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Universidade Federal de Itajubá
Instituto de Ciências Exatas
Departamento de Física e Química
Pós-graduação em Materiais para Engenharia
Estudo das propriedades antimicrobianas de
copolímeros derivados do eugenol
Laiza Maria Borges Tangerino
Dissertação apresentada como exigência parcial
para obtenção do grau de mestre em Materiais para Engenharia
à Comissão Julgadora da Universidade Federal de Itajubá, sob a
orientação do Prof. Dr. Álvaro Antonio Alencar de Queiroz e
co-orientação da Profª. Drª. Mariza Grassi
Itajubá, outubro de 2006
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2
Estudo das propriedades antimicrobianas de
copolímeros derivados do eugenol
Laiza Maria Borges Tangerino
Banca examinadora:
1º examinador
2º examinador
3º examinador
Itajubá, _____de __________de___________
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3
Ao meu marido, Celso Bonfim Junior, pelo amor e dedicação de
sempre, pelo incentivo e apoio incondicionais.
Aos meus pais, Maria do Carmo e Nilson Ricardo, pelos
ensinamentos e incentivos de toda minha vida.
A minha irmã, Cássia Mara, pelo apoio, carinho e amizade tão
imprescindíveis.
4
Agradecimentos:
Ao Prof. Dr. Álvaro Antonio A. de Queiroz, pela orientação,
ensinamentos e comprometimento com minha formação científica.
À Dra. Olga Zazuco Higa, do Instituto de Pesquisas Nucleares da
Universidade de São Paulo pelos ensaios de citotoxicidade e micrografias
MEV.
Ao bioquímico Roberto Mendes, do Laboratório Clínico de Itajubá,
pela colaboração nos ensaios antimicrobianos.
À Profª Drª Cristina I. Mizusaki pela valiosa amizade, estímulo e
incentivo à minha formação científica.
Aos professores da Faculdade de Odontologia da Universidade de São
Paulo e do curso de Mestrado em Materiais para Engenharia da Universidade
Federal de Itajubá pelos ensinamentos que me possibilitaram a conclusão
deste trabalho.
Aos colegas do curso de mestrado, em especial a Nirton Cristi, Mayler
Martins, Edson Giuliani e André Paiva pelo incentivo, companheirismo e
colaborações.
Aos meus familiares e amigos, que cada qual a seu modo, estiveram
sempre presentes apoiando e incentivando-me.
A CAPES pela concessão de bolsa de mestrado.
5
RESUMO
O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver e testar polímeros
biologicamente ativos baseados nos copolímeros macroporosos PCL-co-Eg com potencial
para utilização na medicina. O elemento antimicrobiano na cadeia principal do copolímero
é o eugenol (Eg). O eugenol (2-alil-4-metoxifenol) é amplamente utilizado na odontologia
devido às suas propriedades analgésicas e antissépticas. O eugenol é dotado de
propriedades antimicrobianas devido à capacidade doadora do próton H
+
do grupamento
fenólico hidroxila. Neste trabalho, copolímeros bioreabsorvíveis com atividade
antimicrobiana baseados nos monômeros eugenol (Eg) e caprolactona (CL) foram
preparados por polimerização em massa a 25ºC utilizando iodo (I
2
) como iniciador. A
microestrutura do copolímero obtido foi investigada por espectroscopia
1
H-NMR e FTIR
bem como análises térmicas. A razão de reatividade de ambos os monômeros foi
determinada pela aplicação de método não-linear mínimo-quadrado proposto por Tidwell e
Mortiner. Os resultados obtidos (r
Eg
=0,126 e r
CL
=2,132) confirmam que o par comonômero
polimeriza estatisticamente, independente do suprimento monomérico. Para obtermos mais
informações sobre os fatores que determinam a bioatividade dos copolímeros PCL-co-Eg,
foi realizada modelagem molecular. Os cálculos químicos teóricos indicam que a atividade
antimicrobiana dos copolímeros deve estar significativamente associada com a diferença
de energia do orbital molecular (HOMO LUMO). Os achados presentes são concordantes
com nossos estudos experimentais sobre a propriedade antimicrobiana dos copolímeros
PCL-co-Eg por técnicas in vitro. De acordo com a energia LUMO, as moléculas podem ser
classificadas como fortemente eletrofílicas (E
LUMO
>3,0eV) e levemente eletrofílicas
(E
LUMO
<2,5). Em geral, moléculas fortemente eletrofílicas mostram uma atividade
biológica mais marcante, sugerindo que o sítio ativo na biomolécula deveria ser um forte
nucleofílico. A despeito do fato da atividade antimicrobiana do copolímero PCL-co-Eg ser
influenciada por outros fatores, a energia LUMO parece ser um parâmetro teórico
adequado para prever qualitativamente a atividade antimicrobiana desses copolímeros. A
energia dos orbitais HOMO-LUMO no copolímero não mostrou uma dependência
significativa em relação a concentração de eugenol no copolímero. A energia do orbital
LUMO é inversamente proporcional a concentração de eugenol no PCL-co-Eg. Esses
estudos confirmam os achados anteriores relatando propriedades antimicrobianas dos
copolímeros PCL-co-Eg para S. aureus e E. coli. Investigações futuras precisam ser
desenvolvidas quanto ao uso terapêutico do PCL-co-Eg em tratamentos periodontais. Os
copolímeros PCL-co-Eg mostram grande potencial a esse respeito, especialmente nos
casos em que ocorrem limitações como o desenvolvimento de resistência e toxicidade ao
uso contínuo de antibióticos. Entretanto, mais investigações teóricas e experimentais sobre
os copolímeros PCL-co-Eg auxiliarão na elucidação de suas propriedades de
biodegradação e quanto à sua utilização na área biomédica, antes que possam ser
desenvolvidos comercialmente como um antimicrobiano para as áreas médica e
odontológica.
6
ABSTRACT
The main objective of this work was to develop and to test a novel biologically
active polymer based on macroporous PCL-co-Eugenol copolymers with potential for use
in medicine. The antimicrobial element in the copolymer main chain is the bioactive
compound eugenol (Eg). Eugenol (2-allyl-4-methoxyphenol) (Eg) has wide use as cement
in dentistry due to their analgesic and antiseptic properties. Eugenol is able to act as
antimicrobial due to their hydrogen donating capacity of the phenolic hydroxyl group. In
this work bioresorbable copolymers with antimicrobial properties based on Eugenol (Eg)
and caprolactone (CL) monomers were prepared by mass polymerization at 25
o
C using
iodine (I
2
) as initiator. The microstructure of the copolymer obtained was elucidated by
means of
1
H-NMR and FTIR spectroscopy as well by thermal analyses. The reactivity
ratios of both monomers were determined by the application of the non-linear least-squares
method suggested by Tidwell and Mortiner. The obtained results (r
Eg
=0.126 and
r
CL
=2.132) confirm that the comonomer pairs polymerizes statistically, independently of
the monomer feed. To obtain more information about the factors that determine the
bioactivity of the PCL-co-Eg copolymers, molecular orbital modeling was performed. The
theoretical quantum-chemistry calculations indicated that the antimicrobial activity of
copolymers might be significantly associated with the frontier molecular orbital energy gap
(LUMO-HOMO energy difference). The present findings are consistent with our
experimental studies about the antimicrobial property of PCL-Eg copolymers by in vitro
techniques. According to the LUMO energy, the molecules can be classified as hard
electrophiles (E
LUMO
>3.0 eV) and soft electrophiles (E
LUMO
<2.5 eV). In general, hard
electrophiles show a more important biological activity, suggesting that the active site of
the biomolecule could be a hard nucleophile. Despite the fact that the antimicrobial activity
of the PCL-co-Eg may be also influenced by other factors, LUMO energy seems to be an
adequate theoretical parameter to predict qualitatively the antimicrobial activity of these
copolymers. The energy of the HOMO-LUMO orbitals in the copolymer did not show a
significant dependence with the Eg composition in the PCL-co-Eg copolymer. The frontier
orbital LUMO energy is inversely proportional to the Eg composition in the PCL-co-Eg
copolymer. Our study confirms and supports the earlier findings regarding antimicrobial
properties of PCL-co-Eg copolymers against S. Aureus and E. Coli. Further investigations
need to be done to develop PCL-co-Eg copolymers into a useful therapeutic tool for
treatment of periodontits. PCL-co-Eg copolymers show great potential in this respect,
especially on the grounds of limitations such as development of resistance to side effects
and toxicity of currently used antibiotics. However, more theoretical and experimental
investigations about PCL-Eg copolymers will aid in the elucidation of its biodegradation
properties and clarification about some potential health hazards before they can be safely
evaluated and commercially developed as beneficial antimicrobial coating in medicine.
7
Índice de Figuras
Capitulo 1
Figura 1: Aspecto clínico da gengivite e periodontite evidenciando exposição radicular por
perda óssea............................................................................................................01
Capitulo 2
Figura 1: Estrutura da proteoglicana....................................................................................04
Figura 2: Corte histológico evidenciando osteoblastos, osteócitos e periósteo no tecido
ósseo......................................................................................................................05
Figura. 3: Corte histológico evidenciando osteoclastos e osteócitos no tecido ósseo..........06
Figura. 4: Micrografia obtida por microscopia eletrônica de varredura (MEV) de partículas
de hidroxiapatita.................................................................................................06
Figura 5: Estrutura do colágeno ..........................................................................................07
Figura 6: Corte histológico evidenciando canais de Havers e Volkmann............................08
Figura 7: Corte do osso mandibular humano evidenciando as porções trabecular (A) e
cortical (B).
...........................................................................................................08
Figura 8: Paciente com parte da face transplantada segundo os princípios do enxerto
alógeno .................................................................................................................16
Figura 9: Estrutura química dos fármacos utilizados no controle da rejeição pós-implante
alógeno: ciclosporina (A), prednisona (B), tacrolimus (C), micofenolato mofetil
(D) e rapamune â (E)..........................................................................................17
Figura 10: Materiais empregados no enxerto xenógeno: matriz mineral de osso bovino
PRO-BONE
®
(A) e Gen-Ox (B), matriz orgânica de osso bovino (C)..............19
Figura 11: Representação esquemática de uma prótese de fêmur........................................24
Figura 12: Estrutura química da vancomicina (A), cefalosporina (B), ampicilina (C) e
metronidazol (D)................................................................................................29
Capitulo 3
Figura 1: Estrutura da amilopectina.....................................................................................40
Figura 2: Exemplos das diferentes formas farmacêuticas: (A) esfera (sistema matricial) e
(B) cápsula (sistema reservatório).........................................................................43
Figura 3: Mecanismos de liberação do princípio bioativo por difusão (A), erosão (B) e
liberação pelo sistema reservatório (dissolução ou difusão) (C)...........................44
8
Figura 4: A evolução nas pesquisas sobre a aplicação dos polímeros biodegradáveis na
medicina. Fonte: Science Direct. PEG (A), PLA (B), PCL (C), PHB (D)............46
Figura 5: Estrutura química do PHB (a), PCL (b), PEG (c).................................................47
Capitulo 4
Figura 1: Artigos científicos publicados sobre a PCL nos últimos 10 anos. Fonte: Science
Direct..................................................................................................................55
Figura. 2: Reação de polimerização por abertura de anel da ε-caprolactona.......................57
Figura 3: Esquema de adição de radiocontraste à PCL........................................................58
Figura 4: Embalagem comercial do fio de sutura Monocryl e sutura após exodontia....62
Capitulo 5
Figura 1: Localização geográfica das Ilhas Molucas...........................................................68
Figura 2: Cravo-da-índia .....................................................................................................69
Figura 3: Isômeros do eugenol.............................................................................................70
Figura 4: Condução da reação de isomerização do eugenol................................................70
Figura 5: Embalagem comercial do pó de óxido de zinco e eugenol..................................72
Figura 6:Cones de guta percha, de diferentes diâmetros, para obturação dos canais
radiculares.............................................................................................................73
Figura 7: Mecanismos da atividade antimicrobiana do eugenol (A) e ionização do
copolímero PCL-co-Eg com liberação do próton (B)........................................75
Capitulo 6
Figura. 1: Espectrofotômetro UV/Vis Cary 50 utilizado na caracterização do sistema
ε-CL:I
2
e Eg-I
2
......................................................................................................80
Figura 2: Fundamento da técnica de GPC............................................................................82
Figura 3: Equipamento para cromatografia de permeação em gel (GPC) Waters, modelo
510 utilizado neste trabalho. O equipamento pertence à Petroquímica União/
SP...........................................................................................................................83
Figura 4: O efeito de um campo magnético externo sobre o núcleo do hidrogênio.............85
Figura 5: Separação dos níveis de energia de spin para um núcleo em função de um campo
magnético externo (H
o
).........................................................................................86
Figura 6: Blindagem (H induzido) causada por elétrons circulando em torno do núcleo em
plano perpendicular ao campo externo (H
o
)..........................................................87
Figura 7: Equipamento de RMN Bruker 300 MHz (A) e Bruker 500 MHz (B) do
ICTP/CSIC. Nota-se em (B) a introdução da amostra no equipamento de
RMN...................................................................................................................89
9
Figura 8: Equipamento para análise térmica Metler TA 4000.............................................91
Figura 9: Fluxograma da técnica MEV................................................................................93
Figura 10: Microscópio eletrônico de varredura (MEV) JEOL ..........................................93
Capitulo 7
Figura 1: Processo de polimerização por abertura do anel da poli (ε-caprolactona) com o
iodo......................................................................................................................103
Figura 2: Dependência do percentual de conversão para polimerização em massa do
monômero ε–CL em PCL em função do tempo e da temperatura do sistema
reacional...........................................................................................................105
Figura 3: Espectro vibracional do PCL. . O espectro foi obtido após dispersão de 100mg da
amostra em pastilhas de KBr...............................................................................106
Figura 4: Espectro vibracional do eugenol.........................................................................106
Figura 5: Espectro vibracional do copolímero PCL-co-Eg (18%Eg).................................107
Figura 6: Análise do GPC do polímero PCL polimerizada via CTC após 121 horas de
polimerização......................................................................................................108
Figura 7: Evolução do peso molecular do polímero PCL em função do tempo................109
Figura 8: Espectro
1
H-RMN da poli(ε-caprolactona). Solvente CDCl
3
.............................113
Figura 9: Espectros
1
H-NMR do eugenol. Solvente: CDCl
3
, temperatura: 25ºC...............113
Figura 10:
Espectro
1
H-NMR do copolímero PCL-co-Eg.................................................114
Figura 11: Diagrama de Fineman-Ross para a copolimerização radicalar de Eg com ε-
CL.....................................................................................................................115
Figura 12: Termogramas para o PCL e seus copolímeros PCL-co-Eg..............................118
Figura13: Variação da temperatura de transição vítrea dos copolímeros
PCL-co-Eg em função do teor de Eg. Calculado de acordo com a equação de
Fox (A) e obtido experimentalmente (B).........................................................120
Figura 14: Micrografia de PCL e PCL-co-Eg. %Eg=10%m/m.........................................121
Figura 15: Curva de intumescimento da PCL e do copolímero PCL-co-Eg......................123
Figura 16: Curva de biodegradação da poli (ε-caprolactona)............................................125
Figura 17: Curva de biodegradação da poli (caprolactona)-co-eugenol. Porcentual de Eg no
copolímero: 6,5% (m/m)..................................................................................126
Figura 18:Análise de biodegradabilidade dos copolímeros PCL-co-Eg em solução
fisiológica (PBS 0,1 M, pH 7,4) a 37
o
C contendo 0,15% (m/V) das enzimas:
Lipase (45 U.mL
-1
) (A), colesterol estearase (40 U.mL
-1
) (B) e PBS (C)........128
Figura 19: Ensaio antimicrobiano para E.coli e S.aureus..................................................130
10
Figura 20: Resultados da inibição do crescimento bacteriano em função da concentração de
Eg para E.coli...................................................................................................131
Figura 21: Resultados da inibição do crescimento bacteriano em função da concentração de
Eg para S.aureus...............................................................................................132
Figura 22: Energia mínima local e global obtidas pelo processo de minimização e dinâmica
molecular, respectivamente..............................................................................135
Figura 23: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para os monômeros eugenol (I) e
ε-caprolactona (cadeia aberta) (II)...................................................................141
Figura 24: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para o oligômero
poli(eugenol)....................................................................................................142
Figura 25: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para o oligômero poli(ε-
caprolactona)....................................................................................................142
Figura 26: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para o copolímero alternado
PCL-co-Eg……………….…………………………………………….....…..143
Figura 27: Superfícies equipotenciais para os monômeros eugenol (A) e ε-caprolactona
(B).....................................................................................................................146
Figura 28: Superfície equipotencial 2D para os monômeros eugenol (A) e ε-caprolactona
(B)..................................................................................................................146
Figura 29: Potencial eletrostático (A) e superfície equipotencial 2D (B) para o oligômero
de poli(eugenol).............................................................................................147
Figura 30: Potencial eletrostático (A) e superfície equipotencial 2D (B) para o oligômero
de poli(ε-caprolactona)..................................................................................147
Figura 31: Potencial eletrostático (A) e superfície equipotencial 2D (B) para o copolímero
alternado PCL-co-Eg. ...................................................................................148
Figura. 32: Viabilidade celular após ensaio de citotoxicidade...........................................149
Figura 33: Variação na concentração de macrófagos no exsudato com o tempo de
implantação do copolímero de PCL-co-Eg (A) e silicone grau médico
(B)..................................................................................................................151
Figura 34: Atividade extracelular da fosfatase alcalina no exsudato de PCL-co-Eg (A) e
silicone grau médico (B) em função do tempo de implante.............................152
11
Índice de Tabelas
Capitulo 2
Tabela 1: Módulos de elasticidade de materiais sintéticos e o tecido biológico............20
Tabela 2: Parâmetros para antibioticoterapia profilática................................................32
Capitulo 4
Tabela 1: Composição da solução SBF...........................................................................59
Capitulo 6
Tabela 1: Número quântico de spin para vários núcleos atômicos..................................84
Capitulo 7
Tabela 1: Bandas de absorção relativas ao espectro FTIR do PCL ............................107
Tabela 2: Bandas de absorção relativas ao espectro FTIR do eugenol.........................108
Tabela 3: Copolimerização em massa entre Eg e ε-CL.................................................114
Tabela 4: Diâmetro padrão para alguns antimicrobianos..............................................129
12
Lista de Siglas e Unidades
MEV: microscópio eletrônico de varredura
HA: hidroxiapatita
BMU: unidade multicelular básica de remodelação óssea
IL: interleucina
TNF: fator de necrose tumoral
OPG: osteoprotegerina
PTH: paratormônio
BMP: proteína óssea morfogenética
FGF: fator de crescimento fibroblástico
PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas
ON: óxido nítrico
EGF: fator de crescimento epidérmico
Bis-GMA: bisfenol-A metacrilato de glicidila
UDMA: dimetacrilato de uretano
TEG-DMA: dimetacrilato de trietileno glicol
EDMA: dimetacrilato de etileno glicol
6-APA: ácido 6-aminopenicilâmico
PGA: penicilina G acilase
PCL: poli (ε-caprolactona)
PHB: poli (hidroxibutirato)
PHBV: poli (hidroxibutirato-co-valerato)
ASTM: American Standard for testing and Methods
PEG: poli (etilenoglicol)
PLA: poli (acido lático)
FDA: Food and Drug Administration
PVP: poli N-vinil-2-pirrolidona
NPC-mPEG: metoxi (poli etileno glicol)-p-nitrofenil carbonato
LDA: diisopropilamida de lítio
SBF: Simulated Body Fluid
PGA: poli (ácido glicólico)
Eg: eugenol
13
Gram +: gram positiva
Gram -: gram negativa
PCL-co-Eg: poli (caprolactona-co-eugenol)
CTC: complexo de transferência de carga
1
H-NMR: ressonância magnética nuclear de prótons
DSC: calorimetria exploratória diferencial
GPC: cromatografia de permeação em gel
Na
2
S
2
O
3
: tiossulfato de sódio
H: intensidade do campo magnético
E: nível de energia
h: constante de Planck
[η]: viscosidade intrínseca
η: rendimento
TMS: tetrametil silano
CDCl
3
: clorofórmio deuterado
ATCC: American Type Culture Collection
ε-CL: ε-caprolactona
Tg: temperatura de transição vítrea
QSAR: Quantitative Structure- Activity Relationship
MolM: modelagem molecular
HOMO: Highest Occupied Molecular Orbital
LUMO: Lowest Unoccupied Molecular Orbital
mg: miligrama
L: litro
mM: milimolar
M: massa molar
m: massa molecular
mL: mililitro
min: minuto
h: hora
µm: micrometro
µL: microlitro
GPa: giga pascal
MHz: mega hertz
14
cal: caloria
Hz: hertz
ppm: partes por milhão
ºC: grau Celsius
kg: quilograma
µmol: micromol
mmol: milimol
15
Sumário
1. OBJETIVOS DO PRESENTE TRABALHO.........................................................01
1.1 Proposição da utilização do copolímero PCL-co-Eg em odontologia.......................01
1.2 Objetivos....................................................................................................................02
2. INTRODUÇÃO.........................................................................................................04
2.1 A fisiologia óssea.......................................................................................................04
2.2 Remodelação e reparo ósseo......................................................................................09
2.3 Histórico e caracterização de materiais aloplásticos para implantes.........................15
2.4 Infecção hospitalar e os polímeros com atividade antimicrobiana............................26
2.5 Considerações finais..................................................................................................34
2.6 Referências................................................................................................................35
3. APLICAÇÕES DE POLÍMEROS BIODEGRADÁVEIS EM MEDICINA /
ODONTOLOGIA....................................................................................................40
3.1 Considerações finais..................................................................................................51
3.2 Referências................................................................................................................53
4. POLI (CAPROLACTONA) – GENERALIDADES...............................................55
4.1 Constituição química e métodos de síntese...............................................................55
4.2 Principais utilizações do PCL na medicina/odontologia...........................................57
4.3 Propriedades biodegradáveis da poli (caprolactona).................................................60
4.4 Utilização da poli (ε-caprolactona) conjugada com agentes antimicrobianos...........62
4.5 Considerações finais..................................................................................................64
4.6 Referências................................................................................................................65
5. EUGENOL : OBTENÇÃO E APLICAÇÕES........................................................68
5.1 Histórico sobre a utilização do eugenol.....................................................................68
5.2 Atividade antimicrobiana do eugenol........................................................................74
5.3 Considerações finais..................................................................................................77
5.4 Referências................................................................................................................78
6. EXPERIMENTAL
6.1 Síntese do copolímero PCL-co-Eg...........................................................................79
6.2 Caracterização Físico-Química
6.2.1 Cromatografia de Permeação em gel......................................................................81
6.2.2 Ressonância Magnética Nuclear de prótons (
1
H-NMR) ........................................83
16
6.2.3 Análise Térmica (DSC)..........................................................................................89
6.2.4 Microscopia Eletrônica de varredura (MEV).........................................................92
6.3 Caracterização Bioquímica
6.3.1 Difusão de fluido biológico....................................................................................94
6.3.2 Degradação “in vitro”.............................................................................................94
6.3.3 Estudo da atividade antimicrobiana........................................................................95
6.3.4 Citotoxicidade.........................................................................................................96
6.3.5 Hiperemia...............................................................................................................98
6.4 Referências..............................................................................................................100
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................102
7.1 Porcentual de conversão de polimerização do monômero ε-CL a PCL..................102
7.2 Análise da composição dos copolímeros obtidos....................................................110
7.3 Caracterização Físico-Química do Copolímero PCL-co-Eg
7.3.1 Temperatura de transição vítrea (Tg) do sistema PCL-co-Eg..............................117
7.3.2 Microscopia eletrônica de varredura....................................................................121
7.4 Caracterização bioquímica
7.4.1 Difusão de fluido fisiológico (intumescimento)...................................................122
7.4.2 Biodegradabilidade...............................................................................................124
7.4.3 Hidrólise enzimática.............................................................................................127
7.4.4 Atividade antimicrobiana.....................................................................................129
7.4.5 Relação estrutura química e atividade biológica..................................................133
7.4.6 Citotoxicidade.......................................................................................................148
7.4.7Atividade hiperêmica do copolímero PCL-co-Eg.................................................150
7.5 Considerações finais................................................................................................153
7.6 Referências..............................................................................................................154
8. CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................................155
9. PERSPECTIVAS FUTURAS.................................................................................156
17
1. OBJETIVOS DO PRESENTE TRABALHO
1.1 Proposição da utilização do copolímero PCL-co-Eg em odontologia
A crescente demanda por materiais que possam ser utilizados como enxertos para o
reparo ósseo tanto na medicina quanto na odontologia incentiva continuamente as
pesquisas na área de biomateriais.
Defeitos ósseos gerados por traumatismos, cistos e tumores ou doenças
periodontais ocasionam dificuldades tanto funcionais quanto estéticas, comprometendo a
saúde física e emocional do paciente. Traumas podem acarretar em fraturas mandibulares
que impossibilitam a fala e a mastigação, assim como cistos e tumores na região maxilar
e/ou mandibular levam a perdas ósseas que podem culminar em deformações faciais.
A inflamação dos tecidos moles adjacentes aos elementos dentais (gengivite)
quando não controlada e monitorada evolui para um quadro de comprometimento ósseo
(periodontite) que pode ocasionar até mesmo em perda local ou generalizada dos
elementos dentais.
Figura 1.1: Aspecto clínico da gengivite (A) e periodontite evidenciando exposição
radicular por perda óssea (B).
As chamadas doenças periodontais já constituem a maior causa de perdas dentárias
em pacientes em idade adulta, segundo a Organização Mundial de Saúde. A reposição
(A)
(B)
18
óssea nesse caso evitaria a perda dentária e criaria um suporte ósseo suficiente para casos
em que é necessária a utilização de implantes para o suporte de próteses.
O copolímero poli (ε-caprolactona)-co-eugenol visa conduzir a formação óssea
fornecendo um arcabouço macroporoso que abrigue células osteoprogenitoras e
simultaneamente apresente características antimicrobianas, garantindo o prognóstico
favorável do enxerto e biodegrabilidade suficiente para que seja substituído pelo tecido
ósseo neoformado, não necessitando de procedimento operatório posterior para sua
retirada.
1.2 Objetivos
O presente trabalho tem por objetivo caracterizar e avaliar as características físico-
químicas e bioquímicas do copolímero PCL-co-Eugenol.
Através da investigação de suas propriedades antimicrobianas, de biodegradação e
citotoxicidade buscamos avaliar a viabilidade de sua utilização na odontologia em casos
clínicos em que seja requerido reparo ósseo nos quais o copolímero atuaria como um
arcabouço para a sustentação da neoformação do tecido ósseo. Os objetivos específicos
deste trabalho são:
A) Investigar a síntese e a caracterização do copolímero poli (ε-
caprolactona-co-eugenol).
B) Obter um copolímero de PCL bioativo quanto às suas propriedades
antimicrobianas.
C) Investigar o comportamento biocompatível do copolímero poli (ε-
caprolactona-co-eugenol) obtido neste trabalho.
D) Analisar a biodegradabilidade do copolímero em condições in vitro.
Em função dos objetivos acima explicitados, uma revisão de literatura no sentido de
abordar tópicos que ressaltam a importância deste trabalho para a área de biomateriais será
abordada nos capítulos seguintes.
Neste sentido, no capítulo 2 é abordada a fisiologia do tecido ósseo bem como a
necessidade de desenvolver-se polímeros adequados para sua regeneração.
Os capítulos 3 e 4 tratam do desenvolvimento de polímeros biodegradáveis,
especialmente as aplicações do polímero poli (ε-caprolactona) na medicina. A necessidade
19
de um polímero com propriedades antimicrobianas é enfatizada nos capítulos
anteriormente citados.
O capítulo 5 aborda a utilização de um principio bioativo natural na obtenção de
copolímeros com atividade antimicrobiana.
Nos capítulos 6 e 7 apresenta-se o desenvolvimento deste trabalho a nível
experimental e as discussões decorrentes da interpretação dos principais resultados obtidos.
Procurou-se ao final de cada capítulo apresentar as considerações finais de modo a
favorecer o elo entre teoria e experimento, bem como as ligações entre estes tópicos e a
literatura pertinente à área de biomateriais até este momento.
20
2.INTRODUÇÃO
2.1 A fisiologia óssea
O tecido ósseo é constituído por uma porção orgânica (células ósseas e matriz
orgânica) e uma matriz inorgânica. São células ósseas os osteoblastos, osteócitos,
osteoclastos e células osteoprogenitoras.
Os osteoblastos são responsáveis pela síntese da matriz colágena (colágeno e
proteoglicanas). O colágeno é a proteína mais abundante do organismo humano e tem
fundamental importância na constituição da matriz extracelular do tecido conjuntivo. As
proteoglicanas são macromoléculas formadas por associações entre proteínas (como por
exemplo, o colágeno) e glicosaminoglicanas. As proteoglicanas e as glicosaminoglicanas
participam dos processos de migração e interação celular. A Figura 1 ilustra a estrutura da
proteoglicana constituída pelas glicosaminoglicanas sulfato de queratina e sulfato de
condroitina.
1,2
Figura. 2.1: Estrutura da proteoglicana.
sulfato de queratina
proteína central
região de ligação
sulfato de condroitina
subunidade de proteoglicana
Agregado de proteoglicana
Ácido hialurônico
Proteína de ligação
Sulfato de queratina
Sulfato de condroitina
Proteína central
subunidades
21
Os osteoblastos são encontrados nas regiões periféricas e superficiais dos ossos
adultos. Após a deposição da matriz óssea os osteoblastos que permanecem presos em seu
interior são denominados osteócitos (Figura 2).
1,2
Figura 2.2: Corte histológico evidenciando osteoblastos, osteócitos e periósteo no tecido
ósseo.
3
A reabsorção do tecido ósseo é função dos osteoclastos (Figura 3). Algumas
organelas presentes nessas células (os lisossomos) liberam enzimas para o exterior
resultando em um ambiente propício para a reabsorção da parte mineral pela ação de
enzimas.
As células osteoprogenitoras são encontradas na medula óssea e no periósteo e
originam outras células da linhagem medular.
1,2
periósteo
osteócito
osteoblasto
canal de Havers
22
Figura 2.3: Corte histológico evidenciando osteoclastos e osteócitos no tecido ósseo.
4
A matriz óssea inorgânica é constituída principalmente por cálcio e fósforo
organizados em uma estrutura cristalina denominada hidroxiapatita [Ca
10
(PO
4
)(OH
2
)].
(Figura 4).
Figura 2.4: Micrografia obtida por microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
partículas de hidroxiapatita.
5
A deposição de HA se dá ao longo das fibras de colágeno e essa associação é
responsável pela dureza do tecido ósseo.
No processo de remodelagem óssea as células responsáveis pela reabsorção,
formação e mineralização do tecido ósseo são os osteoclastos. São células grandes,
multinucleares, formadas na medula óssea. Quando estimuladas aparecem na superfície do
23
osso, secretando enzimas que reabsorvem a matriz óssea liberando cálcio para a corrente
sanguínea. Após a reabsorção os osteoclastos dão lugar aos osteoblastos para a formação
de um novo osso. Os osteoblastos imersos na matriz do tecido ósseo neoformado passam a
se chamar osteócitos e levam nutrição ao osso.
1, 2,6
O tecido ósseo é subdividido em osso cortical e osso trabecular. O primeiro é
composto por sistema de Havers (Figura 6), um canal central envolto por lamelas
concêntricas de tecido ósseo composta por colágeno I mineralizado. Perpendicularmente
aos canais de Havers estão os canais de Volkmann (Figura 6) por onde passam veias e
artérias transportando O
2
e nutrientes ou coletando CO
2
e resíduos metabólicos.
1,6
Por ser a proteína mais abundante no organismo humano e exercer diferentes
funções, o colágeno (Figura 5) é diferenciado em mais de 20 subtipos. O colágeno I é o
mais comum deles, está presente nos tendões, cartilagem fibrosa, tecido conjuntivo sob a
forma de fibras e feixes constituindo ossos, tendões e pele.
.
Figura 2.5: Estrutura do colágeno.
7
24
Figura 2.6: Corte histológico evidenciando canais de Havers e Volkmann.
8
O osso trabecular constitui a porção interior do osso. Trabéculas formam um
mosaico com muitos osteoplastos nos quais se localizam os osteócitos. No interior do osso
trabecular encontra-se a medula óssea exercendo a função de regulação mineral e sendo
subdividida em vermelha, amarela e branca. A medula vermelha produz células sanguíneas
e osteoprogenitoras e após certa idade fica confinada no interior dos ossos longos (fêmur e
úmero). Já a medula amarela aparece no tecido ósseo após a adolescência e é formada por
tecido adiposo.
9
Figura 2.7: Corte do osso mandibular humano evidenciando as porções trabecular (A) e
cortical (B).
10
B
A
25
2.2 Remodelação e reparo ósseo
11-18
O osso é um tecido extremamente ativo, sendo que no esqueleto em
desenvolvimento essa atividade é primariamente voltada para o crescimento e a modelação
óssea, processos pelos quais o osso atinge sua forma e seu tamanho. No adulto, a atividade
metabólica envolve predominantemente a remodelação.
A remodelação óssea é definida como um processo de aposição no qual há remoção
localizada do osso antigo (reabsorção) e substituição por osso recentemente formado. Esse
evento continua por toda a vida adulta do indivíduo, sendo responsável pela renovação do
esqueleto e mantendo sua integridade anatômica e estrutural.
A remodelação óssea é um processo fisiológico constante no qual a formação óssea
é correspondente à reabsorção, sendo regulada por diversos fatores, como mecanismos
regulatórios intracelulares, influência hormonal, fatores locais e externos.
O processo de remodelação ocorre em pequenos conjuntos de células chamadas de
unidades multicelulares básicas de remodelação óssea (BMU), sendo caracterizado pelo
acoplamento das funções dos osteoclastos e osteoblastos. Cada unidade é geográfica e
cronologicamente separada de outros conjuntos, sugerindo que a ativação de seqüência de
ocorrências celulares responsáveis pela remodelação seja também controlada localmente
por fatores gerados no microambiente ósseo.
O sinal que inicia a remodelação óssea não está completamente identificado, mas é
evidente que forças mecânicas podem ser capazes de alterar a arquitetura óssea local. O
primeiro estágio da remodelação envolve o recrutamento das células precursoras de
osteoclasto para osso. Essas, presentes em tecidos hematopoéticos, como na medula óssea,
respondem a sinais físicos e hormonais, e, concentrando sobre determinada região da
superfície óssea que será reabsorvida, fundem-se e transformam-se em osteoclastos
multinucleados.
Recentes evidências têm sugerido que o osteoclasto é uma célula secretora que
produz fatores que podem estimular sua própria formação e atividade. Estudos
demonstraram que células osteoclásticas, formadas em cultura de células medulares de
pacientes com doença de Paget, produzem IL-6 capaz de estimular a formação de
osteoclastos e a reabsorção óssea.
A diferenciação de células progenitoras em osteoclastos ocorre por meio de um
mecanismo que envolve a interação célula a célula com células osteoblásticas. Após a
26
diferenciação , a superfície óssea é preparada com a remoção da camada de osteóide não-
mineralizado pelos osteoblastos de revestimento que produzem enzimas proteolíticas,
como as metaloproteinases, colagenases e gelatinases. Esse processo facilita o acesso dos
osteoclastos ao osso subjacente.
A osteoprotegerina (OPG), receptor ativador de fator de necrose tumoral (NF-
kB[RANK]), e a citocina RANK ligante (RANKL) têm sido identificadas como os
principais fatores envolvidos na gênese de osteoclastos. A RANK localiza-se na superfície
de precursores de osteoclastos e de osteoclastos maduros, enquanto a RANKL é uma
proteína pertencente à família do TNF (fator de necrose tumoral). Seu principal papel é a
inibição da apoptose dos osteoclastos e a estimulação da diferenciação e ativação dessas
células. A OPG pode atuar inibindo a RANKL por meio da ligação com RANK e também
diretamente, por meio de outros receptores presentes nos osteoclastos. Seus efeitos são
antagônicos aos da RANKL. Diversas citocinas e compostos, como os estrógenos,
influenciam a gênese dos osteoclastos por meio da regulação da produção de
RANKL/OPG pelas células estromais e pelos osteoblastos. O próximo passo consiste no
reconhecimento das proteínas da matriz óssea extracelular por meio de proteínas de
membrana celular chamadas integrinas. A seguir são formadas a borda vilosa e as zonas
claras, essas livres de organelas e ricas em filamentos de actina. Através das zonas claras
TD0orgalT.1(m)7.3(adaG poutradaso dõvref lois), sp coáv )]TJc0.113 0 TD0.0003 Tc020747 TwemaiG peD0oistisenrigação célu/o s es9(a e a)-5.8( )]TJc0.115 -1.725 TD0.0007 Tc0.0789 Twe pe isol camderntol pdeosteobdeoo osasfiretam drect9(a a céluN da célues.1(m)7. A seida, e a6.2(m)9.8( )]TJ-1911 -1.725 TD0.0004 Tc234096 Twfanese de abursgaç, dos osteoclastoe atis )]TJ7.2465 0 TD0.0007 Tc233753 Twdntos gr3(acam)8.ire(entodas cp cesentecam)8.i(r)-1.nnriinos
27
proliferarem e a sintetizar proteínas da matriz. Em seguida, ao completarem o ciclo da
reabsorção, secretam proteínas que servirão de substrato para a fixação do osteoblasto.
Os osteoclastos sofrem apoptose, possivelmente induzida pelo fator de crescimento
transformante beta (TGF-beta), responsável também pelo bloqueio da reabsorção óssea e
pela atração dos osteoblastos. Ao contrário do TGF-beta, o PTH e a 1,25(OH)
2
D
3
inibem a
apoptose in vitro do osteoclasto.
Em próximo estágio, denominado fase de reversão, células mononucleares da
linhagem monócitos e macrófagos preparam a superfície para novos osteoblastos iniciarem
a formação óssea, produzindo uma glicoproteína à qual os osteoblastos podem aderir.
Caracterizando a fase seguinte, a formação óssea resulta de complexa cascata de eventos
que envolvem a proliferação de células mesenquimais primitivas, diferenciação em células
precursoras osteoblásticas (pré-osteoblasto), maturação dos osteoblastos, formação de
matriz e mineralização.
Os osteoblastos são células que sintetizam a parte orgânica da matriz óssea. São
capazes de concentrar fosfato de cálcio, participando da mineralização do osso. Os
produtos de secreção dessas células são: fosfatase alcalina, ácido hialurônico, sulfato de
condroitina, osteopontina, osteonectina, sialoproteína óssea, pró-colagenase, ativador de
plasminogênio e proteína morfogenética do osso (BMP), entre outras. Essas células
possuem receptores para diversos fatores, como PTH, glicocortcóides, hormônio do
crescimento (GH), além de IL-1, TNF-alfa, prostaglandinas e fator de crescimento
semelhante à insulina (IGF), além de receptores para hormônios sexuais. Dispõem-se nas
superfícies ósseas, lado a lado, em arranjo que lembra um epitélio simples. Quando em
intensa atividade sintética, são cubóides e, em estado pouco ativo, tornam-se achatados. Os
osteoblastos convergem para o fundo da cavidade de reabsorção e formam espessa camada
de osteóide. As células gradualmente se achatam, tornando-se quiescentes. Uma vez
aprisionado pela matriz recém-sintetizada, o osteoblasto passa a ser chamado de osteócito.
Os osteoblastos se proliferam mediados por fatores de crescimento liberados pelos
próprios osteoblastos e pelo osso durante o processo de reabsorção. Entre os mais
importantes estão o TGF-beta e os fatores liberados pela matriz óssea, como o IGF-I e II, o
fator de crescimento fibroblástico (FGF) e o fator de crescimento derivado de plaquetas
(PDGF). Pode ser que esses fatores auxiliem na formação óssea, também impedindo a
apoptose osteoblástica.
Ao sintetizarem novo colágeno e outras proteínas de matriz, preenchendo a
cavidade de reabsorção com osteóide lamelar novo, a deposição mineral inicia-se
28
subseqüentemente e prolonga-se durante vários dias, tempo suficiente para que o colágeno
forme suas pontes de ligação. Apenas poucos osteoblastos permanecem presos à matriz em
mineralização, transformando-se em osteócitos, enquanto a maioria sofre apoptose. O fim
da atividade osteoblástica pode ser devido à inibição por feedback negativo ou à indução
da apoptose do osteoblasto pelo TNF liberado pelas células medulares vizinhas.
Entre os fatores de crescimento encontrados no osso, alguns são produzidos pelas
células ósseas, como IGF,TGF,FGF,PDGF e BMP. Outros, como IL-1 e TNF-alfa, são
produzidos por tecidos relacionados. Os fatores de crescimento, portanto, exercem função
sobre as células ósseas de forma autócrina ou parácrina e não endógena. São produzidos
por células ósseas, células adjacentes vasculares e hematopoéticas. A ligação desses
fatores, como as citocinas, aos receptores de membrana celular gera um sinal ao núcleo,
que resulta na transcrição de genes específicos. As IL-1 e 7, assim como o TNF-alfa
estimulam a reabsorção e inibem a formação óssea, enquanto as IL-6 e 11 também
estimulam a reabsorção, mas também a formação, e as IL-4, 13 e 18 inibem apenas a
reabsorção óssea. Prostaglandinas, leucotrienos e óxido nítrico (ON) são fundamentais na
resposta rápida do osso a ações mecânicas e inflamatórias. As primeiras têm efeitos
bifásicos na reabsorção e formação, mas o efeito predominante é estimulador. O ON inibe
os osteoclastos , enquanto os leucotrienos estimulam a reabsorção óssea.
Sistematicamente, a função das células ósseas é alterada principalmente pelos
hormônios reguladores do metabolismo de cálcio: PTH, vitamina D e calcitocina. Outros
hormônios também interferem no metabolismo ósseo, entre eles GH, glicocorticóides,
hormônios tireoidianos e sexuais.
Além das excelentes propriedades mecânicas, o osso revela um potencial único para
reparação. O tecido ósseo é capaz de reparar fraturas ou defeitos locais por meio do
processo de regeneração, com a formação de novo tecido com a mesma organização
estrutural do tecido anterior, sem a formação de cicatriz.
Após uma lesão óssea, uma seqüência de eventos dinâmicos ocorre com o objetivo
de restaurar a forma e função do osso. Muitos desses mecanismos biológicos celulares
ainda não foram completamente identificados, porém sabe-se que o processo é ativado pela
liberação de fatores de crescimento e citocinas no local.
A reparação óssea é semelhante tanto para pequenas quanto para grandes injúrias,
para fraturas ósseas e para defeitos cirúrgicos. Quando um osso é lesado o periósteo, vasos
na cortical, medula e tecidos circundantes são rompidos. Ocorre um sangramento oriundo
das margens do tecido ósseo lesado e dos tecidos moles vizinhos, sendo formado um
29
hematoma ou coágulo sanguíneo dentro do canal medular, entre as extremidades da fratura
óssea e o periósteo.
O coágulo que ocorre após a fratura consiste em extravasamento de eritrócitos,
fibrina e plaquetas, que liberam PDGF, FGF e TGF-alfa, fatores quimiotáticos e
reguladores da atividade celular. Para que o reparo se inicie, o coágulo sanguíneo e os
restos celulares e da matriz devem ser removidos pelos macrófagos. Simultaneamente à
formação do coágulo, o tecido imediatamente adjacente à fratura se necrosa. Esse tecido
necrótico estimula intensas respostas inflamatórias, caracterizadas por vasodilatação e
exsudação do plasma, leucócitos e células mesenquimais.
Aproximadamente do terceiro ao quinto dia após a fratura, o periósteo e o endósteo
respondem com intensa proliferação, formando um tecido conjuntivo muito rico em células
osteogênicas, o qual constitui um colar em torno da fratura e penetra entre as extremidades
ósseas rompidas, sendo denominado calo fibroso. Células endoteliais derivadas dos tecidos
circunjacentes migram, proliferam-se e formam novos capilares que penetram no
hematoma. O estímulo para essa nova formação vascular parece ser a hipóxia local. A
angiogênese ocorre em direção a um gradiente químico, que pode ser estabelecido pela
hipóxia e pela concentração de quimiotáticos, como PDGF e FGF.
Osteoblastos de dentro do calo sintetizam colágeno e matriz, portanto, nesse anel ou
colar conjuntivo, bem como no conjuntivo que se localiza entre as extremidades ósseas
fraturadas, surge tecido ósseo imaturo, tanto pela ossificação endocondral de pequenos
pedaços de cartilagem que se formam, como também por ossificação intramembranosa.
Esse processo evolui de modo a aparecer, após algum tempo, o calo ósseo, o qual é
constituído de tecido ósseo imaturo, que se formou de modo desordenado, caracterizado
por arranjo irregular dos osteócitos e orientação irregular das fibras colágenas.
Enquanto o processo de reparo continua, ocorre remodelação óssea, o calo se torna
desnecessário, sendo reabsorvido, e as trabéculas são formadas e orientadas ao longo de
linhas de esforços e se tornam funcionais. A velocidade desse processo depende de alguns
fatores locais e sistêmicos, entre eles o tipo de tecido ósseo a ser reparado (cortical ou
esponjoso), presença de infecção, hemorragias, imobilização local, idade e alterações
nutricionais.
Em locais com excessiva mobilidade, pode ocorrer o desenvolvimento de
cartilagem, tecido que possui menos exigências metabólicas do que o osso. Quando o
tecido é imobilizado, o reparo ocorre por meio de formação óssea primária. Durante esse
processo dinâmico, as células ósseas não atuam isoladamente. Elas são reguladas por
30
interações sistêmicas, realizadas pelo sistema endócrino, por meio da liberação de diversos
hormônios: PTH, calcitocina, insulina, GH, hormônios esteróides e da tireóide.
Localmente, certos fatores de crescimento foram identificados, como PDGF, IL-1,
FGF, TGF-alfa e beta, fator de crescimento epidérmico (EGF), entre outros. Os PDGF
induzem tanto fibroblastos quanto fibras musculares a se proliferarem. Também são
quimiotáticos para leucócitos e fibroblastos. A IL-1 estimula os fibroblastos a se
proliferarem e a produzirem colágeno e controla o crescimento das células endoteliais. Os
FGF são da família dos que estimulam o endotélio vascular, os fibroblastos e as fibras
musculares lisas e induzem a formação de novos vasos. O TGF-alfa influencia o TGF-beta
quanto ao índice de proliferação de muitas células. O EGF é mitogênico para células
mesenquimais (osteoblastos) e epiteliais.
Certos componentes da matriz extracelular regulam a proliferação e a quimiotaxia e
são chamadas moléculas de adesão do substrato. Uma dessas moléculas, a fibronectina,
produzida por fibroblastos, macrófagos e células endoteliais exerce diversos efeitos no
processo de reparação. A fibronectina é adesiva e parece facilitar a migração de células
inflamatórias para dentro da ferida, juntamente com o gel de fibrina/fibronectina. Além
disso, estimula a liberação de FGF pelos macrófagos, sendo quimiotática para essas células
e também para fibroblastos. Outras moléculas de adesão incluem tenascina, laminina,
heparan-sulfato e colágeno tipos IV, V e VI.
É fato bem conhecido na medicina e odontologia que as falhas ósseas de grandes
dimensões são difíceis de serem tratadas e que se deixadas ao seu livre curso, não
lograriam regenerar-se ou o fariam muito lentamente e de forma incompleta. Situações
dessa natureza beneficiam-se do uso de biomateriais para reconstrução, substituição ou
preenchimento dos defeitos, e as soluções mais previsíveis ainda não são obtidas com a
utilização dos enxertos ósseos. Esses enxertos têm inconvenientes como a morbidade
cirúrgica da fonte doadora e a disponibilidade limitada de material (enxertos ósseos
autógenos) além de apresentarem ainda riscos de transmissão de infecção e de ativação
imunológica do hospedeiro e a desvantagem dos altos custos dos bancos de ossos (enxertos
homógenos e heterógenos). Em vista disso, têm-se intensificado as pesquisas para o
desenvolvimento de materiais aloplásticos que apresentem características adequadas de
biocompatibilidade e osseointegração.
31
2.3 Histórico e caracterização de materiais aloplásticos para implantes
A utilização de materiais sintéticos para a restauração de uma função biológica
desejada precede a Idade Contemporânea. Tem-se observado na história da ciência relatos
interessantes sobre a utilização de próteses primitivas cuja função não corresponde a de um
biomaterial na íntegra, mas que cumprem no entanto função estética. Cita-se, por exemplo,
Tycho Brahe, astrônomo dinamarquês que ao duelar contra o matemático Manderup
Parsberg em 1566, perdeu o nariz. Passou a usar então uma prótese metálica, liga de ouro e
prata. Tratava-se de uma prótese bastante primitiva simplesmente fixada por uma espécie
de resina que, conta a história, Tycho sempre carregava consigo por não se tratar,
obviamente, de uma prótese permanente.
19-21
A crescente necessidade da utilização de implantes se dá em função da demanda
tanto funcional quanto estética advinda dos pacientes, uma vez que já não é mais suficiente
a reposição de elementos perdidos, cresce cada vez mais a demanda por materiais que
supram funções e devolvam a estética perdida da maneira a mais minuciosa possível.
Na prática odontológica está cada vez mais distante da realidade dos pacientes a
simples extração dentária, atualmente requer-se a reposição dos elementos dentários
perdidos de tal maneira que a estética não seja comprometida e que a função seja
restabelecida o mais permanentemente possível, daí o desenvolvimento de próteses
implanto-suportadas. Para que esses implantes sejam realizados é necessário que o tecido
ósseo adjacente tenha volume e características adequadas e seja reposto ou que tenha sua
neoformação estimulada quando necessário.
Inicialmente, os materiais utilizados na realização de implantes podem ser
classificados de acordo com sua origem ou através dos princípios da fisiologia óssea.
Quanto aos tipos de materiais utilizados, os implantes dividem-se em biológicos ou
sintéticos. Por sua vez, os implantes biológicos subdividem-se em autógenos, alógenos e
xenógenos.
Em implantes autógenos o material enxertado é do próprio paciente. Apesar de ser
uma das melhores técnicas, tem como desvantagens a necessidade de uma segunda
intervenção cirúrgica e o fato de muitas vezes o tecido biológico não poder ser obtido em
quantidade suficiente. Como exemplos dos materiais biológicos, citamos a crista do ilíaco,
costelas e a sínfise da mandíbula.
22,23
32
Quando o material a ser enxertado advém de outro indivíduo da mesma espécie,
geralmente através de bancos de tecidos biológicos temos o implante alógeno.
Recentemente um belo exemplo desta técnica foi apontado pela literatura médica,
destacando-se a reconstrução parcial do rosto de pacientes restaurando-se tanto a
biofuncionalidade quanto o convívio social.
24
A Figura 8 ilustra este recente avanço
alcançado pela prática médica com a face recém implantada da francesa Isabelle Dinoire
receptora do primeiro transplante de rosto do mundo. Neste caso, a paciente recebeu tecido
mole para preenchimento de parte da porção inferior da face, na região que compreende
desde a base do nariz até a sínfise mandibular.
Figura 2.8: Paciente com parte da face transplantada segundo os princípios do enxerto
alógeno.
24
A principal desvantagem do enxerto alógeno é a rejeição, requerendo
medicamentos que controlem a reação do sistema imunológico. Os imunossupressores
mais utilizados na prática médica atualmente são a Ciclosporina (Sandimun Neoral®),
Prednisona( Meticorten®),Tacrolimus ( Prograf® ), Micofenolato Mofetil (Cellcept®),
Rapamune â (Sirolimus).
25
As estruturas químicas desses fármacos são apresentadas na
Figura 9.
33
Figura 2.9: Estrutura química dos fármacos utilizados no controle da rejeição pós-implante
alógeno: ciclosporina (A), prednisona (B), tacrolimus (C), micofenolato mofetil
(D) e rapamune â (E)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
34
O sistema imunológico reconhece o implante como um corpo estranho ao
organismo e desencadeia, em reação, uma resposta mediada por anticorpos.
Entre as células que normalmente são encontradas nos gânglios linfáticos destacam-
se os linfócitos e as células apresentadoras de antígenos, que reconhecem substâncias
estranhas ao corpo. Essas células estimulam os linfócitos T
4
ou auxiliadores a produzirem
inúmeras substâncias capazes de estimular outros linfócitos T e outras importantes células
de defesa. Essas substâncias são as interleucinas e os interferons. Algumas interleucinas
estimulam os linfócitos B, que se transformam em plasmócitos, células produtoras de
anticorpos (ou imunoglobulinas), proteínas presentes no plasma sangüíneo.
Os anticorpos agem por diferentes mecanismos de ação; ligando-se à superfície de
uma bactéria com capacidade própria de destruí-la, recobrindo bactérias encapsuladas e
por isso não fagocitadas por neutrófilos e macrófagos tornando-as susceptíveis à
fagocitose, recobrindo as mucosas, como as das vias aéreas e as do tubo digestivo, podem
impedir que os agentes infecciosos as atravessem.
26
O risco de rejeição pós-implante é permanente, embora seja significativamente
maior nas primeiras semanas após o ato cirúrgico. O avanço dos tratamentos
quimioterápicos levou a uma grande diminuição nos índices de rejeição direcionando o
tratamento pós-transplante para a melhora da saúde em longo prazo e a sobrevida do órgão
transplantado, reduzindo ainda os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras mais
tóxicas.
Complicações a longo prazo e efeitos colaterais associados às drogas
imunossupressoras mais tóxicas incluem a elevação dos níveis de colesterol, pressão alta e
insuficiência renal.
27
Esses medicamentos também estão associados a problemas como o
diabetes e os efeitos colaterais no metabolismo, como falência renal em pacientes que
tiveram outros órgãos transplantados, podendo levar à necessidade de um segundo
transplante.
27-29
O tratamento imunossupressor objetiva minimizar a rejeição e a inflamação
prevenindo a rejeição aguda. Novas pesquisas concentram-se em permitir que as dosagens
de drogas mais tóxicas possam ser reduzidas sem que aumentem os riscos da rejeição
aguda, minimizando a ocorrência de efeitos colaterais, inclusive insuficiência cardíaca e
renal.
30-32
35
Adicionalmente aos efeitos colaterais causados pela terapia medicamentosa,
existem as complicações associadas à transmissão de doenças infecto-contagiosas devido
ao potencial antigênico do material a ser implantado.
No enxerto xenógeno, o material é oriundo de um organismo de espécie diferente,
como por exemplo, matriz orgânica de osso bovino e osso desproteinado, já amplamente
comercializado no Brasil (Figura 10).
Figura 2.10: Materiais empregados no enxerto xenógeno: matriz mineral de osso bovino
PRO-BONE
®
(A) e Gen-Ox (B), matriz orgânica de osso bovino (C).
A metalurgia é uma das ciências mais antigas da humanidade, sendo fácil entender
a razão do domínio do homem sobre o metal quando se consideram as cruzadas. As
próteses mais primitivas de que se têm notícia eram, na sua maioria, metálicas, fabricadas
normalmente a partir do ouro, um metal nobre e de fácil processamento. A primeira
(A)
(B)
(C)
36
referência de restauração craniana na neurocirurgia utilizando-se metal data do século
XVII, quando Fallopius implantou uma placa de ouro para restaurar um defeito craniano.
33
Apesar de alguns metais, como o titânio e suas ligas, considerados biocompatíveis,
serem utilizados na prática odontológica, algumas características dos metais limitam sua
aplicação como material implantável. Alguns metais são susceptíveis à corrosão e os
produtos gerados podem, muitas vezes, ser tóxicos ao organismo humano. Os valores do
módulo de elasticidade são muito superiores aos do osso não permitido muitas vezes que
esse tecido receba estímulo mecânico. A Tabela 1 mostra os valores do módulo de
elasticidade de alguns biomateriais e do osso.
34-36
Tabela 2.1: Módulos de elasticidade de materiais sintéticos e o tecido biológico
34-36
Módulo de elasticidade (GPa)
Osso 13,6 a 35
Dentina 6,9 a 48
Ligas de Alumínio 69
Titânio 105 a 120
Vidro bioativo 80
Em odontologia os metais são utilizados principalmente na confecção de próteses e
podem ser instalados tanto internamente à raiz dental como revestindo a própria coroa dos
dentes. As ligas metálicas utilizadas para essas aplicações normalmente são compostas por
80% Ag, 19% Sn e 1% Cu (Pratalloy
®
, Dentsply).
Os pinos metálicos são comumente utilizados para prover suporte mecânico e
estabilidade às coroas protéticas a serem posteriormente instaladas. Esses pinos são
cimentados no canal radicular previamente tratado e são de fundamental importância em
casos clínicos em que a coroa dental encontra-se total ou parcialmente destruída. O preparo
do canal e a instalação do pino devem ser criteriosamente executados pelo profissional
para eliminar os riscos de que o próprio pino metálico provoque a fratura da raiz dental.
Esse tipo de iatrogenia acarreta em perda não só da prótese como da raiz do elemento. A
dureza do pino metálico e seu alto módulo de elasticidade exigem uma conduta cautelosa
do profissional na execução do processo e instalação do pino a fim de evitar os danos à raiz
dental remanescente.
37
Outra aplicação importante das ligas metálicas na odontologia é a confecção de
coroas metálicas. Quando a coroa dentária encontra-se total ou parcialmente destruída por
fratura ou ocorrência de cárie pode já não haver mais tecido para suportar uma restauração
direta (executada em consultório pelo profissional através da inserção do material
restaurador). O primeiro material a ser utilizado para a confecção de coroas protéticas foi o
metal devido à sua resistência mecânica capaz de suportar as cargas mastigatórias a que os
dentes estão expostos. Uma coroa protética é confeccionada em laboratório a partir de um
modelo obtido após o preparo do elemento dental pelo cirurgião-dentista.
A crescente demanda por melhorias estéticas fez com que novos materiais fossem
desenvolvidos e otimizados para o uso em odontologia. Ainda no século XIX são descritos
relatos de estudos a cerca de incrustações de porcelana a serem utilizadas com finalidade
estética. O método era baseado na trituração e adaptação da porcelana em dentes naturais
preparados, mas só houve a utilização da porcelana como material restaurador
efetivamente nas últimas décadas do século XX.
A porcelana apresenta hoje estética satisfatória, compatibilidade com os tecidos
moles, condutibilidade térmica baixa e insolubilidade diante dos fluidos bucais. Por outro
lado, a contração do material, a friabilidade sob esforços oclusais diretos, além do alto
custo, são desvantagens que acabam tornando a porcelana um material com algumas
limitações para a prática odontológica.
Na década de 60, Bowen desenvolveu um composto formado pelo Bis-GMA
(Bisfenol-A metacrilato de glicidila), matriz orgânica com partículas de carga silanizadas
que apresentava alto peso molecular e menor contração de polimerização, embora ainda
exibisse alto risco de infiltração marginal.
37,38
A partir da década de 80 houve o surgimento
das resinas fotopolimerizáveis , que representaram um avanço entre os materiais
restauradores odontológicos. Além de garantirem um resultado estético satisfatório essas
resinas possibilitam o controle do tempo de trabalho pelo profissional na medida em que a
reação de polimerização é desencadeada pela luz ultravioleta.
A matriz polimérica, que é a parte quimicamente ativa com monômeros que vão
estabelecer ligações cruzadas no momento da polimerização conferindo resistência ao
material, é comumente constituída pelo Bis-GMA (Bisfenol-A metacrilato de glicidila) ou
UDMA (dimetacrilato de uretano). Existem ainda diluentes como o TEG-DMA
(Dimetacrilato de trietileno gicol) ou EDMA (dimetacrilato de etileno glicol) que reduzem
a viscosidade, embora aumentem a contração de polimerização do material após a reação
38
de polimerização. Para garantir o prolongamento da vida útil do material é adicionado um
inibidor de polimerização, normalmente a hidroquinona.
São incorporadas à matriz polimérica partículas de carga (porção inorgânica)
melhorando as propriedades físicas do material, possibilitando a diminuição da contração
na polimerização e aumentando a resistência ao desgaste mecânico. As cargas comumente
utilizadas são o quartzo, sílica coloidal, vidro de fluorsilicato de alumínio, além de bário e
estrôncio. A adição dessas cargas garante ainda radiopacidade ao material possibilitando a
avaliação clínica da resina utilizada através do monitoramento radiográfico.
Para iniciar o processo de polimerização a amina terciária reage com o peróxido de
benzoíla ou luz com comprimento de onda de 470nm e ativa a canforoquinona (iniciador)
reagindo mais eficazmente com as aminas terciárias.
37,38
A baixa resistência ao desgaste e o pouco brilho das resinas compostas em contraste
com a excessiva dureza, grande friabilidade e altíssimo brilho das porcelanas, levaram os
pesquisadores, no início da década de 80, a estudos sobre um material que fosse um
intermediário entre ambos e apresentasse maiores semelhanças com o tecido dentário
original.
37,38
Uma alternativa que tem garantido bons resultados tem sido os cerômeros,
materiais modernos utilizados na odontologia formados por polímeros e carga cerâmica,
que unem as vantagens das porcelanas odontológicas com a praticidade das resinas
compostas. Trata-se de um material com variedade de tonalidades e que conta com
propriedades mecânicas melhoradas em relação àquelas resinas compostas utilizadas nas
restaurações dentárias por técnica direta. Os cerômeros são utilizados em coroas
cimentadas sobre pinos metálicos, revestindo coroas metálicas ou ainda na confecção de
coroas que dispensam a utilização de outro material.
Não só na prática odontológica como também na prática médica, outros materiais
foram projetados para serem implantados no organismo como uma alternativa às
limitações decorrentes da utilização de metais em determinadas situações que requerem,
por exemplo, reabilitação estética.
Para um material substituir adequadamente o tecido ósseo é necessário ainda que
apresente porosidade e que seja capaz de trocar íons com as adjacências, características
essas presentes nas biocerâmicas, que surgiram então como um biomaterial para uso em
processos que requeiram a restauração óssea.
39-41
Em 1894 surge a primeira cerâmica a ser utilizada como substituinte ósseo, o gesso
(CaSO
4
.½H
2
O). Por ser rapidamente absorvido pelo organismo e ter resistência mecânica
39
muito baixa, foi substituído, em 1920, por cerâmicas de fosfato tricálcico para a
regeneração de defeitos ósseos e formação do novo tecido.
39-41
Com o passar do tempo surgiram diferentes materiais cerâmicos baseados no
fosfato de cálcio, materiais esses cuja porosidade representa uma grande vantagem. Apesar
de, isoladamente, o aumento da porosidade diminuir a resistência mecânica do material a
presença de poros com dimensões adequadas pode favorecer o crescimento do tecido
através do biomaterial aumentando a resistência in vivo. A existência de poros possibilita
que células oriundas do tecido adjacente migrem para o interior do material, resultando em
um entrelaçamento que aumenta a resistência e a integração do implante no tecido
possibilitando melhores condições para a neoformação tecidual.
A biocompatibilidade e similaridade química com o tecido ósseo propiciaram a
utilização das cerâmicas baseadas na hidroxiapatita na medicina ortopédica e na prática
odontológica. A hidroxiapatita constitui a porção mineral dos ossos e dentes do organismo,
apresenta cálcio e fósforo em proporções muito similares àquelas encontradas no tecido
ósseo e exibe osteocondução quando implantada.
O uso clínico da hidroxiapatita sintética é bastante difundido, porém limitado
devido a sua lenta biodegradação no organismo humano.
39,40
Em fraturas ósseas bastante circunscritas ou perdas ósseas muito reduzidas em
regiões que não estejam submetidas a excessiva demanda funcional, o implante de
hidroxiapatita pode ser utilizado como substituto do tecido ósseo perdido. Em
contrapartida, quando é desejável a ocorrência de neoformação óssea, a utilização de
hidroxiapatita torna-se limitada pela sua lenta biodegradação em organismo biológico. O
implante de hidroxiapatita pode ser indicado, por exemplo, para fraturas na região do corpo
da mandíbula, no entanto não é adequado para implantação no rebordo alveolar quando é
necessário que esteja disponível um volume de tecido ósseo para receber um implante
osseointegrável.
Na Idade Contemporânea inicia-se a utilização de polímeros nas Ciências da Saúde.
Isto ocorre em razão destes sistemas complexos atingirem o auge com relação a sua
caracterização e síntese somente no século XX.
As tendências atuais apontam para a combinação de materiais aproveitando os
aspectos positivos e otimizando o prognóstico dos implantes, tanto do ponto de vista
funcional quanto estético. Essas tendências incluem a combinação de núcleos metálicos, a
melhoria dos polímeros por depósitos superficiais (como exemplo, cobertura com película
de carbono), uso de matrizes semelhantes ao organismo (proteínas, cerâmicas bioativas,
40
cerâmicas biodegradáveis) e materiais absorvíveis como o polímero poli (ácido lático).
Como exemplo dessa bem-sucedida combinação de materiais, temos a prótese de bacia,
que substitui a articulação pélvica fraturada utilizando uma haste combinada a uma esfera
metálica revestida por um material cerâmico como mostra a Figura.
41
Figura 2.11: Representação esquemática de uma prótese de fêmur.
42
A utilização de materiais sintéticos na prática clínica baseia-se em diferentes
princípios da fisiologia óssea. Tais princípios envolvem a osteoindução, osteocondução e
osteopromoção.
6,41,42
A osteoindução é a propriedade das substâncias de induzir células indiferenciadas a
diferenciarem-se em células osteoprogenitoras e estas em osteoblastos com posterior
formação de novo tecido ósseo. A matriz óssea possui fatores protéicos indutores de
diferenciação de novas células ósseas que foram designados BMP (proteína óssea
morfogenética). Como exemplos dessa classe de materiais temos: osso autógeno, matriz
orgânica de osso humano e bovino, fatores de crescimento, BMP.
Acetábulo de titânio
Cabeça de fêmur
Revestimento
da cabeça de
fêmur
(Polietileno)
41
Quando se trata de ocorrência de osteocondução o material sintético serve como
arcabouço para a proliferação e migração de células osteoprogenitoras e sua posterior
diferenciação em osteoblastos. No entanto, o material osteocondutor não promove a
formação óssea quando implantado em tecido mole. As principais características de um
bom material osteocondutor são a biocompatibilidade e a propriedade de reabsorção. Como
exemplo de materiais osteocondutores, podemos citar a hidroxiapatita natural obtida de
osso bovino, hidroxiapatita sintética, sulfato de cálcio, carbonato de cálcio e vidro bioativo.
A osteopromoção baseia-se na utilização de uma barreira física em forma de uma
membrana de um material biocompatível recobrindo a abertura do defeito ósseo e
separando-o do tecido mole que é altamente proliferante. Esse tipo de membrana protege o
defeito da invasão de células dos tecidos conjuntivo e epitelial adjacentes. O objetivo é dar
tempo para que as células ósseas ocupem o espaço do defeito e formem posteriormente o
novo tecido ósseo. Tais materiais podem ser reabsorvíveis ou não.
6,41
Membranas biocompatíveis, reabsorvíveis ou não, são muito empregadas na
odontologia para estimular a regeneração óssea em defeitos ósseos na cavidade bucal e
também nas áreas de traumatologia e ortopedia para tratamento de falhas ósseas. A
utilização de membranas segue o princípio da regeneração óssea guiada, ou seja, a
aplicação de uma barreira em forma de membrana em defeitos ósseos possibilita a
osteopromoção. A membrana mantém a concentração dos fatores estimulantes da
osteogênese, protege a área do defeito contra a invasão dos tecidos moles adjacentes
altamente proliferantes e delimita a osteogênese no contorno ósseo desejado. Fatores como
constituição, morfologia, textura de superfície, tamanho de poros e duração da integridade
funcional podem influenciar no sucesso da utilização das membranas para a regeneração
óssea.
43-45
A membrana não absorvível de politetrafluoretileno é ainda a mais usada em
odontologia devido às suas excelentes propriedades mecânicas, biocompatibilidade,
facilidade de manipulação e oclusividade celular. Como se faz necessária uma segunda
cirurgia para removê-la, pode haver indução de recessão gengival em casos de cirurgias
periodontais.
46
Para eliminar a necessidade de um segundo procedimento cirúrgico, membranas
absorvíveis foram desenvolvidas, como as de poli (ácido lático), de poli (ácido glicólico) e
de colágeno bovino. O colágeno parece apresentar baixa atividade antigênica e
biocompatibilidade superior a outros polímeros naturais. Para retardar a absorção precoce
das barreiras de colágeno no organismo, são empregados agentes que provoquem a
42
reticulação, tais como o glutaraldeído, formaldeído, resinas epoxídicas ou tratamento físico
com irradiação por raios gama ou por ultravioleta.
45,47
Ao contrário de alguns tecidos biológicos que se regeneram pela formação de um
tecido fibroso, o ósseo conta com um alto poder de regeneração, principalmente por estar
sendo freqüentemente remodelado com osteoclastos reabsorvendo o tecido e osteoblastos
repondo uma nova matriz óssea.
Já as lesões ósseas muito extensas, por exemplo, lesões de tíbia e fêmur, os defeitos
ósseos mandibulares ou na base do crânio ocasionados por volumosas massas tumorais não
se regeneram por serem preenchidas rapidamente por tecido conjuntivo adjacente. Esse
tecido tem velocidade de proliferação e migração celular maior que o tecido ósseo e sua
matriz extracelular inibe a proliferação de células osteoprogenitoras. As células
osteoprogenitoras são as células tronco do tecido ósseo. São células indiferenciadas que
darão origem às células do tecido como osteoblastos, osteoclastos e osteócitos.
Quando ocorre a implantação de um material no organismo e obtém-se uma
resposta biológica específica com adesão entre os tecidos adjacentes e o material
implantado classifica-se o material como bioativo.
6
Os biomateriais bioativos e os biodegradáveis surgem como uma necessidade do
desenvolvimento de materiais sintéticos que promovam a neoformação óssea. Entretanto, é
fato bem conhecido da literatura que um problema significativo com relação ao implante
de biomateriais é a infecção hospitalar. Este problema se agrava ainda mais quando o
material sintético está em contato com a medula óssea.
2.4 Infecção hospitalar e os polímeros com atividade antimicrobiana
As infecções hospitalares são as mais freqüentes e importantes complicações a que
estão sujeitos os pacientes receptores de próteses.
48
A maioria das infecções é de origem
endógena, ou seja, a contaminação ocorre na maioria das vezes no período intra-operatório
tornando necessária a utilização de antibioticoterapia no período pós-implante. Esse
procedimento apresenta as desvantagens inerentes ao uso de antibióticos, principalmente se
for utilizada por tempo prolongado. O principal inconveniente é o desenvolvimento de
resistência bacteriana aos antibióticos utilizados.
48,49
43
Existem muitos trabalhos na literatura que utilizam revestimentos bioativos com
propriedades antimicrobianas. Neste caso, os materiais utilizados como revestimento, tais
como as biocerâmicas, garantem propriedades antimicrobianas ao implante aliadas às
características mecânicas do material utilizado. Como exemplo, podemos citar o
recobrimento de ligas metálicas com fosfato de cálcio, já utilizado clinicamente.
50
Muitos compostos bioativos para o combate da infecção resultante do implante de
próteses foram desenvolvidos pela indústria farmoquímica. Dentre aqueles de maior
significado clínico estão antibióticos como a vancomicina, cefalosporina, ampicilina e o
metronidazol.
48
A vancomicina é um antibiótico glicopeptídico usado no tratamento das infecções
bacterianas; não produzido em ribossoma, mas sim por enzimas específicas. Não é
absorvivel no intestino e é administrada via intravenosa, exceto no tratamento de infecções
do próprio intestino. A vancomicina é eficaz contra bactérias Gram-positivas e ineficaz
contra Streptococcus. É um antibiótico usado como último recurso em casos de multi-
resistência. O mecanismo de ação da vancomicina é a inibição da síntese da parede celular
da bactéria. Com parede celular deficiente as bactérias não resistem às pressões osmóticas
e morrem. Não haviam sido registrados casos de resistência à vancomicina até 2002. O
surgimento de resistência à vancomicina, um dos últimos recursos para tratar
Staphylococcus multi-resistentes, indica que existem cepas de Staphyloccocus que são
resistentes a todos os antibióticos em uso atualmente.
51
As cefalosporinas formam um grupo de antibióticos beta-lactâmicos relacionados
com as penicilinas, usados no tratamento de infecções bacterianas. Como todos os
antibióticos beta-lactâmicos (como as penicilinas), as cefalosporinas interferem na sintese
da parede celular de peptidoglicano via inibição de enzimas envolvidas no processo de
transpeptidação. Há resistência em algumas cepas devido à disseminação de plasmídeos
que codificam o gene da proteína beta-lactamase, que destrói o antibiótico antes que possa
ter efeitos.
A primeira geração de cefalosporinas tais como a cefalotina, cefalexina, entre
outras é efetiva contra algumas espécies de Staphylococcus e Streptococcus embora não
sejam a primeira escolha. Também eficazes contra Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae e Proteus mirabilis. As cefalosporinas de segunda geração são mais eficazes
contra bactérias Gram-negativas, mais resistentes à beta-lactamase. Podemos citar a
cefuroxima, cefamandol, entre outras.
44
As cefalosporinas de terceira geração, dentre elas a cefotaxima, são muito eficazes
contra Gram-negativas e em infecções hospitalares. As cefalosporinas de quarta geração
apresentam mesma atividade contra Gram-negativas, mas mais potentes para Gram-
positivas do que os de terceira geração. Neste caso, a cefipima e a cefpiroma são mais
resistentes à degradação por beta-lactamase (mais eficazes contra estirpes parcialmente
resistentes).
52
A ampicilina é uma penicilina semi-sintética, obtida a partir do ácido 6-
aminopenicilânico (6-APA), de elevado consumo na medicina. A rota atual de produção
conhecida como "rota química", utiliza solventes altamente tóxicos e baixas temperaturas
e, portanto, está restrita a países com exigências ambientais limitadas (como China e
Índia). Outros países apenas importam a ampicilina como principio ativo para
comercialização. Uma rota de produção por via enzimática está em desenvolvimento
(utilizando a Penicilina G Acilase, PGA), conhecida como "rota verde", cujo objetivo é
realizar a síntese em meio aquoso e em temperatura próxima a ambiente, permitindo que o
composto seja produzido em outros países e com risco ambiental mais reduzido.
53
A ampicilina foi a primeira penicilina semi-sintética que mostrou ação contra
bacilos gram-negativos abrindo o campo de penicilinas de amplo espectro. Por ser
antibiótico bacterida, apresenta mecanismo de ação semelhante ao das outras penicilinas.
Entretanto, a ampicilina tem maior afinidade a proteína fixadora da penicilina 3, que é
responsável pela formação de septos no momento da divisão da célula bacteriana. Dessa
forma, age sobre o microorganismo sensível em um prazo médio de 6 a 120 minutos.
A resistência dos microorganismos às penicilinas limita sua indicação na prática
clínica. Os microorganismos tornam-se resistentes às penicilinas por inativação do
antibiótico por beta-lactamases bacterianas, através do rompimento do anel beta-lactâmico
do núcleo das penicilinas, redução na permeabilidade da membrana externa e,
conseqüentemente, uma menor capacidade do antibiótico atingir as proteínas ligantes
apropriadas ou alteração ou diferenças estruturais nas proteínas ligantes à penicilina. A
resistência ao antibiótico pode ocorrer por um desses mecanismos ou combinação dos
mesmos.
53
O metronidazol é uma penicilina ativa quase exclusivamente para microrganismos
anaeróbicos. É menos ativo que a clindamicina para anaeróbios que não Bacteroides
fragilis. A ação bactericida do metronidazol é devida ao fato de, ao penetrar na célula, ser
degradado por ação de nitrorredutases, gerando compostos polares citotóxicos. Estes
determinam perda da estrutura helicoidal do DNA bacteriano, quebra de filamentos e
45
comprometimento concomitante de sua função, além de inibir a síntese de ácidos
nucléicos. Com a ruptura da estrutura helicoidal do DNA, a célula bacteriana morre. O
metronidazol afeta todas as células independentemente de estarem se dividindo ou não.
54
O metronidazol está indicado na profilaxia e tratamento das infecções causadas por
bactérias anaeróbias como Bacteroides fragilis e outros bacteróides, Fusobacterium sp;
Clostridium sp; Eubacterium sp. Está indicado, também, na prevenção e tratamento das
infecções pós-cirúrgicas, nas quais os anaeróbios tenham sido identificados ou
suspeitados.
55
A Figura 12 ilustra as estruturas químicas dos principais antibióticos utilizados na
prática clínica pós-implante de próteses sintéticas.
Figura 2.12: Estrutura química da vancomicina (A), cefalosporina (B), ampicilina (C) e
metronidazol (D).
52,56-58
As infecções hospitalares podem levar a um processo de bacteremia transitória, a
rejeição do material implantado e até mesmo ao óbito, além de elevar o custo do
tratamento e o tempo de internação do paciente.
(A)
(B)
(C)
(D)
46
Em relação aos implantes odontológicos, a ocorrência de infecção interfere ainda na
cicatrização óssea impossibilitando a ocorrência de osseointegração e acarretando a
necessidade da realização de uma nova cirurgia ou até mesmo na rejeição definitiva do
implante. Entende-se por osseointegração o processo em que ocorre uma fixação clínica e
assintomática de materiais aloplásticos que são mantidos durante oclusão funcional.
59
A principal desvantagem da antibioticoterapia é o desenvolvimento de resistência
ao fármaco, além de ocorrer também a depressão do sistema imunológico do paciente. Nas
últimas três décadas tem-se procurado a obtenção de próteses intrinsecamente
antimicrobianas. Neste caso, compostos bioativos como a hidroxiapatita, podem ser
ligados covalentemente à prótese ou simplesmente revesti-la formando um filme com
propriedades bioativas quanto à sua atividade antimicrobiana.
A indução do crescimento ósseo e o combate à infecção podem ser promovidos
utilizando-se sistemas latenciados, especialmente projetados para uma função específica: a
liberação de um hormônio de crescimento ou, o combate da infecção com a liberação de
um antibiótico específico.
Sistemas para a liberação controlada de fármacos têm sido desenvolvidos para
aumentar o crescimento ósseo e a regeneração no tratamento dos defeitos ósseos. Devido à
pobre circulação sanguínea nos locais com defeitos ósseos, fármacos como antibióticos,
antimicrobianos e fatores de crescimento precisam suprir as regiões afetadas.
Muitos transportadores têm sido desenvolvidos para encapsular fármacos, como
polímeros biodegradáveis (sintéticos ou naturais) e as cerâmicas bioativas nas formas de
partículas, membranas e matriz porosa.
60
Os sistemas de liberação controlada, freqüentemente descritos como “drug delivery
systems”, oferecem inúmeras vantagens quando comparados a outros de dosagem
convencional, tais como:
61
9 Maior eficácia terapêutica, com liberação progressiva e controlada do fármaco, a
partir da degradação da matriz;
9 Diminuição significativa da toxicidade e maior tempo de permanência na
circulação;
9 Natureza e composição dos veículos variada e, ao contrário do que se poderia
esperar, não há predomínio de mecanismos de instabilidade e decomposição do
fármaco (bio-inativação prematura);
9 Administração segura (sem reações inflamatórias locais) e conveniente (menor
número de doses);
47
9 Direcionamento a alvos específicos, sem imobilização significativa das espécies
bioativas;
9 Tanto substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas podem ser incorporadas.
Observa-se na literatura que, de maneira geral, os principais fármacos utilizados no
combate à infecção são os antibióticos, entretanto a utilização por tempo prolongado pode
levar a ocorrência de resistência bacteriana ao fármaco.
A utilização de antimicrobianos para prevenir a infecção do local cirúrgico é um
procedimento corriqueiro na prática clínica tanto na preparação para o procedimento
operatório quanto no pós-cirúrgico.
49
O agente antimicrobiano deve estar presente nos tecidos manipulados quando há
exposição aos microrganismos, ou seja, durante o procedimento cirúrgico sua concentração
tecidual deve ser mantida embora alterações hemodinâmicas locais levem-na a decair.
Embora raramente a contaminação do sítio operatório possa ocorrer após o término do
procedimento, existe uma preocupação com o ambiente cirúrgico e com a profilaxia
bacteriana.
Um antimicrobiano adequado deve exibir mínima toxicidade, baixo custo, induzir
mínima ou nenhuma resistência bacteriana, ter farmacocinética adequada e possuir
atividade contra a maior parte dos patógenos causadores de infecção.
62
Podem ser utilizados como agentes antimicrobianos para profilaxia cirúrgica a
cefuroxina para infecções com enterobactérias de alta freqüência ou em caso de
necessidade de concentração no Sistema Nervoso Central e a cefalotina quando há
necessidade de repetição intra-operatória. Há ainda algumas contra-indicações quanto a
alguns antimicrobianos, pois com a utilização da vancomicina pode haver ocorrência de
bactérias gram+ resistentes aos glicopeptídeos e a cefoxitina deve ter uso restrito na
profilaxia cirúrgica e o tempo de uso não deve exceder 48 horas.
Algumas combinações de antimicrobianos são utilizadas como a clindamicina
associada à gentamicina, cuja infusão rápida pode provocar bloqueio neuromuscular e
interferir na recuperação pós-anestésica. Este efeito, no entanto, não ocorre com infusão
lenta (20 a 30 minutos). A associação de ampicilina, gentamicina e metronidazol é
considerada por alguns como um esquema de 1ª linha, embora perda em simplicidade e
praticidade quando comparada aos fármacos utilizados isoladamente.
62
A Tabela 2 mostra alguns parâmetros a serem utilizados com relação ao uso de
antibioticoterapia profilática para o combate de infecção.
48
Tabela 2.2: Parâmetros para antibioticoterapia profilática
62
Parâmetro Recomendação Comentário
Objetivo da
profilaxia
Prevenção da infecção no sítio
cirúrgico
Não previne outras infecções. Eficácia
limitada, não substitui outras medidas.
Início da
profilaxia
Aproximadamente 1 hora antes do
início da cirurgia ou na indução
anestésica.
Profilaxia iniciada mais que 2 horas
antes ou 3 horas após incisão não
possui eficiência comprovada.
Profilaxia em trauma obedece a normas
diferentes.
Escolha do
antimicrobiano
Deve ser pouco tóxico e não deve
ser aquele utilizado para infecções
hospitalares graves.
As cefalosporinas de 1ª e 2ª geração
são, na maioria das situações, os que
melhor se encaixam nesse contexto.
Dose inicial do
antimicrobiano
Deve ser a dose tradicional do
antimicrobiano
Para pacientes com peso ≥ 80 kg a
primeira dose poderá ser o dobro da
convencional.
Doses
adicionais no
intra-operatório
Devem ser realizadas em caso de
perda maciça de sangue ou quando
a duração do procedimento se
prolonga
Repetição intra-operatória numa
freqüência maior do que em outras
situações de uso do mesmo
antimicrobiano é recomendada.
Duração da
profilaxia
Na maioria das situações não deve
exceder o período intra-operatório.
Mesmo em situações de risco ou em
contaminações acidentais, o
prolongamento da profilaxia não está
associado a um melhor resultado
clínico. Exceção em procedimentos
selecionados, os quais não há consenso
em literatura, como implante de prótese
e cirurgia cardíaca.
49
É fato conhecido na literatura que os sistemas poliméricos a serem utilizados em
processos de restauração óssea devem possuir como características fundamentais a
biodegradabilidade e a bioreabsorção.
Entende-se por biodegradabilidade a degradação da macromolécula e dispersão do
sólido in vivo, mas sem a eliminação dos produtos e subprodutos pelo organismo.
Polímeros biodegradáveis podem ser atacados por elementos biológicos de forma que a
integridade do sistema seja afetada, resultando em fragmentos ou outros subprodutos de
degradação, que podem ser removidos do seu local de ação, mas não necessariamente do
organismo.
63
Materiais bioreabsorvíveis degradam através da hidrólise de ligações éster ou
amidas com conseqüente redução do peso molecular, sendo reabsorvidos in vivo e
eliminados metabolicamente pelo organismo. Bioreabsorção é um conceito que reflete a
eliminação total do material e dos subprodutos de degradação (compostos de baixa massa
molar) sem efeitos colaterais residuais.
63
50
2.5 Considerações finais
A necessidade crescente de substituir o tecido ósseo perdido ou lesionado do corpo
humano tornou o estudo dos biomateriais um amplo campo de pesquisa na atualidade. A
ocorrência de perda óssea, seja por causas naturais ou acidentais, resulta muitas vezes na
necessidade de materiais que estimulem a neoformação do tecido perdido restaurando o
organismo tanto estrutural quanto estética e funcionalmente.
Para que esses materiais sejam aceitos para essa finalidade é necessário que
apresentem uma série de características como biocompatibilidade, biodegradabilidade,
propriedades mecânicas compatíveis com sua aplicação, atoxicidade a fim de garantir
longevidade necessária ao implante e remodelação tecidual.
Os biomateriais são necessários tanto na prática médica como odontológica e a
ocorrência de infecções tem se tornado um fator limitante para sua aplicação.
A ocorrência de infecções é, atualmente, a principal causa de rejeição dos materiais
implantados no organismo biológico, além de comprometer a saúde sistêmica do paciente.
Na grande maioria dos casos clínicos, constata-se que a contaminação ocorre no
período intra-operatório sendo, portanto, de indiscutível importância a presença de um
agente antimicrobiano no sítio cirúrgico.
Polímeros ou copolímeros biodegradáveis que apresentem atividade antimicrobiana
têm sido merecedores de muitos estudos para aplicação como materiais enxertáveis por
aliarem, às características de biomateriais, a capacidade de prevenirem a ocorrência de
infecções pós-cirúrgicas.
Este trabalho baseia-se no estudo de um copolímero biodegradável que apresente
simultaneamente propriedades antimicrobianas adequadas para implante em organismo
biológico prevenindo a ocorrência de infecções.
51
2.6 Referências:
[1]ROSSI, R.J.; ARUN, K.G. Implantodontia - Bases Clínicas e Cirúrgicas, Robe
Editora, p.225, 1996.
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56
3. APLICAÇÕES DE POLÍMEROS BIODEGRADÁVEIS EM
MEDICINA/ODONTOLOGIA
Inicialmente, o interesse por polímeros biodegradáveis está baseado em sua
resistência à biodegradação e relativa inércia. Uma ênfase especial tem sido dada à
obtenção de polímeros baseados no amido.
1,2
O amido é um polissacarídeo com cerca de
1.400 resíduos de glicose que funciona como substância de reserva para muitas plantas. O
grão de amido é uma mistura de dois polissacarídeos: amilose e amilopectina.
1,2
A amilose é uma macromolécula constituida de 250 a 300 resíduos de D-
glicopiranose, ligadas por pontes glicosídicas α-1,4, que conferem a molécula uma
estrutura helicoidal. A amilopectina é uma macromolécula, menos hidrossolúvel que a
amilose, constituída de aproximadamente 1400 resíduos de α-glicose ligadas por pontes
glicosídicas α-1,4, ocorrendo tambem ligações α-1,6. A amilopectina (Figura 1) constitui,
aproximadamente, 80% dos polissacarídeos existentes no grão de amido.
O amido é sintetizado em estruturas vegetais denominadas plastídeos :
cromoplastos das folhas e amiloplastos de orgãos de reserva, a partir da polimerização da
glicose, resultante da fotossíntese.
1,2
Figura 3.1: Estrutura da amilopectina.
O amido é encontrado na forma de grãos nas sementes, caules, raízes de várias
plantas como trigo , mandioca , arroz , milho , feijão, batata e outras constituindo, portanto,
uma matéria-prima inesgotável no meio ambiente. O amido é encontrado abundantemente
57
na natureza graças ao cultivo extensivo e intensivo de cereais, é renovável, de baixo custo
e pode ser convertido química, física e biologicamente em compostos úteis à indústria.
Em face ao contexto atual, uma nova tecnologia vem revolucionando o mercado de
descartáveis: é o amido termoplástico, produzido a partir do amido. O amido, sob pressão e
temperatura adequadas, e na presença de um agente plastificante, pode ser gelatinizado, e
sob efeito de cisalhamento se transformar em um material fundido, denominado amido
termoplástico.
O estudo para o emprego do amido termoplástico na substituição do plástico
convencional (de origem petroquímica) destinado a algumas aplicações específicas vem
ganhando força e recebendo considerável atenção no cenário dos recursos renováveis.
3
Quando biodegradado ou incinerado o amido libera CO
2
para a atmosfera. Estas
características do amido têm despertado um interesse acentuado pelo mercado de
polímeros convencionais através da sua incorporação em misturas poliméricas.
Recentemente as pesquisas têm se voltado para o estudo do uso do amido derivado
do milho em misturas com os polímeros biodegradáveis PCL (poli (caprolactona)), PHB
(poli (hidroxibutirato)) e PHBV (poli (hidroxibutirato-co-valerato)). Objetiva-se a
obtenção de novos materiais que apresentem uma maior velocidade de degradação, ou seja,
a obtenção de materiais que após o seu descarte minimize os danos ao ambiente. Além
disso, esses polímeros teriam um custo mais baixo, uma vez que o amido é um material de
baixo custo (valor estimado de U$ 0,50/kg).
4,5
A incorporação do amido em polímeros biodegradáveis provoca mudanças na
morfologia sendo constatado que as propriedades mecânicas são reduzidas
significativamente com o porcentual de amido incorporado.
4,5
No entanto, a incorporação
de cerca de 25% em massa de amido tem permitido a obtenção de materiais com valores de
módulo de elasticidade razoáveis para a utilização como, por exemplo, plásticos
biodegradáveis
3,4
Os biomateriais poliméricos e seus compósitos podem ser classificados em
bioestáveis, parcial ou totalmente biodegradáveis. Os primeiros causam uma resposta
tecidual mínima, mantém suas propriedades durante anos e são praticamente inertes. Os
implantes totalmente absorvíveis, por outro lado, são capazes de serem totalmente
eliminados pelo organismo após sofrerem hidrólise.
Os polímeros parcialmente absorvíveis são também hidroliticamente instáveis, mas
não são metabolizados e eliminados pelo organismo não dispensando uma segunda cirurgia
para retirada do implante após cicatrização do tecido.
6
58
Segundo a American Standard for Testing and Methods (ASTM-D-833), polímeros
biodegradáveis são polímeros degradáveis nos quais a degradação resulta primariamente da
ação de microrganismos como, por exemplo, bactérias, fungos e algas de ocorrência
natural. Frequentemente derivam desse processo CO
2
, componentes celulares microbianos,
entre outros.
7
Com o avanço das pesquisas após a década de 60, os polímeros hidroliticamente
instáveis, ou biodegradáveis, passaram a despertar interesse das áreas médica e
farmacêutica, permitindo aplicações no encapsulamento de drogas para liberação
controlada no organismo do paciente, implantação de pequenas partes do corpo como
cartilagens, pequenos enxertos de vasos sanguíneos, substituição de válvulas cardíacas e
substituição temporária de tecidos aguardando a regeneração. A capacidade dos polímeros
biodegradáveis se adequarem a diferentes situações e a flexibilidade de se projetar
polímeros com características únicas garantiram uma diversidade de aplicações desses
materiais como biomateriais há mais de 50 anos.
6-8
Além de ser biocompatível, um sistema de liberação de drogas implantado no
organismo deve ter componentes quimicamente inertes, não carcinogênicos,
hipoalergênicos, mecanicamente estáveis e não devem causar resposta inflamatória no
local da aplicação. O direcionamento do fármaco a sítios-alvo específicos no organismo é
claramente identificável e bastante estável por não ser reconhecido por macrófagos do
sistema de defesa. Os polímeros utilizados para implante podem ser biodegradáveis ou não,
podendo ser classificados em matriciais (ou monolíticos) e reservatórios.
Nos sistemas biodegradáveis poliméricos matriciais o fármaco encontra-se disperso
na matriz ou adsorvido na sua superfície e é liberado por difusão pelos poros da matriz, por
degradação do polímero ou ambos. A taxa de liberação depende da escolha do polímero.
No caso de polímeros não-degradáveis a liberação ocorre por difusão lenta pela matriz.
Nos polímeros utilizados como reservatórios, o fármaco encontra-se em uma
cavidade central envolta por uma membrana polimérica que controla sua taxa de liberação.
Esse sistema inclui membranas, cápsulas, monocápsulas, lipossomos e fibras ocas. Quando
são utilizados polímeros não-biodegradáveis a liberação do fármaco ocorre também apenas
por difusão pela membrana.
9,10
Os sistemas controlados quimicamente usam a erosão dos polímeros que resulta na
absorção dos resíduos pelo organismo. Quando existem ligações covalentes entre o
fármaco e o polímero pode haver liberação por quebra da ligação pela ação da água ou de
enzimas.
59
Os sistemas biodegradáveis requerem controle no que diz respeito à cinética de
degradação do polímero, que deve permanecer constante para que seja obtida liberação
controlada do fármaco in vivo. Variáveis como pH e temperatura podem promover
alterações na velocidade de degradação do implante.
Os principais fatores responsáveis por alterações no período de degradação dos
polímeros biodegradáveis são:
9
• Estrutura química e composição do sistema
• Distribuição da massa molecular do polímero
• Presença de monômeros e oligômeros
• Tamanho e forma da superfície do sistema
• Morfologia dos componentes do sistema (amorfo, semicristalino, cristalino)
• Local de implantação do sistema
• Mecanismo de hidrólise.
As Figuras 2 e 3 ilustram as diferentes formas farmacêuticas e mecanismos de
liberação de fármacos de matrizes poliméricas.
Figura 3.2: Exemplos das diferentes formas farmacêuticas de liberação controlada: (A)
esfera (sistema matricial) e (B) cápsula (sistema reservatório).
60
Figura 3.3: Mecanismos de liberação do princípio bioativo por difusão (A), erosão (B) e
liberação pelo sistema reservatório (dissolução ou difusão) (C).
O interesse por polímeros biodegradáveis tem crescido muito nos últimos anos
mundialmente apesar do alto custo de produção desses polímeros em relação aos polímeros
sintéticos convencionais A criação de polímeros passíveis de sofrerem degradação natural
constitui uma alternativa ao processo de reciclagem.
O Brasil tem posição privilegiada como produtor de biopolímeros. O PHB obtido a
partir da sacarose é um método de custo reduzido com matéria-prima abundante, sendo o
Brasil o único país que produz este biopolímero por fermentação do açúcar da cana. O
plástico produzido a partir do PHB pela planta-piloto é exportado para Estados Unidos,
Alemanha e Japão.
11
Empresas de grande porte como a Du Pont, Bayer, Basf, 3M, Sony entre outras têm
investido nas pesquisas para a produção de biopolímeros no Brasil e no exterior, muitas
vezes em parceria com universidades.
7
O Instituto Nacional de Propriedade Industrial aliado à Universidade Federal de
Minas Gerais patenteou a técnica de encapsulamento de insulina em microesferas de
polímeros biodegradáveis derivados dos ácidos glicólico e lático. Essa técnica constitui um
avanço no modo de aplicação do medicamento podendo ser administrado na forma de
aerossol em substituição às injeções subcutâneas aplicadas em pacientes diabéticos.
12
O
(A) (B) (C)
61
microencapsulamento da insulina resulta em estabilidade do hormônio e facilita a absorção
pelo organismo, além de conforto na aplicação e eficiência do tratamento. As doses
aplicadas poderão ser menores e o efeito mais satisfatório, uma vez que os alvéolos
pulmonares são mais facilmente permeáveis que o tecido conjuntivo. Não há, no entanto,
empresa no país que se interesse pela produção desse tipo de inovação tecnológica.
12
Na área oftalmológica foram desenvolvidos implantes em forma de bastão para
serem instalados na porção posterior do olho.
12
Enquanto o material polimérico se degrada
no organismo, fármacos são liberados. Por enquanto, as pesquisas com o implante
oftalmológico se concentram nos medicamentos destinados ao tratamento das uveítes.
Trata-se de uma inflamação do trato uveal, composto pela íris, corpo ciliar e coróide
(membrana situada na frente da retina). Denominam-se uveítes também as inflamações em
estruturas adjacentes, como a retina e o nervo óptico. O tratamento convencional para essa
inflamação consiste em colírios à base de corticóide. Entretanto, na maioria das vezes, essa
prática não gera resultados, tornando-se necessária a utilização do medicamento por via
oral ou injeções intra-oculares. Além de dolorido, o tratamento quase nunca dá bons
resultados e é causa de cegueira em grande proporção da população afetada. O tratamento
usando material polimérico biodegradável representaria neste caso um avanço em termos
de conforto e segurança para o paciente.
12
Os polímeros sintéticos têm sido reconhecidos e estudados na engenharia de tecidos
biológicos bem como para a obtenção de compósitos para utilização em implantes e
reconstruções ósseas, principalmente devido à sua biodegradabilidade e boa interação com
o organismo biológico.
Tanto os polímeros naturais quanto os sintéticos têm sido utilizados em sistemas
poliméricos de liberação de drogas e não só permitem uma liberação lenta e gradual do
ingrediente ativo, como também podem possibilitar o direcionamento a alvos específicos
do organismo, como sítios de inflamação ou tumor.
A liberação controlada de fármacos é conveniente ao paciente, seja do ponto de
vista de seu conforto e adesão ao tratamento, seja do menor custo em hospitais, com menor
necessidade de internações, remoções cirúrgicas de implantes e complicações pós-
cirúrgicas. No entanto, uma dificuldade seria interromper a ação farmacológica do
medicamento, no caso de intoxicação ou alguma intolerância, inclusive com risco de
acúmulo do fármaco se não for acompanhada convenientemente a sua farmacocinética.
Os polímeros naturais, à base de proteínas, como as albuminas bovina e humana, o
colágeno e a gelatina têm uso restrito devido à atividade antigênica marcante e a maior
62
susceptibilidade à degradação que acarreta em uma permanência prolongada de fragmentos
no organismo.
9
Dentre os polímeros biodegradáveis abordados pela literatura e mais utilizados na
área médica podemos citar o poli (ácido lático), polietilenoglicol, poli (hidroxibutirato) e
poli (ε-caprolactona). A Figura 4 mostra a crescente utilização desses polímeros como
biomateriais.
1996 1998 2000 2002 2004 2006
número de publicações
ano
Figura 3.4: A evolução nas pesquisas sobre a aplicação dos polímeros biodegradáveis na
medicina. Fonte: Science Direct. PEG (A), PLA (B), PCL (C), PHB (D).
(A)
(B)
(C)
(D)
63
(c)
Figura 3.5: Estrutura química do PHB (a), PCL (b), PEG (c)
O poli (ácido lático) (PLA) é um poliéster relativamente hidrofóbico instável em
presença de umidade, biodegradável a subprodutos atóxicos e produzido a partir de
recursos renováveis. O PLA possui isômeros L-D, o isômero L (PLLA) é biocompatível,
biologicamente inerte, tem longo tempo de biodegradação e boas propriedades mecânicas.
Os produtos da degradação do PLLA (CO
2
e H
2
O) são reabsorvidos pelo organismo
fazendo parte do metabolismo dos carboidratos. Trata-se de um polímero injetável
amplamente utilizado em cirurgias dermatológicas por estimular a produção de colágeno.
Tem sido utilizado em cirurgias de reconstrução de tecidos lesionados ou perdidos por
fortalecer o tecido remanescente e devolver forma a face do indivíduo.
13,14
Os polímeros derivados do ácido lático e glicólico têm recebido muita atenção nas
pesquisas a cerca de polímeros biodegradáveis alternativos, sendo que o órgão norte-
americano Food and Drug Administration (FDA) já aprovou estes polímeros para
utilização como sistema de liberação de drogas, uma vez que existem diversos estudos
demonstrando sua baixa toxicidade.
Os polímeros derivados do ácido lático proporcionam boas propriedades mecânicas,
baixa capacidade alergênica, baixa toxicidade, excelente biocompatibilidade e uma cinética
previsível de biodegradação despertando atenção de vários pesquisadores quanto às suas
possíveis aplicações em tecnologia farmacêutica.
6
Os polímeros derivados do PLA são obtidos por reação de condensação através da
abertura do anel dos dímeros cíclicos (ácido lático e/ou glicólico). A polimerização ocorre
por um período de 2 a 6 horas sob temperatura de 175ºC utilizando como catalisador
principalmente o cloreto estanhoso. Durante o processo pode ser adicionado álcool
laurílico para o controle da massa molecular do polímero resultante.
A biodegradação do poli(ácido lático) ocorre por erosão ou por clivagem da cadeia
polimérica por glicólise liberando ácido lático. A presença do grupo metila (CH
3
) no
64
polímero derivado do ácido lático confere maior hidrofobicidade quando comparado ao
derivado do ácido glicólico.
9
A utilização de polímeros de ácido lático na área médica começou nos EUA na
década de 60. Até então os polímeros não atraiam a atenção dos pesquisadores devido ao
processo de biodegradação em contato com água. Por volta de 1966 pesquisadores norte-
americanos perceberam que a partir de moléculas de ácido lático poderiam criar um
polímero não tóxico, degradável e facilmente metabolizado pelo organismo. A partir de
então, pinos metálicos usados em fraturas ósseas começaram a ser substituídos pelos pinos
obtidos a partir de ácido lático.
15
Os polímeros utilizados nas pesquisas com encapsulamento de insulina são
derivados dos ácidos lático e glicólico, tal como os utilizados na confecção de fios
biodegradáveis para sutura. Esses polímeros são também utilizados na área oftalmológica
na forma de um bastão biodegradável inserido na parte posterior do olho cuja confecção é
baseada na composição do pó contendo o fármaco e o polímero.
12
O poli (hidroxibutirato) (PHB) (Figura 5) é um polímero natural de uma classe dos
polímeros termoplásticos produzidos por síntese microbiana. Neste caso o microrganismo
utiliza o PHB como reserva para a obtenção de carbono e como fonte de energia para o
caso da ausência de um ou ambos. Os polímeros dessa classe, poli (hidroxialcanoatos), em
condições apropriadas de cultura bacteriana são acumulados na forma de grânulos
intracelulares de PHB, gerando um polímero com propriedades semelhantes às dos
polímeros de origem petroquímica, com a vantagem de serem susceptíveis a biodegradação
no ambiente por microrganismos nele existentes em curto espaço de tempo após o descarte.
O tempo de degradação médio do PHB é de 6 a 12 meses.
16
O PHB tem sido produzido no Brasil a partir da sacarose presente no açúcar.
17
Foi
desenvolvido um processo que facilita a obtenção desse polímero a partir do bagaço de
cana hidrolisado, um resíduo da cana da indústria de álcool e açúcar para ser utilizado na
fabricação de embalagens ambientalmente corretas.
As características físicas e mecânicas do PHB, tais como resistência à água,
permeabilidade aos gases, estabilidade à radiação ultravioleta, são semelhantes às de
alguns polímeros sintéticos que têm o petróleo como matéria-prima, mas oferecem o
benefício de se decompor muito mais rapidamente quando descartados do que os polímeros
convencionais.
18
O PHB pode ser utilizado como matéria prima num vasto campo de aplicações,
principalmente naqueles setores em que características como pureza e biodegradabilidade
65
são necessárias, a exemplo da área médico-farmacêutica. Por ser biocompatível e
facilmente absorvido pelo organismo humano, pode ser empregado na fabricação de fios
de sutura, próteses ósseas e cápsulas que liberam gradualmente o fármaco na corrente
sanguínea.
17
O poli (etilenoglicol) (PEG) (Figura 5) é um polímero biodegradável amplamente
difundido na área farmacêutica, tem peso molecular adequado, baixa densidade relativa e é
solúvel em água. O PEG é muito utilizado na indústria farmacêutica e em formulações
cosméticas.
Hidrogéis constituídos de PEG combinado à poli N-vinil-2-pirrolidona (PVP) e
ágar são utilizados como membranas para uso tópico, no tratamento de lesões de pele. São
membranas reticuladas por radiação ionizante utilizadas como dispositivos médicos para
uso tópico. A principal vantagem desta metodologia está na capacidade da radiação
promover a reticulação em condições razoavelmente brandas, sem qualquer aditivo, além
de promover a esterilização simultânea.
19
O PEG tem sido utilizado como modificador de proteínas. A enzima lipase da
Candida rugosa foi modificada com metóxi (polietileno glicol)-p-nitrofenil carbonato
(NPC-mPEG). A lipase modificada reteve em 98% a atividade hidrolítica, em comparação
com a não modificada. A modificação de proteínas se dá em função da otimização das
características dessas proteínas para utilização em biotecnologia e aplicações biomédicas.
20
Para que materiais poliméricos possam ser utilizados como biomateriais é
necessário que exibam características combinadas de biocompatibilidade,
biodegradabilidade, atoxicidade e resistência mecânica adequada para implantação no
organismo biológico.
Recentemente uma intensa atividade em pesquisa e desenvolvimento de materiais
baseados no polímero poli (ε-caprolactona) tem sido observada. A poli (ε-caprolactona)
(PCL) é um poliéster bioreabsorvível com um enorme potencial para aplicações na
medicina ortopédica. Este polímero possui vantagens significativas quando comparado ao
poli (ácido lático) tais como seu baixo custo e a possibilidade de sua síntese em escala
industrial. Muitos estudos atualmente estão sendo dirigidos para a obtenção de compósitos
de PCL para utilização na prática clínica.
O projeto de sistemas biodegradáveis deve ser centrado não somente na obtenção
do polímero, mas também na sua bioatividade quanto ao processo de restauração óssea e
resistência ao ataque microbiano. É fato bem conhecido na literatura que o principal
desafio no caso dos implantes sintéticos é a ocorrência de infecção, que eleva o custo do
66
tratamento devido à utilização de antibióticos ou ao maior tempo de internação ou leva o
paciente ao óbito.
Recentemente, nosso grupo de pesquisa tem se voltado para o projeto de
copolímeros biodegradáveis com propriedades antimicrobianas que contribuam para a
prática clínica, no sentido de eliminar o uso da antibioticoterapia, dado seu elevado custo e
efeitos colaterais associados que reduzem a qualidade de vida do paciente.
67
3.1 Considerações finais:
Os cirurgiões ortopédicos estão amplamente familiarizados com os dispositivos
metálicos para a fixação de fraturas, osteotomias e artroses. Entretanto, os implantes
metálicos não estão isentos de complicações, decorrentes de fixação óssea. Eles deveriam
ser removidos após a consolidação óssea, devido ao fenômeno de stress-shielding e podem
provocar dor devido a sua localização subcutânea.
De acordo com a lei de Wolff (1892), a remodelação óssea ocorre sobre estresse,
porém na presença de fixação rígida, através de implante metálico, este absorveria a
maioria da tensão, ficando pequena parcela para o osso. Concomitante a tais fatos, poderia
ocorrer osteoporose abaixo do implante, com diminuição da resistência óssea; liberação de
íons metálicos dos dispositivos de fixação, reação do tipo corpo estranho e migração tardia
dos parafusos metálicos.
O interesse pelo desenvolvimento de novos materiais utilizados em enxertos com
função de restaurar, remodelar ou mesmo reforçar estruturas ósseas cresceu
significativamente nas últimas décadas. Atualmente o uso desses materiais é bastante
comum em obturações, após a curetagem de lesões cavitárias de tumores ósseos benignos e
malignos, em revisões protéticas, principalmente do quadril em preenchimentos de falhas
de continuidade devido a fraturas cominutivas ou esmagamentos, pseudartroses e
osteomielites.
O emprego de enxerto de osso autógeno fresco, considerado por muitos médicos
como material de eleição, traz alguns problemas como limitação do material, lesão ou
enfraquecimento de outras estruturas ósseas e riscos inerentes a esse tipo de intervenção.
Os bancos de ossos (osso homógeno) também apresentam problemas tais como
alterações das propriedades mecânicas, dificuldades técnicas de esterilização e estocagem,
além, dos custos elevados que essas técnicas acarretam.
A ausência de um substituto biológico que atenda perfeitamente às necessidades
clínicas levou diversos pesquisadores a procurarem biomateriais sintéticos, para eventuais
substituições ósseas. Materiais como gesso e cimento acrílico (polimetacrilato de metila)
vêm sendo utilizados ao longo do tempo, mas apresentam inconvenientes mecânicos e
biológicos.
Materiais compósitos e alguns polímeros reabsorvíveis também vêm sendo
estudados e testados. Atualmente, desenvolveram-se biocerâmicas inertes reabsorvíveis e
68
bioativas como a hidroxiapatita sintética, fosfato tricálcico e os biovidros, respectivamente,
com características vantajosas para o paciente.
Nas duas últimas décadas, vem aumentando o interesse pelo desenvolvimento de
dispositivos de fixação totalmente degradáveis com propriedades mecânicas semelhantes
às do osso. Os polímeros sintéticos biodegradáveis têm sido usados como sutura há mais
de 20 anos e suas propriedades físicas e químicas são bem conhecidas.
Vários estudos experimentais com implantes biodegradáveis, em cirurgia
ortopédica, têm sido publicados nos últimos anos e a efetividade de dispositivos
biodegradáveis utilizados na fixação de fraturas tem sido comprovada pela prática médica.
A busca de um copolímero biodegradável com propriedades antimicrobianas
contribuiria para a consolidação da fratura ao mesmo tempo em que reduziria o risco de
rejeição pelo organismo, melhorando significativamente o prognóstico do implante.
69
3.2 Referências:
[1]Wikipedia, a enciclopédia livre, disponível em http://pt.wikipedia.org/wiki/Amido.
Acesso em novembro de 2005.
[2]Química dos Polímeros e Aplicações - Parte II , disponível em
http://www.systemmud.com.br/index.php?pg=literatura&sub=literatura_home&artigo=
lit_002. Acesso em janeiro de 2006.
[3]DA RÓZ, A. L Plástico Biodegradável preparado a partir de Amido,
Polímeros v.13 no.4 São Carlos Oct./Dec. 2003.
[4]Rosa, D.S;. Franco, B. L. M;.Calil, M.R Biodegradabilidade e Propriedades Mecânicas
de Novas Misturas Poliméricas, Polímeros v..11 n.2 São Carlos, 2001.
[5]Rosa, D.S. ;. Chui, Q.S.H; Pantano Filho, R. ;.Agnelli, J. A. M Avaliação da
biodegradação de poli-β-(hidroxibutirato), poli-β-(hidroxibutirato-co-valerato) e poli-ε-
(caprolactona) em solo compostado, Polím. Ciênc. Tecn., v.12, n.4, p.311-317, 2002.
[6]SOARES, A.Q et al Polímeros biodegradáveis: novas perspectivas para as ciências
farmacêuticas, Rev. Eletr. Farm., vol2(2), 202-205, 2005.
[7]FEYNMAN, R.P. Da pedra lascada aos nanomateriais, Instituto Inovação,
disponível em www.institutoinovação.com.br/estudos/estudomateriais.pdf. Acesso em
setembro de 2005.
[8]OREFICE,R.L. Biopolímeros e polímeros biodegradáveis, Laboratório de Engenharia
de Polímeros e Compósitos, Universidade Federal de Minas Gerais, disponível em
http://www.demet.ufmg.br/docentes/ rodrigo/biopolímeros.htm Acesso em novembro
de 2005.
[9]FIALHO, S.L. et al Biodegradable implants for intraocular drug delivery, Arq. Bras.
Oftalmol., 66:891-6, 2003.
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perspectivas. Disponível em http://www.ifi.unicamp.br/extensao/arq_down/
nanobiotecnologiadoc. Acesso em janeiro de 2005.
[11]SANTOS, Y.E. Produção de planta-piloto é exportada para EUA, Alemanha e Japão,
disponível em http://www.ipt.br/institucional/imprensa/midia/?ID=260. Acesso em
maio de 2006.
70
[12]Cápsula com microesfera biodegradável reduz desconforto terapêutico; Portal da
Retina, disponível em http://www.portaldaretina.com.br/home/noticias.asp?id=86.
Acesso em novembro de 2005.
[13]BEISER,I.H.; KANAT,I.O. Biodegradable internal fixation. A literature review J. Am.
Pediatric. Med. Association, v.80, p.72-75, 1990.
[14]IANNACE,S.; AMBROSIO,L.; HUANG,S.J.; NICOLAIS, L. Poly(3-
Hydroxybutyrate)-co-(3-Hydroxyvalerate)/Poly-L-lactide blends: thermal and
mechanical properties, J. Appl. Polym. Sci. v.54, p.1525-1536, 1994.
[15]Polímeros ampliam sua utilização na área médica; Ciência, Tecnologia & Meio
Ambiente, disponível em http://www.radiobras.gov.br/ct/1997/materia_211197_8.htm.
Acesso em setembro de 2005.
[16]COUTINHO, B.C et al A importância e as vantagens do PHB,
http://www.cefetrn.br. Acesso em novembro de 2005.
[17]Brasil aperfeiçoa plástico que não agride meio ambiente, Ciência & Tecnologia,
http://www.radiobras.gov.br/ct/2002/materia_111002_3.htm. Acesso em novembro de
2005.
[18]PHB- plástico biodegradável, disponível em http://inventabrasilnet.t5.com.br/
plastico.htm. Acesso em novembro de 2005.
[19]ROGERO, S.O. et al. Citotoxicidade in vitro das membranas de hidrogel reticuladas
por radiação ionizante. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 59, p.1-5, 2000.
[20]ZACCHIGNA, M.; DI LUCA, G.; LASSIANI, L.; VARNAVAS, A.; BOCCÙ, E.
Properties of methoxy(polyethylene glycol)-lipase from Candida rugosa in organic
solvents Il Farmaco, v.53, p. 758-763, 1998.
71
4. POLI (CAPROLACTONA) – GENERALIDADES
4.1 Constituição química e métodos de síntese
Alguns biomateriais são projetados para degradarem no organismo de maneira
controlada por um período de implantação pré-determinado, de acordo com uma função
particular.
1
O polímero a ser utilizado como material implantável, por exemplo, em
sistemas de liberação controlada de fármacos ou que sejam utilizados como arcabouço para
sustentação de neoformação tecidual não devem exibir biodegradabilidade acelerada.
A poli (ε-caprolactona) (PCL) tem sido alvo de intensas pesquisas na área de
polímeros bioreabsorvíveis devido à combinação de suas propriedades de
biocompatibilidade e biodegradabilidade. A Figura 1 mostra o crescente interesse por esse
polímero em função das publicações de artigos científicos ao longo de quase uma década.
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
número de publicações
ano
Figura 4.1: Artigos científicos publicados sobre a PCL nos últimos 10 anos. Fonte:
Science Direct
72
Observa-se uma tendência de crescimento exponencial no número de publicações
científicas (Nº(P)) da PCL para propósitos biomédicos em função do ano considerado (x)
cuja equação prevista é dada por:
Nº (P) = 43,731e
0,1309x
Vários métodos de síntese do PCL têm sido propostos destacando-se a
polimerização aniônica, iniciação radicalar ou por abertura de anel. Entre os vários
métodos de polimerização, a polimerização por abertura de anel de lactonas cíclicas é uma
importante alternativa, pois o processo não gera grupos que possam limitar a conversão do
monômero em polímero.
2
A recente introdução de enzimas para a síntese do PCL em solventes orgânicos é
atrativa por desenvolver uma tecnologia sustentável e por seu potencial de sintetizar
materiais não disponíveis por métodos químicos. A Novozyme-435, lipase B da Candida
antarctica , imobilizada em resina acrílica macroporosa, tem sido efetiva para catalisar a
polimerização por abertura de anel do monômero ε-caprolactona.
2,3
Neste sentido, a
utilização de líquidos iônicos como solvente orgânico para conversão enzimática do
monômero ε-CL tem sido enfatizado pela literatura principalmente por não promoverem
uma desativação enzimática como a que ocorre com alguns solventes, como por exemplo,
o metanol. A literatura aponta como líquidos iônicos utilizados para a polimerização por
abertura de anel da ε-caprolactona o PF
6
e BF
4
, que combinam o mesmo cátion com
diferentes ânions. As reações experimentais foram conduzidas com lipase B C. antarctica
imobilizada (Novozym 435). Esses solventes não apresentaram um avanço em relação às
características dos polímeros obtidos com a utilização do tolueno devido à limitada
miscibilidade do polímero obtido.
3
Entretanto, o poder carcinogênico do tolueno aliado à
sua baixa volatilidade contribui para a seleção do método enzimático como uma boa
alternativa para a obtenção de PCL isento de resíduos do solvente aromático.
O crescimento da cadeia do poliéster em sistemas de iniciação enzimática envolve
provavelmente a abertura do anel do monômero por ataque nucleofílico da lipase,
rompendo a ligação C-O e a propagação da polimerização acontece pela adição de
monômero ao fim da cadeia polimérica ativa.
2,4
Em geral, a polimerização por abertura de anel da ε-CL iniciada por complexos de
ferro são exemplos de polimerização por mecanismo de coordenação-inserção. Estudos
indicam que o complexo L
2
1
Fe tenha alta atividade catalítica para polimerização por
abertura de anel da ε-CL. A produção do polímero foi aumentada proporcionalmente ao
aumento do tempo de polimerização enquanto o peso molecular médio foi reduzido. Essa
73
redução no peso molecular médio pode indicar uma reação de transesterificação inter ou
intramolecular durante o processo de polimerização, embora o complexo de ferro deva
inibir a reação de polimerização.
5
De maneira geral, as policaprolactonas são obtidas pela polimerização via abertura
do anel da e-caprolactona na presença de álcoois; variando-se o álcool reagente, obtêm-se
as caprolactonas dióis, trióis ou polióis, normalmente usadas na produção de poliuretanos
de alta resistência ou de poliuretanos termoplásticos (TPUs).
6
A reação de polimerização
da poli(caprolactona) por abertura do anel da ε-caprolactona é ilustrada na Figura 2.
Figura. 4.2: Reação de polimerização por abertura de anel do monômero ε-caprolactona.
4.2 Principais utilizações do PCL na medicina e odontologia
Recentemente o polímero PCL tem se destacado por suas aplicações como matriz
para o crescimento celular na engenharia de tecido ósseo, demonstrando possuir as
propriedades mecânicas necessárias para servir como um arcabouço em enxertos
aloplásticos, onde as propriedades mecânicas têm que ser mantidas até que o processo de
restauração do tecido biológico se complete.
7
A poli (ε-caprolactona) é um poliéster linear com caráter hidrofóbico como
resultado da presença de cinco grupos metilênicos não-polares e um único grupo éster
relativamente polar em cada unidade que se repete. Tem alta permeabilidade, natureza
semicristalina, alta solubilidade, baixo ponto de fusão e estabilidade ao calor.
8,9
74
O PCL é um polímero reabsorvível que, devido à sua biocompatibilidade, é
aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) para uso em seres humanos, sendo
atualmente utilizado como um material de sutura e em sistemas de liberação controlada de
fármacos.
Um biomaterial polimérico a ser implantado no organismo humano muitas vezes
tem sido associado a um aditivo que absorve a raios X, uma vez que materiais poliméricos
não são radiopacos, o que dificulta o acompanhamento da interação entre o material e o
organismo biológico. Muitos dos aditivos utilizados para a obtenção de polímeros
radiopacos são compostos minerais como sais de bário ou dióxido de zinco, entretanto, as
propriedades do polímero podem ser afetadas pela incorporação desses aditivos, além do
risco de ocorrência de toxicidade sistêmica à medida que ocorre a biodegradação. Outro
método para tornar o polímero biodegradável radiopaco é ligar covalentemente à cadeia
polimérica um agente que promova o radiocontraste, como o iodo.
Recentemente foi proposto um método para modificar quimicamente as cadeias
alifáticas do PCL, baseado na ativação aniônica do polímero pela remoção de um próton
do grupo metileno utilizando uma base não nucleofílica, como diisopropilamida de lítio
(LDA). Utilizando-se o iodo como uma espécie eletrofílica obtém-se o copolímero I-PCL
pela substituição do iodo na cadeia polimérica (Figura 3).
10
Figura 4.3: Esquema de adição de radiocontraste à PCL
Foi observado que a radiopacidade obtida esteve relacionada ao conteúdo de iodo
no polímero. A adição de iodo resultou ainda em uma grande degradação hidrolítica devido
à baixa cristalinidade e baixa massa molar do PCL. A literatura indica, pela análise de
75
difração de raios X, cristalinidade de 50% para o PCL enquanto a adição de iodo como
radiocontraste reduziu para 42% a cristalinidade do polímero.
10
A bioatividade da poli (ε-caprolactona) pode ser examinada pela formação de
apatita em sua superfície quando imersa em SBF (Simulated Body Fluid), fenômeno este
denominado de mineralização.
11
O fluido fisiológico simulado, ou SBF é uma solução cuja
composição química foi desenvolvida por Kokubo e outros na década de 90 para simular as
condições fisiológicas do organismo nos ensaios in vitro.
12
A Tabela 1 mostra a
composição química do SBF.
Tabela 4.1: Composição da solução SBF (mg.L
-1
)
12
Foi proposto um processo alternativo no qual o polímero é utilizado como
substrato, sendo alternada e repetidamente imerso em solução com íons cálcio e íons
fosfato. A apatita formada por esse processo é, entretanto, diferente estruturalmente da
apatita óssea. Uma apatita similar à encontrada no osso pode ser obtida se depositada a
partir de SBF com concentração iônica aproximadamente igual à do plasma sanguíneo
humano.
7
Assim, tem-se observado a formação de uma fina camada de apatita na
superfície da poli (ε-caprolactona) mantida em SBF por 24 horas após o polímero ter sido
previamente tratado com NaOH
aq
em meio aquoso e dopado alternadamente com íons
cálcio e fosfato. O compósito resultante apatita-PCL exibiu osteocondutividade, boa
biocompatibilidade e biodegradabilidade.
7
A superfície polimérica do PCL pode ser modificada com grupos funcionais que
induzam a nucleação da apatita a partir da imersão em SBF. Grupos funcionais como Si-
OH, Ti-OH, carboxila e carboxilato têm sido usados como grupos funcionais para
promover a mineralização a partir da deposição de apatita no polímero.
11
76
do módulo de elasticidade, mas com uma redução significativa da habilidade de
mineralização.
11
O polímero PCL tem sido utilizado para melhorar as propriedades mecânicas da
hidroxiapatita. Para se aliar as propriedades de osteocondutividade e bioatividade,
hidroxiapatita e PCL têm sido combinados para a obtenção do compósito HA-PCL.
13
Tem-se observado na literatura que o PCL propicia a proliferação e diferenciação
de fibroblastos e osteoblastos em cultura celular.
14
A mais importante função dos
osteoblastos é a mineralização do tecido, que é regulada por muitos fatores locais, entre os
quais as proteínas morfogenéticas do osso (BMP). As BMP têm a função de induzir a
diferenciação de células da linhagem osteoblástica e, portanto, aumentam o número de
células maduras e acentuam a função de diferenciação dos osteoblastos. As BMP regulam
o crescimento e a diferenciação das linhagens celulares de condroblastos e osteoblastos “in
vitro”.
Arcabouços de PCL com fosfato de cálcio provaram ser osteocondutores, bioativos
e atóxicos para células “in vitro”.
14
A observação de adesão celular e colonização do
arcabouço foram evidências de sua osteocondutividade. Ensaios “in vitro” sugerem que os
compósitos PCL - fosfato de cálcio são biocompatíveis apresentando boa adesão e
proliferação celular evidenciando osteocondutividade.
14
A osteocondutividade, como já
mencionado, é a capacidade das células migrarem, aderirem e proliferarem-se dando
seqüência à síntese da matriz óssea.
14
4.3 Propriedades biodegradáveis da poli (ε-caprolactona)
A biodegrabilidade deve ser um requisito para um material sintético que será
utilizado no reparo ósseo, uma vez que a melhor maneira de se reparar um defeito ósseo é
estimulando-se o próprio tecido ao auto-reparo. Para que ocorra uma substituição óssea
ideal as propriedades mecânicas devem ser mantidas, ou seja, a degradação deve ocorrer
num ritmo no qual seja possível que a regeneração óssea possa formar um tecido com as
propriedades mecânicas mais próximas do tecido original.
11
A poli (ε-caprolactona) é um poliéster semicristalino alifático dotado de uma
variedade de propriedades biocompatíveis como atoxicidade e reabsorção após período
apropriado de implantação.
15
A taxa de biodegradação da PCL pode variar
77
consideravelmente de acordo com as condições de sua síntese. O PCL e seus copolímeros
possuem excelentes propriedades químicas e mecânicas que podem ser utilizadas para uma
variedade de aplicações biomédicas.
7
A principal peculiaridade deste polímero advém do seu mecanismo de
biodegradação por hidrólise da ligação do éster e formação de produtos de decomposição
que são intermediários normais do metabolismo celular. Como já foi citado anteriormente
a taxa de decomposição da PCL pode variar de acordo com a copolimerização e com a sua
formulação.
15
Devido às suas baixas propriedades mecânicas, os compósitos PCL - material
inorgânico têm sido preparados para aplicações clínicas mais específicas. As características
de biodegradação da PCL são ressaltadas quando este polímero está associado em
compósitos com cargas inorgânicas, como ocorre com a sílica híbrida. A PCL é, neste
caso, responsável pela biodegrabilidade do sistema, portanto o controle da biodegradação
dependerá do conteúdo do polímero no sistema. Este controle, no entanto, implica na
determinação de um compósito PCL/sílica bioativo e biodegradável, ou seja, o controle do
conteúdo do polímero não deve implicar em perda de bioatividade e propriedades
mecânicas que sejam significativas para a recuperação do tecido biológico.
11
Considerando o compósito PCL-Si, é comprovado que a hidrofilicidade e a
biodegradabilidade podem ser atribuídas à fase sílica e a fase polimérica, respectivamente.
Quando mantido em SBF este compósito mostra a formação de uma camada de apatita de
baixa cristalinidade podendo-se produzir também camada de apatita semelhante ao osso.
Reafirma-se, portanto, a possibilidade de aplicar a PCL como substituto ósseo bioativo e
reabsorvível.
16
De modo geral, os copolímeros do PCL possuem um tempo de reabsorção maior
que o poli(ácido glicólico) (PGA). Tais copolímeros podem ser úteis para o projeto de
sistemas com tempo de reabsorção modulados, úteis para longos ou curtos intervalos de
tempo para a regeneração óssea.
Devido à combinação única de biocompatibilidade, permeabilidade e
biodegrabilidade, os polímeros e copolímeros do PCL são aplicados na medicina
principalmente como sutura biodegradável e próteses reabsorvíveis.
15,17,18
O PCL é também utilizado na produção de materiais microporosos e pinos para
reparos ósseos craniofaciais e maxilofaciais. Copolímeros em bloco de PCL-co-PGA
(monocryl
®
) oferecem menor rigidez que o PGA puro para ser utilizado como material de
sutura (Figura 4).
9
78
Figura 4.4: Embalagem comercial do fio de sutura Monocryl
19
e sutura após exodontia
20
Na odontologia a poli (ε-caprolactona) é base de um composto termoplástico
utilizado para obturação de canais radiculares no tratamento endodôntico oferecendo
estabilidade hidrolítica e grau de resistência ao corte superiores aos cones de guta percha
tradicionais.
Devido ao seu caráter hidrofóbico o PCL degrada mais lentamente permitindo a
liberação de fármacos que devem ser ativos ao longo do tempo. Estudos têm sido
realizados para encapsulamento de isoniazida, um agente microbiano, obtendo
microesferas e nanoesferas com baixa polidispersividade para aplicações em sistemas de
liberação controlada de fármacos.
21
Observa-se na literatura um aumento significativo de sistemas de liberação
controlada de fármacos baseados no polímero PCL. Tais estudos apontam para um
aumento da eficácia terapêutica, redução da toxicidade e melhora do processo de
administração ao paciente apresentando um avanço terapêutico em questões de segurança e
comodidade.
4.4 Utilização da poli (ε-caprolactona) conjugada com agentes
antimicrobianos
A maior causa do fracasso de implante de materiais sintéticos no organismo
humano é a rejeição provocada pelo desenvolvimento de infecções sistêmicas que podem
comprometer a saúde geral do paciente e levar ao óbito.
79
Não foi observada na literatura uma quantidade de trabalhos sobre PCL bioativo
quanto à atividade antimicrobiana.
22-25
O desenvolvimento de um PCL bioativo com relação às suas propriedades
antimicrobianas pode contribuir significativamente para o desenvolvimento de próteses
implantáveis. Neste sentido, o PCL poderia atuar como um sistema de liberação controlada
de um agente bioativo com propriedades antimicrobianas, prevenindo a proliferação
bacteriana local.
Um princípio ativo natural que nos chama a atenção do ponto de vista da química
farmacêutica é o eugenol. O eugenol possui a estrutura química de um fenol, um
antisséptico clássico cujo uso na prática clínica remonta há pelo menos 1 século.
80
4.5 Considerações finais
As publicações científicas da última década evidenciam um interesse crescente pelo
polímero poli(ε-caprolactona). A poli (ε-caprolactona) surgiu recentemente como um
polímero adequado para uso na engenharia de tecidos biológicos pela combinação de sua
biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades mecânicas satisfatórias para
utilização como arcabouço em enxertos ósseos.
A biodegradação da PCL por hidrólise resulta em subprodutos que são
intermediários normais do metabolismo celular, por isso pode ser utilizada em aplicações
biomédicas como suturas biodegradáveis, próteses reabsorvíveis e sistemas de liberação
controlada de fármacos. O caráter hidrofóbico leva a uma degradação lenta, ideal para o
projeto de sistemas de liberação controlada de compostos que devem permanecer bioativos
por longos períodos, além de favorecer a osseointegração.
Alguns compósitos baseados no polímero PCL são apontados na literatura com o
intuito de otimizar as propriedades mecânicas e biocompatíveis associando o polímero
biodegradável com sílica, hidroxiapatita ou fosfato de cálcio.
A associação das características físico-químicas próprias da poli(ε-caprolactona)
com agentes antimicrobianos incorporados poderia maximizar seu uso em aplicações
biomédicas solucionando problemas relacionados à ocorrência de infecções. Neste trabalho
procuramos associar as já conhecidas propriedades biocompatíveis do PCL e as vantagens
de seu uso em implantes biológicos a um agente microbiano, a fim de apresentar uma
alternativa para tratamentos de lesões ou defeitos do tecido ósseo. O agente antimicrobiano
selecionado neste trabalho foi o fitoterápico eugenol. Uma discussão sobre a origem e as
propriedades bioativas deste composto é assunto do próximo capítulo.
81
4.6 Referências
[1]SAAD, B.; NEUENSCHWANDER, P.; UHLSCHMID, G.K.; SUTER, U.W. New
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2
Cl
2
(thf)
2
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3
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83
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novel biodegradable antimicrobial polymer, Biomaterials, v. 21 (12), p. 1235-1246,
2000.
84
5. EUGENOL : OBTENÇÃO E APLICAÇÕES
5.1 Histórico sobre a utilização do eugenol
As especiarias tiveram um papel importante na história. Pelo seu valor, já foram
moeda de troca; hoje são reconhecidas pelas suas propriedades curativas. A palavra
"especiaria" deriva do latim species, que significa "frutos da terra". Mesmo tendo sido um
condimento essencialmente alimentar, hoje também são conhecidas as suas aplicações
terapêuticas. .
O cravo-da-índia (Canyophillus aromaticus) é uma planta originária das Ilhas
Molucas (ou Malucas, do malaico Maluku) e foi uma das primeiras especiarias a ser
comercializada.
As ilhas Molucas são um arquipélago de ilhas vulcânicas que fazem parte da
Indonésia, localizado entre os Celebes e a Nova Guiné (Figura 1). É limitado ao sul pelo
Mar de Arafura, a oeste pelos Mares de Bauda e das Molucas, ao norte pelo Mar das
Filipinas e a noroeste pelo Mar das Celebes. Estas ilhas eram conhecidas no século XVI
como Ilhas das Especiarias e uma delas foi invadida em 1511 por Afonso de Albuquerque.
Figura 5.1: Localização geográfica das Ilhas Molucas.
1
85
O cravo-da-índia foi uma das especiarias mais valorizadas no mercado do início do
século XVI, sendo um quilograma de cravo equivalente a 7 gramas de ouro. O cravo
(Figura 2) é o botão floral seco, contendo cerca de 15% de óleo essencial cujo principal
componente é o eugenol, daí seu odor característico.
No século XVI, quando chegaram às Ilhas Molucas, os portugueses imediatamente
dominaram as plantações, destruindo aquelas que não podiam vigiar de perto. Esse
monopólio fez com que o preço do cravo-da-índia no mercado ficasse muito alto.
Os holandeses que sucederam aos portugueses agiram da mesma forma e ganharam
o monopólio ao destruir todos os craveiros-da-índia, exceto aqueles que cresciam em uma
ilha de sua propriedade denominada Aubon. Finalmente, a França rompeu o monopólio e,
no começo do século XIX, a planta já era cultivada em grandes plantações em muitas
regiões tropicais. No Brasil, o cravo-da-índia é cultivado principalmente no nordeste, com
destaque para a Bahia.
O óleo do cravo-da-índia é usado há muito tempo no Ocidente devido às suas
propriedades anestésicas e antibacterianas locais, que provêm do seu óleo volátil: o
eugenol.
Figura 5.2: Cravo-da-índia comercializado (A) e botões floríferos do cravo (B).
2
O eugenol (Eg) (4-alil-2-metoxifenol) é um composto fenólico cuja concentração
no óleo essencial do cravo chega a 95%. Esse óleo volátil é obtido através da destilação
por arraste de vapor dos botões floríferos e pedúnculos florais do cravo da família das
mirtáceas.
3
(A)
(B)
86
O eugenol é um composto fenólico que tem como isômero o isoeugenol, no qual a
dupla ligação migra para uma posição conjugada com o anel benzênico (Figura 3). Os
produtos dessa reação têm aplicações farmacêuticas e cosméticas em uma variedade de
composições florais para fragrâncias.
4
Figura 5.3: Isômeros do eugenol.
A obtenção de isômeros do eugenol é geralmente conduzida em meio homogêneo
usando KOH em soluções alcoólicas a altas temperaturas, NaOH, KF, compostos contendo
Mg, Ni, Co, Cu, Zn combinados a Al, Fe, Cr, V, La. Alguns métodos podem ser utilizados
para síntese de isômeros do eugenol, tais como: precipitação seqüencial, co-precipitação,
adição reversa e adição instantânea. A síntese por co-precipitação mostrou melhor
conversão e formação apenas de isômeros cis e trans com maior proporção em volume
trans/cis. A Figura 4 ilustra a isomerização do eugenol na presença de MgAl.
4
Figura 5.4: Condução da reação de isomerização do eugenol.
sendo
87
Eugenol e isoeugenol pertencem à família do fenol e exibem atividade
antimicrobiana e antioxidante. Por terem ocorrência natural levam vantagem em relação
aos antioxidantes sintéticos no tocante à toxicidade, que embora existente é menos lesiva
aos tecidos do que os produtos sintéticos. O eugenol e seus isômeros são conhecidos por
inibirem radicais livres mediadores da peroxidação lipídica através de seus radicais
fenólicos.
5
Uma das propriedades atribuídas ao eugenol é o alívio da dor de origem dentária.
Trata-se de um bloqueador da condução nervosa que, em baixas concentrações, é capaz de
reduzir a transmissão sináptica neuromuscular. Vários estudos concluíram que o eugenol
inibe a ciclooxigenase, inibindo a síntese das prostaglandinas e favorecendo o efeito
analgésico e anestésico.
6
Baixas concentrações de eugenol inibem a atividade nervosa de modo reversível,
atuando como um anestésico local. No entanto, a exposição a altas concentrações (10
-2
a
10
-3
mol/L ) de eugenol bloqueia irreversivelmente a condução nervosa indicando um
efeito neurotóxico.
6
Tendo o óleo essencial de cravo propriedades analgésicas e antissépticas, pode ser
utilizado para anestesiar a dor de origem dentária apenas temporariamente, pois não age
sobre a cárie podendo causar necrose se utilizado isoladamente. Portanto, o eugenol é
medida paliativa para anestesiar a dor de dente por algumas horas. Deve ser evitado seu
uso interno por ser irritante para as mucosas e deve ser evitado também em feridas
expostas por ser alergênico.
7
Trabalhos na literatura apontam que o eugenol também tem propriedades
antissépticas, de estimulante cardíaco, circulatório, digestivo, respiratório e anti-
espamódico.
7
Diluído em óleo vegetal à concentração de até 1% (até 12 gotas do óleo essencial
para 30mL de óleo vegetal) pode ser usado como óleo de massagem para dores
musculares, artrites e reumatismo.
O óleo essencial de cravo pode ser usado juntamente com outros óleos essenciais
para inalação no caso de gripes e resfriados sendo indicada a proporção de 3 gotas de óleo
de cravo, 2 de eucalipto e 1 gota de alfazema para um litro de água.
3
O eugenol é utilizado na odontologia em reação com o Óxido de Zinco, em vários
procedimentos dentários, tais como:
9 Forramento (proteção do complexo dentina-polpa) em restaurações profundas
9 Curativo auxiliar da recuperação da polpa inflamada
88
9 Restaurações provisórias
9 Obturação de canais radiculares
9 Agente de cimentação temporária ou permanente de incrustações, coroas ou prótese
fixa.
9 Cimentos cirúrgicos
9 Pasta para moldagem de prótese total
9 Curativos em alvéolos
Figura 5.5: Embalagem comercial do pó de óxido de zinco e eugenol
A mistura de óxido de zinco e eugenol (Figura 5) proporciona fácil manipulação,
inserção e remoção, apresentando boa resistência à compressão. É também o curativo ideal
nas hiperemias pulpares e pulpites devido às suas qualidades analgésicas e antissépticas.
Associado à guta percha, material termoplástico composto predominantemente por uma
resina vegetal, é utilizado para obturação dos canais radiculares (Figura 6).
8
A hiperemia pulpar é uma inflamação reversível que representa a reação a um
agente agressor.Quando não há a remoção do agente causal, a inflamação evolui para um
quadro irreversível, a pulpite, que requer a remoção da polpa (pulpectomia).
89
Figura 5.6: Cones de guta percha, de diferentes diâmetros, para obturação dos canais
radiculares.
Os cimentos baseados no óxido de zinco e eugenol são os seladores de canal
radicular mais comumente utilizados.
O eugenol é fracamente ionizável e sua reação com o óxido de zinco é uma clássica
reação ácido-base resultando na formação do sal e eugenolato de zinco.
9
O cimento de óxido de zinco e eugenol consiste em grânulos de óxido de zinco em
uma matriz de eugenolato de zinco com unidades ligadas por forças de Van der Waals e
interações entre as partículas, tratando-se de um cimento mecanicamente frágil. Quando
em contato com o meio aquoso (a saliva, por exemplo) ocorre a hidrólise do eugenolato de
zinco resultando na liberação de eugenol e hidróxido de zinco.
6
A liberação do eugenol não é essencialmente afetada pela proporção pó/líquido do
cimento, mas sim pela espessura da dentina remanescente entre a câmara pulpar e a
cavidade que recebeu o cimento. A difusão do eugenol da dentina é dependente ainda da
quantidade de cálcio presente e na ligação entre o eugenol e a matriz orgânica da dentina,
principalmente o colágeno. Estudos têm revelado que as concentrações de eugenol que se
difundem pela dentina não possuem toxicidade.
6
Muitas pesquisas nos últimos anos têm revelado que o eugenol pode reduzir o risco
de cânceres específicos. Derivados fitoquímicos de frutas e vegetais referidos como
agentes preventivos incluem o eugenol.
10
Tais compostos mostraram suprimir a
90
proliferação de células cancerígenas além de inibir fatores de crescimento, induzir
apoptose, inibir angiogênese, suprimir a expressão de proteínas anti-apoptóticas e inibição
da ciclo-oxigenase 2.
10
Estes agentes quimiopreventivos têm recentemente sido estudados em medicina
alternativa para reverter a resistência química e radiológica em pacientes submetidos a
tratamentos contra o câncer tendo potencial para serem usados como adjuntos na terapia
desta doença. Apesar de sua corrente utilização, o eugenol pode acarretar, quando
utilizado em altas concentrações, em diferentes tipos de toxicidade, como danos diretos aos
tecidos, dermatites, reações alérgicas e disfunções hepáticas. A severidade do dano é
proporcional ao tempo de exposição, dose e concentração do fenol. O eugenol puro ou em
concentrações superiores a 10
-4
mol/L inibe a migração celular e modifica a síntese das
prostaglandinas afetando a respiração celular, atividade mitocondrial e alteração da
atividade enzimática da membrana celular.
6
5.2 Atividade antimicrobiana do eugenol
É fato bem conhecido na literatura que os óleos essenciais obtidos de materiais
vegetais (flores, botões, sementes, galhos, cascas, ervas, madeiras, frutas e raízes) possuem
atividade antibacteriana. O eugenol é um composto fenólico que tem mostrado atividade
bactericida na medida em que inibe a respiração e divisão celular. Neste caso, a parede
celular bacteriana é desnaturada pela presença do próton que causa a lise bacteriana.
6
O eugenol é tido como o componente dos óleos essenciais que melhor reduz a
atividade bacteriana, inibindo dessa forma o crescimento de Staphylococcus sp.,
Micrococcus sp. , Bacillus sp. , Enterobacter sp. por mais de 30 dias.
8,11
Um possível mecanismo da atividade antimicrobiana do copolímero PCl-co-Eg é
ilustrado na Figura 7.
91
Figura 5.7: Mecanismos da atividade antimicrobiana do eugenol (A) e ionização do
copolímero PCL-co-Eg com liberação do próton (B).
H
+
+
-
(A)
(B)
92
Nos últimos anos o governo brasileiro tem aumentado o interesse por produtos
bioativos de origem natural, devido às dúvidas em relação à segurança dos produtos
sintéticos. Atualmente são conhecidos mais de 300 óleos essenciais dos quais a maior parte
é utilizada em escala comercial nas áreas de cosméticos, perfumes, fitoterapia,
condimentos e nutrição devido às suas propriedades antibacteriana, antimicótica,
93
5.3 Considerações finais
A busca por produtos bioativos naturais para substituição de produtos sintéticos nas
áreas médica e farmacológica é uma tendência da ciência atual. No Brasil, a riqueza em
plantas medicinais é vantajosa nesse aspecto tornando viável no futuro a produção de
produtos bioativos naturais em escala comercial e minimizando os efeitos indesejados
inerentes ao uso de produtos sintéticos no organismo.
O eugenol é um importante e reconhecido agente antimicrobiano extraído do cravo-
da-índia que possui propriedades de analgesia e qualidades antibacterianas. Por tratar-se de
um composto fenólico, a liberação de prótons de sua estrutura desnatura a parede celular
bacteriana causando a morte do microrganismo.
Na odontologia o eugenol é amplamente utilizado na prática clínica em
restaurações provisórias, curativos, obturações dos canais radiculares e agente de
cimentação. Em baixas concentrações atua de forma reversível na percepção da sensação
de dor e não apresenta risco de toxicidade ao organismo humano.
Suas características antimicrobianas o tornam um importante fármaco de escolha
para ser associado a polímeros para sistemas de liberação controlada, podendo ser utilizado
em reparos ósseos minimizando o risco de ocorrência de infecções em materiais
implantados.
Neste trabalho, propomos a utilização do eugenol como princípio bioativo em
associação à poli(ε-caprolactona) a fim de reduzir a ocorrência de infecção após a
implantação do material no organismo biológico levando em consideração as propriedades
antimicrobianas do composto fenólico, bastante reconhecidas e já sedimentadas na prática
odontológica.
94
5.4 Referências
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foods-a review. Int. J. Food Microb.,v.94 p.223-253, 2004.
95
6. EXPERIMENTAL
6.1 Síntese do copolímero PCL-co-Eg.
O copolímero poli (ε-caprolactona-co-eugenol) (PCL-co-Eg) foi sintetizado através
da polimerização induzida por reação de complexo de transferência de carga (CTC)
conforme trabalhos publicados pelo grupo de pesquisa anteriormente.
1
O monômero ε-
caprolactona (Aldrich Co) foi adicionado ao reator de polimerização na concentração de
10-20 mM. Eugenol (Néon Co) foi adicionado ao sistema contendo a ε-caprolactona no
intervalo de concentrações de 1mM a 3mM. Após homogeneização, iodo ressublimado
(Quimesp Ltda) foi adicionado ao sistema reacional no intervalo de concentrações de 0,20-
0,60 mM. A reação de polimerização foi conduzida isotermicamente por 8 horas em
atmosfera ambiente sendo interrompida pela adição de etanol para precipitação do
copolímero resultante, PCL-co-Eg.
O iodo residual foi removido do copolímero após tratamento com solução de
tiossulfato de sódio (Na
2
S
2
O
3
, Merck) 1M e agitação constante por 24 horas à temperatura
ambiente (25ºC) O iodo livre (I
2
) reage com a solução de Na
2
S
2
O
3
segundo a reação:
2
Na
2
S
2
O
3
+ I
2
2 NaI + Na
2
S
4
O
6
O copolímero PCL-co-Eg foi então lavado com água destilada e deionizada para
remoção do NaI e Na
2
S
4
O
6
, desidratado em etanol e seco sob vácuo a temperatura
ambiente até atingir peso constante.
O copolímero resultante foi caracterizado por técnicas físico-químicas e
bioquímicas. As técnicas físico-químicas envolveram a espectroscopia eletrônica UV/Vis,
microscopia eletrônica de varredura (MEV), a ressonância magnética nuclear de prótons
(
1
H-RMN), análise térmica (calorimetria exploratória diferencial - DSC) e a cromatografia
de permeação em gel (GPC).
96
Figura. 6.1: Espectrofotômetro UV/Vis Cary 50 utilizado na caracterização do sistema
ε-CL:I
2
e Eg-I
2
A composição de Eg no copolímero foi estudada por ressonância magnética nuclear
de prótons (
1
H-RMN, Bruker 200 MHz). O solvente utilizado para as amostras foi o
clorofórmio deuterado.
O copolímero obtido foi caracterizado quanto à distribuição de peso molecular por
cromatografia de permeação em gel em HPLC da Waters modelo 510. Na análise por
GPC, o solvente THF foi utilizado como eluente (fluxo 1,0 mL.min
-1
, pressão 550 psi). A
curva de calibração foi determinada com polietileno glicol (PEG) de pesos moleculares
194, 960, 4250, 18.600, 64.700 e 450.000 g.mol
-1
, respectivamente.
3-5
O sistema analítico
consistiu de um cromatógrafo HPLC-510 da Waters equipado com detector 2414 (índice
de refração). Foram utilizadas colunas de Plgel acopladas em série (10
4
Å + 10
3
Å + 10
2
Å,
tamanho da partícula =5µm). O volume de injeção da amostra foi de 20µL. A aquisição e
tratamento dos dados cromatográficos foram efetuados com software SW da Waters
Breeze 3.3. A empresa Petroquímica União /SP gentilmente realizou as análises por
GPC.
3-5
As características térmicas do copolímero foram estudadas através da análise
térmica (Metler TA 4000).
A microestrutura do copolímero com relação à morfologia dos pós obtidos foi
estudada através da microscopia eletrônica de varredura (MEV, JEOL)
Os princípios fundamentais envolvidos em cada técnica de caracterização físico-
química são discutidos a seguir.
97
6.2 Caracterização Físico-Química
6.2.1 Cromatografia de Permeação em gel
A cromatografia é uma técnica da química analítica utilizada para a separação de
misturas e substâncias baseada no princípio da adsorção seletiva. Esta técnica foi
descoberta em 1906 pelo botânico Mikahail Tswett, mas passou a ser amplamente utilizada
após a década de 30.
6
A descoberta da técnica se deu quando Tswett obteve clorofilas
(pigmentos encontrados em plantas) adicionando um extrato de folhas verdes em éter de
petróleo sobre uma coluna com carbonato de cálcio em pó em um tubo de vidro vertical.
Os componentes individuais da mistura migraram para baixo enquanto a solução percolou
pela coluna, esses componentes migraram em diferentes taxas de velocidade resultando
numa marcação em gradientes horizontais de cores ao longo da coluna.
6
A cromatografia tornou-se então um método de separação físico no qual os
componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma estacionária e outra
móvel. A cromatografia ocorre como resultado de processos repetidos de adsorção e
desorção durante o movimento dos componentes da amostra ao longo da fase estacionária,
e a separação é devida à diferença de constantes de distribuição de cada um dos
componentes da amostra. A distinção entre os principais métodos cromatográficos é feita
em termos das propriedades da fase móvel.
Na cromatografia de permeação em gel (GPC) a separação de diferentes
moléculas em solução é realizada com base na diferença do seu tamanho efetivo ou
volume hidro-dinâmico (Figura 2). A separação ocorre com a injeção da solução em fluxo
contínuo de solvente que passa por géis altamente porosos. O fenômeno ocorre porque as
moléculas com pesos moleculares menores entrarão nos poros menores mais facilmente,
99
Figura 6.3: Equipamento para cromatografia de permeação em gel (GPC) Waters, modelo
510 utilizado neste trabalho. O equipamento pertence à Petroquímica União/
SP.
6.2.2 Ressonância Magnética Nuclear de Prótons (
1
H-RMN)
10-12
A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é reconhecidamente a
técnica mais importante para a investigação a nível molecular, permitindo obter
informação estrutural e dinâmica para qualquer estado da matéria. Em particular é um
método decisivo na determinação de estruturas tridimensionais de moléculas no estado
líquido. A RMN ocupa, igualmente, um lugar de destaque no campo da análise qualitativa
e quantitativa e sua aplicação estende-se desde a análise de componentes em produtos
alimentícios até a análise de fluidos biológicos e metabolitos em tecidos e órgãos de seres
vivos, de modo não invasivo e não destrutivo. A caracterização espacial do sinal de RMN
da água (juntamente com o desenvolvimento acelerado das capacidades de computação)
permitiu, também, um grande desenvolvimentW
100
Tabela 6.1: Número quântico de spin para alguns núcleos atômicos.
Número de
Prótons
Número de
Nêutrons
Número Quântico de
Spin
Exemplos
Par Par 0
12
C,
16
O,
32
S
Ìmpar Par 1/2
1
H,
19
F,
31
P
Ímpar Ímpar 3/2
11
B,
35
Cl,
79
Br
Par Ímpar 1/2
13
C
Par Ímpar 3/2
127
I
Par Ímpar 5/2
17
O
Ímpar Ímpar 1
2
H,
14
N
Quando elementos com número quântico de spin, como o hidrogênio, são expostos
a um campo magnético estático, forte e homogêneo, os núcleos dos átomos se comportam
como magnetos e seus spins se alinham na direção do campo aplicado (Figura 4).
Rigorosamente, núcleos não apresentam spin, mas sim momento angular (exceção
feita somente ao núcleo do isótopo 1 do hidrogênio, que é constituído de um único próton).
Embora o spin possa ser considerado um momento angular, por terem ambos as mesmas
unidades e serem tratados por um formalismo matemático e físico semelhante, nem sempre
o oposto ocorre. O spin é intrínseco, ao passo que objetos compostos têm momento angular
extrínseco. Contudo, motivos históricos levaram a esse abuso de linguagem, tolerado em
textos não rigorosos. Um motivo a mais de complicação é o fato de que a moderna física
de partículas e campos considera que certas partículas, antes pensadas como elementares
(e, portanto possuindo spin), sejam compostas (próton e nêutron compostos de quarks).
Assim, fica um tanto impreciso o limite entre os casos onde se deva usar o termo spin e os
casos onde se deva usar o termo momento angular.
101
Figura 6.4: O efeito de um campo magnético externo sobre o núcleo do hidrogênio.
O alinhamento dos spins dos núcleos pode ser perturbado por um pulso curto de
ondas de rádio (RF) que serve para tirar os spins do núcleo de sua orientação paralela ao
campo magnético e para fornecer a energia necessária para movimentos do tipo giroscópio
dos spins dos núcleos, denominados de precessão. Quando o pulso de RF é retirado, o
núcleo tende a voltar para sua situação original e, assim fazendo, libera energia em forma
de ondas de rádio. A freqüência dessas ondas de rádio é distinta para diferentes espécies de
átomos, assim como para um dado átomo em diferentes meios químicos ou físicos.
Portanto, os núcleos ressonantes tornam-se transmissores de ondas de rádio com
freqüências características e revelam sua presença no polímero pelos seus sinais RF.
Uma carga girando como a de um núcleo
1
H
1
gera um campo magnético que tem
um momento magnético a ele associado. Tal núcleo pode ser considerado como a barra de
um imã. Quando um campo magnético externo (H
o
) é aplicado, o núcleo tenta alinhar seu
momento magnético ao longo da direção do campo. O número quântico de spin do núcleo
é designado por I, havendo 2I + I orientações e correspondentes níveis de energia possíveis
para um núcleo magnético relativo ao campo externo.
Um próton de
1
H
1
tem um número quântico de spin de ½; tendo portanto 2
orientações possíveis, paralelo e antiparalelo ao campo magnético externo. Na ausência de
um campo magnético, cada próton tem a mesma energia nuclear de spin e os spins são
orientados em direções caóticas. Na presença de um campo magnético, os spins do próton
102
são alinhados paralelos ou antiparalelos ao campo e a diferença de energia entre estas duas
orientações (ΔE) é proporcional à intensidade do campo magnético externo, Ho:
o
H
h
hE
π
γ
ν
2
==Δ
(1)
sendo γ = a razão giromagnética (uma constante para um dado núcleo), H
o
é a intensidade
do campo magnético externo e h é a constante de Planck. Esta variação no espaçamento
entre níveis de energia (E) como função da intensidade do campo aplicado (H
o
) é mostrada
na Figura 5.
De acordo com a equação 1
quando prótons são colocados em um campo
magnético que tem uma intensidade fixa, haverá uma freqüência definida separando os
dois níveis de energia. Na prática um campo de 14.100 Gauss requer uma freqüência de 60
MHz de energia (da região de radiofreqüência do espectro eletromagnético) para a
transição entre as orientações. Em um campo de 23.500 Gauss, 100 MHz são necessários;
para um campo de 47.000 G, 200 MHz são necessários. É importante notar que 60 MHz
corresponde à uma quantidade muito pequena de energia (6.10
-3
cal.mol
-1
), significando
que o número de moléculas no estado fundamental é ligeiramente superior ao número de
moléculas no estado excitado.
Figura 6.5: Separação dos níveis de energia de spin para um núcleo em função de um
campo magnético externo (H
o
).
103
Para obter-se um espectro RMN de uma amostra, esta é colocada no campo
magnético no espectrômetro e um campo de radiofreqüência é aplicado, passando-se uma
corrente por uma espira que envolve a amostra. O campo magnético é aumentado aos
poucos e a excitação ou oscilação dos núcleos de uma orientação para outra é detectada
como uma tensão induzida, resultando na absorção de energia do campo de
radiofreqüência. Portanto, um espectro de RMN é um gráfico de voltagem induzida contra
a varredura do campo magnético. A área sob o pico depende do número total de núcleos
que estão oscilando.
A energia absorvida por um núcleo pode ser liberada por relaxamento spin-spin, no
qual a energia de spin é transferida a um núcleo vizinho, ou por relaxamento spin-rede, no
qual a energia do spin é convertida em energia térmica. Os núcleos são, deste modo,
excitados do estado de spin mais baixo ao mais alto por um campo de radiofrequência. Eles
retornam espontaneamente ao estado de energia mais baixo para serem excitados
novamente e assim por diante.
Se o núcleo de hidrogênio é parte de uma molécula e esta molécula é colocada em
um campo magnético, o campo induz uma circulação de elétrons em torno do próton em
um plano perpendicular ao campo externo. Esta carga circulante, por sua vez, gera um
campo magnético induzido na região do núcleo que está geralmente oposta ao campo
externo. Esta carga circulante por sua vez gera um campo magnético induzido na região do
núcleo que está geralmente oposta ao campo externo. Os elétrons que envolvem o próton
são ditos blindarem o próton se o campo induzido se opõe ao campo externo, como
apontado pela Figura 6. Neste caso, os elétrons blindam o núcleo dos efeitos do campo
externo.
Figura 6.6: Blindagem (H induzido) causada por elétrons circulando em torno do núcleo
em plano perpendicular ao campo externo (H
o
).
104
Por outro lado, os elétrons são ditos desblindarem o núcleo se o campo induzido
aumenta o campo externo. Núcleos de hidrogênio em ambientes diferentes possuem
densidade eletrônica maior ou menor em torno deles, e são blindados ou desblindados em
proporções diferentes por elétrons que circulam. O resultado é que o próton é sujeito a um
campo magnético líquido ou efetivo:
H
efetivo
= H
externo
-H
induzido
(2)
Quando ocorre a varredura do campo magnético, nem todos os prótons oscilam na
mesma intensidade do campo. A intensidade do campo na qual oscilam depende de quanto
eles são blindados, o que por sua vez, depende dos ambientes químicos.
Como o campo magnético efetivo sentido pelo núcleo é levemente afetado
(perturbação essa geralmente medida em escala de partes por milhão) pelos débeis campos
eletromagnéticos gerados pelos elétrons envolvidos nas ligações químicas (o chamado
ambiente químico nas vizinhanças do núcleo em questão), cada núcleo responde
diferentemente de acordo com sua lo.2 1t
105
desta dissertação, prof. Alvaro A.A. de Queiroz é pesquisador visitante. As amostras do
copolímero foram dissolvidas em clorofórmio deuterado (CDCl
3
) sendo utilizado como
referência interna o tetrametil silano (CH
3
)
4
Si. A Figura 7 ilustra os equipamentos de RMN
utilizados neste trabalho.
Figura 6.7: Equipamento de RMN Bruker 300 MHz (A) e Bruker 500 MHz (B) do
ICTP/CSIC. Nota-se em (B) a introdução da amostra no equipamento de
RMN.
6.2.3 Análise Térmica (DSC)
A Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) é uma técnica térmica muito
utilizada para a caracterização da cristalinidade e da transição vítrea em biomateriais. O
princípio da técnica consiste na caracterização das alterações cristalinas ocorrida no
material em função da temperatura. Tem sido muito utilizada na indústria farmacêutica
para teste de pureza das amostras de fármacos.
7,13
Na análise por calorimetria diferencial de varredura DSC, quando uma amostra
sofre uma transição térmica, um circuito termoelétrico permite comparar a temperatura da
(A)
(B)
106
amostra com relação à temperatura de um sistema de referência e, deste modo, é gerado
um sinal proporcional e a área sob a curva registrada no gráfico obtido é uma medida
direta do calor desta transição.
7
As diferenças no fluxo de calor na substância e referência são medidas em função
da temperatura da amostra enquanto as duas estão submetidas a um programa de
aquecimento a temperatura controlada. Para se obter os dados de calorimetria exploratória
diferencial são utilizados o método de compensação de potências ou de fluxo de calor. No
primeiro a amostra e o material referência são aquecidos por aquecedores separados sendo
que suas temperaturas são mantidas iguais enquanto as temperaturas são variadas
(aumentadas ou diminuídas) linearmente. Já no método de fluxo de calor a diferença desse
fluxo sobre a amostra e a referência é medida conforme a temperatura é alterada, sendo
aumentada ou diminuída, de maneira linear.
Na técnica DSC de compensação de potências são usados dois fornos
independentes para aquecimento da amostra e da referência. São encontrados modelos
comerciais nos quais os fornos estão embutidos em um sistema de dissipação de calor de
temperatura controlada, acima deles estão os suportes para amostra e referência com
termômetros de resistência de platina embutidos para monitorar as temperaturas dos dois
materiais continuamente. São empregados dois circuitos de controle para a obtenção de
termogramas diferenciais para controlar a temperatura média e a temperatura diferencial.
No caso da temperatura média, um programador fornece um sinal elétrico proporcional à
temperatura média desejada para os suportes da amostra e da referência em função do
tempo. Este sinal é então comparado computacionalmente com a média dos sinais dos
detectores da amostra e da referência embutidos nos suportes. No circuito de temperatura
diferencial os sinais da amostra e da referência advindos do sensor de platina são
alimentados em um amplificador diferencial por um circuito que compara ambos
determinando qual é o maior. A saída do amplificador ajusta as potências de entrada aos
dois fornos de tal modo que suas temperaturas sejam mantidas idênticas, isto é, ao longo
do experimento amostra e a referência são isotérmicas. Um sinal proporcional à diferença
entre a potência de entrada dos dois fornos é transmitido ao sistema de aquisição de dados.
A diferença na potência é a informação normalmente expressa em gráfico em função da
temperatura da amostra.
Na análise por DSC de fluxo de calor, o calor flui tanto na amostra como na
referência através de um disco de constantan termoelétrico aquecido eletricamente. Sobre
esse disco são colocadas plataformas sobre as quais são posicionadas panelas de alumínio
107
para amostra e referência. O fluxo diferencial de calor na amostra e referência é
monitorado por termopares de área de Chromel/constantan, formados pela junção entre a
plataforma de constantan e os discos de Chromel, conectados na parte de baixo das
plataformas. O fluxo diferencial de calor entre os dois pratos é diretamente proporcional à
diferença na saída das junções dos termopares. A temperatura da amostra é estimada por
meio da junção Chromel/alumel sob o disco da amostra.
13
As amostras deste trabalho foram seladas em um porta-amostra (“panela”) de
alumínio de DSC para amostras sólidas. Tipicamente, a massa utilizada em cada análise
variou entre 5 e 10mg. Os copolímeros PCL-co-Eg foram analisados a 10ºC/min sob fluxo
de nitrogênio. Os experimentos foram feitos segundo o programa: i) aquecimento a partir
da temperatura ambiente até 120ºC e tratamento isotérmico nesta temperatura por 5
minutos; ii) resfriamento até -120ºC e estabilização nesta temperatura durante 5 minutos;
iii) aquecimento até 120ºC.
Após a eliminação da história térmica do material, as amostras foram resfriadas a
uma taxa de 3ºC/min até a temperatura ambiente. Medidas realizadas com padrões índio e
estanho permitiram observar alta repetitividade e a reprodutibilidade do equipamento de
DSC, tanto em relação ao perfil da curva obtida como em relação aos valores de
temperatura das transições de primeira ordem (fusão). O equipamento utilizado neste
trabalho é ilustrado na Figura 8.
Figura 6.8: Equipamento para análise térmica Metler TA 4000.
108
6.2.4 Microscopia Eletrônica de varredura (MEV)
Os primeiros microscópios eletrônicos apresentavam a limitação das imagens
serem geradas somente em duas dimensões, referindo-se exclusivamente ao interior do
material, não sendo possível observar a superfície das amostras. Para superar essa
limitação Knoll, em 1935, gerou a primeira imagem por varredura de elétrons. Pelo novo
método, o feixe não era fixo, mas varria a amostra a ser observada através de uma
seqüência de linhas. Os elétrons que são espalhados pela superfície são captados por
sensores que geram a imagem, ou seja, ao contrário do microscópio de transmissão, no
microscópio eletrônico de varredura (MEV) a imagem é processada e não gerada
diretamente. Em 1938 o alemão von Ardenne publicou o primeiro trabalho propondo o
novo método, mas as pesquisas acabaram sendo interrompidas, quando seu primeiro
protótipo foi destruído por um bombardeio em 1944. Assim, o primeiro microscópio
eletrônico de varredura acabou surgindo somente em 1947, na Universidade de Cambridge,
construído por Charles Oatley.
O MEV trouxe a possibilidade de observar estruturas que estavam inacessíveis pelo
microscópio ótico, além de gerar uma série de sinais através do choque dos elétrons, uma
radiação ionizante de alta energia, com os átomos da amostra. Entre esses sinais temos os
raios-X, cujos comprimentos de onda são característicos de cada espécie atômica. Dessa
forma os microscópios eletrônicos podem gerar análises químicas de cada fase
simultaneamente à geração das imagens, o que representa um grande avanço na área de
caracterização de materiais.
14
A Microscopia Eletrônica de Varredura permite portanto, a obtenção de
informações estruturais e químicas de amostras diversas. A técnica (Figura 9) consiste na
incidência de um feixe de elétrons de alta energia na superfície da amostra onde, após
interação, parte do feixe é refletida e coletada por um detector que converte este sinal em
imagem de elétrons retroespalhados (BSE) ou nesta interação a amostra emite elétrons
produzindo a chamada imagem de ES (elétrons secundários). Ocorre também a emissão de
raios-X que fornece a composição química elementar de um ponto ou região da superfície,
possibilitando a identificação de praticamente qualquer elemento presente.
9
A Figura 10
ilustra o equipamento utilizado neste trabalho.
109
Figura 6.9: Fluxograma da técnica MEV.
Figura 6.10: Microscópio eletrônico de varredura (MEV) Philips XL 30 (IPEN/USP).
Injeção de
elétrons
Filamento
Bobinas de
varredura
Lente final
Amostra Detector
Tela TV
110
6.3 Caracterização Bioquímica
A utilização de materiais sintéticos em contato com o fluido biológico requer
desses materiais algumas características biológicas fundamentais para que o tecido, ou
mesmo a função biológica sejam restaurados no organismo humano.
Neste trabalho selecionaram-
111
ser degradado pela ação de enzimas. Um biomaterial que seja utilizado para promover ou
guiar um reparo ósseo deve sofrer degradação à medida que o tecido é neoformado.
Para análise da ocorrência de biodegradação bem como da velocidade em que
ocorre esse processo foram utilizadas pastilhas do polímero e do copolímero PCL-co-Eg.
As pastilhas foram mantidas sob imersão em solução fisiológica à temperatura constante de
37ºC e posteriormente mantidas em dessecador, sendo esse processo alternado a cada 24
horas, a fim de avaliar a ocorrência de perda de massa devido a processos hidrolíticos.
O estudo da biodegradabilidade dos copolímeros PCL-co-Eg também foi realizado
após a imersão em solução PBS, pH 7,4 a 37ºC contendo as enzimas lipase (45 U.mL
-1
) e
coleterol estearase (40 U.mL
-1
). O procedimento para análise da hidrólise enzimática foi
também baseado na imersão e dessecação das amostras como no ensaio para degradação
em solução fisiológica.
6.3.3 Estudo da atividade antimicrobiana
Uma das principais complicações pós-cirúrgicas no que se refere a materiais
sintéticos implantados no organismo é o desenvolvimento de infecções. A adesão de
microrganismos nas superfícies desses materiais resulta no desenvolvimento de colônias
bacterianas que podem levar não só ao comprometimento do enxerto como do estado de
saúde do paciente. Um material bioativo deve, portanto, prevenir esse tipo de complicação.
No compósito PCL-co-Eg o antimicrobiano eugenol foi introduzido com o objetivo
de atuar como um agente bactericida, prevenindo infecções pós-operatórias e otimizando o
prognóstico do enxerto. O eugenol é amplamente utilizado na área odontológica em
tratamentos de canal (endodontia), restaurações profundas, cimentações de próteses,
cimentos pós-cirúrgicos em intervenções periodontais devido às suas reconhecidas
propriedades antimicrobianas. Trata-se de um composto fenólico que através de seu
grupamento hidroxila atua na parede celular bacteriana desnaturando proteínas e causando
a morte deste organismo.
Dentre os microrganismos encontrados nas superfícies de implantes estão a
Escherichia coli e Staphylococcus aureus, bactérias essas presentes na secreção salivar.
112
Escherichia coli pode ser encontrada na flora intestinal humana advinda da
alimentação, água ou até mesmo ar contaminados. Trata-se de uma bactéria gram – que
pode ser encontrada em cirurgias do trato gastrointestinal
3,15
O Staphylococcus aureus é comumente encontrada em infecções hospitalares. Por
estar relacionada a ambientes cirúrgicos é detectada em diversos tipos e locais de
implantes. Trata-se de uma bactéria gram +.
4,5,16-18.
Para o ensaio da atividade antimicrobiana utilizou-se o método de Kirb-Bauer,
recomendado pelo “Center For Disease Control” (EUA) para determinação de
sensibilidade aos antimicrobianos por fornecer resultados correlacionáveis com as
diferentes concentrações inibitórias mínimas sanguínea e urinária
19-21
Como preparo das placas, o meio é fundido e resfriado a 45ºC. Foram distribuídas
alíquotas de 50 a 45mL em placas de 150 mm que foram esfriadas sobre superfícies planas
para formar uma camada uniforme de meio com 4 mm de altura. O meio padronizado é o
de Muller-Hinton e o pH deve ser 7,2 -7,4.
Para o preparo do inoculo foram emulsionadas 4 colônias iguais em 5ml de caldo
de triptose, incubadas por 4 hs a 37ºC e ajustada a suspensão para o padrão 0,5 da escala de
Mc Farland: 0,5ml de BaCl
2
a 1% + 99,5ml H
2
SO
4
a 1% que corresponde a 1,5x10
8
microrganismos por mL. Um cotonete estéril foi embebido no inoculo e a suspensão
bacteriana foi espalhada homogeneamente sobre a superfície do meio, após alguns minutos
foram colocadas as pastilhas do polímero e do copolímero PCL-co-Eg em diferentes
concentrações de eugenol. As amostras foram previamente esterilizadas com raios gama
(Rγ) na dose de 25 KGy para que fosse excluída qualquer possibilidade de contaminação
durante o preparo das pastilhas. As placas de Petri foram incubadas a 37ºC por 18hs para
posterior leitura dos resultados com base no diâmetro da zona de inibição de crescimento
bacteriano encontrada para cada amostra.
22,23
.
6.3.4 Citotoxicidade
A norma ISO 10993 formula as regras e sugere alguns testes para avaliar os efeitos
biológicos adversos de materiais (metais, cerâmicas, polímeros ou compósitos) utilizados
em dispositivos médicos. Segundo a parte 1 da referida norma, o teste de citotoxicidade in
vitro deve ser um dos ensaios iniciais para avaliar a biocompatibilidade de qualquer
113
biomaterial. Após a verificação da ausência de toxicidade, o estudo da biocompatibilidade
do biomaterial pode prosseguir com a realização de outros ensaios in vitro
(genotoxicidade, hemocompatibilidade, etc.) e in vivo em animais de laboratório
(sensibilidade, implante, etc.). Algumas vantagens do teste de citotoxicidade incluem a
rapidez, a sensibilidade (capacidade de distinguir entre materiais tóxicos e não tóxicos) e o
baixo custo.
Os testes de citotoxicidade in vitro se baseiam no contato do biomaterial ou do seu
extrato com uma cultura celular de mamíferos. As alterações celulares são verificadas por
diferentes mecanismos tais como a incorporação de um corante vital ou a inibição da
formação de colônias celulares. A viabilidade celular é o parâmetro mais utilizado para
avaliar a toxicidade do material. As membranas celulares podem ser danificadas por muitas
substâncias, resultando na diminuição da captura de um corante vital. Assim, a
quantificação das células vivas, danificadas ou mortas pode ser efetuada pela intensidade
de cor da cultura celular em um espectrofotômetro.
No presente trabalho o teste de citotoxicidade foi baseado na avaliação quantitativa
de células viáveis depois de expostas ao extrato do biomaterial, e pela incubação com um
corante supravital chamado MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-y)5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-
sulfofenil-2H-tetrazolio) e um reagente de acoplamento eletrônico PMS (metassulfato de
fenazina). O MTS é bioreduzido por células a um produto formazan que é solúvel no meio
de cultura do tecido. A análise colorimétrica do corante incorporado é, então, realizada. A
quantidade de MTS (marcador da viabilidade celular) absorvida pela população de
células, é diretamente proporcional ao número de células viáveis na cultura.(CORY A.H.,
1991). A toxicidade induzida pela amostra sob teste é medida em uma faixa de
concentrações de extrato do biomaterial e a concentração que produz uma redução em 50%
da absorção de MTS é tomada como o parâmetro de toxicidade.
O extrato do biomaterial foi preparado de acordo com a ISO 10993-5, que
preconiza uma razão entre a área da superfície e o volume do veículo de extração no
intervalo de 0,5 a 6,0 cm
2
/mL. Amostras de 4 cm
2
foram esterilizadas por autoclavagem a
120
0
C por 20 min e então 4 mL de RPMI 1640 foram adicionados e incubados a 37
0
C por
48 h. O extrato obtido foi empregado no teste de citotoxicidade com uma cultura de células
de ovário de hamster chinês (CHO K1).
As células CHO foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal
bovino (SFB) e 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina). Uma microplaca de cultura
celular com 96 poços foi preparada com diluições crescentes (100, 50, 25, 12,5, e 6,25%)
114
do extrato do biomaterial (50 μl/poço, 4 poços/cada diluição). Em seguida, 50 μl da
suspensão celular (3000 células) foram dispensadas nos poços. Colunas de controle de
quatro poços foram preparadas com o meio sem células (branco) e meio mais células
(controle negativo). A microplaca foi incubada sob atmosfera úmida de 5% de CO
2
. Após
72h, 20 μl de uma mistura (20:1) de 0,2% de MTS e 0,09% de PMS em PBS (solução
tamponada de fosfato) foi adicionada aos poços e deixada por 2 h. A incorporação do
corante foi medida pela leitura de absorbância a 490nm em leitor de microplacas contra a
coluna do branco. O índice de citotoxicidade (IC
50%
) foi estimado por interpolação, como a
concentração do extrato que resulta em 50% de inibição da absorção de MTS, após a
construção de um gráfico com a média de porcentagem de células vivas contra a
concentração do extrato (%). Paralelamente ao ensaio, uma solução de fenol 0,3% e o
polímero PEAD foram usados, respectivamente, como controles positivo e negativo.
6.3.5 Hiperemia
Diferentes materiais sintéticos orgânicos e seus híbridos orgânico-inorgânicos têm
sido utilizados como implantes na medicina
26
. Do ponto de vista da bioengenharia o
enxerto ideal seria aquele cuja topologia fosse consistente com o tecido biológico, deveria
ser facilmente obtido e moldado e de baixo custo. Do ponto de vista bioquímico o material
sintético “candidato” a biomaterial deveria causar o mínimo de reação tecidual não
induzindo ou causando a inflamação.
27
Neste trabalho a atividade inflamatória do copolímero PCL-co-Eg foi avaliada
medindo-se a atividade da fosfatase alcalina no exsudato pós-implante, segundo
metodologia experimental descrita por Marchant e outros
28
. Foram utilizados 10 ratos
Wistar albinos, adultos, machos, sadios, com peso variando entre 250 e 300 gramas,
alojados no biotério da Faculdade de Farmácia da Universidade Complutense de Madri-
Espanha. Os animais foram alocados em gaiolas apropriadas, máximo de cinco por gaiola,
e receberam ração própria para ratos e água ad libitum.
Todos os animais do experimento foram submetidos ao mesmo protocolo
anestésico. A tranqüilização foi realizada com mistura de fentanil-droperidol (Inoval) na
dose de 0,3 mL/kg por via intramuscular e após 10 minutos foi feita indução anestésica
com associação de tiletamina e zolazepam (Zoletil-50) na dose de 0,4 mL/kg de peso vivo.
115
Na manutenção da anestesia foi empregado o agente inalatório halotano. Cerca de 100 mg
de microesferas do copolímero PCL-co-Eg pré-esterilizadas permaneceram em solução
tampão fosfato (PBS, pH 7,4) a 37
o
C por 4 horas antes do implante. O copolímero de PCL-
co-Eg foi implantado subcutaneamente no nível da panniculous carnosus. Após a
recuperação de sua atividade física, os ratos foram recolocados em suas gaiolas e não
sofreram restrição alimentar.
Amostras do exsudato (0,5 mL) foram periodicamente aspiradas sob condições
estéreis apropriadas e a atividade da fosfatase alcalina foi medida por espectrofotometria
segundo método descrito na literatura
28
. Neste sentido, a fosfatase alcalina foi medida
utilizando como substrato o p-Nitrofenil fosfato 0,01 M em tampão de dietanolamina 1M a
pH 10,25. A intensidade da cor produzida, que é proporcional à atividade enzimática, é lida
em 405 nm. Uma unidade de fosfatase alcalina foi definida como a quantidade de enzima
capaz de liberar 1 μmol de p-nitrofenol em 1 minuto a 37
o
C e pH 10,25. Silicone grau
médico foi escolhido como material para o grupo controle por ser um dos materiais
sintéticos mais extensivamente empregado na medicina.
Considerando que a introdução de um corpo estranho no tecido biológico
comumente induz uma reação mediada predominantemente por macrófagos, o exsudato
também foi analisado quanto à presença destas células fagocíticas derivadas dos monócitos
sanguíneos. Para a contagem dos macrófagos foram adicionados 100 μL de uma solução
corante de cristal violeta a 900 μL de exsudato. O número total de células por mililitro foi
contado em câmara de Neubauer. A média dos quatro cantos da câmara, multiplicada por
10
4
, forneceu o número total de células por mililitro de exsudato. Realizou-se a contagem
diferencial de células, avaliando-se a porcentagem de macrófagos após contagem de 400
células em microscópio óptico comum, em aumento de 400 vezes, utilizando-se as
colorações de Shorr e Giemsa. Nas lâminas que apresentaram muitos aglomerados
celulares, a contagem diferencial foi feita, preferencialmente, na periferia.
Para análise dos resultados relativos a hiperemia causada pelos materiais (silicone e
PCL-co-Eg} foi aplicado teste estatístico através de provas não paramétricas (análise de
variância, seguida do teste de Friedman)
29
. O grau de significância estabelecido foi de 5%
(p<0,05).
116
6.4 Referências
[1]DE QUEIROZ, A. A. A.; FRANÇA, É. J.; ABRAHAM, G. A.; ROMÁN, J. S. Ring-
Opening Polymerization of ε-Caprolactone by Iodine Charge-Transfer Complex.
J.
Polym. Sci. B: Polym. Phys. v.40, p. 714, 2002.
[2]http://www.ucc.ie/academic/chem./dolchem/html/elem/elem053.html, acesso em junho
de 2006.
[3]CHRIST, T L
Heterocyclic Chemistry, 2ªed., Longman Scientific, London, 1992, p.22
[4]CIAPETTI, G; AMBROSIO, L.; SAVARINO, L.; GRANCHI, D.; CENNI, E.;
BALDINI, N.; PAGANI, S.; GUIZARDI, S.; CAUSA, F.; GIUNTI, A.
Osteoblast
growth and function in porous poly
-caprolactone matrices for bone repair: a
preliminary study
, Biomaterials., v.24, p.3815-3824,2003
[5] DE ALMEIDA, K.A.; DE QUEIROZ, A.A.A.
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[8]http://whale.wheelock.edu/bwcontaminants/Gpc2.jpg. Acesso em junho de 2006.
[9]MOREIRA J. C; SILVA, I. F.; WANG, S. H.; BALOGH, D.T.
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[10]KLEIN, I. Ressonância Nuclear Magnética em Químicas, Departamento de Química
Geral e Inorgânica, Instituto de Química de Araraquara – UNESP, 1987 , disponível
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117
[15]GANDLER,J.R.; PATAI,S. In
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[29] ALTMAN, DG; GARDNER, MJ.
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Medical Journal Books; p 28-35,2000.
118
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.1 Porcentual de conversão de polimerização do monômero ε–CL a
PCL.
Neste trabalho o polímero poli(ε-caprolactona) foi obtido a partir da polimerização
por abertura do anel do monômero ε
119
Figura 7.1: Processo de polimerização por abertura do anel da poli (ε-caprolactona) com o
iodo.
120
A Figura 2 ilustra o percentual de conversão do monômero ε-CL em
policaprolactona em função do tempo à temperatura de 25ºC e a 50ºC.
Pode-se observar que o sistema à temperatura de 25ºC apresenta uma baixa
velocidade reacional, levando-se em consideração que são necessárias aproximadamente
12 horas para se obter 90% de conversão. Nota-se ainda que a partir de 12 horas de reação
o percentual de conversão não sofre grandes alterações, tornando-se praticamente
constante.
Com o aumento da temperatura para 50ºC o comportamento da conversão tem
alteração considerável, tendo sido observado um menor percentual de conversão
relativamente à temperatura ambiente.
Neste trabalho observou-se que a reação de abertura de anel do monômero ε-CL
pelo I
2
é exotérmica (ΔH<0). Conseqüentemente, a elevação da temperatura acima de 25ºC
pode deslocar termodinamicamente a reação uma vez que ΔG = ΔH - TΔS. Tal
deslocamento de equilíbrio poderia causar uma diminuição no grau de conversão,
conforme foi observado experimentalmente.
É importante ressaltar que a baixas temperaturas o rendimento do processo também é
baixo. Isto leva a crer que outros fatores como a formação de agregados moleculares entre
solvente e polímero poderia exercer um efeito mais significativo no grau de conversão.
Entenda-se neste caso por solvente o próprio monômero ε-CL.
121
0 20406080100
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
50
o
C
25
o
C
Conversão (%)
Tempo (h)
Figura 7.2: Dependência do percentual de conversão para polimerização em massa do
monômero ε–CL em PCL em função do tempo e da temperatura do sistema
reacional.
As Figuras 3-5 ilustram os espectros vibracionais (FTIR) do PCL, do eugenol e do
copolímero PCL-co-Eg. As bandas de absorção são apresentadas na Tabela 1.
Verificou-se que os valores obtidos para as freqüências vibracionais dos grupos
funcionais característicos do PCL e eugenol estão em boa concordância com os valores
122
Figura 7.3: Espectro vibracional do PCL. O espectro foi obtido após dispersão de 100mg
da amostra em pastilhas de KBr.
4000 3000 2000 1000 0
0
10
20
30
40
50
60
70
123
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
124
Tabela 7.2: Bandas de absorção relativas ao espectro FTIR do eugenol
Abreviação
3520 e 3460 Estiramento do O-H υ (OH)
1370 Estiramento do anel com
deformação no plano do O-H
-----
1209 Deformação no plano do O-H ------
794 Provavelmente um modo
inativo no infravermelho
ativado pelo acoplamento
com deformação do O-H fora
do plano
------
480-450 Deformação do grupo O-H
fora do plano
------
A Figura 6 ilustra o gráfico obtido através da técnica de GPC para o processo de
polimerização por transferência de carga do monômero ε-CL. A Figura 7 ilustra a evolução
do peso molecular do PCL em função do tempo de polimerização. Observa-se uma
significativa diminuição do peso molecular em função do tempo de polimerização. A
diminuição do peso molecular pode ser devido ao aumento da viscosidade do meio
reacional que limita significativamente a difusão de radicais, uma característica dos
sistemas de polimerização em massa.
Figura 7.6: Análise do GPC do polímero PCL polimerizada via CTC após 121 horas de
polimerização.
125
Figura 7.7: Evolução do peso molecular do polímero PCL em função do tempo.
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
Peso Molecular x 10
5
(g.mol
-1
)
Tempo (h)
126
7.2 Análise da composição dos copolímeros obtidos
As reações de copolimerização radicalar ocorrem através de etapas conhecidas
como: iniciação, propagação e terminação.
Na etapa de iniciação geram-se radicais primários geralmente como conseqüência
de decomposição térmica do iniciador. Os radicais primários reagem com os monômeros
formando radicais monoméricos capazes de continuar o crescimento pela adição de novas
unidades monoméricas na etapa de propagação.
Se a reatividade macroradical em crescimento não depender da natureza da unidade
monomérica terminal que suporta o radical livre, o esquema cinético da etapa de
propagação pode esquematizar-se de acordo com as equações:
M
1
●
+ M
1
M
1
●
M
1
●
+ M
2
M
2
●
M
2
●
+ M
1
M
1
●
M
2
●
+ M
2
M
2
●
sendo M
1
●
e M
2
●
os macroradicais em crescimento e K
11
,
K
12
,K
21
e
K
22
representam as
constantes de velocidade de propagação das espécies méricas que se adicionam à cadeia.
As velocidades de consumo dos monômeros são dadas por:
12211111
1
][
MMkMMk
dt
Md
••
+=−
21122222
2
][
MMkMMk
dt
Md
••
+=−
A razão entre as equações (2) e (3) fornecem:
K
11
K
12
K
21
K
22
(1)
(2)
(3)
127
21122222
12211111
2
1
MMkMMk
MMkMMk
Md
Md
••
••
+
+
=
A eliminação das concentrações dos radicais │ M
1
●
│ e │ M
2
●
│ pode ser efetuada
considerando-se que a etapa de propagação alcança rapidamente um estado no qual a
concentração total de radicais se mantém constante (condições de estado estacionário).
Neste caso, as velocidades de conversão do monômero a copolímero serão iguais:
12211112
MMkMMk
••
=
substituindo-se (4) na equação (3) temos:
2122122
1211211
2
1
)(
)(
MMMkk
MMMkk
Md
Md
+
+
=
A razão entre as constantes cinéticas para os processos cinéticos de homo-
propagação e co-propagação denomina-se relações de reatividade dos correspondentes
monômeros:
12
11
1
k
k
r =
e
21
22
2
k
k
r =
A equação (4) conhece-se como equação de composição do copolímero e tem sido
comprovada experimentalmente para a determinação das relações de reatividade de um
grande número de pares monoméricos.
A composição do copolímero quanto aos conteúdos de eugenol e ε-CL foi
determinada a partir dos correspondentes espectros de
1
H-NMR. As Figuras 8-10 mostram
os espectros do PCL, Eg e PCL-co-Eg respectivamente.
Para o cálculo da composição consideramos as intensidades das integrais do sinal
do grupo éster a 6,8 ppm e o sinal dos prótons aromáticos a 1,5 e 2,5 ppm para determinar
a fração molar de caprolactona e eugenol no copolímero, respectivamente.
(3)
(4)
(4)
(5)
128
Considerando a equação (4) as concentrações │ M
1
●
│ e │ M
2
●
│podem ser
substituídas pelas correspondentes frações molares, obtendo-se a expressão:
221
211
2
1
2
1
FrF
FFr
F
F
f
f
+
+
=
sendo F
1
e F
2
as frações molares do monômero na alimentação e f
1
e f
2
as frações molares
no copolímero.
Fineman e Ross propuseram uma expressão linearizada da equação (b) para o
cálculo das correspondentes relações de reatividade:
3
2
2
1
)1( r
f
F
rf
f
F
−=−
sendo F = F
1
/F
2
e f = f
1
/f
2
.
A representação gráfica de F/f(f-1) em função de F
2
/f origina uma linha reta cuja
inclinação é igual a r
1
e o intercepto com a ordenada fornece o valor de –r
2
.
Os valores da composição do copolímero (f) PCL-co-Eg obtidos a partir dos
espectros de RMN são mostrados na Tabela 1.
As Figuras 8-10 mostram os espectros
1
H-RMN obtidos do homopolímero poli(ε-
caprolactona) (PCL), do eugenol e do copolímero PCL-co-Eg. A análise do espectro
1
H-
RMN do copolímero evidencia a presença do eugenol em sua estrutura.
(6)
129
Figura 7.8: Espectro
1
H-RMN da poli(ε-caprolactona). Solvente CDCl
3
.
Figura 7.9: Espectros
1
H-RMN do eugenol. Solvente: CDCl
3
, temperatura: 25ºC.
130
Figura 7.10:
Espectro
1
H-RMN do copolímero PCL-co-Eg.
A aplicação dos dados de composição da Tabela 3 nas equações propostas de
Fineman e Ross permite obter o gráfico representado na Figura 11.
Tabela 7.3: Copolimerização em massa entre Eg e ε-CL.
Composição na alimentação Composição no copolímero
Eg ε-CL Conversão (%) Eg ε-CL
0,15 0,85 6,2 0,05 0,95
0,30 0,70 6,0 0,10 0,90
0,50 0,50 5,9 0,20 0,80
0,70 0,30 6,8 0,30 0,70
Temperatura: 25ºC, [I
2
] = 1,5.10
-2
mol.L
-1
, precipitante: álcool etílico. Os resultados obtidos
correspondem à média aritmética de 3 medidas. Resultados com desvio padrão superior a
0,01 foram desprezados.
131
Figura 7.11: Diagrama de Fineman-Ross para a copolimerização radicalar de Eg com ε-CL
O gráfico obtido foi ajustado pelo método dos mínimos quadrados. As relações de
reatividade para o Eg e o ε-CL calculadas a partir da Figura 11 foram 1,15 e 3,5,
respectivamente.
O inverso das relações de reatividade indica as reatividades dos radicais livres
correspondentes. O valor de 1/r
1
=0,87 indica que os radicais cujo extremo ativo em
-1
132
crescimento é uma unidade de Eg são mais reativos frente a seu próprio monômero que
frente ao ε-CL. O valor obtido 1/r
2
=0,29 indica que os radicais cujo extremo ativo em
crescimento é uma unidade de ε-CL são mais reativos frente a seu próprio monômero que
frente ao Eg.
4
Neste sentido, para uma determinada composição do meio reacional a
tendência à formação de seqüências de ε-CL é relativamente maior que a formação de
seqüências de Eg.
O produto das relações de reatividade indica de uma maneira geral a distribuição
133
7.3.1 Temperatura de transição vítrea (Tg) do sistema PCL-co-Eg
Os polímeros amorfos podem ser considerados como líquidos subresfriados. Ao se
esfriar um líquido a temperatura suficientemente baixas, sem que ocorra a cristalização, a
mobilidade molecular própria do estado líquido se perde e o líquido subresfriado é
convertido em um sólido rígido e indeformável que carece do ordenamento próprio dos
cristais. Considera-se que o sólido aparentemente desordenado e carente de mobilidade
molecular está em um estado denominado estado vítreo. Os polímeros são um exemplo
típico de substâncias químicas que dão lugar ao estado vítreo por resfriamento do material
fundido.
No estado amorfo, as macromoléculas apresentam conformações desordenadas,
como no estado dissolvido. Separando estas distintas conformações, existem barreiras de
energia de rotação (barreiras que separam os isômeros rotacionais de cada uma das
ligações). Quando a temperatura é suficientemente elevada, a freqüência de salto sobre as
barreiras é grande e as macromoléculas passam rapidamente de uma conformação a outra.
Se a temperatura é reduzida progressivamente, a variação conformacional se torna cada
vez mais lenta (menos freqüente) e suas cadeias perdem sua flexibilidade uma vez que suas
unidades perdem a mobilidade que lhes permite saltar de uma conformação a outra.
Se não houver cristalização, o polímero pode se esfriar sem que varie sua
desordem. Nesse resfriamento chega-se a alcançar uma temperatura característica de cada
polímero, que se denomina temperatura de transição vítrea, Tg. Abaixo da Tg a sua
mobilidade molecular é tão pequena que as cadeias se tornam congeladas em
conformações praticamente fixas.
A temperaturas inferiores a Tg o polímero mantém o caráter desordenado, mas
devido á falta de mobilidade molecular o seu aspecto é o de um sólido rígido. Em
temperaturas superiores à Tg o aspecto do polímero sólido é muito diferente, mostrando-se
deformável devido à flexibilidade parcial de suas cadeias.
A transição vítrea dos polímeros biodegradáveis úteis para a ortopedia se encontra
acima da fisiológica (37ºC) e, nessa condição eles se encontram na forma cristalina. Esta
característica é, também, um fator determinante da velocidade de degradação dos
polímeros já que está relacionada ao grau de cristalinidade e à organização das cadeias
poliméricas. Portanto, o polímero que apresenta maior Tg, geralmente se degrada mais
lentamente.
134
Uma das técnicas mais utilizadas para a determinação da Tg é a calorimetria
exploratória diferencial (DSC). A Figura 12 mostra os termogramas para o PCL e seus
copolímeros PCL-co-Eg.
Figura 7.12: Termograma para o PCL e seus copolímeros PCL-co-Eg.
Supondo que o fenômeno da transição vítrea está controlado predominantemente
por interações de curto alcance, as transições vítreas dos homopolímeros podem ser
determinadas considerando uma contribuição aditiva dos pares monoméricos. Neste
sentido, trabalhos na literatura indicam que a distribuição de seqüências na cadeia
polimérica afeta a temperatura de transição vítrea aliada ao fato de que os efeitos em
muitos copolímeros estatísticos podem ter uma origem intramolecular, como interações
moleculares específicas entre unidades monoméricas adjacentes.
5
Os efeitos microestruturais nas temperaturas de transição vítrea dos copolímeros
foram considerados do ponto de vista matemático por Fox.
6
A equação de Fox é dada por:
221
1
1
]
11
[
1
gggg
TTTT
+−=
ω
(7)
135
sendo Tg, Tg
1
e Tg
2
as temperaturas de transição vítrea do copolímero, PCL e PCL-co-Eg,
respectivamente; ω
1
representa as frações em peso de ε-CL nos copolímeros PCL-co-Eg.
T
g1
= T
g(PEg)
= 130°C, T
g2
= T
gPCL
=
- 65°C.
A Figura 13 mostra o diagrama obtido ao aplicar os dados experimentais ao
tratamento proposto por Fox, de acordo com a equação (7). O desvio da equação de Fox e
a elevação na temperatura de transição vítrea (Tg) podem ser devido à formação do
copolímero ao acaso uma vez que estes copolímeros geralmente encontram uma maior
dificuldade em se ordenar em um retículo cristalino. Isto deveria levar a pontos de fusão
mais baixos maiores valores da relação do material amorfo para material cristalino e
consequentemente valores de Tg’s mais baixos. Observando-se ainda a Figura 13 nota-se
que os valores de T
g
aumentam com o teor de eugenol no copolímero e que apresentam a
mesma tendência dos valores obtidos teoricamente utilizando a equação de Fox. Os valores
de T
g
calculados pela equação de Fox são mais elevados que os valores obtidos
experimentalmente. A presença de somente uma T
g
corrobora os resultados de RMN,
indicando que os copolímeros formados são randômicos.
136
0 20406080100
-80
-40
0
40
80
120
160
(B)
(A)
T
g
(
o
C)
Teor de Eg (%)
Figura 7.13: Variação da temperatura de transição vítrea dos copolímeros
PCL-co-Eg em função do teor de Eg. Calculado de acordo com a equação
de Fox (A) e obtido experimentalmente (B).
137
7.3.2 Microscopia eletrônica de varredura
A Figura 14 mostra a micrografia MEV dos copolímeros PCL e PCL-co-Eg,
respectivamente. Observa-se uma estrutura porosa com diâmetro médio dos poros de 5 a
10µm. A porosidade pode favorecer o crescimento de tecidos através do material, fazendo
com que ocorra um forte entrelaçamento do tecido com o implante, aumentando a
resistência do material in vivo. A existência de poros possibilita o estabelecimento de
células que serão precursoras do novo tecido, ou seja, as células osteoprogenitoras
encontram nos poros do material locais para se estabelecerem e darem origem a
osteoblastos formadores de tecido ósseo.
Figura 7.14: Micrografia de PCL e PCL-co-Eg. %Eg=10%m/m.
138
7.4 Caracterização bioquímica
O trabalho de investigação descrito anteriormente tem como objetivo não somente a
síntese de novos sistemas biodegradáveis/bioabsorvíveis e o estudo de sua microestrutura.
É também objetivo deste trabalho a síntese de sistemas macromoleculares com potencial
atividade antimicrobiana capazes de promover a restauração óssea. Por sua natureza
química, os sistemas aqui sintetizados podem sofrer hidrólise por via enzimática através de
mecanismos biodegradáveis dos quais participam enzimas como α-quimotripsina,
esteanases, lípases, entre outras.
De acordo com a proposta deste trabalho, este tópico descreve o estudo dos
processos de biodegradação em função da composição dos copolímeros PCL-co-Eg;
A atividade biológica do copolímero obtido foi estudada utilizando a relação
quantitativa estrutura-química atividade biológica (QSAR).
7.4.1 Difusão de fluido fisiológico (intumescimento)
As características de absorção do copolímero foram avaliadas para prever o
comportamento do polímero PCL e do copolímero PCL-co-Eg em contato com os fluidos
corpóreos. As características de hidrofobicidade da poli (ε-caprolactona) foram reforçadas
pela adição do eugenol, nota-se uma absorção percentual da solução fisiológica
significativamente menor quando o antimicrobiano está presente na amostra. Após
aproximadamente 5 horas de exposição nota-se uma estabilização no comportamento do
copolímero PCL-co-Eg em relação à absorção de água.
A característica de hidrofobicidade do material torna-se importante quando
consideramos que a presença de água é fator desfavorável para a ocorrência de
osseointegração. A Figura 15 mostra a absorção de fluido fisiológico pelo PCL e PCL-co-
Eg, respectivamente. Percebe-se que a incorporação do eugenol no PCL reduz
significativamente a absorção de água, provavelmente devido à presença dos anéis
aromáticos hidrofóbicos do Eg.
139
0 5 10 15 20 25 30
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
(PCL-co-Eg)
(PCL)
Absorção de fluido fisiológico (% m/m)
Tempo (Horas)
Figura 7.15: Curva de intumescimento da PCL e do copolímero PCL-co-Eg
140
7.4.2 Biodegradabilidade
Materiais biodegradáveis despertam grande interesse na medicina, odontologia,
engenharia de tecidos tanto pela utilização com finalidade de regeneração de tecidos
orgânicos como por não provocarem reações inflamatórias que sejam permanentes.
Embora se trate de corpos estranhos que possam estar susceptíveis a adesão de
microrganismos, os materiais biodegradáveis serão absorvidos pelo próprio organismo
gradativamente representando uma importante vantagem no que se refere à saúde do
paciente.
Após contato com o fluido biológico no organismo e hidrólise da cadeia polimérica
as moléculas resultantes, de baixa massa molecular, podem ser absorvidas pelo organismo
ou removidas pelo metabolismo. A biodegradação enzimática da PCL ocorre
principalmente e primordialmente na superfície porque para as enzimas hidrofílicas é
difícil a difusão no polímero hidrofóbico.
As Figuras 16 e 17 apresentam
as curvas de perda de massa em função do tempo
para a PCL e PCL-co-Eg, respectivamente. A derivada obtida aponta para uma máxima
perda de massa por volta do 16º dia para o polímero e do 12º dia para o copolímero. O
comportamento de biodegradação das amostras corrobora com aquele encontrado para
PCL na literatura, pites na superfície após o 9º dia, alguma erosão superficial com
desintegração inicial da estrutura no 16º dia e após o 23º dia perda da forma da amostra.
7
A presença de eugenol parece acelerar as etapas do processo de hidrólise no
copolímero PCL-co-Eg como observado nas Figuras 16 e 17. Essa aceleração pode ocorrer
devido à ionização do grupo fenólico que produz um microambiente levemente ácido e
propício à degradação da ligação éster presente no copolímero.
141
0 5 10 15 20 25
0
20
40
60
80
100
Perda de massa (%m/m)
Tempo (dias)
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
Figura 7.16: Curva de biodegradação da poli (ε-caprolactona)
142
0 5 10 15 20 25
0
20
40
60
80
100
143
7.4.3 Hidrólise enzimática
O polímero poli(ε-caprolactona) (PCL) tem sido utilizado em um amplo número de
aplicações para a obtenção de materiais implantáveis na área médica. Tais aplicações
incluem suturas cirúrgicas, sistemas para liberação controlada de fármacos, dispositivos
ortopédicos e como suporte na engenharia de tecidos.
Exposto aos fluidos biológicos, o PCL pode inicialmente sofrer uma pequena
hidratação através de interações do tipo íon-dipolo ou van der waals entre as moléculas de
água e as ligações éster e unidades metilênicas existentes no PCL.
Após a hidratação o polímero PCL sofre a degradação enzimática via processos
biologicamente ativos uma vez que o corpo humano contém catalisadores biológicos
denominados enzimas.
Estes compostos são capazes de hidrolisar as ligações éster do PCL, produzindo
compostos de baixo peso molecular. Os produtos finais da degradação do PCL são
oligômeros não tóxicos que podem ser dializados ou simplesmente metabolizados pelo
organismo humano.
8
Buscando uma avaliação inicial do comportamento do copolímero PCL-co-Eg pós-
implante, estudos da degradação “in vitro” mostram-se como uma boa alternativa quando
comparados aos estudos “in vivo”, fundamentais e necessários na sua aplicação como
biomaterial. Ressalta-se que os ensaios “in vitro” envolvem custos menores e os produtos e
subprodutos de degradação podem ser quantificados e monitorados de modo mais simples,
relativamente aos ensaios “in vivo”.
Simulando as condições fisiológicas de osmolaridade e pH o estudo da
biodegradabilidade do copolímero PCL-co-Eg foi efetuado em solução tampão fosfato
(PBS) pH 7,4 contendo a enzima lipase.
A lipase é uma enzima da classe das hidrolases que exibe atividade para quebra de
ligações químicas do tipo éster de poliésteres insolúveis em água.
9-11
A maior perda de peso observada para a enzima lipase (Figura 18) pode estar
associada à maior atividade da lipase na hidrólise de poliésteres insolúveis em água
relativamente à colesterol estearase. Observa-se que a determinação das atividades
enzimáticas está fora do escopo deste trabalho.
144
0 50 100 150 200 250
0
10
20
30
40
50
60
70
80
(C)
(B)
(A)
Perda de peso (% m/m)
Tempo (h)
Figura 7.18: Análise de biodegradabilidade dos copolímeros PCL-co-Eg em solução
fisiológica (PBS 0,1 M, pH 7,4) a 37
o
C contendo 0,15% (m/V) das
enzimas: Lipase (45 U.mL
-1
) (A), colesterol estearase (40 U.mL
-1
) (B) e
PBS (C). Os valores correspondem à média de 3 medidas. As medidas com
desvio padrão superior a 3% foram desprezadas. Porcentual de eugenol no
copolímero: 10% m/m.
145
7.4.4 Atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana de um material a ser utilizado com enxerto no
organismo biológico é de indiscutível importância visto que a ocorrência de infecções deve
ter conseqüências não só locais como sistêmicas. O desenvolvimento de microrganismos
no sítio cirúrgico além de comprometer o reparo ósseo local pode levar a instalação de
colônias bacterianas advindas do implante em outros locais do organismo comprometendo
a saúde do paciente e podendo levar até mesmo ao óbito. A análise da propriedade
antimicrobiana do compósito foi realizada com base no diâmetro da zona de inibição
provocada pelo material.
A cepa pode ser considerada sensível ou resistente em função do diâmetro da zona
de sensibilidade estabelecida para cada antimicrobiano. A Tabela 4 mostra o diâmetro
padrão em mm para alguns antibióticos testados, servindo como um paralelo para
comparação com os resultados que obtivemos com as amostras do compósito PCL-co-Eg.
Antimicrobiano Diâmetro mínimo
de sensibilidade (mm)
ampicilina 13-26
cloranfenicol 15
eritromicina 15
norfloxacina 16
penicilina 16-24
rifampicina 16
tetraciclina 17
gentamicina 13
vancomicina 12
cefalexina 16
clindamicina 17
Tabela 7.4: Diâmetro padrão para alguns antimicrobianos
12
146
No copolímero PCL-co-Eg utilizado a unidade mérica correspondente ao eugenol
(Eg) ioniza-se liberando o próton H
+
. Este após difusão no gel de ágar inibe o crescimento
bacteriano através da desnaturação de proteínas e rompimento das membranas dos
microrganismos. Quanto maior a área de alcance da difusão do eugenol maior será o halo
de resistência ao crescimento bacteriano gerado pelo material.
A Figura 19 apresenta as placas utilizadas no ensaio bem como o halo de inibição
gerado para cada amostra.
Figura 7.19: Ensaio antimicrobiano para E.coli e S.aureus. Os números (1-6) representam
as concentrações de eugenol de cada amostra evidenciados nas Figuras 20 e
21. O fenol no centro da placa foi utilizado como controle.
As Figuras 20 e 21 relacionam as medidas dos halos de inibição de crescimento
bacteriano obtidos e as concentrações de eugenol presentes em cada amostra. Considera-se
como halo total inibições superiores a 30 mm, ou seja, admite-se não haver qualquer
147
Figura 7.20: Resultados da inibição do crescimento bacteriano em função da concentração
de Eg para E.coli.
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
0 5 10 15 20 25 30 35 40
FENOL
20% Eg
3,5% Eg
5,5% Eg
6,5% Eg
10,5% Eg
13% Eg
halo de inibição (mm)
concentração de eugenol na amostra (%)
Escherichia coli
(3)
( 4)
( 6)
( 5)
( 2)
( 1)
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
0 5 10 15 20 25 30 35 40
FENOL
20% Eg
3,5% Eg
5,5% Eg
6,5% Eg
10,5% Eg
13% Eg
halo de inibição (mm)
concentração de eugenol na amostra (%)
Escherichia coli
(3)
( 4)
( 6)
( 5)
( 2)
( 1)
148
Figura 7.21: Resultados da inibição do crescimento bacteriano em função da concentração
de Eg para S.aureus.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
0 5 10 15 20 25 30 35 40
FENOL
10,5% Eg
3,5% Eg
6,5% Eg
13% Eg
20% Eg
halo de inibição (mm)
concentração de eugenol na amostra (%)
Staphylococcus aureus
( 3)
( 4)
( 6)
( 5)
( 1)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
0 5 10 15 20 25 30 35 40
FENOL
10,5% Eg
3,5% Eg
6,5% Eg
13% Eg
20% Eg
halo de inibição (mm)
concentração de eugenol na amostra (%)
Staphylococcus aureus
( 3)
( 4)
( 6)
( 5)
( 1)
149
7.4.5 Relação estrutura química e atividade biológica
13
Alguns métodos são propostos para relacionar a estrutura química à atividade
biológica de determinados compostos, dentre eles a relação QSAR, do inglês Quantitative
Structure- Activity Relationship. Esses estudos correlacionam afinidades de ligantes a seus
sítios de ligação, seja proteína ou receptor de membrana, constantes de velocidade e outras
atividades biológicas com certas características estruturais ou com propriedades
moleculares, de grupo ou atômicas, tais como lipofilicidade, polaridade, propriedades
eletrônicas. Equações de QSAR vêm sendo usadas, sobretudo, para descrever atividades
biológicas entre séries diferentes de fármacos e candidatos a fármacos. Especialmente
dados de inibição de enzimas têm sido correlacionados com as propriedades físico-
químicas com sucesso. As pesquisas na área de QSAR (Quantitative Structure-Activity
Relationships) têm como principal objetivo a construção de modelos matemáticos que
relacionem a estrutura química e a atividade biológica de uma série de compostos análogos
Para obter mais informações sobre os fatores que determinam a bioatividade dos
copolímeros PCL-co-Eg foi realizada a modelagem molecular.
A modelagem molecular (MolM) compreende um número de ferramentas e
métodos computacionais e teóricos que têm como objetivo entender e prever o
comportamento de sistemas reais em seus mais diversos aspectos, tais como estruturas
moleculares, propriedades do estado de transição e equilíbrio de reações, propriedades
termodinâmicas, entre outras.
Os métodos de MolM possibilitam a minimização de energia de moléculas, análise
conformacional, simulações de dinâmica molecular, entre outros, e são aplicáveis de
átomos isolados a biomacromoléculas. Um trabalho de MolM envolve basicamente três
estágios:
9 Seleção de um modelo que descreva, com a precisão desejada, interações inter e
intramoleculares de um sistema;
9 Realização dos cálculos e
9 Análise dos resultados, validando ou rejeitando o modelo escolhido.
Deve ser enfatizado que variáveis como o tamanho do sistema (número de átomos)
a ser estudado, a precisão dos resultados, o custo computacional e as condições de
hardware utilizadas para realizar os cálculos devem ser cuidadosamente analisadas durante
a aplicação dos métodos de mecânica computacional a um sistema em particular.
150
O desenvolvimento da MolM deveu-se em grande parte ao avanço dos recursos
computacionais em termos de hardware e software. No passado, a utilização da MolM era
restrita a um seleto grupo de pessoas que desenvolviam seus próprios programas.
Atualmente não é mais necessário a um modelista compor seu próprio programa dada a
variedade de pacotes computacionais comercializados através de grandes companhias e até
mesmo de laboratórios acadêmicos, tais como Hyperchem, Chem3D ou Molecular
151
para identificar a conformação mais estável, com uma energia mínima global, é necessário
gerar várias conformações de uma molécula e comparar os valores de energias obtidos a
cada modificação.
Figura 7.22: Energia mínima local e global obtidas pelo processo de minimização e
dinâmica molecular, respectivamente.
Interações não previsíveis, relacionadas à sobreposição de orbital molecular,
distribuição de densidade eletrônica ou interferências estéricas podem ser solucionadas
pelos métodos computacionais. A minimização de energia e a análise conformacional são
usadas interativamente para otimizar a geometria de uma molécula.
Além de fornecer dados estruturais, os cálculos teóricos são usados também com
interesse químico e farmacológico, como para computar calores de formação de moléculas,
distâncias interatômicas, energias eletrônicas de HOMO e LUMO, energias de ionização,
densidades eletrônicas atômicas, cargas atômicas líquidas, ordens de ligação, momentos
dipolo, entre outros.
A MolM fornece informações importantes para o processo de planejamento de
fármacos. Ela permite a obtenção de propriedades específicas de um composto que podem
152
influenciar na interação com seu receptor. Como exemplo, pode-se citar o mapa de
potencial eletrostático, o contorno da densidade eletrônica e as energias e os coeficientes
dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO. Outras informações importantes também podem
ser obtidas a partir da comparação estrutural entre diferentes moléculas, o que permite a
geração de um índice de similaridade que pode ser correlacionado com a atividade
farmacológica.
É importante ressaltar que um dos avanços mais importantes no planejamento e na
proposição de novos materiais bem como protótipos de fármacos tem sido a utilização da
modelagem molecular. Ela tem se tornado uma ferramenta indispensável não somente no
processo de planejamento, mas também na otimização dos protótipos já existentes.
a) Mecânica Molecular
Na mecânica molecular, as equações da mecânica clássica são utilizadas para
determinar as superfícies equipotenciais e as demais propriedades físicas de uma molécula.
A molécula é descrita como um conjunto de átomos que interagem entre si através de
forças resultantes da compressão ou distensão de ligações. As forças resultantes são
aproximadamente descritas por osciladores harmônicos e resultam em potenciais
proporcionais ao quadrado da deformação da ligação em questão. As distorções resultantes
de processos de deformação angular, torsional e espacial também são consideradas,
aproximando-se a energia potencial por séries truncadas de Fourier. A energia total do
sistema é calculada somando-se a todas estas contribuições potenciais associados a
interações eletrostáticas e Van der Waals entre átomos.. Os métodos de Mecânica
Molecular mais difundidos – MM, AMBER, OPLS ou BIO+, diferem entre si quanto às
parametrizações das diversas aproximações descritas acima. Um grande limitador do
método consiste em que as equações obtidas por mecânica molecular consideram apenas o
núcleo dos átomos e não incluem os elétrons nos cálculos. A energia da molécula de
partida é calculada, de forma comparativa, com relação ao padrão metano (1 kJ/mol). A
energia estérica não expressa quantidades absolutas, apenas diferenças de energia entre
duas ou mais conformações. O processo de minimização de energia, com o uso da
mecânica molecular, promove a modificação dos ângulos e comprimentos das ligações dos
átomos originais e reconhece as mudanças que conduzem a estruturas mais estáveis, de
menor energia estérica e os cálculos são interrompidos quando as modificações da
estrutura mais estável, em relação à molécula original, não resultam em alteração
considerável de energia.
153
Os métodos da mecânica molecular são métodos empíricos (baseados em valores
experimentais); estão incluídos em programas tais como Spartan e SYBYL, incluindo os
campos de força MMFF e CHARMM; são utilizados para moléculas com até 100.000
átomos. Dos três métodos citados anteriormente, demanda menos tempo computacional.
b) Métodos Quânticos
Em métodos quânticos, diferentemente do processo de mecânica molecular, são
utilizadas as equações de física quântica para calcular as propriedades de uma molécula, a
partir das interações entre os seus elétrons e núcleos. O movimento dos elétrons é
considerado mais rápido e independente do núcleo e, uma vez que os elétrons giram em
torno do núcleo, é possível descrever a energia eletrônica separadamente da energia
nuclear. (aproximação de Born-Oppenheimer). A energia eletrônica é obtida a partir da
resolução da equação de Schroedinger, e a solução correspondente ao estado de menor
energia é chamada de estado fundamental dos elétrons.
Os métodos quânticos baseiam-se na resolução da equação de onda do elétron para
a determinação dos parâmetros moleculares orbitais de fronteira, densidade eletrônica ou
análise da população de Mulliken. A função de onda eletrônica de cada elétron é, dentro da
aproximação de Born-Oppenheimer, a mesma para todos. Para uma posição fixa dos
núcleos dos átomos constituintes do sistema, consiste na solução da equação de
Schroedinger:
(1) ),()(),()]()(),()(
,
αααα
ψψ
RrRERrRVrVRrVrE
iel
a
ielNNieeieNieK
=+++
onde E
K,e
é a energia cinética do elétron,
V
e,N
é a energia potencial associada à atração entre o elétron e os núcleos da molécula,
V
e,e
é a energia potencial associada à repulsão entre os elétrons e
V
N,N
é a energia potencial associada à repulsão entre os núcleos da molécula.
A Equação (1) tem várias soluções possíveis para a função de onda eletrônica
(Orbital Molecular), cada qual associada a uma energia, a Energia Orbital. Dificilmente um
Orbital Molecular tem uma expressão analítica simples, se é que esta expressão existe.
Sendo assim, o Orbital Molecular é normalmente expresso como uma combinação linear
de orbitais atômicos (1s, 2s, 2p
x
,...) (Aproximação CLOA):
11 2 3 4 5 6
122 122..... .... (2)
iAiAi xA iBiBi xB
cs c s c p cs c s c p
φ
=+ + +++ + +
154
Uma vez conhecidos os orbitais moleculares, a função de onda total deve levar em
conta o Princípio de Exclusão de Pauli.
Isto significa que a função de onda multi-eletrônica
da molécula deve antissimétrica, com relação à permutação de 2 elétrons, o que pode ser
obtido expressando a função de onda como o produto
11
.... .... (3)
el i i n n
ψ
φαφβ φαφβ φαφ β
=
155
grandemente aumentada pela melhoria dos algoritmos de cálculo e da qualidade das bases
disponibilizadas.
b.2) Cálculo semi-empíricos
Outra forma de se evitar o cálculo complexo envolvido na resolução completa da
equação (1) é desprezar os termos menos relevantes e substituir seus efeitos por uma
parametrização, que permita a reprodução de diferentes resultados experimentais. Por esta
característica, estes métodos são conhecidos por Métodos Semi-Empíricos, tais como
AM1(austin model 1), MNDO3, CNDO, PM3 (parametric method 3). Cada método
apresenta resultados confiáveis em situações específicas. Por exemplo, o MNDO, criado
por Dewar e colaboradores, obtém bons resultados no cálculo do calor de formação, que é
a propriedade que determina a geometria da molécula e também as reações químicas que
ela participa. Trata-se de um conjunto de métodos bastante rápidos e capazes de trabalhar
156
As energias do HOMO e LUMO são descritores muito utilizados sendo
demonstrado que estes orbitais têm um papel fundamental na reatividade dos compostos
em muitos tipos de reação química bem como na determinação dos “gaps” das bandas
eletrônicas nos sólidos. Estes orbitais também são responsáveis pela formação de muitos
complexos de transferência de carga. De acordo com a teoria dos orbitais de fronteira em
reações químicas, a formação do estado de transição se deve a interação entre os orbitais de
fronteira (HOMO e LUMO) das espécies reagentes. Portanto, o tratamento diferenciado
para estes orbitais moleculares é baseado em princípios gerais que governam a natureza
das reações químicas.
A energia de HOMO é diretamente relacionada ao potencial de ionização e
caracteriza a suscetibilidade da molécula ao ataque de eletrófilos enquanto a energia de
LUMO é relacionada à afinidade eletrônica e caracteriza a suscetibilidade ao ataque por
nucleófilos.
O “gap” entre HOMO e LUMO, ou seja, a diferença de energia entre estes orbitais
é um importante índice de estabilidade química e uma grande diferença entre HOMO e
LUMO significa que a molécula tem alta estabilidade, ou baixa reatividade em reações
químicas. Assim, de acordo com a teoria dos orbitais de fronteira para a reatividade, a
maioria das reações química acontece na posição em que HOMO e LUMO dos respectivos
reagentes podem ter a maior sobreposição. Neste caso, se a molécula é doadora de elétrons,
a densidade de HOMO é crítica para a transferência de carga.
As Figuras 23-26 ilustram os orbitais de fronteira HOMO-LUMO para os
monômeros eugenol e ε-caprolactona bem como para as cadeias oligoméricas de PCL, PEg
e PCL-co-Eg. Como pode ser observado, o oxigênio tem uma grande participação no
HOMO. No caso do eugenol, a diferença de energia entre o HOMO e o LUMO, por conta
da influencia do sistema π é muito maior.
A polarizabilidade é uma medida da facilidade com que a nuvem eletrônica de um
átomo pode ser distorcida, em função do efeito de dipolo de um campo elétrico externo,
tendo desta forma uma maior dispersão de elétrons (maior deslocalização). Esta medida
pode ser obtida através da diferença de energia ΔE
HOMO-LUMO
. Neste caso, quanto maior for
a diferença de energia ΔE
HOMO-LUMO
menor será a polarizabilidade do monômero
3
. Neste
trabalho, observaram-se os valores de ΔE
HOMO-LUMO
de 11,2 eV e 8,3 eV para os
monômeros ε-caprolactona e eugenol, respectivamente. Esta observação sugere que o
monômero ε-CL possui uma menor polarizabilidade, o que estaria de acordo com os
157
resultados experimentais de
1
H-NMR. Neste caso, a espectroscopia de NMR indicou a
obtenção de copolímeros PCL-co-Eg cuja composição é pobre em eugenol, indicando
assim, a baixa polarizabilidade deste monômero e em boa concordância com os dados
espectroscópicos.
A diferença de ΔE
HOMO-LUMO
entre os homopolímeros (PCL, PEg) bem como para o
copolímero alternado de PCL-co-Eg foi muito pequena, pois as cadeias propagantes
parecem possuir a mesma polarizabilidade. Mesmo assim, o oligômero do eugenol possui
um ΔE significativamente menor que o homopolímero de PCL indicando que o monômero
de eugenol apresenta uma forte tendência em formar homopolímeros. Talvez o efeito dos
substituintes do anel aromático neste monômero leve a uma deslocalização dos elétrons o
que favoreceria a formação de homopolímeros.
Figura ???- Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para o eugenol.
Figura 7.23: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para os monômeros eugenol (I)
e ε-caprolactona (cadeia aberta)(II).
(A) (B)
(A) (B)
(I)
(II)
158
Figura 7.24: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para o oligômero
poli(eugenol). Foram consideradas 4 unidades méricas repetitivas.
Figura 7.25: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para o oligômero poli(ε-
caprolactona). Foram consideradas 3 unidades méricas repetitivas.
(A)
(B)
(A) (B)
159
Figura 7.26: Orbitais de fronteira HOMO (A) e LUMO (B) para o copolímero alternado
PCL-co-Eg. Foram consideradas 4 unidades méricas.
Outra das propriedades moleculares relevantes para a análise é a determinação da
população de Mulliken , que fornece a carga em cada átomo, indicando se os átomos que
compõe uma molécula apresentam um excesso ou deficiência de carga. Neste sentido a
análise da população de Mulliken é uma forma quantitativa de identificar as regiões na
molécula onde se acumula a carga eletrônica (suscetíveis a ataques eletrófilos) e as regiões
que se encontram despopuladas de carga (susceptíveis a ataques nucleofílicos).
A distribuição total de elétrons de uma molécula é uma boa aproximação para
determinar muitas propriedades moleculares, químicas e físicas. O procedimento consiste
em usar cargas parciais atômicas as quais podem ser determinadas por procedimentos
semi-empíricos. Neste trabalho, analisamos as cargas atômicas derivadas de populações
Mulliken de orbitais atômicos o qual tem dado uma boa descrição da distribuição
eletrônica.
A análise populacional de Mulliken é um método amplamente difundido na
química molecular e baseia-se na teoria de orbitais moleculares, já descrita. Lembrando
que a função de onda
ψ
i
é definida por um combinação linear de k orbitais moleculares,
também chamados de funções de base,
χ
μ
, ,
()
11 2 2
1
....
k
ii ii ikk
ccc c
μμ
μ
ψ
χχχ χ
=
==+++
∑
(4)
considerando C
i
μ
como reais e apenas uma função de base
χ
μ
sobre cada átomo na
molécula, a densidade de probabilidade associada a um elétron em
ψ
é dada por:
(A) (B)
160
..222...
323231312121
2
2
2
2
2
1
2
1
2
+++++==
χχχχχχχχψ
iiiiii
i
i
cccccccc
(5)
Integrando a expressão anterior sobre todo o espaço tridimensional e normalizando
ψ
, a seguinte expressão é obtida:
23321221
2
2
2
1
22...1 SccScccc
iiii
i
i
+++=
(6)
sendo S
12
as integrais de superposição definidas como:
∫
=
ννμμν
σ
σμ
χ
χ
ddS
(7)
Definindo q
i
μ
como o produto da população líquida do elétron na orbital molecular
ψ
i
pela contribuição do orbital atômico
χ
μ
e p
i
μν
como a população eletrônica de
recobrimento entre as orbitais atômicos
χ
μ
e
χ
ν
obtém-se as seguintes expressões são:
μννμ
μν
μ
μ
Sccp
cq
ii
i
i
i
2
2
=
=
No caso em que
0)1( <
μν
i
p
tem-se um orbital antiligante, se
0)1( >
μν
i
p
tem-se
uma orbital ligante e caso
0)1( =
μν
i
p
tem-se uma orbital não-ligante.
Somando as contribuições q
i
e p
i
a população líquida de Mulliken é dada por:
∑
+=
≠
νμ
μ
μ
μν
ii
pqiN
2
1
)(
(9)
Fatores como a facilidade de cálculo e a possibilidade de obtenção da análise
populacional de forma direta a um baixo custo computacional levaram à ampla difusão do
método populacional de Mulliken em química quântica.
Em vez de observar a magnitude de cargas atômicas, procuraram-se efeitos da
distribuição de cargas devido a pequenas, mas claramente distinguíveis mudanças
conformacionais. A atenção principal foi direcionada para as modificações associadas com
átomos específicos como resultado de mudanças conformacionais de toda a molécula ou de
um grupo funcional. A metodologia que utilizamos consistiu em otimizar a geometria de
oligômeros com métodos semi-empíricos, seguidos por cálculos ab initio, usando bases de
alta qualidade (STO-3G, 4-31G , 6-31G**) e incluindo efeitos de correlação(MP), para o
cálculo das cargas atômicas.
(8)
161
O estudo do mecanismo de copolimerização entre os monômeros ε-CL e Eg e da
bioatividade do copolímero PCL-co-Eg pode tornar-se mais compreensível quando se
analisam os mapas de potencial eletrostático destas moléculas.
O potencial eletrostático de uma molécula pode ser determinado selecionando-se
um determinado número de pontos ao redor da molécula e em seguida desprezando-se os
pontos que caem dentro do raio de van der Waals da molécula devido às distorções da
proximidade do núcleo. Neste sentido, o potencial eletrostático (E
i
) é dado por:
∑∑∑
∫
−=
núcleo
A
pAp
A
i
dr
r
r
P
R
Z
E
μν
φνμφ
μν
)()r(*
sendo A o núcleo, Z o número atômico, R
AP
a distância entre o núcleo e uma carga
pontual, P a matriz de densidade e r
p
é a distância de separação entre o elétron e a carga
pontual.
Uma superfície para o qual o potencial eletrostático é negativo indica uma região na
molécula sujeita a um ataque eletrofílico. Simultaneamente à análise populacional de
Mulliken analisou-se neste trabalho o potencial eletrostático (2D e 3D) dos monômeros,
homopolímeros e copolímero PCL-co-Eg sendo os resultados apresentados nas Figuras 23-
26.
Analisando-se as Figuras 27-31, observa-se que toda a densidade de carga negativa
(região azul no MEP) está concentrada nos átomos de oxigênio do poliéster e fenólico
(eugenol). Isto se dá devido ao fato deste átomo ser mais eletronegativo que o carbono,
atraindo a densidade eletrônica.
Os carbonos possuem uma baixa densidade de carga negativa, pois são mais
eletronegativos do que os hidrogênios a que estão ligados. Entretanto, como a diferença de
eletronegatividade entre o carbono e o oxigênio é maior do que entre o carbono e o
hidrogênio, a densidade eletrônica no carbono é menor (não atrai significativamente a
nuvem eletrônica dos hidrogênios). Os átomos de hidrogênio possuem densidade positiva,
o que pode ser confirmado pelo mapa de potencial eletrostático (coloração avermelhada,
Figuras 27-31). Isso porque estão ligados aos átomos de carbono (mais eletronegativos).
Observa-se que o átomo de hidrogênio fenólico possui um caráter ácido de Lewis
(coloração vermelha) e, portanto pode sofrer dissociação. Neste sentido, as correlações
Funções de base
(10)
162
entre as energias do HOMO e LUMO, potencial eletrostático e superfícies equipotenciais
2D permitem concluir que não existe uma alteração significativa no valor de pKa do
eugenol após sua copolimerização com o monômero ε-caprolactona, propiciando ao
copolímero PCL-co-Eg a bioatividade característica do eugenol.
Figura 7. 28: Superfície equipotencial 2D para os monômeros eugenol (A) e ε-caprolactona
(B).
Figura 7.27: Superfícies equipotenciais para os monômeros eugenol (A) e ε-caprolactona (B).
(A)
(B)
163
Figura 7.29: Potencial eletrostático (A) e superfície equipotencial 2D (B) para o oligômero
de poli(eugenol).
Figura 7.30: Potencial eletrostático (A) e superfície equipotencial 2D (B) para o oligômero
de poli(ε-caprolactona).
(A)
(B)
(A)
(B)
164
Figura 7.31: Potencial eletrostático (A) e superfície equipotencial 2D (B) para o
copolímero alternado PCL-co-Eg.
7.4.6 Citotoxicidade
O ensaio de citotoxicidade representa uma fase importante de teste de
biocompatibilidade de um material com potencial para aplicações médicas mostrando se o
material apresenta características de biomaterial quanto à sua interação com o tecido
biológico.
Os ensaios de citotoxicidade podem apresentar resposta celular imediata (curto
prazo) ou resposta a longo prazo. Os primeiros são associados a alta permeabilidade da
membrana ou algum dano específico ao metabolismo das células. Aqueles que têm
resposta a longo prazo implicam na retenção da capacidade de auto-renovação ou
capacidade de sobrevivência celular em estado alternado (ex: mutação genética). Revelam
a capacidade metabólica ou proliferativa das células após ou mesmo durante a exposição a
agentes tóxicos. Os ensaios de curto prazo calculam a proporção de células viáveis
expostas a procedimentos traumáticos.
(A)
(B)
165
Na Figura 32 são apresentadas as curvas de viabilidade celular das amostras do
copolímero PCL-co-Eg e da PCL. Somente a amostra com concentração de eugenol em
10% apresenta comportamento semelhante ao controle positivo (fenol) demonstrando uma
citotoxicidade significativa. As amostras de PCL e PCL-co-Eg (6,5% Eg) mostraram
comportamento semelhante ao controle negativo (polietileno), com viabilidade celular
superior a 50%, sendo compatível com a implantação em organismo biológico no tocante à
toxicidade provocada.
O material utilizado como controle negativo não produz resposta tóxica, o objetivo
de seu uso é demonstrar resposta de acompanhamento das células. O controle positivo
produz uma resposta citotóxica objetivando demonstrar apropriada resposta do sistema
testado.
10 100
0
20
40
60
80
100
120
IC
Viabilidade Celular (%)
Concentração do Extrato (%)
Controle Negativo
Controle Positivo
PCL
PCL 01 com 6,5% Eugenol
PCL 10 com 10% Eugenol
Figura. 7.32: Viabilidade celular após ensaio de citotoxicidade.
50 %
166
7.4.7 Atividade hiperêmica do copolímero PCL-co-Eg
A resposta inflamatória a um implante sintético é controlada pela produção e
difusão de mensageiros químicos derivados dos tecidos danificados e do exsudato
inflamatório agudo. Os macrófagos estão entre as principais células responsáveis pela
inflamação crônica, exercendo vários papéis. Uma vez ativados, os macrófagos exercem
um papel fagocítico e secretor fundamental na defesa contra o agente agressor e são
importantes na imunidade mediada por células. É fato conhecido da literatura que os
macrófagos secretam os mediadores da inflamação aguda (particularmente o fator de
ativação das plaquetas e metabólitos do ácido araquidônico), proteases e enzimas
hidrolíticas (que causam dissolução do material extracelular), citocinas (que estimulam a
proliferação dos fibroblastos e síntese do colágeno) e os fatores de crescimento.
A Figura 33 ilustra a variação da concentração de macrófagos no exsudato com o
tempo de implante. Após duas semanas do implante a população de macrófagos diminuiu
significativamente, indicando imunossupressão do processo inflamatório.
É fato bem conhecido da literatura que uma série de enzimas contidas nos
leucócitos e macrófagos é liberada no processo da inflamação, o que se traduz num
aumento de sua atividade no local da reação inflamatória, enquanto que na zona de
regeneração sua atividade é diminuída. A fosfatase alcalina é uma enzima presente nos
leucócitos e macrófagos e por isso sua quantificação é de particular interesse para o estudo
da relação entre o processo inflamatório e a biocompatibilidade dos materiais sintéticos.
O processo inflamatório pós-implante do copolímero de PCL-co-Eg foi avaliado
levando-se em conta a atividade da enzima fosfatase alcalina relativamente ao controle
(silicone de grau médico). Os resultados apresentados na Figura 34 sugerem que a
biocompatibilidade do copolímero de eugenol é similar à do silicone grau médico, uma vez
que a atividade da enzima fosfatase alcalina diminui significativamente em ambos os
sistemas com relação ao tempo pós-implante.
167
0 5 10 15 20
-5
0
5
10
15
20
25
30
(B)
(A)
Macrófagos /μL
Tempo (dias)
Figura 7.33: Variação na concentração de macrófagos no exsudato com o tempo de
implantação do copolímero de PCL-co-Eg (A) e silicone grau médico (B).
168
0 4 8 12 16 20
0
10
20
30
40
(B)
(A)
Atividade Enzimática (U.dL
-1
)
Tempo (dias)
Figura 7.34: Atividade extracelular da fosfatase alcalina no exsudato de PCL-co-Eg (A) e
silicone grau médico (B) em função do tempo de implante.
169
7.5 Considerações finais
O presente trabalho propôs-se a avaliar a viabilidade da aplicação do copolímero
PCL-eugenol na odontologia, bem como estudar suas propriedades antimicrobianas e de
biodegradação, além de caracterizar físico-quimicamente o copolímero.
A presença de eugenol no copolímero promoveu características antimicrobianas ao
material no que se refere às bactérias estudadas (E.coli e S.aureus) apresentado inibição de
crescimento bacteriano comparável ao encontrado em antimicrobianos utilizados
corriqueiramente na prática clínica.
Simultaneamente concluímos que concentrações mínimas de eugenol no
copolímero correspondentes aos percentuais 5,5% e 6,5% não induziram resposta
citotóxica, atribuindo ao PCL-co-Eg propriedades antimicrobianas.
As características de biodegradação do copolímero PCL-co-Eg apresentam-se
muito semelhante às do polímero PCL na ausência das enzimas hidrolíticas. Por outro lado,
a biodegradação na presença das enzimas lipase e colesterol estearase indicou que a
unidade mérica correspondente ao eugenol favorece a hidrólise do copoliéster.
Os copolímeros obtidos apresentaram uma baixa citotoxicidade hiperêmica
relativamente ao silicone de grau médico.
170
7.6 Referências:
[1] ELZEIN, T.; BROGJY, M.; SCHULTZ, J. Quantitative calculation of the orientation
angles of adsorbed polyamides nanofilms,
Polym., v. 44, p.3649-3660, 2003.
[2] WILSON,A.D.; MESLEY, R.J. Zinc oxide-eugenol cements : Infrared spectroscopic
studies
J.Dent. Res., v.51(6), p.2581-88, 1972.
[3]FIREMAN,M.;ROSS,S.D.
J.Polym. Sci. v.5, p.259,1950.
[4]ODIAN, G.
Principles of polymerization. New York, Wiley Interscience, 2ªed.1985.
[5]BARTON,J.M
. J. Polym. Sci,. v.C30, p.573, 1970.
[6]VAN KREVELEU, D.W.
Properties of polymers: their correlation with chemical
structure: their numerical estimulation and prediction from additive group
contributions. New York, Elsevier, 1990.
[7]NOTTELET,B.; COUDANE,J., VERT,M. Synthesis of an X-ray opaque biodegradable
copolyester by chemical modification of poly(ε-caprolactone),
Biomaterials, v.27,
p.4948-4954,2006.
[8]ZHENG,X; WILNIE, C.A.
Polym. Degrad. Stab, v.81.
[9]CHAHINIAN, H.; NINI,I.; BOITARD, E.; DUBES, J.P.; COMEAN,L.C.; SARDA,I.
Distinction between estearases and lípases : a kinetic study with vinyl esters and TAG,
Lipids v.37, p. 653-662, 2002
[10]SHIRAHAWA, H.; KAWAGUCHI, Y.; ALUDIN, M.S.; YASUDA,H. Synthesis and
enzymatic degradation of high molecular weight aliphatic polyesters
J. Appl. Polym.
Sci.
v.80, p. 340-347, 2001.
[11]GAN,Z.; LIANG, Q.; ZHANG, J., JING,X. Enzymatic degradation of poly(ε-
caprolactone) film in phosphate buffer containing lipases
Polym. Degradat. Stabil..
v.56, p. 209-213, 1997.
[12]Center For Disease Control-Antimicrobial Susceptibility Tests, National Nosocomial
Infection Study, Quartely Report, April 1974.
[13]BAIRD,N. C. ; DEWAR, M.J.S.
J.Chem.Phys., 50,1262(1969).
171
8. CONCLUSÕES GERAIS
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:
9 A presença de eugenol no copolímero promoveu características
antimicrobianas ao copolímero PCL-co-Eg no que se refere às bactérias
estudadas (E.coli e S.aureus), apresentado inibição de crescimento
bacteriano que pode viabilizar sua aplicação como material implantável em
organismo biológico.
9 Foi observado que concentrações mínimas de eugenol no copolímero (5,5%
e 6,5%) não induziram resposta citotóxica, atribuindo ao PCL-co-Eg
propriedades antimicrobianas. Os resultados para indução de crescimento
bacteriano obtido para essas concentrações são semelhantes aos valores-
padrão de muitos antimicrobianos comumente utilizados na prática médica.
9 As características de biodegradação do copolímero PCL-co-Eg apresentam-
se muito semelhante às do polímero PCL, no entanto a presença de enzimas
hidrolíticas (lipase e colesterol estearase) indicou que a unidade mérica
correspondente ao eugenol favorece a hidrólise do copoliéster.
9 As relações entre as energias HOMO LUMO, o potencial eletrostático e as
superfícies equipotencias permitiram concluir que não existe uma alteração
significativa no valor de pKa do eugenol após sua copolimerização com ε-
CL, proporcionando ao copolímero PCL-co-Eg bioatividade própria do
derivado fenólico.
9 Os copolímeros obtidos apresentaram uma baixa citotoxicidade para
concentrações de eugenol de 6,5%.
9 Os copolímeros obtidos PCL-co-Eg apresentaram baixa atividade
hiperêmica relativamente ao silicone grau médico.
172
9. PERSPECTIVAS FUTURAS
É fato que o desenvolvimento de novos materiais com propriedades biocompatíveis
envolve uma grande interdisciplinaridade entre a física, química, biologia e a engenharia
de materiais. Esta interdisciplinaridade por sua vez está implicitamente associada a uma
instrumentação que na maior parte dos casos não está concentrada em um mesmo
laboratório de pesquisa.
Durante a realização deste trabalho procuramos desenvolver pesquisas no sentido
de se obter novos copolímeros que possuíssem atividade antimicrobiana e que, ao mesmo
tempo, pudesse viabilizar sua aplicação à população de baixa renda.
Obviamente, embora certo número de caracterizações físico-químicas e
bioquímicas esteja presente neste trabalho, entendemos que existe a necessidade de uma
continuidade do mesmo uma vez que o binômio instrumentação-tempo nos privou desta
resposta. Neste sentido, as seguintes perspectivas para um trabalho futuro são apontadas
abaixo:
A)
Estudo da cristalinidade do copolímero por difratometria de raios X.
B)
Análise da atividade osteocondutora do copolímero PCL-co-Eg através de
ensaios in vitro e in vivo.
C)
Obtenção de pinos do copolímero PCL-co-Eg para possíveis aplicações como
implante.
D)
Análise das suas propriedades mecânicas de pinos obtidos a partir do
copolímero PCL-co-Eg.
E)
Determinação da distribuição de tamanhos de poros do PCL e PCL-co-Eg por
porosimetria e verificação de sua influência na osteocondutividade.
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