33 entre lesões de cavidade oral
estratificadas segundo o diagnóstico histológico.
2. Verificar a expressão imunohistoquímica das proteínas p27, mdm2 e catepsina B em
lesões de cavidade oral, na presença ou ausência do HPV.
27
3. MATERIAIS E MÉTODOS
28
3.1. CASUÍSTICA
Cinqüenta e cinco biópsias de mucosa oral, fixadas em formalina tamponada e
incluídas em parafina, foram selecionadas dos arquivos do Departamento de Fisiologia e
Patologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara (UNESP) e dos arquivos do
departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP). O estudo
contou com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisas de Seres Humanos (Comitê de
Ética HCFMRP processo nº10108/2004). As biópsias foram selecionadas a partir do
diagnóstico histológico dos cortes corados pela hematoxilina/eosina e as lesões foram
classificadas de acordo com critérios histopatológicos propostos por VAN DER WAAL et al,
2000. A avaliação histológica das lesões foi realizada por dois patologistas experientes da
Faculdade de Odontologia de Araraquara (UNESP) e da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto (USP). As lesões foram estratificadas em grupos denominados de lesões benignas - LB,
lesões epiteliais potencialmente malignas - LEPM e lesões malignas - LM (carcinoma oral).
Cortes histológicos de 4µm foram colocados em lâminas previamente silanizadas com
organosilano 4 % em acetona (3-aminopropril trietoxisilano – SIGMA, St. Louis, USA) para a
realização das reações de imunoh1(upos)-4.6153( )-26.5957(de)-24uílmica. A-id(a)7.83068(,)-15.9459( )-69.1489((e)-2.80762( )58.5.106(c)-13.4459(a)-2.80762(d)10.6383(a)-2.80762( )-69.1489(g)10.6383(r)]TJ398.12 0 Td[(up( )-79.7872(f)-7.42551(or)3.21279(a)-2.80762(m)1.40511( )-69.1489(r)3.21279(e)-13.4459(a)-2.80762(l)1.40511(i)1.40511(z)7.83068(a)-2.80762(dos)-4.61789( )-69.1489(c)-2.81021(or)3.21019(t)-9.23579(e)7.8.805(s)6.0204( )250]TJ-398.12 -20.16 Td[(de)-13.4466( )-207.447154)500]TJ/R64 11.28 Tf276.24 0 Td(m)Tj/R16 11.28 Tf6364 0 Td[(m)1.40381(,)-5.31915( )-218.085(c)-2.80892(ol)1.40381((c)-2.80892(a)-2.80892(dos)-4.6166( )-207.447(e)7.82938(m)1.40381( )250]TJ/R476 11.28 Tf186.68 0 Td[(e)-2.80892(pde)-2.80762(d(or)-4.61789f)2780]TJ/RR16 11.28 Tf405.84 0 Td[( )-207.447(e)-2.80762(s)-4.61789(t)12.0434(é)-2.80762(r)3.21279(i)-9.23319(l)1.40511( )-207.447(e)-13.4459( )-207.447(s)6.0204ub(m)1.40511(e)-2.80762(t)1.40511(i)-9.23319(dos)6.0204( )-207.447(a)-2.80762dos)-4.61789( )-207.447(pr)3.21279(oc)7.83068(e)-13.4459(di)1.40511(m)12.0434(e)-13.4459(g)10.6383(t)1.40511(os)-4.61789( )-207.447(de)-2.80762( )-207.447(e)-13.4459xnt)1.40251ora( )-207.447(e)-2.81021( )250]TJ1365.6 -20.04 Td[aelificaçã( )-5.31915(por)3.21279( )-5.31915(P)2.80892(C)-3.21279R paa a deeo -5.31915(e)-2.80762( )55.31915didetificaão dos t
29
com leite desnatado 1% por 40 minutos. A diluição dos anticorpos foi estabelecida através de
avaliação da positividade em lâmina sabidamente positiva com diferentes concentrações para
determinação de melhor título dos anticorpos p27, mdm2 e catepsina B. Deste modo, as
lâminas foram, novamente, lavadas em PBS e adicionado sobre os cortes o anticorpo primário
monoclonal anti-mdm2 (DAKO, Glostrup, Dinamarca) e monoclonal anti-p27 (DAKO) e
policlonal anti-catepsina B (Calbiochem, Darmstadt, Germany). As lâminas foram incubadas
a temperatura ambiente, overnight em câmara úmida. Decorrido o período de incubação, as
lâminas foram submetidas à lavagem com PBS e incubadas com o anticorpo secundário,
biotonilado anti-cabra, coelho e camundongo produzido em porco (LSAB, DAKO) em
câmara úmida por 30 minutos à 37ºC. A seguir, as lâminas foram novamente lavadas 3 vezes
em PBS, por 5 minutos cada lavagem, e incubadas com complexo Streptavidina- Biotina -
Peroxidase (LSAB, DAKO, Glostrup, Dinamarca), em câmara úmida por 30 minutos, à 37ºC.
Em seguida, os cortes foram lavados em PBS, e a reação revelada com incubação dos cortes
em solução de diaminobenzidina e peróxido de hidrogênio à 37ºC, por cinco minutos. Após a
incubação, as lâminas foram lavadas em água corrente, contra coradas com hematoxilina de
Carrazi por 60 segundos, lavadas novamente em água corrente, desidratadas em baterias de
álcool e xilol e montadas em Permount (Fisher Scientific, CA,USA).
3.2.1.1. Controles
Para controle positivo do marcador mdm2 serão utilizados cortes histológicos de
carcinoma ductal invasivo de mama, para o p27, foi utilizado como controle positivo tonsilas
humanas e para a catepsina B carcinoma de cólon. O controle negativo para ambos os
marcadores serão os mesmos cortes histológicos utilizados no controle positivo, subtraindo-se
a etapa de incubação com o anticorpo primário.
3.2.2. Captura e Análise de Imagem
Os núcleos (p27) ou citoplasma (mdm2 e catepsina B) positivos foram
automaticamente quantificados pelo equipamento Image-Pro Plus (Cybernetics, MD, EUA) o
qual inclui um microscópio, uma câmera digital e um software para análise de imagem. A
média de oito campos randomicos do microscópio foi selecionada para a análise de 1000
células marcadas (núcleo ou citoplasma) por biópsia em todos os pacientes. A aquisição da
30
imagem das lâminas dos 55 pacientes com lesões de cavidade oral foi realizada na
fotomomicrografia e a imagem processada pelo software. Cada lâmina foi digitalizada e a
segmentação foi controlada interativamente pelo filtro RGB existente no programa de análise
de imagem. A contagem automática das células positivas foi estabelecida e expressa em
porcentagem.
3.2.3. Quantificação Interobservador
A expressão imunohistoquímica de p27, mdm2 e catepsina B foi quantificada
manualmente em microscópio ótico por dois observadores e o desempate de um terceiro
observador nos casos de resultados discordantes além de 10%. Em cada marcador (p27,
mdm2 e catepsina B) as células marcadas foram quantificadas no total de 1000 células por
biópsia e a quantificação foi expressa em porcentagem.
3.2.4. Interpretação
A expressão quantitativa de p27, mdm2 e catepsina B foi classificada, em índices de
positividade (IP) 1 (negativo a 30% de positividade), 2 (31 a 60%) e 3 (61 a 69.1%), de
modificadas de Millon et al (2001); Kos e Lah, (1998). Ainda, a expressão de todas as
proteínas foi avaliada segundo a intensidade e distribuição tecidual da coloração.
3.3. Detecção e tipagem do HPV
3.3.1. Extração de DNA genômico de tecido parafinizado
Para a extração do DNA de tecido parafinizado foram utilizados dois cortes
histológicos com espessura de 10 µm e, a extração foi realizada segundo proposto por Sato et
al (2001) e modificado neste estudo. Os cortes histológicos transferidos para eppendorfs
estéreis, adicionado 1000µL de xilol absoluto em cada tubo. O tecido parafinizado contendo
xilol foi homogeneizado por inversão e incubado em Banho Maria a 65ºC, por 10 minutos,
seguido de centrifugação 6000 rpm, 4°C por 2 minutos. O sobrenadante é descartado e esse
procedimento foi repetido por 4 a 5 vezes para retirada completa da parafina. Na última
centrifugação, o sobrenadante foi removido, adicionando 700µL de xilol absoluto e 300µL de
etanol absoluto, e em seguida a amostra é homogeneizada, centrifugado 6000 rpm, 4°C por 2
minutos e novamente o sobrenadante é descartado. Em seguida, foi adicionado ao sedimento,
31
500 µL de xilol e 500µL de etanol absoluto, seguido de centrifugação e descarte do
sobrenadante. Novamente, foi adicionado 300µL de xilol e 700µL de etanol absoluto. Na
seqüência, 1000µL de etanol absoluto foi acrescido ao sedimento, centrifugando e novamente
descartando o sobrenadante. No sedimento obtido foi adicionado 1000µL de tampão de lise
Tris-HCL 10Mm, pH 8,5 (2,5mM MgCl2, 50mM KCl, Nonidet P-40 1% e Tween1%). Em
seguida os tubos foram homogeneizados, centrifugados a 6000 rpm, por 2 minutos e o
sobrenadante descartado. Novamente, o sedimento obtido foi ressuspendido com 1000µL de
tampão de lise Tris-HCl 10mM (pH 8,5) e 10µl de proteinase K (10mg/mL) e incubado em
Banho Maria a 65ºC por 2horas. Após o período de incubação, os tubos foram submetidos a
temperatura de 94ºC por 10 minutos objetivando a inativação da proteinase K. O DNA
extraído foi acondicionado a –20°C até o momento dos experimentos de amplificação para a
detecção do HPV.
3.3.1.1. Amplificação do HPV (região consenso) e de beta globina
Após a extração, o DNA obtido dos tecidos parafinados foi submetido a amplificação
pela reação da polimerase em cadeia (PCR) para verificar a presença de DNA (gene da Beta-
globina) nas amostras e para detectar e tipificar e HPV (GP5+/6+ e HPV tipo específico).
Considerando que os DNA extraídos de tecidos fixados e incluídos em parafina apresentam-se
fragmentados, a estratégia de amplificação deve considerar a utilização de iniciadores para
fragmentos de DNA com no máximo 200 pares de base (pb). Todas as reações foram
realizadas no termociclador Biocycler.
A amplificação do gene da beta-globina (β-globina) foi utilizada para avaliar a
integridade do DNA genômico pós-extração, e como um controle interno da amplificação. Os
iniciadores aqui utilizados (PCO3 e PCO4) gene (PCO3+ CTT CTG ACA CAA CTG TGT
TCA CTA GC e PCO4+ TCA CCA CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC) amplificam um
fragmento de 100 pares de base (pb). A reação de PCR foi realizada sob as seguintes
condições: 0,20mM de dNTP, 0,1uM de cada iniciador, 1.25U/uL de Taq DNA polimerase
(Invitrogen), tampão de PCR 1X (Invitrogen), 2µg de DNA genômico, e água destilada
deionizada para um volume final de 25 µL. Os ciclos da reação foram estabelecidos segundo
(WALBOOMERS et al., 1999) e modificados posteriormente nas etapas de padronização A
mistura de reação foi amplificada pelo programa de 1 ciclo de 94ºC por 7 minutos, 35 ciclos
de 94°C por 1minuto, 55°C por 1minuto e 72ºC por 1 minuto e 1 ciclo de 72ºC por 10
minutos.
32
Para detectar a presença do DNA do HPV nas amostras analisadas, foram utilizados os
iniciadores GP5+ e GP6+(MANOS et al., 1989) que amplificam um fragmento de 142 pb da
região L1 comum a todos os tipos de HPV. A reação de PCR foi realizada o protocolo
modificado de (BETTINI et al., 2003), utilizando-se 0,20mM de dNTP, 0,60uM de cada
iniciador, 1,25U/uL Taq DNA polimerase (Invitrogen), tampão de PCR 1,4 x (Invitrogen),
2µg de DNA genômico e água deionizada para um volume final de 25 µL. O DNA das
amostras foi amplificado em termociclador de acordo com as seguintes condições: 1 ciclo de
95ºC por 5 minutos, 37 ciclos de 94°C por 30 segundos, 45°C por 45 segundos e 72°C por 1
minuto e finalmente 1 ciclo de 72°C por 10 minutos. Como a quantidade de DNA viral
presente na amostra é pouca em relação ao DNA humano e qualidade do DNA extraído de
fragmentos parafinizados com xilol e álcool é baixa, foram necessárias 2 reações de PCR
(nested PCR) sob as mesmas condições de primeira para permitir a visualização dos produtos
amplificados nos géis de poliacrilamida 10%. A segunda PCR foi realizada sob as mesmas
condições de primeira, substituindo-se o DNA genômico por 1µL de DNA amplificado na
primeira reação.
A tipagem dos HPVs 6, 11, 16, 18, 31 e 33 foi realizada em todas as amostras
positivas para GP5+/GP6+, segundo protocolo descrito e modificado por (WALBOOMERS
et al., 1999). Para os procedimentos de amplificação e identificação dos tipos de HPV um
volume final de reação de 25 µl foi utilizado, numa mistura da reação incluía 20 ng de DNA
genômico, 0,020 mM de deoxinucleosideo trifosfato (Pharmacia, Uppsala, Sweden) ,0.6 µM
de primer (IDT, IA, USA), 1,25 U Taq polimerase, 3 mM MgCl2, e 1x buffer (Invitrogen,
Brazil). As condições dos ciclos de amplificação foram: desnaturação de 94°C por 5 minutos,
seguida por 35 ciclos de 94°C por1 minuto, 55°C por 1minuto, e 72°C por 1 minuto e a
extensão por 1 ciclo de 72 °C por 10 minutos. Para a amplificação do HPV11 a temperatura
de anelamento utilizada foi de 60°C.
A observação de todos os produtos amplificados fora feita em gel de poliacrilamida
10%, submetido a eletroforese a 250 volts por 1 hora e 30 minutos e corados com nitrato de
prata (SANGUINETI, 1994).
33
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
34
Para a análise quantitativa da expressão das proteínas p27, mdm2 e catepsina B entre
as lesões estratificadas de acordo com o diagnóstico histológico, foi utilizado o Teste de One
Way ANOVA com pós-teste de Bonferroni. Para a avaliação de presença do HPV entre os
grupos de lesões de cavidade oral, estratificadas segundo o diagnóstico histológico, foi
utilizado o Teste Exato de Fisher. Para a comparação entre a expressão quantitativa p27,
mdm2 e catepsina B e a presença ou ausência do HPV foi aplicado o Teste Z. O teste One
Way ANOVA com pós-teste de Bonferroni foi aplicado para análise comparativa entre os
índices de positividade obtidos da expressão quantitativa das proteínas p27, mdm2 e catepsina
B entre as lesões de cavidade oral. O Teste T não pareado foi aplicado na comparação entre a
avaliação quantitativa por análise de imagem e contagem interobservador. Para todas as
análises foi considerado um nível de significância de ≤ 0.05. Todos os resultados foram
avaliados pelo programa Instat Mac 2.01 (GraphPad software, San Diego, CA, USA).
35
5. RESULTADOS
36
Os resultados do presente estudo estão apresentados nas Tabelas 1 a 5 e Figuras 6 a 9.
De acordo com o diagnóstico histológico, entre os 55 pacientes avaliados, 18(33%)
apresentaram lesões benignas (LB), 18(33%) lesões potencialmente malignas (LPM) e
19(35%) de lesões malignas (LM). Na avaliação da presença do HPV entre os 55 pacientes
(Tabela 1, Figura 6), 21(38%) foram positivos para a presença de HPV e 34 (62%) foram
HPV negativos (Tabela 1). Nos 18 pacientes pertencentes ao grupo de lesões benignas (LB), o
DNA dos tipos de HPV 6/11 foi encontrado em 6(33%) pacientes com (LB). O tipo de HPV
16 foi encontrado em 1(20%) dos 19 pacientes com (LM) e o HPV18 foi identificado em
4(22%) dos 18 pacientes com (LPM) e 10(53%) dos 19 pacientes com (LM). Nenhuma lesão
foi simultaneamente positiva para os tipos de HPV 6/11, 16 e 18. Ainda, nenhuma lesão oral
foi positiva para os tipos de HPV 31 e 33. Estes resultados demonstram uma associação
significante (P<0.0001) entre a infecção pelos tipos de HPV de alto risco e as lesões epiteliais
potencialmente malignas e malignas de mucosa oral.
Tabela 1. Tipificação do Papilomavírus humano (HPV) em 55 lesões de cavidade oral,
estratificadas de acordo com o diagnóstico histológico.
Lesão Benigna (LB); Lesão potencialmente maligna (LPM); Lesão Maligna (LM) = Carcinoma oral.
HPV 31 e 33 não foram detectados em lesão orais. Teste Exato de Fisher, P<0.0001.
HPV (+) HPV 6/11 HPV 16/18 HPV (-)
n (%) n (%) n (%) n (%)
LB (n=18) 6(33) 6 (33) 0 12 (66)
LPM (n=18) 4 (22) 0 4 (22) 14 (77)
LM (n=19) 11(58) 0 11 (58) 8 (42)
Total (n=55) 21 (38) 6 (11) 15 (27) 34 (62)
37
Figura 6 - Reação de polimerização em cadeia (PCR) em gel de poliacrilamida 10%. A)
Reação de amplificação do gene de beta globina e amplificado com banda de 100pb; B)
Amplificação de DNA de HPV utilizando primers de região consenso (GP5+/ 6+); Canaletas
1, 2, 3,4 = pacientes HPV positivo; C) Identificação de HPV 11, utilizando primers
específicos; Canaletas 1 = paciente positivo para a presença do HPV11; PM = Massa
molecular de 100pb; P = Controle positivo com banda de 100 pb referente a amplificação de
DNA de HPV 11 extraído de células HeLa; B = Controle negativo, sem DNA.
A expressão imunohistoquímica quantitativa das proteínas p27, mdm2 e catepsina B
em biópsias de mucosa oral estratificadas de acordo com a infecção pelo HPV demonstrou um
aumento na expressão destas em lesões de mucosa oral infectados com HPV (Tabela 2).
Aumento na expressão de p27 foi observado em lesões infectadas com HPV6 e 11 (P =
0.0035) e HPV 16 e 18 (P = 0.0001) enquanto para catepsina B o aumento da expressão foi
observado somente em lesões com presença de HPV 16 e 18 (P = 0,0388). Não foi encontrada
associação entre a expressão de mdm2 e a infecção pelos tipos de HPV 6,11, 16 ou 18. Lesões
500pb
100pb
PM P 1 2 3 4 B
C)
1 2 3 4 5 6 7 P B PM
500pb
100pb
A)
B PM P 1 2 3 4
500pb
150pb
B)
38
de mucosa oral infectadas com HPV 18 apresentaram coloração intensa e distribuída
difusamente para todas as proteínas avaliadas nesse estudo (Figura 7 a 9).
Tabela 2. Expressão quantitativa de p27, mdm2 e catepsina B
lesões orais infectadas por
HPV.
p27
(
a)
mdm2
Catepsina B
(
b)
M ± EP M ± EP M ± EP
Total
Negativo
27,2 ± 1.5 20,4 ± 2.2 26,5 ± 4.2 34
HPV 6/11 53,9 ± 6,4 23,3 ± 5,6 31,2 ± 1,6 6
HPV 16/18
39,4 ± 4,0 23,3 ± 3,9 44,6 ± 5,5 15
Total 55
Teste Z:
(a)
p27 = HPV negativo versus HPV 6/11 (P=0,0035); HPV 6/11 versus HPV16/18 (P =
0,0001);
(b)
catepsina B = HPV negativo versus HPV16/18 (P= 0,0388). M ± EP = Média e Erro
Padrão.
A comparação entre todos os resultados da expressão quantitativa de p27, mdm2 e
catepsina B e as lesões de cavidade oral (Tabela 3) não demonstrou diferença entre os grupos
(p27, P = 0.7392, mdm2, P= 0.2142 e catepsina B, P = 0.1047). Diferença significativa foi
observada na quantificação por análise de imagem (IM) e interobservador (IO) das proteínas
p27, mdm2 e catepsina B entre as lesões (Tabela 3). Essa diferença foi menor para a p27 (P =
0.0013) e expressivamente maior para mdm2 (P<0,0001) e catepsina B (P<0.0001).
Aparentemente a marcação de mdm2 (Figura 8 C a F) e de catepsina B (Figura 9 A a D), seria
mais difícil de interpretar, principalmente por análise de imagem, cuja característica da
imunocoloração (citoplasmática, intensa e difusa) parece ser um fator limitante na
interpretação especialmente nas lesões epiteliais potencialmente malignas e malignas.
39
Tabela 3 – Média e Erro Padrão (M ± EP) da expressão imunohistoquímica quantitativa de p27,
mdm2 e catepsina B por análise de imagem (IM) e análise interobservador (IO).
p27
(a,d)
mdm2
(
b,e)
catepsina B
(c,f)
IM
IO
IM IO
IM IO
M ± EP M ± EP M ± EP M ± EP M ± EP M ± EP
LB (n=18) 46,0 ± 5,6 37,0 ± 5,1
64,5 ± 8,1 18,6 ± 3,0 86,8 ± 1,7 29,8 ± 2,1
LPM (n=18) 51,0 ± 7,0 39,0 ± 5,1
70,2 ± 9,5 44,3 ± 4,1 74,2 ± 7,8 43,4 ± 4,9
LM (n=19) 60,3 ± 9,0
38,7 ± 4,1
69,0 ± 9,1 24,5 ± 3,5 88,7 ± 7,2 36,7 ± 3,9
Comparação entre IM versus IO - Teste T não pareado: (a) p27 (P = 0,0013); (b) mdm2 (P < 0,0001);
(c) catepsina B (P < 0,0001). One Way ANOVA: Expressão de p27, mdm2 e catepsina B (IO) versus
lesões
(d)
p27 (P=0.7392);
(e)
mdm2 (P = 0.2142);
(f)
catepsina B (P = 0.1047).
Entretanto, quando a expressão das proteínas em relação às lesões de cavidade oral foi
avaliada através da classificação por índice de positividade (IP), foi observada associação
significativa para a expressão de p27, mdm2 e catepsina B (Tabela 4). Esses resultados
sugerem que a avaliação da positividade dessas proteínas, descontada a positividade normal
esperada (cut off), permite boa discriminação entre os grupos de lesões benigna,
potencialmente maligna e maligna.
40
Tabela 4. Índice de positividade (IP) de p27, mdm2 e catepsina B: imunopositividade
quantitativa em lesões orais, de acordo com o diagnóstico histológico.
Lesões p27
(a)
mdm2
(b)
Catepsina B
(c)
TOTAL
Orais IP1 IP2 IP3 IP1 IP2 IP3 IP1 IP2 IP3
LB 8 8 2 16 2 0 6 12 0 18
LPM 4 12 2 10 8 0 3 11 4 18
LM 6 12 1 12 6 1 8 8 3 19
TOTAL 55
One Way ANOVA:
(a)
p27 (P= 0.0033) = IP1 versus IP2 (p<0,05), IP1 versus IP3 (p<0,05), IP2 versus
IP3 (p<0,05);
(b)
mdm2 (0.0035) = IP1 versus IP2 (p<0,05), IP1 versus IP3 (p<0,01), IP2 versus IP3
(p<0,05);
(c)
catepsina B (P = 0,0202) = IP1 versus IP2 (p<0,05); IP1 versus IP3 (p<0,05), IP2 versus
IP3 (p<0,05). Lesão Benigna (LB); Lesão Potencialmente Maligna (LPM); Lesão Maligna (LM) =
Carcinoma oral. IP: IP1 (negativo a 30%), IP2 (>30% a 60%) e IP3 (61% a 69%).
Para mdm2 e catepsina B, foi observada alta intensidade de coloração e distribuição
tecidual difusa (Figura 7 e 8) de acordo com o diagnóstico histológico. A expressão de p27 foi
maior nas leucoplasias (Figura 7F e G) e no carcinoma (Figura 7H), enquanto nas lesões
benignas foi observado um padrão de marcação discreto e distribuído esporadicamente na
camada basal (Figura 7D, 8D e 9A). A maior expressão de p27 foi observada nas lesões
potencialmente malignas e no carcinoma oral, respectivamente, no núcleo das células
pertencentes a camada basal do epitélio. Esses resultados demonstram uma forte associação
entre o aumento de expressão de p27, mdm2 e catepsina B em lesões malignas ou com
elevado potencial de malignização, sugerindo que a avaliação da expressão
imunohistoquímica das proteínas p27 e catepsina B poderia ser um bom marcador do câncer
oral associado à infecção pelo HPV.
41
Figura 7 – Imunoperoxidase para p27 em lesões orais. A) Controle positivo (Tonsila). B)
Controle negativo (Tonsila). C) Controle Normal de mucosa oral. D) Lesão oral benigna com
positividade camada basal e intermediária. E) Lesão oral benigna com mesma marcação vista
em D. F) Lesão Potencialmente Maligna com marcação em todas as camadas de basal a
superficial. G) Lesão Potencialmente Maligna com marcação nas áreas de atipia. H) Lesão
Maligna (Carcinoma oral) com intensa e difusa marcação em toda área neoplásica. Barra de
escala igual a 250µm.
42
Figura 8 – Imunoperoxidase para mdm2 em lesões orais. A) Controle positivo (Carcinoma
ductal invasivo de mama). B) Controle negativo (Carcinoma ductal invasivo de mama). C)
Controle Normal. D) Lesão oral benigna com positividade somente na camada basal. E) Lesão
Potencialmente Maligna com marcação intensa nas áreas de atipia. F) Lesão Maligna
(Carcinoma oral) com intensa e difusa marcação em toda área neoplásica. Barra de escala
igual a 250µm.
43
Figura 9 – Imunoperoxidase para catepsina B em lesões orais. A). Lesão oral benigna com
positividade citoplasmática discreta na camada basal e intermediária. B) e C) Lesão
Potencialmente Maligna com marcação citoplasmática intensa e difusa nas áreas de atipia. D)
Lesão Maligna (Carcinoma oral) com intensa e difusa marcação em toda área neoplásica.
Barra de escala igual a 250µm.
44
6. DISCUSSÃO
45
O câncer de cabeça e pescoço inclui de lábio, cavidade oral, nasofaringe, orofaringe,
hipofaringe, laringe e glândulas salivares. A carcinogênese de mucosa oral é classicamente
atribuída ao fumo e álcool. O hábito de fumar e a ingestão regular de álcool parecem estar
diretamente relacionados ao desenvolvimento desse tipo de carcinoma (SARANATH et al.,
1999; WEINBERG; ESTEFAN, 2002). Nessas localidades, principalmente na laringe, há
evidências da presença do papilomavírus humano (HPV) (SYRJÄNEN, 2005). Entre os
fatores de risco para o desenvolvimento do câncer oral, o HPV vem sendo considerado como
um dos agentes etiológicos relevantes e associados ao descontrole de ciclo celular no
desenvolvimento das lesões bucais.
Entretanto, estudos prévios demonstram variada freqüência de HPV entre as lesões de
cavidade oral (FORNATORA et al. 1996; D’ COSTA et al. 1998; MIGUEL et al. 1998,
FREGONESI et.al, 2003), com uma prevalência média de 20 a 30% (MILLER;
JOHNSTONE 2001; SOARES et al. 2003) e elevada positividade dos tipos de HPV de alto
risco (50%) nas lesões orais (MILLER; WHITE 1996; SOARES et al, 2002; FREGONESI et
al, 2003). Os resultados do presente estudo demonstram uma forte associação entre a presença
dos tipos de HPV de alto risco e o carcinoma espinocelular, indicando que o HPV poderia ser
considerado um dos fatores de risco para a carcinogênese de cavidade oral. Ainda, no presente
estudo, foi observada associação positiva entre a presença do HPV 6 e 11 e lesões orais
benignas cujo prognóstico de sobrevida é geralmente benigno. A presença dos tipos de HPV
de baixo risco em lesões benignas parece indicar um prognóstico mais favorável
(PAPAROTTO LOPES; MEEKS 2001). O HPV 6, baixo risco, é raramente encontrado em
tumores malignos, embora, HPV6/11 têm sido ocasionalmente encontrados em carcinomas
vulvar, cervicais e papilomas de laringe em transição maligna e condilomas gigantes
(SYRJÄNEN; SYRJÄNEN, 2000).
Algumas das oncoproteínas do HPV são capazes de interagir com várias proteínas da
célula hospedeira, interferindo com processos como controle do ciclo celular, resposta
apoptótica, sinalização celular e expressão gênica. Em um estudo comparativo entre câncer
oral (tonsila) e câncer cervical mostrou que no câncer oral há uma maior positividade de p53,
enquanto que no câncer cervical há uma maior expressão de pRb, p16 e p27, sugerindo que
essa diferença pode ser justificada pelas taxas de mutações de p53 (LI et al., 2004).
Os danos produzidos no material genético devem ser sinalizados e corrigidos, e por
isso são ativados mecanismos de controle da progressão pelo ciclo celular – os checkpoints –
quando as condições internas são desfavoráveis à divisão celular (YOO et al., 2002). O
controle da progressão do ciclo celular é promovido pelas Kinases dependente de ciclina
46
(CDK). O complexo ciclina/CDK é controlado por proteínas inibitórias (CKI) (BLOOM,
PAGANO, 2003). A proteína p27 é uma CKI pertencente à família CIP/KIP que interage com
o complexo ciclina/CDK, inibindo CDK4 e CDK2 interrompendo o ciclo celular. Embora
exista oscilação de níveis de p27 durante as fases do ciclo, o nível máximo foi encontrado em
células quiescentes e na fase G1. Em algumas anormalidades do ciclo celular a p27 exerce
papel de supressora de tumor (BLOOM, PAGANO, 2003). No presente estudo nós
verificamos o aumento da expressão de p27 em lesões orais. A presença de altos níveis de p27
é freqüentemente encontrado em tecidos orais normais e benignos (PATAH et al., 2004). A
elevada expressão de p27 tem sido relatada para induzir proteção celular através da morte
programada (COQUERET, 2003). Nós verificamos elevada expressão quantitativa de p27
apresentando imunopositividade moderada à intensa. Em contraste, alguns estudos
demonstraram a ausência da expressão de p27 em neoplasias malignas orais (KUO et al.,
2002; SUPRIATNO et al., 2002). Geralmente, a alta expressão de p27 induz o ciclo celular
para G1 e apoptose, inibindo a proliferação celular e levando a morte celular programada em
carcinoma oral celular (SUPRIATNO et al., 2002). Por outro lado, a alta expressão de p27
pode estar associada ao estágio avançado da doença e com pior prognóstico de carcinoma
esofágico (ANAYAMA et al., 1998; ITAMI et al., 1999). Portanto, é possível que o aumento
da expressão de p27 pode estar associado à agressividade do câncer oral.
Por outro lado baixa expressão de p27 também foi observada em 6 de 19 carcinomas
orais. Embora esta baixa expressão não é completamente entendida, a diminuição da função
de p27 parece implicar em progressão maligna oral. (KIM et al., 2000) Em câncer oral, a p27
é considerada bom marcador, indicando suscetibilidade ao câncer oral, tempo de sobrevida do
paciente e potencial para metástase, principalmente quando a expressão é analisada com
níveis de ciclina D1 (KUROPKAT et al., 2002). Deleções, metilações e aberrações
proteolíticas devem ser a causa da baixa expressão de p27 (COQUERET, 2003). Recentes
estudos demonstraram uma diminuição da expressão de p27 em vários tumores malignos
(PATAH et al., 2004; KIM et al., 2000, HWANG et al., 2003). A degradação de p27 tem sido
relatada com alto potencial metastático em câncer oral de células escamosas (KUDO et al.,
2003). Poucos estudos avaliaram a relação entre a baixa expressão de p27 e tumor metastático
de cabeça e pescoço em nódulos linfáticos.
Uma baixa expressão de p27 foi encontrada no carcinoma espinocelular oral associada
à infecção por HPV 16 e 18 quando comparada à expressão em lesões infectadas por HPV6 e
11. Uma baixa expressão tem sido associada à infecção por HPV, onde as oncoproteínas
virais parecem causar uma regulação negativa do gene p27, contribuindo para transformação
47
maligna celular (KIM et al,. 2000). Em carcinomas cervicais, a baixa expressão de p27 tem
sido relatada em infecção por HPV, e no carcinoma oral esta associação é controvérsia. A
proteína E7 do HPV de alto risco parece relatar a inativação da p27 contribuindo para
desregulação do gene (KIM et al., 2000).
No presente estudo nós verificamos uma elevada expressão de mdm2, principalmente
em lesões pré-malignas, e baixa expressão nas demais lesões orais. Estudos recentes
demonstraram superexpressão de mdm2 (51 e 64%) em cânceres cervical e oral
(YANAMOTO, 2002). O mdm2 é um oncogene que apresenta alta expressão em uma
variedade de tumores. Recentes estudos têm demonstrado que o mdm2 possui capacidade de
se ligar diretamente a p53 e direcionar essa proteína para a degradação proteassômica,
funcionando como uma ubiquitina ligase (HONDA et al., 1997). Através da ligação com
mdm2, p53 é exportada para o citoplasma, p53 é degradada, e, posteriormente mdm2 retorna
ao núcleo (FREADMAN, LEVINE, 1998). A função de p53 é dependente de estoques de
mdm2 e, portanto a superexpressão desta proteína poderá acarretar a perda de controle de
ciclo celular na G1/S, contribuindo para transformação maligna celular (YOO et al., 2002). A
alta expressão imunohistoquímica está associada à proliferação maligna do tumor, indicando
que é um bom marcador tumoral oral (PARTRIDGE, 1999). Interessantemente, em 3/18
(17%) leucoplasias com displasia moderada a severa e 4/19 (21%) de carcinoma oral de
células escamosas apresentou uma expressão imunohistoquímica para mdm2 negativa. A
ausência de expressão de mdm2 tem sido descrita como um marcador de prognóstico
desfavorável em pacientes com câncer de pulmão e ovário submetido a tratamento
quimioterápico (HIGASHIYAMA et al., 1997; TANNER et al., 1997). Em tumores malignos
de cabeça e pescoço, a baixa expressão de mdm2 está associada ao avanço do estágio do
tumor, relatando a progressão do tumor (MILLON et al., 2001). Curiosamente, uma
diminuição da expressão foi observada nos carcinomas de mucosa oral, aparentemente não
associado à presença do HPV. As oncoproteínas dos tipos de HPV de alto risco estão
associadas à degradação de p53 esperando-se uma regulação positiva de mdm2 como ocorre
com a proteína pRb (degrada) e p16INK4a que está superexpressa na presença de HPV no
câncer oral (FREGONESI et al.,2003).
Neste estudo, nós verificamos alta expressão de catepsina B em leucoplasias e
carcinomas orais de células escamosas, em comparação à lesões benignas (hiperplasia).
Recentes estudos demonstraram que a catepsina B é um indicador confiável para diagnóstico
e prognóstico associado à sobrevida de câncer oral metastático e invasivo (VIGNESWARAN
et al., 2000). A catepsina B é um cisteíno protease lisossomal codificada pelo gene 8p22a e
48
está associada com turnover da matriz extracelular e na tumorigênese está associada a
angiogênese, invasão e metástase (MIGNATTI; RIFKIN, 1996; RAO, 2003). A alta atividade
da catepsina B é freqüentemente observada em vários tumores, localizada na membrana
plasmática das células tumorais para garantir a degradação da matriz extracelular e lâmina
basal nos processos de invasão (TALIERI et al., 2004). A catepsina B parece possuir
atividade de protease ativadora de morte celular independente de caspases, disparando sinal
alternativo de apoptose em células tumorais (FU et al., 1998). Assim, é possível que o HPV
possa interferir na sua ativação, impedindo a apoptose e garantindo a transformação maligna
celular (KAZNELSON et al., 2004). Nossos estudos demonstraram a superexpressão de
catepsina B em lesões orais e malignas infectadas por HPV 16 e 18, sugerindo que a
modulação da expressão gênica de catepsina B possa ser desregulada sob a ação de
oncoproteínas do HPV e com isso impedindo a apoptose em células infectadas pelos tipos de
HPV de alto risco. A presença das oncoproteínas E6 e E7 parecem ser capazes de desregular a
expressão de vários genes relacionados com o controle do ciclo-celular, como, 53, PCNA e
p16/ink4a (SOARES et al, 2002; FREGONESI et al., 2003). Contudo, mais estudos devem
ser realizados para investigar a influência do HPV em superexpressão de catepsina B.
No presente estudo, a avaliação da expressão de p27, mdm2 e catepsina B pelo índice
de positividade, o qual desconta a expressão dessas proteínas em tecidos normais, permitiu
uma boa discriminação entre lesões benignas, potencialmente malignas e malignas. A
quantificação dessas proteínas sem levar em conta sua expressão basal demonstrou ser
ineficiente na caracterização do comportamento biológico dos diferentes tipos histológicos de
lesão oral. A utilização dessa estratégia de classificação vem sendo empregada em estudos
conduzidos por nosso laboratório, permitindo melhor identificar o potencial biológico para a
carcinogênese de mucosa oral (SOARES et al., 2005; TERESA et al., 2007).
A avaliação semiquantitativa e a contagem manual de células marcadas são
procedimentos usualmente empregados na avaliação quantitativa de marcadores moleculares
marcados por imunohistoquímica (CHIANG et al 2000; LIU; KLEIN-SZANTO, 2000;
GARCIA-POLA et al, 2001;COLLETA et al, 2001; HAFIAN et al, 2004) e poucos estudos
tem avaliado a quantificação de proteínas por análise de imagem (KUSHNER et al., 1997;
TUMULURI et al., 2002). Entretanto, ao contrário dos observados nesses estudos (SOARES
et al., 2006; TERESA et al., 2007), o presente trabalho demonstrou uma disparidade
impressionante entre a análise de imagem e a avaliação quantitativa interobservador. A
hipótese que nos parece responder a diferença de quantificação poderia ser a dificuldade
potencial de delimitação entre o núcleo ou o citoplasma. Essa dificuldade de discriminação
49
na marcação nuclear e/ou citoplasmática foi relatada em estudos anteriores e considerada
como principal fator limitante da avaliação quantitativa por análise de imagem (GUILLAUD
et al., 1997; DE SOLORZANO et al., 2001). Abordagens metodológicas como a dupla
marcação de membrana nuclear ou citoplasmática (DE SOLORZANO et al., 2001), bem
como, a criação de logarítimos matemáticos nos programas de análise de imagem
(GUILLAUD et al., 1997), poderia garantir uma melhor delimitação das regiões de interface
nuclear ou citoplasmática. Dessa forma, ficaria facilitada a melhor caracterização da
imunocoloração entre as inúmeras células que se justapõem na organização tecidual,
evitando-se falsos positivos. Dessa forma, a quantificação por análise de imagem da
expressão de proteínas por imunohistoquímica deveria ser avaliada com cautela,
principalmente, quando essas proteínas possuem dispersão difusa pelo citoplasma ou pelo
acúmulo de núcleos marcados nos tecidos.
Nós podemos concluir que os tipos de HPV de alto risco estão envolvidos em
superexpressão de p27 e catepsina B, e que a interação viral e disfunção destas proteínas
provavelmente contribuem nos processos de carcinogênese oral. Além disso, nossos
resultados sugerem que a p27, mdm2 e a catepsina B poderiam ser considerados bons
marcadores do desenvolvimento de câncer oral.
50
7. CONCLUSÕES
51
1. A presença do HPV foi encontrada em 38% das lesões de cavidade oral, com presença dos
tipos de HPV de baixo risco (HPV6/11) em lesões benignas e tipos de alto risco (HPV
16/18) em lesões malignas. Não foram encontrados os tipos de HPV 31 e 33.
2. O aumento de expressão de p27 e catepsina B parece estar associado à infecção pelos tipos
de HPV 6/11 e HPV16/18, sugerindo que o vírus possa desregular a expressão dessas
proteínas contribuindo para a carcinogênese de mucosa oral. Nenhuma associação foi
encontrada com a presença do HPV e a alteração na expressão de mdm2.
3. O aumento da expressão de p27 e catepsina B foi associado com as lesões epiteliais
potencialmente malignas e malignas de mucosa oral, sugerindo que essas proteínas
poderiam ser consideradas bons marcadores da carcinogênese oral.
52
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