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SIMONY DAVET MÜLLER
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E
FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE
Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
ITAJAÍ - 2006
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE EDUCAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E
FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE
Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Dissertação submetida à
Universidade do Vale do Itajaí
como parte dos requisitos para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
SIMONY DAVET MÜLLER
Itajaí, Fevereiro 2006.
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"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E
FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
____________________________________
Maique Weber Biavatti, Dra
Orientadora
__________________________________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora:
______________________________________
Maique Weber Biavatti, Dra
Presidente
______________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra
______________________________________
Cid Aimbiré de Moraes Santos, Dr.
DEDICATÓRIA
Ao José Luis e ao nosso bebê,
pelo amor, incentivo e paciência.
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Dra Maique Weber Biavatti pela dedicação e confiança
que depositou em mim ao longo destes anos.
Aos professores Dr. Valdir Cechinel Filho, Dr. Cid A. M. Santos e Dr.
Franco Della Monache pela disponibilidade de alguns padrões.
Ao Prof. MSc Renê Artur Ferreira pela coleta da
Passiflora alata
no
Campus de Ilhota SC.
Ao Prof. Dr. Armando Cervi pela identificação e registro da planta.
Agradeço as bolsistas Michelly e Sônia do Programa Integrado de Pós
Graduação e Graduação (PIPG) pelo esforço e dedicação.
Ao LAPAM, em especial Luciana e Roberta, pelo incentivo, compreensão,
amizade e auxílio no desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu marido José Luis pelo amor e compreensão.
A minha mãe, minha irmã Sabrin
Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES
ATRAVÉS DE CLAE E UV DE EXTRATOS DE
Passiflora
alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Simony Davet Müller
Fevereiro2006
Orientadora: Maique Weber Biavatti, Dra
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas
Palavras-chave:
Passiflora
, flavonóides, controle de qualidade, alcalóides, CLAE
Número de Páginas: 86.
As folhas de Passiflora alata
Curtis, (espécie oficial da Farmacopéia Brasileira) são
utilizadas como medicamento contra ansiedade, como antiespasmódico e sedativo. O
desenvolvimento de metodologias analíticas para análise de flavonóides e alcalóides em espécies
de
Passiflora
é de suma importância, para o controle de qualidade da planta e extratos
fitomedicinais derivados. O estudo sobre perfil de flavonóides e alcalóides em folhas e extrato
fluido de
P. alata
contendo isovitexina foi realizado através de CLAE, comparando seus perfis
cromatográficos com extrato fluido de
P. incarnata
comercial e tintura de
P. actinia
. Adicionalmente,
a concentração total de flavonóides em extratos e folhas foi realizada através de doseamentos
Farmacopéicos. O extrato de
P. alata
foi produzido de acordo com a Farmacopéia Helvetica
(1987), de
P. incarnata
foi obtido comercialmente e de
P. actinia
de acordo com a Farmacopéia
Brasileira (1926). Na análise dos flavonóides em CLAE verificou-se presença de isovitexina em
P.
alata:
no extrato farmacopéico coletado em janeiro e agosto/2001 (0,018 e 0,007% m/m) e no
extrato sob refluxo coletado em janeiro e agosto/2001 (1,137 e 0,018% m/m); em
P. actinia
: no
extrato farmacopeico (0,028% m/m) e no extrato sob refluxo (0,631% m/m) e no extrato comercial
de
P. incarnata
(1,198% m/m) sendo o flavonóide majoritário. A vitexina foi encontrada em
P. alata
(traços),
P. incarnata
(0,312% m/m) e ausência dos outros flavonóides marcadores testados:
orientina, swertisina, hirerosídeo e rutina. O método desenvolvido em CLAE demonstrou ser
adequado e diferenciou as espécies estudadas podendo ser aplicado à amostras comerciais. As
análises espectrofotométricas baseadas em metodologias Farmacopéicas para
P. incarnata,
mostraram resultados diferentes em relação ao flavonóide quantificado isovitexina. Sendo que a
metodologia da Farmacopéia Britânica apresentou melhor resultado. Não foi detectada a presença
de alcalóides
β
-carbolínicos clássicos testados (harmana, harmina, harmol, harmalol e harmalina)
nos extratos e folhas de
P. alata
.
Abstract of Dissertation (Thesis) presented to UNIVALI as a partial fulfillment of the requirements
for the degree of Master in Pharmaceutical Sciences
LC AND UV DETERMINATION OF ALCALOID AND
FLAVONOID
Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae
EXTRACTS
Simony Davet Müller
Fev/2006
Advisor: Maique Weber Biavatti, Dra.
Area of Concentration: Natural Products.
Keywords: Passiflora, flavonoids, quality control, alkaloids, HPLC
Number of Pages: 86.
Leaves of Passiflora alata Curtis (official species in the Brazilian Pharmacopoeia) are
employed for anxiety, as antispasmodic and sedative. The development of new analytical
methodologies for the analysis of flavonoids and alkaloids in Passiflora species are needed in order
to improve the quality assurance of the plant and derived extract and phytomedicines. A survey on
the flavonoids and alkaloids profile and content of isovitexin in leaves and fluid extract of P. alata
through LC was made, comparing its chromatographical profiles with a commercial P. incarnata
fluidextract and P. actinia tincture. Additionally, the concentration of the total flavonoids of extracts
and leaves according to phamarcopoeial photometrical method was determined. The fluidextract of
P. alata was produced in accordance with the Pharmacopoeia Helvetica, tincture of P. actinia as
produced in accordance to the Brazilian Pharmacopoeia method. The presence of isovitexin in the
species (which have distinct chromatographic profiles) was evidenced, which is the major flavonoid
compound in the P. incarnata comercial extract (1.198% w/w), but not in P. alata (0.018 summer e
0.007 winter % w/w) fluidextract and leaves (1.137 e 0.018% w/w) P. actinia (0.028 extract and
leaves 0.631% w/w). Just traces of vitexin could be observed in the P. alata and P. incarnata
(0.312% w/w) and absence of the other tested flavonoids orientin, swertisin, hyperoside and rutin.
The LC developed method demonstrated to be adjusted for the qualitative and quantitative
analyses and to differentiate species, appropriate to be applied to commercial sample analysis. The
flavonoids spectrophotometrical results of three different methods described to P. incarnata were
not comparable, the most suitable performance was verified to the British Pharmacopoeia method.
None of the classical beta-carbolinic alkaloids tested were found in the P. alata leaves and
medicinal extracts: harmane, harmine, harmol, harmalol, harmaline.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO.........................................................................................
1
2
OBJETIVOS.............................................................................................
5
2.1
Objetivo Geral..........................................................................................
5
2.2
Objetivos Especificos...............................................................................
5
3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................
6
3.1
Gênero Passiflora.....................................................................................
6
3.1.1
Considerações botânicas.........................................................................
6
3.1.2
Considerações químicas.........................................................................
10
3.2
Controle de Qualidade de Passiflora........................................................
15
3.3
Considerações Farmacológicas...............................................................
18
4
MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................
23
4.1
Material Botânico......................................................................................
23
4.2
Padrões e Solventes................................................................................
23
4.3
Métodos para Obtenção de Extratos........................................................
24
4.3.1
Pesquisa de alcalóides e flavonóides ...................................................
24
4.3.2
Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides.......
25
4.3.3
Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides.........
26
4.3.4
Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides................................
26
4.4.
4.6.3
Ensaio de especificidade.........................................................................
36
4.6.4
Limite de quantificação.............................................................................
36
4.7
Doseamento do Teor de Flavonóides Totais em UV...............................
37
5
RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................
41
5.1
Obtenção dos Extratos Hidroalcoólico e Fracionados para Pesquisa de Flavonóides
e Alcalóides.........................................................................
41
5.2
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)............................................
41
5.3
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)....................................
45
5.4
Análise Quantitativa Através de CLAE.....................................................
52
5.5
Análise Quantitativa Através de CLAE (Sistema Isocrático)....................
62
5.6
Validação Analítica...................................................................................
64
5.7
Doseamento Espectrofotométrico do Teor de Flavonóides Totais..........
66
5.8
Pesquisa de Alcalóides Através de CLAE................................................
70
6
CONCLUSÕES........................................................................................
78
7
REREFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................
80
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Foto
Passiflora alata
Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da
planta...........................................................................................
8
Figura 2:
Foto
Passiflora incarnata
Lineau, mostrando a inflorescência e o fruto da
planta..................................................................................
9
Figura 3:
Foto
Passiflora actinia
Hooker; mostrando a inflorescência da
planta................................................................................................
9
Figura 4:
Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos....................
28
Figura 5:
Fluxograma do método descrito por PETRY
et al
. (1998)...............
38
Figura 6:
Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA BRITÂNICA,
(2000)..........................................................................
39
Figura 7:
Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA HELVÉTICA
(1987)..........................................................................
40
Figura 8:
CCD do extrato hidroalcoólico total de
P.
alata
.................................................................................................
42
Figura 9:
Cromatografias em camada delgada das amostras: A- Extrato hidroalcoólico
de
P. alata
, B- Tintura Farmacopeica de
P. actinia
, C- Extrato hidroalcoólico
comercial de
P. incarnata
e os respectivos padrões 1-vitexina, 2-rutina e 3-
quercetina...................
43
Figura 10:
Cromatogramas, da sobreposição do extrato fluido de
P. alata
coletadas em
Janeiro/2001 com o extrato fluido das folhas coletadas em
Agosto/2001...............................................................
46
Figura 11:
Cromatogramas das três espécies de
Passiflora
: a)
P. alata
, b
) P. actinia
e c)
P. incarnata
....................................................................
51
Figura 12:
Esquema mostrando degradação microbiana de flavonóides.........
54
Figura 13:
Cromatogramas de: a) Extrato fluido de
P. alata
(A)
.......
................
56
Figura 14:
Cromatograma de Extrato fluido de
P. alata
(A) e espectro de UV de: 1-
isovitexina...............................................................................
57
Figura 15:
Cromatograma da co-injeção de padrões 1-isovitexina + 2-vitexina e espectro
de 1-isovitexina.................................................
57
Figura 16:
Cromatogramas de: b) Tintura de
P. actinia
(T).....................................................................................................
58
Figura 17:
Cromatograma de
P. actinia
(T) e espectro de UV de: 1-
isovitexina.........................................................................................
59
Figura 18:
Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina+2-vitexina e espectro
1-isovitexina......................................................
59
Figura 19:
Cromatogramas de: b) Extrato fluido de P. incarnata (C) e
padrões............................................................................................
60
Figura 20:
Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 2-
vitexina.............................................................................................
61
Figura 21:
Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 1-
isovitexina.........................................................................................
61
Figura 22:
Cromatogramas de P. incarnata (C), co-injeção dos padrões e espectro de UV
de: 2- vitexina.........................................................
61
Figura 23:
Curva de calibração de isovitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340
nm.................................................................................
65
Figura 24:
Curva de calibração de vitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340
nm..................................................................................
65
Figura 25:
Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos...................
71
Figura 26:
Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos...................
72
Figura 27:
Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos...................
72
Figura 28:
Espectros de UV dos padrões de alcalóides....................................
73
Figura 29:
Comparação dos cromatogramas do extrato fluido (A) e dos padrões
(B)................................................................................
74
Figura 30:
Comparação dos cromatogramas do extrato a quente (A), extrato a frio (B) e
padrões (C).....................................................................
75
Figura 31:
Comparação dos cromatogramas do extrato I (A), extrato II (B), padrões
(C)......................................................................................
77
LISTA DE TABELAS
Sistema gradiente (1): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH= 2,88 e B =
Metanol, fluxo de 0,5 mL/min.......................................
31
Sistema gradiente (2): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH 2,88, B) =
Metanol e C = Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min...............
31
Sistema gradiente (3): A = Acetonitrila - água (110:660); B = Acetonitrila -
água (120:180), fluxo de 1 mL/min...........................
32
Sistema Gradiente (4): A = água - ácido acético 0,5 % (m/v); B = Metanol; C
= Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min................................
32
Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................
34
Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................
34
Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................
34
Ensaio de Recuperação do método...............................................
36
Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas de
P. alata
.................
.........................................................................
47
Tempo de retenção relativo aos flavonóides investigados nos extratos de
P.
alata
,
P. actinia
e
P. incarnata
................................
50
Tempo de retenção referente aos flavonóides investigados nos extratos de
P.
alata
,
P. actinia
e
P. incarnata
................................
50
Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas das três espécies de
Passiflora
............................................................
55
Teor encontrado através de CLAE do flavonóide
C-
glucosilado
vitexina...........................................................................................
63
Resultados do Ensaio de Recuperação do método.......................
66
SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E FÓRMULAS
ºC graus Celsius
°
GL Gay Lussac
% porcentagem
µ
g micrograma
µ
m micrômetro
µ
L microlitro
Abs absorbância
AlCl
3
cloreto de alumínio
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BZD benzodiazepínico
CA campo aberto
CCD cromatografia de camada delgada
CLAE cromatografia líquida de alta eficiência
DL
50
dose letal 50%
g grama
H
2
O água
HPLC High performance liquid chromatrography
i.p. intra peritonial
k fator de retenção
LC Liquid chromatrography
LCE Labirinto em cruz elevado
L. Lineau
LQ Limite de Quantificação
m massa
mL mililitro
min minuto
nm nanômetro
P. A. pureza analítica
PDA Photo Diode Array
PIPG Programa Integrado de Pós-graduação e Graduação
p/v peso/volume
R reagente
v/v volume/volume
UFPR Universidade Federal do Paraná
USP United States Pharmacopeia
UV ultravioleta
1 INTRODUÇÃO
O uso das espécies vegetais, com fins de tratamento de doenças e
sintomas, remota ao momento em que o homem despertou para consciência, e
começou um longo percurso de manuseio, adaptação e modificação dos recursos
naturais para seu próprio benefício (DI STASI, 1996; MARTINS; CASTRO;
CASTELLANI, 1994). Esta prática milenar, atividade humana por excelência,
ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo evolutivo e chegou
até os dias atuais, sendo amplamente utilizada por grande parte da população
mundial como fonte de recurso terapêutico eficaz (DI STASI, 1996).
As plantas são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas,
muitas das quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número
de medicamentos. Para obtenção de novos fármacos, dois aspectos distinguem
os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a função
biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela
derivada dos processos de síntese, que apesar dos avanços tecnológicos atuais,
ainda é restrita. Esse fato possibilita que os compostos químicos presentes nas
plantas possam vir a se tornar fármacos em potencial para as mais diferentes
moléstias (NODARI
et al.,
2000).
O conhecimento da biodiversidade vegetal, além de ser considerado uma
fonte de modelos químicos para a síntese de novas moléculas, também deve ser
incentivado como um recurso natural com possível atividade na forma de
fitoterápico padronizado, eficiente e seguro. Dentre as várias plantas com
atividade farmacológica conhecida, destacam-se algumas espécies do gênero
Passiflora
, conhecido popularmente no Brasil como maracujá, cujas partes aéreas
são tradicionalmente empregadas por suas propriedades sedativas,
antiespasmódica e ansiolítica (NODARI
et al.,
2000).
Das quatrocentas espécies conhecidas de
Passiflora
, trinta são descritas
por terem frutos comestíveis. Somente poucas espécies alcançaram
desenvolvimento comercial e dentre estas as mais conhecidas são
Passiflora
edulis Sims, de casca roxa e P. edulis f. flavicarpa Degener, com casca amarela
(SCHMIDT et al., 1995). Esta última é conhecida vulgarmente por maracujá
amarelo, e representa a forma mais cultivada em escala comercial no Brasil. São
também difundidas em nosso país, embora não na mesma escala: Passiflora
edulis Sims (maracujá roxo), Passiflora alata Curtis (maracujá doce), Passiflora
quadrangularis L., Passiflora caerulea L. e Passiflora laurifolia L. (FREITAS, 1985;
SOUZA e MELETTI, 1997).
Entre as inúmeras espécies de Passiflora nativas do Brasil, encontra-se no
estado do Paraná Passiflora actinia Hooker, espécie com poucos estudos
químicos e farmacológicos foram realizados até o presente. Reginatto (2000),
comparando por cromatografia em camada delgada, sete extratos de espécies de
Passiflora, identificou manchas com R
f
semelhante aos padrões dos flavonóides
de isoorientina e isovitexina em P. actinia. Em 2001, Kurtz demonstrou a presença
de traços do alcalóide harmana na mesma espécie. Santos, (2003) demonstrou
que o extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia administrado em camundongos, em
doses inferiores a 1.800 mg/kg, não resultou em toxicidade aparente e através dos
métodos de labirinto em cruz elevado e campo aberto, foi observado um efeito
sedativo com o extrato hidroalcoólico bruto, extrato metanólico e sub-extrato
metanol-água.
A espécie Passiflora incarnata L. é nativa dos Estados Unidos, onde é
muito cultivada e conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho”
(SOUZA e MELETTI, 1997). Esta espécie cresce preferencialmente em solos
secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al., 1997), não tendo grande
difusão no Brasil em parte devido ao amargor da polpa do fruto (MORAES et al.,
1997). As partes aéreas da planta têm sido usada tradicionalmente para o
tratamento da ansiedade, ataques nervosos e nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).
O uso de Passilfora decorrente de suas propriedades sedantes iniciou-se
no século XVII na Europa, mas os estudos farmacológicos sobre P. incarnata L.
começaram a aparecer a partir do século XIX (HOEHNE, 1939). Graças às
propriedades sedantes e devido à presença de flavonóides C-glicosilados e de
alcalóides do tipo harmana, a P. incarnata L. consta em monografias das
Farmacopéias Francesas (Pharmacopée Française, 1980), Européia (European
Pharmacopoeia, 1996), DAB 10 (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética
(Pharmacopoeia Helvetica, 1987) e italiana (Farmacopoea Ufficiale Della
Republica Italiana, 1998). Porém esta espécie não se adapta bem ao clima do
Brasil e desta forma a Farmacopéia Brasileira (Farmacopéia Brasileira, 1977)
elegeu como oficial a P. alata Curtis, apesar desta ainda ser pouco estudada. As
flores grandes e de cor carmim intensa e os frutos comestíveis, de sabor muito
doce, fizeram com que esta espécie se disseminasse muito e fosse bastante
apreciada para o consumo natural, sendo reconhecida vulgarmente como
maracujá-doce (SOUZA e MELETTI, 1997).
Oga et al. (1984); Pereira e Vilegas, (2000); relatam a escassez de literatura
e informações científicas relacionadas com P. alata, o que desperta o interesse e
a necessidade de estudar esta espécie brasileira mais detalhadamente para no
futuro, estabelecer parâmetros mais sólidos em relação à atividade farmacológica
e à composição química correspondente assim como a descrição dos caracteres
microscópicos das espécies aqui encontradas com facilidade e com abundância.
Moraes, Vilegas e Lanças (1997) estudaram várias espécies de Passiflora
incluindo a P. alata, através da observação dos perfis cromatográficos das
amostras comerciais destas espécies. Foi possível ter uma idéia preliminar
somente de flavonóides da espécie comercializada, através de Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE), mas para sua identificação completa é
necessário possuir dados botânicos e identificação dos alcalóides também.
O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma metodologia
validada por CLAE para a determinação qualitativa e quantitativa de flavonóides e
alcalóides em P. alata comparando com os extratos das espécies P. actinia e P.
incarnata. O desenvolvimento desta metodologia poderá ser útil para aplicação no
controle de qualidade, uma vez que a validação de métodos analíticos aplicados
às drogas vegetais ainda é o ponto chave para se obter extratos padronizados.
Este trabalho pretende contribuir ao conhecimento da espécie medicinal brasileira
P. alata (maracujá-doce), carente de informações técnicas sobre sua qualidade,
que é largamente utilizada para ansiedade, como antiespasmódico e sedativa
(ZUANAZZI, 2001).
2 OBETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS
2.1 Objetivo Geral
ϖ Avaliar através de CLAE a presença de flavonóides e alcalóides nas folhas
e nas preparações extrativas de Passiflora alata Curtis, Passifloraceae.
2.2 Objetivos Específicos
ϖ Desenvolver métodos cromatográficos (CLAE), qualitativos e quantitativos
para controle de qualidade de extratos de Passiflora sp;
ϖ Avaliar qualitativamente e quantitativamente os extratos medicinais
produzidos no Laboratório de Farmacognosia da UNIVALI, com relação as
folhas coletadas em janeiro e agosto;
ϖ Avaliar quantitativamente o teor de flavonóides totais por espectrofotometria
de ultravioleta (UV), nas folhas e nas preparações extrativas de P. alata .
ϖ Comparar os teores de flavonóides e alcalóides através de UV, CLAE bem
como os perfis cromatográficos de P. alata com P. incarnata e P. actinia.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Gênero
Passiflora
A família Passifloraceae compreende cerca de vinte gêneros e seissentas
espécies, distribuindo-se principalmente nas Américas e na África (BARROSO,
1978). São plantas escadentes, herbáceas ou lenhosas e possuem gavinhas, as
quais são ramos modificados, podendo ainda ser detectada a presença de
nectários extraflorais (BARROSO, 1978).
O gênero predominante nessa família é Passiflora, representado por
aproximadamente quatrocentas espécies, cujo nome é atribuído ao significado
místico das características físicas de suas flores, nas quais os escritores do século
XVI interpretaram suas diferentes partes como representando os símbolos da
Paixão de Cristo. Por esta razão, esses vegetais são conhecidos na Europa e
América do Norte como flor-da-paixão (BARROSO, 1978; FREITAS, 1985).
Algumas espécies de Passiflora são cultivadas por seus frutos comestíveis,
principalmente na forma de sucos e refrescos. A forma de maracujá comestível, o
maracujá amarelo, cultivada em escala comercial é Passiflora edulis Sims forma
flavicarpa Deg. Também muito difundida no Brasil em menor escala temos a
Passiflora alata (Dryander) Curtis, Passiflora quadrangularis L., Passiflora caerulea
L. e Passiflora caurifolia L. (FREITAS, 1985).
3.1.1 Considerações botânicas
Passiflora alata
Curtis
A Passiflora alata (Figura 1) é uma trepadeira com gavinhas, de caule
quadrangular com ângulos levemente alados. Estípulas foliáceas, verdes, com até
2 cm de comprimento. Folhas alternadas, simples, oval ou oblonga, de 10 a 16 cm
de comprimento por 8 a 11 cm de largura, membranácea, glabérrima, de cor
verde-escura na página superior, mais pálida na inferior, uninérvia e arqueado-
venosa, com as nervuras salientes em ambas as faces, principalmente na inferior;
suas margens são inteiras e hialino-cartilagíneas. O pecíolo mede geralmente
cerca de 3 cm de comprimento e é profundamente caniculado na parte superior,
apresenta 2 a 4 glândulas sésseis nas margens, dispostas aos pares e convexo
na parte inferior, que é carenada. Flores vistosas hermafroditas, actinomorfas,
pentâmeras, solitárias nas axilas das folhas, perfumadas, tendo em média 10 a 12
cm de diâmetro. Sépalas e pétalas camosas, avermelhadas internamente. Corola
bisseriada, a série externa muito mais longa, com filamentos listados de branco e
roxo, série interna muito curta, dentiforme. Fruto ovóide a periforme, com até 10
cm de comprimento e 6 cm de largura, amarelo quando maduro (OLIVEIRA;
AKISUE, 1998; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1977).
A espécie P. alata é aparentemente originária da região leste do Brasil, mas
encontra-se largamente distribuída em várias regiões. Conforme a região
considerada, recebe os mais diversos nomes populares, tais como maracujá-
guaçú, maracujá-guasú, maracujá-de-refresco, maracujá-doce, maracujá-comprido
ou, simplesmente, maracujá. Esta espécie é muito semelhante a Passiflora
quadrangularis L. (maracujá-mamão, maracujá-assú, maracuja-uaçú), que
pertence ao mesmo sub-gênero e série respectivamente, Granadilla e
Quadrangulares; as vezes é difícil distingui-las a primeira vista, mas ambas
apresentam detalhes de organização floral e foliar que as caracterizam. A P. alata
pode ser também confundida com Passiflora macrocarpa (maracujá-melão), mas
novamente, é possível reconhecê-las pela organização foliar e floral. Para alguns
botânicos, P. macrocarpa Mast. é sinonímia de P. quadrangularis L. (FREITAS,
1985; DE OLIVEIRA et al., 1980)
Outros usos farmacêuticos incluem preparações fitoterápicas, como
sedativo no tratamento de nevralgias, insônia, histeria, epilepsia e ataques
nervosos (CORRÊA, 1984). O extrato de maracujá é usado como componente
flavorizante em bebidas alcoólicas e não alcoólicas e em sobremesas frias. Suas
sementes são doces e acídulas, muito apreciadas para a fabricação de
refrigerantes e sucos (CORRÊA, 1984).
Figura 1:
Foto Passiflora alata Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da
planta.
Fonte:
www.herbmed.org/herbs/passifloraalata.
Passiflora incarnata
Lineau
A espécie P. incarnata L. (Figura 2) é nativa dos Estados Unidos, onde é
muito cultivada e conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho”
(SOUZA e MELETTI, 1997). Esta espécie cresce preferencialmente em solos
secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al., 1997) não tendo grande
difusão no Brasil, em parte devido ao amargor da polpa do fruto (MORAES et al.,
1997). As partes mais utilizadas são as folhas, sendo estas trilobadas com
comprimento de 6 a 15 cm e largura de 5 a 12 cm (Souza e Meletti, 1997). As
partes aéreas da planta têm sido usadas tradicionalmente para o tratamento de
ansiedade, ataques nervosos e nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).
A P. incarnata L. consta em monografias das Farmacopéias Francesas
(Pharmacopée Française, 1980), Européia (European Pharmacopoeia, 1996),
DAB 10 (Deutsches Arzneibuch, 1992 ), Helvética (Pharmacopoeia Helvetica,
1987), e italiana (Farmacopoea Officiale Della Republica Italiana, 1998). Porém
esta espécie não se adapta bem ao clima do Brasil.
Figura 2: Foto Passiflora incarnata L. mostrando a inflorescência e o fruto da
planta. Fonte: www.exot-nutz-zier.de/images/ prod_images/Pass...
Passiflora actinia Hooker
A P. actinia (Figura 3), embora sendo uma espécie nativa da região Sul do
Brasil, encontram-se poucos estudos sobre a mesma. Kurtz et al. (2001) em um
estudo morfoanatômico e investigação de constituintes alcaloídicos da espécie
através de CLAE, relatou que as folhas apresentam um contorno oval, margem
lisa, ápice obtuso, base arredondada e limbo inteiro. Observou também que a face
abaxial da epiderme é papilosa, o mesófilo é dorsiventral, os feixes vasculares são
colaterais e idioblastos contendo drusas estão distribuídos no parênquima foliar.
Na análise de alcalóides encontrou a presença de traços de harmana.
Figura 3: Foto Passiflora actinia Hooker mostrando a inflorescência da planta.
Fonte: www.passionflow.co.uk/ actinia1.htm
3.1.2 Considerações químicas
Os estudos referentes à composição química de diversas espécies de
Passiflora
evidenciam, principalmente, os alcalóides e flavonóides. Entretanto,
outras substâncias como saponinas, glicosídios cianogênicos, esteróides,
lignanas, ácidos graxos, maltol, aminoácidos e taninos, também são citados
freqüentemente na literatura (ALONSO, 1998; REGINATTO, 2000; REGINATTO
et
al
., 2001).
Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural (ZUANAZZI, 2001). São
particularmente importantes para o controle de qualidade de fitoterápicos, pois
através deles é possível identificar muitas espécies de
Passiflora
(QUERCIA
et al.
,
1978).
Diversas funções são atribuídas aos flavonóides nas plantas. Entre elas
podemos citar: proteção dos vegetais contra incidência de raios ultravioleta e
visível, além de proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias; atraentes de
animais com finalidade de polinização; antioxidantes; controle de ação de
hormônios vegetais; agentes alelopáticos e inibição de enzimas. Podem também
ser usados como marcadores taxonômicos e isto é devido sobretudo a sua
abundância relativa em quase todo o reino vegetal, especificidade em algumas
espécies, relativa estabilidade e seu acúmulo com menor influência do meio
ambiente (ZUANAZZI, 2001).
Os flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente oxigenados
e um grande
número ocorre conjugado com açúcares. Essa forma conjugada,
também conhecida por glicosídeos, pode ser formada pela ligação de um ou mais
açúcares aos grupos hidroxilas por ligação hemiacetal facilmente destruída por
hidrólise ácida. Outra forma de conjugação de açúcares ao núcleo flavônico é por
meio de ligação açúcar-genina entre carbonos
C
-1 (anomérico) do açúcar e um ou
dois carbonos do anel A do flavonóide (
C-
glicosídeo). Quando o metabólito
encontra-se sem o açúcar, é chamado de aglicona ou genina, sendo também
denominado de forma livre (ZUANAZZI, 2001).
Na Passiflora os flavonóides encontrados são do tipo C-glicosilados,
possuem atividade biológica e são de interesse quimiotaxonômico e
freqüentemente são utilizados como “marcadores” na análise de medicamentos
fitoterápicos. Esses flavonóides C-glicosilados são menos solúveis em acetato de
etila do que as agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após
hidrólise (PEREIRA; VILEGAS, 2000).
Oga et al. (1984) encontraram os flavonóides orientina (1), isoorientina (2)
vitexina (3), isovitexina (4), e rutina (5) em P. alata através de CCD. Freitas (1985)
realizou um estudo dos flavonóides glicosídeos de P. incarnata, P. edulis, P. alata
e P. quadrangulares, através de CCD e verificou a presença de quatro flavonóides
principais nestas espécies identificados como: vitexina, isovitexina, orientina e
isoorientina.
Vários estudos relatam a presença dos seguintes flavonóides em P. incarnata:
C-glicosil schaftosídio, isoschaftosídio, isovitexina-2´-O-glucopiranosídeo,
orientina, isoorientina, isoorientina-2´-O-glucopiranosídio, swertisina (6),
isoscoparin-2”-O-glicosídio quercetina e kaempferol (PROLIAC et al., 1988; LI et
al., 1991; RAHMAN et al., 1997).
Em folhas de P. sexflora, McCormick e Mabry (1992) encontraram seis di-C-
glicosilflavonas: lucenina-2, carlinosídeo, isoviolantina, schaftosídeo, vicenina-1 e
isochaftosídeo e seis mono-C-glicosilflavonas: orientina, isoorientina,
isoswertiajaponina e isoswertisina. Em adição, luteolina-7-O-glucosídeo, luteolina
e uma aurona (sufulrentina), também foram identificadas.
Ulubelen et al. (1982) pesquisaram três espécies de Passiflora e relataram a
presença dos seguintes compostos: C-glucosídeo isovitexina, 2”-xilosilvitexina,
luteolina-7-O-glucosídeo e uma mistura de vicenina-2, schaftosídio e
isochaftosídeo em folhas de P. pittieri. A partir de P. alata, os autores obtiveram
2”-xilosilvitexina, vitexina, isovitexina e orientina. Saponarina foi encontrado
somente em P. ambigua.
Os estudos em relação aos flavonóides de Passiflora relatam que os mesmos
são derivados da luteolina (7) e apigenina (8) (GEIGER et al., 1986). Alguns
flavonóides detectados com maior freqüência no gênero Passiflora são os
seguintes: orientina, homoorientina, isovitexina, vitexina, schaftosídeo e swertisina
(6) (PEREIRA et al., 2000).
Souza, Schapoval e Bassani (2002) realizaram um trabalho utilizando
CLAE, fase isocrática, para quantificar flavonóides isolados ou compostos em
matrizes biológicas complexas, sendo que o mesmo demonstrou um excelente
desempenho em separar os flavonóides quercetina, luteolina e 3-O-
metilquercetina em extratos de Achyrocline satureioides.
Moraes (1995) estudou a diferenciação entre P. edulis, P. alata e P.
incarnata com base nos flavonóides, tendo constatado que o perfil cromatográfico
destas três espécies permite diferenciá-las através da CLAE.
Dhawan et al. (2001) consideraram os flavonóides como o maior grupo de
constituintes já pesquisados no gênero Passiflora.
O
O
O
H
O
H
O
H
Glu
VITEXINA
O
O
O
H
O
H
O
H
Glu
ISOVITEXINA
(2)
(3)
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
Glu
Rha
RUTINA
O
O
O
H
O
H
O
Glu
C
H
3
SWERTISINA
O
O
O
H
O
H
O
H
APIGENINA
(5)
Os alcalóides já encontrados no gênero
Passiflora
são do tipo indólico
simples, derivados do sistema
ß-
carbolina, conhecidos como
ß-
carbolinas ou
alcalóides
ß-
carbolínicos (CORDELL, 1981; DEWICK, 1997). Vários alcalóides
indólicos possuem atividade biológica comprovada, sendo que muitos têm valor na
medicina como tranqüilizante e no tratamento da hipertensão (Cordell, 1981;
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
LUTEOLINA
(7)
(6)
(4)
Harbone, Baxter, 1995), geralmente essa ação é mediada pela sua interação com
um ou mais receptores específicos.
Muitos dos alcalóides ß-carbolínicos são substituídos em C-1 por um grupo
metila, como por exemplo harmana (8) (CORDELL, 1981).
Fellows et al. (1938) foram os primeiros autores a pesquisarem alcalóides em
P. incarnata, porém o extrato clorofórmico da mesma, frente aos reativos gerais
para alcalóides (Mayer e Wagner), não apresentou reação positiva.
Entre 1954-1956, Neu, citado por Souza (1997), isolou o alcalóide harmana a
partir de partes aéreas de P. incarnata e posteriormente detectou a mesma
substância em P. edulis e P. quadrangularis.
Estudos realizados com P. incarnata durante a década de 1960 detectaram,
através de análises cromatográficas e espectroscópicas, os alcalóides harmana
(8), harmol (9), harmalol (10), harmalina (11) e harmina (12) (LUTOMSKI, 1959;
LUTOMSKI, 1960; LUTOMSKI, 1967; BENNATI et al., 1968; LUTOMSKI et al.,
1968; BENNATI, 1971).
Rehwald et al. (1985) desenvolveram uma metodologia analítica para a
detecção de alcalóides em P. incarnata que consistia na extração, purificação,
concentração e posterior análise em CLAE da fração alcaloídica. Essa técnica foi
sensível à detecção de harmana, harmina, harmalina, harmol e harmalol, porém
em quinze amostras comerciais analisadas, somente uma apresentou traços de
harmana.
Segundo Bennati (1967), harmana, harmina e harmalina são alcalóides
presentes no extrato fluido de P. incarnata sendo que o isolamento e separação
foram possíveis mediante extração etérea. O comportamento cromatográfico com
padrões de alcalóide foi característico e permitiu reconhecimento comparando-se
com extrato fluido de Passiflora em preparação farmacêutica complexa.
Estudos com P. incarnata detectaram os alcalóides: harmana, harmina,
harmalina, harmol, harmana e harmalol, sendo que foi utilizado o método de
Cromatografia de Camada Delgada (BENNATI, 1971).
Oga et al. (1984) relatam apenas o teor de alcalóides expresso em
harmana de P. alata, sendo que encontrou 0,217 mg % de alcalóides, no extrato
seco das folhas.
Pereira e Vilegas (2000) relatam que contradições e variações dos
valores de teor de alcalóides encontrados na literatura devem-se em parte as
diferentes metodologias aplicadas, e também pode-se considerar os órgãos
empregados, a época e o local de colheita.
3.2 Controle de Qualidade de
Passiflora
O nome vulgar “maracujá”, de origem tupi-guarani, é empregado para designar
uma série de espécies vegetais pertencentes ao gênero Passiflora. As diversas
empresas que comercializam drogas vegetais obtidas a partir
destas espécies
freqüentemente enfrentam dificuldade na identificação destes materiais.
N
N
C
H
3
H
harmana
N
N
C
H
3
H
O
H
harmalol
N
N
C
H
3
H
O
C
H
3
harmalina
N
N
C
H
3
H
O
C
H
3
harmina
(8)
(9)
(11)
(12)
(10)
N
N
C
H
3
H
O
H
harmol
Com freqüência, tais empresas adquirem-nas de coletores preocupados única
e exclusivamente com a atividade extrativa, sem interesse no cultivo da espécie
medicinal, bem como, indiferentes à época da colheita e ao processo de
transformação adequada das partes vegetais em droga. Por isso, muitas vezes, a
droga comercializada no Brasil é de baixa qualidade e não raro apresenta-se
fraudada. Com referência a este último fato é conveniente acrescentar que o
problema é bem mais amplo e diz respeito de uma maneira geral á maior parte
das drogas aqui comercializadas (FREITAS, 1985).
Recentemente, as Resoluções - RDC n° 48 e 89 de 16 de março de 2004, da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), incorporaram a P. incarnata L.
na lista de plantas para registro simplificado, para as quais não são necessários
estudos complementares toxicológicos, pré-clínicos e clínicos para a obtenção de
registro de medicamentos, em função do acesso aos estudos sobre esta espécie
(BRASIL ANVISA, 2004), embora até hoje não existam resultados conclusivos que
indiquem qual (is) do(s) constituinte(s) químicos(s) presente(s) nas folhas de
maracujá promovam ação sobre o sistema nervoso central (DHAWAN et al.,
2001b). Entretanto, a referida não preconiza os teores de flavonóides totais
(isovitexina/vitexina).
A diferenciação de P. alata de outras espécies comerciais do gênero
Passiflora é relativamente fácil, visto estes materiais apresentarem folhas lobadas,
como P. incarnata L. e P. edulis Sims ou folhas digitadas/palmatilobadas como P.
caerulea L. Outra diferenciação preocupante é aquela que diz respeito a P.
incarnata L. e P. edulis Sims: a margem da folha de P. edulis Sims é mais
nitidamente serrilhada do que a de P. incarnata L. a folha de P. edulis Sims é
também um tanto irregular, não se conseguindo aplainá-la totalmente quando
prensada entre folhas de papel absorvente. Por outro lado, a face dorsal da folha
de P. incarnata L. é pubescente, o que pode ser observado com auxílio de lupa,
fato este não observado em P. edulis Sims (FREITAS, 1985).
Como a droga comercializada na maioria das vezes é representada pelas
partes aéreas, a dificuldade de diferenciação macroscópica destas drogas
aumenta com o grau de fragmentação. Sendo assim, a diferenciação entre as
espécies para propósitos de controle de qualidade deve ser baseada em
constituintes químicos como os flavonóides e farmacognósticas. Normalmente os
parâmetros de avaliação da qualidade da matéria-prima vegetal são
caracterizados por critérios de identidade, pureza e teores descritos nas
Farmacopéias (FARIAS, 2001).
A determinação dos flavonóides em plantas medicinais, como proposto
pelas Farmacopéias Alemã (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética
(Pharmacopoeia Helvetica, 1987), e Italiana (Farmacopoea Ufficiale Della
Republica Italiana, 1998) consiste na análise espectrofotométrica do complexo
quelato de alumínio após hidrólise e extração com acetato de etila. Este é um
método geral e é preconizado para P. incarnata e outras espécies ricas em
flavonóides tais como Camomila recutita, Crataegus spp e Betula alba. Muitos
autores (Glasl e Becker, 1984; Schmidt e Ortega, 1993; Pereira, 2002) têm
atribuído a metodologia muitas fontes de erro analítico, uma vez que o método foi
desenvolvido especificamente para analisar flavonóides O-glicosilados e não para
flavonóides C-glicosilados, que resistem à hidrólise ácida. Os C-glicosilados são
menos solúveis em acetato de etila (solvente utilizado para extração) do que as
agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após hidrólise, fase
esta que é descartada. Durante a hidrólise ácida, podem sofrer isomerização,
denominada rearranjo de Wessely-Moser, formando misturas de 8-C-glicosídeo e
6-C-glicosídeo (MARKHAM, 1982).
Até 1978 haviam sido publicados poucos trabalhos detalhando a análise de
flavonóides por CLAE. Na década de 70, a separação de misturas complexas de
flavonóides glicosídeos ainda era difícil, e eram utilizadas com sucesso fases
estacionárias do tipo C8, C18 e NH
2
, e como fase móvel, misturas de água e
metanol, ou misturas acetonitrila-água, fracamente acidificadas com ácido acético.
A utilização da CLAE começou a crescer como ferramenta de análise de
flavonóides em Passiflora principalmente a partir da década de 80.
Num estudo realizado por Quércia et al. (1978) através de CLAE em
amostras de P. incarnata, foi utilizada coluna Zorbax ODS (25 x 2,0 mm I. D.),
temperatura 45 °C, sistema gradiente composto por metanol-água e fluxo de 0,5
mL/min e foi encontrado um teor de vitexina de 0,226% em extrato pilular e 2,24%
em amostras de extratos pulverizados. Ulubelen e Oksu (1982), analisando teores
de flavonóides através de CLAE utilizaram coluna RP 18 (30 X 0,5 cm I. D.),
sistema isocrático composto por metanol-água-ácido acético (25:70:5) e fluxo 1,5
mL/min em amostras de P. pittieri, P. alata e P. ambigua verificaram que a P. alata
possuía o menor teor de vitexina dentre as três espécies.
Em um outro estudo, Pietta et al. (1986), analisando simultaneamente
flavonóides em amostras que continham extratos de P. incarnata e Crataegus
monogyna, utilizaram coluna C18 (30 cm x 3,9 mm I. D.), sistema isocrático
composto por 2-propanol-tetrahidrofurano-água (5:15:85) e fluxo 1,5 mL/min
verificando a presença de vitexina-4’-O-ramnoside, isovitevina, vitexina e
hiperosídeo.
Também flavonóides C-glicosilados foram pesquisados em extratos de P.
incarnata pelos autores Qimin et al. (1991) em CLAE, onde foi utilizada coluna RP
18 (250 X 4 mm I. D.), sistema gradiente composto por metanol-ácido fórmico 5%-
água e um fluxo de 1,8 mL/min. Foram identificados nestes extratos os flavonóides
schaftosídeo, isochaftosídeo e isovitexina-2”-O-glucopiranosil e isoorientina-2”-
glucopiranosil.
Grice et al., 2001 desenvolveram um novo método em HPLC para análise
simultânea de alcalóides e flavonóides característicos de P. incarnata,
identificando e quantificando harmane, harmine, harmol, isovitexina e vitexina
onde foi utilizado coluna C18 (150 X 4 mm) e um sistema gradiente composto por
metanol-água-ácido acético e fluxo de 1 mL/min.
Os estudos demonstram que a CLAE vem se tornando um dos
procedimentos cromatográficos de análise mais utilizados na área de produtos
naturais, visto a alta eficiência de separação e sensibilidade que são alcançadas,
além da possibilidade de utilização com vários tipos de detectores (MERKEN et
al., 2000).
3.3 Considerações Farmacológicas
O gênero Passiflora é mundialmente conhecido por suas propriedades
terapêuticas sobre o Sistema Nervoso Central, fato que vem sendo cientificamente
comprovado desde meados do séc. XX (RUGGY et al., 1940; LUTOMSKI et al.,
1975; LOGGIA et al., 1981).
Na medicina tradicional, a classe de fármacos mais utilizadas como
ansiolíticas e sedativas são os compostos benzodiazepínicos (BZD). Entretanto,
além dessas ações, também promovem uma série de efeitos indesejados, como
hipnose, relaxamento muscular, amnésia anterógrada, prejuízo no desempenho
psicomotor, dependência, incompatibilidade com álcool e tolerância (GRAEFF,
1999). Devido a esses fatores, faz-se necessária pesquisa e o desenvolvimento de
novas drogas, capazes de produzir uma ação ansiolítica e/ou sedativa desprovida
desses efeitos.
Inúmeras drogas vegetais, como Melissa officinalis L., Tília europaea L.,
Hypericum perforatum L., vêm sendo usadas na medicina popular devido a s 6.71997 0 Tdü0.0Tdü0.048 Tcêêêêêêêêêêêêü6120 10 lühüW o u s
monoamonoxidase B (MAO-B). Experimentalmente o mesmo alcalóide induziu
sedação e relaxamento da musculatura lisa.
Em 1974, foi relatado que os derivados da pirona (maltol e etil maltol),
isolados a partir de P. incarnata L., causavam efeitos depressores em
camundongos como: potencialização do sono induzido por hexobarbital, ação
anticonvulsivante em altas doses e diminuição da atividade locomotora em doses
relativamente baixas (1/10 da DL
50
) (AOYAGI et al., 1974).
Contraditoriamente, Soulimani et al. (1997) demonstraram que o maltol
isolado, misturas de maltol e harmana e misturas de compostos flavonoídicos e
maltol não apresentavam variação nos parâmetros comportamentais e diminuição
da atividade locomotora mesmo em doses elevadas. Porém esses mesmos
autores confirmaram a atividade ansiolítica de P. incarnata L. no extrato
hidroalcoólico (400 mg/kg, i.p.) e a atividade sedativa da mesma a partir do extrato
aquoso (400 e 800 mg/kg, i.p.) em camundongos, caracterizando as atividades
observadas dependentes do solvente utilizado na produção do extrato.
Em estudo químico farmacológico, Lutomski et al. (1960) alertaram para a
importância da presença do complexo alcalóide-flavonóide em P. incarnata, para a
obtenção de um melhor efeito farmacológico. Os mesmos autores ainda observam
que este complexo está presente no extrato etanólico.
Trabalhando com extrato fluido e evaporado obtido a partir de folhas de P.
alata, contendo princípios flavonoídicos e alcaloídicos, Oga et al. (1984) relataram
que o mesmo promoveu redução da atividade locomotora, prolongamento do
tempo de sono induzido por pentobarbital sódico e aumento do tempo de latência
das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (doses de 75 e 159 mg/kg, via i.p.).
Utilizando o modelo experimental de ansiedade, labirinto em cruz elevado
(LCE), Wolfman et al. (1994) testaram a atividade do flavonóide crisina (1 mg/kg,
via i.p.) isolado de P. coerulea e concluíram que esse composto é um agonista
parcial dos receptores BZD, pois apresentou um decréscimo da ansiedade sem
manifestações de atividade sedativa.
Ao contrário dessa observação, Zanoli et al. (2000), ao administrar os
flavonóides crisina a apigenina obtidos respectivamente a partir de P. incarnata e
Matricaria chamomilla, verificaram que ambos produziram uma redução da
atividade locomotora espontânea em ratos (sedação) na dose de 25 mg/kg (via
i.p.). Na dosagem de 1 mg/kg (via i.p.), somente a crisina produziu atividade
ansiolítica no modelo de ansiedade claro-escuro. Entretanto, o efeito observado
não foi atribuído aos receptores BZD, visto que estes se encontravam bloqueados
por injeção do antagonista benzodiazepínico flumazenil.
Um estudo comparativo sobre atividade ansiolítica no LCE dos extratos
hidroalcoólicos das espécies de P. alata e P.edulis foi realizado por Petry et al.
(2001). Ambos extratos, pela via intraperitonial em ratos (100 e 150 mg/kg),
demonstraram atividade, apesar do extrato de P. edulis ser mais efetivo em doses
menores (50 mg/kg). Trabalhando com o extrato aquoso dessas mesmas
espécies, De-Paris et al. (2002) recentemente obtiveram resultados semelhantes,
além de demonstrar que a composição flavonoídica de P. edulis é mais complexa
do que a P. alata.
A partir de 2001, Dhawan et al. começaram a publicar uma série de
experimentos em relação ao gênero Passiflora, dentre os quais um estudo
comparativo da atividade biológica de extratos metanólicos igualmente obtidos de
P. incarnata e P. edulis. A dose de 125 mg/kg (via oral) do extrato metanólico das
partes aéreas de P. incarnata apresentou significante atividade ansiolítica em
camundongos no modelo LCE, enquanto que P. edulis não apresentou atividade
significativa em nenhuma das doses testadas (DHAWAN et al., 2001c). O posterior
fracionamento do extrato metanólico de P. incarnata, possibilitou o isolamento de
uma substância benzoflavônica (BZF), o qual apresentou uma atividade ansiolítica
expressiva (10 mg/kg, p.o.) similar ao efeito exibido pelo diazepam (2 mg/kg, v.o)
em camundongos submetidos ao LCE (DHAWAN et al., 2001a).
Esses mesmos autores analisaram extratos obtidos de diferentes órgãos
vegetais de P. incarnata e observaram que o extrato metanólico das raízes dessa
espécie não apresenta significativa atividade ansiolítica em relação aos demais
órgãos vegetais (DHAWAN et al., 2001b). O extrato metanólico das folhas de P.
incarnata apresentou atividade ansiolítica, propriedades anti-tussígenas (Dhawan
et al., 2002b) contra tosse induzida por SO
2
e propriedades afrodisíacas na dose
de 100 mg/kg em animais de laboratório (DHAWAN et al., 2002c).
Santos (2003) realizou um estudo farmacológico através da administração do
extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia em camundongos, em doses inferiores a
1.800 mg/kg não resultando em toxicidade aparente. Através dos métodos LCE e
campo aberto, observou um efeito sedativo com o extrato hidroalcoólico bruto,
extrato metanólico e sub-extrato metanol-água, sendo que apenas este último
apresentou atividade ansiolítica na dose de 30 mg/kg. Ainda no mesmo estudo
verificou-se que todos os extratos e frações com atividade sedativa, apresentaram
atividade de catalepsia em camundongos.
Apesar dos experimentos laboratoriais desenvolvidos com o intuito de avaliar
a atividade farmacológica de Passiflora, ainda não se pode afirmar à qual classe
de compostos se deve tal atividade sedativa, se a um composto isolado ou a
grupos de compostos químicos (PEREIRA e VILEGAS, 2000).
O extrato fluido de P. alata que foi produzido e analisado quimicamente neste
trabalho, foi também investigado por (Salomão, 2003) farmacologicamente quanto
aos seus efeitos psicotrópicos. Efeito ansiolítico foi observado em camundongos
tratados com o extrato (100 mg/kg) e submetidos ao LCE. Todas as doses
utilizadas do extrato (30, 100 e 300 mg/kg) produziram sedação, confirmada pela
diminuição do número de cruzamentos e levantamentos realizados pelos animais,
no campo aberto. Finalmente, extrato 100 mg/kg aumentou o tempo de sono
induzido pelo pentobarbital sódico e induziu catalepsia em camundongos
produzindo atividade ansiolítica e sedativa nas doses empregadas neste estudo.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material Botânico
A
P. alata
foi coletada no horto botânico do Campus da UNIVALI em Ilhota
SC, nos meses de janeiro e agosto de 2001 e identificada botanicamente como
P.
alata
Curtis pelo Professor Armando Cervi, Curador do Herbário da UFPR e est
harmana, harmol, harmina, harmalina e harmalol, (Fluka) foram cedidos pelo
professor Dr. Cid ª Santos do Departamento de Farmácia da UFPR.
Padrões e solventes foram filtrados por membrana de celulose regenerada
(Schleicher e Schuell) com poros de abertura 0,45 µm.
4.3 Métodos para Obtenção de Extratos
Os diferentes métodos de obtenção de eos 0 Td(t)Tj3.3(h)Tj6.59998áááááááááááááááááááááááááááááááááááááááááá2/R309 12 Tf1 0 I5ááááááTf1 0 Ina de
Extrato de P. actinia (T)
O extrato de P. actinia foi obtido do Laboratório de Farmacognosia da
UFPR, produzido por Kely Cristina Santos, segundo metodologia proposta pela
Farmacopéia Brasileira I para o preparo de tintura de P. alata (DA-SILVA, 1926).
Extrato de P. incarnata ©
O extrato fluido de P. incarnata foi obtido comercialmente (“Chemische
Fabrik Dr. Hetterich
”) Fürth, Alemanha.
4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides
Extrato de P. alata (A
1
)
Após elaborado o extrato hidroalcoólico de acordo com a metodologia
adaptada da Pharmacopoeia Helvética VII (1987) e armazenado em refrigerador a
8°C, por 3 dias, o precipitado (20 g) foi diluído em 200 mL de metanol:água (2:1) e
extraído três vezes em funil de separação, com porções de 100 mL com os
solventes: hexano, diclorometano e acetato de etila. O líquido restante foi
denominado fração aquosa que foi concentrado até secura. Em cada uma dessas
extrações foi aguardado o tempo suficiente até obter a nítida visualização das
linhas de separação das duas fases. As fases orgânicas de cada extração, foram
reunidas e também concentradas até a secura em evaporador rotatório.
4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides
Extrato de
P. alata
e
P. actinia
(B)
Para obtenção dos extratos das folhas sob refluxo, foram utilizados 0,400 g
da planta, seca e padronizada de acordo com o item 3.3.1 para extrato de P. alata.
Colocada em balão de fundo redondo de 50 mL, acrescentado 25 mL de etanol
40% e aquecido em banho-maria, sob refluxo por 15 minutos. Após, a mistura foi
filtrada por algodão para balão volumétrico de 50 mL. O resíduo da droga e o
algodão foram lavados em balão de fundo redondo com 10 mL de etanol 40% e
aquecido a fervura sob refluxo por 10 minutos. Filtrado novamente a mistura por
algodão, lavado o resíduo e o algodão e mais 10 mL de solvente em balão de 50
mL e aquecido em banho-maria sob
refluxo por mais 10 minutos. Após o resfriamento em
temperatura ambiente, o extrato foi filtrado para balão volumétrico completando o volume com
etanol 40%.
4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides
A preparação de extratos para pesquisa de alcalóides foi realizada somente
com P. alata.
Extrato I
Pó padronizado das folhas (5 g), umedecidas com hidróxido de amônio 5%,
deixado em repouso por 10 minutos, adicionado aproximadamente 30 mL de
clorofórmio suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 15
minutos. Após, o extrato foi filtrado e concentrado em banho maria, o resíduo foi
ressuspendido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).
Extrato II
Utilizando 15 g de pó padronizado das folhas, umedecido com hidróxido de
amônio 5%, deixado em repouso por 10 minutos, foi adicionado clorofórmio o
suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 20 minutos. Após, o
extrato foi filtrado, concentrado em banho maria, redissolvido o resíduo com 10
mL de acido clorídrico 1% e colocado no ultrassom por 10 minutos. Filtrado
novamente, alcalinizado com hidróxido de amônia 10% até pH 9-12, foi procedido
a extração em funil de separação com 5 mL de diclorometano. A extração foi
repetida por 3 vezes. Após este processo, a fase orgânica foi concentrada em
banho maria, e o resíduo redissolvido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).
Extratos III e IV
De modo a reproduzir a metodologia clássica para extração de alcalóides,
segundo método descrito por Benatti (1967), uma parte do extrato hidroalcoólico
foi concentrado em rota-vapor, sendo feita a extração durante 7 horas com éter
sob aquecimento usando o aparelho Soxhlet. Após finalizado este pr
Figura 4:
Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos
4.4
.
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
4.4.1 Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
Preparou-se uma tintura alcoólica das folhas de
P. alata
, a 1/5 por
maceração em álcool a 60
°
C à temperatura ambiente. Evaporou-se 3 mL dessa
tintura a banho-maria e o resíduo foi retomado com 5 mL de metanol sendo filtrado
sobre sulfato de sódio anidro ® (cerca de 0,5 g). Evaporou-se o filtrado a seco,
retomando-o com 5 gotas de metanol. Foi depositado 5
µ
L desta última solução
Extrato (A)
(Phram. Helvética VII )
Extrato (T)
(Farm.
Brasielira II)
Folhas padronizadas
P. actinia
Folhas padronizadas
P. alata
Extrato (C)
P. incarnata (
obtido
comercialmente)
Pesquisa
Flavonóides
(CLAE, UV,
CCD)
Extrato (B)
sob refluxo
Pesquisa
Flavonóides e
alcalóides (CLAE,
UV, CCD)
Extrato (A
1
)
fracionado
Pesquisa
Flavonóides
(CCD)
Pesquisa
Flavonóides e
alcalóides (CLAE,
UV, CCD)
Pesquisa
Flavonóides
(CLAE, UV)
Extrato (B)
Sob refluxo
Pesquisa
Flavonóides
(UV, CLAE)
Extrato I, II, III
e IV
Pesquisa
alcalóides
(CLAE)
sobre uma camada fina de sílica e usando como fase móvel: acetato de etila,
metiletilcetona, água, ácido fórmico (5:3:2:1, v/v). A visualização foi feita sob luz
UV (366 nm ) após nebulização de reativo citrobórico (ácido bórico, ácido cítrico,
metanol 5:5:100, p/v) e solução alcoólica de tricloreto de alumínio a 1%),
FARMACOPÉIA BRASILEIRA (1977).
Realizou-se ainda a seguinte pesquisa para flavonóides: 1 mL do extrato
hidroalcoólico foi evaporado e solubilizado com um mínimo de metanol sendo
aplicado em placas de alumínio cobertas com uma fina camada (0,2 mm) de sílica
gel 60 F 254 Merck, ativada a 110°C por 2 horas. Alternadamente, foi preparada a
seguinte fase móvel: acetato de etila, água, ácido fórmico na proporção 80:15:5 e
a visualização foi feita sob luz UV 366 nm seguido pela revelação com ácido 2-
aminoetil ester difenilbórico a 1% em metanol e Polietilenoglicol 4000 a 5% em
metanol, sendo a placa aquecida a 120°C por 5 minutos. Para os extratos
fracionados seguiu-se este mesmo procedimento.
4.4.2 Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
Utilizando o extrato hidroalcoólico de P. alata, foram feitas extrações com
clorofórmio, adicionando o agente secante sulfato de sódio anidro, filtrou-se,
evaporou-se o filtrado a seco, retomando-o com algumas gotas de clorofórmio.
Foi depositado 5 µL desta última solução sobre uma camada fina de sílica e
usando como fase móvel clorofórmio–metanol-hidróxido de amônia (9,7:0,3:0,025
v/v). A visualização foi feita sob luz UV (254 e 365 mm) após nebulização do
reativo Dragendorf (WAGNER e BLADT, 1995).
4.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
4.5.1 Instrumentação
As análises dos extratos foram realizadas utilizando o cromatógrafo líquido
do LAPAM (Laboratório de Produção e Análise de Medicamentos – UNIVALI) da
marca SHIMADZU LC-10; coluna C18 (Phenomenex), Luna 5µm C18 (Dimensão
250 x 4,60 mm), usando detector SPD – M10A VP, um “loop” de injeção de 20 µL,
uma Bomba LC 10 VP e um software Class VP.
4.5.2 Preparo das amostras para pesquisa de flavonóides C-glicosilados e
alcalóides
Os extratos foram filtrados em presença de carvão ativo e diluída em metanol
50% na proporção 1:10, sendo novamente filtrada por membrana de celulose
regenerada (Schleicher e Schuell) com poros de abertura 0,45 µm. Todas as
análises foram realizadas em triplicata, a temperatura da coluna de 30 °C.
4.5.3 Condições cromatográficas para pesquisa de flavonóides C-
glicosilados
Foram testadas sete condições cromatográficas para as análises dos extratos (T, B, A
e C) em CLAE.
A detecção em UV foi efetuada a 340 nm, 270 nm e 260 nm. Conforme Quadro 1 e
Tabelas 1, 2, 3 e 4:
Quadro 1: Sistemas de solventes utilizados nas corridas isocráticas
SISTEMA
SOLVENTES
FLUXO
(mL/min)
1
acetonitrila – água – ácido acético (18:82:0,5)
1
2
A = agua – ácido ortofosfórico (100:0,1), pH= 2,6 e
B = tetrahidrofurano – isopropanol – acetonitrila,
(10:2:3) (0-60 min de 12% de A em B)
1,2
3
A = agua – ácido ortofosfórico (100:0,1), pH= 2,6 e
B = tetrahidrofurano – isopropanol – acetonitrila,
(10:2:3) (0-80 min de 10% de A em B)
1,2
4
isopropanol – tetrahidrofurano – água (5:15:85),
1,5
Tabela 1: Sistema gradiente (1): A = água – ácido acético (100:0,5) pH= 2,88 e B
= Metanol, utilizando um fluxo de 0,5 mL/min.
TEMPO (min)
A (%)
B (%)
1
80
20
45
-
100
60
80
20
Tabela 2: Sistema gradiente (2): A = água – ácido acético (100:0,5) pH 2,88, B) =
Metanol e C = Acetonitrila, utilizando um fluxo de 1 mL/min.
TEMPO (min)
A (%)
B (%)
C (%)
1
80
10
10
20
70
15
15
30
60
20
20
35
50
25
25
Tabela 3: Sistema gradiente (3): A = Acetonitrila – água (110:660); B = Acetonitrila
– água (120:180), utilizando um fluxo de 1 mL/min.
TEMPO (min)
A (%)
B (%)
0,01
88
12
5
95
20
10
90
30
17
83
40
25
75
50
35
65
10
Tabela 4: Sistema Gradiente (4): A = água – ácido acético 0,5% (m/v); B =
Metanol; C = acetonitrila, utilizando um fluxo de 1 mL/min.
TEMPO (min)
A (%)
B (%)
C (%)
1
75
15
10
20
62
20
15
25
55
25
20
30
75
15
10
4.5.4 Curva de calibração para doseamento de isovitexina em CLAE
O teor de isovitexina foi realizado utilizando o sistema gradiente descrito na
Tabela 4. As injeções foram realizadas em triplicata e o resultado foi expresso pela
média das determinações em gramas de isovitexina por 100 g da droga (%, m/m).
Foram pesados 2 mg da substância de referência isovitexina e dissolvido em uma
solução de metanol e água na proporção de 1:1. A solução foi transferida para balão
volumétrico de 100 mL completando-se o volume com solução de metanol na
proporção de 1:1 (solução-mãe). Alíquotas da solução-mãe foram diluídas com uma
mistura metanol e água na proporção de 1:1 obtendo-se soluções contendo
isovitexina, nas seguintes proporções: 4,0; 8,0; 12,0; 16,0; 20,0 µg/mL. As soluções
foram filtradas através de filtro de membrana de celulose regenerada (0,45 µm de
diâmetro nominal de poro) e injetadas no cromatógrafo.
4.5.5 Curva de calibração para doseamento de vitexina em CLAE
O teor de vitexina foi realizado de acordo com o sistema isocrático 4 do
Quadro 1. As injeções foram realizadas em triplicata e o resultado foi expresso
pela média das determinações em gramas de vitexina por 100 g da droga (%,
m/m).
Foi pesado 1 mg da substância referência, vitexina e dissolvida em uma
solução de metanol e água na proporção de 1:1. A solução foi transferida para
balão volumétrico de 100 mL completando-se o volume com solução de metanol
na proporção de 1:1 (solução-mãe). Alíquotas da solução-mãe foram diluídas com
uma mistura metanol e água na proporção de 1:1 obtendo-se soluções contendo
vitexina, nas seguintes proporções: 2,0; 4,0; 8,0; 12,0; 16,0
µ
g/mL. As soluções
foram filtradas através de filtro de membrana de celulose regenerada (0,45
µ
m de
diâmetro nominal de poro) e injetadas no cromatógrafo.
4.5.6 Condições cromatográficas para pesquisa de alcalóides ββ-carbolínicos
Para desenvolver método utilizando a CLAE e melhor separar cada
padrão (harmana, harmina, harmol, harmalina, harmalol), foram usados os
gradientes de concentração da fase móvel (acetonitrila 22%, metanol 22%),
segundo método descrito por Rehwald et al. (1995), conforme as Tabelas 5, 6 e 7.
A detecção em PDA foi efetuada a 340 nm, 240 nm e 260 nm.
Tabela 5: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato
(pH 8,0), utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.
TEMPO (min)
A (%)
B (%)
C (%)
0-5
5-18
18-30
32
40
32
12
20
12
56
60
56
Tabela 6: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato
(pH 8,0), utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.
TEMPO (min)
A (%)
B (%)
C (%)
0-5
5-18
18-30
35
45
35
10
20
10
55
35
55
Tabela 7: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato
(pH 8,0), utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.
TEMPO (min)
A (%)
B (%)
C (%)
0-5
5-18
18-30
31
38
31
11
18
11
58
44
58
4.6 Validação Analítica
A validação do método (sistema gradiente 4 – Tabela 04) foi baseada na
United States Pharmacopeia (2000). A amostra para os ensaios de validação foi o
extrato hidroalcoólico de P. alata conforme procedimento da Farmacopéia
Helvética (1987). A isovitexina, em três níveis diferentes de concentração (5, 7 e
10 µg/mL), foi adicionada ao extrato para avaliação da recuperação do método.
4.6.1 Linearidade e intervalo
A linearidade foi determinada com a construção da curva padrão, obtida
através das injeções no cromatógrafo, de diferentes concentrações da substância
de referência (isovitexina).
Foi realizada análise de regressão linear e calculado a equação da reta e o
coeficiente de correlação linear o qual deve ser R
2
≥ 0,999 usando o software
CLASS VP-503.
4.6.2 Ensaio de exatidão
A exatidão do método foi determinada após o estabelecimento da
linearidade, sendo verificada através do ensaio de recuperação, “contaminando”
diluições apropriadas de amostra, com diferentes concentrações conhecidas de
solução padrão (isovitexina). A concentração em cada balão ficou compreendida
no intervalo de linearidade do método.
A solução-padrão foi preparada pesando-se 8 mg de isovitexina e diluído
com metanol 50% para balão volumétrico de 100 mL, tendo como concentração
final: 80 µg/mL.
No preparo da solução-amostra, foi utilizado 5 mL de extrato fluido de P.
alata, diluído com metanol 50% para balão volumétrico de 50 mL e sonicado
durante 5 minutos, tendo como concentração final: 18 µg/mL.
Filtrou-se a solução amostra em papel filtro com carvão ativo e preparou-se
alíquotas seguindo as concentrações demonstradas na Tabela 8. Após realizou-se
as injeções no cromatógrafo utilizando-se como fase móvel o sistema gradiente
(4), demonstrado na Tabela 4.
Tabela 8: Ensaio de Recuperação calculado para o extrato fluido de P. alata (A)
fortificado com isovitexina.
Balão (10 mL)
Volume (mL)
Amostra
(18 µg/mL)
Volume (µL)
Padrão
(18 µg/mL)
Conc. Teórica
total
(µg/mL)
Conc. Teórica
adicionada
(µg/mL)
1
3
625
10
5
2
3
750
12
7
3
3
1,12
15
10
4 (amostra)
3
-
5
-
5 (padrão)
-
625
5
5
4.6.3 Ensaio de especificidade
Este estudo foi realizado durante o teste de recuperação acima (citado no
ensaio de exatidão), tendo como base os dados relativos ao balão no qual foi
realizada a adição de iguais volumes de amostra e padrão comparando com
aquele que foi colocado apenas padrão.
Cálculo:
Resultado do balão apenas com padrão -------------100%
Resultado do balão com amostra e padrão ---------- X%
Inteferência do extrato fluido = 100 – X%
4.6.4 Limite de quantificação
O limite de quantificação (LQ) corresponde ao menor nível de concentração
que pode ser quantificado com precisão e exatidão aceitáveis. Este foi
determinado através da equação 1, utilizando o coeficiente angular da curva de
calibração e o desvio padrão da curva de regressão linear (S) (USP, 1995).
Equação 1:
LQ = 10 x S
A
4.7 Doseamento do Teor de Flavonóides Totais em UV
Nas Figuras 5, 6 e 7 estão descritos os procedimentos operacionais
realizados para análise do teor de flavonóides totais.
*
Valor de referência para
P.
alata
: 0,55%
C= A*FD
m*E
1%
C= concentração de Apigenina
em % (m/m);
A= absorbância;
FD= fator de diluição;
m= massa da planta seca em g;
E = Coeficiente de abs específica
da apigenina (336,5)
Figura 5:
Fluxograma do método descrito por PETRY
et al.
(1998).
Partes aéreas de
P.
alata
(0,2 g droga
seca)
Extração sob refluxo
etanol 40% (v/v), 30
min
Solução extrativa
Diluição da solução
extrativa (1:20)
Amostra: solução
extrativa + 2 mL
Solução AlCl
3
0,5%
(m/v)
Solução de
compensação: sem
adição de AlCl
3
0,5% (m/m)
Leitura em
espectrofotômetro (397
nm) após 30 min.
*
Valor de referência para
P. incarnata
:
1,5% do total de flavonóides
expressos em Vitexina.
Equação: A x 0,8
m
Sol 1*: metanol 10% em ác.
acético glacial;
Sol oxálico -bórica*:
25 g/l ác. bórico + 20 g/l ác. oxálico
em ác. fórmico.
Figura 6:
Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA
BRITÂNICA, (2000).
Partes aéreas de
P.
alata
(0,2 g droga
seca)
Extração sob refluxo 40
mL etanol 60% (V/V), 30
min (2 x)
Completar vol 100 mL
Evaporar 5 mL sol acima,
adicionar 10 mL sol 1* e 10
mL sol oxálico bórica* e
completar 25 mL ác. acético.
Solução de
compensação: sem
adição da sol oxálico
bórica.
Leitura em espectrofotômetro
(401 nm) após 30 min.
*
Valor de referência para
P. incarnata
:
0,3% expressos em Hiperosídeo.
A x 1.25
m
Sol 1*: hexametilenotetramina
0,5% m/v
Sol 2*: ác. clorídrico R1:
25% m/v
Sol 3*: ác. acético 5% em
metanol.
Figura 7:
Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA HELVÉTICA
(1987).
Partes aéreas de
P. alata
(0,6 g droga seca)
Extração sob refluxo +1mL sol
1*+20 mL acetona +2 mL sol
2*
30 min (2 X)
Amostra: 10 mL sol
acima +1 mL AlCL
3
e
completar vol com sol 3*.
Solução de
compensação: sem
adição de AlCl
3
20 mL sol acima+20 mL H
2
O+15
mL acetado etila partição da fase
aquosa (3 x). Reunir extratos
orgânicos e lavar com 50 mL
H
2
O.Completar vol 50 mL
Leitura em
espectrofotômetro (422
nm) após 30 min.
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Obtenção dos Extratos Fluidos e Fracionados para Pesquisa de
Flavonóides e Alcalóides
O extrato hidroalcoólico (A) (1:1, 360 mL), foi obtido por percolação, com
álcool bidestilado diluído, das folhas de P. alata. Durante o armazenamento
observou-se a formação de um precipitado ocasionado possivelmente devido à
evaporação do álcool, conseqüentemente diminuindo o teor alcoólico do extrato e
tornando insolúveis substâncias menos polares.
O precipitado desse extrato (A
1
) (1,5 g) foi particionado com diclorometano,
hexano e acetato de etila com objetivo de purificá-lo e separar as substâncias nele
contidas, por ordem de polaridade, para posteriormente submetê-las a
cromatografia em camada delgada (CCD).
A fração diclorometano apresentou coloração verde escura intenso, teve
rendimento de 0,2148 g equivalente a 14,32% do precipitado do extrato
hidroalcoólico. A fração hexano obteve um peso de 0,6983 g equivalente a
46,55% do precipitado do extrato hidroalcoólico e a fração acetato de etila de
coloração verde escura, teve rendimento de 0,3 g equivalente a 20% do
precipitado do extrato hidroalcoólico total. A fase aquosa, de coloração castanho
avermelhada, resultou em 0,2870 g de matéria seca, equivalente a 19,13% do
precipitado do extrato hidroalcoólico.
5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
A caracterização de flavonóides de P. alata realizada segundo Farmacopéia
Brasileira (1977), não apresentou resultado satisfatório. A metodologia descreve
que deve aparecer quatro manchas apresentando coloração amarelo esverdeada
sob luz ultravioleta após nebulização do revelador. Observou-se mancha alongada
no centro da placa de alumínio, não apresentando separação para uma possível
caracterização dos flavonóides.
Utilizando a fase móvel, constituída de acetato de etila-água-ácido fórmico
na proporção 80:15:5 houve separação dos flavonóides. Nas frações aquosa,
diclorometano e acetado de etila após a eluição cromatográfica e revelação,
constatou-se a presença de flavonóides e na fração hexânica não houve extração
de flavonóides. Como pode ser observado na Figura 8, a maioria dos flavonóides,
concentram-se na fase acetato e aquosa devido serem os solventes com maior
polaridade que os demais utilizados. Segundo Markhan (1982), os flavonóides são
compostos polares ou moderadamente polares.
Figura 8: CCD do extrato fluido fracionado (A
1
) de P. alata, a-fração diclometano,
b-fração hexano, c-fração acetato de etila e d-fração aquosa. Fase móvel: acetato
de etila – água - ácido fórmico (80:15:5).
Na CCD do extrato hidroalcoólico de P. alata (A) (Figura 9), comparando-se
com os perfis dos padrões observa-se possível ausência do flavonóide O-
glicosilado rutina, presença de flavonóide C-glucosilado vitexina e/ou isovitexina e
possível ausência do flavonóide quercetina. O mesmo foi observado para o extrato
comercial de P. incarnata e para a tintura farmacopeica de P. actinia na Figura 9.
a
b
c
d
Figura 9: Cromatografias de camada delgada das amostras: A- (Extrato
hidroalcoólico de P. alata ), T- (Tintura Farmacopeica de P. actinia), C- (Extrato
hidroalcoólico comercial de P.incarnata) e os respectivos padrões 1-Vitexina, 2-
Rutina e 3-Quercetina. Fase móvel: acetato de etila-água-ácido fórmico
( 80:15:5).
Comparando-se os perfis cromatográficos das três espécies de Passiflora,
observa-se que as espécies que mais assemelham-se são P. incarnata e P.
actinia. Após efetuarmos as análises em CLAE, onde também comparamos os
perfis cromatográficos das três espécies, confirmamos este mesmo resultado,
podendo assim verificar que as análises preliminares efetuadas através de CCD
foram satisfatórias.
Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
Na caracterização de alcalóides de P. alata segundo método da
Farmacopéia Brasileira (1977), utilizando o extrato fluido (A), não foi obtido
resultado satisfatório. A metodologia descreve três manchas apresentando
1
2
3
1
2
3
1
2
3
A
T
C
coloração castanho-avermelhada, após nebulização do revelador. No entanto,
não foi observado nenhuma mancha característica para alcalóides.
A CCD realizada com o extrato I, também não apresentou nenhum
resultado positivo para alcalóides. Já com o extrato II, houve o aparecimento de
uma mancha alaranjada, que depois desapareceu, sendo provavelmente um
resultado falso-positivo para alcalóides, já que o revelador Dragendorff utilizado se
complexa com outras substâncias gerando a mesma coloração característica
(WAGNER e BLADT, 1995)
Segundo Reginatto (2000) há um acúmulo de saponinas em P. alata
verificada por CCD com revelador anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento.
A presença de saponinas em P. alata pode ser considerada explicação para o
aparecimento das manchas CCD quando reveladas por Dragendorff, sendo que
este reativo dá falso positivo para compostos terpênicos como limonóides e
saponinas (Biavatti com. pessoal).
5.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Sistemas utilizados na pesquisa de flavonóides C-glicosilados em CLAE
Foram realizadas várias análises em CLAE, utilizando vários sistemas
isocráticos (Quadro 1) e vários sistemas gradientes (Tabelas 1, 2, 3 e 4), com o
objetivo de obter uma separação dos flavonóides e um perfil cromatográfico
satisfatório das preparações extrativas para assim podermos comparar, qualificar
e quantificar os flavonóides possíveis das três espécies de Passiflora.
De todas as fases testadas para pesquisa de flavonóides verificou-se que a
maior dificuldade foi a separação dos flavonóides C-glucosilados isovitexina e
vitexina, devido à semelhança estrutural, por serem isômeros, mudando apenas a
posição da glucose no anel aromático.
Foi observado uma separação satisfatória destes flavonóides utilizando o
sistema isocrático 4 (Quadro 1) e o sistema gradiente (4) (Tabela 4). Sendo que o
sistema isocrático permitiu quantificar o flavonóide C-glucosilado vitexina na
espécie P. incarnata e o sistema gradiente permitiu quantificar o flavonóide C-
glucosilado isovitexina nas preparações extrativas das três espécies de Passiflora.
O sistema escolhido para ser validado foi o sistema gradiente (4) (Tabela 4).
Comparação entre extrato fluido (A) (Farmacopoea Helvética, VII) de P. alata
coletada no mês de Janeiro e Agosto/2001
Figura 10: Cromatogramas da sobreposição do extrato fluido de P. alata (A) (em
preto) coletadas em Janeiro/2001 com o extrato fluido das folhas coletadas em
Agosto/2001 (em vermelho). Pico 1 – isovitexina. (Sistema gradiente (4) Tabela 4).
A avaliação quantitativa de isovitexina por CLAE e UV entre os extratos
(refluxo e fluido) da planta coletada em janeiro e agosto/2001 em Ilhota SC,
mostra uma diferença significativa entre os diferentes tipos de extratos e entre as
estações do ano da coleta comprovando a influência sazonal na obtenção de
fitoterápicos (Tabela 9).
Um dos fatores que deve ser levado em conta na escolha de um processo
de extração é se o mesmo não altera a composição dos analitos de interesse.
Neste trabalho, tanto a extração por percolação quanto a extração sob refluxo e
aquecimento não alteraram a composição dos flavonóides principais de maracujá
1
que foram encontrados em quase todas as amostras, variando quantitativamente
de acordo com as condições de extração.
Qimin et al. (1991) afirmam que os dados sobre quantificação de
flavonóides de P. incarnata encontrados na literatura são contraditórios, isto
porque a fração flavonoídica também está sujeita a variações no seu conteúdo: a
época de colheita, parte da planta que constitui a droga, o local de cultivo e a
metodologia de análise empregada são responsáveis por estas variações.
Menguini e Mancini (1988) estudando diversos estágios de desenvolvimento de P.
incarnata, verificaram que o teor de flavonóides é maior nas folhas. A maior
concentração do flavonóide isovitexina ocorre no período que antecede a floração
até o período de floração do vegetal (setembro a março).
Em termos qualitativos o perfil cromatográfico não sofreu alterações com as
estações do ano analisadas (Figura 10).
Tabela 9: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas de P. alata.
(1) Metodologia segundo FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000) λ=401 nm
(2) Metodologia segundo PETRY et al. (1998) λ=397 nm
(3) Metodologia segundo FARMACOPÉIA HELVÉTICA, (1987) λ=422 nm
Amostra P.
alata
CLAE*
Isovitexina %
m/m
UV
1
Vitexina % m/m
UV
2
Apigenina %
m/m
UV
3
Hiperosídeo %
m/m
Extrato B
(Janeiro)
1,137 (±0,002)
0,470 (±0,001)
0,087(±0,0005
)
0,775 (±0,001)
Extrato A
(Janeiro)
0,018 (±0,001)
0,256 (±0,069)
0,054 (
±
0,001)
0,116 (
±
0,0005)
Extrato B
(Agosto)
0,018 (±0,006)
0,395(±0,0005)
0,061 (±0,007)
0,405 (± 0,001)
Extrato A
(Agosto)
0,007(±0,0007)
0,204 (±0,001)
0,033 (±0,005)
0,084 (±0,0005)
* Sistema gradiente (4) (Tabela 4), os valores expressam a média de triplicata (±
desvio padrão)
Extrato A= fluido P. alata
Extrato B= refluxo
Comparação dos perfis cromatográficos de P. alata, P. incarnata e P. actinia
Foi observada separação razoável dos diferentes compostos através da
CLAE, sendo possível diferenciar os extratos das espécies de Passiflora nos dois
sistemas cromatográficos desenvolvidos (Figura 11).
Os flavonóides são considerados por alguns autores como sendo o maior
grupo de constituintes ativos presentes no gênero Passiflora (Dhawan et al.,
2001), sendo em grande parte C-glicosilados e com polaridade elevada. Essa
característica possibilita uma eficiente separação e análise por meio de CLAE em
coluna de fase reversa (MORAES, 1995).
Para escolha do melhor comprimento de onda (340 nm) foram levados em
consideração os espectros UV de padrões, das agliconas e principalmente dos
flavonóides presentes nas diferentes espécies aqui estudadas. Através do
Detector de Arranjo de Fotodiodos (PDA) obteve-se os espectros UV dos
diferentes componentes dos extratos de P. alata, P. actinia e P. incarnata os quais
foram identificados como flavonóides, devido aos espectros característicos, com
dois máximos de absorção determinados pelo núcleo da benzopirona: um entre
240-285 nm (banda II) e outro entre 300-400 nm (banda I). Em geral a banda II é
atribuída á absorção do anel A e a banda I devido ao anel B. Em flavonas a banda
I aparece entre 304-350 nm e em flavonóis entre 352-385 nm (Zuanazzi, 2001)
(Figuras 15 e 22). Porém não foi possível a identificação dos flavonóides
majoritários da espécie P. alata devido à indisponibilidade dos padrões.
Quando os cromatogramas dos extratos foram comparados e co-injetados
com amostras autênticas de flavonóides, observou-se a presença de vitexina (pico
2) somente nos extratos de P. alata (Figura 11) e P. incarnata (Figuras 11, 19 e
20). O flavonóide isovitexina (pico 1) foi identificado nos extratos das três espécies
(Figuras 13, 16 e 19). Rehwald et al. (1994) observaram que a isovitexina é um
dos flavonóides majoritários em amostras de P. incarnata. A identificação da
isovitexina feita por meio da comparação dos tempos de retenção de picos e dos
espectros UV foi considerada pelos autores, uma forma segura de identificação de
compostos quando são usados padrões adequados.
No Sistema Gradiente (4), (Tabela 4) foram detectados a presença de 5
picos correspondentes a flavonóides no extrato de P. alata (Figura 13), 6 picos na
tintura farmacopéica de P. actinia (Figura 16) e 11 picos no extrato comercial de
P. incarnata (Figura 19). Neste sistema cromatográfico, nenhuma das espécies
apresentou pico característico de flavonóide com tempo de retenção superior a 25
minutos (Tabela 10).
No sistema isocrático 4 (Quadro 1), foram detectados a presença de
aproximadamente 5 picos correspondentes a flavonóides no extrato de P. alata, 6
picos na tintura farmacopeica de P. actinia e 9 picos no extrato comercial de P.
incarnata. A vitexina foi identificada em maior quantidade em P. incarnata e está
presente na quantidade de traços em P. alata. Já na espécie de P. actinia pode-
se observar a ausência total de vitexina (Figura 11). Neste sistema, a maior
concentração dos picos de flavonóides sai em até 10 minutos e nenhuma das
espécies apresenta pico de flavonóide com tempo de retenção superior a 15
minutos (Tabela 11).
Dessa forma, os dois sistemas permitiram identificar cada espécie e
também permitiram constatar ausência dos demais padrões de flavonóides
(orientina, swertisina e rutina) testados nas preparações extrativas das três
espécies. Há mais semelhança entre as espécies P. incarnata com P. actinia
quando comparados entre si com P. alata, conforme observado através de CCD
(Figura 9).
Tabela 10: Tempo de retenção referente aos flavonóides investigados nos
extratos de P. alata, P. actinia e P. incarnata. (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
* (n=3).
tR (min)
Flavonóide
Padrão
P. alata*
P. actinia*
P. incarnata*
Isovitexina
17,020
17,109
17,230
17,122
Orientina
11,851
-
-
-
Swertisina
26,069
-
-
-
Rutina
22,475
-
-
-
Tabela 11: Tempo de retenção relativo aos flavonóides investigados nos extratos
de P. alata, P. actinia e P. incarnata. Sistema isocrático 4 (Quadro 1). * (n=3).
tR (min)
Figura 11: Cromatogramas das três espécies de Passiflora: a) P. alata, b) P.
actinia e c) P. incarnata. Pico 1-Isovitexina, sistema gradiente 4 (Tabela 4) e Pico
2-Vitexina. À esquerda Sistema Gradiente (4) (Tabela 4) e a direita sistema
isocrático 4 (Quadro 1).
1
tR=17,1
1
tR=17,2
1
tR=17,1
2
tR2=13,8
2
tR2=14,0
8
a
b
c
5.4 Análise Quantitativa Através de CLAE
Quando se trabalha com amostras complexas, como extratos de plantas, a
separação isocrática geralmente exibe baixa resolução das substâncias eluidas
com menor tempo de retenção e difícil detecção das substâncias eluidas com
maior tempo de retenção, além da demora para sua eluição. Neste caso a eluição
por gradiente permite melhores condições de separação, otimizando os valores de
k de cada pico cromatográfico (PEREIRA, 2002).
Visto serem a maioria dos estudos sobre teor de flavonóides direcionados
para P. incarnata, não foram encontrados dados sobre os flavonóides majoritários
em P. alata. Os métodos em CLAE utilizam flavonas C-glicosiladas como padrões
ou então as amostras são submetidas à hidrólise ácida antes da análise por CLAE
(SCHMIDT e ORTEGA, 1993; QUERCIA et al., 1978; QIMIN et al., 1991). Vários
autores relatam que os flavonóide C-glicosilados resistem a hidrólise ácida
(SCHMIDT e ORTEGA, 1993; PETRY et al., 1998; PEREIRA, 2002). Na análise
quantitativa das três espécies, utilizando o sistema gradiente, observou-se que o
flavonóide C-glucosilado isovitexina foi identificado em maior quantidade no
extrato fluido comercial de P. incarnata (C), seguido da tintura Farmacopéica de P.
actinia (T) e em menor quantidade no extrato fluido da espécie oficial da
Farmacopéia Brasileira P. alata (A) (Tabela 12). Sendo identificado como o
composto majoritário nas espécies P. actinia e P. incarnata (Figuras 16 e 19).
Vários autores relatam a presença majoritária de isovitexina ou vitexina em
amostras de P. incarnata. Rehwald et al. (1994) analisando 4 amostras de P.
incarnata através de CLAE, verificou que os teores de isovitexina diferem entre as
amostras, apesar de constatar que é o flavonóide majoritário na espécie. Após
analisar extrato metanólico em 09 amostras de P. incarnata através de CLAE,
Grice et al. (2001) demonstraram não ser a isovitexina o flavonóide majoritário nas
amostras e sim a vitexina. Já Abourashed et al. (2002), analisando extratos
metanólicos através de CLAE em 115 amostras de diferentes espécies de
Passiflora, entre elas as espécies P.alata, P. actinia e P. incarnata, encontrou
ausência de isovitexina em amostras de P. alata, 0,16% de isovitexina em P.
actinia, 0,42 e 0,11% em amostras de P. incarnata de diferentes locais. A literatura
demonstra dados coerentes com este trabalho, evidenciando também que os
teores diferem de acordo com a época e o local onde são coletadas as espécies.
Nas comparações do teor de isovitexina nas preparações extrativas sob refluxo e
aquecimento (B) das espécies P. alata e P. actinia, a P. alata demonstrou maior
teor deste composto. A metodologia de extração sob refluxo e aquecimento
demonstrou que extraiu maior teor de flavonóide do que a metodologia através da
percolação (Tabela 12). Também deve-se considerar que as amostras de P. alata
e P. actinia foram coletadas em épocas e locais diferentes.
Outro fator muito importante na quantificação de flavonóides que deve ser
levado em consideração, é a degradação destas substâncias por fungos e
bactérias (Fiura 12). Em um estudo realizado por Schoefer et al. (2003), o fungo
anaeróbio Clostridium orbiscidens demonstrou ser capaz de converter os
flavonóides quercetina, luteolina, apigenina, entre outros em ácido 3,4-
dihidrofenilacético, ácido 3-(3,4-dihidróxifenil) propiônico e ácido 3-(4-hidroxifenil)
propiônico. Em outro estudo realizado por Mamma et al. (2004) foi investigado um
sistema multienzimático produzido por Penicillium decunbens degrada rutina
quebrando seu anel heterocíclico transformando-a em quercetina.
O baixo teor de flavonóide nos extratos fluidos Farmacopéicos de P. alata
(A) e P. actinia (T), visto que estes extratos foram concentrados, em conseqüência
diminuindo seu teor alcoólico e armazenados por mais de 6 meses em geladeira,
pode ser explicado por uma possível degradação por fungos e bactérias,
diminuindo o teor de flavonóides. Possivelmente o extrato fluido comercial de P.
incarnata possua conservantes ou pode ter sido submetido a uma etapa de
esterilização.
Figura 12: Esquema mostrando degradação microbiana de flavonóides.
quercetina
a
taxifolina
alfitonina
floroglucinol
Ác. 3, 4-
dihidroxifen
ilacético
R= H apigenina
R= OH luteolina
R= H naringenina
R= OH eriodictiol
dihidrochalconas
R= OH floretina
R= H 3-(4-ácido
hidroxifenilpropiônico)
R= OH 3-(3,4- ácido
dihidroxifenilpropiônico)
Tabela 12: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide Isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas das três espécies de
Passiflora (n=3).
(1) Metodologia segundo FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000) λ=401 nm
(2) Metodologia segundo PETRY et al. (1998) λ=397 nm
(3) Metodologia segundo FARMACOPÉIA HELVÉTICA, (1987) λ=422 nm
Amostra
CLAE*
Isovitexina %
m/m
UV
1
Vitexina % m/m
UV
2
Apigenina %
m/m
UV
3
Hiperosídeo %
m/m
Extrato B
P. alata
1,137 (
±
0,002)
0,470 (
±
0,001)
0,087(
±
0,0005)
0,775 (
±
0,001)
Extrato A
0,018 (
±
0,001)
0,256 (
±
0,069)
0,054 (
±
0,001)
0,116 (
±
0,0005)
Extrato T
0,028 (
±
0,002)
0,083 (
±
0,00)
0,022 (
±
0,0005)
0,025 (
±
0,00)
Extrato B
P. actinia
0,631 (
±
0,001)
0,348 (
±
0,001)
0,079 (
±
0,00)
0,668 (
±
0,012)
Extrato C
1,198 (
±
0,009)
0,164 (
±
0,00)
0,023 (
±
0,003)
0,032 (
±
0,0009)
* Sistema gradiente (4) (Tabela 4), os valores expressam a média de triplicata (
±
desvio padrão)
Extrato A= fluido P. alata
Extrato B= refluxo
Extrato T= tintura P. actinia
Extrato C= fluido comercial P. incarnata
Figura 13: Cromatogramas de: a) Extrato fluido de P. alata (A) e Padrões: picos 1-
isovitexina, 2-vitexina, 3-orientina, 4-rutina e 5-swertisina (sistema gradiente (4),
Tabela 4)
1
tR=17,1
tR=17,0
1
2
tR=11,8
4
tR=22,4
5
tR=26,0
3
a
O
O
H
O
H
O
O
H
Glu
isovitexina
O
Glu
O
H
O
H
O
O
H
O
H
orientina
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
g
l
u
-
r
h
a
rutina
O
O
H
O
O
H
Glu
O
C
H
3
swertisina
Figura 14: Cromatograma do extrato fluido de P. alata (A) e ao lado pode ser
visto o espectro de UV de: 1- Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
Figura 15: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina + 2-vitexina e
ao lado pode ser visto o espectro: 1-Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
1
1
2
O
O
H
O
H
O
O
H
Glu
isovitexina
Figura 16: Cromatogramas de: b) Tintura de P. actinia (T). Padrões: picos 1-
isovitexina, 2- vitexina, 3- orientina, 4- rutina e 5- swertisina (Sistema Gradiente
(4), Tabela 4)
tR=17,23
tR=17,0
2
1
1
tR=11,8
2
3
tR=22,4
tR=26,0
b
4
5
O
Figura 17: Cromatograma da tintura de P. actinia (T) e ao lado pode ser visto o
espectro de UV de: 1- Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
Figura 18: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina+2-vitexina e
ao lado pode ser visto o espectro: 1-Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
1
1
2
O
O
H
O
H
O
O
H
Glu
isovitexina
Figura 19: Cromatogramas de: b) Extrato fluido de P. incarnata (C). Padrões: pico
1-isovitexina, 2- vitexina, 3- orientina, 4- rutina e 5- swertisina (Sistema Gradiente
4, Tabela 4)
1
tR= 17,12
3
tR=11,8
tR=17,0
1
2
5
tR=26,0
c
4
tR=22,4
2
O
Glu
O
H
O
H
O
O
H
O
H
orientina
O
O
H
O
O
H
Glu
O
C
H
3
swertisina
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
O
g
l
u
-
r
h
a
rutina
O
O
H
O
H
O
O
H
Glu
isovitexina
Figura 20: Cromatograma do extrato fluido de P. incarnata (C) e ao lado pode ser
visto o espectro de UV de: 2- vitexina (Quadro 1,Sistema isocrático 4).
Figura 21: Cromatograma do extrato fluido P.incarnata (C) e ao lado pode ser
visto o espectro de UV de: 1- isovitexina (Sistema Gradiente (4), tabela 4).
5.5 Análise Quantitativa Através de CLAE (Sistema Isocrático 4, Quadro 1)
As análises realizadas através do sistema isocrático, apresentaram uma
separação satisfatória dos flavonóides vitexina e isovitexina (Figura 22),
possibilitando a quantificação da vitexina nas amostras de P. alata e P. incarnata.
1
2
tR=14,081
OH
OH
Glu
OH
O
O
Vitexina
2
1
Figura 22: Cromatograma da co-injeção dos padrões (1-isovitexina e 2-vitexina).
Ao lado espectros de UV de: 2- Vitexina (Quadro 1, Sistema isocrático 4).
Foi verificado ausência de vitexina em P. actinia e também ausência dos demais
padrões testados. Tanto nos extratos sob refluxo (B) como nos extratos sob
percolação de P. alata (A), a vitexina apareceu em baixa quantidade (traços),
ficando abaixo da menor concentração da curva utilizada para o doseamento,
sendo possível quantificá-la apenas no extrato fluido comercial de P. incarnata
(Tabela 13 e Figura 24).
Ainda existem poucos estudos sobre teores de flavonóides em P. alata
através de CLAE, sendo a maioria direcionados para P. incarnata. Tais estudos
relatam a presença de teores baixos ou ausência de vitexina em amostras de P.
alata e teores maiores em amostras de P. incarnata.
Ulubelen e Oksu (1982), analisando teores de flavonóides através de CLAE
em amostras de P. pittieri, P. alata e P. ambigua verificaram que a P. alata
possuía o menor teor de vitexina entre as três espécies. Abourashed et al. (2002),
analisaram extratos metanólicos através de CLAE em 115 amostras de diferentes
espécies de Passiflora, entre elas as espécies P.alata, P. actinia e P. incarnata.
Estes autores encontraram ausência de vitexina em amostras de P. alata e P.
actinia e 0,06% deste composto para amostras de P. incarnata.
Quercia et al. (1978) através de um estudo em CLAE em amostras de P.
incarnata encontraram um teor de vitexina de 0,226% em extrato pilular e 2,24%
em amostras de extratos pulverizados. Grice et al. (2001) após analisarem 9
amostras de P. incarnata (extratos metanólicos) encontraram teores que variam de
16,3 a 2.301,5 µg/g de vitexina.
Segundo a Resolução número 89, de 16 de março de 2004 da ANVISA na
“Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos” a vitexina ou isovitexina são os
flavonóides marcadores da espécie P. incarnata apontada como forma de uso a
tintura ou extrato das folhas, indicando como dose diária 15 a 100 mg de
vitexina/isovitexina.
Os estudos sugerem um teor menor ou ausência de vitexina em P. alata e
P. actinia comparando-se com P. incarnata. Sendo que os teores podem variar de
acordo com o método de extração, local, época de colheita da planta e possível
degradação de flavonóide por fungos e bactérias.
Tabela 13: Teor encontrado do flavonóide C-glucosilado vitexina,
Amostra
tR (min)*
g de flavonóide/ %
± SD
Extrato A
13,833
Traços
Extrato B (P. alata)
-
Traços
Extrato T
-
-
Extrato B (P. actinia)
-
-
Extrato C
14,081
0,312 ± 0,0009
(Sistema Isocrático 4, quadro 1, n*=3).
Extrato A= fluido P. alata
Extrato B= refluxo
Extrato T= tintura P. actinia
Extrao C= fluido comercial de P. incarnata
5.6 Validação Analítica
O padrão analítico utilizado no procedimento de validação apresentou
resposta linear, cuja curva apresentou valores de R
2
≥ 0,999 com intercepto em y
próximo a zero para isovitexina (Figura 23).
Os dados de recuperação são úteis para avaliar a eficiência do método
analítico proposto, sendo desta forma importante avaliá-la em di ão rt
adicionada, resultou em uma média de 98,67% de recuperação, mostrando que há
uma pequena variação de 1,33%. O coeficiente de variação ficou relativamente
baixo, em torno de 0,01. Com isto tornamos este método válido, pois o valor
encontrado está dentro do limite que é de 2% de variação (GREEN, 1996).
O limite de Quantificação (LQ) corresponde ao menor nível de concentração
que pode ser quantificado com precisão e exatidão aceitáveis. O valor encontrado
foi de 1,29 µg/ml apresentando uma sensibilidade satisfatória (Tabela 14).
A Figura 24 contém a curva de calibração realizada para o flavonóide
vitexina o qual não foi validado devido estar presente em P. alata na forma de
traços.
Figura 23: Curva de calibração de Isovitexina (padrão secundário) em MeOH 50%
a 340 nm (y= 2.11816e-008x-0.000543441)
Figura 24: Curva de calibração de vitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a
340 nm (R
2
= 0,999619). (y=2,29831 e-008x+0,000350931).
Tabela 14: Ensaio de Recuperação do método, calculada para o extrato fluido de
P. alata (A) fortificado com isovitexina
5.7 Doseamento Espectrofotométrico do Teor de Flavonóides Totais
A maneira mais precisa e exata de se identificar e quantificar flavonóides
em produtos naturais é a análise por HPLC. Entretanto, quando se pensa em
controle de qualidade, é conveniente a introdução de alternativas mais simples e
baratas, pois nesses casos requerem-se procedimentos que permitem a análise
rápida de numerosas amostras, em laboratórios geralmente modestos no que se
refere ao instrumental instalado e utilizado por analistas na maioria das vezes
sem formação superior. Uma das técnicas que se enquadram bem nesse contexto
é a determinação de flavonóides totais por espectrometria no UV (MARCUCCI,
1995).
O uso do cloreto de alumínio para a determinação da quantidade de
flavonóides totais não é, no entanto, um procedimento isento de limitações. O
método é preciso, isto é, ele é reproduzível, fornecendo desvios pequenos entre
um ensaio e outro com a mesma amostra. No entanto ele pode ser pouco exato,
Balão
Volume
Amostra
(mL)
Volume
Padrão
(
µ
L)
Conc.
Teórico
adicion.
(
µ
g/mL)
Conc.
Teórico
Total
(
µ
g/mL)
Conc.
Prático
Total
(
µ
g/mL)
Conc.
Prático
adicion.
(
µ
g/mL)
Coef.
de
variação
Desvio
padrão
relativo
%
1 3 625 5 10 10,34 4,96 0,020 0,4 99,20
2 3 750 7 12 12,31 6,93 0,0133 0,2 99,0
3 3 1,12 10 15 15,16 9,78 0,0156 0,15 97,80
4 3 - - 5 5,38 - 0,0155 - -
5 - 625 5 5 5,21 5,21 0,0133 - -
Média 98,67
ou seja, o valor que ele fornece pode ser diferente (geralmente inferior) em relação
à quantidade de flavonóides totais realmente presente na amostra analisada
(MARCUCCI, 1995).
Neste trabalho foram realizadas análises do teor de le fol em P.
alata co
A metodologia da Farmacopéia Helvética (1987) que doseia os flavonóides
totais (λ = 422 nm) em termos de hiperosídeo (O-glicosilado) (ver Figura 7, pág 40
e Tabela 12, pág 55) é um dos métodos de quantificação do teor de flavonóides
totais mais freqüentemente utilizado (DEUTSCHES, 1992). O método é geral e
preconizado para P. incarnata e outras espécies vegetais ricas em flavonóides.
Contudo, diversos autores assinalam para o mesmo diversas fontes de erro
analítico, decorrentes do método ter sido desenvolvido, de forma específica, para
análise de flavonóides O-glicosilados, mas não para flavonóides C-glicosilados,
que resistem a hidrólise ácida (SCHMIDT e ORTEGA, 1993). Além de tudo, o
método apresenta uma metodologia complexa, a amostra é extraída sob refluxo e
aquecimento utilizando como líquido extrator acetona e ácido, na seqüência é
ainda submetida a uma extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila e a
fração aquosa, onde estão presente os flavonóides encontrados freqüentemente
em Passiflora, é desprezada utilizando-se como solução exame a fração acetato
de etila complexada com cloreto de alumínio.
Nesta metodologia, envolvendo diversas etapas, os resultados obtidos das
folhas das espécies de P. alata e P. actinia foram coerentes com o referenciado
pelo método (mínimo 0,3% de flavonóide em termos de hiperosídeo para P.
incarnata). As folhas e o extrato fluido de P. alata (janeiro/2001) possuem maior
teor de flavonóides totais analisadas de acordo com esta metodologia.
Segundo a metodologia da Farmacopéia Britânica, (2000); onde o líquido
extrator é etanol 60%, a amostra não é submetida a hidrólise ácida. A metodologia
propõe o uso do reagente oxalo-bórico no lugar do cloreto de alumínio para a
formação do complexo a ser analisado por espectrofotometria. De acordo com a
literatura (Glasl, 1985), este tipo de complexação é mais específica para flavonas,
sendo portanto sujeito a menos erros analíticos. Os resultados obtidos foram
inferiores ao referenciado pelo método (1,5% de flavonóides totais em termos de
vitexina para P. incarnata). Comparando-se com as outras duas metodologias
testadas, a metodologia da Farmacopéia Britânica (2000) foi a que apresentou
teores maiores para os extratos de P. alata (A), P. incarnata (C) e P. actinia (T)
(Tabela 12).
As três metodologias analisadas para teor de Flavonóides totais em
espectrofotométricos de UV apresentam em comum: a) teores maiores para
amostras de P. alata coletadas em janeiro do que as coletadas em agosto; b)
teores maiores para amostras de extratos sob refluxo e aquecimento do que
extratos fluidos e c) teor maior para o extrato fluido de P. alata do que para extrato
fluido de P. incarnata e tintura de P. actinia (Tabela 12).
Na comparação dos métodos farmacopéicos com a metodologia
desenvolvida em CLAE observa-se divergências nos resultados. A quantificação
por CLAE apresenta vantagem da separação prévia dos compostos e
possibilidade de quantificação isolada de alguma substância de interesse frente
aos métodos espectrofotométricos. Rehwald et al. (1994) em seu estudo também
desenvolveram método em CLAE para qualificar e quantificar flavonóides em P.
incarnata e compararam os resultados com teor de flavonóides totais segundo a
metodologia espectrofotométrica da FARMACOPÉIA HELVETICA (1987). Neste
último a maioria dos resultados apresentou teores totais inferiores ao teor de um
único flavonóide analisado em CLAE. As quatro edições da Farmacopéia
Brasileira incluem monografias das folhas de P. alata sem no entanto, preconizar
um método analítico quantitativo para avaliação fidedigna da qualidade da droga.
Estes dados demonstram que há uma necessidade de reavaliação nos
métodos farmacopéicos para doseamentos de flavonóides totais.
5.8 Pesquisa de Alcalóides Através de CLAE
Sistemas utilizados na pesquisa de alcalóides β-carbolínicos em CLAE
Para desenvolver o cm BTá/R722 12 Tfá1 0 0 1 332.56 233.04 Tmá(b)TjáET.024 Tdá(o)á(a)Tjá6.72 0 72 0 Tdá0 TcTwá( )Tjá13.r
aparecem apenas no comprimento de onda de 240 nm, que foi o de maior
absorção.
Na Figura 25, percebe-se quatro picos característicos de alcalóides, pico 1
do alcalóide harmalol, pico 2 do harmol, pico 3 do harmalina e pico 4 uma mistura
de harmana e harmina. A fase utilizada nesta análise foi baseada na metodologia
descrita por Rehwald, Sticher e Meyer (1995), que utililizou como fase móvel
tampão fosfato em pH 8,0 e metanol-acetonitrila, na proporção 1:1, no
desenvolvimento das suas análises.
A estrutura básica dos padrões harmana (8) e harmina (12) são iguais,
diferenciando-se apenas por uma ligação de um radical –OCH3, na estrutura do
padrão harmina. Provavelmente esta semelhança leva a retenção dos padrões
no mesmo tempo.
(8)
(12)
Na tentativa de separação dos alcalóides harmana e harmina, foram feitas
alterações nos gradientes de concentração da fase móvel utilizada anteriormente,
aumentando a concentração de metanol e diminuindo a de acetonitrila. Como
pode-se perceber na Figura 26, houve um adiantamento nos tempos de retenção
dos padrões, não havendo a separação dos padrões harmana e harmina.
A separação dos padrões harmana e harmina foi realizada após uma
pequena modificação nas concentrações de metanol e acetonitrila (metanol 32% e
acetonitrila 12%), (Tabela 5) como pode ser observado na Figura 27, que
apresenta os tempos de retenções para cada padrão, sendo o do harmolol 6,6
N
N
C
H
3
H
harmana
N
N
C
H
3
H
O
C
H
3
harmina
min, harmol 11,4 min, harmalina 16,5 min, harmana 18,4 min e harmina 19,1min. A
Figura 28 apresenta os espectros em UV de cada padrão.
Figura 25: Cromatograma desenvolvido em CLAE, da mistura dos padrões ß-
carbolínicos, pico 1= harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina e pico 4=
harmana + harmina. Fase móvel metanol 22% , acetonitrila 22% e tampão fosfato
56% pH 8,0.
Figura 26:
Cromatograma, da mistura dos padrões ß-carbolínicos, pico 1=
harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina e pico 4= harmana + harmina. Fase
móvel (Tabela 6)
1
2
3
4
1
2
3
4
Figura 27: Cromatograma, da mistura dos padrões ß-carbolínicos, pico 1=
harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina, pico 4= harmana e pico 5= harmina.
Fase móvel (Tabela 5).
1
2
3
4
5
A
B
C
D
E
N
N
C
H
3
H
O
H
harmalol
N
N
C
H
3
H
O
H
harmol
N
N
C
H
3
H
O
C
H
3
harmalina
N
N
C
H
3
H
harmana
N
N
C
H
3
H
O
C
H
3
harmina
Figura 28:
Espectros em UV dos padrões de alcalóides. A= harmalol, B= harmol, C=
harmalina, D= harmana e E= harmina.
O extrato fluido de
P. alata
(A), foi analisado segundo metodologia descrita
na Tabela 5.
Comparando-se o cromatograma do extrato com o cromatograma
dos padrões, percebe-se que não há picos caracteristícos de alcalóides, não
coincidindo os tempos de retenção. O cromatograma demonstra apenas um pico,
sendo que este apresenta retenção antes de 6 min, e os padrões começam a
serem detectados a partir deste tempo (Figura 29).
Figura 29:
Comparação do cromatograma do extrato
P. alata
(A) e dos padrões
(B), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5= harmina. Fase móvel
metanol 32%, acetonitrila 12% e
tampão fosfato (pH 8,0) 56%.
A
B
1
2
4
3
5
Os extratos a quente (III) e a frio (IV) segundo item 4.3.4, pág 27, também
foram analisados segundo método descrito na Tabela 5
.
Observando os
cromatogramas dos extratos com o dos padrões, percebe-se que não há picos
definidos, além da linha de base estar alterada e quando observado o perfil dos
espectros dos extratos comparado com o dos padrões nota-se que não há
semelhança (Figura 30).
Figura 30:
Comparação do cromatograma extrato a quente (III) (A), extrato a frio
(IV) (B) e padrões (C), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5=
harmina. Fase móvel (Tabela 5)
C
A
B
1
2
3
4
5
Visto que as análises dos extratos anteriores não apresentaram
resultados positivos para presença de alcalóides, foram desenvolvidos novos
extratos, segundo o método de extração clássica para alcalóides ácido/base,
denominamos extrato I e extrato II (descritos nos itens 4.3.4, pág 26 e 27), o último
é mais purificado. As análises foram realizadas em sistema gradiente, com fase
móvel descrita na Tabela 5. Comparando os cromatogramas do extrato I, extrato II
e dos padrões, percebe-se que os cromatogramas dos extratos são semelhantes,
apresentando picos mais definidos, se comparado ao dos cromatogramas
anteriores. Quando comparados com o cromatograma dos padrões, verifica-se
que não há semelhança nos tempos de retenções e o perfil dos espectros não é
caracteristico. (Figura 31).
A literatura relata que, o gênero Passiflora é composto principalmente por
alcalóides e flavonóides. A investigação dos compostos alcaloídicos presentes na
planta, é em função de que esses alcalóides foram associados à atividade
farmacológica de muitas plantas medicinais que atuam sobre o sistema nervoso
central (PEREIRA; VILEGAS, 2000; REHWALD; STICHER; MEIER, 1995).
Atualmente Dharwan, Kumar e Sharma (2001), relatam que ainda não está
claramente descrito qual constituinte, ou grupo de constituintes, é responsável
elos efeitos sedativos e traquilizantes do gênero.
Os primeiros estudos relatados na literatura (Bennati, 1971) que detectaram
alcalóides no gênero Passiflora utilizaram métodos mais antigos (CCD) e não
muito precisos. Grice et al. (2001) desenvolveram um único método em CLAE
para análise simultânea de flavonóides C-glicosilados e alcalóides β-carbolínicos
(harmano, harmina e harmol) em 9 amostras de P. incarnata. Os resultados
obtidos mostraram ausência de harmol em todas as amostras, traços de harmana
em 6 amostras, ausência de harmine em 2 amostras e presença nas demais em
pequenas quantidades. As contradições de informações levam a crer que os
alcalóides não são de fato os compostos predominantes no gênero Passiflora e
provavelmente não estão envolvidos com a atividade farmacológica observada.
Figura 31:
Comparação do cromatograma do extrato I (A), extrato II (B), padrões
(C), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5= harmina. Fase móvel
(Tabela 5)
C
A
B
1
2
3
4
5
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